Fenilcetonuria

INTRODUCERE

Fenilcetonuria (PKU) este o boală ereditară a metabolismului aminoacilor (AA). Aceasta este corelată, în aproape 98% din cazuri, cu o lipsă a unei enzime, hidroxilaza fenilalaninei, responsabilă pentru conversia fenilalaninei (Phe) în tirozină (Tyr). În alte cazuri, fenilcetonuria apare din cauza deficienței unui cofactor al fenilalanin-hidroxilazei numit tetrahidrobiopterin (BH4 sau THB), care este responsabil pentru boală (Feuillet F.,2006).

Aceste deficiențe determină apariția derivaților fenilalaninei în sânge, inclusiv acidul fenilpiruvic în urină. Hiperfenilalaninemia (HPA) provoacă tulburări neurologice severe, cum ar fi tulburări de dezvoltare intelectuală, de atenție și de comportament. De asemenea, poate provoca convulsii, depigmentare a pielii și a părului, precum și un miros specific al pielii și al urinei numit "miros de șoarece".

Dacă hiperfenilalaninemia este depistată în primele zile de viață (prin screening sistematic al al sugarilor la vârsta de trei zile), se blochează acumularea de fenilalanină, printr-o dietă adecvată și, în unele cazuri, cu medicamentația corespunzătoare. Se împiedică astfel, apariția tulburărilor neurologice severe și degradarea ireversibilă a țesutului nervos.

HPA are efect teratogen și poate determina embriopatii congenitale în cazul pacientelor gravide care au această boală ereditară. De aceea ele trebuie să urmeze cu strictețe tratamentul pentru această maladie metabolică ereditară (Abadie V. et al. 2005).

FENILCETONURIA – REPERE ISTORICE

Fenilcetonuria a fost descoperită în 1934 de medicul norvegian Asborn Folling, în timpul activității sale de cercetare la Institutul de Fiziologie din Oslo, într-o familie, în care copii sufereau de retard mental. El a descoperit legătură între retardul mintal, alte semene neurologice și comportamentale și mirosul "de șoarece", pe de-o parte, și reacția pozitivă a urinei cu clorura ferică, pe de altă parte. El a făcut un test de rutină al urinei copiilor folosind clorură de fier pentru a detecta prezența sau absența cetonelor urinare și a constatat apariția culorii verde închis, neobișnuită, care apărut în câteva minute, după care probele s-au normalizat. De obicei, testul dezvoltă o culoare violet în cazul în care urina conține cetone și o culoare roșu-brun, în cazul în care testul este negativ.

Cercetând apoi pe mai multe probe de urină de la aceeași pacienți, Fölling a izolat substanta responsabilă pentru acea reacție chimică ciudată, izolând astfel acidul fenilpiruvic.

A emis, astfel, ipoteza că retardul mental al copiilor este corelat cu prezența acidului fenilpiruvic în urina lor și a teoretizat faptul că acidul fenilpiruvic, găsit în urina pacienților, a provenit din incapacitatea de a metaboliza fenilalanina. În urma acestui studiu, a publicat un articol, într-un ziar german, în care a folosit termenul de "imbecilitate fenilpiruvică" pentru a descrie această boală (Christ S, 2003).

Tot în 1934, George Jervis, un medic neurolog din New York, a folosit termenul de oligofrenie fenilpiruvică (“phenylpyrouvic oligophrenia”) (Jervis G.A., 1937). În același an, Lionel Penrose, un genetician britanic, a sugerat un termen mai scurt al acestei boli și anume, fenilcetonurie (PKU), noțiune care este utilizată și astăzi (Penrose L., 1935). După constatările sale inițiale, Fölling, în colaborarea cu geneticianul Lous Morh și cu Lars Ruud, făcând noi cercetări, a identificat o gena autozomal recesivă responsabilă de apariția fenilcetonuriei.

Împreună cu biologii Karl Closs și Sverre Dick Henriksen, a depistat că bacteria Proteus vulgaris este capabilă să transforme fenilalanina în acid fenilpiruvic și a folosit-o într-o tehnică de testare a probelor de urină, reușind să demonstreze legătura dintre hiperfenilalaninemie și fenilcetonurie (Folling, A. et al, 1945).

În urma cercetării purtătorilor sănătoși heterozigoti ai genei pentru fenilcetonurie, el a emis presupunerea că purtători sănătoși ai genei ar avea o capacitate mai mică de metaboliza excesul de fenilalanină decât persoanele care nu sunt purtători ai genei. A demonstrat această ipoteza realizând experimente cu administrare de fenilalanină la mai mulți indivizi. A descoperit că unii dintre participanții la experimente (purtători heterozigoți ai genei) aveau mai mult acid fenilipiruvic în urină decât alții (care nu erau purtători heterozigoti ai genei). A demostrat astfel că purtătorii heterozigoți ai genei pentru fenilcetonurie au o capacitate mai mică de a metaboliza fenilalanina în exces decât persoanele care nu au gena fenilcetonuriei. Administrarea fenilalaninei permite depistarea purtatortilor de acestei gene făcând posibilă aprecierea riscului de avea copii cu fenilcetonurie.

Pentru toată munca sa, Fölling a primit premiul John F. Kennedy și fenilcetonuria a primit numele de "maladia Fölling", așa cum este adesea găsită în literatura de specialitate (Christ S., 2003).

În 1940, Moss a descris pentru prima dată, prin experimente pe ficat de șobolan, conversia fenilalaninei la tirozină (Moss AR, Schoenheimer R, 1940). În 1947, G. Jervis, analizând in vitro ficatul unui pacient fenilcetonuric, aduce dovezi că eroarea metabolică, în această boală, provine din incapacitatea conversiei fenilalaninei în tirozină (Jervis GA, 1947) .

În 1953, Cooper și Udenfried au descoperit sistemul enzimatic care transformă fenilalanina în tirozină. (Udenfriend S și Cooper JR, 1952). În același an, Jervis a arătat că lipsa hidroxilării parafenilalaninei este cauzată de lipsa de activitate a sistemului enzimatic descoperit. (Jervis GA, 1953). Tot în anul 1953, Horst Bickel, a demonstrat că o dietă cu un aport scăzut de fenilalanină, administrată încă de la naștere, ar putea preveni apariția retardului mental (Bickel H. et al., 1953).

În 1957, Seymour Kaufman scoate în evidență că pacienții (copii) care au o formă de fenilcetonurie atipică, nu au fenilalanin-hidroxilaza activă, ci un co-factor, dihidrobiopterin-reductaza. În același an, Centerwall Willard a realizat testul "în straturi" pentru depistarea fenilcetonuriei. În acest test, clorura de fier este turnată în straturi umede și în cazul în care urina devine verde, testul este pozitiv. Acest mod de detecție nu a fost generalizat deoarece copiii nu pot fi testați imediat după naștere, ci la câteva săptămâni, când acidul fenilpiruvic se găsește în cantități detectabile (Kaufman, S. 1957).

În 1962, Robert Guthrie, microbiolog american, a dezvoltat o metodă ușoară de screening a nou-născuților. Testul de inhibare bacteriană care îi poartă și numele (testul Guthrie) este utilizat pentru a detecta creșteri ale felilalaninei în sânge (Guthrie R, Susi A,1963).

Începând cu anii `70, au fost luate inițiative în ceea ce privește depistarea precoce și prevenirea fenilcetonuriei prin dietă. Au fost create programe naționale de screening neonatal, care în următorii ani au fost puse în aplicare pe scară largă în țările dezvoltate (Feuillet F., 2006).

ASPECTE BIOCHIMICE ALE FENILCETONURIEI

Fenilalanina (Phe), tirozina (Tyr) și triptofanul (Trp) sunt aminoacizi cu o catenă laterală aromatică și sunt esențiali pentru sinteza proteinelor din organism. Fenilalanina în exces nu pote fi eliminată și, ca atare, trebuie să fie metabolizată în ficat (Moussard C.,2006) .

Metabolismul fenilalaninei

Aproximativ 25% din fenilalanina liberă este reutilizată pentru sinteza proteinelor, restul poate urma o transformare pe mai multe căi metabolice, cu o importanță diferită.

1 .1. Calea metabolică principală

Calea principală este reprezentată de hidroxilarea tirozinei pentru a metaboliza fenilalanina. Această hidroxilare necesită prezența unei enzime, fenilalanin hidroxilaza (PAH), a cofactorului său esențial, tetrahidrobiopterina (THB sau BH4) și a ionilor feroși Fe++ (Fig. ).

În timpul oxidării fenilalaninei, catalizată de fenilalanin hidroxilază (PAH), tetrahidrobiopterina (BH4) este transformată într-un compus intermediar pterin-4α-carbinolamina. BH4 este apoi regenerat pe calea quinoid dihidrobiopterinei (q.BH2) sub acțiunea carbinolamin dehidratazei (PCD) și a dihidrobiopteridin-reductazei (DHPR) NADPH dependente.

BH4 este sintetizat în ficat, din guanozin- trifosfat (GTP) cu ajutorul altor trei enzime: GTP ciclohidroxilaza I (GTPCH), 6-piruvoil-tetrahidropterin sintetaza (PTA) și sepiapterin reductaza (SR) (Blau N et al. 2004). Schema formării și rolul de BH4 sunt reprezentate în Fig.2.

Fig.1. Hidroxilarea fenilalaninei. (François L. et al., 2000)

Fig.2. Căile metabolice ale L-fenilalaninei. Calea principală (casetă albastră) este conversia catalitică a L-fenilalaninei în L- tirozină sub acțiunea fenilhidrolazei (PAH). În fenilcetonurie (PKU) deficiența PAH induce producția de fenilcetone pe o cale alternativă (casetă roșie). A treia cale (caseta verde) poate fi întâlnită doar la plante și fungi. (Ho Gladys, Christodoulou J, 2014)

Tetrahidrobiopterina este cofactor al mai multor enzime:

4-fenilalanin hidroxilaza (PAH) , care transformă fenilalanina în tirozină

tirozin hidroxilaza și triptofan hidroxilaza implicate în sinteza de neurotransmițători precum dopamina și serotonina

sintetaza oxidului nitric (NOS), care permite sinteza monooxidului de azot.

Biopterina este activă doar în forma redusă (BH4); forma oxidată (BH2) trebuie să fie transformată în BH4 pentru a-și recăpăta activitatea biologică (C. Gilles et al.2006).

Biosinteza neopterinei este direct legată de activarea sistemului imunitar celular. Creșterea nivelurilor de neopterină a fost observată la pacienții cu infecții virale, bacteriene sau parazitare. Dozarea nivelurilor de neopterina în fluidele corpului uman este, prin urmare, utilă pentru monitorizarea bolilor asociate cu activarea imunității celulare (Sucher R. și colab., 2010).

1.1 Căile metabolice secundare

Aceste căi sunt rar utilizate la indivizii sănătoși, dar sunt importante la cei fenilcetonurici. Este vorba despre transformarea lanțului lateral al fenilalaninei, care poate suferi dezaminare sau decarboxilare, ducând la formarea de compuși caracteristici, de obicei găsiți numai sub formă de urme în urina subiecților sănătoși.

Transaminarea, cea mai importantă cale secundară, duce la formarea de acid fenilpiruvic, în timp ce decarboxilarea conduce la formarea de feniletilamina.

Transformarea fenilalaninei se poate desfășura în trei moduri (Fig.3.):

Prin decarboxilare cu formare de acid fenilacetic. Acidul fenilacetic poate, de asemenea, proveni și din oxidarea fenilalaninei. Acest acid este cel care a permis diagnosticul inițial al bolii și este responsabil de mirosul specific, “de șoarece”, al pacienților cu fenilcetonurie. Apoi, el este conjugat cu glutamina și excretat.

Prin reducere la acid fenillactic.

Hidroxilare cu formarea acidului hidroxifenilacetic. Excreția urinară a acestui acid este de 300-400 de ori mai mare în fenilcetonurie. La subiecții sănătoși, eliminarea urinară a compusilor fenilcetonici este sub formă de urme.

Ar trebui remarcat că transformarea tirozinei, pe lângă încorporarea sa în structuri de proteine, duce, printre altele, la sinteza de hormoni tiroidieni și de catecolamine (dopamină, noradrenalină și adrenalină) și, de asemenea, la sinteza melaninei.

Fig.3. Schema generală a metabolismului fenilalaninei. (François L. et al., 2000)

1.1. Tulburările metabolismului fenilalaninei

În general, tulburările metabolismului fenilalaninei sunt caracterizate printr-o scădere sau printr-un blocaj al hidroxilării de fenilalaninei:

în aval, scăderea tirozinemiei și efectele sale asupra sintezei de catecolamine, melanină și hormoni tiroidieni.

în amonte, acumularea de fenilalanină care este parțial catabolizată în căile secundare, ducând la o creștere a metaboliților în sânge și urină.

Aceste anomalii metabolice pot avea diferite origini și sunt caracterizate prin date biochimice și clinice diferite. Există numeroase sisteme enzimatice implicate. Astfel, o stare de hiperfenilalaninemie nu este întotdeauna sinonimă cu fenilcetonuria.

Creșterea concentrațiilor de fenilalanină are două origini principale:

– fie un deficit de fenilalanin hidrolază

– fie un deficit de BH4 care duce, implicit, la un deficit de sinteză sau de regenerare a biopterinei (Gilles C. et al., 2006).

1.1.1. Anomalii la nivelul fenilalanin hidrolazei

Această enzimă este, în principal, de origine hepatică. Deficitul ei constituie grupul de fenilcetonurii propriu-zise.

Există trei tipuri diferite de fenotipuri ale fenilcetonuriei în funcție de nivelurile plasmatice de fenilalanină:

• fenilcetonurie tipică sau clasică

• fenilcetonurie atipică sau mediteraneană

• hiperfenilalaninemie moderată permanentă (HMP)

În tabelul 1 sunt prezentate diferite fenotipuri de fenilcetonurie în funcție de concentrația plasmatică a fenilalaninei.

Tabelul 1. Fenotipuri ale fenilcetonuriei în funcție de concentrația plasmatică a fenilalaninei (după HAS, 2010).

Concentrația de fenilalanină din plasmă este exprimată în µmol/L sau mg/dL. Formula de conversie este 1 mg/dL=60µmol/ L.

Pacienții cu fenilcetonurie tipică sau atipică trebuie să urmeze o dietă strictă, controlată, în timp ce pacienții cu hiperfenilalaninemie moderată permanentă nu necesită produse speciale. Cu toate acestea, ei trebuie să fie urmăriți medical și familiile lor trebuie să fie informate, în special dacă este vorba de fete, deoarece sarcinile lor viitoare necesită monitorizare specială.

1.1.2. Anomalii ale sintezei sau regenerării de BH4

În 1974, Smith și Bartolomeu au arătat că, la unii pacienți, hiperfenilalaninemia se poate datora unei deficiențe "clasice" a fenilalanin hidroxilazei în concordanță cu observarea unor tulburări neurologice care nu sunt prevenite de o dietă săracă în fenilalanină (Christ S., 2003).

Insuficiența tetrahidrobiopterinei, cofactor al fenilalanin hidroxilazei, era recunoscută că fiind responsabilă pentru hiperfenilalaninemie, dar și pentru un deficit de neurotransmisie monoaminergică, cauzat de o disfuncției a altor hidroxilaze tetrahidrobiopterin dependente, tirozin hidroxilaze, triptofan hidroxilaze și arginin hidroxilaze (Dhondt J-L. et al., 2002).

Aceste deficiențe, considerate anterior ca hiperfenilalaninemii "maligne", sunt cauzate de unele defecte înnăscute ale biopterin sintetazelor. Acest lucru se traduce prin deficit de:

GTP ciclohidrolază I (GTPCH), (boala Segawa)

6-piruvoil-tetrahidropterin sintetază (PTA)

dihidroperidin reductază (DHPR)

pterin-4α-carbinolamin deshidratază (CPD )

Aceste deficite pot cauza hiperfenilalaninemia. (Fig.4.) (Ewenczyk C. et al., 2007).

Fig.4. Schema deficitelor enzimatice responsabile de hiperfenilalaninemii (François L., 2000)

Roșu=blocaj enzimatic; GTPCH=GTP-ciclohidroxilaza I; PTPS=6-piruviol-tetra hidropterin sintetaza; SR = sepiapterin reductaza DHPR = dihidropteridin reductaza; PCD= pterin-4-α-carbinolamin deshidrataza; PAH = fenilalanin hidroxilaza; TH =tirozin hidroxilaza; TPH = triptofan hidroxilaza; GTP = guanosin trifosfat; BH4 sau THB = tetrahydrobiopterina;

q.BH2 sau q. DHB = quinoid dihidrobiopterina; HVA = acid homovanilic; 5-HIAA = acid-5-hidroxiindolacetic; NOS = nitric oxid sintetaza

Prognosticul și tratamentul acestor anomalii, radical diferite de cele ale fenilcetonuriei, justifică o depistare precoce în populația de nou-născuți cu hiperfenilaninemii detectate la naștere. Deși rare (1 la 3% din toate hiperfenilaninemiile), diagnosticul diferențial trebuie să se facă în mod sistematic (C. Gilles et al. 2006).

Consecințele lor metabolice sunt numeroase:

tulburări metabolice în căile metabolice ale pterinelor

hiperfenilalaninemia

deficit de neurotransmițător, dopamină, inducând o creștere prolactinei și o scădere a acidului homovanilic în LCR

deficit de catecolamine și de melanină

deficiență de serotonină inducând o scădere de acid-5-hidroxiindoleacetic în LCR

In metabolizarea fenilalaninei intervine, astfel, într-un număr mare de sisteme enzimatice complexe, care sunt vulnerabile la multe blocaje care împiedică acțiunea lor normală.

2. ASPECTE GENETICE ALE FENILCETONURIEI

Fenilcetonuria este o boală genetică moștenită în mod autozomal recesiv. Gena implicată codifică fenilalanin hidroxilaza și este situată pe brațul lung al cromozomului 12 în regiunea 12q24.1 (Fig. 5). Cuprinde 13 exoni întinși pe o lungime de 90 Kb (kilobaze). Analize genetice ale acestei genei au relevat existența a mai mult de 700 de mutații asociate cu fenilcetonuria (S. Dobrowolski, 2007).

Fig. 5. Cromozomul 12 și poziția genei PAH în cromozom.

(http://wiki.ggc.edu/wiki/File:Chromosome_12.jpg, modificat)

Cele mai multe mutații sunt mutații punctiforme (mutații non-sens). Deletiile și inserțiile sunt mult mai rare. Mutațiile pot apărea într-unul dintre exoni sau la nivelul regiunii promotor).

Studii recente ale structurii cristaline a fenilalanin hidroxilazei au furnizat informații referitoare la situsul activ și situsurile de legare ale substraturilor sale și ale cofactorului sau. Fenilalanin hidroxilaza are trei domenii structurale alcătuite dintr-un domeniu N-terminal de reglare, un domeniu catalitic central și un domeniu terminal de tetramerizare.

Fenilalanin hidroxilaza este compusă din patru proteine monomerice (Fig.6.) (KimS. și colab. 2006). Această structura cristalină prezintă majoritatea mutațiilor (70%) în domeniul catalitic, 16% dintre mutații în domeniul de reglare, iar 14% sunt în domeniul de tetramerizare.

Toată lumea are două gene pentru fenilalanin hidroxilază. Pentru a apărea această boală cele două gene trebuie să fie, amândouă, anormale. Toți cei care au o singură gena afectată sunt doar purtători ai genei pentru fenilcetonurie, iar boala nu se manifestă la ei, dar pot transmite gena anormală generației următoare. Aceasta înseamnă că, în cazul în care ambii părinți sunt purtători, iar copilul moștenește două gene afectate, copilul va avea fenilcetonurie (Blau N. et al., 2010).

Fig.6 Structura cristalină tridimensională a fenilalanin hidroxilazei umane (Daniele A et al., 2008)

A. Modelul structurii monomerului PAH și distribuția de mutații missense legate de HPA. Domeniul de reglare N-terminal este indicat în albastru, domeniul catalitic în roșu și domeniul de tetramerizare în verde. Ionul Fe++ este indicat ca o sferă în centrul domeniului catalitic; B. Modelul structurii tetramerice al fenilalaninhidrolazei

Diagrama din Fig. 7 prezintă combinații genetice posibile ale transmiterii genelor pentru fenilcetonurie

Fig. 7. Diagrama transmiterii ereditare a genelor recesiv autozomale ale fenilalanil hidrolazei

Frecvența purtătorilor sănătoși raportată la populația din România este de 1/50. Una din 50 de persoane este purtătoare sănătoasă a mutației (pentru o frecvența a bolii de 1:10 000). Riscul de apariție a bolii la un alt copil al unui cuplu care are deja un copil afectat este 1 la 4 dacă părinții nu sunt bolnavi (Popescu V. et al., 2009). Părinții sau viitori părinți pot fi informați prin consiliere genetică despre riscul de debut al fenilcetonuriei la copii și despre dimensiunile familiale ale aceste boli.

3. ASPECTE FIZIOPATOLOGICE ALE FENILCETONURIEI

Fenilalanina este un aminoacid esențial al cărui aport depinde exclusiv de alimente. Acest aport trebuie să satisfacă nevoile pentru homeostazia fenilalaninei în sinteza proteinelor din organism. Nevoia fiziologică de fenilalanină a oamenilor variază foarte puțin cu vârsta.

În fenilcetonurie există un deficit de transformare a fenilalaninei în tirozină. Rata creșterii serice a fenilalaninei este proporțională cu severitatea deficitului enzimatic. În consecință, pacienții cu fenilcetonurie nu pot tolera decât o cantitate limitată de fenilalanină pe zi, altfel fenilalanina lor din sânge ajunge la niveluri toxice responsabile pentru simptomatologia clinică (Abadie V., 2007).

Patogeneza fenilcetonuriei rezultă prin mai multe mecanisme fiziologice:

Mai mulți metaboliti toxici se acumulează în creier, fenilalanina însăși, dar și metabolitii săi secundari (fenillactat, fenilpiruvat și fenilacetat).

Deficitul de fenilalanin hidroxilaza este responsabil pentru deficitul de tirozină care devine un aminoacid esential, fiind precursorul unor neurotransmițători cum ar fi dopamina, epinefrina și norepinefrina. Acest deficit de tirozină determină, de asemenea, deficit de melanină, ceea ce cauzează anomalii ale pielii și fanerelor.

Fenilalanina intră în competiție cu alți aminoacizii neutri (AAN), pentru a trece bariera hemato-encefalică pentru a pătrunde în creier. De fapt, ei folosesc un transportor comun, LAT1(L-type amino acid transporter 1).

Hiperfenilalaninemia este responsabilă pentru deficitul intracerebral de AAN, în special deficitul de tirozină și triptofan, precursori ai multor neurotransmițători (dopamină, serotonină). Acest lucru duce la o alterare a sintezei proteinelor și a sintezei intracerebrale de neurotransmițători (Francois L., 2000).

O concentrație mare de PHE are o influență puternică asupra mielinizării. Într-adevăr, în funcție de modelul animal, oligodendrocitele adoptă un fenotip non mielinizant exprimând în exces GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein) (G. Enns et al., 2010).

Recent, la pacienții fenilcetonurici au fost descoperite leziuni în substanța albă. RMN-ul cu difuzie a fost utilizat pentru a evalua natura leziunilor în substanța albă. Această tehnică imagistică oferă, în mod indirect, poziția, orientarea și anizotropia structurilor fibroase, inclusiv ale tractului materiei albe din creier și este folosită pentru a furniza informații legate de pierderea axonală și demielinizare. Datorită aceastei tehnici, a fost posibil să se observe microedeme la nivelul mielinei la pacienții fenilcetonurici care nu au ținut dietă (Anderson P-J. et al. 2010).

4. ASPECTE CLINICE ALE FENILCETONURIEI

4.1. Fenilcetonuria netratată

De la înființarea screening-ului neonatal, tabloul clinic al fenilcetonuriei este greu de cunoscut și, în ciuda fiabilității testării, rezultate fals negative sunt posibile.

Caracteristicile clinice includ retard mental progresiv. Testele standardizate de măsurare a coeficientului de inteligență (IQ) pot evalua deficitul cognitiv (Goldenberg A. și colab., 2010).

Întârzierea dezvoltării intelectuale este semnul cel mai constant și mai grav al fenilcetonuriei. Acesta este adesea asociat cu microcefalie progresivă. Electroencefalograma EEG) este anormală în 78-95% din cazuri, dar numai 25% dintre pacienți au crize de tip “grand mal” sau spasme infantile.

Tulburările de comportament sunt adesea de tip psihotic, cu hiperactivitate, agresivitate și hiperexcitabilitate necontrolată. Aceste semne neurologice sunt asociate cu tulburări ale fanerelor și cu hipopigmentare generală: piele palidă, par blond, ochi albaștri; asociate cu eczeme în 20-40% din cazuri (J-K Gentile și colab. 2010).

La pacienții mai în vârstă, uneori, este fecvent retardul mental, profund asociat cu tulburări de comportament: autoagresiune, comportament autist. Alte semne neurologice (hipertonie globală, sindromul piramidal, tremor, sindrom parkinsonian) pot fi observate cu o frecvență variabilă.

În general, nivelul de deficit intelectual este stabil după copilărie, deși leziunile neurologice pot fi observate și la adulți, cu detectarea proceselor de demielinizare.

4.2. Fenilcetonuria depistată și tratată

Screening-ul neonatal combinat cu un regim alimentar cu restricție la fenilalanină, a îmbunătățit manifestările clinice severe ale fenilcetonuriei.

4.2.1. Tulburări neurologice și psihologice

Studiile au arătat și la copiii și adulții tratați, apariția simptomelor neurologice și a tulburărilor emoționale și comportamentale

La copii

Copiii cu fenilcetonurie tratați rapid și continuu doar cu un regim alimentar cu restricție la fenilalanină au activitatea intelectuală normală, dar, în general, mai mică decât media și mai mică decât a fraților sau a surorilor normali. Mai mult decât atât, s-a demonstrat că, în medie, rezultatele școlare ale unui copil cu fenilcetonurie sunt mai mici. Disfuncțiile s-au observat la nivelul memoriei, raționamentului conceptual și al strategiei de organizare (Hanley W-B, 2004).

La adulți

La adulți, au fost descoperite aceleași probleme. Adulții pot suferi de lipsa de autonomie, pot tinde să dezvolte idei depresive, anxietate, fobii, probleme sociale de izolare (V. Brumm și colab., 2010). Acești factori psihosociali pot fi explicați prin greutatea adaptării la relațiile zilnice. Aceste probleme emoționale neidentificate și netratate poate avea un impact semnificativ asupra calității vieții și statusului social al indivizilor cu fenilcetonurie.

Pacienții adulți cu fenilcetonurie care au fost tratați devreme și care au oprit dieta ar putea dezvoltă semne neurologice minore, cum ar fi tremor, reflexe osteo-tendinoase cu deficiențe de coordonare motorie. Mai rar, au fost descrise leziuni neurologice mai severe: parapareză spastică, boală caracterizată printr-o spasticitate progresivă neurodegenerativă și hiperreflexie a membrelor inferioare, epilepsie cu debut tardiv, ataxie și tremor (Christ S. et al. 2010) .

Aceste tulburări sunt similare cu cele descrise la pacienții cu fenilcetonurie care nu au fost niciodată tratați. Ele ar putea fi legate de controlul metabolic inițial slab în timpul îngrijirii pediatrice, deoarece nu au fost raportate până în prezent alterări neurologice la pacienții care au fost tratați precoce și la care s-a realizat un control metabolic bun. O urmarire prelungită a pacienților adulți permite să se determine dacă există, de fapt, un risc neurologic pe termen lung (Hanley W-B, 2004).

4.2.2. Creșterea și nutriția

Tulburările de creștere cauzate de deficiențele nutriționale au fost subliniate în diferite articole studiate.

Copii și adolescenți

Copiii cu fenilcetonurie care urmează doar un regim alimentar prezintă, adesea, retard de creștere, o scădere a circumferintei craniane, în raport cu normalul, un indice de masă corporală crescut. Aceste tulburări includ, aportul inadecvat al diferiților nutrienți, vitamine și oligoelemente, cum ar fi calciu, zincul, cupru, seleniul, fierul, vitamina A (Christ S. și colab., 2010).

Adulți

Adulții cu fenilcetonurie au aceleași deficiențe, dar în 70% din cazuri la aceștia s-au constatat și o carență de vitamina B12, precum și hipertrigliceridemie (G. Enns et al., 2010).

4.2.3. Boli osoase

La copii

Au fost descrise dezechilibre în ceea ce privește resorbția și formarea osoasă induse de scăderea densității minerale osoase, precum și modificări ale unor dinți permanenți la unii copii. Aceste dezechilibre cresc riscul de fracturi osoase.

La adulți

Osteopenia, inclusiv osteoporoza, este frecventă la adulții cu fenilcetonurie tratați. Fracturile sunt, de asemenea frecvente. Osteoclastele sunt izolate și carențele pe termen lung de calciu și de vitamina D explică aceste patologii (Enns G., 2010).

Monitorizarea alimentației pe termen lung trebuie să fie realizată atent în ceea ce privește aportul de vitamine și microelemente, mai ales în perioada de adolescență în care se constituie masa osoasă, la pacienții cu fenilcetonurie.

Cele menționate mai sus referitor la aceste tulburări subliniază importanța punerii în aplicare a tratamentului precoce și ridică problema duratei regimului. Menținerea regimului pe termen lung reduce consecințele neuropsihice la populația cu fenilcetonurie (François L., 2000).

Introducerea pe piață a diclorhidratului de sapropterină și noi cercetări pentru tratamente viitoare ale bolii ar putea sugera un regim alimentar mai flexibil.

5. METODOLOGIA SCREENING-ULUI NEONATAL PENTRU FENILCETONURIE

Recoltarea probelor

Prelevarea probei de sânge se face după informarea mamei și după obținerea consimțământului de la mamă, sub semnătura acesteia, în Foaia de Observație a nou născutului.

Se va menționa în biletul de externare data recoltării probei. Familiei i se va spune că va fi contactată doar în cazul unei valori crescute.

Se recoltează o picătură de sânge integral de la fiecare nou-născut din maternitate.Probele se recoltează între a treia-a și a cincea zi de viață a nou-născuților normoponderali hrăniți cu lapte. La prematuri, subponderali sau nou-născuții hrăniți inițial cu soluții glucozate și electrolitice, fără proteine (aminoacizi), se recoltează a 3-5-a zi de la introducerea alimentației lactate (Anton DT, 2011).

Probele de sânge sunt recoltate prin înțeparea, cu ac sau lanțetă de unică folosință, a tegumentelor de pe călcâi (la nivelul ariilor laterale ale fetei plantare), care sunt în prealabil curățate cu alcool. Pentru evitarea lezării osului, înțepătura nu trebuie să fie mai adâncă de 2 mm.

Probele sunt recoltate pe hârtie de filtru specială pe care se depune o picătură de sânge pe suprafețele marcate cu cercuri cu diametrul de 15-16mm, tipărite în prealabil (Ordinul MS 1324-anexa 4, 2010).

După înțepătură, prima picătură se îndepărtează, apoi hârtia de filtru se atinge ușor de sângele care trebuie să se îmbibe uniform pe toată suprafață delimitată de cercul exterior, fără a se atinge piciorul. (Fig. 8-11)

Pentru o recoltare cât mai bună, este preferabil că picătura de sânge să fie depusă pe spatele hârtiei de filtru și trebuie să se urmărească colorarea în roșu a suprafeței cercului tipărit pe fața hârtiei.

Hârtia de filtru specială se pune în contact cu picătura mare de sânge. Se va avea grijă ca sângele să îmbibe hârtia față/verso, umplând întreg cercul. Pentru a mări fluxul de sânge, se poate presa blând, intermitent, zona ce cuprinde locul de puncționare.

Suprafața înțepată nu trebuie stoarsă, pentru a se evita hemoliza sau amestecarea cu alte fluide din țesuturi și, de asemenea, trebuie să se evite ca sângele să fie pus în straturi succesive pe hârtia de filtru pentru a nu se forma cruste.

Picătura de sânge de pe hârtia de filtru este marcată cu un număr de identificare (Fig 12).

( http://www.stud-ped.ro/lucrari_practice/screening_neonatal.pdf)

Pe fiecare bandeletă se înregistrează atâția copii câte cercuri există.

Exemplu: 1. Popescu Maria; 2. Ionescu Valentin; 3. Dumitrescu Cristina, etc.

De evitat însă a se lăsa cercuri goale. În cazul în care sunt mai puțini copii decât cercuri, hârtia de filtru se va tăia și se va utiliza la următoarea recoltare.

Fig nr 12. Schema marcajelor de pe hârtia de filtru pe care s-au recoltat picăturile de sânge.

După recoltare, probele de sânge se vor lasa să se usuce la temperatura camerei, în poziție orizontală, urmând să fie trimise către laboratorul de referință, alături de un tabel de identificare a pacienților. Datele se înscriu citeț și corect pentru a se putea identifica, ulterior, fiecare copil și pentru a se putea transfera în baza de date a Programului de screening neonatal. Fiecărui copil trebuie să îi corespundă numărul din tabel cu cel de pe haria de filtru.

Trimiterea probelor către laboratorul de referință se realizează prin poștă sau curier ocazional (salvare sau angajat al instituției sanitare).

Pentru evidența nou-născuților/ recoltărilor maternitatea va transmite lunar, prin e-mail, fax sau poștă, numărul de nou-născuți din luna anterioară. Centrul de referință va face corelarea în timp a numărului de nou născuți, cu numărul de probe trimise.

Din momentul primirii plicurilor la laborator se procedează astfel:

– se triază probele și se înregistrează;

– se lucrează în laborator pentru PKU, se centralizează rezultatele.

În cazul apariției unui caz suspect de fenilcetonurie (Phe>;3mg/dl) se repetă determinarea.

Dacă se menține valoarea crescută, pacientul va fi căutat în teritoriu prin adrese poștale, cu confirmare de primire la adresa copilului și prin fax la A.S.P. a județului respectiv. Ulterior, copilul se prezintă la spital unde va fi luat în evidență.

Pentru început se internează. Pe parcursul internării se realizează un bilanț biologic și se va începe tratamentul. Tratamentul acestei boli constă în regim dietetic sărac în fenilalanină. În cadrul programului se asigură substituent proteic.

După externare copilul rămâne în evidența spitalului și va trimite inițial la 2 săptămîni, apoi lunar un spot de sânge din care se va doza, în laborator, nivelul Phe, aceasta fiind metoda de monitorizare a tratamentului dietetic. Pacientul trebuie să se prezinte la evaluare inițial trimestrial, apoi anual pentru examenul de bilanț (Ordinul MS 1324-anexa 4, 2010).

6. TEHNICI DE DEPISTARE A FENILCETONURIEI

Deși probele de sânge pot fi analizate printr-o varietate de tehnici, fiecare metodă este proiectată pentru a detecta o creștere de fenilalanină și nu defectul enzimatic în fenilcetonurie, care este o deficiență a activității fenilalanin-hidroxilazei (HAP) exprimată numai în ficat. Diferitele metode folosite pentru screening-ul fenilcetonuriei, precum și avantajele și dezavantajele fiecărei tehnici sunt descrise mai jos și sunt prezentate în Tabelul nr. 2.

• Testul Guthrie de inhibare bacteriană

Acest test a fost utilizat pentru a detecta creșteri de fenilalanină în sânge în cadrul screening-ului nou-născuților. Discuri mici sunt decupate din cercurile impregnate cu sânge în cardurile de hârtie de filtru. Aceste discuri sunt plasate pe geluri de agar care conțin o tulpină de Bacillus subtilis și B-2-thienilalanină, un inhibitor de creștere a bacteriilor, dar, care este un analog al fenilalaninei și care contracarează fenilalanina.

Gelul de agar este capabil să susțină dezvoltarea bacteriilor, dar B-2-tienilalanina inhibă dezvoltarea bacteriilor. Cu toate acestea, în prezența fenilalaninei suplimentar impregnată în discul de hârtie de filtru, inhibarea este contracarată și bacteriile cresc. În 24 de ore creșterea bacteriană din jurul discului de hârtie este vizibilă. Creșterea, măsurată ca diametru al coloniei, este aproximativ proporțională cu cantitatea de fenilalanină din sânge. Rezultatul este citit prin compararea diametrului coloniei fiecărui disc-probă cu o serie de discuri etalon cu conținut standard de fenilalanină.

Sensibilitatea este relativ mare, detectând creșteri mici ale fenilalaninei de 180-240 Moli (3-4 mg/dl). Cu toate acestea, acest test este doar semicantitativ și precizia sa poate fi afectată de factori cum ar fi prezența antibioticelor la nou-născut, în momentul colectării probei (Guthrie R, Susi A, 1963).

• Tehnica fluorometrică McCaman-Robins

Testul fenilalaninei neonatale are la bază o metodă chimică utilizată pentru determinarea cantitativă a fenilalaninei din spoturile de sânge uscat. Fenilalanina eluată din spoturile de sânge uscat, formează un compus fluorescent cu ninhidrina. Răspunsul fluorometric este intensificat prin prezența dipeptidei L-leucil-L-alanină. În timpul reacției, pH-ul este controlat de soluția tampon succinat (5,8±0,1) care are rol în optimizarea fluorescenței și maximizarea specificității. Pentru stabilizarea complexului fluorescent format și creșterea semnalului fluorescenței, se utilizează reactivul cupric. Fluorescența este măsurată cu ajutorul fluorometrului, care folosește pentru excitație o radiației ultravioletă (lungimea de undă la 390 nm) și se obține o emisie citită la lungimea de undă de 485nm (McCaman MW, Robins E. 1962).

• Cromatografia pe hârtie și în strat subțire

Detectarea fenilcetonuriei prin cromatografie pe hârtie prin utilizarea plasmei netratate a fost descrisă în 1962 (Culley et al., 1962). O altă varianta a acestei tehnici care utilizează sânge integral sau urină impregnate și uscate pe hârtie de filtru a fost raportată de Efron et al. în 1964. Prin aceasta tehnică se poate detecta nu numai fenilcetonuria, ci, de asemenea, o serie de alte aminoacidopatii (Efron et al., 1964).

Discurile cu sânge uscat sunt preparate și supuse migrării cromatografice pe hârtie, apoi discurile se usucă și sunt colorate cu un amestec isatin-ninhidrina pentru detecția de aminoacizi. Poate fi utilizată o metodă similară cu aceea a cromatografiei pe hârtie, folosind plasmă colectată și transportată în tuburi capilare heparinizate și apoi plasată pe hârtie cromatografică (Scriver et al., 1995). Nivelurile de fenilalanină sub 8 mg /dl nu pot fi detectate în mod constant prin utilizarea acestor tehnici.

Cromatografia în strat subțire oferă, în multe cazuri, analiza mai rapidă, sensibilitate crescută și o rezoluție mai bună, decât cromatografia pe hârtie. Cu toate acestea, este mai scumpă și nu este utilizată în mod curent pentru screening-ul PKU neonatal.

• HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)

Este o metodă cantitativă de determinare simultană a nivelurilor de fenilalanină și de tirozină, precum și a multor altor aminoacizi. Ea este, totuși, prea lentă pentru aplicarea pe scară largă în screening-ul nou-născuților. În 1991, Qu et al. a descris un sistem automatizat pentru screening-HPLC, cu un timp de răspuns per eșantion de aproximativ trei minute (Qu Y, Miller JB et al. 1991).

HPLC este o metodă foarte sensibilă și sunt determinate cantitativ atât fenilalanina cât și tirozina, astfel încât poate fi determinat direct raportul crescut fenilalanină / tirozină în fenilcetonurie. Acest lucru poate reduce costurile într-un sistem, de altfel, costisitor. De aceea metoda HPLC este utilizată, în prezent pentru confirmarea rezultatelor anormale obținute în cadrul screening-ului prin alte tehnici, inclusiv testul Guthrie cu inhibare bacteriană, dar nu ca o metodă de screening primar (Doughertyl FE. and Levy HL, 1999).

• Testul fenilalanin- dehidrogenazei

Recent au fost dezvoltate metode automate de detectare a fenilalaninei crescute printr-un test enzimatic (Wendel et al, 1990; Keiller et al, 1994). Acest test folosește fenilalanin-dehidrogenaza derivată din Rhodococcus sp. M4. Fenilalanina, în prezența apei, a fenilalanin-dehidrogenazei și a NAD (nicotinamid adenin dinucleotid forma oxidată) formează fenil piruvat, amoniac și NADH (nicotinamid adenin dinucleotid forma redusă).

Fenilalanina este determinată cantitativ prin măsurarea NADH rezultat din reacție, prin cuplarea reacției cu un acceptor de electroni intermediar. Cu toate acestea, există discuții cu privire la fiabilitatea și sensibilitatea acestui test.

• Spectrometria de masă în tandem

Tehnologia MS / MS oferă o nouă abordare a screeningului neonatal având capacitatea de a tria rapid 30 sau mai multe tulburări metabolice într-o singură analiză, de la un mic eșantion de sânge și folosind un protocol simplu (Chace et al., 2003). Într-adevăr, într-o singură testare, mai mult de 40 de analiți pot fi cuantificați.O configurație tipică pentru spectrometria de masă în tandem pentru un laborator de screening neonatal include patru componente (Fig. 13). Primul dintre componente este un tip de pompă HPLC care asigură fluxul fazei mobile, dar fără etapa de cromatografie lichidă. Al doilea component preia probe din faza mobilă înainte de a ajunge la MS / MS. Injectarea fiecărei probe este realizată cu un dispozitiv de auto-eșantionare pentru plăci cu 96 de godeuri și sute de probe pe zi.

Fig.13. Configurația schematică pentru spectrometria de masă în tandem

pentru screening-ul nou-născutului

Al treilea component cuprinde două spectrometre de masă care scanează (în tandem) analiții din fiecare eșantion, identifică și cuantifică diferitele semnale ale metaboliților de interes și transferă informația brută spre a patra componentă, un computer, care efectuează cuantificarea formală a fiecărui metabolit și integrează informațiile într-un set de date utile (Rousseau F et al., 2003).

Tabelul nr 2. Metode pentru determinarea PKU (Doughertyl FE. and Levy HL, 1999)

TERAPIA NUTRIȚIONALĂ ÎN FENILCETONURIE

În fenilcetonurie (PKU), singura modalitate terapeutică acceptată prin consens internațional este dieta. În ultimii ani, managementul nutrițional adevenit mai complex, scopul fiind optimizarea creșterii și dezvoltării pacienților și îmbunătățirea complianței la dietă. Rezultatele tratamentului depind de calitatea controlului fenilalaninei (Phe) sanguine în primii ani de viață, cât și de vârsta la momentul începerii tratamentului. (Anton DT, 2010)

Regimul sărac în fenilalanină a fost introdus în 1954 de către Bickel (Bickel et al. 1954)

În ultimii ani managementul PKU a devenit mai complex datorită:

• colectării regulate a probelor de sânge

• urmăririi aportului alimentar

• menținerii unei diete restrictive

• efectuării de către pacient a vizitelor frecvente și regulate la medic

• depistarea precoce a bolii prin screening neonatal.

Scopul acestui management este optimizarea creșterii și dezvoltării pacienților și de ameliorarea complianței la dietă (MacDonald A, 2000).

Dieta reprezintă principala modalitate terapeutică în PKU.

Obiectivul principal al dietei este reprezentat de prevenirea tulburărilor neurologice prin reducerea nivelului Phe, la valori între 2-6 mg/dl sau 120-360 μmoli/l, cât mai rapid posibil.

Acest lucru se poate realiza prin:

• diagnosticul precoce al bolii și inițierea tratamentului cel târziu la vârstă de 20 zile;

• continuarea tratamentului toată viață (un regim mai „relaxat“ după vârsta de 15 ani);

• tratamentul mamelor cu PKU înainte de concepție, cât și pe toată durata sarcinii (Ahring K et al., 2009).

Vârsta în momentul inițierii dietei și nivelul controlului metabolic înfluenteaza evoluția.

Astfel, între vârsta în momentul inițierii dietei și coeficientul de inteligență (QI) există o relație de tip invers: cu cât vârsta în momentul începerii dietei este mai mică, cu atât QI va avea valori mai mari. De asemenea, un control metabolic greșit va conduce la un QI mai scăzut și la apariția tulburărilor de comportament. Studii recente au demonstrat că nivele plasmatice crescute ale Phe în primele 2 săptămâni de viață pot afecta și dezvoltarea structurală a sistemului vizual

Dieta discontinuă înaintea vârstei de 8 ani conduce la un QI mai mic, iar după 12 ani ( vârstă la care se termină măturarea cerebrală) efectele dietei dicontinue sunt mai puțin clare. . (Pons R et al. , 2007)

Punctul de pornire în stabilirea regimului dietetic este toleranța la fenilalanină. Aceasta reprezintă „cantitatea de Phe exprimată în mg/kgc/zi pentru care nivelul sau plasmatic se menține în limite normale (1-4 mg% sau 60-240 µM/l), aport care permite dezvoltarea normală a copilului.

Planul dietetic va fi stabilit luând în considerare nivelul inițial al Phe.

Dieta se bazează pe 2 elemente (De Baulny HO et al. 2007).

restricția proteinelor naturale (cu Phe)

suplimentarea cu aminoacizi (cu exceptiaPhe) pentru a asigura aportul normal de proteine potrivit vârstei și greutății

Inițial, o perioada scurtă de 2-3 zile, se administrează numai formule fără Phe. În acest timp se urmărește aducerea nivelului Phe la valori cât mai apropiate de normal. După această perioadă în care s-au administrat numai formule fără Phe, pacientul va primi cantități specifice de Phe pentru a menține nivelul plasmatic la o valoare sigură.

Necesarul de proteine va fi calculat astfel încât să asigure creșterea optimă și să mențină balanța azotată. Raportul dintre proteinele naturale și proteinele de substituție trebuie să fie 1:2.

După inițierea regimului dietetic este necesară menținerea nivelurilor sanguine ale Phe la valorile indicate în Tabelul 3 (Anton DT et al, 2010 )

Ritmul monitorizării nivelului Phe este menționat în tabelul 4 (Anton DT et al, 2010 ).

7. MĂSURAREA. ESTIMAREA INCERTITUDINII DE MĂSURARE

Conceptul de măsurare include un domeniu vast de activități și scopuri.

Unul dintre scopurile unei măsurări este de a determina valoarea măsurandului, adică valoarea mărimii particulare de măsurat. Că urmare, o măsurare începe prin precizarea corespunzătoare a măsurandului, a metodei de măsurare și a procedurii de măsurare.

Pentru majoritatea măsurătorilor analitice, o definiție bună a măsurandului include o declarație referitoare la (Sorescu G, Vanan M, 2012):

Parametrul este analizat (analitul) și mărimea care îi este măsurată. (Exemplu: fenilalanina respectiv concentrația de fenilalanină)

Materialul de analizat și, dacă este necesar, informații suplimentare despre locul în care se realizează testarea. (Exemplul: "fenilalanina în sângele (serul/plasma) pacientului")

Baza de calcul al rezultatelor mărimii analizate care se menționează în buletinul/raportul de analiză. Cu alte cuvinte unitatea de măsură și formula de calcul. De exemplu, valorile fenilalaninei din sângele pacientului sunt exprimate în unități gravimetrice (mg/dL=mg/100mL=mg%). Conversia la unitățile Sistemului Internațional (SI) poate fi realizată prin utilizarea următoarei ecuații: Fenilalanină (mg/100 ml) x 60 = Fenilalanină (micromol/L)

Valoarea adevărată a unei mărimi este imposibil de determinat, deoarece orice măsurare este practic afectată, mai mult sau mai puțin, de erori, datorate imperfecțiunii mijloacelor de măsurare, condițiilor de mediu, unor perturbatii exterioare, operatorului etc. În practică se acceptă, în locul valorii adevărate, o valoare determinată (valoarea estimată) cu o incertitudine suficient de mică, denumită valoare convențională adevărată.

Furnizare rezultatului unei măsurări trebuie însoțit de indicații asupra calității măsurării.

Utilizare SI a impus o metodologie de evaluare a incertitudinilor de măsurare acceptată pe plan mondial și aplicabilă unei arii largi de domenii care permite compararea rezultatele măsurărilor efectuate oriunde în lume.

Eroarea de măsurare poate fi o diferență între două valori, de exemplu între valoarea indicată de un aparat de măsurare și valoarea indicată de alt aparat de precizie superioară (etalon). În anumite condiții, eroarea poate fi eliminată, prin aplicarea unei corecții adecvate. În principiu, eroarea poate fi cunoscută (cu o abatere), ca valoare și ca semn, prin efectuarea unei măsurări mai precise.

Eroarea este o valoare care reprezintă diferența dintre valoarea măsurată și "valoarea reală" a lucrului măsurat. Eroarea de măsurare poate fi relativă, aleatorie sau sistematică.

Eroare relativă- raport între eroarea de măsurare și valoarea adevărată a măsurandului.

Eroare aleatorie- diferența între rezultatul unuei măsurări și media aritmetică a rezultatelor unui număr infinit de măsurări ale aceluiași măsurand, efectuate în condiții de repetabilitate.

Eroare sistematică- diferența între media aritmetică a rezultatelor unui număr infinit de măsurări ale aceluiași măsurand, efectuate în condiții de repetabilitate și o valoare adevărată a măsurandului.

Incertitudinea de măsurare este o apreciere, un interval de valori ale unor abateri cărora le putem estima niște limite, dar nu și semnul. Incertitudinea de măsurare nu poate fi eliminată sau corectată prin aplicarea unei corecții. Incertitudinea de măsurare cuprinde, mai multe componente. Unele dintre aceste componente pot fi evaluate din distribuția statistică a rezultatelor șirurilor de măsurări și pot fi caracterizate prin abateri standard experimentale. Alte componente sunt evaluate pornind de la distribuții de probabilitate obținute pe baza experimentală sau pe baza unor informații de care se dispune.

În timp ce eroarea este o valoare care reprezintă diferența dintre valoarea măsurată și "valoarea reală" a lucrului măsurat, incertitudinea este o cuantificare a îndoielii cu privire la rezultatul măsurătorii, este un interval de valori (o estimare a intervalului de valori în interiorul căruia se găsește valoarea adevărată a măsurandului). În Fig 14 este prezentată schematic o comparație între eroare și incertitudine (Garganciuc S., 2010).

Fig 14. Comparație între eroare și incertitudine -schema

Incertitudinea de măsurare este un parametru asociat rezultatului unei măsurări, care caracterizează împrăștierea valorilor care, în mod rezonabil, pot fi atribuite măsurandului (EURACHEM Guide, 2012) .

Incertitudine de măsurare poate fi:

Incertitudine standard (u) – incertitudinea rezultatului unei măsurări exprimată printr-o abatere standard.

Abatere standard a populației de date (σ) și varianța (σ²) – abatere standard la pătrat a populației de date, sunt măsuri ale dispersiei întregii populații de date în jurul mediei populației.

Unde: Xi = rezultatul celei de a (i) măsurători;

m = media aritmetică a măsurărilor;

N = efectivul populației de date;

Varianța (σ²) este pătratul abaterii standard (σ).

Abaterea standard a eșantionului (s)- abaterea standard, calculată pentru un eșantion de (n) date, este o estimare a abaterii standard a populației de date.

Unde : xi = rezultatul măsurării ;

– media aritmetică a (n) date;

(n-1) = grade de libertate;

n = număr de rezultate luate în considerare

Incertitudine de tip A – incertitudinea evaluată prin metodă analizei statistice a

seriilor de măsurări. Metoda de evaluare de tip A este o metodă de calcul statistic, din determinări repetate. Incertitudinea standard estimată statistic, se numește – incertitudine standard de tip A.

uA=ux=

Unde : s = abaterea standard a eșantionului;

n = numărul de determinări.

Incertitudine de tip B – incertitudinea evaluată prin alte metode decat analiză statistică a seriilor de măsurări. Metoda de evaluare de tip B cuprinde alte mijloace de calcul din datele din certificatele de etalonare, din date de măsurare anterioare, din experiența de comportare a instrumentelor, din specificațiile fabricantului și din alte informații relevante.

Componentele evaluate folosind metoda de tip B, trebuie exprimate și ele prin abateri standard (intervale de încredere, distribuție). Fiecare componentă evaluată cu metoda de tip B este caracterizată prin incertitudinea standard estimată.

Componentele evaluate, fie prin metoda de tip A fie prin metoda B, sunt combinate pentru a produce o valoare generală a incertitudinii, cunoscută ca incertitudine standard combinată (Ghid ISO/CEI 98-3, 2010) .

Incertitudinea standard compusă (combinată) (uc)– incertitudinea standard a rezultatului unei măsurări, atunci cand acel rezultat este obținut prin însumarea estimărilor componentelor de incertitudine. Incertitudinea standard compusă este exprimată prin rădăcina pătrată pozitivă a sumei estimărilor de incertitudine.

Incertitudini standard individuale calculate prin evaluări tip A sau tip B pot fi combinate în mod valabil cu "însumare în cuadratura" (de asemenea cunoscute ca "radical din suma pătratelor"). Rezultatul se numește incertitudinea standard compusă, se notează prin uc sau uc(y).

Incertitudinea standard combinată, se calculează că rădăcina pătrată din suma pătratelor abaterilor standard ale componentelor.

Incertitudine extinsă (Ue) incertitudinea de măsurare egală cu produsul dintre incertitudinea combinată uc(y) și un coeficient de amplificare k .

Ue = ±k*uc(y)

Coeficientul de amplificare k – valoarea numerică stabilită ca un multiplicator al incertitudinii standard combinate, pentru a obține o incertitudine extinsă. Coeficientul global de amplificare se determină în funcție de repartiția incertitudinii combinate sub nivelul de încredere adoptat al măsurării. Incertitudinea extinsă corespunde unui nivel de încredere superior nivelului de încredere al incertitudinii combinate.

Sursele posibile de incertitudine care trebuie luate în calcul într-o măsurare includ (Bell S, 1999) :

– definiția incompletă a măsurandului;

– esantionarea nereprezentativă a materialelor pentru încercări;

– cunoașterea insuficientă a efectelor condițiilor de mediu asupra măsurării sau măsurarea imperfectă a mărimilor de mediu;

– eroarea de justețe a observatorului la citirea indicației mijloacelor de măsurare;

– rezoluția limitată a mijloacelor de măsurare sau pragul de discriminare al acestora;

– valorile inexacte ale constantelor și ale altor parametri preluate din surse de informare externe și folosite în algoritmul de prelucrare a datelor;

– aproximațiile și presupunerile introduse în metodă și în procedura de măsurare.

Incertitudinea de măsurare este, deci, o estimație a domeniului valorilor în care se găsește valoarea adevărată a unei mărimi măsurate.

Incertitudinea evaluată prin metode de tip A nu acoperă termenul de aleator, iar cea evaluată prin metode de tip B pe cel de sistematic dar ele se pot compensa.

Propunere clasificării în raport cu metode de tip A sau B este facută pentru a indica cele două căi diferite de evaluare a incertitudinii. Nu este însă nici o diferență între natura componentelor rezultând din cele două tipuri de evaluări. Ambele tipuri se bazează pe distribuția probabilității și componentele incertitudinii rezultate din ambele tipuri sunt cuantificate prin varianța sau abatere standard.

În scopul identificării posibilelor surse de incertitudine în procedurile analitice este mai ușor să se împartă analiza într-un set de pași / etape (SAC, Technical Guide 2, 2008) :

a) Prelevarea

b) Prepararea probei

c) Prezentarea materialelor de referință folosite

d) Etalonarea echipamentelor

e) Analiza propriu-zisă (achiziția de date

f) Prelucrarea datelor

g) Prezentarea rezultatelor

h) Interpretarea rezultatelor