FACTORII DE SUSCEPTIBILITATE IN SINDROMUL METABOLIC OBEZITATE DIABET ZAHARAT HIPERTENSIUNE ARTERIALA Conducător științific, Prof. Dr. Tatiana… [301551]

[anonimizat]. dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2016

[anonimizat]. Dr. [anonimizat]: [anonimizat]

2016

CUPRINS

INTRODUCERE……………………………………………………………………………………………………..1

[anonimizat]………………………………………………………………………………………

Cap. I. Considerații generale în Sindromul Metabolic………………………………………………………………………………………………………..

1.1. Noțiunii generale în Sindromul Metabolic (criterile de la Berlin) …………………………………………….

1.2. Istoric…………………………………………………………………………………………………

1.3.Incidența Sindromului Metabolic pe plan mondial și în România……………………

Cap. II. Diagnostic clinic și investigații de laborator:Obezitatea, [anonimizat].

Diagnostic clinic([anonimizat], sex, vârstă, [anonimizat])……..

2.1.1.Obezitatea

2.1.1.1 Principalele forme de obezitate

2.1.1.2 Complicațiile obezității

2.1.2.Diabetul zaharat

2.1.2.1 Principalele forme de diabet zaharat

2.1.2.2 Complicațiile diabetului zaharat

2.1.3. Hipertensiunea arterială

2.1.3.1 Principalele forme de hipertensiune arterială

2.1.3.2 Complicațiile hipertensiunii arteriale

Diagnstic de laborator (biochimie, hematologie)/variații normale și variații patologice

2.2.1 Obezitatea

2.2.2 Diabetul zaharat

2.2.3 Hipertensiunea arterială.

Cap. III. [anonimizat], [anonimizat].

Mecanisme moleculare implicate în metabolsimul Sindromului Metabolic……………. . …………….

3.1.1 Metabolismul glucidic (glucoză, insulină-țesut hepatic).

3.1.2 [anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat].

Alimentație,

Stres,

Fumat,

[anonimizat].

[anonimizat], [anonimizat]..

Tehnici de genetică clasice și moderne utilizate în studiul genelor de risc……………………….. …..

Gena INS(gena pentru insulină)……………………………… …………………………………..

3.3.2.1 Structură

3.3.2.2 Rolul genei INS

3.3.2.3 Mecanismul molecular al genei INS

3.3.2.4 [anonimizat], Diabetul zaharat de tip2 și Diabetul zaharat de tip1,…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

3.3.3 Gena IGF2([anonimizat] 2) ……………..

3.3.3.1 Structură

3.3.3.2 Rolul genei IGF2

3.3.3.3 Mecanismul molecular al genei IGF2

3.3.3.4 Determinismul genetic al genei IGF2 în relație cu Sindromul Metabolic, Obezitatea, Diabetul zaharat de tip2 și Diabetul zaharat de tip1,…………………………………………………………………………………………………………………..

Cap.IV. Managemetul în Sindromul metabolic, Obezitate, Diabet zaharat, Hipertensiune arterială.(tratament, diete, prevenție)…………………………………………………………………………………………..

PARTEA EXPERIMENTALĂ-Studiul relevanței unor biomarkeri genetici de risc în Sindromul Metabolic……………………………………………………………………………………

Introducere …………………………………………………………………

Studiul I-Diagnosticul clinic și investigațiile de laborator ……………………………..

Materiale și Metode…………………

1.Criteriile Federației Internaționale de Diabet (IDF)-Berlin 2005…………………..

2. Evaluarea clinică a subiecților incluși în studiul 1…………

3. Investigațiile de laborator a subiecților incluși în studiul 1………

3.1. Investigații de laborator biochimice……………

3.2. Investigații de laborator hematologice………………..

4.Prelucrarea datelor statistice-Metoda ANOVA One Way …………………

Rezultate și Discuții …………………………………

1.Abordarea clasică a Sindromului Metabolic de confirmare clinică a cazurilor suspecte……………………………………………….

2.Abordarea matematică ANOVA One Way a datelor clinice și a investigațiilor de laborator a cazurilor suspecte ………

Concluzii…………………………………………………………………………………

Studiul II-Genetică…………..…………………………………………………………

Introducere……………………………………………………………………………..

Materiale și Metode………………………………………………………………….

Materiale……………………………………………………………………………….

Metode…………………………………………………………………………………

Extracția ADN genomic…………………………………………………………….

1.1 Izolare din sânge……………………………………………………………..

2. Tehnica RFLP-PCR pentru studiul polimorfismelor genelor INS și IGF2…….

2.1 Reacția PCR

2.2 Digestia enzimatică

2.3Electroforeza în gel de agaroză a ampliconilor(T.Vassu).

3.Prelucrarea datelor statistice

3.1.Echilibrul Hardy-Weinberg

3. 2.Calcularea și interpretarea Odds-ratio(calcularea riscului de boală conferit de genotipuri)………………………………………………………………………………

3.3 VMD, …………………………

3.4 softul PyElph,……………………………………………………………………….

3.5 Jalview………………………

Rezultate și Discuții ………………………

Concluzii………………………………………………………………………………

Studiul III-Programare………

Introducere………………………………………………………………………………

Materiale și Metode………….

Materiale……………………………………………………………………………

Metode…………………………………………………………………………………

ANN-Retele neuronale artificial aplicand MATLAB R2009b ……

Programul MDR……………………………………………………..

Rezultate și Discuții ………………………………

Concluzii…………………………………………………………………………………

CONCLUZII FINALE

Bibliografie

Mulțumiri

Doresc să exprim mulțumiri celor care mi-au acordat o îndrumare calificată și un sprijin real în realizarea acestui studiu: Doamnei Prof. Univ. Dr.Tatiana Vassu-Dimov coordonatorul științific al tezei de doctorat,și domnului îndrumător Conf. Dr.Dănuț Gheorghe Cimponeriu de la Departamentul de Genetică a Facultății de Biologie, Universitatea din București pentru folosirea bazei materiale a Laboratorului de Genetică umană pentru lucrarea testelor genetice; Domnului Doctor.Crăciun. Anne Marie care mi-a permis să utilizez probele biologice de la Institutul de Diabet Nutriție și Boli Metabolice N Paulescu, București și ; Domnului Doctor Popescu – Guinea Gelu-șeful Compartimentul Diabet zaharat, nutriție și boli metabolice, a secției de Boli interne a Spitalului Județean de Urgență Giurgiu care mi-a indicat criteriile clinice pentru selectarea pacienților cu sindrom metabolic, obezitate și diabet zaharat, ale căror probe biologice au fost investigate în Laboratorul clinic-Bacteriologie a Spitalului Județean de Urgență Giurgiu sub îndrumarea doamnei Doctor Matefi Felicia –șeful acestui laborator și domnului Doctor Mihai Petre – Managerul Spitalului Județean de Urgență, Giurgiu care mi-a aprobat efectuarea stagiului de voluntariat(Contract de voluntariat Nr.2./20.01.2014) care mi-a permis adunarea materialului biologic cuprins în acest studiu.

INTRODUCERE

PARTEA TEORETICĂ-Noțiunii fundamentale în Sindromul Metabolic

Cap. I. Considerații generale în Sindromul Metabolic

Noțiuni generale în Sindromul Metabolic

Odată cu dezvoltarea rapidă a economiei mondiale și cu eforturile crescute pentru dobândirea unei calități a vieții superioare, sănătatea umană a devenit principalul subiect de interes.(Hui Chen, et al, 2014).

Sindromul metabolic reprezintă o problemă globală de sănătate complexă, frecventă, în plină evoluție, datorită ariei de răspândire și a incidenței crescute,fiind o asociere de factori de risc cardiovasculari, care au la bază insulinorezistența și care însoțesc depunerea și funcționarea țesuturilor adipoase anormale.

Gruparea factorilor de risc în ceea ce a devenit “sindromul metabolic” (SM) a venit în primul rând din domeniul diabetului. În 1988 de Reaven a introdus conceptul de Sindrom metabolic la Conferința “Banting” din cadrul Reuniunii Anuale a ADA – “Rolul insulino-rezistenței în boala umană”. Reaven a descris insulio-rezistența ca fiind factorul de risc fundamental și dominant ce duce la un metabolism perturbat progresiv. (ACPM, 2009).

Sindromul metabolic este cunoscut sub mai multe denumiri:Sindromul X, Sindromul dismetabolic, Sindromul de insulinorezistență, Sindromul de obezitate sau Sindromul Reaven.

Prima care a publicat o definiție a Sindromului Metabolic, acceptată pe plan internațional a fost Organizația Mondială a Sănătății (OMS) în anul 1998. (Albert K.G., et al., 10 aprilie 2013).

Primele criterii ale Sindromului metabolic folosite pe scară largă au fost elaborate de OMS în 1998, cu accent pe factorii de risc pentru diabetul zaharat de tip 2.( Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren 2014).

Astfel au fost elaborate o serie de crterii de diagnostic:

National Cholesterol Educational Program a propus următoarele criterii de diagnostic:circumferința abdominală trebuie să fie mai mare de 102cm la bărbați și de 88cm la femei, tensiunea arterială trebuie să fie mai mare de 130/85mmHg, glicemia a jeun mai mare de 110mg/dl, trigliceridele mai mari de 150mg/dl, HDL mai mic de 40mg/dl la bărbați și mai mic de 50mg/dl la femei. Prezența a trei dintre cei cinci factori confirmă prezența Sindromului Metabolic.

OMS a propus prezența a patru dintre cei șase factori pentru confirmarea diagnosticului de Sindrom Metabolic.Aceștia sunt:IMC trebuie să fie peste 30, sau raportul talie/șold trebuie să fie mai mare de 0,90la bărbați și de 0,85 la femei, tensiunea arterială mai mare de 140/90,trigliceridele trebuie să fie mai mari de 150mg/dl, HDL-Colesterol trebuie să fie mai mic de 35mg/dl la bărbați și de 39mg/dl la femei, microalbuminuria mai mare de 20microg/dl.

American Heart Association propune pentru confirmarea diagnosticului de sindrom metabolic prezența a cel puțin 3 dintre următorii 5 factori:circumferința abdominală mai mare de 102cm la bărbați și 88cm la femei, trigliceridele care trebuie să fie mai mari de 150mg/dl, glicemia trebuie să fie mai mare de 100mg/dl, tensiunea arterială trebuie să fie mai mare de 130/85mmHg și HDL trebuie să fie mai mic de 40mg/dl l la bărbați și de 50mg/dl la femei.(Restian Adrian,2013). (Tabel.nr1.).

Tabel nr.1.Criteriile de diagnostic a sindromului metabolic(Restian Adrian,2013).

Federația Internațională de Diabet în anul 2005 la Berlin a propus definiția Sindromului Metabolic actualmente acceptată, și care include cel puțin trei dintre următoarele cinci criterii de diagnostic:

Circumferința abdominală > 94 cm la bărbați, > 80 cm la femei; criteriu obligatoriu;

Glicemie á jeun ≥ 100 mg/dl sau diabet zaharat diagnosticat în antecedente;

Trigliceride ≥ 150mg/dl sau valori normale, în context de tratament hipolipemiant;

HDL-Colesterol <50mg/dl la femei; <40mg/dl la bărbați sau tratament;

Tensiunea arterială sistolică ≥130mm Hg sau tensiunea arterială diastolică ≥85mm Hg sau tratament hipotensor.(Dumitrache C., 2008).

Istoric.

De-a lungul anilor noțiunea de sindrom metabolic a evoluat, astfel termenul ''sindrom metabolic''datează cel puțin de la sfârșitul anilor 1950,dar a intrat în uzul comun la sfârșitul anilor 1970,pentru a descrie diferitele asociații de factori de risc cu diabetul care fuseseră observate încă din anii 1920.

În 1947, medicul din Marsilia Jean Vague a observat că obezitatea părții superioare a corpului părea să predispună la diabet, ateroscleroză, gută și calculi.

Avogadro,Crepaldi și colaboratorii lor au descris șase pacienți cu obezitate modernă, cu diabet,hipercolesterolemie și hipertrigliceridemie marcată;toate acestea s-au îmbunătățit atunci când pacienții au trecut la o dietă hipocalorică,săracă în carbohidrați.

În 1977, Haller a folosit termenul ''sindrom metabolic''pentru asocierile dintre obezitate,diabet zaharat,hiperlipoproteinemie,,hiperuricemie și steatoză hepatică, atunci când au descris efectele aditive ale factorilor de risc asupra aterosclerozei.

În același an Singer a folosit acest termen pentru asocierile dintre obezitate,gută,diabet zaharat și hipertensiune cu hiperlipoproteinemia.

În 1977 și1978,Gerald B.Philips a dezvoltat ideea că factorii de risc pentru infarctul miocardic concură pentru a forma''o constelație de anomalii''(adică intoleranța la glucoză, hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia, hipertensiunea) asociată nu numai cu boala cardiacă, ci și cu îmbătrânirea, obezitatea și alte stări clinice.El a sugerat că trebuie să existe un factor de legătură subiacent, a cărui identificare ar putea duce la prevenirea bolii cardiovasculare; el a emis ipoteza că acest factor era reprezentat de hormonii sexuali.

În 1988, la conferința Banting,Gerald M.Reaven a propus insulino-rezistența ca factorul subiacent și a numit constelația de anomalii”sindromul X”. Reaven nu a inclus obezitatea abdominală, despre care s-a și presupus că ar fi un factor subiacent, ca parte a acestei stări ( http://en.wikipedia.org/wiki/Metabolic_syndrome).

1.3.Incidența Sindromului Metabolic pe plan mondial și în România.

Incidența pacienților cu sindrom metabolic în ultima perioadă a crescut alarmant.Cei mai importanți factori implicați în apariția acestor perturbări metabolice sunt:stresul, sedentarismul, alimentația bogată în carbohidrați și lipide polisaturate. Sindromul metabolic este o problemă importantă de sănătate publică, implicând depistare precoce, din cauza prevalenței crescute și a asocierii cu risc crescut de diabet zahar de tip 2 și boli cardiovasculare. Prevalența sindromului metabolic este dificil de estimat, varind în funcție de vârstă, sex, etnie și regiune geografică.În S.U.A conform studiului NHA NES, prevalența sindromului metabolic este de 23-24% și crește cu vârsta, ajungând la aproximativ 50% la persoanele peste 50 ani.Procentul persoanelor obeze sau supraponderale, crește odată cu înaintarea în vârstă, datorită reducerii masei musculare și capacității secretorii a celulor beta-pancreatice, sursa de insulină endogenă.La pacienții cu diabet zaharat de tip 2, prevalența crește cu 7%.(http://www.farmaciata.ro/afectiuni-cardiovasculare/item/831-sindromul-metabolic-risc-crescut-pentru-bolile-coronariene ).

Astăzi în lume există peste 1miliard supraponderali și peste 300 milioane obezi.(Poiană Cătălina, 2007).

Potrivit statisticilor Institutului de Endocrinologie ˝C.I.Parhon˝-România cu peste 4 milioane de adulți obezi și 50% din populațiie peste greutatea normală, a urcat pe locul trei al supraponderalilor din Europa(după Grecia și Iugoslavia).Această statistică mai arată că 30% din românce sunt supraponderale, și 20% din bărbați, în timp ce obezitatea infantilă indică un procent de 40%. La baza acestei situații îngrijorătoare se află faptul că populația nu are o cultură a sportului și care răspunde unui avalanșe de fast-food-uri de o calitate îndoielnică.Obezitatea contribuie la reducerea cu până la nouă ani a speranței la viață și poate duce la apariția unor boli foarte grave, precum diabetul de tip 2, artrita, maladiile cardiovasculare și unele tipuri de cancer.(Toma Laura,2010).

Dacă în anul 1980, 13% dintre bărbați și 17% dintre femei erau obezi, astăzi 28% dintre bărbați și 34% dintre femei sunt obezi. La copii se observă aceeași tendință: rata obezității a crescut de la 6% la 15% în rândul copiilor cu vârstă între 6 și 11 ani, și de la 5% la 16% în rândul celor cu vârstă între 12 și 19 ani, în aceeași perioadă de 20 de ani, între 1980 și 2000.(Ogden CL, Flegal KM,Johnson CL., 2002).

Între NHANES III(1988-1994) și NHANES 1990-2000, prevalența supraponderalității a crescut de la 56% la 65% din populație, iar prevalența obezității a crescut de la 23% la 31%.(Flegal KM, Carroll MD, Ogden CL, Johnson CL., 2002).

Datele NHANES din 1999-2004 arată că peste jumătate din persoanele cu hipertensiune sunt obese.(Ford ES,Zhao G,Li C,Pearson WS, Mokdad AH.2008).

Creșterea obezității abdominale- grăsimea acumulată pe trunchi față de partea inferioară a corpului este strâns asociată cu sindrom metabolic.Datele NHANES arată că circumferința medie a taliei a crescut constant atît la bărbați cît și la femei în ultimiii 40 de ani, dar în mod special în ultimii 10ani.(Okosun IS, Chandra KM,Boev A,Boltri JM,Choi ST,Parish DC,Dever GE,2004).

Într-un studio realizat pe 154000 bărbați și 90000femei din studiul NIH-AARP privind dieta și sănătatea au arătat că, după ajustarea în funcție de IMC și alte covariabile, circumferința mare a taliei luată singură era asociată cu o mortalitate mai mare cu 25%. Chiar și cu un IMC normal, o circumferință mare a taliei era semnul unei creșterii cu 20% a riscului de mortalitate.(Koster A,Leitzman MF,Schatzkin A,2008).

Datele NHANES arată că adulții cu sindrom metabolic au o calitate a vieții în ce privește sănătatea mai slabă decît cei ce nu suferă de acest sindrom.(Ford ES, Li C, 2008).

Sindrom metabolic este asociat cu o creștere de aproape două ori a riscului de evenimente cardiovasculare, independent de prezența diabetului zaharat.(Zarich SW. 2006).

Dublarea riscului a fost confirmată într-o meta-analiză a 9 studii primare publicate între 2002 și 2004, care a fost prezentată la reuniunea anuală a ADA în 2005. Aceasta a inclus peste 50000 pacienți cu o urmărire în medie pe 5ani.(Blonde L, Ray S, Carson W, L'italien GJ.2005 ).

Studiile longitudinale au confirmat că ateroscleroza se dezvoltă mai devreme și cu o viteză mai mare la persoanele cu sindrom metabolic decît la cei care nu au acest sindrom.(Bonora E,2006).

Riscul crescut de BCV care rezultă din sindrom metabolic precedă în general diagnosticul diabetului cu 10-20 de ani.(Hu FB, Stampfer MJ, Haffner SM, Solomon CG, Willett WC, Manson JE.2002).

Sindromul metabolic este un puternic factor de risc pentru diabet zaharat de tip 2, mai puternic decît BCV(Abuissa H, Bel DS, O'keefe JH Jr.2005).

O meta-analiză a 16 grupuri a arătat că prezența sindromului metabolic crește de aproximativ 5ori riscul de a dezvolta diabet zaharat.(Ford ES, Li C, Sattar N,2008).

Cu cît este mai mare numărul componentelor Sindromului Metabolic prezente, cu atît crește riscul de a dezvolta diabet de tip2, în comparație cu subiecții fără sindrom metabolic.

În 2006,Butler et al.au încercat să evalueze impactul sindromului metabolic asupra rezultatelor cardiovasculare la 3031 de indivizi cu vârstă cuprinsă între 70 și 79 de ani și au constatat că sindromul metabolic era asociat independent nu numai cu evenimentele coronariene(EC), infarctul miocardic(IM), insuficiența cardiac(IC) și cu spitalizările din toate cauzele, însă și cu mortalitatea cardiovasculară și coronariană.În același an, Ingelsson et al. au studiat 2314 bărbați de vârstă medie fără insuficiență cardiac(IC) sau boală cardiac coronariană de fond. Aceștia au constatat că sindromul metabolic era un factor predictiv semnificativ al IC și era independent de factorii de risc consacrați pentru IC, inclusiv un infarct miocardic intermediar. Un studiu longitudinal recent a arătat că persoanele cu sindrom metaboli au un risc cu 127%,64%,48% și 39% mai mare de:diabet, boală cardiacă ischemică, boală cardiovasculară și respectiv, AVC, decât subiecții de control normali.Toate aceste date implică faptul că indivizii cu sindrom metabolic au un risc crescut de morbiditate și mortalitate din cauza unei varietăți de boli.( Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren, 2014).

În ultimile trei decenii numărul persoanelor care suferă de diabet s-a dublat.În anul 2011 existau 347milioane de diabetici la nivel mondial, față de 171 milioane câți erau în anul 2000.În anul 2006 în România erau înregistrați 400.000 de persoane cu diabet, în timp ce în anul 2012 numărul lor s-a dublat.Potrivit unor studii recente, 1,7milioane de români au diabet, iar alte trei milioane de persoane suferă de prediabet, urmând ca în următorii zece ani dacă nu iau măsuri pentru a-și proteja sănătatea să dezvolte această boală.

În România, hipertensiunea arterială este întâlnită la aproximativ 40% dintre cetățeni, țara noastră aflându-se pe locul 4 în Europa în ceea ce privește mortalitatea generată de bolile de inimă.

La pacienții cu Sindromul metabolic riscul de a dezvolta diabet zaharat de tip 2, este de 3-5 ori mai mare decât la populația sănătoasă.În studiul Offspring Framingham (FOS) ,derulat pe o perioadă de 8ani, la care au participat femei și bărbați de vârstă medie, riscul atribuit populației de a dezvolta diabet zahart de tip 2 a fost de 62% la bărbați și de 47% la femei.( Jameson Larry J., Drugău Cristina,2014).

Cap. II. Diagnostic Obezitatea, diabet zaharat, hipertensiune arterială.

Diagnostic clinic(istoric familial, debutul bolii, sex, vârstă, tensiune arterială, IMC)

2.1.1.Obezitatea

2.1.1.1 Principalele forme de obezitate

2.1.1.2 Complicațiil obezității

2.1.2.Diabet zaharat

2.1.2.1 Principalele forme de diabet zaharat

2.1.2.2 Complicațiile diabetului zaharat

2.1.3. Hipertensiune arterială

2.1.3.1 Principalele forme de hipertensiune arterială

2.1.3.2 Complicațiile hipertensiune arterială

Diagnstic laborator (biochimie, hematologie)/variații normale și variații patologice

2.2.1 Obezitatea

2.2.2 Diabetul zaharat

2.2.3 Hipertensiune arterială.

Cap. III. Aspecte multifactoriale în Sindromul Metabolic, Obezitatea, diabet zaharat, hipertensiune arterială.

Mecanisme moleculare privind metabolsimele implicate în Sindromul Metabolic……………. . …………….

3.1.1 Metabolismul glucidic (glucoză, insulină-țesut hepatic).

3.1.2 Metabolismul lipidic-țesut adipos.

Factori de mediu implicați în Sindromul Metabolic, Obezitatea, diabet zaharat, hipertensiune arterială.

(alimentație, stres, fumat, alcool, stil de viață).

Factori genetici de susceptibilitate implicați în Sindromul Metabolic, Obezitatea, diabet zaharat, hipertensiune arterială.

Sindromul metabolic a devenit o provocare majoră a societății la nivel mondial, reprezentând un subiect de dezbatere, datorită ariei de răspândire și incidenței crescute.(Covic M., 2011).

Deficitul de insulină sau insulionorezistența reprezintă una dintre manifestările sindromului metabolic, obezității și diabetului zaharat de tip 1 și de tip 2. Determinismul acestor sindroame este multifactorial și include factori genetici, factori de mediu și particularități ale stilului de viață. Două dintre genele candidat sunt localizate 11p15, în loci care codifică pentru insulină și IGF2.

Pentru studiul susceptibilității genetice a diabetului zaharat de tip1 și de tip 2, o genă candidat este regiunea IDDM2(regiunea structurală pentru gena insulinei)(Tom Strachan, Andew P.Read., 1999), care este o secvență de ADN, localizată pe cromozomul 11 în regiunea 11p15.5 se întinde pe aproximativ 4,1 Kba, și reprezintă un locus eterogen ce conține următoarele gene: gena pentru insulină în întregime și secvențele ADN din vecinătate. (Rusu Gianina, și colab.,2004). În regiunea 11p15.5, au fost identificate mai multe polimorfisme genetice, reprezentate de SNP(Single Nucleotide Polimorphism) și INS-VNTR(Număr Variabil de Repetiții în Tandem) plasat în amonte de gena insulinei. Markerii genetici analizați pentru regiunea 11p15.5 sunt:INS-VNTR(polimorfismul -23Hph) situat în amonte de gena insulinei; gena INS(gena pentru insulină cu polimorfismul +1127 Pst) și gena IGF2(polimorfismul IGF2Apa) situată în aval de gena pentru insulină și gena HUMTH01-gena tirozin kinazei.(Cimponeriu Dan., 2005).(Fig.1).

Fig.1. Reprezentarea schematică a regiunii TH-INS-IGF2(IDDM2)(Cimponeriu Dan, 2005).

Regiunea IDDM2 este responsabilă în procent de 10% dintre cazurile de agregare familială.(Gavrilă L., 2009).

Susceptibilitatea pentru diabetul zaharat este cauzată de modificarea expresiei insulinei, IGF2 și tirozinhidroxilazei, deoarece majoritatea pacienților se consideră că nu au mutații în regiunile codificate de aceste gene. Acțiunea factorilor trans reglatori asupra elementelor cis reglatoare poate fi cauzată de modularea expresiei acestor gene. La modificarea riscului de apariție a diabetului zaharat contribuie polimorfismul INSVNTR(-23Hph1) care codifică pentru insulină și IGF2.(Cimponeriu Dan, 2007).

Tehnici de genetică clasicr și moderne utilizate în studiul genelor de risc

Gena INS(gena pentru insulină)

Bell și colaboratori în 1980 au secvențiat gena insulinei umane, evidențind variantele alelice în 5'UTR.( http://www.omim.org/entry/176730).

Cu ajutorul tehnicii FISH (Harper și Saunder 1981)(Cimponeriu Dan, Apostol Pompilia., 2005 ), s-a stabilit că pe cromozomul 11p15.5, se află situate locusul IDDM2, care îi corespunde unui microsatelit VNTR din regiunea 5' necodificată a genei INS pentru insulină(Covic M.,2011) și care este exprimată în celule β ale pancreasului.( Eberhard Passarge,James Lafayette German, 2007).

Structură

Gena insulinei este alcătuită din 3 exoni și 2 introni.(Cimponeriu Dan, Apostol Pompilia, 2005).

Exonul 2 codifică catena B, împreună cu peptidul semnal și o parte din peptidul C găsit ca precursorul insulinei. Exonul 3 codifică catena A și restul peptidului C. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622 ) (Fig.2).

Localizarea citogenetică a acestei gene este :11p15.5.

Gena INS este localizată molecular pe cromozomul 11: 2,159,778 la 2,161,208 perechi de baze.

Fig.2.Localizarea Genei INS.(http://ghr.nlm.nih.gov/dynamicImages/chromomap/INS.jped ).

Rolul genei INS

Gena INS are rol important în producerea hormonului insulină, care este necesar pentru controulul nivelului de glucoză în sânge.( http://ghr.nlm.nih.gov/gene/INS).

Glucoza este un monozaharid și sursă de energie metabolică pentru cele mai multe celule din organism.(Cristea-Popa Elena, Popescu Aurora, Truția E., Dinu Veronica,1991).Aceasta îndeplinind și un rol de depozitare sub formă de glicogen și trigliceride în procent de 30-40%(Greabu Maria și colab., 2014).

Mecanismul molecular al genei INS

Insulina este un hormon polipeptidic, sintetizat de către celulele beta pancreatice din insulele Langerhans, cu principală acțiune hipoglicemiată.Prioritatea descoperirii insulinei aparține școlii românești de fiziologie, profesorului Nicolae Paulescu care a publicat în 1921 izolarea insulinei cu zece luni înainte de publicația canadiană a lui Frederick Banting și a lui Charles Best, pentru care aceștia au luat premiul Nobel. Pentru prima dată la om a fost utilizată pe 11 ianuarie 1922. În anul 1955 Sanger a elucidat structura chimică a insulinei, iar sinteza totală a fost obținută în 1966 de către Katsoyanis(Broo Khaven). Insulina este formată din două lanțuri polipeptidice, lanțul A cu 21 de aminoacizi, legate prin două punți disulfidice, situate între aminoacizii din pozițiile 7A-7B și 20A-19B lanțul A având și o punte disulfidică proprie între aminoacizii 6 și 11. (Dumitrache C.,2008).

Insulina se sintetizează inițial sub forma unui polipeptid precursor de 86 de aminoacizi, preproinsulină. Ulterior are loc procesarea proteolitică prin care se înlătură peptidul amino terminal cu rol de semnal, dând naștere proinsulinei.( Jameson Larry J., Drugău Cristina, 2014).

Proinsulina este un polipeptid format dintr-un singur lanț, peptidul C(un peptid intermediar) care unește lanțurile A și B. Din aparatul Golgi se eliberează atât insulină, cât și peptidul C(30 de aminoacizi), care constituie un marker al sintezei insulelor β pancreatice.(Dumitrace C., 2008).

Sinteza insulinei începe prin translocarea genei INS(gena pentru insulină), care aparține cromozomului 11.În timpul translocației, 2 introni au spliceing alternativ de producerea ARNm, care codifică o proteină formată din 140 aminoacizi. Această primă translocație este numită preproinsulină și este inactivă. Aceasta conține o singură peptidă de 24 aminoacizi, care este necesară pentru a trece proteinele în membranele celulei.Odată ce preproinsulina ajunge în reticulul endoplasmatic, sub acțiunea unei proteaze este clivată formând proinsulină ( peptidă semnal). Proinsulina conține 3 domenii:catena B amino terminal, catena A carboxi terminal și legătura peptidică parțială cunoscută ca peptidul C. La nivelul reticului endoplasmatic, proinsulina sub acțiunea unei endopeptidaze eliberează peptidul C și generează o matură și activă formă de insulină. În aparatul Golgi, insulina și peptidul C liber formează granulele secretorii, situate în citoplasma celulelor beta. Exocitoza granulelor secretorii este o țintă de intrare a glucozei în celulele beta pancreatice, și eliminarea insulinei direct în vena pancreatică, și astfel ficatul devine organul de acțiune al insulinei. Secreția insulinei a avut un larg impact în metabolism.( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622) .(Fig. 3).

Fig 3 Structura terțiară a genei care codifica insulina:Structura 3D a genei INS (3I40 pdb prelucrată VMD Newcartoon).Insulina:catena A(rosu), catena B(albastru).

Determinismul genetic al genei INS în relație cu O,Dz tip1 și 2, SM

Varianta genetică a genei pentru insulină(VNTR și SNP) joacă rol în susceptibilitatea diabetului zaharat de tip 1 și diabetului zaharat de tip 2. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622 ).

Gena INS mutantă este asociată cu boala numită Maturity-Onset-Diabetes of the Young(MODY)( http://ghr.nlm.nih.gov/gene/INS ); forma ereditară de diabet zaharat cauzată de schimbările unei singure gene(MODY 7)(Covic M., 2011).

La persoanele cu diabet zaharat permanent neonatal au fost identificate cel puțin 10 mutații în gena INS.Acestea prezintă la naștere o greutate mică și un nivel crescut de glucide în sânge(hiperglicemie) în primele 6 luni de viață. Aceste mutații ale genei INS se datorează schimbării unei singure proteine.Se crede că aceste mutații clivează lanțul de proinsulină sau construiesc lanțurile A și B formând insulină, cu rol în controlul nivelului de glucoză din sânge.( http://ghr.nlm.nih.gov/gene/INS ).

La pacienții cu diabet zaharat neonatal permanent cu determinism autozomal dominant și care prezință mutații negative KCNJ11 și ABCC8, autorii, au identificat heterozigoți pentru mutația minisens în gena INS(Stoy et al 2007 http://www.omim.org/entry/176730).

Polimorfimsul genei INS -VNTR, a fost propusă ca numere de repetiții și care pot avea un impact asupra greutății la naștere și susceptibilității diabeticilor. Un studiu asupra variantei AND a regiunii 3'UTR a genei INS a fost asociată cu riscul pentru diabet zaharat de tip 2.( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622).

Acest polimorfism este localizat la 363 pb în amonte de situsul start transcripțional al insulinei și este delimitat de secvențele CTGGG3'(la extremitate 5') și ACAG 3' (la extremitate 3').(Cimponeriu Dan, 2007 ).

Determinarea factorilor genetici care predispun pacienții obezi la disfuncții ale celulelor beta pancreatice și posibili cu diabet zaharat de tip 2, s-a realizat prin studierea SNP în regiunea genei INS la 615 copii obezi. Autorii au găsit în faza timpurie de obezitate, alele ale locusului INSVNTR care au fost asociate cu efecte diferite ale îngrășării organismului la secreția de insulină.Tinerii obezi sunt homozigoți pentru alelele de clasa I VNTR care secretă mai multă insulină, acest lucru întânlindu-se și la alte genotipuri.(Le Stunff et al. 2001 http://www.omim.org/entry/176730).

Utilizându-se SNP -23Hph 1 A/T s-a apreciat variantele de microsateliți INSVNTR ca factor de risc pentru 92 de cazuri pentru incidența diabetului zaharat de tip 2 din 883 de studii relatate de Framingham Heart Study(FHS). În analiza stratificată a sexului, genotipul TT crește riscul pentru diabet zaharat la femei dar nu la bărbați. Autorii au concluzionat că aceste date sprijină ipoteza potrivit căreia INSVNTR a fost considerat factor genetic de risc pentru diabet zaharat de tip 2, cu genotipul TT, în procent de 6,6% din cazuri în populația FHS. (Meigs et al., 2005 http://www.omim.org/entry/176730).

Polimorfimsul VNTR al promotorului genei insulinei afectează transcripția la nivelul genelor insulină și IGF2 .VNTR cu variantele ridicate respectă la naștere numărul și secvența repetițiilor. La caucazieni distribuția lungimii este bimodală cu 75% scurtă (clasaI) și 25% lungă(clasa III). Interval VNTR-urile au fost asociate la naștere cu diabetul zaharat de tip1 și diabetul zaharat de tip 2. Legătura regiunii cromozomului 11p15 și creșterea frecvenței celor 2 clase,clasa I de alele(caucazieni) sau 2 clase scurte de alele, clasa I (japonezi) au arătat un număr mai mare de pacienți cu diabet zaharat de tip 1 în populațiile studiate. Efectul genei insulinei pentru riscul diabet zaharat de tip 1 este mai puternic la pacienții care poartă genotipul HLA pentru riscul moderat sau scăzut. Alelele de clasa III au fost asociate cu hiperinsulinemia, creșterea masei corporale și diabetul zaharat de tip 2. O metaanaliză efectuată pe un lot control mic sugerează o creștere a frecvenței homozigoților pentru clasa III pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 2 comparativ cu subiecții control(risc relative 14 P<0,037).( Tiinamaija Tuomi , 2005 ).

Într-un studiu efectuat pe 320 de copii obezi s-a găsit prin scanare INSVNTR, la aceștia prevalența sindromului metabolic ajunge până la 39%.La subiecții obezi prevalența sindromului metabolic a fost înalt semnificativă la subiecții cu genotipul I/I(p=0,006); riscul de a dezvolta sindrom metabolic a fost înalt semnificativ la subiecții purtători ai genotipului I/I(odds ratio=2,5, 95% interval de confidențialitate 1.5-3.9). Subiecții obezi homozigoți pentru clasa I de alele a arătat nivel înalt de insulină și index insulinogenic, dar sensibilitatea la insulină în întreg organismul a fost scăzută. Autorii studiului au concluzionat că varianta I de promotor al insulinei, în expresia homozigoților poate predispune copii obezi de a dezvolta sindrom metabolic.(Santoro et al 2006 http://www.omim.org/entry/176730) .

Pe un lot de 2743 de persoane adulte s-a studiat halotipurile regiunii IGF2-INS-TH și încrucișarea lor cu masa greutății corporale, presiunea sângelului și nivelul trigliceridelor din plasmă.S-a constat că haplotipul 5 este protector împotriva obezității; haplotipul 6 a fost asociat cu un nivel ridicat al trigliceridelor din plasmă; haplotipul 4 este definit de alela IGF2 Apa I(G), INS de clasă III VNTR și TH019.3 care au fost asociate cu un nivel semnificativ ridicat al masei corporale și al procentului de grăsime și cu un nivel seminificativ ridicat al presiunii diastolice sanguine. Alți autori propun că inserția repetată a promotorului genei insulinei (clasaIII), a fost raportat ca rezultat în producerea scăzută a insulinei care poate predispune la sindrom metabolic, fiind o trăsătură a presiunii ridicate a sângelui, cu un nivel ridicat al masei de grăsime sau al trigliceridelor; de aceea acestea apare mai frecvent în diabetul zaharat de tip 2, sindromul ovarului polichistic și în cazurile de boli coronariene.(Rodiguez et al ., 2004 http://www.omim.org/entry/176730). (Fig.4).

Fig.4. Structura secundară INS-IGF2. Compoziția în acizi nucleici.PDB prelucrat in Jalview..

Fig.5.Reprezentarea arborelui filogenetic al celor 2 gene INS și IGF2. PDB prelucrat in Jalview.

Gena IGF2(factor de creștere insulin-like 2)

Încă din anul 1957 a fost postulată existența factorilor de creștere insulin-like-IGF ca hormon de creștere(GH), care mediază acțiunile stimulatoare ale acestuia asupra creșterii. IGF au fost denumite și somatomedine cu rol de mediator în acțiunile somatotropului.(Cristea Elena 1991).

Au fost identificate două somatomedine:SM-C(IGF1) și SM-A(IGF2). Dumitrache C., 2008).

IGF1 și IGF2 se aseamănă structural între ele și ambele se aseamănă cu insulina. .(Cristea Elena 1991).

Insulina este considerată un hormon de creștere deoarece organizarea rezervelor energetice facilitează premisa diviziunii celulare, astfel transmiterea pe calea tirozinkinazei a semnalului insulinic este caracteristică factorilor de creștere.( Greabu Maria și colab., 2014).

IGF1 cuprinde 70 resturi de aminoacizi și are caracter bazic.( Cristea Elena, 1991).

Structură

IGF2 se caracterizează prin structură polipeptidică, greutate moleculară mică(6000-8500 de daltoni), cuprinde 67 de aminoacizi și are caracter neutru.(Dumitrache C., 2008), și este formată din patru promotori situați la 5-20Kb de INS VNTR.Datorită acestei distanțe se exercită un efect de către VNTR asupra IGF2.(Cimponeriu Dan., 2007).

La oameni gena IGF2 este locaizată pe cromozomul 11p15.5 în regiunea care conține numeroase gene amprentate.( http://en.wikipedia.org/wiki/Insulin-like_growth_factor_2).

Este în mod normal o genă fixă a cărei expresie provine exclusiv dintr-o singură alelă parentală.( Jameson Larry J., Drugău Cristina, 2014).

Localizarea citogenetică a genei este : 11p15.5.

Gena IGF2 este localizată molecular pe cromozomul 11: 2,129,111 la 2,149,60 perechi de baze . ( http://ghr.nlm.nih.gov/geneIGF2 , 2008).(Fig.6).

Fig. 6 Locaizarea genei IGF2 (http://ghr.nlm.nih.gov/dynamicImages/chromomap/IGF2.jpeg ,2008).

IGF2 este sintetizată în ficat în principal, iar în plasmă circulă sub formă de complex cu o proteină transportatoare specifică, a cărei sinteză hepatică este indusă de hormonul de creștere. La nivel celular IGF2 reacționează cu receptori distincți. Receptorul de tip 1 poate lega slab IGF2 și insulină, iar receptorul de tip2 prezintă afinitate mare pentru gena IGF2.(Dumitrache C., 2008). Receptorul de tip 2 este format dintr-un singur lanț polipeptidic cu masa moleculară de 260 000 daltoni(Cristea Elena 1991).

Acest factor de creștere inhibă hormonul de creștere și insulina prin creșterea lui.( Jameson Larry J., Drugău Cristina,2014).(Fig. 7)

Fig. 7.Structira terțiară a genei IGF2.Structura 3D a genei IGF2. Insulin-like Growth Factor 2(Somatomedina A).(1IGL pdb prelucrata VMD).( Humphrey, W., Dalke, A. and Schulten, K., 1996).

Rolul genei IGF2

Rolul genei IGF2:

IGF2 este un reglator de creștere somatică, proliferare celulară și amprentare maternală(amprentarea domeniului telomeric al regiunii 11p15 care conține ASCL2, H19 și IGF2, silențiat și hipermetilat, prezent în tumorile Wilms).( http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IGF2 )

Este implicată în diferențierea celulor stem.(http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IGF2).

IGF2 influențează lactația placentară și poate juca un rol în dezvoltarea fetală.(http://www.uniprot.org/uniprot/P01344 ).

Sinteza unor componenții specifici cum sunt proteoglicanii și alți componenți ai matricei conjunctive.

Printr-un mecanism de feedback inhibă eliberarea hormonului de creștere (paralel cu stimularea eliberării de somatostatină ).( Cristea Elena 1991).

IGF2 are rol de factor de creștere și predispune la apariția diabetului zaharat.

Mecanismul molecular al genei IGF2

În timpul dezvoltării fetale IGF2 leagă puternic IGF1 și receptorii tipului A de insulină. De asemenea leagă receptorul manoză-6-fosfat care mediază degradarea IGF2 și reduce semnalul de creștere. (Leslie J. De Groot et al., 2001).

IGF2 mediază acțiunea insulinei asupra neuropeptidului Y.Acesta stimulează, secreția de insulină care favorizează expresia genei ob în țesutul adipos, determinând o creștere a leptinei care, la nivel central, inhibă secreția neuropeptidului Y.(Dumitrache C, 2008).

Determinismul genetic al genei IGF2 în relație cu O,Dz tip1 și 2, SM

În urma unor studii s-a constat că mai multe persoane au moștenit mai mult de o copie de gene de la mamă și numai o singură copie de la tată. Ambele copii sunt tipic activate. Pentru gena IGF2 aceste copii sunt moștenite pe linie paternă, având activitate o singură copie în multe părți ale organismului. Această diferență de activare a genelor la părinți este cauza fenomenului numit amprentarea genomică. ( http://ghr.nlm.nih.gov/geneIGF2 , 2008).

În urma studiilor GWAS al SNP-urilor au fost identificate un număr de variante genetice care au fost asociate cu funcția celulelor beta și rezistența la insulină. Câteva dintre aceste SNP-uri aparent cresc riscul pentru diabet zaharat de tip 2. Au fost găsiți peste 40 de loci independenți care demonstrează această asociere cu creșterea riscului de diabet zaharat de tip 2.( http://emedicine.medscape.com/article/117853-overview).

SNP-urile rs10770063 și rs3842767 au fost asociate cu concentrațiile IGF2 și deasemenea cu schimbările greutății la pacienții cu diabet zaharat de tip 2.( Narayanan RP,et al. 2013).

Variantele polimorfice de transmitere paternală a IGF2 sunt asociate cu creșterea concentrației de glucoză maternală în sarcină și poate avea un potențial risc în diabetul gestațional la mamă.Asocierea poate fi parțial mediată de schimbări ale expresiei IGF2 în placentă.(Clive J.Pertry et al, 2010).

Varianta normală a polimorfismului genei IGF2 poate fi implicată în determinarea la adulți a înălțimii, greutății și poate fi un potențial factor de risc pentru bolile de nutriție ca de exemplu anorexia nervoasă, bulimia nervoasă și bolile de nutriția.( http://ghr.nlm.nih.gov/geneIGF2 , 2008).

IGF2 este un factor de cheie de creștere a organismului uman și este amprentat în diferite regiuni metilate(DMR) astfel numai alelele paternale sunt exprimate. Amprentarea aberantă a genei IGF2 este asociată cu creșterea greutății în sindromul Beckwith-Wildemann și restricția creșterii în sindromul Silver-Russell. Hipometilarea IGF2 DMR0 care este localizată în regiunea 5'a promotorului IGF2 la oameni conduce la expresia bialelei IGF2 și este asociată cu cancerul colorectal uman, tumoarea Wilms, fiind identificate mai târziu și în dezvoltarea obezității și rezistența insulinei la indivizii din uterul matern. Studiile au examinat metilarea IGF2 DMR0 și exprimarea genei în țesut adipos și în sistemul muscular la pacienții cu obezitate și diabet zaharat de tip2.(Miaoxin Chen, 2012).

Cap.IV. Managemetul în Sindromul metabolic, Obezitatea, diabet zaharat, hipertensiune arterială.(tratament, diete, prevenție.

PARTEA EXPERIMENTALĂ-Studiul relevanței unor biomarkeri genetici de risc în Sindromul Metabolic.

Introducere

SCOPUL GENERAL al studiului este următorul:

”Corelarea aspectelor clinice, investigațiilor de laborator și a tehnicilor clasice și moderne de genetică în evaluarea Sindromului Metabolic”.

Studiul I-Diagnosticul clinic și investigațiile de laborator

SCOPUL studiului este următorul:”Corelarea aspectelor clinice și a investigațiilor de labortor biochimice și hematologice în evaluarea Sindromului Metabolic”.

OBIECTIVE:

Pentru atingerea scopului enunțat mi-am propus următoarele obiective:

1.Identificarea pacienților cu Sindrom Metabolic, Obezitate, Diabet zaharat, Hipertensiune arterială pe baza informațiilor clinice și a investigațiilor biochimice și hematologice din probele clinice provenite din mediul spitalicesc.

2.Interpretarea rezultatelor prin testul ANOVA.

Materiale și Metode

Materiale:

Acest studiu a fost efectut în perioada 11.02.2014-21.02.2015, în cadrul unei activități de voluntariat la Spitalul Județean de Urgență, Giurgiu (Contract de voluntariat Nr.2./20.01.2014 cu respectarea art.13(5) din Legea677/2001).

Au fost incluși 370 subiecții cu vârste cuprinse între 21-90 de ani,din care 185 pacienți cu sindrom metabolic (femei / bărbați = 10/10), obezitate (femei / bărbați = 25/30), DZ1 (femei / bărbați =25/25) și DZ2 (femei / bărbați=30/30) și 185 indivizi considerați sănătoși, alcătuind lotul martor.

Recoltarea probelor de sânge a fost efectuată prin puncție venoasă după post nocturn în vacutainere fără anticoagulant pentru analizele de biochimie, și în vacutainere cu anticoagulant-EDTA Na2 , pentru analizele de hematologie și hemoglobină glicozilată.

Un consimțământ informat scris a fost obținut pentru toți subiecții înainte de începerea studiului.

Metode:

1.Criteriile Federației Internaționale de Diabet(IDF)-Berlin 2005

Aceste criterii sunt:

1.Circumferința abdominală > 94 cm la bărbați, > 80 cm la femei; criteriu obligatoriu;

2.Glicemie á jeun ≥ 100 mg/dl sau diabet zaharat diagnosticat în antecedente;

3.Trigliceride ≥ 150mg/dl sau valori normale, în context de tratament hipolipemiant;

4.HDL-Colesterol <50mg/dl la femei; <40mg/dl la bărbați sau tratament;

5.Tensiunea arterială sistolică ≥130mm Hg sau tensiunea arterială diastolică ≥85mm Hg sau tratament hipotensor.(Dumitrache C., 2008).

2. Evaluarea clinică a subiecților incluși în studiul 1.

Evaluarea clinică a fost efectuată în cadrul Compartimentul Diabet zaharat, nutriție și boli metabolice, a secției de Boli interne de către medicii specialiști, care au inclus următorii parametrii:

–Sex

La persoanele de sex feminin proporția țesutului adipos este mai mare decît la persoanele de sex masculin care consumă în medie cu 10-20% mai multe calorii decît femeile.(Sheldon G. Sheps, 2000).

–Vârsta

O dată cu înaintarea în vârstă metabolismul devine mai lent atît la persoanele de sex feminin cât și cele de sex masculin.( Sheldon G. Sheps, 2000).

–Înălțime și Greutate,

Au fost măsurate înălțimea și greutatea de două ori, cu îmbrăcăminte(hainele groase au fost scoase și s-a scăzut 1,0kg corespunzând hainelor rămase), însă fără încălțâminte, cu marje de 0,1cm și respectiv, de 0,1kg.(Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren, 2014).

-IMC,

Indicele masei corporale a fost calculat conform următoarei formule:

IMC=Greutate(kg)/Înălțime2 (m2).

.(Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren ,2014).

Circumferința taliei și a șoldurilor

Circumferința taliei(CT) a fost măsurată de două ori cu subiecții stând în picioare, cu un centimetru, cu o marjă de 1cm, în plan orizontal, la jumătatea distanței dintre ultima coastă ți creasta iliacă.Circumferința șoldurilor(CS) a fost măsurată de două ori, cu o marjă de 1cm, în partea cea mai lată peste trohanteri.(Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren ,2014).

-Tensiunea arterială(HTA)

Tensiunea arterială(TA) a fost măsurată( Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren, 2014), dimineața după repaus fizic și intelectual(Voiculescu Marin,1990), de două ori la brațul drept cu o marjă de 2mm/Hg folosind un tensiometru cu mercur, cu subiecții în poziția șezînd, după ce s-au relaxat cel puțin 30de minute.Tensiunea arterială a fost măsurată la interval de 10minute și s-au calculat valorile medii. .(Hui Chen, Shenghua Xiong Xuan Ren, 2014).

-Stilul de viață:

Stilul de viață sedentar –persoanele care privesc la televizor sau lucrează la calculator mai mult de patru ore pe zi, prezintă un risc dublu de a suferi de sindrom metabolic.(Jameson Larry J., Drugă Cristina, 2014).

–Consmul excesiv de alcool,

Consumul excesiv de alcool determină o creștere a nivelului de lipide plasmatice în special a trigliceridelor. (Jameson Larry J., Drugă Cristina, 2014).

-Fumatul,

Fumatul poate determina prin anumite componente ale sale creșterea rigidității pereților arteriali și a vâscozității sângelui.(Genel Sur Caius Duncea 2003).

-Tratament.

Tratamentul este stabilit de către medicio specialiști.

3.Investigațiile de laborator a subiecților incluși în studiul 1.

Investigațiile de laborator biochimicii și hematologicii a subiecților incluși în studiul 1 au fost efectuate în cadrul Laborator clinic-Bacteriologie.

3.1. Investigațiile de laborator biochimice

Testele biochimice au fost determinate cu reactivi Giesse pe analizatorul automat de chimie clinică model BS-300 Mindray Chemistry analyzer, China, ulterior efectuându-se controalele și calibrarea pentru parametrii determinați. Metoda de lucru a fost spectrofotometrică, utilizându-se ca material de analizat serul sanguin rezultat în urma centrifugării probelor de sânge în centrifuga model ROTINA 35 HETTICH la 3000 turații, 2minute.(Tabel nr.1 și Tabel nr.2).

Tabel nr.1 Prametrii biochimici.

(www.giessediagnostics.com ).

Tabel nr.2.Parametrii biochimici-Hemoglobina glicozilată.

(Dialab,Mag Simone Sturm-E. Rev 06.2013/03).

3.2. Investigațiile de laborator hematologici

Testele hematologice au fost determinate cu reactivi SHENZHEN MINDRAY, BIO-MEDICAL ELECTRONICS CO., LTD. pe analizatorul automat de hematologie clinică model BC-3000 Plus, Mindray Auto Hematology Analyzer, China, ulterior efectuându-se controalele și calibrarea pentru acești parametri. Metoda de lucru a fost: Impedanța, sânge. Principiul aparatului este metoda impedanței electrice pentru numărătoare și metoda colorimetrică pentru hemoglobină. (www.mindray.com).(Tabel nr.3.).

Tabel nr.3.Parametrii normali ai hemoleucogramei.

3.Analiză statistică

Analiza statistică ANOVA a fost utilizată pentru a testa diferențele în cadrul diferitelor momente ale protocolului experimental, de la Quattro Pro X3 de la Corel iar pentru creearea de grafice Microsoft Office 2007.

ANOVA-analiză de varianță

În acest studiu propun compararea mai mult de două grupe de subiecți și de aceea voi apela la tehnicile ANOVA cunoscută și sub denumirea de analiză dispersională sau analiză de varianță.

Datorită designu-lui cercetării tehnicilor de cercetare mai laborioase recomandă însă utilizarea unui număr mai mare de trepte ale variabilei independente pentru a observa cu un grad mai mare de finețe efectul pe care variabila independentă îl are asupra variabilei dependente.

Erorile statistice și anume eroara setului de comparații.Orice calcul statistic presupune efectuarea unor erori ori calculând teste t ar trebui să calculăm trei astfel de teste iar utilizând ANOVA, vom obține un singur indicator F.Fiecare test t calculat induce distorsiuni care se calculează după formula următoare (Hinkle, Wiersma și Jurs, 1994)(Sava,2002) .

1-(1-α)c unde α este pragul de semnificație stabilit pentru fiecare test t efectuat (frecvent p=0,05) iar c este dat de numărul de teste t ce trebuie efectuate. (0,05/3=0,01)

Formulă

Pentru ANOVA: 1-(1-0,05)1=0,05

Pentru testul t: 1-(1-0,05)3=0,15

Condiții necesare pentru aplicarea ANOVA.

1.Eșantionul a fost selectat aleator din populație, iar dacă acest lucru nu este posibil, se recomandă ca măsură compensatorie distribuirea aleatoare a subiecților în grupele experimentale.

2.Variabila dependentă prezintă distribuție normală.Această condiție este greu de îndeplinit în cazul în care grupele experimentale sunt constituite dintr-un număr mic de subiecți.

3.Dispersia subiecților împărțiți pe grupe experimentale să fie egală.Testul Levene este special constituit pentru a observa în ce măsură este realizată această omogenitate a dispersiei.

4.Pentru ANOVA pe măsurări repetate apare o condiție suplimentară denumită condiția de sfericitate.Aceasta implică premisa unei relații similare între fiecare pereche de condiții experimentale, ea fiind o condiție mai generală a simetriei complexe. Aceasta din urmă este îndeplinită, dacă dispersia este egală în toate situațiile exeprimentale(omogenitatea dispersiei).În practică se observă că este foarte dificil de îndeplinit dublă condiție, majoritatea design-urilor ANOVA cu măsurători repetate cu mai mult de două grupe încălcând această condiție.

ANOVA unifactorială este modelul cel mai simplu dintre tehnicile ANOVA, fiind un corespondent al testului t pentru două eșantioane independente.(Marmel Elaine, 2006).

REZULTATE SI DISCUȚII

1.Abordarea clasică a sindromului metabolic de confirmare clinică a cazurilor suspecte.

Studiul a fost efectuat pe un lot de 370 subiecții: 180 de sex feminin(48,64%), 190 de sex masculin(51,35%),cu vârste cuprinse între 21-90 ani din care ,185 persoane sănătoase constituind lotul martor.

Abordarea clasică a condus la următoarea distribuție a celor 185 de pacienți:din cei 20 pacienți diagnosticați cu sindrom metabolic(5,405%), 10 pacienți sunt de sex feminin(50%) și 10pacienți sunt de sex masculin(50%), cu vârste cuprinse între 51-80ani;din cei 55 pacienți diagnosticați cu obezitate(14,86%), 25 pacienți sunt de sex feminin(45,45%) și 30 pacienți sunt de sex masculin(54,54%), cu vârste cuprinse între 31-80ani;din cei 60 pacienți diagnosticați cu diabet zaharat tip 2(16,21%), 30 pacienți sunt de sex feminin(50%) și 30 pacienți sunt de sex masculin(50%),cu vârste cuprinse între 41-90ani; din cei 50 pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip1 (13,51%), 25 pacienți sunt de sex feminin(50%) și 25 pacienți sunt de sex masculin(50%),cu vârste cuprinse între 31-90ani; și 185 subiecți considerați sănătoși constituind lotul martor(50%): 90 subiecți de sex feminin(48,64%) și 95 subiecți de sex masculin(51,35%) , cu vârste cuprinse 21-00ani.(Fig.1 și Fig.2).

Fig.1. Distribuția în funcție de vârstă a pacienților cu sindrom metabolic, obezitate, diabet zaharat de tip2 și diabet zaharat de tip 1.

Fig.2Distribuția în funcție de sex a pacienților cu sindrom metabolic, obezitate, diabet zaharat de tip2 și diabet zaharat de tip 1.

Lotul 1:20 pacienții diagnosticați cu Sindrom metabolic(5,405%), 10de sex feminin(50%) și 10 de sex masculin(50%) cu varste cuprinse între 51-80ani. Între vârste 51-60 ani sunt 3 de sex feminin (30%) și 4 de sex masculin(40%); între 61-70ani sunt 5 de sex feminin(50%) și 2 de sex masculin.(20%); și între 71-80ani sunt 2 de sex feminin(20%) și 4 de sex masculin(40%). (Fig.3 Tabelul 3 și 4).

Fig.3. Distribuția procentuală a pacienților cu sindrom metabolic în funcție de vârstă și sex.

Tabel nr 3. Pacienții diagnosticați cu SM-investigatii clinice

Tabel nr.4. Pacienți diagnosticați cu SM investigații de laborator-biochimice și hematologie

Riscul crescut (300-500mg/dl)=2 pacienții(10%), risc mediu(240-280mg/dl)=1pacient(5%), risc scăzut(90-240mg/dl)=17pacienți(85%) datorită concentrației mari de trigliceride. Riscul crescut (35-40mg/dl)=7 pacienții(35%), risc mediu(30-35mg/dl)=9 pacient(45%), risc scăzut(20-30mg/dl)=4pacienți(20%) datorită concentrației mari de HDL-colesterl. Riscul crescut (300-500mg/dl)=4 pacienții(20%), risc mediu(200-280mg/dl)=5pacient(25%), risc scăzut(110-200mg/dl)=11pacienți(55%) datorită concentrației mari de glucoză. Fig.4,5,6

Fig.4.Interpretarea matematică prin testul ANOVA a pacienților diagnosticați cu sindrom metabolic pe baza tabel nr.2(variația valorilor concetrației de trigliceride)

Fig.5Interpretarea matematică prin testul ANOVA a pacienților diagnosticați cu sindrom metabolic pe baza tabel nr.2(variația valorilor concetrației de HDL )

Fig. 6.Interpretarea matematică prin testul ANOVA a pacienților diagnosticați cu sindrom metabolic pe baza tabel nr.2 (variația valorilor concetrației de glucoză).

2. Lotul 2: 55 pacienții diagnosticați cu Obezitate(14,86%), 25de sex feminin(45,45%) și 30 de sex masculin(54,54%) cu varste cuprinse între 31-80ani. Între vârste 31-40ani sunt 1 de sex feminin(4%) și 1 de sex masculin(3,33%);între 41-50ani sunt 4 de sex feminin(16%) și 4 de sex masculin(13,33%); între 51-60 ani sunt 8 de sex feminin (32%) și 13 de sex masculin(43,33%); între 61-70ani sunt 10 de sex feminin(40%) și 9 de sex masculin(30%); și între 71-80ani sunt 2 de sex feminin(8%) și 3 de sex masculin(10%). (Fig.7 Tabelul 5).

Fig.7. Distribuția procentuală a pacienților cu obezitate în funcție de vârstă și sex.

Tabel.nr.5. Pacienții diagnosticați cu obezitate –Investigați de laborator biochimice și hematologice

Pacienți s-au prezentat pentru evaluarea riscului de obezitate.Examenele biochimice de laborator efectuate au fost următoarele:Colesterol, HDL-Colesterol, LDL-Colesterol, Trigliceride, Glucoză, Acid uric.Datorită concentrațiilor mari de colesterol, trigliceride, HDL, LDL și glucoză sugerează că pacienții sunt diagnosticați cu obezitate. Rezultă că sindromul metabolic este accentuat datorită concentrațiilor crescute de Glucoză, Trigliceride și HDL-Colesterol.

Riscul crescut (300-500mg/dl)=2 pacienții(10%), risc mediu(240-280mg/dl)=1pacientii(5%), risc scăzut(90-240mg/dl)=17pacienții(85%) datorită concentrației mari de trigliceride.(Fig.8).

Fig 8 Interpretarea matematică prin testul ANOVA a pacienților diagnosticați cu obezitate pe baza tabel nr.5 (variația valorilor concetrației de trigliceride).

3.Lotul 3: 60 pacienții diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 (16,21%), 30de sex feminin(50%) și 30 de sex masculin(50%) cu varste cuprinse între 41-90ani. Între vârste 41-50ani sunt 2 de sex feminin(6,66%) și 3 de sex masculin(10%); între51-60 ani sunt 8 de sex feminin (26,66%) și 8 de sex masculin(26,66%); între 61-70ani sunt 10 de sex feminin(33,33%) și 12 de sex masculin(40%); între 71-80ani sunt 9 de sex feminin(30%) și 6 de sex masculin(20%) și între 81-90ani sunt 1de se feminin(3,33%) și 1 de sex masculin(3,33%). (Fig.9 Tabelul nr.6).

Fig.9. Distribuția procentuală a pacienților cu diabet zaharat de tip 2 în funcție de vârstă și sex.

Tabel nr.6 .Pacienții diagnosticați cu diabet zaharat ti 2 –Investigatii de laborator biochimice si hematologice

Pacienți s-au prezentat pentru evaluarea riscului de diabet zaharat.Examenele biochimice de laborator efectuate au fost următoarele:Glucoză, Colesterol, Trigliceride, HDL-C., LDL-C., Creatinină, Uree. Datorită concentrațiilor mari de Glucoză, Colesterol, Trigliceride, HDL-C., LDL-C., Creatinină, Uree sugerează că pacienții sunt diagnosticați cu diabet zaharat. Rezultă că sindromul metabolic este accentuat datorită concentrațiilor crescute de Glucoză, Trigliceride și HDL-Colesterol.

Riscul crescut (300-500mg/dl)=29 pacienții(48%), risc mediu(200-280mg/dl)=24pacienții(40%), risc scăzut(110-200mg/dl)=7pacienții(12%) datorită concentrației mari de glucoză.(Fig10).

Fig 10 Interpretarea matematică prin testul ANOVA a pacienților diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 pe baza tabel nr.6 (variația valorilor concetrației de glucoză).

4.Lotul : 50 pacienții diagnosticați cu diabet zaharat de tip 1 (13,51%), 25de sex feminin(50%) și 25 de sex masculin(50%) cu vârste cuprinse între 31-90ani. Între vârste 31-40ani sunt 3 de sex feminin(12%) și 1 de sex masculin(4%); între 41-50ani sunt 1 de sex feminin(4%) și 4 de sex masculin(16%); între51-60 ani sunt 10 de sex feminin (40%) și 6 de sex masculin(24%); între 61-70ani sunt 5 de sex feminin(20%) și 7 de sex masculin(28%); între 71-80ani sunt 6 de sex feminin(24%) și 6 de sex masculin(24%) și între 81-90ani sunt 0de se feminin(0%) și 1 de sex masculin(4%). (Fig.11.Tabelul nr.7).

Fig.11 Distribuția procentuală a pacienților cu diabet zaharat de tip 1 în funcție de vârstă și sex.

Tabel nr 7. Pacienti diagnosticati cu dz tip 1 Investigatii de laborator biochimice si hematologice.

Riscul crescut (300-500mg/dl)=2 pacienții, risc mediu(200-280mg/dl)=8pacient, risc scăzut(110-200mg/dl)=40pacienți datorită concentrației mari de glucoză.Fig12

Fig 12 Interpretarea matematică prin testul ANOVA a pacienților diagnosticați cu diabet zaharat de tip 1 pe baza tabel nr.7 (variația valorilor concetrației de glucoză).

3.Hipertensiunea arterială:34 pacienți diagnosticați cu hipertensiune arterială:22 de sex feminin, 11 de sex masculin vârste cuprinse între 10-92 ani. Risc crescut(290-380mg/dl)=2pacienții,risc mediu(200-270mg/dl)=22 pacienții, și risc scăzut(100-180mg/dl)=10 pacienții datorită concentrației de colesterol.Risc crescut este predominant la pacienții de sex feminin.(Fig.5).

Hta n=34

Tabel nr.6. Pacienții diagnosticați cu HTA investigatii de laborator biochimice si hematologice.

Din punct de vedere biochimic pentru evaluarea hipertensiunii arteriale se iau în discuție următori parametrii:Colesterol, Trigliceride, HDL-C, LDL-C, Glucoză, Magneziu, Calciu.Din punct de vedere hematologic pentru evaluarea hipertensiunii arteriale se iau în discuție următori parametrii:WBC,RBC,HGB,HCT.Concentrațiile mari de Colesterol, LDL, HDL,Trigliceride, Glucoză, Magneziu, Calciu sugerează riscul de eveniment de hipertensiune arterială, dar și valorile anormale ale WBC, RBC, HGB, HCT, vârsta și sexul constituie criteriul de bază în evaluarea hipertensiunii arteriale. Rezultă că sindromul metabolic este accentuat datorită concentrațiilor crescute de Glucoză, Trigliceride și HDL-Colesterol.

5.Lotul 5 :185 lotul martor (50%), 90de sex feminin(48,64%) și 95 de sex masculin(51,35%) cu varste cuprinse între 21-90ani. Între vârste 21-30ani sunt 14 de sex feminin(15,55%) și 9 de sex masculin(9,47%); între 31-40ani sunt 4 de sex feminin(4,44%) și 10 de sex masculin(10,52%);41-50ani sunt 11 de sex feminin(12,22%) și 32 de sex masculin(33,68%); între51-60 ani sunt 27 de sex feminin (30%) și 19 de sex masculin(20%); între 61-70ani sunt 25 de sex feminin(27,77%) și 17 de sex masculin(17,89%); între 71-80ani sunt 8 de sex feminin(8,88%) și 6 de sex masculin(6,31%) și între 81-90ani sunt 1de se feminin(1,11%) și 2 de sex masculin(2,10%). (Fig.13 Tabelul nr.8).

Fig.13 Distribuția procentuală a lotului martor în funcție de vârstă și sex.

Control /normali n=185

Tabel nr.8. Lotul martor- investigatii de laborator biochimice si hematologice.

2.Abordarea matematicăANOVA One Way a datelor clinice și a investigațiilor de laborator.

Studiul a fost efectuat la Spitalul Județean de Urgență Giurgiu pe un lot de 370 subiecți din care 185 suspecți diagnosticați cu obezitate, diabet zaharat și hipertensiune arterială și 185 de subiecți constituind lotul martor, evaluați pe baza celor 3 criterii de diagnostic al sindromului metabolic propus de Federația Internațională de Diabet în 2005 de la Berlin. S-au luat în discuție ca investigații de laborator 3 parametrii biochimici(domenii de variație):Glucoză,Trigliceridele, HDL-Colesterol.Concentrațiile mari indică că cele 3 criterii de diagnostic pentru sindromul metabolic sunt corecte.

S-a utilizat ANOVA one way(unifactorială).

Pasul 1

Identificarea variabilelor

Analizând problema anterioară identificăm ca variabilă independentă:

A-criterii de diagnostic al Sindromul metabolic, concentrațiile celor 3 parametrii biochimicii:

a1-Glucoză

a2-Trigliceride

a3-HDL-Colesterol

și variabilă dependentă (X)-numărul subiecțiilor luați în studiu.

Pasul 2

Designul cercetării

Avem un design experimental de bază o variabilă independentă cu 3 parametrii biochimici, inter subiect deoarece la fiecare diagnostic au participat alți subiecti.

Tabel nr.9.Designul cercetări model

Tabel.nr.10.Exemplu.

Tabel nr.11 Designul experimental pentru SM- date clinice

Fig.14.Prelucrarea ANOVA pentru Sindrom metabolic pe baza designul creat de program arată valorile crescute ale hipertensiunii arteriale, IMC și vârsta înaintată ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr.12. Desingnul experimental pentru SM-parametrii biochimicii

Fig.15.Prelucrarea ANOVA pentru Sindrom metabolic pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de glucoză, trigliceride și HDL ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr.13 Designul experimental pentru SM-parametrii hematologicii

Fig.16.Prelucrarea ANOVA pentru sindrom metabolic pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de WBC, HGB și HCT ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr.14 Designul experimental pentru OB-parametrii biochimicii

Fig.17.Prelucrarea ANOVA pentru obezitate pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de glucoză, trigliceride și HDL ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr.15 Designul experimental pentru OB-parametrii hematologicii

Fig.18.Prelucrarea ANOVA pentru obezitate pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de WBC, HGB și HCT ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr.16 Designul experimental pentru Dz tip2-parametrii biochimicii

Fig.19. Prelucrarea ANOVA pentru diabet zaharat de tip 2 pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de glucoză, trigliceride și HDL ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr 17 Designul experimental pentru Dz tip2-parametrii hematologicii

Fig.20. Prelucrarea ANOVA pentru diabet zaharat tip 2 pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de WBC, HGB și HCT ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr.18 Designul experimental pentru Dz tip1-parametrii biochimicii

Fig.21. Prelucrarea ANOVA pentru diabet zaharat tip 1 pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de glucoză, trigliceride și HDL ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Table nr 19. Designul experimental pentru Dz tip1-parametrii hematologicii

Fig.22. Prelucrarea ANOVA pentru diabet zaharat tip 1 pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de WBC, HGB, HCT, risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr. Designul experimental pentru HTA-parametrii biochimicii ?

Fig..Prelucrarea ANOVA pentru hipertensiune arterială pe baza designul creat de program arată concentrațiile mari de glucoză, trigliceride și HDL ,risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

Tabel nr. Designul experimental pentru HTA-parametrii hematologicii?

Fig.. Prelucrarea ANOVA pentru hipertensiune arterială pe baza designul creat de program arată că WBC,HGB, HCT sugerează riscul pentru Sindrom metabolic.

Tabel nr 20Designul experimental pentru Lorul martor-parametrii biochimicii

Fig.23. Prelucrarea ANOVA pentru lotul martor arată valoriile normale ale parametriilor biochimici:Glucoză,Trigliceride, HDL-Colesterol.

Tabel nr 21.Designul experimental pentru lotul martor-parametrii hematologici

Fig.24. Prelucrarea ANOVA pentru lotul martor arată valoriile normale ale parametriilor hematologicii:WBC,HGB, HCT.

Tabel nr 22.Designul experimental a subiecților din studiul 1(370)-parametrii biochimicii

Fig.25.Prelucrarea ANOVA pentru subiecții luați în studiu pe baza designul creat de program arată o distribuție uniformă a glucozei, trigliceridelor și HDL.

Tabel nr 23.Designul experimental a subiecților din studiul 1(370)-parametrii hematologicii

Fig.26.Prelucrarea ANOVA pentru subiecții luați în studiu pe baza designul creat de program arată o distribuție uniformă a WBC, HGB și HCT.

Pasul 3 Ipoteza Există diferențe seminificative în ceea ce privește numărul subiecțiilor participanți la studiul sindromului metabolic în funcție de concentrațile parametrilor biochimici și hematologici urmăriți.

Pasul 4 Construcția bazei de date și alegerea metodei statistice. Pentru a construi baza de date ne punem întrebarea ˝Ce știm despre fiecare subiect?˝.În cazul meu știu concentrația parametriilor biochimici evaluați și numărul subiecțiilor luați în studiu.În consecință, în baza de date vom avea 2 variabile, parametrii biochimici cu cele 3 valorii ale concentrațiilor:Glucoză,Trigliceride, HDL-Colesterol și numărul subiecților luați în studiu. Pentru a decide cu privire la metoda de analiză statistică adoptată va trebui să verificăm forma distribuției datelor.Deoarece datele prezintă o distribuție normală la nivelul populației în consecință vom utiliza metoda interferențiale parametrice-respectiv ANOVA cu un singur factor intergrup(One Way ANOVA).Se introduc datele în programul Excel de la Quattro Pro Corel X3 2007.Se selectează datele din designul experimental.ToolsNumeric Tools-Analysis Tools – se selectează ANOVA one way se dă Next apoi se deschide și se selectează la prima căsuță datele introduse, apoi Enter, apoi în adoua căsuță se selectează un spațiu gol apoi Enter, după ce este bifată coloana se dă Finish, și apare rezultatele datelor prelucrate.Se selectează designul experimental și se selecteată Chart și apare astfel graficul la datele prelucrate. (Fig.)

Fig.27. Modul de lucru ANOVA ONE WAY

Pasul 5 Analiza statistică descriptivă relevă existența unor diferențe între mediile numărului subiecțiilor pe diagnostic care participă la studiul Sindromului metabolic în funcție de concentrația parametriilor biochimicii și hematologici urmăriți. Se analizează în continuare în e măsură aceste diferențe între medii se datorează hazardului sau sunt efectul concentrației parametrilor biochimici și hematologici investigați la subiecți care participă la studiul sindromului metabolic.

Fig. 28.Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru. Sindrom metabolic anova one way: clinic, biochimic și hemtaologic

Fig. 29.Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru Obezitate: biochimie și hematologie

Fig.30. Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru Diabet zaharat de tip 2: biochimie și hematologie

Fig.31. Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru Diabet zaharat de tip 1 : biochimie și hematologie

Fig. Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru.Hta: biochimie și hematologie

Fig.32. Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru lotul martor: biochimie și hematologie

Fig.33. Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru subiecții alcătuind lotul total de 370 –teste biochimie și hematologie

Fig. Modul de lucru ANOVA ONE WAY pentru subiecți alcătuind lotul total de 370 biochimie si hematologie (HTA). ?

Pasul 6 Interpretarea rezultatelor

S-a analizat relația dintre numărul subiecțiilor care participă la studiu 1 cu evaluarea clinică și testele biochimice și hematologice utilizate ca criterii de diagnostic de Federației Internaționale de Diabet din 2005 de la Berlin cu scopul evaluării și diagnosticării subiecților cu sindrom metabolic.Se obține pentru domeniile de variației:Vârstă. IMC, Tensiune arterială din lotul de 20 pacienți diagnosticați cu sindrom metabolic:F=0,17;P=0,99<Pcritic P=0,05;Glucoză,Trigliceride, HDL-Colesterol din lotul de 20 pacienți diagnosticați cu sindrom metabolic: F=0,91; P=0,57<P critic P=0,05; WBC,HGB, HCT din lotul de 20 pacienți diagnosticați cu sindrom metabolic: F=0,28; P=0,99; pentru lotul 55 pacienți diagnosticați cu obezitate Glucoză, Trigliceride, HDL-Colesterol: F=0,52 ; P=0,99< Pcritic P=0,05; pentru 55 pacienți diagnosticați cu obezitate WBC,HGB, HCT : F=0,08; P=1<Pcritic P=0,05; pentru 60 pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 parametrii biochimici: F=0,55; P=0,99< Pcritic P=0,05, iar pentru parametrii hematologici: F=0,07,P=1 < Pcritic P=0,05; pentru 50pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 1 pentru parametrii biochimici F=0,79; P=0,82<P critic P=0,05, iar pentru parametrii hematologici F=0,27 ;P=0,99; pentru lotul martor de 185 subiecți pentru parametrii biochimici F=0,61 P=0,99< Pcritic P=0,05 iar pentru parametrii hematologici F=0,039, P=1 <P critic P=0,05; iar pentru întreg grupul de 370 subiecți(185pacienți +185 lotul martor) pentru parametri biochimici F=1,12,P=0,090 <Pcritic P=0,05 și pentru parametri hematologici F=0,05, P=1 <P critic P=0,05, au fost obținute diferențe semnificative din punct de vedere statistic al variației.Rezultă că parametrii clinici, biochimici și hematologici luați în discuție sunt distribuiți similar în loturile investigate ceea ce ne permite să afirmăm că cele 5 loturii de pacienții sunt heterogene din punct de vedere al variației și indicând că nivelurile ridicate ale concentrației de Glucoză, Trigliceride și HDL-Coleserol, la pacienți diagnosticați cu obezitate, diabet zaharat și hipertensiune arterială, sugerând un risc crescut de a dezvolta sindromul metabolic.

În cazul lotului de 20 pacienți diagnosticați cu sindrom metabolic Glucoza, trigliceridele, HDL-Colesterol prezintă F=0,17 ;P=0,99 >prag critic P=0,05 ceea ce ne permite să afirmăm că sindromul metabolic este prezent în procent de 5,405%; în lotul de 55 pacienți diagnosticați cu obezitate diferă semnificativ statistic F=0,52; P=0,99 >prag critic P=0,05 ceea ce ne permite să afirmăm că au risc crescut de a dezvolta sindrom metabolic în procent de 14,86%; în lotul de 60 pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 diferă semnificativ statistic F=0,55 ; P=0,99 >prag critic P=0,05 ceea ce ne permite să afirmăm că au risc crescut de a dezvolta sindrom metabolic în procent de 16,21% iar în cazul lotului de 50 pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 1 diferă semnificativ statistic F=0,79 ; P=0,82> prag critic P=0,05 ceea ce ne permite să afirmăm că au risc crescut de a dezvolta sindrom metabolic în procent de 13,51%.În cazul lotului martor de 185 persoane sănătoase F=0,61, P=0,99 >prag critic P=0,05 ceea ce ne permite să afirmăm că au risc de a dezvolta sindrom metabolic în procent de 50%.Rezultă că cele 5 loturi sunt heterogene din punct de vedere al celor 3 parametrii biochimicii luați în studiu.(Fig.34.).

Fig.34. Abordarea generală a sindromului metabolic prin testul ANOVA.

Interpretarea personalizată ANOVA One Way a programului Quattro Pro X3 a condus la o selecție mai corectă a pacienților pe grupe cu riscul variabil pentru sindrom metabolic, obezitate, diabet zaharat tip 2 și 1 și lotul martor.

CONCLUZII

Analiza parametrilor evaluați clinic și de laborator a celor 4 loturi de pacienți luate în studiu a permis comfirmarea următoare: Lotul 1prezintă sindrom metabolic la ambele sexe. Lotul 2 format din pacienți diagnosticați cu obezitate prezintă risc de a dezvolta sindrom metabolic la pacienți de sex masculin, la pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 care alcătuiesc lotul 3 cât și la cei diagnosticați cu diabet zaharat de tip 1 care alcătuiesc lotul 4, s-a constatat că riscul de a dezvolta sindrom metabolic este prezent atît la pacienții de sex feminin cît și la pacienții de sex masculin. Se poate afirma că pacienții de sex masculin prezintă risc crescut de a dezvolta sindrom metabolic în comparație cu pacienții de sex feminin.Sindromul metabolic poate fi cu ușurință folosit în practica clinică și, atunci când este evaluat pe baza criterilor de vârstă și sex, furnizând o dovadă a unui potențial risc cardiovascular.

Interpretarea investigațiilor de laborator (biochimice și hematologice) prin metoda matematică ANOVA One Way are la bază 3 din criteriile propuse de Federația Internațională de Diabet în anul 2005 la Berlin și anume:Glicemie, Trigliceride, HDL-Colesterol , împreună cu alți parametrii din tabloul clinic al Sindromului metabolic(Vârstă, IMC, HTA), și investigații hematologice WBC, HGB, HVT.Concentrațiile mari indică că cele 3 criterii de diagnostic pentru sindromul metabolic sunt confirmate; acest material constituie baza pentru testarea unor biomarkerii genetici.

Studiul II-Genetică

SCOPUL studiului este următorul:”Testarea asocierii dintre polimorfismele rs689 și rs680 și Sindromul Metabolic, Obezitate, Diabet zaharat, Hipertensiune arterială.”

OBIECTIVE:

Pentru atingerea scopului enunțat mi-am propus următoarele obiective:

1.Selectarea pacienților (Sindromul Metabolic, Obezitate, Diabet zaharat, Hipertensiune arterială).

2.Izolarea ADN genomic.

3.Genotiparea polimorfismelor din regiunea INS-IGF2.

4.Prelucrarea și interpretarea statistică a rezultatelor obținute.

Materiale și Metode

Materiale și metode:

În acest studiu au fost incluși 185 pacienți cu sindrom metabolic (femei / bărbați = 10/10), obezitate (femei / bărbați = 25/30), DZ1 (femei / bărbați =25/25) și DZ2 (femei / bărbați=30/30) și 185 indivizi considerați sănătoși din punct de vedere clinic și paraclinic. Subiecții au fost selectați din IDNBM N Paulescu, București și Spitalul Județean de Urgență, Giurgiu.

Selectarea subiecțiilor pentru analiza genetică s-a efectuat pe baza evaluări : sex, vârstă, înălțime, greutate, raportul 2D/4D, tensiune arterială și a investigațiilor de laborator: glicemie, colesterol, lipemie.Probele de sânge (2 ml) au fost recoltate pe vacutainere cu EDTA.Recoltarea s-a realizat în cadrul Institutului de Diabet Nutriție și Bolii Metabolice "N Paulescu", București și Spitalul Județean de Urgență, Giurgiu.

Un consimțământ informat a fost obținut pentru toți subiecți înainte de începerea studiului care s-a desfășurat pe baza activității mele de voluntariat(Contract de voluntariat Nr.2./20.01.2014) încheiat cu Spitalul Județean de Urgență, Giurgiu.Această activitate a fost aprobată cu respectarea art.13(5) din Legea677/2001.

Lucrarea a fost efectuată în Laboratorului de Genetică umană din cadrul Departamentului de Genetică a Facultății de Biologie a Universității din București.

Metode :

Extracția ADN genomic

S-a utilizat kitul Wizard Genomic DNA Purification de la Promega.

Izolarea ADN-ului genomic din sângele intergral (300μl).

Materiale necesare:

Tuburi sterile de 1,5ml pentru microcentrifugă(pentru probele de sânge de 300μl).

Baie de apă, 37°C.

Izopropanol, la temperatura camerei.

Etanol 70% la temperatura camerei.

Baie de apă, 65°C (opțional, pentru rehidratarea rapidă a ADN-ului).

Pentru probe cu volumul de 300μl.Se adaugă 900μl de soluție pentru liză celulară într-un tub steril de 1,5ml pentru microcentrifugă.

Important:Sângele trebuie colectat în tuburi cu anticoagulant EDTA, pentru a preveni coagularea.

Se Clatină ușor tubul cu sânge până când acesta e bine amestecat, apoi se transferă sângele în tubul care conține soluția pentru liză celulară. Se inversează de 5-6ori pentru a amesteca conținutul.

Se incubează amestecul timp de 10minute la temperatura camerei(în timpul incubării se inversează tubul de 2-3ori) pentru a liza hematiile. Se centrifugează la 13.000-16.000x g timp de 20 de secunde la temperatura camerei.

Se îndepărtează și se elimină cât se poate de mult supernatant fără a tulbura peleta albă vizibilă.În tubul de 1,5ml(proba de 300μl) va rămâne un volum de aproximativ 10-20μl de lichid rezidual.Dacă proba de sânge a fost congelată se repetă pașii 1-4 până când peleta devine albă.În cazul probelor congelate pot exista unele pierderi de ADN.

Observație:Împreună cu leucocitele pot fi vizibile și unele hematii sau resturi de celule. Dacă peleta pare să conțină doar hematii, se adaugă o alicotă de soluție pentru liză celulară după îndepărtarea supernatantului de deasupra peletei celulare,apoi se repetă pașii 3 și 4.

Se agită puternic tuburile prin turbionare până când leucocitele sunt resuspendate(10-15 secunde).

Se resuspendează leucocitele complet pentru a obține o liză celulară eficientă.

Se adaugă soluție de liză nucleară(300μl) în tubul care conține celulele resuspendate. Se pipetează soluția de 5-6ori pentru a liza leucocitele. Soluția trebuie să devină foarte vâscoasă. Dacă după mixare, sunt vizibile aglutinări de celule,se incubează soluția la 37°C până când aglutinările se scindează. Dacă aglutinările sunt încă vizibile după o oră, se mai adaugă soluție pentru liză nucleară(100μl) și se repetă incubarea.

Opțional: Se adaugă soluție de RNAză(1,5μl) la lizatul nuclear, și se mixează proba prin inversarea tubului de 2-3ori. Se incubează amestecul la 37°C timp de 15minute, apoi se răcește la temperatura camerei.

Se adaugă soluție de precipitare a proteinelor(100μl) la lizatul nuclear și se agită puternic prin turbionare timp de 10-20secunde. După turbionare pot deveni vizibile mici aglutinări de proteine.

Observație:Dacă s-a adăugat soluție de liză nucleară suplimentară la Pasul 6, se adaugă o cantitate totală de 130μl de soluție de precipitare a proteinelor.

Se centrifugează la 13.000-16.000x g timp de 3minute la temperatura camerei. Trebuie să fie vizibilă o peletă de proteine de culoare maron închis. În cazul în care nu se observă nici o peletă, se repetă pasul 4.

Se transferă supernatantul într-un tub curat de 1,5ml pentru microcentrifugă conținând 300μl de izopropanol la temperatura camerei. Observație:În tubul inițial care conține peleta de proteine e posibil să rămână o cantitate de supernarant. Se lasă acest lichid rezidual în tub pentru a evita contaminarea soluției de ADN cu proteinele precipitate.

Se amestecă ușor soluția prin inversare până când șuvițele filiforme albe de ADN formează o masă vizibilă.

Se centrifugează la 13.000-16.000x g timp de 1minut la temperatura camerei. ADN-ul va fi vizibil sub forma unei mici pelete albe.

Se decantează supernatantul și adaugă la ADN un volum de etanol 70%(300μl) echivalent cu volumul probei, la temperatura camerei. Se răstoarnă tubul ușor de mai multe ori pentru a spăla peleta de ADN și pereții tubului de microcentrifugă. Se centrifugează în același mod ca la pasul 12.

Se aspiră cu grijjă etanolul folosind o pipetă Pasteur. În acest moment peleta de ADN este în suspensie. Se răstoarnă tubul pe o hârtie absorbantă curată și se usucă peleta în aer liber timp de 10-15minute.

Se adaugă soluție de rehidratare a ADN-ului în tub(100μl) și se rehidratează ADN-ul prin incubare la 65°C timp de o oră. Se amestecă periodic soluția în tub prin lovirea ușoară a tubului cu degetul. Alternativ, se rehidratează ADN-ul incubând soluția peste noapte la temperatura camerei sau la 4°C.

Se depozitează ADN-ul la 2-8°C. (Fig.35)( www.promega.com)

Fig.35. Protocol de extractie ADN genomic.(după www.promega.com .)

Determinarea spectrofotometrică a purității și concentrației ADN genomic izolat.( după Vassu Tatiana și colab., 2001)

Această determinare se face la nanodrop. Înainte de a folosi ADN extras și purificat, în diverse manipulări moleculare, este necesar să se verifice puritatea și integritatea lui. Concentrația și puritatea optimă a ADN pentru reacția RFLP-PCR .Verificarea purității ADN se realizează de regulă spectrofotometric, ținând cont de următoarele considerente: a. Moleculele ADN (atât formele dublu-, cât și cele monocatenare) prezintă absorbanța maximă la lungimi de undă ce variază între 257 și 260nm. b. Absorbanța maximă pentru proteinele rămase eventual în extract este la m=280nm. În funcție de valorile A260 și A280 se stabilește gradul de contaminare astfel: Raportul A260/A280 optim este cuprins între 1.8 -2.0 Daca raportul este mai mic de 1.7, atunci contaminarea proteică a extractului este semnificativă Dacă raportul A260/A280 are valori mai mari de 2.0 atunci avem contaminare a extractului cu ARN. Determinarea concentrației ADN Determinarea concentrației ADN dintr-un extract se bazează pe citirea absorbanței la 260nm. A260=1 corespunde la 50 μg ADN d.c/mL Este de asemenea recomandabil ca determinarea concentrației ADN pe baza A260 să fie corelată și cu aspectul ADN în gel electroforeză. Verificarea electoforetică a integrității ADN Pentru verificarea integrității ADN genomic, extractul este supus unei electroforeze în gel de agaroză în sistem submers în placa orizontală. Principiul metodei. La pH alcalin sau neutru, acizii nucleici au sarcină electrică globală negativă. Ca urmare dacă sunt plasate într-un câmp electric, moleculele de acizi nucleici migrează la anod (+). Migrarea probelor ADN se realizeazăt în gel de agaroză de 0.8%, iar vizualizarea moleculelor ADN din gel se realizează prin așezarea gelului pe transiluminator UV (λ=302).

Materiale necesare : Soltuție agaroză 0.8% Solutie stoc TBE5X pH 8.0-8.5 -500ml,:Tris 27g,Acid boric 13.75g,EDTA.Na2 0.372g Mod de preparare:intr-un balon cotat de 500ml se pun 27gTris, adauga2-300ml Apa distilata si se amesteca pana la dizolvare dupa dizolvarea Tris se adauga EDTA si inca ≈100ml a.d si se amesteca pana la dizolvare la urma se adauga si acidul boric si inca a.d. si se dizolva.Se verifica pH-ul si apoi se aduce la semn.Aceasta solutie reprezinta stocul de TBE5X care este stabil 2-3 saptamani la temperature camerei si 2-3luni la frigider(4-8°C).Soluția de lucru TBE1X se prepara extemporaneu din soluția stoc 5X si doar volumul necesar.

Soluție TE pH 8.0:Tris10mM,EDTA 1mM se prepară de obicei 50-100ml si se poate autoclava.

Soluție BFE: albastru de bromfenol 0.4%;sucroză 55.0%.Se prepară de regulă folosind 1ml TBE 1X dizolvand intai albastru de bromfenol si apoi sucroza. Soluție BFER: albastru de bromfenol 0.4%; RNazăA100μg/ml.,sucroză 55.0%,. Se prepară de regulă folosind 1ml TBE1X, dizolvând componentele in ordinea menționată(albastru de bromfenol,RnazaA, scuroză)RnayaA se adaugă din soluție stoc de 10mg/ml.Sucroza sau glicerina

dau vâscozitate amestecului; albastru de bromfenol este folosit ca marker de migrare,când spotul albastru a migrat până aproape de capătul gelului se oprește curentul electric. Soluție stoc RNază A 10mg/ml Soluție stoc de bromură de etidium(EtBr) 10mg/ml. De obicei, se prepară 5-10ml soluție stoc: se cântărește cantitatea dorită de bromură de etidium si se dizolvă în a.d.Soluția se stochează la frigider(2-3luni) în sticla brună(pentru că substanța se descompune la lumină).Bromura de etidium este extrem de toxică și are un foarte puternic efect mutagen;ca atare este obligatorie manipularea ei cu mănuși de laborator. Aparat de electroforeză

Protocol de lucru:

1.Tampon de elctroforeză:

TBE1X-Tris 0.089M, acid boric 0.089M, EDTA 0.002M pH8.0-8.5.

2.Preparea gelului de agaroză:

Este preferabil să se prepare numai volumul de agaroză necesar pentru un gel. Volumul de agaroză necesar se calculează în funcție de tăvița în care va fi turnat gelul , el trebuie să aibă o grosime de 3-4.5mm,se cântărește agaroză într-un vas Erlenmeyer și peste ea se adaugă volumul de tampon necesar obținerii concentrației de agaroză dorită(concentrația de agaroză poate varia între 0.6-1%, în funcție de dimensiunea moleculelor de ADN ce urmează să fie supusă electroforezei sau de marca și tipul de agaroză folosit), în general pentru un gel de verificare a unor extracte de ADN cromozomal , se folosește o concentrație de 0.7-0.9%. Pentru dizolvarea completă a soluției de agaroză de 0.8% se încălzește recipientul pe bain-marie, 1 minut la cuptorul cu microunde până la firbere, dacă în laborator nu există cuptor cu microunde, cea mai comodă variant este să se pună vasul Erlenmeyer(acoperit cu o plăcuță Petri) pe o sită cu azbest la un Bec Bunsen, nu trebuie să dea în foc, fierbere continuă la flacără mică până la dizolvarea completă a agarozei, apoi se răcește la 45-50°C.

3.Turnarea gelului:

Se efectuează electroforeză în placă orizontală în sistem submers.Aparatul de electroforeză este format din: tanc de electroforeză și o tăvită în care se toarnă gelul de agaroză. Se închide tăvița aparatului de electroforeză cu banda adezivă sau, dacă există, cu suportii de cauciu. Se montează pieptenul astfel încât dinții acestuia să nu atingă tavița(să nu pătrundă în toată groimea gelului)pieptenul se alege corelat cu volumul de probă ce urmează a fi încărcat în gel. Se toarnă gelul cald(45-50°C) în grosime de 3-5mm se lasă 20-45minute în funcție de temperatura ambiantă pentru răcirea și solidificarea gelului fara a se misca tavita sau pieptul. Se indepartează banda adezivă și pieptanul fără a se rupe gelul.

4.Pregatirea probelor de ADN se procedeaza astfel:

Se calculează volumul de proba ce urmează a fi încărcat în gel corelat cu volumul godeurilor lăsate de dinții pieptănului se calculează volumul soluției de BFE sau BFER astfel încât acesta să preinte 1/4-1/6 din volumul probei astfel pentru geluri de verificare a unor extracte de ADN cromozomal, se recomandă încărcarea a 5ml (din volumul de 20-40ml a extractului) care se amestecă cu 2ml BFE pentru detectarea eventualelor molecule de ARN contaminate. Pentru fiecare probă ADN se folosește un tub Eppi mic(de 0.5ml) curat în care se pune întâi volumul de BFE, apoi se pune volumul de probă și se amestecă circular cu vârful pipetei automate urmat de 1-2 aspirării în caz că sau format bule de aer se bate usor tubul de masă sau se centrifughează 2030sec. Tubul cu restul de probă se pun înapoi în frigider/congelator.Pentru economie de timp probele se pot pregătii în timp ce se solidifică gelul.

5.Montarea electroforezei și încărcarea probelor:

Tăvița cu gelul solidificat se asează în tancul de electroforeză În tanc se toarnă tampon TE1XpH8.3 (sau alt tampon de electroforeza)până la nivelul la care lichidul acoperă gelul sub forma unei pelicule de 1-2 mm grosime. În godeurile formate de dinții pieptenului în gel se toarnă probele pregătite .

6.Pornirea electroforezei:

Se pune capacul aparatului de electroforeză Se aranjează fierele de legatură cu un cap la electrozii aparatului de electroforeză și cu celălat la bornele sursei de current (electrodul dinspre godeuri se cuplează la catod). Se porneste sursa de curent si se fixeaza la inceput la 1.5V/c2m până la intrarea probelor din godeuri in gel apoi se poate mari voltajul la maximum 5V/cm și se lasa aproximativ 2h. Se recomanda 2-2.5V/cm si un amperaj de până în 20mA la valori prea mari de amperaj sau de voltaj benzile de ADN se distorsionează prezentand asa numitul fenomen smiling.

7.Colorarea gelului

La expirarea timpului de migrare se intrerupe alimentarea cu curent electric . Se scoate tavita cu gelul si se coloreaza(prin imersare intr-un cristalizor) cu bromura de etidiu(EtBr) 0.5-1mg/ml timp de 20 minute, apoi gelul se spala 30 minute in apa distilata tot in cristalizor. lata varinata decolorare consta in introducerea colorantului direct in tamponul TBE1X inainte de turnarea acestuia in tancul de electroforeza.Colorarea se va realize deci ,simultan cu migrarea moleculelor de acizi nucleici.in acesta situatie se recomanda folosirea unei concentratii mai mici de EtBr(0.3-0.5μg/ml).In afara de economia de timp.Bromura de etidium este un agent intercalant (se intercaleaza intre bazele azotate ale acizilor nucleici) de tip fluorocrom care este excitat de lumina UV(λ=250-310nm) si emite in vizibil(λ=520nm) determinand colorarea moleculelor de ADN in rozviolet.

8.Vizualizarea moleculelor de ADN:

1. Moleculele de ADN se viziualizează prin azarea gelului pe transiluminator UV(λ=302nm). 2. Se face o poză cu aparatul de fotografiat obisnuit și cu un filtru rosu sau cu un aparat Polaroid.(Vassu Tatiana si colab., 2001). Concentrația și puritatea optimă a ADN poate fi folosit pentru amplificare. Verificarea purității și integrității ADN-ului izolat din probele biologice s-a realizat cu ajutorul nanodropului NanoVue.( Vassu Tatiana, Csutak Ortansa, Stoica Ileana, Mușat F.,2001,Genetica microorganismelor și inginerie genetică microbiană-Note de curs și tehnici de laborator.Editura Petrion,București,pag:76-82).

Tehnica RFLP-PCR.

Tehnica RFLP-PCR pentru studiul polimorfismelor genelor INS(rs689) și IGF2(rs680):

Se izolează și purifică ADN-ul: se poate face din probe de sânge total, cu ajutorul kitului de extracție ADN de la Promega.

Purificarea și concetrația ADN extras:se verifică spectrofotometrică(DO260/280nm).

Se amplifică prin PCR, ADN-ul izolat.

Se supun digestiei enzimatice cu ajutorul enzimelor de restricție ampliconii rezultați.

Se face prin electroforeză în gel de agaroză sau poliacrilamidă vizualizarea produșilor rezultați în urma digestiei.(Fig).

a) b) c)

Fig.Etapele:a)ADN de la 2 alele b)Electroforeza fragmentelor de restricție c) Gel complet

Polimorfimele celor 2 gene sunt:

-rs689 în gena INS sau gena insulinei.

-rs680 în gena IGF2 sau factorul de creștere insulin-like2.

Polimorfismul genei Insulină-23Hph(SNP T/A)

Accesarea genei :L15440(GeneBank)

2161   gggcatcctg  cagggggtgc  tgggacacca  gctggccttc  aaggtctctg  cctccctcca

 2221   gccaccccac  tacacgctgc  tgggatcctg  gatctcagct  ccctggccga  caacactggc

 2281   aaactcctac  tcatccacga  aggccctcct  gggcatggtg  gtccttccca  gcctggcagt

 2341   ctgttcctca  cacaccttgt  tagtgcccag  cccctgaggt  tgcagctggg  ggtgtctctg

 2401   aagggctgtg  agcccccagg  aagccctggg  gaagtgcctg  ccttgcctcc  ccccggccct

 2461   gccagcgcct  ggctctgccc  tcctacctgg  gctcccccca  tccagcctcc  ctccctacac

 2521   actcctctca  aggaggcacc  catgtcctct  ccagctgccg  ggcctcagag  cactgtggcg

 2581   tcctggggca  gccaccgcat  gtcctgctgt  ggcatggctc  agggtggaaa  gggcggaagg

Polimorfismul genei IGF2 Apa1(SNP G/A)

Accesarea genei :X07868(GeneBank)

721   gaatttggca  ctccccaccc  ccctctttct  cttctccctt  ggactttgag  tcaaattggc

 781   ctggacttga  gtccctgaac  cagcaaagag  aaaagaaggg▼  ccccagaaat  cacaggtggg

 841   cacgtcgctc  gtaccgccat  ctcccttctc  acgggaattt  tcagggtaaa  ctggccatcc

 901   gaaaatagca  acaacccaga  ctggctcctc  actccctttt  ccatcactaa  aaatcacaga

 961   gcagtcagag  ggacccagta  agaccaaagg  aggggaggac  agagcatgaa  aaccaaaatc

Descriere: regiunea 3'UTR a geneiIGF2.

1.Reacția PCR

Primerii pentru analiza polimorfismului rs689 în gena INS au fost:

-23HphF:5'TCCAGGACAGGCTGCATCAG3'(exonic)

-23HphR:5'AGCAATGGGCGGTTGGCTCA3'(intronic)

Primerii pentru analiza polimorfismului rs680 în gena IGF2 au fost:

-5'CTT GGA CTT TGA GTC AAA TTG G3'

-5'CCT CCT TTG GTC TTA CTG GG3'

Reacția PCR a avut loc într-un thermocycler Corbett.

Volumul în care s-a lucrat a fost de 20 μl de mix 100 pentru PCR ce continea 1× tampon PCR [50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 9.0)], 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 0,5 mM din fiecare primer, și 1 unitate polimerază ADN Taq.

Programul de amplificare PCR pentru polimorfismul rs689:

Programul de amplificare PCR pentru polimorfismul rs680:

2.Digestia enzimatică (Restricție ADN)

Pentru analiza polimorfismului rs689, 10 μl de produs PCR a fost digerat cu 10 unitati de enzima de restricție Hph1, la 37 °C timp de 3 ore.

Dimensiune amplicon:441pb

Enzima de restricție: Hph1

Situs de restricție:5'…ggTgA(N)8▼…3'

3'…CCACT(N)7▲…5'

Dimensiunea fragmentelor de restricție: alela"-":161pb+280pb

alela"+":161bp+241bp+39bp

Separarea fragmentelor : gel de agaroză(2%)

Colorare:Bromură de etidiu.

Pentru analiza polimorfismului rs680, 10 μl de produs PCR a fost digerat cu 5 unitati de enzima de restricție Apa1, la 37 °C timp de 3 ore.

Dimensiune amplicon:236pb

Enzima de restricție: Apa I

Situs de restricție:GGG▼CCC

Dimensiunea fragmentelor de restricție: alela"-":236pb

alela"+":173bp+63bp

Separarea fragmentelor : gel de agaroză(2%)sau poliacrilamidă(8%).

Colorare:Bromură de etidiu.

Reacția de restricție a durat cel puțin 3 ore, pe baia de apă, în condițiile recomandate de producător. Digestia enzimatică s-a realizat conform recomandărilor furnizorului(Fermentas).

3.Electroforeză în gel de agaroză a ampliconilor.

Etapele de preparare ale unui gel de agaroză de 3% de dimensiunea 15x20cm

a) Se amestecă 3g agaroză și 100mL tampon TBE într-un tub Erlenmeyer de 500 mL

b) Se acoperă vasul cu o folie de aluminiu și se topește agaroza pe o plită agitând ocazional

c) Se pregatește cuva gelului și se toarnă agaroza răcită în prealabil la 50-60°C, căreia i s-a adăugat 1-2 μL bromură de etidiu 10 mg/mL;

d) Se inseră pieptenele, și se lasă gelul să se răcească timp de 30-60 min;

e) Se îndepărtează pieptenele și banda adezivă de pe cuvă, plasându-se cuva în tancul de electroforeză cu 1X TBE (astfel încât tamponul să acopere complet gelul);

f) Se introduc probele în godeuri;

g) Conectăm aparatul de electroforeză la o sursă de curent continuu, 100 V, timp de 40-60 min;

h) Scoatem gelul din tancul de electroforeza, și vizualizăm la transiluminator UV;

j) Se fotografiază gelul;

4.Analiza ampliconilor

Genotiparea polimorfismelor markerilor genetici ai regiuni 11p15 INS și IGF2 s-a realizat prin tehnica RFLP-PCR.

Prelucrarea datelor statistice

Echilibrul Hardy-Weinberg. Pentru markeri bialelici, și distribuția genotipurilor.(s-a utilizat pentru a identifica dacă în populația analizată acționează forțe care pot modifica frecvența alelelor analizate[D.CIMPONERIU, Bazele genetice ale diabetului zaharat. Studii pe modele animale și în populațiile umane din România,Teză de doctorat, Facultatea de Biologie, Universitatea din București, 2007 pp29-36.].

Legea (echilibrul Hardy-Weinberg) are rol în interpretarea datelor privind variabilitatea genetică ăn populațiile naturale.Legea este o relație matematică simplă între frecvența alelică și frecvența genotipică pentru un locus autozomal, dintr-o populație cu împerechere întâmplătoare, aflată în echilibru.

Formule:; și pentru frecvențele genotipurilor AA, AG, GG. p-frecvența alelei A,iar q-frecvența alelei G. Probabilitatea ca p2-valoarea frecvenței genotipurilor AA,2pq reprezintă valoarea frecvenței genotipurilor heterozigote AG, iar probailitatea ca alele G ♀și G♂ q*q=q2 reprezintă valoarea frecvenței genotipurilor GG.

Frecvențele sunt termeni în dezvoltarea binomului reprezintă frecvența Hardy-Weinberg.

Frecvența genotipurilor descendenților.

(Simon-Gruiță Alexandra,2007,Introducere în genética populațiilor, Editura Universității din București pag 33-34).

Frecvențele acestor genotipuri vor fi notate p2,2pq , q2, fiind o extensie a binomului -distribuția genotipurilor se află în echilibru genetic Hardy-Weinberg.[ M.COVIC ,D.ȘTEFĂNESCU,I.SANDOVICI, Genetică medicală,Ediția II-a,Ed.Polirom, București, 2011,pp: 480-482.].

Legea Hardy-Weinberg se presupune că împerecherea gameților este întămplătoare, fără să se bazeze pe gena luată în discuție , astfel încât la adulți din populație formează un stoc de gameți care se combină randomic, producând zigoții următoarei generații.

În conformitate cu legea H-W sunt:

– frecvențele genotipice tind să se stabilizeze în împerechere întâmplătoare într-o populație după o singură generație și va rămâne constanță în următoarea generație dacă nu se modifică frecvențele alelelor.

-frecvențele genotipice a unei generații în concluzie depinde de frecvențele alelelor în precedenta generație.(Simon-Gruiță Alexandra,2007,Introducere în genética populațiilor, Editura Universității din București pag 33-34)

Calcularea și interpretarea Odds-Ratio (calcularea riscului de boală conferit de genotipuri).

Formule: OR); (Tabel nr.1). [Simon-Gruiță Alexandra,2007,Introducere în genética populațiilor, Editura Universității din București pag 33-34], OR, unde P+ = bolnavi care posedă genotipul+/+;P-=bolnavi care nu posedă genotipul +/+;C+=subiecții din grupul control+/+;C-=subiecții din grupul control care nu posedă genotipul+/+.OR atunci genotipurile sunt distribuite identic în loturile analizate, OR atunci genotipul conferă susceptibilitate pentru apariția bolii, cu cât valoarea OR este mai îndepărtată de 1 cu atât riscul pentru genotipul analizat este mai mare;OR atunci genotipul nu conferă risc statistic de apariție a bolii.Genotipul are efect protector , cu cât valoarea OR este mai apropiată de 1 cu genotipul analizat conferă o protecție mai mare față de apariția bolii.[ D.CIMPONERIU, Corelarea polimorfismelor regiunii IDDM2 cu Diabet zaharat insulinodependent în populația caucaziană din România, Institutul de Genetică al Universității din București.,2,(2005).].

Tabel nr 1. Distribuția genotipurior.

(Simon-Gruiță Alexandra,2007,Introducere în genética populațiilor, Editura Universității din București pag 33-34)

Pentru prelucrarea datelor sa utilizat următoarele programe: VMD.versiunea 1.9.1.-pentru vizualizarea 3D a moleculelor; Jalview. Versiunea 2.8.-pentru vizualizarea 3 D a structurii secundare și compoziția în acizi nucleicii; softul PyElph versiunea 1.4.-pentru creare de arborii filogenetici,Quatro Pro 3X, 2007.

Software PyElph versiunea 1.4 pentru analiza imaginilor și crearea de arborii filogeneticii (după Pavel Brândușa Ana și Vasile Cristian Ioan,2011).

S-a testat pe imaginii de gel de agaroză /poliacrilamidă în care moleculele de ADN au fost colorate cu bromură de etidiu care este un colorant fluorescent și imaginiile au fost luate utilizând un transiluminator cu UV și un aparat de fotografiat digital comun.Modelul de markeri genetic utilizat este tehnica RFLP-PCR.

Modul de lucru:

Software PyElp cuprinde 6 etape software

Etapa 1

-se deschide programul PyElph din fereastra PyElph GUI cu operații disponibile în bara de instrumente de pe Destop.

-se încarcă o imagine a unui gel de electroforeză.

1.gel de agaroză pentru gena INS

2.gel de poliacrilamidă pentru gena IGF2 obținute prin tehnica RFLP-PCR(Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of PCR.

-se decupează marginiile imagini punctul de vedere.

-se plasează imaginea astfel încât godeurile să fie situate în partea de sus a vizualizării imagini.

-se salvează prin accesarea butonului Save după ce este denumită imaginea cu extensie jpg. Exemplu: INS pyelph.jpg.; IGF2 pyelph.jpg.

-se dă click pe butonul Next după ce imaginea se pregătește din panoul de opțiuni pentru a se duce la etapa2.

Fig.36.Incarcarea Imaginilor cu gel de electroforeză cu genele INS si IGF2 prin tehnica RFLP-PCR

Etapa 2.-Detectarea benzilor

-se detectează automat benzile prin accesarea butonului Detect.

*dacă o imagine are rezoluție scăzută a imagini detectarea automată eșuează.

– se definește grafic lățimea bandei și se îmbunătățește detectarea automată a benzilor(Lane).

-se calculează valorii maxime a fiecărei coloane de pixelii.

*Valoarea medie a lățimi benzilor, se calculează folosind un prag stabilit la 70% din valoarea maximă a domeniului. Dacă acest prag cu valoare mare de intensitate se ia în considerare zgomotul se elimină și probablitatea este mai mare ca benzile detectate să fie benzile reale, iar dacă se folosesc benzi detectate la nivel prag o valoare medie pentru lățimea benzilor se calculează și benzile subțirii decât lățimea medie sunt eliminate. Lățimea medie a benzilor selectate se calculează din nou și se utilizează pentru a detecta toate culoarele între 2 praguri (70% și 15%), cu o abatere lățime de 25% din valoarea medie lățime.

-se modifică din GUI valoarea deviere lățime.

-se detectează benzilor se efectuează, operațiunea de scădere fundal.

-rezultă detectarea benzilor și se trece la Etapa 3.(Fig.).

Fig.37. Detectarea benzilor(Lane).

Etapa 3.Detectarea fragmentelor ADN

-se detectează și se marcheazăcu un X toate benzile care corespund fragmentelor moleculare de ADN real.

-se face automat Detectare Band și se ajustează prin schimbarea unor parametrii sau se adaugă sau se elimină benzi manual.

-se realizează detectarea automată a benzii prin însumarea coloanelor unui culoar și se compară valorilor obținute cu un prag de intensitate setată la 20 înmulțită cu lățimes benzii și se modifică de GUI.

-se evită detectarea vârfurilor false printr-un filtru medie mobilă care se aplică pe date.

-se modifică de GUI lățimea filtrului și trecerile de filtrare pentru a îmbunătăți detectarea.

-se determină lățimea filtrului cât de multe valori sunt utilizate pentru a se calcula media pentru poziția curentă după următoarea formulă:

xF[i]=12*lățime+1*Ʃi+lățime k=x lățime i-[k].

*Parametrul de filtru care trece reprezintă numărul de ori filtrul se aplică pe datele iar în cazul imaginilor de dimensiuni mari se recomandă, să se utilizeze valori mai mari pentru lățimea de filtru și filtru trece.

-se selectează un culoar, graficul din partea dreaptă a vizualizării imaginii prezintă valorile pixelilor să corespundă coloanei situate în mijlocul unei benzi.Fiecare vârf să corespundă o bandă pe banda selectată.

-se termină de tectarea fragmentelor și se trece la etapa 4.

Fig38.

Etapa 4 –opțional și se calculează greutatele moleculare, se folosește un marker de greutate molecular definit.

Greutatea moleculară a markerului

-se selectează de GUI culoarele care conțin markeri moleculari.

-se utilizează apoi un marker pentru a calcula tóate greutățile moleculare bazate pe standard definit.

-se introduc numărul de benzi și apoi greutățile moleculare corespunzătoare într-o ordine descrescătoare.

-se definește un fișier text cu extensia.marker. și se depozitează într-un director local(standarde).

-se salvează noul standard în mod automat după ce este definit și se va utiliza în interfață la utilizarea viitoarea .

*Greutățile moleculare sunt móntate după un model de migrare electroforeză liniar:

In(Greutate)=α*Migration Distance+β, α<0,β>0.

*α este parametrul negativ, pentru că distanța de migrare a fragmentelor este invers proporțională cu logaritmul greutăți moleculare.β este un offset pozitiv datorită distanței de la partea de sus a imaginii în godeuri.

-se trece apoi la etapa5(Fig.)

Fig39

Etapa 5 .Potrivirea fragmentelor ADN

-clusterele sunt linii orizontale sau puncte izolate(în cazul în care un grup conține doar o singură bandă) și sunt de culoare prin alternarea roșu și galben astfel încât oricare pot fi ușor diferențiate.

-se utilizează un algoritm euristic pentru banda de potrivire(mathing) care este dezvoltată astfel încât 2 benzii într-un grup să îndeplinească 2 condiții:

1.să un facă parte din aceași bandă;

2.să aibă distanța dintre ele mai mică de 2% din înălțimea imaginii(valoarea se modifică În GUI).

-se obține o matrice clustering ce se poate modifica și se salvează ăn GUI.

*Coloana matricii clustering reprezintă proba(populația sau specia) iar linia este cluster.

Când banda este prezentă sau absentă se marchează cu 1(sau+) și 0(sau -) iar matricea se utilizează pentru a calcula matricea de similaritate cu ajutorul coeficientului DICE, care se exprimă nivelul de similaritate între 2 modele de ADN.

În cazul probelor Si și Sj similaritatea este:

DICE(Si, Sj)=[%].

Matricea distanță se calculează ca fiind de 100de ori matrice a celor minus matricea de similaritate.

-se folosește matricea pentru generarea arbori filogenetici prin metode de clustering.

-se trece prin butonul Next la etapa 6.

Fig.40

Etapa 6.Generarea de Arborii filogeneticii.

-se calculează arborii filogenetici pe baza metodelor de clustering aplicate pe matricea distanță calculată în etapa 5.

-se selectează metoda din GUI și se afișează arborele corespunzător.

-se utilizează metoda Aderarea Neighbor (Neighbor Joining).

-se afișează etichetele probelor analizate care pot fi modificate de GUI distanțele genetice

care se pot afișa pe ramurile copacului.

-se afișează distanțele genetice pe ramuri.Matricea distanței corespunzătoare imaginii de gel și se calculează.

-se salvează arbori generați folosind PyElph.(Fig.)(Pavel Brândrușa Ana, Vasile Cristan Ion,2012)

a b

Fig.41.Generarea de arbori filogenetici ai genelor INS și IGF2.Arborele filogenetic s-a generat de software PyElph versiunea 1.4 folosind metoda Neighbor Joining.Se calculează pe baza informaților extrase din imaginea gelului de electroforeză –gel de agaroză pentru gena INS (a) și gel de poliacrilamidă pentru gena IGF2(b) prin tehnica RFLP-PCR.

VMD-Visual Molecular Dynamics versiunea 1.9.1

Mod de lucru:

-se deschide aplicația VMD din programul File.

-se încarcă din File ->Open ->un fișier 3I40.pdb.(gena INS) și 1IGL.pdb.(gena IGF2) apoi se dă Browser pentru încărcare.

-se dă click pe butonul Load pentru a apărea molecula format pdb. Nucleotide .

-se prelucrează în Graphical Representations unde se selectează Chain și NewCartoon.

-se denumește și se salvează cu extensia vmd.(Humphrey, W., Dalke, A. and Schulten, K., 1996)(Fig42,43,44)

Fig.42.Mode de lucru VMD.

Fig.43.Structura terțiară a genei care codifica insulina:Structura 3D a genei INS (3I40 pdb prelucrată VMD Newcartoon).Insulina:catena A(rosu), catena B(albastru). ) și modul de lucru al aplicației VMD.

Fig. 44.Structira terțiară a genei IGF2.Structura 3D a genei IGF2. Insulin-like Growth Factor 2(Somatomedina A).(1IGL pdb prelucrata VMD).

Jalview

Structura secundară a acizilor nucleici folosește Jalview versiunea 2.8.

Modul de lucru:

-se deschide aplicația Jalview

-se încarcă din File->Input Alignement->from File se descarcă genele în format pdb(PDB=Protein Date Banks) și se aliniază cele 2gene.

-se calculează arborele filogenetic comun al celor 2 gene prin Calculate->Calculate Tree-> se calculează folosind metoda Neighbour Joining Using%Identily.

-se salvează cu extensia jar. pentru Jalview. (Cole C.,Barber J.D., Barton G.J.,2008).(Fig.45).

Fig.45. Structura secundară INS-IGF2. Compoziția în acizi nucleici și reprezentarea arborelui filogenetic al celor 2 gene INS și IGF2. PDB prelucrat in Jalview.

Rezultate și discuții:

Izolarea ADN din probe biologice(sange).

370 subiecti(probe sange recoltat pe EDTA-2ml):185 pacienți cu sindrom metabolic (femei / bărbați = 10/10), obezitate (femei / bărbați = 25/30), DZ1 (femei / bărbați =25/25) și DZ2 (femei / bărbați=30/30) și 185 subiecti considerați sănătoși din punct de vedere clinic și paraclinic.

Tabel nr 2. Distribuția pe sex a pacienților.

Fig. 46.Distribuția grafică pe sex a pacienților.

Fig. 47.Distribuția grafică pe sex a pacienților.prelucrare Quatro Pro 3 X.

Tabel nr 3.Distribuția parametrilor principali.

Fig.48.Distribuția parametrilor investigați.

Fig. 49. Distribuția parametrilor investigați prelucare Quatro Pro 3X.

Tehnica RFLP-PCR

Analiza polimorfismelor INS și IGF2

Analiza polimorfismelor rs689 în gena INS și rs680 în gena IGF2 prin tehnica RFLP-PCR(Restriction Fragment Length Polymorphism).

Analiza RFLP-PCR a permis identificarea pacienților din grupul analizat care prezintă genele de interes și calcularea riscului relative conferit de prezența genelor la pacienții investigaț.

Analiza polimorfismelor rs689 a genei INS și rs680 a genei IGF2 asociate cu risc crescut de a dezvolta sindrom metabolic, obezitate, diabet zaharat de tip2 diabet zaharat de tip1 și hipertensiune arterială s-a realizat prin tehnica RFLP-PCR.

S-au analizat 370 subiecții din care 20sunt pacienți diagnosticați cu sindrom metabolic, 55 pacienți diagnosticați cu obezitate, 60pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip2, 50 pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip1 și 34 pacienți diagnosticați cu hipertensiune arterială.

Metoda RFLP-PCR se bazează pe digestia diferențiată a ampliconilor în funcție de punctele polimorfice care conduc la schimbarea secvenței țintă recunoscută de enzima de restricție.Se pot obține astfel fragmente diferite de ADN, ce diferă prin greutatea moleculară în funcție de prezența genelor candidat sau a secvenței normale în situsul de recunoaștere al enzimei.(Figurile 50,51,52,53).

Fig. 50.Imaginea unui gel de agaroză în care au fost separați produșii de restricție Insulină-23Hph(Linia 1:amplicon nerestrictat, Linia2:markerul 100pb Ladder,

Fermentas, Liniile 3,4:genotip +/+, Liniile 5,6:genotipul +/-).

Fig.51.Imaginea electroforezei pe agaroză prin tehnica PCR-RFLP a genei INS -23Hph, prelucrată utilizand softul PyElph prin metoda Neibergoing.

Fig.52.Imaginea unui gel de poliacrilamidă PAGE (8%) în care au fost separați produșii de restricție IGF2 Apa(Linia7:markerul 100pb Ladder,Fermentas, Liniile 2,3,5,8:genotip +/+,Linia 10: genotip -/-, Liniile 1,4.6,9,11:genotipul +/-).

Fig.53.Imaginea electroforezei pe acrilamidă (PAGE) prin tehnica PCR-RFLP a genei IGF2 Apa1, prelucrată utilizand softul PyElph prin metoda Neibergoing.

Polimorfismele testate sunt distribuite în conformitate cu echilibrul Hardy-Weinberg în loturile de pacienți și control.

Frecvențele alelelor minore sunt cuprinse în intervalul 8-10% raportat pentru diferite populații din Europa.

Polimorfismul rs689, cartat în gena pentru insulină, este asociat cu DZ1 (OR AA=3,1, p<0,05).

Asocierile dintre alelele și genotipurile rs689 cu sindromul metabolic, DZ2 sau obezitate nu sunt semnificative din punct de vedere statistic (p>0.05).

Varianta rs680 A are tendință de asociere cu sindromul metabolic.

Vârsta la care au debutat afecțiunile testate nu a fost corelată cu polimorfismele testate. Polimorfismele testate nu se asociază cu vârsta la care au debutat.

Polimorfismul IGF2 Apa a fost asociat semnificativ cu valorile raportului 2D/4D.

Analiza combinațiilor de genotipuri și alele nu a permis detectarea altor asocieri semnificative.

Concluzii:

Polimorfismele din regiunea 11p15 sunt asociate cu creșterea riscului pentru apariția sindromului metabolic (rs680)pentru gena IGF2 și DZ1 (rs689) pentru gena INS.

Studiul III-Programare

SCOP:Identificarea riscului crescut și scăzut de a dezvolta SM, la pacienți diagnosticați cu OB, DZ tip 2,DZ tip 1 prin utilizarea si compararea metodelor de programare=Rețele Neuronale Artificiale aplicând MATLAB si programul MDR(Multifactor Dimensionality Reduction) pe baza datelor clinice, de laborator și a testelor genetice.

OBIECTIVE:

1. Adunarea datelor clinice, de laborator și a testelor genetice într-o bază de date.(Fișă de intrare a datelor-tabel).

2. Introducerea datelor clinice, de laborator și a testelor genetice în program, procesarea, prelucrarea datelor în identificarea riscului scăzut și crescut de a dezvolta SM, la pacienți diagnosticați cu OB,DZ tip2, și DZ tip 1.

3. Interpretarea rezultatelor date prin rețeaua neuronală artificială aplicând programul MATLAB și programul MDR.

ANN= RețeleNeuronale Artificiale aplicând MATLAB R2009b și programul MDR sunt folosite în clasificarea pacienților cu riscul cel mai ridicat de a dezvolta Sindrom metabolic, Obezitate, diabet zaharat de tip1 și diabet zaharat de tip 2.

2.1.Populația luată în studiu.

În acest studiu au fost incluși 185 pacienți cu sindrom metabolic (femei / bărbați = 10/10), obezitate (femei / bărbați = 25/30), DZ1 (femei / bărbați =25/25) și DZ2 (femei / bărbați=30/30) și 185 indivizi considerați sănătoși din punct de vedere clinic și paraclinic. Subiecții au fost selectați din IDNBM N Paulescu, București și Spitalul Județean de Urgență, Giurgiu.

Selectarea subiecțiilor pentru analiza genetică s-a efectuat pe baza evaluări : sex, vârstă, înălțime, greutate, raportul 2D/4D, tensiune arterială și a investigațiilor de laborator: glicemie, colesterol, lipemie.Din probele de sânge recoltate pe EDTA (2 ml).

Lucrarea a fost efectuată în Laboratorul de Genetică umană din cadrul Departamentului de Genetică a Facultății de Biologie a Universității din București.

2.2.Adunarea de date/Achiziția de date.

Evaluarea clinică și investigațiilor de laborator și a testelor genetice au fost colectate în dimineața de după post peste noapte de către medici asistenți și biologi instruiți , folosind metode standardizate.

1. Evaluarea clinică include: sex, vârstă, înălțime, greutate, IMC, raportul 2D/4D, tensiunea arterială(HTA);stilul de viață:fumător, consm alcool, tratament.

2. Investigațiile de laborator au fost colectate sânge cu ajutorul puncției venoase după post peste noapte.Cele biochimice recoltate pe vacutainer fără anticoagulant și cele hematologice și genetice pe vacutainer cu EDTA 2ml.

Investigațiile biochimice sunt:glicemia a fost determinată utilizând metoda colorimetrică enzimatică;colesterolul total determinată prin metoda colorimetrică enzimatică.Profilul lipemiei include:Trigliceridele a fost determinată prin metoda colorimetrică enzimatică(GOP-PAP);HDL-Colesterol și LDL-Colesterol au fost determinate prin metoda enzimatică directă cu precipitați.

Determinarea indicatorilor/parametrilor biochimici s-a efectuat cu ajutorul unui analizator biochimic, model de instrument automat BS300 Mindray Chimestery Analyzer, China.determinările biochimice spectrofotometrice utilizând ca material de analizat serul; iar pentru parametri hematologici s-a efectuat cu ajutorul unui analizator hematologic, model de instrument automat BS3000 Plus, Mindray Auto Hematology Analyzer, China.

3. Testele genetice

Extracția ADN genomic din sânge total.

S-a utilizat kitul Wizard Genomic DNA Purification de la Promega.Aceasta s-a efectuat în următoarele etape:Liza hematiilor.Se combină 900μl soluție de liză celulară și 300μl sânge. Se amestecă prin inversare. Se incubează la temperatura camerei timp de 10 minute. Se centrifugează.Probă ≤300μl 13.000-16.000 x g*;20 secunde.Se îndepărtează supernatantul. Se agită peleta prin turbionare.Liza nucleară și precipitarea proteinelor: Se adaugă 300μl soluție de liză nucleară și se amestecă prin inversare.Se adăugă 100μl soluție de precipitare a proteinelor; se agită prin turbionare timp de 20 de secunde. Se centrifugează.Probă ≤300μl 13.000-16.000x g*;3minute.Precipitarea și rehidratarea ADN-ului. Se transferă supernatantul într-un nou tub conținând 300μl izopropanol.Se amestecă.Se centrifugează.Probă ≤300μl 13.000-16.000 x g*;1minut.Se înlătură supernatantul. Se adaugă 300μl etanol 70%(același volum ca și izopropanolul).Se centrifugează. Probă ≤300μl 13.000-16.000 x g*;1minut.Se aspiră etanolul și se uscucă peleta în aer(timp de 10-15minute).Se rehidratează ADN-ul în 100μl soluție de rehidratare a ADN-ului timp de 1 oră la 65°C sau peste noapte la 4°C.*Viteza maximă pe o microcentrifugă.[15].

Tehnica RFLP-PCR.

Genotiparea genelor INS și IGF2:Etapele sunt următoarele:Amplificare PCR.Restricție ADN.(Digestie enzimatică).Electroforeza în gel de agaroză.Analiza ampliconilor..[3]. Genotiparea polimorfismelor markerilor genetici ai regiuni 11p15 INS și IGF2 s-a realizat prin tehnica RFLP-PCR. Reacția de restricție a durat aproximativ 3 ore, pe baia de apă la 37°C.

2.3. Rețea neuronală cu retropropagare(BP sau RP)-Algoritm matematic.

Rețea neuronală BP este un model tipic de inteligență artificială, este un tip de rețea cu câmp mare de aplicabilitate.

Rețea neuronală BP este introdusă pentru a stabili modelul de clasificare a sindromului metabolic, obezității, diabetului zaharat de tip 1 și a diabetului zaharat de tip 2.Modelul ANN(Rețele neuronale) a fost efectuat cu MATLAB R 2009b versiunea 7.9.0529 compartibil cu WINDOWS XP și 10.

2.3.1 Structura rețea neuronală BP.

Cuprinde 3 straturi:

Stratul de intrare de acceptare a datelor de intrare. Numărul de noduri din stratul de intrare este egal cu numărul variabilelor explicative.

X-variabila independentă(de intrare sau predictor).

X=[sex. Vârstă, înălțime, greutate, IMC, HTA, stil de viață:fumător, consum de alcool, regim alimentar, tratament, raport 2D/4D, glicemie, colesterol total, trigliceride, HDL-colesterol, LDL-colesterol, prezența /absența genelor INS și IGF2, genotipurile genei: +/+, +/-,-/-].

Stratul ascuns .se folosește metoda Hecht-Nelson și 2i+1 a fost ales număru de noduri din stratul ascuns și esteegal cu numărul de noduri de intrare din stratul de intrare.

Stratul de ieșire pentru obiținerea rezultatului rețelei.

Y-variabila dependentă poate fi [0, 1] sau [risc crescut , risc scăzut de a dezvolta SM la pacienți diagnosticați cu OB, DZ1, DZ2].

(http://www.hindawi.com/journals/aaa/2014/207268/fig1/)

Figure :53.The topology of BP neural network. Note: is the th input variable of neural network, is the weight from the th node in the input layer to th node in the hidden layer, is the weight from the th node in the hidden layer to the th node in the output layer, and is the output of the neural network.

2.3.1.1Standardizarea de date.

Standardizarea datelor sau normalizarea este prima etapa în folosirea rețelei neuronale.

Procesarea datelor brute înainte ca rețeaua să calculeze. Vectorii de intrare și de ieșire sunt normalizați și apoi datele de intrare și de ieșire pentru instruirea rețelei nuronale BP sunt obținute conform următoarei formule:

, xi este valoarea de eșantion th a unei variabile.

2.3.1.2.Training de rețea/Instruirea rețelei

Rețeaua trebuie instruită înainte de a fi utilizată pentru a prognoza valoarea variabilei dependete(Y).structura rețelei trebuie inițializată conform reguli algoritmului BP .

Aplicând formula regresiei logistice mulivariabile.

F(x)=logit(x)=log()=Y

Y=β0+β1×1+β2×2+….+βixi +ε , β=constantă

β1 ,β2 ,βi=coeficient de moment

ε=eroare

(https://en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression 2015 )

P(X)=0, P(X)=anXn+an-1Xn-1+…+a1X1+a0 , -polinom , an coeficientii polinomului care pot fi numere reale sau complexe. (I.Iatan,2009, Laboratorul 5).

Y=variabile dependente (strat de ieșire), parametrii de ieșire.

x1,x2,xi=variabile independente(strat de intrare), parametrii de intrare (I.Iatan,2009, Laboratorul 12).

Apoi se introduc în rețea datele utilizate pentru instruirea rețelei. Se folosește algoritmul BP pentru a obține parametrii finali din rețea. În procesul instruirii rețelei, numărul de noduri din stratul ascuns nu este ușor determinat.Este folosită o metodă de aproximațiilor succesive pentru a confirma numărul de noduri.

2.3.1.3. Descrierea de BP Algoritm.

Algoritmul BP este utilizat în rețeaua neurală BP pentru a instrui rețeaua să performeze eficient în vederea calculării parametrilor finali.

Algoritmul este împărțit în 2 părții:

Instruirea de rețea

Testarea de rețea.

Etapele de algoritm BP sunt următoarele:

Etapa1 -inițializarea rețelei.Sunt inițializați unii parametri cum ar fi structura rețelei, numărul de noduri din fiecare strat, vectorul de intrare(X,D), unde ih ponderea dintre stratul de intrare și stratul ascuns, unde hj ponderea dintre stratul ascuns și stratul de ieșire, rata de învățare, η(a) coeficientul de moment α, eroarea medie pătratică maximă acceptabilă a epsilonului mașină al rețelei și alți parametri.

Etapa 2 se selectează un model și se trece la calcul rezultatului(output) stratului ascuns după cum urmează:

netkh k ih x k i a k i) ; =f(netkh) ;

neth este inputul nodului hth din stratul ascuns, este output nodului hth din stratul ascuns, ai este pragul de la nodul ith din stratul de intrare către nodul hth din stratul ascuns,

f(x)=1/(1) , k înseamnă iterarea kth și p este numărul de noduri din stratul de intrare. Apoi rezultatul stratului de ieșire se calculează după cum urmează:

netkj= k hj -bk i) , =(netkj) ,

kj= ,

netj este inputul nodului jth din nodul output. Aici

j=1, este output nodului jth din stratul output, bi este pragul de la nodul hth din stratul ascuns către nodul jth din stratul ascuns.

sau , și q este numărul de noduri din stratul ascuns.

Etapa 3.Se trece înapoi pentru a calcula eroarea de neuron începând de la stratul de ieșire după cum urmează: = , este eroarea nodului jth din stratul de ieșire și este corecția la . Apoi se calculează eroarea din stratul ascuns după cum urmează:

= ; = , unde este eroarea nodului hth din stratul de ieșire și ; este corecția la .

Etapa 4. Actualizați ponderile după cum urmează: , ;

Etapa 5.Calculați eroarea de output a rețelei după cum urmează: =2 . Dacă această valoare este mai mare decât eps , atunci se merge înapoi ka etapa 2 sau algoritmul se încheie. După etapele de mai sus rețeaua va fi instruită să ajungă la precizia presetată. Odată testată și evaluată de o serie de modele, rețeaua poate fi utilizată.[H.Xiaorui and L.Changchuan, "A preliminary study on targets association algorithm of radar and AIS using BP neural network" Procedia Engineering, vol.15, pp1441-1445, 2011]. (Evaluating the risk of metabolic syndrome based on an artificial intelligence model 2014 Hui Chen et al Hindawi).

MATLAB R 2009b versiunea 7.9.0529 ,12august 2009 MathWorks. MATLAB The Language of tehnical Computing www.mathworks.com/patents. compartibilă cu Windows XP. I.Iatan-"Îndrumător de laborator în Matlab 7.0"Ed.Conspress, București, 2009, Laboratorul 12.Funcții definite de utilizator în Matlab 7.0. și Laboratorul 5.Calcul numeric în Matlab 7.0 cu aplicații în Algebră

2.4.MDR(Multifactor dimensionality reduction software)pentru detectarea interacților gene-gene și gene-mediu.

O metodă utilizată în reducerea dimensiuni la o singură dimensiune.În genetica umană o provocare este identificarea polimorfismelor sau variantelor de secventă ADN, care prezintă risc crescut de boală.În cazul unei singure gene rare, tulburări Mendel, cum ar fi anemia falciformă sau fibroza chistică relația genotip-fenotip este ușor aparent, deoarece genotipul mutant este responsabil în mod explicit de boală.În cazul bolilor comune:hipertensiune, diabet zaharat, această relație este extrem de dificil de caracterizat deoarece boala este rezultatul mai multor factori genetici și de mediu și de fapt epistasis sau interacțiunea genă-genă este din ce în ce mai importantă și joacă un rol crucial în arhitectura bolilor genetice comune.Demensionalitatea implicată în evaluarea combinaților ale acestor variabile dimensionează rapid utilizarea metodelor statistice tradiționale, parametrice, cunoscut ca blestemul dimensionalității, ca număr de factori genetici sau de mediu, crește și numărul de interacțiuni posibile crește exponețial, multe celule ale tabelului de urgență, va fi lăsat cu foarte puține, dacă este cazul de puncte de date.În analiza regresiei logistice acest lucru poate duce la creșterea de erori de tip I și estimări parametrilor cu foarte multe erori standard.Metodele tradiționale care folosesc modelarea regresiei logistică sunt limitate în capacitatea lor de a face față mai multor factori și simultam nu pentru a caracteriza modele epistasis în absența efectelor principale, datorită procesului ierarhic de model de construire.Acest lucru duce la creșterea de erori de tip II și a reduceri puterii de lucru.Aceasta este o problemă deosebită cu dimensiuni relativ mici de probă.Deoarece colectarea probei este comună de timp și costisitor, putere scăzută poate face costul de studii eficiente. Pentru a răspunde acestor întrebări s-a utilizat o metodă de statistică, s-a dezvoltat MDR software. MDR reduce dimensiunea datelor multilocus pentru a îmbunătăți capacitatea de a detecta combinații genetice conferite ca riscul de boală.Am dezvoltat o abordare nonparametrică și geetică fără model numit MDR software pentru a detectarea interacțiunilor genotipurilor sunt reunite în grad ridicat de risc și a grupurilor cu risc scăzut reducând efectiv dimensiunea genotipurilor predictori de la N-dimensiuni la o dimensiune.O dimensiune nouă variabilă genotip multilocus este evaluat pentru abilitatea sa de a clasifica și prezice starea de boală folosind cross-validare și testarea premutare.Abordarea MDR este un model gratuit care nu îșî asumă orice model genetic particular este nonparametric deoarece nu estimează nici un parametru.În MDR genotipurile pot fi descrise ca "risc ridicat"și "risc scăzut" din grupuri pentru a reduce datele multidimensionale la o singură dimensiune, pentru că este o metodă non-parametrică.MDR a fost proiectat pentru a detecta gena-gena sau gene-mediu în seturile de date cu variabile categorice independente(Xi), cum ar fi polimorfisme unice de nucleotide(SNP) și alte variați de secvență(deleții), precum și datele de mediu care pot fi reprezentate ca variabile categorice. Obiectivul sau variabila dependentă(Y) trebuie să fie dihotomice cum ar fi caz/control pentru studii de boala la om.MDR e potrivit pentru orice tip de date cu 2 obiective distincte clinice.

MDR software cuprinde 6 etape generale pentru modelul de studiu caz/control utilizând 10 cross-validare.

Etapa 1. Al MDR implică împărțirea datelor într-un număr de părți egale pentru cross-validare.Cross-validarea permite estimarea erorii de predicție a unui model lăsând o parte a datelor ca un set de testare independent. Și se utilizează numărul egal de date în ambele loturi caz și control.

Etapa 2. Un set N discret de factori genetici sau de mediu este selectat din lista tuturor factorilor.

Etapa 3. N factorii și clasele lor multifactoriale sau celulele sunt reprezentante în spațiu N-dimensional.(2 polimorfisme rs680, rs689, fiecare cu 3genotipuri :++=0,+-=1,–=2 există 9 combinați de genotipuri cu 2 locus.Apoi raportul număr de cazuri(pacienți/persoane afectate)cu număr controale(sau neafctate/martori) este evaluat în cadrul fiecărei celule multifactoriale).

Etapa 4. În fiecare celulă multifactorială, spațiul N-dimensional este etichetat cagrad ridicat de risc în cazul în care raportul de cazuri pentru controale îndeplinește sau depășește un anumit prag T(de exemplu T=1,0) și cu risc scăzut dacă pragul nu este depășit, astfel modelul pentru cazuri și controale (afectați și neafectați) este format prin punerea în comun de celule marcate cu risc ridicat într-un grup și a celulelor marcate cu risc scăzut într-o altă grupă.

Etapa 5. Modul N-dimensional cu o dimensiune(o variabilă cu 2 clase multifactoriale, cu risc scăzut și cu risc ridicat).În cazul în care există cazuri dar nu există control, celula este etichetată cu risc ridicat iar dacă nu există controale și nu există cazuri, celula este etichetată cu risc scăzut. În final modului,utilizatorul poate decide dacă această este corectă.Toate combinațiile posibile de N factori evaluați pentru capacitatea lor de a clasifica persoanele afectate și neafectate în date de formare și în cel mai bun model N factori de selectat.

Etapa 6. Datele de test independent de eco-validare este utilizat pentru a estima eroare de predicție a modelului selectat în cele 5 etape pentru fiecare posibilă cross-validare. Etapele de la 1 la 6 sunt repetare de 10 ori cu divizarea datelor în 10 date de seturi de formare și de testare diferite.Datele sunt randomizate și alternate numai la începutul analizei. Coloanele reprezintă distribuția ipotetică de cazuri(stânga) și controale (dreaptea) cu fiecare combinație multifactorială.Celule întunecate reprezintă combinația genotipurilor cu grad ridicat de risc iar cele luminate cu risc scăzut.Fiecare set de date permutate și maxim cross-validare consecință și de eroare minimă de predicție identificate pentru estimarea unei valori P. După ce MDR identifică cele mai bune combinații de factori ultima etapă este de a determina care niveluri multifactoriale (genotipuri ) sun cu risc ridicat și care sunt cu risc scăzut, folosind întregul set de date.Această evaluare finală se realizează cu un prag raport care este determinată de raportul dintre numărul de persoane afectate împărțit la numărul de persoane neafectate în setul de date.MDR poate fi aplicat pentru punerea în evidență a maxim 3 niveluri/3genotipuri codificate 0,1, 2 pentru nivelurile factorilor genetici și de mediu.

Format de intrare.

Fișierul de intare poate fi în una din cele 2 formate: text format și restricționat format pre-makeped.În text format, date o singură persoană sunt reprezentate pe o singură linie.Prima valoare într-o linie este individul statutul bolii și toate valorile următoare se presupun a fi date genotipice sau date de mediu.Valorile trebuie să fie separate prin delimitatori non-numerice, cum ar fi spații, file sau virgule. Deși statusul bolii este de obicei de 1 pentru afectați și 0 pentru neafectați utilizatorul poate specifica valoarea asociată cu persoana afectată în fișierul de configurare.[Excel sau și text format].Comentarile pot fi incluse la începutul fișierului de date prin simpla deschidere a liniei cu un simbol alfabetic sau non-numeric. Formatul pre-makeped se referă la fișierele de intrare utilizate de utilitarul makeped(Terwilliger și Ott, 1994). Pentru o anumită linie, caractere de la 1 la 16 sunt folosite pentru a descrie ID-ul pedigree și alte atribute ale individului, caracterul 17 indică statusul bolii(1 nu este afectat și 2 este afectat). Este mai restrictiv decât makeped în care atributele individuale din datele trebuie să fie exact 16 caractere.Variabilele genetice sunt descrise în termeni de alele cu fiecare alelă separată printr-un spațiu.Variabele genetice și de mediu pot avea 2 sau 3 niveluri(genotipuri 0,1 sau 0,1,2) plus un nivel suplimentar pentru datele care lipsesc.(MDR software pentru detectarea interacției gene-gene și gene-mediu Lance W.et.al.1002 Bioinformatics).

3.Analiza statistică

Datele au fost reprezentate valoarea deviației medie ± și ca procent.One-Way ANOVA a fost aplicat pentru a evalua comparabilitatea seturilor de date de formare și validare în programul Quatro Pro 3X.

Echilibrul Hardy-Weinberg. Pentru markeri bialelici, și distribuția genotipurilor.(s-a utilizat pentru a identifica dacă în populația analizată acționează forțe care pot modifica frecvența alelelor analizate[3]. Formule:; și pentru frecvențele genotipurilor AA, AG, GG. . Frecvențele acestor genotipuri vor fi notate p2,2pq , q2, fiind o extensie a binomului -distribuția genotipurilor se află în echilibru genetic Hardy-Weinberg.[4].

Calcularea și interpretarea Odds-Ratio (calcularea riscului de boală conferit de genotipuri). Formule: OR);(Tabel 1). [14], OR, unde P+ = bolnavi care posedă genotipul+/+;P-=bolnavi care nu posedă genotipul +/+;C+=subiecții din grupul control+/+;C-=subiecții din grupul control care nu posedă genotipul+/+.OR atunci genotipurile sunt distribuite identic în loturile analizate, OR atunci genotipul conferă susceptibilitate pentru apariția bolii, cu cât valoarea OR este mai îndepărtată de 1 cu atât riscul pentru genotipul analizat este mai mare;OR atunci genotipul nu conferă risc statistic de apariție a bolii.Genotipul are efect protector , cu cât valoarea OR este mai apropiată de 1 cu genotipul analizat conferă o protecție mai mare față de apariția bolii.[1].

Rezultate și Discuții

Variabila de răspuns este riscul crescut,scăzut, normal pentru a dezvolta sindrom metabolic, obezitate, diabet zaharat de tip1, diabet zaharat de tip 2, iar variabile predictive sunt:vârsta,sexul.înălțimea, greutatea,CMI,HTA,stil de viață:fumător, consum alcool, regim alimentar,tratament, raportul 2D/4D, glicemie, colesterol total, trigliceride,HDL-Colesterol, LDL-colesterol,prezența/absența genelor INS și IGF2;Genotipul genei:+/+,+/-,-/+,-/-.(Tebel-Fișa de intrare a datelor).

Fișa de intrare a datelor in lucru.:clinice , de laborator si genetice.

Am considerat vectorii Xk =[ sex. Vârstă, înălțime, greutate, IMC, HTA, stil de viață:fumător, consum de alcool, regim alimentar, tratament, raport 2D/4D, glicemie, colesterol total, trigliceride, HDL-colesterol, LDL-colesterol, prezența /absența genelor INS și IGF2, genotipurile genei: +/+, +/-,-/-], variabile independente, strat de intrare ce conțin rezultatele pentru N=370 determinări experimentale(370 subiecți: 185 pacienți și 185 control). S-a realizat un fișier script în MATLAB R 2009b versiunea 7.9.0529 în care am calculat Y=[risc crescut=1, risc scăzut=0 de a dezvolta SM la pacienți diagnosticați cu OB, DZ1, DZ2], variabila dependentă sau stratul de ieșire, folosind formula regresiei logistice mulitivariabile :

, Y=variabile dependente (strat de ieșire), parametrii de ieșire.

x1,x2,xk=variabile independente(strat de intrare), parametrii de intrare

(I.Iatan, 2009 Laboratorul 12.)

ln()=β0+β1X1+β2X2+….+βiXi , ln()=βXi

Yi= βXi+ε

β0=constantă, β1 ,β2 ,βi=coeficient de moment , ε=eroare,

Yi0=β0Xi+ε 0

Yi1=β1X1+ε 1 Yi=

ln()=logit(p) => rezultat logaritmic al raportului de șansă.

Modelul de șansă OR (odds ratio) = .dacă p>0.5 => Y=1, Y= risc crescut de a dezvolta SM și este echivalentă OR>1 adică logit(p)>0 și dacă p<0.5 => Y=0, Y= risc scăzut de a dezvolta SM și este echivalentă OR<1 adică logit (p)<0.(https://en.wikipedia.org/wiki/Logistic_regression 2015)

Rețelei neuronale BP model de clasificare a riscului de a dezvolta SM, OB, DZ1 și DZ2.

Aici există 19 noduri stratul de intrare deoarece există 19 variabile explicative [vârsta,sexul.înălțimea, greutatea,CMI,HTA,stil de viață:fumător, consum alcool, regim alimentar,tratament, raportul 2D/4D, glicemie, colesterol total, trigliceride,HDL-Colesterol, LDL-colesterol,prezența/absența genelor INS și IGF2;Genotipul genei:+/+,+/-,-/+,-/-.].MS=Metsd.

Structura BPANN proiectat.

Etapa 1(normalizare date).

Etapa 2(formarea de rețele neuronale).

Aici datele normalizate de formare [vârsta,sexul.înălțimea, greutatea,CMI,HTA,stil de viață:fumător, consum alcool, regim alimentar,tratament, raportul 2D/4D, glicemie, colesterol total, trigliceride,HDL-Colesterol, LDL-colesterol,prezența/absența genelor INS și IGF2;Genotipul genei:+/+,+/-,-/+,-/-.]=toți cei 19 parametrii-fiecare nod corespunde un nod in stratul de intrare și date de instruire sunt folosite ca ieșire a rețelei neuronale de a instrui rețea.

Fig.5 programul MATLAB R2009b versiunea 7.9.0.529.compartibilă cu WINDOWS XP.

Fig.6.Programul MATLAB R2009b compartibil cu Windows XP.Rezultatul simulării programului.Editor: x=variabile independente cu parametri luați în lucru, y=variabila dependentă și formula calculată.și figura1 este rezultatul programului și y=[1,0,1,1,0]unde 1=risc crescut , 0=risc scăzut de a dezvolta SM.

Structura Rețelei Neuronale artificiale în MATLAB

BPANN=Rețele Neuronale Artificiale în biologie aplicând MATLAB.

/

Figure :7 The structure of the designed BPANN.Fig.6 .Structura BPANN=Rețele Neuronale Artificiale în biologie aplicând MATLAB utilizând datele clinice , de laborator si genetice în identificarea riscului de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2 ( http://www.hindawi.com/journals/aaa/2014/207268/fig3 )

BPANN=Rețele Neuronale Artificiale în biologie aplicând MATLAB.

Studiul nostru a verificat predicția de risc pentru SM, OB, DZ1, DZ2.Variabilele de intrare conțin 19 parametrii [vârsta,sexul.înălțimea, greutatea,CMI,HTA,stil de viață:fumător, consum alcool, regim alimentar,tratament, raportul 2D/4D, glicemie, colesterol total, trigliceride,HDL-Colesterol, LDL-colesterol,prezența/absența genelor INS și IGF2;Genotipul genei:+/+,+/-,-/+,-/-.] sunt semnificativi asociați cu SM, OB, DZ1,DZ2. Modelul de Rețele Neuronale Artificiale(ANN) identificat cu datele noastre folosind literatura de specialitate.

Individul 1diagnosticat cu SM având datele clinice, de laborator și genetice cu prezența/absența genei IGF2 genotipul +/+,+/-,-/+,-/- prezintă asociere directă/risc crescut/risc scăzut/normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2 în urma prelucrări în MATLAB.

Individul 2 diagnosticat cu OB având datele clinice, de laborator și genetice cu prezența/absența genei INS/ IGF2 genotipul +/+,+/-,-/+,-/- prezintă asociere directă/risc crescut/risc scăzut/normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2 în urma prelucrări în MATLAB.

Individul 3diagnosticat cu DZ1 având datele clinice, de laborator și genetice cu prezența/absența genei INS genotipul +/+,+/-,-/+,-/- prezintă asociere directă/risc crescut/risc scăzut/normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2 în urma prelucrări în MATLAB.

Individul 4 diagnosticat cu DZ2 având datele clinice, de laborator și genetice cu prezența/absența geneiINS/ IGF2 genotipul +/+,+/-,-/+,-/- prezintă asociere directă/risc crescut/risc scăzut/normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2 în urma prelucrări în MATLAB.

Individul 5 Control având datele clinice, de laborator și genetice cu prezența/absența genei INS/IGF2 genotipul +/+,+/-,-/+,-/- prezintă asociere directă/risc crescut/risc scăzut/normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2 în urma prelucrări în MATLAB.

Aplicarea MDR software

Am folosit programul MDR software versiunea 3.0.2 (20.02.2013 15:27 versiune3.0.2 http://sourceforge.net/projects/mdr/), am stimula un lot de 370 subiecți format din 185 date cazuri și 185 date control cu 2 polimorfisme rs680(gena INS) și rs689(gena IGF2) polimorfisme unice de nucleotide(SNP) pentru fiecare individ.

Scopul simulări a fost de a creea un set de date care a reprezentat o etiologie boală care a fost cauzată de interacțiunea a 2 SNP.Am descris modelul complex de interacțiune genă-genă cu 2 variabile în care (+/+),(+/-) sunt genotipuri cu risc ridicat de combinații și (-/-) este genotipul cu risc scăzut. Când frecvențele alelelor sunt egale nu au un efect de interacțiune puternic asupra riscului de îmbolnăvire și în absența a nici un efect principal sau independent pentru oricare din variațiile genetice și înseamnă că variațiile genetice nu afectează în mod independent riscul de îmbolnăvire și fiecare variație genetică are doar un efect asupra riscului de boală în contextul altor variații genetice.Interacțiunea gene-gene pot juca un rol important în determinarea la un individ riscul de dezvolta bolii comune precum:sindrom metabolic, obezitate, diabet zaharat de tip 1, diabet zaharat de tip 2.Următoarele valori ale penetranței au fost utilizate pentru a defini probabilitatea(P) și boala(D) având în vedere fiecare combinație specifică de genotipuri din cele 2 SNP funcționale:P(D/)(+/+))=1, P(D/)(+/-))=1, P(D/)(-/-)=0. Am analizat datele utilizând 10ori cross-validare și configurare se ia în considerare în MDR 6 variabile la un moment dat.

Fig.8.Prelucrarea datelor în programul MDR.

În MDR software datele clinice, de laborator și genetice sunt codificate cu 0 și 1. Și se iau în lucru loturi separate Control-SM, Control-OB, Control-DZ1 și Control-DZ2.Genotipurile celor 2 SNP:rs680(gena IGF2) și rs689(gena INS) sunt codificate pentru recesiv 0(-/-) și pentru dominant 1(+/+),(+/-) pentru a forma un nou atribut.

SNP1= rs689 pentru gena INS(Diabet zaharat de tip 1)

SNP= rs680 pentru gena IGF2 (Sindrom metabolic).

0 1 2

SNP1

h 2 =

H=

SNP 2 0 1 2

h 2 =

H=

SNP1

SNP2

h 2 =

H=

0= Risc scăzut de a dezvolta SM pacienți diagnosticați cu OB, DZ1 și DZ2

1= Risc crescut de a dezvolta SM pacienți diagnosticați cu OB, DZ1 și DZ2

MDR software este un model genetic particular non-parametric prin aceea că nu se estimează nici un parametru real. Se determină un cluster prin dendogramă pe baza asocierii genelor dar și a interacțiunii dintre gene-mediu.

În MDR se introduc datele celor 4 loturi codate.

Integrează – lotul pacienți DZ1 și control pe criterile sale(clinice, de laborator si genetice) care sunt codificate în 1 și 0 (tabel excel si text format) și determină echilibru hardy-Weinberg(X2)(p2) și Odds ratio.

– lotul pacienți DZ2 și control pe criterile sale(clinice, de laborator si genetice) care sunt codificate în 1 și 0 (tabel excel si text format) și determină echilibru hardy-Weinberg(X2)(p2) și Odds ratio.

-lotul pacienți OB și control pe criterile sale(clinice, de laborator si genetice) care sunt codificate în 1 și 0 (tabel excel si text format) și determină echilibru hardy-Weinberg(X2)(p2) și Odds ratio.

– lotul pacienți SM și control pe criterile sale(clinice, de laborator si genetice) care sunt codificate în 1 și 0 (tabel excel si text format) și determină echilibru hardy-Weinberg(X2)(p2) și Odds ratio.

5.Concluzii

Acest model ANN poate fi aplicat ca un instrument de prognoză pe baza informațiilor în identificarea pacienților care prezintă un risc crescut, scăzut, normal de SM, OB, DZ1 și DZ2. Poate ajuta medicii, biologicii și chiar pacienții în prevenția și reducerea riscului de SM, OB, DZ1, DZ2. Rețele neuronale joacă un rol cheie în procesul de luare a deciziei medicale, deoarece aceasta sunt eficiente în analiza multifactorială.Ea poate lua în considerare mai mulți factori în același timp prin combinarea și recombinarea factorilor în moduri diferite de a oferi instrumente de sprijin decizii adecvate pentru predicție, clasificare, diagnostic.Modelul BPANN este o abordare eficientă de clasificare pentru identificarea pacienților cu risc crescut, scăzut, normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2.MDR s-a folosit pentru detectarea și caracterizarea interacțiunii dintre gene-gene și gene-mediu cu efect asupra riscului de a dezvolta boli multifactoriale complexe, comune și poate fi utilizat pentru analiza interacțiunii dintre 15 factori genetici și de mediu la loturi foarte mari de subiecți și tot la fel de multe variabile nonparametrici luați în calcul fără datele reale.

CONCLUZII FINALE

Analiza parametrilor evaluați clinic și de laborator a celor 4 loturi de pacienți luate în studiu a permis comfirmarea următoare: Lotul 1prezintă sindrom metabolic la ambele sexe. Lotul 2 format din pacienți diagnosticați cu obezitate prezintă risc de a dezvolta sindrom metabolic la pacienți de sex masculin, la pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 care alcătuiesc lotul 3 cât și la cei diagnosticați cu diabet zaharat de tip 1 care alcătuiesc lotul 4, s-a constatat că riscul de a dezvolta sindrom metabolic este prezent atît la pacienții de sex feminin cît și la pacienții de sex masculin. Se poate afirma că pacienții de sex masculin prezintă risc crescut de a dezvolta sindrom metabolic în comparație cu pacienții de sex feminin.Sindromul metabolic poate fi cu ușurință folosit în practica clinică și, atunci când este evaluat pe baza criterilor de vârstă și sex, furnizând o dovadă a unui potențial risc cardiovascular. Interpretarea investigațiilor de laborator (biochimice și hematologice) prin metoda matematică ANOVA One Way are la bază 3 din criteriile propuse de Federația Internațională de Diabet în anul 2005 la Berlin și anume:Glicemie, Trigliceride, HDL-Colesterol , împreună cu alți parametrii din tabloul clinic al Sindromului metabolic(Vârstă, IMC, HTA), și investigații hematologice WBC, HGB, HVT.Concentrațiile mari indică că cele 3 criterii de diagnostic pentru sindromul metabolic sunt confirmate; acest material constituie baza pentru testarea unor biomarkerii genetici.

Polimorfismele din regiunea 11p15 sunt asociate cu creșterea riscului pentru apariția sindromului metabolic (rs680) pentru gena IGF2 și DZ1 (rs689) pentru gena INS.

Acest model ANN poate fi aplicat ca un instrument de prognoză pe baza informațiilor în identificarea pacienților care prezintă un risc crescut, scăzut, normal de SM, OB, DZ1 și DZ2. Poate ajuta medicii, biologicii și chiar pacienții în prevenția și reducerea riscului de SM, OB, DZ1, DZ2. Rețele neuronale joacă un rol cheie în procesul de luare a deciziei medicale, deoarece aceasta sunt eficiente în analiza multifactorială.Ea poate lua în considerare mai mulți factori în același timp prin combinarea și recombinarea factorilor în moduri diferite de a oferi instrumente de sprijin decizii adecvate pentru predicție, clasificare, diagnostic.Modelul BPANN este o abordare eficientă de clasificare pentru identificarea pacienților cu risc crescut, scăzut, normal de a dezvolta SM, OB, DZ1, DZ2.MDR s-a folosit pentru detectarea și caracterizarea interacțiunii dintre gene-gene și gene-mediu cu efect asupra riscului de a dezvolta boli multifactoriale complexe, comune și poate fi utilizat pentru analiza interacțiunii dintre 15 factori genetici și de mediu la loturi foarte mari de subiecți și tot la fel de multe variabile nonparametrici luați în calcul fără datele reale.

BIBLIOGRAFIE

ACPM,2009. American College of Preventive Medicine. All rights reserved. Metabolic Syndrome A Resource from the American College of Preventive Medicine A Clinical Reference The following Clinical Reference provides evidence to support the Metabolic Syndrome Time Tool.pag :4,12,13,14.

Abbas.Shania, Raza Tasleem Syed., Ahmed Faisal,Ahmad Absar,Rizvi Saliha Mahdi Farzana 2013.,Asociația de polimorfismul genetic al PPAR – 2 ,ACE , MTHFR , FABP – 2 și genele FTO în riscPredicția de diabet zaharat tip 2 Journal of Biomedical Stiinta 2013 , 20:80 http://www.jbiomedsci.com/content/20/1/80..

Abuissa H., Bel Ds, O'keefe JH Jr.Strategies to prevent type 2 diabetes.Curr Med Res Opin.2005 Jul;21(7):1107-14.

Alberti KG, Zimmet PZ. Diabet Med 1998; 15:539-553,Grundy, SM et. al. Circulation 2005; 112:2735-2752, Sindrom Metabolic,2012 ,pag 3. http://labtestsonline.org/understanding/conditions/metabolic/start/1http://labtestsonline.org/understanding/conditions/metabolic/start/1.

Alberti G,,Zimmet, P., Shaw J.,Grundy, Scott.M.,2006 IDF The IDF consensus worldwide definition of the METABOLIC SYNDROME.pag 10.

Albert K.G., et al., 10 aprilie 2013 Diabet Med. Sindrome Metabolic http://labtestsonline.org/understanding/conditions/metabolic/start/1http://labtestsonline.org/understanding/conditions/metabolic/start/1

BS-300 Mindray Chemistry analyzer, China.pag.3

BC-3000 Plus, Mindray Auto Hematology Analyzer, China.pag.4. www.mindray.com.

Blonde L, Ray S, Carson W, L'italien GJ.Metabolic syndrome predicts cardiovascular disease and new onset diabetes-a systematic review of the literature.Program and abstracts of the 65th Scientific Sessions of the American Diabetes Association; June 10-14,2005;San Diego,California.Abstract 2449-PO

Bonora E, The metabolic syndrome and cardiovascular disease.Ann Med.2006;38(1):64-80.

Borundel C.,2009; Medicină internă, Ed.All, București, pag: 681, 682,684, 687,688,689, 713,715,683.

Calciu 003007 Ed.2012/03 rev.00 www.giessediagnostics.com

Creatinină 006007 Ed.2013/01 rev.01 www.giessediagnostics.com

Colesterol 004507Ed.2013/01 rev.01www.giessediagnostics.com

Chiran Nina Monica, Licsandru Ana Maria,Cîinaru Cati Georgiana, 2013, Diabetul zaharat, Revista Română de Laborator medical,Ed.OBBCSSR,București, anul VIII, nr.29 martie,pag:43-45.

Cimponeriu Dan, 2007 Bazele genetice ale diabetului zaharat. Studii pe modele animale și în populațiile umane din România,Teză de doctorat, Universitatea din București, Facultatea de Biologie, pag 29-36, 35

Cimponeriu Dan., Corelarea polimorfismelor regiunii IDDM2 cu Diabet zaharat insulinodependent în populația caucaziană din România, Institutul de Genetică al Universității din București pag 2,

Cimponeriu Dan., Apostol Pompilia., Popa L.O.,Raicu Florina, Bordeianu Gabriela, 2005 Corelarea regiunii IDDM2 cu Diabet zaharat insulinodependent,articol Institutul de Genetică al Universității din București pag11 .

Clive J.Pertry Rachel V. Seear,Dianne L. Wingate,Lucy Manico, Carlo L. Acerini, Ken K. Ong, Ieuan A. Hughes and  David B. Dunger, 2010 Associations Between Paternally Transmitted Fetal IGF2 Variants and Maternal Circulating Glucose Concentration in Pregnancy http://diabetes.diabetesjournals.org/content/60/11/3090.full pag:5

Chesser Alistar, Steddon Simon,Ashman Neil, Cunningham John,2014,Oxford Handbook of Nephrology and hypertension Second Edition Oxford medical publications University press pag 463.

Cole C.,Barber J.D., Barton G.J.,(2008) The Jpred 3 secondary structure prediction server Nucleic Acids Research, 36 w197-w201No jobs ran. Jalview. Versiunea 2.8.

Covic Mircea, Ștefănescu Dragoș, Sandovici Ionel 2011 Genetică medical ediția a IIa reviyuită și actualizată editura polirom Iași pag: 333,471,486,480,481,482,478,479.

Cristea-Popa Elena, Popescu Aurora, Truția E., Dinu Veronica, 1991, Tratat de biochimie medicală vol I, Editura Medicală București pag 528.

Cristea-Popa Elena, Popescu Aurora, Truția E., Dinu Veronica,1991, Tratat de biochimie medical, vol.II., ed.Medicală, București pag 271,561-562

Dinischiotu Anca, Costache Marieta, 2004, Biochimie generală proteine, glucide, lipide,Vol.I.,Ed. Ars Docendi, București, pag 99, 207.

Dobreanu Minodora, 2010,Biochimie clinică implicații practice, Ediția aIIa, Ed. Medicală, București, pag.113,127.

Dobjanschi Carmen, 2015, Diabet zaharat sau "epidemiologia secolului" ,CDNBM-Spital Clinic N.Malaxa, București pag2.

Dominiczak Anna F. Negrin C. Domingo, Clark S.James, Brosnam M.Julia, McBride W.Martin, Alexander M. Yvonne, 2000 From Gene Mapping in Experimental Models to Vascular Gene Transfer Strategies Genes and Hypertension, Hypertension. 2000 ;35 164-172 doi 10.1161-01.HYP.35.1.164 https://hyper.ahajournals.org/content/35/1/164.full pag 2

Dumitrache C., 2008, Endocrinologie… de la A la Z-dicționar enciclopedic Editura Național, București pag 158, 257-258,380,382, , 461,526,530, 534, 714-715.

Eberhard Passarge James Lafayette German, 2007, Color atlas of genetics Diabetes metilus Georg Thieme Veriag KG, Stuttgargt-New Yorg pag 372

Flonta Maria-Luisa ,Racottă Radu, 2012, Metabolismul energetic uman descriere cantitativă, Editura Universității din București pag 71,72..

Flegal KM, Carroll MD, Ogden CL, Johnson CL.,2002, Prevalence and trends in obesity among US adults, 1999-2000.JAMA.2002 Oct9;288(14):1723-7,pag.1724.

Ford ES.Risks for all-cause mortality,cardiovascular disease, and diabetes associated with the metabolic syndrome: a summary of the evidence.Diabetes Care.2005 Jul;28(7):1769-78.

Ford ES., Li C.,Sattar N.Metabolic syndrome and incident diabetes:current state of the evidence.Diabetes Care.2008 Sep;31(9):1898-904.

Ford ES, Li C, Metabolic syndrome and health-related quality of life among U.S.adults. Ann Epidemiol.2008 Mar;18(3):165-71

Ford ES,Zhao G,Li C,Pearson WS, Mokdad AH.Trends in obesity and abdominal obesity among hypertensive and non-hypertensive adults in the United States.Am J Hypertens.2008 Oct,21(10):112-8 pag.116.

Glucoză 405707Ed.2012/03 rev.00www.giessediagnostics.com

Gaiță Dan,Hâncu Nicolae,2013, Ghid ESC de Diabet,Pre-Diabet și Boli cardiovasculare elaborat în colaborare cu EASD, Romanian Journal of Cardiology Vol.23. www.mediamed.ro pag.17,30(Ghidul ESC de Diabet și boli cardiovasculare Romanian of Cardiology, Vol.23 Supplement D,2013 pag 30.

Genel Sur, Caius Duncea 2003,Hipertensiune arterială la copil și adult Ed. Casa cărții de ștință,Cluj-Napoca,pag. 15,54,42,43,121,113.

Greabu Maria ,Totan Alexandra, Mohora Maria, Dricu Anica, Pârvu Alina Elena, Motoc Marilena,2014, Ghid de biochimie medical Editura curtea Veche București www.obbcssr.ro , pag 212,294.

Gherasim L.,2004,Medicină internă Ed.aIIa.,Revizuită și adăugată Bolile cardiovasculare metabolice partea aIIa.Ed.Medicală,București,pag 1617.

Hanley AJ, Karter AJ, Williams K et al.Prediction of type 2 diabetes mellitus with alternative definitions of the metabolic syndrome:the Insulin Resistance Atherosclerosis Study.Circulation.2005 Dec 13;112(24):3713-21.

HDL-Colesterol 002107 Ed.2013/01 rev.01www.giessediagnostics.com

Hinkle, D.E., Wiersma, W., Jurs, S.G. (1994). Applied statistics for the behavioral sciences (3rd.). Boston, USA: Houghton Mifflin Company.

Helen V.Firth, Jane A.Hurst.Advisory Editor Judith G.Hall.,2003 OXFORD DESK REFERENCE CLINICAL GENETICS, OXFORD University press , pag 203,206

Humphrey, W., Dalke, A. and Schulten, K., "VMD – Visual Molecular Dynamics", J. Molec. Graphics, 1996, vol. 14, pp. 33-38. VMD.versiunea 1.9.1.

Hui Chen, Shenghua Xiong, Xuan Ren, 2014 Volume 2014, Article ID207268 pages 12 Evaluating the Risk of Metabolic Syndrome Based on an Artificial Intelligence Model Abstract and Applied Analysis http://dx.doi.org/10.1155/2014/207268 pag 1,2, 3.

Hu FB, Stampfer MJ, Haffner SM, Solomon CG, Willett WC, Manson JE.Elevated risk of cardiovascular disease prior to clinical diagnosis of type 2 diabetes.Diabetes Care.2002;25:1129-1134

Ionescu C.,Lichiardopol R.,Dobjanschi Carmen.,Guja C.,Culman Mirela., brădescu O.,Bojin Andrada.,2006,Diabetul zaharat de tip 2 Ghid terapeutic pentru medicul de familie,Jurnalul Român de Diabet,Nutriție și Boli Metabolice/Vol.13/nr.4/2006 pag 233.

Jameson Larry J., Drugău Cristina,2014. Harrison.Endocrinologie, Ed.All, București,pag 255, 256 , 265-267,234,236,237,254,331.

JiamSripong P, Mookadam M, Honda T, 2008 The metabolic syndrome and cardiovascular disease: Part I. Prev Cardiol. 2008 Summer,11(3):155-61.

Kasper D.,Fauci A., Longo D., Hauser S., Jameson L.,2005, Harrison’S Principles of internal medicine 16th edition traducere selectivă pentru examenul de rezidențiat ,Ministerul Sănătății-Centrul Național de Prefecționare în Domeniul Sanitar, Editura Medicală București pag 43, 51

Knut Borch-Johnsen ,H.Beck-Nielsen, 2013, Epidemiology of the Metabolic Syndrome , The Metabolic Syndrome Springer-Verlag Wien doi.10.1007/978-3-7091-1331-8_2 pag 7.

Koster A,Leitzman MF,Schatzkin A,et al.Waist circumference and mortality.Am J Epidemiol.2008;167:1465-1475

LDL-Colesterol 002307 Ed.2012/03 rev.00www.giessediagnostics.com

Lim HS, Lip GY,Beevers DG,Blann AD.Factors predicting the development of metabolic syndrome and type II diabetes against a background of hypertension.Eur J Clin Invest.2005 May;35(5):324-9.

Lorenzo C,Okoloise M, Williams K et all.The metabolic syndrome as predictor of type 2 diabetes:the San Antonio Heart study.Diabetes Care.2003 Nov;26(11):3153-9

Le Stunff, C., Fallin, D., Bougneres, P. 2001,Paternal transmission of the very common class I INS VNTR alleles predisposes to childhood obesity. Nature Genet. 29: 96-99, 2001. [PubMed: 11528401, related citations] [Full Text:Nature Publishing Group]

Leslie J. De Groot et al(Morris F.White;Martin G.Mzers Jr.),2001, Chapter 50. The Molecular Basis of Insulin Action Endocrinology, vol.1, Ediția a4a., W.B.SAUNDERS COMPANY pag.710-711.

Magneziu 009607 Ed.2012/10 rev.01www.giessediagnostics.com

Mincu Iulian, 1976, Diabet zaharat în condiții de muncă și odihnă,Ed. Sport-Turism,București, pag 55

Mincu Iulian, 1977, Diabet zaharat(fiziopatologie, clinică, complicații), Ed. Medicală, București, pag 432.

Mincu I., Hâncu N., 1977, Boli cronice degenerative, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, pag:17, 72, 80,83.

Marinescu Șerban 2002 Sindroame clinice cu evoluție gravă. Elemente de bază în terapia de suport.Note de curs.Editura Sylvi București pag 116.

Mark P.Keller, Choi Y., Wang P., Davis DB., Rabaglia ME., Oler AT., Stapleton DS., Argmann C., Schueler KL., Edwards S., Steinberg HA., Chaibub Neto E., Kleinhanz R., Turner S., Hellerstein MK., Schadt EE., Yandell BS., Kendziorski C., Attie AD.,2008, A gene expression netword model of type 2 diabetes links cell cycle regulation in islets with diabetes susceptibility, Genome Research 2008 May;18(5):706-16.doi.10.1101gr.074914.107.Epub. http://genome.cshlp.org/content/18/5/706.full pag 707),

Marmel Elaine,Que Publishing,8 feb.2006- pag.352, Absolute Beginner’s Guide to Quattro Pro X3 is endorsed by Corel.

Meerarani P.,Badimon JJ., Zias E.,, Fuster V., Moreno PR.,2006, Metabolic syndrome and diabetic atherothrombosis:implications in vascular complications.Curr.Mol.Med.2006 Aug6(5):501-14

Meigs, J. B., Dupuis, J., Herbert, A. G., Liu, C., Wilson, P. W. F., Cupples, L. A. The insulin gene variable number tandem repeat and risk of type 2 diabetes in a population-based sample of families and unrelated men and women. J. Clin. Endocr. Metab. 90: 1137-1143, 2005. [PubMed: 15562019, related citations] [Full Text: HighWire Press].

Meigs JB,Wilson PW,Fox CS,Vasan RS,Nathan DM,Sullivan LM, D'Agostino RB.Body mass index, metabolic syndrome and risk of type 2 diabetes or cardiovascular disease.J Clin Endocrinol Metab.2006 Aug;91(8):2906-12.

Mihăescu Gh, Cifiriuc Carmen, Dițu Lia-Mara, 2009, Imunobiologie, Editura Universității din București pag 416

Mihăescu Grigore, Chifiriuc Carmen, 2015 Imunologie și imunopatologie, Editura Medicală, București pag 510.

Miaoxin Chen, Anne Macpherson, Julie Owens, Gary Wittert, Leonie K. Heilbronn DOI : http://dx.doi.org/10.7243/2050-0866-1-16 © 2012 Heilbronn et al; licensee Herbert Publications Ltd, Obesity alone or with type 2 diabetes is associated with tissue specific alterations in DNA methylation and gene expression of PPARGC1A and IGF2. http://www.hoajonline.com/jdrcm/2050-0866/1/16

Mihele Denisa, 2000, Biochimie clinic,Metode de laborator, Ediția aIIa, Editura Medicală, București pag 81.

Năstoiu Ioana,2011,Bolile și analizele medicale pe înțelesul tuturor,Ed. Niculescu,București pag 87

Narayanan RP, Fu B, Payton A, Hudson JE, Oliver RL, Anderson SG, Siddals KW, White A, Ollier WE, Heald AH, Gibson JM. Exp Clin Endocrinol Diabetes. 2013 Jun;121(6):361-7. doi: 10.1055/s-0033-1345122. Epub 2013 Jun 6. IGF2 gene polymorphisms and IGF-II concentration are determinants of longitudinal weight trends in type 2

diabetes.http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23757053

Ogden CL, Flegal KM,Johnson CL.,2002,Prevalence and trends in overweight among US children and adolescents, 1999-2000.JAMA.2002Oct 9;288(14):1728-32 pag 1729.

Okosun IS, Chandra KM,Boev A,Boltri JM,Choi ST,Parish DC,Dever GE,Abdominal obesity in U.S. adults: prevelance and trends,1960-2000.Prev Med 2004 Jul;39(1):197-206.

O’Neill S., O’Driscoll L., 2014 Metabolic syndrome:a closer look at the growing epidemic and its associated pathologies. Etiology and Pathophyaiology/Obesity Comorbidities Obesity reviews doi:10.1111/obr.12229 pag 7.

Pavel Ana Brândusa, Cristian Vasile ,2011, Facultatea de Automatică și Calculatoare specializarea B3,Universitatea Politehnică din București, . softul PyElph versiunea 1.4.update versiunea 2.6.5.

Pavel Ana Brândusa, Cristian Vasile ,2012,Software PyElph-a software tool for gel images analysis and phylogenetics,BMC Bioinformatics,2012,13:9. http://www.biomedcentral.com/1471-2105/13/9.

Paveliu Fraga Silivia, 2002 Supraponderalitatea și obezitatea de la prevenție la tratament,Ed. INFO Medica,București, pag 9,29-31.49,47,50.

Poiană Cătălina, 2011, Obezitate, Sindrom metabolic-suport de curs, Catedra de Endocrinologie, UMF˝Carol Davila˝,Institul˝C.I.Parhon˝,București, WHO report,2007.pag.2.41.

Pârcălăboiu Lucreția 2010 Prevalence of Metabolic Syndrome in an Adult Population from Târgu-Jiu Applied Medical Informatics Vol 27, No 3/2010, pp23 published 30 september 2010

Restian Adrian ,2013 Bazele medicinei de familie ed a IIIa revizuită Ed Medicală București pag 1307,1361,1362, 1636,1640,1651,1655,1656,1665.

Rodriguez, S., Gaunt, T. R., O'Dell, S. D., Chen, X., Gu, D., Hawe, E., Miller, G. J., Humphries, S. E., Day, I. N. M.Haplotypic analyses of the IGF2-INS-TH gene cluster in relation to cardiovascular risk traits. Hum. Molec. Genet. 13: 715-725, 2004. [PubMed: 14749349, related citations] [Full Text: HighWire Press

Romesh Khardori, George T Griffing, Howard A Bessen, Barry E Brenner, William L Isley,Kenneth Patrick L Ligaray,Anne L Peters, David S Schade, Don S Schalch, Erik D Schraga,Francisco Talavera, Scott R Votey,Type 2 Diabetes Metllius, 2011. http://emedicine.medscape.com/article/117853-overview

Sava, F. (2002). Pagina de statistică socială. http://statisticasociala.tripod.com

Sfîrlează Vasile,1977, Ghidul diabetului,Ed. Scrisul românesc,Craiova, pag 73, 83,84.

Santoro, N., Cirillo, G., Amato, A., Luongo, C., Raimondo, P., D'Aniello, A., Perrone, L., del Giudice, E. M. Insulin gene variable number of tandem repeats (INS VNTR) genotype and metabolic syndrome in childhood obesity. J. Clin. Endocr. Metab. 91: 4641-4644, 2006. [PubMed: 16868061, related citations] [Full Text: HighWire Press]

Sheldon G.Sheps 2000, Clinica Mayo-despre hipertensiunea arterială, Ed.All, București pag 18-22.,8, 16,17-25.19,23,47.

Smith AG., Muscat GE.,2005,Skeletal muscle and nuclear hormone receptors:implications for cardiovascular and metabolic disease.Int.J.Biochem.Cell.Biol.2005 Oct.37(10):2047-63)

Stanley S Wang,2010 Metabolic Syndrome pag 4 http://emedicine.medscape.com/article/165124-overview

Stoy, J., Edghill, E. L., Flanagan, S. E., Ye, H., Paz, V. P., Pluzhnikov, A., Below, J. E., Hayes, M. G., Cox, N. J., Lipkind, G. M., Lipton, R. B., Greeley, S. A. W., Patch, A.-M., Ellard, S., Steiner, D. F., Hattersley, A. T., Philipson, L. H., Bell, G. I. Insulin gene mutations as a cause of permanent neonatal diabetes. Proc. Nat. Acad. Sci. 104: 15040-15044, 2007. [PubMed: 17855560, related citations] [Full Text: HighWire Press

Șomordolea Florina Sindromul X metabolic-contribuția medicului de familie la diagnostic și terapie nr.5 2015 Medicină internă http//:www.medicină-internă.ro/articol.php?articol=754&lang=ro. pag 2.

Toma Laura , 12 iulie 2010, România XXL: locul trei la obezitate în Europa, http://www.romanialibera.ro/actualitate/eveniment/romania-xxl–locul-trei-la-obezitate-in-europa-193494.

Testul ANOVA-analiză de varianță (Hinkle, Wiersma și Jus, 1994, apud Sava, 2002) Quattro Pro X3 2007.

Trigliceride 007507 Ed.2013/01 rev.01www.giessediagnostics.com

Tiinamaija Tuomi , 2005 Taype 1 and Type 2 Diabetes What Do They Have in Common? doi:10.2337/ diabetes.54.suppl_2.S40 Diabetes December 2005 vol. 54no. suppl 2 S40-S45 http://diabetes.diabeetesjournals.org/content/54/suppl_2/S40.full

Voiculescu M., 1990 Medicină generală vol 1Editura Medicală, Bucurști, pag 353,354.

Vassu -Dimov Tatiana, Csutak Ortansa, Stoica Ileana, Mușat F.,2001,Genetica microorganismelor și inginerie genetică microbiană-Note de curs și tehnici de laborator.Editura Petrion,București,pag:76-82

Wannamethee SG, Shaper AG, Lennon L, Morris RW.Metabolic syndrome vs Framingham Risk Score for prediction of coronary heart disease,stroke, and type 2 diabetes mellitus.Arch Intern Med.2005 Dec 12-26;165(22):2644-50.

Wilson PW,D'Agostino RB,Parise H,Sullivan L,Meigs JB.Metabolic syndrome as a precursor of cardiovascular disease and type 2 diabetes mellitus.Circulation.2005 Nov 15;112(20):3066-72.

Uree 416407 Ed.2012/03 rev.00www.giessediagnostics.com

Acid uric 405907 Ed.2013/01 rev.01www.giessediagnostics.com

Zarich SW.Metabolic syndrome, diabetes and cardiovascular events:current controversies and recommendations.Minerva Cardioangiol,2006April;54(2):195-214.

Zetu Cornelia,2012, Sindromul metabolic-suport de curs, UMF˝Carol Davila˝,București,pag.2.

www.giessediagnostics.com Giesse Diagnostics srl Via Cervinara, 45 – Colle Prenestino – Roma – Italia. Tel. +39 06 22429353 / +39 06 22429097 – Fax +39 06 22429098 005607 e-mail: info@giessediagnostics.com – web site: www.giessediagnostics.com Ed. 2012/03 rev. 00 .

http://www.farmaciata.ro/afectiuni-cardiovasculare/item/831-sindromul-metabolic-risc-crescut-pentru-bolile-coronariene.

Home

http://www.emedicine.medscape.com/article/165124-overview Stanley S.Wang,2003, Metabolic Syndrome

http://www.heart.org/HEARTORG/Conditions/More/MetabolicSyndrome/Why-Metabolic-Syndrome-Matters UCM301922 Article.jsp. 29Mar 2012)

http:///www.heart.org/HEARTORG/Conditions/More/MetabolicSyndrome/Your-Risk-for-Metabolic-SyndromeUCM301924Article.jsp.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1665/

http://labtestsonline.org/understanding/conditions/metabolic/start/4

http://labtestsonline.org/understanding/conditions/metabolic/start/3 2015 Metabolic Syndrome Lab Tests Online Empower Your Health, Understand Your Tests pag 5.

http://ghr.nlm.nih.gov/gene/INS Genes INS pag 1.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1662/.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622 The Genetic Landscape of Diabetes [Internet]. The Story of insulin. Insulin Synthesis , 2004 Bookshelf ID: NBK1671) .

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622 The Genetic Landscape of Diabetes [Internet].The Insulin Hormone (INS) 2004 Bookshelf ID: NBK1671).

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622 The Genetic Landscape of Diabetes [Internet].INS and Diabetes:Digest of Recent Articles, 2004 Bookshelf ID: NBK1671).

http://www.omim.org/entry/176730 *176730ICD+ INSULIN; INS

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1671/#A622 pag 75.

http://ghr.nlm.nih.gov/dynamicImages/chromomap/INS.jped

http://ghr.nlm.nih.gov/gene/INS Genes INS pag 1

http://en.wikipedia.org/wiki/Insulin-like_growth_factor_2 .

http://ghr.nlm.nih.gov/geneIGF2 . Gnes IGF2, 2008)

http://ghr.nlm.nih.gov/dynamicImages/chromomap/IGF2.jpeg Genes IGF2,2008.

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IGF2 Genatlas biochemistry entry for IGF2

http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=IGF2 Insulin-Like Growth Factor2(Somatomedina A).

http://www.uniprot.org/uniprot/P01344 UniProt KB/Swiss-Prot:IGF2_HUMAN, P01344

http://www.uniprot.org/uniprot/P01344 pag 120 Insulin-like growth factor II(IGF2) Homo sapiens PO1344-IGF2-HUMAN

www.wikipedia.ro/IGF2 pag3 IGF2.

http://en.wikipedia.org/wiki/Metabolic_syndrome.

LUCRARII PUBLICATE

Sesiunea de Comunicări Științifice a Studenților Facultății de Biologie – Ediția 2014 30 mai Markeri biochimici și hematologici de evaluare a Sindromului Metabolic Autor principal: Doctorand Stanislav Alexandra-Alina Coordonator științific: Prof. Dr. Tatiana Vassu Dimov.

Biochemical markers and hematological evaluation Metabolic Syndrome Scientific Communication Alina Alexandra Stanislav * Natalia Cucu * Felicia Matefi **, Tatiana Vassu-Dimov *. * University of Bucharest, Faculty of Biology, Department of Genetics ** Giurgiu County Hospital, Clinical Bacteriology Laboratory E-mail: SAalexy@yahoo.com Copie poster și certificat simpozion BAHH,20-22mai 2014,Academia Româna București.

Bahh poster comun

Sesiunea de Comunicări Științifice a Studenților Facultății de Biologie – Ediția 2015 Testarea asocierii dintre rs689 și rs680 din regiunea INS-IGF2 și sindromul metabolic, obezitate și diabet zaharat Autor principal: Alexandra Alina Stanislav Coordonator științific: Prof. dr. Tatiana Vassu-Dimov.

Gen etica

L-selection gene p213s polymorphism implication in some human pathologies din 23octombrie 2015 este trimis spre publicare în revista RBL