Faza De Proiect 20 Noiembrie Final Pc (2) [306327]

Activitatea: Act 1.11 – Producerea pe baza unor rețete de laborator verificate (la nivel minim de TRL2) ale componentelor de bază (micro- și nanoparticule (NP) metalice și polimerice (NPP), matrice de plasturi și geluri) funcționalizate cu agenți bioactivi cu acțiune de vindecare din structura plasturilor inteligenți și a hidrogelurilor pentru tratamente topice avansate

1. PARTEA EXPERIMENTALĂ

Materiale și reactivi chimici

Pentru realizarea probelor de hidrogel s-[anonimizat]:

Chitosan (CS), cu masă moleculară medieMw=1.9 – 3.1 ×105 g/mol

Polivinilpirolidonă (PVP),cu masă moleculară Mw=3.6×105 g/mol și PVP cu masă moleculară Mw=1.3×106 ([anonimizat])

Polietilen glicol (PEG), cu masă moleculară Mw = 2×104 g/mol ([anonimizat])

Polietilen oxid (PEO), cu masă moleculară Mw = 3×105g/mol ([anonimizat])

Acid Lactic (LA), cu masă moleculară Mw = 90.08 g/mol ( PuracPowder 55)

N,N-metilen-bis-acrilamida(NMBA)99%, cu masă moleculară Mw=154.17 g/mol ([anonimizat])

Acid acrilic anhidru (AA) 99%, cu masă moleculară Mw = 72.06 g/mol ([anonimizat])

Ibuprofen procurat de la ROMPHARM România

Hidroxid de sodiu (NaOH), cu masă moleculară Mw = 40 g/mol ([anonimizat])

Acid tanic (TA), cu masă moleculară Mw = 1701.19 g/mol (Scharlau)

Citrat de sodiu (SC), cu masă moleculară Mw = 294.10 g/mol (Scharlau)

Azotat de argint (AgNO3), cu masă moleculară Mw = 169.87 g/mol (Scharlau)

Apă deionizată

Soluție tampon fosfat (PBS, pH = 7.4, T = 37°C)

1.2. Sinteza hidrogelurilor prin reticulare cu fascicule de electroni accelerați

În scopul optimizării rețetei de obținere a hidrogelurilor prin reticulare cu radiații ionizante (e-beam), în această etapă de proiect s-au preparat 4 compoziții diferite de hidrogeluri (notate cu G1, G2, G3 și G4) pe bază de chitosan (CS), polivinilpirolidonă (PVP). [anonimizat], a [anonimizat], având ca scop principal reducerea la minim sau eliminarea materialelor potențial toxice.

[anonimizat] (0.5%) a fost dispersat fie într-o [anonimizat] (0.05 mol/L) [anonimizat] (0,05 mol/L). Înainte de adăugarea CS, s-a [anonimizat] (AA, pH= 2,7, LA, pH = 2,5). Chitosanul a fost solubilizat prin ultrasonare timp de 2,5 h (T = 50oC, 37 kHz, putere 130 W). După solubilizarea CS, s-a verificat pH amestecului obținut (pH=3,8 în AA) și (pH = 3,7 în LA). În continuare s-au adăugat PVP 360 kDa (7%) sau PVP 1300 kDa (5%), PEG 20 kDa (1,2-2,5%), PEO 300 kDa (1,2-1,25%) și 0,5% NMBA, continuându-se agitarea la temperatura camerei până la omogenizarea completă a amestecului. După solubilizarea completă a amestecului prin agitare mecanică la 500 rpm, pH-ul final al amestecului polimeric (pre-hidrogel) a fost ajustat până la valoarea de 5.5 cu NaOH (1 M). Pentru reducerea efectelor de degradare oxidativă a [anonimizat] (500 rpm, 5 min) pentru eliminarea aerului introdus în timpul agitării mecanice. [anonimizat] a fost distribuită în cutii Petri cu diametrul de 32 mm, [anonimizat] o masă de 3+0,1g. Înainte de iradiere cutiile Petri conținând soluția polimerică neiradiată, au fost ambalate în vid. În continuare în tabelul 1 se prezintă compoziția procentuală a celor 4 rețete de hidrogel preparate.

Tabel 1. Compoziția masică a hidrogelurilor

Hidrogelurile preparate conform descrierii de mai sus au fost iradiate în câmp de fascicul de electroni accelerați la Acceleratorul Liniar de Electroni ALID-7 (INFLPR), cu energia medie a electronilor de 6 MeV. Dozele de iradiere aplicate probelor au fost cuprinse în intervalul 5- 25 kGy la un debit doză de 3 kGy / min.

Geometria de iradiere, doza absorbită și debitul dozei au fost stabilite prin efectuarea dozimetriei fasciculului de electroni accelerați cu calorimetre de grafit. Calorimetrele de grafit, au fost realizate în laboratorul nostru, în conformitate cu standardul ISO/ASTM 51 631: 2011 Sensibilitatea calorimetrului este de 0.75 kGy·C-1, iar domeniul de energie pentru care poate fi utilizat este cuprins între 1.5–12 MeV. Calorimetrele au fost calibrate față de calorimetre din grafit de referință. în Polonia (Institute of Nuclear Chemistryand Technology)

Figura 1. a) Soluția polimerică înainte de iradiere; b) Aspectul hidrogelurilor obținute după iradiere

Activitatea: Act 1.12 – Caracterizarea fizico-chimică a micro- și NP metalice saupolimerice precum și matricilor plasturilor și hidrogelurilor din punct de vederecompozițional, structural și al stabilității termice, chimice și fotochimice. Indicatori de realizare: 1 Buletin de analiza pe loturi de probe de tipul micro- și NP metalice sau polimericeprecum și matricilor plasturilor și hidrogelurilor

și

Activitatea: Act 1.13 – Evaluarea stabilității materialelor sintetizate în soluții simulate de pH fiziologic și optimizarea compozițională și structurală a materialelor suport (micro- și nanoparticule metalice și polimerice, matrice plasturi și geluri)

1.3. Caracterizarea hidrogelurilor

1.3.1. Determinarea fracției de gel (%)

După iradiere hidrogelurile au fost divizate în probe individuale de masă apropiată pentru a permite investigațiile ulterioare. Astfel, probele de hidrogel obținute după iradiere au fost uscate la etuva cu vid la 40oC până la masă constantă (mi). În continuare, probele de hidrogel în stare uscată, după cântărire au fost imersate în apă deionizată la temperatura camerei timp de 48 h, cu scopul de a îndepărta fracția de polimer nereacționată. După 48 h, probele de hidrogel au fost filtrate pe hârtie de filtru și uscate din nou la etuvă cu vid la 40oC până la masă constantă (md). Fracțiile de gel (G%) și sol (s)s-au calculat conform ecuațiilor:

(1)

(2)

1.3.2. Analiza sol-gel

Analiza sol-gel este o metodă gravimetrică care permite evaluarea procesului de gelifiere în sistemele polimerice iradiate (mono- sau multi-componene). Doza de gelifiere (Dg), raportul degradare vs. reticulare (p0/q0) și determinarea dozei virtuale (Dv) au fost estimate folosind un software gratuit disponibil (GelSol95) conceput pentru analiza sol-gel (http://mitr. p.lodz.pl/biomat/old_site/gelsol.html), care implementează versiunea extinsă a ecuației Charlesby-Pinner dezvoltată de Charlesby și Rosiak[1] exprimată în ecuația de mai jos:

(3)

unde s – fracția solubilă dehidrogel, p0– densitatea de degradare, q0 – densitatea de reticulare, D – doza absorbită.

1.3.3. Determinarea gradului de gonflare la echilibru (%) și stabilitatea hidrogelurilor în condiții simulate de pH fiziologic

Pentru studiile de gonflare s-au utilizat probe uscate de hidrogel, după îndepărtarea fracției de polimer nereacționat. Probele de hidrogel în stare uscată (md) de masă aproximativ egală (0.11- 0.12 g) au fost introduse în soluție tampon fosfat (PBS, pH = 7.4) la temperaturi diferite (37, 39, 41°C), dar și la temperatură constantă de 37°C în pH diferit (5.4, 6.3 și 9.2).Deoarece soluția tampon fosfat imită starea fiziologică (pH, osmolaritate și concentrația ionilor) ale corpului uman, stabilitatea și capacitatea de umflare a hidrogelurilor cu chitosan au fost studiate în aceste condiții. La intervale de timp exact stabilite, proba de hidrogel (ms) a fost uscată prin tamponare cu hârtie de filtru pentru îndepărtarea excesului de apă și cântărită la balanța analitică cu o precizie de 0.0001 g.

Gradul de gonflare la echilibru (SD), reprezintă cantitatea maximă de lichid absorbită raportată la masa de hidrogel uscat și care a fost calculat conform ecuației:

(4)

1.3.4. Capacitatea de reținere a umidități

Pentru a examina capacitatea de reținere a umidității, fiecare probă de hidrogel cu o suprafața de 1 x 1 cm2, a fost dispusăîntr-o cutie Petri după cares-a măsurat greutatea inițială (wi) la temperatura camerei (25°C) . La intervale diferite de timp (2-24 h), cutia Petri conținând proba de hidrogel a fost cântărită (wt). Capacitatea de reținere a umidității (Rh(%)) reprezintă cantitatea de apa reținută în hidrogel și a fost calculată cu relația (5):

(5)

1.3.5. Rata de transmisie a vaporilor de apă

Măsurarea ratei de transmisie a vaporilor de apă (WVTR) a fost utilizată în conformitate cu procedura din Phamacopoeia Europeană. Permeabilitatea la vapori a hidrogelului a fost determinată din pierderea în greutate a ansamblului de hidrogel și un flacon de sticlă (di = 15 mm) conținând 10 ml de apă deionizată. Sticla a fost închisă cu un disc de hidrogel (dhidrogel = 20 mm obținut dupăiradiere în stare umedă, dar negonflat, etanșat de jur împrejur cu parafilm și păstrat într-un exicator în etuvă la 37°C timp de 24 de ore. WVTR a fost calculat folosind următoarea formulă:

(6)

unde A este suprafața flaconului (mm2), wiși wtsunt masele flaconului înainte de a fi introdus în etuvă, respectiv după ce a fost scos din etuvă.

1.3.6. Spectroscopie ATR-FTIR

Spectrele FT-IR s-au efectuat pe probe de hidrogel uscat, după determinarea fracției de gel.Pentru înregistrarea spectrelor FTIR, s-a utilizat un instrument PerkinElmerSpectrum 100 în modul ATR, cu cristal de diamant, în domeniul spectral 4000–600 cm-1 la o rezoluție de 4 cm-1. Fiecare spectru a fost achiziționat după 50 scanări/probă, atât pentru hidrogelurile neiradiate cât și pentru cele iradiate.

2. Rezultate și discuțiicaracterizare hidrogeluri

2.1 Analiza sol-gel

În Figura 2 se prezintă variația fracției de gel cu doza absorbită pentru hidrogelurile G1 – G4 , obținute la un debit de doză de 3kGy/min.Fracția de gel a crescut cu doza absorbită până la doza maximă de 25 kGy pentru hidrogelurile G1 și G3 preparate cu AA, iar pentru hidrogelurile G2 și G4, preparate cu LA, a crescut cu doza absorbită doar până la 10 kGy. Fracția de gel a atins 96% pentru hidrogelul G3, iar cea mai mică fracție de gel s-a obținut la doza minimă de 5 kGy de 32% pentru hidrogelul G1.

Evaluarea eficienței de reticulare cu fascicule de electroni pentru hidrogelurile G1-G4 a fost urmată de determinarea raportului densității de degradare față de densitatea de reticulare conform Ec. (3). Proporția randamentului de degradare (scindare) versus randamentul de reticulare exprimat ca raportul p0/q0 cuantifică relația dintre procesele de reticulare și de degradare. Rapoartele p0/q0 au variat între 0.07 și 0.49, ceea ce sugerează că predomină procesele de reticulare (Tabel 2). În acest caz, am constatat că raportul p0/q0 a fost mai mic pentru hidrogelul G3.

Figura 2. Efectul dozei absorbite asupra fracției de gel pentru hidrogelurile G1-G4

Pentru sistemele mono sau multicomponente iradiate, care prezintă o fracție insolubilă mai mare de 50 % și p0/q0 mai mic de 2, aceasta indică faptul că deși procesele de reticularea au loc simultan cu procesele de degradare în timpul iradierii, procesul de reticulare, predomină [3].

Tabel 2. Doza de gelifiere și gradul de degradare vs. reticulare conform ecuației lui Charlesby-Rosiak.

În plus, analiza sol-gel corelată cuexperimentele de gonflare permite determinarea randamentelor radiochimice de reticulare și de scindare (degradare) conform Ecuațiilor 5 și 6. Datele obținute sunt listate în Tabelul 4. Randamentul de reticulare (eng. G-value) este definit ca fiind numărul de unități (molecule, atomi, ioni), transformate de radiația ionizantă în urma absorbției unei cantități de energie radiantă de 100 eV.

(5)

(6)

unde GX este randamentul de reticulare, GS este randamentul de degradare, Mc (g/mol) este masa moleculară a lanțului polimeric dintre două puncte de reticulare succesive, c (g/L) este concentrația de polimer în soluția iradiată, D (Gy) este doza absorbită și ρ (g/cm3) este densitatea soluției. Estebine cunoscut faptul că principalele efecte chimice asupra sistemelor polimerice iradiate sunt reticularea și degradarea [4].Astfel, pentru evaluarea completă a procesului de iradiere este necesară determinarea valorilor numerice ale parametrilor principali, randamentul de reticulare (GX), precum și randamentul de degradare (GS). Calculul GX și GS poate fi realizat din experimente de gonflare [5].

Din datele obținute, s-a observat că pentru hidrogelulG2, G(X) < G(S) . Se observă ca pentru hidrogelul G1, valorile G(X) sunt foarte scăzute. Pentru celelalte hidrogeluri obținute prin iradiere, predomină procesele de reticulare, GX > GS.

Tabel 3. Randamentele radiochimice de reticulare și degradare calculat pentru hidrogelurile G1-G4

2.2. Gradul de gonflare la echilibru

Hidrogelurile sunt de obicei definite prin capacitatea de absorbție, de aceea primul pas pentru caracterizarea structurii reticulate a unui hidrogel, este studierea proprietăților de gonflare. Capacitatea de absorbție a unui hidrogel depinde de natura polimerului, natura soluției, structura hidrogelului și gradul de reticulare. Cei mai importanți parametrii în evaluarea structurii unui hidrogel sunt densitatea de reticulare și distribuția punctelor de reticulare în interiorul rețelei de hidrogel. Capacitatea de gonflare este dată de spațiul din interiorul rețelei polimerice disponibil pentru a reține un lichid. În funcție de caracteristicile hidrogelului, gonflarea se produce prin forțe de interacție polimer-apă, forțe electrostatice și procese de osmoză [2],[6].

Figura 3. Efectul dozei de radiație asupra gradului de gonflare a hidrogelurilor G3 și G4 în PBS (pH = 7.4) la temperaturi diferite

Comportamentul de gonflare și stabilitatea structurală a hidrogelului sunt esențiale pentru utilizarea lor practică ca pansamente pentru vindecarea rapidă a rănilor. Majoritatea polimerilor naturali, inclusiv chitosanul, se gonflează rapid în fluide biologice. Experimentele de gonflare au fost efectuate până când gradul de gonflare a atins o valoare constantă (echilibru) pentru fiecare probă iradiată la 15−25 kGy.

Proprietățile de gonflare ale hidrogelurilor G3 și G4 care au prezentat cele mai bune fracții de gel și comportare post-iradiere, au fost testate în soluție tampon fosfat salin (PBS, , pH = 7.4) la temperaturile de 37, 39 și 41° C. În figura 3 se prezintă, capacitatea de gonflare la echilibru a hidrogelurilor. Procentul de gradului de gonflare (GG) a atins o valoare peste 1750% la temperatura de 37 °C pentru hidrogelul G3 obținut la 15 kGy, iar pentru G4 maximul a fost de 1300%. În ceea ce privește evoluția capacității de gonflare în funcție de doza absorbită și de temperatură, s-a observat că GG a scăzut în funcție de doza de radiație, așa cum era de așteptat. La doze de radiație, peste 25 kGy, în cazul acestor geluri, gradul de reticulare crește semnificativ, astfel rețeaua macromoleculară a hidrogelului devine tot mai densă, ceea ce împiedică difuzia moleculelor din mediul de gonflare.

În ceea ce privește stabilitatea hidrogelurilor, în condiții de stare febrilă simulate, cu creșterea temperaturii mediului de gonflare, s-a observat o reducere a GG cu un procent de până la 10% la temperatura de 41° C.

Hidrogelurile care au prezentat cele mai bune proprietăți în condiții simulate de pH fiziologic și temperatură diferită au fost evaluate și din punct de vedere al stabilității în soluții simulate de pH diferit. Este cunoscut faptul că pH-ul pielii sănătoase este de 5,5, în timp ce pH-ul unei răni infectate, poate să depășească valoarea de 9. Hidrogelurile testate au fost capabile să își păstreze capacitatea de gonflare în condițiide pHdiferit: 5.4, 6.3 și 9.2. Pentru aceste experimente s-au folosit soluții tampon cu compoziție similară mediului fiziologic

În figura 4 se prezintă evoluția gradului de gonflare la echilibru a hidrogelurilor G3 și G4 în soluții simulate cu pH diferit și temperatura fiziologică de 37 °C.

În cadrul acestui studiu, s-a observat că hidrogelul G3 prezintă aceeași valoare a GG în intervalul de pH 5.4 – 9.2. Valoarea maximă de gonflare s-a situat între 1100 – 1200% pentru hidrogelul preparat la 15 kGy.

Pentru hidrogelul G4 preparat la 15-25 kGy s-a observat că modificarea pH-ului din mediul de gonflare, conduce la scăderea gradului de gonflare, până la 20%, cu creșterea pH-ului, dar ceea ce nu afecteazăsemnificativaceastă proprietate.

Figura 4. Efectul dozei de radiație asupra gradului de gonflare la echilibru a hidrogelurilor G3 și G4 în soluții tampon simulate la pH 5.4, pH 6.3 și pH 9.2 și temperatura fiziologică de 37 °C.

Hidrogelurile preparate au fost testate și din punctul de vedere al stabilității la absorbția de nanoparticule de argint (AgN). Soluția coloidală de nanoparticule de Ag a fost preparată prin reducerea chimică a AgNO3 (25 mM) în prezență de citrat de sodiu (5mM) și acid tanic (0,1 mM).

Hidrogelurile G3 și G4 au atins starea de echilibru după 24 de ore, sugerând astfel formarea unei rețele mai dense datorită pătrunderii Ag în rețeaua hidrogelului. Hidrogelurile și-au păstrat de asemenea și forma fizică, sugerând totodată stabilitatea acestora în soluția de AgN. Gradul de gonflare a scăzut cu creșterea dozei absorbite pentru ambele hidrogeluri, ceea ce sugerează că densitatea de reticulare a crescut. Maximul de gonflare pentru G3 a avut valoarea de 1835%, iar pentru G4 la 1204% pentru hidrogelurile preparate la doza de 15 kGy.

Figura 5. Gradul de gonflare la echilibru a hidrogelurilor G3 și G4 în soluție coloidală de Ag preparată la rece.

2.3.Mecanismul de difuzie

Studiul mecanismului de difuzie al apei în hidrogeluri cu proprietăți superabsorbante este de mare interes, deoarece astfel sestabilește cu exactitate aplicația pentru care este potrivit. În continuare, folosind datele obținute din experimentele de gonflare (PBS, pH=7.4), s-a determinat cinetica de difuzie a mediului de gonflare similară condițiilor fiziologice. Următoarea ecuație a fost utilizată pentru a determina mecanismul de difuziei al soluției de PBS în hidrogeluri:

(7)

unde Mt și M∞ reprezintă cantitatea de solvent difuzată în hidrogel la momentul t și în stare de echilibru; k este o constantă legată de rețeaua macromoleculară, iarexponentul n este un număr utilizat pentru a caracteriza tipul de difuzie șimecanismul de transport [7].

Când valoarea n ≤ 0.5 indică un mecanism de difuzie Fickian sau Case I, rata de difuzie a solventuluieste mult mai mică decât relaxarea lanțurilor macromoleculare ale polimerului. Valorile lui n între 0.5 <n <1 indică un transport de tipnon-Fickian sau anormal, în care atât difuzia, cât și penetrarea solventului se datorează relaxării lanțului macromolecular al polimerului.[8].

Ecuația 7 se aplică etapei inițiale a procesului de gonflare, până la 60% din maxim de gonflare (stare de echilibru)[9].Pentruprobele luate în studiu , Fvst0.5 este reprezentat grafic și rezultate sunt prezentate în Figurile 6A și 7A. Figurile 6B și 7B reprezintăreprezentarea grafică lui lnF față de ln tfolosind cinetica degonflare.

Figura 6. a) Reprezentarea grafică a lui F față de t0,5 pentru hidrogelurile G3;b) Curbele cinetice de gonflare ale hidrogelurilor G3.

Parametrii n, k și D au fost determinați din panta și intersecțiile liniilor. Valorile constantelor de difuzie (k), exponenților de difuzie (n) și coeficienților de difuzie (D) pentru hidrogeluri sunt indicate în Tabelul 4.

Valorile luin depind de forma geometrică a hidrogelurilor, care afectează mecanismul de difuzie. Se poate constata că valorile lui n pentru hidrogelurile G3 si G4 sunt în intervalul 0.28−0.41, prin urmare, tipul de difuzie în hidrogeluri a fost considerat ca fiind Fickian. Rezultatul indică faptul că moleculele de solvent pot difuza pur și simplu prin rețeaua de polimeri prin procese de difuzie.

Figura 7. Reprezentarea grafică a lui F față de t0,5 pentru hidrogelurile G4; b) Curbele cinetice gonflate ale hidrogelurilor G4.

Tabel 4. Parametrii k, n și D pentru hidrogelurile G3 și G4.

2.4. Caracterizarea structurii reticulate a hidrogelurilor

Hidrogelurile au fost caracterizate prin determinarea fracției volumice a polimerului în stare gonflată (V2,s), a masei moleculare a lanțului polimeric dintre două reticulări succesive (Mc) și dimensiunea corespunzătoare ochiurilor rețelei polimerice (ξ) utilizând datele de gonflare observate mai sus. Numărul efectiv al lanțurilor polimerice (Ve în mol/g) determinat cuecuația 8 [10].

(8)

unde este volumul specific polimerului,V1 este volumul molar al apei (18 cm3/mol) și χ este parametrul de interacție polimer-solvent Flory. Volumul hidrogelului în stare relaxată (V2,r) după iradiere, dar înainte de gonflare, și volumul hidrogelului gonflatîn apă (V2,s) au fost determinate cu ecuațiile 9 și 10.

(9)

(10)

unde ρpolymerșiρsolventau fost luate ca densități ale polimerului și ale apei. Raportul de gonflare a masei hidrogelurilor după reticulare (w2r) a fost calculat astfel:

w2r = masa hidrogelului după iradiere/masa uscată hidrogel. Raportul de gonflare a masei hidrogelurilor după gonflare (w2s) a fost calculat astfel: w2s= masa hidrogelului după gonflare/masa uscată hidrogel. Valoarea χ a fost calculată folosind următoarea formulă [11]:

(11)

Dacă se ignoră capetele lanțului polimeric Ve = 1/Mc. Dimensiunea corespunzătoare ochiurilor rețelei polimerice sau distanța liniară dintre două puncte dereticulare este un parametru important pentru predicția permeabilității hidrogelului și a fost estimată utilizând următoarea ecuație [12]:

(12)

unde Cn este raportul caracteristic Flory determinat ca masamedie a valorilor polimerilor conținuți (Cn, PVP= 12.3, Cn, CS= 19, Cn, AA= 6,7,Cn, PEO= 4.1). Mrmasa moleculară medie a unității monomerice (PVP= 122.88 g/mol, CS = 154 g/mol, NMBA =154.17, PEO = 44.05 și AA = 72 g/mol), l este lungimea legăturii carbon–carbon (0.154 nm).

Valorile experimentale ale lui Mc, Ve și ξ determinate pentru hidrogelurile G1 și G4 sunt prezentate în Tabelul 5.

Tabel 5. Parametri caracteristici structurii macromoleculare a hidrogelurilor G1-G4.

În general, densitatea de reticulare (Ve), instrument utilizat pentru evaluarea caracteristicilor hidrogelurilor a fost situată între 1.8–68.8 × 10-5 mol/cm3 a crescut cu doza de iradiere.

Mc pentru toate tipurile de hidrogeluri este cuprinsă între 1.3 – 54.4 x 103 g/mol a scăzut cu doza absorbită. Fiecare compoziție de hidrogel a relevat un comportament în funcție de dozele absorbite. Hidrogelul G1 iradiat la 10 kGy a prezentat un Mc foarte mare, spre deosebire de hidrogelurile G2 – G4, ceea ce arată ca hidrogelul cu această compoziție nu s-a reticulat corespunzător

ξ este un parametru care descrie spațiul disponibil între lanțurile macromoleculare ale matricei de hidrogel, fiind un factor important pentru determinarea rezistenței mecanice, a degradabilității și a difuziei moleculelor de apă sau alte lichide. Valorile calculate pentru dimensiunea corespunzătoare ochiurilor rețelei polimerice sunt în intervalul 5.8 – 72.2 nm.

2.5. Capacitatea de retenție a umidități

După două ore nu au existat diferențe semnificative în capacitatea de retenție a umidității hidrogelurilor , fiind cuprinsă în intervalul 96.7% – 97.6%. Se poate observa în Tabelul 6 ca ambele hidrogeluri preparate cu doze de radiație între 15-25 kGy , rețin după 24 de ore între 80.59% și 82% din umiditate. Menținerea umidități crescute în plăgile acoperite cu un astfel de hidrogel asigură un mediu propice pentru o vindecare mai rapidă.

Tabel 6.Capacitatea de reținere a umidități la diferite intervale de timp pentru hidrogelurile G3 și G4

2.6. Rata de transmisie a vaporilor de apă

Un pansament ideal controlează pierderea de apă evaporată dintr-orană . Rata normală pentru pielea sănătoasă este de 204 g/m2 pe zi, în timp ce pentru pielea vătămată poate ajunge la 279- g/m2 pe zi pentru o arsură de gradul I. Permeabilitatea vaporilor de apă la un pansament ideal pentru vindecarea rănilor ar trebui să împiedice atât deshidratarea excesivă cât și acumularea exsudatului[13].

Așa cum se arată în tabelul 7, hidrogelurile au prezentat o gamă largă de valori WVTR, între 167-273 g /m2 la 24 ore în condițiile de testare indicate. Acest lucru sugerează că hidrogelurile de chitosan G3 și G4 pot fi utilizate pentru a controla pierderea de lichide corporale și pentru a menține mediul umed al rănilor arse.Trebuie remarcat totuși că WVTR este influențat de umiditatea relativă și de temperatura care determină forța de antrenare a presiunii parțiale a vaporilor de apă pe hidrogel. Astfel, dacă umiditatea relativă a camerei ar fi crescută, WVTR ar fi redus și invers [14].

Tabel 7. Hidrogelurile evaluate și rezultatele ratei de transmisie a vaporilor de apă (WVTR)

2.7. ATR- FTIR

Schimbările structurale care au apărut după iradierea cu fascicule de electroni în hidrogelurile G1- G4 au fost investigate prin spectroscopie ATR-FTIR.Benzile principale de absorbție caracteristice chitosanului sunt: o bandă puternică în intervalul de la 3750 cm-1 până la 3000 cm-1 care corespunde vibrațiilor de întindere a grupărilor –OH și N-H; benzile de absorbție de la aproximativ 2921 și 2877 cm-1 pot fi grupărilor C-H; benzile de la aproximativ 1650 cm-1 sunt caracteristice grupărilorC=O , la 1325 cm-1 (C-N dinamida III); bandade absorbție de la 1153 cm-1, poate fi atribuită întinderii asimetrice a grupării C-O-Cbenzile de la 1066 și 1028 cm-1 corespund grupării C-O. Aceste benzi sunt caracteristice polizaharidelor[15].

Benzile specifice de absorbție corespunzătoare pentru PVP sunt: 3470 cm-1 (vibrații de întindere O–H,), 2870-2950 cm-1 (vibrații de întindere C–H și CH2), 1664 cm-1 (vibrații de întindere C=O și C­N); 1370/1420/1459/1490 cm -1 (vibrațiile de deformare specifice C−H și CH2 din inelul pirolidinic).Pentru hidrogelurile G1-G4, iradiate la doze cuprinse în intervalul 10-25 kGy s-a observat că intensitatea benzilor de absorbție variază cu doza absorbită.Spectrele neiradiate (0 kGy) pentru fiecare compoziție de hidrogel G1- G4 (figura 8a-d) au prezentat variații ale intensității vibrațiilor de întindere OH și NH. Picul de absorbție de la 1589 cm-1 N-H, caracteristică chitosanului nu a mai fost identificat după iradiere, datorită creșterii intensității maxime a vibrațiilor de întindere în regiunea 1641 cm-1, care indică participarea grupurilor hidroxil și a grupărilor amino în reacția chimică. Reticularea hidrogelului este confirmată de banda de absorbție apărută la 1641 cm-1, datorită vibrațiilor și alungirii picului caracteristic C=O.

Reticularea unui sistem polimeric poate fi urmărită în spectrul FT-IR prin două mecanisme: creșterea intensității benzilor de absorbție caracteristice sau deplasarea acestora spre lungimi de undă mai mici[16].

Intensitatea benzilor de absorbție a hidrogelurilor G1 de la 3800–2400 cm-1 a fost dependentă de doza de radiație aplicată. Se poate observa că intensitatea benzilor pentru probele iradiate la 10-25 kGy a fost mai mică în comparație cu probele neiradiate. Poziția benzilor atribuite grupărilor O-H a fost deplasată de la 3350 cm-1 la 3383 cm-1 după 25 kGy. În intervalul 1800-600 cm-1 (Figura 8a), cea mai evidentă deplasare în funcție de doza absorbită a fost observată pentru benzile situate la 1645 cm-1 la 1650 cm-1, 1283 cm-1 până la 1284 cm-1 precum și pentru 1102 cm-1 până la 1105 cm-1.

Un trend evident s-a observat pentru hidrogelurile G3 (figura 8c) pentru care intensitatea benzilor de absorbție situate în intervalul 3600-800 cm-1 crește până la doza de 10 kGy. La dozele de 15, 20 și 25 kGy, intensitatea benzilor a scăzut proporțional cu doza absorbită. În spectrele FTIR ale hidrogelului G3 neiradiat,benzile principale au fost identificate la 3358 cm-1, 2884 cm-1, 1644 cm-1, 1463 cm-1, 1285 cm-1 și 1107 cm-1. După iradierea cu fascicul de electroni cu 25 kGy, benzile au fost deplasate spre lungimi de undă superioare: 3384 cm-1; 2899 cm-1; 1647 cm-1 și 1286 cm-1.

Faptul că intensitatea benzilor caracteristice pentru hidrogelul cu compoziția G3 scade la doze de peste 25 kGy este atribuit faptului că reticularea scade. Un sistem polimeric puternic reticulat nu are capacitate de absorbție importantă, deoarece spațiul disponibil difuzării moleculelor în rețeaua polimerică este foarte redus. Mai mult de atât, conform definiției hidrogelurilor acestea trebuie să fie sisteme tridimensionale „moderat reticulate”, cu capacitate de absorbție a apei, soluțiilor saline sau fluide fiziologice cuprinsă între 10-1000 ori în raport cu greutatea lor.

În figura 8d sunt prezentate spectrele FT-IR pentru hidrogelurile G4. Putem vedea că intensitatea benzilor pentru probele iradiate la dozele de 10-25 kGy a fost mai mare decât pentru probele neiradiate ( 0 kGy).

Figura 8.Spectrele FTIR ale hidrogelurilor neiradiate și iradiate: a) G1; b) G2; c) G3; d) G4.

Activitatea: Act 1.14 – Evaluarea compozițională și a profilelor de eliberare de agenți bioactivi (ioni, extracte naturale și medicamente) din componentele de bază ale dispozitivelor medicale (micro- și nanoparticule metalice și polimerice, matricea plasturilor și gelurilor) în soluții fiziologice simulate

2.8. Eficiența de absorbție medicamente și studiul de eliberare in vitro a Ibuprofenului pentru hidrogelurile cu compoziție optimizată

Eficiența de încapsulare, capacitatea de încărcare și profilul de eliberare a medicamentelor fost testate pentru ibuprofen (IBU). Aceste proprietăți au fost determinate spectrofotometric cu un spectrofotometru Varian (model Cary 100). 2000 mg IBU au fost dizolvate în 100 mL alcool etilic absolut (EtOH). Din această soluție s-au luat 10 mL soluție EtOH+IBU (200 mg – L1) în care a fost adăugate probele de hidrogel uscat (100+0,2 mg – L).

Flacoanele cu probele de hidrogel au fost etanșate apoi agitate timp de 6 ore la 50 rpm într-o baie cu apă prevăzută cu termostatare la temperatura de 37±0,1°C. Soluția a fost filtrată, iar hidrogelul încărcat cu medicament a fost spălat cu 2 ml de EtOH pentru îndepărtarea medicamentului adsorbit pe suprafața hidrogelului. Hidrogelurile cu IBU încapsulat au fost uscate într-o etuvă prevăzută cu sistem de vidare la temperatura de 37°C până la masă constantă. Concentrația reziduală de IBU în soluția de etanol filtrat (L2) a fost determinată prin măsurarea absorbanței la 264 nm, conform curbei de calibrare determinată.

Eficiența de încapsulare reprezintă procentul de medicament care este înglobat într-o matrice polimerică, iar capacitatea de încărcare reprezintă cantitatea totală de medicament înglobată raportată la greutatea totală a matricei polimerice. Eficiența de încapsulare cu IBU (EI) și capacitatea de încărcare (CI) a hidrogelurilor G3 și G4 a fost determinată cu relația [17] :

(13)

(14)

Concentrația reziduală de IBU a fost calculată, ținând cont de factorul de diluție și volumul de soluție. Testul de eliberare in vitro al IBU a fost efectuat prin introducerea unui hidrogel încărcat cu medicament în 100 ml (pH = 7,4) soluție tampon fosfat salin (PBS). Soluția a fost agitată continuu la 37±0,1°C. Pentru măsurarea concentrației de IBU eliberată, la intervale diferite de timp s-a extras un volum de 5 mL din mediul de eliberare. Pentru menținerea unui volum constant al mediului de eliberare, s-au adăugat de fiecare data 5 mL PBS proaspăt menținut la temperatura de 37oC. Profilul de eliberare al IBU a fost obținut prin trasarea unei curbe Mt / M față de t (timpul în minute), unde Mt este cantitatea de medicament eliberată la momentul t, iar M este cantitatea de medicament eliberată după 360 minute. Pentru determinarea cantității de IBU absorbite și eliberate, s-a determinat curba de calibrare pentru IBU solubilizat în EtOH la concentrații cunoscute de IBU (0,05-0,6 mg/ml).

Figura 9. Absorbția de Ibuprofen în hidrogelurile G3 și G4; a) Curba calibrare IBU-EtOH (0,05-0,6 mg/mL); b) Spectrele UV-Vis ale ibuprofenului solubilizat în etanol absolut; c) și d) Spectrele UV-Vis înregistrate după absorbția ibuprofenului în hidrogelurile G3 și G4 (0.3 mg/mL – spectrul UV-Vis pentru proba martor fără hidrogel)

Tabelul 8. Eficiența de încapsulare și capacitatea de încărcare cu ibuprofen pentru G3 și G4

În Figura 9 și Tabelul 8 sunt prezentate datele experimentale obținute pentru determinarea eficienței de încapsulare și a capacității de încărcare in vitro cu ibuprofen a hidrogelurilor G3 și G4. Așa cum se observă din valorile prezentate în Tabelul 1, eficiența de încapsulare a IBU scade cu doza de radiație pentru hidrogelurile G3. O scădere de 5% a fost observată pentru hidrogelul reticulat la doza de 25 kGy, cel mai probabil datorită creșterii gradului de reticulare, astfel substanța activă fiind împiedicată efectiv din punct de vedere steric, să pătrundă în rețeaua macromoleculară a hidrogelului. Hidrogelurile testate au arătat o comportare satisfăcătoare în ceea ce privește eficiența de încapsulare și capacitatea de încărcare cu medicamente cu solubilitate redusă, cum este cazul ibuprofenului.

Figura 10. Imagini cu hidrogelurile obținute după iradiere la 15 kGy, după încapsularea cu ibuprofen și după eliberarea completă a medicamentului.

Profilul de eliberare al ibuprofenului a fost investigat timp de 360 min pentru hidrogelurile G3 și G4 și este prezentat în figura 11. IBU din rețeaua macromoleculară a hidrogelurilor a fost eliberat în proporție de 50-60% în primele 120 min, ajungând la un maxim după 6h. Eliberarea mai lentă a IBU poate ajuta la menținerea unei concentrații optime în organism considerând ca timpul normal de înjumătățire în organism este de 1-3 h [18]. Acest comportament se datorează cel mai probabil moleculelor de IBU care au fost strâns legate de lanțurile de polimeri prin legături intermoleculare, forțe hidrofobe de interacțiune sau atracție electrostatică. Pentru hidrogelul G3, este evident faptul că producerea lui la o doză mai mare de 15-20 kGy, încetinește rata de eliberare a IBU după 120 min. În ceea ce privește, rata de eliberare a IBU din hidrogelurile G4, doza de radiație nu reduce rata de eliberare a medicamentului în primele 120, pentru hidrogelul obținut la 20 kGy. De asemenea, este evident faptul că puterea de gonflare a hidrogelurilor are un efect deosebit asupra ratei de eliberare a medicamentului. Se observă că eliberarea controlată a medicamentului prin difuzie, crește odată cu creșterea gonflării hidrogelului în mediul de PBS la pH = 7.4. După 8 h, concentrația de IBU eliberată a scăzut sub 50 %.

Figura 11. Profilul de eliberare al Ibuprofenului din hidrogelurile G3 și G4

2.9. Eficiența absorbției de nanoparticule de Ag în hidrogelurile G3 și G4

Hidrogelurile preparare au fost testate în vederea înglobării cu nanoparticule de Ag (AgN). Pentru prepararea AgN s-au utilizat două abordări pentru sinteza chimică a acestora:

Hidrogelurile au fost gonflate în soluții de AgNO3 (precursor de nanoparticule de Ag) de concentrații diferite (1-3%), după care au fost introduse într-o soluție de citrat de sodiu 1%, pentru reducerea ionilor de Ag+ la Ag0. În urma investigațiilor prin microscopie electronica de baleiaj (SEM), s-a dovedit că metoda folosită a condus la formarea de nanoparticule de Ag cu dimensiuni cuprinse în domeniul 3-50 µm.

A doua abordare a constat în obținerea nanoparticulelor de Ag prin reducerea chimică a AgNO3 (25 mM) în prezență de SC-citrat de sodiu (5 mM) și acid tanic (TA) 0,1 mM, la temperatura camerei. Nanoprticulele de Ag obținute au fost caracterizate prin UV-Vis pentru care s-a observat un pic cu maximul situat la λmax = 400 nm.

Figura 12. Spectrele UV-Vis pentru hidrogelurile G3 și G4 înainte și după introducerea în soluția

de nanoparticule de Ag

Din figura 12 se observă așa cum era de așteptat că absorbția nanoparticulelor de Ag este influențată de doza de radiație la care au fost obținute hidrogelurile. După introducerea hidrogelurilor G3 în soluția coloidală de AgN, picul maxim de absorbție s-a deplasat ușor, fiind identificat la λmax = 407 nm. Pentru hidrogelurile G4, picul maxim de absorbție s-a deplasat spre lungimi de undă mai mari λmax = 455 nm. După terminarea reacției, pentru aceste geluri s-a observat apariția unui precipitat fin care a fost îndepărtat prin filtrare, după care s-a înregistrat spectrul UV-Vis al soluției filtrate. Eficiența de absorbție al nanoparticulelor de Ag a fost determinată în funcție de absorbanța maximă a soluției de nanoparticule reziduale după gonflarea până la echilibru a hidrogelului. Procentul final al absorbției de AgN în hidrogelurile investigate a fost exprimat folosind următoarea formulă de calcul:

EA, % (AgN) = (Amartor-Aprobă)*Aprobă (15)

Unde, Amartor este absorbanța maximă determinată pentru soluția de nanoparticule fără hidrogel, Aprobă este absorbanța maximă măsurată pentru soluția reziduală de AgN după gonflarea hidrogelului. Înainte de determinarea absorbanței maxime, pentru hidrogelul G3 soluțiile de AgN au fost diluate în raport de 1:4.

Deoarece după gonflarea hidrogelurilor G4 în soluția de AgN s-a observat formarea unui precipitat fin, iar absorbția maximă fiind identificată la 455 nm, nu s-a putut determina cu precizie eficiența de absorbție a AgN. Pentru hidrogelurile G3, eficiența de absorbție a nanoparticulelor de Ag este cuprinsă între 43-86%. Datele de literatură semnalează că deplasarea benzilor de absorbție spre lungimi de undă mai mari, este asociată cu formarea de nanoparticule de Ag cu dimensiuni cuprinse între 100-200 nm, în timp ce pentru soluțiile coloidale de AgN, cu dimensiuni ale nanoparticulelor cuprinse între 20-30 nm, absorbția maximă este în domeniul 400-406 nm [19].

Tabelul 9. Eficiența maximă de absorbție a soluțiilor coloidale de AgN în hidrogelul G3

Figura 13.Imagini cu soluția de AgN și aspectul hidrogelurilor după gonflarea în soluția cu nanoparticule

Concluzii

În această etapă de proiect s-au preparat 4 compoziții diferite de hidrogeluri obținute prin reticulare cu fasciule de electroni accelerați (e-beam).

Hidrogelurile G1 și G2 preparate fară adaugare de agent de reticulare au prezentat o fracție de gel mai mică de 90% la dozele de iradiere cuprinse în intervalul 15-20 kGy.

Hidrogelurile G3 și G4 preparate și cu agent de reticulare au prezentat un procent ridicat de fractie de gel (peste 90%) chiar și la doză mai mică de radiație (5 kGy – G4).

Capacitatea de gonflare a scăzut cu doza de radiație, hidrogelurile atingând echilibrul după 8 ore de imersie în soluții tampon cu pH diferit. Pentru hidrogelurile G3 și G4 s-a observat că cea mai bună capacitate de gonflare este obținută la doza de 15 kGy.

Hidrogelurile cu compozitia G3 și G4 au prezentat cea mai bună stabilitate atât în condiții de pH=5-9 și temperatură diferite (37-41oC), după 48 h de menținere în aceste condiții, forma hidrogelurilor nu a fost afectată.

Parametrii de rețea (masa moleculară – Mc, densitatea de reticulare (Ve) și mesh size (ξ) au indicat formarea unei structurii polimerice reticulate cu o dimensiune a ochiului rețelei între 5.8 – 72.2 nm.

Hidrogelurile G4 și G4 au arătat că pot menține umiditatea mai mult de 6 h. Considerand că acest timp reprezintă frecvența normală de schimbare a unui pansament, astfel se asigură un mediu propice pentru vindecarea rănilor.

Permeabilitatea vaporilor de apă la un pansament ideal pentru vindecarea rănilor ar trebui să împiedice atât deshidratarea excesivă cât și acumularea exsudatului. Hidrogelurile au prezentat o permeabilitate a vaporilor de apă între 167-273 g /m2 la 24 h.

Hidrogelurile G3 și G4 au fost testate pentru determinarea capacității de încărcare pentru ibuprofen și nanoparticule de Ag. În ceea ce privește (CI%) pentru IBU, valorile sunt cuprinse între 75-89 % în funcție de doza de radiație la care au fost preparate, asigurând posibilitatea încorporării unei doze terapeutice minime de 200 mg de medicament.

IBU din rețeaua macromoleculară a hidrogelurilor a fost eliberat în proporție de 50-60% în primele 120 min, ajungând la un maxim după 6h, demonstrând capabilitatea de eliberare controlată.

Hidrogelul G3 a arătat o eficiență de absorbție a soluțiilor coloidale de AgN cuprinsă între 43-86%.

Dozele de iradiere optime la care se obțin hidrogelurile cu cele mai bune proprietăți sunt cuprinse între 15- 20 kGy.

Bibiliografie

[1] <sol gel formula 1991.pdf>.

[2] J. Olejniczak, J. Rosiak, A. Charlesby, Gel Dose Curves for Polymers Undergoing Simultaneous Cross-Linking and Scission, Radiation Physics and Chemistry 37(3) (1991) 499-504.

[3] W. Mozalewska, R. Czechowska-Biskup, A.K. Olejnik, R.A. Wach, P. Ulański, J.M. Rosiak, Chitosan-containing hydrogel wound dressings prepared by radiation technique, Radiation Physics and Chemistry 134 (2017) 1-7.

[4] R.A. Wach, H. Mitomo, N. Nagasawa, F. Yoshii, Radiation crosslinking of methylcellulose and hydroxyethylcellulose in concentrated aqueous solutions, Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section B: Beam Interactions with Materials and Atoms 211(4) (2003) 533-544.

[5] I.A.E. AGENCY, Radiation Synthesis and Modification of Polymers for Biomedical Applications, INTERNATIONAL ATOMIC ENERGY AGENCY, Vienna, 2002.

[6] Y. Huang, M. Zeng, J. Ren, J. Wang, L. Fan, Q. Xu, Preparation and swelling properties of graphene oxide/poly(acrylic acid-co-acrylamide) super-absorbent hydrogel nanocomposites, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 401 (2012) 97-106.

[7] P.L. Ritger, N.A. Peppas, A simple equation for description of solute release I. Fickian and non-fickian release from non-swellable devices in the form of slabs, spheres, cylinders or discs, Journal of Controlled Release 5(1) (1987) 23-36.

[8] P. Colombo, R. Bettini, P. Santi, N.A. Peppas, Swellable matrices for controlled drug delivery: gel-layer behaviour, mechanisms and optimal performance, Pharmaceutical Science & Technology Today 3(6) (2000) 198-204.

[9] E. Karadağ, D. Saraydın, O. Güven, Influence of some crosslinkers on the swelling of acrylamide-crotonic acid hydrogels, 1997.

[10] J. Rosiak, J. Olejniczak, A. Charlesby, Determination of the radiation yield of hydrogels crosslinking, International Journal of Radiation Applications and Instrumentation. Part C. Radiation Physics and Chemistry 32(5) (1988) 691-694.

[11] Z.Y. Ding, J.J. Aklonis, R. Salovey, Model filled polymers. VI. Determination of the crosslink density of polymeric beads by swelling, Journal of Polymer Science Part B: Polymer Physics 29(8) (1991) 1035-1038.

[12] T. Canal, N.A. Peppas, Correlation between mesh size and equilibrium degree of swelling of polymeric networks, Journal of Biomedical Materials Research 23(10) (1989) 1183-1193.

[13] F.-L. Mi, S.-S. Shyu, Y.-B. Wu, S.-T. Lee, J.-Y. Shyong, R.-N. Huang, Fabrication and characterization of a sponge-like asymmetric chitosan membrane as a wound dressing, Biomaterials 22(2) (2001) 165-173.

[14] Y. Hu, V. Topolkaraev, A. Hiltner, E. Baer, Measurement of water vapor transmission rate in highly permeable films, Journal of Applied Polymer Science 81(7) (2001) 1624-1633.

[15] A.B. Vino, P. Ramasamy, V. Shanmugam, A. Shanmugam, Extraction, characterization and in vitro antioxidative potential of chitosan and sulfated chitosan from Cuttlebone of Sepia aculeata Orbigny, 1848, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2(1, Supplement) (2012) S334-S341.

[16] M. Barsbay, A. Güner, Miscibility of dextran and poly(ethylene glycol) in solid state: Effect of the solvent choice, Carbohydrate Polymers 69(2) (2007) 214-223.

[17] M. Maswal, O.A. Chat, A.A. Dar, Rheological characterization of multi-component hydrogel based on carboxymethyl cellulose: insight into its encapsulation capacity and release kinetics towards ibuprofen, Colloid and Polymer Science 293(6) (2015) 1723-1735.

[18] L.L. Mazaleuskaya, K.N. Theken, L. Gong, C.F. Thorn, G.A. FitzGerald, R.B. Altman, T.E. Klein, PharmGKB summary: ibuprofen pathways, Pharmacogenet Genom 25(2) (2015) 96-106.

[19] N.G. Bastus, F. Merkoci, J. Piella, V. Puntes, Synthesis of Highly Monodisperse Citrate-Stabilized Silver Nanoparticles of up to 200 nm: Kinetic Control and Catalytic Properties, Chem Mater 26(9) (2014) 2836-2846.

Activitatea: Act 1.17 – Diseminarea rezultatelor obținute în proiect (publicare articol, crearea paginii web) Indicatori de realizare:minim 1 articol ISI acceptat spre publicare, 2 participari la conferinte

Rezultatele obținute în cadrul aceste etape a proiectului a fost diseminate prin participarea la

conferință cu o lucrare poster:

I. Călina, M. Demeter, C. Vancea, E. Manailă, G. Crăciun, E-Beam Radiation Cross-linking of Chitosan-PEG-Poly(Vinyl-Pyrrolidone) Hydrogels for Skin Healing,The 15th National Conference of Biophysics, 7-10 September 2018, Bucharest, Romania.