FACTORI DE RISC CU PENETRANȚĂ REDUSĂ ÎN FORMELE SPORADICE DE CANCER DE SÂN [304527]
I. [anonimizat].
1.1. Incidență
Riscul de a dezvolta o boală malignă pe parcursul vieții a crescut foarte mult în ultimele decenii. Recent s-a estimat că la nivel global 1 din 3 bărbați și 1 din 4 femei pot dezvolta o astfel de boală pe parcursul vieții (până la vârsta de 79 ani)(American Cancer Society, 2019). În anul 2017 s-a estimat că numărul de cazuri la nivel mondial a atins valoarea de 24,5 milioane cazuri (Fitzmaurice et al., 2019). Atingerea acestei valori reflectă tendința de creșterea semnificativă a numărului de cazuri de cancer de sân înregistrată la nivel global în ultimele decenii. [anonimizat], creșterea speranței de viață după diagnostic reprezintă o parte dintre factorii care au contribuit la creșterea numărului de cazuri diagnosticate de cancer de sân.
Bolile maligne reprezintă o cauza importantă de deces. În anul 2018 au fost înregistrate 9,6 milioane decese (~1 din 6 decese) atribuite cancerului. Dintre acestea, 70% s-au înregistrat în țările moderat dezvoltate sau în cele aflate în curs de dezvoltare. În funcție de localizarea tumorii cele mai multe decese au fost cauzate de neoplazii pulmonare (1760000 decese), colorectale (862000), de stomac (783000), ficat (782000) și sân (627000) (WHO, 2018),(Bray et al., 2018).
Cancerul de sân a devenit una dintre cele mai comune boli maligne care apar la femei; în topul frecvenței acesta este devansat doar de cancerul pulmonar (Siegel, Miller and Jemal, 2018), (Edwards et al., 2005), (El Saghir et al., 2007). Cazurile noi de cancer de sân reprezintă până la 32% din numărul total de cazuri de cancer identificate anual (ex. [anonimizat] 2014, au fost 230000 cazuri noi; în Marea Britanie, ~36900 cazuri/an) (Howlander et al., 2019), (Siegel, Miller and Jemal, 2017). Incidența bolii în populația din România a ajuns la valori comparabile cu cele raportate pentru țările vestice (ex. în 2018 au fost diagnosticate ~9629 cazuri noi de cancer) (Globocan, WHO, 2017).
1.2. Clasificare
În anii 1960 s-a analizat modul în care sunt distribuite decesele cauzate de cancerul de sân (cârligul lui Clemmesen) pe grupe de vârstă. Rezultatele au sugerat că există două forme de boală care se pot defini în raport cu menopauza (Manton and Stallard, 1980),(Kristensen, 2014). Acestea au fost printre primele date care au susținut existența unor subtipuri de boală.
Din punct de vedere histopatologic au fost identificate mai multe subtipuri de boală; dintre aceste tipuri cel mai frecvent este identificat carcinomul ductal in situ (Weigelt, Peterse and Van’t Veer, 2005). In funcție de exprimarea receptorului pentru estrogen (ER) au fost descrise tumori pozitive (ER+) sau negative (ER-).
[anonimizat]. Formele unilaterale sunt mult mai frecvente (97,40 – 99,00%) comparativ cu cele bilaterale.
Alte sisteme populare de clasificare sunt: [anonimizat].
În funcție de agregarea familială a cazurilor cancerul de sân a fost considerat sporadic sau familia. Formele sporadice sunt caracterizate prin incidență crescută (75-80% dintre toate cazurile de cancer de sân) (Frank et al., 2015),(Ahern et al., 2017),(Frank et al., 2017) debut clinic mai frecvent după instalarea menopauzei și arhitectură genetică complexă. Arhitectura genetică a formelor sporadice de boală este parțial cunoscută. Numărul mare de factori care pot să predispună la boală și perioada îndelungată de timp în care aceștia acționează, cresc dificultatea identificării presimptomatice a persoanelor care vor dezvolta boala (Kelsey, 1993). Formele de cancer care prezintă agregare au fost diferențiate în familiale și ereditare. Formele familiale sunt caracterizat prin: predispoziția complexă, incidență mai redusă (10-15% dintre cazuri) (American Cancer Society, 2019), debut precoce și tendință de agregare familială. Formele ereditare de cancer de sân sunt caracterizate prin: incidență redusă (1-5% dintre cazuri), tendință de agregare familială și determinism genetic mai simplu, care include mutații cu penetranță crescută. Spre exemplu pacientele care moștenesc mutații în genele BRCA1 și 2 au un riscul de a dezvolta cancer de sân și/sau ovar, pe parcursul vieții, cu 80% mai mare comparativ cu persoanele care nu au aceste mutații. Formele ereditare de boală sunt cel mai bine caracterizate din punct de vedere genetic motiv pentru care acestea sunt recomandate pentru testarea genetică.
Progresele înregistrate în ultimele decenii în domeniile -omice au permis caracterizarea tot mai detaliată a celulelor tumorale și la descrierea unui număr tot mai mare de subtipuri de cancer de sân și de sisteme de clasificare (Gilcrease, 2015). Încă din anii 2000 s-a propus clasificarea bolii pe baza nivelurilor de expresie genică (ex. gene care codifică receptori pentru estrogeni și progesteron sau pentru factori de creștere – HER2) (Perou et al., 2000), (Sørlie et al., 2001). Particularitățile genetice ale celulelor tumorale a permis diferențierea următoarelor forme de cancer de sân: Luminal A, Luminal B, Bazal, HER2, Claudin-low și neclasificabil (Perou et al., 2000),(Sørlie et al., 2001), (Hedenfalk, 2006), (Kittaneh, Montero and Glück, 2013). Se consideră că profilul Luminal A are cel mai bun prognostic iar la polul opus se găsesc pofilele Luminal B și Bazal.
În anul 2012 s-a propus clasificarea bazată pe combinarea datelor de expresie genică cu cele referitoare la numărul de copii genice (CNVs); rezultatele au permis diferențierea a 10 subgrupe integrate de cancer de sân (Curtis et al., 2012). Identificarea unor noi mutații somatice care au semnificație patologică dovedită (ex. mutații în locusul PIK3CA) a adus noi clarificări privind sistemul de clasificare și a permis explicarea unor diferențe privind speranța de viață a pacientelor care au anumite tipuri particulare de tumori (ex. tumori de tip ER+) (Pereira et al., 2016).
Un alt nivel de clasificare a fost obținut prin utilizarea datelor de tip ARNm, microARN (miARN), numărul de copii ADN și metilare. Pe baza acestor date s-au identificat o serie de particularități biologice și imune ale cancerului de sân (preinvaziv sau invaziv) (Kristensen et al., 2012). Datele referitoare la profilurile de expresie genică, proteică și metabolică au permis regruparea tumorilor glandei mamare în trei profile metabolice distincte (Haukaas et al., 2016).
Clasificarea tumorilor glandei mamare este importantă și pentru îmbunătățirea strategiilor de prevenție, tratament (identificarea de noi ținte terapeutice), a prognosticului, a creșterii calității vieții pacienților și a consilierii pe care aceștia o primesc (Rosa, 2015). De asemenea, aceste informații pot să explice de ce pacienții care sunt similari din punct de vedere clinic sau histologic răspund diferit la tratament și au o speranță de viață diferită.
În România mai mult de 60% din pacientele cu cancer de sân sunt diagnosticate în stadii avansate ale bolii (III și IV). În aceste stadii avansate de boală speranța de viață este scăzută iar costurile directe și indirecte alocate acestei boli sunt ridicate. O serie de factori (ex. ignoranța, spaima de diagnostic, lipsa educației sanitare, aspectele socio-economice) pot să contribuie la această model de identificare a cazurilor noi.
1.3. Complexitate
Armitage și Doll (1954) au lansat ipoteza privind evoluția stadială a tumorilor (Armitage and Doll, 1954). Evoluția stadială a fost observată și în cazul cancerului de sân. În anii următori s-au identificat o serie de factori genetici și non-genetici care pot să influențeze riscul apariției bolii sau particularitățile sale clinice (ex. vârsta la debut, modelul evolutiv, răspunsul la tratament) (Ahmad, 2013), (Fuglede et al., 2006). Complexitatea și heterogenitatea cancerului de sân s-au observat la nivel:
– genetic (ex. poligenia, pleiotropia, mutații cu penetranță incompletă sau fondatoare);
– epigenetic (anomalii ale marcajelor epigenetice în diferite regiuni din genom alterează expresia unor gene supresor de creștere tumorală sau protooncogene și astfel, contribuie la alterarea controlului ciclului celular și implicit la modificarea progresiei tumorale) ;
– fiziopatologic (ex. căi fiziopatologice diferite pot să determine un fenotip identic) ;
– fenotipic (ex. celulele tumorale pot să dobândească caracteristici noi, inclusiv rezistența la tratamentul cu citostatice) ;
– populațional (ex. incidența bolii, stadiul evolutiv în care este stabilit diagnosticul și distribuția mutațiilor patogene prezintă diferențe interetnice sau interpopulaționale semnificative) (Rivenbark, O’Connor and Coleman, 2013),(Majeed et al., 2014).
Toate aceste date susțin heterogenitatea cancerului mamar și posibilitatea existenței unor endofenotipuri.
II. FACTORII DE RISC PENTRU CANCERUL DE SÂN
Pe parcursul vieții, persoanele sunt expuse la o serie de factori de risc și protectivi pentru apariția bolilor maligne, inclusiv pentru cancerul de sân (Gray et al., 2017). Spre exemplu, într-un studiu de tip cross-secțional, s-a stabilit că ~¾ dintre respondente au raportat expunerea la unul (30%), doi (30%) sau trei (13%) factori de risc pentru cancer (Memon et al., 2015). Balanța dintre factorii de risc și cei protectivi, indiferent de natura acestora (ex. factori genetici sau non-genetici), conferă un anumit grad de susceptibilitate individuală pentru apariția, promovarea și progresia tumorii. Acești factori se pot clasifica în funcție de influența pe care o au asupra riscului de boală (factori cu risc scăzut, moderat sau crescut de boală) și de modul în care acționează (ex. independent, aditiv sau multiplicativ).
Unele studii au condus la rezultate care sunt parțial concordante sau chiar discordante privind efectele unor factori de risc. Concordanța parțială a rezultatelor se poate explica prin heterogenitatea clinică și genetică a bolii și prin modul în care au fost organizate aceste studii (ex. diferențe în ceea ce privește ipotezele de lucru, criteriile de includere / excludere, modul în care sunt colectate, înregistrate și prelucrate datelor, puterea statistică a studiilor, ajustarea rezultatelor în funcție de factorii de confuzie și de stratificarea populației etc.).
Dintre factorii de risc, cea mai puternică asociere cu boala a fost atribuită:
– mutațiilor germinale care au penetranță crescută (ex. unele mutații în genele BRCA1, BRCA2 și TP53) (Ford et al., 1994), (Kuchenbaecker et al., 2017), (Begg, 2002);
– modificărilor histologice produse în țesuturile din glanda mamară (Fabian et al., 2000);
– antecedentelor heredocolaterale maligne (Rosen et al., 1989);
– particularităților reproductive (ex. nuliparitatea) (Schedin, 2006), (Singletary, 2003) etc.
Alți factori de risc importanți pentru apariția cancerului de sân sunt: sexul, vârsta, menarha, menopauza, nuliparitatea/ prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 ani (Mohandass et al., 2010), antecedentele heredocolaterale de boală, obezitatea, consumul de alcool, predispoziția genetică (ex mutațiile BRCA1, BRCA 2), utilizarea de contraceptive orale, terapie hormonală combinată, țesutul mamar dens etc.
2.1. Genul
Boala este considerată una dintre cele mai frecvente afecțiuni maligne identificate la femei (Jemal et al., 2017), (El Saghir et al., 2007) și, ca urmare, o cauză majoră de mortalitate în întreaga lume. Riscul de boală la bărbați este de 100 de ori mai redus, comparativ cu valorile estimate pentru femei (Siegel, Miller and Jemal, 2016).
2.2. Antecedentele heredocolaterale
Riscul de cancer de sân la femei este crescut de prezența bolilor maligne în antecedente (ex. cancer de sân invaziv RR = 6,8) (‘A Retrospective Cohort Analysis of Second Breast Cancer Risk for Primary Breast Cancer Patients With an Assessment of the Effect of Radiation Therapy<xref ref-type="fn" rid="FN2">2</xref>’, 1983), (Rosen et al., 1989) sau în antecedentele heredocolaterale (ex. existența cancerului de sân la rudele de grad I conferă un risc relativ -RR = 3,6), mai ales dacă boala a debutat în premenopauză (RR = 3,3) (Singletary, 2003).
2.3. Populația și etnia
Populația și etnia au fost asociate semnificativ cu riscul de boală. Aceste asocieri au la bază particularități genetice (diferențe în spectrul mutațional) sau socio-economice (Kadouri et al., 2007), (‘Cancer incidence in five continents. Volume IX.’, 2008), (Parkin et al., 2010), (Desantis, Siegel and Jemal, 2015).
Diferențele interpopulaționale ale incidenței cancerului de sân sunt semnificative (raportul dintre valorile maxime și cele minime este de ~8) (Armstrong and Doll, 1975), (‘Cancer incidence in five continents. Volume VIII.’, 2002), (‘Cancer incidence in five continents. Volume IX.’, 2008). Spre exemplu, riscul de boală este cu 25-33% mai redus în populația din Asia sau din țările în curs de dezvoltare, comparativ cu cel estimat pentru populațiile dezvoltate din punct de vedere economic. Valori extreme ale incidenței au fost raportate în America de Nord, Europa de Vest și Australia (70-90 cazuri noi / 100000 de locuitori / an) (Edwards et al., 2005) și în Africa sub-Sahariană și Asia de Sud (Tavassoli and Devilee, 2003).
Mutațiile fondatoare contribuie semnificativ la apariția unor diferențe interpopulaționale în ceea ce privește predispoziția genetică și manifestările clinice (ex. vârsta la debut, raportul dintre principalele subtipuri de boală, simptomatologia, evoluția) (Khairy et al., 2005). Relația dintre mutațiile fondatoare și incidența bolii, corelată cu etnia subiecților, a fost evidențiată în populația din diferite țări (ex. Israel, Anglia, SUA, Franța).
2.4. IMC crescut
American Cancer Society a estimat că pentru cei mai mulți americani care nu au fost expuși la fum de țigară principalii factori de risc modificabili pentru cancer sunt: greutatea, dieta, activitatea fizică și consumul de alcool (Rock et al., 2020).
Analiza datelor înregistrate într-un studiu monocentric a evidențiat că riscul de cancer de sân inflamator este mai mare la femeile care au avut indicele de masă corporală (IMC) ≥25kg/m2 (p<0,01) (Atkinson et al., 2016).
IMC crește riscul de cancer de sân care debutează după menopauză. Femeile care au un exces ponderal în post-menopauză au un risc cu 10-20% mai mare comparativ cu femeile normoponderale; femeile care sunt obeze după instalarea menopauzei au un risc de boală cu 30% mai mare comparativ cu cele normoponderale. Riscul de boală este însă cu 15% mai redus la femeile care au IMC< 22,5 comparativ cu femeile care au IMC cuprins în intervalul 22,5 – 24,9. (Reeves et al., 2007). Reducerea IMC la persoanele supraponderale sau obeze este însoțit de o diminuare a riscului de cancer de sân.
IMC crescut și obezitatea pot indica un aport alimentar dezechilibrat (ex. aport energetic crescut sau un aport crescut de grăsimi saturate) și o diminuare a activității fizice. Acești factori se regăsesc în categoria factorilor de risc modificabili pentru cancerul de sân. Studiile WHEL (Women’s Healthy Eating and Living) (Hong et al., 2007) și WINS (the Women’s Intervention Nutrition Study) (Froelicher and Christopherson, 2000), (Martin, Froelicher and Miller, 2000) au demonstrat că nutriția sănătoasă are efecte benefice asupra evoluției cancerului de sân. Totuși aceste rezultate nu au fost confirmate în toate studiile.
2.5. Vârsta
Riscul dezvoltării cancerului de sân este corelat cu modificările care au loc la nivelul glandei mamare sau la nivelul profilului hormonal și implicit cu vârsta.
Glanda mamară parcurge o serie de modificări și remodelări pe parcursul vieții. Dezvoltarea glandei mamare începe în perioada fetală. La pubertate precursorii celulelor ductale și țesutul conectiv din jurul lor proliferează. În timpul perioadei fertile celulele ductale intră într-un proces periodic de proliferare și apoptoză, care este controlat pe cale hormonală. În timpul gestației se produc modificări care pregătesc glanda mamară pentru lactație (ex. proliferarea celulelor ductale). După încheierea perioadei de alăptare se inițiază un nou proces de remodelare a glandei mamare. Toate aceste modificări cresc susceptibilitatea celulelor din glanda mamară la acțiunea factorilor mutageni și cresc riscul apariției unor erori în replicarea ADN sau în derularea ciclului celular.
Grupa de vârstă 0 – 30 ani se caracterizează printr-o incidență foarte redusă a cazurilor de cancer de sân. Incidența redusă a bolii se poate explica mai ales prin: particularitățile balanței hormonale din această perioadă a vieții, ritmul redus de dezvoltare a glandei mamare până la pubertate și timpul necesar pentru transformarea celulelor normale în celule maligne.
Frecvența bolii crește lent în grupa de vârstă 30 – 40 ani (~1 caz la 200 femei) și mai abrupt în intervalul 40 – 50 ani (1 caz la 50 femei). Incidența maximă a bolii este atinsă până la vârsta de 70-80 ani (1 caz la 8-10 femei). Compararea ratelor brute ale incidenței a indicat că aceasta este de ~10 ori mai redusă la femeile din grupa de vârstă 30-34 de ani (7,95 cazuri /100000 femei) comparativ cu cele din grupa 50-54 de ani (85,24 cazuri /100000 femei).
Relația dintre cancerul de sân cu debut în premenopauză și vârstă are la bază modificarea morfologiei sânului și factorii de risc care acționează în timpul tranziției spre menopauză (ex. modificările hormonale) (United States Department of Health and Human Services, 2014).
Vârsta la care debutează clinic cancerul de sân a fost corelată și cu particularitățile evolutive ale bolii. Tumorile care debutează înainte de instalarea menopauzei sau în primii 40 de ani de viață în general sunt mai agresive comparativ cu cele care debutează după această vârstă (Chung et al., 1996), (de la Rochefordière et al., 1993).
2.6. Particularitățile reproductive
Nuliparitatea, reducerea numărului de sarcini și a duratei de alăptare reprezintă particularități reproductive care pot explica de ce femeile din țările dezvoltate au un risc mai mare de a dezvolta cancer de sân comparativ cu cele din țările subdezvoltate. Unele meta-analize au evidențiat că efectul acestor factori este asociat în diferite grade cu subtipurile de cancer de sân (Lambertini et al., 2016).
Analiza cumulativă a datelor colectate de la 50302 cazuri cu cancer de sân invaziv și 96973 femei control care au făcut parte din 47 studii epidemiologice, desfășurate în 30 țări, a nuanțat impactul particularităților reproductive asupra riscului de boală. Din această categorie de factori de risc cele mai importante componente au fost: menarha înainte de 11 ani (RR=1,7-3,4); perioada reproductivă mai mare de 40 de ani (RR = 2,5-5,0); ciclurile menstruale anovulatorii (RR = 2,4-4,0); vârsta la care prima sarcină este dusă până la termen (ex. RR 35 de ani = 1,5-4,0; RR <20 de ani = 0,4); alăptarea (fiecare 12 luni de alăptare reduc riscul de boală cu 4,3%, p<0,0001); nuliparitatea (OR= 1,3-4,0). S-a mai observat că numărul de copii a fost mai redus la paciente comparativ cu femeile din lotul control (2,2 vs. 2,6). Fiecare sarcină a redus riscul de boală cu 7,0% (95%CI: 5,0-9,0; p<0,0001). Durata totală de alăptare a fost, de asemenea, asociată semnificativ cu boala. S-a mai estimat că riscul de boală în țările dezvoltate se poate reduce cu >50% dacă numărul mediu de copii și durata totală de alăptare ar ajunge la valorile raportate pentru țările care sunt în curs de dezvoltare (ex. riscul poate să scadă de la 6,3 la 2,7 cazuri / 100 femei până la vârsta de 70 ani) (Beral et al., 2002).
Particularități reproductive (ex. vârsta la care se înregistrează menarha, menopauza, prima sarcină dusă la termen, nuliparitatea, durata lactației) au fost asociate cu cancerul de sân în diferite populații (Colditz and Rosner, 2000), (Key, Verkasalo and Banks, 2001), (Ursin et al., 2005), (Anderson, Schwab and Martinez, 2014). Asocierea dintre acești factori și riscul de boală prezintă particularități care depind de populația analizată (Anderson, Schwab and Martinez, 2014). Astfel, la 6,74% dintre pacientele cu cancer de sân din China au fost identificați factori de risc reproductivi (Li et al., 2012). Variantele protective ale acestor factori pot reduce incidența bolii cu 17,9% la femeile din Suedia (Granström, Sundquist and Hemminki, 2008). Un studiu desfășurat în Germania a estimat că factorii de risc hormonali sau reproductivi sunt prezenți la 50% dintre pacientele la care cancerul de sân a debutat după instalarea menopauzei au (ex. vârsta la care se instalează menarha: 7,7%, menopauza: 12%, numărul de sarcini: 10,9%, terapia de substituție hormonală: 19,4%) (Barnes et al., 2011).
Menarha precoce și menopauza tardivă (creșterea perioadei fertile) sunt caractere multifactoriale (Karapanou and Papadimitriou, 2010). Ele au fost asociate în mod constant cu riscul de cancer de sân. Mecanismul fiziopatologic al acestei asocieri are la bază dinamica hormonilor sexuali, numărul de cicluri de remodelare (proliferare – apoptoză) pe care le parcurge glanda mamară pe parcursul perioadei fertile și sensibilitatea diferită a celulelor din glanda mamară la acțiunea factorilor de stres pe parcursul acestor cicluri. La femeile care au origine africană menarha tinde să se producă la vârste mai mari (~15 ani) comparativ cu cele caucaziene (Fregene and Newman, 2005). Acest aspect poate explica unele particularități pe care le are cancerul de sân în aceste populații. Într-un studiu regional efectuat în Craiova s-a estimat că menarha înaintea vârstei de 14 ani și ciclicitatea menstruală pentru o perioadă mai mare de 32 ani reprezintă factori de risc importanți pentru cancerul de sân în populația investigată (Mazilu et al., 2003). Rezultate similare au fost raportate și pentru populația din Coreea (J.S. et al., 1996). În Pakistan se înregistrează una dintre cele mai mari incidențe ale cancerului de sân. Într-un studiu monocentric care a analizat persoane din această țară s-a estimat că factorii de risc reproductivi (ex. ciclul menstrual, menarha, perioada de lactație) au doar o contribuție redusă la riscul total de boală (Mansha et al., 2016).
Nuliparitatea și vârsta înaintată la care se produce prima sarcină au fost raportate de 29,5% dintre pacientele cu tumori mamare (Madigan et al., 1995), (Schedin, 2006). Aceste asocieri sunt de interes mai ales în contextul în care femeile au tendința de a avea un număr tot mai redus de sarcini iar prima sarcină dusă la termen este înregistrată la vârste tot mai înaintate.
Factorii de risc reproductivi au fost asociați și cu unele particularități ale subtipurilor de boală. Intervalul de timp cuprins între menarhă și prima sarcină dusă la termen a fost asociat cu modificarea riscului de cancer de sân inflamator (ex. luminal: ER+ și/sau PR+/HER2neu-; HER2neu+: oricare ER și PR, HER2neu+; triplu-negativ: ER-/PR-/HER2neu-). Acesta reprezintă aproximativ 2,5% din numărul total de cazuri de cancer de sân invaziv (Low et al., 2004). Descifrarea predispoziției pentru aceste tipuri de cancer de sân contribuie la îmbunătățirea conduitei terapeutice și la creșterea speranței de viață după stabilirea diagnosticului (în intervalul 1988-2000 speranța medie de viață a fost de 2,9 ani) (Hance et al., 2005). Analiza multivariată a datelor raportate în SUA (n=224 femei cu cancer de sân inflamator; n=396 femei control) a evidențiat riscul crescut de cancer de sân triplu negativ la femeile care au avut prima sarcină înaintea vârstei de 26 ani (OR = 3,32, 95% CI: 1,37 – 8,05) comparativ cu cele care au avut prima sarcină la vârste mai mari. Alăptarea reduce riscul de cancer de sân triplu negativ (OR= 0,30; 95%CI: 0,15–0,62) și luminal (OR =0,35, 95%CI: 0,18–0,68). Fumatul este un alt factor care crește riscul pentru cancer de sân luminal (OR=2,37; 95%CI: 1,24–4,52). Totodată, creșterea greutății peste valorile normale (obez, supraponderal) a crescut riscul de cancer de sân (indiferent de subtip) și devine unul dintre principalii factori de risc modificabili pentru boală (p<0,01) (Atkinson et al., 2016).
Numărul sarcinilor duse la termen a fost asociat cu reducerea riscului de boală (nulipare vs. multipare). În Nurses' Health Studies s-a estimat că prima sarcină dusă la termen la vârstă mai mare crește riscul de cancer de tip luminal A (HR = 1,03, 95% CI: 1,02 – 1,05); durata lactației a fost invers asociată cu apariția tumorilor de tip bazal-like (HR lactație >7 luni vs. niciodată = 0,65, 95%CI: 0,49 – 0,87). În acest studiu numărul mare de sarcini nu a avut un impact semnificativ asupra riscului de apariție a acestor subtipuri de boală (Sisti et al., 2016). La femeile din China scăderea numărului mediu de copii (1,47%), utilizarea contraceptivelor orale (0,71%) și terapia de substituție hormonală (0,31%) au fost implicate într-un procent redus de cazuri de cancer de sân (Li et al., 2012).
Perioada de alăptare este consideră un factor protectiv pentru cancerul de sân (Anderson, Schwab and Martinez, 2014),(Islami et al., 2015),(Lambertini et al., 2016). Mamele din Texas care și-au alăptat natural copiii au avut un risc mai redus de a dezvolta cancer de sân inflamator luminal (OR = 0,35, 95% CI 0,18 – 0,68) sau triplu negativ (OR = 0,30; 95% CI: 0,15 – 0,62) comparativ cu cele care nu au alăptat (Barnard, Boeke and Tamimi, 2015). Pentru populația din Coreea s-a raportat că o creștere a duratei de alăptare la primul copil (p = 0,006) și a perioadei totale de lactație (p = 0,03) au redus semnificativ riscul de cancer de sân. Riscul de boală a fost cu ~ 50% mai redus la femeile care alăptează ~1 an comparativ cu cele care alăptează <4 luni (OR = 0,46; 95% CI: 0,30 – 0,70) (Kim et al., 2007). În Breast Cancer Etiology in Minorities (BEM) Study riscul pentru cancerul de sân triplu-negativ a fost redus cu 48% la femeile tinere, pare, care au alăptat cel puțin 24 luni (John et al., 2018).
Terapia de substituție hormonală poate avea efecte secundare importante, printre care se regăsesc și creșterea riscului de tromboză și de cancer (ex. cancer de sân și de ovar). Terapia de substituție hormonală este utilizată mai ales în țările vestice (în 2010 în țările vestice ~12 milioane de femei au utilizat această terapie). În consecință, s-a observat că procentul de paciente cu cancer de sân care au utilizat această terapie prezintă diferențe interpopulaționale semnificative (ex. 0,3% în China și Coreea și 19,4% în Germania) (Li et al., 2012),(Park et al., 2016), (Barnes et al., 2011). O meta-analiză a confirmat că persoanele care utilizează și cele care au utilizat terapia de substituție hormonală au avut un risc crescut de cancer de sân (Calle et al., 1997). O meta-analiză mai recentă a datelor înregistrate în perioada 1992-2018 a inclus 108647 cazuri de cancer de sân cu debut în postmenopauză (vârsta medie 65±7 ani); aproximativ jumătate dintre aceste paciente au utilizat terapie de substituție hormonală, mai ales la vârsta instalării menopauzei (40–59 ani). Regresia logistică a indicat că durata de utilizare și folosirea preparatelor pe bază de estrogen-progesteron cresc semnificativ riscul de boală. Rezultatele au avut un impact mai mare în cazul tumorilor care exprimau receptorul pentru estrogen. Riscul de boală a crescut ușor la persoanele care utilizau această terapie de 1-4 ani (RR pentru estrogen-progesteron =1,60, 95%CI: 1,52–1,69; RR doar estrogen = 1, 17, 1,10–1,26) însă acesta s-a dublat la grupul care a utilizat această terapie 5–14 ani (RR estrogen-progesteron= 2,08; 2,02–2,15; RR doar estrogen= 1,33, 95%CI=1,28–1,37) (‘Type and timing of menopausal hormone therapy and breast cancer risk: individual participant meta-analysis of the worldwide epidemiological evidence’, 2019).
Factorii de risc reproductivi pot să interacționeze cu alți factori care interferă cu riscul de boală. Unul dintre cele mai cunoscute exemple este reprezentat de interacțiunea dintre prima sarcină dusă la termen și fumat. O asemenea asociere a fost raportată și în The Canadian National Breast Screening Study, în care s-au urmărit prospectiv 89835 femei cu vârsta cuprinsă între 40 și 59 ani. În perioada de urmărire (~22,1 ani) s-au identificat 6549 cazuri de cancer de sân. Particularitățile fumatului (ex. durata: 40 ani vs. 0: HR=1,57; 95%CI: 1,92-51,29; intensitatea: 40 țigări/zi vs. 0: HR=1,21; 95%CI: 1,40-51,04; expunerea cumulativă: 40 pachete / an vs. 0: HR=1,19; 95%CI: 1,13-51,06; latența: 40 ani de la inițiere vs. 0: HR=1,19; 95%CI: 1,53 – 51,10) au fost asociate cu risc crescut de cancer de sân. Fumatul înainte de prima sarcină dusă la termen a crescut riscul de cancer de sân (fumătoare 5 ani înainte de naștere vs. nefumătoare: HR=1,18; 95%CI: 1,26-51,10) (Catsburg, Miller and Rohan, 2015). Un studiu multicentric derulat în intervalul 1993-2010 a urmărit o cohortă de femei, heterogenă din punct de vedere al backgroundului etnic, alcătuită din 83300 de femei din Hawai și California (interval vârstă: 45-75 ani). În perioada de urmărire (~15 ani) au fost identificate 4484 cazuri de cancer de sân invaziv. S-a observat că riscul de boală a fost cu 35% mai mare la femeile care au început să fumeze cu cel puțin 5 ani înainte de prima sarcină și au fumat mai mult de 20 de ani, comparativ cu femeile care au născut dar nu au fumat (HR = 1,35, 95%CI: 1,13-1,63). Dacă în analiză s-au păstrat doar femeile care nu au consumat alcool s-a constatat că riscul de boală a fost ușor crescut și a ajuns la 40% (HR = 1,40, 95%CI: 1,08-1,81). Rezultatele nu au prezentat diferențe interetnice semnificative (Gram et al., 2015).
2.7. Consumul de alcool
Consumul de alcoolul crește nivelul de estrogeni. Acești hormoni pot să predispună la malignizare prin efectele directe sau mediate de receptorul pentru estrogeni la nivelul glandei mamare sau prin mecanisme alternative (ex. via acetaldehidă, stres oxidativ, modificări epigenetice). Aceste mecanisme sunt dificil de investigat având în vedere numărul semnificativ de factori de confuzie care pot influența rezultatele (ex. expunerea la fum de țigară).
O meta-analiză a sugerat că alcoolul, chiar dacă este consumat în doze reduse, poate crește riscul de cancer de sân. Consumul redus de alcool poate să fie implicat în apariția a 1-2% din numărul total de cazuri de cancer de sân din Europa și America de Nord (Seitz et al., 2012).
Analiza datelor din 53 studii a condus la observația că pentru fiecare 10g alcool consumate suplimentar/zi riscul de boală crește cu 7,1% (95%Cl: 5,5-8,7%; p<0,00001) (Hamajima et al., 2002).
2.8. Fumatul activ și pasiv
În fumul de țigară au fost identificați ~ 7000 compuși chimici dintre care mai mult de 100 sunt carcinogeni, co-carcinogeni sau mutageni (ex. hidrocarburi aromatice policiclice, nitrozamine specifice tutunului) (Kispert and McHowat, 2017), (Johnson et al., 2011). O parte dintre carcinogenii prezenți în fumul de țigară (ex. benzen, formaldehidă, N-nitrozamine) se găsesc la niveluri crescute și în organismul fumătorilor pasivi (International Agency for Research on Cancer (IARC), 2004), (‘IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans’, 2010). Acești compușii pot să pătrundă în aproape toate organele corpului, inclusiv în țesuturile cale alcătuiesc sânul. Experimentele efectuate pe animale au demonstrat că acești compuși pot induce tumori la nivelul glandei mamare (ex. benzo[a]pirenul, izoprenul, etilen oxidul pot induce tumori mamare la șobolani) (Hecht, 2002), (Alavanja et al., 2004). În consecință, s-a estimat că fumatul, indiferent dacă este activ sau pasiv, poate predispune la cancer de sân (Kispert and McHowat, 2017).
Nicotina este unul dintre cei mai cunoscuți compuși care face legătura dintre fumat și patologia umană. Nicotina, prin intermediul receptorului nicotinic și al protein-kinazei C, poate promova secreția unor factori de creștere (ex. bFGF, TGF-α, calpain, VEGF) care pot activa diferite căi de semnalizare (ex. căile Raf, Akt, PKC, Bcl-2, Bax, VEGF/neuropilin 1) (Narayan et al., 2004) implicare în promovarea diviziunii celulare (Guo et al., 2008) și în creșterea riscului transformării unor celule sensibile.
Compușii chimici din fumul de țigară pot modifica riscul de cancer mamar prin:
– efecte antiestrogenice care pot să reducă riscul de cancer de sân;
– efecte imunomodulatoare mediate de NF-κB (moleculă care participă la reglarea expresiei citokinelor sau proteinelor implicate în supraviețuirea celulară) (Hayden, West and Ghosh, 2006);
– stimularea proliferării celulelor din care se dezvoltă tumorile glandei mamare. Interacțiunea dintre nicotină și receptorul nicotinic pentru acetilcolină, Src sau EGFR facilitează creșterea, proliferarea și capacitatea de supraviețuire a celulelor (Nishioka et al., 2011), (Dasgupta et al., 2009);
– facilitează motilitatea celulară și parcurgerea etapelor inițiale ale metastazării. Diferiți compuși din fumul de țigară (inclusiv nicotina) promovează tranziția epitelio-mezenchimală (Di Cello et al., 2013) și stimulează secreția enzimelor care degradează componente din matricea extracelulară (ex. calpain) (Dasgupta et al., 2009), (Hanahan and Weinberg, 2011), (Kispert, Marentette and McHowat, 2015);
– crește riscul producerii de mutații. În anul 1978 în fluidele din glanda mamară recoltate de la fumătoare care nu erau în perioada de lactație s-au identificat nicotina și cotinina (metabolit principal al nicotinei) cu ajutorul metodelor cromatografice și a spectrometriei de masă (Petrakis et al., 1978). În 66% dintre celulele epiteliale ductale exfoliate și în 88% dintre probele de lapte uman integral recoltat la 4-6 săptămâni după naștere (n=50 femei) s-au identificat aducți ADN și respectiv activitate mutagenică (independent de genotipul NAT2) (Thompson et al., 2002). Nivelurile aducților ADN la fumători pot să reflecte interacțiuni de tip Gene x Mediu (GxE) sau Genă x Genă (GxG). Astfel, concentrații mai mari de aducți au fost raportate la fumătorii care au genotipurile CYP1A1*1/*2 sau *2/*2 (comparativ cu cei care au genotipul CYP1A1*1/*1), la cei care au genotipul combinat CYP1A1*1/*2 sau CYP1A1*2/*2 și GSTM1 nul (comparativ cu polimorfismele CYP1A1 sau GSTM1) sau genotipurile de risc CYP1A1 și NAT2 (Firozi et al., 2002). Prezența și nivelurile semnificative de aducțiuni ADN în țesutul mamar și proprietățile mutagenice ale laptelui de la mamele fumătoare reprezintă argumente în favoarea prezenței compușilor din fumul de țigară la nivelul glandei mamare. Compușii care rezultă din activarea metabolică a carcinogenilor pot forma aducți cu ADN. Dacă sistemele de reparare nu reușesc să restabilească starea normală a ADN, atunci celulele care își continuă ciclul celular pot să fixeze mutații și să le transmită la celulele fiice (Kundu et al., 2007), (Hecht, 1999). Mutațiile induse de compușii din fumul de țigară pot să țintească inclusiv oncongene (ex. Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) și gene supresor de creștere tumorală (ex. TP53) (Tang et al., 1999),(Feng, 2002) și astfel pot să crească riscul de transformare malignă.
Riscul de boală conferit de expunerea la fum de țigară poate să fie influențat de alți factori de risc sau protectivi. Chiar dacă fiecare dintre acești factori are o contribuție minoră asupra riscului total de boală efectul lor cumulat poate să devină important. Spre exemplu, în predispoziția pentru boală au fost identificate interacțiuni dintre factorii mediu și cei genetici. Un astfel de exemplu este reprezentat de expunerea la fumul de țigară a persoanelor care au mutații în genele implicate în metabolizarea carcinogenilor sau procarcinogenilor. GSTM1 sau GSTT1 sintetizează izoenzime implicate în metabolizarea carcinogenilor. Indivizi homozigoții pentru deleții în aceste gene nu pot să metabolizeze eficient carcinogenii din fumul de țigară; indiferent dacă sunt fumători activi sau pasivi acești indivizi au un risc crescut de a dezvolta tumori. Un studiu de tip caz-control realizat în Connecticut, în intervalul 1994-1998, a evidențiat că femeile în postmenopauză care au genotipul GSTT1 nul au un risc crescut de cancer de sân (OR = 1,9; 95%CI: 1,2 – 2,9) mai ales dacă au început să fumeze înaintea vârstei de 18 ani (OR = 2,9; 95%CI: 1,0 – 8,8) (Zheng et al., 2002). Asocierea dintre fumat și cancerul de sân pare să fie influențată și de etnie. Delețiile homozigote în GSTM1 sau GSTT1 sunt destul de frecvente în populația Caucaziană; aceste mutații pot crește riscul de cancer mamar la femeile fumătoare. S-a raportat că femeile caucaziene care fumează mai mult de 15 pachete de țigări / an au un risc crescut de cancer de sân cu debut în pre-menopauză (OR = 1,6; 95%CI: 1,1-2,4). Femeile hispanice și amerindiene, care au genotipul IL6GG (rs2069832) și care au fost expuse la fum de țigară mai mult de 10 ore/săptămână au un risc crescut de boală în premenopauză (OR = 4,4; 95%CI = 1,5-12,8; p < 0,01) chiar dacă nu erau fumătoare active (Slattery et al., 2008).
În unele cazuri testarea relației dintre fumat, cancer de sân, risc de recurență sau mortalitatea atribuită bolii, au identificat asocieri care însă au o semnificație statistică cel mult moderată. Investigarea rezidentelor din Massachusetts (interval de vârstă 25-55) care au născut în perioada 1987-1999 nu a evidențiat o relație semnificativă între fumatul în timpul sarcinii și riscul de boală (RR= 1,0, 95% CI: 0,81 – 1,2) (Fink and Lash, 2003). Rezultate concordante pentru fumatul continuu, activ (OR = 0,72, 95%CI: 0,55-0,95) sau pasiv (OR = 0,85, 95%CI: 0,63-1,1), au fost obținute și în alte populații (Lash and Aschengrau, 2002).
Este posibil ca relația dintre fumat și cancerul să se manifeste în anumite condiții de expunere sau care sunt în relație cu biologia individului expus (ex. durata și intensitatea expunerii la fum de țigară și perioada din viață în care individul a fost expus la fum de țigară în mod activ sau pasiv). Ipoteza referitoare la sensibilitatea crescută a celulelor de la nivelul glandei mamare în curs de dezvoltare a fost enunțată de către Palmer în anul 1991 pe baza rezultatelor obținute într-un studiu multicentric. Au fost analizat datele de la 607 femei cu cancer de sân și 1214 femei control din Canada și 1955 femei cu cancer de sân și 805 femei control cu alte tipuri de cancer din Statele Unite. În ambele loturi s-a constatat o tendință de creștere a riscului de boală (OR=1,2; 95%CI: 0,9-1,6) în cazul persoanelor care au fumat mai mult de 25 țigări/zi, comparativ cu femeile nefumătoare. Asocierea a devenit mai puternică dacă în analiză au fost păstrate datele femeilor care au fumat cel puțin 25 de țigări/zi în ultimul an și dacă au început să fumeze înainte de vârsta de 16 ani (Canada: OR=1,7; 95%Cl: 1,0-2,9; SUA: OR= 1,8, 95%Cl: 1,0-3,4) (Palmer et al., 1991). Rezultatele pot să fie influențate de durata mai mare a expunerii la fum de țigară sau de deprinderea acestui viciu la vârste precoce. În populația din China, persoanele expuse pasiv la fum de țigară la locul de muncă pentru minim 5 ore/zi, în ultimii 5 ani, au avut un risc crescut de cancer de sân (OR=1,6; 95%CI: 1,0 -2,4, p=0,02) (Shrubsole et al., 2004). Într-un alt studiu realizat recent pe subiecți din această populație s-a observat că femeile expuse pasiv comparativ cu cele care nu au fost expuse pasiv la fum de țigară, au avut un risc mai mare de cancer de sân (OR= 1,35; 95%CI: 1,11-1,65). Efectele expunerii pasive la fum de țigară au fost influențate și de particularitățile expunerii active la fum de țigară (ex. numărul anilor în care au fumat activ, numărul de țigări fumate/zi) (Li et al., 2015). În SUA fostele fumătoare au avut un risc de cancer de sân cu 9% mai mare în raport cu nefumătoarele (RR= 1,09; 95%CI: 1,02-1,17); riscul de boală a fost și mai mare în sublotul de femei care au fumat în timpul derulării studiului (RR=1,16; 1,00-1,34). Valorile au crescut suplimentar în cazul femeilor care au fumat ≥50 de ani raportat la femeile nefumătoare (RR=1,35; 95%CI=1,03-1,77) sau la persoanele care nu au fost expuse activ sau pasiv la fum de țigară (RR= 1,45; 95%CI: 1,06-1,98). Expunerea pasivă la fum de țigară, în copilărie (cel puțin 10 ani) sau la vârstă adultă (>20 de ani la domiciliu; >10 ani la locul de muncă), a crescut suplimentar riscul de cancer de sân (Luo et al., 2011).
Urmărirea unei cohorte de femei (111140 participante la The Nurses' Health Study, în intervalul 1976- 2006 și 36017 femei) în intervalul 1982-2006 a sugerat că fumatul activ, mai ales înainte de prima naștere, crește ușor riscul de cancer de sân. După ajustarea pentru factorii de confuzie, s-a constatat o ușoară creștere a riscului de cancer de sân la fumători raportat la nefumători (HR=1,06%; 95%CI: 1,01%-1,10%). Riscul de boală a crescut semnificativ la marii fumătorii (în timpul studiului: p=0,02; în trecut; p = 0,003), mai ales dacă acest viciu a fost dobândit la vârste reduse (p = 0,01) sau dacă indivizii au fumat perioade mai îndelungate (p= 0,01). Fiecare 20 de pachete de țigări/an consumate suplimentar înainte de prima naștere (HR=1,18; 95%CI: 1,10-1,27) sau înainte de menopauză (HR=1,11; 95%CI:1,07-1,15) au crescut ușor riscul de boală (Xue et al., 2011). O cohortă de femei afro-americane a fost urmărită pentru o perioadă de 14 ani iar în acest interval s-a identificat 1377 cazuri de cancer de sân. Analiza datelor a indicat că femeile care au fumat înaintea vârstei de 18 ani mai mult de 20 de pachete țigări / an au avut un risc crescut de cancer de sân cu debut în premenopauză (RR=1,70; 95%CI: 1,05-2,75). Riscul de cancer de sân în premenopauză a fost crescut și de fumatul pasiv, la domiciliu sau la serviciu (RR = 1,42, 95%CI: 1,09-1,85). În acest lot riscul de cancer la sân cu debut în postmenopauză nu a fost influențat semnificativ de expunerea activă sau pasivă la fum de țigară (Rosenberg et al., 2013). Dintr-un lot alcătuit din 322988 femei din Europa un număr de 9822 persoane au dezvoltat cancer de sân. Persoanele care în momentul includerii în studiu erau fumătoare active (HR= 1,16, 95%CI: 1,05-1,28) sau pasive (HR=1,14, 95%CI: 1,04-1,25) au avut un risc crescut de cancer de sân comparativ cu femeile care nu au fost expuse la fum de țigară (activ sau pasiv, la domiciliu sau la locul de muncă). Cea mai puternică asocierea cu boala a fost atribuită pentru numărul de pachete de țigări fumate/ an în intervalul de timp cuprins între menarhă și prima sarcină dusă la termen (HR= 1,73, 95%CI: 1,29-2,32; pentru fiecare supliment de 20 pachete țigări/an). S-a mai observat că riscul de boală tinde să scadă pe măsură ce crește numărul de pachete țigări/an fumate după menopauză (HR = 0,53, 95%CI: 0,34-0,82 pentru fiecare creștere de 20 pachete/an). Aceste date au arătat că fumatul, mai ales în perioada cuprinsă între menarhă și prima sarcină dusă la termen, crește cel mai puternic riscul de boală (Dossus et al., 2014a). Țesuturile glandei mamare au o sensibilitate crescută la carcinogenii din fumul de țigară mai ales în perioada cuprinsă între pubertate și prima sarcină (perioadă în care celulele epiteliale de la nivelul sânului nu sunt complet diferențiate). Studiile efectuate pe animale susțin această ipoteză. În US Surgeon General’s report se analizează datele referitoare la fumat și riscul de cancer mamar și se precizează că „probele sunt sugestive, dar nu sunt suficiente pentru a deduce o relație de cauzalitate între fumatul activ și cancerul de sân” (United States Department of Health and Human Services, 2014).
Renunțarea la fumat are efecte benefice asupra calității vieții în cazul pacienților cu boli maligne (NCT01434342, 2011). În unele studii riscul de boală nu a diferit semnificativ la nefumătoare și la fostele fumătoare (care au raportat < 20 pachete țigări / an). Fostele fumătoare care au raportat 20-34,9 pachete/an au avut un risc de recurență mai mare cu 22% (HR = 1,22; 95%CI: 1,01-1,48). Riscul de recurență a crescut cu 37% dacă subiecții au fumat mai mult de 35 de pachete/an (HR = 1,37; 95%CI = 1,13-1,66). În acest grup mortalitate atribuită cancerului de sân a fost cu 54% mai mare comparativ cu pacientele care au fumat (Pierce et al., 2014). Într-un studiu prospectiv s-a estimat că pacienții obezi care au cancer de sân, care consumă minim 7 băuturi alcoolice / săptămână (OR=1,9; 95%CI: 1,1 -3,2) și continuă să fumeze (OR= 2,2; 95%CI= 1,2-4,0) au un risc crescut de a dezvolta cancer de sân controlateral. Riscul de cancer de sân crește suplimentar dacă se asociază mai mulți factori de risc. Spre exemplu, fumătoarele active care consumată și alcool (minim 7 băuturi alcoolice/săptămână) au un risc semnificativ mai mare comparativ cu femeile nefumătoare care au consumat mai puțin alcool (OR=7,2, 95%CI: 1,9 – 26,5) (Li et al., 2009). N-acetiltransferaza 2 (NAT2) codifică pentru o enzimă responsabilă de metabolizarea unor compuși din fumul de țigară (ex. aril amine și amine heterociclice) care pot iniția tumorigeneza. Riscul de cancer de sân la fumători (fumătorii vechi) pot să fie modificat și de polimorfismele NAT2 (ex. rs1041983 C/T, rs1801280 T/C, rs1799930 G/A) (Kasajova et al., 2016).
Fumat, indiferent dacă este considerat independent sau în asociere cu alți factori de risc (ex. obezitate, menopauză), poate influența mortalitatea atribuită cancerului de sân. Un studiu realizat în SUA a sugerat că fumatul, indiferent dacă este activ sau pasiv, nu modifică semnificativ mortalitatea atribuită cancerului de sân invaziv. O tendință de asociere a fost însă raportată între mortalitatea atribuită cancerului de sân și fumatul activ la pacientele care erau în postmenopauză (HR: 1,45, 95%CI: 0,78-2,70) sau care erau obeze în momentul diagnosticării cancerului (HR= 1,97; 95%CI:0,89-4,36) (Sagiv et al., 2007). În The Collaborative Breast Cancer and Women's Longevity Study s-au analizat femei (n=20691) cu vârsta cuprinsă între 20 și 79 ani din Wisconsin, New Hampshire și Massachusetts. Mortalitatea atribuită cancerului a fost semnificativ mai mare la pacientele care au fumat activ cel puțin un an înainte de a se stabili diagnosticul de cancer, raportat la femeile nefumătoare (HR = 1,25; 95%CI: 1,13-1,37). Aproximativ 10% dintre paciente au continuat să fumeze și după ce au fost diagnosticate cu cancer de sân. Riscul de deces a fost mai mare în cazul pacientelor care au continuat să fumeze după ce s-a stabilit diagnosticul (HR = 1,72; 95%CI: 1,13 -2,60) și a fost mai redus în cazul celor care au renunțat la acest viciu (HR= 0,67; 95% CI, 0,38-1,19) (Passarelli et al., 2016). Într-un alt studiu s-a raportat că mortalitatea atribuită cancerului de sân poate să fie influențată de interacțiunea dintre fumat și polimorfismele din genele care codifică proteine implicate în calea de semnalizare JAK/STAT/SOCS (Slattery et al., 2014).
Meta-analizele susțin asocierea dintre cancerul de sân și expunerea activă sau pasivă la fum de țigară, mai ales dacă expunerea a început de la vârste reduse. În funcție de particularitățile expunerii, valorile riscului de cancer de sân cu debut în premenopauză la fumătorii pasivi au fost cuprinse în intervalul 1,68 (95%CI: 1,33-2,12) – 2,19 (95% CI 1,68-2,84). Fumătoarele active au avut un risc de cancer de sân de 1,46 ori mai mare comparativ cu femeile care nu au fost expuse activ sau pasiv la fum de țigară (Johnson, 2005). Într-un alt studiu s-a constatat doar o creștere moderată a riscului de cancer de sân la fumătoarele pasive (1,10; 95%CI: 1,09-1,12) sau active (1,13; 95%CI: 1,09-1,17) în raport cu nefumătoarele (Macacu et al., 2015a). Rezultate concordante au fost raportate și pentru populația din Japonia (Nagata et al., 2006). Prelucrarea datelor provenite de la 116544 subiecți din California a condus la concluzia că incidența bolii este mai mare la fumătorii actuali indiferent dacă raportarea se face la nefumători (HR = 1,32, 95%CI: 1,1-1,57) sau la fumătorii pasivi (HR = 1,25, 95%CI: 1,02-1,53). Riscul de boală a fost și mai mare în sublotul de femei care au început să fumeze la vârste reduse sau cu cel puțin 5 ani înainte de prima sarcină dusă la termen (Reynolds et al., 2004).
Studii mai recente susțin totuși existența unei relații între cancerul de sân și fumat. Spre exemplu, reevaluarea datelor din 150 studii epidemiologice susțin această asociere (Secretan et al., 2009). În alte meta-analize riscul de cancer de sân a crescut la femeile care au început să fumeze la vârste mai reduse, care au fumat mai multe pachete de țigări/an sau care au fumat perioade mai mari de timp (15%-40%). Riscul de boală a fost crescut și prin asocierea fumatului îndelungat cu alți factori de risc (ex. genotipuri de acetilare lentă NAT2) (35%-50%) (Johnson et al., 2011). Într-un alt studiu s-au analizat datele cumulate din 14 studii (934681 participanți, 36060 cazuri de cancer de sân invaziv) pentru a identifica relațiile de cauzalitate dintre fumat și cancerul de sân invaziv. Rezultatele au indicat că riscul de cancerul de sân (mai ales pentru subtipul ER+) crește dacă femeile au fumat cel puțin 10 ani înainte de prima sarcină (HR = 1,18, 95%CI: 1,12-1,24). Riscul de cancer de sân crește cel mai mult în cazul femeilor care au fumat >40 țigări/zi (HR=1,17 95%CI: 1,05–1,31, p tendință=4×10–3) (Gaudet et al., 2017).
Asocierea dintre cancerul de sân și fumat poate să fie influențată de o serie de factori de confuzie. Din această categorie cele mai cunoscute exemple sunt:
– consumul de alcool (fumătorii consumă mai frecvent alcool comparativ cu nefumătorii);
– mamografiile (persoanele nefumătoare și fostele fumătoare realizează mai frecvent mamografii în scop de screening comparativ cu nefumătoarele) (IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans, 2012), (Gross et al., 2006);
– expunerea la aminele aromatice și heterociclice (mutagenii prezenți în mediu, gazele de combustie, carnea prăjită și fumul de țigară);
– unele particularități ale fumatului (ex. durata de expunere la fum de țigară la vârste reduse poate să fie mascată de un interval de timp crescut în care o persoană a fumat, numărul mediu de țigări fumate/ interval de timp poate să mascheze efectul unui anumit model în care persoana a fost expusă la fum de țigară pe perioada unei zile);
– modificarea riscului de boală conferită de profilul hormonal (ex. menopauză) sau de nivelurile receptorilor pentru estrogeni (United States Department of Health and Human Services, 2014).
Datele prezentate anterior sugerează că există o relație de cauzalitate între fumatul activ și cancerul de sân. Elucidarea acestei relații este complicată de către diferite aspecte ale stilului de viață (ex. număr de pachete țigări/an, vârsta la care s-a deprins acest viciu, modelul în care persoana a fost expusă la fum de țigară pe parcursul unei zile) și de asocierea fumatului cu alți factori de risc (ex. consumul de alcool, condiții preexistente, predispoziția genetică). Devine astfel evident că investigarea predispoziției pentru cancerul de sân necesită o abordare complexă, în care să fie investigată o paletă mai largă de factori care pot influența riscul de boală.
2.9. Agregarea familială a cazurilor. Predispoziția genetică
Warthun (1913) a estimat că 1% dintre tumorile umane sunt grupate în cadrul unor familii și a introdus conceptul de agregare familială a cazurilor de cancer. Ulterior agregarea familială a cazurilor a fost identificată pentru diferite boli complexe, inclusiv pentru cazurile de cancer de sân (Czene, Lichtenstein and Hemminki, 2002),(Thomas et al., 1994).
Agregarea familială a cazurilor reflectă backgroundul genetic comun, expunerea membrilor familiei la factori non-genetici similari și efectul similar al interacțiunii dintre cele două tipuri de factori. Familiile în care o boală este prezentă la mai multe rude directe sunt utilizate ca punct de pornire pentru realizarea studiilor de linkage care încearcă să localizeze regiuni genomice care conțină o genă de tip candidat pozițional (Hall et al., 1990). Ulterior se încearcă identificarea unor mutații în aceste gene care pot să explice predispoziția genetică pentru boală și care pot reprezenta noi ținte farmacologice. Agregarea familială a cazurilor este însoțită de o creștere semnificativă a riscului de boală în familie comparativ cu riscul estimat pentru populația generală.
Contextul molecular, celular și ambiental pot influența transformarea malignă -inițierea, promovarea și progresia tumorilor. Toate etapele tumorigenezei pot să fie influențate de aberații genetice (mutații), anomalii ale expresiei genice (ex. ARNm, miRNA, proteine) și alterări epigenetice (metilarea unor regiuni de control implicate în reglarea expresiei genice) care pot influența semnificativ metabolismul celular sau mecanismele care controlează progresia ciclului celular. În consecință, diferite combinații de anomalii pot să determine fenotipuri tumorale identice sau similare. În consecință în ultimii ani cancerul a început să fie privit ca o boală de rețea, adică o boala cauzată de anomalii care sunt produse în diferite puncte ale rețelei (Creixell et al., 2012). Această abordare poate explica și agregarea familială a cazurilor (pacienții și rudele lor directe au în comun diferite anomalii și sunt mai frecvent expuse la factori de risc similari).
Agregarea familială a cazurilor de cancer de sân a fost raportată la ambele sexe (Basham et al., 2002), (Hulka and Moorman, 2001). Agregarea cazurilor de cancer are un impact deosebit și asupra estimării riscului de recurență pentru cancerul de sân. Riscul de boală crește de două ori dacă în antecedentele heredo-colaterale ale unui subiect a existat o rudă de grad I care a fost diagnosticată cu cancer de sân (Amundadottir et al., 2004). Riscul de boală crește de 3,3 ori (comparativ cu persoanele care au un istoric familial negativ pentru boală) dacă la ruda de grad I cancerul de sân a debutat înainte de menopauză. Creșterea este de 3,6 ori dacă în antecedente se identifică două rude de grad I cu cancer de sân (Singletary, 2003). Chiar dacă rudele afectate sunt mai îndepărtate (adică există mai puțini factori genetici și ambientali comuni) riscul de boală pentru rudele pacienților depășește nivelul înregistrat în populația generală.
Agregarea familială a cazurilor de cancer de sân a fost explicată și prin utilizarea unor modele matematice. Un model bazat pe existența unei alele recesive care să confere un risc crescut de boală a reieșit în urma analizei unui lot de paciente din Australia (856 cazuri de cancer de sân care au debutat în primii 40 de ani de viață și care au fost testate pentru mutații în genele BRCA1 și 2) (Cui et al., 2001). Modelul recesiv a fost confirmat și într-un studiu realizat în Anglia bazat pe analiza datelor provenite de la 1500 de rude ale pacientelor care au avut cancer de sân și care au fost testate pentru identificarea mutațiilor în genele BRCA1 și 2; modelul obținut a sugerat că alela recesivă poate avea frecvența de 0,24, penetranța estimată a fost de 42% iar homozigoții recesivi au avut un risc de boală care a fost de 21 de ori mai mare comparativ cu persoanele care nu au acest genotip. A fost propus și un model alternativ, de tip poligenic, în fiecare alelă are un efect minor. În acest model riscul de boală a crescut semnificativ prin efectul multiplicativ al unui număr relativ redus de alele (Antoniou et al., 2001).
Agregarea cazurilor este mai evidentă în cazul sindroamelor maligne ereditare. Existența formelor sindromice de cancer a fost postulată în anul 1969 atunci când au fost identificate patru familii în care erau pacienți cu diferite tipuri de cancer (inclusiv cancer de sân) care a debutat la vârste reduse; urmașii pacienților și rudele lor directe prezentau diferite boli maligne care au debutat tot la vârste reduse (inclusiv în copilărie) (Li and Fraumeni, 1969). După aproximativ două decenii s-a confirmat existența formelor sindromice de cancer (Li et al., 1988) și s-a stabilit că rudele persoanelor afectate au un risc de 20 de ori mai mare de a dezvolta o boală malignă comparativ cu cel estimat pentru populația generală (Garber et al., 1991). În anul 1990 s-a stabilit că mutațiile în gena TP53 sunt responsabile de apariția acestui sindrom malign care a fost denumit sindromul Li–Fraumeni.
În anul 1991 s-a estimat că 5% dintre cancere pot să fi determinate monogenic de mutații care au penetranță crescută. A devenit astfel evident că la predispoziția genetică pentru restul cazurilor de cancer de sân contribuie un număr mare de gene care au o penetranță redusă în fenotip. Mutațiile în aceste gene pot influența diferite căi metabolice relevante pentru fiziopatologia bolii (ex. modifică absorbția, transportul, activarea, detoxifierea sau excreția carcinogenilor) (Shields and Harris, 1991), (Li, 1995).
Într-un studiu realizat în anul 2000 s-a raportat că factorii genetici pot explica o parte dintre cazurile de cancer (27%; 95%CI: 4-41%). S-a estimat că riscul de boală în cazul gemenilor monozigotici a fost aproape dublu (RR= 5,2, 95%CI 3,7-7,4) în raport cu cel estimat pentru gemenii dizigotici (RR= 2,8, 95%CI: 2,1-3-8). Vârsta la care a fost diagnosticată boala nu a prezentat diferențe semnificative între perechile concordante de gemeni (monozigotici vs. dizigotici: 7,9±5,95 vs. 10,21±8,16, p=0,12) (Lichtenstein et al., 2000). Genele candidat, identificate în următorii ani au putut explica aproximativ 30% riscul familial de boală. Genotiparea a 29807 SNPs la 45290 paciente și 41880 femei control care au fost selectate din Breast Cancer Association Consortium (BCAC) a permis identificarea a 41 de loci de susceptibilitate noi pentru cancerul de sân (p<5×10-8). Analiza tuturor datelor a indicat un număr mare de loci poate influența riscul de cancer de sân (Michailidou et al., 2013).
Ulterior s-a considerat că genele care au penetranță crescută sau moderată (BRCA1, BRCA2, TP53, PTEN și ATM) pot explica apariția a 30% din numărul total de cazuri familiale de cancer de sân și ~5% din numărul total de cazuri înregistrate (Turnbull and Rahman, 2008), (Vahteristo et al., 2002), (Erkko et al., 2007). Între anii 1943-2010 au fost identificați 3933 gemeni cu cancer de sân. S-a estimat că factorii investigați pot explica ~50% din agregarea familială a cazurilor (Möller et al., 2016).
O contribuție relativ constantă a factorilor genetici și a celor ambientali la riscul de boală estimat pentru persoanele din grupa de vârstă 50-96 ani a fost sugerată de analiza datelor înregistrate de la perechile de surori monozigotice (n=21054) sau dizigotice (n=30939) care au făcut parte din The Nordic Twin Study of Cancer. Heritabilitatea pentru cancerul de sân a fost de ~31% și a fost net superioară valorilor atribuite componentei ambientale (~16%).
Variantele comune din genele candidat identificate în studii de scanare genomică pe scală largă (GWS) pot explica 30-31% (95%CI:10%–52%) din riscul familial pentru cancerul de sân (Michailidou et al., 2013),(Möller et al., 2016). În prezent, se estimează că există mai mult de 80 loci care au penetranță redusă sau moderată în cancerul mamar. Toate variantele genetice cunoscute până în prezent pot explica cel mult 50% din heritabilitatea pentru cancerul mamar (Skol, Sasaki and Onel, 2016).
Din cele prezentate anterior se poate observa că factorii genetici contribuie mai ales la predispoziția genetică pentru formele familiale (ereditare sau sindromice) de boală și mai puțin la cele sporadice (Narod, 2010),(Roy, Chun and Powell, 2012). Mutațiile cu penetranță crescută din BRCA1 și BRCA2 pot explica 16-20% din riscul familial total pentru boală. Mutațiile cu penetranță crescută din alte gene, care pot determina forme sindromice de cancer, contribuie la apariția unui număr redus de cazuri de cancer familial (Stratton and Rahman, 2008), (Easton, Ford and Bishop, 1995),(Begg, 2002). Diferența mare dintre heritabilitatea estimată pentru cancerul de sân (0,27) și impactul total pe care îl au factorii genetici cunoscuți sugerează că în viitor se vor identifica și alți factori de risc cu penetranță redusă sau moderată în fenotip.
2.10. Alți factori cu potențial patogen. Virusurile Torque Teno (TTVs)
Infecțiile virale (ex. HPV, HBV și HCV, virusul Epstein-Barr, KSHV, HTLV-I) au fost asociate cu un spectru larg de boli umane, inclusiv unele tipuri de cancer. Virusurile pot să contribuie semnificativ la 15-20% dintre tumorile umane. Cele mai multe dintre aceste cazuri (>85 %) sunt raportate în țările dezvoltate (Schiller and Lowy, 2014).
Unele infecții virale pot să contribuie la riscul de boală mai discret, prin mecanisme directe sau indirecte. Un exemplu este reprezentat de familia Anelloviridae.
Particularități ale familiei Anelloviridae. Familia Anelloviridae include trei specii de virusuri Torque Teno: Torque Teno virus (TTV), Torque Teno midi virus (TTMDV) și Torque Teno mini virus (TTMV). Primul reprezentant al genului TTV a fost identificat în anul 1997 în serul unui pacient diagnosticat cu hepatită cu etiologie necunoscută. Acesta a avut niveluri semnificativ crescute de alaninaminotransferază la 9-11 săptămâni după o transfuzie sanguină (Nishizawa et al., 1997). În anul 2000 s-au purificat virioni de TTV din materii fecale și s-a stabilit că aceștia au diametrul de 30 – 32 nm (Itoh et al., 2001). Virusurile TTV au o serie de particularități:
– se pot transmite prin diferite căi (inclusiv transmitere verticală de la mamă la copil) (Davidson et al., 1999),(Kazi et al., 2000), (Sugiyama et al., 1999);
– o persoană poate să fie infectată cu mai multe variante genomice; dintre acestea unele genotipuri pot să prezinte o afinitate crescută pentru anumite celule sau țesuturi;
– produc infecții cronice (Niel, Saback and Lampe, 2000), (Okamoto, 2009); în prezent nu se cunoaște mecanismul exact prin care virusul poate evita sistemul imunitar al gazdei;
– infecțiile sunt frecvente în populațiile umane; probe pozitive pentru TTV au fost detectate la 5,26% dintre donatorii de sânge din Brazilia (n=57) (De Oliveira et al., 2008) și la 92,5% dintre persoanele sănătoase din Pakistan (n=40 subiecți) (Hussain et al., 2012). Sunt însă și studii care au raportat valori mari ale prezenței TTV la indivizi sănătoși în loturi mai mari de subiecți. Spre exemplu, probe pozitive pentru TTV au fost raportate la 93,1% dintre subiecți din Japonia (261 subiecți; interval de vârstă: 1-81 ani) (Ninomiya et al., 2008) și la 94% dintre sportivii de elită din Rusia (n=512) (Vasilyev et al., 2009). În România, incidența infecțiilor cu virusurile TT este semnificativă (TTV: 71%, TTMV 54% și TTMDV 31% (Spandole et al., 2013). Totuși nu toate rezultatele sunt concordante. Incidența infecțiilor cu TTV poate să fie influențată și de metoda utilizată pentru identificarea virusului (Vasconcelos, Menezes and Niel, 2001) sau de particularitățile probelor biologice testate.
Organizarea genomului viral. Genomul TTV este de tip ADN monocatenar, circular (3,6 – 3,9 kb), de polaritate negativă (Miyata et al., 1999), (Heller et al., 2001),(Peng et al., 2002),(Okamoto et al., 1998). El include o secvență netradusă (UTR de ~1,2 kb) și o regiune care are potențial de codificare (~2,6 kb). Secvența netradusă conține o regiune bogată în GC și câteva regiuni care au cel mai probabil rol reglator (ex. o regiune de ~170, relativ conservată între tulpinile virale, intervine probabil în reglarea replicării genomului viral) (Leary et al., 1999),(Peng et al., 2002).
Regiunea care are potențial de codificare este organizată în:
– ORF1, cel mai mare cadru de citire, codifică pentru o secvență de 770 (TTV -izolatul TA278) – 637 aminoacizi (TTMDV -izolatul MD1-073). El conține o regiune hipervariabilă, de dimensiuni reduse, (Nishizawa et al., 1999) care poate modula răspunsul imun (Jelcic et al., 2004),(Nishizawa et al., 1999).
– ORF2- poate codifica pentru o proteină care are dimensiunea de 123 (TTMDV -izolatul MD1-073) – 91 aminoacizi (TTMV -izolatul CBD231).
– patru ORFs care au dimensiuni mult mai reduse (ex. ORF3 are o capacitate de codificare de 57 aminoacizi); funcția biologică a produșilor pe care îi pot codifica aceste ORFs nu este descifrată.
– ORFs accesorii generate prin procese de splicing (Jelcic et al., 2004),(Qiu et al., 2005).
Expresia genelor virale poate să fie influențată de SNPs din genom (Ball et al., 1999), (Jelcic et al., 2004).
Diversitatea genetică. Diversitatea genetică extremă a virusurilor TT a determinat clasificarea lor în cinci grupuri genetice majore (notate cu 1-5) și mai mult de 39 de genotipuri. Diferențele de secvență dintre grupuri sunt mai mari de 50% iar cele observate între genotipuri pot ajunge la 30% (Biagini, 2004), (Heller et al., 2001), (Heller et al., 2001), (Okamoto, 2009).
Diversitatea genetică mare a virusurilor TT nu este specifică virusurilor care au genom ADN deoarece materialul lor genetic este replicat de ADN-polimerazele celulei gazdă care asigură o fidelitate crescută a replicării. În consecință s-a estimat că diversitate TTV poate crește prin realizarea unor recombinări omoloage intra-genomice (Leppik et al., 2007).
Analiza distribuției mutațiilor în regiunile codificatoare la diferite izolate TTV înrudite a indicat că, substituțiile apar cel mai frecvent în regiunile hipervariabile din ORF1. Aceste regiuni cresc diversitatea secvențelor de aminoacizi care sunt codificate de ORF1 și prin acest mecanism contribuie la evitarea răspunsul imun și la cronicizarea infecțiilor (Jelcic et al., 2004).
În prezent nu se știe dacă virusuri TT care au lungime completă (descrise în număr mare) reprezintă tipuri particulare de virus sau dacă variantele genomice mai scurte reflectă rearanjamente intragenomice care s-au produs în decursul timpului. Recombinările omoloage produse între diferite variante genomice de TTV pot să fie facilitate de prezența unor puncte fierbinți de recombinare, localizate preponderent în regiunile necodificatoare din genomul viral (Biagini et al., 2001),(Worobey, 2000) sau în regiunile hipervariabile din ORF1 (Manni et al., 2002). În aceste puncte nu au fost identificate secvențe specifice de nucleotide și nu reprezintă poziții cu semnificație particulară în genom care să predispună la instabilitate genomică (Wells et al., 2005). Totuși este posibil ca secvențele de nucleotide (contextul genomic regional caracterizat prin omologii între anumite secvențe repetitive sau prin concentrații mari de GC) să permită formarea unor structuri secundare particulare.
Dinamica secvențelor repetitive din genomul unor virusuri ADN a indicat că recombinările de la acest nivel pot să fie implicate în evoluția virusurilor (Amin et al., 2006) și în modificarea simptomatologiei bolilor virale (Patil et al., 2007). Diversitatea genetică, indiferent de mecanismul prin care este generată, poate să influențeze asocierea virusurilor TT cu patologia umană. În prezent, nu se cunoaște dacă recombinările intragenomice între anumite tulpini sunt necesare pentru ca TTV să dobândească potențial patogen.
Asocierea TTV cu patologia. Distribuția tulpinilor TT în populație și potențialul lor patogen au fost testate în diferite studii (Umemura et al., 2001), (McLaughlin-Drubin and Munger, 2008). Aceste virusuri pot avea un potențialul patogen indirect prin:
– influențarea funcționării sistemului imunitar. MicroARNs (miARNs) sunt molecule de ARN de mici dimensiuni (∼22 bp), necodificatoare, care intervin în reglarea posttranscripțională a expresiei genice (Lee, Feinbaum and Ambros, 1993), inclusiv în cazul genelor virale. miARN de proveniență virală pot interfera cu sinteza unor miARN în celula gazdă, pot sta la baza evadării imunologice, la reglarea balanței dintre infecțiile persistente și cele productive sau la cronicizarea infecției (Kincaid and Sullivan, 2012),(Cullen, 2013),(Boss and Renne, 2010). miARN codificate de TTV au fost identificate in vivo. miARN de origine virală pot interacționa cu N-myc (și STAT) interactor (NMI) și pot modifică expresia unor citokine pro-inflamatorii (via receptori Toll-like 9) (Rocchi et al., 2009) și interferoni (Kincaid et al., 2013), (Zhu et al., 1999) sau pot influența declanșarea apoptozei ca răspuns la infecția virală (Wang et al., 2012). Prin aceste mecanisme virusurile TT pot să contribuie la transformarea malignă (Zur Hausen and Villiers, 2009).
– promovarea sau accentuarea efectelor patogene ale altor agenți infecțioși care sunt prezenți în cazul coinfecțiilor virale. Această ipoteză se bazează pe identificarea frecventă în unele tumori umane a coinfecției cu TTV și virusurile herpetic 8 (în sarcomul Kaposi) (Girard et al., 2007), papiloma umane (la în carcinomul laringeal) (Szládek et al., 2005) sau HIV (în tumorile pacienților cu SIDA) (Thom and Petrik, 2007).
– promovarea unor aberații cromozomale structurale; infecțiile persistente cu TTV cresc riscul unor translocații specifice, cum sunt cele identificate în cazul unor tumori (ex. leucemii sau limfoame cu debut la copii) (Zur Hausen and De Villiers, 2005).
Aceste date arată că infecțiile cu TTV pot avea o contribuție la apariția unor tipuri de cancer. O serie de observații susțin această ipoteză:
– virusurile TT au fost identificate în tumorile umane (ex. tumori gastrointestinale, mieloame, boală Hodgkin, tumori cerebrale) (De Villiers et al., 2002), (Jelcic et al., 2004), (Sospedra et al., 2005), (De Villiers et al., 2007). TTV a fost identificat mai frecvent la paciente care au cancer de sân (84% vs. 60%) (Cimponeriu et al., 2013) sau cancer colorectal comparativ cu lotul control (De Villiers et al., 2007);
– prezența virusului în teritorii afectate de boli maligne. Identificarea unor secvențe de ADN specifice TTV uman la animale (ex. primate non-umane, cămile, bivoli de apă, găini, porci, vaci, oi) (Abe et al., 2000), (Leary et al., 1999), (Brassard et al., 2008), (Al-Moslih, Perkins and Hu, 2007) sugerează că ele pot produce infecții interspecifice (ex. genotipurile TTV umane 11 și 16 au fost detectate în ser și în lapte de cămilă) (Al-Moslih, Perkins and Hu, 2007). De asemenea prezența acestor secvențe în laptele recoltat de la Bubalus bubalis (bivolii de apă) crescuți în sudul Italiei (regiunea Caserta) (Roperto et al., 2009) sugerează ca virusurile TT pot să fie prezente și în glanda mamară.
– transcripția și replicarea virală în anumite celule normale (ex. celule din măduva osoasă) (Hiroaki Okamoto et al., 2000) sau tumorale (Zhong et al., 2002). ADN specific TTV a fost identificat în celulele nucleate din sânge (Shiraki et al., 2001),(Garbuglia et al., 2003), (Takahashi et al., 2002). În consecință este dificil să stabilim originea ADN viral din probele analizate (țesutul analizat sau celulele sanguine) (H. Okamoto et al., 2000), (Yu et al., 2002). De asemenea absența TTV din eritrocite și trombocite este corelată cu absența nucleului (inclusiv a ADN polimerazelor nucleare care sunt necesare pentru replicarea virală) din aceste celule diferențiate terminal. În celulele mononucleate din sânge, TTV se replică mai ales după ce se realizează stimularea acestora (Mariscal et al., 2002). Această observație susține importanța coinfecțiilor în declanșarea mecanismelor fiziopatologice.
În baza datelor prezentate devine evident că virusurile TT au un potențial patogen care însă nu este elucidat deși nu se poate exclude nici varianta că ele sunt doar virusuri oportuniste.
III. TIPURI DE STUDII UTILIZATE PENTRU INVESTIGAREA PREDISPOZIȚIEI PENTRU CANCER
Componenta genetică a bolilor maligne se poate investiga prin studii bazat pe scanarea genomică (GWS), pe linkage sau pe asociere.
Studiile de scanare genomică nu necesită o ipoteză de lucru deoarece sunt testați markerii genetici distribuiți în tot genomul (>100000 SNPs). În consecință sunt mai puțin predispuse la apariția unor rezultate eronate. În aceste studii se evită polimorfismele genetice care au alele minore cu frecvențe reduse. GWS au identificat un număr mare de gene care pot să fie asociate cu bolile maligne, inclusiv cu cancerul de sân. Această strategie de selectare a polimorfismelor genetice crește probabilitatea de a identifica loci care au o contribuție semnificativă la riscul de boală dar are dezavantajul că exclude din analiză alelele/ variantele genice rare care pot să contribuie semnificativ la apariția unor subtipuri de boală.
Studiile de linkage testează dacă un locus, care este ipotetic implicat în fiziopatologia bolii, co-segregă cu una dintre alelele unui marker genetic. În familii diferite pot exista alele diferite care predispun la boala. Aceste studii pot detecta locusul de susceptibilitate doar dacă acesta este localizat în vecinătatea polimorfismului genetic testat. Această strategie a fost aplicată mai ales pentru identificarea mutațiilor care au penetranță crescută în sindroamele genetice ereditare. Deși numărul cazurilor de cancer de sân care fac parte din această categorie este redus, investigarea lor a condus la identificarea unor noi mecanisme implicate în malignizare și a unor noi ținte potențiale pentru substanțe farmacologice.
Studiile bazate pe analiza perechilor de frați (gemeni monozigotici și dizigotici) sau a celor de tip părinte – copil sunt dependente de agregarea familială a cazurilor de cancer. Analiza concordanței la acești subiecți ajuta la înțelegerea contribuției componentelor ereditare și ambientale la predispoziția pentru boală. Acest tip de studiu este dificil de implementat pentru formele comune de cancer având în vedere că ~80% dintre ele sunt forme sporadice de boală.
Studiile de asociere necesită o ipoteză de lucru, bazată pe existența unei gene/ unor gene candidat de tip funcțional sau pozițional. Variantele unui polimorfism genetic se pot comporta ca un factor de risc sau ca un factor protectiv pentru boală. Linkageul strâns dintre locusul de susceptibilitate și polimorfismul genetic testat crește posibilitatea detectării unei gene relevante pentru predispoziția genetică. Acest tip de studiu este considerat util pentru investigarea predispoziției pentru formele sporadice de cancer de sân având în vedere particularitățile clinice și fiziopatologice ale acestor forme de boală.
IV. PARTE PRACTICĂ
Cercetarea a fost organizată în următoarele studii principale:
Studiul 1. Caracterizarea populației caucaziene din România.
Studiul 2. Testarea predispoziției pentru formele sporadice de carcinom ductal invaziv;
Studiul 3. Efectele citogenetice ale citostaticelor utilizate în chimioterapia cancerului mamar. Testarea reactivității genomului murin la acțiunea unor doze reduse de doxorubicină.
STUDIUL 1. CARACTERIZAREA FORMELOR SPORADICE DE CANCER DE SÂN LA PACIENTELE DIN ROMÂNIA
1.1 Introducere
În România aproximativ 25% din numărul total de cazuri de cancer nou identificate la femei sunt localizate la nivelul sânului ( Fig. 1) (Globocan, 2018) (No Title), no date).
Fig. 1. Numărul cazurilor de cancer nou diagnosticate în România (conform Globocan, 2018)
Formațiunile tumorale detectate clinic pot avea caracteristici variabile. Acestea se referă la dimensiune, consistență (fermă sau dură), margini (grade de delimitare variată) și localizare (sunt localizate cel mai frecvent în cadranul supero-lateral). În cazurile mai avansate se poate identifica retracția cutanată sau fixarea fasciei profunde. Durerea și secrețiile mamelonare pot să completeze uneori spectrul manifestărilor carcinomului invaziv.
În țara noastră la o pondere semnificativă de paciente cancerul de sân este diagnosticat în stadii avansate, atunci când formațiunile tumorale sunt palpabile. La diagnosticul tardiv al cancerului de sân contribuie:
– lipsa de eficiență a programelor de screening, accesul dificil la screeningul oportunist și la metodele modern de diagnostic, traseul complicat pe care îl urmează pacienta de la screening la tratament;
– deficitul de educație sanitară și de auto-screening;
– lipsa de încredere în sistemul medical;
– întârzierea (sau chiar refuzul) voluntar al investigațiilor;
– indiferență față de problemele medicale etc.
Carcinom ductal invaziv este cel mai frecvent tip de carcinom mamar. Se estimează că acesta reprezintă 47-75% din numărul total de cazuri de cancer mamar. Termenul “ductal” indică originea celulelor tumorale. Această concept nu este unanim acceptat deoarece se consideră că nu reflectă originea celulelor din unitatea terminală ducto-lobulară.
Macroscopic. Tumorile au dimensiuni variabile (0,1-10 cm), au consistența crescută sau dură, conturul tumorii este variabil (poate să fie neregulat, stelat, infiltrativ, sau mai rar bine delimitat). Din punct de vedere evolutiv se consideră că tumorile care au aspect stelat au un prognostic mai puțin favorabil (Renshaw, 2014).
1.2. Scop
În acest studiu am încercat să stabilim care este cel mai frecvent tip de cancer mamar identificat la pacientele din România.
1.3. Materiale și metode
Pentru această activitate am revizuit experiența personală pe acest subiect și am analizat 672 cazuri de cancer de sân din arhivele spitalelor din București.
1.4. Rezultate
Dacă îmi analizez experiența personală de 26 ani (intervalul de timp cuprins între momentul când, student fiind, m-am alăturat echipa dlui Prof Dr. Timaru I și momentul actual) constat o creștere constantă a numărului de cazuri de cancer de sân / an. Acest aspect este superpozabil pe incidența cazurilor de cancer de sân raportată la nivel național și internațional. În perioada de timp menționată s-a produs o diversificare și o creștere a specificității și sensibilității metodelor utilizate pentru diagnosticul cancerului mamar (ex. ecografia de mare fidelitate, sonoelastografia, mamografia computerizată, testarea genetică, biopsia ghidată ecografic, RM și CT, examenele histopatologice și imunohistochimice, examenul Oncotype Dx, etc.). Aceste progrese au permis creșterea procentului de cazuri de cancer de sân diagnosticate, rafinarea criteriilor utilizate pentru stadializarea bolii, abordări chirurgicale personalizate, refacerea estetică ulterioară și tratament oncologic sau hormonal specific fiecărui caz.
În ultimii ani s-a pus un accent deosebit pe dezvoltarea metodelor de screening și pe creșterea accesibilității populației la aceste metode. De altfel, politicile de sănătate de la nivel național și mondial au pus accent pe identificarea și inițierea cât mai precoce a tratamentului cancerului mamar. Pe baza experienței personale consider că este absolut necesar ca, după identificarea leziunilor mamare suspecte (prin metode imagistice și /sau clinice), să stabilim un diagnostic histopatologic (eventual imunohistochimic), fie prin puncție biopsie, fie prin excizia chirurgicală a leziunii. În cazul leziunilor de mici dimensiuni reperăm tumora, montăm ancora sub ghidaj ecografic și excizăm în limită de siguranță oncologică, cu control ecografic al piesei de rezecție (Fig. 2). Există cazuri în care avem confirmarea malignității prin puncție biopsie și în aceste situații, câteodată, procedăm la identificarea ganglionului santinelă. Astfel, înainte de excizia formațiunii tumorale se injectează Tc99 în albumină macrocoloidală, în câteva puncte peritumoral. Acesta are o resorbție și o migrare rapidă de la locul injectării, în rețeaua limfatică și un grad mare de retenție în ganglionul santinelă. Acesta este detectat cu ajutorul gamma camerei, conform imaginilor de mai jos. Poate fi evitată disecția axilară dacă leziunea mamară malignă este reprezentată de un carcinom ductal in situ iar în ganglionul santinelă nu există celule tumorale identificate histopatologic (Fig. 3).
Fig. 2. Montare ancoră cu ghidaj ecografic. (imagine originală).
Fig. 3. Ganglionul santinelă. a) identificarea ganglionului cu ajutorul gamma camerei; b) excizia ganglionului și confirmarea leziunii; (arhiva personală).
Studiul realizat a vizat identificarea factorilor care pot influența predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv. Din păcate, o parte dintre cazurile cu neoplazii mamare se prezintă în stadii avansate, unele dintre ele fiind depășite din punct de vedere oncologic ( Fig. 4, Fig. 5, Fig. 6). Deși aceste cazuri au fost excluse din studiu, procentul lor trebuie luat în seamă. Realizarea acestui studiu a necesitat asigurarea omogenității loturilor studiate și excluderea cazurilor care nu au respectat criteriile de includere (descrise în capitolul Materiale și metode). Astfel de cazuri sunt prezentate în figurile următoare ( Fig. 7, Fig. 8, Fig. 9, Fig. 10, Fig. 11, Fig. 12, Fig. 13).
Fig. 4. Caz exclus din studiu. a), b) tumoră mamară stângă gigantică, invadantă cutanat; c) aspect intraoperator; d) piesa excizată; e) final de rezecție; f) plagă postoperatorie; (imagine originală).
Fig. 5. Caz exclus din studiu. a), b) tumoră mamară dreaptă, invadantă cutanat; c) imagine intraoperatorie- incizie cutanată la distanță de tumoră; d) aspect intraoperator după excizia tumorii, a țesutului cutanat invadat și a fasciei pre pectorale; e) recoltare grefă cutanată de la nivelul coapsei cu ajutorul dermatomului; f) cicatrice postoperatorie imediată cu acoperirea deficitului parietal cu grefă cutanată; (imagine originală).
Fig. 6. Caz exclus din studiu. a), b) aspect preoperator postrezecție mamară stângă în urmă cu 5 ani. Se observă metastaze cutanate de a lungul cicatricei postoperatorii și bloc tumoral adenopatic metastatic; c) rezecția adenopatiei tumorale metastatice și a invaziei acesteia în vena axilară stângă cu refacerea venei axilare; d) final de rezecție; e) acoperirea deficitului parietal cu grefă cutanată de la nivelul coapsei; f) cicatrice postoperatorie la 3 luni; (imagine originală).
Fig. 7. Caz exclus din studiu. a), b) tumoră mamară sân stâng, cadran supero-intern, invadantă cutanat, ulcerată, suprainfectată; c), d) imagine intraoperatorie, excizie tumorală împreună cu țesutul muscular invadat; e) piesa de rezecție; f) cicatrice postoperatorie imediată; (imagine originală).
Fig. 8. Caz exclus din studiu. a) tumoră ulcerată infectată mamară stângă, cadran supero-intern, invadantă cutanat și la nivelul mușchiului pectoral mare; b) izolarea tumorii cu steril drape; c) excizia tumorii și a mușchiului mare pectoral invadat; d) final de rezecție; e) grefă cutanată recoltată de la nivelul coapsei și montată la nivelul deficitului parietal postrezecție; f) plagă postoperatorie la distanță; (imagine originală).
Fig. 9. Caz exclus; a) , b) tumoră mamară gigantă ulcerată și suprainfectată, cadran supero-extern- izolare cu steril drape; c), d) imagine intraoperatorie, rezecție tumorală; e) imagine intraoperatorie, final de rezecție; f) cicatrice postoperatorie imediată; (imagine originală).
Fig. 10. Caz exclus din studiu. a), b), c) tumoră mamară gigantă stângă ulcerată și suprainfectată – izolare cu steril drape; d) imagine intraoperatorie – final de rezecție; e) cicatrice postoperatorie la distanță în urma plastiei cutanate; (imagine originală).
Fig. 11. Carcinom mamar invaziv tip lobular [a) obiectiv 20x; b) obiectiv 10x] (imagini prelucrate din piesele descrise mai sus de Dna Dr. Vasilescu Florina)
Fig. 12. Caz exclus din studiu . Tumori benigne. Tumoră lipomatoasă. a) excizia tumorii; b) piesa de rezecție- tumora excizată; c) aspect macroscopic tumoră lipomatoasă; (imagine originală).
Fig. 13. Caz exclus din studiu. Tumoră benignă. a) Imagine preoperatorie- tumoră sân stâng cadrane inferioare; b), c) imagine intraoperatorie- excizie tumorală; d) sutură cutanată intradermică; e) aspect postoperator (3 luni); (imagine originală).
Cazurile incluse în studiu, selectate în funcție de scopul studiului, au fost reprezentate de carcinoame ductale invazive. Câteva exemple de cazuri incluse sunt prezentate în imaginile următoare ( Fig. 14, Fig. 15, Fig. 16, Fig. 17, Fig. 18, Fig. 19, Fig. 20).
Fig. 14. Caz inclus. a) piesă excizată- sectorectomie cadran supero-extern sân stâng; b) aspect intraoperator -final de rezecție; c) aspect intraoperator- axilă stângă evidată; d) cicatrice postoperatorie imediată; e) cicatrice postoperatorie (la 6 luni); (imagine originală).
Fig. 15. Caz inclus; a), b) tumoră voluminoasă sân stâng – cu hemoragie intratumorală; imagine preoperatorie; c), d) imagine intraoperatorie- final de rezecție cu ablația fasciei pre-pectorale, a stației limfoganglionare Rotter și limfadenectomie axilară stângă, cu prezervare de nervi axilari; (imagine originală).
Fig. 16. Caz inclus. a) imagine preoperatorie- tumoră mamară sân drept cu invazie cutanată, cu hematom post puncție biopsie; b), c) imagine intraoperatorie- final de rezecție cu ablația fasciei prepectorale, a stației limfo-ganglionare Rotter și limfadenectomie axilară dreaptă, cu prezervare de nervi axilari; (imagine originală).
După atingerea obiectivelor de vindecare oncologică, ne-am preocupat în mod constant de aspectul estetic, un factor extraordinar de important din punct de vedere psihologic. Au fost cazuri în care am abordat refacerea estetică prin efectuarea implantului mamar în același timp cu mastectomia (introducerea expanderului sau a protezei din silicon), dar și cazuri în care implantul s-a realizat în al 2-lea timp, după finalizarea tratamentului oncologic. Menționez că intervențiile cu caracter reconstructiv au fost efectuate de către Dl. Dr. Bogdan Marinescu (șef Clinică Chirurgie plastică a SUUMC) ( Fig. 17).
Fig. 17. Caz inclus în studiu. a) aspect preoperator; b) aspect intraoperator – final de rezecție cu ablația sânului, a fasciei anterioare a marelui pectoral, a stației limfoganglionare Rotter și limfadenectomie axilară dreaptă; c) imagine post limfadenectomie axilară dreaptă cu prezervarea nervilor axilari; d) expander; e) aspect postoperator imediat; f) aspect postoperator (3 luni). (imagine originală).
Fig. 18. Carcinom mamar invaziv tip NST (no special type), G3, invaziv în țesutul muscular striat (ob 20x) (imagini prelucrate din piesele descrise mai sus de Dna Dr. Vasilescu Florina)
Fig. 19. Carcinom mamar invaziv tip NST (no special type), G3, cu ulcerarea tegumentului (ob 10x) (imagini prelucrate din piesele descrise mai sus de Dna Dr. Vasilescu Florina)
Fig. 20. Carcinom mamar invaziv tip NST (no special type), G3, cu invazie perineurală prezentă [a) obiectiv 20x] (imagini prelucrate din piesele descrise mai sus de Dna Dr. Vasilescu Florina (imagini prelucrate din piesele descrise mai sus de Dna Dr. Vasilescu Florina)
Au fost investigate 672 cazuri de cancer de sân. Gruparea cazurilor de cancer de sân a indicat că 469 paciente au avut carcinom ductal invaziv (Fig. 21).
Fig. 21. Distribuția cazurilor de cancer de sân într-un lot de 672 cazuri
1.5. Concluzie
– Atât din experiența personala cât și din arhivele consultate carcinomul ductal invaziv este cel mai frecvent tip de cancer mamar.
STUDIUL 2. TESTAREA PREDISPOZIȚIEI PENTRU FORMELE SPORADICE DE CARCINOM DUCTAL DIN ROMÂNIA
2.1. Introducere
Investigarea factorilor care pot modula riscul pentru bolile comune necesită abordări complexe. În general acești factori de risc sau protectivi au penetranță redusă. Ei pot acționa independent, sinergic, aditiv sau multiplicativ. Interacțiunile biologice și statistice care se stabilesc între aceștia pot permite identificarea unor endofenotipuri. Descifrarea predispoziției pentru boală și identificarea unor endofenotipuri contribuie la dezvoltarea metodelor de screening, prevenție și pronostic. În consecință aceste descoperiri au un impact și asupra statusului clinic (personalizarea conduitei terapeutice, creșterea speranței de viață) și social al pacienților.
Obținerea unor rezultate replicabile este condiționată de definirea precisă a fenotipului studiat și este influențată de heterogenitatea clinică și genetică a bolii. Definirea imprecisă a fenotipului și erorile de includere contribuie semnificativ la eșecul studiilor de epidemiologie genetică. În cazul bolilor maligne heterogenitatea clinică (existența unor endofenotipuri) și genetică (cauzată de originea multiclonală a tumorii și instabilitatea genomică a celulelor tumorale) complică semnificativ definirea fenotipului de interes.
Testarea predispoziției pentru formele sporadice de carcinom ductal invaziv este justificată deoarece:
– incidența bolii în întreaga lume este semnificativă iar costurile directe și indirecte necesare pentru îngrijirea acestor pacienți sunt mari;
– date referitoare la caracteristicile epidemiologice și genetice ale cancerului de sân și ale subtipurilor de boală în România sunt destul de sărace (Pop et al., 2018), (Mihalcea et al., 2017),(Balacescu et al., 2016),(Mihalcea et al., 2015),(Negură et al., 2015),(Burcoș et al., 2013),(Narița et al., 2010),(Burcoș et al., 2010). În studiile realizate nu a fost testat impactul relațiilor de epistazie statistică asupra predispoziției pentru formele sporadice de carcinom ductal invaziv sau existența unor endofenotipuri.
– bolile maligne (inclusiv carcinomul ductal) au o evoluție stadială; etapele tumorigenezei și atingerea fenotipului malign complet (metastazat) sunt influențate de o serie de interacțiuni complexe care se stabilesc între factorii de risc și cei protectivi (Ahmad, 2013), indiferent de natura acestora;
– identificarea factorilor care modulează riscul de boală și descrierea unor endofenotipuri constituie etape esențiale pentru descifrarea arhitecturii bolilor complexe, inclusive pentru carcinomul ductal invaziv. Predispoziția genetică pentru aceste fenotipuri se poate explica cel mai frecvent prin ipotezele „variante rare multiple – boli comune” sau „variante comune – boli comune”. Prima ipoteză se bazează pe existența unui număr redus de alele care au penetranță semnificativă/ crescută și care sunt specifice anumitor grupuri etnice/ populații. Ipoteza „variante comune – boli comune” sugerează că predispoziția pentru fenotipurile complexe este asigurată de un număr mare de alele care au frecvență semnificativă în populația generală dar care au penetranță redusă în fenotip. Această ipoteză poate explica dezvoltarea unui număr mare de fenotipuri patologice, care sunt comune în populațiile umane. Datele din literatura de specialitate sugerează că ipoteza „variante comune – boli comune” explică cel mai bine predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv.
2.2. Scop. Obiective
În acest studiu se propune identificarea unor factori genetici și/sau nongenetici care pot influența riscul apariției formelor sporadice de carcinom ductal invaziv în populația caucaziană din România.
Obiectivele subordonate acestui scop sunt:
– identificarea factorilor genetici și nongenetici care pot modifica riscul apariției carcinomului ductal invaziv;
– descrierea factorilor sau combinațiilor de factori care pot influența vârsta la care a fost diagnosticată boala;
– identificarea unui model care descrie prezența unor forme sporadice de carcinom ductal invaziv și caracterizarea relațiilor de epistazie statistică dintre factorii care intră în componența sa.
2.3. Organizarea studiului
Investigarea arhitecturii predispoziției pentru bolile maligne este crescută de existența unor endofenotipuri, complexitatea predispoziției genetice și perioada mare de timp în care factorii de risc pot acționa reprezintă. Predispoziția pentru bolile complexe se poate testa prin studii bazate pe asociere sau pe linkage.
2.3.1. Studiile bazate pe testarea asocierii – tip caz-control
Aceste studii încearcă să identifice asocierea dintre un factor de risc și un caracter de interes (condiție patologică) prin analiza distribuției factorului de risc în loturile de pacienți și control. În studiile de tip caz-control variabilele independente sunt colectate retrospectiv iar variabila dependentă (prezența bolii) este identificată la includerea în studiu.
Studiile de tip caz-control permit investigarea unei game largi de factori de risc și fenotipuri complexe și necesită mai puțin timp, resurse financiare și logistice comparativ cu studiile bazate pe analiza linkageului. Aceste studii au dezavantajul că sunt influențate de particularitățile bolii (existența unor endofenotipuri), subiecților testați (ex. o parte dintre subiecți nu reprezintă un control real) sau ale populației din care s-a realizat eșantionarea (ex. stratificarea populației).
2.3.2. Estimarea puterii studiului și dimensiunea loturilor
Estimarea dimensiunii loturilor este utilă pentru proiectarea studiilor genetice astfel încât rezultatele care se obțin să atingă nivelul de încredere statistică dorit. Dimensiunile loturilor care asigură puterea dorită pentru un studiu se estimează pe baza caracteristicilor loturilor (ex. raportul între numărul de pacienți și de subiecți sănătoși), bolii (ex. la nivel fenotipic și populațional) și predispoziției genetice (ex. model de transmitere în descendență, frecvența alelelor de risc).
Dimensiunea loturilor necesare pentru acest studiu a fost estimată cu programele StatsDirect și Power for Genetic Association (PGA). În simulările realizate s-a considerat că valorile riscului de boală sunt semnificativ dacă sunt cuprinse în intervalul 1,2 -2,5.
Simulările realizate cu programul StatsDirect (funcția “sample size”) au evidențiat că numărul minim de subiecți / lot (n= 157) se obține dacă: probabilitatea de expunere – pentru lotul control a fost 0,3; O.R. a fost 2,1; raportul dintre numărul de subiecți control și cel de pacienți a fost 1; alfa a fost 0,05 iar puterea studiului a fost 0,8.
Cu programul PGA s-a estimat impactul pe care îl au asupra puterii studiului: modelul genetic asumat, riscul relativ estimat (2,1), LD – dezechilibrul de linkage (1,0), prevalența caracterului patologic (0,30) și alfa (0.05). Rezultatele obținute au indicat că, în funcție de modelul testat (dominant, recesiv sau codominant), dimensiunea minimă recomandată pentru loturi este de 100 – 170 subiecți ( Fig. 22).
Rezultatele obținute la simulările efectuate cu programele StatsDirect și PGA sunt concordante cu cele publicate de Dupont WD și Plummer WD. Aceștia au estimat că un efect genetic substanțial se poate detecta chiar și prin studierea unor loturi care au dimensiuni relativ reduse (ex. n = 200 subiecți / lot) (Dupont and Plummer, 1990).
Fig. 22. Puterea studiului (estimare cu programul PGA; Legendă culori: roz -model codominant, portocaliu -model dominant, negru -model recesiv).
2.3.3. Criterii de includere și excludere
Studiul propus este de tip caz-control. Realizarea sa presupune constituirea unor loturi de studiu cât mai omogene din punct de vedere populațional, fenotipic și genetic. Acest aspect se poate asigura prin utilizarea unor criterii precise de includere-excludere.
Principalele criterii pentru excludere au fost: antecedente persoanele (în cazul subiecților din lotul control) sau heredocolaterale de boli maligne (inclusiv alte forme de cancer de sân sau forme sindromice de cancer), evenimente maligne la nivelul glandei mamare controlaterale, mutații cu penetranță crescută în genele BRCA1, BRCA2 și TP53 (la subiecții selectați pentru studiu sau la rudele lor directe), implanturi sau operații estetice înainte de diagnosticul cancerului mamar, expunerea (profesională sau accidentală) la agenți mutageni recunoscuți (ex. radiații sau mutageni chimici) sau potențiali (ex. insecticide, pesticide), prima naștere s-a produs la mai puțin de 31 săptămâni de sarcină, femei care au născut înainte de 18 ani sau după 37 ani, suspiciuni de preeclampsie, accident vascular cerebral, obezitate (IMC >30kg/m2 oricând pe parcursul vieții), incertitudini privind etnia sau locul de naștere, utilizarea unor medicamente care pot modifica riscul de cancer de sân (ex. dietilstilbestrol), terapia de substituție hormonală (care include estrogeni sau progesteron) sau absența acordului pentru participare la studiu. În studiu nu au fost incluse persoane care au fumat mai mult de 25 țigări/ zi cel puțin 1 an, cele care au avut perioade mai mari de 2 luni în care au renunța la fumat sau care au avut variații ale numărului de țigări fumate / zi mai mari de 25%. Au fost excluse și persoanele care au raportat că au consumat mai mult de 75g alcool / zi, mai mult de 3 zile pe săptămână. În studiu nu au fost incluse persoane pare care au avut o durată total de lactație mai mică de 4 luni, la care s-a indus lactația sau care au avut relactație.
Principalele criterii de includere au fost:
– subiecți caucaziene care aparțin unui grup etnic relativ omogen din punct de vedere genetic (Nica et al., 2020), care s-au născut și au trăit într-o regiune care a fost foarte clar delimitată din punct de vedere geografic. Această regiune (Sudul României) include orașul București și județele Ilfov, Călărași, Dâmbovița, Dolj, Giurgiu, Ialomița, Ilfov, Olt și Teleorman.
– paciente care au fost diagnosticate cu forme sporadice de carcinom ductal invaziv (diagnosticul a fost confirmat histologic);
– vârsta la includerea în studiu și la care a fost diagnosticată boala a fost cuprinsă în intervalul 50-65 ani;
– femei sănătoase din punct de vedere clinic și paraclinic, similare ca vârstă, etnie și origine geografică cu pacientele.
– menarha s-a produs în intervalul 9-13 ani.
Pe baza datelor prezentate în subcapitolul anterior s-a stabilit că acest studiu va avea puterea statistică de 80% pentru a detecta un factor de risc cu impact moderat asupra riscului de boală dacă sunt analizați minim 150 pacienți cu carcinom ductal (lot paciente) și 200 femei sănătoase (lot control).
Loturile finale au fost reprezentate 158 femei cu carcinom ductal invaziv (vârsta medie 60,12±3,05 ani) și 200 femei considerate clinic și paraclinic sănătoase (vârsta medie 59,27±3,82 ani) recrutate din spitale din România. O parte dintre probele testate au provenit de la Dr Crăciun Anne-Marie.
Schema constituirii loturilor este prezentată în graficul următor (Fig. 23).
Fig. 23. Constituirea loturilor de studiu.
2.3.4. Teste de biologie moleculară
a) Strategia de genotipare. Pentru acest studiu au fost considerate gene de tip candidat pozițional sau funcțional pentru cancerul de sân sau fenotipurile asociate. Acestea sunt: interleukina 6 (IL6), enzima de conversie a angiotensinei I (ACE), receptorul tip 1 pentru angiotensina 2 (AGTR1), sintetaza endotelială a oxidului nitric (eNOS), metilentetrahidrofolat reductaza (MTHFR), factorul de creștere transformant B 1 (TGFb), selectina L (L-SELL). Date referitoare la expresia acestor gene în țesuturile relevante pentru cancerul de sân au fost obținute din bazele publice de date (ex. GENE, AceView, ENSEMBL). Produșii acestor gene sunt implicați în inflamație, hemodinamică sau ciclul metil.
Selectarea polimorfismelor genetice de interes s-a realizat utilizând următoarele criterii: polimorfismele sunt incluse într-o bază publică de date (ex. dbSNP, Alfred, Ensemble și ClinVar), există date populaționale privind distribuția variantelor acestor polimorfisme, au MAF (frecvența alelei minore) >5% și nu se găsesc în regiuni particulare din genom (regiuni bogate în GC, regiuni care se găsesc în mai multe copii / genom sau care au similaritate cu secvențe din pseudogene).
Polimorfismele de interes pentru acest studiu au fost: ACE ID (rs4646994), AGTR1 A1166C (rs5186), eNOS 4a/b, TGFb C-509T (rs1800469), IL6 G-174C (rs1800795), L-SELL P213S alias C/T (rs2229569) și MTHFR C677T (rs1801133).
Probele au fost testate pentru a verifica prezența/ absența mutațiilor BRCA1 185delAG, BRCA1 5382insC și BRCA2 6174delT care au penetranță crescută în cancerul de sân. Subiecții pozitivi pentru aceste mutații au fost excluși din studiu.
Testarea și optimizarea in silico a metodelor utilizate pentru genotipare. BLAST și BLAT au fost utilizate pentru: localizarea polimorfismelor de interes în genom, testarea specificității primerilor și identificarea regiunilor genomice care au similaritate crescută cu secvențele de interes.
Metodele utilizate pentru genotipare au fost testate și optimizate in silico cu programele OligoAnalyzer 3.1 Integrated DNA Technologies, UNAFold (Zuker, 2003), RestrictionMapper (Blaiklock, 2009). Programul DINAMelt (Markham and Zuker, 2005) s-a utilizat pentru a estima capacitatea unei secvențe de ADN de a adopta conformații particulare. Rezultatele obținute au fost utilizate pentru a stabili dacă regiunile genomice de interes se pot amplifica prin sau dacă ampliconii se pot testa prin metode indirecte de analiză (ex. analize de tip HRM -analiza curbei de topire a ampliconilor, SSCP – analiza polimorfismului conformațional al monocatenelor și HA – analiza heteroduplexurilor).
Metode utilizate pentru genotiparea polimorfismelor de interes. Probele de sânge periferic (recoltat pe EDTA) necesare pentru constituirea băncii de ADN au fost congelate la -200C în primele 24 ore de la recoltare de la fiecare subiect inclus în studiu. ADN s-a extras din 300 µl sânge cu Promega Wizard® Genomic DNA Purification Kit, conform instrucțiunilor producătorului. Puritatea ADN extras a fost măsurată la nanodrop. Ulterior tuburile cu soluția de ADN au fost păstrate la -200C până la efectuarea testelor de biologie moleculară.
Genotiparea polimorfismelor de interes s-a realizat prin metode bazate pe PCR (PCR-RFLP și PCR-ARMS). Amplificarea regiunilor care conțin polimorfismele de interes s-a realizat prin reacția de polimerizare în lanț (PCR). Pentru o reacție s-au folosit 7 componente esențiale: o ADN polimerază termostabilă, o pereche de primeri oligonucleotidici sintetizați in vitro, deoxinucleotidtrifosfați (dNTP), cationi bivalenți, o soluție tampon pentru PCR, cationi monovalenți și o matriță ADN (până la 1,0 μg/reacție sau ~3 x 105 copii ale unei regiuni autozomale).
Detectarea variantelor polimorfismelor de interes. Genotiparea ampliconilor s-a realizat prin electroforeza ampliconilor (în cazul polimorfismului de tip InDel) sau prin metoda PCR-RFLP (în cazul polimorfismelor de tip SNP). Metoda PCR-RFLP presupune digestia ampliconului care conține polimorfismul de interes cu endonucleaze specifice și separarea fragmentelor de restricție prin electroforeză orizontală (în gel de agaroză) sau verticală (în gel de poliacrilamidă). Această metodă a fost utilizată pentru genotiparea polimorfismelor de interes deoarece produce rezultate reproductibile iar costurile pentru genotipare sunt reduse.
b) identificarea mutațiilor cu penetranță crescută. Mutații cu penetranță crescută BRCA1 185delAG, BRCA1 5382insC și BRCA2 6174delT au fost testate cu Pronto® BRCA kit. Pentru detecția mutațiilor kitul utilizează extensia primerilor cu un singur nucleotid iar detecția ampliconilor se realizează prin metoda ELISA.
c) Căutarea unor variante genetice noi în vecinătatea polimorfismelor de interes. Această activitate s-a realizat cu metode indirecte de analiză (ex. analiza polimorfismului conformațional al monocatenelor – SSCP, analiza heteroduplexurilor -HA, analiza combinată SSCP-HA, analiza curbelor de topire de înaltă rezoluție -HRM).
d) Identificarea materialului genetic specific virusurilor Torque teno a fost realizată prin hemi-nested PCR (Ninomiya et al., 2008). Rezultatele au fost confirmate și prin analiză HRM (high resolution melting) cu kitul SensiMix® (Bioline, USA).
Aparatura utilizată pentru testele de biologie moleculară a fost reprezentată de: sisteme de electroforeză orizontală și verticală, aparat Corbett RotorGene 6000 dotat cu modul HRM, sistem pentru controlul temperaturii lichidului din tancul de electroforeză.
2.3.5. Prezentarea datelor
Femeile care au utilizat anticoncepționale orale cel puțin 2 ani s-au considerat pozitive pentru acest caracter.
În categoria fumătoarelor active a fost definit subgrupul de subiecți fumători ocazionali dacă au fumat maxim 5 țigări/zi.
Numărul de pachete de țigări fumate înainte de prima sarcină a fost estimat cu formula:
unde: – număr ani= numărul de ani în care persoana a fumat înainte de prima sarcină;
– 365= număr zile/ an
– 20 = număr țigări/ pachet
Tipul de activitate diurn sau nocturn a fost stabilit în funcție de modul în care subiecții și-au desfășurat activitatea/ au lucrat. S-a considerat că subiecții au avut activitate nocturnă dacă și-au desfășurat activitatea noaptea sau au lucrat în ture de noapte cel puțin 5 ani.
Exercițiile fizice au fost considerate regulate dacă subiecții au efectuat minim 30 de minute de exerciții fizice moderate- viguroase/ zi pentru cel puțin cinci zile / săptămână. Dacă exercițiile efectuate săptămânal au echivalat cu 1-4 astfel de antrenamente s-a considerat că au efectuat ocazional exerciții fizice. Persoanele care au efectuat mai puțin de un astfel de antrenament/ săptămână au fost considerate sedentare (Fagard, 2011).
2.3.6. Prelucrarea statistică a datelor
În acest studiu au fost investigate variabile cantitative și variabile calitative.
a) Compararea variabilelor cantitative. Aceste variabile au fost prezentate sub formă de valoare medie + SD (valoare minimă –valoare maximă). Asocierea dintre fenotip și aceste variabile a fost estimată cu Odds-Ratio (O.R.). Prima etapă în calcularea OR reprezintă tabularea datelor.
Tabel 1. Exemplu de tabel utilizat pentru calcularea O.R.
Formula de calcul pentru O.R. a fost:
O.R. =
O.R. poate avea valori cuprinse între 0 și +∞. Dacă valoarea OR este 1 se consideră că factorul testat nu este asociat cu boala (este distribuit similar în cele două loturi). Dacă valoarea este subunitară atunci factorul testat este considerat protectiv. Dacă valoarea este supraunitară atunci factorul testat este considerat de risc. Valorile OR cuprinse în intervalul 1,5-– 2 sunt considerate moderat iar cele > 2 sunt considerate asocieri puternice.
Testele chi2 și Fisher au fost utilizate pentru analiza distribuției datelor calitative (ex. genotipuri și alele) în loturile de interes. Testul Chi2 a fost utilizat pentru a evalua discrepanța dintre rezultatele observate și cele așteptate. Testul este aplicat dacă observațiile sunt independente, variantele de răspuns se exclud reciproc iar numărul de observații nu este foarte redus (ex. numărul total de observații >20, maxim 20% dintre căsuțele tabelului de contingență au valori <5).
În cazul tabelelor de contingență 2×2 care conțin un număr redus de observații (ex. cel puțin una dintre valorile tabelate a fost mai mică sau egală cu 10) s-a aplicat corecția Yates. Această corecție reduce cu 0,5 diferența dintre frecvențele observate și cele așteptate și apoi ridică rezultatul la pătrat. Se consideră că această corecție este conservativă.
Compararea distribuției genotipurilor în conformitate cu condiția de echilibru Hardy-Weinberg s-a realizat utilizând un grad de libertate (DF =1). Respectarea condiției de echilibru Hardy-Weinberg a fost o precondiție pentru a compara distribuția acestora în loturile studiate.
b) Compararea variabilelor calitative. Variabilele calitative (inclusiv datele obținute în urma genotipării polimorfismelor de interes) au fost prezentate ca valori absolute (procentuale) sau au fost reprezentate sub forma graficelor de tip coloană. Pentru a verifica dacă datele provin dintr-o populație de valori care are o distribuție normală s-a utilizat testul Shapiro-Wilk. Dacă datele respectă o serie de condiții (ex. distribuție normală, dispersie omogenă) atunci variabilele s-au comparat cu teste parametrice. Dacă aceste condiții nu au fost îndeplinite atunci datele au fost comparate cu teste non parametrice. Principalele teste non parametrice utilizate au fost:
– Testul U al lui Mann Whitney (5) – pentru a compara date chiar dacă acestea nu sunt perechi.
– Testul Kruskal-Wallis a fost utilizat pentru a compara mai multe eșantioane, indiferent dacă datele au fost sau nu au fost perechi.
– Corelația este utilizată pentru a identifica existența unei relații între două variabile. Rezultatul este exprimat sub forma unui coeficient de corelație care poate avea valori cuprinse în intervalul (-1 si +1). Valorile extreme indică dependența dintre cele două variabile iar valoarea 0 demonstrează absența unei relații liniare între acestea. Testele de corelație au fost aplicate pentru variabilele cantitative relevante în cazul în care corelația dintre cele două variabile este lineară.
Coeficientul de corelație a fost calculat cu formula:
Unde și reprezintă media celor două eșantioane comparate.
– ANOVA (ANalysis Of VAriance)- testează simultan împrăștierea valorilor unei variabile continue în mai multe eșantioane. Testul compară variabilitatea mediilor tuturor grupurilor cu variabilitatea din jurul mediei specifice fiecărui grup. Dacă variabilitatea în interiorul grupului este similară cu variabilitatea mediei tuturor grupurilor atunci se consideră că mediile provin din aceeași populație (este acceptată ipoteza nulă).
Acest test are avantajul că deși compară mai multe grupuri pragul de semnificație statistică nu scade foarte mult. Chiar dacă diferențele sunt semnificative testul nu poate preciza care sunt loturile care diferă semnificativ.
ANOVA cu 2 factori independenți a fost utilizat pentru a testa asocierea dintre o variabilă dependentă (continuă) și două variabile independente (variabile discrete); testul permite o diferențiere între influențele exercitate independent de către fiecare factor de cele care rezultă din combinarea acestor factori.
– Analiza post-hoc a fost utilizată dacă testul ANOVA a respins ipoteza nulă (ipoteza privind egalitatea mediilor). Acest test utilizat pentru comparații multiple identifică grupurile care au medii care diferă semnificativ. Pentru acest studiu s-a utilizat metoda de analiză post-hoc Tukey HSD (HSD -honestly significant difference). Această metodă deși compară toate perechile de grupuri este considerată suficient de conservativă.
c) Metoda reducerii dimensiunilor multiple (MDR- multifactor-dimensionality reduction). Metodele clasice care pot testa interacțiunile dintre factorii de risc (ex. metode de regresie logistică, testarea dezechilibrului de linkage) au o serie de limitări (Moore and Williams, 2002). MDR este o metodă derivată din algoritmii de tip learning machine. Ea analizează combinații de date calitative (Ritchie et al., 2001),(Hahn, Ritchie and Moore, 2003),(Ritchie, Hahn and Moore, 2003) și identifică interacțiuni care nu sunt lineare între diferite tipuri de atribute (ex. factori calitativi de risc sau protectivi etc.).
MDR, în comparație cu metodele clasice de analiză, are două avantaje majore: este non-parametrică și reduce dimensiunea datelor analizate. Puterea metodei MDR este crescută de posibilitatea de testare permutațională a datelor, posibilitatea de validare încrucișată a rezultatelor și construirea de atribute noi prin combinarea variabilelor disponibile (realizează o analiză exhaustivă a datelor).
Programele utilizate pentru testele de asociere, corelație și de epistazie statistică au fost Microsoft Excel ®, Simple Interactive Statistical Analysis-SISA, StatsDirect și MDR (reducerea dimensiunilor multiple).
Semnificația statistică a diferențelor. În studiile biomedicale se consideră că un rezultat de asociere este semnificativ dacă p <0,05. Pentru acest studiu am utilizat p cu două cozi deoarece variabilele comparate puteau să prezinte diferențe bidirecționale. Deoarece am testat ipoteze multiple valoarea prag pentru semnificația statistică a fost corectată prin metoda Bonferroni care reduce riscul de a identifica rezultate fals pozitive (eroare de tip I). Această corecție se aplică mai ales dacă numărul de teste este mediu (cum este și în cazul acestui studiu). În baza de date organizată pentru acest studiu au fost înregistrați 35 parametrii principali. In consecință, valoarea prag pentru a respinge ipoteza nulă a fost diminuată – p corectat <0,0014.
2.3.7. Etică
Acest studiu pilot s-a organizat conform principiilor Declarației de la Helsinki și a fost avizat de către Comisia de etică a Spitalului Universitar de Urgență Militar Central “Dr.Carol Davila” (aviz nr 1627/ 25.03.2015; nr 338/21.06.2019).
2.4. Rezultate
Identificarea mutațiilor cu penetranță crescută din genele BRCA1, BRCA2 și TP53.
Mutațiile BRCA1 185delAG, BRCA1 5382insC și BRCA2 6174delT au fost testate cu Pronto® BRCA kit. Fiecare probă a fost testată pentru prezența alelei normale și pentru prezența alelei mutante. Dintre cele trei mutații testate a fost identificată doar BRCA1 5382insC (Fig. 24). Două dintre paciente au fost excluse din studiu deoarece aveau mutații BRCA1 5382insC.
Fig. 24. Testarea mutațiilor BRCA1 185delAG, BRCA1 5382insC și BRCA2 6174delT (cu BRCA Pronto Kit). Vârful de săgeată roșie indică o probă heterozigotă pentru mutația BRCA1 5382insC.
În lotul investigat nu au fost detectate mutații în gena TP 53. În consecință nu au fost exclude din studiu paciente din cauza mutațiilor în această genă.
Fig. 25. Imagini cu geluri de poliacrilamidă în care au fost analizați prin metoda SSCP-HA (stânga) și HA (dreapta) (colorație argentică) în vederea testării existenței unor noi mutații în regiunile de interes (exemplificare pentru o regiune din exonul 11 al genei BRCA1 și respectiv pentru TP53).
2.4.1. Caracterizarea subiecților rămași în studiu
Perioada de includere a fost cuprinsă în intervalul 01.XI.2016 –01.III.2020.
Distribuția geografică a subiecților. Subiecții au fost selectați din regiunea de Sud a României. Această regiune este considerată omogenă din punct de vedere: istoric (face parte din regiunea cunoscută anterior ca Țara Românească / Valahia), geografic, lingvistic și genetic (nu există bariere geografice semnificative care pot interfera cu fluxul genic) (Nica et al., 2020).
Regiunile din care au provenit subiecții selectați pentru acest studiu sunt: București și județele Ilfov, Călărași, Dâmbovița, Dolj, Giurgiu, Ialomița, Ilfov, Olt și Teleorman ( Fig. 26).
Fig. 26. Distribuția geografică a cazurilor care au fost selectate pentru acest studiu
Distribuția cazuisticii pentru acest studiu în funcție de luna ( Fig. 27) și vârsta ( Fig. 28) la care s-a stabilit diagnosticul de cancer de sân precum și vârsta la care s-a realizat includerea ( Fig. 29) sunt prezentate în format grafic.
Distribuția vârstei la care au fost diagnosticate cazurile de carcinom ductal invaziv nu a fost de tip Gaussian (testul Shapiro-Wilk p=0,01).
Fig. 27. Distribuția calendaristică a cazurilor în funcție de luna în care s-a stabilit diagnosticul de cancer de sân
Fig. 28. Distribuția cazuisticii în funcție de vârsta la care s-a stabilit diagnosticul de carcinom ductal invaziv.
Fig. 29. Repartizarea cazuisticii în funcție de vârsta la includere
2.4.2. Predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv
Investigarea predispoziției pentru carcinomul ductal a presupus parcurgerea a două etape principale: testarea individuală a fiecărui factor de interes și estimarea impactului pe care îl are asocierea acestor factori.
Lotul de studiu a fost alcătuit femei care au avut carcinom ductal invaziv (n=158) sau care au fost considerate sănătoase din punct de vedere clinic și paraclinic (n=200). Intervalul de timp cuprins între diagnosticul cancerului de sân (ani) și includerea în acest studiu a fost de 1,92±1,80 ani (0-7 ani). Principalele caracteristici ale subiecților care au rămas în studiu sunt prezentate în Tabel 2.
Tabel 2. Caracteristicile subiecților care au rămas în acest studiu după ce s-au aplicat criteriile de includere și excludere
Analiza datelor înregistrate pentru subiecții selectați pentru acest studiu a evidențiat unele diferențe între lotul de pacienți și cel control care se referă la expunerea activă sau pasivă la fum de țigară, vârsta la prima sarcină, particularitățile lactației și utilizarea anticoncepționalelor orale.
IMC (25,62 kg/m2 vs. 25,13 kg/m2), procentul de femei supraponderale (63,92% vs. 48%), numărul de pachete de țigări fumate înainte de prima sarcină dusă la termen (3917,23 vs. 1999,90) și durata expunerii pasive la fum de țigară/zi (5,22 ore vs. 4,66 ore) au avut tendința de a avea valori mai mari în lotul de paciente comparativ cu femeile din lotul control (p<0,05).
– Paritatea
Sarcinile duse la termen au reprezentat un caracter protectiv important pentru carcinomul ductal invaziv (O.R.= 0,41, p=3,6E-5). Prima sarcină produsă înaintea vârstei de 30 ani a reprezentat un factor protectiv comparativ cu sarcina produsă după această vârstă sau cu absența sa (O.R.=0,20, p=0*). Prima sarcină după vârsta de 30 de ani a reprezentat un factor de risc important pentru boală dacă s-a raportat la cele produse înainte de această vârstă (O.R.=5,02, p=0*) ( Tabel 2).
Vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină a fost semnificativ mai mare la paciente comparativ cu femeile din lotul control (29,34 ani vs. 25,06 ani, p=5,4e-10) ( Tabel 2); diferența de vârstă a fost mai evidentă în cazul femeilor unipare (30,26 ani vs. 25,33 ani; p<0,001) ( Fig. 30). În sublotul de paciente pare vârsta la care s-a produs prima sarcină dusă la termen a avut tendința de a fi cu 2,11 ani mai mare la unipare comparativ cea înregistrată la multipare (30,26 ani vs. 28,15 ani, p=0,03) (Tabel 3).
O diferență de 5,61 ani a existat și între vârsta la care s-a produs prima sarcină la pacientele unipare comparativ cu vârsta la femeile control multipare (30,26 ani vs. 24,65 ani; p<0,001) (Tabel 3).
Tabel 3. Compararea vârstei la care s-a produs prima sarcină la subiecții care au avut sarcini duse la termen (Analiza post-hoc -Tukey HSD valoarea p)
Fig. 30. Vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină la femeile din loturile de paciente și control, stratificate în funcție de numărul sarcinilor
– Virusurile Torque Teno
Virusurile TTV (O.R.=3,14, p=1,0E-6) și TTMDV (O.R.=2,64, p=1,0E-5) au fost identificate mai frecvent în lotul de paciente comparativ cu lotul control. Un rezultat similar a fost obținut și pentru coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=2,73, p=4,01, E-6).
Distribuția indivizilor care au avut coinfecții cu două variante virale sau cu toate trei virusurile a fost similară în loturile de pacienți și control (p>0,05) (Tabel 4).
Pentru a putea înțelege mai bine relația dintre virusuri și carcinomul ductal s-au comparat datele înregistrate pentru indivizii care aveau infecții monotipice sau coinfecții cu aceste virusuri. Proporția de pacienți și femei sănătoase care aveau infecții doar cu TTV a fost similară (4,43% vs. 4%, p>0,05). Numărul de subiecți care aveau doar TTMDV sau TMV a fost prea redus pentru a se putea compara din punct de vedere statistic. În consecință nu s-a putut formula o concluzie referitoare la acest aspect.
Tabel 4. Distribuția virusurilor Torque teno în loturile investigate
– Paritatea și virusurile Torque Teno
Virusurile Torque Teno au fost identificate mai frecvent la pacientele care au avut prima sarcină după vârsta de 30 ani sau care au fost nulipare comparativ cu subloturile control corespunzătoare (Tabel 5).
Tabel 5. Distribuția virusurilor Torque Teno la subiecții stratificați pe baza datelor referitoare la prima sarcină
– Perioada de lactație
Asocierea dintre carcinomul ductal invaziv și lactație este similară cu cea dintre boală și paritate (O.R.= 0,41, p=3,6E-5). În mod similar pacientele care nu au avut perioadă de lactație (56,33% vs. 34,5%) au avut un risc de boală similar cu cel al nuliparelor (O.R.=2,45, p=3.6E-5). Pentru a se discrimina efectul acestor factori s-a estimat și efectul perioadei totale de lactație. Ea a fost cu ~ 6,59 luni mai redusă la paciente comparativ cu femeile control, diferență care este înalt semnificativă din punct de vedere statistic (13,52 luni vs. 20,11 luni, p = 0,000002). Pacientele care au avut lactație mai puțin de 6 luni au fost de ~2,85 ori mai frecvente comparativ cu femeile control (8,7% vs. 3,05%, p>0,05). Femeile care au avut o perioadă de lactație mai mare de 12 luni au fost comparate și cu cele care nu au avut lactație. Procentul pacientelor care au avut mai mult de 12 luni de lactație a fost semnificativ mai redus comparativ cu valorile estimate pentru lotul control (38,20% vs. 58,68%, O.R.=0,27, p=0*). Acest caracter a rămas protectiv și dacă raportarea s-a făcut la pacientele care au avut o perioadă de lactație mai redusă de 12 luni (O.R.=0,32, p=0,0003) ( Tabel 2).
– Perioada de lactație și virusurile Torque Teno
S-a comparat distribuția probelor pozitive pentru virusurile TT în subloturile de subiecți stratificate în funcție de durata lactației. Procentul pacientelor care nu au avut lactație și care au fost pozitive pentru virusurile Torque Teno, TTV, TTMDV, TTMV sau coinfecția cu TTV și TTMDV a fost cel puțin dublu comparativ cu cel estimat pentru lotul control (p<0,001). În cazul subiecților care au avut mai puțin de 12 luni de lactație, coinfecția cu TTV și TTMDV a fost de ~ 3 ori mai frecventă la paciente comparativ cu lotul control (15,82% vs. 5%). În consecință, virusurile Torque Teno sunt asociate cu un risc crescut de apariție a carcinomului ductal invaziv (O.R. > 2,89).
În subloturile de paciente și femei sănătoase care au avut lactație mai mare de 12 luni distribuția virusurilor TT a fost similară ( Tabel 6).
Tabel 6. Distribuția virusurilor TT în subloturile de subiecți obținute prin stratificare în funcție de durata lactației
– Prima sarcină după vârsta de 30 ani, perioada de lactație mai mică de 12 luni și virusurile Torque Teno
Sarcina la vârstă înaintată (după vârsta de 30 ani), perioada totală de lactație care nu a depășit 12 luni și prezența virusurilor Torque Teno au reprezentat factori asociați cu carcinomul ductal invaziv. S-a observat că asocierea dintre prima sarcină după 30 ani, durata de lactație (totală) mai mică de 12 luni și coinfecția cu TTV și TTMDV crește riscul de carcinom ductal invaziv ( Tabel 7).
Tabel 7. Relația dintre carcinom ductal invaziv, prima sarcină după vârsta de 30 ani, perioada de lactație < 12 luni și virusuri TT
– Polimorfismele genetice
Distribuția genotipurilor testate în ambele loturi este în concordanță cu condiția de echilibru Hardy-Weinberg. În această activitate s-au comparat distribuțiile polimorfismelor considerate individual sau în asociere.
a) Compararea distribuției genotipurilor și alelelor în loturile de pacienți și control nu a evidențiat diferențe semnificative din punct de vedere statistic indiferent dacă a fost asumat un model dominant sau recesiv. Când s-a utilizat modelul codominant s-a observat doar o tendință de asociere între polimorfismul IL6 G-174C și carcinomul ductal invaziv, genotipul heterozigot apărând ca un factor protectiv (O.R.=0,61, p=0,03) (Tabel 8).
Tabel 8. Distribuția genotipurilor în loturile de paciente cu cancer de sân și femei sănătoase
b) Analiza combinațiilor de genotipuri
Principalele rezultate obținute la analiza combinațiilor alcătuite din câte două polimorfisme genetice și carcinomul ductal invaziv sunt prezentate în tabelele următoare (Tabel 9, Tabel 10, Tabel 11, Tabel 12, Tabel 13, Tabel 14).
Tabel 9. Analiza distribuției combinațiilor de variante genetice care includ ACE ID
Tabel 10. Analiza distribuției combinațiilor de variante genetice care includ AGTR1
Tabel 11. Analiza distribuției combinațiilor de variante genetice care includ eNOS 4b/a
Tabel 12. Analiza distribuției combinațiilor de variante genetice care includ TGFb
Tabel 13. Analiza distribuției combinațiilor de variante genetice care includ IL6 G-174C
Tabel 14. Analiza distribuției combinațiilor de variante genetice care includ L-SELL P213S
Analiza combinațiilor de polimorfisme genetice a evidențiat că IL6 GG -TGFb CC (O.R.=34,69, p<0,0001) este asociat foarte puternic cu carcinomul ductal invaziv. Tendințe de asociere cu efect opus au fost identificate pentru IL6-174C -TGFb-509T (O.R.=2,48, p=0,0017) și ACE D-TGFb TT (O.R. =0,14, p=0,005).
Asocierile IL6 GG -ACE DD, IL6 GG și L-SELL C sau IL6 C și MTHFR CC și ACE-eNOS (ACE D și eNOS bb) nu ating valoarea prag corectată pentru a considera că influențează semnificativ statistic riscul de boală (p<0,05).
– Polimorfismele genetice și virusurile Torque teno
Compararea distribuției combinațiilor de polimorfisme genetice și virusuri Torque Teno a evidențiat o serie de diferențe între lotul de pacienți și control. Dintre acestea combinațiile alcătuite din genotipul eNOS bb și TTV sau dintre IL6 GG și TTV (O.R.= 2,44, p=6.5E-5) sau TTMDV (O.R.= 2,46, p=8,8E-5) au fost identificate mult mai frecvent în lotul de paciente (O.R.= 2,7, p=7,0E-6). Asocieri cu carcinomul ductal, cu semnificație statistică mai redusă, au fost calculate și pentru combinațiile alcătuite din L-SELL CC și TTMDV (O.R.= 2,09, p=0,001) sau MTHFR T și TTV (O.R.=2,04, p=0,0012) sau TTMDV (O.R.=2,10, p=0,0013) (Tabel 15).
Tabel 15. Distribuția virusurilor Torque Teno în loturile de pacienți și control în funcție de polimorfismele genetice
– Polimorfismelor genetice și anticoncepționalele orale
Utilizarea anticoncepționalelor orale de către indivizii purtători de genotip AGTR1 AA (O.R.=0,15, p=0,0008) sau IL6 (GG O.R.= 0,22, Yate's p=0,001) reprezintă caractere protective pentru carcinomul ductal invaziv (Tabel 16).
Tabel 16. Rezultatele testării asocierii dintre carcinomul ductal invaziv, polimorfismele genetice și anticoncepționalele orale.
– Anticoncepționalele orale și prima sarcină înainte de 30 ani
Pacientele au utilizat mult mai rar anticoncepționale orale comparativ cu femeile din lotul control (8,86% vs. 24%, p=0,00017) ( Tabel 2).
Anticoncepționalele orale și prima sarcini înaintea vârstei de 30 sunt factori protectivi pentru carcinomul ductal invaziv. Efectul cumulat al acestor factori protectivi nu a fost semnificativ din punct de vedere statistic; ambii factori protectivi au fost identificați la 3,16% dintre paciente și la 5,5% dintre femeile control (p>0,05).
– Anticoncepționalele orale și virusurile TT
In cazul femeilor care nu au utilizat anticoncepționale riscul de boală a fost crescut de prezența TTs, TTV, TTMDV și a coinfecției cu TTV și TTMV (Tabel 17).
Prezența TT la femeile care au utilizat anticoncepționale nu a avut un impact semnificativ asupra riscului de carcinom ductal invaziv.
Tabel 17. Distribuția virusurilor TT în subloturile de femei stratificate în funcție de utilizarea anticoncepționalelor
– IMC și polimorfismele genetice
Valorile IMC au avut tendința de a fi mai mari la pacientele cu carcinom ductal (Tabel 2); diferențele nu au devenit semnificative nici dacă în analiză au fost păstrate femeile cu IMC din intervalul normoponderal sau supraponderal. Dacă s-au comparat valorile IMC la persoanele stratificate în funcție de expunerea la alcool nu s-au constatat diferențe semnificative între subloturi (ANOVA și testul post-hoc Tukey HSD, p>0,05) (Tabel 18).
Tabel 18. Relația dintre IMC și expunerea la alcool
Relația dintre IMC și factorii genetici a fost evaluată prin compararea valorilor IMC din subloturile de paciente și femei control care aveau același genotip (Tabel 19) și din subloturile de paciente care aveau variante genetice de risc comparativ cu cele care nu aveau aceste variante ( Tabel 20).
Tabel 19. Distribuția polimorfismelor genetice și a IMC la subiecții selectați pentru acest studiu
Tabel 20. Distribuția polimorfismelor genetice și a valorilor IMC (kg/m2) la pacientele cu cancer de sân
Cea mai mare diferență între valorile IMC a fost identificată la purtătorii de MTHFR T. Pacientele purtătoare de MTHFR T au avut un IMC cu ~1 km/m2 mai mare în comparație cu femeile sănătoase care purtau această alelă (25,88 kg/m2 vs. 24,91 kg/m2, p=0,0008). Valorile IMC au avut tendința de a fi mai mari și la pacientele purtătoare de ACE DD (25,86 vs. 24,76), AGTR1 C (25,91 vs. 25,12), TGFb C (25,60 vs. 25,18), IL6 CC (26,62 vs. 24,47) sau L-SELL CC (25,62 vs. 25,05) raportat la femeile din subloturile control corespunzătoare (Tabel 19). În lotul de paciente valorile IMC au avut tendința de a fi mai reduse la purtătorii de MTHFR CC (25,23 kg/m2 vs. 25,88 kg/m2), MTHFR C (25,46 kg/m2 vs. 26,41 kg/m2) sau AGTR1 AA (25,48 kg/m2 vs. 25,86 kg/m2) comparativ cu cei care nu au avut aceste variante (Tabel 20).
– IMC și prima sarcină
Relația dintre IMC, prima sarcină și riscul pentru carcinomul ductal invaziv s-a testat în subloturile de paciente normoponderale sau supraponderale. S-a constatat că prima sarcină înainte de 30 ani exercită un efect protectiv important la persoanele supraponderale (O.R.=0,22, p=3,0E-6). Nuliparitatea (O.R.=4,11) în raport cu sarcinile multiple și prima sarcină după vârsta de 30 ani în raport cu cea produsă înainte de 30 de ani (O.R.=5,19) reprezintă factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv (Tabel 21).
Tabel 21. Relația dintre paritate, IMC crescut și carcinomul ductal invaziv
În sublotul de femei normoponderale prima sarcină înainte de 30 de ani a fost un important factor protectiv (O.R.=0,19). Nuliparitatea în raport cu prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 de ani (O.R.=5,45) sau prima sarcină după vârsta de 30 de ani în raport cu cea produsă înainte de 30 de ani (O.R.=4,78) reprezintă factori de risc importanți pentru boală la persoanele normoponderale (Tabel 22).
Tabel 22. Compararea particularităților parității în subloturile de pacienți normoponderale
Vârsta la care a avut loc prima sarcină a fost semnificativ mai mare la pacientele cu carcinom ductal invaziv comparativ cu cea a femeilor din lotul control, indiferent dacă a fost analizat sublotul cu IMC normoponderal (p<0,000006) sau supraponderal (0,000045) (Tabel 23). Vârsta la care a fost înregistrată prima sarcină la pacientele normoponderale și la cele supraponderale a fost similară (29,32 vs. 29,55, p>0,05) (Tabel 23).
Tabel 23. Compararea vârstei la care a avut loc prima sarcină la subiecții normoponderali și supraponderali
– IMC și virusurile Torque Teno
Pacientele supraponderale au fost mai frecvent purtătoare de TTV (O.R.=4,89, 95%CI: 2,68-9,03, p=0*) și TTMDV (O.R.=3,04, 95%CI: 1,72-5,39, p<0,0001) comparativ cu femeile din sublotul control corespunzător. Prezența simultană a TTV și TTMDV a fost identificată mai frecvent la pacientele supraponderale comparativ cu femeile control corespunzătoare (O.R.=3,14, p=6,8E-5) ( Tabel 24).
În cazul indivizilor normoponderali nu s-au observat diferențe care să atingă pragul semnificației statistice.
Tabel 24. Distribuția virusurilor Torque teno în subloturile de subiecți stratificate în funcție de IMC
Pacientele și femeile din lotul control care aveau infecții cu virusurile Torque teno au avut valori diferite ale IMC. Aceste diferențe au fost semnificative din punct de vedere statistic în cazul sublotului de subiecți care erau pozitivi pentru TTV; valorile IMC au fost cu ~ 0,86 kg/m2 mai mari în sublotul de paciente (25,66 vs. 24,80, p<0,0009) (Tabel 25).
Tabel 25. Relația dintre prezența virusurilor Torque teno și IMC
– Expunerea (activă sau pasivă) la fum de țigară și prima sarcină.
Procente similare de paciente și femei control au fost expuse în mod activ (la momentul includerii în studiu sau anterior) (38,61% vs. 37,5%) sau pasiv (58,23% vs. 59,6%) la fum de țigară (Tabel 2).
S-a calculat că pacientele au început să fumeze la vârste mai reduse (18,11 ani vs. 23,77 ani, p=1,12e-10), au renunțat la acest viciu la vârste mai înaintate (56,56 ani vs. 45,30 ani, p=2,1e-11) și au fumat activ cu ~ 10 ani mai mult (38,52 ani vs. 28,69 ani, p<2,2e-08) comparativ cu femeile control (Tabel 26).
Aproximativ de 4 ori mai multe paciente au început să fumeze înainte de prima sarcină comparativ cu femeile sănătoase (40,58% vs. 9,92%, O.R.= 6,19, p= 0*) (Tabel 26). Numărul de ani de fumat activ înainte de prima sarcină tinde să fie corelat invers cu vârsta la care a fost diagnosticată boala (r= -0,31). Raportat la femeile din lotul control, pacientele au fumat înainte de prima sarcină mai mult cu 2,4 țigări/ zi (15±7,20 țigări / zi vs. 12,69±6,96 țigări / zi, p >0,05) pentru o perioadă medie de ~5 ani (13,18 ani vs. 8 ani, p=0,005). Aceasta înseamnă că înainte de prima sarcină pacientele au fumat de ~2 ori mai multe pachete de țigări (4045,42 pachete vs. 1999,90 pachete, p<0,01) comparativ cu femeile din sublotul control corespunzător (Tabel 26).
Expunerea pasivă la fum de țigară a fost cu ~ 3,91 ani mai îndelungată în cazul pacientelor în raport cu femeile sănătoase (19,95 ani vs. 16,04 ani, p<0,00001) (Tabel 26).
Tabel 26. Particularitățile expunerii la fum de țigară și riscul de carcinom ductal invaziv
– Expunerea activă la fum de țigară și virusurile TT
În lotul de paciente au fost mai mulți fumătorii activi pozitivi pentru TTs, TTV și TTMDV comparativ cu lotul control (Tabel 2, Tabel 27) dar diferențele nu au fost semnificative statistic.
Tabel 27. Distribuția virusurilor TT la fumătorii activi
– Exerciții fizice
La subiecții sedentari, sarcinile duse la termen reprezintă factori protectivi iar nuliparitatea și durata de alăptare mai mică de 12 luni reprezintă factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv.
În subloturile de pacienți și indivizi sănătoși supraponderali s-au constat diferențe în ceea ce privește vârsta la care au început să fumeze (18,94 ani vs. 22,98 ani, p=0,0002) și intervalul de timp în care au fumat activ (37,94 ani vs. 30,24 ani, p=0,001) (Tabel 28).
Tabel 28. Estimarea riscului de carcinom ductal invaziv la persoanele sedentare
– Exercițiile fizice și virusurile Torque teno
TTV (39,87% vs. 26,5%, p=0,007) și coinfecția cu TTV și TTMDV (32,28% vs. 20%, p=0,006) tind să fie mult mai frecvente în lotul de paciente sedentare comparativ cu femeile sănătoase sedentare. Coinfecția cu TTV și TTMDV tinde să mai frecventă la pacientele care au practicat exerciții fizice (regulat sau ocazional) (32,28% vs. 20%, p=0,006) (Tabel 29).
Tabel 29. Distribuția virusurilor TT în subloturile de subiecți stratificate în funcție de regularitatea cu care efectuează exerciții fizice
– Activitate nocturnă sau în ture
Nu au fost identificați factori care să influențeze riscul de boală la persoanele care lucrează în ture de noapte ( Tabel 30).
Tabel 30. Estimarea riscului de carcinom ductal invaziv la persoanele care lucrează în ture de noapte
– Mediul în care locuiesc
Persoanele care locuiesc în mediul urban au fumat activ cu 10,77 ani mai mult comparativ cu femeile din lotul control (38,91 ani vs. 28,14 ani, p<0,000003) ( Tabel 31).
Tabel 31. Estimarea riscului de carcinom ductal invaziv la persoanele care locuiesc în mediul urban
La persoanele din mediul rural s-a observat o tendință de asociere între expunerea activă sau pasiv la fum de țigară și carcinomul ductal invaziv (O.R.= 3,93, p>0,002) (Tabel 32).
Tabel 32. Estimarea riscului de carcinom ductal invaziv la persoanele care locuiesc în mediul rural
2.4.3. Factori care pot influența vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân
– Paritatea și vârsta la care s-a produs prima sarcină
Vârsta la debutul cancerului de sân nu a fost influențată semnificativ de asocierea dintre paritate și factorii de risc investigați (
Tabel 33, Tabel 53).
Tabel 33. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de paritate
Vârsta la care a fost diagnosticată boala nu a fost influențată semnificativ de momentul în care s-a produs prima sarcină și de ceilalți factori investigați ( Tabel 34).
Tabel 34. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de momentul în care s-a produs prima sarcină
Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân la pacientele nulipare, unipare sau multipare nu a prezentat diferențe semnificative din punct de vedere statistic (~58 ani, p>0,05) ( Tabel 35).
Tabel 35. Compararea vârstei la care a fost diagnosticată boala la pacientele stratificate în funcție de numărul de sarcini (analiza post-hoc- Tukey HSD – valoare p).
Vârsta la care a fost diagnosticată boala în subloturile de pacientele nulipare (58,29 ani), pare care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (58,00 ani) sau după această vârstă (58,14 ani) nu a prezentat diferențe semnificative din punct de vedere statistic (p>0,05) (Fig. 31).
Fig. 31. Relația dintre vârsta la care s-a produs prima sarcină (unipare vs. multipare) și vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân
Pacientele pare au fost stratificate și în funcție de numărul de sarcini și vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină. Astfel au rezultat loturi de paciente nulipare (58,29 ani), unipare cu prima sarcină apărută înainte (58,64 ani) sau după (57,84 ani) vârsta de 30 ani, multipare cu prima sarcină apărută înainte (57,30 ani) sau după (57,56 ani) vârsta de 30 de ani. Vârsta la care a fost diagnosticată boala la femeile din aceste subloturi nu a prezentat diferențe semnificative din punct de vedere statistic (p>0,05).
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv nu a fost corelată semnificativ statistic cu vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină în subloturile de femei pare (r = -0,04), unipare (r = -0,12) sau multipare (r=-0,05, t calc < t crit).
Intervalul de timp cuprins între vârsta la care s-a produs prima sarcină (unipare: 30,26 ani, multipare: 28,15 ani) (Tabel 3) și vârsta la care s-a diagnosticat cancerul de sân a fost cu ~ 2,11 ani mai redus la pacientele unipare comparativ cu cele multipare (27,79 ani vs. 30,0 ani, p=0,02). Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân la unipare cât și la multipare a fost similară (~ 58 ani) (Tabel 35) Având în vedere aceste rezultate se poate concluziona că intervalul de timp cuprins între prima sarcină și diagnosticul bolii reflectă de fapt vârsta la care a avut loc prima sarcină dusă la termen la cele două categorii de paciente.
– Virusurile Torque Teno
Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân a fost similară la pacientele care au avut și la cele care nu au avut virusuri TT ( Tabel 36).
Tabel 36. Relația dintre prezența virusurilor TT și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
La subiecții care au fost pozitivi pentru virusurile Torque teno nu au fost observat diferențe semnificative ale vârstei la care s-a stabilit diagnosticul de carcinom ductal (Tabel 37). Spre exemplu, vârstă la care a fost diagnosticată boala a fost similară la pacienții care au fost pozitivi pentru TTV și negativi pentru TTMDV (58,26 ani) și la cei pozitivi pentru TTV și TTMDV (58,24 ani) sau TTV și TTMDV (58,38 ani).
Numărul de paciente care nu au avut TTV a fost prea redus pentru a permite testarea impactului TTMDV asupra vârstei la care a fost diagnosticată boala.
În subcapitolul anterior s-au prezentat dovezi în favoarea asocierii dintre carcinomul ductal invaziv și prezența virusurilor TTV, TTMDV sau a coinfecției cu TTV și TTMDV (Tabel 4). În consecință s-a decis extinderea investigării relației dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv și virusurile Torque Teno prin includerea în analiză a factorilor care pot modula această relație.
Tabel 37. Relația dintre virusurile Torque Teno și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
– Vârsta la care s-a produs prima sarcină și virusurile Torque Teno
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal a fost similară la pacientele nulipare stratificate în funcție de prezența sau absența virusurilor Torque teno (Tabel 38).
Tabel 38. Testarea relației dintre prezența sau absența virusurilor TT și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la pacientele nulipare
Virusurile TT și vârsta la care s-a produs prima sarcină nu au influențat semnificativ vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal (Tabel 39).
Tabel 39. Testarea relației dintre vârsta la care s-a produs prima naștere dusă la termen, virusurile TT și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal
Pacientele care au fost nulipare și cele care au avut prima sarcină înainte sau după vârsta de 30 ani au fost stratificate în funcție de prezența sau absența TTV. În subloturile rezultate carcinomul ductal invaziv a fost diagnosticat la vârste similare (ANOVA și testul post-hoc Tukey HSD, p>0,05). Rezultate cu semnificație statistică similară s-au obținut și în cazul stratificării pacientelor pe baza parității și a prezenței/ absenței TTMDV sau TTMV (One-way ANOVA cu test post-hoc Tukey HSD, p>0,05).
– Perioada de lactație
Vârsta la care a fost identificat carcinomul ductal invaziv a fost similară indiferent dacă pacientele au avut sau nu au avut lactație. Rezultate similare au fost obținute și dacă subiecții au fost stratificați pe baza perioadei de lactație și a altor factori de risc ( Tabel 40, Tabel 53).
Diferențe nu au atins pragul de semnificație statistică nici dacă s-au comparat pacientele care au avut mai puțin sau mai mult de 12 luni de lactație ( Tabel 41).
Durata de alăptare nu a fost corelată cu vârsta la care s-a diagnosticat carcinomul ductal invaziv în subloturile de paciente pare (r=0,07), unipare (r=0,18) sau multipare (r=-0,006).
Tabel 40. Compararea vârstei la care a fost diagnosticată boala în funcție de durata perioadei de lactație
Tabel 41. Compararea datelor din lotul de paciente stratificate în funcție de durata lactației
Particularitățile lactației și virusurile Torque Teno
Diagnosticul de carcinom ductal invaziv la pacientele stratificate în funcție de durata lactației și de prezența sau absența virusurilor Torque Teno a fost stabilit la vârste similare.
Cele trei subloturi de paciente obținute pe baza particularităților perioadei de lactație (nu au avut perioadă de lactație, au avut mai puțin sau mai mult de 12 luni de lactație) au fost stratificate în funcție de prezența sau absența virusurilor TT. Diagnosticul carcinomului ductal invaziv a fost stabilit la vârste similare indiferent dacă factorul de risc a fost considerat TTV, TTMDV sau TTMV (ANOVA cu test post-hoc Tukey HSD, p>0,05) (Tabel 42).
Tabel 42. Vârsta la diagnosticul carcinomului ductal în funcție de particularitățile lactației și prezența virusurilor Torque teno
Prima sarcină după vârsta de 30 ani, perioadă de lactație redusă (<12 luni) și virusurile TT
Prima sarcină după vârsta de 30 ani, perioada de lactație mai mică de 12 luni și virusurile TT au reprezentat factori de risc importanți pentru cancerul de sân. Asocierea celor trei factori de risc nu a modificat semnificativ vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv (Tabel 43).
Tabel 43. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal și prima sarcină după vârsta de 30 ani, durata de alăptare mai mică de 12 luni și prezența virusurilor Torque Teno
– Polimorfismele genetice
Polimorfismele genetice testate nu au fost asociate cu modificarea vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la persoanele incluse în acest studiu ( Tabel 44).
Tabel 44. Relația dintre polimorfismele genetice și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Polimorfismele genetice și virusurile Torque Teno
Interacțiunea dintre polimorfismul testate și virusurile TT nu modifică semnificativ vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv (Tabel 45, Tabel 46, Tabel 47, Tabel 48, Tabel 49, Tabel 50, Tabel 51).
Tabel 45. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv, virusurile TT și polimorfismul ACE ID
Tabel 46. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv, virusurile TT și polimorfismul AGTR1 A1166C
Asocierea dintre eNOS bb și TTV crește semnificativ riscul de carcinom ductal (O.R.= 2,7, p=7,0E-6) (Tabel 15) dar nu modifică vârsta la care boala este diagnosticată (Tabel 47).
Tabel 47. Relația dintre carcinomul ductal invaziv, virusurile TT și polimorfismul eNOS ba
Tabel 48. Relația dintre carcinomul ductal invaziv, virusurile TT și polimorfismul TGFb C-509T
Tabel 49. Relația dintre carcinomul ductal, virusurile TT și polimorfismul IL6 -174GC
Tabel 50. Relația dintre carcinomul ductal invaziv, virusurile TT și polimorfismul L-SELL P213S
Tabel 51. Relația dintre carcinomul ductal invaziv, virusurile TT și polimorfismul MTHFR C677T
– Anticoncepționalele orale și vârsta la care s-a produs prima sarcină
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal a fost similară în subloturile de paciente care au utilizat sau care nu au utilizat anticoncepționale orale (58,29 ani vs. 58,19 ani, p>0,05). Această diferență de vârstă nu se poate explica nici prin vârsta la includere în studiu a pacientelor din ambele loturi (60,14 ani vs. 60,12 ani, p>0,05).
La momentul includerii în studiu femeile sănătoase care au utilizat și cele care nu au utilizat anticoncepționale orale au avut vârste similare (58,83 ani vs. 59,4 ani).
Pacientele și femeile sănătoase care au utilizat anticoncepționale orale (60,14 ani vs. 58,83 ani) și cele care nu au utilizat astfel de medicamente (60,12 ani vs. 59,4 ani, p>0,05) au avut vârste similare la includerea în studiu. În consecință factorul vârstă nu influențează semnificativ rezultatele obținute la compararea subiecților care au utilizat sau nu au utilizat anticoncepționale orale.
Vârsta la care a fost diagnosticată boala la pacientele care nu au utilizat anticoncepționale și au avut prima sarcină dusă la termen înainte sau după vârsta de 30 ani a fost similară (58,00 ani vs. 58,03 ani, p>0,05).
– Anticoncepționalele orale și virusurile TT
Utilizarea anticoncepționalelor orale și prezența TTV nu a influențat vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv (Tabel 52). Numărul redus de observații nu a permis compararea valorilor pentru celelalte virusuri Torque Teno.
Tabel 52. Relația dintre utilizarea anticoncepționalelor orale, virusurile Torque Teno și vârsta la care a fost diagnosticată boala.
– IMC
Vârsta la debutul cancerului de sân nu a fost influențată semnificativ de IMC chiar dacă în analiză fost incluse și alte particularități ale subiecților investigați. O tendință de asociere a fost observată în cazul pacientelor normoponderale care lucrează noaptea / în ture (p<0,005) ( Tabel 53).
Tabel 53. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticată boala în funcție de mediul în care trăiesc
Valorile IMC nu au fost corelate cu vârsta la care a fost diagnosticată boala în lotul integral de paciente (r=0,24) sau în subloturile de paciente normoponderale (r=0,30) sau supraponderale (r=0,2). Absența corelației a fost observată și între vârsta la includere și vârsta la care a fost înregistrată prima sarcină, indiferent dacă pacientele erau normoponderale (r=-0,02) sau supraponderale (r=0,04).
IMC și prima sarcină
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la pacientele normoponderale și la cele supraponderale a fost similară (57,39 ani vs. 58,65 ani, p<0,01).
Vârsta la care a fost diagnosticată boala nu a fost corelată cu valorile IMC indiferent dacă au fost analizate femeile normoponderale (r= 0,34) sau cele supraponderale (r=0,02). În consecință valorile IMC în intervalul normoponderal-supraponderal nu reprezintă un factor de risc important pentru vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv.
IMC și virusurile Torque Teno
Vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv a avut tendința de a fi cu 1,77 ani mai mare la pacientele care aveau coinfecție cu TTV și TTMDV și erau supraponderale comparativ cu cele care aveau coinfecția dar erau normoponderale (58,88 ani vs. 57,11 ani, p<0,008) ( Tabel 54).
Tabel 54. Evidențierea relației dintre IMC, virusurile TT și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Testarea corelației dintre vârsta la care a fost diagnosticată boala și valorile IMC la purtătorii de TTV+TTMDV (r=0,26), TTV+TTMV (r=0,27), TTMDV+TTMV (r=0,37) și TTV+TTMDV+TTV (r=0,29) nu a condus la rezultate semnificative din punct de vedere statistic.
– Expunerea la fum de țigară
Pentru această analiză s-au avut în vedere expunerea la fum de țigară în mod activ, pasiv și mixt (activ și pasiv). Principalele rezultate obținute sunt prezentate în paragrafele următoare.
Fumat activ. Compararea datelor înregistrate la fumătorii activi și la nefumători a evidențiat unele diferențe între pacientele analizate. S-a observat că vârsta la care a fost diagnosticată boala tinde să scadă pe măsură ce crește numărul de țigări fumate / zi (Tabel 55).
Tabel 55. Compararea vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv în funcție de numărul de țigări fumate
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv tinde (p<0,05) să fie mai redusă la persoanele fumătoare active care sunt nuliparele (57,38 ani vs. 58,67 ani), care nu consumă alcool (57,48 ani vs. 58,62 ani) sau care au avut studii gimnaziale sau liceale (57,46 ani vs. 58,31 ani) comparativ cu pacientele care nu au fumat sau au fumat ocazional ( Tabel 56).
Tabel 56. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de statutul de fumător activ/ nefumător
Expunerea activă (nu și pasivă) la fum de țigară. Dacă au fost comparate pacientele care au fumat activ (fără să fie expuse și pasiv la fum de țigară) cu cele care nu au avut acest viciu s-a observat o tendință de reducere a vârstei la care a fost diagnosticată boala în cazul persoanelor care au fumat și au avut studii gimnaziale/liceale (Tabel 57).
Tabel 57. Impactul fumatului activ (în absența expunerii la fumat pasiv) asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
c) Expunere pasivă la fum de țigară (indiferent dacă au fumat activ). Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv a fost cu 2,15 ani mai redusă la pacientele care au fost expuse pasiv la fum de țigară comparativ cu cele care nu au fost expuse (57,3 ani vs. 59,45 ani, p<0,00001). O diferență de 2,21 ani au fost înregistrate și în subloturile de paciente nulipare (57,4 ani vs. 59,61 ani, p<0,00008). O diferență de 3 ani a fost identificată și în cazul fumătoarelor pasive care practică activități fizice (în mod ocazional sau regulat) (56,85 ani vs. 59,87 ani, p<0,0001) și de 3,84 ani în sublotul care lucrează în ture/ noaptea (56,16 ani vs. 60,00 ani, p<0,0003).
Diferențe semnificative au fost identificate și între persoanele expuse pasiv la fum care au avut studii gimnaziale sau liceale (57,46 ani vs. 58,31 ani, p<0,00001) (Tabel 58).
Tabel 58 Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de expunerea pasivă la fumă de țigară
Expunerea la fum de țigară s-a efectuat acasă, la locul de muncă sau acasă și la locul de muncă. Durata expunerii pasive la fum de țigară a pacientelor a fost cu 3,06 ani mai mare în sublotul expus acasă și la locul de muncă comparativ cu cel expus doar acasă (7,17 ore vs. 4,11 ore, p<0,001). Diferența a fost de 2,76 ore dacă s-au testat doar cazurile expuse doar la muncă (7,17 ore vs. 4,40 ore, p<0,001) (Tabel 59). Diferențele dintre cele trei subloturi nu au fost semnificative statistic dacă s-a comparat numărul de ani în care s-a realizat expunerea pasivă la fum de țigară (Tabel 60).
Tabel 59. Durata expunerii pasive la fum de țigară (ore) în subloturile de paciente stratificate în funcție de locul în care se realizează expunerea.
Tabel 60. Durata expunerii pasive la fum de țigară (ore) în subloturile de paciente stratificate în funcție de locul în care se realizează expunerea.
d) Expunere pasivă în absența expunerii active la fum de țigară. În sublotul de paciente care nu au fumat activ expunerea pasivă la fum de țigară a fost asociată cu o reducere cu 2,46 ani a vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv (57,42 ani vs. 59,88 ani, p<0,00002). În sublotul de paciente nulipare, care nu au consumat alcool, care au efectuat activități fizice ocazionale sau regulate sau care au avut doar studii gimnaziale/ liceale și au fost expuse doar pasiv la fum de țigară boala a fost diagnosticată la vârste semnificativ mai reduse (Tabel 61).
Tabel 61. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv și expunerea pasivă la fum de țigară
e) Expunerea la fum de țigară (activ sau pasiv)
Diferența dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la pacientele care au fost expuse (activ sau pasiv) comparativ cu cele care nu au fost expuse la fum de țigară a fost de 2,29 ani (57,59 vs. 59,88, p<0,000007). Diferențe ceva mai mari între persoanele expuse și cele care nu au fost expuse activ sau pasiv la fum de țigară au fost calculate pentru subloturile de femei nulipare (2,65 ani) ( Tabel 62), care nu consumă alcool (2,34 ani), care desfășoară exerciții fizice (~3 ani) sau care au studii gimnaziale sau liceale (3,14 ani). Aceste rezultate reflectă cel mai probabil impactul stilului de viață asupra vârstei la care este diagnosticată boala.
Tabel 62 Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de statutul de fumător activ/ nefumător
f) Expunerea la fum de țigară activ și pasiv
A fost identificată o diferență de 2,74 ani între vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân la pacientele expuse atât activ cât și pasiv la fum de țigară și cele care nu au fost expuse (activ sau pasiv) la fum de țigară (57,14 ani vs. 59,88 ani, p<0,00001). Diferența de vârstă a fost asociată și cu nuliparitatea (2,97 ani), activitatea nocturnă sau în ture de noapte (2,55 ani) sau absența consumului alcool (2,11 ani) (Tabel 63).
Tabel 63. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de statutul de fumător (activ și pasiv) sau nefumător
g) Fumatul activ și prima sarcină.
Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân la pacientele care au studii universitare și au fumat înainte de prima sarcină a avut tendința de a fi mai mare în comparație cu cea estimată pentru pacientele care nu au fumat înainte de prima sarcină (59,64 vs. 57,33 ani, p<0,05) ( Tabel 64).
Tabel 64. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de statutul de fumător înainte de prima sarcină
Au fost comparate și datele referitoare la vârsta la care a fost diagnosticată boala la pacientele care au fumat activ înainte de prima sarcină și la cele care nu au fost expuse la fum de țigară (activ sau pasiv) (Tabel 65). Singura diferență semnificativă observată a fost în sublotul de paciente care au avut studii gimnaziale sau liceale (57,28 ani vs. 60,66 ani, p<0,0004).
Tabel 65. Efectele fumatului activ înainte de prima sarcină comparativ cu cele ale absenței expunerii la fum de țigară (activ sau pasiv) și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Expunerea la fum de țigară (activă său pasivă) și virusurile TT
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal la pacientele fumătoare active care aveau infecții cu virusurile Torque Teno a fost similară cu vârsta raportată de pacientele care nu au fost expuse la această combinație de factori de risc ( Tabel 66).
Tabel 66. Testarea relației dintre fumatul activ, infecțiile cu virusuri TT și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Un procent semnificativ de paciente au declarat că au fost expuse pasiv la fum de țigară (indiferent de locație). Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la pacientele expuse pasiv la fum de țigară care erau pozitive pentru TTV a fost cu ~2,82 ani mai redusă comparativ cu vârsta la care a fost identificată boala la pacientele care nu au fost expuse la niciunul dintre acești factori de risc (57,67 ani vs. 60,31 ani, p<0,0016) (
Tabel 67).
Tabel 67. Testarea impactului infecțiilor cu virusurile TT și a expunerii pasive la fum de țigară asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv este influențată și de locul în care s-a realizat expunerea pasivă la fum de țigară și de prezența virusurilor Torque Teno. Diferențe înalt semnificative au fost identificate în cazul pacientelor expuse pasiv la fum de țigară, atât acasă cât și la locul de muncă, pozitive pentru TTs (56,20 vs. 60,09 ani, p<0,0005) (
Tabel 68) sau TTV (56,20 ani vs. 60,31 ani, p<0,0001) ( Tabel 69).
Vârsta la care a fost diagnosticată boala nu a fost influențată semnificativ de asocierea dintre fumatul pasiv și TTMDV ( Tabel 70) sau TTMV ( Tabel 71).
Tabel 68. Testarea asocierii dintre virusurile TTs și a fumatului pasiv asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Tabel 69. Testarea asocierii dintre virusurile TTV și a fumatului pasiv asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Tabel 70. Testarea asocierii dintre virusurile TTMDV și a fumatului pasiv asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Tabel 71. Testarea asocierii dintre virusurile TTMV și a fumatului pasiv asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Ulterior au fost testate pacientele care au fost expuse la fum de țigară în mod activ sau pasiv. Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul mamar a avut tendința de a fi cu ~ 1,5 ani mai redusă la pacientele expuse la fum de țigară care erau purtătoare de TTs (57,60 vs. 59,06), TTV (57,67 vs. 58,87) sau de TTMDV (57,50 vs. 58,89) comparativ cu pacientele care nu au fost expuse la acești factori de risc ( Tabel 72).
Tabel 72. Testarea efectului virusurilor Torque Teno și al expunerii la fum de țigară (în mod activ sau pasiv) asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv
Vârsta la care a fost diagnosticată boala a fost 2,14 ani mai redusă la pacientele care au fumat minim 15 țigări/zi și care aveau virusuri Torque Teno comparativ cu restul subiecților (subiecți care nu au fost expuși la această combinație de factori de risc) (56,40 vs. 58,54, p<0,001) ( Tabel 73).
Tabel 73. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân, virusurile TT și fumatul activ
Vârsta la debutul bolii a avut tendința de a fi mai redusă și în cazul pacientelor purtătoare de virusuri TT care au fumat minim 15 țigări/zi comparativ cu pacientele nefumătoare care nu au fost infectate cu virusurile TT (p<0,01) ( Tabel 74).
Tabel 74. Relația dintre vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân, fumatul activ și prezența virusurilor TT
– Exerciții fizice
Vârsta la debutul cancerului de sân nu a fost influențată semnificativ de caracteristicile exercițiilor fizice realizate de către subiecții selectați pentru acest studiu în asociere cu alți factori de risc investigați (Tabel 75).
Tabel 75. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de particularitățile activității fizice
– Exercițiile fizice și virusurile TT
Asocierea dintre exercițiile fizice și virusurile Torque Teno nu are un impact semnificativ asupra vârstei la care a fost diagnosticată boala (Tabel 76).
Tabel 76. Relația dintre exercițiile fizice, virusurile Torque teno și vârsta la care a fost diagnosticată boala.
– Activitatea nocturnă sau în ture
Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân tinde să fie influențată de tipul de activitate (lucrează în ture de noapte) considerat independent sau în asociere cu particularitățile expunerii la alcool sau fum de țigară sau cu tipul de exerciții fizice efectuate (Tabel 77).
Tabel 77. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de activitatea diurnă sau nocturnă desfășurată
– Mediul în care locuiesc
Vârsta la debutul cancerului de sân nu a fost influențată semnificativ de mediul în care trăiesc subiecții selectați pentru acest studiu stratificați în funcție de factorii de risc investigați (Tabel 78).
Tabel 78. Compararea datelor înregistrate pentru lotul de paciente stratificate în funcție de mediul în care trăiesc
– Diferite particularități ale subiecților investigați și virusurile TT
Prezența sau absența virusurilor TTV, TTMDV sau TTMV în asociere cu tipul de studii (gimnaziu vs. liceale și facultate), tipul de activitate (diurnă sau în ture), mediul în care locuiesc subiecții incluși în studiu poate influența vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal. Diferențele constatate între subiecții stratificați pe baza acestor variabile și a prezenței / absenței virusurilor Torque Teno nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (ANOVA cu test post-hoc Tukey HSD, p>0,05).
Un rezultat similar a fost obținut și pentru subiecții stratificați în funcție de HTA, prezența sau absența HTA sau a parodontopatiei.
2.4.4. Analiza MDR și interacțiunile dintre factorii genetici și non -genetici
Analiza MDR a fost utilizată pentru a identifica principalii factori individuali și principalele modele predictive pentru carcinomul ductal invaziv. În această analiză au fost analizate date calitative și date cantitative care au fost transformate prealabil în date calitative (transformarea s-a realizat în funcție de distribuția valorilor sau de semnificația lor biologică). Utilizarea filtrelor MDR a permis selectarea atributelor (5-8 variabile) care au avut cea mai importantă semnificație statistică. Relațiile de sinergie, mai ales cele detectate între atributele care au rămas în urma filtrării datelor, au fost utilizate pentru a construi atribute compuse. Atât atributele compuse cât și datele filtrate au fost reanalizate iar rezultatele obținute au fost utilizate pentru a genera modele MDR. Pentru fiecare lot sau sublot analizat dintre modelele MDR generate a fost selectat doar modelul care a avut 10 din 10 cross-validări (repartiția aleatorie și retestarea datelor a produs rezultate identice în 100% dintre retestări), valoarea p estimată a fost p<0,0001 iar O.R. a avut valoarea maximă. Modelele MDR selectate au fost comparate pentru a identifica combinații potențiale de atribute care descriu cel mai bine un fenotip particular de carcinom ductal invaziv (endofenotip).
Analiza întregului lot de subiecți a indicat că modelul MDR care are cea mai mare capacitate de predicție a carcinomului ductal invaziv este “TGFb-IL6,sarcina_30 ani, parodontopatie” (O.R.=10,02). În acest model cea mai importantă contribuție individuală a fost atribuită atributului complex IL6-TGFb (12,74%) (Fig. 33). Chiar dacă filtrele utilizate pentru selectarea atributele relevante au fost schimbate (ex. ReliefF- stânga, SURF*nTuRF – dreapta, MultiSURFnTuRF) interacțiunea IL6-TGFb a fost prezentă în toate modelele generate (Fig. 32). Asocierea dintre aceste modele MDR și starea clinică a subiecților (starea de boală sau sănătate) a fost mai redusă comparativ cu cea atribuită modelului principal “TGFb-IL6,sarcina_30 ani, parodontopatie”. Modelul MDR principal a sugerat că între subiecții testați poate exista o diferențiere semnificativă bazată pe parodontopatie.
Pentru a verifica acest aspect s-a testat sublotul de subiecți care nu au avut parodontopatie. Cel mai bun model care descrie apariția cancerului de sân la aceste paciente a fost alcătuit din “TGFb_IL-6, sarcină_30_ani_AGTR1, TTV” (Fig. 34) (O.R.= 9,52).
Fig. 32. Predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv și acțiunea sinergică dintre polimorfismele localizate în genele TGFb și IL6 (Rezultatele analizei MDR – sus: după aplicarea filtrului ReliefF; jos: după aplicarea filtrului SURF*nTuRF).
Fig. 33. Rezultatele analizei MDR: sinergismul dintre TGFb-IL6 (sus) și relația dintre vârsta la care se produce prima sarcină dusă la termen (sarcină_30 ani) și parodontopatie în predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv (jos).
Fig. 34. Rezultatele analizei MDR: acțiunea sinergică dintre TGFb și IL6 în cazul pacientelor care nu au avut parodontopatie (sus) și cel mai bun model care descrie predispoziția pentru carcinom ductal invaziv (jos).
O parte dintre modelele MDR identificate au fost obținute prin stratificare subiecților în funcție de criterii diferite (ex. status de fumător, paritate, vârsta la care se produce prima sarcină dusă la termen, IMC, utilizarea anticoncepționalelor orale). Rezultatele obținute la analiza acestor subloturi au reconfirmat rolul interacțiunii dintre IL6 și TGFb în predicția carcinomului ductal invaziv. Această interacțiune a fost identificată în modelele MDR obținute la testarea subloturilor de femei:
– care au avut infecții cu virusurile Torque Teno (“sarcina_30 ani_anticoncepționale, TGFb-IL6,eNOS”) (Fig. 37)
– indivizi expuși activ sau pasiv la fum de țigară (“TGFb_IL6, sarcina_30 ani, parodontopatie”).
– care nu consumă sau care consumă ocazional alcool (Fig. 38),
– nulipare (“TGFb_IL-6, parodontopatie, consum_alcool”) (Fig. 43),
– care au avut sarcini la termen („sarcina_30_ani, TGFb_IL-6, TTV”) (Fig. 39),
– care nu au utilizat anticoncepționale (“IL6-TGFb, IMC-sarcină_30_ani și parodontopatie”) ( Fig. 40).
Valoarea interacțiunii IL6-TGFb este mai redusă comparativ cu cea descrisă la subiecții care au avut infecții cu virusurile Torque teno (14,10%) iar dintre modele MDR asocierea cu boala este mai redusă comparativ cu cea descrisă la subiecții supraponderali.
Contribuția individuală maximă la predicția cancerului de sân a fost identificată în modelul MDR “sarcină_30 ani_TTV, TGFb-IL6, anticoncepționale-eNOS” generat pentru femeile supraponderale (contribuțiile individuale au fost 16,54%, 12,99%, respectiv 2,94%) (Fig. 14).
Cele mai puternice asocieri dintre modelele MDR și carcinomul ductal invaziv au fost identificate în cazul femeilor care au fost supraponderale (“sarcină_30 ani_TTV, TGFb-IL6, anticoncepționale-eNOS” O.R.= 17,18) (Fig. 35) sau care au fost normoponderale (“TGFb-IL6, sarcină_30 ani, parodontopatia” O.R.=16,74) (Fig. 36).
Fig. 35. Rezultatele analizei MDR: sinergia dintre TGFb și IL6 (sus) și dintre sarcină_30 ani și TTV (jos) identificată la subiecții supraponderali
Fig. 36. Modelul MDR care descrie cel mai bine cancerul de sân la pacientele normoponderale.
Interacțiuni complexe au fost identificate în modelul MDR “TGFb_IL-6, parodontopatie, consum_alcool” generat la analiza femeilor nulipare. În acest model a fost detectată o interacțiune suplimentară între atributul complex IL-TGFb și consumul de alcool (Fig. 43).
Interacțiunea IL6-TGFb nu are cea mai importantă contribuție în modelele MDR generate pentru indivizii nefumători. Modelul MDR optim pentru acest sublot se subiecți este „sarcina_30 ani_eNOS,TGFb_IL-6,TTV”; contribuția individuală a atributului TGFb-IL6 (10,69%) a fost depășită de atributul complex sarcină_30_ani_eNOS (11,99%) ( Fig. 41). Un rezultat similar a fost identificat în subloturile de femei care au fost infectate cu virusurile Torque Teno (Fig. 37) sau care au fost supraponderale (Fig. 35).
În cadrul acestei analize s-au identificat și subloturi de subiecți în care atributul combinat IL6-TGFb nu mai are o acțiune sinergică semnificativă. Spre exemplu, interacțiunea IL6-TGFb nu s-a mai regăsit în modelul MDR optim (“IL6,fumat_pasiv,consum_alcool”; O.R.= 12,18, 95%CI=4.50-32.95) identificat pentru subiecții care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (Fig. 44).
Fig. 37. Model MDR care descrie predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv la subiecții care au infecții cu virusurile Torque Teno.
Fig. 38. Model MDR care descrie carcinomul ductal invaziv la persoanele care nu consumă alcool sau care consumă ocazional alcool (stânga: sinergia dintre TGFb și IL6; dreapta: asocierea TGFb-IL6).
Fig. 39. Modelul MDR care a avut cea mai bună capacitate de predicție a cancerului de sân la pacientele care au avut sarcini la termen
Fig. 40. Efectul sinergic al IL6- TGFb în predicția carcinomului ductal invaziv la subiecții care nu au utilizat anticoncepționale (stânga) și cel mai bun model MDR asociat cu boala (dreapta)
Fig. 41. Interacțiunea sinergică dintre eNOS-sarcină_30 ani la subiecții nefumători
Fig. 42. Model MDR care descrie riscul de carcinom ductal invaziv la pacientele expuse (activ sau pasiv) la fum de țigară
Fig. 43. Model MDR asociat cu carcinomul ductal la femeile nulipare
Fig. 44. Modelul MDR care a avut cea mai bună capacitate de predicție a cancerului de sân la femeie care au avut o sarcină înaintea vârstei de 30 ani.
Tabel 79. Modele MDR care au descris cel mai bine predispoziția pentru carcinom ductal invaziv în lotul de subiecți analizați. Au fost selectate doar modelele care au avut cross validare 100%, p<0,0001 și O.R. maxim
Compararea tuturor modelelor MDR a evidențiat că cea mai importantă contribuție individuală este conferită de atributul complex “sarcina_30 ani_TTV” în cadrul modelului obținut pentru lotul de persoane supraponderale (16,65%). Interacțiunea IL6_TGFb are cea mai importantă contribuție individuală la modelul MDR în cazul sublotului de subiecți care infecții cu Torque Teno (14,10%).
Având în vedere aceste aspecte s-a reluat analiza MDR dar s-au exclus din analiză pacientele care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (au rămas în analiză femeile nulipare și cele care au avut prima sarcină după vârsta de 30 ani). Rezultatele au indicat că modelul MDR optim este “alcool,parodontopatie,TGFb_IL6”. Se observă că în acest sublot de subiecți asocierea cu carcinomul ductal invaziv (O.R.: 11,94 vs. 10,02) și contribuția individuală a interacțiunii dintre IL6_TGFb (13,93% vs. 12,74%) sunt superioare celor identificate la analiza lotului inițial (Fig. 45).
Fig. 45. Model MDR obținut prin analiza lotului de subiecți din care au fost excluse persoanele care au avut prima sarcină dusă la termen înainte de 30 ani.
Principalele atribute care intră în alcătuirea modelelor MDR pentru carcinomul ductal invaziv sunt sarcina _30 ani și interacțiunea dintre IL6-TGFb. Dacă s-au exclus din analiză aceste caractere s-a identificat un model MDR alternativ pentru carcinomul ductal invaziv. Acest model a inclus: “durata de alăptare, fumatul, eNOS”. Caracteristicile acestui model au fost: acuratețea balansată: 0,69, acuratețea testării: 0,69, sensibilitatea: 0,66, specificitatea: 0,72, O.R.:4,95 (95%CI: 1,19-20,61, chi2=5,11, p=0,02) (Fig. 46). Se observă că semnificația statică a asocierii acestui model cu boala semnificativ mai redusă cu cea raportată pentru lotul integral.
Fig. 46. Modelul MDR care are cea mai mare capacitate de predicție a carcinomului ductal invaziv construit după excluderea din analiză a interacțiunii dintre IL6-TGFb și a vârstei la care s-a produs prima sarcină (sarcinia_30 ani)
2.5. Discuții
Rezultatele obținute la studierea bolilor complexe au o rată redusă sau moderată de reconfirmare. Câțiva factori care pot să contribuie la aceste rezultate discordante sunt: complexitatea predispoziției pentru fenotipurile studiate (și implicit dificultățile care apar la definirea fenotipului de interes), diferențele privind organizarea studiilor, particularitățile populației studiate (ex. stratificarea populației), puterea statistică redusă și lacunele privind relațiile de epistazie dintre diferiți factori (Moore, 2003),(Chanock et al., 2007).
Cele mai multe boli umane sunt rezultatul acțiunii unui număr semnificativ de factori (de risc sau predispozanți, genetici sau de mediu) care pot să acționeze independent sau în asociere. Între acești factori se stabilesc relații de epistazie de tip biologic, ecologic sau statistic iar efectele sunt antagoniste sau sinergice (independente, aditive sau multiplicative). Identificarea relațiilor de epistazie statistică dintre acești factori reprezintă o bază pentru descifrarea relațiilor de epistazie biologică și la înțelegerea predispoziției pentru caracterele complexe (inclusiv a celor referitoare la inițierea, promovarea, progresia tumorală). Din punct de vedere clinic descifrarea predispoziției pentru cancerul de sân contribuie la îmbunătățirea conduitei terapeutice și astfel contribuie la creșterea speranței de viață. În intervalul 1988-2000 speranța medie de viață a acestor paciente a fost de 2,9 ani) (Hance et al., 2005) iar în prezent există cazuri care au supraviețuit mai mult de 20 ani (Giannakeas and Narod, 2019).
În acest studiu au fost testate relațiile de epistazie statistică dintre diferiți factori asociați cu carcinomul ductal invaziv (numit uneori carcinom ductal infiltrant). Carcinomul ductal invaziv reprezintă 70- 80% din numărul total de cazuri de cancer de sân. În consecință pentru acest studiu a fost abordată predispoziția pentru subtipul de cancer de sân care a fost cel mai frecvent diagnosticat la femei.
2.5.1. Punctele tari ale acestui studiu.
Principalele puncte tari ale acestui studiu sunt: uniformitate clinică a loturilor de subiecți și selectarea subiecților dintr-o regiune geografică delimitată precis reduce efectul potențial al acțiunii unor factori de confuzie asupra rezultatelor studiului; populația investigată a fost puțin analizată anterior din punct de vedere al predispoziției pentru cancerul de sân sau al backgroundului genetic; criteriile complexe utilizate pentru selectarea subiecților care au alcătuit loturile de studiu (ex. interval de vârstă pentru includere 50-65 ani, fenotipul patologic de interes -carcinom ductal invaziv, criterii referitoare la antecedentele personale și heredocolaterale precise), utilizarea unor metode complementare de analiză statistică.
a) Antecedentele heredocolaterale și mutațiile cu penetranță crescută. Predispoziția pentru formele ereditare, familiale sau sporadice de cancer de sân, prezintă o serie de particularități. Riscul de cancer de sân este crescut de antecedentele de boli maligne, mai ales dacă rudele sunt apropiate din punct de vedere genetic (ex. cancer de sân invaziv: RR = 6,8; cancer de sân la rudele de grad I: RR = 3,6) (‘A Retrospective Cohort Analysis of Second Breast Cancer Risk for Primary Breast Cancer Patients With an Assessment of the Effect of Radiation Therapy<xref ref-type="fn" rid="FN2">2</xref>’, 1983),(Rosen et al., 1989), (Singletary, 2003) (Beral et al., 2001),(Sun et al., 2017),(Pharoah et al., 1997). Creșterea riscului de boală la rudele pacienților poate avea la bază backgroundul genetic comun sau expunerea la factori nongenetici similari. Predispoziția pentru formele de cancer de sân care prezintă agregare familială este mai ușor de descifrat. Spre exemplu s-au identificat mutații cu penetranță crescută în genele BRCA1 și BRCA2. Aceste mutații pot explica apariția a 10% din numărul total de cazuri de cancer de sân identificate la femeile caucaziene (70 – 90% dintre cazurile familiale și 1-5% dintre cele sporadice) (Claus et al., 1996), (Smith et al., 1992),(Ford et al., 1998). Având în vedere particularitățile predispoziției pentru subtipurile de cancer de sân s-a încercat constituirea unui lot de paciente cât mai omogen pentru studiul de tip caz -control realizat.
Două dintre criteriile utilizate pentru excluderea subiecților au vizat formele ereditare sau familiale de boală și prezența mutațiilor cu penetranță crescută în genele BRCA și TP53.
Dintre mutațiile cu penetranță crescută din genele BRCA1, BRCA2 sau TP53 care au fost testate s-a identificat doar BRCA1 5382insC în două dintre probe (detectate cu Pronto® BRCA kit). Aceste rezultat are două consecințe:
– justifică excluderea celor 2 probe din studiu;
– arată că BRCA1 5382insC este cea mai frecventă mutație identificată la pacientele cu forme sporadice de carcinom ductal invaziv din România ; Frecvența redusă cu care se identifică mutații în genele BRCA la pacientele care au forme sporadice de cancer de sân a fost raportată în numeroase studii, inclusiv în studii recente bazate pe secvențierea genelor BRCA (Tung et al., 2015).
O serie de studii au indicat că vârsta la care debutează clinic cancerul de sân este mai redusă la pacientele care au mutații cu penetranță crescută comparativ cu cea înregistrată la pacientele care nu au astfel de mutații (Liu et al., 2019). În consecință pentru acest studiu au fost selectate paciente care au forme sporadice de carcinom ductal invaziv care fac parte din grupă de vârstă 50-65 ani. Prin aceste criterii s-a încercat excluderea din studiu a subiecților care aveau mutații cu penetranță crescută și care predispun la apariția unor subtipuri de boală cu debut la vârste mai reduse.
b) Etnia. Particularități genetice (spectrul mutațional diferit) și cele socio-economice contribuie la diferențele interetnice sau interpopulaționale privind riscul de boală (Kadouri et al., 2007), (‘Cancer incidence in five continents. Volume IX.’, 2008), (Parkin et al., 2010), (Desantis, Siegel and Jemal, 2015). Valorile extreme ale incidenței bolii au fost raportate în America de Nord, Europa de Vest și Australia (70-90 cazuri noi / 100000 de locuitori / an) (Edwards et al., 2005). În unele studii s-au raportat particularități ale cancerului de sân în diferite subgrupuri populaționale (Eliassen et al., 2010),(Hunter et al., 2010),(Friebel, Domchek and Rebbeck, 2014) sau chiar la grupuri etnice care trăiesc într-o anumită regiune geografică (El Saghir et al., 2015),(L. et al., 2007).
Având în vedere diferențele interetnice sau interregionale ale incidenței cancerului de sân selectarea subiecților pentru acest studiu s-a realizat dintr-o regiune limitată din Sudul României care este caracterizată prin omogenitate etnică, genetică și culturală. Prin limitarea arealului din care au fost selectați subiecții s-a redus impactul unor factori de confuzie asupra rezultatelor obținute.
c) Excluderea subiecților care au carcinom ductal in situ. Depășirea membranei bazale de către celulele tumorale și colonizarea teritoriului stromal din vecinătate reprezintă evenimente cheie în apariția formelor invazive de cancer. Prezența carcinomului ductal in situ crește de 4-12 ori riscul de a dezvolta forma invazivă de boală (Collins et al., 2005),(Osuala et al., 2015). Au fost însă raportate și cazuri care deși nu au beneficiat de un tratament specific au avut o evoluție extrem de lentă a bolii într-un interval de timp semnificativ (5-20 ani) (Sgroi, 2010). Datele disponibile în prezent sugerează că delimitarea și tranziția de la forma ductală in situ la forma invazivă sunt dependente de rețele moleculare complexe care nu sunt încă elucidate. În consecință cele forme de carcinom ductal au o serie de particularități histopatologice și moleculare iar forma de carcinom ductal invaziv reprezintă un fenotip particular de carcinom ductal (Lin et al., 2019). Aceste rezultate reprezintă un alt motiv pentru care în acest studiu s-a decis limitarea investigării predispoziției pentru carcinomul ductal doar la forma invazivă.
Datele morfologice sunt utile în practica medicală curentă pentru stadializarea carcinomului ductal, pentru diferențierea cazurilor care au un risc crescut de invazivitate de cele care pot avea o evoluție lentă (Lakhani and Ashworth, 2001),(Gradishar, 2005),(Patani, Cutuli and Mokbel, 2008) și pentru alegerea strategiei terapeutice optime (Zujewski et al., 2011),(Cuzick et al., 2011). Totuși heterogenitatea fenotipului celular reduce valoarea practică a datelor morfologice și impune identificarea unor noi biomarkeri specifici pentru fiecare subtip de carcinom ductal. Un prim pas a fost realizat prin compararea profilului de expresie genică în eșantioane de carcinom ductal in situ și carcinom invaziv și identificarea genelor care au expresie diferențiată (Muggerud et al., 2010),(Hannemann et al., 2006), (Ma et al., 2003), (Schultz et al., 2018), (Elias et al., 2016), (Schultz et al., 2018). Unele observații sugerează că modificarea profilului de expresie genică precede modificările morfologice (Castro et al., 2008). În consecință se încearcă identificarea unor noi biomarkeri pentru inițierea și tranziția spre forma invazivă sau pentru diferențierea carcinomului ductal in situ pur de cel care are potențial crescut de invazivitate.
Particularitățile subtipurilor de carcinom ductal au reprezentat o bază pentru centrarea acestui studiu doar pe cazurile care au avut forma invazivă.
d) Preeclampsia a fost considerată un potențial factor protectiv pentru cancerul de sân (Innes and Byers, 2004),(Innes, Byers and Schymura, 2000). În consecință din studiul realizat au fost excluse persoanele care au avut preeclampsie sau suspiciuni de preeclampsie.
e) Vârsta și modificările care apar la nivelul glandei mamare sau la nivelul profilului hormonal cresc riscul dezvoltării cancerului de sân. Perioadele în care se remodelează glanda mamară sunt însoțite de o creștere a riscului de apariție a unor erori în replicarea ADN și a susceptibilității celulelor din glanda mamară la acțiunea agenților mutageni. În aceste perioade crește riscul amorsării proceselor tumorale.
Datele epidemiologice arată că frecvența bolii crește lent până la vârsta de 50 ani (grupa de vârstă 30 – 40 ani: ~1 /200 femei; grupa 40 – 50 ani: 1/ 50 femei); după vârsta de 50 ani incidența bolii crește și atinge valoarea maximă la grupa de vârstă 70-80 ani (1 caz la 8-10 femei).
În acest studiu am selectat doar cazuri pentru care vârsta la diagnosticul carcinomului ductal invaziv (58,20±2,89 ani) și vârsta la includere (vârsta medie la includere 60,12±3,05 ani) au fost cuprinse în intervalul 50-65 ani, adică intervalul în care incidența bolii crește accentuat (Tabel 2).
S-a observat că tumorile care debutează înainte de instalarea menopauzei sunt în general mai agresive comparativ cu cele care debutează după această vârstă (Chung et al., 1996), (de la Rochefordière et al., 1993). Aceste observații au reprezentat un alt argument pentru care s-a optat pentru selectarea cazurilor la care boala a fost diagnosticată în intervalul de vârstă 50-65 ani. Prin excluderea cazurilor care debutează la vârstă mai redusă s-a încercat limitarea probabilității de a include în studiu paciente care au mutații cu penetranță crescută.
f) Particularitățile reproductive. Numărul de sarcini duse la termen și perioada de lactație reprezintă particularități reproductive care explică parțial de ce femeile care locuiesc în țări dezvoltate au un risc mai mare de a dezvolta cancer de sân comparativ cu cele din țările subdezvoltate. Studii efectuate în diferite populații au evidențiat efectul particularităților reproductive (ex. vârsta la care se înregistrează menarha, menopauza, prima sarcină dusă la termen, nuliparitatea, durata lactației) asupra riscului de cancer de sân (Colditz and Rosner, 2000), (Key, Verkasalo and Banks, 2001), (Ursin et al., 2005), (Anderson, Schwab and Martinez, 2014). Într-un studiu regional efectuat în Craiova s-a estimat că menarha înaintea vârstei de 14 ani și ciclicitatea menstruală pentru o perioadă mai mare de 32 ani reprezintă factori de risc importanți pentru cancerul de sân (Mazilu et al., 2003). La inițierea acestui studiu nu se cunoșteau alte date referitoare la impactul pe care îl au factorii reproductivi asupra riscului de carcinom ductal invaziv la femeile din România.
Nașterea prematură a fost raportată ca un factor care poate crește riscul de cancer de sân în premenopauză (dacă se alege ca referință lotul de surori control) (Hajiebrahimi et al., 2016). Pentru acest studiu au fost selectate doar femei nulipare sau care au avut prima naștere după săptămâna 31 de gestație pentru a limita efectele nașterii premature asupra rezultatelor obținute.
Caracteristicile subiecților la vârsta la care are loc prima sarcină dusă la termen este un factor de risc important pentru apariția cancerului de sân iar această relație a fost descrisă în numeroase studii (Clavel-Chapelon and Gerber, 2002),(Cnattingius et al., 2005),(Bernstein, 2002). Asocierea menționată anterior poate să fie influențată și de particularitățile mamei (înălțime, IMC) la ultima sarcină. În consecință pentru acest studiu au fost selectate doar femei care au avut IMC <30 kg/m2.
g) Consumul de alcool. Expunerea la alcool poate influența balanța hormonală a organismului (inclusiv nivelul estrogenilor) (Assi et al., 2020). Cu toate acestea mecanismul fiziopatologic care poate explica relația potențială dintre expunerea la alcool și cancerul de sân nu este elucidat. Diferite studii, inclusiv două meta-analize au sugerat că alcoolul, chiar dacă este consumat în doze reduse, poate crește riscul de cancer de sân. Riscul de boală este influențat și de cantitatea alcool consumată. Riscul de boală crește cu 4%-7% chiar dacă se consumă o băutură alcoolică (~10g alcool) / zi (Liu, Nguyen and Colditz, 2015) și cu până la 40-50% dacă se consumă cantități mari de alcool. Într-o meta-analiză, care a grupat datele din 53 studii, s-a calculat că riscul de cancer de sân crește semnificativ la femeile care consumă >35g alcool/ zi (35-44 g: O.R. =1,32, p <0,00001; ≥45 g: O.R. =1,46, p <0,00001) în raport cu cele care nu consumă alcool. Fiecare 10 g alcool consumate suplimentar/zi cresc riscul de boală cu 7,1% (95%Cl: 5,5-8,7%; p<0,00001). Acesta crește s-a considerat că nu este influențată de statutul de fumător activ (Hamajima et al., 2002). Alte date sugerează că riscul de boală este crescut mai ales la pacientele care au dobândit acest viciu înainte de prima sarcină (Jayasekara et al., 2016). Date similare au fost publicate și pentru expunerea la fum de țigară.
La nivel mondial acest viciu poate să fie implicat în apariția a 5% dintre cazurile de cancer de sân (~50000 cazuri). În Europa și America de Nord consumul redus de alcool poate să fie implicat în apariția a 1-2% din numărul total de cazuri de cancer de sân (Seitz et al., 2012).
În consecință din acest studiu au fost excluse persoanele care au raportat un consum de alcool mai mare de 75g alcool / zi, mai mult de 3 zile pe săptămână (echivalentul a 225 g alcool / săptămână).
2.5.1. Predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv
În acest studiu principalele rezultate obținute au vizat factorii care pot modula riscul pentru carcinom ductal invaziv sau vârsta la care debutează boala. Factorii asociați cu carcinomul ductal invaziv au fost considerați protectivi sau de risc.
1. Principalii factori protectivi pentru carcinomul ductal invaziv identificați în acest studiu sunt:
a) prima sarcină înainte de 30 ani la femei normoponderale (O.R.=0,19, p=1,9E-5) (Tabel 22) sau sedentare (O.R.=0,14, p=1,8E-5) (Tabel 28);
b) perioadă totală de lactație > 12 luni în raport cu absența lactației (O.R.=0,27, p=0*) sau cu o perioadă de lactație care < 12 luni (O.R.=0,32, p=0,0003) ( Tabel 2);
c) anticoncepționalele orale consumate de purtătoarele de genotip AGTR1 AA (O.R.=0,15, p=0,0008) sau IL6 GG (O.R.= 0,22, Yate's p=0,001) (Tabel 16),( Tabel 2);
d) paritatea (O.R.= 0,41, p=3,6E-5).
2. Principalii factori de risc pentru carcinomul ductal invaziv au fost calculați pentru:
a) nulipare (absența lactației) purtătoare de TTV (O.R.=3,44, p=0*) (Tabel 5) sau de coinfecție cu TTV și TTMDV (O.R.=3,32, p=3,0E-6) ( Tabel 6). Asocierea este mai importantă comparativ cu cea conferită de nuliparitate (O.R.=2,45, p=3.6E-5) (Tabel 2), de prezența TTV (O.R.=3,14, p=1,0E-6) sau de coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=2,73, p=4,01, E-6) ( Tabel 4). Riscul de boală a fost și mai mare în cazul femeilor nulipare sedentare (O.R.= 3,69, p=1,3E-5) (Tabel 28) și a atins valori maxime în cazul nuliparelor normoponderalele (O.R.=5,45, p=4,2E-5) sau nuliparelor supraponderale ( O.R.=4,11);
b) absența consumului de anticoncepționale orale de persoane care au TTV (O.R.=3,54, p=0*) (Tabel 17, Tabel 4). Asocierea cu carcinomul ductal invaziv este superioară celei conferite de absența consumului de anticoncepționale orale (O.R.=3,25, p=0,00017) ( Tabel 2) sau de prezența TTV (O.R.=3,14, p=1,0E-6) ( Tabel 4);
c) mai puțin de 12 luni de lactație la femeile care au avut coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=3,57, p=0,0006) ( Tabel 6) sau care au fost sedentare (O.R.= 4,67, p=0,0006) (Tabel 28);
d) supraponderale care au avut prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 (O.R.=5,19, p=7,1E-5) (Tabel 21), care au avut TTV (O.R.=4,89, p=0*) sau coinfecție cu TTV și TTMDV (O.R.=3,14, p=6,8E-5) ( Tabel 24) sau care au fost nulipare (O.R.=4,11);
e) parodontopatia cronică (O.R.= 4,11, p=0) (Tabel 2).
f) fumatul activ înainte de prima sarcină (O.R.= 6,19, p= 0);
g) prima sarcină după vârsta de 30 ani și coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=7,87, Yate's p=0,0002); asocierea cu carcinomul ductal invaziv este mai puternică în comparație cu cea conferită de prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 ani (O.R.=5,02, p=0*) sau de coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=2,73, p=4,01, E-6) (Tabel 2, Tabel 4);
h) prezența simultană a genotipurilor IL6 GG -TGFb CC (O.R.=34,69, p<0,0001) (Tabel 12).
3. La riscul de carcinom ductal invaziv pot să contribuie și:
– particularitățile fumatului activ: pacientele comparativ cu femeile sănătoase au fumat cu ~ 10 ani mai mult (p<2,2e-08), vârsta la care au dobândit acest viciu a fost cu 5,66 ani mai redusă (p=1,12e-10) iar cele care au renunțat la acest viciu au a fost cu 11,26 ani mai mare (p=2,1e-11). De asemenea pacientele au fost expuse pasiv la fum de țigară cu ~ 3,91 ani mai mult comparativ cu femeile sănătoase (p<0,00001) (Tabel 26). Expunerea fum de țigară a prezentat diferențe semnificative în sublotul de femei de la oraș unde pacientele au fumat activ cu 10,77 ani mai mult comparativ cu femeile sănătoase (p<0,000003) ( Tabel 31).
– prima sarcină dusă la termen. În acest studiu s-a observat o creștere cu 4,28 ani a vârstei la care s-a înregistrat prima sarcină dusă la termen la paciente în raport cu femeile din lotul control (29,34 ani vs. 25,06 ani, p<5,4e-10). Această diferență a fost de ~5 ani în sublotul de femei unipare (paciente vs. femei sănătoase: 30,26 ani vs. 25,33 ani; p<0,001). În cazul multiparelor diferența a fost de ~3,5 ani care nu a mai fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic (28,15 ani vs. 24,65 ani, p<0,004) ( Tabel 3, Fig. 30).
– valorile IMC au fost cu ~1 km/m2 mai mari la purtătorii de MTHFR T din lotul de paciente în raport cu femeile sănătoase (25,88 kg/m2 vs. 24,91 kg/m2, p=0,0008) (Tabel 19). IMC din intervalul supraponderal pot influența riscul de boală dacă este asociat cu alți factori (virusurile TT, nuliparitate sau prima sarcină dusă la termen la vârste înaintate).
– pacientele au fumat un număr dublu de pachete de țigări înainte de prima sarcină comparativ cu femeile din lotul control (3917,23 vs. 1999,90, p<0,02) și au fost expuse o perioadă mai mare la fum de țigară (5,22 vs. 4,66 ore, p=0,04). Aceste diferențe nu au atins pragul (corectat) pentru a le considera semnificative statistic dar pot avea o semnificație biologică.
4. Factorii antagoniști, în unele combinații, își pot reduce / anula reciproc efectele individuale. Două dintre exemple sunt reprezentate de asocierea dintre anticoncepționalele orale și prima sarcini înaintea vârstei de 30 sau prezența virusurilor TT (p>0,05).
– Particularitățile reproductive
Asocierea dintre cancerul de sân (mai ales cu formele care au debutat în premenopauză) și particularitățile reproductive (ex. vârsta la care se înregistrează menarha, menopauza, prima sarcină dusă la termen, intervalul de timp cuprins între menarhă și prima sarcină dusă la termen, nuliparitatea, durata lactației) a fost raportată în diferite populații (Colditz and Rosner, 2000), (Key, Verkasalo and Banks, 2001), (Colditz and Bohlke, 2015),(Ursin et al., 2005), (Anderson, Schwab and Martinez, 2014),(Tamimi et al., 2016).
Riscul de cancer de sân se modifică pe măsură ce intervalul de timp care a trecut de la sarcină crește. Spre exemplu în primii 10 ani după naștere riscul este mai mare pentru formele de cancer de sân care nu exprimă receptori hormonali. La distanță mai mare de prima sarcină aceste relații pare să nu mai fie atât de evidentă. Aceste rezultate au contribuit la decizia de a introduce criterii de includere -excludere legate de vârstă și de a exclude din acest studiu pacientele la care boala a fost diagnosticată la vârste extreme.
Unele studii au estimat că la 29,5% dintre pacientele cu tumori mamare se pot identifica doi factori de risc: nuliparitatea sau vârsta înaintată la care se produce prima sarcină (Madigan et al., 1995), (Schedin, 2006). Importanța acestor factori în predispoziția pentru boală tinde să crească deoarece la nivel global se manifestă o tendință de a se reduce numărul de sarcini și de a avea primul urmaș la vârste tot mai înaintate. Impactul nuliparității în predispoziția pentru boală a fost reconfirmată și într-o meta-analiză recentă. Ea a fost considerată principalul factor de risc modificabil pentru cancerul de sân la femeile din Sud-Estul Asiei (OR = 1,85, 95%CI: 1,47-2,32) (Nindrea, Aryandono and Lazuardi, 2017). Într-o altă meta-analiză au fost investigate datele din 47 studii epidemiologice (50302 paciente și 96973 femei control). Rezultatele obținute au indicat că riscul de cancer de sân invaziv este crescut de: nuliparitate (OR= 1,3-4,0), vârsta mai mare de 35 de ani la care este înregistrează prima sarcină dusă la termen (ex. R.R, = 1,5-4,0), numărul mai redus de copii (paciente vs. femei control: 2,2 vs. 2,6 copii). Dintre factorii protectivi s-au remarcat prima sarcină înainte de 20 de ani (R.R. = 0,4) și creșterea duratei de alăptare (fiecare 12 luni de lactație reduc riscul de boală cu 4,3%, p<0,0001) (Beral et al., 2002). Meta-analiza realizată de către Nicholas și colaboratorii a indicat că riscul de cancer de sân este mai mare în primii 20 de ani după naștere, mai ales în cazul în care mama a avut vârstă mai înaintată la momentul nașterii (Nichols et al., 2019). Totuși impactul acestor factori nu a fost reconfirmat în toate studiile iar rezultatele discordante par să fie influențate de particularitățile populației analizate. Spre exemplu, un studiu monocentric efectuat în Pakistan, țară în care incidența cancerului de sân atinge valori impresionante, a stabilit că factorii de risc reproductivi (ex. ciclul menstrual, menarha, perioada de lactație) au o contribuție redusă la riscul total de cancer de sân (Mansha et al., 2016). Valori intermediare ale acestor factori au fost raportate la pacientele cu cancer de sân din China (6,74% dintre paciente) (Li et al., 2012). Contribuții mai mari (31%) au fost identificate în Germania, la pacientele care au cancer de sân care a debutat după instalarea menopauzei (ex. vârsta la care se instalează menarha: 7,7%, menopauza: 12%, numărul de sarcini: 10,9%) (Barnes et al., 2011). În Suedia variantele protective ale acestor factori pot reduce incidența bolii cu 17,9% (Granström, Sundquist and Hemminki, 2008). Creșterea numărului de sarcini duse la termen a fost asociat cu diminuarea riscului de boală (multipare vs. nulipare). La femeile din China scăderea numărului mediu de copii a fost considerată responsabilă de 1,47% dintre cazurile de cancer de sân iar utilizarea contraceptivelor orale a fost implicată în apariția unui procent redus de cazuri (0,71%) (Li et al., 2012). In Black Women's Health Study au fost investigate 59000 femei afro-americane și au fost identificate 775 cazuri de cancer de sân (457 cazuri pozitive pentru receptorii pentru estrogeni și progesteron și 318 cazuri negative pentru acești receptori). Numărul mare de sarcini a fost asociat cu o tendință de creștere a riscului de cancer de sân negativ pentru receptorii pentru estrogen și progesteron (3+ vs. 0 sarcini: H.R. = 1,48, 95% CI: 0,98-1,84) și cu o diminuare a riscului pentru formele pozitive pentru receptorii pentru estrogen și progesteron (H.R. = 0,53, 95%CI: 0,39-0,73, p= 0.,002) (Kim et al., 2007).
Diferențele interetnice și interpopulaționale au justificat includerea criteriilor de includere privind originea și etnia subiecților selectați pentru acest studiu.
În cercetarea realizată s-a testat dacă riscul de apariție a carcinomului ductal invaziv și vârsta la care acesta a fost diagnosticat sunt influențate de: vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină dusă la termen, numărul de sarcini și vârsta la care s-a produs prima sarcină (înainte sau după vârsta de 30 ani), intervalul de timp cuprins între prima sarcină dusă la termen și vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv.
Paritatea
Creșterea numărului de sarcini a fost considerată un factor protectiv pentru apariția cancerului de sân, mai ales pentru formele cu debut în premenopauză (Bernstein, 2002),(Cnattingius et al., 2005),(Rojas and Stuckey, 2016),(Atkinson et al., 2016). Fiecare sarcină dusă la termen a fost asociată cu o reducere a riscului de cancer de sân înainte de menopauză cu 3% iar pentru formele cu debut mai tardiv cu 12% (Clavel-Chapelon and Gerber, 2002). Într-un studiu caz-control realizat în Suedia la nivel național s-a estimat că fiecare sarcină reduce riscul de cancer de sân cu 10% (O.R. =0,90, 95% CI: 0,88-0,91) (Lambe et al., 1996). Rezultate similare au fost prezentate și în alte studii. Aceste date susțin că promotorii carcinogenezei care sunt în relație cu factorii reproductivi acționează cu mult timp înainte de debutul clinic al bolii. Posibilitatea de a identifica efectele acestor factori scade pe măsură ce se analizează cazuri care debutează la vârste înaintate. Acest aspect a fost un alt argument pentru care le selectarea loturilor s-au avut în vedere doar forme care au debutat în intervalul 50-65 ani.
Un studiu realizat în Germania pe un lot de paciente cu cancer de sân (706 cazuri cu debut înainte de 50 ani) și două loturi control (1381 subiecți din populația generală și 252 surori) a evidențiat o relație inversă între riscul de cancer de sân și numărului de sarcini sau durata de lactație. In plus istoricul de avorturi a fost raportat ca un factor de risc pentru apariția bolii (Becher, Schmidt and Chang-Claude, 2003).
În studiul realizat prezența sarcinilor duse la termen a reprezentat un caracter protectiv pentru carcinomul ductal invaziv (O.R.= 0,41, p=3,6E-5). Asocierea a fost și mai importantă dacă prima sarcină s-a produs înaintea vârstei de 30 ani indiferent dacă ne raportăm la persoanele care au avut sarcini după această vârstă sau nu au avut sarcini (O.R.=0,20, p=0*). Un efect opus a avut prima sarcină după vârsta de 30 de ani; ea a reprezentat un factor de risc pentru boală dacă datele au fost raportate la cele produse înainte de această vârstă (O.R.=5,02, p=0*) ( Tabel 2).
Avorturile spontane sau provocate, nu au fost asociate cu modificarea riscului de carcinom ductal invaziv în populația caucaziană din România (Tabel 2). Acest rezultat este concordant cu cel obținut într-un studiu derulat în China (Wu et al., 2014),(Couzin, 2003) dar este diferit față de cel raportat în alte populații (Becher, Schmidt and Chang-Claude, 2003),(Toleutay et al., 2013). Este posibil ca la aceste rezultate discordante să contribuie diferiți factori de confuzie care sunt asociați cu avorturile sau interacțiunea dintre aceștia și factorii genetici.
Nuliparitatea (sau absența perioadei de lactație) a conferit un risc semnificativ de cancer de sân (O.R.=2,45, 95%CI: 1,59 – 3,76; p=3.6E-5) ( Tabel 2). Asocierea are valori intermediare comparativ cu cele raportate în alte populații chiar dacă au fost testate loturi de dimensiuni similare. Spre exemplu, în studii caz-control realizate în Maroc (237 paciente cu cancer de sân și 237 persoane control, O.R. = 3,77, 95% CI: 1,98-7,30) (Khalis et al., 2018) și Malaesia (147 cazuri cancer de sân și 147 indivizi control; O.R.= 15,3; 95%CI: 3,2,-72,4) (Norsa’adah et al., 2005) au scos în evidență asocieri mult mai puternice între nuliparitate și cancerul de sân.
Vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină a fost cu ~4,3 ani mai mare la paciente comparativ cu femeile din lotul control (29,34 ani vs. 25,06 ani, p=5,4e-10) ( Tabel 2). Această diferență a fost de ~5 ani în sublotul de femei unipare (paciente vs. femei sănătoase: 30,26 ani vs. 25,33 ani; p<0,001). În cazul femeilor multipare diferența deși a fost de ~3,5 ani nu a mai fost semnificativă din punct de vedere statistic (28,15 ani vs. 24,65 ani, p<0,004) ( Tabel 3, Fig. 30). Dacă au fost comparate doar paciente pare s-a constatat că vârsta la care s-a produs prima sarcină dusă la termen a avut tendința de a fi cu 2,11 ani mai mare la unipare comparativ cea înregistrată la multipare (30,26 ani vs. 28,15 ani, p=0,03) (Tabel 3). Aceste date sugerează că riscul de carcinom ductal invaziv la pacientele unipare este crescut atât de numărul redus de sarcini cât și de vârsta mai înaintată la care aceasta se produc. Rezultate sunt concordate cu datele epidemiologice publicate anterior care susțin relația dintre vârsta înaintată la care se produce prima sarcină și riscul de cancer de sân (Colditz, 1998), (Pathak, 2002),(Clavel-Chapelon and Gerber, 2002), (Bernstein, 2002), (Cnattingius et al., 2005).
Tendința de a avea urmași la vârste mai înaintate a fost raportată în diferite populații (Mathews and Hamilton, 2016),(Hamilton et al., 2015),(Hamilton et al., 2018) și este însoțită de creșterea riscului de cancer de sân (Matsuda et al., 2012),(Matsuda et al., 2012),(Andersson et al., 2009). În unele studii asocierea este mai puternică cu formele de boală diagnosticate post-partum (Schedin, 2006),(Albrektsen et al., 2005),(Lambe et al., 1994). În Women's Contraceptive and Reproductive Experiences Study au fost investigate 1457 paciente cu cancer de sân și 1455 persoane control cu vârsta mai mare de 55 ani. Rezultatele au sugerat că nașterile înaintea vârstei de 25 ani reduc riscul de boală cu 36% – în raport cu absența sarcinilor (Lord et al., 2008). Studiul realizat pe pacientele din România nu a putut analiza acest aspect deoarece în studiu au fost investigate doar paciente în postmenopauză iar vârsta medie de la prima sarcină la includerea în studiu a fost de 28,62±4,77 ani (15,00-39,00 ani).
În alte studii s-a considerat că vârsta la prima sarcină nu are un impact important asupra riscului de cancer de sân indiferent dacă statutul de purtător de mutații în genele BRCA1 sau BRCA2 este cunoscut (Kotsopoulos et al., 2007) sau nu (Huo et al., 2008). Pentru a evita mascarea efectului vârstei asupra riscului de boală de către mutații din genele BRCA s-a decis excluderea din studiu a subiecților care au avut mutații cu penetranță crescută.
Datele obținute în acest studiu au arătată că asocierea dintre paritate și riscul de carcinom ductal invaziv este superioară valorilor identificate în alte populații. Această asociere poate reprezenta o caracteristică a populației studiate.
Paritatea și virusurile Torque Teno. Frecvențele probelor pozitive pentru TTV (p=1,0E-6), TTMDV (p=1,0E-5) sau pentru coinfecția cu aceste virusuri (O.R.=2,73, p=4,01E-6) au fost semnificativ mai mari la pacientele care au carcinom ductal invaziv și mai reduse în lotul control (Tabel 4).
Virusurile Torque Teno au fost detectate mai frecvent în probele prelevate de la pacientele nulipare sau de la cele care au avut prima sarcină după vârsta de 30 ani în raport cu cele care provin din subloturile control corespunzătoare (Tabel 5).
În sublotul de paciente frecventă cazurilor care au avut prima sarcină după vârsta de 30 ani și coinfecție cu TTV și TTMDV a fost de 2,37 ori mai comparativ cu cea calculată pentru lotul control (69,05% vs. 29,03%). În consecință asocierea dintre prima sarcină după vârsta de 30 ani și coinfecția cu TTV și TTMDV crește semnificativ riscul de carcinom ductal invaziv (O.R.=7,87, Yate's p=0,0002) (Tabel 5). Valoarea acestei asocieri este mai mare comparativ cu cea calculată doar pentru sublotul în care prima sarcină a fost înregistrată după vârsta de 30 (O.R.=5,02, p=0*) (Tabel 2) sau pentru coinfecția TTV și TTMDV (O.R.=2,73, p=4,01, E-6) (Tabel 4). În consecință prezența simultană a celor doi factori crește semnificativ riscul de carcinom ductal invaziv în loturile studiate în acest studiu.
În subloturile de femei nulipare s-a observat că pacientele au fost mai frecvent pozitive pentru TTV (71,91% vs. 47,83%), TTMDV (64,04% vs. 44,93%) și TTMV (33,71% vs. 21,74%) în raport cu femeile sănătoase. Pe baza acestor date s-a calculat că riscul de boală la femeile nulipare a crescut semnificativ dacă au fost prezente și TTV (O.R.=3,45, p=0*), TTMDV (O.R.=3,07, p=7,0E-6) sau TTMV (O.R.=2,89, p=0,001) (Tabel 5). În consecință devine evident că asocierea cu carcinomul ductal invaziv este mai puternică în raport cu cea estimată independent pentru nuliparitate (O.R.=2,45, p=3,6E-5) (Tabel 2) și pentru virusurile TTV (O.R.=3,14, p=1,0E-6), TTMDV (O.R.=2,64, p=1,0E-5) sau TTMV (p>0,05) (Tabel 4). Două dintre probele pozitive pentru TTMDV (5,36%) și două dintre probele pozitive pentru TTMDV (7,14%) nu au avut și TTV (p>0,05). Frecvența mare a coinfecțiilor și numărul redus de probe care au avut doar TTV, TTMDV sau TTMV nu au permis estimarea efectului independent pe care îl exercită aceste virusuri (Tabel 5).
Având în vedere modul în care a fost organizat acest studiu de tip caz – control nu se poate testa dacă virusurile TTV sau TTMDV contribuie printr-un mecanism (cel mai probabil indirect) la apariția carcinomului ductal invaziv sau dacă ele sunt doar agenți patogeni oportuniști care infectează mai frecvent pacientele care au transformări maligne. Dacă virusurile TT reprezintă un factor de risc pentru carcinomul ductal invaziv atunci este necesar să stabilim dacă prezența lor reprezintă un marker pentru un fenotip tumoral particular (endofenotip) care este caracterizat prin invazivitate.
Într-un studiu anterior realizat de Cimponeriu și colaboratorii a fost investigată relația dintre virusurile Torque teno și formele sporadice de cancer de sân. În studiu monocentric menționat au fost investigate paciente care au avut forme sporadice de cancer de sân care au avut vârsta cuprinsă într-un interval destul de larg (57-84) (Cimponeriu et al., 2013). Rezultatele au indicat că TTV a fost mai frecvent în lotul de paciente iar asocierea cu cancerul de sân a fost semnificativă (84% vs. 60%, OR=3,5, p=0,00016). Această cercetare, spre deosebire de studiul realizat de Cimponeriu și colaboratorii, a vizat un lot mai mare de subiecți, mult mai omogen din punct de vedere al vârstei și al subtipului de boală și în care au fost testate toate cele trei tipuri de virusuri Torque teno. Asocierea cu boala a fost similară în cele două studii (O.R.=3,14) dar în această cercetare s-a obținut și date noi: s-a evidențiat asocierea dintre TTMDV și boală și s-a stabilit că prezența virusurilor TT nu modifică semnificativ vârsta la care a fost diagnosticată boala. Cumulat, aceste date sugerează că există o relație de asociere între virusurile TT și carcinomul ductal iar această asociere poate să reflecte particularitățile subiecților investigați.
Într-un studiu publicat în anul 2001 s-a testat viremia într-un lot heterogen de pacienți cu boli maligne (n=148) și indivizi control (n=50). Analiza celulelor mononucleare a indicat că 99% dintre probele prelevate de la pacienți cu boli maligne și 86% dintre cele care au provenit de la indivizii sănătoși au fost pozitive pentru TTV și că încărcătura virală este mult mai mare în cazul pacienților (Zhong et al., 2001). Un an mai târziu Zhong a publicat un studiu similar în care a constatat că 98,6% dintre cele 153 probele de celule sanguine mononucleate prelevate de la pacienți cu cancer și în 86% dintre cele 50 probe de la subiecții sănătoși (Zhong et al., 2002). În studiul realizat am obținut procentele mai reduse de probe pozitive pentru TTV atât în lotul de paciente cu carcinom ductal invaziv (76,58%) cât și în lotul de femei sănătoase (51%) comparativ cu valorile prezentate de Zhong și colaboratorii. Aceste rezultate nu sunt surprinzătoare având în vedere că procentul de probe pozitive pentru virusurile TT variază în limite largi în regiuni / populații diferite.
Prima sarcină după vârsta de 30 ani, durata redusă de alăptare și virusurile TT. Prima sarcină produsă după vârsta de 30 ani, durata de lactație (totală) care nu depășește 12 luni și virusurile Torque Teno sunt factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv. Atunci când s-a testat efectul cumulat al celor trei factori de risc s-a constatat că riscul de carcinom ductal invaziv este crescut de prima sarcină după 30 ani, durata de lactație totală mai mică de 12 luni și coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=3,57, p=0,0006) ( Tabel 7). Valoarea acestei asocieri este mai redusă comparativ cu cea conferită de coinfecția cu TTV și TTMDV la persoanele care au avut prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 ani (O.R.=7,87, Yate's p=0,0002). Pe baza acestor rezultate s-a considerat că asocierea dintre carcinomul ductal invaziv și cei trei factori reflectă riscul de boală conferit de coinfecția cu TTV și TTMDV la persoanele care au avut prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 ani.
– Lactația
Glanda mamară parcurge procese de remodelare care încep în perioada premergătoare nașterii (care sunt ghidate de proliferare celulară mai accentuată) și continuă și după perioada de înțărcare (când pierderea de celule domină procesele de remodelare) (Lund et al., 1996). S-a constatat că în timpul acestor procese la animalele model are loc un influx semnificativ de celule cu rol imunitar (Martinson et al., 2015),(O’Brien et al., 2010),(Betts et al., 2018), remodelarea matricei extracelulare (Goddard et al., 2016),(Lyons et al., 2011) și limfangiogeneză (Lyons et al., 2014). Experimentele au demonstrat că alterarea remodelării la nivelul glandei mamare crește riscul apariției tumorilor, de invazivitate și de metastazare (McDaniel et al., 2006). O parte dintre aceste modificări au corespondent și în procesele care însoțesc remodelările fiziologice ale glandei mamare la femei (Martinson et al., 2015),(Jindal et al., 2014),(Lyons et al., 2014).
Efectele lactației asupra riscului de cancer de sân sunt similare cu cele atribuite pentru menarha produsă la vârste înaintate și menopauza precoce. Substratul pentru această asociere poate să fie reprezentat de reducerea expunerii la estrogeni, scăderea numărului total de cicluri menstruale produse pe parcursul vieții și diminuarea concentrației carcinogenilor și poluanților liposolubili la nivelul sânului în timpul perioadei de lactație.
În unele studii lactația (Mayberry and Branch, 1994), (Romieu et al., 1996), (Gilliland et al., 1998), (Sweeney et al., 2008) sau creșterea perioadei de lactație (Kour et al., 2019) au fost considerate factori protectivi pentru cancerul de sân. Particularitățile lactației pot să contribuie la diferențele interetnice ale incidenței bolii (Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2010),(Howlader et al., 2014). Fiecare 12 luni de alăptare reduce cu 7% riscul de cancer de sân (Huo et al., 2008). Într-un studiu realizat în Spania s-a concluzionat că alăptarea mai mare de 6 luni are un efect protectiv pentru cancerul de sân la persoanele care nu fumează (González-Jiménez et al., 2014).
O meta-analiză în care au fost incluse 13907 cazuri de cancer de sân (Centers for Disease Control and Prevention (CDC), 2010) a evidențiat efectul protectiv al alăptării la sân (R.R.= 0,61, 95%CI:0,44-0,85). Acest efect este evident chiar și la persoanele care au avut durate extreme de hrănire (R.R.= 0,47, 95%CI: 0,36-0,60) (Zhou et al., 2015).
Din cohorta Nurses' Health Study au fost selectate femei aflate în premenopauză. S-a calculat că alăptarea naturală a redus riscul de cancer de sân, indiferent de vârsta la care a fost diagnosticată boala (vârstă <40: R.R.= 0,84, 95% CI: 0,57-1.,2; vârstă ≥40: R.R. = 0,85, 95% CI: 0,72-0,99) (Warner et al., 2013). Efectul protectiv al alăptării a fost influențată de către diferiți factori modulatori dar nu și de expresia receptorilor hormonali pe celulele tumorale. Astfel, analiza datelor din Women's Contraceptive and Reproductive Experiences Study a sugerat că riscul de boală poate să fie influențat de interacțiunea dintre paritate și alăptarea la sân (Lord et al., 2008). In Black Women's Health Study numărul mare de sarcini și prevalența redusă a femeilor care alăptează au fost considerate responsabile de incidența crescută a formelor negative pentru hormoni (ER -/PR -) la persoanele afro-americane (Palmer et al., 2011).
Analiza combinată a datelor din 47 studii epidemiologice desfășurate în 30 de țări (echivalentul a 50302 femei cu carcinom ductal invaziv și 96973 controli) a confirmat efectul protectiv al alăptării. Procentul de femei care au alăptat la sân (71% față de 79%) și durata medie de alăptare (9,8 față de 15,6 luni) au fost mai reduse în lotul de paciente cu cancer de sân comparativ cu cel înregistrat în lotul control. Pe baza acestor date s-a estimat că în medie riscul de cancer mamar a scăzut cu 4,3% pentru fiecare 12 luni de alăptare (p <0,0001) (Beral et al., 2002). Și în Coreea creșterea duratei de lactație la primul copil (p = 0,006) și a perioadei totale de lactație (p = 0,03) au redus semnificativ riscul de cancer de sân. Riscul de boală a fost cu ~ 50% mai redus la femeile care au alăptat ~1 an comparativ cu cele care au alăptat <4 luni (OR = 0,46; 95% CI: 0,30 – 0,70) (Kim et al., 2007). La femeile hispanice din SUA și Mexic durata lactației a redus riscul de cancer de sân mai ales dacă au fost comparate femei care au alăptat mai mult de 25 luni (O.R. =0,73, 95%CI=0,60–0,89, p=0,03) (Sangaramoorthy et al., 2019).
În acest studiu realizat pe populația din Sudul României perioada de lactație a reprezentat un factor protectiv asociat semnificativ cu carcinomul ductal invaziv. Durata lactației a fost cu 6,59 luni mai redusă la paciente comparativ cu femeile sănătoase (13,52 luni vs. 20,11 luni, p = 0,000002).
S-a observat că riscul de carcinom ductal invaziv atribuit persoanelor care au avut o perioadă de lactație care a depășit 12 luni a fost mult mai redus în raport cu cel estimat pentru persoanele care au avut o perioadă de lactație mai redusă (O.R.=0,32, p=0,0003) sau care nu au alăptat (38,20% vs. 58,68%, O.R.=0,27, p=0*) ( Tabel 2).
În acest studiu pacientele nulipare nu au avut perioadă de lactație. Pacientele care nu au avut lactație (nulipare) au fost stratificate în funcție de prezența virusurilor Torque teno. Rezultatele au fost similare cu cele obținute în cazul pacientelor nulipare (Tabel 5). Organizarea studiului nu permite discriminarea consecințelor pe care le are nuliparitatea și lipsa perioadei de lactație, în cazul în care acești factori sunt testați separat sau în asociere.
Absența lactației (sau nuliparitatea) (O.R.=2,45, p=3.6E-5) ( Tabel 2) și prezența TTV (O.R.=3,14, p=1,0E-6) sau a TTMDV (O.R.=2,64, p=1,0E-5) au crescut riscul de carcinom ductal invaziv (Tabel 4). La femeile care nu au avut lactație (nulipare) prezența virusurilor TT a crescut semnificativ riscul de boală. Riscul de boală a fost crescut de infecțiile cu TTV (O.R.=3,44, p=0), TTMDV (O.R.=3,07, p=7,0E-6) și de coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=3,32, p=3,0E-6) ( Tabel 6). Se poate observa în sublotul de femei care nu au avut lactație infecțiile cu virusurile Torque Teno considerate individual sau în asociere (TTV și TTMDV) cresc intensitatea asocierii cu carcinomul ductal invaziv. Acest rezultat susține importanța studierii efectului combinațiilor de factori care pot modula riscul de boală (ex. asocierea dintre absența lactației și prezența virusurilor Torque Teno). Astfel de interacțiuni au fost identificate și în alte studii. Spre exemplu o relație de asociere pozitivă între vârsta la care s-a produs prima naștere și riscul de cancer de sân la femeile care nu au alăptat niciodată dar nu și la persoanele care au alăptat a fost raportată în unele studii (Lord et al., 2008), (Sangaramoorthy et al., 2019). Interacțiunea dintre durata alăptării și efectul sarcinilor la termen a fost observată ți în cazul pacientelor care au cancer de sân triplu negativ înaintea vârstei de 50 ani (John et al., 2018). Aceste rezultate susțin complexitatea predispoziției pentru cancerul de sân și rolul interacțiunilor dintre factorii de risc și cei protectivi (ex. alăptarea poate diminua riscul de cancer de sân la femeile care au prima sarcină la vârste înaintate).
În cazul subiecților care au avut mai puțin de 12 luni de lactație coinfecția cu TTV și TTMDV a crescut semnificativ riscul de carcinom ductal invaziv (O.R.=3,57, p=0,0006) ( Tabel 6). În acest sublot frecvența coinfecției cu TTV și TTMDV a fost de ~3 ori mai frecventă la paciente comparativ cu lotul control (15,82% vs. 5%). Rezultatele prezentate (ex. reducerea perioadei de lactație și virusurile Torque Teno) susțin importanța testării combinațiilor de factori care pot modula predispoziția pentru bolile complexe.
În cazul subiecților care au avut o perioadă de lactație mai mare de 12 luni nu s-au observat diferențe semnificative ale distribuției virusurilor TT în subloturile de pacienți și control ( Tabel 6). Acest rezultat se poate explica prin efectul opus pe care îl exercită asupra riscului de boală cei doi factori analizați: lactația mai mare de 12 luni este un factor protectiv iar virusurile TT sunt factori de risc pentru boală.
– Polimorfismele genetice
Spectrul mutațional identificat la pacientele care au forme sporadice, familiale sau ereditare de cancer de sân prezintă o serie de particularități. La pacientele diagnosticate cu forme sporadice de cancer de sân spectrul mutațional identificat este destul de heterogen (Koboldt et al., 2012).
Polimorfismele genetice testate în acest studiu au fost distribuite în conformitate cu condiția de echilibru Hardy Weinberg. Acest rezultat a indicat că în lotul testat nu au acționat factori care să modifice semnificativ frecvența genotipurilor iar diferențele observate reflectă particularitățile loturilor testate.
În studiul realizat pe subiecți din Sudul României s-a observat că în model codominant polimorfismul IL6 G-174C are o tendință de reducere a riscului pentru carcinomul ductal invaziv (O.R. GC=0,61, p=0,03) (Tabel 8).
În prezent mecanismele moleculare care contribuie la etapele precoce ale tranziției de la carcinomul ductal in situ la forma invazivă nu sunt elucidate (Leygue et al., 2000),(Zajchowski et al., 2001),(Abba et al., 2004),(Hannemann et al., 2006), (Nagaraja et al., 2006),(Schuetz et al., 2006),(Ma et al., 2009). Unele studii au identificat gene care pot să fie implicate în etapele inițiale ale acestei tranziții (Perou et al., 2000),(Muggerud et al., 2010),(Knudsen et al., 2012). Totuși, în cele mai multe studii în care s-a testat spectrul mutațional (Hernandez et al., 2012),(Vincent-Salomon et al., 2008), anomaliile genomice (Vincent-Salomon et al., 2008) sau modificarea profilului de expresie genică (Schuetz et al., 2006),(Ma et al., 2003),(Lee et al., 2012) nu au evidențiat diferențe semnificative între eșantioanele de carcinom ductal in situ sau invaziv. În consecință sunt necesare abordări noi care să permită o caracterizare mai bună a predispoziției pentru boală (ex. testarea interacțiunilor dintre diferiți factori de risc sau protectivi).
În studiul realizat s-a constatat că prezența simultană a genotipurilor IL6 GG și TGFb CC este asociată cu carcinomul ductal invaziv (O.R.=34,69, p<0,0001) (Tabel 12). Și asocierile dintre IL6 GG și ACE DD (O.R.=1,93) sau L-SELL C (O.R.=1,53) sau dintre ACE D și eNOS bb (O.R. = 1,62) au o tendință de a crește riscul de boală (p<0,05). Tendințe opuse au fost estimate și pentru asocierea IL6 -174C și MTHFR CC (O.R.=0,52, p<0,05) sau TGFb -509T (O.R.=2,48, p=0,0017) (Tabel 12) sau pentru ACE D – TGFb TT (O.R. =0,14, p=0,005) (Tabel 9). Aceste rezultate susțin necesitatea investigării efectelor individuale dar și a combinațiilor de factori de risc și protectivi pentru a înțelege mai bine predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv.
Relația dintre inflamație și tumorigeneză nu este elucidată. Activarea mediatorilor și efectorii celulari implicați în inflamație se poate realiza înainte sau după apariția manifestărilor tumorale. Inflamația, indiferent de momentul în care s-a produs în raport cu debutul manifestărilor tumorale, are efecte complexe: poate activa mecanismele antiapoptotice și poate favoriza proliferarea celulară, angiogeneza și metastazarea (Mantovani et al., 2008), poate influența caracteristicile micromediului tumoral și răspunsul tumorii la hormoni și citostatice.
IL6 se exprimă atât în țesutul tumoral cât și în cel stromal (ex. fibroblastele asociate țesutului tumoral) (Osuala et al., 2015). Această citokină își exercită efectele prin interacțiunea cu receptorul specific (IL-6R) (prin calea de semnalizare JAK/STAT) sau prin “trans-semnalizare” (IL6 interacționează cu receptorul IL6 solubil care interacționează cu gp130 prezentă pe suprafața celulelor) (Cheng et al., 2008),(Sullivan et al., 2009),(Rose-John and Heinrich, 1994). Citokina, prin aceste căi de semnalizare, își exercită efectele versatile, care sunt predominant proinflamatorii. Componentele micromediului tumoral (ex. celulele mioepiteliale, fribroblaste) au un rol esențial în progresia carcinomului mamar (Gauger et al., 2009).
IL6 poate influența tumorigeneză prin efecte paracrine care pot afecta morfologia și adeziunea celulară, expresia proteazelor (ex. cistein catepsinse, matrix metaloproteaze) și migrarea celulelor tumorale (Badache and Hynes, 2001),(Leslie et al., 2010),(Ásgeirsson et al., 1998). De asemenea ea favorizează tranziția epitelio-mezenchimală care reprezintă o etapă importantă în progresia tumorilor (Thiery and Sleeman, 2006),(Mohamed et al., 2010), (Bengsch et al., 2014) și în tranziția carcinomului ductal de la forma in situ la forma invazivă (Osuala et al., 2015). Un alt mecanism este intermediat de expresia receptorilor pentru estrogeni și progesteron la nivelul unor celule derivate din celulele glandei mamare (Danforth and Sgagias, 1993). Există și ale motive care justifică includerea IL6 pe lista candidaților pentru carcinomul ductal invaziv. Spre exemplu, supraexprimarea elementelor acestei căi de semnalizare în formele invazive de cancer (Hobisch et al., 2000), (Kinoshita, Ito and Miki, 1999) reprezintă un potențial factor de prognostic nefavorabil (Dethlefsen, Højfeldt and Hojman, 2013),(Narița et al., 2011), (Ravishankaran and Karunanithi, 2011) iar inhibarea acestor semnale poate stopa creșterea unor linii celulare derivate din tumorile glandei mamare (Hartman et al., 2013),(Jiang et al., 2011).
Polimorfismul testat în acest studiu IL6 G-174C este considerat funcțional pe baza studiilor efectuate in vitro care au indicat că variantele sale sunt asociate cu o rată diferită de transcripție și de expresie proteică (Vickers et al., 2002),(JONES et al., 2001).
Relațiile dintre polimorfismul IL6 G-174C și cancerul de sân sunt contradictorii. În unele studii polimorfismul a avut o tendință de asociere cu prognosticul bolii, mai blând (DeMichele et al., 2003) sau mai agresiv (Iacopetta, Grieu and Joseph, 2004). Un studiu realizat în India a investigat 200 paciente cu cancer de sân și 200 femei sănătoase. Nivelurile de IL6 au fost similare în loturile de paciente și control. Alela mutantă sau genotipul homozigot mutant al IL6G-174C au fost considerate protective pentru cancerul de sân (Pooja et al., 2012). Un studiu realizat pe 269 paciente caucaziene cu cancer de sân și 227 persoane sănătoase a concluzionat că alela -174C IL6 crește riscul de cancer de sân la caucazieni iar asocierea este dependentă de doza de alele de risc (Hefler et al., 2005). Într-un studiu caz- control realizat în SUA au fost incluse 2325 paciente cu cancer de sân și 2451 femei control. Prezența variantei -174 C a redus semnificativ riscul de cancer de sân la femeile nonhispanice (O.R.~0,6), hispanice sau native din SUA (O.R.= 0,4). Această asociere se pare că poate să fie influențată și de expunerea la estrogeni (Slattery et al., 2007). În acest studiu realizat pe populația caucaziană din România am observat o tendința de asociere dintre IL6 G-174C și diminuarea riscului de carcinom ductal invaziv. Această tendință a fost evidentă în model codominant (O.R. GC=0,61, p=0,03) și a fost absentă în modelele recesiv sau dominant (Tabel 8). În consecință rezultatul obținut pentru populația din România este parțial concordant cu datele obținute în alte populații.
Creșterea și dezvoltarea normală a glandei mamare este controlată de interacțiuni complexe între factorii genetici și modificările hormonale sau expunerea la factori de creștere. O parte dintre acești factori sunt secretați de celulele epiteliale din glanda mamară (pot acționa autocrin) sau sunt sintetizați de către celulele stromale (pot controla proliferarea celulelor epiteliale). Factorii care inhibă creșterea epiteliului pot influența creșterea și dezvoltarea glandei mamare. Dintre acești factori, TGFb are efecte care depind de stadiul tumorigenezei: este un factor supresor de creștere tumorală în etapele inițiale ale tumorigenezei dar poate influența tranziția epitelio-mezenchimală și astfel poate favoriza invazia și metastazarea tumorii (Katsuno, Lamouille and Derynck, 2013),(Scollen et al., 2011). Studiile efectuate pe modele experimentale susțin rolul TGFb în progresia tumorilor și în metastazarea celulelor tumorale derivate din glanda mamară (Drabsch et al., 2013).
Polimorfismele TGFb1 par să influențeze predispoziția pentru cancerul de sân (ex. rs1982073) (Cox et al., 2007),(Scollen et al., 2011). Polimorfismul TGFb1 C-509T (linkat cu rs1982073) a fost considerat un factor de risc pentru cancerul de sân invaziv (O.R. =1,25, 95% CI: 1,06-1,48, p= 0,009) într-un studiu care a inclus 3987 cazuri și 3867 femei control (Dunning et al., 2003). În studiul realizat în populația din România la analiza individuală acest polimorfism nu a fost asociat cu carcinomul ductal invaziv. În consecință rezultatul obținut nu a fost concordant cu rezultatele raportate pentru alte populații.
Xiao și colaboratorii au sugerat că între semnalele induse de IL-6 și TGFb pot exista interrelații complexe care pot avea un impact semnificativ asupra tranziției epitelio- mezenchimale (Xiao et al., 2005). Rezultatele obținute în populația din Sudul României au arătat că prezența simultană a genotipurilor IL6 GG și TGFb CC cresc riscul de carcinomul ductal invaziv (O.R.=34,69, p<0,0001) (Tabel 12). Această asociere este net superioară celei conferite de polimorfismele considerate independent. În consecință acest rezultat susține importanța interacțiunii dintre polimorfismele din genele L6 și TGFb în predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv.
În loturile testate din România asocierea dintre IL6 G-174C și alte polimorfisme genetice (ex. ACE ID, L-SELL P213S sau MTHFR C677T) poate influența riscul de carcinom ductal invaziv (p<0,05). Tendințe de asociere cu boala au fost raportate și pentru asocierea dintre polimorfismele ACE ID și polimorfismele eNOS 4ba sau TGFb C-509T. Substratul acestor asocieri este mai dificil de interpretat și comparat cu datele din literatură având în vedere numărul redus de studii disponibile.
ACE realizează conversia angiotensinei 1 în angiotensina 2 și joacă un rol limitant în sistemul renină-angiotensină-aldosteron. Această enzimă are efecte pleiotrope (ex. intervine în remodelarea vasculară, vasoconstricție, procese aterosclerotice) (Morishita et al., 1994), (Pitt, 1994). În intronul 16 al genei care codifică pentru această enzimă a fost identificat polimorfismul ACE ID (Inserție/ deleție) care constă în prezența sau absența unei secvențe ALU polimorfice. Variantele polimorfismului prezintă diferențe interetnice semnificative (Johanning et al., 1995). Din punct de vedere funcțional aceste variante au fost considerate responsabile de variația plasmatică a enzimei ACE sau de alterarea procesului de splicing (Rigat et al., 1990), (Tiret et al., 1992),(Singh et al., 2018),(Fishchuk and Gorovenko, 2013).
ACE ID a fost asociat cu diferite afecțiuni maligne sau non-maligne. Într-o meta-analiză recentă au fost investigate 2846 cazuri de cancer de sân și 9299 subiecți control care au provenit din 20 studii. În acest lot ACE ID a fost asimilat unui factor de risc pentru cancerul de sân (II vs. DD: O.R.= 0,66, 95%CI: 0,46-0,94, p=0,02; ID vs. DD: O.R.= 0,71, 95%CI: 0,53-0,94, p=0,02; II+ID vs. DD: O.R.= 0,69, 95%CI: 0,51-0,94, p=0,02) indiferent dacă pacientele au avut origine asiatică sau caucaziană (Moghimi et al., 2018).
Rezultatele obținute în studii care au avut dimensiuni mai reduse nu au fost total concordante. Un studiu realizat în Nordul Indiei (161 paciente cu cancer de sân și 152 femei sănătoase) a evidențiat că prezența AGTR1 A1166C și ACE D sau DD conferă predispoziție pentru o formă mai agresivă de boală (Singh et al., 2018). Un alt studiu caz – control realizat în Ukraina (131 paciente cu cancer de sân și 102 femei control) a estimat că ACE D a crescut riscul de cancer de sân la femeile din grupa de vârstă 36 -54 ani iar AGTR1 A1166AC a fost un factor de risc pentru boală, mai ales în sublotul de subiecți din grupa de vârstă ≥54 ani. De asemenea unele asocieri din ACE ID și alte polimorfisme au apărut ca fiind protective (ex. ACE II/ AGT 174TT sau ACE II/AGT 235MT) (Fishchuk and Gorovenko, 2013). În populația din Singapore (189 cazuri de cancer de sân și 671 controli din Singapore Chinese Health Study) varianta ACE I a fost considerată un factor protectiv pentru cancerul de sân (O.R.=0,55, 95%CI: 0,30–0,99) (Koh et al., 2003). În mod contrar, un studiu case-control (1263 cazuri cancer sân, 2269 controli), multietnic, a estimat că genotipul ACE II a avut un efect marginal asupra riscului de boală (II vs. DD:O.R.=1,30; 95% CI: 1,05-1,61) (Haiman et al., 2003). În Egipt analiza femeilor în postmenopauză (n=120) nu a detectat o asociere semnificativă între polimorfismul ACE ID și riscul de cancer de sân (El Sharkawy et al., 2014).
NO este produs de sintetaza endotelială (eNOS) sau inductibilă (iNOS) a oxidului nitric. Această biomoleculă, considerată atât agent citoprotectiv cât și agent citotoxic, joacă un rol cheie în angiogeneză, inflamație și statusul inflamator, producerea leziunilor ADN (Jadeski, Chakraborty and Lala, 2003) și eficiența cu care acestea sunt reparate (Chien, Bau and Jan, 2004).
Polimorfism eNOS 4a/b este considerat un polimorfism de tip VNTR (număr variabil de repetiții în tandem) care are patru sau cinci unități repetate în tandem. Acest polimorfism are potențial funcțional: varianta cu cinci repetiții este asociată cu producerea unor cantități mari de transcript pentru eNOS în comparație cu varianta care are patru repetiții (Lu et al., 2006),(Silva et al., 2011).
Analiza unor eșantioane din populația Han din China (873 paciente cu cancer de sân, vârsta: 50,62 ± 10,20 ani; 1034 femei sănătoase, vârsta: 51,02 ± 10,79 ani) a evidențiat că polimorfismul eNOS 894G>T crește riscul de carcinom ductal infiltrativ. Tot în acest studiu a fost realizată și o meta-analiză pentru care s-au colectat date din 33 studii în care s-a analizat relația dintre polimorfismele eNOS și cancerul de sân. Riscul de boală a fost influențat de eNOS -786T>C (CC vs. TT: O.R. = 2,19, 95%CI: 1,01–4,76, p = 0,05) sau eNOS 894G>T (TT vs. G: O.R. = 1,69; 95%CI: 1,18–2,41, p = 0,001) dar nu și de eNOS 4a/b (Gao et al., 2015). Rezultatele obținute în această meta-analiză sunt concordante cu datele obținute în populația din România.
MTHFR este o enzimă cheie în metabolismul folaților care participă la sinteza, repararea și metilarea ADN (Qi et al., 2010). Prin aceste efecte poate influența riscul apariției unor boli, inclusiv cancer de sân.
Polimorfismul MTHFR C677T pare să fie funcțional deoarece poate reduce producția și activitatea enzimei MTHFR (Parle-McDermott et al., 2006).
Asocierea dintre MTHFR C677T și cancerul de sân nu a fost concordantă nici în studiile de mari dimensiuni. Spre exemplu într-o meta-analiză care a inclus 39 studii s-a evidențiat o asociere între MTHFR C677T și cancerul de sân (C vs. TT sau CC vs. T: O.R. =1,19, p<0,05) la subiecții care au origine asiatică sau caucaziană (He and Shen, 2017). Asocierea nu a fost confirmată în Multiethnic Cohort Study în care au fost investigate 1189 paciente cu forme invazive de cancer de sân și 2414 controli indiferent dacă genotipul de risc a fost considerat MTHFR 677 CC (O.R.=1), 677 CT (O.R. = 0,98, 95%CI: 0,83-1,15) sau 677 TT (O.R.= 0,86, 95%CI: 0,67-1,09). Totuși în acest studiu rezultatele au fost semnificative în subloturile de paciente care au beneficiat de terapie de substituție hormonală (Le Marchand et al., 2004). Lipsa de consens se poate observa și între rezultatele obținute în studii care au avut dimensiuni mai reduse. Asocierea dintre MTHFR C677T și diferite tipuri de cancer de sân a fost identificată prin compararea pacientelor diagnosticate cu cancer de sân (n=51) cu femeile control (n=106) din Turcia (O.R. T: 2,29, 95%CI: 1,28-4,14, p<0,006) (Ozen et al., 2013). În Brazilia investigarea paciente cu carcinom ductal invaziv (n=68) și femei control (n=85) nu a evidențiat o asociere între polimorfismul MTHFR C677T și boala (Batschauer et al., 2011). În studiul realizat în populația din România nu s-a identificat o asociere între polimorfismul MTHFR C677T și carcinomul ductal invaziv. Rezultatele sunt similare cu cele obținute în Multiethnic Cohort Study și în populația din Brazilia dar sunt diferite de cele raportate în Turcia sau în meta-analiza realizată de He și Shen în 2017 .
Rezultatele discordante observate în acest studiu și cele publice anterior se pot explica prin caracteristicile genetice (backgroundul genetic) ale populațiilor studiate, particularitățile fenotipurilor studiate (subtipul de boală), organizarea studiului (ex. criterii de includere și excludere, dimensiunea loturilor, pragul utilizat pentru semnificația statistică) etc.
Polimorfismele genetice și virusurile Torque teno. Prezența TTV la persoanele care poartă eNOS bb (O.R.= 2,7, p=7,0E-6), IL6 GG (O.R.= 2,44, p=6.5E-5) sau MTHFR T (O.R.=2,04, p=0,0012) crește riscul de a dezvolta carcinom ductal invaziv. Rezultate similare au fost obținute și pentru prezența TTMDV la purtătoare de IL6 GG (O.R.= 2,46, p=8,8E-5), L-SELL CC (O.R.= 2,09, p=0,001) sau MTHFR T (O.R.=2,10, p=0,0013) (Tabel 15).
La analiza separată a factorilor de risc s-a constatat că TTV (O.R.= 3,09, p=3,0E-6) și TTMDV (O.R.=3,14, p=1,0E-6) ( Tabel 4) cresc riscul de carcinom ductal invaziv iar polimorfismele genetice nu au un impact semnificativ asupra riscului de boală (Tabel 8).
Dacă s-au comparat rezultate obținute la testarea acestor factori, considerați individual sau în asociere, se poate observa că interacțiunea dintre virusurile TT și polimorfismele din genele eNOS, IL6, L-SELL și MTHFR nu cresc suplimentar riscul de carcinom ductal invaziv conferit de virusurile Torque Teno. În consecință riscul de boală conferit de virusurile TT nu este influențat semnificativ de genotipurile testate.
Polimorfismelor genetice și anticoncepționalele orale. Utilizarea anticoncepționalelor orale de către femeile care au genotipul AGTR1 AA (O.R.=0,15, p=0,0008) sau IL6 GG (O.R.= 0,22, Yate's p=0,001) conferă protecție semnificativă pentru carcinomul ductal invaziv (Tabel 16). În acest studiu s-a estimat că riscul pentru carcinom ductal invaziv nu este influențat semnificativ de către polimorfismele genetice testate (Tabel 8) dar este diminuat semnificativ de utilizarea anticoncepționalelor orale (O.R.=0,31, p=0,00017) (Tabel 2). Datele statistice prezentate anterior sugerează că utilizarea anticoncepționalelor orale de către femeile care au genotip AGTR1 AA sau IL6 GG cresc suplimentar intensitatea efectului protectiv conferit de către acești factori considerați independent. Acest rezultat susține importanța testării interacțiunilor dintre diferite categorii de factori care pot modula predispoziția pentru carcinom ductal invaziv.
– Anticoncepționalele orale
Utilizarea contraceptivelor orale a fost asociată cu modificarea riscului de cancer de sân în numeroase studii. Asocierea este mai evidentă la femeile care au început să utilizeze contraceptive orale de la vârste reduse, care au utilizat tratamentului mai mult de 5 ani s-au expunerea s-a realizat până la includerea în studiu (Huzell et al., 2015),(Althuis et al., 2003),(Dai, Liu and Du, 2009),(Pasanisi et al., 2009),(Kumle et al., 2002),(Sweeney et al., 2007). Efectul anticoncepționalelor orale asupra riscului de boală pare că se reduce în timp iar după ~ 10 ani de la întreruperea administrării riscul de boală se apropie foarte mult de cel al persoanelor care nu au utilizat astfel de medicamente.
Într-o meta-analiză au fost incluse 53297 femei cu cancer de sân și 100239 femei control din 54 studii. Riscul de cancer de sân a fost crescut modest de utilizarea anticoncepționalelor orale (R.R.= 1,24, p<0,00001). Acest efectul a avut o tendință descrescătoare în primii 9 ani după întreruperea tratamentului cu anticoncepționale (după 1-4 ani: R.R.= 1,16, p=0,00001; după 5-9 ani: R.R.= 1,07, p=0,009) iar după 10 ani diferențele nu au mai fost semnificative statistic (Calle et al., 1996).
In Nurses’ Health Study au fost investigate 116000 asistente medicale cu vârsta 24- 43 ani. Riscul de boală a avut o tendință de a avea valori mai mari la persoanele care au utilizat anticoncepționale orale în trecut (R.R.=1,2, 95%CI: 0,95-1,33). Valori la limita semnificației statistice au fost obținute pentru persoanele care au utilizat anticoncepționale inclusiv la includerea în studiu (R.R.= 1,33; 95% CI: 1,03-1,73). Rezultatele au depins de formulele farmaceutice (Hunter et al., 2010) și de asemenea pot să fie influențate și de durata de utilizare (Hankinson et al., 1997),(Bhupathiraju et al., 2016).
În Danemarca au fost urmărite ~1,8 milioane de femei timp de ~10,9 ani și au fost identificate 11517 cazuri de cancer de sân. Riscul de cancer de sân la persoanele care au utilizat recent anticoncepționale a fost ușor mai mare comparativ cu cele care nu au fost expuse (R.R.= 1,20, 95% CI: 1,4-1,26). Riscul de boală a fost influențat de durata expunerii: nu a fost modificat la persoanele care au utilizat anticoncepționale pentru mai puțin de 1 an (R.R.=1,09, 95%CI: 0,96-1,23) dar a crescut semnificativ dacă au fost consumate mai mult de 10 ani (R.R.= 1,38, 95%CI: 1,26 -1,51, p=0,002) (Mørch et al., 2017).
Date mai recente arată că riscul de boală conferit de anticoncepționalele orale este modest (Schneyer and Lerma, 2018) și este mult mai diminuat comparativ cu valorile raportate în urmă cu câteva decenii. În timp s-au redus progresiv dozele de hormoni care au fost utilizate pentru contracepție; această reducere poate explica tendință de diminuare în timp a asocierii cu boala (Del Pup, Codacci-Pisanelli and Peccatori, 2019).
În acest studiu s-a observat că anticoncepționalele orale au fost mult mai rar utilizate de către paciente comparativ cu femeile din lotul control (8,86% vs. 24%, O.R.=0,31, p=0,00017) ( Tabel 2). În consecință utilizarea anticoncepționalelor orale a fost asociată cu diminuarea riscului de carcinom ductal invaziv. Această asociere înalt semnificativă nu este concordantă cu rezultatele publicate anterior care susțineau că anticoncepționalele orale pot crește riscul de boală. Rezultatele obținute în acest studiu pot să fie influențate și de expunerea la alte surse de steroizi (naturali sau sintetici), inclusiv din produse utilizate în scop personal sau farmacologic. Expunerea la aceste surse de steroizi nu a fost investigată în acest studiu.
Anticoncepționalele orale și prima sarcină înainte de 30 ani. În acest studiu utilizarea anticoncepționalelor orale (O.R.=0,31, p=0,00017) și prima sarcină înainte de 30 ani (O.R.=0,20, p=0*) au reprezentat factori protectivi pentru carcinomul ductal invaziv ( Tabel 2). Asocierea celor doi factori protectivi a fost identificată la 3,16% dintre paciente și la 5,5% dintre femeile sănătoase (p>0,05). Datele prezentate sugerează că utilizarea anticoncepționalelor orale de către femei care au avut prima sarcini înaintea vârstei de 30 ani nu a modificat semnificativ riscul de boală.
Anticoncepționalele orale și virusurile TT. Prezența virusurilor TT la femeile care au utilizat anticoncepționale orale nu a modificat riscul de carcinom ductal invaziv. În loturile investigate riscul pentru carcinom ductal invaziv este redus de utilizarea anticoncepționalelor orale (O.R. =0,31, p=0,00017) ( Tabel 2) și este crescut de prezența virusurilor TTV (O.R.= 3,14, p=1,0E-6) sau TTMDV (O.R.=2,64, p=1,0E-5) (Tabel 4). În consecință indivizii care au utilizat anticoncepționale și sunt purtători de virusuri Torque teno sunt expuși la doi factori antagoniști iar efectele lor probabil se anulează reciproc.
In cazul femeilor care nu au utilizat anticoncepționale riscul de boală a fost crescut de prezența TTV (O.R.=3,54, p=0*), TTMDV (O.R.=3,18, p=0*) și de coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=3,18, p=0*) (Tabel 17). Dacă se compară riscul de boală atribuit pentru absența utilizării anticoncepționalelor (O.R.=3,25, p=0,00017) ( Tabel 2), pentru prezența virusurilor TTV (O.R.= 3,14, p=1,0E-6), TTMDV (O.R.=2,64, p=1,0E-5) sau pentru coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=2,73, p=4,01, E-6) (Tabel 4) se constată că cea mai mare valoare este atribuită pacientelor care nu au utilizat anticoncepționale și au avut infecții cu TTV.
– IMC
American Cancer Society a estimat că excesul ponderal, sedentarismul, consumul excesiv de alcool și / sau alterarea nutriției se pot identifica la mai mult de 18% dintre cazurile de cancer diagnosticate în USA (Rock et al., 2020). În cele mai multe studii s-a raportat că excesul ponderal sau obezitatea după menopauză reprezintă factori de risc pentru apariția cancerului de sân (Pfeiffer et al., 2018).
Se presupune că femeile supraponderale au niveluri mai mari de estrogeni comparativ cu normoponderalele ca urmare a reacțiilor de aromatizare care au loc la nivelul țesutului adipos (Morris et al., 2011),(Ray and Cleary, 2012). Cantitatea de țesut adipos din organism este corelată cu leptinemia iar aceasta este corelată cu nivelurile de estrogeni și prin intermediul acestora poate influența riscul de cancer de sân (Grayson, 2012). În condiții fiziologice, după instalarea menopauzei se acumulează țesut adipos care devine principala sursă de estrogeni endogeni dar care predispune și la creșterea insulinemiei (Neuhouser et al., 2015),(Friedenreich, 2001). În consecință crește riscul apariției tumorilor, inclusiv a celor localizate la nivelul glandei mamare. Acest mecanism este susținut și de rezultatele unor studii efectuate în diferite populații care au asociat creșterea IMC cu cancerul de sân care debutează în premenopauză (Michels, Terry and Willett, 2006),(Dowsett and Folkerd, 2015) sau în postmenopauză (Galanis et al., 1998),(Renehan et al., 2008),(Van Den Brandt et al., 2000),(Bhaskaran et al., 2014),(Kour et al., 2019). Un studiu efectuat în SUA a sugerat că persoanele obeze și cele supraponderale au un risc crescut de cancer de sân (indiferent de subtip) (Atkinson et al., 2016). O creștere a valorii IMC cu 5 kg/m2 este însoțită de o crește cu 5%–15% a riscului de cancer de sân cu debut după instalarea menopauzei (Renehan et al., 2008),(Bhaskaran et al., 2014). Deși asocierea dintre IMC și cancerul de sân a fost raportată în diferite studii populaționale și meta-analize (Amadou et al., 2013) au fost obținute și rezultate discordante (Feigelson et al., 2004). Această asociere se complică suplimentar dacă în analiză se include și predispoziția genetică pentru IMC (Guo et al., 2016). Cu toate acestea în prezent IMC crescut este considerat unul dintre principalii factori de risc modificabili pentru cancerul de sân.
În baza aspectelor prezentate anterior pentru acest studiu au fost selectate doar paciente care au avut IMC<30kg/m2 în perioada de postmenopauză și care nu au fost obeze pe parcursul vieții. Acest criteriu a crescut omogenitatea lotului investigat și a permis caracterizarea mai precisă a efectului pe care îl are creșterea ponderală moderată asupra riscului de boală. Rezultatele obținute au indicat că valorile IMC (25,62 kg/m2 vs. 25,13 kg/m2, p=0,02) și procentul de subiecți supraponderali (63,92% vs. 48%, p=0,02) au avut tendința de a fi fost mai mari în lotul de paciente comparativ cu lotul control. Diferența dintre greutatea medie a pacientelor și a femeilor control a fost de ~2 kg (73,9 vs. 71,95 kg, p<0,003) iar diferența de înălțime a fost de ~1 cm (1,70 vs. 1,69 m, p>0,05) (Tabel 2). În consecință valorile mai mari ale IMC și procentul mai mare de femei supraponderale observate în lotul de paciente au fost cauzate mai ales de diferența de greutate dintre cele două loturi și mai puțin diferența de înălțime. Pe baza rezultatelor obținute în acest studiu s-a considerat că valorile IMC sau greutatea nu au reprezentat factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv.
Unele studii au sugerat femeile înalte au un risc mai mare de a dezvolta cancer de sân; baza acestei observații este reprezentată probabil de factorii (ex. genetici, hormonali, nutritivi) care acționează în copilărie sau adolescență. În studiul pe care l-am realizat diferențele de înălțime dintre paciente și femeile sănătoase nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (~1 cm). În consecință rezultatele obținute în această cercetare nu se pot explica prin influența semnificativă a acestui factor.
O parte dintre studii au arătat că supraponderalitatea sau obezitatea cresc cu 10-20% riscul de cancer de sân după instalarea menopauzei în comparație cu femeile normoponderale. Riscul de boală crește la 30% în cazul femeilor care sunt obeze după instalarea menopauzei. Relația dintre boală și IMC a fost identificată și în cazul femeilor care sunt normoponderale. Astfel riscul de boală a fost cu 15% mai redus la femeile care au un IMC< 22,5 comparativ cu femeile care au IMC cuprins în intervalul 22,5 – 24,9. (Reeves et al., 2007). Un studiu monocentric a concluzionat că riscul pentru cancerul de sân inflamator este mai mare la femeile care au avut un IMC ≥25kg/m2 (obeze sau supraponderale) în raport cu cele normoponderale (p<0,01) (Atkinson et al., 2016). Spre deosebire de datele prezentate în acest studiu realizat în populația caucaziană din România s-au investigat doar persoane care nu au fost obeze iar la pacienți boala s-a diagnosticat după instalarea menopauzei pentru a crește precizia rezultatelor. Datele obținute au indicat că greutatea sau IMC (<30 kg/m2) nu au reprezentat factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv.
Valorile IMC pot să fie influențate de către o varietate de factori genetici și nongenetici. Dintre aceștia cei mai cunoscuți sunt aportul alimentar dezechilibrat (ex. aport energetic crescut, aport crescut de grăsimi saturate) și diminuarea activității fizice. Acești factori intră în categoria factorilor de risc modificabili pentru cancerul de sân. Studiile WHEL (Women’s Healthy Eating and Living) (Hong et al., 2007) și WINS (the Women’s Intervention Nutrition Study) (Froelicher and Christopherson, 2000), (Martin, Froelicher and Miller, 2000) au demonstrat că nutriția sănătoasă are efecte benefice și asupra evoluției cancerului de sân.
În acest studiu s-a observat o relație între IMC și polimorfismele genetice și factorii non-genetici studiați. Spre exemplu, la purtătorii de MTHFR T valorile IMC au fost cu ~1 km/m2 mai mari în lotul de paciente comparativ cu lotul control (25,88 kg/m2 vs. 24,91 kg/m2, p=0,0008) (Tabel 19). Valorile IMC pot să fie influențate și de polimorfismele din genele ACE, AGTR1, TGFb, IL6 sau L-SELL (Tabel 20). În subloturile de pacienți și indivizi sănătoși supraponderali s-au constat diferențe în ceea ce privește vârsta la care au început să fumeze (18,94 ani vs. 22,98 ani, p=0,0002) și intervalul de timp în care au fumat activ (37,94 ani vs. 30,24 ani, p=0,001) (Tabel 28). Aceste rezultate arată că relația dintre carcinomul ductal invaziv și IMC poate să fie influențată semnificativ de către diferiți factori genetici (ex. alela MTHFR T) sau nongenetici (ex. vârsta la care subiecții au început să fumeze și numărul de ani în care aceștia au fumat activ).
IMC și prima sarcină. Prima sarcină înainte de 30 ani conferă protecție similară pentru cancerul de sân în lotul integral de subiecți (indiferent de valorile IMC O.R.=0,20, p=0*) (Tabel 2) și în sublotul de subiecți supraponderali (O.R.=0,22, p=3,0E-6) (Tabel 21). În consecință asocierea dintre creșterea modestă a IMC (în domeniul supraponderal) și prima sarcină dusă la termen înaintea vârstei de 30 de ani nu modifică semnificativ riscul de boală.
În sublotul de persoane supraponderale absența sarcinilor reprezintă un important factor de risc pentru carcinomul ductal invaziv în comparație cu persoanele care au avut prima sarcină dusă la termen înainte de 30 de ani (O.R.=4,11, p=3,3E-5). Diferențele nu mai rămân semnificative statistic dacă ne raportăm la persoanele care au avut prima sarcină dusă la termen înainta vârstei de 30 ani (Tabel 21). Rezultatele obținute în acest studiu au arătat că nuliparitatea reprezintă un factor de risc pentru carcinomul ductal invaziv (O.R.=2,45, p=3.6E-5), prima sarcină produsă înaintea vârstei de 30 ani reprezintă un factor protectiv (O.R.=0,20, p=0*) iar valorile IMC nu influențează semnificativ riscul de boală (Tabel 2). În consecință nu este surprinzător că riscul de boală estimat pentru femeile nulipare supraponderale (O.R.=4,11) este aproape dublu comparativ cu cel estimat pentru femeile nulipare (O.R.=2,45).
În Norvegia s-a investigat o cohortă care a fost alcătuită din 58191 femei care au fost urmărite prospectiv ~24,1 ani. Lotul a inclus și 2890 cazuri de cancer de sân invaziv cu debut după instalarea menopauzei. IMC a fost considerat un factor de risc pentru cancerul de sân, indiferent dacă acestea au fost nulipare sau pare. Analiza stratificată a cazurilor a indicat că IMC nu este asociat cu riscul de cancer de sân în grupa de vârstă 55-69 ani. Acest rezultat este concordant cu cel obținut în populația din România. În studiul realizat în Norvegia s-a raportat că efectul combinat al nuliparității și IMC este sinergic la subiecții din grupa de vârstă mai mare de 70 ani (efectul combinat H.R.: 1,88, 95%CI:1,53-2,30). În grupa de vârstă 55-69 ani cei doi factori acționează independent (efectul combinat H.R.: 1,29, 95%CI: 0,92-1,80) (Opdahl et al., 2011). Spre deosebire de aceste rezultate în lotul analizat din România s-a observat o interacțiune între nuliparitate și creșterea IMC în intervalul supraponderal crește semnificativ riscul de boală chiar și în intervalul de vârstă 50-65 ani. La aceste diferențe pot să contribuie și particularitățile genetice și comportamentale ale pacientelor din cele două țări.
În sublotul de femei supraponderale vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină care a fost dusă la termen a influențat semnificativ riscul de boală. Astfel riscul de carcinom ductal invaziv la persoanele supraponderale a fost foarte mare la persoanele care au avut prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 de ani comparativ cele care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (O.R.=5,19, p=7,1E-5) (Tabel 21). Asocierea cu boala a fost mai puternică și în raport cu cea estimată pentru prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 ani (O.R.=5,02, p=0*) (Tabel 2). În consecință riscul de cancer de sân se poate specula că riscul de boală poate să fie influențat de interacțiunea dintre creșterea IMC (în intervalul supraponderal) și vârsta înaintată la care se produce prima sarcină.
În sublotul de femei normoponderale s-a constatat că prima sarcină înainte de 30 ani reprezintă un caracter protectiv pentru carcinomul ductal invaziv important (O.R.=0,19, p=1,9E-5) (Tabel 22). Valoarea acestei asocieri este similară cu cea calculată pentru prima sarcină produsă înaintea vârstei de 30 ani (O.R.=0,20, p=0*).
S-a observat că în subloturile de femei normoponderale absența sarcinilor comparativ cu prezența unei sarcini duse la termen înaintea vârstei de 30 ani a crescut semnificativ riscul de carcinom ductal invaziv (O.R.=5,45, p=4,2E-5) (Tabel 22). În acest studiu analiza factorilor care pot modula predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv a evidențiat că nuliparitatea a reprezentat un factor de risc (O.R.=2,45, p=3.6E-5) (Tabel 2) iar prima sarcină înainte de 30 ani în raport cu nuliparitatea a fost un factor protectiv (O.R.= 0,20, p=0*). În consecință nu este surprinzătoare observația că în sublotul de femei normoponderale nuliparitatea conferă un risc de boală de 5,45 ori (p=4,2E-5) mai mare în raport cu o sarcină dusă la termen înaintea vârstei de 30 ani.
Diferențele au fost semnificative și dacă au fost comparate persoanele normoponderale care au avut prima sarcină după sau înainte de 30 de ani (O.R.=4,78, p=0,001) (Tabel 22). Trebuie remarcat că acest risc este mai redus comparativ cu cel estimat la compararea subiecților care au avut prima sarcină după sau înaintea vârstei de 30 de ani (O.R.=5,02, p=0*) (Tabel 2). În consecință IMC normoponderal nu influențează semnificativ asocierea dintre vârsta la care are loc prima sarcină dusă la termen și carcinomul ductal invaziv.
IMC și virusurile TT. Organizarea studiului a permis testarea relației dintre TTV și carcinomul ductal invaziv la subiecții normoponderali sau supraponderale. În cazul indivizilor normoponderali nu s-au observat diferențe care să atingă pragul de semnificație statistică.
În subloturile de subiecți supraponderali pacientele au fost mai frecvent pozitive pentru TTV (O.R.=4,89, p=0*), TTMDV (O.R.=3,04, p<0,0001) ( Tabel 24) sau pentru coinfecția cu TTV și TTMDV (O.R.=3,14, p=6,8E-5) comparativ cu femeile control. Pacientele pozitive pentru TTV au avut valori ale IMC mai mari comparativ cu femeile control (25,66 kg/m2 vs. 24,80 kg/m2, p<0,0009) (Tabel 25). În cazul purtătorilor de TTMDV (p<0,004) sau de TTV și TTMDV (p<0,05) valorile IMC aveau doar tendința de a fi mai mari în sublotul de paciente. Aceste date arată că prezența virusurilor Torque Teno la persoanele supraponderale reprezintă un factor de risc pentru carcinomul ductal invaziv. Rezultatele cele mai evidente au fost observate în cazul femeilor care aveau TTV. Numărul redus de probe în care s-a identificat doar una dintre cele două variante virale nu a permis testarea efectului independent al virusurilor Torque Teno ( Tabel 24).
– Expunerea la fum de țigară
O parte semnificativă dintre cetățenii Uniunii Europene (28-29%) și ai României (30%) fumează activ (European Commission, 2012). În consecință, fumatul reprezintă unul dintre cele mai comune vicii identificate la nivel global și principalul factor de risc modificabil pentru unele boli maligne (mai ales tumori pulmonare, de cap și gât).
Relația complexă dintre expunerea la fum de țigară și cancerul de sân nu este foarte clară. Compuși chimici din fumul de țigară au capacitatea de a induce tumori la oameni și de a cauza tumori ale glandei mamare la animale (Chen et al., 2011) dar, prin efectele antiestrogenice, pot să reducă riscul de boală (Band et al., 2002). În plus, efectele antiestrogenice par că se reduc după renunțarea la fumat (Luo et al., 2011),(Manjer, Johansson and Lenner, 2004). Această relație poate să fie influențată de particularitățile expunerii (ex. vârsta la care s-a deprins acest viciu, fumat pasiv/ activ, intervalul de timp în care a fumat, numărul de țigări / zi), de modificările care au loc în organism în perioada expunerii (Russo et al., 2000) sau de interacțiunea cu alți factori de risc (Barrdahl et al., 2014). Alte studii au arătat că riscul de cancer de sân crește doar la marii fumători după o perioadă semnificativă de la dobândirea acestui viciu sau în anumite subgrupe de subiecți (ex. fumători înainte de prima sarcină) (Terry, Miller and Rohan, 2002),(Catsburg, Miller and Rohan, 2015),(Kispert and McHowat, 2017). Datele obținute din The National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) Breast Cancer Prevention Trial (BCPT) au indicat că fumat poate crește splimentar riscul de cancer de sân conferit de către alți factori de risc (conferit de istoricul familial pozitiv sau de către alți factori de risc). De asemenea renunțarea la fumat și activitatea fizică pot reduce riscul de boală (Land et al., 2014). Cu toate acestea, în anul 2014, s-a raportat că există date “sugestive dar care nu sunt suficiente” pentru a susține o relație de cauzalitate între expunerea la fum de țigară și riscul de cancer de sân (United States Department of Health and Human Services, 2014).
În studiul realizat în populația caucaziană din România s-au identificat procente similare de paciente și femei sănătoase care au fost expuse activ (38,61% vs. 37,5%) sau pasiv (58,23% vs. 59,6%) la fum de țigară. Caracteristicile expunerii au fost însă diferite. Astfel pacientele au fumat activ mai mult cu ~ 10 ani (38,52 ani vs. 28,69 ani, p<2,2e-08) comparativ cu femeile sănătoase. Ele au dobândit acest viciu la vârste cu 5,66 ani mai reduse (18,11 ani vs. 23,77 ani, p=1,12e-10) și au renunțat la acest viciu cu 11,26 ani mai târziu (56,56 ani vs. 45,30 ani, p=2,1e-11) (Tabel 26).
Fumatul activ înainte de prima sarcină a reprezentat un factor de risc important pentru carcinomul ductal invaziv (O.R.= 6,19, p= 0). În medie pacientele au avut tendința de a fuma mai mult înainte de prima sarcină comparativ cu femeile din sublotul control corespunzător. Această tendință a fost evidențiată prin analiza numărului de ani în care au fumat activ înainte de prima sarcină (13,18 ani vs. 8 ani, p=0,005) și de pachete de țigări fumate (valori estimate 4045,42 vs. 1999,90, p<0,01) (Tabel 26). Deși aceste diferențe nu ating valoarea prag pentru a le considera semnificative din punct de vedere statistic pentru acest studiu nu putem exclude o semnificație biologică conferită de diferențele observate.
De asemenea pacientele au fost expuse pasiv la fum de țigară cu ~ 3,91 ani mai mult comparativ cu femeile sănătoase (19,95 ani vs. 16,04 ani, p<0,00001) (Tabel 26).
Datele prezentate anterior arată că fumatul activ înainte de prima sarcină și creșterea duratei în care au fost expuse activ sau pasiv la fum de țigară reprezintă factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv în populația din România.
Interacțiunea dintre factorii de risc reproductivi și alți factori care pot modula riscul de boală a fost raportată și în alte studii. Unul dintre cele mai cunoscute exemple este interacțiunea dintre prima sarcină dusă la termen și fumat. Studierea unor cohorte semnificative de subiecți a indicat că fumătorii puternici au un risc crescut de cancer de sân mai ales în cazul pacientelor care au dobândit acest viciu la vârste reduse (Jones et al., 2017) sau înainte de prima sarcină (Dossus et al., 2014a),(Gram et al., 2016),(Gram et al., 2015),(Gaudet et al., 2013a),(Xue et al., 2011),(Xue et al., 2011),(Rosenberg et al., 2013). În The Canadian National Breast Screening Study s-au urmărit prospectiv 89835 femei (vârsta: 40-59 ani) pentru o perioadă de ~22,1 ani. Pentru acest lot s-a stabilit că riscul de cancer de sân a fost crescut de particularitățile fumatului: durată (40 ani: HR=1,57), intensitate (40 țigări: HR=1,21), expunerea cumulativă (40 pachete / an: HR=1,19), latență (40 ani de la inițiere: HR=1,19) sau fumatul înainte de prima sarcină dusă la termen (fumătoare 5 ani înainte de naștere vs. nefumătoare: HR=1,18; 95%CI: 1,26-51,10) (Catsburg, Miller and Rohan, 2015). Într-un studiu multicentric a fost urmărită prospectiv (~15 ani) o cohortă heterogenă din punct de vedere etnic alcătuită din 83300 femei din Hawai și California (interval vârstă: 45-75 ani). Riscul pentru cancer de sân a fost cu 35% mai mare la femeile care au început să fumeze cu cel puțin 5 ani înainte de prima sarcină și au fumat cel puțin 20 de ani comparativ cu femeile pare care nu au fumat (HR = 1,35, 95%CI: 1,13-1,63). Riscul de boală a crescut ușor dacă în analiză s-au păstrat doar femei care nu au consumat alcool (HR = 1,40, 95%CI: 1,08-1,81). Aceste rezultate nu au prezentat diferențe interetnice semnificative (Gram et al., 2015). Riscul de cancer de sân conferit de fumatul activ înainte de prima sarcină raportat în aceste studii este concordant cu cel obținut pentru populația din România. Având în vedere aceste rezultate se poate constata că asocierea nu este specifică unei singure populații. În studiul pe care l-am realizat nu au fost incluși marii fumători. Rezultatele obținute demonstrează că riscul de boală nu este limitat la marii fumători, el crește semnificativ chiar și la persoanele care fumează maxim 25 țigări/ zi. Interpretarea acestor rezultate trebuie făcută cu precauție deoarece există numeroși factori de confuzie care pot influența relația dintre boală și expunerea la fum de țigară (Morabia and Wynder, 1990),(McPhillips et al., 1994).
Expunerea la fum de țigară și virusurile TT. Asocierea dintre fumatul activ și virusurile TTV nu a influențat semnificativ riscul de carcinomul ductal invaziv (Tabel 2, Tabel 27). În literatura de specialitate nu am identificat studii în care să fie tratat acest aspect.
– Exerciții fizice
În anul 2001 s-a estimat că o treime dintre decesele înregistrate au fost atribuite factorilor de risc modificabili (Danaei et al., 2005). O parte dintre acești factori pot influența și predispoziția pentru cancer. Unul dintre aceștia este activitatea fizică regulată. S-a observat că riscul pentru cancerul de sân poate să fie redus de activitatea fizică regulată. Aproximativ 40% dintre studiile de cohortă sau de tip caz-control care au analizat această relație au estimat că activitatea fizică poate reduce riscul de boală cu 20-30% (Friedenreich, 2011),(Friedenreich, 2010),(Kerr, Anderson and Lippman, 2017), (Mctiernan et al., 2019). Efectele benefice par să fie mediate de impactul ale activității fizice asupra inflamației și a nivelului balanței hormonale și energetice (Neilson et al., 2009); în unele studii asocierea dintre activitatea fizică și riscul de cancer de sân nu a fost influențat de IMC (Pizot et al., 2016). Datele disponibile nu au permis stabilirea unui nivel minim de activitate fizică care poate diminua riscul de boală (efect prag inferior – podea) sau care este nivelul maxim de activitate fizică care reduce maxim riscul de cancer de sân (ex. efect prag superior – plafon) (Brown et al., 2012). Unele societăți profesionale recomandă adulților să efectueze mai mult de 150 minute de exerciții fizice care au intensitate moderată sau minim 75 minute de exerciții fizice intensive / săptămână (Kushi et al., 2012),(Rock et al., 2020). În acest studiu s-a considerat că exercițiile fizice au efectuate regulat dacă cele 150 minute de activitate moderată sau viguroasă / săptămână au fost efectuate în 5 zile. S-a considerat că subiecții au efectuat ocazional exerciții fizice dacă exercițiile efectuate săptămânal au echivalat cu 1-4 antrenamente de 30 de minute de exerciții fizice moderate- viguroase/ zi.
În acest studiu procentele de paciente și femei sănătoase care au fost sedentare sau care au efectuat activitate fizică au fost similare (Tabel 2). În consecință sedentarismul sau activitatea fizică nu au influențat semnificativ riscul de boală. Aceste rezultate sunt concordante cu cele raportate de majoritatea studiilor de cohortă sau de tip caz-control care au investigat acest caracter. Ele au sugerat că activitatea fizică reduce riscul de boală mai ales în populația asiatică și negroidă (41%), mai puțin la indieni (38%) și hispanici (28%) și atinge valoarea minimă la caucazieni (20%) (Friedenreich, 2010). În mod concordant nu s-a observat o asocierea semnificativă între exercițiile fizice și riscul de cancer de sân la pacientele caucaziene din sudul României.
La analiza multivariată s-a constatat că în sublotul de subiecți sedentari sarcinile duse la termen (O.R.=0,27, p=1,3E-5), mai ales dacă s-au înregistrat înaintea vârstei de 30 de ani (O.R.=0,14, p=1,8E-5), reprezintă factori protectivi importanți pentru carcinomul ductal invaziv (Tabel 28). Analiză univariată a evidențiat că sarcinile duse la termen au fost asimilate unui factor protectiv pentru carcinomul ductal invaziv (O.R.= 0,41, p=3,6E-5) (Tabel 2) însă asocierea este mai reducă comparativ cu cea identificată în cazul pacientelor supraponderale (O.R.=0,27 vs. O.R.= 0,41). Prima sarcină înainte de 30 ani apare ca un factor protectiv indiferent de IMC (normoponderale: O.R.=0,19, p=1,9E-5; indiferent de IMC: O.R.=0,20, p=0*) (Tabel 22),( Tabel 2). Cumulat aceste date arată că în populația din România relația dintre prima sarcină și riscul de carcinom ductal invaziv este mai puternică în cazul persoanelor sedentare.
Tot în sublotul de subiecți sedentari s-a constatat că nuliparitatea (O.R.= 3,69, p=1,3E-5) și durata de alăptare <12 luni (O.R.= 4,67, p=0,0006) reprezintă factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv (Tabel 28). La analiza univariată acești factori au apărut ca predispozanți pentru boală (nuliparitatea /sau absența perioadei de lactație: O.R.=2,45, p=3.6E-5; durata de lactație mai mică de 12 luni: O.R=3,06, p=0,0003) (Tabel 2). Se poate observa că riscul de boală conferit de nuliparitate sau de perioada de lactație mai mică de 12 luni este și mai mare în sublotul de paciente sedentare. În consecință este posibilă existența unor interacțiuni între stilul de viață sedentar, nuliparitate și durata de alăptare mai mică de 12 luni.
Exerciții fizice regulate și virusurile Torque teno. TTV (39,87% vs. 26,5%, p=0,007) și coinfecția TTV+TTMDV (32,28% vs. 20%, p=0,006) tind să fie mai frecvente în lotul de paciente sedentare comparativ cu femeile sănătoase sedentare. Și în lotul de persoane care practică exerciții fizice regulate sau ocazionale coinfecția cu TTV+TTMDV tinde să mai frecventă la paciente (32,28% vs. 20%, p=0,006) (Tabel 29). Diferențele constatate între femeile bolnave și cele sănătoase nu ating pragul corectat de semnificație statistică. În literatura de specialitate nu au fost identificate studii care să investigheze relația potențială dintre activitatea fizică, virusurile TT și cancerul de sân.
– Activitatea nocturnă sau în ture
În ultimii ani incidența cazurilor de cancer ocupațional are o tendință crescătoare (Hohenadel et al., 2015). Unele studii au sugerat că femeile care lucrează noaptea sau în ture de noapte pot avea un risc mai mare de cancer de sân (Engel et al., 2018),(Purdue et al., 2015) ca urmare a perturbării nivelurilor unor hormoni (ex. melatonina) sau alterării ritmului circadian (He et al., 2015). Meta-analize efectuate nu au ajuns la un consens în privința activității deși unele au indicat că impactul este moderat (RR 1.79; 95% CI: 1.25–2.57) (Kamdar et al., 2013), foarte redus (R.R.=1,04; 95%CI: 1,00–1,10) (Megdal et al., 2005) sau nesemnificativ (Hansen, 2017),(Pahwa, Labrèche and Demers, 2018). La aceste rezultate discordante pot să contribuie: durata în care subiecții au avut acest tip de activitate, diferențele privind tipul de activitate, particularitățile de la locul de muncă (He et al., 2015),(Wang et al., 2013), expunerea diferită la mutageni (Allen et al., 2013) sau prezența altor factori de risc (istoricul reproductiv) (Jia et al., 2013).
În acest studiu nu au fost identificați factori care să influențeze riscul de carcinom ductal invaziv la persoanele care au lucrat în ture de noapte sau au fost active noaptea ( Tabel 30). În consecință activitatea nocturnă sau în ture de noapte, considerată independent sau în asociere cu alți factori de risc, nu a influențat semnificativ riscul de boală în populația caucaziană din România. Acest rezultat este similar cu cel raportat în alte studii (ex. istoricul reproductiv) (Jia et al., 2013).
– Mediul în care locuiesc
Unele date arată că boala este mai frecventă în mediul urban (Fogleman, Mueller and Jenkins, 2015),(Singh, 2012), diferența dintre valorile raportate în mediul urban și cel rural fiind de ~ 9% (Blake et al., 2017).
În acest studiu persoanele care locuiesc în mediul urban au fumat activ cu 10,77 ani mai mult comparativ cu femeile control (38,91 ani vs. 28,14 ani, p<0,000003) ( Tabel 31). De asemenea persoanele care locuiesc în mediul urban au avut și alți factori de risc care pot influența riscul de boală. Dintre aceștia cei mai importanți sunt nuliparitatea (O.R.=2,38, p< 0,005) și perioada de lactație mai mică de 12 luni (O.R.=3,4, p=0,006).
La persoanele din mediul rural s-a observat o tendință de asociere între expunerea activă sau pasiv la fum de țigară și carcinomul ductal invaziv (O.R.= 3,93, p>0,002) (Tabel 32).
În consecință diferite particularități ale subiecților analizați se pot suprapune peste efectul pe care îl are mediul asupra riscului de boală.
2.5.2. Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal
În acest studiu au fost incluse paciente caucaziene, care au avut vârsta medie de 60,12±3,05 ani (interval vârstă 50-65 ani). Pentru această categorie de vârstă probabilitatea de a se diagnostica cancer de sân este de 2,4-4%. Deși vârsta medie la care este diagnosticată boala prezintă diferențe interetnice / interpopulaționale semnificative (American Cancer Society, 2019) se consideră că vârsta (mediană) este de 62 ani (Howlander et al., 2019). În consecință pentru a evita înclinarea (bias) rezultatelor s-a testat un lot omogen din punct de vedere al vârstei (vârsta pacientelor din acest studiu este cuprinsă în intervalul valorilor medii descrise în literatura de specialitate) și al etniei (paciente caucaziene din România).
Cei mai importanți factori care au fost asociați cu cancerul de sân sunt reprezentați de: vârsta, antecedentele fiziologice (istoricul reproductiv, istoricul menstrual) sau patologice (boli maligne, boli care au afectat glanda mamară), personale și heredocolaterale, particularitățile antropometrice (ex. IMC crescut, particularitățile glandei mamare), expunerea la factori de risc (ex. iradiere mai ales la nivelul toracelui anterior, expunere la fum de țigară și sau alcool, terapia de substituție hormonală), etnia, diferite particularități ale stilului de viață (exerciții fizice), predispoziția genetică (Momenimovahed and Salehiniya, 2019),(Akram et al., 2017),(Malvia et al., 2017),(Maas et al., 2016). Deși impactul acestor factori asupra riscului de boală a fost testat în numeroase studii influențele exercitate asupra vârstei la care este diagnosticată boala au fost puțin investigate. În consecință am decis să testam aceste influența în cercetarea realizată.
Rezultatele obținute în acest studiu au indicat că vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv nu a fost influențată semnificativ de: prezența virusurilor Torque Teno ( Tabel 36, Tabel 37), gradul de paritate (ex. nulipare sau pare) (Tabel 38, Tabel 39), vârsta la care s-a produs prima sarcină (înainte sau după vârsta de 30 ani), particularitățile lactației ( Tabel 40, Tabel 53, Tabel 41,Tabel 42), anticoncepționalele orale, polimorfismele genetice ( Tabel 44), sau de mediul în care locuiesc subiecții testați (Tabel 78). Rezultatele nu au fost semnificative nici în cazul testării unor asocieri de factori de risc. Spre exemplu, vârsta la care a fost diagnosticată boala nu a fost influențată de prezența virusurilor Torque Teno la pacientele care au genotipuri de risc (Tabel 43, Tabel 45, Tabel 46, Tabel 47, Tabel 48, Tabel 49, Tabel 50, Tabel 51), care au utilizat anticoncepționale orale (Tabel 52), care au avut prima sarcină după vârsta de 30 ani sau cu diferite particularități ale lactației (p>0,05) (Tabel 42). Vârsta la debutul bolii nu a fost influențată semnificativ nici de particularitățile activității fizice în asociere cu alți factori de risc (Tabel 29, Tabel 75, Tabel 76).
Pentru exemplificare este discutată sumar relația dintre vârsta la care a fost diagnosticată boala și paritate sau vârsta la care s-a produs prima sarcină. În timpul sarcinii celulele de la nivelul glandei mamare proliferează (inclusiv celulele care deși aveau modificări și aveau potențial tumoral erau într-o stare latentă) (Adami et al., 1995),(Adami, Signorello and Trichopoulos, 1998). La pacientele care au avut sarcini precoce s-au identificat în celulele glandei mamare o serie de leziuni ADN care sunt specifice cancerului de sân (ex. frecvență crescută a mutațiilor de tip InDel, a mutațiilor în TP53 și a amplificărilor MYC) (Nguyen et al., 2019). În cazul în care prima sarcină se produce la vârste mai înaintate probabilitatea de a avea astfel de mutații crește și implicit crește riscul de a dezvolta un proces tumoral. Micromediul de la nivelul glandei mamare în perioada postnatală poate favoriza și el procesul de metastazare și agresivitatea bolii și astfel poate să contribuie la reducerea vârstei la debutul bolii (Johansson et al., 2013),(Lyons et al., 2011).
În unele studii (Goddard et al., 2019) sau meta-analize (Nichols et al., 2019) s-a raportat că sarcinile, pe termen scurt, cresc riscul de cancer de sân (Palmer et al., 2014), mai ales dacă prima sarcină s-a produs la vârste înaintate (Kauppila et al., 2012),(Schedin, 2006),(Innes and Byers, 2004),(Innes and Byers, 2004). În studiu realizat în România s-a încercat evitarea unui astfel de efect prin criteriile de includere -excludere utilizate pentru constituirea loturilor (nu au fost incluse paciente la care boala a debutat la vârste reduse).
In acest studiu au fost identificate femei nulipare (56,33%), unipare (27,22%) sau multipare (16,45%). Vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină dusă la termen a fost mai mare la pacientele unipare comparativ cu cele multipare (30,26 ani vs 28,15 ani) (Tabel 3). La pacientele din aceste subloturi vârsta la care a fost diagnosticată boala a fost similară (~58 ani) ( Tabel 35), (Fig. 31) și nu a fost corelată cu vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină dusă la termen (pare: r = -0,04; unipare r = -0,12; multipare r=-0,05). Intervalul de timp cuprins între prima sarcină și vârsta la care s-a diagnosticat cancerul ductal invaziv a avut tendința de a fi cu ~ 2,21 ani mai redus la femeile unipare comparativ cu cele multipare (27,79 ani vs. 30,0 ani, p<0,02). Având în vedere rezultatele prezentate anterior se poate concluziona că intervalul de timp cuprins între prima sarcină și diagnosticul bolii reflectă în realitate vârsta la care a avut loc prima sarcină la cele două categorii de paciente.
Pentru rafinarea analizelor statistice pacientele au fost stratificate și în funcție de vârsta la care s-a înregistrat prima sarcină dusă la termen. În subloturile rezultate boala a fost diagnosticată la vârste similare (ex. 58,64 ani la pacientele unipare care au avut sarcina înainte de 30 ani; 57,84 ani la pacientele unipare care au avut prima sarcină ≥30 ani; 57,30 ani la multipare care au avut prima sarcină înainte de 30 ani; 57,56 ani la multipare care au avut prima sarcină după această vârstă; 58,29 ani la pacientele nulipare; p>0,05). În consecință vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân nu a fost influențată semnificativ de numărul de sarcini (
Tabel 33, Tabel 53), de apariția primei sarcini înainte sau după vârsta de 30 ani ( Tabel 34) sau de asocierea lor cu alți factori investigați. Aceste rezultate sunt concordante cu cele publicate anterior. Rezultatele unui studiu prospectiv în care au urmărite 107146 asistente căsătorite timp de patru ani au arătat că nu există o relație semnificativă între vârsta la care s-a produs prima sarcină și vârsta la care a fost diagnosticată boala (Pathak et al., 1986).
Dintre factorii care au avut tendința de a influența vârsta la care a fost diagnosticată boala cel mai puternic impact l-au avut IMC și activitatea nocturnă sau în ture.
IMC crescut a fost considerat un factor de risc mai ales pentru formele de cancer de sân care debutează în postmenopauză deoarece în această perioadă țesutul adipos este cea mai importantă sursă de estrogen (Iyengar et al., 2019),(Picon-Ruiz et al., 2017). În cadrul unei meta-analize s-a calculat că o creștere a greutății corporale de 5 kg în timpul perioadei adulte poate crește riscul de cancer de sân în postmenopauză cu 11% (Keum et al., 2015). Scăderea ponderală poate să reducă riscul de boală; această asociere este mai dificil de testat având în vedere dinamica modificărilor ponderale în timpul perioadei adulte (Chlebowski et al., 2019).
În eșantionul testat vârsta la care a fost diagnosticată boala nu a fost corelată cu valorile IMC pacientelor normoponderale (r= 0,34) sau supraponderale (r=0,02). Diferența de 1,26 ani dintre vârsta medie la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la pacientele supraponderale și la cele normoponderale nu a atins valoarea prag pentru a o considera semnificativă din punct de vedere statistic (58,65 ani vs. 57,39 ani, p<0,01). În consecință valorile IMC în intervalul normoponderal-supraponderal nu au reprezentat un factor cu impact semnificativ statistic asupra vârstei la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv.
Unele studii au indicat că relația dintre vârsta la care are loc prima sarcină și riscul de cancer de sân poate să fie influențată de IMC sau de înălțimea subiecților (Cnattingius et al., 2005),(Lukanova et al., 2006). În loturile analizate în acest studiu înălțimea, greutatea și IMC tind să fie mai mari în lotul de paciente în raport cu valorile înregistrate pentru lotul control. Diferența dintre vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv la pacientele supraponderale și la cele normoponderale nu a atins pragul corectat pentru semnificația statistică (58,65 ani vs. 57,39 ani, p<0,01). Această diferență nu a fost influențată de vârstă la care s-a produs prima sarcină (29,53 ani la pacientele supraponderale vs 29,32 ani la normoponderale) (Tabel 23).
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal la pacientele care au avut coinfecție cu TTV și TTMDV a avut tendința de fi mai mare la femeile supraponderale în raport cu cele normoponderale (58,88 ani vs. 57,11 ani, p<0,008) ( Tabel 54). Pentru celelalte virusuri sau coinfecții virale (ex. TTV+TTMDV: r=0,26); TTV+TTMV: r=0,27; TTMDV+TTMV: r=0,37; TTV+TTMDV+TTV: r=0,29) nu s-a observat o astfel de tendință de asociere.
În consecință vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv a avut tendința de asociere cu IMC, mai ales în cazul pacientelor supraponderale care au avut coinfecții cu TTV și TTMDV. În literatura de specialitate nu au fost identificate date similare raportate care să permită compararea rezultatelor prezentate anterior.
Activitatea nocturnă sau în ture. Studiile anterioare au indicat că alterarea ritmului circadian, la începutul vârstei adulte (Wegrzyn et al., 2017),(Cordina-Duverger et al., 2018) sau pentru perioade îndelungate (cum se întâmplă în cazul persoanelor care lucrează noaptea / în ture), au un risc mai mare de a dezvolta cancer mamar (Jia et al., 2013),(Schernhammer et al., 2006),(Schernhammer et al., 2003),(Rabstein et al., 2014). Melatonina poate să fie elementul care mediază aceste asocieri prin efectele antioxidante, stimulatoare asupra sistemului imunitar și de diminuare a concentrației formelor active de estrogen (J. Sanchez-Barcelo et al., 2012). Prin aceste efecte melatonina poate reduce riscul de proliferare (Stevens et al., 2014),(Hill et al., 2011),(Hill et al., 2015) și invazie tumorală (R.J. et al., 2017) și poate avea efecte benefice în pentru prevenția primară sau secundară a bolilor maligne (S. Cos and Sánchez-Barceló, 2000),(Samuel Cos and Sánchez-Barceló, 2000).
La analiza univariată, activitatea diurnă sau nocturnă (lucrează noaptea/ în ture) nu a reprezentat un factor modificator al vârstei la care a fost diagnosticată boala (58,42 vs. 57,54, p>0,05) (Tabel 77). Totuși aceasta a fost mai redusă la pacientele care au lucrat în ture de noapte și au consumat ocazional alcool (57,3-3,23 vs. 58,48-2,80, p<0,03), au făcut exerciții fizice în mod ocazional (56,47 vs. 58,62, p<0,02) sau nu au fumat (57,14 vs. 58,86, p<0,006) sau) (Tabel 77). Dintre aceste asocieri cea mai importantă dintre punct de vedere statistic a fost observată la pacientele care au lucrat în ture și nu au fumat (p<0,006).
– Expunerea la fum de țigară
Datele din literatura de specialitate sugerează că expunerea la fum de țigară (activă și / sau pasivă), pentru perioade îndelungate, poate avea o contribuție nesemnificativă sau modestă la riscul de cancer de sân. Unele rezultate sugerează că acest risc este mai important în cazul persoanelor care au dobândit viciul la vârste reduse sau înainte de a avea prima sarcină dusă la termen (Gram et al., 2019), (Dossus et al., 2014b),(Macacu et al., 2015b),(Andersen et al., 2017), în cazul foștilor fumători (Ilic, Vlajinac and Marinkovic, 2013) sau al celor expuși pasiv la fum de țigară (Chen et al., 2014), (Gao et al., 2013),(Shrubsole et al., 2004). Spre exemplu, riscul de cancer de sân crește cu 17% în cazul expunerii pasive la fum de țigară încă din copilărie (White et al., 2017) și cu 18% în cazul pacientelor care fumat activ >10 ani înainte de nașterea primului copil (Gaudet et al., 2013b) sau cu 27% dacă au fumatul înainte de prima sarcină (Olson et al., 2005).
Principalele rezultate obținute în acest studiu la analiza expunerii active, expunerii doar pasive sau expunerii combinate la fum de țigară sunt prezentate în paragrafele următoare.
Fumat activ. Vârsta la care a fost diagnosticată boala a fost însă cu atât mai redusă cu cât persoanele au fumat mai mult de 10 țigări / zi. Spre exemplu vârsta la care a fost diagnosticată boala a fost mai redusă cu 0,73 ani la persoanele care au fumat ≥10 țigări/ zi (56,98 ani vs. 58,66 ani, p<0,0007), cu 2,25 ani la cele care au fumat ≥15 țigări/zi (56,41 ani vs. 58,66 ani, p<0,00005) și cu 3,08 ani la cele care au fumat ≥20 țigări/ zi (55,55 ani vs. 58,63 ani, p<0,000003) comparativ cu restul subiecților (Tabel 55).
Vârsta la care a debutat boala a prezentat diferențe semnificative între subloturile de paciente care au avut studii gimnaziale sau liceale și au fumat activ comparativ cu cele care nu au fumat activ înainte de prima sarcină (57,28 ani vs. 60,66 ani, p<0,0004) (Tabel 65). În două studii realizate după anii 2010 s-a raportat că fumatul este asociat cu reducerea vârstei la care a fost diagnosticată boala (Abramowitz et al., 2010),(Malik et al., 2015). În consecință datele obținute în acest studiu sunt parțial concordante cu cele publicate anterior.
Procentul de fumătoare active care au fost pozitive pentru infecțiile cu virusuri Torque teno a fost mai mare în lotul de paciente comparativ cu lotul control ( Tabel 27). Numărul redus de fumătoare active înainte de prima sarcină care au avut TTV nu a permis estimarea impactului acestei asocieri de factori de risc asupra vârstei la care a fost diagnosticat cancerul de sân.
Expunerea pasivă la fum de țigară a început să fie privită ca un potențial factor de risc pentru cancerul de sân la începutul anilor 2000 (Khuder and Simon, 2000). Această asociere nu a fost confirmată însă în toate studiile ulterioare (Kruk, 2014). În acest studiu diferența dintre vârsta la care a fost diagnosticată boala la persoanele care au fost expuse doar pasiv și cele care nu au fost expuse pasiv la fum de țigară a fost de 2,46 ani (57,42 ani vs. 59,88 ani, p<0,00002). Semnificația statistică a diferențelor a fost și mai mare în sublotul de paciente expuse doar pasiv la fum de țigară care au avut studii gimnaziale/ liceale- 3,08 ani la (57,58 ani vs. 60,66 ani, p<0,000003) (Tabel 61).
Durata expunerii pasive la fum de țigară a fost mai mare la pacientele care au fost expuse atât la locul de muncă cât și acasă (7,17 ore) comparativ cu cele care au fost expuse doar acasă (4,11 ore, p<0,001) sau doar la locul de muncă (4,40 ore, p<0,001) (Tabel 59). Numărul de ani în care s-a realizat această expunere a fost similar la pacientele din cele trei subloturi de paciente expuse pasiv la fum de țigară (Tabel 60). Vârsta la care a fost diagnosticată boala a fost cu 4,11 ani mai redusă la pacientele care au fost expuse pasiv la fum de țigară (acasă și la locul de muncă) și care au avut infecții cu TTV comparativ cu pacientele care nu au avut niciunul dintre acești factori de risc (56,20 ani vs. 60,31 ani, p<0,0001) (Tabel 69). La acest rezultat pare să contribuie durata mai mare de expunere a pacientelor la fum de țigară. O tendință similară a fost observată și în cazul pacientelor care au fost expuse pasiv la fum de țigară (indiferent de locație) și au fost pozitive pentru TTV comparativ cu cele care nu au avut niciunul dintre acești factori de risc (57,67 ani vs. 60,31 ani, p<0,0016) (Tabel 67).
Expunerea la fum de țigară (activ sau pasiv). Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv a fost cu 2,29 ani mai redusă la pacientele care au fost expuse comparativ cu cele care nu au fost expuse activ sau pasiv la fum de țigară (57,59 vs. 59,88, p<0,000007). Această diferență a crescut la 2,65 ani în sublotul de paciente care au fost nulipare (57,55 vs. 60,20, p<0,00001) ( Tabel 62) și la 3,14 ani la cele care au avut studii gimnaziale sau liceale (57,52±2,56 vs. 60,66±2,00, p<0,00001). Aceste rezultate reflectă cel mai probabil diferite aspecte corelate cu stilul de viață al pacientelor analizate.
Expunerea activă și pasivă la fum de țigară. Vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân a fost cu 2,74 ani mai redusă la pacientele expuse comparativ cu cele care nu au fost expuse atât activ cât și pasiv la fum de țigară (57,14 ani vs. 59,88 ani, p<0,00001). Diferența de vârstă a fost și mai mare în subloturile de femei nulipare- 2,97 ani (57,23 vs. 60,20, p<0,00001), care nu consumă alcool – 3,53 ani (56,30 ani vs. 59,83 ani, p<0,00001) sau care au avut studii gimnaziale sau liceale – 3,84 ani (56,82 ani vs. 60,66 ani, p<0,00001) ( Tabel 63). Aceste rezultate reflectă impactul pe care îl au diferiți factori de risc asupra relației dintre expunerea activă și pasivă la fum de țigară și vârsta la care a fost diagnosticată boala (Tabel 63).
2.5.3 Concluzii referitoare la factorii care pot influența vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân
În concluzie vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân este diminuată de particularitățile expunerii la fum de țigară. Vârsta la care a fost diagnosticată boala a fost diminuată:
– cu cât persoanele au fumat activ mai mult (2,25 ani dacă au fumat ≥15 țigări/zi și 3,08 ani dacă au fumat ≥20 țigări/ zi, p<0,000003) (Tabel 55).
– la persoanele expuse activ sau pasivă la fum de țigară (2,29 ani, p<0,000007).
– la persoanele expuse doar pasiv la fum de țigară (cu 2,46 ani, p<0,00002) mai ales în sublotul de persoane care au avut studii gimnaziale/ liceale (3,08 ani, p<0,000003) (Tabel 61);
– la pacientele care fumează activ și pasiv (2,74 ani, p<0,00001), mai ales dacă erau nulipare (2,97 ani, p<0,00001), care nu consumă alcool (3,53 ani, p<0,00001) sau care au avut studii gimnaziale sau liceale (3,84 ani, p<0,00001) ( Tabel 63).
Vârsta la care a fost diagnosticat carcinomul ductal invaziv a avut tendința de asociere cu IMC, mai ales în cazul pacientelor supraponderale care au avut coinfecții cu TTV și TTMDV și cu la cu activitatea nocturnă/în ture la pacientele care nu au fumat activ (p<0,006).
Aceste rezultate reflectă impactul pe care îl au diferiți factori de risc asupra relației dintre expunerea activă și pasivă la fum de țigară și vârsta la care a fost diagnosticată boală.
2.5.4. Detecția relațiilor de epistazie statistică prin metoda MDR
Aplicarea algoritmilor MDR permite detecția factorilor care, independent sau în asociere, pot influența predispoziția pentru boală sau particularitățile sale clinice. Acești algoritmi de analiză au fost aplicați și pentru detecția relațiilor de epistazie statistică în unele tipuri de cancer, printre care și cancerul de sân (Ritchie et al., 2001),(Briollais et al., 2007),(Uppu, Krishna and Gopalan, 2015),(Milne et al., 2008),(Oestergaard et al., 2006).
În acest studiu am utilizat analiza MDR pentru a identifica modele predictive pentru carcinomul ductal invaziv și principalii factori care contribuie semnificativ la aceste modele. Dintre aceste modele generate au fost selectate doar acele variante care au avut numărul maxim de cross-validări (10 din 10), valoarea p<0,0001 iar O.R. a avut valoarea maximă. În etapa de analiză a datelor, au fost comparate modelele MDR pentru a identifica combinațiile de atribute care descriu cel mai bine un fenotip particular de carcinom ductal invaziv (endofenotip).
a) Analiza întregului lot de subiecți a scos în evidență că modelul MDR care are cea mai mare capacitate de predicție a carcinomului ductal invaziv este alcătuit din “TGFb-IL6,sarcină_30 ani, parodontopatie” (O.R.=10,02). Cea mai importantă contribuție la realizarea acestui model a fost alocată atributului combinat IL6-TGFb (12,74%) (Fig. 33); ea depășește contribuția atribuită vârstei la care se produce prima sarcină dusă la termen (înainte / după vârsta de 30 ani) (8,85%) sau parodontopatia (5,72%).
Acest model MDR sugerează că între loturile investigate poate exista o diferențiere semnificativă bazată pe parodontopatie. Pentru a verifica acest aspect trebuia analizat sublotul de subiecți care au avut parodontopatie. Deoarece numărul de subiecți pozitivi pentru acest caracter nu a permis efectuarea analizei MDR s-a recurs la testarea subiecților care nu au avut parodontopatie. Pentru acest sublot de subiecți (care nu au avut parodontopatie) capacitatea maximă de discriminare a statusului clinic a fost atribuit modelului MDR “TGFb_IL-6, sarcină_30_ani_AGTR1, TTV” (O.R.= 9,52) (Fig. 34).
Cele două modele MDR obținute pentru întregul lot de subiecți și pentru sublotul de subiecți care nu au avut parodontopatie au reconfirmat sinergismul dintre TGFb-IL6 în predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv iar această interacțiune are un impact semnificativ în riscul de boală independent de prezența / absența parodontopatiei.
Unele date din literatură susțin existența unei relații între IL6, TGFb și parodontopatie (sau un factor asociat cu aceasta -ex. inflamația) și pot explica prezența lor în modelele MDR care descriu carcinomul ductal invaziv. Spre exemplu pacienții cu parodontopatie cronică au niveluri mai crescute de IL6 (Hegde and Awan, 2019);(Cardoso, Reis and Manzanares-Céspedes, 2018), riscul de boală poate să fie influențat de unele polimorfisme din IL6 (Zhao and Li, 2018),(Zhao, Li and Li, 2019),(Scapoli et al., 2019),(Chatzopoulos et al., 2018) iar mediatorii inflamatori implicați în boala parodontală pot influența alte afecțiuni care nu sunt localizate la nivelul cavității bucale, inclusiv boli maligne (Hoare et al., 2019). TGFb este un factor de creștere care este implicat în diferite procese care au și impact imunomodulator (Verrecchia and Mauviel, 2002). Studiile populaționale (Zhao, Guan and Zhang, 2010), inclusiv cele de tip meta-analiză (Cui et al., 2015), sau cele bazate pe analiza profilului de expresie (Vikram et al., 2015),(Mize et al., 2015) au sugerat că TGFb1 reprezintă un factor care poate influența riscul de boală parodontală. Asocierea dintre boală și polimorfismele TGFb1 (ex. rs1800469) pare să fie mai evident în populația asiatică și mai discret în populația caucaziană (Cui et al., 2015).
b) Modelele MDR care au fost cel mai puternic asociate cu carcinomul ductal invaziv au fost identificate în subloturile de femei supraponderale (“sarcină_30 ani_TTV, TGFb-IL6, anticoncepționale-eNOS” O.R.= 17,18) (Fig. 35) sau normoponderale (“TGFb-IL6, sarcină_30 ani, parodontopatia” O.R.=16,74) (Fig. 36). Cele două modele MDR au elemente comune (ex. TGFb-IL6 și anticoncepționale-eNOS) dar au și elemente specifice (ex. sarcină_30 normoponderale sau interacțiunea dintre sarcină_30 ani_TTV) (Fig. 35, jos), (Fig. 36). Asocierea cu boala (O.R.=17,18 vs. 16,74) și contribuția IL6-TGFb (12,99% vs. 12,75%) au valori mai mari la femeile supraponderale.
Se poate observa că modelul identificat la pacientele normoponderale este identic cu cel detectat pentru lotul integral dar spre deosebire de acesta este asociat mai puternic cu boala (normoponderale O.R.=16,74, 95%CI:7,22-38,80; lot integral O.R.=10,02, 95%CI: 6,09-16,50).
Metode statistice convenționale utilizate în acest studiu au evidențiat și relația puternică dintre carcinomul ductal invaziv și prezența/absența unei sarcini înaintea vârstei de 30 ani (O.R. sarcini înainte de 30 ani=0,20, p=0*) ( Tabel 2), creșterea expunerii la acțiunea fumului de țigară (ex. pacientele au început să fumeze în medie cu 5,66 ani mai reduse comparativ cu femeile sănătoase, p=1,12e-10; de 4 ori mai multe paciente au început să fumeze înainte de prima sarcină, p= 0* și au fumat în medie cu ~ 10 ani mai mult, p<2,2e-08 comparativ cu femeile control) (Tabel 26). De asemenea aceste metode au evidențiat tendința de creștere a IMC la paciente (p<0,02) și modul în care factorii genetici sau nongenetici pot influența relația dintre IMC și carcinomul ductal invaziv (Tabel 2), (Tabel 19), (Tabel 20), (Tabel 28).
Fumatul este considerat principalul factor de risc modificabil pentru parodontopatie (Razavi et al., 2012),(Zhang et al., 2019) și poate influența riscul pentru cancerul de sân. Unele studii au evidențiat prezența unor compuși din fumul de țigară în glanda mamară sau în laptele matern (Dahlstrom et al., 1990),(Geraghty et al., 2015). Acești compuși, cel puțin în condiții experimentale, pot predispune la tumori ale glandei mamare (Hecht, 2002), (Alavanja et al., 2004). În consecință, asocierea dintre fumat, durata de alăptare și cancerul de sân nu este surprinzătoare (Kispert and McHowat, 2017).
NO este o biomoleculă care are funcții biologice complexe dintre care unele pot predispune la dezvoltarea și evoluția proceselor tumorale (ex. mediază inflamația, crește rata de apariție a leziunilor ADN, reduce eficiența cu care sunt reparate aceste leziuni, poate influența angiogeneza și metastazarea) (Chien, Bau and Jan, 2004),(Jadeski, Chakraborty and Lala, 2003),(Jadeski, Chakraborty and Lala, 2002),(Duda, Fukumura and Jain, 2004),(Jadeski et al., 2000). Studiile de asociere și meta-analizele aduc dovezi suplimentare în favoarea existenței unei relații între polimorfismele eNOS și riscul de cancer, inclusiv de cancer de sân (Gao et al., 2015),(Yao et al., 2010),(Hao, Montiel and Huang, 2010). Această relație poate să fie influențată de către diferiți factori (ex. expunerea la fum de țigară) (Fard, 2020).
In consecință datele obținute în acest studiu și cele publicate în literatura de specialitate pot explica includerea vârstei la care se produce prima sarcină la termen, parodontopatiei, TGFb, IL6 și eNOS în cele mai bune modele MDR care descrie riscul de carcinom ductal invaziv. De asemenea analiza modelelor MDR sugerează că la studierea predispoziției pentru carcinomul ductal invaziv ar trebui să se țină cont și de IMC subiecților.
c) Interacțiunea dintre IL6 și TGFb în predicția carcinomului ductal invaziv a fost prezentă în 11 dintre cele 12 modele MDR generate (nu a fost identificat în sublotul de paciente care a avut prima sarcină înainte de 30 ani) (Tabel 79). Spre exemplu, aceste interacțiuni au fost prezente în modelele MDR obținute la testarea sublotului de femei: care au avut infecții cu virusurile Torque Teno (“sarcina_30 ani_anticoncepționale, TGFb-IL6,eNOS”) (Fig. 37), care au fost expuse activ sau pasiv la fum de țigară (“TGFb_IL6, sarcina_30 ani,parodontopatie”), care nu au fumat („sarcina_30 ani_eNOS, TGFb_IL-6,TTV”), care nu consumă sau care consumă ocazional alcool (Fig. 38), nulipare (“TGFb_IL-6, parodontopatie, consum_alcool”) (Fig. 43), care au avut sarcini la termen („sarcina_30_ani, TGFb_IL-6, TTV”) (Fig. 39), care nu au utilizat anticoncepționale (“IL6-TGFb, IMC-sarcină_30_ani și parodontopatie”) ( Fig. 40) etc. Între aceste modelele MDR pot exista diferențe reduse. Spre exemplu, modelele MDR generate pentru subloturile de subiecți fumători (activi sau pasivi) (“TGFb_IL6, sarcina_30 ani,parodontopatie”) sau nefumători („sarcina_30 ani_eNOS,TGFb_IL-6,TTV”).
Impactul IL6-TGFb în predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv este susținut de numărul mare de modele MDR care includ această combinație de atribute sau de riscul semnificativ de boală pe care îl conferă (OR TGFb CC-IL6 GG =34,69, p<0,0001) (Tabel 12).
d) Interacțiunea IL6-TGFb are cea mai importantă contribuție la discriminarea stărilor de sănătate și de boală în sublotul de subiecți care au infecții cu Torque Teno (14,10%). Cu toate acestea modelul MDR nu are cea mai puternică asociere cu boala (acest model O.R.=15,5 vs. model supraponderal O.R:.17,18) (Fig. 37), (Tabel 79). În consecință se poate observa că această asociere de factori are un impact diferit asupra riscului de boală în diferite subloturi de subiecți.
e) În unele subloturi interacțiunea IL6-TGFb nu a avut cea mai importantă contribuție la modelele MDR generate. Astfel de cazuri au fost detectate pentru subloturile de indivizii nefumători, supraponderali sau care au avut infecții cu virusurile Torque Teno. Atributul TGFb-IL6 contribuie cu 10,69% la modelul MDR identificat la indivizii nefumători („sarcina_30 ani_eNOS,TGFb_IL-6,TTV”) ( Fig. 41), cu 12,99% la cel realizat pentru femeile supraponderale (“sarcină_30 ani_TTV, TGFb-IL6, anticoncepționale-eNOS”) (Fig. 35) sau cu 14,10% la modelul generat pentru pacientele care au avut infecții cu virusurile Torque Teno (“sarcina_30 ani_anticoncepționale, TGFb-IL6,eNOS”) (Fig. 37).
f) Interacțiuni complexe au fost identificate în sublotul de femei nulipare. În modelul MDR obținut “TGFb_IL-6, parodontopatie, consum_alcool” a fost detectată o interacțiune între IL-TGFb și alcool. Deși au fost identificate și alte interacțiuni acestea nu au influențat semnificativ rezultatele și nu se regăsesc în modelul optim pentru predicția statusului clinic al femeilor nulipare (O.R.=12,85) (Fig. 43). Analiza statistică clasică a stabilit că absența lactației (sau nuliparitatea) (O.R.=2,45, p=3.6E-5) sau lactația <12 luni (vs. ≥12 luni, O.R=3,06, p=0,0003) reprezintă factori de risc importanți pentru carcinomul ductal invaziv (Tabel 2). Aceste rezultate susțin importanța modelului MDR descris în cazul femeilor nulipare.
Pentru a se evita heterogenitatea loturilor, în studiu au fost incluse doar femei pare care au avut perioadă de lactație sau nulipare. Acest criteriu utilizat pentru constituirea loturilor are și dezavantaje – împiedică discriminarea efectului nuliparității de cel al absenței lactației iar rezultatele obținute pentru cele două caractere sunt superpozabile.
g) Interacțiunea IL6-TGFb nu a fost detectată la pacientele care au avut prima sarcina înainte de 30 ani (modelul MDR a fost “IL6, fumat_pasiv, consum_alcool”) iar contribuțiile individuale ale acestor factori au fost reduse (4,3%, 0,47%, 0,31%). Acest rezultat susține existența unor subloturi de pacienți pentru care predispoziția pentru boală cuprinde combinații particulare de factori.
h) Nu au fost identificate interacțiuni complexe în sublotul de femei care au avut prima sarcină înainte de 30 ani. În acest sublot modelul optim este “IL6,fumat_pasiv,consum_alcool” (O.R.= 12,18, 95%CI=4.50-32.95). În consecință apariția cancerului de sân la pacientele care au avut prima sarcină înaintea vârstei de 30 ani se poate descrie cel mai bine prin acțiunea individuală a factorilor de risc și mai puțin prin interacțiunea dintre aceștia (Fig. 44).
Metodele clasice de analiză au evidențiat că persoanele care nu consumă alcool, care nu au fost expuse pasiv la fum de țigară și sunt purtătoare de IL6 -174C au un risc statistic mai redus de cancer de sân comparativ cu persoanele care nu au fost expuse la această combinație de factori (Fisher: p=0,001). Într-un studiu publicat în anul 2008 s-a raportat că femeile hispanice și amerindiene purtătoare de genotip IL6GG (rs2069832) care au fost expuse la fum de țigară mai mult de 10 ore/săptămână (chiar dacă nu erau fumătoare active) au un risc crescut de boală în premenopauză (OR = 4,4; 95%CI = 1,5-12,8; p < 0,01) (Slattery et al., 2008). Aceste rezultate sunt concordante cu rezultatele obținute în acest studiu chiar dacă au fost analizate paciente cu forme de cancer de sân care debutează la vârste diferite (în premenopauză sau în postmenopauză). În consecință interacțiunea dintre IL6 și TGFb nu contribuie semnificativ statistic la apariția bolii la pacientele care au avut o sarcină dusă la termen înaintea vârstei de 30 de ani. Se poate observa că metoda MDR poate identifica modele care descriu riscul de boală chiar dacă elementele componente au influențe discrete asupra riscului boală.
i) În unele subloturi asocierea dintre modelele MDR și boală a fost mai redusă în comparație cu asocierea raportată pentru lotul integral (O.R.=10,02). Astfel de cazuri au fost identificate în subloturile de persoane care nu consumă sau consumă ocazional alcool („TGFb_IL-6,sarcina_30 ani,parodontopatie” O.R. = 8,01) sau care nu au avut parodontopatie („TGFb_IL6,sarcina_30 ani_AGTR1,TTV”, O.R.= 9,52). Pentru aceste subloturi de subiecți trebuie căutați alți factori de risc sau predispozanți care pot influența predispoziția pentru carcinomul ductal invaziv.
j) Pentru optimizarea modelului MDR care descrie riscul de carcinom ductal invaziv dintre femeile investigate au fost excluse persoanele care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (au rămas în analiză femeile nulipare și cele care au avut prima sarcină după vârsta de 30 ani) Analiza acestui sublot a condus la modelul MDR “alcool,parodontopatie,TGFb_IL6”. Asocierea cu carcinomul ductal invaziv (O.R.: 11,94 vs. 10,02) și contribuția IL6_TGFb (13,93% vs. 12,74%) sunt superioare celor calculate pentru modelul MDR descris la analiza lotului integral (Fig. 45). În consecință repetarea analizei MDR permite generarea unor modele care au capacitatea de a identifica factori asociați semnificativ cu diferite subtipuri de boală.
k) Principalele atribute care intră în alcătuirea modelelor MDR pentru carcinomul ductal invaziv sunt sarcina _30 ani și interacțiunea dintre IL6-TGFb. Dacă s-au exclus din analiză aceste caractere și s-au reanalizat datele disponibile s-a identificat un model MDR alternativ pentru carcinomul ductal invaziv. Acest model a inclus: durata de alăptare, fumatul și polimorfismul eNOS. Caracteristicile acestui model sunt: acuratețea balansată: 0,69, acuratețea testării: 0,69, sensibilitatea: 0,66, specificitatea: 0,72, O.R.:4,95, 95%CI: 1,19-20,61, chi2=5,11, p=0,02) (Fig. 46). Asocierea dintre boală și acest model este inferioară celei descrise pentru întregul lot de subiecți (“TGFb-IL6,sarcină_30 ani, parodontopatie”; O.R.=10,02). În consecință modelul nu a fost considerat optim deoarece nu a îmbunătățit capacitatea de clasificare a subiecților.
Rezultatele obținute la analiza tuturor datelor și a subloturilor de femei supraponderale, sau care au avut prima sarcină înainte de 30 ani susțin ipoteza existenței unor forme particulare de carcinom ductal invaziv (endofenotipuri). Aceste forme pot să fie descrise mai bine prin combinații diferite de factori de risc sau protectivi. Spre exemplu în sublotul de persoane care au avut prima sarcină înainte de 30 de ani nu au fost identificate interacțiuni sinergice semnificative în modelul MDR (IL6, fumat_pasiv, consum alcool) iar la indivizii supraponderali modelul MDR include interacțiune dintre IL6_TGFb și dintre anticoncepționale_eNOS (model care a fost cel mai puternic asociat cu carcinomul ductal invaziv O.R.=17,18, 95% CI=8,58-34,69).
Pentru unele subloturi de subiecți (persoane care nu consumă alcool sau care nu au avut parodontopatie) nu s-au identificat factori care să contribuie semnificativ la riscul de boală. Modelul MDR identificat la analiza întregului lot de subiecți a fost asociat cu carcinomul ductal invaziv mai puternic comparativ cu modelul identificat pentru subiecții care nu au consumat alcool. Într-un studiu multicentric în care au fost urmărite clinic pentru o perioadă de 15 ani aproximativ 83300 de femei din Hawai și California (interval vârstă: 45-75 ani) s-a constatat că riscul de cancer de sân invaziv a crescut ușor dacă în analiză s-au păstrat doar femeile care nu au consumat alcool (HR = 1,40, 95%CI: 1,08-1,81) (Gram et al., 2015). Într-un studiu s-a raportat că în Europa și America de Nord consumul redus de alcool poate să fie implicat în apariția unui procent redus de cazuri de cancer de sân (1-2%) (Seitz et al., 2012). În consecință rezultatul obținut la analiza persoanelor din România prin metoda MDR este concordant cu cel raportat de Seitz (2012) pentru populația din Europa și sunt diferite de cele raportate de Gram (2015) pentru populația din Hawai și California. La diferențele raportate între aceste studii pot să contribuie backgroundul genetic diferit al populațiilor testate și criteriile diferite de includere (din acest studiu am exclus persoanele care au raportat că au consumat mai mult de 75g alcool / zi, mai mult de 3 zile pe săptămână).
În concluzie
– Analiza MDR poate identifica atribute care sunt utile pentru a discrimina stările sistemului (bolnav vs. sănătos), chiar dacă factorii testați au o contribuție statistică redusă la riscul total de boală (ex. modelul MDR “IL6,fumat_pasiv,consum_alcool” identificat la analiza femeilor care au avut prima sarcină înainte de 30 ani asocierea cu boala este O.R.= 12,18, 95%CI=4.50-32.95).
– Modelul MDR „TGFb-IL6,sarcină_30 ani, parodontopatie” are cea mai bună capacitate de identificare a carcinomului ductal invaziv în lotul integral de subiecți (O.R.= 10,02).
– Un model MDR particular a fost identificat în cazul persoanelor care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (modelul “IL6,fumat_pasiv,consum_alcool”, O.R.= 12,18). Dacă aceste persoane au fost excluse din analiză modelul MDR obținut pentru persoanele rămase (“alcool,parodontopatie,TGFb_IL6”, O.R.: 11,94) a depășit modelul MDR identificat pentru lotul inițial de subiecți.
– Modelele MDR care au fost asociate cel mai puternic cu carcinomul ductal invaziv au fost identificate în subloturile de femei supraponderale (“sarcină_30 ani_TTV, TGFb-IL6, anticoncepționale-eNOS” O.R.= 17,18) (Fig. 35) sau normoponderale (“TGFb-IL6, sarcină_30 ani, parodontopatia” O.R.=16,74) (Fig. 36).
– Aceste date sugerează că în loturile analizate pot exista unele fenotipuri particulare în care contribuția factorilor de risc și protectivi este diferită (ex. IMC, vârsta la care se produce prima sarcină, persoane care nu consumă alcool).
2.6. Concluzii
Rezultatele obținute în acest studiu au permis formularea următoarelor concluzii referitoare la carcinomul ductal invaziv:
I. Factori care modifică riscul de carcinom ductal invaziv
I.a) Factori protectivi:
– prima sarcină înainte de 30 ani la femei sedentare (O.R.=0,14, p=1,8E-5) (Tabel 28) sau la femei normoponderale (O.R.=0,19, p=1,9E-5) (Tabel 22);
– perioadă de lactație mai mare de 12 luni (comparativ cu persoanele care nu au avut lactație O.R.=0,27, p=0* sau cu cele care au avut o perioadă de lactație mai redusă de 12 luni O.R.=0,32, p=0,0003) ( Tabel 2);
– anticoncepționalelor orale utilizate de purtătoarele genotipurilor AGTR1 AA (O.R.=0,15, p=0,0008) sau IL6 GG (O.R.= 0,22, Yate's p=0,001) (Tabel 16).
I.b) Factori de risc:
– prezența virusurilor TTV la persoane nulipare (O.R.=3,44, p=0*) ( Tabel 6), supraponderale (O.R.=4,89, p=0*) ( Tabel 24) sau care nu au utilizat anticoncepționale (O.R.=3,54, p=0*) (Tabel 17, Tabel 4);
– nuliparitatea la persoane normoponderale (comparativ cu normoponderale care au avut prima sarcină înaintea vârstei de 30 ani: O.R.=5,45, p=4,2E-5) sau supraponderale (comparativ cu supraponderalele care au avut prima sarcină dusă la termen înainte de 30 de ani: O.R.=4,11);
– prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 la persoane supraponderale (comparativ cu supraponderale care au avut prima sarcină înainte de 30 ani: O.R.=5,19, p=7,1E-5) (Tabel 21) sau care au avut coinfecție cu TTV și TTMDV (O.R.=7,87, Yate's p=0,0002).
– persoane sedentare care au alăptat <12 luni (O.R.= 4,67, p=0,0006) (Tabel 28);
– fumatul activ înainte de prima sarcină (O.R.= 6,19, p= 0); pacientele au fumat activ cu ~ 10 ani mai mult (p<2,2e-08) și au fost expuse pasiv la fum de țigară cu ~ 3,91 ani mai mult comparativ cu femeile sănătoase (p<0,00001) (Tabel 26);
– prezența simultană a IL6 GG -TGFb CC (O.R.=34,69, p<0,0001) (Tabel 12).
I.c) Asocieri de factori care pot influența riscul de carcinom ductal invaziv
– valorile IMC au fost cu ~1 km/m2 mai mari la purtătorii de MTHFR T din lotul de paciente în raport cu lotul control (25,88 kg/m2 vs. 24,91 kg/m2, p=0,0008) (Tabel 19). Creșterea IMC, în intervalul supraponderal, în asociere cu alți factori (virusurile TT, nuliparitate sau prima sarcină dusă la termen la vârste înaintate) contribuie la creșterea riscului de boală.
I.d) Asocierea factorilor care au efecte antagoniste
– testarea lor simultană poate determina pierderea asocierii cu boala (ex. asocierea anticoncepționalelor orale cu prima sarcini înaintea vârstei de 30 sau cu prezența virusurilor TT, p>0,05).
I.e) Modele MDR care pot discrimina stările clinice ale subiecților (bolnav vs. sănătos)
– în lotul integral de subiecți modelul MDR „TGFb-IL6,sarcină_30 ani, parodontopatie” a avut cea mai bună capacitate de identificare a carcinomului ductal invaziv (O.R.= 10,02). Modelul este îmbunătățit dacă au fost excluse din studiu persoanele care au avut prima sarcină înainte de 30 ani (“alcool,parodontopatie,TGFb_IL6”, O.R.= 11,94);
– modelele MDR care au fost asociate cel mai puternic cu boala au fost identificate în subloturile de femei stratificate în funcție de IMC (supraponderale -“sarcină_30 ani_TTV, TGFb-IL6, anticoncepționale-eNOS” O.R.= 17,18; normoponderale – “TGFb-IL6, sarcină_30 ani, parodontopatia” O.R.=16,74) (Fig. 35),(Fig. 36).
– datele obținute sugerează că în loturile analizate pot exista unele fenotipuri particulare în care contribuția factorilor de risc și protectivi este diferită (ex. IMC, vârsta la care se produce prima sarcină, persoane care nu consumă alcool, parodontopatia).
– metoda MDR are eficiență crescută de identificare a combinațiilor de factori care au capacitate superioară de predicție a bolii chiar dacă acești factori au avut o contribuție individuală redusă la riscul statistic de boală.
II. Particularitățile expunerii la fum de țigară pot să fie asociați cu diminuarea vârstei la care a fost diagnosticat cancerul de sân:
-numărul de țigări fumate/zi (2,25 ani dacă au fumat ≥15 țigări/zi și 3,08 ani dacă au fumat ≥20 țigări/ zi, p<0,000003) (Tabel 55).
– expunerea activ sau pasivă la fum de țigară (2,29 ani, p<0,000007).
– expunerea doar pasivă la fum de țigară (cu 2,46 ani, p<0,00002) mai ales în sublotul de persoane care au avut studii gimnaziale/ liceale (3,08 ani, p<0,000003) (Tabel 61);
– expunerea activă și pasivă (2,74 ani, p<0,00001), mai ales dacă pacientele erau nulipare (2,97 ani, p<0,00001), nu consumă alcool (3,53 ani, p<0,00001) sau fac parte din lotul care a avut studii gimnaziale sau liceale (3,84 ani, p<0,00001) ( Tabel 63).
Aceste rezultate reflectă impactul pe care îl au diferiți factori de risc asupra relației dintre expunerea activă și pasivă la fum de țigară și vârsta la care a fost diagnosticată boală.
STUDIUL 3. TESTAREA FACTORILOR CARE POT INFLUENȚA REACTIVITATEA GENOMULUI MURIN LA ACȚIUNEA UNOR DOZE REDUSE DE DOXORUBICINĂ.
1. Introducere
Terapia cancerului mamar se bazează în principal pe abordarea chirurgicală, terapia hormonală, radioterapie și chimioterapie. Chimioterapia este recomandată pentru ~40% dintre cazurile de cancer de sân, deoarece are efecte importante asupra tumorilor care au ajuns în diferite stadii evolutive (tumori primare, localizate –tumori metastazate).
Doxorubicina (C27H29NO11) a fost izolată în anul 1969 din actinobacteria Streptomyces peucetius var. Caesius s (Arcamone et al., 2000). Acest citostatic (Adriamicina, Adriblastin, Adriamycin, Adrimedac, Doxolem, Doxotec) care face parte din familia antraciclinelor este utilizat în scheme terapeutice complexe pentru diferite tipuri de tumori umane lichide (ex. leucemii, limfom Hodgkin și non-Hodgkin) sau solide (ex. cancer de sân, vezică urinară, sarcom Kaposi, tumora Wilms). Efectele secundare expunerii la Doxorubicină limitează utilizarea sa în practica medicală; o parte dintre aceste efecte (ex. cardiotoxicitate dependentă de doză) depind de particularitățile administrării (ex. cale de administrare, schema de administrare, doză).
1.1 Interacțiuni cu celulele care se divid
Sistemele enzimatice pot transforma compușii mutageni în intermediari care au caracter electrofil; acești intermediar pot să fie responsabili de efectele compușilor mutageni la nivelul organelor, țesuturilor sau celulelor (ex. efectul antitumoral sau reacții toxice) (Gülkaç et al., 2004).
Moartea celulară indusă de Doxorubicină reprezintă probabil principalul efect prin care citostaticul își exercită efectul antitumoral (Wassermann, 1994). Doxorubicina poate induce moartea celulară printr-un mecanism direct sau prin mecanisme indirecte (via genotoxicitate sau blocare mitotică) (Kirsch-Volders, 2001).
Rata de proliferare a celulelor care se divid intens este diminuată de către Doxorubicină (Huynh, Chow and Soo, 2007), un citostatic care acționează în mod specific în faza S a ciclului celular (Kusyk and Hsu, 1976). Spre exemplu, s-a raportat că activitatea mitotică s-a redus cu 48% la șobolanii care, pe parcursul unei perioade de două săptămâni, au primit Doxorubicină (3mg/kg), intraperitoneal, la intervale de două zile (Ola et al., 2000).
Doxorubicina și metaboliții săi au proprietăți citotoxice, genotoxice și pro-apoptotice care sunt incomplet înțelese (Bose et al., 1995),(Quiles et al., 2002),(Ashikawa et al., 2004). Efectele sale citotoxice, aneugenice (Aly, Othman and El Nahas, 1999),(Dhawan et al., 2003) și clastogenice (Anderson, Yu and Browne, 1997) au fost evidențiate în diferite sisteme de testare (ex. bacterii, linii celulare normale sau tumorale, pești, mamifere) (Singal et al., 2000),(Jung and Reszka, 2001),(Quiles JL, 2002), sub forma rupturilor ADN (mono- sau dublu-catenare), anomalii cromozomale (numerice sau structurale) sau prin apariția micronucleilor (Boucher, Livingston and Hee, 1993),(Aït Amara-Mokrane et al., 1996),(Jagetia and Nayak, 1996),(Duffaud et al., 1998). Principalele mecanisme prin care se pot explica efectele citostaticului sunt:
– intercalarea antraciclinei între perechile de baze azotate ale dublului helix ADN (Jain et al., 2005); complexele ADN-Doxorubicină reduc semnificativ capacitatea helicazelor (mai ales topoizomeraza II) (Binaschi et al., 2001) de a denatura ADN dublu catenar.
– inhibarea funcției topoizomerazei II de către Doxorubicina care ajunge în nucleu. În consecință concentrația intranucleară de Doxorubicină (forma legată de ADN), care depinde de concentrația intracelulară totală de citostatic, a fost considerată un predictor bun al activității citostaticului (Lankelma et al., 2003). Doxorubicina poate determina formarea unor leziuni monocatenare care sunt “acoperite” de proteine (complexul ADN-topoizomeraza II); aceste complexe alterează procese biologice fundamentale (ex. transcripția, sinteza proteinelor, replicarea ADN) (Li and Yu, 1993),(Wassermann, 1994),(Gruber et al., 2005) care pot determina moartea celulelor (mai ales a celor care se divid rapid) (Sinha et al., 1984). Alterarea replicării crește rata cu care apar rupturi la nivelul macromoleculei de ADN (Kasahara et al., 1992),(Zwelling, 1989), (Binaschi M, 1990) și mutații (de diferite dimensiuni: mutații punctiforme – aberații cromozomale) și predispune la pierdere de material genetic în timpul rundelor succesive de diviziune celulară. Creșterea frecvenței rupturilor moleculelor de ADN în diferite țesuturi ale șobolanilor Wistar au fost observate după administrarea intraperitoneală de Doxorubicină (doză acută: 15 mg/kg) (Martins et al., 2012). Rezultate concordante au fost raportate și pentru celule umane normale (limfocite sau spermatozoizi) (Baumgartner et al., 2004) sau linii celulare (ex. cardiomiocite H9c2) (L’Ecuyer et al., 2006). După ce expunerea la citostatic încetează, leziunile induse de către acesta pot să persiste și se pot amplifica. Această evoluție a leziunilor poate să fie relevantă pentru supraviețuirea unor celule și evoluția tumorii (Binaschi et al., 1990).
– stres oxidativ; expunerea in vitro și in vivo la Doxorubicină crește concentrația radicalilor liberi de oxigen (Steven et al., 1992),(Carvalho et al., 2009),(Wagner et al., 2005),(Goodman and Hochstein, 1977),(Sato et al., 1977) prin mecanisme indirecte (au la bază reacții de oxidare a moleculelor de citostatic) sau directe (ex. bazate pe interacțiunea directă dintre fier și grupul chinonă al citostaticului). Dacă generarea speciilor reactive de oxigen depășește capacitatea sistemelor antioxidante de apărare (ex. sistem din care fac parte glutation peroxidaza, catalaza, superoxid dismutaza) se instalează stresul oxidativ (Li, Horke and Förstermann, 2013). Țesuturile în care activitatea enzimelor care fac parte din sistemul antioxidant este redusă sunt mai predispuse la alterările produse de Doxorubicină (ex. cardiomiocite) (James Kang, Chen and Epstein, 1996).
– alchilarea constituenților celulari macromoleculari,
– formarea unor legături încrucișate,
– peroxidarea lipidelor (Muindi et al., 1984),
– alterarea membranelor celulare,
– influențarea producerii de ceramide,
– lezarea ADNmt (Lebrecht et al., 2005) și alterarea proceselor bioenergetice care se produc la nivel mitocondrial (Tokarska-Schlattner et al., 2006),
– inducția p53 și apoptoza (Gewirtz, 1999);(Chen et al., 2007),(Takemura and Fujiwara, 2007),(Gianni et al., 2008),(Menna, Salvatorelli and Minotti, 2008),(Gewirtz DA, 1999),(Xu, Persson and Richardson, 2005),(Kotamraju et al., 2000),(Ruiz-Ruiz et al., 2003). Dozele terapeutice de Doxorubicină pot induce ligandul CD95‐L care interacționează cu receptorul CD95 (denumit și TNFRSF6) (Friesen, Fulda and Debatin, 1999) și pot declanșa apoptoza (Fig. 47).
– alterarea altor enzime (ex. Doxorubicina poate inhiba revers transcriptazele) (Tomita and Kuwata, 1976).
Importanța acestor mecanisme s-a reevaluat în ultimii ani. Spre exemplu, studii mai recente nu au putut să demonstreze că stresul oxidativ și peroxidarea lipidelor contribuie semnificativ la efectele antitumorale ale antraciclinelor (Šimůnek et al., 2009),(Myers et al., 1977),(Wu and Hasinoff, 2005),(Gewirtz DA, 1999),(Minotti et al., 2004).
Fig. 47. Principalele consecințe ale administrării Doxorubicinei
1.2 Metabolismul Doxorubicinei
DOX este metabolizată preponderent la nivel hepatic unde nucleul chinonic al Doxorubicinei intră în ciclul redox (Herman, El-Hage and Ferrans, 1988),(Todorova et al., 2010). Aproximativ 50% din cantitatea de citostatic administrată este eliminată fără să fie metabolizată (Mordente et al., 2009). În decurs de 5 zile, ~40% din doza administrată se regăsește în bilă iar 5-12% din citostatic și din metaboliții săi se regăsesc în urină (No Title, no date a).
Cele mai multe studii sugerează că metabolismul Doxorubicinei are 3 componente mai importante:
– calea metabolică primară constă în reducerea Doxorubicinei cu doi electroni și formarea unui alcool secundar (Doxorubicinol) (Mordente A, 2009).
– reducerea unui electron și formarea Doxorubicin-semiqinonei (Minotti, 1989); reacția este catalizată enzimatic (ex. xantinoxidaza și sintetaza oxidului nitric) (Pawłowska et al., 2002),(Thornalley, Bannister and Bannister, 1986),(Nohl, Gille and Staniek, 1998).
– deglicozilarea enzimatică (realizată probabil de xantin-oxidaza, NADPH-citocrom P450 reductaza și citosolic NADPH dehidrogenaza) presupune reacții de reducere sau hidroliză; această cale metabolică conduce la Doxorubicin deoxaglicone sau Doxorubicinol hidroxaglicone ((Licata et al., 2000),(Mordente A, 2009),(Thorn et al., 2011).
1.3 Toxicitate și reacții adverse
Toxicitatea Doxorubicinei depinde și de modul de administrare, de organismul model utilizat pentru testare (Pugazhendhi et al., 2018) și de perioada de timp cuprinsă între administrarea Doxorubicinei și cuantificarea modificărilor citogenetice.
Doxorubicina se administrează mai ales prin injectare intravenoasă (IV). Administrarea prin gavaj nu este indicată deoarece Doxorubicina neîncapsulată este instabilă în mediu acid (ex. în timpul pasajului gastric). Studiile efectuate pe animale susțin această observație și indică o absorbție extrem de redusă a citostaticului la nivelul tractului gastrointestinal (Higginson and DeVita, 1980).
Tabel 80. LD50 pentru Doxorubicină (Higginson and DeVita, 1980),(Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials, 2004).
Stresul oxidativ (Takemura G, 2007), mutațiile, apoptoza și inflamația care apar după administrarea de Doxorubicină pot avea efecte nefavorabile în diferite tipuri de țesuturi și organe (ex. inimă, rinichi, măduva osoasă, testicule) (Simůnek T, 2009),(Yagmurca et al., 2004),(Prahalathan et al., 2006).
Stresul oxidativ este prezent în diferite condiții patologice, inclusiv la pacienții cu cancer mamar (Opanuraks et al., 2010),(Soini et al., 2011). Speciile reactive de oxigen produse în exces pot acționa prin mecanisme:
– directe – oxidează și alterează diferite macromolecule (ex. lipide, proteine, ADN); speciile reactive de oxigen predispun la instabilitate genomică și cresc rata cu care apar mutații, fenomene care cresc riscul inducerii unor noi transformări neoplazice (ex. pacienții tratați cu antracicline, inclusiv clorhidrat de Doxorubicină, dezvoltă mai frecvent leucemii mielogene secundare);
– indirecte –activează căi de semnalizare celulare sensibile la stres (ex. JNK (Zhang et al., 2013), p38MAPK, ERK1/2) (Sankar et al., 2015).
Doxorubicina, în funcție de doză și de capacitatea de regenerare a măduvei osoase, poate induce supresia măduvei osoase, leucopenie, trombocitopenie și anemie. Intensitatea maximă a mielosupresiei este observată în a doua săptămână de tratament. În forme mai severe ea predispune la infecții grave, șoc septic și chiar deces.
Cardiotoxicitatea indusă de antracicline depinde de particularitățile expunerii. Incidența acestei manifestări este de 1-20% dacă Doxorubicina este administrată la fiecare 3 săptămâni, iar doza cumulată este 300-500 mg/m2. Sensibilitatea la cardiotoxicitate prezintă variații interindividuale semnificative; există pacienți care tolerează doze cumulate de Doxorubicină care depășesc 1g/m2 în timp ce alți pacienți prezintă modificări histopatologice caracteristice chiar dacă dozele cumulate de citostatic sunt mai mici de 300 mg/m2. Doxorubicina alterează ADN, în celulele normale și în celulele tumorale. Se consideră că alterarea ADN reprezintă un eveniment precoce în moartea cardiomiocitelor indusă de DOX (L'Ecuyer T, 2006).
Au fost descrise trei tipuri de cardiotoxicitate indusă de antraciclină:
– tranzitor acut- această manifestare destul de rară poate să apară după expunerea la o singură doză de citostatic;
– cronic, subacut – apare de obicei în primul an de la terapia cu antracicline; din punct de vedere clinic și al frecvenței este considerată cea mai importantă toxicitate asociată administrării antraciclinelor;
– cu debut tardiv.
Doxorubicina poate induce reacții inflamatorii la nivelul diferitelor organe (ex. ficat, rinichi, intestin) și vase de sânge (Leal et al., 2014).
Alte reacții adverse raportate după administrarea de Doxorubicină sunt: celulita, tromboflebita, limfangita sau indurația dureroasă, limitarea mobilității articulațiilor adiacente, stomatită și esofagită (mucozită); ulcerația și necroza colonului; alopecia completă; febră, frisoane, urticarie; neurotoxicitate periferică; oligospermie sau azoospermie sau necroză tisulară locală (dacă se produce extravazarea Doxorubicinei). Reacții adverse similare au fost identificate și la animalele expuse la citostatic. Studii pe animale (șoareci Swiss albino) au indicat că Doxorubicina induce întârzierea diviziunii nucleare și alterarea spermatogenezei (Attia, 2011).
2. Modularea efectelor citogenetice ale Doxorubicinei
În prezent se încearcă identificarea unor substanțe (naturale sau artificiale) care să crească eficiența tratamentelor antitumorale și să protejeze celulele normale de efectele secundare ale acestor tratamente. Administrarea de antioxidanți (ex. metalotioneina, desferrioxamina (Halliwell, 1985), vitamina A (Gülkaç MD, 2004), nicotinamida (Oktem et al., 2011), vitamina C (Amara-Mokrane YA, 1996), WR-1065 (metabolitul activ al amifostinei) (Dragojevic-Simic et al., 2013) poate reprezenta o strategie pentru reducerea stresului oxidativ și a leziunilor pe care acesta îl produce în diferite organe și țesuturi (Quiles JL, 2002). La șobolani s-a observat că genotoxicitatea Doxorubicinei (3μg/g la fiecare două zile, pe parcursul unei perioade de două săptămâni) se reduce cu 50% dacă acesta se administrează intraperitoneal, la o oră după administrarea de L-carnitină (100 μg/g) (Ola et al., 2000).
Utilizarea terapeutică a antioxidanților sintetici este limitată de unele dintre proprietățile lor (Yagmurca et al., 2004). În consecință s-au încercat strategii alternative care să crească eficiența sistemelor antioxidante endogene prin administrarea unor nanoparticule (ex. nanoparticule de seleniu), suplimente alimentare sau extracte vegetale (ex. extracte obținute din C. spinosa (în culturi de H9c2)(Mousavi et al., 2016), Salvia rosmarinus (Abdella and Ahmed, 2009), Nigella sativa, alfa-hederin, clorofilin (Amara-Mokrane YA, 1996), ulei de măsline (Antunes and Takahashi, 1999). Nanoparticulele de seleniu pot influența activitatea selenoenzimelor (ex. glutation peroxidaza, tioredoxin reductaza) și astfel pot diminua efectele stresului oxidativ indus de citostatic (Brigelius-flohé and Maiorino, 2013),(Horky et al., 2016). Proteine care fac parte din sistemele de apărare antioxidantă se exprimă și la nivelul glandei mamare și a măduvei osoase la șoarece și la om iar disfuncția lor poate să fie importantă pentru apariția efectelor secundare ale Doxorubicinei.
Se estimează că factorii care cresc stresul oxidativ pot accentua efectele toxice ale Doxorubicinei. Efectele acestor asocieri au fost însă mai puțin investigate. Spre exemplu, pre-tratamentul celulelor HeLa cu Doxorubicină hidroclorit (10 μg/ml) înainte de iradiere cu diferite doze de radiații gamma (0; 0,5; 1; 2; Gy) crește semnificativ frecvența cu care apar micronuclei, comparativ cu tratamentele administrate separat (Jagetia and Nayak, 2000).
Dieta reprezintă un alt factor care poate interfera cu efectele medicamentelor. Un exemplu este dieta bogată în lipide care poate să inducă stres oxidativ, alterarea apetitului și a epiteliului intestinal (mai ales la animalele tratate cu citostatice), modificarea greutății animalelor.
Lipidele alimentare sunt absorbite în jejun (~90%) și ileon (~8%) sau sunt eliminate pin fecale (~2%). Absorbția constituenților lipidici la nivel intestinal depinde de o serie de proteine (FAT / CD36 (Drover et al., 2008), (FATP-4) (Stahl et al., 1999),(Shim et al., 2009) și mecanisme (ex. mecanismul de flip-flop cu acid gras). În enterocite, trigliceridele sunt resintetizate iar chilomicronii asamblați sunt eliberați în circulația sanguină (via circulația limfatică) (Adeli and Lewis, 2008). Preluarea colesterolului alimentar de către celulele epiteliale implică proteine (ex. NPC1L1 și probabil receptorii SR-B1 și CD36). Sterolii dietetici (inclusiv colesterolul) pot să fie exportați din enterocit în lumenul intestinal (proteinele ABCG5 și -8) (Sabeva, Liu and Graf, 2009). Colesterolul se poate sintetiza de novo în celulele epiteliale (Feingold, Lear and Moser, 1984) și apoi exportat (împreună cu TG) prin chilomicroni.
Organismul produce energia necesară preponderent din glucide. In absența aportului adecvat de glucide, corpul va utiliza lipidele ca sursă de energie. Modificarea dietei (ex. diete hipercalorice, de tip occidental) în condiții experimentale determină utilizarea lipidelor ca sursă de energie.
Dieta bazată pe lipide este solicitantă pentru organism; diferite organe (ex. intestin, ficat) reacționează astfel încât să se adapteze la încărcarea cu grăsimi. Dacă este depășită capacitatea de adaptare a organismului atunci crește riscul dezvoltării unor condiții patologice. Efectele dietei bogate în lipide sunt destul de heterogene. Ea poate determina:
– dezechilibru energetic (E.A., K.T. and K.M., 2015);
– reacții adaptative coordonate care cresc capacitatea de digerare, suprafața de absorbție intestinală (Singh et al., 1972) și rata de metabolizare a unor cantități mari de lipide (ex. trigliceride, steroli și fosfolipide) (Iqbal and Hussain, 2009). Spre exemplu: crește secreția de lipoproteine (Unger and Orci, 2002) și expresia genelor care codifică pentru enzime implicate în absorbția și procesarea lipidelor (ex. supra-exprimarea enzimelor care participă la β și ω lipooxidare pentru a crește rata de oxidare a acizilor grași) (Petit et al., 2007),(de Wit et al., 2008),(Kondo et al., 2006);
– reacții care au rolul de a diminua efectele lipotoxice (ex. dieta hiperlipemică a fost asociată cu creșterea ratei de apoptoză la șobolani) (Gniuli et al., 2008) exercitate asupra celulelor epiteliale din intestinul subțire;
– modificări bichimice sanguine; dieta de tip vestic crește nivelurile colesterolului plasmatic la șoareci. Dieta bogată în lipide crește și producția de corpi cetonici care reduc semnificativ apetitul și, în timp, greutatea corpului; în consecință compoziția corpului se poate modifica (se modifică raportul dintre procentul de țesut gras și de țesut slab din organism);
– grade reduse de inflamație sistemică (Duan et al., 2018)
și inflamație în diferite țesuturi și organe (ex. intestin, ficat, țesut adipos sau muscular, sistemul nervos central – inclusiv hipotalamus) (Guillemot-Legris et al., 2016); ele pot altera desfășurarea reacțiilor metabolice care se produc în celulele active metabolic (inclusiv enterocite). Dieta bogată în grăsimi și nivelurile crescute de acizi grași pot indice inflamazomii (într-o manieră dependent de ROS-autofagie-protein kinază activată de AMP) (Wen et al., 2011). La șoareci, s-a raportat că după 16 săptămâni de dietă bogată în lipide, crește producția speciilor reactive de oxigen și supraexprimarea citokinelor inflamatorii (Kawasaki et al., 2012);
– supraproducție de ROS, stres oxidativ (Erdemir et al., 2012) și activarea unor căi de răspuns la stres indus de către acizii grași liberi și de supraîncărcarea ectopică cu acizi grași. Radicalii liberi (ex. superoxid, oxid nitric, hidroxil) și alte specii reactive (ex. apă oxigenată, peroxinitrit, acid hipocloros) se formează în corp și în condiții fiziologice (în principal, ca rezultat al reacțiilor din metabolismul aerobic). Producția acestor radicali crește foarte mult în cazul unei diete bogate în lipide.
3. Investigarea aberațiilor citogenetice induse de către Doxorubicină
Genotoxicitatea Doxorubicinei a fost sugerată încă din 1977-1978 (Benedicl, Baker and Ames, 1977),(Lee and Dixon, 1978). Studiile realizate în anii 1980-2000 au arătat că expunerea bacteriilor (Salmonella typhimurium) (Cebula, 1986), culturilor celulare (ex. celule B16-BL6 sensibile la Doxorubicină, celule ovariene de hamster chinezesc, limfocite umane) (Slovak, Hoeltge and Ganapathi, 1986),(Antunes et al., 1999),(Amara-Mokrane YA, 1996) și animalelor (ex. pești Boleophthalmus dussumieri) (Gadhia et al., 2008) la citostatic crește rata aberațiilor cromozomale numerice și structurale. Unele anomalii citogenetice apărute după expunerea la Doxorubicină sunt asociate cu dobândirea rezistenței la citostatic (Hoeltge and Trent, 1987).
Doxorubicina predispune la producerea rupturilor ADN (mono sau dublu-catenare) și mutațiilor de dimensiuni variabile (mici, punctiforme sau mari, care afectează structura sau numărul cromozomilor) (Singh and Gupta, 1983),(Yu, Xu and Hsie, 1994), în celule normale și tumorale (Au and Hsu, 1980), (Larramendy et al., 1980),(Quiles JL, 2002). Alterarea materialului genetic pare să fie destul de bine corelată cu efectul anti proliferativ al citostaticului.
La pești (Boleophthalmus dussumieri) s-a observat că modificările citogenetice care apar depind de perioada de timp cuprinsă între administrare și analiză: după 24 ore se regăsesc aberații de tip cromatidian (ex. Gap, rupturi, interschimburi) iar după 4 ore sunt prezente aberații cromozomale (ex: inelari, dicentrici, translocații). De asemenea, după 24h de la administrarea unor doze de Doxorubicină care au depășit 40µg/10g corp, au fost identificate anomalii cromozomale complexe sau chiar distrugerea complementului cromozomal (Gadhiai PK, 2008).
La șobolani s-a constatat că injecția intraperitoneală de Doxorubicină (3mg/kg corp) crește semnificativ incidența aberațiilor cromozomale în măduva osoasă (Ola et al., 2000). Și în alte studii s-a raportat un efect similar (30 mg/kg corp) (Ciaccio et al., 1993), (Antunes and Takahashi, 1998),(Tavares et al., 1998).
La șoareci s-a raportat că frecvența rupturilor cromozomale în măduva osoasă atinge un maxim în intervalul cuprins între 5-24h după administrarea Doxorubicinei. Însă în celule care supraviețuiesc tratamentului (ex. spermatogonii) modificările induse de citostatic se pot identifica și după perioade mai îndelungate de timp (Au WW, 1980). Într-un alt studiu s-a estimat că după 12 ore de la administrarea Doxorubicinei unele celule din măduva osoasă au trecut prin cel puțin două cicluri celulare (Larramendy ML, 1980). În experimentul pe care l-am realizat, în perioada cuprinsă între administrarea citostaticului și prelevarea măduvei osoase unele celule au trecut printr-un număr semnificativ de cicluri celulare (până la 28 de cicluri celulare). In timpul acestor rude de diviziune unele modificări citogenetice se pierd iar rezultatele obținute prin analiza citogenetică convențională oferă doar o imagine limitată a întregului spectru de modificări citogenetice induse de DOX.
Modificările genetice induse de citostatice se pot investiga prin estimarea frecvenței aberațiilor cromozomale (Klimova Yu., Novitsky and Goldberg, 1990), micronucleilor sau a schimbului de material genetic între cromatidele surori (SCE) și prin cuantificarea gradului de fragmentare al ADN (Fram, Egan and Kufe, 1983),(Ratain and Rowley, 1992).
Analizele citogenetice se pot utiliza pentru a determina proprietățile mutagenice ale compușilor chimici (recomandarea Committee on Mutagenicity Guidelines of the Department of Health, UK) (‘Guidelines for the testing of chemicals for mutagenicity. Committee on Mutagenicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment.’, 1989). Aceste metode pot fi considerate clasice sau la granița dintre metodele citogenetice și cele moleculare (metode de citogenetică moleculară). Analiza citogenetică convențională este considerată în prezent o procedură de rutină pentru identificarea aberațiilor cromozomale care apar la nivelul unei singure celule. Aberațiile cromozomale dobândite, numerice sau structurale, pot fi evidențiate în măduva osoasă prelevată de la diferite animale model. Acest studiu s-a focalizat pe efectele citogenetice care au tendința de a se fixa (efecte tardive) după administrarea Doxorubicinei, adică pe analiza aberațiilor care încă sunt prezente după 3 sau 7 zile de la administrare (sau după 12-28 runde de diviziuni celulare).
Analizele citogenetice clasice se pot utiliza pentru investigarea celulelor care se divid activ sau la care diviziunea celulară poate fi indusă. Frecvent, pentru testele citogenetice se utilizează limfocite, celule din măduva osoasă (pentru diagnosticul postnatal sau pentru teste citogenetice) sau celule din vilozitățile coriale sau amniocite (pentru diagnosticul prenatal).
Investigarea efectelor induse de citostatice poate viza două momente diferite: alterarea generală a ADN și investigarea aberațiilor cromozomale.
4. Parte practică
Pentru realizarea acestui studiu s-au realizat colaborări cu Institutul de Bioresurse Alimentare și departamentul de Genetică al Facultății de Biologie, București.
4.1 Obiectivele studiului
Principalele efecte ale acestui studiu sunt:
– testarea efectelor citogenetice ale unor doze reduse de Doxorubicină;
– testarea efectului dietei bazată pe lipide asupra efectelor dozelor reduse de Doxorubicină.
4.2 Justificarea studiului
Realizarea acestui studiu este justificată prin:
– Doze: efectele citogenetice ale dozelor reduse de Doxorubicină au fost puțin investigate;
– Calea de administrare: s-a ales administrarea intra-peritoneală deoarece s-a observat că o parte dintre efectele secundare ale Doxorubicinei depind de calea de administrare, iar efectele secundare administrării intraperitoneale par să fie mai reduse (Gilliam et al., 2011).
– Durata de urmărire post administrare: a fost limitată la maxim șapte zile pentru a limita efecte toxice ale Doxorubicinei la nivelul diferitelor țesuturi și organe;
– dinamica în timp a aberațiilor cromozomale induse de Doxorubicină a fost investigată mai puțin; Cele mai multe studii s-au concentrat pe modificările care apar în primele 24-72 ore de la administrare.
– Analiza celulelor din măduva osoasă: efectele citogenetice ale Doxorubicinei sunt mai evidente în cazul celulelor care proliferează intens (ex. celule din tractul gastro-intestinal, precursorii gameților, celule din măduva osoasă);
– Dietă: – analiza consecințelor asocierii Doxorubicinei cu factori care pot să amplifice efectele stresului oxidativ a fost investigată mai puțin;
– definirea dietei bogate în grăsimi la animale (Buettner, Schölmerich and Bollheimer, 2007), efectele și mecanismele prin care ea contribuie la problemele de sănătate nu sunt complet înțelese;
– la șoareci, aportul crescut de lipide determină încă din primele 7 zile modificări la nivel intestinal (ex. crește capacitatea de secreție a lipoproteinelor intestinale postprandiale) (Cartwright and Higgins, 1999),(Hernández Vallejo et al., 2009);
– Importanța clinică: nu se cunosc condițiile în care o parte dintre pacienți dobândesc rezistență la Doxorubicină;
– Există similarități în ceea ce privește reactivitatea genomurilor murin și uman la citostatice și în ceea ce privește mecanismele prin care se pot “salva” celulele care dobândesc mutații.
4.3 Materiale și metode
În continuare sunt descrise principalele metode și tehnicile utilizate pentru analiza probelor biologice și interpretarea rezultatelor.
4.3.1 Substanța testată și doze utilizate:
În acest studiu a fost testat clorhidratul de Doxorubicină (Actavis) pentru soluție perfuzabilă (concentrație: 2 mg/ml).
Citostaticul a fost administrat intraperitoneal, în doză unică.
Dozele testate au fost 1,7; 1,9; 2,2; 2,6; 3,1; 3,8; 5,1; 7,7 mg Doxorubicină / kg corp.
Dozele selectate au fost alese astfel să fie mai mici în comparație cu dozele echivalente administrate în tratamentele oncologice (Thompson Coon, 2010) sau cu LD50.
Animalele din lotul control au fost tratate cu ser fiziologic prin administrare intraperitoneală. Volumul de ser fiziologic a fost calculat astfel încât să fie echivalent cu doza cea mai mare de citostatic care a fost administrată animalelor (7,7 mg Doxorubicină / kg corp).
4.3.2 Loturi de animale; condiții de găzduire și hrănire
În acest studiu au fost testate patru grupuri de șoareci, de sex masculin, care aveau 6-8 săptămâni în momentul includerii în studiu și greutatea de 21,33 ± 2,19 g (16,6- 28,41 g). S-au organizat patru grupuri de animale care au fost notate cu NFI (dietă normală I), NFII (dietă normală II), PGI (jumări I), PGII (jumări II). Fiecare lot a cuprins 36 animale (Fig. 48).
Perioada de pre-administrare
Animalele au primit o dietă specifică până la vârsta de 6-8 săptămâni când au fost incluse în experiment.
Perioada de pre-administrare a durat o săptămână (zilele 1-7 din experiment). În prima zi de experiment s-a inițiat dieta specifică pentru fiecare grup de șoareci: grupurile NFI și NFII au primit dieta normală iar grupurile PGI, PGII au primit jumări din carne de porc. Ulterior, tipul de dietă nu s-a schimbat până la sfârșitul experimentului. Animalele din grupurile PGI și PGII au primit jumări din carne de porc (jumări Poiana Mărului).
Fig. 48. Șoricei masculi BALBc, cu vârsta de 6-8 săptămâni
A) și B) șoricei activi, în perioada de pre-administrare;
C) și D) șoricei care prezentau manifestări de stres la 10 minute după administrare;
E) și F) șoricei care aveau tonus mult diminuat la 12 ore de la administrare.
Administrarea tratamentului
La începutul celei de-a 8-a zi, șoarecii au fost injectați i.p. cu 1,7; 1,9; 2,2; 2,6; 3,1; 3,8; 5,1; 7,7 mg Doxorubicină / kg corp sau cu soluție salină izotonică (0,02 ml / g) (Tabel 81).
Tabel 81. Reprezentarea principalelor etape parcurse în acest studiu
Perioada de urmărire post-administrare
Perioada de urmărire după administrarea citostaticului a fost stabilită la 3 sau 7 zile. În consecință șoarecii au fost sacrificați la sfârșitul zilelor 10 (grupuri NFI, IGP) și 14 (grupuri NFII, PGII) de la începutul experimentului (Fig. 47). Toxicitatea crescută și reacțiile adverse grave (ex. necroza țesuturilor din jurul locului de injecție, cardiotoxicitate, risc crescut de deces) au justificat limitarea perioadei de urmărire la maxim 7 zile post-administrare
Doi șoareci au murit în primele 4 ore după injectarea Doxorubicină; aceste animale au fost înlocuite cu șoareci care au fost tratați similar (greutate similară, dietă și doze identice de Doxorubicină). În consecință, un număr total de 144 șoareci BALBc au parcurs întregul experiment. Dintre acești șoareci, o parte au fost tratați cu Doxorubicină (n=128) iar ceilalți au constituit lotul control (n=16).
Modificările ponderale. Toți șoarecii au fost cântăriți în zilele 1, 8 (la administrarea tratamentului) și 10 (3 zile de la administrare); șoarecii din grupul NFII și PGII au fost cântăriți și în ziua 14 de la începerea experimentului (7 zile de la administrare) (Tabel 81).
Găzduirea animalelor: Temperatura ambientală a fost de 20–24°C iar umiditatea a fost cuprinsă în intervalul 55–65%; raportul lumină : întuneric a fost de 12 h : 12 h.
Hrana. Jumările utilizate pentru hrănirea animalelor au avut un conținut ridicat de grăsimi. 100 g din acest produs conține aproximativ grăsimi (65g; dintre care 26g acizi grași liberi), proteine, glucide, fibre și sare (1,6g). Jumările nu au conținut aditivi alimentari. În fiecare zi s-a calculat cantitatea de alimente consumate de animale (diferența dintre greutatea alimentelor înregistrată în zile succesive). Rezultatul obținut a avut un caracter estimativ, deoarece o parte din hrană putea să fie dispersată de animale prin așternut.
Pe tot parcursul experimentului hrana și apa (apă filtrată -Millipore) au fost ad libitum. Hrana și apa au fost schimbate în fiecare zi pe parcursul experimentului iar așternutul a fost schimbat la 3 zile.
Acest studiu a fost aprobat de Comitetul de Etică (IBA 342/16.5.2014).
4.3.3 Prelevarea probelor și obținerea preparatelor citogenetice
Materiale necesare pentru etapa de pre-prelevare și prelevare a materialului biologic au fost: containere, formol, vată, seringi și ace pentru administrare subcutanată sau intravenoasă, soluție de colchicină, foarfece, bisturiu, suport pentru disecție, tuburi Eppendorf, soluție hipotonă de KCl (75mM), pense.
Recoltarea probelor biologice a presupus parcurgerea următoarelor etape:
1. injectarea intraperitoneală a unei substanțe cu efect statmochinetic (colchicină) cu 1 oră înainte de începerea disecției. Colchicina blochează fusul de diviziune și încetinește foarte mult progresia ciclului celular; în consecință, numărul celulelor în metafază și prometafază crește foarte mult.
2. anestezia șoriceilor după o oră de la injecția cu colchicină. Instalarea anesteziei a fost stabilită prin testarea reflexului de clipire;
3. pregătirea pentru prelevarea materialului biologic – animalul a fost așezat cu partea dorsală pe placa de disecție iar membrele au fost fixate cu ace.
4. s-a efectuat un buton (la 1 cm deasupra regiunii genitale s-a ridicat tegumentul cu o pensă și s-a secționat cu o foarfecă).
5. s-a efectuat o incizie (cu bisturiul sau cu foarfeca) pornind de la butonul tegumentar spre fiecare membru posterior până la nivelul articulației genunchiului. Tegumentul s-a fixat cu bolduri pentru a evidenția mușchii coapsei care au fost ulterior îndepărtați;
6. s-au prelevat cele două oase femurale ale trenului posterior; s-au îndepărtat resturile de țesut muscular cu un bisturiu;
7. animalele au fost eutanasiate prin disecția crosei aortei.
Analizele citogenetice au fost efectuate pe celule din măduva osoasă prelevate de la toți șoarecii care au parcurs întregul experiment.
Materialele necesare pentru realizarea și analiza preparatelor citogenetice: amestec fixator (metanol: acid acetic glacial 3:1), lame și lamele; soluție colorant Giemsa (2%), apă distilată, microscop optic (x20, x40, x100).
Preparatele citogenetice au fost urmărite conform protocolului următor:
1. s-au îndepărtat epifizele și s-a păstrat diafiza; pentru a preleva măduva osoasă diafiza a fost prinsă cu o pensă. Canalul medular s-a spălat prin injectarea (cu o seringă prevăzută cu ac pentru injecție intravenoasă) unei soluții de KCl (1,5 ml soluție, 75mM); soluția de KCl care a ieșit din canalul medular și măduva osoasă au fost colectate în tuburi de 15 ml. Această etapă facilitează dispersarea cromozomilor în celulele care sunt turgescente (hipotonizare) și îmbunătățește posibilitatea de a identifica cromozomii și anomaliile cromozomale.
2. celulele care erau agregate s-au dispersat în soluția salină cu o pipetă Pasteur;
3. s-a centrifugat suspensia celulară (1000 RPM/ 1 minut);
4. s-a aruncat supernatantul astfel încât în tub a rămas puțină soluție salină (maxim 200 μL) în care s-a resuspendat sedimentul celular;
5. în fiecare tub s-au adăugat prin picurare 4 ml de soluție fixator proaspăt preparată (metanol: acid acetic glacial 3v:1v), rece (40C); în timpul fixării eprubetele au fost agitate ușor, continuu;
6. suspensia celulară s-a incubat la 40C (la frigider) pentru minim 2 ore; această etapă crește calitatea fixării și conservă mai bine structura cromozomilor;
7. s-au repetat pașii 4-6 de trei ori; după ultima centrifugare s-a păstrat în fiecare tub aproximativ 200 μL soluție în care s-a resuspendat sedimentul celular;
8. preparatele citogenetice s-au obținut prin picurarea suspensiei celulare (1-2 picături de suspensie au fost picurate de la o înălțime de aproximativ 30 de cm) pe o lamă de microscop; s-au realizat 2 lame/femur;
9. preparatele s-au păstrat la temperatura camerei (aproximativ 24 de ore) pentru a se usca și pentru a crește aderența dintre cromozomi și lamă;
10. lamele au fost imersate 7-8 minute într-un amestec colorant Giemsa (75 ml apă călduță și 6ml colorant Giemsa);
11. s-a îndepărtat excesul de colorant prin spălare sub jet de apă, apoi s-au păstrat la temperatura camerei, în zone ferite de praf, pentru a se usca;
12. analiza preparatelor citogenetice la microscopul optic (x100) a presupus identificarea a 100 metafaze, bine etalate, astfel încât să se poată analiza numărul și morfologia cromozomilor. Aberațiile cromozomale cuantificate au fost de tip numeric (poliploidia) sau structural (ex. Gap, deleții, translocări, fragmente acentrice, lacune și cromozomi lipicioși).
Lacunele și cromozomii lipicioși (fenomenul de stickiness) nu sunt considerate indicatori foarte buni ai afectării cromozomilor. În consecință, aceste modificări au fost înregistrate dar nu au fost incluse în numărul total de aberații și au fost excluse din analizele statistice ulterioare.
4.3.4 Prelucrarea statistică a datelor
Rezultatele au fost raportate ca valoare medie ± SD.
Procentul de câștig ponderal a fost calculat astfel:
În funcție de caracteristicile valorilor observate în loturile de animale, analiza statistică s-a realizat cu testele Fisher, Chi2, Chi2 corectat Yate, Mann-Whitney U Test Calculator (No Title, no date b), ANOVA (Analysis of variance) și analiza post-hoc.
ANOVA testează simultan împrăștierea valorilor unei variabile continue în mai multe eșantioane (compară mediile unei variabile în trei sau mai multe eșantioane).
In principiu, acest test compară variabilitatea mediilor tuturor grupurilor cu variabilitatea din jurul mediei fiecărui grup. Ipoteza nulă este acceptată (se consideră că mediile provin probabil din aceeași populație) dacă variabilitatea în interiorul grupului este similară cu variabilitatea mediei tuturor grupurilor. În caz contrar se estimează că eșantioanele nu provin din aceeași populație.
Raportul dintre varianța dintre grupuri și cea din grupuri este denumită F. Valorile F depind de numărul de grupuri comparate și de numărul scorurilor care se găsesc în fiecare grup. Pentru interpretarea rezultatelor este necesară calcularea DF care are două componente:
– DF corespunzător numărătorului testului F (corespunde variabilității dintre grupuri) depinde de numărul grupurilor testate (k). DF = k-1.
– DF corespunzător numitorului (corespunde variabilității în interiorul grupurilor)- depinde de numărul de grupuri (k) și de numărul scorurilor (n). În consecință, această componentă a DF este calculată cu formula k*(n-1).
Acest test are avantajul că, deși compară mai multe grupuri, pragul de semnificație statistică nu scade foarte mult. Principalul dezavantaj al acestui test apare atunci când diferențele deși sunt considerate semnificative nu poate preciza care sunt loturile care diferă semnificativ.
ANOVA cu 2 factori independenți
Atunci când testăm asocierea dintre o variabilă dependentă (continuă) și două variabile independente (variabile discrete) este necesar să putem distinge contribuția factorilor considerați separat de contribuția combinată a celor doi factori.
Analiza post-hoc
Dacă în urma unui test ANOVA se respinge ipoteza nulă (ipoteza privind egalitatea mediilor) se pot aplica teste de comparație multiplă, denumite și analize post-hoc; acestea identifică grupurile ale căror medii diferă semnificativ.
Există mai multe posibilități de analiză post-hoc. Dintre acestea, pentru acest studiu am ales metoda Tukey (honestly significant difference – HSD) deoarece:
– permite compararea tuturor perechilor de grupuri;
– această metodă este considerată suficient de conservativă (acceptă cel mai repede ipoteza nulă privind omogenitatea grupurilor);
– nu necesită o putere de calcul deosebită.
Pragul de semnificație statistică
Diferențele dintre valorile comparate au fost considerate semnificative din punct de vedere statistic dacă valoarea p<0,05.
5. Rezultate
Doxorubicina, similar altor citostatice, are o serie de efecte adverse care pot include anomalii ale celulelor și țesuturilor normale.
Agenții intercalanți (inclusiv Doxorubicina) modifică proprietățile moleculelor de ADN, alterează replicarea și transcripția genică și cresc rata cu care se produc mutații. În consecință funcționarea, capacitatea de multiplicare și de supraviețuire a celulelor este afectată.
În acest studiu s-a testat efectul citogenetic al Doxorubicinei și impactul pe care îl are dieta bogată în lipide asupra modificărilor induse de citostatic, în celulele din măduva osoasă a șoriceilor BALBc.
Principalele modificări citogenetice cuantificate au fost: delețiile, fragmentele acentrice, translocațiile (Robertsoniene, telomer la telomer, telomer la centromer, interschimburi complexe), tendințe de atracție și rozetare, double minutes, lacune (cromozomale și cromatidiene) și efilările.
5.1 Modificarea ponderală
La începutul experimentului greutatea medie a șoriceilor a fost de 21,33 ± 2,19g. Compararea statistică a datelor inițiale a demonstrat că greutatea animalelor din cele patru grupuri a fost similară la începutul experimentului (Anova unidirecțională: p> 0,05) (Tabel 82). Acest rezultat sugerează că diferențele de greutate observate între animale la începutul experimentului nu pot să fie considerate responsabile de răspunsul diferit al animalelor la tratamentele administrate.
Tabel 82. Compararea greutății animalelor la începutul experimentului (Anova, Single Factor); greutatea animalelor din cele patru loturi a fost similară
În primele 7 zile de la inițierea experimentului (perioada de pre-administrare) procentul de creștere ponderală a fost diferit la șoriceii care au primit dietă normală comparativ cu cei care au primit dieta alternativă, bazată pe jumări; câștigul ponderal în lotul cu dietă normală a fost aproape dublu, comparativ cu cel înregistrat de șoriceii care au avut dieta alternativă (NFI, NFII vs IGP, PGII: 5,26 ± 1,57% vs 2,98 ± 1,66%, p <0,00001).
După administrarea Doxorubicinei s-a observat o reducere a greutății corporale care poate să fie influențată de dietă și de doza de citostatic administrată (Fig. 49).
Fig. 49. Greutatea medie a șoriceilor (g) în cazul loturilor care au fost tratate cu Doxorubicină (linii continue) sau cu soluție salină (șoriceii controli –linie punctată). Tipul de dietă este indicat prin culori diferite (linia roșie – NF; linia albastră – PG).
În intervalul de timp cuprins între zilele 8-10, procentul de creștere ponderală pentru șoarecii controli a rămas pozitiv; în acest interval de timp câștigul ponderal pentru lotul șoarecii care au primit dietă normală a rămas semnificativ mai mare comparativ cu cel înregistrat pentru animalele control care au primit hrană bogată în lipide (3,36 ± 0,56 vs 1,41 ± 0,51, p = 0,0009).
Scăderea ponderală procentuală înregistrate în primele 3 zile după administrarea Doxorubicinei a fost mai redusă în cazul animalelor care au primit hrană normală comparativ cu cea înregistrată în cazul animalelor care au avut o dietă hiperlipemică (câștigul ponderal în zile 8-10 pentru NF vs PG: -14,47±4,56% vs -16,83±4,15%, p=0,0026). Aceste modificări au fost influențate de doza de citostatic administrată. Analiza post-hoc a evidențiat diferențe semnificative între dozele de citostatic administrate cu excepția celor mai reduse (1,7 vs 1,9 mg/kg corp) (Tabel 83,Tabel 84, Fig 4 A)
Tabel 83. Compararea modificărilor ponderale la 3 zile de la injectarea Doxorubicinei în funcție de doza de citostatic administrată (Anova: Single Factor)
Tabel 84. Analiza post hoc pentru compararea modificărilor ponderale la 3 zile de la injectarea Doxorubicinei în funcție de doza de citostatic administrată (Rezultate testului post-hoc Tukey HSD)
În intervalul cuprins între zile 10-14 s-a constatat că animalele din lotul NFII au avut un câștig ponderal care a fost mai mare comparativ cu cel înregistrat de animalele din lotul PGII. Cu toate acestea diferențele nu au fost semnificative din punct de vedere statistic (2,03 ± 0,71% vs 1,76 ± 1,02%, p> 0,05). S-a observat că deși în lotul NFII câștigul ponderal a continuat să scadă în lotul PG, câștigul ponderal a avut o ușoară tendință de creștere. Această creștere observată în lotul PGII poate să reflecte epuizarea rezervelor pe care le-au avut animalele în timpul celor 14 zile de dietă.
Câștigul ponderal procentual mediu înregistrat în intervalul cuprins între zilele 10-14 nu a fost influențat de doza de citostatic administrată.
Tabel 85. Compararea modificărilor ponderale în intervalul cuprins între zilele 10-14 (zile 4-7 de la injectarea Doxorubicinei) în funcție de doza de citostatic administrată (Anova: Single Factor)
Tabel 86. Analiza post hoc pentru compararea modificărilor ponderale înregistrate între zilele 10-14 (zile 4-7 de la injectarea Doxorubicinei) în funcție de doza de citostatic administrată (Rezultate testului post-hoc Tukey HSD) nu a identificat diferențe semnificative între animalele care au primit doze diferite de citostatic
Procentul de pierdere în greutate în primele trei zile după administrarea DOX a fost influențat de:
– doza de citostatic (Anova one way: p = 1,7E-28) (Fig. 50),
– tipul dietei (grupurile NFI, NFII vs PGI, PGII: -14,47 ± 4,56 vs -16,83 ± 4,15, p = 0,003) (Fig. 49). Testul post-hoc a evidențiat diferențe semnificative ale procentului de pierdere ponderală (Tukey HSD p <0,05) între diferite doze de DOX, cu excepția celor mai mici doze (1,7 și 2,9 mg / kg corp).
Pentru intervalul de timp cuprins între zilele 10-14 procentul de pierdere ponderală nu a fost asociat cu doza de citostatic (NFII vs. PGII: -2,25 ± 2,88 vs -1,83 ± 0,98, p = 0,52) sau cu tipul de dietă.
Interacțiunea dintre tipul de dietă și dozele de DOX nu a fost semnificativă în ambele intervale care au urmat administrării DOX (toate grupele: interacțiuni p = 0,68; grupuri NFII-PGII: interacțiuni p = 0,81).
A)
B)
Fig. 50. Câștigul ponderal procentual în perioada de post-administrare.
A) La trei zile (toate grupurile) sau B) la șapte zile (grupurile NFII-PGII) după injecția Doxorubicinei. În ambele grafice, datele sunt prezentate ca valoare medie și abatere standard p< 0,05 pentru diferența globală între loturi (one way ANOVA). Diferențele semnificative identificate de analiza post-hoc (testul Tukey HSD, p<0,05) sunt identificate prin litere (comparativ cu doza de Doxorubicină: 1,7 (a), 1,9 (b), 2,2 (c), 2,6 (d), 3,1 (e) sau 3,8 (f) μg/g corp șoarece).
Aportul alimentar
Primele 7 zile
Consumul de alimente nu a fost constant pe parcursul experimentului (Fig. 51). În primele 7 zile de la inițierea experimentului consumul mediu zilnic de alimente a fost de 4,71±0,6 pentru animalele care au primit o dietă normală și de 2,34±0,59g pentru lotul de animale care a primit o dietă bogată în lipide. Adică animalele expuse la o dietă bogată în lipide au avut un consum de alimente cu aproximativ 50% mai mic comparativ cu animalele care au avut o dietă normală.
Se poate observa că în cazul animalelor din loturile control aportul alimentar nu s-a modificat semnificativ după injectarea serului fiziologic.
Fig. 51. Cantitatea medie de hrană consumată zilnic de animale care au primit dietă normală și dietă bogată în lipide. Aportul alimentar se reduce semnificativ după administrarea Doxorubicinei.
Ulterior s-a analizat cantitatea medie zilnică de alimente consumată de animalele în primele 7 zile din experiment, în funcție de tipul de dietă.
În cazul animalelor care au avut o dietă normală (NFI și NFII) analiza Anova (one way) a evidențiat diferențe semnificative între cantitățile de alimente consumate de animale în primele 7 zile din experiment (p=3,49E-07) (Tabel 87). Pe baza acestui rezultat s-a realizat și analiza post hoc Tukey care a evidențiat că diferențele identificate prin Anova sunt cauzate de diferențele între cantitățile de alimente consumate de animale în ziua 1 comparativ cu zilele 2, 4, 5, 6 și 7 (p<0,01) (Tabel 88). Acest rezultat sugerează că în prima zi a experimentului animalele au consumat mai puține alimente, probabil din cauza stresului sau unui alt factor care nu a fost investigat.
Tabel 87. Compararea cantităților de alimente consumate zilnic de animalele din loturile NFI și NF2 în primele 7 zile din experiment (Anova: Single Factor). În prima coloană sunt prezentate zilele din experiment comparate.
Tabel 88. Analiza post hoc pentru compararea cantității medii zilnice de alimente consumate în primele 7 zile de animalele care au avut o dietă normală. Diferențele semnificative statistic (p<0,05) sunt indicate.
Ulterior s-au comparat datele înregistrate pentru animalele hrănite cu o dietă bogată în lipide (PGI și PGII). Analiza Anova a identificat existența unor diferențe semnificative (p=3,73E-23) între loturi (
Tabel 89). Analiza post hoc Tukey a arătat că diferențele semnificative există însă doar atunci când se compară cantitățile de alimente consumate în primele 3 zile din experiment și cele consumate în ultimele zile (p<0,05) (Tabel 90). Acest rezultat sugerează ca animalele au început să consume cantități semnificativ statistic mai mari de jumări după primele 3 zile de la introducerea dietei, dar în ziua a 5-a aportul de alimente s-a diminuat, pentru ca ulterior să revină.
Tabel 89. Compararea cantităților de alimente consumate zilnic de către animalele din loturile PGI și PG2 în primele 7 zile din experiment (Anova: Single Factor). În prima coloană sunt prezentate datele comparate (cantitățile de alimente consumate în zilele respective).
Tabel 90. Analiza post hoc realizată pentru a compara cantitățile (medii) zilnice de alimente consumată în primele 7 zile de către animalele care au avut o dietă bogată în lipide. Diferențele semnificative din punct de vedere statistic (p<0,05) sunt indicate.
În concluzie, datele prezentate în paragrafele anterioare arată că în primele 7 zile din experiment animalele care au primit o dietă normală au avut un consum care nu s-a modificat semnificativ (excepție cantitățile consumate în prima zi vs cele consumate în celelalte 6 zile). La animalele care au avut o dietă bogată în grăsimi aportul alimentar a crescut semnificativ din punct de vedere statistic după 3 zile de la introducerea acestei diete iar această creștere nu a fost constantă (ex. în ziua 5 consumul de alimente s-a diminuat).
Zilele 7-8
Șoarecii care au avut o dietă normală au consumat cu 75,35% (ziua 7 vs ziua 8: 4,82±0,60g vs 1,19±0,39g) mai puține alimente comparativ cu ziua precedentă. La animalele care au avut o dietă bogată în lipide consumul de alimente a scăzut cu 64% (ziua 7 vs ziua 8: 2,78±0,48g vs 1,00±0,20g).
Zilele 8-10
În intervalul de trei zile cuprins între zilele 8-10 consumul mediu de alimente/zi înregistrat pentru animalele care au primit hrană normală (NFI, NFII) a fost diferit din punct de vedere statistic (testul Anova p=2,31E-26) (Tabel 91). Analiza post hoc a evidențiat că în acest interval de timp consumul de alimente a crescut semnificativ in zilele 9 și 10 (Tabel 92).
Tabel 91. Compararea cantităților medii de alimente consumate de animalele din loturile NFI și NF2 în intervalul cuprins între zile 8-10 din experiment (Anova: Single Factor). În prima coloană este prezentată ziua din experiment
Tabel 92. Analiza post hoc pentru compararea cantităților medii zilnice de alimente consumate în zilele 8-10 de către animalele au avut o dietă normală (NF1 și NF2). Diferențele semnificative statistic (p<0,05) sunt indicate în tabel.
Zilele 11-14
În intervalul de timp cuprins între zilele 11-14 animalele care au avut o dietă normală (NFII) consumul de alimente a prezentat diferențe semnificative statistic (Anova Single Factor: p=4,82E-27) (Tabel 93); Analiza post hoc a indicat o creștere semnificativă a consumului de alimente în zilele 13 și 14 (Tabel 94).
Tabel 93. Compararea cantităților medii de alimente consumate de animalele din lotul NFII în intervalul de timp cuprins între zile 11-14 (Anova: Single Factor). În prima coloană este prezentată ziua de referință din experiment.
Tabel 94. Analiza post hoc pentru compararea cantității medii zilnice de alimente consumată între zilele 11-14 de către animalele care au avut o dietă normală. Diferențele semnificative statistic (p<0,05) sunt indicate.
Ziua 8-10
În intervalul de trei zile cuprins între zilele 8-10 animalele care au avut o dietă bogată în lipide (PGI, PGII) au consumat cantități diferite de alimente (testul Anova p=3,02E-30) (Tabel 95). Analiza post hoc a indicat că în intervalul de timp analizat consumul de alimente a crescut semnificativ în zilele 9 și 10 comparativ cu ziua 8 (Tabel 96).
Tabel 95. Compararea cantităților medii de alimente consumate/ zi de către animalele din loturile PGI și PGII în intervalul de timp cuprins între zilele 8-10 din experiment (Anova: Single Factor). În prima coloană este prezentată ziua de referință din experiment.
Tabel 96. Analiza post hoc efectuată pentru a compara cantitățile medii zilnice de alimente consumate în intervalul de timp cuprins între zilele 8-10 de către animalele au avut o dietă bogată în lipide (PGI și PGII). Diferențele semnificative statistic (p<0,05) sunt prezentate.
Zilele 11-14
În intervalul de timp cuprins între zilele 11-14 consumul mediu de alimente/ zi estimat pentru animalele din lotul PGII a indică existența unor diferențe semnificative din punct de vedere statistic (Anova (p=1,62E-14) (Tabel 97); analiza post hoc a indicat că aportul de alimente a crescut semnificativ începând cu ziua 13 (Tabel 98).
Tabel 97. Compararea cantităților medii de alimente consumate/ zi de către animalele din lotul PGII în intervalul de timp cuprins între zile 11-14 (Anova: Single Factor). În prima coloană este prezentată ziua analizată.
Tabel 98. Rezultatul analizei post hoc realizată pentru a compara cantitățile medii de alimente / zi consumate în intervalul de timp cuprins între zilele 11-14 de către animalele care au avut o dietă bogată în lipide. Diferențele semnificative statistic (p<0,05) sunt indicate.
Toate aceste rezultate arată că după expunerea la Doxorubicină animalele care au avut o dietă normală au început să consume semnificativ mai multe alimente începând din a doua zi (ziua 9 din experiment) după administrarea citostaticului și a continuat și în ziua următoare (ziua 10); un nou salt cantitativ s-a înregistrat în zilele șase (ziua 13) și șapte (ziua 14) după administrarea citostaticului.
În cazul animalelor care au avut o dietă bogată în lipide comportamentul alimentar a fost similar cu cel al animalelor care au avut o dietă normală (aportul alimentar a crescut semnificativ statistic tot în zilele 9, 10, 13 și 14. Aceste rezultate arată că animalele au un comportament relativ similar după administrarea Doxorubicinei și că aceasta nu este influențat semnificativ de tipul de dietă.
Cantitatea de alimente consumată de animale în prima zi după administrarea citostaticului pare să atingă o valoare similară indiferent de doza de citostatic administrată și de tipul de dietă (NF: 1,19±0,39g vs PG: 1,00±0,20g) (Fig. 52). Având în vedere consumul mediu de alimente/ zi înainte de administrare se poate spune că cel mai mult a scăzut aportul alimentar la animalele care au fost menținute pe dietă normală.
În primele 3 zile după administrarea Doxorubicinei scăderea ponderală înregistrată a fost mai redusă în cazul animalelor care au primit hrană normală comparativ cu cea înregistrată în cazul animalelor care au avut o dietă hiperlipemică (modificarea ponderală în zilele 8-10 a fost de NF: -14,47±4,56% vs PG: -16,83±4,15%, p=0,0026) deși aportul de alimente s-a redus cu 67,63% și respectiv 54,93% comparativ cu cantitatea de alimente consumată în ziua precedentă administrării. Se poate astfel observa că la animalele care au avut o dietă normală au scăzut mai puțin în greutate deși aportul alimentar a scăzut mai mult comparativ cu valorile observate la animalele care au primit o dietă hiperlipemică (Fig. 53).
În raport cu valorile medii raportată pentru intervalul de 3 zile postadministare în ultimele 4 zile din experiment aportul de alimente normale (1,56g vs 2,80g –echivalentul unei creșteri de 78,81%) sau bogate în lipide (1,25g vs 2,15g echivalent cu 71,53%) a crescut semnificativ.
În consecință se poate observă că după administrarea Doxorubicinei aportul alimentar a scăzut dramatic în prima zi după administrarea citostaticului. Ulterior comportament alimentar a crescut în trepte animalele (la 2-3 zile și 6-7 zile post administrare) indiferent de tipul de dietă pe care l-au urmat animalele.
Fig. 52. Consumul mediu de alimente/ zi în timpul celor 14 zile din experiment în funcție de doza de citostatic administrată. Animalele din lotul control au avut un consum de alimente care a crescut ușor pe toată durata experimentului. După administrarea de citostatice consumul de alimente s-a redus semnificativ în toate loturile mai ales în primele 24 de ore după administrare.
Fig. 53. Relația dintre scăderea ponderală și scăderea consumului de alimente înregistrate în primele 3 zile după administrarea Doxorubicinei, în funcție de tipul de dietă.
Fig. 54. Relația dintre scăderea ponderală și scăderea consumului de alimente înregistrate în intervalul cuprins între zilele 4-7 după administrarea Doxorubicinei, în funcție de tipul de dietă.
Aportul de apă
Se poate observa că în cazul animalelor din loturile control consumul mediu de apă nu s-a modificat semnificativ după injectarea serului fiziologic.
Primele 7 zile
Aportul de apă s-a modificat pe parcursul experimentului (Fig. 55). În primele 7 zile consumul de apă a crescut semnificativ începând cu a 3-a zi din experiment. În primele 7 zile din experiment animale care au avut o dietă normală și cele care au primit o dietă bogată în lipide au consumat cantități similare de apă (4,24±0,45g apă/zi vs 4,26±0,45g apă/ zi). Consumul de apă contrastează cu aportul alimentar (animalele care au avut o dietă bogată în lipide au consumat cu 50% mai puține alimente comparativ cu cele care au avut o dietă normală).
Fig. 55. Consumul zilnic de apă a scăzut semnificativ după administrarea Doxorubicinei.
Cantitatea de apă consumată de animale în primele 7 zile din experiment (Analiza Anova one way) a evidențiat diferențe semnificative (1,96E-15) (Tabel 99). Analiza post hoc Tukey a indicat diferențe semnificative importante între consumul de apă înregistrat în primele 3 zile și următoarele 4 (p<0,01) (Tabel 100).
Tabel 99. Compararea cantităților de apă consumată zilnic în primele 7 zile din experiment (Anova: Single Factor). Prima coloană prezintă zilele din experiment.
Tabel 100. Compararea cantităților de apă consumată zilnic în primele 7 zile din experiment (Analiza post hoc). Diferențele semnificative statistic (p<0,05) sunt indicate.
Zilele 7-8
Consumul de apă în primele 24 ore după injectarea citostaticului s-a diminuat cu -50,66% (ziua 7 vs ziua 8: 4,39±0,4g vs 2,17±0,27g) în cazul șoarecilor care au avut o dietă normală și cu -48,02% (ziua 7 vs ziua 8: 4,45±0,41g vs 2,31±0,29g) în cazul celor care au avut o dietă hiperlipemică.
Zilele 8-10
Consumul de apă analizat în subloturilor de animale stratificate în funcție de tipul de dietă a prezentat diferențe semnificative statistic între zilele 8 -9 și 9-10 (Analiza post hoc p<0,01). Acesta nu este influențat semnificativ de interacțiunea dintre tipul de dietă și durata de la administrarea citostaticului (Anova Two-Factor With Replication p=0,2) (Tabel 101).
Tabel 101. Investigarea interacțiunii dintre timp (durata de la administrare) și tipul de dietă (Anova: Two-Factor With Replication, zilele 8-10).
Zilele 11-14
În intervalul de timp cuprins între zilele 11-14 consumul mediu de apă/ zi nu a fost influențat semnificativ de interacțiunea dintre dietă și timp (p=0,11) (Tabel 102). În subloturile de animale stratificate în funcție de tipul de dietă s-a constatat că aportul de apă crește semnificativ între 11, 12, 13 și 14 (Analiza post hoc Tukey HSD: p<0.01).
Tabel 102. Investigarea interacțiunii dintre timp (durata de la administrare) și tipul de dietă (Anova: Two-Factor With Replication, zilele 8-10).
Aceste date arată că aportul de apă în primele 2 zile după administrarea citostaticului se reduse cu -60,20% (4,39±0,4 vs 1,75±0,24) în lotul de animale care a primit o dietă normală și cu -54,44% (4,45±0,41 vs 2,03±0,51) în cazul animalelor care au primit o dietă hiperlipemică. În zilele următoare consumul de apă a crescut semnificativ. Cu toate acestea după 7 zile de la administrare consumul de apă rămâne cu -16,64% (4,39±0,4 vs 3,66±0,4) mai redus în lotul de animale care a primit o dietă normală și cu -15,10% (4,45±0,41 vs 3,78±0,4) mai redus în lotul care a primit dietă hiperlipemică (Fig. 56).
Se observă că în intervalul de timp cuprins între zilele 10 și 14 greutatea animalelor continuă să scadă deși aportul de alimente și de apă cresc (Fig. 55, Fig. 57). Aceste date sugerează că reducerea ponderală în intervalul cuprins între zilele 4 -7 după administrarea citostaticului poate să reflecte alterarea enterocitelor.
A)
B)
Fig. 56. Reprezentarea relației dintre scăderea ponderală înregistrată de animalele care au primit dietă normală sau dietă hiperlipemică și scăderea consumului de apă observată la 3 (A) sau la 7 (B) zile de la administrarea Doxorubicinei.
Fig. 57. Reprezentarea grafică a greutății corporale (g), consumului de alimente (g) și apă (g) de către animalele care au primit dietă normală sau hiperlipemică în zilele 1, 7, 10 și 14.
5.2 Modificări citogenetice induse de Doxorubicină
S-a observat o corelație lineară negativă între modificarea ponderală și numărul total de aberații citogenetice sau numărul de deleții identificate la trei (-0,76 și respectiv -0,7) sau la șapte (-0,66) zile după administrarea citostaticului.
Frecvența aberațiilor citogenetice poate să fie influențată de dozele de Doxorubicină utilizate și de interacțiunea lor cu tipul de dietă sau cu perioada de urmărire post-administrare.
Toate dozele de Doxorubicină testate au crescut frecvența poliploidiilor, delețiilor cromatidiene, fragmentelor acentrice și translocațiilor Robertsoniene, comparativ cu valorile acestor aberații observate în lotul control (Tabel 80,Tabel 81) (p<0,0001).
Numărul total de aberații citogenetice, poliploidii (Fig 107) și deleții prezintă diferențe semnificative între animalele care au fost tratate cu diferite doze de citostatic (ANOVA one way p<0,0003). Diferențele au fost semnificative și atunci când valorile corespunzătoare dozelor reduse cu fost comparate cu cele mari (5,1 or 7,7 mg/kg corp) (post hoc Tukey HSD p<0,05).
A fost identificată o interacțiune semnificativă între doza de Doxorubicină și dietă în cazul poliploidiilor (two ways ANOVA p= 4,5E-11). Frecvența poliploidiilor a crescut semnificativ la șoarecii care au fost injectați cu 5,1 sau 7,7 mg DOX /kg corp (cele mai mari doze) și dieta bazată pe jumări, comparativ cu cei care au primit o dietă normală (p<0,009) (Fig. 59).
Interacțiunea dintre dozele de DOX și perioada de urmărire post-administrare nu au influențat semnificativ frecvența aberațiilor citogenetice identificate în acest studiu (p>0,05).
Principalele rezultate obținute în cadrul lucrării sunt prezentate sub forma valorilor medii, în tabelul următor (Tabel 103).
Modificările citogenetice care au fost contorizate dar nu au fost incluse în prelucrarea statistică a datelor deoarece semnificația lor biologică nu este cunoscută sunt prezentate separat (Fig. 57, Fig. 58).
Tabel 103. Modificări citogenetice identificate în cele patru loturi de animale. Datele sunt prezentate sub forma valorilor medii.
Fig. 58. Distribuția numărului mediu de aberații citogenetice observate în funcție de doza de Doxorubicină administrată. Datele sunt prezentate ca valoare medie ± SE în toate graficele. p<0,05 pentru diferența globală (one-way ANOVA) a fost detectat pentru numărul total de aberații citogenetice (Fig 10A), poliploidii (Fig 10B) și deleții (Fig 10C). Diferențele semnificative (p<0,05) identificate prin analiza post-hoc Tukey HSD test sunt indicate prin litere (comparativ cu 1,7 (a), 1,9 (b), 2,2 (c), 2,6 (d) 3,1 (e), 3,8 (f) or 5,1 (g) mg/kg corp Doxorubicină).
A)
B)
Fig. 59. Numărul mediu de poliploidii după (A) 3 (NFI vs PGI) sau (B) 7 (NFII vs PGII) zile după injecția intraperitoneală a Doxorubicinei în funcție de tipul de dietă pe care au primit-o animalele. Datele sunt prezentate ca valoare medie ± SD în ambele grafice. p<0,05 pentru diferența globală (two-way ANOVA) a fost detectat în ambele cazuri. Diferențele semnificative statistic sunt indicate prin * (p<0,05) sau ** (p<0,002).
A)
B)
C)
Fig. 60. Distribuția modificărilor citogenetice care, deși nu au o semnificație biologică certă, au fost contorizate dar nu au fost utilizate în prelucrarea statistică. Datele sunt prezentate corelat cu doza de Doxorubicină pe care au primit-o șoriceii; Modificările prezentate sunt A) Atracții cromozomale; B) Tendință de rozetare; C) Efilări
A)
B)
C)
Fig. 61. Distribuția modificărilor citogenetice care, deși nu au o semnificație biologică certă, au fost contorizate dar nu au fost utilizate în prelucrarea statistică. Datele sunt prezentate corelat cu doza de Doxorubicină pe care au primit-o șoriceii; Modificările prezentate sunt A) Lacune cromatidiene; B) Atracții telomer la telomer; C) Atracții telomer la centromer
A) B)
C) D)
E) F) G)
H)
Fig. 62. Principalele modificări citogenetice induse de administrarea de Doxorubicină (A-cromozomi inelar, B- atracție centromer la centromer și telomer la centromer; deleție cromatidiană); C deleție cromatidiană; D) fragmente acentrice; E) translocație Robertsoniană; F) fragment acentric; cromozom inelar. G) elilare; H) GAP cromatidian.
6. Discuții
Doxorubicina este un citostatic utilizat frecvent în tratamente oncologice complexe, deoarece reduce viabilitatea celulelor tumorale și poate determină moartea lor. Doxorubicina intranucleară determină, prin diferite mecanisme (ex. principalul mecanism pare să fie inhibarea topoizomerazei II), modificări (ex inhibă replicarea, transcripția, predispune la mutații) care sunt importante pentru inhibarea proliferării celulelor. Producerea, acumularea și reversia leziunilor ADN induse de citostatice reprezintă elemente centrale în supraviețuirea celulelor expuse la citostatice (Binaschi M, 1990) și în eficiența chimioterapiei. In consecință, înțelegerea toxicității (la nivel celular sau nuclear) citostaticelor este necesară pentru a înțelege mai bine mecanismele de acțiune ale medicamentelor și pentru a dezvolta strategii prin care se poate reduce frecvența și intensitatea reacțiilor adverse.
Capacitatea mutagenică a Doxorubicinei a fost evidențiată prin studii efectuate pe diferite sisteme de testare. Cu toate acestea, dinamica în timp a aberațiilor produse de citostatic a fost investigată mai puțin.
Studiile efectuate pe diferite modele animale murine au arătat că Doxorubicina induce aberații cromozomale în celulele din măduva osoasă (Au WW, 1980) iar efectele modificării dietei se pot vedea după câteva zile.
În consecință, am evaluat efectele clastogenice pe care le induce expunerea acută la Doxorubicină în celulele din măduva osoasă de la șoareci. Au fost testate 8 doze de Doxorubicină iar efectele au fost evaluate după trei sau șapte zile de la administrare.
Principalele rezultate obținute în cadrul acestui studiu sunt discutate în paragrafele următoare.
6.1 Durata studiului
Larramendy ML și colaboratorii au raportat că după 12 ore de la administrarea Doxorubicinei unele celule din măduva osoasă au trecut prin cel puțin două cicluri celulare (Larramendy ML, 1980). În experimentul pe care l-am realizat durata de urmărire după administrarea citostaticului a fost limitată la 7 zile. În consecință, (unele celule au trecut printr-un număr semnificativ de cicluri celulare (până la 28 de cicluri celulare). O parte dintre celulele care au avut mutații importante au intrat cel mai probabil în apoptoză iar altele au supraviețuit și s-au multiplicat. În timpul ciclurilor celulare succesive unele aberații citogenetice se pierd (ex. fragmente acentrice, structuri de tip double minutes, interschimburi complexe, pulverizarea cromozomilor), sunt convertite (ex. delețiile cromatidiene sunt convertite în deleții cromozomale) sau pot reprezenta o bază pentru apariția unor noi aberații citogenetice (ex. cromozomii inelari și interschimburile complex). În plus administrarea colchicinei pentru a crește frecvența celulelor care sunt în metafază predispune la condensarea cromozomilor; acest proces poate masca unele aberații citogenetice iar spectrul de mutații detectate se putea reduce. Prelungirea duratei experimentului ar fi predispus la o reducere (pierdere) importantă a spectrului și a frecvenței mutațiilor și ar fi putut conduce la obținerea unor rezultate care să nu fie semnificative din punct de vedere statistic.
6.2 Impactul aportului alimentar și de apă asupra greutății corporale
Efectele utilizării lipidelor ca sursă de energie în cazul unui aport alimentar dezechilibrat au fost testate pe diferite modele animale. Dieta bazată pe lipide induce o serie de reacții (adaptative sau de stres) din partea unor organe (ex. inclusiv intestin și măduvă osoasă). Ele se pot manifesta prin: reducerea semnificativă a apetitul și a greutății corpului (ca urmare a creșterii producției de corpi cetonici), stres oxidativ etc (Erdemir F, 2012; Kawasaki N, 2012). Intensitatea manifestărilor se poate accentua dacă la dieta bazată pe lipide se asociază și alți factori de stres (ex. administrarea unor medicamente).
Dieta bogată în lipide a indus o serie de modificări. Dintre aceste modificări de interes pentru studiu sunt cele produse la nivelul intestinului și la nivelul măduvei osoase.
Intestin. În condiții fiziologice, celulele epiteliale de la nivelul intestinului au activitate metabolică și rată de diviziune crescută. Ele sunt supuse unui stres continuu, cauzat de agenții carcinogeni și oxidanți (proveniți din dietă sau din activitatea bacteriană locală), stres oxidativ, leziuni ADN. Acești factori de stres pot altera homeostazia metabolică a intestinului și pot predispune la alterarea funcției intestinului, apoptoză sau la proliferări maligne (Guz et al., 2008).
Dieta bogată în lipide induce o serie de reacții adaptative din partea intestinului. La șoareci s-a observat că după șapte zile de dietă bogată în lipide scade expresia genelor implicate în sinteza acizilor grași (ex. FAS și ACC) și crește expresia genelor implicate în asamblarea lipoproteinelor (ex. apoB, MTP, apoA-IV) (Hernández Vallejo SJ, 2009). De asemenea, s-a raportat că în același interval de timp aportul crescut de lipide crește capacitatea de secreție postprandială a lipoproteinelor intestinale (Cartwright IJ, 1999; Hernández Vallejo SJ, 2009).
Asocierea dietei bogate în lipide cu alți factori care pot leza mucoasa intestinală (ex. tratamentul cu citostatice) pot să afecteze suplimentar activitatea intestinului și chiar a organismul (ex. alterarea absorbției intestinale se poate manifesta și prin alterarea greutății sau câștigul ponderal).
Măduva osoasă. Studiile efectuate pe animale au arătat că dieta bogată în grăsimi predispune la un status pro-inflamator/pro-oxidant și la nivel osos. Spre exemplu:
– la șoarecii care au primit 13 săptămâni o dietă bogată în lipide (21,1% lipide) s-a constatat stresul oxidativ care a fost asociat inclusiv cu diminuarea masei osoase (Xiao et al., 2011);
– la șoarecii Swiss Webster hrăniți 6 săptămâni cu o dietă bogată în lipide (lipide 60,9% vs 9,3% la animalele control) s-a constatat creșterea celularității măduvei osoase. Acest tip de dietă predispune și la un proces inflamator la nivelul măduvei osoase (crește infiltratul celular între adipocite) și la creșterea expresiei factorilor proinflamatori (ex. TNF-α și IL-6) (Lumeng et al., 2007),(Santos et al., 2019).
– la șobolanii Wistar care au primit o dietă bogată în grăsimi 12 săptămâni s-au observat concentrații crescute de leptină și proteină C reactivă (do Carmo et al., 2013). Leptina are efecte asupra sistemului imunitar, stimulează formarea de globule albe în măduva osoasă și migrarea acestora în sânge. În consecință, se poate estima că dieta bogată în lipide poate influența rata de diviziune a celulelor din măduva osoasă.
În acest studiu, modificările citogenetice induse de Doxorubicină au fost testate la nivelul măduvei osoase la șoarecii BALBc. În acest context a fost de interes testarea efectului pe care îl are asocierea dintre Doxorubicină și dieta bazată pe lipide.
S-a constatat o modificare a greutății corporale la șoareci BALBc din cele patru loturi în timpul experimentului (Fig. 49). Aceste modificări reflectă complianța animalelor la tipul de dietă (Fig. 51), starea de hidratare (Fig. 55) și efectele citostaticelor (la nivel de stare generală, de apetit și de funcționare a intestinului).
În prima săptămână de experiment, creșterea procentuală în greutate a fost pozitivă, dar a fost mult mai mică la șoarecii care au primit dietă bazată pe lipide comparativ cu cei care au rămas pe dietă normală (p = 0,00001). La șoarecii control (injectați cu soluție salină) s-a menținut această tendință și în perioada următoare dar diferențele au rămas semnificative statistic doar pentru intervalul cuprins între zilele 8 și 10 (p = 0,0009). In intervalul 10-14 procentul de creștere ponderală nu a mai prezentat diferențe semnificative statistic (p> 0,05). Aceste rezultate au sugerat că dieta bazată pe lipide (jumări) nu a fost acceptată prea bine de șoareci cel puțin în primele 10 zile după introducere (Fig. 51).
Diferența dintre studiul pe care l-a realizat și studiile anterioare constă în faptul că dieta pe care am administrat-o șoriceilor a constat doar în jumări. Alimentele utilizate în aceste studii au conținut maxim 61% lipide.
După administrarea DOX s-a observat reducerea greutății corporale la toate animalele; cele mai mari scăderi ponderale au fost însă calculate pentru animalele care au primit doze mai mari de citostatic. În primele trei zile după injectare procentul de pierdere în greutate a fost influențat în mod semnificativ de doze de citostatice (Fig. 50.A), de tipul dietei (p <0,003) (Fig. 51) și cantitatea de apă consumată (Fig. 55, Fig. 56). Această tendință nu a fost detectată în următoarele patru zile (intervalul cuprins între zilele 10-14).
Scăderea în greutate a animalelor expuse la Doxorubicină a fost raportată în diferite studii. Spre exemplu:
– la șoriceii C57/Bl administrarea intraperitoneală a unei singure doze de Doxorubicină (20 mg/ kg corp) a determinat o scădere a greutății corporale cu aproximativ 3,3g în primele șapte zile după administrare; pierderea ponderală a fost mai importantă în primele 3 zile după administrare și mai redusă între zilele 6-7 post-administrare. In intervalul cuprins între zilele 7 -10 post-administrare s-a observat că animalele au o creștere ușoară în greutate (aproximativ 0,75g) (Rephaeli et al., 2007).
– șoriceii TNFR1−/−; B6.129-Tnfrsf1atm1Mak au scăzut în greutate cu ~4 g în primele trei zile după administrarea intraperitoneală de Doxorubicină (20 mg/kg corp) (Gilliam et al., 2009). In studiile realizate de Doroshow J (1985) și Gilliam LA (2009) s-a observat că tratamentul sistemic cu Doxorubicină produce edeme intramusculare și reduce forța specifică a mușchilor striați (Doroshow, Tallent and Schechter, 1985). La afectarea musculară (miastenie) contribuie și catabolismul promovat de scăderea aportului nutritiv după administrarea citostaticului. Toate aceste modificări pot să reducă și mai mult dorința animalelor de a se deplasa spre sursele de hrană.
– administrarea unor doze reduse de DOX pentru o perioadă de câteva săptămâni reduce greutatea corpului (în funcție de doza cumulată de citostatic administrată) și la șobolani (Herman, Zhang and Ferrans, 1994). Scăderea ponderală observată la diferite animale (ex. șobolani, câini) (Herman et al., 2000),(Herman et al., 1988) și la pacienții cu boli maligne (Tozer et al., 2008) după administrarea de Doxorubicină reflectă în principal pierderea apetitului, utilizarea deficitară a hranei (cauzată de lezarea gravă a epiteliului tractului gastrointestinal) și diminuarea aportului de apă.
Coroborarea rezultatelor din aceste studii cu cele din studiul pe care l-am realizat arată că pierderea ponderală după administrarea intraperitoneală de Doxorubicină este mai accentuată în primele 3 zile (3-4 g) și mai redusă în următoarele 4 zile și este influențată de doza de citostatic administrată. Principala diferență constă în faptul că scăderea ponderală similară înregistrată în primele zile a fost consecința administrării unor doze mult mai reduse de citostatic în studiul pe care l-am realizat.
Aportul de hrană și apă
Diferite tipuri de dieta hiperlipemică au fost testate pe animale. Dieta hiperlipidică a fost obținută prin înlocuirea unor componente din alimente (ex. glucide, proteine) cu lipide (care au origine animală sau vegetală) sau prin adăugarea acestora la hrana standard a animalelor. Aceste modificări pot să altereze compoziția în micro și macro-nutrienți a alimentelor. În consecință, diversitatea și caracteristicile (ex. compoziția, consistență, originea suplimentelor utilizate) hranei utilizate în diferite studii efectuate pe animale, pot explica, cel puțin parțial, heterogenitatea rezultatelor raportate. În acest studiu hrana bogată în lipide a fost reprezentată de jumări care au conținut 65% lipide (dintre care 26g acizi grași liberi). S-a optat pentru acest tip de dietă deoarece ea are un conținut crescut de lipide iar hrana care are consistență mai mare este mai bine tolerată de șoareci.
Consumul de apă și alimente în perioada de pre-administrare a fost similară cu cea raportată în alte studii realizate pe șoareci (Bachmanov et al., 2002). Creșterea greutății corporale la murine este indusă mai eficient dacă modificarea dietei este inițiată la vârste reduse și este menținută pentru câteva săptămâni. La șoareci, s-a observat că la șapte zile după inițierea dietei bogate în lipide apar deja reacții adaptative din partea organismului (se modifică expresia unor gene implicate în sinteza acizilor grași și în asamblarea lipoproteinelor (Hernández Vallejo SJ, 2009), crește capacitatea de secreție postprandială a lipoproteinelor intestinale) (Cartwright IJ, 1999). Creșterea greutății corporale poate să apară în primele 2 săptămâni însă devine mai evidentă după 4 săptămâni de dietă bogată în lipide (PECKHAM and ENTENMAN, 1962). În acest studiu am dorit să limităm impactul unor factori care pot modula răspunsul animalelor la tratament (ex. efectul vârstei înaintate asupra modificărilor citogenetice, obezitatea indusă de o dietă hiperlipemică prelungită); în consecință am utilizat animale adulte (de 6-8 săptămâni), care au primit o dieta bogată în lipide timp de 10-14 zile, care nu au fost și nu au devenit obeze în timpul experimentului.
În studiul realizat, aportul alimentar a prezentat variații care au avut amplitudine diferită în perioada de pre- și post-administrare.
În prima zi din experiment cantitatea de alimente consumată de către animalele care au fost trecute pe o dietă bogată în lipide a fost cu 54,35% mai redusă comparativ cu cea consumată de către animalele care au avut dietă normală (4,35±0,52g vs 1,99±0,59g). Acest rezultat arată că animalele nu au tolerat foarte bine acest tip de dietă.
În primele 7 zile din experiment, cantitatea zilnică de alimente consumată de animalele care au primit dietă normală (NFI și NFII) nu a prezentat modificări semnificative statistic (excepție cantitățile consumate în prima zi vs cele consumate în celelalte 6 zile). Aportul alimentar al animalelor care au primit o dietă hiperlipemică a crescut semnificativ din punct de vedere statistic după 3 zile de la introducerea dietei. Această creștere nu a fost constantă în zilele următoarele (ex. în ziua 5 consumul de jumări s-a diminuat).
În prima săptămână de experiment, creșterea procentuală în greutate a fost pozitivă, indiferent de tipul de dietă, dar a fost mult mai mică la șoarecii care au avut o dietă hiperlipidică comparativ cu cei care au rămas pe dietă normală (2,98%±1,66 vs 5,26%±1,57, p = 0,00001). Modificarea ponderală în primele 7 zile din experiment reflectă aportul alimentar al animalelor care au fost primit hrană normală sau hrană hiperlipemică. Numeroase studii au raportat că dieta bogată în lipide poate predispune la hiperfagie iar aceasta poate predispune la creșterea greutății corporale atât la oameni cât și la animale model (Buettner R, 2007). În consecință, putem să spunem că datele pe care le-am obținut sunt concordante cu cele raportate anterior în literatură.
Zilele 7-8
Este de menționat că în prima zi după administrarea citostaticului, indiferent de tipul de dietă, animalele au consumat cantități de alimente similare (NF: 1,19±0,39g vs PG: 1,00±0,20g) (Fig 6). Cantitatea de alimente consumată scade cel mai mult la animalele care au avut dietă normală în raport cu valorile înregistrate în ziua precedentă administrării; diminuarea aportului alimentar este de 75,35% (ziua 7 vs ziua 8: 4,82±0,60g vs 1,19±0,39g) în cazul dietei normale și de 64% (ziua 7 vs ziua 8: 2,78±0,48g vs 1,00±0,20g) în cazul dietei hiperlipemice.
Zilele 8-10
Scăderea ponderală procentuală înregistrată în primele 3 zile după administrarea Doxorubicinei a fost mai redusă în cazul animalelor care au primit hrană normală comparativ cu cea înregistrată în cazul animalelor care au avut o dietă hiperlipemică (modificarea ponderală în zilele 8-10 a fost de NF: -14,47±4,56% vs PG: -16,83±4,15%, p=0,0026). În această perioadă consumul mediu de alimente/ zi a fost de 1,56 g hrană normală și de 1,25g jumări; scăderea aportului de alimente în cele trei zile a reprezentat 67,63% și 54,93% din cantitatea de alimente pe care animalele au consumat-o în ziua precedentă administrării. Se poate astfel observa că la animalele care au avut o dietă normală au scăzut mai puțin în greutate deși aportul alimentar a scăzut mai mult comparativ cu valorile observate la animalele care au primit o dietă hiperlipemică (Fig 6b.)
Zilele 11-14
Între zilele 4-7 după administrarea Doxorubicinei scăderea ponderală (NF: -2,25% vs PG -1,83%) observată în ambele loturi nu poate fi justificată doar prin cantitatea de alimente consumată (NF: 78,81% vs PG: 71,53%); cantitatea de alimente consumată în această perioadă a crescut semnificativ comparativ cu valorile înregistrate în primele 3 zile după administrare înregistrate (Fig 6c.). Modificarea ponderală observată poate să fie explicată mai bine dacă se compară diferența dintre cantitățile de alimente consumată în ziua precedentă administrării și în zilele 4-7 după administrarea Doxorubicinei; s-a observat că atât la animalele care au primit o dietă normală (4,82g vs 2,80g adică 41,98% mai redus) cât și la cele care au primit o dietă hiperlipemică (2,78g vs 1,72g, adică -22,69%) consumul de alimente a rămas semnificativ mai redus comparativ cu valorile înregistrate înainte de administrare.
Aceste rezultate arată că la modificarea ponderală înregistrată după administrarea citostaticului pot să contribuie mai mulți factori: tipul de dietă, aportul de apă, doza de citostatic administrată, intervalul de timp cuprins între administrare și determinare etc. Cu toate acestea se poate observa că în zilele care urmează după administrarea citostaticului animalele au un pattern de consum alimentar similar; aportul alimentar a crescut semnificativ statistic la 2-3 zile și 6-7 zile post-administrare, atât la animalele care au avut o dietă bogată în lipide cât și la cele care au avut o dietă normală. Începând cu a 2-a zi după administrare, aportul de apă a crescut semnificativ. În consecință după 78 de ore de la administrare greutatea animalelor continuă să scadă deși aportul de alimente și de apă cresc (Fig. 55, Fig. 57). Această reducere ponderală observată după 78h de la administrarea citostaticului poate să reflecte alterarea enterocitelor, având în vedere că aportul alimentar și mai ales cel de apă cresc semnificativ.
6.3 Efectele citogenetice ale Doxorubicinei
Doxorubicina are efecte complexe la nivel nuclear (ex. cauzează stres oxidativ, poate alchila moleculele de ADN, se intercalează în ADN și inhibă topoizomeraza II (Deepa and Varalakshmi, 2006), alterează denaturarea și replicarea ADN etc.) care pot să conducă la apariția unor rupturi mono- sau dublu-catenare și la diferite tipuri de mutații (Cummings et al., 1991). Potențialele aneugenice și clastogene (Fenech, 1993) ale DOX au fost observate în diferite sisteme de testare (ex. limfocite umane, șoareci albino, șobolani) (Dhawan A, 2003; Attia SM, 2011). La șoarecii Swiss s-a raportat că o singură doză de Doxorubicină (3, 12 sau 24 mg/kg corp) poate determina apariția aberațiilor cromozomale în măduva osoasă la 1-5 zile după administrare (Au WW, 1980). Un alt studiu a indicat că aberațiile cromatidiene apar la 6 ore după administrare iar numărul acestora este corelat direct cu doza de citostatic. Această corelație nu a mai fost prezentă la 12 ore după administrarea de citostatic. La 12 ore de la administrare s-au identificat aberații de tip cromatidian și cromozomal (inclusiv fuziuni Robertsoniene), însă doar aberațiile de tip cromozomal au fost corelate cu doza de citostatic. Aceste date referitoare la aberațiile de tip cromozomal sugerează că în măduva osoasă există o populație de celule care pot să parcurgă 2 runde de diviziune (două mitoze) în 12 ore (Larramendy ML, 1980). Se consideră că apariția translocațiilor Robertsoniene reflectă afectarea heterocromatinei pericentromerice de către citostatic (cromozomii restructurați de tip metacentric pot să se formeze prin translocația ambelor brațe cromozomale sau prin schimbul aberant de material dintre brațele scurte ale unor cromozomi acrocentrici).
Numărul de administrări. DOX poate produce leziuni în țesuturile din vecinătatea locului de administrare (Lipshultz et al., 2006), leziuni care pot să influențeze absorbția unor noi doze de medicament. Acesta este principalul motiv pentru care s-a optat pentru testarea efectelor pe care le are expunerea animalelor la o singură doză de Doxorubicină.
Dozele. Expunerea la doze mari de citostatic (ex. 15 mg/kg la șobolanii Wistar) (El-Moselhy and El-Sheikh, 2014),(Martins RA, 2012) poate determina stări toxice la nivelul mai multor țesuturi și organe sau chiar moartea animalelor. LD50 depinde de particularitățile sistemului de testare și ale expunerii. La șoarecii adulți, valorile LD50 pentru Doxorubicina administrată intraperitoneal se înscriu într-un interval destul de mare (11,98 – 56,87 mg / kg corp)((Bertazzoli et al., 1985),(Sen, Karakas and Bilaloglu, 2010).
Pentru a limita efectele secundare ale Doxorubicinei, s-a testat impactul pe care îl are administrarea intraperitoneală a unei singure doze de citostatic (cuprinsă în intervalul 1,7-7,7 mg / kg corp) la șoarecii BALBc adulți. Aceste doze sunt comparabil mai mici în raport cu cele utilizate pentru tratarea pacienților sau cu cele care au fost testate mai frecvent pe modelele murine (15 mg/kg la șobolanii Wistar (El-Moselhy MA, 2014; Martins RA, 2012) -20 mg / kg corp la șoarecii C57BL/6N (Wang et al., 2016)- 24 mg la șoareci (Au WW, 1980).
Efectele citogenetice care se pot identifica după 3 sau 7 zile de la administrare. Unele leziuni genetice induse de agenții mutageni pot să fie reparate, pot predispune la apoptoză (ex. prin intermediul ligandului CD95 care activează receptorul CD95) (Friesen C, 1999) sau pot se pot fixa în genomul celulelor.
Larramendy ML și colaboratorii au testat în anul 1980 efectele citogenetice ale Doxorubicinei în primele 24 de ore de la administrare intraperitoneală a unei singure doze de citostatic. Pe baza analizei modificărilor citogenetice s-a considerat că după 12 ore de la administrarea Doxorubicinei unele celule din măduva osoasă au parcurs cel puțin două cicluri celulare. Rezultatele au indicat că frecvența aberațiilor cromozomale este corelată cu doza de Doxorubicină. Valorile raportate la 12 ore după injectarea a 5 sau 10 mg/kg corp au fost diferite de cele pe care le-am obținut în acest studiu după 3 sau 7 zile de la injectarea a 5,1 sau 7,7 mg/kg corp: gap-urile, delețiile și cromozomii inelari au avut o frecvență mai mare iar interschimburile complexe au fost mai rare (Larramendy ML, 1980). Frecvența mai mică a interschimburilor complexe pe care le-am identificat după câteva zile de la administrare reflectă comportamentul acestor structuri cromozomale aberante în timpul diviziunii celulare (mai ales în timpul trecerii de la metafază la anafază.
Au WW și colaboratorii au administrat șoarecilor Swiss o doză de 3 mg/kg corp de Doxorubicină și au observat că în măduva osoasă frecvența rupturilor cromozomale atinge un maxim în intervalul cuprins între 5-24h după administrare. Însă în celule care supraviețuiesc tratamentului (ex. spermatogonii) modificările induse de citostatic se pot identifica și după perioade mai îndelungate de timp (Au WW, 1980). Spre deosebire de acest studiu la șoareci BALBc după 3 și la 7 zile de la administrarea aceleiași doze de citostatic am observat mai frecvent deleții cromatidiene (Au WW, 1980). Acest rezultat pare să fie în concordanță cu ipoteza care susține că după perioade variabile de timp de la administrarea de Doxorubicină în celule care supraviețuiesc pot să apară noi mutații.
După 24 ore de la administrarea intraperitoneală a unor doze reduse de Doxorubicină (ex. 0,2, 0,4 și 0,8 mg/kg corp) în zile succesive s-au identificat modificări citogenetice la șoarecii albinotici (Mus musculus). Frecvența medie a celulelor cu aberații cromozomale (calculate pentru trei animale) pentru dozele de 0,2 mg/kg corp (12,67±2,42), 0,4 mg/kg corp (29,00±4,27) și 0,8 mg/kg corp (38,67±2,82) a fost semnificativ mai mare comparativ cu cea înregistrată pentru lotul control (3,33 ± 0,28). Aberațiile identificate au fost Gap-uri, rupturi cromatidiene, fragmente acentrice, cromozomi inelari și translocații Robertsoniene. Dintre acestea, cele mai frecvente au fost rupturile cromatidiene și fragmentele cromozomale iar cel mai rar au fost identificate translocațiile Robertsoniene. S-a mai observat că poliploidiile au fost identificate doar la animalele care au fost tratate cu 0,4 și 0,8 mg/kg corp Doxorubicină. La cea mai mare doză testată (0,8 mg/kg) frecvența delețiilor cromatidiene (12,6%), a fragmentelor acentrice (11,6%), a cromozomilor inelari (8,3%), a translocațiilor Robertsoniene (4%) și a poliploidiilor (2%) a fost semnificativ mai mare comparativ cu valorile înregistrate la doze mai mici (Mohamed et al., 2018). Comparativ cu aceste date, la cea mai mică doză pe care am testat-o (1,6 mg/kg corp) pe șoarecii care au primit o dietă normală am identificat mai frecvent deleții cromatidiene (15,25%) și mai rar translocații Robertsoniene (1,5%), fragmente acentrice (0,75%) și poliploidii (0%). Frecvența mai mare a delețiilor cromatidiene poate să fie explicată prin doza mai mare de citostatic utilizată la o administrare (1,7 mg/kg corp administrată în doză unică vs 0,8 mg/kg corp administrat de două ori). Frecvența mai redusă a fragmentelor acentrice, translocațiilor Robertsoniene și poliploidiilor se poate explica prin perioada mai mare de timp la care s-au făcut determinările după administrarea citostaticului (7 zile vs 1 zi) și prin caracterul instabil al acestor modificări în timpul rundelor succesive de diviziune.
Apariția translocațiilor de tip Robertsonian este o dovadă că Doxorubicina acționează la nivelul heterocromatinei pericentromerice. Identificarea translocațiilor de tip Robertsonian la toate dozele de citostatic administrate sugerează că heterocromatina pericentromerică poate să fie afectată inclusiv de doze reduse de citostatic (1,7 mg/kg corp).
O serie de aberații citogenetice (e.g. Gap-urile, interschimburile complexe, translocațiile Robertsoniene, cromozomii lipicioși) pot să fie importante pentru stabilirea destinului pe care îl au celulele purtătoare. Ele reflectă potențialul toxic al xenobioticelor (FISKESJÖ, 1985);(Türkoǧlu, 2007). In acest studiu, frecvența acestor modificări nu a fost corelată semnificativ din punct de vedere statistic cu doza de citostatic deși s-a observat că acest aberații cromozomale devin tot mai numeroase pe măsură ce doza de citostatic administrată animalelor era mai mare.
Rezultatele obținute nu sunt în concordanță cu datele publicate în anul 1990 de către Meistrich ML. Acesta nu a observat o creștere semnificativă a frecvenței aberațiilor cromozomale în spermatozoizii șoriceilor după administrarea a 6 mg/kg corp de Doxorubicină (Meistrich et al., 1990).
Poliploidii. După expunerea la doze reduse de Doxorubicină unele celule (ex. HCT116, MCF7) pot să prezinte modificări fenotipice: devin gigantice, poliploide și polimorfice (Sliwinska et al., 2009),(Mosieniak et al., 2015),(Mansilla, Priebe and Portugal, 2006). Mohamed NA și colaboratorii (2018) au arătat că în măduva osoasă a șoriceilor la 24 ore după administrarea intraperitoneală a unor doze reduse de citostatic (0,8 mg/kg) în două zile consecutive, 0,2% dintre metafazele investigate prezentau poliploidii. În studiul pe care l-am realizat, poliploidia a fost mai frecventă la șoriceii care au primit dietă bogată în lipide comparativ cu cei care au primit dietă normală (PG vs NF); aceste diferențe au fost și mai evidente la doze mari de Doxorubicină (Fig 6, Fig 11). Acest rezultat observat după 3 sau 7 zile de la administrare poate avea semnificație oncologică. Diviziunea celulelor poliploide pare să fie importantă pentru generarea celulelor stem maligne (Fujioka et al., 2004) și repopularea cu celule tumorale după tratamentul cu citostatice (Sundaram et al., 2004). În acest context se poate specula că utilizarea unor doze subclinice de citostatic poate să crească suplimentar heterogenitatea tumorii și riscul de recurență a tumorii.
Frecvența aberațiilor citogenetice identificate în acest studiu nu se modifică semnificativ în perioada de urmărire după administrarea Doxorubicinei (p>0,05). În această interval de timp s-a observat un patern de consum alimentar similar (aportul alimentar a crescut semnificativ la 2-3 zile și 6-7 zile după administrarea citostaticului) pentru animalele care au primit hrană normală sau hrană hiperlipemică. Aceste date arată că modificarea ponderală și consumul de alimente nu au un traseu similar cu cel al frecvenței aberațiilor cromozomale.
Aberații citogenetice care nu au fost incluse în prelucrarea statistică a datelor
Lacunele au fost identificate mai frecvente la 3 zile după administrarea citostaticului comparativ cu valorile înregistrare la 7 zile. Această dinamică poate sugera că o parte dintre lacunele produse după administrarea citostaticului au dispărut (celulele purtătoare au intrat în apoptoză sau nu au mai intrat într-un nou ciclu celular) sau structura cromozomilor a fost reparată.
Atracțiile centromer – la centromer, tendința de rozetare și efilarea cromozomilor au fost identificate mai frecvent la 7 zile de la administrarea dozelor mari de citostatic. La doze intermediare de citostatic atracțiile dintre cromozomi și tendința de rozetare au fost mai frecvente la 3 zile după administrare. În consecință se poate observa că pentru atracții, tendința de rozetare și efilare nu se poate stabili o relație clară doză –răspuns.
Atracțiile telomer la telomer și telomer la centromer au fost mai frecvente după 7 zile de la administrarea citostaticului. Frecvența mai mare a atracțiilor telomer la telomer a fost observată la animalele care au primit doze extreme de citostatic (ex. 1,7 și 7,7 mg/kg corp) iar atracțiile telomer la centromer au fost mai frecvente la cele mai multe dintre dozele de citostatic testate (ex. 1,7;2,2;2,6; 3,1; 3,8; 7,7mg/kg corp). Apariția atracțiilor și tendința de rozetare poate reflecta o alterarea a structurii și funcției telomerelor, mai ales dacă ținem cont și de capacitatea limitată de refacere (elongare) a structurilor cromozomale. Frecvența mai mare a acestor modificări la 7 zile după administrare poate să reflecte și dinamica celulelor care au fost expuse la citostatic (au supraviețuit sau au intrat în diviziune mai ales celule care au avut modificări citogenetice mai reduse).
7. Concluzii
Acest studiu s-a focalizat pe analiza efectelor citogenetice care sunt prezente la 3 sau 7 zile după administrarea Doxorubicinei la șoriceii BALBc care au primit două tipuri de hrană (normală sau hiperlipemică). Având în vedere că în acest interval unele celule din măduva osoasă au parcurs 12-28 runde de diviziune celulară rezultatele obținute au vizat mai ales aberațiile citogenetice care au tendința de a se fixa.
Rezultatele obținute în acest studiu au permis formularea următoarelor concluzii:
-în primele 7 zile din experiment (perioada de pre administrare) animalele care au avut o dietă normală au consumat cu ~50% mai multe alimente comparativ cu cele care au primit dieta hiperlipemică (NF: 4,71±0,6g vs PG: 2,34±0,59g). Dieta hiperlipemică nu a fost tolerată foarte bine de animale (loturile PGI și PGII). Ele au consumat semnificativ mai multe alimente în zilele 3,4,6,7 după inițierea dietei.
– Doxorubicina are un impact puternic asupra pierderii greutății corporale; în prima zi după administrarea citostaticului aportul alimentar a înregistrat o scădere foarte importantă și a ajuns la valori similare (NF: 1,19±0,39g vs PG: 1,00±0,20g). În primele 3 zile după administrarea citostaticului aportul alimentar (NF: -67,63% vs PG: -54,93%) și câștigul ponderal (NF: -14,47±4,56% vs PG: -16,83±4,15%, p=0,0026) au scăzut semnificativ. În următoarele 4 zile aportul alimentar a început să crească (comparativ cu ziua 7 scăderea a fost de 41,98% în cazul dietei normale și de -22,69% în cazul dietei hiperlipemie) dar greutatea animalelor a nu a urmat același trend;
– consumul de alimente și de apă au o tendință similară după administrarea citostaticului;
– modificarea ponderală înregistrată după 72 ore de la administrarea citostaticului nu este corelată cu aportul de alimente și apă; acest rezultat poate să reflecte disfuncțiile produse de citostatice la nivelul tubului digestiv (enterocitelor);
– Doxorubicina are un impact semnificativ asupra materialului genetic la șoarecii BALBc; efect mutagen depinde de doză și apare și la dozele reduse de citostatic;
– efectele Doxorubicinei în celulele din măduva osoasă par să nu fie influențat semnificativ de dieta alternativă și de modificările metabolice pe care aceasta le induce;
– frecvența aberațiilor cromozomale identificate la 3 și la 7 zile după administrarea unor doze reduse de Doxorubicină crește de câteva ori în comparație cu lotul control. Dintre aberațiile citogenetice identificate frecvența poliploidiilor și delețiilor a crescut semnificativ, mai ales la șoarecii care au primit 5,7-7,1 μg/g corp comparativ cu cei care au promit doze mai reduse de citostatic.
– prezența translocațiilor Robertsoniene demonstrează că citostaticul acționează inclusiv asupra regiunii heterocromatice, pericentromerice;
– la 3 și 7 zile după administrarea de citostatice s-a identificat fenomenul de poliploidizare; acest fenomen pare să fie important pentru generarea celulelor stem maligne (Fujioka S, 2004) și repopularea cu celule tumorale după tratamentul cu citostatice (Sundaram M, 2004).
– nu au fost identificate structuri de tip double minutes după expunerea la Doxorubicină.
-apariția unor aberații citogenetice (ex. fragmentele acentrice, interschimburi complexe, tendința de rozetare) nu a fost corelată cu doza de citostatic. Acest rezultat se poate explica prin caracterul lor instabil și prin numărul mare de diviziuni celulare pe care l-au parcurs celulele din măduva osoasă în perioada de post-administrare.
– pentru o caracterizare mai bună asupra reactivității materialului genetic murin la citostatic este necesară efectuarea analizelor citogenetice și la mai puțin de 72 ore de la administrare și prin testarea mai detaliată a dozelor de citostatic cuprinse în intervalul 1,9- 2,2 mg citostatic / kg corp;
– având în vedere rezultatele obținute pentru unele aberații citogenetice se poate specula că utilizarea unor doze subclinice de citostatic poate să crească suplimentar heterogenitatea tumorii și riscul de recidivă.
8. Concluzii finale
Principalele rezultate obținute în cadrul acestei lucrări susțin formularea următoarelor concluzii:
a) carcinomul ductal invaziv este cel mai frecvent tip de cancer mamar identificat la pacientele din România;
b) principalii factori protectivi pentru carcinomul ductal invaziv identificați sunt:
– prima sarcină înainte de 30 ani la femei sedentare (O.R.=0,14, p=1,8E-5) sau la femei normoponderale (O.R.=0,19, p=1,9E-5);
– perioadă de lactație mai mare de 12 luni (comparativ cu persoanele care nu au avut lactație O.R.=0,27, p=0*);
– anticoncepționalelor orale utilizate de purtătoarele genotipurilor AGTR1 AA (O.R.=0,15, p=0,0008) sau IL6 GG (O.R.= 0,22, Yate's p=0,001).
c) principalii factori de risc pentru carcinomul ductal invaziv identificați sunt:
– nuliparitatea la persoane normoponderale (O.R.=5,45, p=4,2E-5) sau supraponderale (O.R.=4,11);
– prima sarcină dusă la termen după vârsta de 30 la persoane supraponderale (O.R.=5,19, p=7,1E-5) sau care au avut coinfecție cu TTV și TTMDV (O.R.=7,87).
– perioada de lactație <12 luni asociată cu sedentarismul (O.R.= 4,67, p=0,0006);
– fumatul activ înainte de prima sarcină (O.R.= 6,19, p= 0); pacientele au fumat activ cu ~ 10 ani mai mult (p<2,2e-08);
– prezența simultană a genotipurilor IL6 GG -TGFb CC (O.R.=34,69, p<0,0001).
d) vârsta la care a fost diagnosticat cancerul de sân a fost mai redusă la pacientele expuse la fum de țigară. Diminuarea vârstei a fost asociată semnificativ cu:
– numărul de țigări (2,25 ani dacă au fumat ≥15 țigări/zi; 3,08 ani dacă au fumat ≥20 țigări/ zi, p<0,000003);
– expunerea pasivă la fum de țigară (cu 2,46 ani, p<0,00002);
– expunerea activă și pasivă (2,74 ani, p<0,00001), mai ales dacă pacientele erau nulipare (2,97 ani, p<0,00001), nu consumă alcool (3,53 ani, p<0,00001).
e) efectele citogenetice ale administrării Doxorubicinei la șoriceii BALBc care au primit două tipuri de hrană (normală sau hiperlipemică), după 3 sau 7 zile de la administrare. Studiul a vizat mai ales aberațiile citogenetice care au tendința de a se fixa în celule din măduva osoasă. Rezultatele obținute au arătat următoarele:
-în perioada de pre administrare (primele 7 zile din experiment) animalele care au avut o dietă normală au consumat cu ~50% mai multe alimente comparativ cu cele care au primit dieta hiperlipemică (NF: 4,71±0,6g vs PG: 2,34±0,59g). Dieta hiperlipemică nu a fost tolerată foarte bine de animale (loturile PGI și PGII).
– administrarea Doxorubicinei are un impact puternic asupra pierderii greutății corporale; în prima zi după administrarea citostaticului aportul alimentar a înregistrat o scădere foarte importantă și a ajuns la valori similare (NF: 1,19g vs PG: 1,00g). În primele 3 zile după administrarea citostaticului câștigul ponderal (NF: -14,47±4,56% vs PG: -16,83±4,15%, p=0,0026) și aportul alimentar (NF: -67,63% vs PG: -54,93%) au scăzut semnificativ. În următoarele 4 zile aportul alimentar a început să crească (comparativ cu ziua 7 scăderea a fost de 41,98% în cazul dietei normale și de -22,69% în cazul dietei hiperlipemie) dar greutatea animalelor a nu a urmat același trend;
– frecvența aberațiilor cromozomale la 3 și la 7 zile după administrarea unor doze reduse de Doxorubicină crește de câteva ori în comparație cu lotul control. Dintre aberațiile citogenetice identificate frecvența poliploidiilor și delețiilor a crescut semnificativ, mai ales la șoarecii care au primit 5,7-7,1 μg/g corp comparativ cu cei care au promit doze mai reduse de citostatic.
– prezența translocațiilor Robertsoniene demonstrează că citostaticul acționează inclusiv asupra regiunii heterocromatice, pericentromerice;
-frecvența aberațiilor citogenetice instabile (ex. fragmentele acentrice, interschimburi complexe, tendința de rozetare) după 12-28 runde de diviziune celulară nu a fost corelată cu doza de citostatic administrată.
– la 3 și 7 zile după administrarea de citostatice s-a identificat fenomenul de poliploidizare; acest fenomen pare să fie important pentru generarea celulelor stem maligne și repopularea cu celule tumorale după tratamentul cu citostatice;
– având în vedere rezultatele obținute pentru unele aberații citogenetice se poate specula că utilizarea unor doze subclinice de citostatic poate să crească suplimentar heterogenitatea tumorii și riscul de recidivă.
9. Perspective
Rezultatele studiilor de asociere pot reprezenta o bază pentru identificarea relațiilor de cauzalitate. Pentru aceasta datele obținute în acest studiu trebuie să fie discutate și analizate din punctul de vedere al criteriilor enunțate de către Sir Bradford Hill (în anul 1965) și nuanțate în anii ulteriori (Hill, 1965),(Phillips and Goodman, 2004),(Hill, 2015).
Verificarea potențialului virusurilor Torque Teno de a interfera cu tumorigeneza.
Identificarea unor noi endofenotipuri care să permită o mai bună reclasificare a cazurilor de carcinom ductal invaziv.
10. Referințe
(No Title) (no date). Available at: https://gco.iarc.fr/today/data/factsheets/populations/642-romania-fact-sheets.pdf (Accessed: 17 December 2020).
‘A Retrospective Cohort Analysis of Second Breast Cancer Risk for Primary Breast Cancer Patients With an Assessment of the Effect of Radiation Therapy<xref ref-type="fn" rid="FN2">2</xref>’ (1983) JNCI: Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/70.5.797.
Abba, M. C. et al. (2004) ‘Transcriptomic changes in human breast cancer progression as determined by serial analysis of gene expression’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr899.
Abdella, E. M. and Ahmed, R. (2009) ‘Suppression of doxorubicin apoptotic, histopathologic, mutagenic and oxidative stress effects in male mice bone marrow and testis tissues by aqueous rosemary leaves extract’, Iranian Journal of Cancer Prevention.
Abe, K. et al. (2000) ‘TT Virus Infection in Nonhuman Primates and Characterization of the Viral Genome: Identification of Simian TT Virus Isolates’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.74.3.1549-1553.2000.
Abramowitz, M. C. et al. (2010) ‘History of smoking is associated with younger age at diagnosis of breast cancer’, Breast Journal. doi: 10.1111/j.1524-4741.2010.00921.x.
Adami, H. O. et al. (1995) ‘The aetiology and pathogenesis of human breast cancer’, Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. doi: 10.1016/0027-5107(95)00128-X.
Adami, H. O., Signorello, L. B. and Trichopoulos, D. (1998) ‘Towards an understanding of breast cancer etiology’, Seminars in Cancer Biology. doi: 10.1006/scbi.1998.0077.
Adeli, K. and Lewis, G. F. (2008) ‘Intestinal lipoprotein overproduction in insulin-resistant states’, Current Opinion in Lipidology. doi: 10.1097/MOL.0b013e3282ffaf82.
Ahern, T. P. et al. (2017) ‘Family history of breast cancer, breast density, and breast cancer risk in a U.S. breast cancer screening population’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-16-0801.
Ahmad, A. (2013) ‘Pathways to Breast Cancer Recurrence’, ISRN Oncology. doi: 10.1155/2013/290568.
Aït Amara-Mokrane, Y. et al. (1996) ‘Protective effects of α-hederin, chlorophyllin and ascorbic acid towards the induction of micronuclei by doxorubicin in cultured human lymphocytes’, Mutagenesis. doi: 10.1093/mutage/11.2.161.
Akram, M. et al. (2017) ‘Awareness and current knowledge of breast cancer’, Biological Research. doi: 10.1186/s40659-017-0140-9.
Al-Moslih, M. I., Perkins, H. and Hu, Y. W. (2007) ‘Genetic relationship of torque teno virus (TTV) between humans and camels in United Arab Emirates (UAE)’, Journal of Medical Virology. doi: 10.1002/jmv.20776.
Alavanja, M. et al. (2004) ‘Tobacco smoke and involuntary smoking’, in IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.
Albrektsen, G. et al. (2005) ‘Breast cancer risk by age at birth, time since birth and time intervals between births: Exploring interaction effects’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6602302.
Allen, J. G. et al. (2013) ‘Exposure to flame retardant chemicals on commercial airplanes’, Environmental Health: A Global Access Science Source. doi: 10.1186/1476-069X-12-17.
Althuis, M. D. et al. (2003) ‘Hormonal content and potency of oral contraceptives and breast cancer risk among young women’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6600691.
Aly, M. S., Othman, O. E. and El Nahas, S. M. (1999) ‘Specific numerical chromosomal aberrations induced by adriamycin’, Environmental and Molecular Mutagenesis. doi: 10.1002/(SICI)1098-2280(1999)33:2<161::AID-EM8>3.0.CO;2-M.
Amadou, A. et al. (2013) ‘Overweight, obesity and risk of premenopausal breast cancer according to ethnicity: A systematic review and dose-response meta-analysis’, Obesity Reviews. doi: 10.1111/obr.12028.
American Cancer Society (2019) ‘Breast Cancer Facts & Figures 2019-2020’, American Cancer Society.
Amin, I. et al. (2006) ‘Mobilisation into cotton and spread of a recombinant cotton leaf curl disease satellite’, Handbook of Environmental Chemistry, Volume 5: Water Pollution. doi: 10.1007/s00705-006-0773-4.
Amundadottir, L. T. et al. (2004) ‘Cancer as a complex phenotype: Pattern of cancer distribution within and beyond the nuclear family’, PLoS Medicine. doi: 10.1371/journal.pmed.0010065.
Andersen, Z. J. et al. (2017) ‘Active smoking and risk of breast cancer in a Danish nurse cohort study’, BMC Cancer. doi: 10.1186/s12885-017-3546-4.
Anderson, D., Yu, T. W. and Browne, M. A. (1997) ‘The use of the same image analysis system to detect genetic damage in human lymphocytes treated with doxorubicin in the Comet and fluorescence in situ hybridisation (FISH) assays’, Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. doi: 10.1016/S0165-1218(96)00167-X.
Anderson, K. N., Schwab, R. B. and Martinez, M. E. (2014) ‘Reproductive risk factors and breast cancer subtypes: A review of the literature’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-014-2852-7.
Andersson, T. M. L. et al. (2009) ‘Increasing incidence of pregnancy-associated breast cancer in Sweden’, Obstetrics and Gynecology. doi: 10.1097/AOG.0b013e3181b19154.
Antoniou, A. C. et al. (2001) ‘Evidence for further breast cancer susceptibility genes in addition to BRCA1 and BRCA2 in a population-based study’, Genetic Epidemiology. doi: 10.1002/gepi.1014.
Antunes, L. M. G. et al. (1999) ‘Modulatory effects of curcumin on the chromosomal damage induced by doxorubicin in Chinese hamster ovary cells’, Teratogenesis Carcinogenesis and Mutagenesis. doi: 10.1002/(SICI)1520-6866(1999)19:1<1::AID-TCM1>3.0.CO;2-7.
Antunes, L. M. G. and Takahashi, C. S. (1998) ‘Effects of high doses of vitamins C and E against doxorubicin-induced chromosomal damage in Wistar rat bone marrow cells’, Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. doi: 10.1016/S1383-5718(98)00132-6.
Antunes, L. M. G. and Takahashi, C. S. (1999) ‘Olive oil protects against chromosomal aberrations induced by doxorubicin in Wistar rat bone marrow cells’, Genetics and Molecular Biology. doi: 10.1590/s1415-47571999000200015.
Arcamone, F. et al. (2000) ‘Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S. peucetius var. caesius. Reprinted from Biotechnology and Bioengineering, Vol. XI, Issue 6, Pages 1101-1110 (1969)’, Biotechnology and Bioengineering.
Armitage, P. and Doll, R. (1954) ‘The age distribution of cancer and a multi-stage theory of carcinogenesis’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/bjc.1954.1.
Armstrong, B. and Doll, R. (1975) ‘Environmental factors and cancer incidence and mortality in different countries, with special reference to dietary practices’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.2910150411.
Ásgeirsson, K. S. et al. (1998) ‘The effects of IL-6 on cell adhesion and E-cadherin expression in breast cancer’, Cytokine. doi: 10.1006/cyto.1998.0349.
Ashikawa, K. et al. (2004) ‘Evidence that activation of nuclear factor-κB is essential for the cytotoxic effects of doxorubicin and its analogues’, Biochemical Pharmacology. doi: 10.1016/j.bcp.2003.08.039.
Assi, N. et al. (2020) ‘Mediation analysis of the alcohol-postmenopausal breast cancer relationship by sex hormones in the EPIC cohort’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.32324.
Atkinson, R. L. et al. (2016) ‘Epidemiological risk factors associated with inflammatory breast cancer subtypes’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1007/s10552-015-0712-3.
Attia, S. M. (2011) ‘Comparative aneugenicity of doxorubicin and its derivative idarubicin using fluorescence in situ hybridization techniques’, Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2011.07.012.
Au, W. W. and Hsu, T. C. (1980) ‘The genotoxic effects of adriamycin in somatic and germinal cells of the mouse’, Mutation Research/Genetic Toxicology. doi: 10.1016/0165-1218(80)90160-3.
Bachmanov, A. A. et al. (2002) ‘Food intake, water intake, and drinking spout side preference of 28 mouse strains’, Behavior Genetics. doi: 10.1023/A:1020884312053.
Badache, A. and Hynes, N. E. (2001) ‘Interleukin 6 inhibits proliferation and, in cooperation with an epidermal growth factor receptor autocrine loop, increases migration of T47D breast cancer cells’, Cancer Research.
Balacescu, O. et al. (2016) ‘Blood Genome-Wide Transcriptional Profiles of HER2 Negative Breast Cancers Patients’, Mediators of Inflammation. doi: 10.1155/2016/3239167.
Ball, J. K. et al. (1999) ‘TT virus sequence heterogeneity in vivo: Evidence for co-infection with multiple genetic types’, Journal of General Virology. doi: 10.1099/0022-1317-80-7-1759.
Band, P. R. et al. (2002) ‘Carcinogenic and endocrine disrupting effects of cigarette smoke and risk of breast cancer’, Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(02)11140-8.
Barnard, M. E., Boeke, C. E. and Tamimi, R. M. (2015) ‘Established breast cancer risk factors and risk of intrinsic tumor subtypes’, Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. doi: 10.1016/j.bbcan.2015.06.002.
Barnes, B. B. E. et al. (2011) ‘Population attributable risk of invasive postmenopausal breast cancer and breast cancer subtypes for modifiable and non-modifiable risk factors’, Cancer Epidemiology. doi: 10.1016/j.canep.2010.11.003.
Barrdahl, M. et al. (2014) ‘Post-GWAS gene-environment interplay in breast cancer: Results from the Breast and Prostate Cancer Cohort Consortium and a meta-analysis on 79 000 women’, Human Molecular Genetics. doi: 10.1093/hmg/ddu223.
Basham, V. M. et al. (2002) ‘BRCA1 and BRCA2 mutations in a population-based study of male breast cancer’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr419.
Batschauer, A. P. et al. (2011) ‘HFE, MTHFR, and FGFR4 genes polymorphisms and breast cancer in Brazilian women’, Molecular and Cellular Biochemistry. doi: 10.1007/s11010-011-0895-1.
Baumgartner, A. et al. (2004) ‘Parallel evaluation of doxorubicin-induced genetic damage in human lymphocytes and sperm using the comet assay and spectral karyotyping’, Mutagenesis. doi: 10.1093/mutage/geh032.
Becher, H., Schmidt, S. and Chang-Claude, J. (2003) ‘Reproductive factors and familial predisposition for breast cancer by age 50 years. A case-control-family study for assessing main effects and possible gene-environment enteraction’, International Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/ije/dyg003.
Begg, C. B. (2002) ‘On the Use of Familial Aggregation in Population-Based Case Probands for Calculating Penetrance’, CancerSpectrum Knowledge Environment. doi: 10.1093/jnci/94.16.1221.
Benedicl, W. F., Baker, M. S. and Ames, B. N. (1977) ‘Mutagenicity of Cancer Chemotherapeutic Agents in the Salmonella/Microsome Test’, Cancer Research.
Bengsch, F. et al. (2014) ‘Cell type-dependent pathogenic functions of overexpressed human cathepsin B in murine breast cancer progression’, Oncogene. doi: 10.1038/onc.2013.395.
Beral, V. et al. (2001) ‘Familial breast cancer: Collaborative reanalysis of individual data from 52 epidemiological studies including 58 209 women with breast cancer and 101 986 women without the disease’, Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(01)06524-2.
Beral, V. et al. (2002) ‘Breast cancer and breastfeeding: Collaborative reanalysis of individual data from 47 epidemiological studies in 30 countries, including 50 302 women with breast cancer and 96 973 women without the disease’, Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(02)09454-0.
Bernstein, L. (2002) ‘Epidemiology of endocrine-related risk factors for breast cancer’, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. doi: 10.1023/A:1015714305420.
Bertazzoli, C. et al. (1985) ‘Experimental systemic toxicology of 4′-epidoxorubicin, a new, less cardiotoxic anthracycline antitumor agent’, Toxicology and Applied Pharmacology. doi: 10.1016/0041-008X(85)90139-5.
Betts, C. B. et al. (2018) ‘Mucosal Immunity in the Female Murine Mammary Gland’, The Journal of Immunology. doi: 10.4049/jimmunol.1800023.
Bhaskaran, K. et al. (2014) ‘Body-mass index and risk of 22 specific cancers: A population-based cohort study of 5·24 million UK adults’, The Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(14)60892-8.
Bhupathiraju, S. N. et al. (2016) ‘Exogenous hormone use: Oral contraceptives, postmenopausal hormone therapy, and health outcomes in the nurses’ health study’, American Journal of Public Health. doi: 10.2105/AJPH.2016.303349.
Biagini, P. et al. (2001) ‘Genetic analysis of full-length genomes and subgenomic sequences of TT virus-like mini virus human isolates’, Journal of General Virology. doi: 10.1099/0022-1317-82-2-379.
Biagini, P. (2004) ‘Human circoviruses’, in Veterinary Microbiology. doi: 10.1016/j.vetmic.2003.10.004.
Binaschi, M. et al. (1990) ‘Comparison of dna cleavage induced by etoposide and doxorubicin in two human small‐cell lung cancer lines with different sensitivities to topoisomerase ii inhibitors’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.2910450223.
Binaschi, M. et al. (2001) ‘Anthracyclines: selected new developments.’, Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents. doi: 10.2174/1568011013354723.
Blaiklock, P. (2009) RestrictionMapper version 3. Available at: http://restrictionmapper.org/ (Accessed: 4 May 2020).
Blake, K. D. et al. (2017) ‘Making the case for investment in rural cancer control: An analysis of rural cancer incidence, mortality, and funding trends’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-17-0092.
Bose, R. et al. (1995) ‘Ceramide synthase mediates daunorubicin-induced apoptosis: An alternative mechanism for generating death signals’, Cell. doi: 10.1016/0092-8674(95)90429-8.
Boss, I. W. and Renne, R. (2010) ‘Viral miRNAs: Tools for immune evasion’, Current Opinion in Microbiology. doi: 10.1016/j.mib.2010.05.017.
Boucher, R., Livingston, G. K. and Hee, S. S. Q. (1993) ‘In vitro micronucleus bioassay of human peripheral lymphocytes for adriamycin in the presence of cyclophosphamide and urines of patients administered anticancer drugs’, Environmental and Molecular Mutagenesis. doi: 10.1002/em.2850210409.
Van Den Brandt, P. A. et al. (2000) ‘Pooled analysis of prospective cohort studies on height, weight, and breast cancer risk’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/152.6.514.
Brassard, J. et al. (2008) ‘Molecular detection of bovine and porcine Torque teno virus in plasma and feces’, Veterinary Microbiology. doi: 10.1016/j.vetmic.2007.07.014.
Bray, F. et al. (2018) ‘Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries’, CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.21492.
Brigelius-flohé, R. and Maiorino, M. (2013) ‘Biochimica et Biophysica Acta Glutathione peroxidases ☆’, BBA – General Subjects. doi: 10.1016/j.bbagen.2012.11.020.
Briollais, L. et al. (2007) ‘Methodological issues in detecting gene-gene interactions in breast cancer susceptibility: A population-based study in Ontario’, BMC Medicine. doi: 10.1186/1741-7015-5-22.
Brown, J. C. et al. (2012) ‘Cancer, physical activity, and exercise.’, Comprehensive Physiology. doi: 10.1002/cphy.c120005.
Buettner, R., Schölmerich, J. and Bollheimer, L. C. (2007) ‘High-fat diets: Modeling the metabolic disorders of human obesity in rodents’, Obesity. doi: 10.1038/oby.2007.608.
Burcoș, T. et al. (2010) ‘MTRR polymorphism and the risk for colorectal and breast cancer in Romanian patients – A preliminary study’, Chirurgia (Romania).
Burcoș, T. et al. (2013) ‘Analysis of several BRCA1 and BRCA2 mutations in a hospital-based series of unselected breast cancer cases’, Chirurgia (Romania).
Calle, E. E. et al. (1996) ‘Breast cancer and hormonal contraceptives: Collaborative reanalysis of individual data on 53 297 women with breast cancer and 100 239 women without breast cancer from 54 epidemiological studies’, Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(96)90806-5.
Calle, E. E. et al. (1997) ‘Breast cancer and hormone replacement therapy: Collaborative reanalysis of data from 51 epidemiological studies of 52,705 women with breast cancer and 108,411 women without breast cancer’, Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(97)08233-0.
‘Cancer incidence in five continents. Volume IX.’ (2008) IARC scientific publications. doi: 10.1097/00008469-199309000-00010.
‘Cancer incidence in five continents. Volume VIII.’ (2002) IARC scientific publications. doi: 10.1007/bf00050870.
Cardoso, E. M., Reis, C. and Manzanares-Céspedes, M. C. (2018) ‘Chronic periodontitis, inflammatory cytokines, and interrelationship with other chronic diseases’, Postgraduate Medicine. doi: 10.1080/00325481.2018.1396876.
do Carmo, L. S. et al. (2013) ‘The effects of yerba maté (Ilex paraguariensis) consumption on IL-1, IL-6, TNF-α and IL-10 production by bone marrow cells in wistar rats fed a high-fat diet’, International Journal for Vitamin and Nutrition Research. doi: 10.1024/0300-9831/a000142.
Cartwright, I. J. and Higgins, J. A. (1999) ‘Increased dietary triacylglycerol markedly enhances the ability of isolated rabbit enterocytes to secrete chylomicrons: An effect related to dietary fatty acid composition’, Journal of Lipid Research.
Carvalho, C. et al. (2009) ‘Doxorubicin: The Good, the Bad and the Ugly Effect’, Current Medicinal Chemistry. doi: 10.2174/092986709788803312.
Castro, N. P. et al. (2008) ‘Evidence that molecular changes in cells occur before morphological alterations during the progression of breast ductal carcinoma’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr2157.
Catsburg, C., Miller, A. B. and Rohan, T. E. (2015) ‘Active cigarette smoking and risk of breast cancer’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.29266.
Cebula, T. A. (1986) ‘Genetic and physiological modulation of anthracycline‐induced mutagenesis in Salmonella typhimurium’, Environmental Mutagenesis. doi: 10.1002/em.2860080504.
Di Cello, F. et al. (2013) ‘Cigarette smoke induces epithelial to mesenchymal transition and increases the metastatic ability of breast cancer cells’, Molecular Cancer. doi: 10.1186/1476-4598-12-90.
Centers for Disease Control and Prevention (CDC) (2010) ‘Racial and ethnic differences in breastfeeding initiation and duration, by state – National Immunization Survey, United States, 2004-2008.’, MMWR. Morbidity and mortality weekly report.
Chanock, S. J. et al. (2007) ‘Replicating genotype-phenotype associations’, Nature. doi: 10.1038/447655a.
Chatzopoulos, G. et al. (2018) ‘Interleukin-6 and interleukin-10 gene polymorphisms and the risk of further periodontal disease progression’, Brazilian oral research. doi: 10.1590/1807-3107bor-2018.vol32.0011.
Chen, B. et al. (2007) ‘Molecular and cellular mechanisms of anthracycline cardiotoxicity’, in Cardiovascular Toxicology. doi: 10.1007/s12012-007-0005-5.
Chen, C. et al. (2014) ‘Active and passive smoking with breast cancer risk for Chinese females: A systematic review and meta-analysis’, Chinese Journal of Cancer. doi: 10.5732/cjc.013.10248.
Cheng, G. Z. et al. (2008) ‘Twist is transcriptionally induced by activation of STAT3 and mediates STAT3 oncogenic function’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M707429200.
Chien, Y. H., Bau, D. T. and Jan, K. Y. (2004) ‘Nitric oxide inhibits DNA-adduct excision in nucleotide excision repair’, Free Radical Biology and Medicine. doi: 10.1016/j.freeradbiomed.2004.01.011.
Chlebowski, R. T. et al. (2019) ‘Weight loss and breast cancer incidence in postmenopausal women’, Cancer. doi: 10.1002/cncr.31687.
Chung, M. et al. (1996) ‘Younger women with breast carcinoma have a poorer prognosis than older women’, Cancer. doi: 10.1002/(SICI)1097-0142(19960101)77:1<97::AID-CNCR16>3.0.CO;2-3.
Ciaccio, M. et al. (1993) ‘Vitamin A Inhibits Doxorubicin-Induced Membrane Lipid Peroxidation in Rat Tissues in Vivo’, Archives of Biochemistry and Biophysics. doi: 10.1006/abbi.1993.1186.
Cimponeriu, D. et al. (2013) ‘Potential implication of genetic polymorphisms and torque teno virus in sporadic breast cancer’, Romanian Biotechnological Letters.
Claus, E. B. et al. (1996) ‘The genetic attributable risk of breast and ovarian cancer’, Cancer. doi: 10.1002/(SICI)1097-0142(19960601)77:11<2318::AID-CNCR21>3.0.CO;2-Z.
Clavel-Chapelon, F. and Gerber, M. (2002) ‘Reproductive factors and breast cancer risk. Do they differ according to age at diagnosis?’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1023/A:1014891216621.
Cnattingius, S. et al. (2005) ‘Pregnancy characteristics and maternal risk of breast cancer’, Journal of the American Medical Association. doi: 10.1001/jama.294.19.2474.
Colditz, G. A. (1998) ‘Relationship between estrogen levels, use of hormone replacement therapy, and breast cancer’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/90.11.814.
Colditz, G. A. and Bohlke, K. (2015) ‘Preventing breast cancer now by acting on what we already know’, npj Breast Cancer. doi: 10.1038/npjbcancer.2015.9.
Colditz, G. A. and Rosner, B. (2000) ‘Cumulative risk of breast cancer to age 70 years according to risk factor status: Data from the nurses’ health study’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/152.10.950.
Collins, L. C. et al. (2005) ‘Outcome of patients with ductal carcinoma in situ untreated after diagnostic biopsy: Results from the nurses’ health study’, Cancer. doi: 10.1002/cncr.20979.
Cordina-Duverger, E. et al. (2018) ‘Night shift work and breast cancer: a pooled analysis of population-based case–control studies with complete work history’, European Journal of Epidemiology. doi: 10.1007/s10654-018-0368-x.
Cos, S. and Sánchez-Barceló, E. J. (2000) ‘Melatonin, experimental basis for a possible application in breast cancer prevention and treatment’, Histology and Histopathology. doi: 10.14670/HH-15.637.
Cos, Samuel and Sánchez-Barceló, E. J. (2000) ‘Melatonin and mammary pathological growth’, Frontiers in Neuroendocrinology. doi: 10.1006/frne.1999.0194.
Couzin, J. (2003) ‘CANCER RISK: Review Rules Out Abortion-Cancer Link’, Science. doi: 10.1126/science.299.5612.1498b.
Cox, A. et al. (2007) ‘A common coding variant in CASP8 is associated with breast cancer risk’, Nature Genetics. doi: 10.1038/ng1981.
Creixell, P. et al. (2012) ‘Navigating cancer network attractors for tumor-specific therapy’, Nature Biotechnology. doi: 10.1038/nbt.2345.
Cui, J. et al. (2001) ‘After BRCA1 and BRCA2 – What next? Multifactorial segregation analyses of three-generation, population-based Australian families affected by female breast cancer’, American Journal of Human Genetics. doi: 10.1086/318187.
Cui, L. et al. (2015) ‘Transforming growth factor-β1 rs1800469 polymorphism and periodontitis risk: a meta-analysis.’, International journal of clinical and experimental medicine.
Cullen, B. R. (2013) ‘MicroRNAs as mediators of viral evasion of the immune system’, Nature Immunology. doi: 10.1038/ni.2537.
Cummings, J. et al. (1991) ‘The molecular pharmacology of doxorubicin in vivo’, European Journal of Cancer and Clinical Oncology. doi: 10.1016/0277-5379(91)90209-V.
Curtis, C. et al. (2012) ‘The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups’, Nature. doi: 10.1038/nature10983.
Cuzick, J. et al. (2011) ‘Effect of tamoxifen and radiotherapy in women with locally excised ductal carcinoma in situ: Long-term results from the UK/ANZ DCIS trial’, The Lancet Oncology. doi: 10.1016/S1470-2045(10)70266-7.
Czene, K., Lichtenstein, P. and Hemminki, K. (2002) ‘Environmental and heritable causes of cancer among 9.6 million individuals in the Swedish Family-Cancer Database’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.10332.
Dahlstrom, A. et al. (1990) ‘Nicotine and cotinine concentrations in the nursing mother and her infant’, Acta Paediatrica Scandinavica. doi: 10.1111/j.1651-2227.1990.tb11430.x.
Dai, Q., Liu, B. and Du, Y. (2009) ‘Meta-analysis of the risk factors of breast cancer concerning reproductive factors and oral contraceptive use’, Frontiers of Medicine in China. doi: 10.1007/s11684-009-0080-z.
Danaei, G. et al. (2005) ‘Causes of cancer in the world: Comparative risk assessment of nine behavioural and environmental risk factors’, Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(05)67725-2.
Danforth, D. N. and Sgagias, M. K. (1993) ‘Interleukin-la and Interleukin-6 Act Additively to Inhibit Growth of MCF-7 Breast Cancer Cells in Vitro1’, Cancer Research.
Dasgupta, P. et al. (2009) ‘Nicotine induces cell proliferation, invasion and epithelial-mesenchymal transition in a variety of human cancer cell lines’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.23894.
Davidson, F. et al. (1999) ‘Early Acquisition of TT Virus (TTV) in an Area Endemic for TTV Infection’, The Journal of Infectious Diseases. doi: 10.1086/314730.
Deepa, P. R. and Varalakshmi, P. (2006) ‘Influence of a low-molecular-weight heparin derivative on the nitric oxide levels and apoptotic DNA damage in adriamycin-induced cardiac and renal toxicity’, Toxicology. doi: 10.1016/j.tox.2005.09.009.
DeMichele, A. et al. (2003) ‘Interleukin-6 – 174G→C Polymorphism Is Associated with Improved Outcome in High-Risk Breast Cancer’, Cancer Research.
Desantis, C., Siegel, R. and Jemal, A. (2015) ‘Breast Cancer Facts & Figures 2015-2016’, Surveillance and Health Services Research Program. doi: 10.1016/B978-1-4377-1757-0.00028-7.
Dethlefsen, C., Højfeldt, G. and Hojman, P. (2013) ‘The role of intratumoral and systemic IL-6 in breast cancer’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-013-2488-z.
Dhawan, A. et al. (2003) ‘Aneugenic and clastogenic effects of doxorubicin in human lymphocytes’, Mutagenesis. doi: 10.1093/mutage/geg024.
Doroshow, J. H., Tallent, C. and Schechter, J. E. (1985) ‘Ultrastructural features of adriamycin-induced skeletal and cardiac mmuscle toxicity’, American Journal of Pathology.
Dossus, L. et al. (2014a) ‘Active and passive cigarette smoking and breast cancer risk: Results from the EPIC cohort’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.28508.
Dossus, L. et al. (2014b) ‘Active and passive cigarette smoking and breast cancer risk: Results from the EPIC cohort’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.28508.
Dowsett, M. and Folkerd, E. (2015) ‘Reduced progesterone levels explain the reduced risk of breast cancer in obese premenopausal women: a new hypothesis’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-014-3211-4.
Drabsch, Y. et al. (2013) ‘Transforming growth factor-β signalling controls human breast cancer metastasis in a zebrafish xenograft model’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr3573.
Dragojevic-Simic, V. et al. (2013) ‘Efficacy of amifostine in protection against doxorubicin-induced acute cardiotoxic effects in rats’, Vojnosanitetski pregledMilitary Medical and Pharmaceutical Journal of Serbia. doi: 10.2298/vsp110905041d.
Drover, V. A. et al. (2008) ‘CD36 mediates both cellular uptake of very long chain fatty acids and their intestinal absorption in mice’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M708086200.
Duan, Y. et al. (2018) ‘Inflammatory links between high fat diets and diseases’, Frontiers in Immunology. doi: 10.3389/fimmu.2018.02649.
Duda, D. G., Fukumura, D. and Jain, R. K. (2004) ‘Role of eNOS in neovascularization: NO for endothelial progenitor cells’, Trends in Molecular Medicine. doi: 10.1016/j.molmed.2004.02.001.
Duffaud, F. et al. (1998) ‘GENOTOXICITE DE LA DOXORUBICINE ET DU CISPLATINE: RECHERCHE D’UN TEMOIN POSITIF POUR LE TEST DES MICRONOYAUX’, Annales de Biologie Clinique.
Dunning, A. M. et al. (2003) ‘A transforming growth factorβ1 signal peptide variant increases secretion in vitro and is associated with increased incidence of invasive breast cancer’, Cancer Research.
Dupont, W. D. and Plummer, W. D. (1990) ‘Power and sample size calculations. A review and computer program’, Controlled Clinical Trials. doi: 10.1016/0197-2456(90)90005-M.
E.A., M., K.T., V. and K.M., H. (2015) ‘Influence of high-fat diet on gut microbiota: A driving force for chronic disease risk’, Current Opinion in Clinical Nutrition and Metabolic Care. doi: 10.1097/MCO.0000000000000209 LK – http://resolver.ebscohost.com/openurl?sid=EMBASE&issn=14736519&id=doi:10.1097%2FMCO.0000000000000209&atitle=Influence+of+high-fat+diet+on+gut+microbiota%3A+A+driving+force+for+chronic+disease+risk&stitle=Curr.+Opin.+Clin.+Nutr.+Metab.+Care&title=Current+Opinion+in+Clinical+Nutrition+and+Metabolic+Care&volume=18&issue=5&spage=515&epage=520&aulast=Murphy&aufirst=E.+Angela&auinit=E.A.&aufull=Murphy+E.A.&coden=COCMF&isbn=&pages=515-520&date=2015&auinit1=E&auinitm=A.
Easton, D. F., Ford, D. and Bishop, D. T. (1995) ‘Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium.’, American journal of human genetics.
Edwards, B. K. et al. (2005) ‘Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2002, featuring population-based trends in cancer treatment’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/dji289.
El-Moselhy, M. A. and El-Sheikh, A. A. K. (2014) ‘Protective mechanisms of atorvastatin against doxorubicin-induced hepato-renal toxicity’, Biomedicine and Pharmacotherapy. doi: 10.1016/j.biopha.2013.09.001.
Elias, E. V. et al. (2016) ‘Epithelial cells captured from ductal carcinoma in situ reveal a gene expression signature associated with progression to invasive breast cancer’, Oncotarget. doi: 10.18632/oncotarget.12352.
Eliassen, A. H. et al. (2010) ‘Physical activity and risk of breast cancer among postmenopausal women’, Archives of Internal Medicine. doi: 10.1001/archinternmed.2010.363.
Engel, C. L. et al. (2018) ‘Work and female breast cancer: The state of the evidence, 2002–2017’, New Solutions. doi: 10.1177/1048291118758460.
Erdemir, F. et al. (2012) ‘The effect of diet induced obesity on testicular tissue and serum oxidative stress parameters’, Actas Urológicas Españolas (English Edition). doi: 10.1016/j.acuroe.2012.05.003.
Erkko, H. et al. (2007) ‘A recurrent mutation in PALB2 in Finnish cancer families’, Nature. doi: 10.1038/nature05609.
European Commission (2012) Attitudes of Europeans towards tobacco., Special Eurobarometer. doi: 10.2875/670456.
Fabian, C. J. et al. (2000) ‘Short-term breast cancer prediction by random periareolar fine-needle aspiration cytology and the gail risk model’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/92.15.1217.
Fagard, R. H. (2011) ‘Exercise Therapy in Hypertensive Cardiovascular Disease’, Progress in Cardiovascular Diseases. doi: 10.1016/j.pcad.2011.03.006.
Fard, Z. T. (2020) ‘The Relationship Between eNOS Polymorphisms With Age, Smoking, Body Mass Index, and Clinicopathologic Parameters in Patients With Breast Cancer in Comparison With a Control Group’, Clinical Breast Cancer. doi: 10.1016/j.clbc.2019.12.013.
Feigelson, H. S. et al. (2004) ‘Weight Gain, Body Mass Index, Hormone Replacement Therapy, and Postmenopausal Breast Cancer in a Large Prospective Study’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-03-0301.
Feingold, K. R., Lear, S. R. and Moser, A. H. (1984) ‘De novo cholesterol synthesis in three different animal models of diabetes’, Diabetologia. doi: 10.1007/BF00252414.
Fenech, M. (1993) ‘The cytokinesis-block micronucleus technique and its application to genotoxicity studies in human populations’, in Environmental Health Perspectives. doi: 10.2307/3431708.
Feng, Z. (2002) ‘Preferential DNA Damage and Poor Repair Determine ras Gene Mutational Hotspot in Human Cancer’, CancerSpectrum Knowledge Environment. doi: 10.1093/jnci/94.20.1527.
Fink, A. K. and Lash, T. L. (2003) ‘A null association between smoking during pregnancy and breast cancer using Massachusetts registry data (United States)’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1023/A:1024922824237.
Firozi, P. F. et al. (2002) ‘Aromatic DNA adducts and polymorphisms of CYP1A1, NAT2, and GSTM1 in breast cancer’, Carcinogenesis. doi: 10.1093/carcin/23.2.301.
Fishchuk, L. E. and Gorovenko, N. G. (2013) ‘Genetic polymorphisms of the renin-angiotensin system in breast cancer patients’, Experimental Oncology.
FISKESJÖ, G. (1985) ‘The Allium test as a standard in environmental monitoring’, Hereditas. doi: 10.1111/j.1601-5223.1985.tb00471.x.
Fitzmaurice, C. et al. (2019) ‘Global, regional, and national cancer incidence, mortality, years of life lost, years lived with disability, and disability-Adjusted life-years for 29 cancer groups, 1990 to 2017: A systematic analysis for the global burden of disease study’, JAMA Oncology. doi: 10.1001/jamaoncol.2019.2996.
Fogleman, A. J., Mueller, G. S. and Jenkins, W. D. (2015) ‘Does where you live play an important role in cancer incidence in the U.S.?’, American Journal of Cancer Research.
Ford, D. et al. (1994) ‘Risks of cancer in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium.’, Lancet (London, England).
Ford, D. et al. (1998) ‘Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer families’, American Journal of Human Genetics. doi: 10.1086/301749.
Fram, R. J., Egan, E. M. and Kufe, D. W. (1983) ‘Accumulation of leukemic cell DNA strand breaks with adriamycin and cytosine arabinoside’, Leukemia Research. doi: 10.1016/0145-2126(83)90014-0.
Frank, C. et al. (2015) ‘Population landscape of familial cancer’, Scientific Reports. doi: 10.1038/srep12891.
Frank, C. et al. (2017) ‘Concordant and discordant familial cancer: Familial risks, proportions and population impact’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.30583.
Fregene, A. and Newman, L. A. (2005) ‘Breast cancer in sub-Saharan Africa: How does it relate to breast cancer in African-American women?’, Cancer. doi: 10.1002/cncr.20978.
Friebel, T. M., Domchek, S. M. and Rebbeck, T. R. (2014) ‘Modifiers of cancer risk in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: Systematic review and meta-analysis’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/dju091.
Friedenreich, C. M. (2001) ‘Review of anthropometric factors and breast cancer risk’, European Journal of Cancer Prevention. doi: 10.1097/00008469-200102000-00003.
Friedenreich, C. M. (2010) ‘The role of physical activity in breast cancer etiology’, Seminars in Oncology. doi: 10.1053/j.seminoncol.2010.05.008.
Friedenreich, C. M. (2011) ‘Physical activity and breast cancer: Review of the epidemiologic evidence and biologic mechanisms’, Recent Results in Cancer Research. doi: 10.1007/978-3-642-10858-7_11.
Friesen, C., Fulda, S. and Debatin, K. M. (1999) ‘Cytotoxic drugs and the CD95 pathway’, in Leukemia. doi: 10.1038/sj.leu.2401333.
Froelicher, E. S. and Christopherson, D. J. (2000) ‘Women’s initiative for nonsmoking (WINS) I: Design and methods’, Heart and Lung: Journal of Acute and Critical Care. doi: 10.1067/mhl.2000.110323.
Fuglede, N. et al. (2006) ‘Development in incidence of breast cancer in non-screened Danish women, 1973-2002 – A population-based study’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.21654.
Fujioka, S. et al. (2004) ‘Stabilization of p53 is a novel mechanism for proapoptotic function of NF-κB’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M313435200.
Gadhia, P. K. et al. (2008) ‘Induction of chromosomal aberrations in mitotic chromosomes of fish Boleophthalmus dussumieri after exposure in vivo to antineoplastics Bleomycin, Mitomycin-C and Doxorubicin’, Indian Journal of Science and Technology. doi: 10.17485/ijst/2008/v1i7/29598.
Galanis, D. J. et al. (1998) ‘Anthropometric predictors of breast cancer incidence and survival in a multi-ethnic cohort of female residents of Hawaii, United States’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1023/A:1008842613331.
Gao, C. M. et al. (2013) ‘Active and passive smoking, and alcohol drinking and breast cancer risk in Chinese women’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2013.14.2.993.
Gao, X. et al. (2015) ‘ENOS genetic polymorphisms and cancer risk: A meta-analysis and a case-control study of breast cancer’, Medicine (United States). doi: 10.1097/MD.0000000000000972.
Garber, J. E. et al. (1991) ‘Follow-up Study of Twenty-four Families with Li-Fraumeni Syndrome’, Cancer Research.
Garbuglia, A. R. et al. (2003) ‘Detection of TT virus in lymph node biopsies of B-cell lymphoma and Hodgkin’s disease, and its association with EBV infection’, International Journal of Immunopathology and Pharmacology. doi: 10.1177/039463200301600204.
Gaudet, M. M. et al. (2013a) ‘Active smoking and breast cancer risk: Original cohort data and meta-analysis’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/djt023.
Gaudet, M. M. et al. (2013b) ‘Active smoking and breast cancer risk: Original cohort data and meta-analysis’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/djt023.
Gaudet, M. M. et al. (2017) ‘Pooled analysis of active cigarette smoking and invasive breast cancer risk in 14 cohort studies’, International Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/ije/dyw288.
Gauger, K. J. et al. (2009) ‘Down-regulation of sfrp1 in a mammary epithelial cell line promotes the development of a cd44high/cd24low population which is invasive and resistant to anoikis’, Cancer Cell International. doi: 10.1186/1475-2867-9-11.
Geraghty, S. R. et al. (2015) ‘Tobacco Metabolites and Caffeine in Human Milk Purchased via the Internet’, Breastfeeding Medicine. doi: 10.1089/bfm.2015.0096.
Gewirtz, D. A. (1999) ‘A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin’, Biochemical Pharmacology. doi: 10.1016/S0006-2952(98)00307-4.
Giannakeas, V. and Narod, S. A. (2019) ‘A generalizable relationship between mortality and time-to-death among breast cancer patients can be explained by tumour dormancy’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-019-05334-5.
Gianni, L. et al. (2008) ‘Anthracycline cardiotoxicity: From bench to bedside’, Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1200/JCO.2007.14.9401.
Gilcrease, M. Z. (2015) ‘How Many Etiological Subtypes of Breast Cancer: Two, Three, Four, or More?’, Breast Diseases. doi: 10.1016/j.breastdis.2015.10.037.
Gilliam, L. A. A. et al. (2009) ‘Doxorubicin acts through tumor necrosis factor receptor subtype 1 to cause dysfunction of murine skeletal muscle’, Journal of Applied Physiology. doi: 10.1152/japplphysiol.00776.2009.
Gilliam, L. A. A. et al. (2011) ‘Doxorubicin causes diaphragm weakness in murine models of cancer chemotherapy’, Muscle and Nerve. doi: 10.1002/mus.21809.
Gilliland, F. D. et al. (1998) ‘Reproductive risk factors for breast cancer in hispanic and non-hispanic white women: The new mexico women’s health study’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/148.7.683.
Girard, C. et al. (2007) ‘High prevalence of torque teno (TT) virus in classical Kaposi’s sarcoma’, Acta Dermato-Venereologica. doi: 10.2340/00015555-0188.
Gniuli, D. et al. (2008) ‘High saturated-fat diet induces apoptosis in rat enterocytes and blunts GIP and insulin-secretive response to oral glucose load’, International Journal of Obesity. doi: 10.1038/ijo.2008.9.
Goddard, E. T. et al. (2016) ‘Quantitative extracellular matrix proteomics to study mammary and liver tissue microenvironments’, International Journal of Biochemistry and Cell Biology. doi: 10.1016/j.biocel.2016.10.014.
Goddard, E. T. et al. (2019) ‘Association Between Postpartum Breast Cancer Diagnosis and Metastasis and the Clinical Features Underlying Risk’, JAMA network open. doi: 10.1001/jamanetworkopen.2018.6997.
González-Jiménez, E. et al. (2014) ‘Breastfeeding and the prevention of breast cancer: A retrospective review of clinical histories’, Journal of Clinical Nursing. doi: 10.1111/jocn.12368.
Goodman, J. and Hochstein, P. (1977) ‘Generation of free radicals and lipid peroxidation by redox cycling of adriamycin and daunomycin’, Biochemical and Biophysical Research Communications. doi: 10.1016/S0006-291X(77)80048-X.
Gradishar, W. J. (2005) ‘The future of breast cancer: The role of prognostic factors’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-005-0144-y.
Gram, I. T. et al. (2015) ‘Smoking and risk of breast cancer in a racially/ethnically diverse population of mainly women who do not drink alcohol the MEC Study’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/kwv092.
Gram, I. T. et al. (2016) ‘The fraction of breast cancer attributable to smoking: The Norwegian women and cancer study 1991-2012’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/bjc.2016.154.
Gram, I. T. et al. (2019) ‘Smoking and breast cancer risk by race/ethnicity and oestrogen and progesterone receptor status: The Multiethnic Cohort (MEC) study’, International Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/ije/dyy290.
Granström, C., Sundquist, J. and Hemminki, K. (2008) ‘Population attributable risks for breast cancer in Swedish women by morphological type’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-007-9814-2.
Gray, J. M. et al. (2017) ‘State of the evidence 2017: An update on the connection between breast cancer and the environment’, Environmental Health: A Global Access Science Source. doi: 10.1186/s12940-017-0287-4.
Grayson, M. (2012) ‘Breast cancer’, Nature. doi: 10.1038/485S49a.
Gross, C. P. et al. (2006) ‘The relation between projected breast cancer risk, perceived cancer risk, and mammography use: Results from the national health interview survey’, Journal of General Internal Medicine. doi: 10.1111/j.1525-1497.2005.00312.x.
Gruber, B. M. et al. (2005) ‘Relationship between topoisomerase II-DNA cleavable complexes, apoptosis and cytotoxic activity of anthracyclines in human cervix carcinoma cells’, Anticancer Research.
‘Guidelines for the testing of chemicals for mutagenicity. Committee on Mutagenicity of Chemicals in Food, Consumer Products and the Environment.’ (1989) Reports on health and social subjects.
Guillemot-Legris, O. et al. (2016) ‘High-fat diet feeding differentially affects the development of inflammation in the central nervous system’, Journal of Neuroinflammation. doi: 10.1186/s12974-016-0666-8.
Gülkaç, M. D. et al. (2004) ‘Effects of vitamin A on doxorubicin-induced chromosomal aberrations in bone marrow cells of rats’, Mutagenesis. doi: 10.1093/mutage/geh021.
Guo, J. et al. (2008) ‘Nicotine promotes mammary tumor migration via a signaling cascade involving protein kinase C and cdc42’, Cancer Research. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-08-0131.
Guo, Y. et al. (2016) ‘Genetically Predicted Body Mass Index and Breast Cancer Risk: Mendelian Randomization Analyses of Data from 145,000 Women of European Descent’, PLoS Medicine. doi: 10.1371/journal.pmed.1002105.
Guz, J. et al. (2008) ‘The relationship between 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanosine level and extent of cytosine methylation in leukocytes DNA of healthy subjects and in patients with colon adenomas and carcinomas’, Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. doi: 10.1016/j.mrfmmm.2007.12.013.
Hahn, L. W., Ritchie, M. D. and Moore, J. H. (2003) ‘Multifactor dimensionality reduction software for detecting gene-gene and gene-environment interactions’, Bioinformatics. doi: 10.1093/bioinformatics/btf869.
Haiman, C. A. et al. (2003) ‘Genetic Variation in Angiotensin I-Converting Enzyme (ACE) and Breast Cancer Risk: The Multiethnic Cohort’, Cancer Research.
Hajiebrahimi, M. et al. (2016) ‘Pregnancy history and risk of premenopausal breast cancer—a nested case-control study’, International Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/ije/dyv293.
Hall, J. M. et al. (1990) ‘Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21’, Science. doi: 10.1126/science.2270482.
Halliwell, B. (1985) ‘Use of desferrioxamine as a “probe” for iron-dependent formation of hydroxyl radicals. Evidence for a direct reaction between desferal and the superoxide radical’, Biochemical Pharmacology. doi: 10.1016/0006-2952(85)90129-7.
Hamajima, N. et al. (2002) ‘Alcohol, tobacco and breast cancer – Collaborative reanalysis of individual data from 53 epidemiological studies, including 58 515 women with breast cancer and 95 067 women without the disease’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6600596.
Hamilton, B. E. et al. (2015) ‘Births: Preliminary data for 2014’, National Vital Statistics Reports.
Hamilton, B. E. et al. (2018) ‘Births: Provisional data for 2017’, NVSS Vital Statistics Rapid Release.
Hanahan, D. and Weinberg, R. A. (2011) ‘Hallmarks of cancer: The next generation’, Cell. doi: 10.1016/j.cell.2011.02.013.
Hance, K. W. et al. (2005) ‘Trends in inflammatory breast carcinoma incidence and survival: The surveillance, epidemiology, and end results program at the National Cancer Institute’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/dji172.
Hankinson, S. E. et al. (1997) ‘A prospective study of oral contraceptive use and risk of breast cancer (Nurses’ Health Study, United States)’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1023/A:1018435205695.
Hannemann, J. et al. (2006) ‘Classification of ductal carcinoma in situ by gene expression profiling’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr1613.
Hansen, J. (2017) ‘Night Shift Work and Risk of Breast Cancer’, Current environmental health reports. doi: 10.1007/s40572-017-0155-y.
Hao, Y., Montiel, R. and Huang, Y. (2010) ‘Endothelial nitric oxide synthase (eNOS) 894 G>T polymorphism is associated with breast cancer risk: A meta-analysis’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-010-0833-z.
Hartman, Z. C. et al. (2013) ‘Growth of triple-negative breast cancer cells relies upon coordinate autocrine expression of the proinflammatory cytokines IL-6 and IL-8’, Cancer Research. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-12-4524-T.
Haukaas, T. H. et al. (2016) ‘Metabolic clusters of breast cancer in relation to gene- and protein expression subtypes’, Cancer and Metabolism. doi: 10.1186/s40170-016-0152-x.
Zur Hausen, H. and Villiers, E. M. D. (2009) ‘TT viruses: Oncogenic or tumor-suppressive properties?’, Current Topics in Microbiology and Immunology. doi: 10.1007/978-3-540-70972-5_7.
Zur Hausen, H. and De Villiers, E. M. (2005) ‘Virus target cell conditioning model to explain some epidemiologic characteristics of childhood leukemias and lymphomas’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.20905.
Hayden, M. S., West, A. P. and Ghosh, S. (2006) ‘NF-κB and the immune response’, Oncogene. doi: 10.1038/sj.onc.1209943.
He, C. et al. (2015) ‘Circadian disrupting exposures and breast cancer risk: a meta-analysis’, International Archives of Occupational and Environmental Health. doi: 10.1007/s00420-014-0986-x.
He, L. and Shen, Y. (2017) ‘Mthfr C677T polymorphism and breast, ovarian cancer risk: A meta-analysis of 19,260 patients and 26,364 controls’, OncoTargets and Therapy. doi: 10.2147/OTT.S121472.
Hecht, S. S. (1999) ‘Tobacco smoke carcinogens and lung cancer’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/91.14.1194.
Hecht, S. S. (2002) ‘Tobacco smoke carcinogens and breast cancer’, in Environmental and Molecular Mutagenesis. doi: 10.1002/em.10071.
Hedenfalk, I. A. (2006) ‘Gene expression profiling can distinguish tumor subclasses of breast carcinomas’, in Gene Expression Profiling by Microarrays: Clinical Implications. doi: 10.1017/CBO9780511545849.008.
Hefler, L. A. et al. (2005) ‘Interleukin-1 and interleukin-6 gene polymorphisms and the risk of breast cancer in Caucasian women’, Clinical Cancer Research. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-05-0001.
Hegde, R. and Awan, K. H. (2019) ‘Effects of periodontal disease on systemic health’, Disease-a-Month. doi: 10.1016/j.disamonth.2018.09.011.
Heller, F. et al. (2001) ‘Isolate KAV: A new genotype of the TT-virus family’, Biochemical and Biophysical Research Communications. doi: 10.1006/bbrc.2001.6089.
Herman, E. H. et al. (1988) ‘Effect of pretreatment with icrf-187 on the total cumulative dose of doxorubicin tolerated by beagle dogs’, Cancer Research.
Herman, E. H. et al. (2000) ‘Comparison of the protective effects of amifostine and dexrazoxane against the toxicity of doxorubicin in spontaneously hypertensive rats’, Cancer Chemotherapy and Pharmacology. doi: 10.1007/s002800050048.
Herman, E. H., El-Hage, A. and Ferrans, V. J. (1988) ‘Protective effect of ICRF-187 on doxorubicin-induced cardiac and renal toxicity in spontaneously hypertensive (SHR) and normotensive (WKY) rats’, Toxicology and Applied Pharmacology. doi: 10.1016/0041-008X(88)90226-8.
Herman, E. H., Zhang, J. and Ferrans, V. J. (1994) ‘Comparison of the protective effects of desferrioxamine and ICRF-187 against doxorubicin-induced toxicity in spontaneously hypertensive rats’, Cancer Chemotherapy and Pharmacology. doi: 10.1007/BF00686629.
Hernandez, L. et al. (2012) ‘Genomic and mutational profiling of ductal carcinomas in situ and matched adjacent invasive breast cancers reveals intra-tumour genetic heterogeneity and clonal selection’, Journal of Pathology. doi: 10.1002/path.3990.
Hernández Vallejo, S. J. et al. (2009) ‘Short-term adaptation of postprandial lipoprotein secretion and intestinal gene expression to a high-fat diet’, American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. doi: 10.1152/ajpgi.90324.2008.
Higginson, J. and DeVita, V. T. (1980) ‘IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risk of chemicals to humans.’, American Industrial Hygiene Association journal. doi: 10.1136/oem.42.3.214.
Hill, A. B. (1965) ‘The Environment and Disease: Association or Causation?’, Journal of the Royal Society of Medicine. doi: 10.1177/003591576505800503.
Hill, A. B. (2015) ‘The environment and disease: association or causation?’, Journal of the Royal Society of Medicine. doi: 10.1177/0141076814562718.
Hill, S. M. et al. (2011) ‘Melatonin and associated signaling pathways that control normal breast epithelium and breast cancer’, Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. doi: 10.1007/s10911-011-9222-4.
Hill, S. M. et al. (2015) ‘Melatonin: An inhibitor of breast cancer’, Endocrine-Related Cancer. doi: 10.1530/ERC-15-0030.
Hoare, A. et al. (2019) ‘Chronic Inflammation as a Link between Periodontitis and Carcinogenesis’, Mediators of inflammation. doi: 10.1155/2019/1029857.
Hobisch, A. et al. (2000) ‘Immunohistochemical localization of interleukin-6 and its receptor in benign, premalignant and malignant prostate tissue’, Journal of Pathology. doi: 10.1002/1096-9896(2000)9999:9999<::AID-PATH633>3.0.CO;2-X.
Hoeltge, G. A. and Trent, J. M. (1987) ‘Cytogenetic Alterations Associated with the Acquisition of Doxorubicin Resistance: Possible Significance of Chromosome 7 Alterations’, Cancer Research.
Hohenadel, K. et al. (2015) ‘The inclusion of women in studies of occupational cancer: A review of the epidemiologic literature from 1991-2009’, American Journal of Industrial Medicine. doi: 10.1002/ajim.22424.
Hong, S. et al. (2007) ‘Correlates of physical activity level in breast cancer survivors participating in the Women’s Healthy Eating and Living (WHEL) Study’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-006-9284-y.
Horky, P. et al. (2016) ‘Electrochemical methods for study of influence of selenium nanoparticles on antioxidant status of rats’, International Journal of Electrochemical Science. doi: 10.20964/110402799.
Howlader, N. et al. (2014) ‘US incidence of breast cancer subtypes defined by joint hormone receptor and HER2 status’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/dju055.
Howlander, N. et al. (2019) ‘SEER Cancer Statistics Review 1975-2016’, National Cancer Institute.
Hulka, B. S. and Moorman, P. G. (2001) ‘Breast cancer: Hormones and other risk factors’, in Maturitas. doi: 10.1016/S0378-5122(00)00196-1.
Hunter, D. J. et al. (2010) ‘Oral contraceptive use and breast cancer: A prospective study of young women’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-10-0747.
Huo, D. et al. (2008) ‘Parity and breastfeeding are protective against breast cancer in Nigerian women’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6604275.
Hussain, T. et al. (2012) ‘Phylogenetic analysis of torque teno virus genome from Pakistani isolate and incidence of co-infection among HBV/HCV infected patients’, Virology Journal. doi: 10.1186/1743-422X-9-320.
Huynh, H., Chow, P. K. H. and Soo, K. C. (2007) ‘AZD6244 and doxorubicin induce growth suppression and apoptosis in mouse models of hepatocellular carcinoma’, Molecular Cancer Therapeutics. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-07-0162.
Huzell, L. et al. (2015) ‘History of oral contraceptive use in breast cancer patients: impact on prognosis and endocrine treatment response’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-014-3252-8.
Iacopetta, B., Grieu, F. and Joseph, D. (2004) ‘The – 174 G/C gene polymorphism in interleukin-6 is associated with an aggressive breast cancer phenotype’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6601545.
‘IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans’ (2010) IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. doi: 10.1136/jcp.48.7.691-a.
IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans (2012) ‘Personal habits and indoor combustions. Volume 100 E. A review of human carcinogens.’, IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans / World Health Organization, International Agency for Research on Cancer.
Ilic, M., Vlajinac, H. and Marinkovic, J. (2013) ‘Cigarette smoking and breast cancer: A case-control study in Serbia’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2013.14.11.6643.
Innes, K., Byers, T. and Schymura, M. (2000) ‘Birth characteristics and subsequent risk for breast cancer in very young women’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/152.12.1121.
Innes, K. E. and Byers, T. E. (2004) ‘First pregnancy characteristics and subsequent breast cancer risk among young women’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.20402.
International Agency for Research on Cancer (IARC) (2004) ‘IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Tobacco smoke and involuntary smoking’, IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans.
Iqbal, J. and Hussain, M. M. (2009) ‘Intestinal lipid absorption’, American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. doi: 10.1152/ajpendo.90899.2008.
Islami, F. et al. (2015) ‘Breastfeeding and breast cancer risk by receptor status-a systematic review and meta-analysis’, Annals of Oncology. doi: 10.1093/annonc/mdv379.
Itoh, M. et al. (2001) ‘High prevalence of TT virus in human bile juice samples: Importance of secretion through bile into feces’, Digestive Diseases and Sciences. doi: 10.1023/A:1005618308943.
Iyengar, N. M. et al. (2019) ‘Association of Body Fat and Risk of Breast Cancer in Postmenopausal Women with Normal Body Mass Index: A Secondary Analysis of a Randomized Clinical Trial and Observational Study’, in JAMA Oncology. doi: 10.1001/jamaoncol.2018.5327.
J. Sanchez-Barcelo, E. et al. (2012) ‘Breast Cancer Therapy Based on Melatonin’, Recent Patents on Endocrine, Metabolic & Immune Drug Discovery. doi: 10.2174/187221412800604581.
J.S., S. et al. (1996) ‘Menstrual and reproductive factors related to the risk of breast cancer in Korea. Ovarian hormone effect on breast cancer.’, Journal of Korean medical science.
Jadeski, L. C. et al. (2000) ‘Nitric oxide promotes murine mammary tumour growth and metastasis by stimulating tumour cell migration, invasiveness and angiogenesis’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/(SICI)1097-0215(20000401)86:1<30::AID-IJC5>3.0.CO;2-I.
Jadeski, L. C., Chakraborty, C. and Lala, P. K. (2002) ‘Role of nitric oxide in tumour progression with special reference to a murine breast cancer model’, Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. doi: 10.1139/y02-007.
Jadeski, L. C., Chakraborty, C. and Lala, P. K. (2003) ‘Nitric oxide-mediated promotion of mammary tumour cell migration requires sequential activation of nitric oxide synthase, guanylate cyclase and mitogen-activated protein kinase’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.11268.
Jagetia, G. C. and Nayak, V. (1996) ‘Micronuclei-induction and its correlation to cell survival in HeLa cells treated with different doses of adriamycin’, Cancer Letters. doi: 10.1016/S0304-3835(96)04470-9.
Jagetia, G. C. and Nayak, V. (2000) ‘Effect of doxorubicin on cell survival and micronuclei formation in HeLa cells exposed to different doses of gamma-radiation’, Strahlentherapie und Onkologie. doi: 10.1007/PL00002351.
Jain, M. et al. (2005) ‘Restrained molecular dynamics studies on complex of adriamycin with DNA hexamer sequence d-CGATCG’, Archives of Biochemistry and Biophysics. doi: 10.1016/j.abb.2005.05.009.
James Kang, Y., Chen, Y. and Epstein, P. N. (1996) ‘Suppression of doxorubicin cardiotoxicity by overexpression of catalase in the heart of transgenic mice’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.271.21.12610.
Jayasekara, H. et al. (2016) ‘Is breast cancer risk associated with alcohol intake before first full-term pregnancy?’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1007/s10552-016-0789-3.
Jelcic, I. et al. (2004) ‘Isolation of Multiple TT Virus Genotypes from Spleen Biopsy Tissue from a Hodgkin’s Disease Patient: Genome Reorganization and Diversity in the Hypervariable Region’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.78.14.7498-7507.2004.
Jemal, A. et al. (2017) ‘Annual Report to the Nation on the Status of Cancer, 1975-2014, Featuring Survival’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/djx030.
Jia, Y. et al. (2013) ‘Does night work increase the risk of breast cancer? A systematic review and meta-analysis of epidemiological studies’, Cancer Epidemiology. doi: 10.1016/j.canep.2013.01.005.
Jiang, X. P. et al. (2011) ‘Down-regulation of expression of interleukin-6 and its receptor results in growth inhibition of MCF-7 breast cancer cells’, Anticancer Research.
Jindal, S. et al. (2014) ‘Postpartum breast involution reveals regression of secretory lobules mediated by tissue-remodeling’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr3633.
Johanning, G. L. et al. (1995) ‘Ethnic differences in angiotensin converting enzyme gene polymorphism’, Journal of Hypertension. doi: 10.1097/00004872-199506000-00021.
Johansson, A. L. V. et al. (2013) ‘Stage at diagnosis and mortality in women with pregnancy-associated breast cancer (PABC)’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-013-2522-1.
John, E. M. et al. (2018) ‘Reproductive history, breast-feeding and risk of triple negative breast cancer: The Breast Cancer Etiology in Minorities (BEM) study’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.31258.
Johnson, K. C. (2005) ‘Accumulating evidence on passive and active smoking and breast cancer risk’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.21150.
Johnson, K. C. et al. (2011) ‘Active smoking and secondhand smoke increase breast cancer risk: the report of the Canadian Expert Panel on Tobacco Smoke and Breast Cancer Risk (2009)’, Tobacco Control. doi: 10.1136/tc.2010.035931.
Jones, M. E. et al. (2017) ‘Smoking and risk of breast cancer in the Generations Study cohort’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/s13058-017-0908-4.
JONES, S. A. et al. (2001) ‘The soluble interleukin 6 receptor: mechanisms of production and implications in disease’, The FASEB Journal. doi: 10.1096/fj.99-1003rev.
Jung, K. and Reszka, R. (2001) ‘Mitochondria as subcellular targets for clinically useful anthracyclines’, Advanced Drug Delivery Reviews. doi: 10.1016/S0169-409X(01)00128-4.
Kadouri, L. et al. (2007) ‘A novel BRCA-1 mutation in Arab kindred from east Jerusalem with breast and ovarian cancer’, BMC Cancer. doi: 10.1186/1471-2407-7-14.
Kamdar, B. B. et al. (2013) ‘Night-shift work and risk of breast cancer: A systematic review and meta-analysis’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-013-2433-1.
Karapanou, O. and Papadimitriou, A. (2010) ‘Determinants of menarche’, Reproductive Biology and Endocrinology. doi: 10.1186/1477-7827-8-115.
Kasahara, K. et al. (1992) ‘Determinants of response to the DNA topoisomerase II inhibitors doxorubicin and etoposide in human lung cancer cell lines’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/84.2.113.
Kasajova, P. et al. (2016) ‘Active cigarette smoking and the risk of breast cancer at the level of N-acetyltransferase 2 (NAT2) gene polymorphisms’, Tumor Biology. doi: 10.1007/s13277-015-4685-3.
Katsuno, Y., Lamouille, S. and Derynck, R. (2013) ‘TGF-β signaling and epithelial-mesenchymal transition in cancer progression’, Current Opinion in Oncology. doi: 10.1097/CCO.0b013e32835b6371.
Kauppila, A. et al. (2012) ‘Dual effect of short interval between first and second birth on ductal breast cancer risk in Finland’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1007/s10552-011-9868-7.
Kawasaki, N. et al. (2012) ‘Obesity-induced endoplasmic reticulum stress causes chronic inflammation in adipose tissue’, Scientific Reports. doi: 10.1038/srep00799.
Kazi, A. et al. (2000) ‘High frequency of postnatal transmission of TT virus in infancy’, Archives of Virology. doi: 10.1007/s007050050044.
Kelsey, J. L. (1993) ‘Breast Cancer Epidemiology: Summary and Future Directions’, Epidemiologic Reviews. doi: 10.1093/oxfordjournals.epirev.a036112.
Kerr, J., Anderson, C. and Lippman, S. M. (2017) ‘Physical activity, sedentary behaviour, diet, and cancer: an update and emerging new evidence’, The Lancet Oncology. doi: 10.1016/S1470-2045(17)30411-4.
Keum, N. et al. (2015) ‘Adult weight gain and adiposity-related cancers: A dose-response meta-analysis of prospective observational studies’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/djv088.
Key, T. J., Verkasalo, P. K. and Banks, E. (2001) ‘Epidemiology of breast cancer’, Lancet Oncology. doi: 10.1016/S1470-2045(00)00254-0.
Khairy, G. A. et al. (2005) ‘Bilateral breast cancer. Incidence, diagnosis and histological patterns’, Saudi Medical Journal.
Khalis, M. et al. (2018) ‘Menstrual and reproductive factors and risk of breast cancer: A case-control study in the Fez region, Morocco’, PLoS ONE. doi: 10.1371/journal.pone.0191333.
Khuder, S. A. and Simon, V. J. (2000) ‘Is there an association between passive smoking and breast cancer?’, European Journal of Epidemiology. doi: 10.1023/A:1010967513957.
Kim, Y. et al. (2007) ‘Dose-dependent protective effect of breast-feeding against breast cancer among ever-lactated women in Korea’, European Journal of Cancer Prevention. doi: 10.1097/01.cej.0000228400.07364.52.
Kincaid, R. P. et al. (2013) ‘A Human Torque Teno Virus Encodes a MicroRNA That Inhibits Interferon Signaling’, PLoS Pathogens. doi: 10.1371/journal.ppat.1003818.
Kincaid, R. P. and Sullivan, C. S. (2012) ‘Virus-Encoded microRNAs: An Overview and a Look to the Future’, PLoS Pathogens. doi: 10.1371/journal.ppat.1003018.
Kinoshita, T., Ito, H. and Miki, C. (1999) ‘Serum interleukin-6 level reflects the tumor proliferative activity in patients with colorectal carcinoma’, Cancer. doi: 10.1002/(SICI)1097-0142(19990615)85:12<2526::AID-CNCR6>3.0.CO;2-3.
Kirsch-Volders, M. (2001) ‘Inclusion of micronuclei in non-divided mononuclear lymphocytes and necrosis/apoptosis may provide a more comprehensive cytokinesis block micronucleus assay for biomonitoring purposes’, Mutagenesis. doi: 10.1093/mutage/16.1.51.
Kispert, S., Marentette, J. and McHowat, J. (2015) ‘Cigarette smoke induces cell motility via platelet-activating factor accumulation in breast cancer cells: A potential mechanism for metastatic disease’, Physiological Reports. doi: 10.14814/phy2.12318.
Kispert, S. and McHowat, J. (2017) ‘Recent insights into cigarette smoking as a lifestyle risk factor for breast cancer’, Breast Cancer: Targets and Therapy. doi: 10.2147/BCTT.S129746.
Kittaneh, M., Montero, A. J. and Glück, S. (2013) ‘Molecular Profiling for Breast Cancer: A Comprehensive Review’, Biomarkers in Cancer. doi: 10.4137/bic.s9455.
Klimova Yu., M., Novitsky, V. V. and Goldberg, E. D. (1990) ‘Early and late effects of cytogenetic action of doxorubicin’, Antibiotiki i Khimioterapiya.
Knudsen, E. S. et al. (2012) ‘Progression of ductal carcinoma in situ to invasive breast cancer is associated with gene expression programs of EMT and myoepithelia’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-011-1894-3.
Koboldt, D. C. et al. (2012) ‘Comprehensive molecular portraits of human breast tumours’, Nature. doi: 10.1038/nature11412.
Koh, W. P. et al. (2003) ‘Angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene polymorphism and breast cancer risk among Chinese women in Singapore’, Cancer Research.
Kondo, H. et al. (2006) ‘Differential regulation of intestinal lipid metabolism-related genes in obesity-resistant A/J vs. obesity-prone C57BL/6J mice’, American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism. doi: 10.1152/ajpendo.00583.2005.
Kotamraju, S. et al. (2000) ‘Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen. Role of reactive oxygen and nitrogen species’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M003890200.
Kotsopoulos, J. et al. (2007) ‘Age at first birth and the risk of breast cancer in BRCA1 and BRCA2 mutation carriers’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-006-9441-3.
Kour, A. et al. (2019) ‘Risk factor analysis for breast cancer in premenopausal and postmenopausal women of Punjab, India’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.31557/APJCP.2019.20.11.3299.
Kristensen, G. N. (2014) ‘Testing “ Clemmensen ” s hook ’ in the death rate from breast cancer’, Journal of Statistical and Econometric Methods.
Kristensen, V. N. et al. (2012) ‘Integrated molecular profiles of invasive breast tumors and ductal carcinoma in situ (DCIS) reveal differential vascular and interleukin signaling’, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. doi: 10.1073/pnas.1108781108.
Kruk, J. (2014) ‘Lifestyle components and primary breast cancer prevention’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2014.15.24.10543.
Kuchenbaecker, K. B. et al. (2017) ‘Risks of breast, ovarian, and contralateral breast cancer for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers’, JAMA – Journal of the American Medical Association. doi: 10.1001/jama.2017.7112.
Kumle, M. et al. (2002) ‘Use of oral contraceptives and breast cancer risk: The Norwegian-Swedish women’s lifestyle and health cohort study’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention.
Kundu, C. N. et al. (2007) ‘Cigarette smoke condensate-induced level of adenomatous polyposis coli blocks long-patch base excision repair in breast epithelial cells’, Oncogene. doi: 10.1038/sj.onc.1209925.
Kushi, L. H. et al. (2012) ‘American Cancer Society guidelines on nutrition and physical activity for cancer prevention: Reducing the Risk of Cancer with Healthy Food Choices and Physical Activity’, CA Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.20140.
Kusyk, C. J. and Hsu, T. C. (1976) ‘Adriamycin-induced chromosome damage: Elevated frequencies of isochromatid aberrations in G2 and S phases’, Experientia. doi: 10.1007/BF01924424.
L., K. et al. (2007) ‘A novel BRCA-1 mutation in Arab kindred from east Jerusalem with breast and ovarian cancer’, BMC Cancer.
L’Ecuyer, T. et al. (2006) ‘DNA damage is an early event in doxorubicin-induced cardiac myocyte death’, American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. doi: 10.1152/ajpheart.00738.2005.
de la Rochefordière, A. et al. (1993) ‘Age as prognostic factor in premenopausal breast carcinoma’, The Lancet. doi: 10.1016/0140-6736(93)92407-K.
Lakhani, S. R. and Ashworth, A. (2001) ‘Microarray and histopathological analysis of tumours: The future and the past?’, Nature Reviews Cancer. doi: 10.1038/35101087.
Lambe, M. et al. (1994) ‘Transient increase in the risk of breast cancer after giving birth’, New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJM199407073310102.
Lambe, M. et al. (1996) ‘Parity, age at first and last birth, and risk of breast cancer: A population-based study in Sweden’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/BF01806150.
Lambertini, M. et al. (2016) ‘Reproductive behaviors and risk of developing breast cancer according to tumor subtype: A systematic review and meta-analysis of epidemiological studies’, Cancer Treatment Reviews. doi: 10.1016/j.ctrv.2016.07.006.
Land, S. R. et al. (2014) ‘Cigarette smoking, physical activity, and alcohol consumption as predictors of cancer incidence among women at high risk of breast cancer in the NSABP P-1 trial’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-13-1105-T.
Lankelma, J. et al. (2003) ‘Simulation model of doxorubicin activity in islets of human breast cancer cells’, Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. doi: 10.1016/S0304-4165(03)00139-9.
Larramendy, M. L. et al. (1980) ‘In vivo dose—response relationship in bone-marrow cells of mice treated with adriamycin’, Mutation Research – Genetic Toxicology. doi: 10.1016/0165-1218(80)90081-6.
Lash, T. L. and Aschengrau, A. (2002) ‘A null association between active or passive cigarette smoking and breast cancer risk’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1023/A:1019625102365.
Leal, A. D. et al. (2014) ‘Fosaprepitant-induced phlebitis: A focus on patients receiving doxorubicin/cyclophosphamide therapy’, Supportive Care in Cancer. doi: 10.1007/s00520-013-2089-8.
Leary, T. P. et al. (1999) ‘Improved detection systems for TT virus reveal high prevalence in humans, non-human primates and farm animals’, Journal of General Virology. doi: 10.1099/0022-1317-80-8-2115.
Lebrecht, D. et al. (2005) ‘Tissue-specific mtDNA lesions and radical-associated mitochondrial dysfunction in human hearts exposed to doxorubicin’, Journal of Pathology. doi: 10.1002/path.1863.
Lee, I. P. and Dixon, R. L. (1978) ‘Mutagenicity, carcinogenicity and teratogenicity of procarbazine’, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology. doi: 10.1016/0165-1110(78)90009-X.
Lee, R. C., Feinbaum, R. L. and Ambros, V. (1993) ‘The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14’, Cell. doi: 10.1016/0092-8674(93)90529-Y.
Lee, R. J. et al. (2012) ‘Ductal carcinoma in situ of the breast’, International Journal of Surgical Oncology. doi: 10.1155/2012/123549.
Leppik, L. et al. (2007) ‘In Vivo and In Vitro Intragenomic Rearrangement of TT Viruses’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.00781-07.
Leslie, K. et al. (2010) ‘Differential interleukin-6/Stat3 signaling as a function of cellular context mediates Ras-induced transformation’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr2725.
Leygue, E. et al. (2000) ‘Lumican and decorin are differentially expressed in human breast carcinoma’, Journal of Pathology. doi: 10.1002/1096-9896(200011)192:3<313::AID-PATH694>3.0.CO;2-B.
Li, B. et al. (2015) ‘Passive smoking and breast cancer risk among non-smoking women: A case-control study in China’, PLoS ONE. doi: 10.1371/journal.pone.0125894.
Li, C. I. et al. (2009) ‘Relationship between potentially modifiable lifestyle factors and risk of second primary contralateral breast cancer among women diagnosed with estrogen receptor-positive invasive breast cancer’, Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1200/JCO.2009.23.1597.
Li, F. P. et al. (1988) ‘A Cancer Family Syndrome in Twenty-four Kindreds’, Cancer Research.
Li, F. P. (1995) ‘Phenotypes, Genotypes, and Interventions for Hereditary Cancers’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention.
Li, F. P. and Fraumeni, J. F. (1969) ‘Soft-tissue sarcomas, breast cancer, and other neoplasms. A familial syndrome?’, Annals of internal medicine. doi: 10.7326/0003-4819-71-4-747.
Li, H., Horke, S. and Förstermann, U. (2013) ‘Oxidative stress in vascular disease and its pharmacological prevention’, Trends in Pharmacological Sciences. doi: 10.1016/j.tips.2013.03.007.
Li, L. et al. (2012) ‘Attributable causes of breast cancer and ovarian cancer in China: Reproductive factors, oral contraceptives and hormone replacement therapy’, Chinese Journal of Cancer Research. doi: 10.1007/s11670-012-0009-y.
Li, L. H. and Yu, F. L. (1993) ‘Transcriptional specificities of adriamycin’, Biochemistry and Molecular Biology International.
Licata, S. et al. (2000) ‘Doxorubicin metabolism and toxicity in human myocardium: Role of cytoplasmic deglycosidation and carbonyl reduction’, Chemical Research in Toxicology. doi: 10.1021/tx000013q.
Lichtenstein, P. et al. (2000) ‘Environmental and heritable factors in the causation of cancer: Analyses of cohorts of twins from Sweden, Denmark, and Finland’, New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJM200007133430201.
Lin, C. Y. et al. (2019) ‘Genomic landscape of ductal carcinoma in situ and association with progression’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-019-05401-x.
Lipshultz, S. E. et al. (2006) ‘The relevance of information generated by in vitro experimental models to clinical doxorubicin cardiotoxicity’, Leukemia and Lymphoma. doi: 10.1080/10428190600800231.
Liu, Y. et al. (2019) ‘BRCA1/BRCA2 mutations in Japanese women with ductal carcinoma in situ’, Molecular Genetics and Genomic Medicine. doi: 10.1002/mgg3.493.
Liu, Y., Nguyen, N. and Colditz, G. A. (2015) ‘Links between alcohol consumption and breast cancer: A look at the evidence’, Women’s Health. doi: 10.2217/whe.14.62.
Lord, S. J. et al. (2008) ‘Breast cancer risk and hormone receptor status in older women by parity, age of first birth, and breastfeeding: A case-control study’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-07-2824.
Low, J. A. et al. (2004) ‘Long-term follow-up for locally advanced and inflammatory breast cancer patients treated with multimodality therapy’, Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1200/JCO.2004.04.068.
Lu, J. et al. (2006) ‘Promoter polymorphism (-786T>C) in the endothelial nitric oxide synthase gene is associated with risk of sporadic breast cancer in non-Hispanic white women age younger than 55 years’, Cancer. doi: 10.1002/cncr.22269.
Lukanova, A. et al. (2006) ‘Body mass index and cancer: Results from the Northern Sweden Health and Disease Cohort’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.21354.
Lumeng, C. N. et al. (2007) ‘Increased inflammatory properties of adipose tissue macrophages recruited during diet-induced obesity’, Diabetes. doi: 10.2337/db06-1076.
Lund, L. R. et al. (1996) ‘Two distinct phases of apoptosis in mammary gland involution: Proteinase-independent and -dependent pathways’, Development.
Luo, J. et al. (2011) ‘Association of active and passivesmoking with risk of breast cancer among postmenopausal women: A prospective cohort study’, BMJ. doi: 10.1136/bmj.d1016.
Lyons, T. R. et al. (2011) ‘Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2’, Nature Medicine. doi: 10.1038/nm.2416.
Lyons, T. R. et al. (2014) ‘Cyclooxygenase-2-dependent lymphangiogenesis promotes nodal metastasis of postpartum breast cancer’, Journal of Clinical Investigation. doi: 10.1172/JCI73777.
Ma, X. J. et al. (2003) ‘Gene expression profiles of human breast cancer progression’, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. doi: 10.1073/pnas.0931261100.
Ma, X. J. et al. (2009) ‘Gene expression profiling of the tumor microenvironment during breast cancer progression’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr2222.
Maas, P. et al. (2016) ‘Breast Cancer Risk From Modifiable and Nonmodifiable Risk Factors Among White Women in the United States’, JAMA oncology. doi: 10.1001/jamaoncol.2016.1025.
Macacu, A. et al. (2015a) ‘Active and passive smoking and risk of breast cancer: a meta-analysis’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-015-3628-4.
Macacu, A. et al. (2015b) ‘Active and passive smoking and risk of breast cancer: a meta-analysis’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-015-3628-4.
Madigan, M. P. et al. (1995) ‘Proportion of breast cancer cases in the United States explained by well-established risk factors’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/87.22.1681.
Majeed, W. et al. (2014) ‘Breast cancer: Major risk factors and recent developments in treatment’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2014.15.8.3353.
Malik, A. et al. (2015) ‘Passive smoking and breast cancer – A suspicious link’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2015.16.14.5715.
Malvia, S. et al. (2017) ‘Epidemiology of breast cancer in Indian women’, Asia-Pacific Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1111/ajco.12661.
Manjer, J., Johansson, R. and Lenner, P. (2004) ‘Smoking is associated with postmenopausal breast cancer in women with high levels of estrogens’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.20409.
Manni, F. et al. (2002) ‘Detecting recombination in TT virus: A phylogenetic approach’, Journal of Molecular Evolution. doi: 10.1007/s00239-002-2352-y.
Mansha, M. et al. (2016) ‘Prevalence of known risk factors in women diagnosed with breast cancer at INMOL hospital, Lahore, Punjab’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2016.17.2.563.
Mansilla, S., Priebe, W. and Portugal, J. (2006) ‘Mitotic catastrophe results in cell death by caspase-dependent and caspase-independent mechanisms’, Cell Cycle. doi: 10.4161/cc.5.1.2267.
Manton, K. G. and Stallard, E. (1980) ‘A two-disease model of female breast cancer: Mortality in 1969 among white females in the United States’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/64.1.9.
Mantovani, A. et al. (2008) ‘Cancer-related inflammation’, Nature. doi: 10.1038/nature07205.
Le Marchand, L. et al. (2004) ‘MTHFR polymorphisms, diet, HRT, and breast cancer risk: The multiethnic cohort study’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention.
Mariscal, L. F. et al. (2002) ‘TT virus replicates in stimulated but not in nonstimulated peripheral blood mononuclear cells’, Virology. doi: 10.1006/viro.2002.1545.
Markham, N. R. and Zuker, M. (2005) ‘DINAMelt web server for nucleic acid melting prediction’, Nucleic Acids Research. doi: 10.1093/nar/gki591.
Martin, K., Froelicher, E. S. and Miller, N. H. (2000) ‘Women’s Initiative for Nonsmoking (WINS) II: The intervention’, Heart and Lung: Journal of Acute and Critical Care. doi: 10.1067/mhl.2000.110576.
Martins, R. A. et al. (2012) ‘Exercise preconditioning modulates genotoxicity induced by doxorubicin in multiple organs of rats’, Cell Biochemistry and Function. doi: 10.1002/cbf.2799.
Martinson, H. A. et al. (2015) ‘Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.29181.
Mathews, T. J. and Hamilton, B. E. (2016) ‘Mean Age of Mothers is on the Rise: United States, 2000-2014’, NCHS data brief.
Matsuda, T. et al. (2012) ‘Cancer incidence and incidence rates in Japan in 2006: Based on data from 15 population-based cancer registries in the Monitoring of Cancer Incidence in Japan (MCIJ) project’, Japanese Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1093/jjco/hyr184.
Mayberry, R. M. and Branch, P. T. (1994) ‘Breast cancer risk factors among Hispanic women.’, Ethnicity & disease.
Mazilu, V. et al. (2003) ‘Diagnosis characteristics features in breast cancer’, Chirurgia (Bucharest, Romania : 1990).
McDaniel, S. M. et al. (2006) ‘Remodeling of the mammary microenvironment after lactation promotes breast tumor cell metastasis’, American Journal of Pathology. doi: 10.2353/ajpath.2006.050677.
McLaughlin-Drubin, M. E. and Munger, K. (2008) ‘Viruses associated with human cancer’, Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. doi: 10.1016/j.bbadis.2007.12.005.
McPhillips, J. B. et al. (1994) ‘Dietary differences in smokers and nonsmokers from two southeastern New England communities’, Journal of the American Dietetic Association. doi: 10.1016/0002-8223(94)90370-0.
Mctiernan, A. et al. (2019) ‘Physical Activity in Cancer Prevention and Survival: A Systematic Review’, Medicine and Science in Sports and Exercise. doi: 10.1249/MSS.0000000000001937.
Megdal, S. P. et al. (2005) ‘Night work and breast cancer risk: A systematic review and meta-analysis’, European Journal of Cancer. doi: 10.1016/j.ejca.2005.05.010.
Meistrich, M. L. et al. (1990) ‘Low Levels of Chromosomal Mutations in Germ Cells Derived from Doxorubicin-treated Stem Spermatogonia in the Mouse’, Cancer Research.
Memon, Z. A. et al. (2015) ‘Risk of breast cancer among young women and importance of early screening’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2015.16.17.7485.
Menna, P., Salvatorelli, E. and Minotti, G. (2008) ‘Cardiotoxicity of antitumor drugs’, Chemical Research in Toxicology. doi: 10.1021/tx800002r.
Michailidou, K. et al. (2013) ‘Large-scale genotyping identifies 41 new loci associated with breast cancer risk’, Nature Genetics. doi: 10.1038/ng.2563.
Michels, K. B., Terry, K. L. and Willett, W. C. (2006) ‘Longitudinal study on the role of body size in premenopausal breast cancer’, Archives of Internal Medicine. doi: 10.1001/archinte.166.21.2395.
Mihalcea, C. E. et al. (2015) ‘Particular molecular and ultrastructural aspects in invasive mammary carcinoma’, Romanian Journal of Morphology and Embryology.
Mihalcea, C. E. et al. (2017) ‘Molecular analysis of brca1 and brca2 genes by next generation sequencing and ultrastructural aspects of breast tumor tissue’, Romanian Journal of Morphology and Embryology.
Milne, R. I. et al. (2008) ‘The importance of replication in gene-gene interaction studies: multifactor dimensionality reduction applied to a two-stage breast cancer case-control study’, Carcinogenesis. doi: 10.1093/carcin/bgn120.
Minotti, G. (1989) ‘Reactions of adriamycin with microsomal iron and lipids’, Free Radical Research. doi: 10.3109/10715768909087936.
Minotti, G. et al. (2004) ‘Anthracyclines: Molecular advances and pharmacologie developments in antitumor activity and cardiotoxicity’, Pharmacological Reviews. doi: 10.1124/pr.56.2.6.
Miyata, H. et al. (1999) ‘Identification of a Novel GC-Rich 113-Nucleotide Region To Complete the Circular, Single-Stranded DNA Genome of TT Virus, the First Human Circovirus’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.73.5.3582-3586.1999.
Mize, T. W. et al. (2015) ‘Increased and correlated expression of connective tissue growth factor and transforming growth factor beta 1 in surgically removed periodontal tissues with chronic periodontitis’, Journal of Periodontal Research. doi: 10.1111/jre.12208.
Moghimi, M. et al. (2018) ‘Angiotensin converting enzyme insertion/deletion polymorphism is associated with breast cancer risk: A meta-analysis’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.31557/APJCP.2018.19.11.3225.
Mohamed, M. M. et al. (2010) ‘Interleukin-6 increases expression and secretion of cathepsin B by breast tumor-associated monocytes’, Cellular Physiology and Biochemistry. doi: 10.1159/000276564.
Mohamed, N. et al. (2018) ‘Genotoxic Effects of the Anti-Cancer Drug Doxorubicin (Dxr) in the Bone Marrow Cells of Swiss Albino Mice (Mus musculus)’, Journal of Agricultural Chemistry and Biotechnology. doi: 10.21608/jacb.2018.35380.
Mohandass, J. et al. (2010) ‘BCDB – A database for breast cancer research and information’, Bioinformation. doi: 10.6026/97320630005001.
Möller, S. et al. (2016) ‘The heritability of breast cancer among women in the nordic twin study of cancer’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-15-0913.
Momenimovahed, Z. and Salehiniya, H. (2019) ‘Epidemiological characteristics of and risk factors for breast cancer in the world’, Breast Cancer: Targets and Therapy. doi: 10.2147/BCTT.S176070.
Moore, J. H. (2003) ‘The ubiquitous nature of epistasis in determining susceptibility to common human diseases’, in Human Heredity. doi: 10.1159/000073735.
Moore, J. H. and Williams, S. M. (2002) ‘New strategies for identifying gene-gene interactions in hypertension’, Annals of Medicine. doi: 10.1080/07853890252953473.
Morabia, A. and Wynder, E. L. (1990) ‘Dietary habits of smokers, people who never smoked, and exsmokers’, American Journal of Clinical Nutrition. doi: 10.1093/ajcn/52.5.933.
Mørch, L. S. et al. (2017) ‘Contemporary hormonal contraception and the risk of breast cancer’, New England Journal of Medicine. doi: 10.1056/NEJMoa1700732.
Mordente, A. et al. (2009) ‘New Developments in Anthracycline-Induced Cardiotoxicity’, Current Medicinal Chemistry. doi: 10.2174/092986709788186228.
Morishita, R. et al. (1994) ‘Evidence for direct local effect of angiotensin in vascular hypertrophy. In vivo gene transfer of angiotensin converting enzyme’, Journal of Clinical Investigation. doi: 10.1172/JCI117464.
Morris, P. G. et al. (2011) ‘Inflammation and increased aromatase expression occur in the breast tissue of obese women with breast cancer’, Cancer Prevention Research. doi: 10.1158/1940-6207.CAPR-11-0110.
Mosieniak, G. et al. (2015) ‘Polyploidy Formation in Doxorubicin-Treated Cancer Cells Can Favor Escape from Senescence’, Neoplasia. doi: 10.1016/j.neo.2015.11.008.
Mousavi, S. H. et al. (2016) ‘Capparis spinosa reduces Doxorubicin-induced cardio-toxicity in cardiomyoblast cells.’, Avicenna journal of phytomedicine, 6(5), pp. 488–494. doi: 10.22038/ajp.2016.6207.
Muggerud, A. A. et al. (2010) ‘Molecular diversity in ductal carcinoma in situ (DCIS) and early invasive breast cancer’, Molecular Oncology. doi: 10.1016/j.molonc.2010.06.007.
Muindi, J. R. F. et al. (1984) ‘Hydroxyl radical production and DNA damage induced by anthracycline-iron complex’, FEBS Letters. doi: 10.1016/0014-5793(84)81130-8.
Myers, C. E. et al. (1977) ‘Adriamycin: The role of lipid peroxidation in cardiac toxicity and tumor response’, Science. doi: 10.1126/science.877547.
Nagaraja, G. M. et al. (2006) ‘Gene expression signatures and biomarkers of noninvasive and invasive breast cancer cells: Comprehensive profiles by representational difference analysis, microarrays and proteomics’, Oncogene. doi: 10.1038/sj.onc.1209265.
Nagata, C. et al. (2006) ‘Tobacco smoking and breast cancer risk: An evaluation based on a systematic review of epidemiological evidence among the japanese population’, Japanese Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1093/jjco/hyl031.
Narayan, S. et al. (2004) ‘Cigarette smoke condensate-induced transformation of normal human breast epithelial cells in vitro’, Oncogene. doi: 10.1038/sj.onc.1207792.
Narița, D. et al. (2010) ‘Molecular profiling of ADAM12 gene in breast cancers’, Romanian Journal of Morphology and Embryology.
Narița, D. et al. (2011) ‘Expression of CCL18 and interleukin-6 in the plasma of breast cancer patients as compared with benign tumor patients and healthy controls’, Romanian Journal of Morphology and Embryology.
Narod, S. A. (2010) ‘BRCA mutations in the management of breast cancer: The state of the art’, Nature Reviews Clinical Oncology. doi: 10.1038/nrclinonc.2010.166.
NCT01434342 (2011) ‘Feasibility of Delivering a Quitline Based Smoking Cessation Intervention in Cancer Patients’, https://clinicaltrials.gov/show/NCT01434342.
Negură, L. et al. (2015) ‘BRCA1 5382insC founder mutation has not a significative recurrent presence in Northeastern Romanian cancer patients’, Romanian Journal of Morphology and Embryology.
Neilson, H. K. et al. (2009) ‘Physical activity and postmenopausal breast cancer: Proposed biologic mechanisms and areas for future research’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-08-0756.
Neuhouser, M. L. et al. (2015) ‘Overweight, obesity, and postmenopausal invasive breast cancer risk: A secondary analysis of the women’s health initiative randomized clinical trials’, JAMA Oncology. doi: 10.1001/jamaoncol.2015.1546.
Nguyen, B. et al. (2019) ‘Imprint of parity and age at first pregnancy on the genomic landscape of subsequent breast cancer’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/s13058-019-1111-6.
Nica, R. et al. (2020) ‘Distribution of eleven markers in South Romanian (Walachia region) population’, Romania. All rights reserved Rom Biotechnol Lett, 25(2), pp. 1424–1431. doi: 10.25083/rbl/25.2/1424.1431.
Nichols, H. B. et al. (2019) ‘Breast cancer risk after recent childbirth: A pooled analysis of 15 prospective studies’, Annals of Internal Medicine. doi: 10.7326/M18-1323.
Niel, C., Saback, F. L. and Lampe, E. (2000) ‘Coinfection with multiple TT virus strains belonging to different genotypes is a common event in healthy Brazilian adults’, Journal of Clinical Microbiology. doi: 10.1128/jcm.38.5.1926-1930.2000.
Nindrea, R. D., Aryandono, T. and Lazuardi, L. (2017) ‘Breast cancer risk from modifiable and non-modifiable risk factors among women in Southeast Asia: A meta-analysis’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.22034/APJCP.2017.18.12.3201.
Ninomiya, M. et al. (2008) ‘Development of PCR assays with nested primers specific for differential detection of three human anelloviruses and early acquisition of dual or triple infection during infancy’, Journal of Clinical Microbiology. doi: 10.1128/JCM.01703-07.
Nishioka, T. et al. (2011) ‘Sensitization of epithelial growth factor receptors by nicotine exposure to promote breast cancer cell growth’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/bcr3055.
Nishizawa, T. et al. (1997) ‘A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology’, Biochemical and Biophysical Research Communications. doi: 10.1006/bbrc.1997.7765.
Nishizawa, T. et al. (1999) ‘Quasispecies of TT Virus (TTV) with Sequence Divergence in Hypervariable Regions of the Capsid Protein in Chronic TTV Infection’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.73.11.9604-9608.1999.
No Title (no date a) Drugbank. Available at: http://www.drugbank.ca/drugs/DB00997 (Accessed: 10 May 2018).
No Title (no date b). Available at: https://www.socscistatistics.com/tests/mannwhitney/default2.aspx (Accessed: 15 May 2019).
Nohl, H., Gille, L. and Staniek, K. (1998) ‘The exogenous NADH dehydrogenase of heart mitochondria is the key enzyme responsible for selective cardiotoxicity of anthracyclines’, Zeitschrift fur Naturforschung – Section C Journal of Biosciences. doi: 10.1515/znc-1998-3-419.
Norsa’adah, B. et al. (2005) ‘Risk factors of breast cancer in women in Kelantan, Malaysia’, Singapore Medical Journal.
O’Brien, J. et al. (2010) ‘Alternatively activated macrophages and collagen remodeling characterize the postpartum involuting mammary gland across species’, American Journal of Pathology. doi: 10.2353/ajpath.2010.090735.
Oestergaard, M. Z. et al. (2006) ‘Interactions between genes involved in the antioxidant defence system and breast cancer risk’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6603272.
Okamoto, H. et al. (1998) ‘Molecular cloning and characterization of a novel DNA virus (TTV) associated with posttransfusion hepatitis of unknown etiology’, Hepatology Research. doi: 10.1016/s1386-6346(97)00123-x.
Okamoto, Hiroaki et al. (2000) ‘Replicative forms of TT virus DNA in bone marrow cells’, Biochemical and Biophysical Research Communications. doi: 10.1006/bbrc.2000.2481.
Okamoto, H. et al. (2000) ‘Sequestration of TT Virus of Restricted Genotypes in Peripheral Blood Mononuclear Cells’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.74.21.10236-10239.2000.
Okamoto, H. (2009) ‘History of discoveries and pathogenicity of TT viruses’, Current Topics in Microbiology and Immunology. doi: 10.1007/978-3-540-70972-5_1.
Oktem, G. et al. (2011) ‘Doxorubicin induced nephrotoxicity: Protective effect of nicotinamide’, International Journal of Cell Biology. doi: 10.1155/2011/390238.
Ola, H. et al. (2000) ‘Modulation of induced cardiocytotoxicity and genotoxicity of Doxorubicin in Rat by LCarnitine’, Jr. Egypt. Nat. Cancer Inst., 12(4), pp. 267–274.
De Oliveira, J. C. et al. (2008) ‘Detection of TTV in peripheral blood cells from patients with altered ALT and AST levels’, New Microbiologica.
Olson, J. E. et al. (2005) ‘Prepregnancy exposure to cigarette smoking and subsequent risk of postmenopausal breast cancer’, Mayo Clinic Proceedings. doi: 10.4065/80.11.1423.
Opanuraks, J. et al. (2010) ‘Elevated urinary total sialic acid and increased oxidative stress in patients with bladder cancer’, Asian Biomedicine. doi: 10.2478/abm-2010-0092.
Opdahl, S. et al. (2011) ‘Joint effects of nulliparity and other breast cancer risk factors’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/bjc.2011.286.
Osuala, K. O. et al. (2015) ‘Il-6 signaling between ductal carcinoma in situ cells and carcinoma-associated fibroblasts mediates tumor cell growth and migration’, BMC Cancer. doi: 10.1186/s12885-015-1576-3.
Ozen, F. et al. (2013) ‘Germ-line MTHFR C677T, FV H1299R and PAI-1 5G/4G variations in breast carcinoma’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2013.14.5.2903.
Pahwa, M., Labrèche, F. and Demers, P. A. (2018) ‘Night shift work and breast cancer risk: What do the meta-analyses tell us?’, Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. doi: 10.5271/sjweh.3738.
Palmer, J. R. et al. (1991) ‘Breast cancer and cigarette smoking: A hypothesis’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a115984.
Palmer, J. R. et al. (2011) ‘Parity and lactation in relation to estrogen receptor negative breast cancer in African American women’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-11-0465.
Palmer, J. R. et al. (2014) ‘Parity, lactation, and breast cancer subtypes in African American Women: Results from the AMBER Consortium’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/dju237.
Park, B. et al. (2016) ‘Population attributable risks of modifiable reproductive factors for breast and ovarian cancers in Korea’, BMC Cancer. doi: 10.1186/s12885-015-2040-0.
Parkin, D. M. et al. (2010) ‘Fifty years of cancer incidence: CI5 I-IX’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.25517.
Parle-McDermott, A. et al. (2006) ‘The MTHFR 1298CC and 677TT genotypes have opposite associations with red cell folate levels’, Molecular Genetics and Metabolism. doi: 10.1016/j.ymgme.2006.02.011.
Pasanisi, P. et al. (2009) ‘Oral contraceptive use and BRCA penetrance: A case-only study’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-09-0024.
Passarelli, M. N. et al. (2016) ‘Cigarette smoking before and after breast cancer diagnosis: Mortality from breast cancer and smoking-related diseases’, Journal of Clinical Oncology. doi: 10.1200/JCO.2015.63.9328.
Patani, N., Cutuli, B. and Mokbel, K. (2008) ‘Current management of DCIS: A review’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-007-9760-z.
Pathak, D. R. et al. (1986) ‘Parity and breast cancer risk: Possible effect on age at diagnosis’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.2910370105.
Pathak, D. R. (2002) ‘Dual effect of first full term pregnancy on breast cancer risk: Empirical evidence and postulated underlying biology’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1023/A:1015282916368.
Patil, B. L. et al. (2007) ‘Deletion and recombination events between the DNA-A and DNA-B components of Indian cassava-infecting geminiviruses generate defective molecules in Nicotiana benthamiana’, Virus Research. doi: 10.1016/j.virusres.2006.10.003.
Pawłowska, J. et al. (2002) ‘Differential Ability of Cytostatics from Anthraquinone Group to Generate Free Radicals in Three Enzymatic Systems: NADH Dehydrogenase, NADPH Cytochrome P450 Reductase, and Xanthine Oxidase’, Oncology Research. doi: 10.3727/096504003108748294.
PECKHAM, S. C. and ENTENMAN, C. (1962) ‘The influence of a hypercaloric diet on gross body and adipose tissue composition in the rat’, Research and development technical report. United States. Naval Radiological Defense Laboratory, San Francisco. doi: 10.1093/jn/77.2.187.
Peng, Y. H. et al. (2002) ‘Analysis of the entire genomes of thirteen TT virus variants classifiable into the fourth and fifth genetic groups, isolated from viremic infants’, Archives of Virology. doi: 10.1007/s705-002-8301-7.
Pereira, B. et al. (2016) ‘The somatic mutation profiles of 2,433 breast cancers refines their genomic and transcriptomic landscapes’, Nature Communications. doi: 10.1038/ncomms11479.
Perou, C. M. et al. (2000) ‘Molecular portraits of human breast tumours’, Nature. doi: 10.1038/35021093.
Petit, V. et al. (2007) ‘Chronic high-fat diet affects intestinal fat absorption and postprandial triglyceride levels in the mouse’, Journal of Lipid Research. doi: 10.1194/jlr.M600283-JLR200.
Petrakis, N. et al. (1978) ‘Nicotine in breast fluid of nonlactating women’, Science. doi: 10.1126/science.619458.
Pfeiffer, R. M. et al. (2018) ‘Proportion of U.S. Trends in breast cancer incidence attributable to long-term changes in risk factor distributions’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-18-0098.
Pharoah, P. D. P. et al. (1997) ‘Family history and the risk of breast cancer: A systematic review and meta-analysis’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/(SICI)1097-0215(19970529)71:5<800::AID-IJC18>3.0.CO;2-B.
Phillips, C. V. and Goodman, K. J. (2004) ‘The missed lessons of Sir Austin Bradford Hill’, Epidemiologic Perspectives and Innovations. doi: 10.1186/1742-5573-1-3.
Picon-Ruiz, M. et al. (2017) ‘Obesity and adverse breast cancer risk and outcome: Mechanistic insights and strategies for intervention’, CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.21405.
Pierce, J. P. et al. (2014) ‘Lifetime cigarette smoking and breast cancer prognosis in the after breast cancer pooling project’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/djt359.
Pitt, B. (1994) ‘Angiotensin-converting enzyme inhibitors in patients with coronary atherosclerosis’, American Heart Journal. doi: 10.1016/0002-8703(94)90255-0.
Pizot, C. et al. (2016) ‘Physical activity, hormone replacement therapy and breast cancer risk: A meta-analysis of prospective studies’, European Journal of Cancer. doi: 10.1016/j.ejca.2015.10.063.
Pooja, S. et al. (2012) ‘Polymorphic variations in IL-1β, IL-6 and IL-10 genes, their circulating serum levels and breast cancer risk in Indian women’, Cytokine. doi: 10.1016/j.cyto.2012.06.241.
Pop, L. A. et al. (2018) ‘Genetic alterations in sporadic triple negative breast cancer’, Breast. doi: 10.1016/j.breast.2017.11.006.
Prahalathan, C. et al. (2006) ‘Salubrious effects of lipoic acid against adriamycin-induced clastogenesis and apoptosis in Wistar rat bone marrow cells’, Toxicology. doi: 10.1016/j.tox.2006.02.015.
Pugazhendhi, A. et al. (2018) ‘Toxicity of Doxorubicin (Dox) to different experimental organ systems’, Life Sciences. doi: 10.1016/j.lfs.2018.03.023.
Del Pup, L., Codacci-Pisanelli, G. and Peccatori, F. (2019) ‘Breast cancer risk of hormonal contraception: Counselling considering new evidence’, Critical Reviews in Oncology/Hematology. doi: 10.1016/j.critrevonc.2019.03.001.
Purdue, M. P. et al. (2015) ‘The proportion of cancer attributable to occupational exposures’, Annals of Epidemiology. doi: 10.1016/j.annepidem.2014.11.009.
Qi, X. et al. (2010) ‘Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and breast cancer risk: A meta-analysis from 41 studies with 16,480 cases and 22,388 controls’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-010-0773-7.
Qiu, J. et al. (2005) ‘Human Circovirus TT Virus Genotype 6 Expresses Six Proteins following Transfection of a Full-Length Clone’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.79.10.6505-6510.2005.
Quiles, J. L. et al. (2002) ‘Antioxidant nutrients and adriamycin toxicity’, Toxicology. doi: 10.1016/S0300-483X(02)00383-9.
R.J., R. et al. (2017) ‘Melatonin, a full service anti-cancer agent: Inhibition of initiation, progression and metastasis’, International Journal of Molecular Sciences.
Rabstein, S. et al. (2014) ‘Polymorphisms in circadian genes, night work and breast cancer: Results from the GENICA study’, in Chronobiology International. doi: 10.3109/07420528.2014.957301.
Ratain, M. J. and Rowley, J. D. (1992) ‘Review: Therapy-related acute myeloid leukemia secondary to inhibitors of topoisomerase II: From the bedside to the target genes’, Annals of Oncology. doi: 10.1093/oxfordjournals.annonc.a058121.
Ravishankaran, P. and Karunanithi, R. (2011) ‘Clinical significance of preoperative serum interleukin-6 and C-reactive protein level in breast cancer patients’, World Journal of Surgical Oncology. doi: 10.1186/1477-7819-9-18.
Ray, A. and Cleary, M. P. (2012) ‘Obesity and breast cancer: A clinical biochemistry perspective’, Clinical Biochemistry. doi: 10.1016/j.clinbiochem.2011.11.016.
Razavi, S. M. et al. (2012) ‘Trends in oral cancer rates in Isfahan, Iran during 1991-2010.’, Dental research journal. doi: 10.4103/1735-3327.107947.
Reeves, G. K. et al. (2007) ‘Cancer incidence and mortality in relation to body mass index in the Million Women Study: Cohort study’, British Medical Journal. doi: 10.1136/bmj.39367.495995.AE.
Renehan, A. G. et al. (2008) ‘Body-mass index and incidence of cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective observational studies’, The Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(08)60269-X.
Renshaw, A. (2014) ‘Rosen’s Breast Pathology, 4th Edition’, Advances In Anatomic Pathology. doi: 10.1097/pap.0000000000000044.
Rephaeli, A. et al. (2007) ‘Anticancer prodrugs of butyric acid and formaldehyde protect against doxorubicin-induced cardiotoxicity’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6603781.
Reynolds, P. et al. (2004) ‘Active smoking household passive smoking, and breast cancer: Evidence from the California Teachers Study’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/djh002.
Rigat, B. et al. (1990) ‘An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels’, Journal of Clinical Investigation. doi: 10.1172/JCI114844.
Ritchie, M. D. et al. (2001) ‘Multifactor-dimensionality reduction reveals high-order interactions among estrogen-metabolism genes in sporadic breast cancer’, American Journal of Human Genetics. doi: 10.1086/321276.
Ritchie, M. D., Hahn, L. W. and Moore, J. H. (2003) ‘Power of multifactor dimensionality reduction for detecting gene-gene interactions in the presence of genotyping error, missing data, phenocopy, and genetic heterogeneity’, Genetic Epidemiology. doi: 10.1002/gepi.10218.
Rivenbark, A. G., O’Connor, S. M. and Coleman, W. B. (2013) ‘Molecular and cellular heterogeneity in breast cancer: Challenges for personalized medicine’, American Journal of Pathology. doi: 10.1016/j.ajpath.2013.08.002.
Rocchi, J. et al. (2009) ‘Torquetenovirus DNA drives proinflammatory cytokines production and secretion by immune cells via toll-like receptor 9’, Virology. doi: 10.1016/j.virol.2009.08.036.
Rock, C. L. et al. (2020) ‘American Cancer Society guideline for diet and physical activity for cancer prevention’, CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.21591.
Rojas, K. and Stuckey, A. (2016) ‘Breast Cancer Epidemiology and Risk Factors’, Clinical Obstetrics and Gynecology. doi: 10.1097/GRF.0000000000000239.
Romieu, I. et al. (1996) ‘Breast cancer and lactation history in Mexican women’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/oxfordjournals.aje.a008784.
Roperto, S. et al. (2009) ‘Detection of human torque teno virus in the milk of water buffaloes (Bubalus bubalis)’, Journal of Dairy Science. doi: 10.3168/jds.2009-2265.
Rosa, M. (2015) ‘Advances in the molecular analysis of breast cancer: Pathway toward personalized medicine’, Cancer Control. doi: 10.1177/107327481502200213.
Rose-John, S. and Heinrich, P. C. (1994) ‘Soluble receptors for cytokines and growth factors: Generation and biological function’, Biochemical Journal. doi: 10.1042/bj3000281.
Rosen, P. P. et al. (1989) ‘Contralateral breast carcinoma: An assessment of risk and prognosis in stage I (T1N0M0) and stage II (T1N1M0) patients with 20-year follow-up’, Surgery. doi: 10.5555/uri:pii:0039606089901645.
Rosenberg, L. et al. (2013) ‘A prospective study of smoking and breast cancer risk among African-American women.’, Cancer causes & control : CCC. doi: 10.1007/s10552-013-0298-6.
Roy, R., Chun, J. and Powell, S. N. (2012) ‘BRCA1 and BRCA2: Different roles in a common pathway of genome protection’, Nature Reviews Cancer. doi: 10.1038/nrc3181.
Ruiz-Ruiz, C. et al. (2003) ‘Characterization of p53-mediated up-regulation of CD95 gene expression upon genotoxic treatment in human breast tumor cells’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M304397200.
Russo, J. et al. (2000) ‘Developmental, cellular, and molecular basis of human breast cancer.’, Journal of the National Cancer Institute. Monographs. doi: 10.1093/oxfordjournals.jncimonographs.a024241.
Sabeva, N. S., Liu, J. and Graf, G. A. (2009) ‘The ABCG5 ABCG8 sterol transporter and phytosterols: Implications for cardiometabolic disease’, Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. doi: 10.1097/MED.0b013e3283292312.
El Saghir, N. S. et al. (2007) ‘Trends in epidemiology and management of breast cancer in developing Arab countries: A literature and registry analysis’, International Journal of Surgery. doi: 10.1016/j.ijsu.2006.06.015.
El Saghir, N. S. et al. (2015) ‘ BRCA1 and BRCA2 Mutations in Ethnic Lebanese Arab Women With High Hereditary Risk Breast Cancer ’, The Oncologist. doi: 10.1634/theoncologist.2014-0364.
Sagiv, S. K. et al. (2007) ‘Active and Passive Cigarette Smoke and Breast Cancer Survival’, Annals of Epidemiology. doi: 10.1016/j.annepidem.2006.11.004.
Sangaramoorthy, M. et al. (2019) ‘A Pooled Analysis of Breastfeeding and Breast Cancer Risk by Hormone Receptor Status in Parous Hispanic Women’, Epidemiology. doi: 10.1097/EDE.0000000000000981.
Sankar, P. et al. (2015) ‘Amelioration of oxidative stress and insulin resistance by soy isoflavones (from Glycine max) in ovariectomized Wistar rats fed with high fat diet: The molecular mechanisms’, Experimental Gerontology. doi: 10.1016/j.exger.2015.02.001.
Santos, E. W. et al. (2019) ‘Short-term high-fat diet affects macrophages inflammatory response, early signs of a long-term problem’, Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences. doi: 10.1590/s2175-97902019000117561.
Sato, S. et al. (1977) ‘Electron spin resonance study on the mode of generation of free radicals of daunomycin, adriamycin, and carboquone in NAD(P)H-microsome system’, Gann, The Japanese Journal of Cancer Research. doi: 10.20772/cancersci1959.68.5_603.
Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials (2004) Sax’s Dangerous Properties of Industrial Materials. doi: 10.1002/0471701343.
Scapoli, L. et al. (2019) ‘Evaluation of IL6, IL10 and VDR alleles distribution in an Italian large sample of subjects affected by chronic periodontal disease’, International Journal of Immunopathology and Pharmacology. doi: 10.1177/2058738419840844.
Schedin, P. (2006) ‘Pregnancy-associated breast cancer and metastasis’, Nature Reviews Cancer. doi: 10.1038/nrc1839.
Schernhammer, E. S. et al. (2003) ‘Night-shift work and risk of colorectal cancer in the Nurses’ Health Study’, Journal of the National Cancer Institute. doi: 10.1093/jnci/95.11.825.
Schernhammer, E. S. et al. (2006) ‘Night work and risk of breast cancer’, Epidemiology. doi: 10.1097/01.ede.0000190539.03500.c1.
Schiller, J. T. and Lowy, D. R. (2014) ‘Virus infection and human cancer: An overview’, Recent Results in Cancer Research. doi: 10.1007/978-3-642-38965-8_1.
Schneyer, R. and Lerma, K. (2018) ‘Health outcomes associated with use of hormonal contraception: Breast cancer’, Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. doi: 10.1097/GCO.0000000000000493.
Schuetz, C. S. et al. (2006) ‘Progression-specific genes identified by expression profiling of matched ductal carcinomas in situ and invasive breast tumors, combining laser capture microdissection and oligonucleotide microarray analysis’, Cancer Research. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-05-4610.
Schultz, S. et al. (2018) ‘Progression-specific genes identified in microdissected formalin-fixed and paraffin-embedded tissue containing matched ductal carcinoma in situ and invasive ductal breast cancers’, BMC Medical Genomics. doi: 10.1186/s12920-018-0403-5.
Scollen, S. et al. (2011) ‘TGF-β signaling pathway and breast cancer susceptibility’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-11-0062.
Secretan, B. et al. (2009) ‘A review of human carcinogens–Part E: tobacco, areca nut, alcohol, coal smoke, and salted fish.’, The lancet oncology. doi: 10.1016/s1470-2045(09)70326-2.
Seitz, H. K. et al. (2012) ‘Epidemiology and pathophysiology of alcohol and breast cancer: Update 2012’, Alcohol and Alcoholism. doi: 10.1093/alcalc/ags011.
Sen, A. K., Karakas, E. and Bilaloglu, R. (2010) ‘Genotoxic effect of epirubicin in mouse bone marrow in vivo’, Zeitschrift fur Naturforschung – Section C Journal of Biosciences. doi: 10.1515/znc-2010-3-408.
Sgroi, D. C. (2010) ‘Preinvasive breast cancer’, Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. doi: 10.1146/annurev.pathol.4.110807.092306.
El Sharkawy, R. M. et al. (2014) ‘Association between the polymorphisms of angiotensin converting enzyme (Peptidyl-Dipeptidase A) INDEL mutation (I/D) and Angiotensin II type I receptor (A1166C) and breast cancer among post menopausal Egyptian females’, Alexandria Journal of Medicine. doi: 10.1016/j.ajme.2013.10.002.
Shields, P. G. and Harris, C. C. (1991) ‘Molecular Epidemiology and the Genetics of Environmental Cancer’, JAMA: The Journal of the American Medical Association. doi: 10.1001/jama.1991.03470050081027.
Shim, J. et al. (2009) ‘Fatty acid transport protein 4 is dispensable for intestinal lipid absorption in mice’, Journal of Lipid Research. doi: 10.1194/jlr.M800400-JLR200.
Shiraki, K. et al. (2001) ‘TT virus (TTV) loads associated with different peripheral blood cell types and evidence for TTV replication in activated mononuclear cells’, Journal of Medical Virology. doi: 10.1002/jmv.1035.
Shrubsole, M. J. et al. (2004) ‘Passive smoking and breast cancer risk among non-smoking Chinese women’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.20168.
Siegel, R. L., Miller, K. D. and Jemal, A. (2016) ‘Cancer Siegel, R. L., Miller, K. D., & Jemal, A. (2016). Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin, 66(1), 7–30. https://doi.org/10.3322/caac.21332tatistics, 2016’, CA Cancer J Clin. doi: 10.3322/caac.21332.
Siegel, R. L., Miller, K. D. and Jemal, A. (2017) ‘Cancer statistics, 2017’, CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.21387.
Siegel, R. L., Miller, K. D. and Jemal, A. (2018) ‘Cancer statistics, 2018’, CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.21442.
Silva, P. S. et al. (2011) ‘Pharmacogenetic implications of the eNOS polymorphisms for cardiovascular action drugs’, Arquivos Brasileiros de Cardiologia. doi: 10.1590/S0066-782X2011000200017.
Šimůnek, T. et al. (2009) ‘Anthracycline-induced cardiotoxicity: Overview of studies examining the roles of oxidative stress and free cellular iron’, in Pharmacological Reports. doi: 10.1016/S1734-1140(09)70018-0.
Singal, P. K. et al. (2000) ‘Adriamycin-induced heart failure: Mechanism and modulation’, Molecular and Cellular Biochemistry. doi: 10.1023/a:1007094214460.
Singh, A. et al. (1972) ‘Adaptive changes of the rat small intestine in response to a high fat diet’, Biochimica et Biophysica Acta (BBA)/Lipids and Lipid Metabolism. doi: 10.1016/0005-2760(72)90019-7.
Singh, A. et al. (2018) ‘Association of AGTR1 (A1166C) and ACE (I/D) Polymorphisms with Breast Cancer Risk in North Indian Population’, Translational Oncology. doi: 10.1016/j.tranon.2017.12.007.
Singh, B. and Gupta, R. S. (1983) ‘Mutagenic Responses of Thirteen Anticancer Drugs on Mutation Induction at Multiple Genetic Loci and on Sister Chromatid Exchanges in Chinese Hamster Ovary Cells’, Cancer Research.
Singh, G. K. (2012) ‘Rural-urban trends and patterns in cervical cancer mortality, incidence, stage, and survival in the United States, 1950-2008’, Journal of Community Health. doi: 10.1007/s10900-011-9439-6.
Singletary, S. E. (2003) ‘Rating the Risk Factors for Breast Cancer’, Annals of Surgery. doi: 10.1097/01.SLA.0000059969.64262.87.
Sinha, B. K. et al. (1984) ‘Enzymatic activation and binding of adriamycin to nuclear dna’, Cancer Research.
Sisti, J. S. et al. (2016) ‘Reproductive risk factors in relation to molecular subtypes of breast cancer: Results from the nurses’ health studies’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.29968.
Skol, A. D., Sasaki, M. M. and Onel, K. (2016) ‘The genetics of breast cancer risk in the post-genome era: Thoughts on study design to move past BRCA and towards clinical relevance’, Breast Cancer Research. doi: 10.1186/s13058-016-0759-4.
Slattery, M. L. et al. (2007) ‘IL6, aspirin, nonsteroidal anti-inflammatory drugs, and breast cancer risk in women living in the southwestern United States’, Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention. doi: 10.1158/1055-9965.EPI-06-0667.
Slattery, M. L. et al. (2008) ‘Active and passive smoking, IL6, ESR1, and breast cancer risk’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-007-9629-1.
Slattery, M. L. et al. (2014) ‘Genetic variation in the JAK/STAT/SOCS signaling pathway influences breast cancer-specific mortality through interaction with cigarette smoking and use of aspirin/NSAIDs: The Breast Cancer Health Disparities Study’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-014-3071-y.
Sliwinska, M. A. et al. (2009) ‘Induction of senescence with doxorubicin leads to increased genomic instability of HCT116 cells’, Mechanisms of Ageing and Development. doi: 10.1016/j.mad.2008.04.011.
Slovak, M. L., Hoeltge, G. A. and Ganapathi, R. (1986) ‘Abnormally banded chromosomal regions in doxorubicin-resistant B16-BL6 murine melanoma cells’, Cancer Research.
Smith, S. A. et al. (1992) ‘Allele losses in the region 17q12–21 in familial breast and ovarian cancer involve the wild–type chromosome’, Nature Genetics. doi: 10.1038/ng1092-128.
Soini, Y. et al. (2011) ‘8-hydroxydeguanosine and nitrotyrosine are prognostic factors in urinary bladder carcinoma’, International Journal of Clinical and Experimental Pathology.
Sørlie, T. et al. (2001) ‘Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications’, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. doi: 10.1073/pnas.191367098.
Sospedra, M. et al. (2005) ‘Recognition of conserved amino acid motifs of common viruses and its role in autoimmunity’, PLoS Pathogens. doi: 10.1371/journal.ppat.0010041.
Spandole, S. et al. (2013) ‘Rapid detection of human Torque teno viruses using high-resolution melting analysis’, Balkan Journal of Medical Genetics. doi: 10.2478/bjmg-2013-0018.
Stahl, A. et al. (1999) ‘Identification of the major intestinal fatty acid transport protein’, Molecular Cell. doi: 10.1016/S1097-2765(00)80332-9.
Steven, A. A. et al. (1992) ‘DNA Base Modifications Induced in Isolated Human Chromatin by NADH Dehydrogenase-Catalyzed Reduction of Doxorubicin’, Biochemistry. doi: 10.1021/bi00128a026.
Stevens, R. G. et al. (2014) ‘Breast cancer and circadian disruption from electric lighting in the modern world’, CA: A Cancer Journal for Clinicians. doi: 10.3322/caac.21218.
Stratton, M. R. and Rahman, N. (2008) ‘The emerging landscape of breast cancer susceptibility’, Nature Genetics. doi: 10.1038/ng.2007.53.
Sugiyama, K. et al. (1999) ‘Route of TT virus infection in children’, Journal of Medical Virology. doi: 10.1002/(SICI)1096-9071(199910)59:2<204::AID-JMV13>3.0.CO;2-T.
Sullivan, N. J. et al. (2009) ‘Interleukin-6 induces an epithelial-mesenchymal transition phenotype in human breast cancer cells’, Oncogene. doi: 10.1038/onc.2009.180.
Sun, Y. S. et al. (2017) ‘Risk factors and preventions of breast cancer’, International Journal of Biological Sciences. doi: 10.7150/ijbs.21635.
Sundaram, M. et al. (2004) ‘Neosis: A novel type of cell division in cancer’, Cancer Biology and Therapy. doi: 10.4161/cbt.3.2.663.
Sweeney, C. et al. (2007) ‘Oral, injected and implanted contraceptives and breast cancer risk among U.S. Hispanic and non-Hispanic white women’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.22970.
Sweeney, C. et al. (2008) ‘Reproductive history in relation to breast cancer risk among Hispanic and non-Hispanic white women’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1007/s10552-007-9098-1.
Szládek, G. et al. (2005) ‘High co-prevalence of genogroup 1 TT virus and human papillomavirus is associated with poor clinical outcome of laryngeal carcinoma’, Journal of Clinical Pathology. doi: 10.1136/jcp.2004.022103.
Takahashi, M. et al. (2002) ‘TT virus is distributed in various leukocyte subpopulations at distinct levels, with the highest viral load in granulocytes’, Biochemical and Biophysical Research Communications. doi: 10.1006/bbrc.2001.6183.
Takemura, G. and Fujiwara, H. (2007) ‘Doxorubicin-Induced Cardiomyopathy. From the Cardiotoxic Mechanisms to Management’, Progress in Cardiovascular Diseases. doi: 10.1016/j.pcad.2006.10.002.
Tamimi, R. M. et al. (2016) ‘Population attributable risk of modifiable and nonmodifiable breast cancer risk factors in postmenopausal breast cancer’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/kww145.
Tang, M. S. et al. (1999) ‘Use of UvrABC nuclease to quantify benzo[a]pyrene diol epoxide-DNA adduct formation at methylated versus unmethylated CpG sites in the p53 gene’, Carcinogenesis. doi: 10.1093/carcin/20.6.1085.
Tavares, D. C. et al. (1998) ‘Protective effects of the amino acid glutamine and of ascorbic acid against chromosomal damage induced by doxorubicin in mammalian cells’, Teratogenesis Carcinogenesis and Mutagenesis. doi: 10.1002/(SICI)1520-6866(1998)18:4<153::AID-TCM1>3.0.CO;2-P.
Tavassoli, F. a and Devilee, P. (2003) ‘Classification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of the Breast and Female Genital Organs’, World Health Organization.
Terry, P. D., Miller, A. B. and Rohan, T. E. (2002) ‘Cigarette smoking and breast cancer risk: A long latency period?’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.10536.
Thiery, J. P. and Sleeman, J. P. (2006) ‘Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions’, Nature Reviews Molecular Cell Biology. doi: 10.1038/nrm1835.
Thom, K. and Petrik, J. (2007) ‘Progression towards AIDS leads to increased torque teno virus and torque teno minivirus titers in tissues of HIV infected individuals’, Journal of Medical Virology. doi: 10.1002/jmv.20756.
Thomas, A. et al. (1994) ‘Familiality of Cancer in Utah’, Cancer Research.
Thompson Coon, J. (2010) ‘Goodman and Gilman’s the Pharmacological Basis of Therapeutics’, Focus on Alternative and Complementary Therapies. doi: 10.1111/j.2042-7166.2002.tb05480.x.
Thompson, P. A. et al. (2002) ‘Evidence for the presence of mutagenic arylamines in human breast milk and DNA adducts in exfoliated breast ductal epithelial cells’, in Environmental and Molecular Mutagenesis. doi: 10.1002/em.10067.
Thorn, C. F. et al. (2011) ‘Doxorubicin pathways: Pharmacodynamics and adverse effects’, Pharmacogenetics and Genomics. doi: 10.1097/FPC.0b013e32833ffb56.
Thornalley, P. J., Bannister, W. H. and Bannister, J. V. (1986) ‘Reduction of oxygen by NADH/NADH dehydrogenase in the presence of adriamycin’, Free Radical Research. doi: 10.3109/10715768609088068.
Tiret, L. et al. (1992) ‘Evidence, from combined segregation and linkage analysis, that a variant of the angiotensin I-converting enzyme (ACE) gene controls plasma ACE levels’, American Journal of Human Genetics.
Todorova, V. K. et al. (2010) ‘Oral Glutamine Protects against Acute Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity of Tumor-Bearing Rats’, The Journal of Nutrition. doi: 10.3945/jn.109.113415.
Tokarska-Schlattner, M. et al. (2006) ‘New insights into doxorubicin-induced cardiotoxicity: The critical role of cellular energetics’, Journal of Molecular and Cellular Cardiology. doi: 10.1016/j.yjmcc.2006.06.009.
Toleutay, U. et al. (2013) ‘Risk factors of breast cancer in Kyzylorda oblast of Kazakhstan: A case-control study’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2013.14.10.5961.
Tomita, Y. and Kuwata, T. (1976) ‘Effects of adriamycin on the reverse transcriptase and the production of murine leukemia virus’, Cancer Research.
Tozer, R. G. et al. (2008) ‘Cysteine-rich protein reverses weight loss in lung cancer patients receiving chemotherapy or radiotherapy’, Antioxidants and Redox Signaling. doi: 10.1089/ars.2007.1919.
Tung, N. et al. (2015) ‘Frequency of mutations in individuals with breast cancer referred for BRCA1 and BRCA2 testing using next-generation sequencing with a 25-gene panel’, Cancer. doi: 10.1002/cncr.29010.
Türkoǧlu, Ș. (2007) ‘Genotoxicity of five food preservatives tested on root tips of Allium cepa L.’, Mutation Research – Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. doi: 10.1016/j.mrgentox.2006.07.006.
Turnbull, C. and Rahman, N. (2008) ‘Genetic Predisposition to Breast Cancer: Past, Present, and Future’, Annual Review of Genomics and Human Genetics. doi: 10.1146/annurev.genom.9.081307.164339.
‘Type and timing of menopausal hormone therapy and breast cancer risk: individual participant meta-analysis of the worldwide epidemiological evidence’ (2019) The Lancet. doi: 10.1016/S0140-6736(19)31709-X.
Umemura, T. et al. (2001) ‘SEN virus infection and its relationship to transfusion-associated hepatitis’, Hepatology. doi: 10.1053/jhep.2001.24268.
Unger, R. H. and Orci, L. (2002) ‘Lipoapoptosis: Its mechanism and its diseases’, Biochimica et Biophysica Acta – Molecular and Cell Biology of Lipids. doi: 10.1016/S1388-1981(02)00342-6.
United States Department of Health and Human Services (2014) ‘The Health Consequences of Smoking—50 Years of Progress A Report of the Surgeon General’, A Report of the Surgeon General.
Uppu, S., Krishna, A. and Gopalan, R. P. (2015) ‘A multifactor dimensionality reduction based associative classification for detecting SNP interactions’, in Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). doi: 10.1007/978-3-319-26532-2_36.
Ursin, G. et al. (2005) ‘Reproductive factors and subtypes of breast cancer defined by hormone receptor and histology’, British Journal of Cancer. doi: 10.1038/sj.bjc.6602712.
Vahteristo, P. et al. (2002) ‘A CHEK2 genetic variant contributing to a substantial fraction of familial breast cancer’, American Journal of Human Genetics. doi: 10.1086/341943.
Vasconcelos, H. C. F., Menezes, M. E. and Niel, C. (2001) ‘TT Virus Infection in Children and Adults who Visited a General Hospital in the South of Brazil for Routine Procedure’, Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. doi: 10.1590/S0074-02762001000400013.
Vasilyev, E. V. et al. (2009) ‘Torque Teno Virus (TTV) distribution in healthy Russian population’, Virology Journal. doi: 10.1186/1743-422X-6-134.
Verrecchia, F. and Mauviel, A. (2002) ‘Transforming growth factor-β signaling through the Smad pathway: Role in extracellular matrix gene expression and regulation’, Journal of Investigative Dermatology. doi: 10.1046/j.1523-1747.2002.01641.x.
Vickers, M. A. et al. (2002) ‘Genotype at a promoter polymorphism of the interleukin-6 gene is associated with baseline levels of plasma C-reactive protein’, Cardiovascular Research. doi: 10.1016/S0008-6363(01)00534-X.
Vikram, V. et al. (2015) ‘Changes in transforming growth factor-β1 in gingival crevicular fluid of patients with chronic periodontitis following periodontal flap surgery’, Journal of Clinical and Diagnostic Research. doi: 10.7860/JCDR/2015/11039.5539.
De Villiers, E. M. et al. (2002) ‘Heterogeneity of TT virus related sequences isolated from human tumour biopsy specimens’, Journal of Molecular Medicine. doi: 10.1007/s001090100281.
De Villiers, E. M. et al. (2007) ‘TTV infection in colorectal cancer tissues and normal mucosa [1]’, International Journal of Cancer. doi: 10.1002/ijc.22931.
Vincent-Salomon, A. et al. (2008) ‘Integrated genomic and transcriptomic analysis of ductal carcinoma in situ of the breast’, Clinical Cancer Research. doi: 10.1158/1078-0432.CCR-07-1465.
Wagner, B. A. et al. (2005) ‘Doxorubicin increases intracellular hydrogen peroxide in PC3 prostate cancer cells’, Archives of Biochemistry and Biophysics. doi: 10.1016/j.abb.2005.06.015.
Wang, F. et al. (2013) ‘A meta-analysis on dose-response relationship between night shift work and the risk of breast cancer’, Annals of Oncology. doi: 10.1093/annonc/mdt283.
Wang, J. et al. (2012) ‘A critical role of N-myc and STAT interactor (Nmi) in foot-and-mouth disease virus (FMDV) 2C-induced apoptosis’, Virus Research. doi: 10.1016/j.virusres.2012.08.018.
Wang, L. et al. (2016) ‘Doxorubicin-induced systemic inflammation is driven by upregulation of toll-like receptor TLR4 and endotoxin leakage’, Cancer Research. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-15-3034.
Warner, E. T. et al. (2013) ‘Reproductive factors and risk of premenopausal breast cancer by age at diagnosis: Are there differences before and after age 40?’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-013-2721-9.
Wassermann, K. (1994) ‘Intragenomic heterogeneity of DNA damage formation and repair: A review of cellular responses to covalent drug DNA interaction’, Critical Reviews in Toxicology. doi: 10.3109/10408449409017921.
Wegrzyn, L. R. et al. (2017) ‘Rotating night-shift work and the risk of breast Cancer in the nurses’ health studies’, American Journal of Epidemiology. doi: 10.1093/aje/kwx140.
Weigelt, B., Peterse, J. L. and Van’t Veer, L. J. (2005) ‘Breast cancer metastasis: Markers and models’, Nature Reviews Cancer. doi: 10.1038/nrc1670.
Wells, R. D. et al. (2005) ‘Advances in mechanisms of genetic instability related to hereditary neurological diseases’, Nucleic Acids Research. doi: 10.1093/nar/gki697.
Wen, H. et al. (2011) ‘Fatty acid-induced NLRP3-ASC inflammasome activation interferes with insulin signaling’, Nature Immunology. doi: 10.1038/ni.2022.
White, A. J. et al. (2017) ‘Breast cancer and exposure to tobacco smoke during potential windows of susceptibility’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1007/s10552-017-0903-1.
WHO (2018) World Health Organization Fact Sheets: Cancer 2018, 12 September.
de Wit, N. J. et al. (2008) ‘The role of the small intestine in the development of dietary fat-induced obesity and insulin resistance in C57BL/6J mice’, BMC Medical Genomics. doi: 10.1186/1755-8794-1-14.
Worobey, M. (2000) ‘Extensive Homologous Recombination among Widely Divergent TT Viruses’, Journal of Virology. doi: 10.1128/jvi.74.16.7666-7670.2000.
Wu, J. Q. et al. (2014) ‘Induced abortion and breast cancer: Results from a population-based case control study in China’, Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. doi: 10.7314/APJCP.2014.15.8.3635.
Wu, X. and Hasinoff, B. B. (2005) ‘The antitumor anthracyclines doxorubicin and daunorubicin do not inhibit cell growth through the formation of iron-mediated reactive oxygen species’, Anti-Cancer Drugs. doi: 10.1097/00001813-200501000-00014.
Xiao, L. Z. et al. (2005) ‘Interleukin-6 regulation of transforming growth factor (TGF)-β receptor compartmentalization and turnover enhances TGF-β1 signaling’, Journal of Biological Chemistry. doi: 10.1074/jbc.M413284200.
Xiao, Y. et al. (2011) ‘Dyslipidemic high-fat diet affects adversely bone metabolism in mice associated with impaired antioxidant capacity’, Nutrition. doi: 10.1016/j.nut.2009.11.012.
Xu, X., Persson, H. L. and Richardson, D. R. (2005) ‘Molecular pharmacology of the interaction of anthracyclines with iron’, Molecular Pharmacology. doi: 10.1124/mol.105.013383.
Xue, F. et al. (2011) ‘Cigarette smoking and the incidence of breast cancer’, Archives of Internal Medicine. doi: 10.1001/archinternmed.2010.503.
Yagmurca, M. et al. (2004) ‘Caffeic acid phenethyl ester as a protective agent against doxorubicin nephrotoxicity in rats’, Clinica Chimica Acta. doi: 10.1016/j.cccn.2004.03.035.
Yao, L. et al. (2010) ‘The association between two polymorphisms of eNOS and breast cancer risk: A meta-analysis’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-010-0800-8.
Yu, Q. et al. (2002) ‘TT virus: Preferential distribution in CD19+ peripheral blood mononuclear cells and lack of viral integration’, Journal of Medical Virology. doi: 10.1002/jmv.2142.
Yu, Y., Xu, Z. and Hsie, A. W. (1994) ‘Adriamycin induces large deletions as a major type of mutation in CHO cells’, Mutation Research Letters. doi: 10.1016/0165-7992(94)90007-8.
Zajchowski, D. A. et al. (2001) ‘Identification of gene expression profiles that predict the aggressive behavior of breast cancer cells.’, Cancer research.
Zhang, Y. et al. (2019) ‘Effect of tobacco on periodontal disease and oral cancer’, Tobacco Induced Diseases. doi: 10.18332/tid/106187.
Zhang, Z. F. et al. (2013) ‘Purple sweet potato color attenuates hepatic insulin resistance via blocking oxidative stress and endoplasmic reticulum stress in high-fat-diet-treated mice’, Journal of Nutritional Biochemistry. doi: 10.1016/j.jnutbio.2012.07.009.
Zhao, B. and Li, R. (2018) ‘The association between periodontitis and interleukin-6 genetic polymorphism -174 G/C: A meta-analysis’, Archives of Oral Biology. doi: 10.1016/j.archoralbio.2018.08.007.
Zhao, B., Li, X. and Li, R. (2019) ‘Genetic Relationship Between IL-6 rs1800796 Polymorphism and Susceptibility to Periodontitis’, Immunological Investigations. doi: 10.1080/08820139.2018.1517365.
Zhao, X. zhen, Guan, Z. min and Zhang, Y. min (2010) ‘Relationship between transforming growth factor beta-1 gene-509C/T polymorphism and severe chronic periodontitis’, Zhonghua kou qiang yi xue za zhi = Zhonghua kouqiang yixue zazhi = Chinese journal of stomatology.
Zheng, T. et al. (2002) ‘Cigarette smoking, glutathione-S-transferase M1 and T1 genetic polymorphisms, and breast cancer risk (United States)’, Cancer Causes and Control. doi: 10.1023/A:1019500109267.
Zhong, S. et al. (2001) ‘Gross elevation of TT virus genome load in the peripheral blood mononuclear cells of cancer patients’, in Annals of the New York Academy of Sciences. doi: 10.1111/j.1749-6632.2001.tb03868.x.
Zhong, S. et al. (2002) ‘Frequent detection of the replicative form of TT virus DNA in peripheral blood mononuclear cells and bone marrow cells in cancer patients’, Journal of Medical Virology. doi: 10.1002/jmv.2163.
Zhou, Y. et al. (2015) ‘Association between breastfeeding and breast cancer risk: Evidence from a meta-analysis’, Breastfeeding Medicine. doi: 10.1089/bfm.2014.0141.
Zhu, M. H. et al. (1999) ‘Functional association of Nmi with Stat5 and Stat1 in IL-2- and IFNγ-mediated signaling’, Cell. doi: 10.1016/S0092-8674(00)80965-4.
Zujewski, J. A. et al. (2011) ‘Ductal carcinoma in situ: Trends in treatment over time in the US’, Breast Cancer Research and Treatment. doi: 10.1007/s10549-010-1198-z.
Zuker, M. (2003) ‘Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction’, Nucleic Acids Research. doi: 10.1093/nar/gkg595.
Zwelling, L. A. (1989) ‘Topoisomerase II as a target of antileukemia drugs: A review of controversial areas’, Hematologic Pathology.
Copyright Notice
© Licențiada.org respectă drepturile de proprietate intelectuală și așteaptă ca toți utilizatorii să facă același lucru. Dacă consideri că un conținut de pe site încalcă drepturile tale de autor, te rugăm să trimiți o notificare DMCA.
Acest articol: FACTORI DE RISC CU PENETRANȚĂ REDUSĂ ÎN FORMELE SPORADICE DE CANCER DE SÂN [304527] (ID: 304527)
Dacă considerați că acest conținut vă încalcă drepturile de autor, vă rugăm să depuneți o cerere pe pagina noastră Copyright Takedown.