Expunerea caracteristicilor generale ale factorului de transcripție Lmx1a [307183]

INTRODUCERE

Proteina Lmx1a reprezintă un factor transcripțional încadrat în grupul Lhx din cadrul familiei de proteine LIM ce conțin homeodomeniu. Termenul de Lmx1a provine de la LIM homeobox trancription factor 1 alpha si locația cromozomală a acestei gene la om se întâlnește pe cromozomul 1 în poziția 1q22-q23 (German și colab.,1994), în timp ce gena murină se află mapată pe cromozomul 1. [anonimizat]1a începe în ziua embrionară E-8.5 la nivelului plăcii dorsale a tubului neural (Failli și colab., 2002) [anonimizat], apoi începând cu ziua embrionară E-9.5 se exprimă în istm (Guo și colab.,2007). [anonimizat]-HD, Lmx1a prezintă două domenii LIM dispuse în tandem ce prezintă două motive „degete de zinc” în regiunea N-terminală, un homeodomeniu care este dispus central ce prezintă o [anonimizat]-helix, conservat din punct de vedere evolutiv și o regiune C-terminală care are rol în represie sau activare transcripțională.

[anonimizat]1a [anonimizat], dar și producerea neuronilor dopaminergici din mezencefal.[anonimizat]. [anonimizat], Lmx1a activează gena insulinei prin legarea homeodomeniului său de secvența FLAT a [anonimizat], ducând astfel la activarea transcripției. [anonimizat], Lmx1a [anonimizat] o dezvoltare normală a membrelor anterioare și posterioare. [anonimizat]1a este o [anonimizat], [anonimizat].

Pentru cercetarea funcțiilor îndeplinite de această proteină, s-[anonimizat]-[anonimizat]. Șoarecii dreher prezintă mutații autozomale recesive la nivelul genei Lmx1a, ceea ce duce la apariția unor malformații la nivelul mai multor organe (Costa și colab., 2001). [anonimizat], absența expresiei lui Lmx1a duce la migrarea timpurie a celulelor progenitoare din fosa romboidă și la o dimensiune redusă a [anonimizat], [anonimizat] (Chizhikov și colab., 2009). În absența lui Lmx1a, placa dorsală nu se formeaza și astfel se produce un numar inadecvat de interneuroni dl1. [anonimizat] a corpului deoarece este afectată funcția de echilibru și poate duce și la pierderea auzului. [anonimizat], ceea ce poate determina sterilitate în rândul acestor șoareci (Chizhikov și colab., 2006). Alte studii experimentale s-[anonimizat], ceea ce înseamnă că acești șoareci prezintă o [anonimizat]lformații.

Obiectivul principal al acestei teze constă în analiza sistematică a proteinei Lmx1a, având drept scop înțelegerea rolului complex pe care această proteină îl exercită la nivelul organismelor vertebrate. Astfel, realizarea acestui obiectiv se bazează pe îndeplinirea următoarelor obiective specifice:

Expunerea caracteristicilor generale ale factorului de transcripție Lmx1a;

Înțelegerea mecanismelor celulare și molecular prin care Lmx1a își exercită acțiunea la nivelul diferitelor țesuturi, în raport cu alte proteine;

Descrierea patogenezei Lmx1a

Precizarea rolului terapeutic sau de biomarker exercitat de către Lmx1a.

În concluzie, elementul de noutate care este adus prin prezenta lucrare este reunit prin prezentarea conceptelor si teoriilor actuale care fac referire la mecanismele celulare si moleculare associate factorului Lmx1a, dar si funcțiile pe care le exercită la nivelul organismelor vertebrate.

2.1. Familia proteinelor LIM

Proteinele LIM pot fi împărțite în două clase majore : proteine LIM citoplasmatice și proteine LIM nucleare . Proteinele LIM citoplasmatice prezintă mai multe domenii LIM, indiferent dacă acestea sunt funcționale sau nu . Marea majoritate a proteinelor LIM citoplasmatice au rol în reglarea citoscheletului . Proteinele LIM nucleare, denumite LMO nucleare, au fost pentru prima dată descoperite ca oncogene în leucemia umană asociată celulelor T ; în componența acestor proteine LIM nucleare intră două domenii LIM .

Au fost identificate mai multe proteine LIM nucleare, citoplasmatice sau proteine LIM care se încadrează în ambele categorii sau se relochează între ambele compartimente celulare pentru a influența expresia genică (Cattaruzza și colab., 2004; Muller și colab., 2002; Chang și colab., 2003). Acestea sunt alcătuite din unul, două sau mai multe domenii LIM. Pe baza omologiei de secvență, acestea pot fi clasificate în mai multe grupuri (Figura 1) (Bach, 2000).

Figura 1 . Reglarea proceselor celulare mediate de proteinele care conțin domenii LIM (imagine preluată după Bach, 2000

2.1. Proteinele LMO nucleare

Proteinele LIM exclusiv nucleare – LMO nucleare – au in componență două domenii LIM și reprezintă molecule adaptor, având rolul de a lega mai multe tipuri de proteine (Figura 2).Aceste proteine au o funcție importantă în dezvoltarea organismului (Bach, 2000). Domeniile LIM din structura proteinelor LMO prezintă o secvență de aminoacizi diferită față de domeniile LIM care au rol în organizarea citoscheletului . De asemenea, s-a arătat faptul că proteinele LIM nucleare sunt implicate în procesul de oncogeneză (Rabbitts, 1998).

Figura 2. Organizarea domeniilor LIM din structura proteinelor LMO. Aceste proteine conțin două domenii LIM dispuse în tandem, unde fiecare domeniu LIM prezintă două motive “degete de zinc”. Aceste motive coordineaza un atom de zinc între patru resturi de aminoacizi. Motivele de tipul “degetelor de zinc” sunt unite între ele prin două resturi de aminoacizi conservate din punct de vedere evolutiv, conferiindu-le specificitate (imagine preluată după Chambers și Rabbitts, 2015)

Până în prezent s-au descoperit 4 proteine aparținând clasei LMO : LMO-1, LMO-2, LMO-3 și LMO-4. Proteinele LMO-1 și LMO-2 au fost inițial descoperite la pacienții care sufereau de leucemia asociată limfocitelor T. La acești bolnavi s-au putut evidenția expresii anormale ale acestor proteine în timocite și în limfocitele T, aceste tipuri celulare exprimând doar un nivel scăzut al lui LMO-1 și LMO-2.

Prin supraexpresia lui LMO-1 sau LMO-2 în timusul animalelor transgenice s-a putut dovedi faptul că acestea pot provoca apariția unor modificări la nivelul limfocitelor T. De asemenea, prin intermediul experimentelor realizate pe soarecii knockout pentru LMO-2 s-a aratat că această proteina are rol și în eritropoieză (Figura 3). Astfel, în lipsa proteinei LMO-2, șoarecii sunt incapabili de a forma etritrocite mature și astfel nu pot supraviețui în timpul embriogenezei .

Figura 3. Rolul LMO2 în dezvoltarea organismului embrionar murin. LMO-2 la șoareci prezintă roluri importante atât în procesul de hematopoieză, cât și în formarea vaselor de sange. LMO-2 are un rol esențial în hematopoieza primitivă (a) (Warren și colab., 1994) și în cea definitivă (b) . De asemenea, este importantă pentru remodelarea rețelelor vasculare ca parte a angiogenezei (c) (Yamada și colab., 2000). În plus, LMO-2 este exprimată în sistemul nervos în timpul dezvoltării (Foroni și colab., 1992; imagine preluată după Chambers și Rabbitts, 2015)

Domeniile LIM ale proteinei LMO-2 interacționează cu factorii transcripționali TAL1-47 și GATA1, formându-se astfel un complex de legare la ADN capabil de a activa procesul transcripțional (Figura 4). TAL1-E47 are rolul de a recunoaște secventele de ADN E-box, iar GATA1 recunoaște secvențele ADN GATA. În urma acestui proces se formează un complex LMO-2:TAL1:E47:GATA1, care recunoaște secventele GATA E-box din cadrul ADN, ducând la transcrierea genelor necesare procesului de hematopoieză. Activarea transcripției este dependentă de interacțiunea dintre LMO-2 și adaptorul nuclear, NLI, dar și de homodimerizarea acestuia. De asemenea, LMO-2 interacționează și cu proteinele GATA2 Tal1/Scl, aceștia fiind factori de transcripție care aparțin clasei bHLH (basic helix-loop-helix). De exemplu, la soarecii de tip knock-out pentru gena LMO-2, s-a demonstrat că acești factori de transcripție au și un rol fiziologic, deoarece aceșția pot inhiba realizarea eritropoiezei. La animalele dublu transgenice LMO-2, unde au loc modificări la nivelul limfocitelor T, proteina Tal1 este supraexprimată împreună cu LMO-2, demonstrându-se astfel un potențial sinergic al ambelor proteine.(de adăugat bibliografie)

Figura 4. Reprezentare grafică a complexelor proteice de activare a transcripției ce contin LMO-2. (A) LMO-2 se găsește la nivelul complexelor factorilor transcripționali care leaga ADN-ul, de tipul TAL1/SCL, E47, LDB1 și GATA1 în celulele eritrocitare normale (Wadman și colab., 1994) (B) la nivelul celulelor T tumorale se găsește un complex alcătuit din Lmo2, Tal1/Scl, E47 și Ldb1 (Tanaka și colab., 2003, imagine preluată după Nam și Rabbitts, 2006)

LMO-4 prezintă în structura sa două domenii LIM, unite între ele printr-o legătură scurtă. Prin cristalografie cu raze X s-a arătat faptul că nu există legături stabile între cele două domenii, dar în momentul în care LMO-4 este complexată de partenerul său de interacție, orientarea domeniilor devine fixă. Totuși, datorită faptului că nu este cunoscută întreaga structură si lungime a proteinei LMO-4, nu se poate spune cu exactitate dacă orientarea devine fixă în momentul legării de proteina țintă sau după legare. In vivo, LMO-4 poate interacționa cu mDEAF (factorul autoreglator epidermic deformat ) și DEAF1. În plus, domeniile LIM din componența proteinelor LIM nucleare nu interacționează doar cu factori transcripționali, ci și cu cofactori, dintre aceștia făcînd parte : CLIM1/Ibd2 si CLIM2/Ibd1/NLI/Chip. În urma acestor interacții și pe baza testelor experimentale se poate constata faptul ca proteinele LIM nucleare au rol în formarea complexelor multiproteice de la nivelul moleculei de ADN, din care rezultă faptul că au importanță și în realizarea procesului de transcripție.

2.2. Alte tipuri de proteine LMO

La vertebrate au fost descoperite mai multe proteine care conțineau unul sau mai multe domenii LIM, care fac parte din clasa de proteine bogate în cisteină (CRP) , acestea fiind reprezentate de CRP1, CRP2, CRP3/MLP și CRIP. Proteina CRP are în componență doar un singur domeniu LIM, în timp ce celelate proteine, CRP1-CRP3 contin fiecare câte două domenii LIM (Perez-Alvaro și colab., 1996; Dawid și colab., 1998). La CRP1 și CRP2, cele două domenii LIM se împachetează independent, neexistând o orientare preferențială ori legături stabile între ele, ceea ce susține ideea de modularitate a domeniului LIM (Schmeichel și Beckerle, 1994). Zona de interacție dintre cele două domenii LIM ale proteinelor CRP1 si CRP2 este flexibilă, conține o cantitate mare de glicină și prezintă o structură mai mare de 50 de resturi de aminoacizi, deși, de obicei, proteinele multi-LIM au în componență între 8 și 10 resturi de aminoacizi. La om au fost identificate proteinele CRP1, CRP2 și CRP3. CRP1 și CRP2 se găsesc cu precădere în mușchiul neted, în timp ce CRP3 este specifică mușchiului striat, fiind cunoscută și sub denumirea de proteina LIM musculară (MLP). Aceste proteine sunt asociate cu citoscheletul de actină, deoarece ele interacționează cu α-actinina. La fel ca celelate tipuri de proteine LIM, proteinele CRP odată ajunse în nucleu, participă la expresia genelor musculare. Mecanismul prin care proteinele CRP favorizează expresia genică este cel mai bine explicat la proteinele CRP1 și CRP2, La aceste două proteinele, factorul de răspuns seric este cuplat în mod cooperativ cu domeniul LIM din regiunea N-terminala, iar factorii GATA4 și GATA6 sunt cuplați cu domeniul LIM aflat C-terminal. În urma acestei cuplări se formează un complex terțiar, denumit SRF (factorul de răspuns seric) -CRP-GATA, acest complex având rol în evidențierea expresiei markerilor de diferențiere ai mușchiului neted. Datorită rolului pe care proteinele CRP îl exercită în contracția musculară și în reglarea transcripțională, membrii familiei CRP contribuie la homeostazia sistemului muscular și pot fi folosiți ca markeri pentru evidențierea stării fiziologice a acestuia (Kadrmas și Beckerle, 2004).

În momentul în care muschiul se află într-o stare de stres sau este lezat, proteinele CRP transmit semnale celulare nucleare astfel încât să se inițieze repararea zonei sau țesutului lezat prin intermediul unei gene specific musculare. De aceea, se presupune că CRP3 poate fi o componentă a unui factor de stres localizat în discurile Z ale cardiomicetelor. În momentul în care funcționează necorespunzator, la oameni poate apărea boala denumită cardiomiopatie dilatativă (Knoll și colab, 2002). Atunci când cardiomicetele interceptează factorii de stres mecanic, are loc o modificare la nivelul expresiei genice, aceste modificări putând duce la apariția hipertrofiei. De exemplu, la șoarecii la care hipertrofia a fost indusă in vitro, se poate observa o relocalizare nucleară a proteinei CRP3. Mai mult, la soarecii knockout a genei CRP3 există disfuncții atât la nivelul mușchiului cardiac, cât și la nivelul mușchiului scheletic. Membrii familiei de proteine CRP reprezintă componenți esențiali ai mecanismelor reglatoare multicomponente și pot fi priviți drept conectori, aceștia făcând legătura între citoschelet și nucleu (Kadrmas și Beckerle, 2004).

De asemenea, există și un alt grup de proteine LIM, denumit grupul divergent 3 din care fac parte Ril, Enigma, Zyxin,Prickle și Paxilin. Proteina Ril conține un domeniu LIM, Enigma, Zyxin și Prickle au în structura lor trei domenii LIM, iar Paxilin prezintă patru domenii LIM conservate din punct de vedere evolutiv. Toate proteinele care fac parte din acest grup divergent prezintă în structura lor domenii adiționale, localizate în regiunea amino-terminală. Interacțiile care sunt mediate de domeniile LIM ale proteinei Enigma și omologului său includ receptorul pentru insulină, receptorul tirozin kinazei si protein kinaza C (PKC) (Wu și Gill, 1994, Kuroda și colab., 1996, Wu și colab. ., 1996). Un numar mare de proteine LIM se poate găsi la nivelul adeziunilor focale sau structurilor analoage. Aceste proteine sunt reprezentate de migfilină – cunoscută ca fiind proteina LIM de legare a filamentelor- și NRAP (nebulin-related actin-binding protein). Migfilina reprezintă un membru mai îndepărtat al familiei proteice Xyzin și aceasta conține 3 domenii LIM localizate în regiunea carboxi-terminală, unde are loc legarea factorului integrin de adeziune focală MIG2, iar regiunea sa amino-terminală leagă proteina Filamin, care reprezintă o moleculă de actină reticulată. Acest mecanism explică rolul integrinei în exercitarea funcției citoscheletice (Kadrmas și Beckerle, 2004, Tu, Wu și colab., 2003, Takafuta și colab., 2003).

NRAP reprezintă o proteină din familia de proteine LIM asociată cu domeniul SH3; este alcătuită dintr-o regiune N-terminală în care se găsește domeniul LIM și o regiune C-terminală. Regiunea N-terminală are rolul de a lega o proteină, denumită Talin, aceasta având o funcție reglatoare a activității integrinei (Tadokoro și colab., 2003), în timp ce regiunea C-terminală este implicată în reglarea actinei. NRAP este o proteină care se găsește la nivelul țesutului muscular , apărând la nivelul joncțiunilor miotendinoase în mușchiul scheletic, în timp ce în mușchiul cardiac este localizată în discurile intercalare . De asemenea, această proteină poate forma complexe cu alte proteine astfel încât să aibă loc transmiterea tensiunii în mușchi prin ancorarea filamentelor de actină terminală din miofibrile (Kadrmas și Beckerle, 2004, Luo și colab., 1999).

Proteinele LIM de adeziune focală, pe lângă funcțiile de legare și de reglare a citoscheletului de actină, au capacitatea de a semnala integrina. De exemplu, proteina Paxilina are o structură formată din 5 motive LD în regiunea N-terminală și 4 domenii LIM în regiunea C-terminală, aceasta legându-se de proteine citoscheletice și de proteine de semnalizare și este o structură importantă din punct de vedere al adeziunii dinamice deoarece controlează motilitatea (Kadrmas și Beckerle, 2004). S-a demonstrat faptul că Paxilina are capacitatea de a coordona transmiterea semnalului, proces dependent de starea de fosforilare . Paxilina poate fi dezasamblată prin fosforilarea sa cu complexe kinazice de adeziune focală (PAK) și se poate întâlni și la nivelul nucleului, împreună cu HIC5, care este un membru foarte înrudit al acesteia, putând interacționa in vitro cu receptorii nucleari ai hormonilor androgeni și glucocorticoizi (Kadrmas și Beckerle , 2004, Kasai și colab., 2003; Fujimoto și colab., 1991; Yang și colab., 2000).

O altă proteină care are rol în adeziunea focală este reprezentată de PINCH, aceasta fiind constituită numai din 5 domenii LIM. Pe langă rolul de adeziune, aceasta este un factor important în răspândirea și supraviețuirea celulelor . Astfel, prin interacția cu ILK și NCK2, este capabilă să se lege de molecule aflate în cascada de semnalizare ale integrinelor și de factorul de creștere (Tu , Wu și colab., 1999; Tu , Li și Wu, 1998). În momentul în care apar disfuncționalități la nivelul lui PINCH, poate avea loc moartea embrionară, apărând modificări la nivelul legăturilor actinice din membrană și la nivelul aderenței dependente de integrină (Kadrmas și Beckerle, 2004, Clark, McGrail și Beckerle , 2003; Hobert și colab., 1999)

2.3. Proteinele LIM kinaze

Proteinele LIM kinaze sunt serin/treonin kinaze,care din punct de vedere structural, conțin în regiunea N-terminală două domenii LIM ancorate la un domeniu kinazic C-terminal (Arber și colab, 1998, Yang și colab., 1998, Bernard și colab.,1994; Mizuno și colab.,1994; Okano și colab., 1995; Stanyon și Bernard, 1999). Prima Lim kinază studiată a fost cofinila, factorul de dezasamblare al actinei, unde fosforilarea acesteia modulează reorganizarea scheletului de actină (Arber și colab, 1998, Yang și colab., 1998). Două dintre cele mai studiate kinaze sunt Lmk1 și Lmk2 (Bernard și colab., 1994; Mizuno și colab., 1994; Okano și colab.,1995, Stanyon și Bernard, 1999). În interiorul acestor LIM kinaze există secvențe țintă, astfel încât acestea pot fi direcționate în citoplasmă sau în nucleu, sau pot fi transferate între ambele compartimente, cum este în cazul lui Lmk1 .

Lmk1 prezintă un rol central în procesul de organizare al scheletului de actină. Această kinază este fosforilată de factorul Rho GTP-azic asociat cu kinaze (ROCK), implicat în reorganizarea indusă de Rho a citoscheletului de actină (Maekawa și colab., 1999)(Figura 5). În plus, Lmk1 are și capacitatea de a activa factorul de răspuns seric (SRF); acest factor este implicat în procesul de transcripție și în reglarea mai multor gene inductibile seric și specific-muscular (Bach,2000). Activarea factorului de răspuns seric de către LMK1 este dependentă de modificarea dinamicii actinice (Sotiropoulos și colab., 1999), indicând rolul pe care Lmk1 îl exercită în morfogeneza și motilitatea celulară .

Figura 5. Căile de semnalizare intracelulară în care sunt implicate LIM kinazele. Membrii subfamiliei Rho din clasa GTP-azelor, care includ Rac, Rho și Cdc42, mediază răspunsurile chemotropice prin rolul lor la nivelul dinamicii citoscheletului (Hall și Lalli, 2010). Rac și Rho activează LIM kinaza (LIMK) prin intermediul PAK și ROCK, care la rândul ei reglează depolimerizarea actinei indusă de cofilină.

Autoinhibiția este un fenomen în care deletia unui singur domeniu LIM poate duce la o activitate îmbunatațită a celuilalt domeniu LIM rămas . De exemplu, deleția domeniilor LIM sau mutații la nivelul resturilor de zinc coordinate din cadrul proteinei Lmk1 determină creșterea activității kinazice. În plus, domeniile LIM intermoleculare (in trans) pot interfera cu activitatea kinazică prin legarea în mod direct la domeniul kinazic . În afară de fosforilarea mediată de ROCK, Lmk1 poate fi fosforilată și de către PAK1 , un alt efector în aval al lui Rho și Rac (Ohashi și colab.,2000, Edwards și colab., 1999). În concluzie, fosforilarea afectează în mod direct autoinhibarea LIM-dependentă .

2.4. Proteine LIM ce prezintă homeodomeniu

O altă clasă de proteine LIM este reprezentată de familia de proteine LIM cu homeodomeniu (LIM-HD), ai cărei membrii au funcție de factori transcripționali. Proteinele LIM-HD contin două domenii LIM aflate în regiunea N-terminală și un homeodomeniu, dispus central, având rol de legare la secvențe țintă din structura moleculelor de ADN (Hunter și Rhodes, 2005).

Familia de proteine LIM-HD este conservată din punct de vedere evolutiv, fiind constituită din 12 gene la mamifere si 5 gene la Drosophila melanogaster, care codifica proteinele LIM-HD (Tabel 1). La organismele nevertebrate (C. elegans) a fost descrisă o singură genă, lim-6 (Hobert și Westphal, 2000). Aceasta este întâlnită la nivelul unor neuroni postmitotici, în celulele endoteliale din structura uterului și în anumite regiuni ale sistemului excretor.În plus, are rolul de a determina traiectoria axonală corectă unui grup de neuroni GABA-ergici și este de asemenea implicată în sinteza neurotrasmițătorului GABA ( acidul gama-aminobutiric) (Hobert și colab., 1999)

Cel mai important grup al familiei de proteine LIM-HD este reprezentat de grupul Lhx, din care fac parte Lmx1b si, respectiv, Lmx1a. Grupul Lhx prezintă un rol important în dezvoltarea neuronală deoarece se exprimă odată cu formarea structurilor complexe de la nivelul creierului (Hobert și Ruvkun, 1998). De asemenea, membrii acestui grup sunt implicați în modelarea structurilor embrionare și prezintă un rol deosebit de important în specificitatea neuronală (Doucet – Beaupré și colab., 2015).

Proteina Lhx1, denumită și LIM1, se găsește în timpul dezvoltării embrionare timpurii la nivelul mezodermului, apoi pe parcursul dezvoltării se află la nivelul sistemului genital, rinichiului, ficatului și sistemului nervos (Barnes și colab.,1994; Dong și colab., 1997; Fujii și colab., 1994). În dezvoltarea sistemului nervos, Lhx1, împreuna cu Lmx1b, sunt importante pentru direcționarea traiectului axonal al nervilor motori de la nivelul membrelor. La embrionii de șoareci s-a observat că o deleție a acestei gene poate duce la un fenotip anencefalic, unde structurile anterioare ale capului, rinichii și gonadele lipsesc (Shawlet și Behringer,1995). Gena Lhx1 umană prezintă omologie în secvența aminoacizilor de 87% cu gena de la șoarece. O genă foarte înrudită din punct de vedere structural cu Lhx1 este Lhx5, ale cărei funcții se suprapun cu Lhx1 în sistemul nervos.

O altă proteină Lhx, Lhx2, se găsește la nivelul ficatului, în regiunile diencefalică și telencefalică în timpul dezvoltării sistemului nervos, la nivelul organelor olfactive și audtive și în limfocitele B și T (Wu și colab.,1993). Un domeniu omolog al acestei gene este întâlnit și la gena Apterous de la Drosophila, sugerându-se astfel rolul similar pe care aceste proteine îl au indiferent de specie (Rincon-Rimas și colab.,1999). S-a descoperit faptul că Lhx2 este un marker important în leucemia mielogenă cronică , unde un nivel de expresie crescut al ARNm al genei Lhx2 duce la o hipometilare în celulele tumorale (Wu și colab.,1996).

Pe lânga Lhx2, o altă genă importantă în dezvoltarea sistemului nervos este reprezentată tot de o proteina din aceeași clasă și anume Lhx3, care este exprimată la nivelul maduvei spinării, punții și bulbului rahidian. La om există trei izoforme ale acestei gene. Aceste izoforme se leagă diferit la ADN, prezentând astfel și functii diferite (Sloop și colab.,2001).

Un grup de proteine LIM-HD foarte asemanator cu Lhx3 în privința secvenței în aminoacizi este Lhx4, aceștia prezentând omologie de secvență în domeniile LIM de 77% , 86% și respectiv 95% în ceea ce privește homeodomeniul (Yamashita și colab.,1997). Lhx4 este exprimat la nivelul măduvei spinării, cortexului cerebral și glandei pituitare. Șoarecii homozigoti care prezintă o întrerupere a genelor LHx3 și Lhx4 mor la scurt timp după naștere datorită malformatiilor aparute la nivelul sistemul respirator, fiind asemănator cu distresul respirator la om (Li și colab.,1994).

Tabelul 1. Genele LIM-HD la om și șoarece: denumire și localizare cromozomală (imagine preluată după Hunter și Rhodes,2005)

Cei mai importanți membrii ai grupului Lhx sunt Lmx1a, Lmx1b și Pitx3. La șoarece, Lmx1a este prima dată exprimat începând cu ziua embrionară 8.5 (E-8.5) în placa dorsală a tubului neural (Failli și colab.,2002). În schimb, Lmx1b este exprimat, în timpul dezvoltării sistemului nervos, încă din ziua E-7.5 în jumatatea anterioară a tubului neural. De asemenea, în ziua embrionară E-8.5 Lmx1a apare la nivelul șanțului ponto-peduncular , iar în ziua embrionară E-9.5 apare exprimat în istm (Guo și colab., 2007). Precum Lmx1a, Lmx1b este exprimat în timpul dezvoltarii embrionare, având un rol esențial în modelarea dorso-ventrală a membrelor, dar și în organogeneză. În plus, acest factor de transcripție este implicat in dezvoltarea epiteliului visceral al glomerulului vascular din rinichi și în formarea segmentului anterior al ochiului (Doucet – Beaupré și colab., 2015)

La fel ca alți factori de transcripție, Lmx1a și Lmx1b sunt paralogi,aceștia având o specificitate de legare la ADN identică. În plus, aceștia prezintă o secvență de aminoacizi asemănătoare, conservarea de la nivelul homeodomenilor fiind de 100%, iar gradul de similitudine a domeniilor LIM este de 67% și respectiv 83%

S-au efectuat cercetări care arată faptul că polimorfismele din genele care codifică pentru Lmx1a și Lmx1b sunt asociate cu Boala Parkinson și cu schizofrenia (Bergman și colab., 2009, Bergman și colab., 2010). Astfel s-a demonstrat că există 5 polimorfisme în populații specifice pentru schizofrenie, în timp ce alte 5 polimorfisme sunt comune atât acestei boli neurologice, cât și bolii Parkinson (Bergman și colab., 2009, Bergman și colab., 2010, Bergman și colab., 2010, Haubenberger și colab., 2011, Le și colab., 2011, Fuchs și colab., 2009)

3. Organizarea structurala a genei și proteinei Lmx1a

Proteina Lmx1a face parte din grupul Lhx din familia proteinelor LIM care conțin homeodomeniu și denumirea provine de la termenul “LIM homeobox transcription factor 1 alpha” . Lmx1a a fost clonat pentru prima dată la hamster, evidențiindu-se rolul acestuia în legarea promotorului care codifică insulina.

La șoarece , Lmx1a este exprimat începând cu ziua embrionară E-8.5 în mai multe țesuturi , printre care placa dorsală a tubului neural, fiind implicat în dezvoltarea sistemului nervos, în veziculele otice, notocord și pancreas. La nivelul sistemului nervos central, Lmx1a controlează formarea și dezvoltarea adecvată a SNC posterior și poate acționa și cu alți factori transcripționali de la nivelul plăcii dorsale, cum ar fi MafB, Gdf7, Bmp6 și Bmp7. Mutații sau deleții a acestei gene poate duce la modificări la nivelul interneuronilor Dl1.La om, Lmx1a este exprimat și în mușchiul scheletic, țesutul adipos, glandele mamare și hipofiza. Totuși, încă nu s-au detectat mutații la nivelul genei Lmx1a la oameni.

Gena LMX1A umană este localizată pe cromozomul distal 1q22-q23 și este alcatuită din 382 de aminoacizi, conține o regiune N-terminală în care se găsesc două domenii LIM dispuse în tandem, o regiune centrală în care se află homeodomeniul , fiind conservate pe tot parcursul evoluției și o regiune C-terminală cu rol în activare sau represie.

La șoarece, ADN-ul genomic al lui Lmx1a conține 8 sau 9 exoni, care diferă doar prin exonul inițial din capătul 5’. De asemenea, sunt prezente două izoforme al acestei gene, dar ambele au aceeași structură și codifică același număr de aminoacizi. În schimb, la om s-au identificat 4 izoforme ale genei Lmx1a, Lmx1a-001 și Lmx1a-002 conțin 9 exoni și au o lungime de aproximativ 3350 pb, în timp ce Lmx1a-003 prezintă 8 exoni, iar Lmx1a-004 7 exoni și este un transcript necodificator

Figura 6. Structura genelor Lmx1a la soarece si reprezentarea schematica a structurii proteinelor LIM-HD (imagine preluata dupa Doucet-Beaupré și colab., 2015)

Denumirea de LIM provine de la numele primelor trei proteine la care s-a descoperit această structură, și anume Lin11, Isl-1 și Mec-3 . Domeniul LIM prezintă două subdomenii și este alcătuit din 55 de aminoacizi și 8 resturi de aminoacizi, reprezentate în principal de cisteină și histidină, conservate din punct de vedere evolutiv, acestea având rolul de a lega zincul. Astfel, resturile 1-4 leagă primul ion de zinc, iar resturile 5-8 cel de-al doilea ion de zinc, ceea ce îi conferă modelul de structură secundară “degete de zinc” , care sunt dispuse în tandem.

Domeniul LIM se găsește într-o mare varietate de organisme eucariote, ca de exemplu se întâlnește la nevertebratele C.elegans și D. melanogaster, cât și în anumite drojdii și mucegaiuri unde se găsesc proteine care conțin domenii LIM. La om, de exemplu , domeniul LIM poate avea aceeași distribuție ca domeniile SH3 și SH2 si pot conține proteine care au în structură pînă la 5 domenii LIM. În schimb, la organismele procariote , domeniul LIM este absent deoarece acestea nu prezintă structură nucleară individualizată (Kadrmas și Beckerle , 2004)

Figura 7. (a) Structura consensus a domeniului LIM; (b) Topologia legării ionilor de Zinc ( imagine preluată după Kadrmas și Beckerle , 2004)

Domeniul LIM este un motiv de interacțiune de tip proteină-proteină și prezintă un rol fundamental în realizarea funcțiilor biologice, prin formarea de complexe multiproteice. Proteinele care conțin domeniu LIM mediază procesele biologice prin legarea acestora de proteinele țintă, acestea funcționînd ca molecule adaptor, pot fi competitori, inhibitori sau pot determinara localizarea celulară.Domeniul LIM se pot lega de domeniile PDZ , cît și de domenii kinazice; de asemenea, s-a demonstrate ca acesta se poate lega de motive tirozinice care nu necesită fosforilare. Astfel de interacție a fost descrisă la proteina LIM Enigma, care conține un domeniu PDZ în regiunea N-terminală și 3 domenii LIM in regiunea C-terminală.

Domeniul LIM prezintă și anumite funcții în patogeneză, de exemplu în oncogeneză, unde deleții sau mutații la nivelul său poate duce la apariția de boli umane. În plus, față de interacțiunile proteice pe care le confer domeniul LIM, acesta poate media proprietățiile proteinelor care se leagă la ADN și poate conferi și functii de transactivare

Homeodomeniul din structura proteinelor LIM-HD se află în regiunea centrală și este alcătuit din 60 de aminoacizi care formează o structură de tip helix-turn-helix , unde două alfa-helixuri sunt unite prin regiuni sub formă de buclă. Cele două helixuri din regiunea N-terminală sunt antiparalele și helixul aflat C-terminal este aproape perpendicular pe axele formate de cele două helixuri, acesta interacționînd direct cu molecula de ADN prin punți de hidrogen și interacții hidrobe, dar și indirect prin moleculele de apă formate de lanturile laterale și expuse fosei majore ale ADN-ului .

Proteinele LIM care contin homeodomeniu pot actiona prin legarea cu mare afinitate a domenilor LIM de cofactori, astfel încît acestea duc la formarea unor complexe transcriptionale care regleaza transcriptia intr-un mod specific, functionand sinergic pentru a determina soarta neuronală. .

Figura 8. Diferite tipuri de complexe de cofactori în care sunt implicate proteinele LIM-HD. Complexele formate in a-c vor duce la activarea transcripției, în timp ce complexul prezentat in (d) duce probabil la represia transcripțională (imagine preluată după Hobert și Westphal,2000)

Unul dintre cei mai importanți cofactori care mediază legarea la ADN este reprezentat de CLIM , acesta fiind implicat în inhibarea genelor țintă sau în activarea sinergică, aceste procese fiind realizate în funcție de natura promotorului (Bach și colab., 1997; Jurata și Gill, 1997).De exemplu, la Drosophila melanogaster s-a demonstrat că o anumită valoare a expresiei cofactorilor CLIM/chip influențează dezvoltarea aripei (Fernandez-Funez et al., 1998; Milan et al., 1998; Milan and Cohen, 1999; van Meyel et al., 1999).

Adaptorul de interacție nucleară, NLI,numit si LDB1 ( LIM domain binding protein 1) are rolul de a recunoaște domeniile LIM care se leagă cu afinitate mare, legarea avand loc prin intermediul promotorilor sau activatorilor de la nivelul moleculelor de ADN, oferind astfel o activitate transcriptionala maxima. NLI este format din regiuni hidrofobe în regiunea N-terminală și regiuni helicale în regiunea C-terminala, aceste regiuni avînd roluri importante în interacțiunea proteică. Regiunea N-terminală este format din 200 de aminoacizi, la nivelul ei avînd loc formarea complexelor homodimerice si tetramerice de tipul 2LHX-2LDB1. De asemenea, NLI este exprimat impreuna cu Isl1 pntru diferentierea neuronilor motori si se pot asocia si cu alti factori de transcriptie reglatori, cum ar fi proteinele Otx . Pentru a putea face posibilă legarea la ADN, proteinele LIM cu homeodomeniu necesită NLI drept punte de interacțiune, singura interacțiune directă avînd loc doar între Lhx3 și Isl .

Figura 9. Identificarea domeniului de interacție LIM (LID) din structura NLI (imagine preluată după Jurata și Gill,1997)

4. Functia factorului de transcriptie Lmx1a la animalele vertebrate

Proteina Lmx1a reprezinta un factor de transcriptie care are un rol esential in organismul vertebratelor , cum ar fi la nivelul sistemului nervos, pancreasului, membrelor si urechii interne, descriindu-se astfel activitatea sa ubicuitara in procesele de dezvoltare al acestor organe

4.1 Actvitatea lui Lmx1a la nivelul sistemul nervos

4.1.1. Dezvoltarea fosei romboide și a hemului cortical (telencefal)

În momentul dezvoltării sistemului nervos, generarea neuronilor se realizează la nivelul a două zone germinale: fosa rombică și hemul cortical (ambele telencefalice), acestea contribuind într-un mod substanțial la diversitatea neuronală din sistemul nervos central. Aceste zone germinale sunt localizate în regiunea dorso-medială, mărginesc plexul coroid și definesc marginile unui neuroepiteliu (Chizhikov și colab., 2009).

Fosa romboidă se găsește în regiunea dorsala a Rh1 (rombomera 1) și dă naștere mai multor tipuri de neuroni, printre care și neuronii cerebeloși și neuronii sistemului precerbelar, dar contribuie și la formarea plăcii dorsale a ventriculului al patrulea și la formarea derivațiilor plexului coroid (Chizhikov și colab., 2009; Fink și colab., 2006; Goldowitz și Hamre, 1998; Hunter și Dymecki, 2007; Wang și Zoghbi, 2001). Prin analiza de mutanți și folosirea de hărți genetice, s-a descoperit faptul că Lmx1a , pe lânga rolul său în inducția non-neurală a plăcii dorsale de la nivelul tubului neural și diferențierea neuronilor dopaminergici din mezencefal , acesta are și un rol major în reglarea neurogenezei în aceste zone germinale (Chizhikov și colab., 2009; Chizhikov și Millen, 2004; Millen și Gleeson, 2008; Millonig și colab., 2000).

În Rh1, Lmx1a reprezintă un marker specific al plăcii dorsale, iar în ziua embrionară E-10.5 este exprimat împreună cu Gdf7 (Figura 10A) ,dar pe parcursul dezvoltării embrionare, Lmx1a se extinde în fosa romboidă până în E12.5, în timp ce Gdf7 rămîne exprimat în plexul coroid (Figura 10B, b’ și b’’). Expresia lui Lmx1a în fosa romboidă începe cu ziua embrionară E-12.5 (Figura 10B) și pentru a putea observa expresia lui Lmx1a în fosa romboidă, s-a comparat expresia acestuia cu cea a lui Atoh1, care reprezintă un marker pentru întreaga populație neuronală din fosa romboidă . Pe baza acestui studiu s-a constatat faptul că, deși în E-12.5 și în E-16.5 unele celule coexprimă Atoh1, majoritatea celulelor Lmx1a subexprimă acest marker (Figura 10C-G), ceea ce demonstrează faptul că expresia acestuia nu este dependentă de cea a lui Atoh .De asemenea, prin această observație s-a putut demonstra și o mare heterogenitate la nivelul cerebelului, deoarece Lmx1a este exprimat și în alte populații celulare/neuronale din cerebel, în afară de expresia sa în fosa romboidă și placa dorsală, exemple de populații celulare fiind reprezentate de celulele “c3”, expresia Lmx1a în aceste celule fiind inițiată începand cu ziua embrionară E-12.5 (Figura 10B) sau populatia de celule UBC, expresia acestuia fiind evidențiată prin locația sa, modul de migrare și expresia lui Tbr2 (Chizhikov și colab., 2006; Chizhikov și colab., 2009; Englund și colab., 2006).

Prin studiile efectuate pe șoarecii Dreher, s-a arătat faptul că Lmx1a generează celule progenitoare granulare și, în lipsa expresiei Lmx1a, acești progenitori ies mult mai devreme din fosa romboidă și migrează în vermisul anterior. Așadar, un rol pe care îl are Lmx1a în fosa romboidă este acela de a preveni această ieșire a celulelor progenitoare din fosa romboidă și de a inhiba în mod autonom această migrare . Tot prin studiile realizate pe șoarecii dreher în analogie cu șoarecii de tip salbatic, s-a arătat că migrarea progenitorilor într-o etapă timpurie duce la reducerea semnificativă a fosei romboide la șoarecii dreher (Chizhikov și colab., 2009).

Expresia lui Lmx1a poate fi observată și în altă zonă germinală, și anume hemul cortical. Spre deosebire de fosa romboidă, în hemul cortical expresia lui Lmx1a nu poate fi mediată de catre Atoh, deoarece acesta nu este exprimat la nivelul telencefalului. În plus, prin studiile efectuate pe șoarecii dreher, s-a putut demonstra că Lmx1a nu este necesar pentru inductia hemului cortical, structura acestuia fiind observată prin folosirea unui marker specific al hemului cortical, Wnt3a (Yoshida și colab., 2006). În schimb, față de fosa romboidă, lipsa expresiei lui Lmx1a poate duce la modificări substanțiale, și anume că celulele progenitoare ale hemului cortical nu mai au capacitatea de a produce neuroni de tip Cajal-Retzius, ci fenotipul acestora se schimbă, adoptând o soartă neuronală hipocampală (Chizhikov și colab., 2009).

Figura 10. Lmx1a este exprimat în fosa rombică independent de Atoh1 în E10.5. A- expresia lui Lmx1a în rh1 începând cu E-10.5 . B-G – secțiuni sagitale din populația celulară neuronală marcate immunologic si hibridizate în situ în stadiile indicate ( E-12.5, E-16.5). b’-b’’ și g’-g’’ prezintă amplificări ale regiunilor B, E și G. H-K – secțiuni sagitale de la șoarecii de tip sălbatic (H-J), marcați imunologic cu Lmx1a în E-12.5 și E-16.5 (imagine preluată după Chizhikov și colab., 2009)

4.1.2. Specificarea, diferentierea si protejarea neuronilor dopaminergici din mezencefalul ventral

În sistemul nervos central, majoritatea neuronilor dopaminergici, aproximativ 75% din totalul acestora , provin din mezencefalul ventral (Blum,1998; German și colab.,1983; Pakkenberg și colab.,1991). În timpul dezvoltării embrionare, acești neuroni se formează la nivelul plăcii dorsale a mezencefalului ( Ono și colab.,2007) și sunt generate în trei zone distincte: câmpul A8, care reprezintă câmpul retrorubral și reglează funcțiile motorii voluntare prin intermediul căii nigro-striatale, câmpul A9 –substanța neagră partea compactă și A10-aria ventrală a tegumentului (VTA) ,neuronii din zonele A9-A10 inervând striatumul ventral și cortexul frefrontal prin intermediul canalului mezocortolimbic (Lees și colab.,2009; Toulouse și Sullivan,2008; Tzschentke și Smidt,2000).

Figura 11. Neuronii dopaminergici din Sistemul Nervos Central. Ilustrare schematica a neuronilor TH+ apartinand grupurilor A8-A15. Grupurile A16-A17 nu sunt prezentate (cer-cerebel; d-dorsal;dm-dorso-medial; l-r1- regiunea istmica; lge- eminescenta ganglionica lateral; m-corpul mamilar; Mb-mezencefal; mge – eminescenta ganglionica mediala; ob – bulbul olfactiv; or- fosa optica; p-prosomere; sP- prozencefalul secundar) ( imagine preluată după Ang,2006)

Dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal se realizează prin intermediul mai multor factori transcripționali și implică mai multe etape: inducția, specificarea, diferențierea, maturarea și menținerea (Abeliovich și Hammond,2007).

În timpul embriogenezei, inducția neurală începe în momentul în care celulele mezodermale trimit semnale către ectoderm, astfel încât acesta să devină neuroectoderm, acest proces relizându-se în momentul în care se activează cascadele de semnalizare (Moreau și Lecler,2004).

Primul semnal care induce un fenotip al neuronilor dopaminergici este dat de către Sonic hedgehog (Shh), o proteină care este secretată de către placa dorsală începând cu ziua embrionară E-8.5. Totuși, printr-un studiu efectuat de Andersson și colab. în 2006, s-a demonstrat că expresia acestei proteine nu este suficientă pentru dezvoltarea acestor neuroni, astfel în timpul acestei etape se observă și expresia factorului de crestere al fibroblastelor Fgf8. Fgf8 provine din șantul ponto-peduncular și funcționeaza cooperativ cu Shh pentru a induce sinteza neuronilor dopaminergici. Expresia lui Fgf duce la suprimarea altor molecule de semnalizare și activarea markerilor specifici neuronilor dopaminergici. În plus, Shh induce și expresia proteinelor Lmx1a și Msx1/2, aceste proteine fiind implicate în specificarea și diferențierea neuronilor dopaminergici (Jaeger și colab., 2011).

Un alt factor transcriptional implicat în inducția celulelor progenitoare ale neuronilor dopaminergici este Wnt1. Wnt1 este o glicoproteină secretată în istm și este exprimată începând cu ziua embrionară E-9.5 (Wilkinson și colab., 1987). Prin studii in vitro, s-a arătat că Wnt1 regleaza proliferarea celulelor progenitoare din mezencefalul ventral și, de asemenea, poate duce la o creștere a numărului de neuroni generați în aceste celule.

Toți acești factori funcționează cooperativ: Shh și Fgf8 generează o soartă neuronală dorso-ventrală, în timp ce Wnt1 generează o soartă neuronală antero-posterioară, ducând la activarea altor factori transcripționali, ca de exemplu Otx2, Lmx1a /b, En1/2, Msx1/2, Ng2 și Mash (Ang,2006).

În etapa de specificare a neuronilor dopaminergici, Otx2 joacă un rol destul de important. Otx2 este prima dată exprimat în epiblast apoi, începând cu ziua embrionară E-7 la șoarece se poate vedea modelul său de expresie în neuroectodermul anterior, acesta din urmă dând naștere rombencefalului și mezencefalului (Broccoli și colab., 1999; Simeone și colab., 2002) .Expresia lui Otx2 este indusă de către Wnt1 prin intermediul β-cateninei (Chung și colab., 2009) și aceasta reprimă activitățiile factorilor Gbx2 și Nkx2.2 pentru a putea delimita celulele progenitoare dopaminergice de cele serotonergice (Xi și colab.,2012). Pe baza studiilor de deleție la șoarecii knock-out a genei Otx2 (Otx2 -/-) s-a observat că în absența acestei gene se generează un numar mult mai mic de neuroni dopaminergici la nivelul mezencefalului (Puelles și colab., 2004) și poate duce chiar și la incapacitatea de a dezvolta prozencefalul sau mezencefalul (Acampora și colab., 1995).

Proteina Shh și molecula de semnalizare Wnt1 induc expresia lui Lmx1a, aceasta funcționând cooperativ și, câteodată, având functii suprapuse cu Lmx1b în etapele de specificare și diferențiere a neuronilor dopaminergici. Astfel, Lmx1a reprezintă un factor cheie al dezvoltării neuronilor mDA, acesta inducând expresia lui Msx1. Msx1 induce exprimarea factorilor Ngn1 și Nurr1 și, de asemenea, reprimă expresia lui Nkx6.1, impiedicând astfel generarea de alte subtipuri neuronale pornind de la aceste celule progenitoare (Chung și colab., 2009). În plus, Lmx1a reglează și activitatea factorului transcripțional Pitx3, care are capacitatea de a activa enzima tirozin-hidroxilază (Chung și colab., 2009).

Figura 12. Shh induce expresia lui Msx1 si Lmx1a in vitro . A- ilustrare schematica a nivelelor axiale . B-E- sectiuni transversale care arata expresia Lmx1a si Msx1/2 (B), Msx1.2 si Nurr1 (C), Lmx1a si Lmx1b (D) si tirozin-hidroxilaza(TH) si Nurr1(E) (F-prozencefal; M- mezencefal; H-rombencefal; D-dorsal; V- ventral; A- anterior; P-posterior) (imagine preluata dupa Andersson și colab.,2006)

În timpul diferențierii timpurii a neuronilor dopaminergici din mezencefal, celulele progenitoare ies din ciclul celular și generează neuroni dopaminergici imaturi postmitotici , între E-9.5 și E-13.5 la șoarece (Bayer și colab., 1995). În această etapă expresia lui Lmx1a este în continuare activă, deoarece aceasta joacă un rol esențial în diferențierea neuronilor mDA, acesta inducând și expresia lui Nurr1 si En1/2 (Simon și colab., 2001; Alberi și colab., 2004).

Nurr1 este un membru al familiei de receptori nucleari și face parte din clasa factorilor de transcripție intracelulari. În ceea ce privește structura sa, Nurr1 prezintă patru domenii: primul domeniu reprezintă domeniul de legare la ADN, care este conservat din punct de vedere strctural în rândul membrilor familiei din care provine și prezintă două motive de tip „degete de zinc” care permite activarea transcripției; cel de-al doilea domeniu are rol în legarea liganzilor , în timp ce urmatoarele două domenii se află în regiunea N-terminală, respectiv C-terminală, fiind denumite AF1 și AF, acestea având rol și în interacția acestora cu cofactori, pe lânga cel de activare al transcripției (Alavian și colab., 2014). S-a arătat că Nurr1 induce expresia tirozin-hidroxilazei (TH) prin legarea sa la secvența NRBE din promotorul genei TH (Kim și colab., 2003, Sakurada și colab., 1999) . De asemenea, acesta poate induce expresia DAT (transportorul de dopamină), dar printr-un mecanism independent de NRBE (Sacchetti și colab., 2001). S-a demonstrat faptul că FoxA1 și FoxA2 participă la reglarea expresiei sale și acționează sinergic cu acesta în timpul neurogenezei dopaminergice la nivelul mezencefalului ventral și că Nurr1 acționează dependent de Shh, deoarece FoxA2 este un factor în aval (downstream) al lui Shh. O pierdere a expresiei FoxA2 a determinat o creștere a numărului de celule Nurr+ și TH- în mezencefalul ventral (Ferri și colab., 2007).

Doi factori de transcripție ce prezintă un domeniu homeobox de legare la ADN sunt En1 și En2 (Engrailed 1/2) . Aceștia reglează activitatea lui Fgf8 și sunt factori importanți atât în diferențierea, cât și în menținerea neuronior, deoarece sunt implicați în mod direct în apoptoză (Ang, 2006).

În etapa de diferențiere târzie, denumită și maturare, neuronii mDA imaturi încep să migreze spre zona de manta, în urma acestui proces devening neuroni mDA maturi. La nivelul acestori neuroni se observă în continuare activitatea factorului Nurr1, care reglează activitatea TH, AADC (L-aromatic aminoacid decarboxilază) și DAT. Printr-un studiu efectuat pe embrioni de șoarece, s-a concluzionat că absența acestei gene nu afecteaza dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal, ci doar fenotipul acestora. FoxA1 și FoxA2 reglează activitatea lui Nurr1 și poate influența și activitatea lui Lmx1a sau Lmx1b (Bergman și colab.,2009).

În această etapă de maturare a neuronilor dopaminergici din mezencefal, Lmx1b este exprimat împreună cu Pitx3 și reglează expresia acestuia, acționând snergic cu Nurr1 pentru reglarea activității TH, WMAT2 si DAT (Bergman și colab.,2009).

Ultima etapă de diferențiere a neuronilor dopaminergici din mezencefal, adică cea de menținere, presupune mai multe mecanisme complexe, cât și continuarea expresiei factorilor de transcripție descriși în etapele anterioare.

S-a demonstrat faptul că Otx2 protejează neuronii împotriva toxinei MPTP, toxină care se întâlnește în boala Parkinson în zona tegumentară ventrală (VTA). O altă genă care conferă rezistență la MPTP este Nurr1 și s-a dovedit că este o genă importantă și în supraviețuirea neuronilor (Bergman și colab.,2009). De asemenea, Pitx3 pe lânga funcția descrisă anterior, adică aceea de a regla expresia DAT și VMAT2, acesta codifică și o proteină denumită Rgs6. Astfel, prin alterarea expresie Pitx3 de către Rgs6, are loc degenerarea neuronilor din VTA.

Factorii de transcripție Foxa1 și Foxa2, pe lângă rolul pe care îl exercită în dezvoltarea neuronilor mDA, au rol și în menținerea acestor neuroni, deoarece s-a descoperit că lipsa expresiei acestora duce la o concentrație scazută de Aldh1a1 și inexpresia transportorului de dopamină (DAT), ceea ce duce și la o scădere a numărului de neuroni (Domansky și colab., 2014).

Lmx1a este prezent și în această etapă, prezentându-se rolul esențial pe care îl exercită în toate stadiile dezvoltării neuronilor dopaminergici, fiind astfel un factor indispensabil, deoarece lipsa acestei proteine duce la o drastică scădere a numărului de neuroni dopaminergici, cât și la o diferențiere fenotipică a acestora, putând dezvolta alte sorți neuronale.

4.1.3 Importanta genei Lmx1a in generarea de neuroni dopaminergici din celule stem

Celulele stem reprezintă un tip de celule nespecializate care se găsesc la organismele vertebrate și care au capacitatea de a se diferenția în diferite tipuri celulare. Celulele stem au capacitatea de a se reînnoi prin intermediul diviziunii celulare, unde pot rămâne la stadiul de celulă stem sau pot fi induse pentru a deveni celule specializate și ,astfel , a ocupa diferite funcții în organism, această proprietate fiind denumită drept potență. Pentru a putea da naștere unor celule mature, o celulă stem trebuie să fie toti- sau multipotentă. Această capacitate de reînnoire a celulelor stem este menținută cu ajutorul unei replicări asimetrice, unde o celulă stem se împarte într-o celulă mamă identică cu celula stem originară și o celulă fiică care este diferențiată, și cu ajutorul unei diferențieri aleatorii, unde o celulă stem se diferențiază în două celule fiice, apoi o altă celulă stem intră în mitoză și produce alte două celule stem identice cu cea originară.

Figura 13 . Formarea celulelor stem embrionare umane

4.1.3.1 Rolul lui Lmx1a in generarea de neuroni dopaminergici din celule stem embrionare

Neuronii dopaminergici din mezencefal iau nastere din celule progenitoare neuronale, unde acestea impreuna cu diferiti marker de semnalizare, Shh, Fgf8 si Wnt, si factori transcriptionali, Otx2, Lmx1a, Foxa1/Foxa2, Ngn2, Pitx3 si Nurr1, contribuie la dezvoltarea adecvata a acestor tipuri de neuroni.

Cunoscand rolul esential pe care il are Lmx1a in dezvoltarea neuronilor dopaminergici din mezencefal s-au efectuat mai multe studii in legatura cu generarea de neuroni mDA din celule stem emprionare. Un prim studiu a fost realizat de catre Andersson și colab. in 2006, dovedindu-se astfel implicarea lui Lmx1a in generarea acestor tipuri de neuroni din celule stem embrionare, dar doar sub anumite conditii. Astfel, pentru a format neuroni mDA din celule stem embrionare, acestea necesita sa adope o soarta neuronala dorsala, acest proces fiind realizat de Shh (Andersson si colab.,2006).

In 2009, s-a realizat un protocol de catre Filing si colab pentru producerea de neuroni mDA, folosind atat celule stem embrionare umane (hESC), cat si celule stem embrionare de soarece (mESC). Astfel, folosind un vector ce prezinta enhancer Neston pentru mESC si un vector viral cu promotor PGK asupra hESC, acestia au indus o expresie fortata a lui Lmx1a .

In ceea ce priveste celulele stem embrionare de soarece, de la nivelul acestora s-au generat neuroni TH+, acestia avand intre 70 si 90% sansa de a reusi.In plus, majoritatea neuronilor TH+ au exprimat si factorii cheie ce participa la dezvoltarea mDA: Lmx1a, Lmx1b, Pitx3, Nurr1 si Foxa2. De asemenea, s-a observat si un numar foarte scazut de neuroni serotonergici, ceea ce arata ca expresia lui Lmx1a impiedica producerea acestor neuroni.

Pe baza analizelor efectuate ulterior s-a demonstrat ca celulele/neuronii TH+ exprima atat DAT, cat si VMAT2. Dupa ce s-au produs neuronii mature, acestia au fost transplantati in creierul soarecilor , apoi la 4 saptamani dupa transplantare s-au efectuat studii care arata ca in zonele unde celulele transplantare au putut supravietui, diferenta dintre neuronii TH+ proveniti din celulele stem embrionare de soarece si neuronii mDA este aproape imperceptibila, aceste celule exercitand exact aceeasi functie.

In concluzie, Lmx1a are un rol esential in producerea neuronilor dopaminergici din mezencefal care provin din celule stem embrionare, deoarece expresia acestuia poate induce formarea acestor neuroni daca exista si activitatea factorului Shh.

2.3.1.2.Rolul lui Lmx1a in generarea de neuroni dopaminergici din celule stem pluripotente induse

Celulele stem pluripotente (iPSC) s-au format din celule somatice mature prin intermediul reprogramarii, devenind astfel pluripotente. Primele celule stem pluripotente induse s-au obtinut de catre Yamanaka si colab in 2006. Prin reprogramarea fibroblastelor de la soareci prin intermediul factorilor transcriptionali Oct3/4, Sox2, c-Myc si KLF, acestia au obtinut celule pluripotente.

Pentru a se putea obtine neuroni indusi in vitro, este necesara reprogramarea celulelor folosite, de exemplu fibroblaste, hepatocite sau astrocite, cu factori pan-neuronali, cum ar Brn1, Ascl1 si Mytl1 (BAM). In contrast cu aceasta, reprogramarea celulelor dopaminergice induse se realizeaza folosind doar factorii specifici Lmx1a, Ascl1 si Nurr1 (LAN), sau acestia se pot folosi impreuna cu alti factori suplimentari , Foxa2,En1 si Pitx3. In ambele cazuri, celulele rezultate au prezentat un model de expresie mai asemanator cu neuronii mDa decat cu tipul celular de unde provin. Celulele iDA au exprimat endogen Lmx1a, Nurr1 sau Pitx2, precum si eGFP din locusul endogen al lui Pitx3 (Caiazzo și colab., 2011; Kim si colab.,2011).

In 2008 s-a efectuat un experiment de catre Werning si colab pentru a transforma celulele pluripotente induse in neuroni mDa. Astfel, celulele pluripotente induse au fost adaugate intr-un mediu ce contin fibroblaste embrionare de soarece (MEF). Dupa expansiunea celulara, in etapele ulterioare celulele MEF se indeparteaza, celulele iPS sunt transferate intr-un mediu neaderent si sunt puse in contact cu Fgf2, dand nastere celulelor neuroepiteliale , eliberand si factorii specifici ai acestor celule : Sox2,Brn2 si Nestin. Dupa ce Fgf2 a fost indepartat si in mediu s-a adaugat Shh si Fgf8, s-au obtinut celulele de beta-tubulina III +, o parte dintre aceste celule au exprimat VMAT2,Pitx3,Nurr1 si En1/2 si deci, au devenit neuroni TH+.

Prin urmare, celulele stem pluripotente induse necesita expresia Lmx1a pentru a da nastere neuronilor dopaminergici din mezencefal. De asemenea, prin studiul realizat asupra acestor tipuri de celule stem , s-ar putea realiza reprogramarea celulelor pentru a putea repara sau inlocui tesuturile lezate din corpul uman

2.3.1.3 Activitatea Lmx1a in dezvoltarea placii dorsale

In sistemul nervos central, placa dorsala reprezinta un centru important in dezvoltarea posterioara/dorsala a acestuia, avand rol de centru de semnalizare. Celulele placii dorsale iau nastere din precursori mitotitici multipotenti care se gasesc intr-o stare biologica activa la nivelul crestelor si tubului neural. Aceasta regiune in care se gasesc celulele placii dorsale dau nastere si la celulele crestelor neurale si celulele precursoare ale interneuronilor dorsali dI1 (Bronner-Fraser și Fraser, 1988; Echelard et al., 1994 , Lee și Jessell, 1999, Helms și Johnson, 2003). La nivelul maduvei spinarii se observa existenta mai multor factori de transcriptie, Pax3,Pax7 si Msx1/2, acestia avand rol in dezvoltarea placii dorsale, dar si in formarea crestelor neurale si interneuronilor dorsali (Lee și Jessell, 1999; Knecht și Bronner-Fraser, 2002) , cat si existenta unor cascade de semnalizare, Bmp4/Bmp7 si Wnt7.

Activitatea lui Lmx1a in dezvoltarea placii dorsale este dependenta de semnalizarea Bmp si nu este afectata atunci cand WNT prezinta o expresie scazuta. S-a aratat ca in momentul in care BMP este activata, zona in care poate induce placa dorsala se poate extinde, putand include chiar intreaga axa dorso-ventrala a maduvei , in timp ce Lmx1a poate induce formarea placii dorsale doar in regiunea posterioara a tubului neural.

Figura 14. Expresia lui Lmx1a in timpul dezvoltarii maduvei spinarii (imagine preluata dupa Chizhikov și Millen,2004)

De asemenea, Lmx1a prezinta un rol dual in maduva spinarii deoarece pe langa rolul pe care il exercita in dezvoltarea acesteia, acesta poate separa si celulele progenitoare ale placii dorsale de cele ale interneuronilor dorsali dl. Astfel, Lmx1a induce formarea interneuronilor dI1 , in timp ce celulele inhiba intr-un mod autonom exprimarea lui Math1 (Cath1), impiedicand astfel ca celulele din linia mediana dorsala sa adopte o soarta neuronala de interneuroni dI1. Se poate concluziona astfel ca Lmx1a regleaza in mod negativ expresia Math1 si astfel participa la delimitarea dintre placa dorsala si interneuronii dorsali dl1.

Figura 15. Lmx1a inhiba in mod autonom formarea interneuronilor dI1 (imagine preluată după Chizhikov și Millen,2004)

Prin studiile efectuate pe soarecii dreher, s-a observat ca in lipsaLmx1a placa dorsala nu se poate dezvolta, ducand astfel la un numar necorespunzator de interneuroni dI1 . In plus, precursorii postmitotici ai interneuronilor dI1 nu pot dezvolta o polaritate axonala normala si nu pot migra pentru a forma nucleii mediali si laterali, aceste procese fiind esentiale in mentinerea starii fiziologice normale a maduvei spinarii.

In concluzie, Lmx1a are un rol esential in timpul dezvoltarii maduvei spinarii deoarece acesta duce la formarea placii dorsale si a interneuronilor dl1, lipsa expresiei acestei gene avand urmari destul de grave, asa cum s-a observat in studiile efectuate pe mutantii dreher.

2.3.2 Rolul lui Lmx1a în dezvoltarea urechii interne

Dezvoltarea urechii interne începe în momentul formării placodei otice prin intermediul îngroșării ectodermului care se află adiacent de rombencefal. În etapa următoare, placoda otică suferă o serie de modificări morfogenetice, care duc la formarea veziculei otice, și în final dau naștere unei structure complexe ce prezintă șase organe senzoriale : trei canale semicirculare, două macule vestibulare și cohleea (Bryant și colab.,2002; Barald și Keley,2004). Expresia timpurie a lui Lmx1a se realizează în ziua embrionară E8, apoi este exprimat în urechea internă începînd cu ziua embrionară E10.5, în stadiul de otocist și se suprapune cu expresia lui Pax2, acesta fiind implicat în formarea și specificarea canalului cohlear, în special în regiunea dintre epiteliul cohlear senzitiv și stria vascularis (Burton și colab.,2004). Spre deosebire de Pax2, Lmx1a este exprimat exclusiv în regiunea non-senzorială, inclusiv în epiteliul vestibular tranzitoriu, peretele saculei, celulele întunecate, stria vascularis și proeminența strială. Epiteliile non-senzoriale unde este observată expresia lui Lmx1a sunt implicate în urmatoarele procese: a)separă și participă la contricția sacului endolimfic prin formarea canalului endolimfic; b) separă și formează utricula din saculă prin intermediul formării foramenului utriculo-sacular; c) separă și formează cohleea din saculă și canalul semicircular posterior prin intermediul formării ductului reunions.De asemenea, se poate observa și rolul pe care Lmx1a îl exercită în dezvoltarea ductului endolimfatic, care reprezintă o structură esențială în menținerea homeostaziei fluidului la nivelul urechii interne. La acest nivel, există o genă esențială care ajută la formarea și dezvoltarea ductului endolimfatic, Gbx2, care reglează și modul de expresie a lui Dlx5 și Wnt2b. Aici, Lmx1a funcționează independent de Gbx2 și reglează în mod indirect expresia celorlalte două gene, Dlx5 și Wnt2b (Lin și colab.,2005; Everett și colab.,2001; Karet și colab.,1999).

Figura 16. Expresia proteinelor LIM-HD la nivelul urechii interne în E10.5 (A,B) , E12.5 (C-H) și E14.5(I-0) (imagine preluată după Huang și colab., 2008)

Pe baza studiilor efectuate pe mutanții dreher s-a observat că Lmx1a reprezintă o genă esențială în menținerea domeniilor funcționale la nivelul urechii interne, deoarece lipsa acestei gene poate avea urmatoarele consecințe: a) zonele neurogenice vestibulare și auditive să fie foarte slab delimitate sau să existe o limită anormală între acestea; b) organele senzoriale pot avea mărimi și forme neobișnuite; c) o extindere a regiunii neurogenice. De asemenea, s-a observat că Lmx1a poate regla expresia Sox2, aceasta avînd capacitatea de a delimita teritoriile senzoriale de cele non-senzoriale.

Prin urmare, Lmx1a este descrisă ca fiind o gena functională esențială în morfogeneza urechii interne, deoarece lipsa acesteia poate duce la malformații sau diferite fenotipuri la nivelul acestei structuri.

2.3.3 Rolul lui Lmx1a la nivelul pancreasului

La organismele vertebrate și inclusiv la om, promotorul insulinei este transcris la nivelul celulelor B în insulele Langerhans de la nivelul pancreasului (Clark și Steiner 1969; Giddings și colab., 1985). Prin studii de deleție efectuate asupra promotorului, s-a observat că promotorul genei insulinei acționează în cis, avînd și un rol reglator la nivelul transcripției (Edlund și colab., 1985, Karlsson și colab., 1987, Crowe și Tsai 1989, Whelan și colab., 1989, Boam și colab., 1990) și acesta prezintă în structura sa două elemente, Far și FLAT, acestea funcționînd sinergic în activarea și transcripția genei insulinei. Secvența FLAT prezintă două elemente : FLAT-E și FLAT-F, dintre care unul dintre aceste elemente este necesar pentru o funcționare completă a complexului mini-enhancer (German și colab, 1992). Proteinele bHLH Pan-1 și Pan-2, care sunt echivalente cu proteinele E47 și E12 la om, recunosc complexul specific de legare al elementului Far și se leaga la acesta (Nelson și colab., 1990; (Aronheim și colab., 1991; Cordle și colab., 1991, German și colab., 1991; Sheih și Tsai 1991). Astfel, la nivelul pancreasului, Lmx1a este deosebit de important deoarece acesta se leagă prin intermediul homeodomeniului la secvența FLAT și , împreuna cu proteina Pan-1, formează un complex minienhancer, ceea ce duce la activarea genei insulinei și astfel la începerea procesului de transcripție (German și colab,1992).

2.3.4 Rolul lui Lmx1a la nivelul membrelor

La vertebrate, dezvoltarea membrelor începe în mezodermul dorsal și , prin studiile realizate, s-a descoperit modul de formare al acestora. Aici, Lmx1a este analizat împreună cu un alt factor de transcripție LIM-HD, și anume Wnt7a. Astfel, s-a descoperit că Wnt7a este esențial pentru menținerea axei dorso-ventrale în momentul formării membrelor și că expresia ectopică a acestuia poate induce expresia Lmx1a atît in vivo, cît și in vitro. In vivo, expresia lui Lmx1a reprezintă un răspuns la semnalizarea Wnt7a și, astfel, acesta reglează dezvoltarea membrelor dorsale/posterioare. Concomitent cu studiul Lmx1a și Wnt7a, s-a descoperit o altă proteină LIM-HD la Drosophila melanogaster și anume Apterous (Ap) aceasta găsindu-se la nivelul formațiunilor care vor da naștere aripilor, aceasta fiind implicată în dezvoltarea acestora.

Figura 17. Relațiile spațiale și temporale între Lmx1a și Wnt7a (imagine preluată după Riddle și colab., 1995)

Astfel, se poate concluziona că Lmx1a reprezintă un element important în modelarea dorso-ventrală a membrelor, deoarece lipsa expresiei acestuia duce mai degrabă la o dezvoltare ventrală și nu dorsală a membrelor .

Rolul lui Lmx1a la nivelul mitocondriei

Mitocondria reprezinta unul dintre cele mai importante organite celulare din organismul eucariotelor, deoarece aceasta participa la respiratia celulara, transportul electronului, dar si la producerea de energie. Prin studii de imunohistochimie si hibridizare in situ efectuate pe soarecii knockout Lmx1a si Lmx1b, s-a aratat ca principalele disfunctii apar la nivelul complexului mitocondrial I ( NADH – ubichinon oxidoreductaza). Astfel, s-a demonstrat ca expresia genelor care codifica acest complex mitochondrial – genele Ndufa2, Ndufa3 si Ndufa4) este scazuta la acesti soareci. S-a descoperit recent ca Ndufa3 participa la formarea unei holoenzime, in timp ce Ndufa2 si Ndufa4 sunt associate unei tulburari neurologice si anume boala Leigh. De asemenea, tot prin studii efectuate pe soarecii knockout Lmx1a/Lmx1b s-a observat o expresie scazuta a genelor ce codifica proteinele lanturilor transportoare de electroni din cadrul Complexului mitocondrial III. Nrf1, un factor transcriptional aflat in amonte are rol in biogeneza si, la nivelul mitocondriei, impreuna cu PGC-1α, controleaza fosforilarea oxidativa prin exprimarea genelor mitocondriale nucleare, inclusiv toate subgenele nucleare ale citocrom c oxidazei. In plus, s-a descoperit ca Nrf1 are drept tinta mai multe gene asociate bolii Parkinson, cum ar fi PARK2 (Parkin), PARK6 (Pink1), PARK7 si PAELR. Prin masuratoriile privind consumul de oxigen efectuat pe soarecii knockout, s-a aratat ca exista disfunctii la nivelul lantului transportor de electroni, deoarece mitocondriile prezinta o capacitate si o activitate mai redusa si, pe termen lung, nu pot face fata perioadelor bioenergetice ridicate. In momentul in care aceasta limita este depasita, lantul respirator incepe sa produca cantitati ridicate de specii reactive de oxigen (SRO), putand duce si la producerea de leziuni oxidative. De asemenea, stresul oxidativ poate reveni la nivelul mitocondriei si poate duce si la distrugerea ADN-ului mitocondrial. Prin modificarea metabolismului mitocondrial, se poate modula si procesul de autofagie, unde la acest nivel observandu-se o modificare a proteinei LC3-II.

Figura 18. O expresie scazuta a Lmx1a/Lmb1a duce la o superproductie de specii reactive de oxigen si la afectarea ADN-ului mitocondrial, iar expresia fortata a lui Nrf1 prezinta un efect de salvare atat in vitro, cat si in vivo. (A) Culturi neuronale primare din mezencefalul ventral din ziua postnatala 1 (proba de control) sau soareci knockout Lmx1a/Lmx1b infectati cu un vector nul sau un vector care exprima Nrf1. (B si C) Cuantificare densiometrica a probelor sensitive la speciile reactive de oxigen (B) si procentul relativ al neuronilor TH+ care au supravietuit (C) dupa 3 DIV a culturilor neuronale in Lmx1a/Lmx1b unde controlul si vectorul care exprima Nrf1 au fost transfectate. (D) Reprezentarea Sistemului Nervos la P60 si soarecii knockout Lmx1a/b. Tesuturile au fost marcate cu TH(rosu) si un marker mitocondrial, Tom20 (albastru) si a fost tratat cu ARP (verde) (scala – 20 μm)

2.4 Patogeneza Lmx1a

2.4.1 Asocierea lui Lmx1a în boli neurologice

Boala Parkinson este o boala neurologică ce se caracterizează prin degenerarea neuronilor dopaminergici, adică neuronii dopaminergici se distrug pe tot parcursul dezvoltării acestei afecțiuni. Pentru a putea observa corelația dintre Lmx1a și fiziopatologia bolii Parkinson, s-a efectuat un studiu pe trei SNP-uri din gena Lmx1a (rs4657411, rs4657412 și rs6668493) și un SNP din Lmx1b (rs10987386), care au arătat că aceste gene sunt implicate în creșterea susceptibilității de a dezvolta această boală. De asemenea, o serie de SNP-uri corelate cu boala Parkinson care au fost studiate in functie de gen au arătat că boala Parkinson este mai răspîndită în rîndul bărbaților, deoarece la femei estrogenul are un rol neuroprotector, incidența în rîndul femeilor fiind astfel mai mică.

Tot pe baza studiului SNP-urilor, s-a descoperit că dintre SNP-urile care au fost asociate inițial cu boala Parkinson, două dintre acestea sunt prezente și la pacientii care suferă de schizofrenie. Schizofrenia reprezintă o tulburare mentală heterogenă, fiind asociată cu simptome severe, cum ar fi psihoza și halucinații. Alelele genelor prezente în boala Parkinson sunt comune și în schizofrenie. Pe baza ipotezei dopaminergice care stă la baza acestei afecțiuni, mai mulți autori au precizat că există o disfuncție care poate duce la un dezechilibru la nivelul căilor de transmitere a dopaminei, ceea ce ar putea conduce la o manifestare a schizofreniei chiar din timpul procesului de maturare al creierului (Murray și Lewis, 1987; Sesack și Carr,2002). Astfel, se poate concluziona că SNP-urile din gena Lmx1a pot duce și la creșterea susceptibilității de a dezvolta această boală neurologică severă.

Pe lîngă schizofrenie și boala Parkinson, s-a observat că Lmx1a este un factor implicat în scolioza congenitală, deși nu prezintă un rol esențial în dezvoltarea acestei malformații de la nivelul coloanei vertebrale. Prin studiul SNP-urilor de la nivelul genei Lmx1a, Rs1354510 și rs16841013 au fost semnificativ asociate cu o predispoziție congenitală a scoliozei în rîndul populației chineze Han , de asemenea acestea au prezentat diferențe semnificative între grupul de control și subiecții testați. Prin urmare, se poate spune că Lmx1a prezintă un rol ]n scolioza congenitală, deși acesta nu este unul major în cauza genetica care duce la apariția acestei boli.

2.4.2 Asocierea lui Lmx1a cu diferite tipuri de cancer

Recent, s-a observant că Lmx1a prezintă un rol major în diferite tipuri de cancer. De exemplu, acesta a fost identificat drept supresor metastazic în cancerul cervical și ,de asemenea, hipermetilarea acestuia în regiunea promoter duce la pierderea functiei genelor tumorale supresoare. În plus, metilarea este cea mai frecventă în țesuturile carcinoamelor și este corelată cu recurența sau supraviețuirea în rîndul pacienților cu cancer ovarian. Lmx1a a fost observată și într-o linie celulară HCT-115, care reprezintă cancerul de colon.

În cancerul gastric, Lmx1a poate fi privit drept un potential biomarker tumoral, deoarece expresia lui Lmx1a este mult mai redusă în țesuturile cancerului gastric în comparație cu țesuturile normale din punct de vedere fiziologic și hipermetilarea acestei gene este o anomalie epigenetică comună în rîndul tumorilor de acest tip.

Lxm1a poate fi corelat și cu cancerul ovarian epitelial, deoarece o expresie crescută a acestuia îi conferă acestui cancer o chemorezistentă mai scăzută și o natură metastazică mai mică , iar pacienții, după o intervenție chirurgicală citoreductivă, pot avea mai multe beneficii, printre care și rata mai mică de recidivism. De asemenea, tot o expresie crescută a lui Lmx1a este corelată cu stadiul patologic și natura histologică în adenocarninoamele pancreatice.

În afară de rolul de supresor metastazic al celulelor cancerului de col uterin, s-a arătat că proteina Sp1 și EZHZ2 sunt implicați în mod direct în reglarea expresiei acestei gene la nivelul celulelor cancerului de col uterin. S-a dovedit astfel că Sp1 se leagă în mod direct de promotorul genei Lmx1a și este implicat în exprimarea sa endogenică, în momentul în care este supus stresului oncogen în timpul dezvoltării cancerului de col uterin, ceea ce duce la o supresie a celulelor canceroase și la o metastaziere întîrziată.

Prin urmare, expresia lui Lmx1a în diferite tipuri de cancer prezintă are un rol important deoarece acesta poate stopa procesul de metastaziere și poate împiedica apariția de celule tumorale.