Fotoreactivitatea Escherichia Coli din Probe de Apa Dupa Tratarea cu Lumina Uv

În primul rând, aș dori să-mi exprim cele mai calde mulțumiri

coordonatorului tezei mele, profesorul Mihaela Zăuleț,

pentru sprijinul său imens și pentru îndrumare.

De asemenea, vreau să mulțumesc Laurei Buburuzan

pentru ajutorul în laborator.

Mulțumesc Departamentului de Biochimie și Biologie

Moleculară, pentru sprijinul acordat în efectuarea

părții experimentale

Aș vrea să le mulțumesc totodată părinților mei

pentru sprijinul necondiționat și

pentru omul care sunt astăzi.

Introducere

Apa este una dintre cele mai abundente substanțe de pe pământ și joacă un rol crucial în ciclul vieții. În fapt, viața pe Terra își are originea în apă, tot ceea ce este viu are nevoie de apă, iar numeroși oameni de știință consideră că viața ar fi imposibilă fără apă. Totuși, apa reprezintă între 60 și 90% din compoziția chimică a unui organism, restul fiind ocupat de alte elemente reunite în molecule de complexitate variabilă în care prezența carbonului este uzuală, element ce se poate combina cu alți atomi în cele mai variate feluri. Cel mai evident efect al microorganismelor de pe Pământ este abilitatea lor de a recicla elementele primare existente în toate ecosistemele din natură, în principal carbonul, oxigenul și azotul. Aceste elemente și moleculele care le conțin trebuiesc puse la dispoziția tuturor formelor de viață existente și ele se regăsesc deopotrivă în sol și apă, în concentrații din cele mai variate, permițându-le microorganismelor să și le extragă în funcție de necesități (Bogdan A.T. et al, 2011).

Importanța apei și a calității acesteia pentru industria alimentară este majoră (Bogdan A.T. et al, 2011).

Accesibilitatea și disponibilitatea apei curate dulci joacă un rol important nu numai în dezvoltarea economică și bunăstarea socială, dar, de asemenea, este un element esențial în sănătate, producția de alimente și reducerea sărăciei. Cu toate acestea, apa potabilă rămâne inaccesibilă pentru aproximativ 1,1 miliarde de oameni din lume și taxa pe oră de contaminare biologică a apei potabile este de 400 de decese ale copiilor cu vârsta sub cinci ani (Odonkor S.T:, Ampofo J.K.., 2013)..

Produsele alimentare conțin, în mod constant și în număr destul de mare, diferite microorganisme. Studiul microbiotei alimentelor a condus la stabilirea în diferite țări a unor norme microbiologice privind încărcarea cu microorganisme a alimentelor, formarea microbiotei în condițiile proceselor tehnologice de prelucrare a alimentelor, rolul microorganismelor la creșterea valorii biologice și alimentare și rolul etiologic al unor alimente în transmiterea microorganismelor patogene (Aida V., 2009).

Poluarea microbiană se referă la căile prin care pot ajunge, ocazional, microorganisme patogene/toxicogene, agenți ai îmbolnăvirilor prin consum de alimente contaminate (Aida V., 2009).

Este evident că pentru producerea unei infecții trebuie ingerat fie agentul patogen, fie toxinele preformate ale acestuia. Cu excepția toxinelor botulinice, aminotoxinelor și a toxinelor fitoplanctonului, aproape toți agenții patogeni pot fi contactați pe calea fecal-orală. Vehicularea acestora se face fie prin intermediul operatorilor din industria alimentară, fie prin vectori, fie prin elementele constituente ale alimentelor (Bogdan A.T. et al, 2011, vol. 2).

Pentru ca gazda să fie invadată, este necesar ca o suită de evenimente nedorite să aibă loc, evenimente pe care agentul patogen trebuie să le execute. Trebuie să supraviețuiască mediului acid conferit de pH-ul gastric, să se atașeze sau să colonizeze pereții intestinali, în așa fel încât să se poată înmulți, să posede o serie de “arme” împotriva mecanismelor de apărare ale gazdei, să competiționeze cu ceilalți membrii ai microbiontei intestinale (Bogdan A.T. et al, 2011, vol. 2).

Protecția sănătății publice și a mediului necesită apă potabilă, ceea ce înseamnă că trebuie să fie lipsită de bacterii patogene. Printre agenții patogeni diseminați în apă, patogenii enterici sunt cel mai des întâlniți (Rompre A.,et al, 2002).

În lucrarea de față mă voi referi numai la una dintre speciile bacteriene responsabile de apariția unor astfel de infecții, respectiv la Escherichia coli.

Fig.1. Escherichia coli (fineartamerica.com)

Deși Escherichia coli a fost intens studiată din punct de vedere fiziologic, genetic și biochimic, nu se știe în detaliu cum se comportă bacteria în cadrul habitatelor sale naturale (Dirk van Elsas J., et al, 2011).

Capitolul I: Studiu bibliografic

1. Escherichia coli

1.1.Generalități

Escherichia coli, numită inițial „Bacteria coli comună”, a fost izolată pentru prima dată din fecale de copil de către pediatrul german Theodor Escherich în anul 1885, iar în zilele noastre reprezintă bacteria cel mai bine studiată (Paiva de Sousa C., 2006).

Escherichia coli este specia tip a genulului Escherichia care conține în cea mai mare parte bacili Gram negativ mobili și care se încadrează în familia Enterobacteriaceae (Weintraub A., 2007).

Escherichia (E.) coli este un microorganism comensal care aderă la nivelul stratului mucos al colonului mamiferelor. Atâta timp cât aceste bacterii nu dobândesc elementele de codificare genetică a factorilor de virulență (fimbrii, capsulă, toxine, siderofori), ele rămân comensale benigne. Este o bacterie facultativ anaerobă foarte abundentă în microbiota intestinală umană (Weintraub A., 2007) (are capacitatea de a ocupa nișe ecologice cu condiții diferite. Intestinul oferă predominant condiții anaerobe, dar habitatul în strânsă proximitate cu celulele epiteliale unde oxigenul difuzează din capilarele sanguine, creează condiții aerobe. Inclusă în stratul de mucus ce acoperă epiteliul intestinal, crește cu un timp de generație de 40-80 de minute (Chifiriuc C., et al., 2011)).

Fig.2. Escherichia coli văzută la microscopul electronic (http://msb.embopress.org/content/2/1/2006.0008)

E. coli este un membru al grupului de bacterii coliforme fecale și este un indicator mai specific de poluare fecaloid-orală decât alte bacterii coliforme folosite pentru monitorizarea calității microbiologice a apei potabile (Odonkor S.T:, Ampofo J.K.., 2013).

În prezent, E. coli pare să fie cel mai bun indiciu al contaminării fecale în apa de băut. Această afirmație se bazează pe termotoleranța coliformilor în mediile temperate, comparativ cu incidența rară a E. coli, prevalența de E. coli în materiile fecale umane și animale în comparație cu alte bacterii coliforme termotolerante (Odonkor S.T:, Ampofo J.K.., 2013).

Membrana externă a tuturor bacteriilor Gram negative este formată din lipopolizaharide care sunt grupate în trei regiuni principale. Regiunea III sau Lipidul A este hidrofobă și înlocuiește structura fosfolipidică. Regiunea II reprezintă miezul stratului lipopolizaharidic și este legată de Lipidul A. Aceasta este formată din 5 tipuri de oligozaharide. Regiunea I este formată din unități oligozaharidice repetitive și are un rol important în interacția dintre bacterie și sistemul de apărare al gazdei. Este purtătoare a antigenului O care crește virulența bacteriană. Unele tulpini de E. coli prezintă o capsulă ( antigenul K) formată din polizaharide extracelulare.

Fig.3. Structura internă a celulei de Escherichia coli (http://melpor.hubpages.com/hub/Understanding-The-E-Coli-Bacteria)

1.2. Caractere morfologice și de cultură

Celulele au forma unor bacili drepți sau ușor curbați, cu dimensiuni cuprinse între 1-3 µm lungime (Chifiriuc C., et al., 2011) și cu un diametru de aproximativ 0,5 µm (Paiva de Sousa C., 2006).

Fig.4. Escherichia coli- colorație Gram (http://www.bacteriainphotos.com/Escherichia%20coli%20light%20microscopy.html)

Se dezvoltă foarte bine pe medii simple de cultură. Pe geloză pot dezvolta colonii de tip „S” convexe, umede cu suprafața lucioasă, margini netede, sau colonii „R” uscate, cu marginile crenelate (Chifiriuc C., et al., 2011). Este o specie bacteriană nesporogenă (Paiva de Sousa C., 2006).

E. coli sunt de obicei mobile în lichid datorită flagelului peritrich, cel mai adesea prezentând și fimbrii (Paiva de Sousa C., 2006).

Folosesc acetatul ca unica sursă de carbon, fără să folosească citratul. Majoritatea tulpinilor fermentează lactoza (Chifiriuc C., et al., 2011).

Se dezvoltă între limite largi de temperatură și pH. Creșterea optimă se realizează la temperatura de 37◦C și pH de 7,2-7,8 (Chifiriuc C., et al., 2011).

1.3. Rezistența la factori chimici, fizici și biologici

E.coli este rezistentă la o serie de factori fizici și chimici, la care se adaptează supraviețuind perioade lungi de timp fără creștere. Solul, apa și alimentele reprezintă variante alternative extraintestinale ale acestei specii bacteriene. Tulpinile de E.coli sunt sensibile la acțiunea antisepticelor uzuale: fenol, sublimat, cloramina. Sunt sensibile și la acțiunea unor coloranți, cum ar fi verdele brilliant, verdele malachit, clorura de litiu, sărurile de seleniu, teluritul de potasiu, tetrationatul, care au acțiune bacteriostatică asupra lor. De asemenea, prezintă niveluri ridicate de sensibilitate la acțiunea bacteriofagilor, unele dintre ele fiind lizogene (Chifiriuc C., et al., 2011).

1.4. Clasificare

Este adesea nepatogenă, dar există și câteva tulpini care sunt capabile să producă infecții gastrointestinale, urinare sau ale sistemului nervos central (Weintraub A., 2007). Este un patogen oportunist și poate determina un proces infecțios, depinzând de densitatea populației bacteriene și de factori predispozanți: compromiterea funcției de apărare și creșterea permeabilității barierei intestinale (Chifiriuc C., et al., 2011).

Printre E. coli care provoacă boli intestinale, există șase categorii bine descrise: E. coli enteroagregativă (CEEA), E. coli aderentă difuz (DAEC), E. coli enteroinvazivă (EIEC), E. coli enteropatogenă (EPEC), E. coli enterohemoragică (EHEC) și E. coli enterotoxigenă (ETEC). Aceste categorii au factori de virulență care ajută bacteriile să provoace boli prin diferite mecanisme. (Weintraub A., 2007).

Tulpinile enteropatogene posedă o plasmidă numită EAF, care determină capacitatea acestor tulpini de a produce un tip de aderență localizată. Aderența este urmată de atașarea intimă a bacteriilor la suprafața celulei gazdă, mediată de o proteină a membranei externe- intimina, considerată factor de virulență a tulpinilor EPEC. Se deosebesc de alte tulpini de E.coli prin capacitatea de a produce leziuni caracteristice în enterocitele intestinului subțire, cu modificări ale citoscheletului și pierderea microvililor ce formează bordura în perie (Chifiriuc C., et al., 2011).

Tulpinile enterotoxigene se transmit prin alimente și apa contaminată. Produc câteva fimbrii cu rol de factori de colonizare, deoarece au rolul de a adera la celulele mucoasei, permițând ETEC să colonizeze intestinul subțire. Sinteza adezinelor este codificată de plasmide. După aderență și colonizarea mucoasei intestinului subțire, tulpinile ETEC determină un sindrom diareic prin inhibarea resorției ionilor de sodiu și a apei, datorită producerii și eliminării unor exotoxine, cu tropism pentru celulele intestinale. Cele două enterotoxine sunt de două tipuri termolabile și, respectiv termostabile. Enterotoxina termolabilă este formată din două subunități A și B. Subunitatea B se leagă de un gangliozid specific al celulelor epiteliale de la nivelul intestinului subțire, dar nu sunt internalizate. Subunitatea A se activează prin clivajul legăturii peptidice și este internalizată. Subunitatea A catalizează ADP-ribozilarea adenilat ciclazei legată de membrană, rezultând creșterea activității AMP ciclic și creșterea secreției de fluide și electroliți (Chifiriuc C., et al., 2011).

Tulpinile EHEC secretă citotoxine puternice formate din două subunități A și B. Subunitatea B se leagă de un glicolipid membranar, iar subunitatea A este internalizată și produce moartea celulei prin inhibiția sintezei proteinelor, împiedicând legarea aminoacil-ARNt de codonul ARNm (Chifiriuc C., et al., 2011).

Tulpinile enteroinvazive penetrează și se multiplică în celulele epiteliale ale colonului, producând modificări ale mucoasei intestinale. Virulența este dependentă de prezența unei plasmide de invazie și constă în ulcerații ale mucoasei digestive (Chifiriuc C., et al., 2011).

Escherichia coli enteroagregativ este un subgrup de E. coli care produce diaree și care, în ultimul deceniu, a primit o atenție sporită fiind cauza principală a apariției diareei apoase, care de multe ori devine persistentă (Weintraub A., 2007).

Tulpinile difuz-aderente sunt ultimul virotip de E. coli care a fost descrise (Chifiriuc C., et al., 2011).

Tulpinile de uropathogenic E. coli produc infecții ale tractului urinar inferior, care pot progresa pe cale ascendentă (Chifiriuc C., et al., 2011).

Septic E. coli produc infecții generalizate, complicate cu șoc septic și meningită, factorii de virulență fiind pe de o parte reprezentați de structurile de aderență și invazie, iar pe de altă parte de mecanismele de evitare a efectorilor imunitari (Chifiriuc C., et al., 2011).

1.4. Genom

Escherichia coli este o componentă importantă a biosferei și un model ideal pentru studiul proceselor implicate în evoluția genomului bacterian (Lukjancenko O., et al, 2010).

Ca organism model primar pentru bacterii, a fost folosit pentru a defini codul genetic și elucida mecanismele de importanță centrală, cum ar fi transcripția, translația, restricția, replicarea și o mare parte din metabolismul de bază. Adnotările sale sunt transferate în mod regulat la alte organisme pentru ca secvențele genomului lor să fie finalizate, astfel acuratețea genomicii funcționale a E. coli este deosebit de importantă pentru toată întreprinderea genomică. De asemenea, este utilizat pe scară largă ca un instrument genomic pentru a propaga subclonele ADN pentru secvențiere și pentru o varietate de studii funcționale la multe specii. Industrial, E. coli este folosită pentru a produce hormoni, enzime și antibiotice (http://genome.cshlp.org/content/12/4/640.long).

Analiza comparativă a secvențelor de ARN ribosomal de tip 5S și respectiv 16S a evidențiat faptul ca Escherichia și Salmonella provin dintr-un ancestor comun de acum 120-160 milioane de ani, lucru care coincide cu originea mamiferelor (Paiva de Sousa C., 2006).

Secvențierile genomice efectuate de-a lungul timpului au demonstrat o conservare fără echivoc de aproape 40% a secvențelor genice de bază (Paiva de Sousa C., 2006).

Materialul genetic al tulpinilor de Escherichia coli este reprezentat de un singur cromozom, o moleculă circulară dublu-catenară de ADN ce are aproximativ 4.6 x 106 perechi de baze și cuprinde aproximativ 4300 de potențiale secvențe de codificare. Cuprinde setul complet de gene pentru toate caracteristicile celulei bacteriene, pentru metabolismul energetic, biosintezei celulare, creștere, diviziune, dar și pentru reglarea activităților intracelulare (http://utminers.utep.edu/rwebb/html/the_e__coli_genome.html).

Cromozomul bacterian este atașat la membrana plasmatică a celulei bacteriene în aproximativ 20 de puncte, dar o funcție deosebită o are punctul de atașare de lângă regiunea de origine a replicării acestei molecule de ADN (http://www.bio.unibuc.ro/pdf/Masterat_2014/Cap_3_Cromozomul_la_organisme_pro-si_eucariote.pdf).

În cadrul genomului, 70% din numărul total de gene sunt monocistronice, doar 6% din ele fiind policistronice (http://utminers.utep.edu/rwebb/html/the_e__coli_genome.html).

În cromozomul de E.coli, majoritatea genelor (operonilor) par să fie distribuite randomizat (indiferent de înrudirea lor fiziologică), cu excepția celor implicate în catabolismul glucozei ce par să fie dispuse în 4 zone echidistante pe harta circulară a cromosomului. Această randomizare a dispunerii operonilor a fost verificată și prin rearanjamente cromosomale induse experimental– caz în care operonii au continuat să funcționeze normal (http://www.bio.unibuc.ro/pdf/Masterat_2014/Cap_3_Cromozomul_la_organisme_pro-si_eucariote.pdf).

Totuși, în treimea cromosomală ce are în centru regiunea ter (ca, de altfel, și în regiunea oriC), poziția operonilor pare săfie destul de fixă, orice rearanjament deranjând total funcționarea acestora (http://www.bio.unibuc.ro/pdf/Masterat_2014/Cap_3_Cromozomul_la_organisme_pro-si_eucariote.pdf).

În afară de ARN polimeraza, care datorită ratei înalte de transcriere la bacterii, rămâne asociată cvasi-permanent cu moleculele de ADN, cromosomul bacterian este asociat cu o serie de proteine bazice, similare cu histonelede la organismele eucariote, denumite proteine histone-like http://www.bio.unibuc.ro/pdf/Masterat_2014/Cap_3_Cromozomul_la_organisme_pro-si_eucariote.pdf).

La E.coli au fost descrise 9 specii moleculare de proteine bazice, cu greutate moleculare între 9 și 28 kDa, care se atașează la ADN într-o manieră situs-nespecifică și care au funcții similare cu histonele de la organismele eucariote. Dintre cele 9 specii moleculare proteice, cea mai importantă este

o proteină denumită HU(« Helix–Unwinding » = desfacerea dubului helix). Din complexarea moleculelor HU cu ADN cromozomal bacterian se formează structuri similare cu nucleosomii de la eucariote.

Fig.5. Cromozom E.coli. Se poate observa faptul că ADN-ul este superrăsucit, fiind complexat cu proteine de tipul H-like în 50 de domenii separate superîncolăcite (http://utminers.utep.edu/rwebb/html/the_e__coli_genome.html).

Genomul mediu al E.coli este dependent de forțele evolutive derivate din gazda primară și de habitatele secundare, în care sunt prezente atât presiuni biotice (prădători, concurenți, mecanismele de apărare ale gazdei), cât și presiuni abiotice (pH, UV, temperatură, epuizarea resurselor). Tulpinile de coli posedă un genom de bază format din aproximatic 2000 de gene. Pan-genomul este format din aproximativ 18000 de gene, din care 11% îi aparțin genomului de bază, 62% este reprezentat de genele persistente, iar restul de 26% sunt considerate gene volatile (Dirk van Elsas J., et al, 2011).

Evenimentele de achiziție și pierdere de gene sunt în mod constant legate de hotspot-uri de introducere / eliminare de gene, genomul de E. coli de bază fiind menținut în mod selectiv sub forma unor gene persistente. Aceste evenimente pot avea ca rezultat evoluția unor clustere de gene care definesc anumite fenotipuri de E. coli, precum operonul pap, care este implicat în patogeneza infecției (Dirk van Elsas J., et al, 2011).

Fig.6.Genom E.coli (Dirk van Elsas J., et al, 2011).

2. Tratarea apei contaminate cu Escherichia coli cu lumină UV

Ultravioletele (UV) câstigă tot mai mult teren față de dezinfecția cu clor, având capacitatea de a inactiva o gamă largă de agenți patogeni.

Iradierea UV este unul dintre cele mai eficiente tratamente utilizate pentru dezinfectare. Numărul stațiilor de epurare a apei și a apelor uzate echipate cu sisteme de dezinfecție UV au fost dublat în ultimele decenii, în multe țări, pentru că un astfel de sistem este ușor de întreținut, nu are necesită introducerea unor produse chimice și nu produce subproduse periculoase. Capacitatea luminii UV de a inactiva microorganismele (cu alte cuvinte, sensibilitatea microorganismelor la lumina UV) diferă de la organism de organism (Oguma K., et al, 2002).

Prima iradiere UV a apei de băut ca proces de dezinfectare s-a realizat în 1910 la Marsilia, după dezvoltarea lămpii cu vapori de mercur și a tubului de cuarț, dar și după stabilirea efectul germicid al iradierii UV (Hijnen W.A.M., et al, 2006).

Spre deosebire de dezinfectanții de natură chimică, stabilitatea biologică a apei nu este afectată de lămpile de joasă presiune. În Europa, iradierea UV a fost aplicată pe scară largă pentru dezinfecția apei din anii 1980, dar și pentru controlul contaminării accidentale a apelor subterane vulnerabile (Hijnen W.A.M., et al, 2006).

Radiațiile afectează moleculele bacteriilor care le absorb prin declașarea reacțiilor fotochimice. Lumina UV este absorbită de bazele azotate purinice și pirimidinice, care reprezintă componenta majoră a acidului dezoxiribonucleic. Pe măsură ce absorb fotonii proveniți de la sursa de lumină, moleculele primesc energie. energia fotonului este invers proporțională cu lungimea de undă la care sunt emise radiațiile. Energia totală pe care o moleculă o absoarbe este direct proporțională cu durata și intensitatea radiațiilor. Această absorbție de fotoni determină o acumulare de energie care este utilizată pentru modificările de la nivelul ADN, adică se formează noi legături dar între bazele azotate ale nucleotidelor adiacente situate pe aceeași catenă (Aguiar A., et al., 1996).

Mecanismele prin care lumina UV inactivează un microorganism sunt diferite la diferite lungimi de undă. Efectul bactericid al luminii UV la o lungime de undă scurtă (UV-C și UV-B; 220 320 nm) se datorează formării dimerilor pirimidinici și timinici în ADN-ul organismelor ( se formează legături încrucișate între pirimidinele de pe catene opuse care blochează separarea catenelor necesară atât în replicare cât și în transcriere; un dimer de timină poate avea efect letal asupra celulei dacă o asemenea leziune nu este reparată (Oguma K., et al, 2002).

Leziunile inhibă replicarea normală a genomului, având ca rezultat inactivarea microorganismelor, deci moarte celulară. Pe lângă gene, proteinele și enzimele cu legături nesaturate sunt cunoscute ca având capacitatea de a absorbi UV-C și UV-B, ceea ce poate duce, de asemenea, la o deteriorare semnificativă a organismelor. Pe de altă parte, lumina UV cu o lungime de undă mare (UV-A; 320-400 nm) este cunoscută pentru daunele produse organismelor în principal prin excitarea moleculelor fotosensibile din interiorul celulei pentru a produce specii active, precum O2 , peroxid de hidrogen și OH-, care deteriorează genomul și alte molecule intracelulare și provoacă efecte letale și subletale, cum ar fi mutațiile și întârzierea creșterii (Oguma K., et al, 2002).

Unele organisme sunt cunoscute pentru că posedă mecanisme de repara a ADN deteriorat UV. Fotoreactivarea este un mecanism de reparare a ADN-ului, în timp ce alte mecanisme sunt frecvent menționate ca remedianți după întuneric în contrast cu fotoreactivarea. O atenție specială a fost acordată fotoreactivării, deoarece aceasta poate afecta foarte mult eficacitatea dezinfecției UV în câteva ore după tratament (Oguma K., et al, 2002), acesta constituind dezavantajul major al tehnologiei UV.

Fotoreactivarea a fost descoperită în anul 1940 de către A. Keiner la celulele de E.coli și la conidiile de Streptomyces griseus.

Fotoreactivarea este fenomenul prin care organismele inactivate UV își reiau activitatea prin fotorepararea leziunilor induse de UV în ADN prin utilizarea energiei luminoase aproape de UV (310-480 nm) și a enzimelor, respectiv a fotoliazelor (testele efectuate de-a lungul timpului de către cercetători au evidențiat faptul că o astfel de enzimă este capabilă să repare cinci dimeri pe minut, în condițiile în care numărul total de fotoliaze per organism este de aproximativ 20). De aceea, UV-A este esențială pentru fotoreactivare, deși are și efecte letale și subletale asupra organismelor, după cum s-a menționat mai sus. Jagger a numit acest fenomen concomitent fotoreactivării deoarece lumina inactivatoare în sine are potențialul de a fotorepara dimerii (Oguma K., et al, 2002).

Fig.7. Repararea dimerilor de timină ce apar în urma expunerii la UV. Fotoliazele ADN, codificate de genele phr permit bacteriilor să repare dimerii de timină. Acidul folic este folosit pentru a "recolta" energia luminoasă, care este transmisă rapid la FADH, ceea ce face FADH2.Acum FADH2, electronic excitat, poate transfera electronul de mare energie dimerului, pentru a sparge structura dimerului în molecule de timină distincte (http://utminers.utep.edu/rwebb/html/dna_repair__photoreactivation.html).

Fotoreactivarea este influențată de intensitatea și durata expunerii la lumina vizibilă, temperatură, fluxul UV și tipul de lămpi UV utilizate pentru a dezinfecta apa (Locas A., et al., 2008).

În timp ce rata de fotoreparare crește odată cu creșterea intensității luminii vizibile, valoarea maximă de supraviețuire în urma reactivării este independentă de nivelul intensității și de sursa de lumină. Studiile au demonstrat că fenomenul de reactivare atinge intensitatea maximă după 2 – 3 ore (Hallmich C., 2009).

Capacitatea de a realiza fotoreactivarea diferă de la specie la specie, și cele mai multe tulpini de Escherichia coli, bacterie indicator utilizată în controlul calității apei, sunt cunoscute ca fiind capabile de fotoreactivare. Fotoliazele E. coli sunt specifice pentru repararea dimerilor pirimidinici și de timină (sunt activate de lumina albastră), în timp ce unele organisme descoperite recent au o enzimă de fotoreactivare specifică pentru fotoproduși (Oguma K., et al, 2002).

Diversitatea și distribuția fotoliazelor sunt încă probleme controversate, și de aceea este important a se investiga capacitatea fotoreactivatoare a microorganismelor-cheie, cum ar fi bacteriile indicatoare. În plus, este nevoie să se poată calcula dozele UV necesare pentru a compensa potențialul de repararea în avans (Oguma K., et al, 2002).

Familia fotoliazelor cuprinde proteine monomerice de 55-70 kDa (Thompson C.L., Sancar A., 2002).

Fotoliazele de la E.coli sunt codificate de gene phr. Acestea au capacitatea de a recunoaște regiunile în care au apărut leziuni produse de radiațiile UV, ele neputându-se lega la ADN-ul normal. Fotoliazele au 471 aminoacizi (Thompson C.L., Sancar A., 2002) și conțin doi co-factori, flavin adenin dinucleotid (FAD) și un alt cromofor, meteniltetrahidrofolat. Cromoforul activ în fotoliază este FADH, forma redusă a FAD. Forma oxidată de FAD se leagă la dimerul de pirimidină, dar este incapabil să transfere electroni, motiv pentru care este considerat forma inactivă. Din acest motiv, FAD este redus pentru a putea fi capabil să participe la divizarea dimerilor (Hallmich C., 2009).

Fig.8. Structura fotoliazelor de la E.coli (Thompson C.L., Sancar A., 2002)

Deși doar FAD este necesar pentru activitatea catalitică, al doilea cofactor accelerează semnificativ viteza de reacție în condiții de lumină scăzută (Hallmich C., 2009)

Fotoliazele se împart în două mari categorii: de tip I (cele microbiene) și de tip II (cele de la plante și animale). Prezintă două domenii: unul α/β- N terminal și un domeniu helical C-terminal, cele două fiind conectate prin intermediul unui interdomeniu (Thompson C.L., Sancar A., 2002).

Lămpile UV convenționale folosite pentru dezinfecție sunt lămpile UV de joasă presiune (LP), în timp ce lămpile UV de presiune medie (MP) au fost de asemenea folosite. Lămpile UV LP au emisie monocromatică la lungimea de undă de 254 nm, care este cel mai eficient absorbită de bazele azotate ADN și prin urmare are unele dintre cele mai mari efecte germicide în rândul lungimilor de undă UV. Pe de altă parte, lămpile UV MP emit lumină policromatică la o gamă largă de lungimi de undă, de la aproximativ 200 până la 600 nm. Lămpile UV MP pot emite lumină la o intensitate mare, care permite sistemelor MP UV să fie operat la debite mai mari decât sistemele UV LP. Lămpi UV MP sunt cunoscute a fi la fel de eficace ca și lămpile UV LP convenționale la inactivarea microorganismelor sau chiar mai eficiente.

Capitolul II: Studiu de caz

Obiectivul principal al lucrării de față este de a utiliza un instrument capabil să crească nivelul de puritate al apei, utilizând un dispozitiv spectral cu o sensibilitate foarte ridicată, bazată pe excitația laser. Acest instrument va emite UV la o lungime de undă de 260 de nanometrii.

Aparat experimental

Aparatul folosit se numește Dowa Superb UV Led Solutions, modelul fiind DF7V (Flip chip form). Este utilizat ca instrument analitic, în analizele chimice, biochimice și medicale, în fototerapie medicală, pentru emisia de UV. Emite radiații UV între 260 nm și maxim 270 nm.

Fig.9. Dowa DF7V

În ceea ce privește caracteristicile electrico- optice, are o intensitate de 20 mA, voltajul fiind de maxim 10.5 V. Temperatura la care se poate lucra cu aparatul este cuprinsă între -30 si +80◦C.

Se cunoaște faptul că sub spectrul vizibil se află o bandă de lungimi de undă, numite ultraviolete (UV). Variind 100-400 nm, radiația poate fi utilizată în mod eficient pentru a steriliza cosmetice, pentru a efectua analize medico-legale sau chiar pentru a dezinfecta apa.

Radiațiile UV, în intervalul 265-280 nm, sterilizează apa, prin ruperea catenelor de ADN și ARN ale microorganismelor, prevenind astfel reproducerea lor. Mai exact, 275 nm este considerată a fi cea mai eficientă lungime de undă pentru eradicarea patogenilor, cum ar fi E-coli în apă. Se pare că un grup de ingineri din Columbia au stabilit că 275 nm este lungimea de undă optimă pentru dezinfecția apei.

Probe de apă

Ca material de lucru, au fost analizate 10 probe din rețeaua de apă a municipiului București.

Trebuie amintit faptul că fiind vorba de probe de apă, prelevarea lor se face numai în recipiente sterile (recipiente din plastic). S-a prelevat un volum de probă cuprins între 250-500 mL, pentru a se putea realiza o bună omogenizare a probei înainte de analiză. Flacoanele cu probele prelevate au fost etichetate, pe aceasta fiind inscripționate numărul probei, locul și data prelevării. După prelevare, probele au fost puse și transportate la o temperatură adecvată, astfel încât intervalul de timp între prelevare și analiza probei să fie cât mai scurt posibil. Timpul maxim de păstrare nu trebuie să depășească 8-18h, ele fiind menținute la întuneric la 5◦C.

În momentul în care toate probele au fost prelevate, am efectuat în cadrul laboratorului determinarea numărului total de germeni, conform diagramei 1 și detecția și numărarea de E. coli β-glucuronidază-pozitivă, conform diagramei 2. Încărcătura microbiană totală inițială (numărul total de germeni), obținută la momentul prelevării probelor este precizată în tabelul 1.

Tabel 1. Încărcătura microbiană totală inițială a probelor analizate

În urma stabilirii încărcăturii bacteriene totale, probele au fost supuse verificarii prezenței cantitative a E. coli. Toate cele 10 probe analizate au fost negative în ceea ce privește prezența E. coli.

Materiale și metode utilizate

Principiul metodei utilizate pentru determinarea încărcăturii totale inițiale de germeni este următorul și este exemplificat în cadrul diagramei 1 de mai jos:

Însămânțarea în profunzime, a unui mediu de cultură definit, turnat în două cutii Petri, cu o cantitate determinată de diluție inițială a probei supuse testării.

În aceleași condiții, însămânțarea diluțiilor decimale obținute din diluția inițială a probei supuse testării.

Incubarea cutiilor la 300 C, în aerobioză, timp de 72 h.

Pornind de la numărul de colonii obținute în cutiile Petri selectate, calcularea numărului de microorganisme pe mililitru probă.

Stabilirea încărcăturii microbiene totale s-a efectuat conform diagramei următoare:

Diagrama 1. Determinarea încărcăturii microbiene totale inițiale

10-2

10-1 10-3

1

Pentru detecția și numărarea E. coli am folosit Metoda orizontală pentru enumerarea E. coli β-glucuronidază-pozitiv. Tehnica de numărare a coloniilor se face la 440 C, utilizând 5-bromo-4-cloro-3-indolil- β-D-glucuronid.

E. coli β-glucuronidază-pozitivă sunt bacterii capabile să se dezvolte la 44°C, pe mediu cu triptonă-bilă-glucuronid (TBX), în condițiile specificate în prezenta procedură.

Numărarea E. coli β-glucuronidază-pozitivă constă în determinarea numărului de unități formatoare de colonii (UFC) produse de E. coli β-glucuronidază-pozitivă per mililitru sau gram de probă, în condițiile în care testarea și calculul sunt efectuate conform prezentei proceduri.

Diagrama 2. Detecție și numărare de E. coli β-glucuronidază-pozitivă

10-2

10 -1 10-3

Toate cele 10 probe analizate au fost negative în ceea ce priveste prezența E. coli β-glucuronidază-pozitivă.

Pentru stabilirea încărcăturii ințiale de E. coli, ca material de lucru, au fost analizate aceleași 10 probe de apă prelevate, ele fiind păstrate în acest interval de timp la o temperatură de 5◦C, la întuneric. Toate cele 10 probe analizate au fost negative în ceea ce privește prezența E. coli.

Următorul pas a constat în crearea diluțiilor seriale de E. coli și contaminarea artificială a eșantioanelor, analizarea prin tehnici de microbiologie și biologie moleculară la intervale de timp determinate, pentru stabilirea încărcăturii microbiene.

Analizarea prin tehnici de microbiologie la intervale de timp determinate

Probele au fost contaminate artificial cu un inocul preparat prin cultivarea tulpinii de referință E. coli ATCC 25922. Din fiecare probă au fost create câte 3 eșantioane identice care au fost contaminate artificial cu acea cultură de referință, aflată la 3 concentrații de inocul diferite.

Din tulpina de referință (E. coli ATCC 25922), au fost efectuate culturi proaspete (18-24h la 25°C), pe agar nutritiv, aduse la o turbiditate de 0,5 McFarland, ceea ce corespunde unei concentrații de 3 x 108 bacterii/mL și diluate corespunzător. Cele 3 eșantioane au fost inoculate cu concentrații diferite de inocul, astfel:

– eșantionul 1 a fost inoculat 3×106 cfu/ml E. coli (nivel crescut de contaminare);

– eșantionul 2 a fost inoculat 3×104 cfu/ml E. coli (nivel mediu de contaminare);

– eșantionul 3 a fost inoculat 3×102 cfu/ml E. coli (nivel scăzut de contaminare);

Probele au fost supuse investigațiilor pentru numărătoarea totală de germeni și pentru detecția și numărarea de E. coli β-glucuronidază-pozitivă, imediat după contaminarea artificială, apoi la interval de 24, 48 si 72 de ore. Pe parcursul testării, probele inoculate au fost păstrate în condiții de refrigerare la 5C. Rezultatele obținute sunt specificate în tabelele 2 și 3. Aspectele caracteristice al coloniilor de E. coli β-glucuronidază-pozitivă pe mediile specifice sunt prezentate în figurile de mai jos.

Fig.10. Colonii de E. coli, β-glucuronidază pozitive (verzi albăstrui, netede).

Fig. 11. Colonii de E. coli, β-glucuronidază pozitive. Aspect de detaliu.

Rezultate și discuții

Au fost supuse investigațiilor microbiologice 10 probe de apă prelevate din rețeaua de apă a municipiului București. La momentul prelevării probelor, s-a efectuat determinarea numărului total de germeni și detecția și numărarea de E. coli. Încărcătura microbiană totală inițială (numărul total de germeni), obținută la momentul prelevării probelor este precizată în tabelul 2. Toate cele 10 probe analizate au fost negative în ceea ce privește prezența E. coli β-glucuronidază-pozitivă.

Ulterior s-a procedat la fortificarea probelor prin contaminare artificială cu culturi proaspete (24 de ore) de E. coli β-glucuronidază-pozitivă ATCC 25922, la 3 niveluri diferite de concentrație.

La interval de 24, 48 și 72 de ore în urma contaminării artificiale, perioadă în care probele au fost păstrate în condiții de refrigerare, s-a procedat la detecția și numărarea E. coli β-glucuronidază-pozitivă, prin tehnici de microbiologie clasică( Tabelul 3).

Într-un anumit mediu, o tulpină bacteriană se înmulțește într-un anumit mod, cu o rata caracteristică. Rata de înmulțire a tulpinii bacteriene utilizate pentru contaminarea artificială a probelor analizate reprezintă un factor implicit de influențare a microorganismelor din microbionta existentă.

În plus, este bine cunoscut faptul că E. coli prezentă în apă este un competitor ce se dezvoltă bine în prezența altor microorganisme ce compun microbionta de asociație. Astfel, rezultatele obținute relevă efectul inhibant al microbiontei de asociație asupra multiplicării E. coli, însă numai când această microbiontă se află la un nivel mare de concentrație.

Tabel 2. Încărcătura microbiană totală a probelor analizate imediat după contaminare (T0), la 24 de ore după contaminare (T1), la 48 de ore după contaminare (T2) și la 72 de ore după contaminare (T3)

Tabel 3. Numărul de E.coli β-glucuronidază pozitivă în probele analizate imediat după contaminare (T0), la 24 de ore după contaminare (T1), la 48 de ore după contaminare (T2) și la 72 de ore după contaminare (T3)

Analizarea prin tehnici de biologie moleculară a probelor fortificate, pentru stabilirea încărcăturii microbiene.

Obiectivul principal a fost determinarea coloniilor E. coli în apă.

Investigarea prezenței speciei E. coli în probe de apă, acestea au fost analizate prin metoda real-time PCR. Pentru aceasta au fost prelevate probe de apă pentru care s-a detectat prezența prin trehnici de microbiologie încărcătura totală a germenilor (NTG). Probe de apă au fost ulterior fortificate (contaminate) cu E. coli în diferite concentrații (106, 108, 1010 CFU/mL). Pentru probele inițiale nu s-a detectat prezența speciei E. coli. Pentru fiecare probă în parte s-a realizat extracția ADN bacterian cu ajutorul kitului DNeasy mericon Food – Qiagen. Concentrația și puritatea ADN bacterian a fost determinată cu ajutorul unui spectofotometru NanoDrop.

Detecția E. coli. prin tehnica Real-Time PCR a fost realizată folosind secvențele de primeri specifici pentru: E. coli O157 (conțin genele specifice Stx1 si Stx2)

Au fost investigate 8 probe de apă, fortificate cu E.coli O157 în concentrații de 106, 108, 1010 CFU/g. Tehnica real time PCR a confirmat prezența E.coli O157 în probele investigate așa cum era de așteptat. Proba cu cea mai mare concentrație de bacterii a avut cea mai scazută valoare a Ct, denotând o cantitate de ADN crescută în probă și, deci, posibilitatea detectării intensității fluorescenței care depășeste semnificativ valoarea de bază.

Valoarea Ct obținută pentru fiecare probă a fost invers proporțională cu concentrația bacteriilor în proba cunoscută din analizele microbiologice, fapt ce a demonstrat prezența E.coli O157 în concentrațiile asteptate.

Detectarea moleculară și identificarea microorganismelor este utilizată pe scară largă în microbiologia produselor alimentare. Cu toate acestea, în acest moment există informații limitate care pot fi folosite pentru detectarea moleculară a bacteriilor alteraratoare și dezvoltarea de strategii adecvate pentru identificarea lor rapidă și monitorizarea lor.

Ca material de lucru au fost selectate pentru identificarea prin tehnica real-time PCR 8 probe de apă. O parte dintre acestea au fost fortificate cu culturi bacteriene de E.coli O157 (in concentrații de 106, 108, 1010 CFU/mL), pentru a determina gradul de recuperare prin tehnica real time PCR, precum și limita de detecție a metodei.

Extracția ADN bacterian din apă

Pentru extracția ADN bacterian din produse alimentare s-a folosit kitul DNeasy mericon Food de la OIAGEN.

DNeasy mericon Food permite purificarea eficientă a ADN bacterian dintr-o gamă largă de probe: apă, alimente, furaje și produse farmaceutice. Acizii nucleici extrași sunt fără proteine, nucleaze și alte impurități și pot fi utilizați în continuare pentru real-time PCR în scopul identificării agentului patogen.

Într-o piață globalizată creșterea necesarului de apă potabilă impune și dezvoltarea de noi tehnici de cercetare privind monitorizarea în vederea asigurării siguranței alimentare. În acest scop există o nevoie de soluții de testare simplificate, sensibile, precise, și ușor de utilizat, pe o varietate de materii prime.

Kitul mericon de testare a apei este un sistem complet de preparare a probelor utilizând truse care îndeplinesc cerințele enumerate mai sus. Acest kit furnizează acici nucleici de calitate, care ulterior pot fi utilizați în detectarea în timp real a patogenilor .

DNeasy mericon Kit este proiectat pentru obținerea ADN, rapid, (de până la 30 de extracții 2.5 ore) și obținerea ADN purificat dintr-o varietate de matrici formate din apă, alimente crude și prelucrate, minimizând în același timp prezența inhibitorilor PCR existenți în probele de apă și produse alimentare. În urma utilizarii kit-ului DNeasy mericon, ADN este gata de utilizare pentru PCR în timp real utilizând un kit PCR mericon, de amplificare.

Principiul metodei:

Kitul DNeasy mericon utilizează ca agent de extracție bromură de cetiltrimetilamoniu modificată (CTAB). CTAB este un detergent neionic care este utilizat pe scară largă pentru extracția eficientă a acizilor nucleici totali, dintr-o gamă largă de tipuri de țesuturi. Protocolul este optimizat, iar utilizarea CTAB în combinație cu proteinaza K se realizeză pentru digestia țesutului compact și, ulterior, precipitarea proteinelor și a derivatelor alimentare care pot fi inhibitori ai reacției PCR.

Inhibitorii sunt precipitați prin centrifugare, iar ADN extras rămâne în soluție. Prin extracția succesivă în cloroform și. Ulterio,r în CTAB, inhibitorii sunt precipitați în continuare și îndepărtați în fiecare fază organică. Numai faza apoasă conținând ADN este prelucrată în continuare; în acesta fază este omogenizat cu soluție tampon de legare în coloanele spin QIAquick. ADN obținut se poate utiliza în tehnici de aanaliza Real Time PCR.

Pe lângă kitul de extracție mai sunt necesare:

 Omogenizator

 Vortex

 Etanol (96–100%)

 Cloroform

 Centrifugă (pentru tuburi de 50 ml); microcentrifugă (pentru tuburi de 1.5 ml)

 Baie de apa cu agitare (600C)

 Pipete și tipsuri de diferite volume

Când se lucrează cu probe de țesut, structura sa trebuie degradată mecanic sau enzimatic pentru eliberarea celulelor, eliberarea ulterioară a acizilor nucleici, și permeabilizarea membranei materialului. Diferitele tipuri de țesuturi pot varia foarte mult în ceea ce privește textura și rigiditatea, tipurile de celule, conținutul de acizi nucleici-gazdă precum și de substanșe inhibitoare. În plus, localizarea acizilor nucleici patogeni în țesut poate varia în funcție de tipul de țesut, agent patogen, precum și stadiul de infecție.

1. Se pun până la 200 mL probă pentru eficientizarea lizei celulare într-un tub de 2 mL. Se adauga 1 mL tampon de lisă și 2.5 μL soluție proteinaza K. Se omogenizează prin vortexare până la omogenizarea completă.

2. Se incubează la 60°C pentru 30 min, într-un termobloc și se vortexează din când în când pentru a dispersa proba până când este complet lizată. Pentru precipitarea inhibitorilor, se răcesc probele la temperatura camerei (15-250C) prin amplasarea tuburilor pe gheață.

4. Centrifugare pentru 5 min la 2500 rpm.

5. Se transferă 700 μL din supernatantul clar într-un tub de microcentrufugă în care se găsesc 500 μL cloroform.

6. Se vortexează 15 secunde și apoi tuburile se centrifughează la 14.000 rpm pentru 15 min.

7. Într-un tub nou de 2 mL se pipetează 350 μL de tampon PB și se adaugă 350 μL din faza lichidă (supernatant), obținut la pasul 6 și se omogenizeză prin vortexare.

8. Se transferă lichidul omogenizat într-o coloană spin QIAquik amplasată într-un tub de colectare de 2 mL. Se centrifughează la 8000 rpm timp de 1 minut. Se îndepărtează conținutul tubului și se reamplasează colonița spin.

9. Se adaugă 500 μL tampon AW2 în colonița spin. Se centrifughează la 8000 rpm timp de 1 min. Se plasează coloana spin QIAquik într-un tub de colectare de 2 mL curat.

11. Se adaugă 150 μL tampon EB direct pe membrana coloniței spin. Se incubează 1 minut la temperatura camerei (15-250C). Se centrifughează la 8000 rpm timp de 1 minut.

Detecția E.coli O157 prin tehnica Real-Time PCR

Real Time PCR a fost realizată cu ajutorul echipamentului Light-Cycler™ (Roche, Germany). Cea mai importantă caracteristică a acestei tehnici este rapiditatea cu care este posibilă obținerea de rezultate, reducându-se timpul de amplificare, detecție și analiză a ADN de la câteva ore la 30 minute. Evidențierea produsului PCR în acest caz se realizează cu ajutorul fluoroforului. Intensitatea semnalului luminos emis crește odată cu fiecare ciclu de amplificare și este direct proportională cu cantitatea de ADN specific disponibil pentru hibridizare.

Tehnica utilizată a fost preluată din literatura de specialitate și s-au folosit primeri specifici pentru genele specifice Stx1 și Stx2.

Detecția prin real-time PCR

Detecția E.coli prin tehnica Real-Time PCR a fost realizată folosind secvențele de primeri specifici pentru: E. coli O157 (conțin genele specifice Stx1 și Stx2); Stx1 STXA1-598 50-AGTCGTACGGGGATGCAGATAAAT-30; STXA1-1015 50-CCGGACACATAGAAGGAAACTCAT-30; Stx2 STXA2-679 50-TTCCCGAATGCAAATCAGTC-30; STXA2-942 50-CGATACTCCGGAAGCACATTG-30. Master mixul pentru Real-time PCR conține 10 µL iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) și 0.2 mM din fiecare primer într-un volum total de 15 µL. Echipamentul utilizat a fost real-time PCR LightCycler 2.0.

Se pregătește ADN pentru fiecare dintre probe (concentrație sugerată de 5ng/μL). Dacă concentrația de ADN nu este cunoscutș atunci se face o diluție de 1:20 (10 μL ADN și 190 μL apă)

Se pipetează 5 μL de ADN diluat în fiecare capilar conform setării. (Pentru controalele negative se pipetează 5 μL apă RNAse/DNAse free. Volumul final va fi de 20 μL).

Protocol de amplificare

Condiții de amplificare utilizând mericon QIAGEN:

Investigarea prezenței speciei E. coli O157 în apă a fost efectuată prin metoda real-time PCR. Pentru aceasta au fost prelevate probe de apă (pentru care, prin tehnici de microbiologie nu s-a detectat prezența E. coli O157) și probe de apă fortificate E. coli O157 (în concentrații: 106, 108, 1010 CFU/mL).

Analiza probelor de apă

Pentru fiecare probă în parte s-a realizat extracția ADN a cărui concentrație și puritate a fost determinată cu ajutorul unui spectofotometru NanoDrop.

Detecția E. coli O157 prin real-time a fost realizată cu ajutorul echipamentului real-time PCR LightCycler 2.0 (Roche, Germania).

Probele investigate prin aceasta metodă se regăsesc în tabelul 1 și au fost lucrate în duplicat pentru confirmarea rezultatului. S-a folosit un control negativ pentru verificarea lipsei de contaminare și a corectitudinii reacției de amplificare. Ca proba de referință s-a ales proba cu ADN corespunzător apei din rețeaua de apă. Celelalte probe investigate au folosit ADN corespunzător apei contaminate cu cultura bacteriană de E. coli O157 (în concentrații: 106, 108, 1010 CFU/mL).

În figura următoare este prezentat graficul curbelor de amplificare pentru toate probele luate în lucru. La un anumit ciclu de amplificare, intensitatea fluorescenței depășeste semnificativ valoarea de bază, iar cinetica PCR intră în faza exponențială. Acest ciclu este denumit Ct (threshold cycle). Se poate observa faptul ca ADN bacterian extras din apa de rețea nu s-a amplificat – tabelul 4. Pentru probele analizate, rezultatele real-time PCR confirmă rezultatele microbiologice. Pentru proba țintă 4, cu concentrația cea mai crescută de agent patogen, curba de amplificare a intersectat linia treshold la ciclul de amplificare 21 (tabel 4, figura următoare), confirmând amplificarea cea mai rapidă, deci concentrația cea mai ridicată de ADN bacterian. Restul de probe cu concentrații bacteriene descrescătoare și-au intersectat curba de amplificare cu treshold la cicluri de amplificare crescătoare (figura următoare, tabel 4).

Tabel 4. Probele investigate prin real-time PCR și ciclurile de amplificare corespunzătoare.

Fig.12. Graficul de amplificare corespunzător probelor investigate prin tehnica real-time PCR

Rezultate și discuții

1. S-a analizat prin metoda Real-time PCR prezența E. coli O157.

2. Au fost investigate probe de referință constituite din probe de apă și 8 probe fortificate cu E. coli O157 în concentrații diferite.

3. Tehnica real time PCR a confirmat prezența E. coli O157 în probele investigate așa cum era de așteptat. Proba cu cea mai mare concentrație de bacterie a avut cea mai scazută valoare a Ct .

4. Valoarea Ct obținută pentru fiecare probă a fost invers proporțională cu concentrația bacteriei în proba cunoscută din analizele microbiologice, fapt ce a demonstrat prezența bacteriilor investigate în concentrațiile așteptate.

5. Limita de detecție a metodei Real Time PCR s-a situat în jurul valorii de 104 CFU/mL pentru E. coli O157.

Concluzii

În general, Escherichia coli nu poate supraviețui în afara tractului intestinal, prezența sa în probele din mediu, produse alimentare, sau apă indică, de obicei, o contaminare recentă cu fecale sau practici de salubritate săraci în instalațiile de prelucrare a produselor alimentare (Odonkor S.T:, Ampofo J.K.., 2013).

Calitatea microbiologică a apei potabile este o preocupare a consumatorilor, furnizorilor de apă, și a Autorității de Sănătate Publică deopotrivă. Potențialul apei potabile de a transporta agenți microbieni patogeni către un mare număr de oameni, cauzând boli ulterioare, este bine documentat în toate țările, indiferent de nivelul de dezvoltare economică (Odonkor S.T:, Ampofo J.K.., 2013).

În ceea ce privește obiectivul principal al dezinfecției, agentul patogen este ținta, iar patogenitatea este rezultatul semnificativ care trebuie atins. Odată patogenul moare sau este inactivat, siguranța microbiană este instalată. Luând dezinfecția UV ca un exemplu, UV are marele avantaj de inactiva eficient mulți agenți patogeni, inclusiv bacterii, virusuri și protozoare (Guo M., et al. 2011).

Se pare că emisia de UV la lungimi de undă cuprinse între 220 și 300 de nanometrii reduce rata procesului de fotoreparare a dimerilor apăruți în urma expunerii microorganismelor la UV.

Problema cea mai gravă o constituie mecanismul de reparare. Repararea daunelor produse de UV, în special prin fotoreactivare, este un dezavantaj major al dezinfecției UV, cu toate că această tehnologie este pe cale de a deveni o alternativă populară a dezinfecției cu clor (Guo M., et al. 2011).

Bibliografie

Adachi J.A., Ericsson C.D., Jiang Z.D., DuPont M.W., Pallegar S.R., DuPont H.L., Natural History of Enteroaggregative and Enterotoxigenic Escherichia coli Infection among US Travelers to Guadalajara, Mexico, 2002, The Journal of Infectious Diseases.

Aguiar A., Bainbridge D., Bond M., Gupta C., Matthews K., Plante J., Rantanen E., Turner C., Yang D., Zhang W., Modeling UV-damage to E.coli Bacteria, 1996, Recent IMA Preprints.

Aida V., Microbiologie specială, 2009, Universitatea “Dunărea de Jos” Galați.

Bogdan A.T., Țogoe I., Câmpeanu G., Ivana S., Enache T., Bărăităreanu S., Iudith I., Popescu A., Microbiologia alimentelor, 2011, Asclepius, Vol. 1.

Bogdan A.T., Țogoe I., Câmpeanu G., Ivana S., Enache T., Bărăităreanu S., Iudith I., Popescu A., Microbiologia alimentelor, 2011, Asclepius, Vol. 2.

Chifiriuc C., Mihăescu G., Lazăr V., Microbiologie și virologie medicală, 2011, Editura Universității din București.

Collignon P., Resistant Escherichia coli—We Are What We Eat, 2009, Clinical Infectious Diseases.

Dirk van Elsas J., Semenov A.V., Costa R., Trevors J.T., Survival of Escherichia coli in the environment: fundamental and public health aspects, 2011, Nature.

Guo M., Huang J., Huc H., Liu W., Yang J., UV inactivation and characteristics after photoreactivation of Escherichia coli with plasmid: Health safety concern about UV disinfection, 2011, Elsevier.

Hallmich C., Effect of pre- and post- UV disinfection conditions on photoreactivation of fecal coliforms from a physicochemical wastewater effluent, 2009, Department of Civil Engineering and Applied Mechanics McGill University.

Hijnen W.A.M., Beerendonk E.F., Medema G.J., Inactivation credit of UV radiation for

viruses, bacteria and protozoan (oo)cysts in water: a review, 2006, Elsevier.

Jagger J., PHOTOREACTIVATION, Biology Division.

Juneja V.K., Sofos J.N., Pathogens and Toxins in food-challenges and intervention, 2010, ASM Press.

Locas A., Demers J., Paymant P., Evaluation of photoreactivation of Escherichia coli and Enterococci after UV disinfection of municipal wastewater, 2008, Canadian Journal Of Microbiology.

Lukjancenko O., Wassenaar Trudy M., Ussery David W., Comparison of 61 Sequenced Escherichia coli Genomes, 2010, Springer.

Odonkor S.T:, Ampofo J.K., Escherichia coli as an indicator of bacteriological quality of water: an overview, 2013, Microbiology Research.

Oguma K., Katayama H, Ohgaki S., Photoreactivation of Escherichia coli after Low- or Medium-Pressure UV Disinfection Determined by an Endonuclease Sensitive Site Assay, 2002, Applied And Environmental Microbiology.

Paiva de Sousa C., Escherichia coli as a specialized bacterial pathogen, 2006, Revista De Biologia E Ciências Da Terra, Vol. 6.

Rasko D.A., Rosovitz M.J., Myers G.S.A., Mongodin E.F., Fricke W.F., Gajer P., Crabtree J., Sebaihia M., Thomson N.R., Chaudhuri R., Henderson I.R., Sperandio V., Ravel J., The Pangenome Structure of Escherichia coli: Comparative Genomic Analysis of E. coli Commensal and Pathogenic Isolates, 2008, JOURNAL OF BACTERIOLOGY.

Rompre A., Servais P., Baudart J., de-Roubin M.R., Laurent P., Detection and enumeration of coliforms in drinking water: current methods and emerging approaches, 2002, Elsevier, 31-54.

Thompson C.L., Sancar A., Photolyase/cryptochrome blue-light photoreceptors use photon energy to repair DNA and reset the circadian clock, 2002, Oncogene, 9043 – 9056.

Vincent C., Boerlin P., Daignault D., Dozois C.M., Dutil M., Galanakis C., Reid-Smith R.J., Tellier P.P., Tellis P.A., Ziebell K., Manges A.R., Food Reservoir for Escherichia coli Causing Urinary Tract Infections, 2010, Emerging Infectious Diseases.

Weintraub A., Enteroaggregative Escherichia coli: epidemiology, virulence and detection, 2007, Journal of Medical Microbiology, 4-8.

Xu L., Zhu G., The Roles of Several Residues of Escherichia coli DNA Photolyase in the Highly Efficient Photo-Repair of Cyclobutane Pyrimidine Dimers, 2010, Journal of Nucleic Acids.

Zimmer J.L., Slawson R.M., Potential Repair of Escherichia coli DNA following Exposure to UV Radiation from Both Medium- and Low-Pressure UV Sources Used in Drinking Water Treatment, 2002, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.

http://melpor.hubpages.com/hub/Understanding-The-E-Coli-Bacteria

http://genome.cshlp.org/content/12/4/640.long

http://utminers.utep.edu/rwebb/html/dna_repair__photoreactivation.html

http://utminers.utep.edu/rwebb/html/the_e__coli_genome.html

http://www.bacteriainphotos.com/Escherichia%20coli%20light%20microscopy.html

fineartamerica.com

http://msb.embopress.org/content/2/1/2006.0008