Fig. 1. Anatomia sistemului genital masculin (Adaptat după Shier și colab., 2015) [311464]

Capitolul I. Anatomia și fiziologia sistemului reproducător masculin

Sistemul reproducător masculin (Fig. 1) este format din testicule (la nivelul cărora are loc spermatogeneza și sinteza de hormoni necesari pentru dezvoltarea și menținerea caracterelor sexuale masculine), [anonimizat] (Kumar și Sharma, 2017). Testiculele conțin celule germinale care prin diviziuni succesive produc o nouă generație de celule care se vor transforma în spermatozoizi (Marieb, 2015). Transportul spermatozoizilor de la nivelul testiculelor către exteriorul corpului are loc printr-o [anonimizat]-testiculare (Dongmei, 2011). [anonimizat]-[anonimizat], epididim, canalul deferent și canalul ejaculator. [anonimizat]-uretrale. Acestea își varsă produsul de secreție în ducte pe parcursul ejaculării (Marieb, 2015).

Fig. 1. Anatomia sistemului genital masculin (Adaptat după Shier și colab., 2015)

I.1 Gonada masculină

I.1.1 Structura testiculului

Testiculele (Fig. 2A) [anonimizat] (Shier și colab., 2015). [anonimizat], [anonimizat]-un pliu tegumentar numit scrot. Acestea au o greutate cuprinsă între 10.5-15 grame și au aproximativ 4,5 cm lungime și 2,5 cm lățime. Din punct de vedere anatomic testiculele sunt alcătuite dintr-o [anonimizat]: compartimentul tubular și compartimentul interstițial (Kumar și Sharma, 2017).

Capsula testiculului este compusă din trei tunici concentrice situate de la exterior spre interior: [anonimizat]. Tunica vaginalis este un strat subțire format din celule mezoteliale. Aceasta constă dintr-o foiță viscerală și una parietală. Între cele 2 foițe se formează o cavitate unde celulele mezoteliale sintetizează și elimină o [anonimizat]. [anonimizat]-opacă, sidefie și este formată din fibroblaste și fibre de colagen. Partea externă a tunicii albuginea este acoperită de stratul visceral al tunicii vaginalis. Tunica vasculară constă în vase de sânge și din țesut conjunctiv lax (Kumar și Sharma, 2017). [anonimizat]-o serie de cavități interne numite lobuli (Coward și Wells, 2013). În fiecare dintre cei 250-300 [anonimizat] 1-3 tubi seminiferi contorți (Tortora, 2017). Tubii seminiferi ocupă 95% din volumul testicular și sunt tapetați la interior cu celule germinale aflate în diferite stadii de dezvoltare (spermatogonii, spermatocite, spermatide) [anonimizat] (Kumar și Sharma, 2017). [anonimizat] (diastematică), [anonimizat] a testiculului (Van De Graaff, 2001).

Fig. 2. A) Structura testiculului. B) Secțiune transversală prin tub seminifer (Adaptat după Shier și colab., 2015)

I.1.2 Celulele Leydig

Celulele interstițiale Leydig produc și secretă cel mai important hormon sexual masculin, testosteronul (Nieschlag și colab., 2010). În timpul vieții embrionare, celulele Leydig se dezvoltă din celule stem mezenchimale și produc hormoni androgeni necesari pentru masculinizarea fătului. Celulele Leydig mamaliene sunt clasificate în două grupe distrincte: celulele Leydig fetale (FLCs) și celule Leydig adulte (ALCs). Deși ambele tipuri de celule derivă din celule stem mezenchimale de la nivelul interstițiului testicular, fiecare are morfologie, sistem hormonal si funcții fiziologice diferite. Celulele Leydig fetale produc testosteron necesar pentru diferențierea masculină în timp ce la adult funcția celulele Leydig este menținerea caracterelor sexuale masculine (Kumar și Sharma, 2017). Rata de proliferare a celulelor Leydig în testiculul adult este destul de scăzută și influențată de hormonul luteinizant (LH). În testiculul adult, celulele Leydig se dezvoltă din celulele mezenchimale și diferențierea acestora în celule Leydig este indusă de hormonul luteinizant (LH) dar și de factori de creștere și de diferențiere proveniți de la celulele Sertoli (Nieschlag și colab., 2010).

I.1.3 Macrofagele testiculare

Macrofagele de la nivelul testiculului constituie 25% din celule interstițiale si apar din monocitele circulante din sânge aproape de momentul nașterii. Numărul macrofagelor crește exponențial în momentul când apar celulele Leydig adulte și începe diviziunea celulelor germinale. În momentul în care celulele germinale mor, macrofagele din interstițiu intră în tubii seminiferi și fagocitează celulele germinale moarte. Macrofagele testiculare secretă factori inflamatori de tipul citokinelor cum ar fi interleukina 1 (IL-1) și TNF-α. Macrofagele testiculare dezvoltă complexe celulare joncționale specializate cu celulele Leydig. În testiculul adult, macrofagele secretă 25-hidroxicolesterol care intră în celulele Leydig adulte și este utilizat în sinteza de testosteron. În momentul în care populația de celule Leydig este complet distrusă, numărul de macrofage se reduce (Nieschlag și colab., 2010).

I.1.4 Celulele mioide

La toate mamiferele, celulele mioide înconjoară tubii seminiferi. La om, celulele mioide se organizează pentru a forma mai multe straturi. Aceste celule conțin filamente de actină, miozină, dezmină, vimentină și α-actină. Mișcarea acestor celulele ajută la mișcarea spermatozoizilor și a lichidului testicular de la nivelul tubilor seminiferi. Celulele mioide secretă un număr mare de componente ale matricei extracelulare, cum ar fi colagenul de tip I și IV, proteoglicani și factori de creștere. Acestea prezintă și receptori pentru hormonii androgeni. Experimental s-a demonstrat că prin blocarea acestor receptori duce la o reducere a greutății testiculare, azoospermie și infertilitate (Kumar și Sharma, 2017)

I.2 Căile spermatice

I.2.1 Căile spermatice intra-testiculare

Tubii drepți se formează din tubii seminiferi contorți care se unesc în porțiune distală. Aceștia sunt tubi scurți, formați dintr-un epiteliu cuboidal simplu. Ei au rolul de a transporta din tubii seminiferi, spermatozoizii împreună cu un lichid testicular. Tubii drepți se anastomozează într-o rețea formând rete testis. Aceasta este o rețea de tubuli cu lumen neregulat, tapetată cu un epiteliu cuboidal simplu. Rete testis are rolul de a transporta spermatozoizi de la nivelul tubilor drepți în cele 6-12 canale eferente (Schill și colab., 2006).

I.2.2 Căile spermatice extra-testiculare

Canale eferente sunt tapetate cu două tipuri de celule: celule cuboidale neciliate și celule columnare ciliate. Canalele eferente absorb un lichid testicular și transportă spermatozoizii la nivelul capului epididimului (Dongmei, 2011).

Epididimul are trei regiuni: cap, corp și coadă. Fiecare dintre aceste regiuni realizează funcții distincte, capul și corpul sunt implicate în evenimentele de maturare timpurie și târzie a spermatozoizilor, în timp ce regiunea caudală servește în primul rând ca spațiu de stocare a spermatozoizilor maturi funcționali (Carrell, 2007). Stereocilii celulelor absorb lichidul testicular în exces care nu a fost absorbit în timpul trecerii spermatozoizilor prin canalele eferente. Aceste celulele principale cu stereocili sunt de asemenea responsabile pentru fagocitoza celulelor anormale sau degenerate dar și a produșilor reziduali care nu au fost îndepărtați de celulele Sertoli din testicul (De Jonge și Barrat, 2006). L-carnitina liberă, glicerofosfocolina și α-glucozidaza neutră sunt produse în special de epididim și sunt folosite clinic ca markeri epididimali. Atât L-carnitina, cât și acetil L-carnitina sunt prezente în cantități mari în epididim și se găsesc și în lichidul seminal ejaculat. L-carnitina joacă un rol important în metabolismul spermatozoizilor prin furnizarea de energie pentru mobilitate și maturare. Multe proteine secretate de epididim interacționează cu suprafața spermatozoidului în timpul tranzitului acestuia prin epididim. Unele dintre aceste proteine s-au dovedit a fi importante pentru capacitatea de maturare și fertilizare a spermatozoidului, însă funcția multora nu este încă cunoscută (Kumar și Sharma, 2017).

Canalul deferent (vas deferens) este situat între coada epididimului și canalul ejaculator. Din punct de vedere anatomic acest conduct cilindric lung de 45-60 cm prezintă 3 porțiuni: o porțiune scrotală, o porțiune inghinală și o porțiune abdomino-pelvină. Porțiune terminală a canalului deferent poartă denumirea de ampula canalului deferent. Canalul deferent se unește cu canalul de excreție al veziculei seminale și formează canalul ejaculator (Shier și colab., 2015).

Canalul ejaculator se află în continuarea canalului deferent. Canalele ejaculatorii sunt scurte de circa 2 cm și se varsă în uretra masculină (Nieschlag și colab., 2010).

I.3 Glandele sexuale accesorii

I.3.1 Prostata

Glanda prostatică (Fig. 3) are formă unei castane și o greutate medie de 11 grame. Aceasta înconjoară porțiunea distală a uretrei și este localizată inferior de vezica urinară. Din punct de vedere structural, aceasta este formată din glande tubulare ramificate, formate din țesut conjunctiv. Ductele glandelor se deschid în uretră (Shier și colab., 2015).

Fig. 3. Reprezentarea schematică a structurii glandelor sexuale accesorii masculine (Adaptat după Kumar și Sharma, 2017).

Prostata secretă un lichid lăptos. Acest lichid lăptos este alcalin, neutralizând lichidul care provine din epididim împreună cu spermatozoizii, acest lichid fiind acid datorită acumulărilor metabolice din timpul maturării spermatozoizilor. Secreția prostatică intensifică motilitatea spermatozoizilor, care rămân imobili în acidul de la nivelul epididimului. În plus, secreția prostatică ajută la neutralizarea secrețiilor acide ale vaginului, ajutând spermatozoizii să se deplaseze către trompa uterină. Glanda prostatică eliberează secrețile în uretră pe măsură ce țesutul muscular din capsulă se contractă (Shier și colab., 2015). Fosfotaza acidă prostatică este o enzimă glicoproteică dimerică. Aceasta este sintetizată de epiteliul columnar sector al prostatei. Enzima este exprimată la pubertate având control androgenic. Sunt cunoscute două forme de fosfatază acidă prostatică: forma celulară și secretată. Prezența unei cantități mari de fosfatază acidă prostatică în plasma seminală sugerează un rol în fertilitate, probabil prin creșterea mobilității spermatozoizilor însă rolul fosfatazei acide celulare este controversat. Multe studii au demonstrat că o concentrație mare de fosfatază acidă celulară s-a găsit în plasma seminală la pacienții azoospermici iar un nivel scăzut de fosfatază acidă a fost observat la pacienții oligospermici. Acidul citric se găsește într-o cantitate mult mai mare în lichidul spermatic decât în plasma sangvină. Rolul acestuia nu este elucidat, dar probabil intervine în menținerea echilibrului osmotic/electrolitic în spermă (Nieschlag și colab., 2010). Zincul din celulele epiteliale de la nivelul prostatei ajută la îndeplinirea funcțiilor fiziologice majore ale producției și secreției citratului. O concentrație ridicată de zinc în plasma seminală conferă activitate antibactericidă acesteia. Ionii de zinc din lichidul prostatic sunt importanți pentru coagularea spermei, deoarece determină o schimbare conformațională a proteinelor de semenogelină care formează un complex proteic insolubil (Zini și Agarwal, 2011). Spermina este o poliamină bazică alifatică secretată de prostată. Spermina are o afinitate puternică pentru ionii fosfat, acizii nucleici sau fosfolipide. În momentul când materialul seminal este menținut la temperatura camerei, se formează un cristal galben transparent de fosfat de spermină. Acesta se datorează hidrolizei fosforilcolinei seminale, produse în principal în epididim din fosfataza acidă, rezultând eliberarea ionilor fosfat anorganici. În cele din urmă, ionii fosfat reacționează cu spermina pentru a forma fosfat spermina. Enzima diamină oxidază prezentă în plasma seminală, oxidează sperma la un produs aldehidic care este responsabil pentru mirosul caracteristic al materialului seminal (Kumar și Sharma, 2017).

I.3.2 Veziculele seminale

Veziculele seminale sunt glande tubulare pereche, având forma unor săculeți cu lungime de aproximativ 5 centimetri, fiind atașate la vasul deferent, în apropierea vezicii urinare. Țesutul glandular care căptușește pereții interni ai veziculelor seminale secretă un compus ușor alcalin (Shier și colab., 2015). Funcția principală a veziculelor seminale este de a produce componentele plasmei seminale. Plasma seminală acționează ca un diluant natural și ca un mediu de transport pentru spermatozoizi, atât prin tractul reproducător masculin, cât și prin cel feminin. Constituenții cei mai importanți ai plasmei seminale secretați de veziculele seminale includ fructoza, semenogelina I și II, prostaglandinele, acidul citric, acidul ascorbic, ergotioneina, ionii de potasiu și fosfatul anorganic (Nieschlag și colab., 2010). Fructoza este sursa principală de energie pentru spermatozoizi după pătrunderea acestora în tractul genital feminin. Deoarece la nivelul vaginului se află o cantitate scăzută de oxigen, fructoza suferă o degradare anaerobă pentru a produce acid lactic și adenozin trifosfat (Schill și colab., 2006). Plasma seminală are cel mai ridicat nivel de prostaglandine dintre toate fluidele prezente la om. Aproximativ 15 tipuri diferite de prostaglandine sunt produse de vezicula seminală. Acestea stimulează contracțiile musculaturii netede atât în tractul masculin, cât și în cel feminin. La bărbați acestea inițiază procesele de erecție și ejaculare, iar la femei modifică mucusul cervical și vaginal și induc contracțiile uterine necesare spermatozoizilor să ajungă la ovocit (Singh, 2016). Un al component important al veziculelor seminale sunt semenogelinele care sunt necesare pentru coagularea spermei. Semenogelinele reprezintă până la 30% dintre toate proteinele. Importanța fiziologică exactă a coagulării materialului seminal nu este cunoscută. S-a demonstrat faptul că spermatozoizii prezintă numeroase molecule de suprafață care pot contribui la procesul natural de fertilizare (Kumar și Sharma, 2017).

I.3.3 Glandele bulbo-uretrale

Glandele bulbo-uretrale sau glandele Cowper’s sunt glande mici, pereche, situate inferior de prostată. Acestea sunt compuse din mai multe tuburi ale căror celule epiteliale secretă un lichid asemănător cu mucusul (Shier și colab., 2015). Mucinele sunt expulzate chiar înainte de ejaculare și ajută la neutralizarea urinei reziduale din uretră. De asemenea servesc ca lubrifiant în timpul fazei inițiale de ejaculare. Un al rol fiziologic al secrețiilor glandei Cowper’s se consideră a fi imunoprotecția tractului genito-urinar, deoarece aceastea conțin cantități mari de imunoglobulină A (Kumar și Sharma, 2017).

Capitolul II. Gametogeneza

II.1 Celulele Sertoli

Celulele Sertoli (Fig. 4) sunt celule mari cu un nucleu oval, eucrom și nucleolat situate în epiteliul germinal. Aceste celule sunt localizate în membrana bazală și se extind prin prelungirile citoplasmatice până în lumenul tubului seminifer, fiind considerate structuri de susținere ale epiteliului germinal. Acestea formează joncțiuni gap cu celulele Sertoli vecine, inițiind astfel bariera hemato-testiculară, care protejează celulele germinale de reacții autoimmune (Dongmei, 2001). Datorită structurilor citoplasmatice speciale acestea susțin alinierea și orientarea spermatozoizilor spre lumen în timpul diferențierii. Aproximativ 35-40% din volumul epiteliului germinal este reprezentat de celulele Sertoli. Un testicul sănătos cu o spermatogeneză completă conține 800-1200 x 106 celule Sertoli (Nieschlag și colab., 2010).

Fig. 4. Aspectul microscopic al celulelor Sertoli (Kruger și Oehninger, 2007)

Există două tipuri distincte de celule Sertoli, respectiv imature și mature care diferă din punct de vedere morfologic și biochimic. Doar celulele Sertoli imature proliferează. La primate, inclusiv la om, proliferarea celulelor Sertoli are loc în două perioade distincte. Perioada proliferativă începe în timpul perioadei fetale și continuă cu perioada neonatală apoi se oprește. A doua etapă a expansiunii imature a celulelor Sertoli este perioada pubertății în care acestea se diferențiază definitiv în stadiul matur. Celulele Sertoli mature își pierd capacitatea de a se divide (Kumar și Sharma, 2017). Importanța celulelor Sertoli în dezvoltarea celulelor germinale a fost recunoscută de mult timp. Multe studii au demonstrat că celulele germinale sunt puternic dependente de asociațiile chimice și fizice cu celulele Sertoli. Bariera creată de celulele Sertoli în tubii seminiferi asigură separarea fiziologică între celulele germinale premeiotice și postmeiotice și circuitul bidirecțional al factorilor de creștere între celulele Sertoli și celulele germinale în dezvoltare. Un număr mare de proteine cum ar fi activina (stimulează producerea hormonului foliculostimulant-FSH), inhibina, interleukina-1, interleukina-6, transferina, ceruloplasmina, macroglobulina (inhibă eliminarea intra-luminală a spermatozoizilor), proteine care leagă hormonii androgeni, retinolul sunt secretate de celule Sertoli și influențează dezvoltarea celulelor germinale (Kumar și Sharma, 2017). Acestea joacă un rol important în susținerea, protejarea și hrănirea celulelor germinale, precum și în secreția lichidului testicular (bogat în fructoză), pentru a ajuta la transportul spermatozoizilor din tubii seminiferi (Dongmei, 2001).

II.2 Etapele spermatogenezei

Spermatogeneza este un proces complex care începe cu diviziunea celulelor stem și se încheie cu formarea spermatozoizilor. Întregul proces spermatogenic poate fi împărțit în:

Proliferarea celulară (mitoza);

Diviziunea meiotică (meioza);

Formarea spermatozoidului matur (spermiogeneză);

Eliberarea spermatozoizilor din epiteliul germinal în lumenul tubului seminifer (spermiație).

La om, este nevoie de o medie de 74 de zile pentru ca o celulă primordială să se transforme într-un spermatozoid matur (Kumar și Sharma, 2017).

II.2.1 Proliferarea celulară (MITOZA)

În faza mitotică (proliferativă), spermatogonia (Fig. 5) suferă o auto-reînnoire sau diferențiere, ambele procese implicând diviziuni succesive. Proliferarea spermatogoniilor are loc în partea bazală a epiteliului seminifer. Primatele, inclusiv oamenii, au două tipuri distincte de populații de spermatogonii, acestea sunt de tip A și de tip B care se disting prin morfologia și caracterele tinctoriale ale nucleilor. Spermatogoniile sunt celule mici, sferice cu un diametru de 6–7 μm (Guraya, 1987). Spermatogonia de tip A poate fi diferențiată în spermatogonie cu cromatină „întunecată” și spermatogonie cu cromatină „palidă” pe baza colorării lor nucleare în secțiunile histologice. Spermatogoniile cu cromatină „întunecată” sunt populațiile de rezervă (stem), neproliferative din testicul. Acest subtip de spermatogonii au nucleii ovoizi și hipercromi. În condiții fiziologice normale, acestea nu prezintă activitate mitotică. În anumite condiții, cum ar fi radiațiile sau terapia cu estrogeni pe termen lung, spermatogonia cu cromatină „întunecată” se poate transforma în spermatogonie cu cromatină „palidă” pentru a mențin constant numărul de spermatogonii. Spermatogoniile cu cromatină „palidă” sunt celule mai mari, cu un nucleu ovoid și eucrom. Aceste spermatogonii sunt considerate celulele stem ale testiculelor care își reînnoiesc propria populație de spermatogonii A cu cromatină „palidă” și se diferențiază pentru a produce spermatogonia de tip B (Winters și Huhtaniemi, 2017). Spermatogoniile de tip B au un nucleu sferic, hipercrom și conțin unul sau doi nucleoli mari situați central. La om, spermatogoniile de tip B se divid mitotic o singură dată pentru a forma în cele din urmă două spermatocite primare (Kumar și Sharma, 2017)

Fig. 5. Tipuri de spermatogonii de la nivelul tubului seminifer masculin. Ap- Spermatogonie A cu cromatină „palidă”, Ad-Spermatogonie A cu cromatină „întuncată”, B- Spermatogonie de tip B (După Guraya, 1987).

II.2.2 Diviziunea meiotică (MEIOZA)

Spermatocitul primar are un diametru de 17-19 μm, fiind cea mai mare celulă dintre toate celulele seminale, acesta suferind diviziunea meiotică I (reducțională). Meioza asigură reducerea numărului de cromozomi de la diploid la haploid și generarea diversității genomice prin remanierea informației între perechile omoloage de cromozomi (crossing-over). În timpul meiozei I, profaza este cea mai lungă etapă și constă în următoarele subfaze: leptoten, zigoten, pachiten, diploten și diachineză. Profaza I este apoi urmată de metafaza I, anafaza I și telofaza I. În timpul profazei I, conținutul de ADN din fiecare cromozom se dublează. Fiecare cromozom replicat conține două cromatide surori identice, conectate prin centromer. În etapele ulterioare ale profazei meiotice I, cromozomii omologi se apropie unul de celălalt și se împerechează. Împerecherea cromozomilor omologi este esențială pentru schimbul de informație genetică (Kumar și Sharma, 2017).

În spermatocitul diploid pre-leptotenic sau interfazic, celulele cresc în dimensiune, iar cantitatea de ADN din fiecare cromozom se dublează. Cromozomii din acest stadiu sunt lungi, filamentoși și decondensați (Kumar și Sharma, 2017). În leptoten, cromozomii se condensează și devin vizibili. Cromozomii omologi încep să se deplaseze unul către celălalt în plan longitudinal, dar nu sunt încă împerecheați. Începe asamblarea complexului sinaptonemal, o structură asemănătoare unui fermoar care constă din două elemente laterale și un element central care sunt ținute împreună prin filamente transversale. Elementele laterale apar mai întâi ca elemente axiale înainte de asocierea cromozomilor omologi. Acest complex este esențial pentru împerecherea cromozomilor omologi de-a lungul întregii lor lungimi. Fiecare structură axială este asociată cu o pereche de cromatide surori (Schill și colab., 2006).

Fig. 6. Reprezentarea schematică a etapelor ciclului seminifer (I-VI) în testiculul uman și tipurile de celule germinale asociate ale epiteliul seminifer în fiecare dintre aceste etape. CB- compartiment bazal, BTS- bariera hemato-testiculară, CA- compartimentul adluminal (Adaptat după Winters și Huhtaniemi, 2017).

În zigoten, cromozomii se scurtează și se condensează. Asocierea cromozomilor omologi este facilitată de asamblarea completă a complexului sinaptonemal. Filamentele transversale conectează atât elementul axial legat de cromozom, cât și elementul central, asociind astfel cromozomii omologi. Cromozomii omologi pereche se numesc cromozomi bivalenți (Kumar și Sharma, 2017).

În pachiten, are loc schimbul de informație genetică între cromatidele nesurori. Acest schimb este numit recombinare genetică sau Crossing over care are loc la nivelul unui sit specific numit chiasmă (De Jonge și Barrat, 2006).

În diploten, complexul sinaptonemal se degradează și cromozomii omologi sunt parțial separați unul de celălalt dar rămân atașați la nivelul chiasmei. Spermatocitele primare din diploten sunt cele mai mari celule germinale și au fibrele de cromatină îngroșate. În timpul diachinezi, ultima etapă a profazei I, cromozomii devin complet condensați. La sfarșitul profazei I, nucleolul dispare și membrana nucleară se dezorganizează. În timpul profazei I, centriolii duplicați se deplasează către polul opus al celulei (Kumar și Sharma, 2017).

În timpul metafazei I, perechea de cromozomi omologi se deplasează de-a lungul plăcii metafazice și se aliniază pe planul ecuatorial, o regiune care împarte fusul meiotic în două jumătăți (Kumar și Sharma, 2017).

În timpul anafazei I, cei doi cromozomi omologi se îndreaptă către polii opuși ai celulei.

În timpul telofazei I, cromozomii haploizi ajung la cei doi poli opuși ai celulei, cromozomii se decondensează, dispar nucleolii și membrana nucleară începe să se formeze în jurul cromozomilor haploizi. Evenimentul următor este citochineza incompletă în care se formează două spermatocite secundare haploide din fiecare spermatocit primar (Kumar și Sharma, 2017).

Meioza II urmează meioza I și este similară cu mitoza. Profaza II este foarte scurtă iar cromozomii sunt condensați și formați din două cromatide. Profaza II este urmată de metafaza II unde are loc formarea fusului de diviziune iar cromozomii formează placa ecuatorială datorită aranjării acestora pe planul central al fusului. În Anafaza II are loc clivarea centromerului fiecărui cromozom dicromatidic, rezultând doi cromozomi-fii monocromatidici, care se deplasează spre polii opuși ai celulei. Ultima fază este reprezentată de telofaza II, în care rezultă celule haploide cu cromozomi monocromatidici. Meioza II se termină cu formarea a patru spermatide haploide rotunde (Kumar și Sharma, 2017)

II.3 Formarea spermatozoidului matur (Spermiogeneza)

Spermiogeneza (Fig .7) implică transformarea spermatidelor Sa în Sb1, Sb2, Sc, Sd1 și Sd2. În timpul acestui proces nu apar alte diviziuni celulare, spermatidele rotunde nou formate din spermatocitele secundare sunt caracterizate printr-un nucleu sferic (Winters și Huhtaniemi, 2017). Evenimentele asociate cu spermiogeneza includ modificări nucleare, cu formarea acrozomului și asamblarea structurilor care vor da naștere cozii spermatozoizilor (De Jonge și Barrat, 2006). Complexitatea structurală a spermatozoidului matur, este rezultatul procesului evolutiv, care a dus la un genom masculin condensat care va fi transportat de coada spermatozoidului și va fi prevăzut cu sisteme de recunoaștere și de penetrare a ovocitului (acrozomul și membrana plasmatică a spermatozoidului) care permit legarea și intrarea în ovocit (De Jonge și Barrat, 2006).

Fig. 7. Etapele diferențierii unei spermatogonii într-un spermatozoid matur (Adaptată după Zini și Agarwal, 2011).

II.3.1 Structura și morfologia spermatozoidului matur

a) Structura capului spermatozoidului

Capul spermatozoidului (Fig. 8) are o lungime de aproximativ 4 μm și este format din nucleu, acrozom și citoschelet. Aranjamentul structural al acestor componente de la interior spre exterior este reprezentat de nucleu, înveliș nuclear, teacă perinucleară, acrozom și membrană plasmatică (Rao și colab., 2010). Nucleul este compus dintr-un miez de acid deoxiribonucleic (ADN) complexat cu proteine histone (H2A, H2B și H3) care au fost înlocuite în timpul spermiogenezei prin protamine, proteine de ADN încărcate pozitiv, care redă forma condensată și compactă a nucleului dar și forma hidrodinamică care permite mobilitatea și penetrarea zonei pellucida (De Jonge și Barrat, 2006). Protaminele sunt proteine mici și bogate în arginină și cisteină, fiind produse în timpul spermatogenezei, care stabilizează cromatina formând punți disulfurice cu catenele de ADN adiacente, ceea ce face ca nucleul spermatozoidului să fie hipercondensat. Alte tipuri de proteine sunt degradate în timpul maturării spermatozoizilor. Proteinele degradate sunt transportate în citoplasma de la nivelul gâtului prin porii nucleari prezenți în învelișul nuclear de la nivelul inelului posterior. Aceste proteine se încorporează în picături citoplasmatice sau în corpurile reziduale care în final se varsă în timpul maturării epididimale (Kumar și Sharma, 2017).

Fig. 8. Structura spermatozoidului matur (Adaptată după Kumar și Sharma, 2017)

Nucleul este acoperit de învelișul nuclear care este format dintr-o membrană înternă și externă. În timpul spermatogenezei condensarea nucleului duce la reducerea mărimii învelișului nuclear și reorganizarea învelișului nuclear în exces în înveliș nuclear redundant. Învelișul nuclear redundant în spermatozoidul matur facilitează mobilitatea hiper-activată prin furnizarea de depozite intracelulare de calciu (Kumar și Sharma, 2017).

Inelul posterior sau inelul nuclear este localizat la tranziția dintre cap și piesa de legătură. Acesta reprezintă linia de fuziune a membranei plasmatice cu membranele exterioare și interioare ale învelișului nuclear. Inelul posterior este prezent în toți spermatozoizi mamiferelor. Suprafața internă a membranei interne a învelișului nuclear indică prezența unor proteine dispuse în rețea care formează citoscheletul. Această rețea este cunoscută sub denumirea de lamină nucleară (Kumar și Sharma, 2017).

Teaca perinucleară este prezentă în afara învelișului nuclear. Aceasta este formată din proteine citoschelet cum ar fi actina și proteine de legare de actină, ca de exemplu spectrina și tubuline. Datorită acestora, se menține forma ovală a capului și sunt îndepărtate în momentul fertilizări. Teaca perinucleară este împărțită în trei segmente, sub-acrozomal, ecuatorial și post-acrozomal (Kumar și Sharma, 2017).

Segmentul sub-acrozomal este prezent sub acrozom și este contopit cu membrana acrozomală internă. Contopirea acesteia cu membrana acrozomală internă stabilizează receptorii prezenți pe membrana acrozomală pentru legarea capului spermatozoidului de zona pellucida. Teaca sub-acrozomală conține proteine de tipul T-actinei 2. În timpul spermatogenezei, actina filamentoasă este depolimerizată în actină globulară. Polimerizarea actinei este vazută în zona pellucida, prin inducerea recției acrozomale (De Jonge și Barrat, 2006).

Segmentul ecuatorial al tecii perinucleare este pliat și constă din membrana acrozomală externă și internă. Aceasta conține receptori de tipul ecuatorinei sau MN9 care ajută la legarea capului spermatozoidului la nivelul membranei ovocitare (Kumar și Sharma, 2017).

Segmentul post-acrozomal al tecii perinucleare este situat între nucleu și membrana plasmatică posterioară a acrozomului și se extinde până la inelul posterior. Proteinele prezente în acest segment sunt reprezentate de ciclina 1, ciclina 2 și calicină. De asemenea acestea conțin proteine semnal sau factori de activare a ovocitelor pe baza spermatozoidului. Acești factori sunt importanți pentru activarea ovocitului, facilitând astfel completarea ciclului celular meiotic, formarea pronucleilor și inhibă polispermia. Aceste evenimente inițiind dezvoltarea zigotului (Kumar și Sharma, 2017).

b) Acrozomul

Acrozomul este o formațiune unică, ce derivă din aparatul Golgi în timpul spermatogenezei. Acesta este un înveliș membranos dublu situat în jurul părți anterioare a capului spermatozoidului și conține enzime necesare penetrării învelișului ovocitar cum ar fi cumulusul oophorus, zona pellucida și membrana plasmatică. Acrozomul conține de asemenea receptori pentru interacțiunea spermatozoidului cu zona pellucida. Din punct de vedere structural, acrozomul este format dintr-o membrană acrozomală internă și una externă. Membrana acrozomală internă acoperă membrana exterioară a învelișului nuclear și se continuă cu membrana acrozomală externă. Membrana plasmatică acoperă membrana acrozomală externă (Kumar și Sharma, 2017).

Membrana acrozomală externă se dezintegrează în timpul reacției acrozomale iar membrana acrozomală internă nu suferă modificări în timpul acestui proces. Între cele doua membrane acrozomale se află un matrix acrozomal bogat in proteaze. Proteazele de la nivelul matrixului acrozomal este reprezentat de acrosină sau serină care este unică pentru spermatozoid și este importantă pentru penetrarea zonei pellucida. Alte enzime acrozomale sunt acrogranina ce favorizează aderarea la zona pellucida, hidrolaze acide și hialuronidaze cu rol în penetrarea învelișului ovocitar. Conținutul non-enzimatic (MC41, SP56 și SP-10) este important pentru legarea la zona pellucida. Membrana plasmatică a spermatozoidului este organizată într-o regiune acrozomală si una posterioară. Membrana plasmatică acoperă regiunea post-acrozomală și este prezentă între capătul posterior al acrozomului și piesa de legătură (Kumar și Sharma, 2017).

c) Piesa gâtului

Baza flagelului este situată aproape de nucleu, la joncțiunea piesei de legătură și a capului. Structura bazală a flagelului este exonema care este prezentă pe toată lungimea flagelului. La mamiferele cu fertilizare internă, axonema este înconjurată de fibre dense exterioare și de un manșon fibros. Fibrele dense exterioare sunt prezente în piesa de mijloc și piesa principală. Manșonul fibros înconjoară fibrele dense exterioare în piesa principală. Cealaltă componentă importantă a flagelului este teaca mitocondrială care înconjoară fibrele dense exterioare în piesa de mijloc. Axonema este componenta interioară a flagelului și constă din microtubuli aranjați în formula 9+2. Acest aranjament structural se referă la complexul de motilitate axonemală a spermatozoidului. Acesta reprezintă nouă dublete exterioare (MT-1 și MT-2) și un singur dublet central care este atașat de dubletele exterioare prin filamente radiale. Microtubulii formează unitatea structurală de bază a axonemei. Microtubulii sunt formați din heterodimeri ai proteinelor de tubulină alfa și beta. Acești heterodimeri tubulinici alfa și beta se asociază și formează protofilamente. Treisprezece protofilamente asociază și formează MT-1 și unusprezece protofilamente formând MT-2 în formă de C. Tubulinele suferă modificări post-translaționale cum ar fi acetilări și fosforilări care sunt esențiale pentru motibilitatea spermatozoidului (Kumar și Sharma, 2017).

Dineina (Fig. 9) se extinde de la MT-1 la MT-2 prin dubletele exterioare adiacente. Dineinele sunt proteine pe bază de actină cu rol motor deoarece au activitate de adenozin trifosfatază (ATP-ază) care generează forță de alunecare și energie mecanică necesară pentru motilitate (Kumar și Sharma, 2017). Dineina este alcătuită din trei tipuri de proteine cu lanțuri grele, intermediare și ușoare. Aceasta are doua tipuri de brațe, unele externe și unele interne. Brațul extern este atașat la tubuline prin setul de trei polipeptide care formează unitatea de ancorare a dineinei. Brațul extern este implicat în reglarea vitezei și alunecării. Bratul intern este responsabil de generarea forței propulsive de înaintare și de formare a undei flagelare. Unitatea reglatoare polipeptidică din structura dineinei este atașată de membrana externă a dubletelor microtubulilor iar la acest nivel este situsul de reglare a activității dineinei (Kumar și Sharma, 2017). Dineina este de asemenea necesară în timpul formării acrozomului pentru translocarea granulelor pro-acrozomale derivate din aparatul Golgi către suprafața nucleară. Aceste granule pro-acrozomale fuzionează lângă suprafața nucleară și formează vezicule acrozomale. Dubletele microtubulare adiacente sunt unite de proteina nexină cum ar fi kinazele de difosfat de nucleozidă reglatoare de calciu. Lamelele radiale se extind de la dubletele exterioare ale microtubulilor până la dubletele centrale ale microtubulilor. Lamele radiale asigură o conexiune structurală între dubletele microtubulare centrale, brațele dineinei și unitatea de reglare a dineinei (Kumar și Sharma, 2017).

S-a demonstrat că interacțiunea dintre lamele radiale și dubletele microtubulare centrale transmite un semnal pentru reglarea vitezei de alunecare a brațelor dineinei și formarea formei de undă flagelară. Flagelul spermatozoidului este structurat în patru segmente care înconjoară piesa centrală a axonemei, respectiv: piesa de legătură, piesa de mijloc, piesa principală și piesa terminală (Kumar și Sharma, 2017).

Fig. 9. Structura complexului motor axonal (După Kumar și Sharma, 2017)

d) Piesa de legătură

Piesa de legătură are o lungime de aproximativ 0.5 μm. Aceasta se compune din nouă coloane striate sau segmentate care reprezintă o continuare directă a fibrelor dense exterioare în celelalte segmente flagelare. În interiorul acestor nouă coloane este o masă densă care la majoritatea mamiferelor conține centriolul spermatozoidului (proximal), o rămășiță a centrozomului bicentriolar găsit în celulele spermatogene haploide timpurii. Placa bazală asigură legătura dintre capătul proximal al piesei de legătură și fosa de implantare a capătului spermatozoidului (De Jonge și Barrat, 2006).

Centriolii proximali și distali, împreună cu matricea pericentriolară formează centrozomul, de unde se formează microtubulii. Centrozomul spermatozoidului joacă un rol critic după fuziunea gameților. Proteinele centrozomului din ovocit se asamblează pe componentele centrozomale ale spermatozoidului și formează o multitudine de microtubuli care sunt necesari pentru ghidarea mișcărilor și pentru unirea pronucleilor masculini cu cei feminini. Centrozomul anormal este considerat un factor de infertilitate masculină (Kumar și Sharma, 2017).

e) Mijlocul sau piesa de mijloc

Piesa de mijloc sau mijlocul are o lungime de aproximativ 7 μm. Se compune dintr-o teacă mitocondrială care formează un helix structural de aproxmativ 75-100 de mitocondrii condensate și alungite. Prezența manșonului mitocondrial (Fig. 10) în miezul piesei are rolul de a depozita energia necesară pentru mobilitatea flagelară a spermatozoidului. Mitocondriile din spermatozoizi sunt speciale deoarece acestea sunt rezistente la mediile hipotonice și pot utiliza lactatul ca substrat de energie. Acestea conțin genomul paternal. Manșonul mitocondrial este înfășurat în jurul fibrelor dense exterioare și aderă la rețeaua submitocondrială. Reteaua submitocondrială este formată dintr-o rețea de filamente care fuzionează cu inelul de la nivelul joncțiunii piesei intermediare cu cea principală. Manșonul mitocondrial conține o proteină numită spergenină, a cărei funcție nu este complet cunoscută, dar se sugerează faptul că are rol în formarea manșonului mitocondrial. Învelișul interior al manșonului mitocondrial este constituit din fibrele dense exterioare care se extind de la piesa de mijloc la partea anterioară a piesei principale (Kumar și Sharma, 2017).

Fibrele dense exterioare constau din filamente bogate în cisteină, serină sau prolină care sunt legate prin punți disulfurice. Fiecare dublet de microtubuli periferici este asociat cu o fibră densă exterioară, rezultând astfel complexul cu formula (9+2). Fibrele dense exterioare 1 și 5 sunt fibre mai mari în comparație cu fibrele dense exterioare rămase. Fibrele dense exterioare 3 și 8 se termină la joncțiunea miezului și piesei intermediare, de unde acestea sunt înlocuite de coloanele longitudinale ale învelișului fibros (Kumar și Sharma, 2017).

Fibrele dense exterioare acoperă aproximativ 60% din lungimea piesei principale a flagelului și conțin 30% din proteinele de la nivelul spermatozoidului. De asemenea, acestea protejează spermatozoizii în timpul trecerii acestora prin epididim. Fibrele dense exterioare se formează în timpul spermiogenezei. În timpul acestui proces, fibrele dense exterioare conțin zinc, acesta reprezentând faptul ca 93% din zincul intracelular din spermatozoid este localizat la nivelul fibrelor dense exterioare. Cantitatea de zinc din ejaculat este de 100 de ori mai mare decât în plasma sangvină (Kumar și Sharma, 2017).

Axonema produce energie cinetică care este transferată la baza flagelului prin punți disulfurice în fibrele dense exterioare. Zincul formează un complex prin legare la gruparea sulfhidril a cisteinei, împiedicând oxidarea prematură a fibrelor dense exterioare (Kumar și Sharma, 2017).

În timpul maturării spermei post-testiculare în epididim, mai mult de 60% din zinc este îndepărtat din fibrele dense exterioare, ceea ce face ca fibrele dense exterioare să fie rigide. Zicul flagelar a fost invers corelat cu motilitatea și fertilitatea spermatozoizilor (Kumar și Sharma, 2017).

Fig. 10. Reprezentarea schematică a structurii piesei mijlocii a spermatozoidului (Adaptat după Kumar și Sharma, 2017)

f) Piesa principală

Piesa principală este situată distal față de piesa intermediară și este cel mai lung segment, măsurând 40 μm lungime. Extensia proximală a piesei principale este identificată prin prezența unui inel transversal sau inelul lui „Jansen”, care o separă de piesa mijlocie. Inelul transversal conține grupul de proteine septin care mențin forma flagelului (Sharma și Kumar, 2017). Piesa principală este acoperită de o teacă fibroasă, compusă din doua coloane longitudinale paralele cu fibrele dense exterioare trei și opt care sunt conectate pe ambele parți de o serie de nervuri transverse. Teaca fibroasă asigură suportul pentru axonema spermatozoidului (De Jonge și Barrat, 2006). Proteina predominantă din teaca fibroasă este AKAP4 (proteină de ancorare a kinazei 4). AKAP4 ancorează kinaza A (PKA) care este ținta cascadei de semnalizare mediată de adenozin monofosfatul ciclic (cAMP). PKA stimulează continuarea fosforilării tirozinei care are ca țintă proteinele implicate în capacitație, reacție acrozomală și motilitatea spermatozoizilor. Proteina prezentă în piesa principală este tectina-2 (TEKT2) care este implicată în motilitatea spermatozoizilor (Kumar și Sharma, 2017).

Teaca fibroasă (Fig. 11) este necesară pentru a oferi flexibilitate și motilitate flagelară. Integritatea structural între fibrele dense exterioare și teaca fibroasă este menținută de proteinele de legare cum ar fi rofilina prezentă la fibrele dense exterioare și roporina localizată la teaca fibroasă. Teaca fibroasă conține de asemenea enzime glicolitice cum ar fi gliceraldehida 3, fosfohidrogeneza-S specifică spermei, rolul acestei enzime este de a furniza energie în timpul motilității spematozoizilor.

Fig. 11. Reprezentarea schematică a structurii piesei principale (Adaptat după Kumar și Sharma, 2017).

g) Piesa finală

Piesa finală (Fig. 12) are o lungime de aproximativ 5-7 μm și constă din complexul axonemal înconjurat de membrana plasmatică. Membrana plasmatică a flagelului este organizată în domeniul piesei medii, domeniul piesei principale și domeniul piesei distale. Domeniul piesei medii și domeniul piesei principale sunt separate printr-un inel fibros (Kumar și Sharma, 2017).

Fig. 12. Reprezentarea schematică a structurii piesei finale (Adaptat după Kumar și Sharma, 2017).

II.4 Maturarea și metabolismul spermatozoizilor

La scurt timp după eliberarea spermatozoidului din testicul, acesta nu este capabil să fertilizeze ovocitul. Acesta trebuie să treacă prin toata lungimea epididimului pentru o maturare completă care durează de la 10 zile până la 2 săptămâni. Epididimul secretă proteine care interacționează cu spermatozoidul. Acestea duc la modificarea proteinelor de suprafață a spermatozoizilor, modificări ale membranei plasmatice și încorporarea proteinelor epididimale în componentele celulare a spermatozoidului (Kumar și Sharma, 2017).

Epididimul secretă proteine pe căi merocrine și apocrine. Proteinele epididimale suferă modificări post-translațonale în aparatul Golgi care produc vezicule secretoare. Aceste vezicule secretoare (epididimozomi) eliberează proteine prin exocitoză. Spermatozoidul captează proteinele epididimale prin ancorarea glicozilfosfatidilinozitolului care se formează prin modificări post-translaționale (Kumar și Sharma, 2017).

Epididimozomii sunt bogați în proteine implicate în remodelarea spermatozoidului, mobilității și interacțiunilor acestuia. Unul dintre constituenții epidimozomilor este factorul de inhibare a migrației macrofagelor care se acumulează în fibrele dense exterioare ale spermatozoidului, fiind implicat în eliminarea zincului, care este o etapă esențială pentru facilitarea motilității spermatozoidului. Prin urmare epididimozomii reglează motilitatea în timpul maturării epididimale. Alte componente ale epididimozomilor implicate în reacția acrozomală sunt lipina α3 și kinaza cSrc (Kumar și Sharma, 2017).

Zincul reglează cantitatea de proteine care se transferă de la epididimozomi la spermatozoizi. Proteinele ubiquitinilate în epididimozomi sunt responsabile de eliminarea spermatozoizilor cu defecte. Proteina ADAM 7 sau metaloproteazele alfa-dezinteginice exprimată exclusiv în epididimozomi sunt de asemenea implicate în procesul de fertilizare (Kumar și Sharma, 2017).

Maturarea spermatozoizilor are loc și in secrețiile eliberate de glandele anexe. Spermatozoizii se amestecă cu secrețiile glandelor accesorii la ejaculare. Secrețiile veziculelor care sunt produse din celulele acinare prostatice sau glandulare sunt numite prostasomi. Prostasomii sunt prezenți în interiorul veziculele mari în majoritatea celulelor glandulare. Atunci când veziculele mari fuzionează cu membrana plasmatică a celulelor acinare, se secretă prostasomi. Prostazomii au un raport ridicat de colesterol: fosfolipid de 2: 1. Colesterolul ridicat inhibă capacitația spermatozoidului, deoarece efluxul de colesterol din membrana spermatozoidului este stimulator pentru capacitație. Prostazomii conțin proteine de semnalizare dependente de Ca2 +, care sunt importante pentru motilitatea spermatozoizilor. Prostazomii protejează, de asemenea, spermatozoizii împotriva reacției imune în tractul reproducător feminin prin inhibarea căilor de activare a complementului, a fagocitozei mediate de neutrofile și a proliferării limfocitelor (Kumar și Sharma, 2017).

Capitolul III. Cauzele infertilității masculine

III.1 Anomalii genetice

III.1.1 Microdeleții ale brațului lung din cromozomul Y (AZFa, AZFb, AZFc)

Infertilitatea afectează aproximativ 15% din cuplurile aflate la vârsta reproductivă, fiind datorată în 50% din cazuri partenerei, în 35% partenerului, în timp ce în 15% din cazuri cauza rămâne nedecelată. Cauza cea mai frecventă a infertilității masculine este reprezentată de tulburări/anomalii ale spermatogenezei, care duc la oligozoospermii sau azoospermii iar probabilitatea obținerii unei sarcini naturale este foarte scăzută. Microdeleția cromozomului Y este cea de-a doua cea mai frecventă cauză genetică de infertilitate masculină după sindromul Klinefelter (Carrell, 2007). Deși inițial se considera că prezența cromozomului Y (Fig. 13) în cariotipul masculin nu are un rol funcțional, acesta fiind considerat un cromozom „defectuos”, ulterior s-a demonstrat faptul că acesta codifică mai multe gene care sunt necesare dezvoltării masculine și reproducerii. Structural cromozomul Y este compus din segmente eucromatice și heterocromatice care sunt adiacente regiunilor pseudoautozomale situate la capete. Acesta constă din 59 de milioane de perechi de baze de ADN cu cromozomul Y din regiunea specifică sexului masculin ce reprezintă 95% din lungimea cromozomului. Regiunea specifică din cromozomul Y constă din porțiuni eucromatice și heterocromatice care sunt responsabile de diferențierea specifică masculină. Porțiunea eucromatică a cromozomului Y din regiunea specifică masculină are o lungime de aproximativ 24 megabaze și este formată din trei clase de secvențe distincte: X-transpuse, X-degenerate și ampliconice (Garrido și Rivera, 2017) iar regiunea heterocromatică conține 30 megabaze (Carrell, 2007). Există două regiuni pseudoautozomale PABY1 și PABY2 pe brațele scurte și lungi ale cromozomului Y. Acesta cuprinde aproximativ 5% din cromozom și este singura regiune care participă la recombinarea meiotică. Există mai multe gene de pe cromozomul Y asociate cu anomalii genetice și legate de infertilitate. O genă care controlează spermatogeneza este menționată ca factor implicat în azoospermie (AZF), localizată în regiunea Yq11.23 (Carrell, 2007).

Conversia genei non-alelice sau ectopice apare atunci când secvențele neomoloage se combină eronat, iar materialul genetic care intervine poate fi eliminat. Aceste eliminări poartă numele de microdeleție deoarece sunt detectate în urma cariotipării. În cazul pacienților cu oligozoospermie severă sau a celor azoospermici s-a detectat absența unui locus numit locusul specific factorului azoospermic sau AZF. Această regiunea prezintă trei subregiuni care sunt implicate în diferite faze ale opriri spermatogenezei și au fost denumite AZFa, AZFb și AZFc (Garrido și Rivera, 2017).

Fig. 13. Structura cromozomului Y cu delețiile regiunilor AZFa, AZFb și AZFc și a secvențelor repetitive (palindroame-colorate) care explică apariția acestora prin recombinare omoloagă între zone similare (Adaptată după Nieschlag și colab., 2010).

Deleția AZFa

Regiunea AZFa are o lungime de aproximativ 1100 kilobaze și conține două gene (USP9Y și DDX3Y) recunoscute ca fiind vitale pentru procesul de spermatogeneză. Proteina specifică de pe crozomomul Y a fost ubicuitina 9 sau USP9Y, aceasta fiind prima genă identificată în cadrul AZFa. Această genă diferă de alte gene din AZF, deoarece se află într-o singură copie pe cromozomul Y, are o genă omoloagă activă pe cromozomul X și este exprimată într-o gamă de țesuturi. S-a constatat că o microdeleție de numai 4 perechi de baze în exonul genei USP9Y a determinat sinteza unei proteine trunchiate și azoospermie, deși cele mai multe microdeleții sunt mult mai mari, cuprinzând mai multe gene. Acestă microdeleție specifică într-o singură genă demonstrează că o copie funcțională a genei USP9Y pe cromozomul Y este necesară pentru spermatogeneza normală. Cealaltă genă, DDX3Y, implicată în azoospermie, este mai frecvent eliminată decât gena USP9Y, conducând la afectarea gravă a procesului spermatogenic. Deleția totală a subregiunii AZFa este rară, apărând doar în 0,5-4% din microdelețiile cromozomului Y și duce la absența completă a celulelor germinale sau a celulelor Sertoli. Absența completă a regiunii AZFa reprezintă un criteriu de eliminare pentru extracția testiculară a spermatozoizilor (TESE) în vederea injectării intra-citoplasmatice (ICSI) (Garrido și Rivera, 2017).

Deleția AZFb

AZFb este cea mai mare parte din cele trei subregiuni și se întinde pe 6,2 Mb, de la paliandromul 5 până în regiunea proximală a paliandromului 1. Gena principală din această subregiune este RBMY1 fiind un factor specific testicular. RBMY1 aparține familiei genice RBMY, formată din 20-50 de gene specifice testiculelor și pseudogene care sunt răspândite pe ambele brațe ale cromozomului Y. Funcția exactă a RBMY1 în spermatogeneza umană este neclară, în afara faptului că este o proteină nucleară împlicată în splicing-ul ARN pre-mesager. Eliminarea acestei subregiuni are loc în 1-5% din cazuri și determină stoparea maturării la stadiul primar al spermatocitului. Procedura de biopsie testiculară nu este recomandată deoarece aceste celule sunt într-o fază premeiotică și nu pot fi folosite în proceduri de reproducere umană (Garrido și Rivera, 2017).

Deleția AZFc

Regiunea AZFc are o lungime de 3,5 Mb și este localizată între ampliconii b2 și b4. Gena cea mai recunoscută pentru spermatogeneză în această subregiune este gena DAZ. Această genă este specifică testiculului și se exprimă în toate fazele spermatogenezei. Deleția subregiunii AZFc este cea mai comună microdeleție a cromozomului Y, reprezentând 12% din azoospermiile non-obstructive și 6% din cazurile de oligozoospermie. Incidența crescută a deleției AZFc este rezultatul unei identități de secvență ridicate braț la braț (99,97%) care permit o mai mare rată de recombinare ne-omoloagă. Deși în majoritatea acestor cazuri pacienții sunt azoospermici, rata de recuperare a spermatozoizilor prin biopsie testiculară este semnificativ crescută (Garrido și Rivera, 2017).

III.2 Anomalii structurale

III.2.1 Varicocelul și infertilitatea

Varicocelul (Fig. 14) reprezintă a dilatare anormală a venelor testiculare (plexului pampiniform) de la nivelul scrotului. Această anomalie are ca efect apariția durerii și disconfortului la nivelul testiculelor și implicit o încetinire a creșterii testiculelor și infertilitate (Kumar și Sharma, 2017). În definiție modernă, varicocelul este o dilatare patologică a plexului pampiniform sau a sistemului venos cremasteric care este suficient pentru a permite fluxului retrograd sangvin să trecă înapoi în sistemul venos atunci când presiunea intra-abdominală crește. Această anomalie fizică este prezentă la 11,7% dintre barbații cu materialul seminal normal, la 25,4% dintre barbații cu o spermogramă anormală, la aproximativ 25% din populația normală de sex masculin și până la 40% dintre bărbații infertili. Apare mai frecvent în partea stângă la 98% dintre pacienți, probabil din cauza diferențelor anatomice. Vena spermatică stângă se varsă în vena renală stângă și este mai lungă (6-8 cm) decât vena spermatică dreaptă, care se varsă în vena cavă. Se presupune că acest proces are ca rezultat creșterea presiunii hidrostatice, provocând dilatarea acestor vene.

În practica medicală, s-a realizat clasificare varicocelului în: varicocel sublinic, care nu este palbabil sau vizibil în repaus sau în timpul manevrei Valsalva, dar este identificat prin ultrasonografie scrotală și examen Doppler; varicocel de gradul 1, care este palpabil în timpul manevrei Valsalva, dar nu și în alt mod; varicocel de gradul 2, care este palpabil în repaus, dar nu este vizibil și de gradul 3 care este vizibil și palpabil în repaus (Kumar și Sharma, 2017)

Fig. 14. Modificările anatomice la nivelul circulației testiculare în varicocel (După Hamada și colab, 2016)

Deși majoritatea bărbaților cu varicocel sunt fertili și capabili să procreeze, există dovezi care susțin faptul că varicocelul poate afecta fertilitatea masculină (Hamada și colab., 2016).

S-a observat mult timp că fluctuațiile minore ale temperaturii pot afecta spermatogeneza și funcția spermatozoizilor. Scrotul reglează temperatura testiculară, iar varicocelul poate determina o creștere a temperaturii scrotului și astfel poate afecta spermatogeneza. Unii cercetători au demonstrat legătura strânsă dintre creșterea temperaturii intra-scrotale cu afectare funcției testiculare la pacienții cu varicocel. Totoodată, s-a demonstrat că datorită fluxului retrograd al sângelui din venele renale și suprarenale în partea stângă acesta poate conține substanțe toxice, inclusiv o concentrație ridicată de catecolamine. Unii autori au constatat o concentrație de catecolamine mai mare în vena spermatică varicocelică, ceea ce a condus la formularea ipotezei conform căreia catecolaminele din plexul pampiniform produc o vasoconstricție testiculară cronică și contribuie la afectarea spermatogenezei. Varicocelul este asociat cu deteriorarea ADN spermatic, iar aceasta patologie a spermatozoizilor poate fi secundară stresului oxidativ mediat de varicocel. Un alt efect al varicocelului vizează obstrucția ductelor eferente sau a canalului epididimal, care pot afecta maturarea spermatozoizilor în epididim și pot duce la tulburări de motilitate (Zini și Agarwal, 2018).

III.3 Cauze infecțioase

Infecțiile sistemice influențează adesea funcția testiculară chiar și fără a provoca orhită. Sunt implicate numeroase mecanisme, inclusiv febra sau mediatorii inflamatori cum ar fi citokinele. Efectele nete depind de severitate și durată, precum și de situsul infecției (Nieschlag și colab., 2010)

III.3.1 Parotidita epidemică (orhita)

Orhita este recunoscută ca o cauză a infertilității masculine. Deși apare rar la bărbații prepubertali, orhita este întâlnită la până 25% dintre bărbații adulți cu oreion, unii devenind chiar azoospermici. Mecanismele care stau la baza infertilității sunt reprezentate de leziuni ale epiteliului germinal, ischemie sau disfuncția imune (Kumar și Sharma, 2007). Mecanismele pato-fiziolozice includ infecția virală directă a tubilor seminiferi, necroza indusă de presiunea tubilor seminiferi datorită edemului parenchimal din capsula testiculară stransă, precum și de reacția inflamatorie asociată. Leziunile directe asupra distrugerii testiculare sunt evidente în faza acută, prin scăderea proeminentă a testosteronului sangvin și creșterea gonadotropinelor sangvine înainte de atrofia testiculară care apare la jumătate dintre bărbații infectați. Orhita virală apare secundar diseminării virusului pe cale hematogenă și poate fi cauzată atât de paramyxovirus (virusul urlian), cât și de varicela zoster virus și virusul Marburg (Aziz și Agarwal, 2017). Cea mai buna protecție împotriva virusului urlian o reprezintă vaccinarea (Nieschlag și colab., 2010).

III.3.2 Infecțiile cu bacili Gram negativi

Microorganismele pot afecta funcția de reproducere masculină fie direct cauzând aglutinarea spermatozoizilor mobili reducând astfel capacitatea de fertilizare și modificând morfologia celulei sau indirect prin producerea reacțiilor oxidative generate în urma procesului inflamator la infecție. Infiltrarea leucocitelor la situsul inflamației poate fi asociată cu afectarea potențialului de fertilizare al spermatozoizilor datorită proceselor oxidative, apoptotice și imune (Berjis și colab., 2018). Bacilii Gram negativi (în special Escherichia coli) sunt cele mai frecvente cauze ale infecțiilor bacteriene non-gonococice ale tractului genital masculin. Aceste infecții cu bacterii Gram-negative sunt aproape întotdeauna simptomatice și asociate cu piospermie și uroculturi pozitive. Cu toate acestea epididimita și prostatita se întâlnesc rar la bărbații cu vârsta sub 40 de ani. Bacteriile Gram-negative au un efect negativ asupra motilității și viabilității spermei, determinând aglutinarea in vitro a spermatozoizilor. Semnificația clinică a acestor studii in vitro este incertă, deoarece densitatea suspensiilor bacteriene utilizate depășește cu mult pe cea care se găsește în mod normal în ejaculatul bărbaților cu infecții ale tractului genital masculin. Examinarea secreției prostatice a pacienților cu prostatită a relevat faptul că aceasta este mai alcalină, cu un nivel redus de zinc, acid citric și fructoză, modificări ce afectează foarte mult calitatea materialului seminal. Îmbunătățirea calității spermei și a fertilității la bărbații cu infecții bacteriene ale tractului reproducător a fost observată în urma tratamentului cu antibiotice (Bar-Chama și Fisch, 1993). Patogenitatea Escherichia coli este exprimată în special prin capacitatea acesteia de a adera, determinând aglutinarea spermatozoizilor și implicit o scădere a mobilității spermatice sau chiar astenozoospermie severă. În plus studii recente au demonstrat că Escherichia coli produce un factor de imobilizare spermatică. Contactul in vitro al acestei bacterii cu spermatozoizii poate induce o scădere a mobilității spermatice și prin modificarea membranei plasmatice, apariția unor vacuole spermatice și alterarea funcției acrozomale (Boitrelle și colab., 2012).

III.3.3 Infecțiile cu coci Gram-negativi

Gonoreea este cauzată de bacteria Neisseria gonorrhoeae (NG) care aparține familiei Neisseriaceae. Neisseria gonorrhoeae este o bacterie aerobă Gram-negativă, care afectează suprafeța mucoasei tractului genital inferior. Neisseria gonorrhoeae prezintă pili, aceștia fiind niște structuri specializate situate pe suprafața acesteia care contribuie la aderență și conjugare. Legarea pililor la celulele gazdă implică proteina de reglare a complementului CD46. Odată ce bacteriile colonizează mucoasa, acestea provoacă un răspuns inflamator. Uretra masculină reprezintă situsul primar al colonizării care conduce la răspunsul inflamator și la apariția uretritei purulente, care este cel mai frecvent simptom. Durerea sau micțiunea dureroasă sunt de obicei prezente. În puține cazuri, sunt posibile și infecții ale tractului genital superior, precum prostatita sau epididimita. Infecțiile gonococice difuze sunt rareori întâlnite. Gonoreea este diagnosticată prin prepararea unui frotiu din secreția uretrală care arată prezența diplococilor Gram-negativi. Gonoreea este tratată de obicei cu ceftriaxonă și azitromicină. Ceftriaxona este un inhibitor al sintezei peretelui celular bacterian, în timp ce azitromicina este un inhibitor al sintezei proteinelor (Kumar și Sharma, 2017). Datorită studiilor realizate s-a ajuns la concluzia că Neisseria gonorrhoeae are cel mai mare impact direct asupra fertilității masculine dintre infecțiile cu transmitere sexuală. Efectele Neisseria gonorrhoeae includ infecții uretrale, obstrucția canalului ejaculator, obstrucția epididimală și, mai puțin frecvent, diseminarea sistemică. Infecția devine simptomatică în mod obișnuit în decurs de 2 săptămâni și, dacă nu este tratată, poate duce la epididimo-orhită. Într-un studiu al Organizației Mondiale a Sanătății realizat în Uganda Neisseria gonorrhoeae a avut o prevalență de 27,9% la bărbații cu epididimită unilaterală și de 6% la cei cu epididimită bilaterală. Din eșanționul analizat 44% dintre bărbații cu epididimită nu aveau copii. Deși nu foarte frecventă rezistenta la antibiotic, Neisseria gonorrhoeae poate duce la o recrudescență a cazurilor de epididimită și a infertilității (Plessis și colab., 2014)

III.3.4 Infecțiile cu bacterii intracelulare

Chlamydia trachomatis

Clamidioza este cea mai frecventă boală cu transmitere sexuală în țările industrializate și este cea mai importantă cauză etiologică a uretritei non-gonocice și a epididimitei acute la bărbații cu vârsta sub 35 de ani. Între 10% și 25% dintre bărbații infectați pot fi asimptomatici. Infecțiile pot fi invazive, ducând la epididimo-orhită, atrofie testiculară și obstrucție ductală. Chlamydia trachomatis aderă la suprafața celulelor, este endocitată și se multiplică intracelular. Diagnosticul de laborator al bolii este posibil folosind tehnici imunologice pentru a detecta prezența anticorpilor anti Chlamydia trachomatis în ser sau plasmă sau a antigenelor în secreția plasmatică. Deși infecția cu C. trachomatis este un potențial factor etiologic, lipsesc dovezile clare care asociază acest agent cu infertilitatea masculină. Unii autori au studiat rolul infecției asimptomatice cu Chlamydia trachomatis la 52 de bărbați infertili și 45 de controale și au putut izola acest microorganism numai la 1 din cei 52 de subiecți infertili. Alți autori au evaluat 120 de bărbați fertili și 120 de bărbați subfertili prin analiza calității materialului seminal și nu au observat diferențe statistice între infecția cu Chlamydia trachomatis pozitivă și calitatea materialului seminal. Potrivit altor autori care au evaluat 491 de bărbați infertili asimptomatici pentru infecția cu Chlamydia trachomatis, aceștia nu au găsit corelații semnificative ale infecției chlamidiene cu parametrii spermatici. Autorii sugerează că influența principală a infecțiilor cu Chlamydia trachomatis asupra infertilității se datorează transmiterii sexuale, ducând la o patologie tubară la partenerul de sex feminin (Bar-Chama și Fisch, 1993).

Potrivit altor autori, incubarea in vitro a bacteriei Chlamydia trachomatis cu spermatozoizii conduce la astenospermie și la moartea prematură a celulelor. Într-o analiză a probelor de donatori de sperma, unii autori au descoperit că spermatozoizii in probele pozitive infecției cu Chlamydia trachomatis au rate de motilitate semnificativ mai mici și rate semnificativ crescute de teratospermie comparativ cu lotul control (Plessis și colab., 2014). Boitrelle și colab., 2012 au demonstrat că infecția cu C. trachomatis este asociată cu o scădere a volumului spermatic ejaculat, a numărului de spermatozoizi, a gradului de mobilitate și cu apariția morfologiei anormale.

În contrast, alte studii nu au demonstrat nici o diferență semnificativă în ceea ce privește numărul spermatozoizilor, motilitatea sau morfologia acestora în infecția cu Chlamydia trachomatis. Având în vedere prevalența sa ridicată în rândul tinerilor bărbați activi sexual și tendința de a rămâne asimptomatică pentru perioade lungi de timp, este necesară o cercetare suplimentară privind modul în care această infecției influențează fertilitatea (Plessis și colab., 2014)

Ureaplasma urealyticum

Clasa Mollicutes cuprinde opt genuri de bacterii, inclusiv ureaplasmele și micoplasmele. Ureaplasmele genitale și micoplasmele se găsesc frecvent în tractul uman genito-urinar cu prevalență ridicată la persoanele active sexual. Ureaplasma urealyticum a fost asociată cu uretrita non-gonococică și a fost observată la 10-40% dintre bărbații infertili (Plessis și colab., 2014).

Unele studii au demonstrat o asociere între infertilitatea masculină și Ureaplasma. Un studiu realizat pe 625 de bărbați cu infertilitate de etiologie necunoscută a evidențiat o corelație dintre Ureaplasma și scăderea motilității spermatozoizilor și a morfologiei normale. Se crede că Ureaplasma aderă la spermatozoizi, ducând la scăderea motilității și a procentului de spermatozoizi cu morfologie normală dar și la scăderea capacității de fertilizare. Unele studii au raportat că spermatozoizii expuși la Ureaplasma au prezentat o rată scăzută de penetrare a ovocitelor de hamster. Deși există dovezi care sugerează că Ureaplasma afectează negativ funcția spermatozoizilor, rolul său în infertilitatea masculină rămâne controversat (Bar-Chama și Fisch, 1993).

III.4 Factori endocrini

III.4.1 Hipotiroidim și hipertiroidism

Hipertiroidismul și hipotiroidismul sunt principalele boli ale tiroidei cu afecte adverse asupra sistemului reproducător masculin. Hipotiroidismul pe termen scurt nu are un efect semnificativ asupra reproducerii masculine la adulți, în timp ce hipotiroidismul sever, prelungit poate afecta funcția reproductivă. Printre cele mai frecvente anomalii endocrine la bărbați se numără testosteronul seric scăzut (15%), hiperprolactinemia (13,7%) și hipotiroidismul (3,1%). Hipotiroidismul poate afecta morfologia și mobilitatea spermatozoizilor, dar și funcția erectilă. În secțiunile histologice provenite din biopsiile testiculare ale pacienților hipotiroidieni s-au identificat numeroase anomalii. La animale, s-a arătat că funcția anormală a tiroidei a determinat scăderea fertilității și activității sexuale. La animale, dacă hipotiroidismul apare imediat după naștere se observă o întârziere în maturizarea sexuală. La șoarecii masculi cu hipotiroidism congenital, canalele eferente și epididimul sunt fie absente, fie lumenul canalului eferent este redus, ceea ce duce la o atrofie testiculară și la absența spermatozoizilor. Mai mult, la șoarecii masculi cu hipotiroidism tranzitoriu, cu debut gestațional, maturarea spermei în epididim este puternic afectată (Nikoobakht și colab., 2012). Atât hiper și hipotiroidismul pot avea un impact negativ asupra funcției gonadale masculine. La pacienții cu hipertiroidism s-a constatat că nivelurile de testosteron total, estradiol, globulina care leagă hormonii sexuali (SHBG), hormonul luteinizant (LH) și hormonul foliculostimulant (FSH) și răspunsurile gonadotrofinei la GnRH sunt semnificativ mai mari decât valorile normale corespunzătoare vârstei, în timp ce valorile testosteronului liber au fost mai mici. Prin urmare, raportul de testosteron liber / estradiol liber la bărbații hipertiroidieni este mai mic decât în mod normal. Parametrii spermei sunt deseori afectați. Aceste anomalii pot reveni după corectarea hipertiroidismului. S-a raportat că hipotiroidismul este asociat atât cu hipogonadismul hipergonadotrofic, cât și cu cel hipogonadotrofic. Parametrii spermei (în special motilitatea) pot fi afectați (Schill și colab., 2006)

Pacienții hipertiroidieni pot dezvolta ginecomastie, un număr scăzut de spermatozoizi și / sau motilitate scăzută și disfuncție sexuală. Hipertiroidismul este evidențiat ca având efecte atât la nivel hipofizar, cât și la nivel testicular, cu alterarea secreției hormonilor eliberatori și creșterea conversiei androgenilor la estrogeni. Bărbații cu hipotiroidism pot prezenta o scădere a libidoului, precum și alte efecte asupra sistemului nervos central. Scăderea nivelurilor SHBG și scăderea testosteronului total la acești pacienți poate indica eșec testicular. Hipotiroidismul sau hipertiroidismul sunt cauze extrem de rare de infertilitate (Patton și Battaglia, 2005).

III.4.2 Hiperprolactinemia

Prolactina (PRL) este un hormon peptidic produs și secretat în principal de către celulele acidofilice lacto-trofice ale lobului anterior al hipofizei. De asemenea, poate fi secretat de endometru, placentă, glande mamare, celule ale sistemului reticuloendotelial și ocazional de celule neoplazice. În ceea ce privește structura sa chimică, prolactina este o proteină cu masa moleculară de 23,4 kDa, constând din 199 de aminoacizi, conținând trei legături bisulfurice. Este filogenetic cel mai vechi hormon al hipofizei, ceea ce înseamnă că stimulează celulele diferitelor organe. Funcția de bază a prolactinei este acțiunea sa asupra glandelor mamare. Aceasta contribuie la creșterea masei glandelor și la stimularea și întreținerea lactației după naștere. Astfel, ea prezintă acțiune mamutrofică, lactogenică și galactopoietică. Prolactina este responsabilă pentru originea instinctului matern și joacă un rol în toleranța imună în timpul sarcinii. În concentrații scăzute (fiziologice) prezintă un efect "luteotrofic", care acționează ca gonadotrofină, și în concentrații mari inhibă secreția gonadotropinelor pituitare. (Palubska și colab., 2017). Hiperprolactinemia poate fi asimptomatică sau poate prezenta o pierdere a libidoului / disfuncție erectilă însoțită de simptome de presiune dacă este cauzată de o tumoare, de exemplu defecte de câmp vizual. Diagnosticul se bazează pe detectarea constantă a prolactinei în ser (Schill și colab., 2006). Prolactinomul este cea mai frecventă tumoare a glandei pituitare, cuprinzând până la 45% din toate tumorile hipofizare. Prolactinomul este cea mai frecventă cauză de hiperprolactinemie, care provoacă hiperprolactinemie și infertilitate la aproximativ 11% din bărbații oligospermici. Hiperprolactinemia inhibă secreția hormonului eliberator de gonadotrofină, care determină scăderea eliberării a hormonului foliculoluteinizat (FSH), a hormonului luteinizant (LH) și a testosteronului, care la rândul său determină stopări ale spermatogenezei, ducând de asemenea la o motilitate scăzută a spermatozoizilor. Mai târziu produce hipogonadism secundar și infertilitate. Hiperprolactinemia are un efect direct asupra spermatogenezei și steroidogenezei, acționând asupra receptorilor de prolactină prezenți în celule Sertoli și în celule Leydig din testicule și produce hipogonadism și infertilitate primară. Pacienții oligospermici sau azoospermici cu niveluri serice normale de gonadotrofine prezintă niveluri serice relativ mai mari de prolactină, dovedind un rol al prolactinei în gametogeneză, care este independentă de gonadotrofine. Există multe studii care sugerează că hiperprolactinemia are un rol determinant în infertilitatea masculină și este una din cauzele reversibile ale infertilității (Gude, 2011).

III.5 Factori exogeni și stilul de viață

III.5.1 Sedentarismul și obezitatea

Obezitatea, definită de Organizația Mondială a Sănătății (OMS) ca "acumulare anormală sau excesivă de grăsime care poate afecta sănătatea", este o tendință negativă care a crescut în întreaga lume, dublându-se din 1980 până în 2008. Mai exact, OMS estimează că mai mult de 1,5 miliarde din adulții cu vârsta peste 20 de ani sunt supraponderali și că unul din zece adulți din lume este obez. S-a sugerat că această tendință crescătoare a acumulării excesive de țesut adipos nu a fost cauzată doar de creșterea dietelor cu conținut ridicat de zahăr și de colesterol, ci și de o creștere a stilurilor de viață sedentare. În timp ce obezitatea a fost asociată cu o serie de boli cardiovasculare, sindrom metabolic și o mare varietate de anomalii endocrine, cercetările recente au sugerat o posibilă legătură între obezitate și infertilitate masculină (Plessis și colab., 2014).

Mai multe studii demonstrează că indicele de masă corporal (ICM) masculin crescut este asociat cu concentrații plasmatice reduse de globulină care leagă hormonul sexual (SHBG) și testosteron, cu o creștere concomitentă a concentrației plasmatice a estrogenului. Testosteronul scăzut și creșterea estrogenului au fost asociate mult timp cu subfertilitatea și reducerea numărului de spermatozoizi prin întreruperea buclei de feedback negativ a axei gonadale hipotalamice hipofizare (HPG). Alți hormoni implicați în reglarea funcției celulare Sertoli și a spermatogenezei, cum ar fi raportul FSH / LH, nivelurile de inhibină B și SHBG, au fost toate observate ca fiind scăzute la bărbații cu indice corporal crescut (ICM). Acest dezechilibru al semnalelor hormonului foliculostimulant (FSH) și a receptorilor conduce la o gametogeneză aberantă și dezechilibru hormonal. De aceea, rămâne plauzibil faptul că scăderea numarului de spermatozoizi observați în obezitatea masculină sunt, cel puțin, un rezultat al modificarii axei HPG prin testosteron și estrogen și probabil reducerea funcției celulelor Sertoli. Obezitatea masculină este asociată cu niveluri scăzute ale testosteronului total și liber. Această scădere a nivelurilor de androgeni este proporțională cu gradul de obezitate. Diferite mecanisme contribuie la scăderea nivelului total de testosteron și sunt date într-o cale reversibilă de hipogonadism hipogonadotropic. Reducerea funcției pituitare sau hipogonadismul hipogonadotropic la bărbații obezi sunt cauzate de factori multipli. Se știe că la bărbații obezi atât estrogenul, cât și estradiolul sunt crescuți datorită aromatizării periferice sporite a androgenilor. Estrogenii au un efect negativ asupra hipotalamusului prin modificarea efectelor hormonului de eliberare a gonadotropinei (GnRH), având ca rezultat suprimarea secrețiilor de FSH și LH (Schill și colab., 2016). În afară de hiperestrogenemie, s-au propus diferiți factori care să explice hipogonadotropismul observat în obezitate. S-a sugerat că opioidele endogene au un rol în patofiziologia hipoandrogenismului hipogonadotropic la bărbații extrem de obezi. Una dintre deficiențele obezității care pot contribui la producerea parametrilor spermei modificați este creșterea temperaturii testiculare care rezultă din creșterea adipozității scrotului. Procesul de spermatogeneză este foarte sensibil la căldură, având o temperatură optimă la om care variază între 34-35°C. Temperaturile ridicate din scrot, datorate țesutului gras, ar putea afecta celulele spermatozoizilor. Efectul negativ al căldurii este asociat cu o motilitate redusă a spermatozoizilor, o fragmentare crescută a AND-ului spermatic și cu creșterea stresului oxidativ local. Modificările temperaturii testiculare pot apărea printr-o serie de mecanisme, cum ar fi varicocelul, poziționarea laptopurilor pe picioare și băile foarte fierbinți. Îndepărtarea chirurgicală a grăsimi scrotale a fost urmată de o îmbunătățire a parametrilor seminali. Numeroase studii pe organismul uman și pe cel animal au determinat existența unei relații între obezitate și integritatea AND-ului spermatic. Obezitatea masculină a fost legată de o reducere a concentrației și motilității spermatozoizilor, o creștere a afectării AND-ului spermatic și a modificărilor hormonilor sexuali. Unul dintre potențialele mecanisme patologice care stau la baza șanselor reduse de reproducere la bărbații obezi este stresul oxidativ al spermatozoizilor. Studiile au arătat că stresul oxidativ crește odată cu creșterea ICM, în primul rând datorită creșterii activării macrofagelor din lichidul seminal, care conduce la scăderea motilității spermatozoizilor, la creșterea fragmentării AND-ului spermatic, la scăderea reacției acrozomale și la scăderea ratelor de implantare a embrionilor după fertilizare in vitro (FIV). Creșterea ICM a fost descoperit ca fiind legat de scăderea concentrației spermatozoizilor, a testosteronul seric și de creșterea estradiolului seric (Katib, 2015)

III.5.2 Tabagismul

Conținutul fumului de țigară are efecte substanțiale asupra fertilității masculine la nivel mondial. Aproximativ 4.000 de compuși sunt eliberați de o țigară aprinsă constând din gaze, lichide vaporizate și particule rezultate prin procese de hidrogenare, piroliză, oxidare, decarboxilare și deshidratare. Fumul de țigară constă din două faze: gazoasă și particule. Nicotina și gudronul sunt eliberate în faza de particule, în timp ce monoxidul de carbon în faza gazoasă. Poloniu radioactiv, benzopiran, dimetilbenzantracen, naftalen, metilnaftalină, hidrocarburi aromatice policiclice și cadmiu (Cd) sunt substanțe cancerigene și mutagene prezente în țigarete.

Fig. 15. Efectele tabagismului asupra infertilității masculine (Adaptat după Plessis și colab., 2014).

Consensul din literatura medicală arată că fumatul poate afecta în mod virtual orice aspect al sistemului reproductiv masculin. Datorită unei multitudini de factori (Fig. 15), spermatozoizii fumătorilor cronici au o capacitate de fertilizare scăzută și rate de implantare mai slabe. În timp ce parametrii materialului seminal sunt o modalitate de a evalua capacitatea de reproducere a spermatozoizilor aceștia variază deseori extrem de mult. Evaluarea microscopică a efectului fumului de țigară asupra spermatozoizilor a evidențiat fluctuații atât în ceea ce privește cantitatea cât și poziționarea microtubulilor axonemici la fumători. Modificările induse de fumul de tigară (cum ar fi înfășurarea filamentelor colaterale) ar putea împiedica bătăile flagelare, conducând la modificarea motilității normale a spermatozoizilor observate la fumători (Plessis și colab., 2014).

Plasma seminală, componenta fluidă a ejaculatului, joacă, de asemenea, un rol major în fertilitatea masculină. Acest fluid complex conține o mare varietate de molecule, atât organice cât și anorganice, oferind nutriția si protecția spermatozoizilor în timpul traversării tractului reproductiv feminin (Zini și Agarwal, 2018). Glandele sexuale asociate, responsabile de producerea plasmei seminale, sunt un ansamblu de celule specializate pentru a secreta substanțe chimice și compuși pentru a satisface nevoile biologice și metabolice ale unui organism. Glandele sexuale de sex masculin includ veziculele seminale, glanda prostatică și glandele bulbo-uretrale care asigură hrănirea spermatozoizilor și acționează ca mediu pentru transportul spermei. Studiile au analizat funcția acestor trei glande prin examinarea conținutului ejaculat pentru diferiți markeri glandulari (fosfat total pentru veziculele seminale, fosfatază acidă cu zinc pentru glanda prostatică și alfa-1,4 pentru glandele bulbo-uretrale). Rezultatele semnificative din punct de vedere statistic au evidențiat scăderea parametrilor veziculari și prostatici la fumători (Zini și Agarwal, 2018). Speciile de oxigen reactiv (ROS) sunt radicali liberi care conțin oxigen biologic active care au capacitatea de a deteriora ADN-ul și celulele. Atunci când apare un dezechilibru între crearea și neutralizarea speciilor de oxigen reactiv, are loc apariția stresului oxidativ (OS), ducând la deteriorarea lipidelor, acizilor nucleici, proteinelor și carbohidraților. Spermatozoizi sunt foarte susceptibili la OS, datorită citoplasmei și zonei celulare cu enzime și antioxidanți reduse. OS poate deteriora calitatea spermei, ducând la o viabilitate mai scăzută, motilitate și fertilizare scăzută. Similar, speciile reactive de azot (RNS) acționează sinergic cu ROS pentru a provoca OS. Speciile de oxigen reactiv frecvente în spermatozoizi includ anionul superoxid și peroxidul de hidrogen, în timp ce speciile reactive de azot sunt oxidul nitric și peroxid nitritul. Se consideră că diferiți compuși din fumul de țigară traversează bariera hemato-testiculară, provocând fragmentarea AND-ului indusă de strusul oxidativ și reducând calitatea spermatozoizilor (Plessis și colab., 2014).

II. Materiale si Metode

1.1 Populația analizată:

Studiul s-a realizat pe o perioadă de 12 luni (ianuarie 2018-decembrie 2018) pe un număr de 876 de pacienți care s-au prezentat la Centrul de Reproducere Umană Asistată, în vederea efectuării spermogramei și spermoculturii. Media de vârstă a participanților a fost de 36,35±6,12 ani, iar motivul investigației a fost legat de incapacitatea de a obține o sarcină, după o perioadă de 12 luni de contact sexual neprotejat.

1.2 Evaluarea în laborator

1.2.1 Colectarea și evaluarea materialului seminal

Probele de spermă au fost prelevate prin masturbare după 3-5 zile de abstinență. Colectarea probelor s-a realizat în recipiente gradate și sterile. Probele au fost depozitate la 37°C pe o placă termică. După lichefiere, s-a efectuat analiza macroscopică și microscopică a materialului seminal în conformitate cu criteriile manualului Organizației Mondiale a Sănătății (OMS) 2010. Parametrii care au fost luați în studiu au fost reprezentați de volum, vâscozitate, pH, densitatea spermatozoizilor, tipul de mobilitate, numărul de celule rotunde și morfologie.

1.2.2. Volumul seminal

Probele de material seminal au fost evaluate prin măsurarea volumului ejaculat prin utilizarea unei seringi gradate. Volumul considerat normal, în conformitate cu criteriile OMS2010, a fost mai mare de 1,5 ml.

1.2.3 Vâscozitatea

După lichefiere, vâscozitatea probelor a fost evaluată prin aspirarea lichidului seminal cu ajutorul unei pipete Pasteur. O probă cu vâscozitate normală se desprinde, datorită gravitației, în picături mici individuale. Dacă vâscozitatea este crescută desprinderea se realizează sub forma unui fir lung de minim 2 cm.

1.2.4 pH-ul spermei

Măsurarea pH-ului s-a realizat cu ajutorul hârtiei de pH cu valori cuprinse între 5 și 9. Modul de lucru a constat în omogenizarea eșantionului și impregnarea hârtiei de pH. După câteva secunde (<30 secunde) s-a comparat culoarea cu banda de calibrare pentru a se citi pH-ul.

1.2.5 Densitatea și mobilitatea spermatozoizilor

Densitatea și mobilitatea spermatozoizilor a fost evaluată cu ajutorul camerei de numărare Makler. Camera Makler (Sefi Medical Instruments Ltd., Israel) este special concepută pentru a evalua densitatea și mobilitatea spermatozoizilor. Aceasta are doar 10μm adâncime pentru ca tot volumul să fie în același plan focal, iar examinarea să fie foarte precisă. Camera este compusă din două piese din sticlă optic plate. Piesa inferioară este un suport pentru probă, prevăzută cu 4 știfturi din cuarț care creează un spațiu bine definit, unde va fi adăugat un volum de 10μl din proba analizată. Sticla superioară este prevăzută cu o grilă pătrată în centru, împărțită în 100 de pătrate de câte 0,1×0,1 mm fiecare. Când sticla superioară este plasată pe știfturile cuarțului, volumul cuprins între cele două straturi este exact 1 parte/milion dintr-un mililitru. Numărul de spermatozoizi este determinat prin numărarea celulelor în 10 pătrățele. Dacă numărul spermatozoizilor este mic, se numără toate celulele din cele 100 de pătrățele. Conform criteriilor OMS2010, densitatea normală a spermatozoizilor a fost considerată >15 milioane spermatozoizi/mL. Mobilitatea spermatozoizilor a fost evaluată prin numărarea spermatozoizilor mobili în 10 pătrățele. Tipurile de mobilitate au fost grupate în mobilitatea de tip A (spermatozoizi rapid progresivi), mobilitate de tip B (spermatozoizi lent progresivi), mobilitate de tip C (spermatozoizi non-progresivi) și spermatozoizi tip D (spermatozoizi imobili). Conform OMS2010 procentul normal de spermatozoizi cu mobilitate progresivă de tip A și B s-a considerat >32%.

1.2.6 Determinarea numărului de leucocite

Determinarea numărului de leucocite s-a realizat după realizarea testului oxidazei. Acestea au fost numărate prin folosirea metodei LeucoScreen. Pe o lamă s-a pipetat o picătură de probă care a fost amestecată cu o picătură de soluție de lucru (Colorant Leucoscreen și peroxid de hidrogen), s-a acoperit cu o lamelă și s-a lăsat timp de 2 minute pentru a avea loc reacția. Rezultatul a fost citit la o mărime de 400X. Celulele pozitive cu peroxidază s-au colorat în galben-maron, iar celelalte celule în roz.

1.2.7 Morfologie

Determinarea morfologiei spermatozoizilor s-a realizat pe frotiuri colorate May-Grünwald Giemsa (Fig. 16). Soluția May-Grünwald  este o soluție de eozinat de albastru de metilen. Colorantul albastru de metilen are afinitate pentru componentele acide ale celulei (nucleul). Soluția Giemsa este formată dintr-un amestec de eozinat de azur de metilen și alcool metilic. Acestea au afinitate pentru componentele celulare.

Fig. 16. Etapele colorației May-Grünwald  Giemsa.

S-au evaluat aproximativ 200 de spermatozoizi pentru procentul de forme normale și forme anormale. Procentul formelor normale trebuie să fie mai mare de 4%.

1.3. Spermocultura

Spermocultura a permis identificarea microorganismelor patogene prezente în lichidul seminal. Probele de spermă au fost însămânțate pe urmatoarele medii de cultură: geloză sânge, agar Chocolate + PVS, Mac Conkey, Sabouraud și Muller Hinton (pentru realizarea antibiogramei). Placuțele însămânțate au fost incubate la 37°C în anaerobioză timp de 24 h cu excepția mediului Chocolate agar + PVS care s-a incubat timp de 48 h în atmosferă cu 5% CO2. Ziua urmatoare probele au fost evaluate micro și macroscopic . Identificarea a presupus examinare aspectului coloniilor și morfologiei celulelor pe frotiul colorant Gram.

1.4. Analiza statistică a datelor

Datele statistice au fost realizate folosind funcţiile statistice, disponibile în programul Microsoft Excel 2016.

III. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Infertilitatea masculină este considerată o problemă majoră de sănătate, fiind definită ca incapacitatea de a concepe un copil după un an de raport sexual regulat. Infertilitatea de cuplu cauzată de factorul masculin afectează aproximativ 50% dintre cuplurile infertile din întreaga lume. Analiza spermei evaluează statusul fertil al bărbatului și vizează evaluarea unor parametri precum densitatea, mobilitatea, morfologia, integritatea acrozomală, deteriorare ADN, stabilitatea cromatinei, stresul oxidativ și compoziția genomică și proteomică (Khatun și colab., 2018). Deoarece fertilitatea masculină poate fi influențată de o varietate de factori, o posibilă explicație pentru tendința de scădere a fertilității masculine ar fi aceea că există factori de mediu sau ocupaționali care împreună cu stilul de viață contribuie la deteriorarea calității materialului seminal (Durairajanayagam, 2018).

În cadrul studiului nostru, pacienții luați în studiu au fost împărțiți în 7 categorii de vârstă (Fig.17): 17-25, 26-30, 31-35, 36-40, 41-45, 46-50 și peste 51 de ani. Grupele de vârstă predominante au fost reprezentate de pacienții cu vârste cuprinse între 31-35 de ani (284 de pacienți), urmat de grupul de vârstă de 36-40 de ani (279 de pacienți), 41-45 de ani (131 de pacienți) și 26-30 de ani (108 pacienți). Grupurile minoritare de vârstă au fost cele de 17-25 de ani (22 de pacienți), 46-50 de ani (33 de pacienți) și ultima categorie de >51 de ani (19 pacienți).

Media de vârstă a pacienților a fost 36,35 ± 6,12 ani iar grupul predominant de vârstă a fost 31-35 de ani (32,42%) urmat de grupul de vârstă 36-40 de ani (31,85%); așadar decada 31-40 de ani însumează 563 de pacienți (64,27%).

Fig. 17.Distribuțiapacienților pe categorii de vârstă.

Kumar și colab., 2017 au raportat în studiul lor cel mai mare număr de bărbați investigați pentru infertilitate ca făcând parte din grupul 29-42 de ani. Potrivit lui Shabani și colab., 2017 media de vârstă a eșantionului analizat a fost de 33,65±1,68 ani iar în studiul lui Menkveld și colab., 2001 media de vârstă a fost 33,8±4,3 ani, ceea ce ne confirmă faptul că problemele de infertilitate masculină apar preponderent la bărbați după vârsta de 30 de ani.

Valorile parametrilor seminali au fost încadrate conform criteriilor OMS2010 (Tabel 18). În urma efectuării spermogramei s-au avut în vedere urmatprii parametri: aspectul materialul seminal, vâscozitatea, pH-ul, densitatea spermatozoizilor, motilitatea, morfologia lor și numărul de leucocite. Potrivit și altor studii (Levitas și colab., 2007) acești parametri permit studiul influenței vârstei asupra calității spermei.

Tabelul 18: Valorile de referință ale materialului seminal în conformitate cu criteriile

OMS2010 pentru examinarea materialului seminal.

Din analiza celor 876 de spermograme, pacienții au fost clasificați în funcție de densitatea, mobilitatea și morfologia spermatozoizilor. Din totalul de 876 de pacienți, diagnosticul de laborator (Fig. 19) a fost de: a) Normozoospermie (densitate >15 mil./mL, mobilitate >32% și morfologie normală >4%) – 340 de pacienți (38,81%), b) Astenozoospermie (mobilitate progresivă <32%) – 151 de pacienți (17,24%), c) OligoAstenozoospermie (densitate <15 mil./mL, mobilitate <32%)- 129 de pacienți (14,73%), d) OligoAstenoTeratozoospermie (densitate <15 mil./mL, mobilitate <32%, morfologie <4%) – 137 de pacienți (15,64%), e) Oligozoospermie (densitate <15 mil./mL) – 55 de pacienți ( 6,28%), f) Azoospermie (nu s-au identificat spermatozoizi în ejaculat ) – 40 de pacienți (4,57%), g) Criptozoospermie (s-au identificat spermatozoizi după centrifugarea întregii probe într-un volum de 100µl) – 13 pacienți (1,48%), h) Astenoteratozoospermie (mobilitate <32% și morfologie <4%) – 5 pacienți (0,57%), i) Oligoteratozoospermie (densitate <15 mil./ml, morfologie <4%) – 5 pacienți (0,57%) j) Necrozoospermie (spermatozoizi fără mobilitate-imobili 100%)- 1 pacient ( 0,11%) și k) Teratozoospermie (morfologie <4%)- niciun pacient.

În cadrul eșantionului nostru, doar 38,81% dintre pacienți au prezentat toți cei 3 parametri în limitele agreate de OMS2010. Procentajul pacienților care au prezentat doar unul dintre parametrii analizați în limite anormale a fost de 23,52% (206 pacienți). Cei mai mulți dintre aceștia au prezentat astenozoospermie (mobilitate redusă <32%) și oligozoospermie (concentrație <15 mil./mL). Pacienții cu valorile anormale a doi parametri au fost în număr de 15,87% (139 de pacienți) iar cei mai mulți dintre aceștia au prezentat oligoastenozoospermie (92,81%) care se caracterizează printr-un număr mic de spermatozoizi (<15 mil./mL) și mobilitate redusă (<32%) iar celălalt grup a fost reprezentat de astenoteratozoospermie (3,60%), spermatozoizi cu mobilitate redusă (<32%) și morfologie anormală (<4%). oligoteratozoospermie au prezentat doar 3,60% dintre pacienți, iar aceasta se caracterizează prin concentrație scăzută de spermatozoizi (<15 mil./mL) și morfologie modificată (<4%). Grupul care a prezentat toți cei 3 parametrii modificați, care nu au fost cuprinși în criteriile OMS2010, a fost reprezentat de pacienții cu diagnosticul de oligoastenoteratozoospermie (17,12%), aceștia prezintă un număr de spermatozoizi sub 15 mil./mL, mobilitate redusă (<32%) și spermatozoizi cu diferite modificări morfologice (<4%).

În cadrul grupului nostru, pacienții azoospermici la care nu s-a identificat niciun spermatozoid după centrifugarea probei au fost într-un procent de 4,57% (40 de pacienți). Criptozoospermia reprezintă indentificarea spermatozoizilor după centrifugarea întregii probe și examinarea unui volum de 100ul la microscopul optic. În cazul eșantionului nostru, pacienții criptozoospermici au reprezentat 1,48% din numărul total de pacienți.

Potrivit altor studii, criptozoospermia a fost identificată la 9% dintre pacienți, iar azoospermia la 6% dintre pacienți, iar acest lucru se poate datora în principal anomaliilor genetice (Karabulut și colab., 2018). Pe de altă parte unii autori, clasifică azoospermia în azoospermie obstructivă care blochează/împiedică trecerea spermatozoizilor din testicul în ejaculat datorită unor cauze congenitale cum ar fi absența canalelor deferente sau obstrucția epididimală și azoospermie non-obstructivă care poate fi dată de anumite dereglări hormonale, varicocel sau torsiune testiculară (Patel și colab., 2018).

În cazul altor populații, procentul de pacienți normozoospermici cu o spermogramă normală a fost de 57,7%, urmată de pacienții oligozoospermici (19,5%) și de pacienții zoospermici cu un procent de 9,3%, iar doar 13,5% dintre pacienți au prezentat alte diagnostice (Kambala și colab., 2018). Alți autori care au analizat o populație din India prin analiza statistică a 500 de spermograme, 73,99% dintre pacienți au fost normozoospermici (Butt și Akram, 2013). Acest fapt se poate datora diferențelor privind zona geografică, stilul de viață, locul de muncă și factorii de mediu (Karabulut și colab., 2018).

Fig. 19. Distribuția pacienților în funcție de caracteristicile materialului seminal.

În continuare, s-a realizat o analiză a celor 876 de spermograme, în conformitate cu valorile OMS2010 și s-a observat modificarea tuturor parametrilor, față de limitele nromale (Fig. 20). Așadar, cele mai multe valori anormale au fost constatate pentru mobilitatea progresivă a spermatozoizilor (49,77%), urmate de densitatea totală a spermatozoizilor <39 mil./ejaculat (45,09%) iar densitatea scăzută a spermatozoizilor <15 mil./mL s-a identificat la 38,81% dintre pacienți. Totodată numărul de leucocite peste 1 mil./mL a fost găsit la un procent de 44,41% dintre pacien

Fig. 20. Distribuția valorilor normale și patologice ale parametrilor seminali la toți pacienții investigați.

În continuare, s-a realizat evaluarea variațiilor parametrilor seminali în funcție de vârstă. În cadrul grupului de vârstă 17-25 de ani, s-a identificat o scădere a numărului total de spermatozoizi și a mobilității la 59,09% dintre pacienți. În ceea ce privește grupul pacienților cu vârsta de 26-30 de ani, se observă o scădere dramatică a densității spermatozoizilor la 51,85% dintre pacienți dar și o scădere a mobilității spermatozoizilor, la 57,41%. În ceea ce privește acest grup se observă și o creștere a numărului de leucocite peste valoarea de referință.

În cadrul grupului de vârstă de 31-40 de ani (Fig. 21), din care au făcut parte 564 (64%) dintre pacienți se observă faptul că atât densitatea spermatozoizilor, cât și densitatea totală a spermatozoizilor este scăzută la 42,35% dintre pacienți, această scădere fiind corelată și cu mobilitatea scăzută a spermatozoizilor la 51,87% dintre aceștia. În ceea ce privește numărul de leucocite, în cazul ambelor grupe de pacienți acestea au fost crescute în 43,34% din cazuri.

Procentul de spermatozoizi cu morfologie anormală a fost mai ridicat în cadrul grupei de 36-40 de ani cu 26,88% ceea ce sugerează faptul că teratozoospemia se instalează odată cu înaintarea în vârstă. În ceea ce privește grupurile de vârstă de 41-45, 46-50 și peste 50 de ani se observă cele mai mari scăderi în cazul mobilității spermatozoizilor cu peste 60%. Acest lucru indică faptul că după vârsta de 41 de ani mobilitatea progresivă a spermatozoizilor scade dramatic.

În ceea ce privește volumul și pH-ul materialului seminal, acestea nu sunt influențate de vârstă, acestea fiind normale în 91% din cazuri.

In concluzie, noi credem că anumiți parametri spermatici care sunt esențiali pentru fertilitatea masculină și în special mobilitatea spermatozoizilor scade odată cu vârsta.

Rezultatul studiului nostru este întărit de studiul autorilor Kumar și colab., 2017 care au analizat un eșantion de populație și au ajuns la concluzia că îmbătrânirea are un impact negativ asupra diferiților parametri ai materialului seminal și asupra fertilității masculine.

Fig.20. Variația parametrilor seminali în funcție de vârsta pacienților investigați pentru

infertilitate.

ASTENOZOOSPERMIA

Pacienții cu astenozoospermie au fost în numărul cel mai mare (427 de pacienți), reprezentând 48,75% din numărul total de pacienți. Pacienții cu astenozoospermie prezintă o mobilitate scăzută a spermatozoizilor (<32%), ceea ce indică faptul că există o relație directă între incapacitatea de fecundare a unui ovocit datorită mobilității scăzute și infertilitate.

Mobilitatea spermatozoizilor este un factor extrem de important pentru ca aceștia să se deplaseze către trompa uterină în vederea penetrării și fertilizării ovocitului. Astenozoospermia sau mobilitatea scăzută a spermatozoizilor poate fi cauzată de deficiența funcțională a structurii spermatozoizilor sau de absența/prezența peste valoarea normală a unor componente din plasma seminală. Conform OMS2010, mobilitatea spermatozoizilor este clasificată de la A la D. Mobilitatea de tip A grupează spermatozoizii care au o mișcare rapidă și rectilinie, spermatozoizii de tip B se deplasează mai lent. Spermatozoizii de tip A și B au fost incluși în grupul cu motilitate progresivă (PR), aceștia fiind capabili să fecundeze un ovocit. Spermatozoizii de tip C sunt spermatozoizi cu mobilitate non-progesivă, aceștia având bătăi statice flagelare iar ultimul grup, spermatozoizii de tip D sunt spermatozoizii imobili, fără mobilitate.

În cazul astenozoospermiei, Guo și colab., 2017 au raportat o asociere între nivelul crescut al leptinei din plasma seminală și mobilitatea scăzută a spermatozoizilor. Potrivit lui Qin și colab., 2019 gradul de astenozoospermie severă până la ușoară este dat de numărul de gene hipermemetilate și hipometilate anormal care sunt implicate în mobilitatea scăzută a spermatozoizilor.

În cadrul studiului nostru, la cei 436 pacienți astenozoospemici s-a identificat și o modificare a celorlalți parametri (Fig. 22). În ceea ce privește vâscozitatea probei, 14,91% dintre pacienți au prezentat o vâscozitate crescută. Într-un studiu efectuat pe un eșantion de pacienți cu hipervâscozitate a materialului seminal (23,2%) s-a identificat faptul că vâeliscozitatea crescută influențează foarte mult mobilitatea spermatozoizilor iar apariția acesteia se datorează unui cumul de factori (genetici, enzimatici, biochimici) care acționează sinergic (Elia și colab., 2009). Gradul de vâscozitate crescută este asociat în cadrul studiului nostru și cu un număr mare de leucocite în ejaculat (53,85%). Rezultatul studiului nostru este susținut și de studiul autorilor Mahran și Saleh, 2015, care au asociat hipervâscozitatea cu un număr crescut de leucocite în materialul seminal și că vâscozitatea crescută este rezultatul unei inflamații a tractului genital care conduce la modificarea unor componente din structura plasmei seminale cum ar fi fructoza, acidul ascorbic, calciul și zincul și care au un efect negativ asupra mobilității spermatozoizilor. La nivelului întregului eșantion, 43,35% dintre pacienții astenozoospermici au prezentat piospermie. Se consideră că numărul de leucocite crescute în materialul seminal inhibă motilitatea spermatozoizilor prin faptul că acestea elimină substanțe microbicide, dar acestea au un efect toxic și asupra spermatozoizilor. Potrivit lui Moubasher și colab., 2018 leucitospermia a fost catalogată ca jucând un rol major în deterioararea ADN spermatic prin stresul oxidativ, leucocitele fiind sursa principală de specii oxigenice reactive implicate în mobilitatea scăzută a spermatozoizilor.

Fig. 22. Distribuția parametrilor seminali la pacienții astenozoospermici.

Un alt parametru modificat din cadrul eșantionului analizat a fost reprezentat de vâscozitatea scăzută. Probele de material seminal care au prezentat o densitate de spermatozoizi <15 mil./mL au fost asociate cu o vâscozitate scăzută. În ceea ce privește numărul de leucocite din materialul seminal, doar 23,76% dintre pacienți au prezentat un număr crescut de leucocite. În schimb un procent de 62,71% dintre pacienți au prezentat anomalii ale spermatozoizilor (teratozoospermie) în comparație cu probele cu hipervâscozitate la care morfologia modificată a spermatozoizilor s-a găsit doar la 29,23% din pacienți. Potrivit unui studiu care întărește datele obținute de noi, defectele morfologice ale spermatozoizilor cresc odată cu scăderea numărului de spermatozoizi (Goyal și colab., 2018).

Mobilitatea spematozoizilor de tip A a fost semnificativ scăzută în cadrul populației analizate, doar 32,34% dintre pacienți au prezentat spermatozoizi cu mobilitate de tip A în comparație cu pacienții normozoospermici la care spermatozoizi cu mobilitate de tip A a fost întâlnită într-un procent ridicat de 79,71%.

OLIGOZOOSPERMIA

O densitate scăzută de spermatozoizi poartă numele de oligozoospermie (Fig. 23). Aceasta este adesea însoțită de mobilitate scăzută (astenozoospermie) și morfologie anormală (teratozoospermie), care reflectă defectele calitative și cantitative ale spermei. Fertilitatea la bărbați este afectată de un număr mic de spermatozoizi motili care vin în proximitatea ovocitului în vederea fecundării, iar aceste defecte funcționale apar în infertilitatea neexplicată sau idiopatică. Pentru acest timp de infertilitate nu există un anumit tratament, însă se are în vedere dozarea hormonilor tiroidieni și a hormonilor secretați de glanda hipofiză. De asemenea anumite patologii de la nivelul testiculului, cum ar fi varicocelul poate duce la o densitate scăzută a spermatozoizilor, în care se impune tratamentul chirurgical.

În cadrul studiului nostru, s-a realizat gruparea pacienților cu oligozoospermie, în funcție de densitatea spermatozoizilor în oligozoospermie severă care a reprezentat 39,16% dintre pacienți, oligozoospermie moderată (29,31%) și oligozoospermie ușoară întâlnită la 16,63% dintre aceștia. Cazurile de azoospermie în care nu s-a găsit niciun spermatozoid au reprezentat 7,92% din totalul pacienților cu oligozoospermie.

Oligozoospermia a fost asociată în 53,66% din cazuri cu mobilitatea progresivă redusă a spermatozoizilor (astenozoospermie) și morfologia anormală (teratozoospermie). În acest studiu s-a constatat că mobilitatea spermatozozoizilor scade odată cu scăderea numărului de spermatozoizi, iar doar 10% dintre pacienții oligozoosprmici au prezentat mobilitate progresivă peste >32% conform criteriilor OMS2010.

Fig. 23. Distribuția pacienților în funcție de numărul de spermatozoizi.

TERATOZOOSPERMIA

Teratozoospermia este o afecțiune caracterizată printr-un număr mare de spermatozoizi cu morfologie anormală și este considerată a fi un factor care poate duce la infertilitatea masculină. Caracteristicile morfologice ale spermatozoizilor sunt rezultatul modificărilor celulare foarte complexe care apar în timpul spermatogenezei. Aceste modificări anormale pot apărea fie numai la nivelul capului, gâtului sau cozii, fie pot fi mixte. Cele mai frecvente modificări (Tabel 24) structurale apar la nivelul capului, acesta poate fi, globulos, macrocefalic, dublu, amorf, vacuolat, iregulat, conic, în formă de ac, sau cu acrozom peste 75% din suprafata lui. Modificările de gât pot fi reprezentate de gât îngroșat, gât frânt, iregulat, cu picătură citoplasmatică iar modificările de la nivelul cozii cuprind coadă răsucită, dublă, frântă, scurtă (Fig. 25 A-X). Potrivit unor studii, Ma și colab., 2019 au studiat starea condensării cromatinei prin metode biologie și biochimice și au constatat că o condensare anormală a cromatinei duce la apariția modificărilor de cap și se datorează faptului că în timpul condensării are loc înlocuirea incompletă a histonei cu protamina și implicit duce și la o elasticitate nucleară (cap amorf).

În cadrul studiului nostru, am identificat o relație directă între timpul de abstinență și modificările anormale ale spermatozoizilor. În cazul pacienților cu abstinență de la 0 până la 2 zile procentul de spermatozoizi sub 4% forme normale a fost prezent doar la 21,33% dintre aceștia. De asemenea teratozoospermia este însoțită și de o concentrație scăzută de spermatozoizi sub 15 mil./ mL. în 93 % din cazuri.

Tabelul 24. Tipuri de modificări morfologice ale spermatozoizilor

Fig. 25 A-X. Tipuri de modificări structurale prezente la nivelul capului, gâtului și cozii. Colorație May-Grünwald Giemsa, X630.

Una dintre cauzele infertilității masculine o poate reprezenta infecțiile ale tractului genito-urinar masculin. Infecțiile acute și cronice și inflamația sistemului reproducător masculin pot duce la un dezechilibru al întregului proces spermatogenic care determină modificări calitative și cantitative ale spermatozoizilor și ar putea compromite funcția acestora. Bacteriile prezente în materialul seminal provin din tractul genital al bărbatului sau pot fi contaminări.

Asocierea dintre infecție și calitatea spermatozoizilor este susținută în unele studii prin constatarea faptului că s-au găsit mai puține bacterii în plasma seminală a bărbaților fertili. Acțiunea acestor microorganism poate fi directă asupra spermatozoizilor sau indirectă asupra plasmei seminale, prin apariția anticorpilor antispermatici (Merino și colab., 1995).

Prezența leucocitelor în spermă sau leucocitospermia are un impact negativ asupra calității materialului seminal datorită producției de specii reactive de oxigen (ROS). ROS produse de leucocite măresc rata de apoptoză a spermatozoizilor maturi, aceștia având și o probabilitate mai mare de a prezenta un ADN fragmentat (Zeyed și colab., 2017).

În cadrul studiului nostru din cei 876 de pacienți, 206 au prezentat spermoculturi pozitive (23,52%). Etiologia și prevalența (Fig. 26) au fost reprezentate de Enterococcus spp. (52,91%) (n=109), Escherichia coli (31,07%) (n=64), Proteus spp. (6,80%) (n=14), Klebsiella spp. (5,34%) (n=11), Streptococcus de grup B (1,94%) (n=4), Morganella spp., Providencia spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (0,49% fiecare) (n=1).

Fig. 26. Prevalența tulpinilor bacteriene la pacienții cu spermoculturi pozitive.

În cadrul unui alt studiu, Staphylococcus aures a fost cel mai frecvent izolat (40%), urmat de Escherichia coli (25%), Klebsiella ozaenae (15%), Proteus vulgaris (12,5%) și Pseudomonas aeruginosa (10%) (Sasikumar și colab., 2013).

Agyepong și Bedu-Addo, 2018 au cercetat prevalența speciilor bacteriene și au identificat o posibilă cauză între infecția spermatică și infertilitatea masculină. Speciile izolate au fost reprezentate de Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas spp., Proteus spp., Klesbsiella spp. și Morganella morganii. Moretti și colab., 2009 pe lângă aceste specii au mai identificat într-un procent foarte mare Enteroccocus faecalis. În studiul autorilor Baud și colab., 2019 aceștia au identificat alte genuri și specii bacteriene implicate în infecții ale tractului genital masculin. Genurile și speciile microbiene au aparținut grupurilor: Actinobacterii (Corynebacterium), Bacteroidetes (Prevotella), Firmicutes (Lactobacillus, Streptococcus, Staphylococcus, Planococcaceae, Finegoldia), și Proteobacteria (Haemophilus, Burkholderia).

În cazul cocilor Gram-pozitivi izolați în acest studiu (Enterococcus spp. și Streptococcus de grup B) (n = 113) s-a constatat că tulpinile au efect asupra mobilității spermatozoizilor, acestea ducând la o mobilitate progresivă scăzută în 42,06% din cazuri. În acest caz, numărul crescut de leucocite a fost prezent la 44,25% din pacienți (Fig. 27)

Fig. 27. Distribuția parametrilor seminali la pacienții cu infecții produse de coci Gram-pozitivi.

În cazul studiului nostru se asociază numărul crescut de leucocite cu mobilitatea și densitatea scăzută a spermatozoizilor în cazul infecției cu Enterococcaceae. Potrivit autorilor Vilvanathan și colab., 2016, Lozano-Hernandez și colab., 2017 tulpinile de Enterococcus spp. au fost identificate și izolate mai frecvent la pacienții cu teratozoospermie și oligozoospermie.

În cazul Enterococcaceelor izolate (Enterococcus spp. și Streptococcus de grup B ) (n = 113) toate tulpinile au fost rezistente la tetraciclină (100%) iar 72,57% dintre tulpini la eritromicină (Fig. 28).

Din numărul total (n = 113) de tulpini de Enterococcus sp și Streptococcus de grup B o proporție redusă au prezentat rezistență la ofloxacin și ciprofloxacin (7,08%) și cloramfenicol (3,4%). Restul antibioticelor, reprezentate de rifampicină, penicilină, ampicilină, vancomicină și amoxicilină/acid clavulanic prezintă eficacitate de 100% asupra inhibării multiplicării acestora. În cadrul studiului nostru tulpinile bacteriene au manifestat rezistență la antibiotice uzuale, în comparație cu studiul autorilor Vilvanathan și colab., 2016 care au raportat o incidență ridicată a tulpinilor de Enterococcus spp. rezistente la vancomicină și cloramfenicol.

Fig.28. Distribuția tulpinilor de coci Gram-pozitivi rezistente la antibiotice.

În cazul Enterobacteriaceelor izolate în acest studiu (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Morganella spp., Providencia spp.) (n = 91), cea mai mare prevalență a avut-o Escherichia coli (31,07%) (n=64), urmată de Proteus spp., (6,80%) (n=14), Klebsiella spp. (5,34%) (n=11) celelalte specii Morganella spp., și Providencia spp., reprezentând (0,49%) (n=1).

Prin analiza comparativă a parametrilor seminali la pacienții cu spermoculturi pozitive care au prezentat tulpini de Escherichia coli, Proteus spp., și Klebsiella spp., s-a identificat o scădere a mobilității spermatozoizilor la 52,43% dintre pacienți dar și a densității normale de spermatozoizi (43%). Procentul crescut de leucocite a fost semnificativ mai mare la pacienții cu Escherichia coli (51,56%) în comparației cu pacienții care au prezentat o infecție cu Proteus spp. (36,36%).

Fig.29. Variația parametrilor seminali în cazul infecțiilor cu tulpini din familia Enterobacteriaceae.

Tulpinile de Escherichia coli sunt cunoscute pentru capacitatea lor de a imobiliza și de a deteriora morfologia spermatozoizilor prin contact direct mediat de adezine, precum pilii sau fimbriile dar și de interacțiunile dependente de receptorul de manoză. De asemenea suprafața spermatozoidului este bogată în glicoproteine și este prin urmare susceptibilă la aderarea bacteriilor (Zeyed și colab., 2018). Prevalența tulpinilor de Escherichia coli a fost identificată în 48,2% din cazuri în cadrul pacienților astenozoospermici (Agyepong și Bedu-Addo, 2018). Acest lucru ne confirmă faptul că și în cazul eșanționului nostru, cât și al altor autori tulpinile de Escherichia coli sunt asociate cu o incidență crescută a astenozoospermiei.

Din numărul total (n = 91) de tulpini de Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp., Morganella spp., Providencia spp., 98,90% (n=90) acestea au prezentat rezistență la: ampicilină 29,67% (n=27), amoxicilină/acid clavulanic, 25,27% (n=23), cefuroxim, sulfametoxazol/trimitoprim 18,68% (n=17), gentamicină și cloramfenicol 14,29% (n=13), ciprofloxacin 12,09% (n=11) și Ceftriaxon și Ceftazidim 2,20% (n=2). Administrarea de ampicilină (Fig. 12) este ineficiență datorită fenomenului de rezistență naturală a tulpinilor.

Fig. 30. Distribuția tulpinilor de enterobacterii rezistente la antibiotice.

O cauză a infertilității masculine o reprezintă varicocelul, incidența acestuia în populația de sex masculin fiind în general de 15% iar în cazul bărbaților subfertili într-un procent de 21-39%. Deși patofiziologia sa nu este clară, se caracterizează prin leziuni testiculare progresive, volum testicular redus și disfuncția celulelor Leydig (Rehman și colab., 2019) iar alți autori sugerează că hipertermia scrotală, stresul oxidativ, tulburările hormonale și metaboliții toxici duc la infertilitatea masculină mediată de varicocel (Agarwal și colab., 2016).

În cadrul studiului nostru, 30 dintre pacienții care s-au prezentat la clinică au declarat că suferă de varicocel. În urma analizei rezultatelor spermogramelor, se identifică un procent de 66,67% al numărului scăzut de spermatozoizi (<15 mil./ml) dar și o scădere a mobilității progresive, cu valori anormale la 76,67% dintre pacienți (Fig. 13). De asemenea se observă și un grad mare de teratozoospermie la 43,33% dintre pacienții cu varicocel. Aceste rezultate sunt susținute și de studiul autorilor Taha și colab., 2012 care au comparat spermogramele unor pacienți înainte și după tratamentul chirurgical al varicocelului. Preoperator aceștia prezentau o densitate scăzută a spermatozoizilor, o rată scăzută de mobilitate progresivă dar și morfologiei anormală. Dupa cura chirurgicală s-a identificat o rată de normalizare semnificativă a acestor parametri.

Fig. 31. Variația parametrilor seminali la pacienții cu varicocel.

Asocierea varicocelului cu infertilitatea masculină se datorează în primul rând creșterii temperaturii scrotale care duce la o spermatogeneză dezechilibrată. Alte studii care au realizat o corelare între creșterea temperaturii scrotale și scăderea parametrilor seminali au vizat 2 grupuri de pacienți, primul grup expus la temperatură crescută iar celălalt grup fiind expus la temperatura normală. S-a identificat o scădere considerabilă a parametrilor seminali la pacienții expuși la temperatură ridicată în comparație cu cei care nu au fost expuși la temperatură înaltă (Hamerezaee și colab., 2018).

Tabagismul sau consumul regulat de tutun reprezintă o altă cauză care poate duce la infertilitate. Se consideră că 37% din populația României este consumatoare de tutun. Fumul de țigară conține un număr mare de substanțe recunoscute ca agenți carcinogeni și mutageni, inclusiv poloniu radioactiv, cadmiu, benzopiran, dimetilbenzantracen, dimetilnitrosamină, naftalină și metaftalenă. Cu toate acestea, toxicitatea multora dintre constituenții din fumul de tigară nu au fost evaluate pentru efectul lor asupra spematozoizilor (Meri și colab., 2012). Unele studii au arătat că efectul nicotinei duce la o scădere a producției hormonilor sexuali care influențează parametrii seminali dar această ipoteză este sub investigare (Al-Turki, 2015).

În studiul nostrum (Fig. 32), s-a identificat o scădere a mobilității spermatozoizilor în 46,81% din cazuri. Această scădere a mobilității este corelată și cu o scădere a numărului de spermatozoizi sub 15 mil./mL (40,43%). În ceea ce privește morfologia spermatozoizilor numai 10,64% dintre pacienți prezintă modificări structurale ale spermatozoizilor sub 4%. Aceste rezultate sunt susținute și de Parmar și colab., 2015 care au analizat un grup de fumători și un grup de nefumători și au identificat o scădere a mobilității spermatozoizilor și a densității. Ca și în cazul studiului nostru, Mostafa și colab., 2006 nu au găsit corelații între teratozoospermie și consumul de țigări la grupul studiat. Alți autori au identificat o scădere a tuturor parametrilor la pacienții fumători investigați (Vine și colab., 1993). Pe de altă parte rata de sarcini scăzute la fumători s-ar putea datora stresului oxidativ și modificărilor genetice și epigenetice induse de fumat, acestea putând să se coreleze direct cu reducerea funcției spermatozoizilor și a capacității de fertilizare a acestora. Aceste modificări la nivelul ADN au fost puse în evidență de Vine și colab., 1993 utilizând metoda imunoperoxidazei care a arătat prezența legăturilor formate între benzopiran și ADN spermatozoizilor la bărbații fumători.

Fig. 32. Variația parametrilor seminali la bărbații fumători.

Obezitatea sau indicele de masă corporală crescut reprezintă o altă cauză a infertilității masculine. Numeroase studii au constatat o scădere a parametrilor seminali odată cu creșterea în greutate. În cazul bărbaților, creșterea în greutate duce la tulburări ale axei hipotalamo-hipofizare, afectând nivelul de testosteron și estrogen. Raportul modificat al acestor doi hormoni duce la afectarea gravă a spermatogenezei. Influența obezității masculine poate avea efect asupra metilării ADN-ului din spermatozoizi și efecte asupra numărului de spermatozoizi din ejaculat și asupra motilității (Ramaraju și colab., 2018).

În acest studiu, am analizat efectul indicelui de masă corporală (ICM) crescut asupra parametrilor seminali și asupra statusului fertil.

În ceea ce privește eșantionul analizat (Fig. 33), 8,11% dintre pacienți au prezentat un indice de masă corporală crescut. Parametrii seminali la acești pacienți au fost foarte scăzuți în ceea ce privește mobilitatea spermatozoizilor, care a fost anormală în 59,15% din cazuri dar și a densității spermatozoizilor, la 52,11% dintre pacienți. Morfologia anormală a spermatozoizilor a fost prezentă la 26,76% dintre aceștia. Rezultatele noastre sunt susținute și de rezultatele autorilor Bieniek și colab., 2016 care au analizat diferiți pacienți cu diferiți indici de masă corporală și au ajuns la concluzia că motilitatea, densitatea spermatozoizilor și morfologia scade odată cu creșterea greutății corporale. Un alt studiu realizat pe 1285 de pacienți dintre care 201 erau obezi, a relevat faptul că în majoritatea cazurilor, pacienții erau oligozoospermici și astenozoospermici (Ramaraju și colab., 2018). Pe de altă parte alți autori nu au găsit modificări semnificative și corelații între mobilitatea spermatozoizilor și indicele de masă corporală crescut, singurul parametru care a prezentat schimbări semnificative fiind densitatea spermatozoizilor care a fost scazută la bărbații cu greutate corporală peste medie (Alshahrani și colab, 2016).

Fig. 33. Variația parametrilor seminali la pacienții cu indice de masă corporală crescut.

CONCLUZII

Media de vârstă a pacienților luați în studiu a fost 36,35±6,12 ani, iar decada 31-40 a însumat 563 de pacienți (64,27%) ceea ce ne indică faptul că infertilitatea la sexul masculin apare cu precădere după vârsta de 30 de ani.

Din analiza celor 876 de spermograme, 340 de pacienți au prezentat parametrii spermatici (densitate, mobilitate, morfologie) în limite normale, restul pacienților au prezentat modificarea a cel puțin unui parametru seminal. Diagnosticul de azoospermia (lipsa spermatozoizilor din ejaculat) a fost pus unui număr de 40 de pacienți;

În cadrul pacienților cu vârsta între 31-40 de ani s-a identificat o scădere a densități spermatozoizilor la 42,35% dintre aceștia și o scădere a mobilității progresive la 51,85% dintre pacienți. Procentul de spermatozoizi cu morfologie anormală a fost mai ridicat în cadrul grupei de 31-40 de ani cu 26,88% ceea ce sugerează faptul că teratozoospemia se instalează odată cu înaintarea în vârstă.

Pacienții cu astenozoospermie au fost în număr de 427 iar 15% dintre aceștia au prezentat hipervâscozitatea probei. De asemenea, 43,35% dintre pacienți au prezentat piospermie. Vâscozitatea și piospermia afectează așadar mobilitatea progresivă a spermatozoizilor.

În cadrul pacienților cu oligozoospermie (densitate scăzută de spermatozoizi) s-a identificat faptul că 53,66% din cazuri prezintă mobilitate progresivă scăzută și morfologie modificată. În acest fel s-a constatat faptul că odată cu scăderea numărului de spermatozoizi scade mobilitatea și morfologia spermatozoizilor.

Din analiza timpului de abstinență s-a identificat o corelare între zilele de abstinență și morfologia spermatozoizilor. Procentul de pacienți cu morfologie anormală a fost sub 21% în cadrul grupului 0-2 zile de abstinentă. Acest lucru ne sugerează că morfologia spermatozoizilor se poate datora și timpului prelungit de abstinență sexuală.

Prevalența speciilor bacterine prezente în materialul seminal au fost reprezentate de Enterococcus spp. (52,91%), Escherichia coli (31,07%), Proteus spp. (6,80%), Klebsiella spp. (5,34%), Streptococcus de grup B (1,94%), Morganella spp., Providencia spp., Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus (0,49%).

În cazul cocilor Gram-pozitivi izolați s-a identificat o scădere a parametrilor seminali, mai exact a mobilității spermatozoizilor la 44% dintre pacienți.

În cazul Enterococcaceelor izolate (Enterococcus spp. și Streptococcus de grup B) toate tulpinile au fost rezistente la tetraciclină (100%) iar 72,57% dintre tulpini la eritromicină datorită fenomenului de rezistența naturală a tulpinilor.

În cazul Enterobacteriaceelor, Escherichia coli duce la scade densitatea spermatozoizilor și mobilității progresive acestora.

Pacienții cu varicocele au prezentat o scăderea a densității spermatozoizilor și a mobilității progresive cu aproximativ 70%.

În cazul pacienților cu indicele de masa corporală crescut s-a identificat o scădere a mobilității progresive a spermatozoizilor cu 59%.

BIBLIOGRAFIE

Agarwal, A., Sharma, R., Harlev, A., & Esteves, S. (2015). Effect of varicocele on semen characteristics according to the new 2010 World Health Organization criteria: a systematic review and meta-analysis. Asian Journal of Andrology, 18(2), 163.

Agyepong, E., & Bedu-Addo, K. (2018). Semen parameters and the incidence and effects of bacteriospermia in male partners of infertile couples attending a fertility clinic in the Kumasi Metropolis, Ghana. International Journal of Reproduction, Contraception, Obstetrics and Gynecology, 8(1), 99.

Al-Turki, H. (2015). Effect of smoking on reproductive hormones and semen parameters of infertile Saudi Arabians. Urology Annals, 7(1), 63.

Alshahrani, S., Ahmed, A. F., Gabr, A. H., Abalhassan, M., & Ahmad, G. (2016). The impact of body mass index on semen parameters in infertile men. Andrologia, 48(10).

Aziz N., & Agarwal A., (2017). Diagnosis and Treatment of Male Infertility. Editura Springer.

Bar-Chama, N., & Fisch, H. (1993). Infection and pyospermia in male infertility. World Journal of Urology, 11(2), 76–81.

Baud, D., Pattaroni, C., Vulliemoz, N., Castella, V., Marsland, B. J., & Stojanov, M. (2019). Sperm microbiota and its impact on semen parameters. Frontiers in Microbiology, 10(FEB), 1–9.

Berjis, K., Ghiasi, M., & Sangy, S. (2018). Study of seminal infection among an infertile male population in Iran, and its effect on sperm quality. Iranian Journal of Microbiology, 10(2), 111–116.

Boitrelle, F., Robin, G., Lefebvre, C., Bailly, M., Selva, J., Courcol, R., Albert, M. (2012). Bacteriospermia in Assisted Reproductive Techniques: Effects of bacteria on spermatozoa and seminal plasma, diagnosis and treatment. Gynecologie Obstetrique et Fertilite, 40(4), 226–234.

Butt, F., & Akram, N. (2013). Semen analysis parameters: Experiences and insight into male infertility at a tertiary care hospital in Punjab. Journal of the Pakistan Medical Association, 63(5), 558–562.

Carrell D. T., (2007). The Genetics of Male Infertility. Editura Human Press.

Coward K., Wells D., (2013). Textbook of Clinical Embryology. Editura Cambridge University Press.

De Jonge, J. C., , Barrat, L. R. C., (2006). The Sperm Cell. Production, Maturation, Fertilization, Regeneration. Editura Cambridge University Press.

Dongmei Cui (2011). Atlas of Histology with Functional & Clinical Correlations. Editura Lippincott Williams & Wilkins, Wolters Kluwer business.

Durairajanayagam, D., (2018). Lifestyle causes of male infertility. Arab Journal of Urology, 16(1), 10–20.

Elia, J., Delfino, M., Imbrogno, N., Capogreco, F., Lucarelli, M., Rossi, T., & Mazzilli, F. (2009). Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian Journal of Andrology, 11(5), 609–615.

Garrido N., Rivera R., (2017). A practical guide to sperm analysis. Basic Andrology in Reproductiv Medicine. Editura CRC Press.

Goyal, Rachna & Kotru, Mrinalini & Gogia, Aarti & Sharma, Sonal. (2018). Qualitative defects with normal sperm counts in a patient attending infertility clinic. Indian Journal of Pathology and Microbiology. 61. 233

Gude, D., (2011). Finasteride and male fertility. Journal of Human Reproductive Sciences, 4(2), 101.

Guo, D., Wu, W., Tang, Q., Qiao, S., Chen, Y., Chen, M.,Wang, X. (2017). The impact of BMI on sperm parameters and the metabolite changes of seminal plasma concomitantly. Oncotarget, 8(30), 48619–48634.

Guraya, S. (1987). Biology of Spermatogenesis and Spermatozoa in Mammals. In Animal Reproduction Science (Vol. 20).

Hamada A., Esteves C. Sandro, Agarwal A. (2016). Varicocele and Male Infertility.Current Concepts, Controversies and Consensus. Editura Springer.

Hamerezaee, M., Dehghan, S. F., Golbabaei, F., Fathi, A., Barzegar, L., & Heidarnejad, N. (2018). Assessment of Semen Quality among Workers Exposed to Heat Stress: A Cross-Sectional Study in a Steel Industry. Safety and Health at Work, 9(2), 232–235.

Kambala GM., Kalakonda, M., & Vk, Undavalli. (2018). Pattern of Semen Analysis : An Insight into Male Infertility at a Tertiary Care Hospital . Journal of Dental and Medical Sciences (IOSR-JDMS17(2), 30–33.

Karabulut, S., Keskin, I., Kutlu, P., Delikara, N., Atvar, O., & Ozturk, M. I. (2018). Male infertility, azoozpermia and cryptozoospermia incidence among three infertility clinics in Turkey. Türk Üroloji Dergisi/Turkish Journal of Urology, 44(2), 109–113.

Katib, A. (2015). Mechanisms linking obesity to male infertility. Central European Journal of Urology, 68(1), 79–85.

Khatun, A., Rahman, M. S., & Pang, M. G. (2018). Clinical assessment of the male fertility. Obstetrics & Gynecology Science, 61(2), 179.

Kumar A., Sharma M., (2017). Basics of Human Andrology. Editura Springer.

Kumar, N., Singh, A. K., & Choudhari, A. R. (2017). Impact of age on semen parameters in male partners of infertile couples in a rural tertiary care center of central India: A cross-sectional study. International Journal of Reproductive Biomedicine (Yazd, Iran), 15(8), 497–502.

Levitas, E., Lunenfeld, E., Weisz, N., Friger, M., & Potashnik, G. (2007). Relationship between age and semen parameters in men with normal sperm concentration: Analysis of 6022 semen samples. Andrologia, 39(2), 45–50.

Lozano-hernández, R., Judith, V., & Maythe, R. (2017). Impact of Coagulase-Negative Staphylococci and Other Germs on Sperm Forms. 92–97.

Ma, Y., Xie, N., Li, Y., Zhang, B., Xie, D., Zhang, W., Xie, X. (2019). Teratozoospermia with amorphous sperm head associate with abnormal chromatin condensation in a Chinese family. Systems Biology in Reproductive Medicine, 65(1), 61–70.

Mahran, Z., & Saleh, M.-E. (2015). Human semen hyperviscosity: prevalence and effects on physical and biochemical semen parameters in subfertile Egyptian men. Egyptian Journal of Dermatology and Venerology, 34(2), 135.

Marieb, E. N. (2015). Essential of Human Anatomy & Physiology. In Pearson (Vol. 11).

Menkveld, R. (2001). Semen parameters, including WHO and strict criteria morphology, in a fertile and subfertile population: an effort towards standardization of in-vivo thresholds. Human Reproduction, 16(6), 1165–1171.

Meri, Z. B., Irshid, I. B., Migdadi, M., Irshid, A. B., & Mhanna, S. A. (2013). Does cigarette smoking afect seminal fluid parameters? A Comparative study. Oman Medical Journal, 28(1), 12–15.

Merino, G., Carranza-Lira, S., Murrieta, S., Rodriguez, L., Cuevas, E., & Moran, C. (1995). Bacterial infection and semen characteristics in infertile men. Systems Biology in Reproductive Medicine, 35(1), 43–47.

Moretti, E., Capitani, S., Figura, N., Pammolli, A., Federico, M. G., Giannerini, V., & Collodel, G. (2009). The presence of bacteria species in semen and sperm quality. Journal of Assisted Reproduction and Genetics, 26(1), 47–56.

Mostafa, T., Tawadrous, G., Roaia, M. M. F., Amer, M. K., Kader, R. A., & Aziz, A. (2006). Effect of smoking on seminal plasma ascorbic acid in infertile and fertile males. Andrologia, 38(6), 221–224.

Moubasher, A., Sayed, H., Mosaad, E., Mahmoud, A., Farag, F., & Taha, E. A. (2018). Impact of leukocytospermia on sperm dynamic motility parameters, DNA and chromosomal integrity. Central European Journal of Urology, 71(4), 470–475.

Nieschlag E., Behre H.M., Nieschlag S., (2010). Andrology: male reproductive health and dysfunction. Heidelberg/New York: Springer. p. 263–78.

Nikoobakht, M. R., Aloosh, M., Nikoobakht, N., Mehrsay, A., Biniaz, F., & Karjalian, M. A. (2012). The role of hypothyroidism in male infertility and erectile dysfunction. Urology Journal, 9(1), 405–409.

Palubska, S., Adamiak-Godlewska, A., Winkler, I., Romanek-Piva, K., Rechberger, T., & Gogacz, M. (2017). Hyperprolactinaemia – A problem in patients from the reproductive period to the menopause. Przeglad Menopauzalny, 16(1), 1–7.

Parmar, N., Gohel, V., Sarvaiya, J., Patel, N., & Vala, N. (2015). Effect of tobacco chewing on semen parameters. International Journal of Medical Science and Public Health, 5(6), 1139.

Patel, A. S., Leong, J. Y., & Ramasamy, R. (2018). Prediction of male infertility by the World Health Organization laboratory manual for assessment of semen analysis: A systematic review. Arab Journal of Urology, 16(1), 96–102.

Patton Phillip.E., Battaglia David E., (2005). Office Andrology. Editura Humana Press.

Plessis, S. A., Agarwal, E.S. Sabanegh Jr. (2014). Male Infertility, A complete Guide to Lifestyle and Environmental Factors. Editura Springer.

Qin, L., Luo, X., Wei, J., Wei, Y., Wang, J., Zhang, L., & Huang, H. (2019). Genome-wide DNA methylation analysis of oligospermia and asthenozoospermia in a Chinese population. 12(4), 3168–3184.

Ramaraju, G. A., Teppala, S., Prathigudupu, K., Kalagara, M., Thota, S., Kota, M., & Cheemakurthi, R. (2018). Association between obesity and sperm quality. Andrologia, 50(3), 1–12.

Rehman, Khaleeq & Zaneb, Hafsa & Qureshi, Abdul & Shahbaz Yousaf, Muhammad & Numan, Ahsan & Majeed, Khalid & Rabbani, Imtiaz & Khan, Tahir & Rehman, Habib. (2019). Correlation between Testicular Hemodynamic and Semen Quality Indices in Clinical Varicocele Patients in Pakistan. BioMed Research International.

Sasikumar, S., Madhankumar, E. K., Dakshayani, D., Franklin, A., & Samuel, R. (2013). Antimicrobial chemotherapy for microorganisms causing male infertility. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci, 2(8), 177–186.

Schill W. B., F. H. Comhaire , T. B. Hargreave (2006). Andrology for the Clinician. Editura Springer.

Shabani K, Hosseini S, Mohammad khani AG, Moghbelinejad S (2017) The effects of Semen Parameters and age on Sperm Motility of Iranian men. Glob J Fertil Res 2(1): 024-029.

Shier, D., Butler, J., & Lewis, R. (2015). Human Anatomy & Physiology. Editura McGraw Hill.

Singh K., S., (2016). Mammalian Endocrinology and Male Reproducitive Biology. Editura CRC Press.

Taha, E. A., Kamal, E. E., Abdulwahed, S. R., & Elktatny, H. (2012). Impact of varicocele recurrence on semen parameters and pregnancy outcome. Human Andrology, 2(3), 65–69.

Tortora J. G., Nielsen M. T., (2017). Principles of Human Anatomy. Editura Wiley.

Van de Graaff K, (2001). Human Anatomy. Editura McGraw-Hill.

Vilvanathan, S., Kandasamy, B., Jayachandran, A. L., Sathiyanarayanan, S., Tanjore Singaravelu, V., Krishnamurthy, V., & Elangovan, V. (2016). Bacteriospermia and Its Impact on Basic Semen Parameters among Infertile Men. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 1–6.

Vilvanathan, S., Kandasamy, B., Jayachandran, A. L., Sathiyanarayanan, S., Tanjore Singaravelu, V., Krishnamurthy, V., & Elangovan, V. (2016). Bacteriospermia and Its Impact on Basic Semen Parameters among Infertile Men. Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases, 2016(June 2015), 1–6.

Vine, M. F., Hulka, B. S., Margolin, B. H., Truong, Y. K., Hu, P. C., Schramm, M. M., Everson, R. B. (1993). Cotinine concentrations in semen, urine, and blood of smokers and nonsmokers. American Journal of Public Health, 83(9), 1335–1338.

Winters J. S., Huhtaniemi T. L., ( 2017). Male Hypogonadism. Basic, Clinical and Therapeutic Principles. Editura Humana Press.

Zeyad, A., Amor, H., & Hammadeh, M. E. (2017). The impact of bacterial infections on human spermatozoa. International Journal of Women’s Health and Reproduction Sciences, 5(4), 243–252.

Zeyad, A., Amor, H., & Hammadeh, M. E. (2017). The impact of bacterial infections on human spermatozoa. International Journal of Women’s Health and Reproduction Sciences, 5(4), 243–252.

Zeyad, A., Amor, H., & Hammadeh, M. E. (2017). The impact of bacterial infections on human spermatozoa. International Journal of Women’s Health and Reproduction Sciences, 5(4), 243–252.

Zeyad, A., Hamad, M., Amor, H., & Hammadeh, M. E. (2018). Relationships between bacteriospermia, DNA integrity, nuclear protamine alteration, sperm quality and ICSI outcome. Reproductive Biology, 18(1), 115–121.

Zini, A., Agarwal, A., (2011). Sperm Chromatin. Biological and Clinical Applications in Male Infertility and Assisted Reproduction . Editura Speringer.

Zini, A., & Agarwal, A. (2018). A Clinician’s Guide to Sperm DNA and Chromatin Damage. Editura Springer.