Fig.1.2.3 Schema stimulării electrice indirecte cu ajutorul nanoparticulelor piezoelectrice de GaN 10 [630483]

1 Ministerul Sănătății al Republicii Moldova Universitatea  de  Stat  de  Medicină  și Farmacie "Nicolae  Testemițanu" FACULTATEA  MEDICINĂ Catedra:  Anatomie  Topografică  și Chirurgie Operatorie TEZA  DE  DIPLOMĂ Aplicații ale elementelor nanostructurate de GaN în  regenerarea  tisulară. Autor:  Lîsîi  Corneliu,  anul  VI,  gr.  1601. Conducători științifici: dr.hab., prof.univ., Nacu Viorel. dr.hab., prof.univ., academician, Tighineanu Ion. Chișinău, 2014

2 Cuprins I. Introducere………………………………………………………………  3 1.1. Scop  și  obiective…………………………………………………  4 1.2. Actualități   în  utilizarea   nanostructurilor  pentru  stimularea  proliferării   celulare……………………………………………….5 II. Materiale   și  metode de cercetare……………………………………….  16 2.1. Referințe  la  studiu………………………………………………  16 2.2. Medii de cultură………………………………………………… 16 2.3. Culturi celulare ………………….………………………………17 2.4. Protocol de numărare  a  celulelor………………………………..21 2.5. Nanotehnologie………….………………………………………. 22 2.6. Protocol experimental…….……………………………………..  24 2.7. Studiu comparativ……….……………………………………….  26 III. Rezultate proprii  și  discuții…….……………………………………… 27 IV. Concluzii……………………….……………………………………… 32 V. Bibliografie…………………….……………………………………… 34

3 I. Introducere Cercetările   științifice  și aplicațiile tehnologice ale materialelor avansate nanostructurate au crescut  vertiginos  în  ultimele decenii. Interesul pentru dezvoltarea nanodispozitivelor biomedicale bazate pe materiale noi avansate este datorat evoluției și dezvoltării  Nanotehnologiei. Știință  tânără   care   a descoperit mecanisme și fenomene  noi  ce  au  loc  în  materialele  de  ordinul micro și nano, fenomene care au atras atenția unei comunități largi de  cercetători  din  diferite  domenii  și specialități: fizicieni, chimiști, biologi, ingineri, medici etc. Focusarea cercetărilor  în  domeniul aplicării   nanomaterialelor   în   medicină   a  facilitat dezvoltarea unei noi științe –Nanomedicina. Apariția ei a  fost  determinată  de  evoluția și transformarea medicinii contemporane într-un domeniu multidisciplinar bazat pe dovezi și care   necesită  utilizarea materialelor noi avansate tehnologic, care ar rezolva problemele actuale de tratament, diagnostic și profilaxie [21]. Nanomedicina este   definită  drept aplicarea   nanobiotehnologiei   în   medicină,  prin utilizarea nanoparticulelor și nanodispozitivelor   în   domeniul   îngrijirii  sănătății în  scop profilactic, diagnostic și terapeutic cu respectarea tuturor condițiilor de siguranță și criteriilor etice reglementate[21]. Nanotehnologia este definită  ca  înțelegerea și controlul materiei la dimensiuni de 1-100 nanometri [52]. Nanoparticulele prezintă   un   interes   înalt pentru   medicină deoarece sunt particule speciale care au dimensiuni comparabile cu ribozomii sau virușii, ceea  ce  le  oferă  din  start  proprietăți specifice avansate capabile de a acționa la nivel celular și molecular, aceste proprietăți fiind  păstrate  în  concentrații mici  datorită raportului suprafață/volum mare, asigurând astfel o biocompatibilitate accesibilă  clinic. Stimularea  diviziunii  celulare  este  importantă  deoarece  este  obiectul  de  studiu  al medicinei regenerative. În   prezent   amplificarea   ratei   de   diviziune   în   culturile  celulare  prin  diferite  metode  și  mecanisme  este  cercetată  intens [22]. În  prezent  sunt  utilizate   și   cercetate   celule   stem   de   diverse   origini   (embrionare,   mezenchimale,  induse   pluripotente   ,   derivate   din   sânge   și   cordon   ombilical   etc.),   dar   cele   mai

4 eficiente din   punct   de   vedere   practic   și   clinic   se   evidențiază   celulele   stem  mezenchimale(MSC)   și   celulele stem induse pluripotente (iPSC). Aceste celule nu declanșează  un  răspuns  imun,  sunt  accesibile,  nu  creează  probleme  etice,  dar  sunt  limitate din cauza numărului  de  celule care poate fi  obținut  de  la  un  pacient  și  datorită perioadei mari de timp necesar  pentru  a  obține  o  cantitate  de  celule  suficientă  pentru  a   fi   utilizată   clinic [29].   Problema   actuală   a   ingineriei   tisulare   se   rezumă   la  incapacitatea   metodelor   disponibile   de   a   obține   o   cantitate   mare  de  celule  in vitro într-un interval de timp scurt cu   scopul   de   stimula   regenerarea   tisulară   în   cazul  vreunei  patologii  sau  leziuni  specifice.  Acest  impediment  argumentează  intensificarea  cercetărilor   în   domeniul   regenerării   tisulare   cu   utilizarea   nanotehnologiilor   și  implementarea  lor  în  studii  clinice.  Noile  materiale  de  ordin  nanometric  cercetate  în  prezent dispun   de   un   potențial   enorm   în   domeniul   medicinei   prin   faptul   că  proprietățile  lor  specifice  și  dimensiunile  de  ordinul  nano  permit  intervenția  la  nivel  celular  și  molecular,  ceea  ce  corespunde  cu  statul actual al medicinei- «Medicina  bazată  pe  dovezi». 1.1. Scop și obiective Scopul  acestei  lucrări  este  de  a  cerceta  efectele  nanoparticulelor  de  nitrid de galiu (GaN) asupra culturilor celulare in vitro, de a testa biocompatibilitatea materialului și posibila  utilizare   în  medicina  regenerativă. 1. Analiza   bibliografică   a   temei   ”Aplicații  ale  elementelor  nanostructurate de GaN  în  medicina  regenerativă”. 2. Studierea   particularităților  procesului de   obținere   a   nanoparticulelor   de  GaN. 3. Aprecierea efectului piezoelectric asupra culturilor celulare sub  influența  undelor  acustice  de  frecvență  înaltă. 4. Stabilirea ratei de   diviziune   după inducția  efectului piezoelectric al nanoparticulelor de GaN în  culturile  de  celule  stem.

5 1.2. Actualități  în  utilizarea  nanostructurilor  în  stimularea proliferării  celulare. În   ultimii   decenii,   cercetările   în   domeniul   nanotehnologiei   au   crescut  exponențial, depășind 350,000 publicații conform ISI Web of Science. Progresele nanotehnologiei au determinat studierea noilor materiale și cercetarea  lor  în  studii  biologice și clinice [52]. Aceste progrese sunt fundamentate de proprietățile speciale ale   nanostructurilor,   cea   mai   importantă   fiind   raportul  suprafață/volum mare. Materialele nanostructurate sunt ușor aplicabile  în  medicină  și biologie, deoarece la baza vieții celulare sunt procesele biochimice de ordinul nanometric, la acest nivel materialele nanostructurate interacționează ușor cu celulele, biomoleculele și oferă  astfel un spectru larg de aplicații, care în  prezent necesită  a  fi  minuțios cercetate și analizate pentru a determina care sunt mecanismele lor de acțiune, precum și ce efecte negative posedă pe  termen  scurt  sau  lung  în  sistemele biologice. Nanotehnologia  utilizează  nanostructuri  și  nanodispozitive de dimensiuni de la 1 nanometru până   la   câteva   sute   de   nanometri. Materialul nativ din care sunt confecționate nanostructurile este   produs   prin   metode   chimice   și   fizice   foarte  specifice.  Aceasta  permite  de  a  asigura  un  control  riguros  în  sinteza  moleculară  și  asamblarea   lor   finală. Astfel   nanomaterialele   sunt   înalt   funcționale   și   datorită  dimensiunile   lor   favorizează  interacțiunea specifică  cu  celulele  și  țesuturile  la  nivel  molecular. Prin aceasta ele permit integrarea nanotehnologiei cu fiziologia   și  medicina   la   un   nivel   care   până în   prezent  nu  a  fost  posibil  [39]. Componentul indispensabil   al   unui   țesut   este   mediul   extracelular.   În   acest   mediu   sunt   incluse:  matricea  extracelulară,  celule  de  diferită  origine,  proteine  și molecule solubile, factori specifici  de  creștere  și  interacțiune  celulară.  Matricea  extracelulară  este  compusă  de  o  diversitate de molecule precum glicoproteide,   colagen,   glicozaminoglicani   și  proteoglicani, aceste molecule au dimensiuni de câteva sute  de  nanometri.  Funcția  lor este  de  oferi  un  suport  structural  pentru  creșterea  celulelor  și  definirea  morfologică  a  țesutului.  Totodată  diferite  structuri  speciale  cu  dimensiuni  nanometrice: desmozomi,

6 canale intercelulare, fibronectina etc.,   stimulează   și   determină   funcții   celulare importante   precum   adeziunea,   migrarea,   proliferarea   și   diferențierea.  Din   această  cauză cercetările   capabile   să   elucideze   mecanismele   fundamentale   ce   determină  interacțiunile   biologice   și   fizice   dintre   celule   și   mediul   extracelular   asigură  dezvoltarea și   progresele   științifice   în   cadrul   Medicinei   Regenerative (fig.1.2.1.) [48,19].
Fig.1.2.1 Concept general al medicinei regenerative [44]. Medicina regenerativă  este  un  domeniu  multidisciplinar  care  are  obiectivele  de  a   restabili,   a   menține   și   a  stimula  regenerarea  țesuturilor  și  organelor cu ajutorul ingineriei tisulare.  Regenerarea  tisulară  este  realizată  prin  combinarea  celulelor  vii  ce  vor   realiza   funcția   biologică   cu   matricea   ce   va   servi   suport pentru proliferarea

7 celulelor.  În  prezent  medicina  regenerativă  propune  noi  metode  în  cazul  a  numeroase  maladii actuale. Sunt  studiate  maladii  cărora  opțiunile  terapeutice  clasice  nu  le  oferă  o   soluție   definitivă,   patologii precum   infarct   de   miocard,   osteoporoză,   maladia  Parkinson, Alzheimer, traumatisme  osoase,  leziuni  spinale  și  cerebrale, etc. Acestea sunt  maladii  care  pot  fi  rezolvate  doar  prin  producerea  de  țesut  de  novo sau prin stimularea  regenerării  endogene.  Însă  progresele  actuale  sugerează  că  aceste maladii ar fi posibil de tratat prin metode și tehnici pe  care  medicina  regenerativă  le  studiază  în   prezent.  Perspectiva   actuală   a   medicinei   de   regenera   țesutul   distrus   sau  nefuncțional   are   la   bază   substituirea   matricei   biologice   cu   una   artificială   care   să  stimuleze   aderarea   și   proliferarea   celulelor   pe   substrat   și   să   determine   calea   de  diferențiere  în  direcția  țesutului  necesar  pentru a fi restabilit [19]. Ingineria  tisulară  cercetează  aplicarea  noilor  materiale  sintetice  prin  colaborare  cu  nanobiotehnologia,  deoarece   celulele   ce   măsoară   zeci   de   micrometri   interacționează   cu   matricea  extracelulară   care   este   compusă   din   molecule   de   zeci   și   sute   de   nanometri.  Nanotehnologiile   sub   formă   de   nanostructuri   și   nanodispozitive  sunt  modele  ideale  pentru   suprafețe   și   structuri   care   mimează  mediul  extracelular, astfel ele pot oferi soluții  adecvate  de  integrare  și  interacțiune  ale  celulelor  cu  matricea  extracelulară  la  nivelul  molecular  și  funcțional,  în  cadrul  obiectivelor  de  studii  ale  ingineriei  tisulare [31]. În   Medicina   regenerativă   sunt  cercetate  și  implementate nanotehnologii sub formă   de  nanoparticule,  nanofibre  și  nanodispozitive.  Nanoparticulele sunt utilizate pentru   transportul   specific   și   controlat   de   factori   de   creștere,   medicamente   și  molecule  de  ADN  în  țesuturi.  Nanofibrele  sunt  utilizate  pentru  producția  de  matrice  tisulară  și  pentru  a  modifica  suprafața  materialelor  implantate.  Nanodispozitivele  sunt  cercetate pentru rolul de biosenzori ai  proceselor  fiziologice  și  patologice  în  corpul  uman [45].

8 Fig.1.2.2 Matrice de nano polimer PCL (A), cultivată  cu  mioblaști (B) [18]. Celulele stem adulte, embrionare, stem induse, sau   provenite   din   sânge  ombilical,   sunt   capabile   să   genereze   diferite   tipuri   de   celule   pentru   utilizare  terapeutică.  Celule  diferențiate  din  aceste  celule  stem  sunt  utilizate  pentru  tratamentul  diverselor patologii degenerative sau genetice precum: leziuni spinale, osteoporoza, tulburări  hematologice și  imune,  insuficiența  cardiacă,  ciroza  hepatică, diabet, artrite, combustii,  maladia  Parkinson  și  Alzheimer,  infarctul  de  miocard.  Celulele  stem  au  revoluționat   medicină   regenerativă   și   a   oferit   perspective   clinice reale ingineriei tisulare.  Ele  oferă  o  sursă  adecvată  de  materie  primă  prin  faptul  că  pot  fi  diferențiate  în   toate   tipurile   de   celule   necesare   pentru  a  reconstrui  diverse  tipuri  de  țesuturi  biologice (conjunctiv, epitelial, osos, muscular, cardiac, neural) [35]. Aceste celule stem  sunt  obținute  din  diverse  surse,  și cultivate  în  condiții  specifice  in vitro până  este  obținut   un   număr   suficient   de   celule  capabile  să  ofere  un  răspuns  clinic  adecvat.  Ulterior sunt combinate cu o matrice   biologică   sau   artificială,  pentru a realiza diferențierea   în   tipul   de   celule   necesar sunt   utilizați   factori   specifici  de   creștere (fig.1.2.2). Astfel este dezvoltat un model artificial analogic structurii naturale necesare a fi reparate sau substituite, ulterior structura obținută   este   cultivată   în  bioreactoare   pentru   a  asigura  interacțiunea  biologică  dintre  matrice  și  celule,  după

9 care  este  implantată  în  regiunea  țesutului  lezat (fig.2.1). Pentru  diferențierea  specifică  a   celulelor   stem   sunt   utilizați   factori   de   creștere   specifici, medicamente, gene, secvențe   de   peptide   (ex.   Arg-Gly-Asp), proteine, nanoparticule. Bioreactoarele asigură  condițiile  fizice  analogice  sistemelor biologice necesare, iar mediul artificial creat poate   fi   controlat   și   modificat   în   dependență   de   parametrii necesari [34]. Creșterea   și   expansiunea   celulelor   stem   necesită   o  eficiență  și  un  randament  înalt  pentru   ca   procesul   de   regenerare   să   fi   efectiv.   Problemele   actuale   care   vizează  regenerarea in vitro includ izolarea celulelor stem de la pacient, proliferarea lor in vitro și  perioada  mare  timp  necesară  proliferării  celulare  până la implantarea lor la pacient [28]. Cercetările   în   domeniu   demonstrează   că   în  organism se regăsesc celule capabile  să  regenereze  într-o  anumită  măsură  orice  țesut,  însă  în  cazul  apariției  unei  leziuni aceste celule sunt insuficiente sau nu sunt activate pentru a-și  realiza  funcția [30].  În  acest  context  este  definită o altă  strategie pentru regenerarea tisulară,  aceasta  prevede   utilizarea   de   materiale   avansate   care   să   emită   semnale   celulelor   stem  endogene  și să stimuleze  proliferarea  lor  în  regiunea  țesutului  lezat.  Celule  primesc  semnale biologice pentru a migra la locul leziunii, iar semnale artificiale emise stimulează  diviziunea  lor  și  realizează  o  regenerarea  tisulară  semnificativă. Un model al  acestei  strategii  este  plasma  îmbogățită  cu  trombocite,  aplicată  de  Whithman  în  1997. Acesta reprezintă   un   gel   extras   din   plasma   pacientului   împreună   cu  trombocitele (Gel Tombocitar). El conține  în  cantități  mari  fibrină  și  mulți  factori  de  creștere,   care   stimulează   regenerarea  endoteliului, epitermalului,   intensifică  angiogeneza,  sinteza  de  colagen  și  osteogeneza,  are  proprietăți  hemostatice  puternice  și   un   efect   antimicrobial.   Acest   produs   este   aplicat   în   diverse   domenii   precum  chirurgie oromaxilofacială,   vasculară,   în   combustii   și   cicatrici   postoperatorii,   în  fracturi neconsolidate, etc. [33,51]. Sursa  de  celule  stem  pentru  regenerarea  tisulară  se limitează  la aplicarea lor la liniile celulare ce provin din aceeași foiță  embrionară  din  care  derivă  celule  stem.  Din

10 această  cauză  sunt  intens  cercetate celulele  stem  multipotente,  care  sunt  capabile  să  genereze toate liniile celulare ale organismului. Sunt 2 tipuri de celule stem pluripotente:   embrionare   și   induse   pluripotente   (induced   Pluripotent   Stem   Cell- iPSC).   În   prezent   ambele   tipuri   implică   limite   în   utilizare,   cele   embrionare  declanșează   un   răspuns   imun   și   sunt   criticate  din  considerente  bioetice, iar iPSC prezintă  dificultăți  izolare și  necesită  o  perioadă  mare pentru proliferarea lor in vitro. Însă   iPSC  sunt  capabile  să  genereze  toate  liniile  celulare  fără  a  declanșa  răspuns  imun,   din   această   cauză  sunt cele mai studiate   în  prezent  și  oferă  cea  mai   bună  perspectivă  de  viitor  în  implementarea  lor  în  regenerarea  tisulară [42]. Celule stem adulte   provenite   din   măduva   osoasă   hematogenă,   sunt   cele mai utilizate clinic la moment,  deoarece  sunt  accesibile  la  orice  pacient,  nu  declanșează  răspuns  imun  și nu necesită   metode  laborioase  de  cultivare.  Totodată ele sunt  limitate  la  linia  celulară  mezenchimală,  astfel sunt   capabile   sa   genereze   doar   țesut   osos,   cartilaginos,  conjunctiv și adipos.   Totodată  aplicarea lor clinică   este   eficientă în   fracturi,  osteoporoză,  etc. [36]. Studiile   în   domeniul   regenerării   tisulare   confirmă   faptul   că   celulele   stem  mezenchimale   sunt   responsabile   de   restabilirea   țesuturilor  cu originea din aceeași foiță  embrionară.  Însă  implantarea  de  celule  stem  multipotente alogene împreună  cu  produse biologice, precum gel trombocitar, de asemenea stimulează   proliferarea  celulelor in vivo și  ameliorează  restabilirea  țesutului.  Suplimentarea  cu  biomateriale  acționează  în  calitate  de  suport  biologic  pentru  celulele  stem,  deoarece  dezvoltă  o  ”nișă”   în   care   concentrația   factorilor   de   creștere  este  cea  mai  mare  și  stimulează  proliferarea   celulară.   Însă   calitatea   regenerării   tisulare  mai este   influențată  și de condițiile  biologice  ale  organismului:  vârsta,  sexul,  patologii asociate [38]. Aspirații actuale   în   ingineria   tisulară   și   terapiile   celulare  sunt focusate pentru a elabora o matrice   artificială biocompatibilă,  accesibilă  și  capabilă  să  interacționeze  biologic  și  funcțional   cu   celulele   stem.   În   acest   context   sunt   cercetate   și   implementate noi materiale elaborate prin nanotehnologie. Sunt  cercetate  structuri  ale  căror  suprafețe

11 sunt modificate la nivel nanometric,  și pot fi utilizate pentru celule stem embrionare [27], mezenchimale [49,15], hematopoietice [12,13]. Sunt importante dimensiunile nanoparticulelor. Un studiu care cercetează influența  dimensiunilor  nanotuburilor  de  TiO2  asupra  viabilității  celulare  a  determinat  că  lungimea nanostructurilor de 15-30 nm   asigură  o   interacțiune  optimă   pentru   conexiunile   cu   integrina,  este stimulată proliferarea,   migrarea   și   diferențierea   în   linii   osteogene. Nanoparticulele cu dimensiuni  mai  mari  de  50  nm  afectează  proliferarea  celulară  și  diminuează  aderența  lor la substrat. Iar dimensiunile mai mari de 100nm intensifică apoptoza celulelor [37]. Nanotehnologia se dezvoltă rapid   în   domeniul   imagisticii   moleculare,  în  controlul  molecular  al  proliferării  și  diferențierii  celulelor stem. Ferreira a demonstrat utilizarea  eficientă  a  nanomaterialelor în  etichetarea  celulelor  stem,  urmărirea  lor,  în  genoterapie,  diferențierea  și  transplantarea  celulelor  stem.  Au  demonstrat  potențialul  citotoxic al nanoparticulelor  în  aceste  culturi  celulare[20]. În  pofida  faptului  că  sunt  realizate un număr  mare  de  cercetări  diverse  pentru implementarea nanotehnologiilor în   ingineria   tisulară,   totuși   nu  sunt elucidate deplin mecanismele de   interacțiune,  influență  și  metabolizare  a  nanomaterialelor  în  culturile  de  celule  [50].  Dar  cercetările  recente   în   bioingineria   cordului   cu   implicarea   nanostructurilor   demonstrează  că  interacțiunea  celule stem-nanoparticule are   efecte   regeneratoare,   diminuează  dimensiunea   și   gradul   fibrozei   în   cicatricele   post   infarct,   măresc   viabilitatea  miocardului,   influențează   pozitiv   remodelarea   miocardului,   stimulează   funcția  ventriculară   și   diastolică,   totodată   induce   efecte   paracrine   locale   [6]. Sinteza nanoparticulelor  pentru  medicina  regenerativă  este  focusată astăzi  pe  dezvoltarea  și  stabilirea unor sisteme de livrarea: a materialului genetic, biomoleculelor, proteinelor morfogenetice,  concomitent  sunt  cercetate  și  dezvoltate matrice 3D bioactive pentru ingineria   tisulară.   Pentru   sistemele   de   livrare   sunt   sintetizate:   microsfere,   lipozomi,  microcapsule,   dendrimeri   și   micelii, ele sunt create din nanomateriale prin

12 nanomanipulare,   autoasamblare   moleculară,   bioagregare   și   modelare   fotochimică [3,4]. Matrice   artificiale   create   astăzi   pentru   ingineria   tisulară   reprezintă   construcții  3D  care  sunt  capabile  să  imite  structura  țesutului  necesar  de a fi substituit sau reparat. Aceste matrice au  o  structură  poroasă,  sunt  biodegradabile  și  reprezintă  un  micro mediu ce   favorizează colonizarea   și   proliferarea   celulară.   Progresele   actuale   în  nanobiotehnologii   dezvoltă   nanofibre   capabile   să   asambleze   astfel   de  matrice artificiale   pentru   regenerarea   tisulară.   Nanofibrele   substituie   cu   succes   matricea  extracelulară   din   cauza   suprafeței mari de contact cu celulele, ele   stimulează  colonizarea   și   diferențierea   celulară.   Totodată   este   îmbunătățită   schimbul   de  substanțe   nutritive   și   metaboliți   între   matrice   și   mediul   extern.   Cercetările  demonstrează  că  matricele  3D  sunt  mai  bine  organizate  în  comparație  cu  matricele  2D  în  sistemele  celulare  bazate  pe  măduvă  osoasă [17].  O  perspectivă  actuală  de  a  obține  o  matrice  3D  biologică  este  decelularizarea  țesutului.  Modelarea  unor  sisteme  hibride   bazate   pe   astfel   de   biomatrice   în   combinare   cu   nanostructuri   ameliorează  proprietățile   electrofiziologice,   propune   un   potențial   electric  mare  și  o  interacțiune  mai   bună   cu   cardiomiocitele   rezidente   în   cazul   ingineriei   tisulare   a   infarctului   de  miocard [6]. Nanoparticulele își asigură  prezența sa în  viitorul  regenerării  tisulare prin   noi   fenomene   pe   care   le   demonstrează   în  interacțiunea lor cu celulele. Nanoparticulele interacționează diferit cu celule distincte, influențând pozitiv cât și negativ anumite culturi celulare- nanotuburile de carbon favorizează aderarea osteoblastelor, dar în  același timp   ele   diminuează   aderarea   fibroblastelor,  condrocitelor, miocitelor și macrofagelor[46].   Un   alt   exemplu   în   domeniu   sunt  suprafețele cu   topografie   nanostructurată   de   ZnO  și TiO, care   stimulează  mineralizarea și măresc   viabilitatea   osteoblastelor,  iar viabilitatea fibroblastelor și endoteliocitelor este diminuată [7]. În   această   lucrare   abordăm   nanoparticule   care   posedă   efectul  piezoelectric.  Efectul piezoelectric este capacitatea unui material de a genera electricitate atunci

13 când este   stresat   mecanic.   Această   proprietate realizată   la  nivel  nanometric  poate genera biocurenți   la   nivel   celular, pe suprafața celulei sau citoplasmatic. Curenții  electrici citoplasmatici influențează metabolismul   celular,     în   special   celulele  excitabile electric precum neuronii sau celulele musculare [7].Nanotehnologiile cu efect piezoelectric în   viitorul   apropiat   vor   avea   un   impact   mare   în   tratamentul  maladiilor.  Ele  au  un  potențial  înalt  în  tratamentul leziunilor traumatice, degenerative, neoplazice care sunt dificile de tratat prin metode medicale clasice. Un mare interes prezintă  posibilitatea  de  a  crea  o  interfață  între  nanostructuri  și  celule  electric  active  (neuroni, miocite). Un exemplu sunt aplicații  ale  nanotuburilor  de  carbon  în  domeniul  ingineriei   tisulare   a   țesutului   nervos,   unde   au   demonstrat   o   ameliorare   a   funcției  electrice  a  celulelor  nervoase,  au  stimulat  creșterea  lor,  și  au  favorizat  organizarea  rețelelor   neuronale.   Alte   cercetări   de asemenea   demonstrează   capacitățile  nanotuburilor   de   a   susține   și   a   stimula  activitatea electrică   neuronală   în   culturi  celulare.  Însă  mecanismul  prin  care  aceste  nanostructuri  acționează  încă  nu  este  pe  deplin   elucidat.   Prin   utilizarea   tehnicilor   de   înregistrare   a   potențialelor  electrofiziologice ale unei singure celule,   microscopia   electronică   a  evidențiat   că  nanotuburile   piezoelectrice   ameliorează   excitabilitatea   neuronală   prin   formarea   a  contactelor   membranoase   intercelulare.   Totodată   în   culturile   celulare aceste nanotuburi   stimulează   activitatea   electrică   neuronală   prin   îmbunătățirea   circuitului  între  regiunile  distale  și  proximale  ale  neuronului [5]. Stimularea  electrică  ca  stimul  artificial  în  structurile  neurale  a  găsit  o  aplicare  vastă  în  clinică  și în  cercetările  in vitro.  Există  diverse  tehnici  pentru  a  acționa  cu  potențiale electrice localizate pentru a   activa   diverse   structuri   nervoase.   Însă  majoritatea  acestor  metode  sunt  invazive  și  duc  cu  sine  un  risc  mare  de  efecte  adverse  [23]. Aceste tehnici   prevăd   amplasarea   sau   atașarea  unui  electrod  în  regiunea  sau țesutul   necesar,   la   electrod   este   atașat   un   fir   care   este   conectat  la un dispozitiv electronic care   generează   impulsuri   electrice   necesare   [1,2]. Aceste sisteme au dezavantajul de a contacta direct   cu   țesutul   la   interfața   electrod/țesut   și   apar

14 complicații  în  urma  abordului  percutan.  Nanoparticulele  piezoelectrice  sub  acțiunea  undelor  acustice  externe,  se  deformează  și  produc  un  potențial  electric [32]. Studiile recente in vitro demonstrează  posibilitatea  inducerii  stimulării  electrice  indirecte  cu  ajutorul nanoparticulelor piezoelectrice   de   nitrid   de   bor   (BN).   Această   metodă   a  demonstrat   că   stimulează   proliferarea   și   activitatea   electrică   în   culturile   celulare  neuronale in vitro [16]. Nanoparticule  de  GaN  reprezintă  sisteme excelente, deoarece capacitatea piezoelectrică este la un nivel mult mai mare decât în sistemele piezoelectrice   polimerice   și   sunt   comparabile   cu  cele  generate  de  semiconductorii  wurtzite [14,32]. În  culturile  celulare  nanoparticulele  sunt  internalizate  în  citoplasma  celulară.   Stimulare   cu   ultrasunet   a   mediului  extracelular   provoacă   apariția   prin  intermediul   efectului   piezoelectric   de   biocurenți   intracelulari   de intensitate   mică  fig.1.2.3.[10].   Karl   H   Shoenbach   și   coautorii  demonstrează   că   impulsuri   electrice  scurte  și  ultrascurte pot  stimula  sau  inhiba  metabolismul  celular,  în  citoplasmă  apar  modificări  ale  proteinelor,  apar  micropori  în  membrana  celulei  și  a  nucleului,  și  este  modificat metabolismul calciului intracelular. Efectele acestor impulsuri electrice pot stimula   regenerarea   tisulară,  totodată prin amplificarea parametrilor pot   influența negativ asupra  țesuturilor  neoplazice[26]. Pentru o  administrare  eficientă  a  nanoparticulelor  în  sistemele  biologice, spre exemplu  în  culturi celulare, este necesar a obține o soluție apoasă  stabilă  și omogenă  de  nanoparticule.  În  cazul  nanoparticulelor  hidrofile  este  suficientă  dizolvarea  lor  în  mediul nutritiv și sonicarea lor în  ultrasunet. Însă  particulele  hidrofobe formează  o  suspensie  coloidală  datorită  interfeței solid-lichid, ce împiedică dizolvare  în  soluții și captarea  lor  de  către  celule.  Pentru  a le dizolva este necesar a obține o suprafață hidrofilă, pentru aceasta este  necesară  tratarea  lor, cu scopul de a realiza dispersia nanoparticulelor în  soluții apoase. Aceasta poate fi realizat cu utilizarea detergenților acizi sau neutri. Procesul de solubilizare a nanoparticulelor  se  manifestă  prin  atașarea moleculelor amfifile cu polul hidrofob la suprafața hidrofobă  a particulelor,  capătul  hidrofil rămâne la exterior, astfel se micșorează forțele Wan der Vaals dintre particule

15 și le   stabilizează   în  soluție [8]. Gradul de stabilitate în  soluție este determinat de potențialul Zeta, iar distribuția nanoparticulelor   în  soluție poate   fi   cercetată   cu  ajutorul unui analizator de particule submicronice. Pentru  a  utiliza  nanoparticulele  în  culturi celulare și pentru a realiza un efect metabolic este necesar ca ele să  poată  fi  internalizate de celule prin canale   membranare   sau   prin   endocitoză,  iar  pentru  a  asigura aceasta este important ca ele   să   fie   dispersate   uniform   în  mediul  nutritiv  utilizat.  Pentru  o  dispersie  uniformă  a  nanoparticulelor  în  soluție și pentru a anticipa precipitarea lor sunt utilizați diferiți agenți de solubilizare și surfactanți: solvenți (polietilenglicoli, PEG8k, PEG12k, alcool polivinilic), detergenți (SDS, Tryton-X, Arabic Gum), polimeri (poli l-lizină,  glicol-citosan), dendrimeri (poliamidoamidă). În  soluție   nanoparticulele  rămân stabile   până   la   câteva   săptămâni,   însă   stabilitatea dispersiei  coloidale  variază mult în  dependență de agentul de solubilizare folosit și materialul nanoparticulelor, [9,47,40,24].
Fig.1.2.3 Schema   stimulării   electrice   indirecte   cu   ajutorul   nanoparticulelor piezoelectrice de GaN [10]

16 II. Materiale și metode 2.1 Referințe la studiu Studiul a fost realizat în  laboratorul  de  Inginerie  tisulară  și culturi celulare (LITCC)  condus  de  către  Domnul  Profesor  Nacu  Viorel, în  baza  Centrului  Național de Studiu și Testare  a  Materialelor  condus  de  către  Domnul  Profesor  Tighineanu  Ion  și în  colaborare  cu  departamentul  de  Inginerie  Tisulară  din  cadrul  LEBAO  MHH  Hannover,  condus  de  către  Domnul  Profesor  Andres  Hilfiker. Materialele  utilizate  în  studiu au fost achiziționate în  cadrul  grantului  nr.266515  (FP7  Mold-Era). 2.2  Mediile  de  cultură Pentru culturile celulare de celule progenitoare de endoteliocite (CPE) am folosit 2 tipuri de medii, mediul EGM-2 Bulletkit (Lonza cat. nr. C2517A) a fost utilizat pentru izolarea și obținerea unei populații omogene de CPE, mediul EBM-2 (Lonza cat. nr. CC-3156) a fost folosit pentru lotul experimental. Mediul EGM-2 este un   mediu   selectiv   și   este  destinat special pentru izolarea și stimularea proliferării  CPE,   el   conține  suplimente speciale adaptate pentru culturile celulare endoteliale : hEGF, hidrocortizon, gentamicin, ser bovin fetal, VEGF, hFGF-B, IGF, acid ascorbic,   heparină.   Mediul   EBM-2   reprezintă   un   mediu   bazal   destinat   pentru  menținerea culturilor celulare secundare de   CPE,   el   oferă   elementele   nutritive  esențiale supraviețuirii unei culturi celulare de CPE și nu conține factori de creștere pentru  stimularea  proliferării celulelor progenitoare de endoteliocite.

17 2.3 Culturi celulare În  acest  studiu  au  fost  utilizate  culturi  de  celule  progenitoare  de  endoteliocite,  culturile primare au fost obținute conform uni protocol standard de izolare a CPE din aortă ovină. Din   aortă  se  detașează mecanic intima vasculară,  ea  se  prezintă  ca  un  concentrat celular, apoi este  diluat  într-o soluție tampon  de  PBS  într-o  eprubetă  de  15  ml.   Suspensia   este   omogenizată  și centrifugată   la  400g 5min. Supernatantul este decantat,   iar   precipitatul   este   resuspendat   în  5ml de mediu EGM-2. Suspensia celulară  obținută este  plasată  într-un flacon pentru culturi celulare T75 (NUNC) în  incubator   la  37˚C și 5% CO2. La fiecare 72h ore a fost schimbat mediul EGM-2, culturile primare au fost crescute până la confluența de  80%,  după  care  am  efectuat  pasaje  1:2  în  flacoane  T25  pentru  subcultivarea  culturii  până la obținerea numărului  necesar  de  celule  în  experiment.  Pasajele celulelor am efectuat cu o soluție de  tripsină  0,25% și EDTA 0,5mM. Celule au fost monitorizate la microscopul inventat cu contrast   de   fază   pentru   a   atesta  morfologia specială  „cobblestone” a celulelor endoteliale. De asemenea am analizat culturile de progenitoare de endoteliocite la microscopul electronic prin scanare (fig.2.3.5, fig.2.3.6). Pentru confirmarea identității celulelor am folosit protocolul standard de identificare a antigenilor specifici (Ag) cu ajutorul anticorpilor monoclonali (Ac) caracteristici pentru liniile celulare de progenitoare de endoteliocite: Ac antiVE-Cadherin (CD144) (fig.2.3.1), Ac anti eNOS(fig.2.3.3), Ac anti-factor von Willebrand (CD42) (fig.2.3.4) și Ac anti CD31(fig.2.3.2). De asemenea, pentru evidențierea nucleului  a  fost  efectuată  si  colorarea  cu  fluorescentul  DAPI  (4,6-difenil-2-aminoindol). Identificarea   a   fost   realizată   cu   ajutorul   microscopului   confocal  invertat Zeiss LSM 510. Imaginile au fost prelucrate cu ajutorul programului Axiovison LE, cu care am evidențiat răspunsul  pozitivi la anticorpii monoclonali selectați.

18 Fig.2.3.1. Evidențierea Ag CD144(cyan), nucleul celulei (roșu),obiectiv- 20x
Fig. 2.3.2. Evidențierea AgCD31(verde), nucleul celulei (roșu),obiectiv- 20x

19 Fig.2.3.3.  Evidențierea  Ag  eNOS(albastru),  nucleul  celulei  (roșu),  obiectiv- 20x
Fig.2.3.4.  Evidențierea  Ag  CD42(verde),  nucleul  celulei  (roșu),  obiectiv- 20x

20 Fig.2.3.5.  CPE  pe  suprafață  nanostructurată.  SEM.
Fig. 2.3.6 Cultură  de  CPE  pe  suprafața  nanostructurată.  SEM.

21 2.4.  Protocolul  de  numărare  a  celulelor  și testul de viabilitate Pentru a determina care este  rata  de  proliferare  a  celulelor,  a  fost  efectuată  numărarea   celulelor și a   fost   verificată   viabilitatea   lor după  influența efectului piezoelectric ale nanostructurilor. Celulele au fost detașate de la baza godeurilor cu ajutorul soluției de  tripsină  0,25%  și EDTA  0,5mM  timp  de  5  min  la  37˚C.  După  ce  s-a verificat detașarea tuturor   celulelor   la   microscopul  invertat  cu  contrast  de  fază,  tripsina   a   fost   inactivată   cu   mediu   nutritiv   ce  conținea FBS 20%,   în   cantitatea  necesară  de  a  asigura  un  raport  mediu/tripsină- 1:2, astfel s-a obținut o suspensie celulară.  20µl  de  suspensie  celulară  a  fost  diluată  cu  soluție de  trypan  blue  10%    în  raport  1:20,  după  care  au  fost  numărate  în  camera  Goreeav.  A  fost  stabilit  numărul  celulelor și procentajul celulelor viabile. De asemenea pentru   numărarea  și viabilitatea   celulelor   a   fost   utilizat   alternativ  dispozitivul  electronic  de  numărarea  a  celulelor  CASY.  Acest  dispozitiv  are  capacitatea  de  a  număra  celulele  în  soluție și de a verifica viabilitatea lor automat   în   baza  diferenței de potențial electric al celulei (fig.2.4.1).
Fig.2.4.1 Principiul de lucru al aparatului Casy.[25]

22
2.5. Nanotehnologie Nanoparticulele   de   GaN   au   fost   produse   prin   metoda   decapării  fotoelectrochimice (PEC) în  soluție de 0,1M de KOH la temperatura de 300K, cu agitarea   fină   a  soluției.   În  același timp   proba   a   fost   iradiată   cu   raze   ultraviolete,  generate  de  o  lampă  cu  vapori  de  mercur  cu  puterea  de  350W.  Nanostructurile de GaN crescute pe safir au fost vizualizate la microscopul electronic cu scanare (SEM) (fig.2.5.1.). Ulterior placa de safir cu nanofire de GaN (fig2.5.2) este sterilizată și introdusă  într-o eprubetă   sterilă   cu 5 ml de mediu   de   cultură   EBM-2, eprubeta este supusă ultrasunetului timp de 20min. Dispozitivul utilizat pentru baia cu ultrasunet este Bandelin Sonorex cu puterea 120W și frecvența 35khz. Nanoparticulele de GaN se rup de pe suportul de safir și în  așa mod obținem o  suspensie  de  nanoparticule  în  mediu  de  cultură.  Această  suspensie  este  sterilă  și poate  fi  utilizată  pentru  aplicații cu culturi celulare. Pentru a confirma prezența nanoparticulelor  în  soluție,  plăcile  de  safir  au  fost  analizate la microscopul electronic prin scanare (SEM), lipsa nanoparticulelor de GaN   argumentează  detașarea lor cu succes și prezența lor   în   mediul   nutritiv (fig2.5.3).   În  corelație cu  defectele  rămase  pe  placă în  urma  detașării  s-a calculat densitatea nanostructurilor- 5*108/cm2, concentrația în  soluția a  fost  stabilită  pentru  a  respecta raportul nanoparticule/celule 1000:1. Fig.2.5.1. Nanoparticule de GaN produse prin metoda PEC. SEM.

23 Fig.2.5.2. Nanoparticule  atașate la placa de GaN. SEM.
Fig.2.5.3.  Placa  de  GaN  după  tratarea  în  baia  cu  ultrasunet,  nanoparticulele lipsesc. SEM.

24 2.6. Protocol experimental: Determinare efectului piezoelectric al suspensiei de nanoparticule de  GaN  în  culturi  de  celule  progenitoare  de  endoteliocite Celule  progenitoare  de  endoteliocite  din  linia  celulară  obținută anterior au fost cultivate  în  cutii  cu  96  de  godeuri  (BIOFIL).  În  experiment  s-au utilizat 4 loturi: 1. un lot experimental pentru a determina influențele   efectului   piezoelectric al nanoparticulelor   în   proliferarea   celulară,   în   mediul   nutritiv  erau prezente nanoparticule, care au fost influențate  cu  ultrasunet (fig.2.6.1); 2. un lot experimental care a avut obiectivul de cerceta efectele nanoparticulelor native asupra culturilor celulare. În  lot  au  fost prezente nanoparticule care nu a fost influențate cu ultrasunet; 3. un lot experimental cu scopul de a demarca care este acțiunea intrinsecă   a  ultrasunetului  în  culturi  celulare.  Acest  lot nu conținea nanoparticule și  a fost stimulat cu ultrasunet; 4. un lot martor care a servit pentru a compara obiectiv rezultatele obținute  în  celelalte loturi, lotul nu conținea nanoparticule  și nu a fost stimulat cu ultrasunet. Au   fost   efectuate   4   experimente   în  condiții identice,   iar   în   scopul   de   a  standardiza cercetarea,   a   fost   utilizată   o   singură   linie   de   celule   progenitoare   de endoteliocite și în  fiecare  lot  au  fost  utilizate  câte 12 godeuri,  în  total  au  fost  cultivate  192 de godeuri. În  prima  etapă  au  fost  plantate  în  godeuri  câte 15.000 cel/godeu cu 200µl  de  mediu  EGM-2.  Cutiile  cu  celule  au  fost  păstrate  în  incubator  la  37,0˚C  și 5% CO2 (Sanyo) timp de 72h. În  a  doua  etapă  mediul a fost decantat din godeuri și a fost  introdusă  suspensia  de  nanoparticule.  Menționăm că  în  loturile  martor  și loturile care nu conțineau nanoparticule a fost utilizat de asemenea mediu nutritiv EBM-2. Pentru loturile experimentale au fost atașate generatoare piezoelectrice la baza godeurilor cu celule, prin intermediul unui gel care transmite ultrasunetele. Generatoarelor piezoelectrice cu  parametrii  de  10khz  și  frecvența  de  50V au activat 72 ore  cu  pauză  de  15  minute  la  fiecare  15  minute. Cutiile cu celule și generatoare au fost incubate pentru 72 ore (fig2.6.2). În   a  treia  etapă  a  fost  determinat  numărul

25 celulelor  în  loturi  și au  fost  analizate  modificările  morfologice  la  microscopul  invertat  cu  contrast  de  fază,  după  care  au  fost  analizate  rezultatele  pentru  a  releva  influența efectului piezoelectric asupra culturilor celulare.
Fig.  2.6.1  Schema  generală  a  experimentului.
Fig. 2.6.2 Amplasarea cutiilor cu celule și a  generatoarelor  în  incubator.

26 3.7. Studiul comparativ al rezultatelor experimentului O modalitate de rezolva una din problemele actuale ale medicinei regenerative și   a   ingineriei tisulară,   este   de   a   dezvolta   noi   materiale  și metode   capabile   să  amplifice   regenerarea   tisulară.  Aceasta este posibil prin amplificarea ratei de diviziune  celulară,  ceea  ce  noi am cercetat în  acest  experiment. Scopul acestei  lucrări  a fost realizat prin cercetarea capacității nanoparticulelor de a stimula rata de diviziune   în culturi celulare in vitro,  în  special am  încercat  să  utilizăm  proprietăți speciale ale nanoparticulelor de GaN- efectul piezoelectric. Pentru a evidenția amplificarea ratei   de   diviziune   a   celulelor   în   cadrul  experimentului, am realizat experimentul   în  condiții speciale și standardizate. Au fost create condiții fizice identice pentru toate loturile cu culturi celulare cercetate (CO2 5%, atmosferă  umedă,  temperatură  37˚C),  condițiile au fost realizate și monitorizate de utilaj specializat și certificat (incubator SANYO). Am stabilit diferite loturi experimentale pentru a demarca lipsa efectelor adverse datorită  ultrasunetului,  și a fost prezent un lot martor pentru a asigura un studiu comparativ.  În  toate  loturile cercetate au fost incluse câte 12 godeuri care conțineau câte o  cultură  celulară  distinctă. Celulele  au  fost  numărate  cu ajutorul unui dispozitiv specializat și care verifică  automat viabilitatea celulelor (fig.3.7.1). Fig.  3.7.1.  Dispozitiv  pentru  numărarea  și  verificarea  viabilității   celulelor.

27 III. Rezultate proprii și discuții Cercetarea  a  avut  scopul  de  a  determina  modul  de  influență  a nanoparticulelor asupra culturilor de celule progenitoare de endoteliocite.   În   special,   am  focusat cercetarea asupra efectului piezoelectric  pe  care  îl  posedă  nanoparticulele de GaN. Datorită  dimensiunilor  de  1 până  la  100 nanometri și a unui raport suprafață/ volum mare, aceste efect poate fi utilizat pe suprafața   sau   în  intracelular, aceste nanostructuri   sunt   captate   în   interiorul   celulei,   fiind   aflate   sub   acțiunea   undelor  acustice   de   frecvență   înaltă, provoacă   potențiale   electrice ce dezvoltă   biocurenți  intracelulari   și   intensifică   transportul   citoplasmatic   de   molecule   și   ioni,   astfel  accelerează metabolismul celulei[16]. Experimentul nostru a utilizat celule progenitoare de endoteliocite, care au capacitatea   înaltă   de   endocitoză  și un potențial de   proliferare   ridicat,   această favorizează  captarea   intracelulară   a   nanoparticulelor   de   GaN, și ne   permite   să  evidențiem influența lor  asupra  ratei  de  diviziune   celulară. Rezultatele obținute în  experiment  arată  că  nanoparticulele de GaN ce produc efectul piezoelectric sub  influența  undelor  acustice  de  frecvență  înaltă măresc rata de proliferare a celulelor progenitoare de endoteliocite cu 23%±2% (p<0.05). Prezența   nanoparticulelor de GaN în  culturi  celulare  fără  a induce un efect piezoelectric cu ajutorul ultrasunetului a micșorat moderat rata de proliferare cu 6%±1% (p<0.05) (fig.3.1.1). Totodată  prezența  nanoparticulelor  de  GaN  sub  formă  de  suspensie  în  mediul  nutritiv din godeurile cu culturi celulare de progenitoare de endoteliocite nu  afectează  viabilitatea celulelor considerabil,   micșorând-o cu doar 1%±0,2%  (p<0.05) (fig.3.1.2).

28 Fig.3.1.1. Influenta efectului  piezoelectric  al  nanoparticulelor  asupra  numărului de celule  în  loturile  experimentale  și martor.
Fig.3.1.2.Influența  prezenței nanoparticulelor asupra viabilității celulare.
050001000015000200002500030000350004000045000
fără  UScu USnr. de cel.Influența  efectului  piezoelectric
nanoparticulecontrol
96%97%
95.295.495.695.89696.296.496.696.89797.2
nanoparticulefără  nanoparticuleViabilitatea  celulară

29 Rezultatele   preliminare   ne   demonstrează   că   nanoparticulele   de   GaN   sunt  biocompatibile  în  culturi  celulare  de progenitoare de endoteliocite, ele  nu  modifică  morfologia ”cobblestone” a celulelor progenitoare de endoteliocite (fig3.1.3, fig.3.1.5), fiind identice morfologic cu celulele din lotul martor (fig.3.1.4). Totodată  cu ajutorul anticorpilor monoclonali am verificat antigenii specifici acestei culturi celulare (fig3.1.6). În   baza   datelor   din   literatură   în comparație   cu   materialele  nanostructurate   de   nitrid   de   bor   ce   posedă   proprietăți  piezoelectrice similare, noi argumentăm  efectul  stimulator  prin  faptul  că  nanoparticule  de  GaN  sunt  captate  în  interiorul celulei, iar ele fiind stimulate de ultrasunet produc  un  potențial  electric,  ce  intensifică   metabolismul   celulei   [16].   Fenomenul   stimulator   este   datorat  inducției  efectului piezoelectric al nanoparticulelor de GaN într-un  câmp  de unde acustice cu frecvența  înaltă.
Fig.3.1.3  Celule  progenitoare  de  endoteliocite  în  prezența  nanoparticulelor  de  GaN.  Obiectiv 4x.

30 Fig. 3.1.4 Celule progenitoare de endoteliocite fără nanoparticule de GaN. Obiectiv 4x.
Fig.3.1.5 Celule  progenitoare  de  endoteliocite  în  prezența  nanoparticulelor de GaN. Obiectiv 20x.

31 Fig. 3.1.6. Evidențierea   Ag   CD144(cyan)  AgCD31(verde), Ag eNOS(albastru), Ag CD42(verde),  nucleul  celulei  (roșu),  obiectiv- 20x

32 IV. Concluzii 1. Nanomedicina   reprezintă aplicarea   nanobiotehnologiei   în   medicină,   prin  utilizarea nanostructurilor și  nanodispozitivelor  în  domeniul  îngrijirii  sănătății în  scop profilactic,  diagnostic  și  terapeutic  cu  respectarea  tuturor  condițiilor de  siguranță  și  criteriilor etice reglementate. Evoluția  continuă  a medicinei   determină anumite progrese în   nanobiotehnologie   să   fie   implementate   printre   metodele  actuale de diagnostic   și   tratament   medical. În prezent   sunt  elaborate  diverse  nanostructuri  și  nanodispozitive   pe   care   echipe   multidisciplinare   le   cercetează   pentru   a  releva eventuale   aplicații   la   nivel   tisular,   celular,   genetic.   Ingineria   tisulară   ocupă   un   rol  determinant   în   aceste   cercetări,   deoarece anume ea studiază interacțiunea   dintre  celule  și  nanostructuri.   2. În   această   lucrare   am   avut   obiectivul   de  determina interacțiunea   dintre  nanostructuri  și  culturi  celulare.  Nanoparticulele de GaN au fost produse prin metoda decapării  fotoelectrochimice. Placa  obținută  este  sterilizată,  iar  nanoparticulele  sunt  detașate   de   la   baza   plăcii   în   mediul   nutritiv   cu   ajutorul   ultrasunetului.   Astfel  am obținut o  suspensie  de  nanoparticule  în  mediu  nutritiv steril. În  corelație  cu  defectele  rămase  pe  placa  în  urma detașării sa calculat densitatea nanoparticulelor- 5*108/cm2, concentrația  în  soluția  a  fost  stabilită  pentru  a  respecta  raportul  nanoparticule/celule  1000:1. 3. Rezultatele   preliminare   ne   demonstrează că nanostructurile de GaN sunt biocompatibile  în  culturi celulare de progenitoare de endoteliocite. Ele nu  modifică  morfologia celulelor. Fenomenul stimulator asupra ratei de diviziune este produs datorită  nanoparticulelor de GaN care sunt captate  în  interiorul celulei și  dezvoltă  un  efect piezoelectric la stimularea lor de   către   undele   acustice  de frecvență înaltă. Tehnologia  dată  poate  stimula  electric  celulele  și  componentele  intracelulare  fără  a  utiliza  electrozi  speciali,  prin  intermediul  ultrasunetului   la  distanță

33 4. Cercetările  noastre  demonstrează  că  nanoparticulele  de  GaN  în  concentrații  de   până   la   15*106 mln./ml   nu   afectează   morfologia   și   viabilitatea   celulelor.   Prin  comparare  cu  lotul  martor  am  observat  că  ultrasunetul  la  parametrii  de  10khz  și  frecvența   de   50V   nu   a   manifestat   influențe   asupra  culturilor celulare. Rata de diviziune  a  celulelor  progenitoare  de  endoteliocite  a  crescut  cu  23%  după  aplicarea  nanoparticulelor   de   GaN   și   a   ultrasunetului. Metoda   dată poate   fi  utilizată  pentru intensificarea   regenerării   tisulare cu scopul de a accelera osteogeneza sau neurogeneza în  diferite  patologii.  Totodată  aceste  nanostructuri  sunt  cercetate  în mod special   în   ingineria   țesuturilor  care   posedă   proprietăți   electrice   accentuate,   spre  exemplu  țesutul  muscular,  cardiac, neuronal. O  eventuală  aplicare,  cercetată  actual  este   realizarea   unei   interfețe   neuronale,   capacitățile   piezoelectrice   ale  nanoparticulelor   de   GaN   prin   stimularea   unor   descărcări   ionice   pot   interfera   cu  activitatea   neuronului   astfel   ar   fi   posibil   detectarea   și   inducerea   unor   semnale  biologice.   De   asemenea   nanostructurile   pot   fi   utilizate   în   scopul   recepționării  informației   dintr-un sistem biologic, deoarece aceste nanoparticulele pot fi stresate mecanic   și   în   cadrul  activității tisulare, iar plasarea unui receptor din exterior ar determina curenții  emiși  de  aceste  nanostructuri. 5. În   concluzie,   cercetările   efectuate   în   cadrul   acestui   studiu   au   realizat  scopurile și  obiectivele  propuse  inițial.  Rezultatele  obținute  argumentează  cercetarea  ulterioară  a  nanostructurilor  de  GaN  cu  scopul  de  a  delimita domeniile medicale în  care aceste noi tehnologii pot fi implementate. De asemenea propunem colaborarea la nivel de echipe multidisciplinare cu scopul de a cerceta noi nanomateriale similare (ZnO,TiO2).

34 V. Bibliografie 1. Adams, C., Mathieson, K., Gunning, D., et al. Development of flexible arrays for in vivo neuronal recording and stimulation. // Nucl. Instrum. Meth. A, 2005,  №  546,  p.  154–159. 2. Albert, G.C., Cook, C.M., Prato, F.S., et al. Deep brain stimulation, vagal nerve stimulation and transcranial stimulation: an overview of stimulation parameters and neurotransmitter release. // Neurosci. Biobehav.  R  ,  2009,  №    33, p 1042–1060. 3. Allemann E, Gurny R, Doelker E. Drug loaded nanopaticles~methods and drug  targeting  issues.  //  Eur  J  Pharm  Biopharm,  1993,  №  39,  p.  173–191. 4. Cade D, Ramus E, Rinaudo M, et al.Tailoring of biocompatible polymers for elaboration of sugar-functionalized nanoparticles. // Biomacromolecules, 2004, №  5,  p  922–927. 5. Cellot, G., Cilia, E., Cipollone, S., et al. Carbon nanotubes might improve neuronal performance by favouring electrical shortcuts. // Nat. Nanotechnol. 2009,  №  4,  p.  126–133. 6. Chachques JC. Development of bioartificial myocardium using stem cells and nanobiotechnology  templates.  //  Car  Res  Prac.  2011,  №  10,  p.  795-806. 7. Ciofani, G. Ricotti, L. Danti S. et al. Investigation of interactions between poly-L-lysine-coated boron nitride nanotubes and C2C12 cells: up-take, cytocompatibility and differentiation. // Int. J. Nanomed. 2010,  №  5,  p  285–298. 8. Ciofani,  G.  Danti,  S.,  D’Alessandro,  D.,  et  al.  Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation.  //  ACS  Nano,  2010,  №  4,  p.6267–6277. 9. Ciofani Gianni, Arianna Menciassi. Piezoelectric Nanomaterials for Biomedical Applications. ISBN 978-3-642-28043-6

35 10. Ciofani  Gianni,  Serena  Danti,  Leonardo  Ricotti,  Delfo  D’Alessandro,  Stefania  Moscato, and Virgilio Mattoli, Piezoelectric Nanomaterials for Biomedical applications. ISBN 978-3-642-28043-6. 11. C.Adams , Alvarez, P.J. Comparative eco-toxicity of nanoscale TiO2, SiO2, and ZnO water suspensions. // Water Res., 2006, Nr. 40, p. 3527–3532. 12. Chua KN, Chai C, Lee PC, et al. Functional nanofiber scaffolds with different spacers modulate adhesion and expansion of cryopreserved umbilical cord blood  hematopoietic  stem/progenitor  cells.  //Exp  Hematol,  2007,  №  35,  p.  771–781. 13. Chua KN, Chai C, Lee PC, et al. Surface aminated electrospun nanofibers enhance adhesion and expansion of human umbilical cord blood hematopoietic stem/progenitor cells. Biomaterials,  //  2006,  №  27,  p.  6043–6051. 14. Dai, Y., Guo, E., Zhang, Z., et al. Electric-field-induced deformation in boron nitride nanotubes. // J. Phys. D  Appl.  Phys.  2009,  №  42,  p.854. 15. Dalby MJ, Gadegaard N, Tare R, et al. The interaction of human bone marrow cells with nanotopographical features in three dimensional constructs. //J Biomed  Mater,  Res.  2007,  №  79,  p.431–439. 16. Danti S, Ciofani G, Boron nitride nanotubes and primary human osteoblasts: in vitro compatibility and biological interactions under low frequency ultrasound stimulation. //Nanotechnology. 2013,  Vol.24,  №  46,  p.46-51. 17. Di Maggio N, Piccinini E, Jaworski M, et al. Toward modeling the bone marrow niche using scaffold-based 3D culture systems. // Biomaterials. 2011, №  32,  p.  321–329. 18. Eberli Daniel. Tissue engineering for tissue and organ regeneration. // 2011, ISBN 978-953-307-688-1 19. Engel E, Michiardi A, Navarro M, et al. Nanotechnology in regenerative medicine:  the  materials  side.  //  Cell  Press.,  2007,  №  26,  p.39–47.

36 20. Ferreira L, Karp JM, Nobre L, et al. New opportunities: the use of nanotechnologies to manipulate and track stem cells. // Cell Stem Cell, 2008, №  3,   p. 136–146. 21. Jain, Kewal K. The Handbook of Nanomedicine. // 2012, Ed.2, ISBN 978-1-61779-983-9 22. Jean D. Sipe. Tissue Engineering and Reparative Medicine. // Ann. N.Y. Acad.  Sci.  2002,  №  961,  p.  1–9. 23. Gimsa, J., Habel, B., Schreiber, U., et al. Choosing electrodes for deep brain stimulation experiments-electrochemical considerations. // J. Neurosci. Meth. 2005,  №  142,    p.251–265. 24. Horváth  L.,  Magrez  A.,  Golberg  D.  et  al.  In vitro investigation of the cellular toxicity of boron nitride nanotubes. // ACS Nano,  2011,  №  5,  p.  3800–3810. 25. http://www.rjmsales.com/casy.htm 26. Karl H Shoenbach et al. Bioelectric Effects of Intense Nanosecond Pulses. IEEE  Transactions  on  Dielectrics  and  Electrical  Insulation.  2007,  Vol.  14,  №  5,  p.1088-1105. 27. Kang X, Xie Y, Powell HM, et al. Adipogenesis of murine embryonic stem cells in a three-dimensional culture system using electrospun polymer scaffolds.  //Biomaterials,  2007;;  №  28,  p.  450–458. 28. Lanza, R.P. et al. Principles of Tissue Engineering. Ed. 2, Academic Press, 2000. 29. Lanza R, John Gearhart, Brigid Hogan, Douglas Melton, Roger Pedersen, E. Donnall Thomas, James Thomson and Sir Ian Wilmut. Essentials of Stem Cell Biology. // 2009, Ed.2, ISBN: 978-0-12-374729-7. 30. Lanza R.P. et al. Handbook of stem cells. Vol.1. Academic Press, 2012, ISBN: 978-0-12-385942-6. 31. Liao SS, Cui FZ, Zhang W, Feng QL. Hierarchically biomimetic bone scaffold materials: nano-HA/collagen/PLA composite.// J  Biomed  Mater  Res,  2004,  №  69, vol. 2, p.158–65.

37 32. Majid Minary-Jolandan, Rodrigo A. Bernal et al. Individual GaN Nanowires Exhibit Strong Piezoelectricity in 3D. //, Nano Lett,  2012,  №  12,  970-976. 33. Marx RE. Platelet rich plasma: evidence to support its use. //J Oral Maxillofac Surg,  2004,  №  62,  p.489–496. 34. Martin I, Wendt D, Heberer M, The role of bioreactors in tissue engineering. Biotechnol,  2004,  № 22, p.60–68. 35. Mimeault M, Hauke R, Batra SK. Stem cells: a revolution in therapeutics–recent advances in stem cell biology and their therapeutic applications in regenerative  medicine  and  cancer  therapies.  //  Clin  Pharmacol  Ther,  2007,  №  2, p. 252–264. 36. Nacu V. Optimizarea regenerării  osoase  posttraumatice  dereglate.  Chișinău:  “Tipografia  Sirius”,  2010.   37. Park J, Bauer S, Von MK, et al. Nanosize and vitality: TiO2 nanotube diameter  directs  cell  fate.  //  Nano  Lett.,  2007,  №  7,  p.1686–91. 38. Porcellini A. Regenerative medicine: a review. //Rev Bras Hematol Hemoter, 2009,  №  3,  p.63-66. 39. Pooja A, Annu S, Nano-regenerative medicine towards clinical outcome of stem cell and tissue engineering in humans. // Cell. Mol. Med., 2012, Vol 16, №9,  p.  1991-2000. 40. Robert W., Scott J., Orla M., Richard M et al. Synthesis, characterization, and applications of dendrimer-encapsulated nanoparticles. // The Journal of Physical Chemistry, 2005,  №109,  Vol.2,  p.692-704 41. Scott A., Jewett A, Matthew S. et al. Gallium nitride is biocompatible and non-toxic before and after functionalization with peptides. Acta biomaterialia, 2012,  №  8,  Vol.2,  p.728-33. 42. Shinya Yamanaka, Induced Pluripotent Stem Cells: Past, Present, and Future, //  Cell  Stem  Cell,  2012,  Vol.10,  №6,  p.678-684.

38 43. Valls-Solé,  J.,  Compta,  Y., Costa, J., et al. Human central nervous system circuits examined through the electrodes implanted for deep brain stimulation. // Clin. Europhysiol,  2008,  №  119,  p.  1219–1231. 44. Tal Dvir, Brian P. Timko, Daniel S. Kohane, Robert Langer. nanotechnological strategies for engineering complex tissues. // Nature Nanotechnology,  2011,  №  6,  p.13-22. 45. Tomalia DA, Reyna LA, Svenson S. Dendrimers as multi-purpose nanodevices for oncology drug delivery and diagnostic imaging. //Biochem Soc  Trans,  2007,  №  35,  vol.1,  p.61–70. 46. Zaveri T.D. Dolgova N.V. Chu, B.H. et al. Contributions of surface topography and cytotoxicity to the macrophage response to zinc oxide nanorods.  //  Biomaterials,  2010,  №  31,  p.2999–3007. 47. Zhi C., Bando Y., Tang C., et al. Perfectly dissolved boron nitride nanotubes due to polymer wrapping. J. Am. Chem. Soc. // 2005,  №  127,  p.15996–15997. 48. Yang YK, Leong W. Nanoscale surfacing for regenerative medicine. WIREs Nanomed  Nanobiotechnol,  2010,  №  2,  p.478–95. 49. Yim EKF, Pang SW, Leong KW. Synthetic nanostructures inducing differentiation of human mesenchymal stem cells into neuronal lineage. //Exp Cell  Res.  2007,  №  313,  p.  1820–1829. 50. Wang Z, Ruan J, Cui D. Advances and prospect of nanotechnology in stem cells.  //  Res  Lett,  2009,  №  4,  p.  593–605. 51. Whitman DH, Berry RL, Green DM. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. //J Oral Maxillofac Surg, 1997, №. 55, p.1294–1299. 52. Whitesides,  G.M.  The  „right”  size  in  nanobiotechnology.  //  Nat.  Biotechnol., Vol. 21, p. 1161-1165.

39 Declarație Prin prezenta declar   că   lucrarea de licență cu   titlul   ”Aplicații   ale  elementelor nanostructurate  de  GaN  în  regenerarea  tisulară”  este  scrisă  de  mine  și nu a mai fost prezentată  niciodată  la  o  altă  facultate  sau  instituție de învățământ superior din țară sau  străinătate.  De  asemenea,  că  toate  sursele  utilizate,  inclusive  cele  de  pe  Internet,  sunt  indicate  în  lucrare,  cu  respectarea  regulilor  de  evitare  a  plagiatului:   – toate fragmentele de text reproduse exact, chiar și în  traducere  proprie  din altă  limbă,  sunt  scrise  între  ghilimele  și dețin referința precisă  a  sursei;; – reformularea  în  cuvinte  proprii  a  textelor  scrise  de  către  alți autori deține referința precisă;; – rezumarea ideilor altor autori deține referința precisă  la  textul  original. Data Absolvent Corneliu  Lîsîi ________________________