“Există oameni și categorii de oameni care se situează deasupra celor comuni …medicul aproape de regulă. El este floarea civilizației noastre … El… [303741]

MOTO:

“Există oameni și categorii de oameni care se situează deasupra celor comuni …medicul aproape de regulă. El este floarea civilizației noastre … El posedă generozitate atât cât este posibil celor care practică o artă, niciodată cât a acelora care fac o meserie; [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat] “

Robert Luis Stevenson

Introducere

Din cele mai vechi timpuri omul a sesizat caracterul aparte al unui grup de boli care apăreau brusc într-o colectivitate și care îmbolnăveau un număr mare de locuitori. [anonimizat], care de-a [anonimizat] o permanentă preocupare a medicilor în vederea prevenirii și tratării acestora.

Chimioterapicele antiinfecțioase sunt substanțele cele mai des prescrise de medic. [anonimizat] o problemă prioritară a [anonimizat]. Astfel de infecții sunt din ce în ce mai greu de stăpânit datorită apariției “supergermenilor de spital”. Acești germeni prezintă pe lângă o virulență ridicată și o rezistență multiplă la antibiotice dobândită cel mai frecvent prin mecanism plasmidic.

După enunțarea de către Louis Pasteur a teoriei microbiene a bolilor infecțioase și aplicarea regulilor de asepsie și antisepsie fenomenul de „hospitalism” a [anonimizat], problema părea definitiv rezolvată. În jurul anului 1960 [anonimizat] „hospitalism modern”.În scurt timp s-a văzut clar că măsurile de igienă nu pot fi înlocuite cu chimioterapia antiinfecțioasă profilactică și că administrarea antibioticelor trebuie făcută după anumite reguli.

[anonimizat], concentrației la care poate ajunge antibioticul în focarul de infecție și mai ales asupra spectrului antibioticului utilizat. [anonimizat] a tulpinilor izolate de-a lungul anilor în laboratorul din zona geografică respectivă.

[anonimizat]. El poate aprecia și evoluția în timp a sensibilității florei bacteriene cu scopul de a preveni transformarea tulpinilor rezistente în populații rezistente. Preocuparea pentru prevenirea apariției „supergermenilor de spital” este o muncă de echipă care presupune colaborarea strânsă între medicul clinician și medicul microbiolog. Rezultatele se obțin în timp și motivează pe deplin acest efort.

[anonimizat], [anonimizat], secretate de unele bacterii și mucegaiuri. [anonimizat] s-au obținut mai ușor pe cale sintetică decât pe cale biologică. Utilizarea antibioticelor în infecțiile bacteriene a determinat apariția în decurs de 50 de ani apariția sub presiunea selectivă a fenomenului de rezistență. Astfel producerea de chimioterapice antiinfecțioase a devenit o industrie, care fiind în permanentă concurență cu apariția tulpinilor rezistente, încearcă să obțină noi produși față de care microorganismele să fie sensibile. Bacteriile au manifestat o abilitate extraordinară de a dezvolta mecanisme care le conferă rezistență la chimioterapicele antiinfecțioase.

Aspectul clinic al infecțiilor, s-a schimbat datorită introducerii metodelor invazive de diagnostic pe de o parte și datorită unor tratamente imunosupresoare capabile să diminueze capacitatea de apărare antiinfecțioasă a pacientului pe de altă parte.

Chimioterapia antiinfecțioasă tulbură echilibrul ecologic al florei normale a organismului, selectând tulpini rezistente care le pot înlocui pe cele sensibile dispărute în urma tratamentului. Entuziasmul introducerii terapiei antiinfecțioase s-a diminuat și o dată cu realizarea faptului că această terapie are rezultate mai ales în tratamentul infecțiilor produse de bacterii, substanțele antifungice și antivirale dau rezultate sub nivelul așteptărilor.

O serie de studii apreciază că de obicei rezistența la acestea este asociată cu rezistență și la alte clase de antibiotice, mai ales la aminopeniciline, cefalosporine de primă generație (Cefalotin) și tetracicline, iar multirezistența poate fi transferată prin intermediul unui singur plasmid.

Studiile au semnalat că prevalența tulpinilor de E. coli implicate în infecții comunitare de tract urinar care au dobândit rezistență la chimioterapicele antiinfecțioase este în creștere. O explicație posibilă a mecanismului de producere a infecțiilor comunitare de tract urinar cu tulpini de E. coli multirezistente, ar fi consecința tratamentului cu antibiotice, administrate pentru diferite afecțiuni (mai ales respiratorii), care modifică prin selecție flora intestinală și în felul acesta favorizează apariția tulpinilor rezistente la acest nivel.

Spre deosebire de infecțiile comunitare, infecțiile nosocomiale sunt infecții contractate de către pacienți în urma internării lor în spital sau a îngrijirilor primite, indiferent dacă simptomele bolii apar sau nu în timpul spitalizării. De obicei infecțiile nosocomiale de tract urinar apar în secții în care se folosește cateterismul uretral (urologie, , nefrologie, neurologie). În cazul acestor infecții problemele sunt mai serioase decât în cazul infecțiilor comunitare cu atât mai mult cu cât pacienții au și un status imun deficitar[1].

Starea de sepsis apare atunci când o infecție învinge sistemul imun care de regulă este incapabil să lupte cu germenii invadatori. Termenul este folosit împreună cu termenul de septicemie.

Termenul de bacteriemie se referă la prezența bacteriilor în sânge care trebuie controlată imediat cu antibiotice. [2]. Bacteriemia este o cauză principală de mortalitate în spitale, care poate evolua într-o infecție sistemică. Infecțiile sistemice sunt o problemă majoră de sănătate și au o prevalență în spitale comparabilă cu infarctul miocardic, accidentele vasculare sau traumatismele, fiind pe locul 8 între cauzele de mortalitate intraspitalicească [3].

Bacteremia poate fi clasificată în funcție de locul de debut ca comunitară sau nozocomială. Ea suscită un interes particular datorită ratei mari de mortalitate la 30 de zile (16-29%) [4]. În consecință, există numeroase programe locale și naționale de supraveghere a bacteriemiei în spitale, care încearcă să prevină infecțiile sistemice prin antibioterapie empirică și controlul infecțiilor.

Majoritatea studiilor de tip cohortă efectuate în spitale raportează incidențele globale, factorii de risc și rata de mortalitate, însă puține studii au investigat incidența în timp (zilnic) a bacteriemiei [5, 6].

Evoluția mijloacelor de detecție a infecțiilor bacteriene și modificările demografice au schimbat epidemiologie infecțiilor bacteriene în ultimele decenii, cu schimbarea spectrului etiologic[7]. Deși între anii 1987-2000 etiologia bacteriemeiei a fost dominată de bacteriile Gram pozitive, prevalența Gram negativilor a crescut, Escherichia coli fiind o infecție re-emergentă în ultimii ani [8].

Septicemia este principala cauză de morbiditate și mortalitate în toată lumea, care conduce la creșterea perioadei de spitalizire și a costurilor îngrijirilor medicale. Se estimează că rata de incidență a sepsisului tratat în spital este de 427 cazuri/100.000 persoane*ani și cea a sepsisuluui sever de 331 cazuri/100.000 persoane*ani [7, 8].

Principalul agent patogen implicat în septicemie este Staphylococcus aureus (SA). Stafilococul poate produce de asemenea endocardită infecțioasă[9], infecții osteoarticulare, cutanate sau ale țesuturilor moi sau infecții asociate dispozitivelor medicale [10]. SA este implicat în 26% din cazurile de endocardită infecțioasă la adulți, iar numărul de cazuri este în creștere [9]. Această situație clinică intervine în special la pacienții imunocompromiși sau cu ciroză hepatică [11].

Odată cu trecerea timpului, tratamentul devine din ce în ce mai dificil datorită creșterii treptate a rezistenței la antibiotice a tulpinilor izolate [12]. Deoarece septicemia este cea mai importantă infecție bacteriană, în special la pacienții imunocompromiși, trebuie determinată sensibilitatea la antibiotice a tulpinilor bacteriene izolate din sânge. Pot exista variații geografice ale rezistenței, astfel încât va trebui aleasă antibioterapia adecvată care să acopere toate tulpinile izolate. [13].

Hemoculturile sunt esențiale pentru diagnosticul infecțiilor sistemice atunci când există suspiciunea unui focar infecțios care prezintă risc pentru sepsis, cum ar fi pielonefrita, bronhopneumonia sau endocardita infecțioasă[4, 9]. Hemoculturile sunt indicate de asemenea în cazul pacienților cu sindrom septic sever, febră prelungită, proteze valvulare și afecțiuni metabolice cu este diabetul.

PARTEA GENERALĂ

Infecțiile invazive

Generalități

Bacteriemia este definită prin prezența unui agent bacterian viabil în fluxul sanguin și este diagnosticată în practica clinică zilnică prin utilizarea hemoculturilor. Incidența anuală a bacteremiei cu debut comunitar este evaluată între 40 și 154/100.000. Gama ratelor de mortalitate este extrem de mare în funcție de apariția șocului septic, a rezistenței antimicrobiene, a vârstei, a comorbidităților și a infecțiilor obținute în asistența medicală. Bacteriemia corespunde diseminării bacteriene prin fluxul sanguin dintr-o focalizare infecțioasă inițială, printre care sepsisul urinar, pneumonia și infecția cu cateterul intravascular sunt cele mai frecvente. Cu toate acestea, chiar și cu o procedură de diagnostic exhaustivă, acest portal de intrare rămâne uneori necunoscut.

Infecțiile din fluxul sanguin (BSI) sunt boli infecțioase definite prin prezența microorganismelor bacteriene sau fungice viabile în fluxul sanguin (ulterior demonstrate prin pozitivitatea uneia sau mai multor hemoculturi) care provoacă sau au provocat un răspuns inflamator caracterizat prin modificarea clinică, de laborator și parametrii hemodinamici. În acest sens, definițiile BSI și cele ale sepsisului sunt două părți ale aceluiași fenomen, deoarece sepsisul este un sindrom infecțios declanșat de o boală infecțioasă, în timp ce BSI este un sepsis declanșat de microorganisme viabile care circulă în fluxul sanguin. Desigur, BSI poate fi precedată, urmată sau concomitentă cu o boală infecțioasă localizată, cum ar fi endocardita, pneumonia, ITU, meningita și altele.

De regulă, BSI pot fi clasificate în 3 grupuri principale:

BSI în gazdele normale imunologic, cu apărare intactă,

BSI la pacienții cu afecțiuni care afectează starea fiziologică (nou-născuți, vârstnici),

BSI la pacienții afectați de afecțiuni patologice sau farmacologice predispuse la infecții.

Primul grup include, de exemplu, infecțiile cu N. meningitidis și S. pyogenes, BSI în timpul endocarditei valvulare la copii, adolescenți sau adulți tineri, S. pneumoniae post-gripă și bacteriemii cu S. aureus și Salmonella typhi și non-tifi în anumite zone ale globului; în majoritatea cazurilor, acestea sunt infecții cu debut comunitar, chiar dacă uneori sunt diagnosticate la câteva ore de la internare. BSI-ul dobândit comunitar și meningita la gazdele cu imunitate normală sunt îngrijorătoare, în special în lumina recomandărilor repetate de multe autorități de a nu utiliza antibiotice fără un motiv adecvat și riscului consecințelor de a nu trata o infecție care pare banală, dar poate fi periculoasă. Într-adevăr, granița în termeni de diagnostic diferențial inițial între o infecție virală și o boală bacteriană insidioasă poate fi estompată.

Al doilea grup de BSI cuprinde infecții la pacienții cu un sistem imunitar imatur sau îmbătrânit. Agenții patogeni sunt frecvent și surprinzător de asemănători la cele două extreme și includ Listeria, infecțiile streptococice și pneumococice din grupul B, E. coli, Klebsiella spp. și Candida.

Al treilea grup de BSI, care poate fi obținut atât în ​​comunitate cât și în spital, poate fi cauzat de practic orice agent patogen, de la Gram-pozitivi la Gram-negativi și ciuperci. Include infecții la pacienții cu imunodeficiență dobândită sau moștenită, afectate de boli precum diabetul, care sunt asociate cu un risc crescut de complicații infecțioase și cele aparținând zonei mari de infecții asociate asistenței medicale și nosocomiale, tipice medicinii moderne, în care utilizarea terapiei imunosupresoare și citotoxice sau a unei intervenții chirurgicale extrem de invazive a devenit o practică comună. Într-adevăr, progresul medicinei moderne a obținut rezultate de neimaginat în ultimele decenii, în terapia multor boli, în medicină, chirurgie și terapie intensivă, la adulți și copii, dar nu fără a plăti un preț. Unul dintre efectele nefavorabile ale medicinei moderne a fost crearea unei populații de pacienți definite ca fiind compromise sau imunocompromise, cu defecte unice sau multiple ale mecanismelor de apărare, care predispun la infecții severe datorate agenților patogeni oportunisti. Deci capacitatea unui microorganism de a cauza boala este o funcție nu numai a virulenței sale intrinseci, ci și a competenței imunologice a gazdei și a perturbării barierelor sale de apărare.

Cu siguranță, categoriile de mai sus sunt imperfecte și există suprapuneri. Unul este, de exemplu, populația bolnavilor de cancer, în care riscul de infecție este rezultatul unei interacțiuni atât între boala care stă la baza acesteia, care prin ea însăși poate modifica atât mecanisme mecanice și imunologice de apărare, cât și toxicitatea legată de chimioterapie. Cu toate acestea, această clasificare este utilă pentru a descrie realitatea bolilor infecțioase în zilele noastre. Câteva recenzii interesante pe acest subiect au fost publicate recent.[1,2]

Definiție. Clasificare

Infecția invazivă se pot clasifica în:

BSI-uri legate de cateterul vascular

BSI-uri legate de suportul circulației mecanice

Cateterele vasculare sunt plasate pentru administrarea de medicamente intravascular sau monitorizare. Riscul de infecție a fluxului sanguin este mai mare atunci când aceste dispozitive de acces vascular (VAD) sunt plasate ca linii centrale.

Dispozitivele mecanice de susținere a circulației (MCSD) sunt plasate în vene sau artere mari pentru a mări sau menține funcția cardiacă la pacienții cu insuficiență cardiacă severă. Unul dintre factorii determinanți majori ai supraviețuirii pacientului este infecția legată de dispozitiv. Cea mai recentă generație de MCSD folosesc pompe rotative cu flux axial cu rulmenți de contact și conducte percutanate mai mici. Din cauza îmbunătățirilor tehnice, se preconizează că această generație mai nouă de dispozitive are o rată mai mică de complicații infecțioase legate de dispozitiv. Datele din studiile clinice demonstrează o incidență mai mică a infecției. Cu toate acestea, doar unul dintre aceste studii a arătat că BSI-ul inferior a fost legat de dispozitive de a doua generație. Rezultatele pe termen lung ale marilor studii multicentrale, Registrul Interagențelor pentru Suportul Circulator Mecanic (INTERMACS) va fi disponibil în viitorul apropiat.

Definirea BSI invazive

Definițiile infecțiilor din fluxul sanguin variază semnificativ în funcție de diferiți autori.

Infecții confirmate de laborator (LCBSI): Pentru a fi considerat evenimentul trebuie să îndeplinească unul dintre următoarele criterii la un pacient:

are un „patogen recunoscut” din hemocultură, iar organismul cultivat nu are legătură cu o infecție din alt loc. Organismele considerate contaminanți comuni ai pielii nu sunt incluși în definiția unui agent patogen recunoscut.

prezintă cel puțin unul dintre următoarele semne sau simptome:

febră (> 38 ° C), frisoane sau hipotensiune arterială dacă pacientul are vârsta de> 1 an

febră (> 38 ° C) hipotermie (<36 ° C miez), apnee sau bradicardie dacă pacientul are vârsta de 1 an

rezulat microbiologic care nu are legătură cu o infecție pe un alt site SAU

un contaminant cutanat obișnuit (adică, difteriomorfi (Corynebacterium spp.), Bacillus spp. (cu excepția B. anthracis), Propionibacterium spp., stafilococi coagulaza-negativi [inclusiv S. epidermidis], streptococi din grupul viridans, Aerococcus spp., Micrococcus spp. ) este cultivat din două sau mai multe culturi de sânge recoltate separat.

Confirmarea de laborator a BSI primară:

contaminant comun de pe piele:

izolat din 2 sau mai multe hemoculturi

izolat în ocazii separat

Confirmarea de laborator a BSI primară:

contaminant comun de pe piele:

izolat din 1 sau mai multe hemoculturi

linie intravasculara

tratament antiinfecțios prescris

Confirmarea de laborator a BSI primară:

comun contaminant de pe piele:

Hemophilus influenzae

SAU Neisseria meningitidis

SAU Streptococi grup B

Linia centrală: Linia centrală este un cateter intravascular care se termină la inimă sau aproape de inimă sau într-unul dintre marile vase care este utilizat pentru infuzie, recoltare de sânge sau monitorizare hemodinamică.

Infecția primară a fluxului sanguin: BSI-uri primare sunt infecții confirmate de laborator (culturi de sânge crește organisme) infecții ale fluxului sanguin (LCBSI) care nu rezultă dintr-o infecție dintr-un alt site.

Infecția cu fluxul sanguin asociat cu linia centrală: Centrul de control și prevenire a bolilor (CDC) dezvoltă definiții care sunt utilizate pentru supraveghere.

O infecție de flux sanguin este definită atunci când un cateter central era inserat la momentul sau în termen de 48 de ore înainte de debutul infecției. Nu există nici o perioadă de timp minimă pentru ca linia centrală să fie inserată pentru a putea fi considerată infecție sanguină asociată cu linia centrală (CLABSI).

Epidemiologie

Epidemiologia globală a BSI este foarte dificil de evaluat, deoarece studiile au fost realizate cu diferite metodologii (incidență și prevalență, de exemplu) și au inclus populații și tipuri de spital foarte diferite. Incidența BSI variază substanțial între cele 3 categorii pe care am încercat să le definim mai sus. În special în a treia categorie, incidența depinde de boala de bază, țara, tipul de spital, tipul de secție și lungimea spitalizării, fiind de până la 30% în populația transplantului de celule stem hematopoietice (HSCT) (3) În ceea ce privește BSI comunitare, Laupland și colaboratorii, 1 care au revizuit mai multe articole despre BSI cu debut comunitar, au descoperit o incidență anuală care variază de la 40 la 154 / 100.000 din populație. În ceea ce privește infecțiile asociate asistenței medicale, un studiu pivot realizat de Hilmar Wisplinghoff și coworkers în 2003, 4 au raportat peste 24000 de cazuri de BSI în 49 de spitale americane pe o perioadă de 7 ani, cu o incidență de 6 cazuri / 100.000 de internări în spital. Acest articol oferă informații importante, incluzând, de exemplu, mortalitatea foarte mare asociată cu candidemia. În anii mai recenți, Ani și colab., Pornind de la codurile ICD-9-CM, au identificat peste 5.000.000 de cazuri de sepsis severe spitalicesc în SUA din 1999 până în 2008 (5). Un studiu de prevalență realizat de CDC european (ECDC) a găsit o prevalență a pacienților cu cel puțin un HAI în spitale europene de 6%, cu o gamă de țări care variază de la 2,3% la 10,8%. Aproximativ 10% din episoade au fost BSI (6). Datele din Sistemul european de supraveghere a rezistenței antimicrobiene (EARSS) (7) au arătat că numărul de BSI din cauza S. aureus, E. coli, S. pneumoniae, E. faeciumul sau faecalis raportate între 2002 și 2008 au crescut cu 47% de la 46.095 la 67.876.

Interesant este că modelul agenților patogeni care provoacă BSI s-a schimbat de-a lungul anilor, cu un număr din ce în ce mai mare de infecții Gram-negative și, mai ales, de infecții cu fungi (C. albicans și non albicans) (8). Cu toate acestea, în ultimele 2 decenii, cele mai semnificative modificarea etiologiei BSI nu a fost tipul de organisme infectante, ci mai degrabă rezistența lor la antibiotice, în special pentru bacteriile Gram-negative. Două mecanisme principale au pus în pericol arma antibiotică: (i) producerea ESBL (mai multe subtipuri diferite), pentru care în unele țări am pierdut (în altele pierdem) activitatea cefalosporinelor din generația a III-a, cel puțin în spitale și (ii) producția de carbapenemaze și metalo-betalactamaze, cu răspândirea în consecință a unui organism multi sau rezistent la pan.

Sursa BSI este controversată. Dispozitivele medicale pot fi surse evidente, atunci când pacientul nu are alte disruperi aparente în mecanismele de apărare. Cu toate acestea, acest lucru se întâmplă rar. La pacienții cu cancer, de exemplu, cateterul central este doar unul dintre numeroasele mecanisme care predispun la BSI. Noile date sugerează de fapt că 40–50% din infecțiile fluxului sanguin din mediul oncologic se datorează leziunii barierei mucoasei (13). Acest lucru are un impact asupra așteptărilor de la îmbunătățirile în gestionarea corectă a cateterului, astfel încât să poată scădea BSI la pacienții cu cancer și să impună înlocuirea precipitativă a cateterului , în afara unei situații bine definite, cum ar fi candidemia (14).

După cum am menționat deja, diagnosticul unui BSI se bazează pe pozitivitatea uneia sau mai multor culturi de sânge. Două culturi de sânge pozitive sunt preferabile pentru contaminanții obișnuiți ai pielii, pentru a evita atribuirea etiologiei unui agent patogen care nu a fost de fapt prezent în fluxul sanguin, cu greșeli terapeutice evidente și posibile consecințe dramatice. Rezultă că progresele tehnologiilor terapeutice pot avea un impact substanțial asupra multor factori legați de BSI, inclusiv sensibilitatea procedurii și timpul de transformare de la colectarea eșantionului până la detectarea pozitivității, identificarea patogenului și a rezultatelor susceptibilității. Accelerarea tuturor procedurilor de cultivare a sângelui este esențială pentru clinicieni, deoarece poate scurta terapia empirică și permite terapiile vizate anterior, cu avansuri în administrarea antimicrobiană. In ultimii ani, au fost propuse mai multe metodologii noi, iar unele dintre ele sunt deja disponibile în multe laboratoare. Acest articol depășește scopurile acestui articol pentru a trece în revistă noile metode microbiologice. Merită menționată doar tehnologia MALDI-TOF, care a fost cu siguranță un progres revoluționar în microbiologia de diagnostic. În orice caz, până în prezent, tehnologia tradițională de cultură a sângelui, bazată pe detectarea creșterii bacteriene sau fungice într-un mediu rămâne încă de ultimă generație. Neclar este dacă, cum și în ce măsură lucrurile se vor schimba dacă vom putea accepta metode alternative ca demonstrație a unui agent patogen în sânge, cum ar fi detectarea antigenului (deja utilizat pentru Candida), și în special metodele de biologie moleculară.

În concluzie, cea mai remarcabilă schimbare din ultimele două decenii în gestionarea infecțiilor bacteriene este eficiența scăzând dramatic a multor antibiotice în concordanță cu o lipsă importantă de noi molecule. Bacteriile au arătat capacități extraordinare de reziliență. Măsurile de control al infecției, îmbunătățirile în diagnosticări, utilizarea mai prudentă a antibioticelor vechi și disponibilitatea de noi molecule sunt toate urgent necesare pentru a controla răspândirea rezistenței. BSI rămâne o provocare formidabilă pentru medicul bolii infecțioase, dar poate deveni o misiune imposibilă dacă nu vom contrasta eficient dezvoltarea rezistenței.

Bacterii implicaTE în infecții sistemice

Staphylococcus aureus

Habitat

Stafilococii sunt germeni ubiquitari, fiind răspândiți în mediul ambiant, aer, apă, sol, pe suprafețele meselor, podelelor, pe câmpuri operatorii, instrumentar, lenjerie. Se găsesc ca germeni comensali la nivelul țesutului cutanat, la nivelul mucoaselor căilor respiratorii, vagin, intestin. Stafilococii patogeni, prin unele componente celulare sau extracelulare, determină procese supurative localizate la nivelul țesuturilor organismului[14].

Stafilococul aureu poate fi găsit în procent de 10 până la 40% la purtătorii sănătoși, iar în mediul spitalicesc ajunge și la 40-70%[15].

Caractere morfologice

Stafilococii sunt coci Gram pozitivi, sferici, cu diametrul cuprins între 0,5-1,2 μm. Se grupează sub formă de grămezi, asemănător boabelor din ciorchinele de strugure (staphyle kokkus). Sunt nesporulați, imobili și uzual necapsulați, existând și forme capsulate la tulpinile virulente.

Caractere antigenice

Tulpinile capsulate prezintă o capsulă de natură muco-polizaharidică. Capsula constituie un important factor de virulență, având rol antifagocitar.

Componentele peretelui celular sunt următoarele[16]:

• peptidoglicanul – are structură mucopeptidică

– are caracter imunogen

– asigură păstrarea formei sferice, permițând celule bacteriene să reziste în condițiile nefavorabile de mediu.

•acidul teichoic -are rol în fixarea bacteriofagilor la nivelul peretelui celular

– asigură funcțiile fiziologice normale, controlând activitatea enzimelor implicate în sinteza peretelui celular și diviziunea celulară.

• proteina A – este componenta proteică majoră a stafilococului aureu, fiind prezentă la peste 90% din ei;

– are acțiune: antifagocitară, anticomplementară și antitrombocitară;

– fixează fragmentul Fc al IgG, lăsând libere fragmentele Fab care se cuplează cu antigene bacteriene. Această proprietate este folosită în identificarea serologică a altor categorii de bacterii (ex. reacția de coaglutinare pentru identificarea serologică a streptococilor, meningococilor, genococilor);

– este sensibilă la tratamentul cu enzime (tripsină, chemotripsină).

Caractere de patogenitate

În producerea unei boli stafilococice intervin, pe de o parte, puterea patogenă a germenului datorită componentelor celulare, echipamentului enziamtic și a toxinelor eliberate și, pe de altă parte, starea organismului infectat (diabet, hepatită, tulburări endocrine, boli virale anergizante, de nutriție, deficite imune, tratamente imunosupresive, stres etc.).

Staphylococcus aureus prezintă numeroși factori de patogenitate, fiecare având un mecanism propriu de acțiune, determinând polimorfismul clinic al infecțiilor. Fiecare factor de agresiune constituie o verigă din lanțul complex de factori a căror acțiune se sumează pentru realizarea infecției. Faptul că o parte din acești factori sunt cu determinism plasmidic sau se află sub controlul bacteriofagilor temperați (conversie lizogenă) explică variațiile de virulență observate la stafilococi.

Genul Enterococcus

Bacteriile din genul Enterococcus au fost catalogate ca bacterii cu un grad scăzut de patogenitate, dar in anii 1990 au devenit importanți agenți etiologici ai infecțiilor nosocomiale (Merquior, Netz et al. 1997, Rugină 2004).

La pacienții spitalizați, enterococii pot fi evidențiati la nivelul leziunilor țesuturilor moi, ulcerelor și tractului gastro-intestinal(Patel, Piper et al. 1998).

Sindroame infecțioase care recunosc enterococi în etiologie pot fi reprezentate de infecții ale tractului urinar la pacienții cu uropatii obstructive, infecții mixte ale plăgilor mai ales la pacienții aflați sub tratament antimicrobian (Hayakawa, Marchaim et al. 2013, Gurnee, Ndao et al. 2014, Calina, Docea et al. 2017).

Pot sa apară bacteriemii la vârstnici și pacienții imunocompromiși(Moradigaravand, Gouliouris et al. 2017). Studii efectuate în Statele Unite au demonstrat că majoritatea pacienților infectați cu tulpini deosebit de rezistente la antibiotic provin din unitățile de Terapie Intensivă (Byun and Kang 2013).

Factorii de risc ce pot fi adăugați celor deja menționați regăsim: durata crescută a spitalizării, colonizarea gastro-intestinală cu VRE, expunerea la echipamente medicale contaminate, transplantul medular, afecțiunile hematologice, tratamentul cu cefalosporine de generatia a 3-a și antibiotice cu acțiune asupra bacteriilor anaerobe16.

Enterococii cauzează rar infecții ale tractului respirator, osteomielită sau celulită, în schimb au devenit a treia cauză a infecțiilor nosocomiale în Statele Unite. Infecțiile enterococice pot fi cauzate de cel puțin 19 specii incluzând E. avium, E. casseliflavus, E. durans, E.faecalis, E. faecium, E. gallinarum, E. hirae, E. malodoratus, E. mundtii, E. pseudoavium, E. raffinosus, E. solitarius.

Caractere morfologice

Sunt coci sferici Gram pozitivi dispuși în lanțuri sau tetrade.

Caractere de cultură

Pe mediile cu sânge sunt non-hemolitici (gamma) sau, mai rar, alfa sau beta

Cultivă pe medii cu NaCl 6,5%

Cultivă pe medii cu bilă și esculină (determină colonii mari, opace, negre)

Sunt rezistenți la azidă de sodiu 0,05% (spre deosebire de alți streptococi).

După 18-24h incubarea la 35-37 °C pe agar sânge sunt coloniile de 1-2 mm și pot fi α, β sau non-hemolitice. Majoritatea speciilor vor crește pe agar nutritiv la 45 °C. Câțiva vor crește la 50 °C, la pH 9,6 și în NaCl 6,5%. De asemenea, pot supraviețui 60 °C timp de 30 de minute.

Caractere Biochimice

Două specii din genul Enterococcus sunt mobile, Enterococcus casseliflavus și Enterococcus gallinarum. Enterococii sunt negativi pentru oxidază și carbohidrați fermentați.

Majoritatea speciilor sunt negative catalazice, dar unele tulpini produc o pseudocatalază.

Dau testul pozitiv la hipurat de sodiu pozitiv (albastru deschis).

Caractere antigenice

Majoritatea enterococilor posedă antigen de grup D, deși unele tulpini pot reacționa cu antiserumul Lancefield de grup G.

E. faecalis este foarte rar rezistent la ampicilină.

Enterobacteriaceae

Escherichia coli

Habitat

Speciile de Escherichia sunt componente ale microbiotei intestinale a omului și animalelor cu sânge cald, cu excepția E. blattae, izolată de la gândacii de bucătărie. E.coli este bacteria cel mai frecvent implicată în patologia infecțioasă, celelalte specii fiind patogene ocazional (16).

Dintre Enterobacteriaceae, E. coli reprezintă specia cel mai frecvent izolată atât în mediul spitalicesc cât și în ambulator. E. coli reprezintă 20-40 % din totalul germenilor și 40-60 % din totalul bacililor Gram negativi izolați din septicemii, 40 % din meningitele neonatale și 80-85 % din infecțiile tractului urinar (cistite, pielonefrite).

E. coli este principalul agent etiologic al infecțiilor tractului urinar. Nu orice germen și nu în orice moment, intră în interrelație cu structurile aparatului urinar. Tractul urinar este dotat cu posibilitatea de eliminare a germenilor, fără producerea de infecție la acest nivel. Alteori, acest echilibru este dereglat, în favoarea agresiunii exercitată de germenii patogeni, fapt care se soldează cu apariția procesului inflamator.

În mod natural E. coli (fenotipul sălbatic) este sensibilă la numeroase chimioterapice antiinfecțioase aparținând diferitelor familii: beta-lactamine, aminoglicozide, quinolone, sulfamide în asociație cu trimetoprim, cicline etc.

Caractere morfologice

Bacili Gram negativi, cu lungime 2-3 µm, cu polimorfism accentuat. Sunt nesporulați, necapsulați, cu excepția speciilor care posedă antigenul K, sunt mobile, cu cili peritriche (unele imobile).

Figura 3.1. Morfologia Escherichia coli

Klebsiella

Caractere generale

Ordinul: Eubacteriales; familia: Enterobacteriaceae; tribul: Klebsiellae; genul: Klebsiella.

Din cele 10 specii ale genului, 4 sunt importante în patologia umană: Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, K. ozenae și K. rhinoscleromatis.

Caractere morfologice

Pe frotiul efectuat din cultură: bacili Gram-negativi, nesporulați, capsulați, groși, drepți sau ușor încurbați.

Pe preparat proaspăt între lama și lamelă, efectuat din cultură: bacili imobili, monomorfi.

Caractere de cultură

Se folosesc medii simple – geloză simplă; selective – Istrate-Meitert, Leifson, MacConkey și complexe – geloză sânge .

Geloză simplă – colonii mucoide, mari, opalescente, uneori cenușii, cu suprafață umedă care după incubare prelungită prezintă tendința de confluare și curgere pe suprafața mediului

Mediul Istrate-Meitert – colonii lactozo-pozitive, opace, galbene, mari, mucosae, filante, ,,în picătură de miere”(prin prezența capsulei); fenomenul de „cameleonaj” (24 ore lactozo(+) apoi devin lactozo (-) )

Geloză-sânge – colonii mucosae, filante în picătură de miere, fără hemoliză

Mediul MacConkey – colonii lactoză-pozitive roz-roșii

Mediul Leifson – colonii lactozo-pozitive roșii

Caractere metabolice

fermentează glucoza cu producere de gaz (cu excepția K. Rhinoscleromatis);

fermentează lactoza variabil;

nu fermentează insulina;

uneori, aciditatea produsă prin fermentare este tranzitorie (fenomenul de cameleonaj);

nu produce hidrogen sulfurat;

nu produce indol (cu excepția K. Oxytoca);

folosește citratul ca sursă unică de carbon;

reduce nitrații la nitriți;

produce urează;

produce acetoină din glucoză (reacția Voges-Proskauer pozitivă);

reacția roșu metil-negativă (concentrația de acid produsă prin fermentarea dextrozei nu depășește sistemul fosfat tamponat);

ornitindecarboxilază negativă, fenilalanindezaminază negativă;

lizindecarboxilază de regulă pozitivă;

Figura 3.2. Caractere metabolice și de cultură – Klebsiella Pneumoniae

Caractere antigenice

prezintă un antigen somatic O (pe baza căruia s-au descris 5 grupe antigenice) și un antigen capsular K (pe baza căruia s-au descries 80 fracțiuni antigenice)

prin reacția de umflare a capsulei cu ajutorul serurilor anticapsulare de tip se identifică 80 de serotipuri de Klebsiella

Caractere de patogenitate:

germeni condiționat-patogeni:

Virulența depinde de capsulă (antigenul K de înveliș), ce îi conferă protecție antifagocitară;

Toxinogeneza se manifestă prin endotoxină (antigen somatic O); au fost evidențiate ocazional la Klebsiella enterotoxine termolabile responsabile de apariția scaunelor diareice.

Epidemiologie și profilaxie

K. pneumoniae este specia cel mai frecvent izolată din cadrul genului, fiind deseori cauza unor infecții nosocomiale la gazda imunocompromisă (post intervenții chirurgicale; prezența dispozitivelelor medicale invazive – bronhoscopie, cateter venos central, tubulatura de intubație, drenuri chirurgicale; prezența comorbidităților – diabet zaharat, hepatită cronică, tuberculoză, neoplazii, infecție HIV, alte boli cronice; afecțiuni acute – arsuri, traumatisme ce duc la pierderea unor suprafețe mari de piele; tratamente imunosupresoare etc.) și la vârstele extreme (vârsta înaintată sau nașterea prematură) .

Răspunsul imun umoral este slab și profilaxia nespecifică. Profilaxia se aplică în primul rând în infecțiile nosocomiale și constă în măsurile uzuale de limitare a infecțiilor: igiena mâinilor, screening-ul și izolarea pacienților care provin din zone endemice pentru tulpini cu factori de rezistență, aplicarea unor proceduri corespunzătoare pentru manevrele de îngrijire medicală invazive etc.

Fenotipuri de rezistență la antibiotice ale Enterobacteriaceelor

Fenomenul rezistenței germenilor microbieni față de chimiterapice domină astăzi patologia infecțioasă, interesând deopotrivă pe microbioliog, clinician și epidemiolog.

Frecvența bacteriilor cu rezistență crescută la antibiotice, este în continuă creștere și cuprinde bacterii care au avut reputația de bacterii sensibile la antibiotice, ca de exemplu: Streptococcus pneumonie rezistent la penicilină, Stafilococcus spp. rezistent la meticilină, Enterococcus spp. rezistent la penicilină și glicopeptide. Rezistența la antibiotice se manifestă și pentru germenii Gram pozitivi, cum ar fi genul Corynebacterium: C. jeikeium (Rosato, Coryneb jeikeium), C. amycolatum (Rosato, Lee, & Nash, 2001; Yague Guirao et al., 2005), C. striatum (Verroken A., 2014), C. campanile și C. resistens (Otsuka et al, 2005).

Bacteriile rezistente la antibiotice au tendința de a difuza epidemic în spitale și sunt implicate în producerea de infecții nozocomiale. Infecțiile cu bacterii rezistente la antibiotice ridică noi probleme atât clinicianului cât și microbiologului.

Se impun măsuri de prevenire pentru a controla răspândirea bacteriilor rezistente, ca de exemplu izolarea pacienților cu infecție sau a pacienților colonizați, respectarea precauțiunilor universale, sterilizarea corectă a instrumentarului.

La fel de importante sunt și supravegherea folosirii antibioticelor, restricționarea selectivă a lor, limitarea duratei terapiei empirice.

In orice spital, rezistența crescută la antibiotice reflectă atât modul de administrare a antibioticelor cât și nerespectarea măsurilor de prevenire a infecțiilor nozocomiale.

Eforturile companiilor pentru a dezvolta tratamente alternative vor fi supuse eșecului, dacă nu se aplică măsurile care previn și controlează răspândirea bacteriilor cu rezistență crescută la antibiotice.

Laboratorul clinic de bacteriologie are un rol esențial în diagnosticul și controlul infecțiilor cu bacterii rezistente la antibiotice, prin acuratețea identificării agenților etiologici, detectarea rezistenței la antibiotice și tipare moleculară.

Dificultățile pe care le întâmpină laboratorul în izolarea și testarea sensibilității bacteriilor rezistente sunt majore, deoarece metodele uzuale nu sunt atât de sensibile în detectarea bacteriilor rezistente la antibiotice.

Se deosebesc două tipuri de rezistență a bacteriilor la antibiotice:

rezistența naturală, care este un caracter de specie, determinat genetic, deci absolut;

rezistența dobândită, care apare la tulpinile unor specii natural sensibile la un anumit antibiotic; ea este relativă, deoarece desemnează rezistența unei tulpini la concentrațiile de antibiotic utilizate în terapie.

Mecanismele biochimice implicate in rezistența la antibiotice sunt:

producerea de către bacterii a unei enzime care inactivează antibioticul, de exemplu penicilinaza Stafilococului aureu care inactivează nucleul betalactam al penicilinelor sau diferitele tipuri de betalactamaze produse de bacteriile Gram negative (Enterobacterii).

scăderea permeabilitații peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotice(formele L)

elaborarea în exces de către bacterie a unor enzime complementare, care limitează sau anulează acțiunea antibacteriană a antibioticului, exercitată la nivelul enzimei respective

alterarea țintei intracelulare (modificarea proteinelor ribozomale)

amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulându-se prin „diluare” acțiunea inhibitorie a sulfamidelor.

Rezistența dobândită poate fi cromozomială și extracromozomială.

Rezistența cromozomială se poate dezvolta ca rezultat al unei mutații spontane la nivelul unui locus ce controlează sensibilitatea față de un anumit produs antimicrobian. Prezența antibioticului servește ca un mecanism selector, suprimând organismele sensibile și favorizând dezvoltarea unei populații provenite din organismele mutante, rezistente la antibiotic. Mutațiile cromozomiale sunt definitive, afectează numai un anumit antibiotic sau o familie de antibiotice și se transmit vertical la toți descendenții sușei bacteriene devenite rezistente.

Rezistența extracromozomială este mult mai frecventă decât cea cromozomială, reprezentând aproximativ 90% din cazurile de rezistență. În acest caz transmiterea materialului genetic pentru rezistență se poate face orizontal, la toți membrii populației bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, transpozomi.

Bacili Gram negativ glucozo-nefermentativi

Pseudomonas

Pseudomonas aeruginosa, denumit si bacilul piocianic, a fost mult timp considerat ca germen saprofit sau cu patogenitate scazută. Ulterior s-a dovedit a fi agentul etiologic al unor infecții cum sunt: infecții nosocomiale, infecții pulmonare, infecții otice, infecții urinare, septicemii etc.

Patologia provocată de bacilul piocianic s-a amplificat considerabil in ultimii ani datorita utilizării pe scară largă a chimioterapicelor, ceea ce a condus la selectarea tulpinilor rezistente. La acestea se mai adaugă creșterea riscului de contaminare în spitale datorită unor manevre de diagnostic și tratament (cateterisme, endoscopii, intubații pentru anstezie etc.).

Datorită numărului crescut al infecțiilor cu Pseudomonas aeruginosa, atât în mediul spitalicesc cât și extraspitalicesc, prin rata crescută a morbiditații și mortalitații și prin consecințele economice pe care le determină, acest microorganism reprezintă un important subiect al numeroaselor studii.

Habitat

Pseudomonas aeruginosa face parte dintre agenții de putrefacție ai materiei organice vegetale și animale.

A fost izolat din apă, sol, aer, fiind foarte raspândit în spitale, acolo unde există umezeală: vaze cu flori, dezinfectante, echipamenul de respirație artificială. Portajul uman este în jur de 6% la persoanele sănătoase, 38% la cei spitalizați o periaodă mai lungă și 78% la persoanele cu sistem imun deficitar. S-au semnalat infecții cu caracter epidemic la bolnavii cu arsuri în unitațile de terpie intensivă, secții de ORL și oftalmologie.

Pseudomonas aeruginosa este frecvent izolat din intestinul și de pe tegumentele si mucoasele persoanelor sănătoase. Necesitățile nutriționale simple și abilitatea de a metaboliza o mare varietate de substanțe chimice organice îi dau posibilitatea să supraviețuiască și să se înmulțească în fluide și în medii umede care se găsesc în secțiile de spital. Sursele din mediul spitalicesc, care s-au dovedit a fi vectori de tranzit, includ soluții oftalmice, soluții antiseptice, soluții medicamentoase cu utilizare repetată din același recipient, cremele de mâini, loțiunile de corp, ventilatoarele respiratorii, decantoarele de apă din apropierea paturilor, plantele ornamentale, pămătufurile, termometrele orale, obiectele din camera de baie (prosoape, bureți, perii).

Pseudomonas aeruginosa este în procent de 10% cauza infecțiilor nosocomiale.

Acest microorganism a fost izolat din apa distilată, din soluțiile perfuzabile, din alimente, din medicamente (cutii cu creme, colire oftalmice).

Caractere morfologice

Sunt bacili gram negativi, subțiri, izolați, foarte mobili, cu un flagel polar monotriche, necapsulați (unii capsulați), nesporulați.

Au fost descrise tulpini capsulate izolate din infecții grave.

Caractere culturale

Pseudomonas aerugionsa crește cu ușurință pe medii simple și este deci foarte ușor de izolat din produsele patologice. De obicei se izolează prin cultivare pe agar simplu sau agar îmbogațit cu 5% sânge de oaie sau de iepure, deși mediile îmbogațite cu sânge nu sunt esențiale pentru izolarea sa. Se mai pot utiliza medii precum McConkey, albastru de eozin-metilen sau agar- Leifson dezoxicolat.

Majoriatatea tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa pot fi identificate datorită pigmentației caracteristice, a mirosului de flori de salcâm și aspectului coloniilor pe mediul agar- sânge. Astfel, pot fi observate urmatoarele tipuri de colonii:

formă netedă ( smooth type ) ;

formă rugoasa ( rough type ) ;

formă intermediară ;

formă mucoidă ( mucoid type ) ;

formă gelatinoasă ( gelatinous type ) .

Coloniile cu formă neregulată, cu un diametru de 2-3 mm, cu sprafață netedă și mată reprezintă tipul neted; coloniile convexe, circulare, cu diametrul de 1-2 mm, suprafață netedă și strălucitoare și o consistență ușor vâscoasă, reprezintă tipul convex; coloniile cu formă neregulată, bombate, cu diametrul de 2-3 mm, cu o suprafață aspră sau rugoasă aparțin tipului rugos; coloniile convexe circulare care tind să concrească, cu diametrul de 1-3 mm, cu suprafață netedă și strălucitoare, cu consistență umedă sau vâscoasă aparțin tipului mucoid; coloniile circulare, bombate cu centrul înalt, cu diametrul de 2-3 mm, cu suprafață netedă si strălucitoare și cu consistență membranoasă sau gelatinoasă reprezintă tipul gelatinos.

Caractere biochimice și pigmentogeneza

Pseudomonas aeruginosa prezintă teste pozitive pentru producerea de indofenoloxidază și arginin- dihidrolază. Alte teste caracteristice sunt:

lichefierea gelatinei ;

eliberarea de coagulază, lecitinază, catalază și arginin- dihidrolază ;

folosirea citratului de sodiu ca unică sursă de carbon ;

descompunerea nitratului și a ureei ;

formarea de H2 S pe medii adecvate ;

producerea de pigment.

Chiar dacă Pseudomonas aeruginosa este un aerob strict, el crește în mediu anaerob care conține nitrați, cu producere de gaz, de azot. Creșterea la 42 grade Celsius este unul din caracterele cele mai constante ale acestui bacil. Produce enzime extracelulare: proteaza, lipaza, lecitinaza, esteraza, colagenaza și hemolizina.

Pigmenții elaborați de diversele tulpini de Pseudomonas aeruginosa sunt:

pigmenți albaștri: piocianina și proteina albastră ;

pigmenți galbeni: oxifenazina și fenazina -1- acid carbonic ;

pigmenți galben- verzui: pioverdina ( bacteriofluoresceina ) ;

pigmenți roșii: aeruginozina A și aeruginozina B ( piorubina ) .

Piocianina este un pigment de fenazină solubil în apă, albastru, nefluorescent. Abilitatea de a forma piocianină poate fi pierdută definitiv după repetate subculturi.

Pioverdina este un pigment solubil în apă, galben- verzui, fluorescent.

Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa pot sintetiza diferite combinații de piocianină, pioverdină, piorubină și piomelanină în funcție de mediile nutritive de de cultură.

Caractere antigenice

Pseudomonas aeruginosa posedă o varietate de antigene:

Antigenele „ O ” de natură lipopolizaharidică sunt localizate în peretele bacterian, sunt termostabile.

Antigenele „H ” sunt de natură proteică, termostabile ,izolate din flagel și fimbrii ;

Antigenele „R ” , slab imunogene și slab aglutinogene.

Acinetobacter

Acinetobacter este un gen de bacterii Gram negative, aparținând clasei mai largi de Gammaproteobacteria. Sunt organisme importante în sol, de exemplu, contribuie la mineralizarea compușilor aromatici. Speciile de Acinetobacter sunt o sursă importantă de infecție intraspitalicească la pacienții imunodeficienți, tarați, în special specia Acinetobacter baumannii.

Taxonomie

Acinetobacter este un cuvânt compus din limba greacă științifică [α + κίνητο + βακτηρ (ία)], ceea ce înseamnă "bacil nonmotil". Primul element acineto- apare ca o versiune oarecum barocă al ακίνητο- morfemă greacă, de obicei transliterat limba engleză ca akineto-, dar, de fapt, provine din cinetique francez și a fost adoptat în mod direct în limba engleză.

Genul Acinetobacter cuprinde 23 în mod valabil cu numele și 11 (genomice) specii anonime(66).

Habitat

Speciile de Acinetobacter sunt larg răspândite în natură, fiind frecvent întâlnite în sol și apă. Datorită capacității de a se dezvolta pe suprafețe umede și uscate, dar și celei de rezistență la unii dezinfectanți, unele tulpini de Acinetobacter pot supraviețui în mediul spitalicesc(67). În plus, Acinetobacter se poate dezvolta într-un interval larg de temperatură și poate supraviețui în diferite medii(67).

Caractere biochimice

Speciile din genul Acinetobacter sunt strict aerobe, nu fermentează glucoza, sunt oxidazo-negativ și nitrat negativ.

Caractere de cultură

Cele mai multe tulpini de Acinetobacter, cu excepția câtorva din tulpina A. lwoffii , cresc bine pe agar MacConkey (fără NaCl). Cu toate că sunt clasificate oficial ca lactozo-nefermentativi, acestea sunt de multe ori parțial lactozo-fermentativi pe agar MacConkey.

Bacteriile din genul Acinetobacter au proprietatea de a forma incluziuni intracelulare ale polihidroxialcanoaților în anumite condiții de mediu (de exemplu, lipsa unor elemente precum fosfor, azot sau oxigen combinat cu o alimentare excesivă a surselor de carbon).

Caractere morfologice

Sunt imobili, dispuși în diplo. Prezintă o morfologie preponderent coccobacillară pe agar neselectiv. în medii lichide, predomină formele bacilare în special în timpul creșterii timpurii.

Morfologia speciilor de Acinetobacter poate varia destul de mult în probele clinice umane și nu poate fi utilizată pentru a diferenția Acinetobacter din alte cauze frecvente de infecție.

Figura 3.3. Acinetobacter baumanni. Aspect la microscopul electronic

Caractere de patogenitate

Acinetobacter posedă numeroși factori de patogenitate, dintre care vom menționa pe cei mai importanți și specifici mai ales speciei A. baumanni.

Diagnostic de laborator

Identificarea speciilor de Acinetobacter este complicată de lipsa unor tehnici standard de identificare. Inițial, identificarea se realizează pe baza caracteristicilor fenotipice, cum ar fi temperatura de creștere, morfologia coloniei, mediu de creștere, folosirea surselor de carbon, hidroliza gelatinei, fermentarea glucozei. Astfel poate fi identificat complexul A. calcoaceticus-A. baumannii prin formarea de colonii netede rotunjite, mucoide, la 37 ° C. Însă fenotipic nu pot fi diferențiate specii strâns înrudite sau specii individuale din interiorul complexului, cum ar fi A. baumannii și Acinetobacter specia genomică 3.

Pentru că identificarea de rutină în laboratorul de microbiologie clinică nu este încă posibilă, izolatele de Acinetobacter sunt divizate și grupate în trei complexe principale:

Complexul Acinetobacter calcoaceticus-baumanii: glucoza-oxidant nonhemolytic, (A. baumannii pot fi identificate prin tipizarea OXA-51)

Acinetobacter lwoffii:-glucoză negativ nonhemolitic

Acinetobacter haemolyticus: hemolitic

Diferite specii de bacterii din acest gen pot fi identificate folosind două teste fiabile la nivel de gen.

Denitrificarea cu fluorescență a lactozei, pentru a găsi cantitatea de acid produsă prin metabolismul glucozei.

Testul de transformare a ADN-ului cromozomial. O mutantă natural auxotrofică triptofan competentă de Acinetobacter baylyi (BD4 trpE27) este transformată cu ADN-ul total al unui izolat presupus de Acinetobacter și amestecul de transformare este inoculat pe un mediu gelozat BHI (infuzie cord-creier). După incubare timp de 24 de ore la 30 ° C, tulpina se replică pe Acinetobacter minimal agar (AMA), și se incubează la 30 ° C timp de 108 ore. Creșterea pe AMA indică un test de transformare pozitivă și confirmă izolatul ca un membru al genului Acinetobacter. E. coli HB101 și MTCC1921T A. calcoaceticus pot fi utilizate ca martor negativ și respectiv pozitiv.

Unele dintre metodele moleculare utilizate în identificarea speciilor sunt: PCR repetitiv extragenic palindromic bazate pe secvențe, ribotipizarea, electroforeză în gel în câmp pulsatil(PFGE), ADN polimorfic amplificat aleator, polimorfismul lungimii fragmentelor amplificat (AFLP), restricția și analiză secvenței ARNt și 16S- 23S ARNr spacer gene și 16S amplificare prin analiza de restricție ADN ribozomal (ARDRA)(87). PFGE, AFLP și ARDRA sunt metode validate utilizate în prezent, datorită capacității lor de discriminative.

Cu toate acestea, metodele cele mai recente includ tiparea multilocus a secvenței și multilocus PCR și spectrometrie de masă cu ionizare electrospray, care se bazează pe amplificarea genelor "housekeeping" înalt conservate și pot fi folosite pentru a studia înrudirea genetică între diferitele izolate(88).

PARTEA SPECIALĂ

Premise și Obiective

PREMISE

Infecțiile sistemice ocupă un loc important în clinica medicală, prin gravitatea și prognosticul lor sever. Mortalitatea prin sepsis este de circa 80%. Succesul antibioterapiei la acești pacienți gravi depinde de informarea la zi a medicilor clinicieni, de asigurarea unui diagnostic etiologic corect și de realizarea antibiogramei în timp cât mai scurt.

Criteriile de care trebuie să se țină cont în alegerea unui anumit antibiotic pentru tratamentul unei infecții sunt menționate în ordinea importanței lor, având în vedere obiectivul urmărit – obținerea unei vindecări rapide. Schemele de utilizare a antibioticelor în terapia de primă intenție (tip de preparat, doza, calea de administrare, durata tratamentului), în funcție de tipul infecției și de specia bacteriană implicată, vor fi foarte utile medicilor clinicieni de diferite specialități. Prin cunoașterea și aplicarea în practică a noțiunilor din această lucrare se va putea spera la o îmbunătățire a schemelor terapeutice antibiotice utilizate la noi în țară și la reducerea posibilității bacteriilor de evoluție spre rezistență.

În prescrierea și aplicarea unui tratament cu chimioterapice antiinfecțioase este necesar ca medicul să se informeze asupra proprietăților agenților antimicrobieni, mecanismului de absorbție și eliminare, concentrației la care poate ajunge antibioticul în focarul de infecție și mai ales asupra spectrului antibioticului utilizat. Când nu poate beneficia de antibiogramă în tratarea unei infecții medicul trebuie să cunoască spectrul actual al antibioticului în unitatea în care lucrează și în zona geografică respectivă, spectru care se poate determina doar prin monitorizarea rezistenței la chimioterapice a tulpinilor izolate de-a lungul anilor în laboratorul din zona geografică respectivă.

Laboratorul de microbiologie are rol în elaborarea unei chimioterapii antiinfecțioase corecte, după rezultatul antibiogramei. El poate aprecia și evoluția în timp a sensibilității florei bacteriene cu scopul de a preveni transformarea tulpinilor rezistente în populații rezistente. Preocuparea pentru prevenirea apariției „supergermenilor de spital” este o muncă de echipă care presupune colaborarea strânsă între medicul clinician și medicul microbiolog. Rezultatele se obțin în timp și motivează pe deplin acest efort.

OBIECTIVE

Obiectivul prezentului studiu a fost stabilirea etiologiei infecțiilor sistemice prin studiul hemoculturilor primite și prelucrate în laboratorul de analize medicale al SCJU Craiova, precum și stabilirea rezistenței la antibiotice a tulpinilor izolate în vederea unui tratament corect și eficient, care să reducă substanțial mortalitatea prin sepsis în spital. Prin identificarea mecanismelor de rezistență pe baze fenotipice studiul încearcă să definească antibiotipurile circulante în spitalul nostru cu potențial invaziv sistemic ceea ce are impact asupra antibioterapiei preventive și curative la toate categoriile de pacienți cu infecții sistemice.

Material și metode

Studiul a fost efectuat pe 1880 pacienți (825 femei și 1055 bărbați) cu vârsta cuprinsă între 1 an și 92 ani spitalizați în secțiile SCJU Craiova, de la care au fost recoltate în total 3610 de probe pentru hemocultură. Studiu s-a desfășurat în perioada 1.09.2018-31.12.2019. Fiecare probă a fost recoltată într-un balon de hemoculturi pentru germeni aerobi și unul pentru germeni anaerobi. De la unii pacienți au fost recoltate multiple hemoculturi seriate la interval de 4-6 ore.

Diagnosticul bacteriologic s-a bazat pe incubatorul cu detecție automată a creșterii Bactalert 3D (Biomerieux, USA) și identificarea germenilor izolați, împreună cu testarea sensibilității la substanțe antimicrobiene s-a realizat cu ajutorul sistemului de identificare automatizată și antibiogramă Vitek 2 (Biomerieux, USA).

Recoltarea produselor biologice

Probele biologice au fost prelevate în condiții de asepsie, de către personal medical din secțiile respective în spital și de către personalul sanitar calificat în ambulator. Recoltarea produselor este o etapă a diagnosticului bacteriologic care reprezintă „punctul de întâlnire” dintre clinică și laborator. Nici o performanță tehnică a laboratorului nu poate să corecteze erorile datorate disfuncționalității acestui „punct de întâlnire”.

Hemocultura este un test calitativ pentru detectarea microorganismelor prezente in sânge. Sângele, prelevat în condiții de strictă asepsie, este însămânțat în flaconul de hemocultură a cărui compoziție favorizează dezvoltarea germenilor aerobi, anaerobi și microaerofili.

Mediul de îmbogățire

Principalii factori de îmbogățire încorporați în mediul care favorizează dezvoltarea germenilor sunt:

• asociere de peptone, cazeina si gelatina pentru aportul de aminoacizi;

• extract de levuri pentru aportul de vitamine;

• hemine si NAD care permit dezvoltarea Haemophilus si favorizează creșterea unor germeni pretențioși nutritiv cum sunt Actinobacillus spp, Cardiobacterium spp, Eikenella spp și alți anaerobi;

• vitamina B6, element indispensabil în dezvoltarea streptococului deficient întalnit în endocardite și a stafilococului;

• CO2 element important pentru creșterea germenilor din speciile: Neisseria, Brucella, Haemophilus, Streptococcus , Campylobacter.

Multiplicarea bacteriilor depinde însa și de o serie de factori independenți de condițiile de cultivare: densitatea germenilor în sânge, stadiul lor de multiplicare, prezența în sânge a unor substanțe inhibitorii.

Bacteriemiile si fungemiile adulților evolueaza în general cu un număr redus de microorganisme circulante (intre 1-30 UFC/mL sange). La nou-născut, sugar și copilul mic concentrația depăseste 100 UFC/mL. În general, între gravitatea infecției, prognostic și concentrația bacteriilor din sânge există o relație direct proporțională.

Bacteriile captate in flaconul de hemocultură pot fi:

• intacte, libere in plasma, în faza de multiplicare activă și vor continua să se dividă rapid în bulionul de hemocultură, sau în faza de repaus și vor începe să se multiplice la sfârșitul fazei de latență corespunzătoare adaptării la mediul nutritiv al flaconului;

• mai mult sau mai putin lezate sau mascate de acțiunea sistemului anticorp-complement, antibiotice, fagocitate de polimorfonucleare sau monocite și se vor dezvolta dupa autoliza leucocitelor dacă rămân viabile;

• bacterii în forme L (deficiente nutritional) a căror creștere necesită un mediu adaptat (hipertonic si bogat in factori de creștere).

Creșterea bacteriilor în hemocultură poate fi întarziată sau împiedicată dacă nu se utilizează un anticoagulant în mediul de cultură, deoarece microorganismele riscă să fie capturate în cheagul de fibrină. În același timp, unele anticoagulante pot fi toxice față de anumiți agenți patogeni la fel ca antibioticele prezente în sânge. Aceste obstacole pot fi înlaturate dacă se utilizează polyanetholsulfonat de sodiu (SPS), un anticoagulant netoxic care favorizeazaă proliferarea bacteriană prin neutralizarea activitații bactericide a serului uman și inhibarea acțiunii unor antibiotice (Streptomicina, Kanamicina, Gentamicina, Polymixina B). SPS-ul poate avea rol inhibitor asupra unor sușe de Peptostreptococcus, Neisseria, efect neutralizat de prezența gelatinei în mediul de cultura.

Sunt comercializate sisteme semiautomate sau automate computerizate pentru detecția rapidă a bacteriilor în hemoculturi.

Recomandări pentru determinare :

Se face la indicația medicului în anumite situații clinice cum sunt:

• toate cazurile cu febră de origine neprecizată, mai ales dacă se acompaniază de semne clinice evocatoare de infecție;

• sepsis, șoc septic;

• pacienți cu endocardită acuta;

• sindrom sugestiv pentru infecție sistemică cu germeni specifici (febra enterica, bruceloza, leptospiroza);

• infecții localizate severe (meningite, pneumonii, supurații intraabdominale).

Hemocultura este in plus motivată la:

• bolnavii imunodeprimați (cancer, toxicomani);

• pacientul care este supus unei agresiuni medicale (cateter, dializă sau intervenții chirurgicale) și prezintă o stare febrilă;

• în anumite situații particulare (femeie însărcinată, pacient cardiac, diabetic, cu insuficiență renală, insuficiență hepatică) sau când pacientul prezintă febră de origine neprecizată.

În afara datelor necesare identificării probei, cererea de analiza trebuie să cuprindă în mod expres urmatoarele informații:

-diagnosticul prezumtiv,

-zona prelevatului ,

-ora precisă a prelevării,

-dacă pacientul a fost sub cura antimicrobiană,

-examenul solicitat

Pregătirea pacientului

Prelevarea se efectuează înainte de tratamentul antimicrobian, conform evoluției predictive a curbei febrile sau în momentul în care bolnavul semnalează apariția frisonului. În cazul în care acest lucru nu este posibil, sângele va fi prelevat imediat înaintea administrării unei noi doze de antibiotic. Se indică prelevarea a trei probe intermitente în decurs de 24 de ore; în urgențe ritmul este la un interval de 30-60 de minute.

Specimen recoltat – sânge venos, de preferință à jeun (pe nemâncate), hiperlipemia putând împiedica evidențierea unei creșteri bacteriene în mediul lichid.

Zona de elecție pentru puncție este reprezentată de venele plicii cotului. Procedura de prelevare respectă normele de asepsie și antisepsie necesare pentru a evita contaminarea probei cu bacterii rezidente în flora tegumentară. După recoltarea sangelui, proba de 10 mL sânge, recoltată în seringă se introduce în recipientul cu mediul de cultura Signal prin înteparea capacului de cauciuc al acestuia în condiții de strictă asepsie. Flaconul se agită blând pentru omogenizarea acestuia în masa mediului. Pentru sistemul BACTALERT® recoltarea se face în recipientul de hemocultură pe principiul sistemelor închise cu vid.

Proba se etichetează și se transportă în cel mai scurt timp de la recoltare la laborator, la temperaturi cât mai apropiate de 37șC (cutie izotermă).

Tabelul 2.1. Volumul de sânge recoltat pentru hemocultură în funcție de vârsta pacientului

Cauze de respingere a probei:

• probe neetichetate;

• probe incorect recoltate (nu s-au respectat regulile de antisepsie);

• transport necorespunzător.

Prelucrare necesară după recoltare –Sistem BACTALERT: se scanează codul de bare de pe flacon la cititorul de cod de bare și se introduce flaconul în pozitia indicată. Odată ce ușa este închisă, procesul începe automat. Aparatul are o capacitate de 50 flacoane. El monitorizează permanent flacoanele de hemocultură incubate la 35șC. Flacoanele sunt agitate continuu pentru a favoriza creșterea bacteriană. Flacoanele pozitive sunt semnalizate sonor și vizual. Sistemul efectuează automat controlul de calitate la fiecare 10 minute. Softul integrat administrează datele despre probe.

Metoda de lucru

Prin activitatea metabolică microorganismele din flacon eliberează CO2, iar flacoanele continând un marker de activare care devine fluorescent în contactul cu CO2 detectează prezența acestuia. Fotodetectorul aparatului măsoara nivelul de fluorescență și trimite datele spre computer. Măsuratoarea este interpretată de sistem în funcție de parametrii de pozitivitate programați în prealabil. Computerul identifică flaconul pozitiv care este semnalat auditiv și vizual prin aprinderea unui beculeț. Pe ecranul de afișaj al aparatului apare poziția grafică a flaconului detectat pozitiv.

Fiind un sistem complet automat flacoanele sunt monitorizate la fiecare 10 minute ceea ce permite detectarea imediată a flacoanelor pozitive.

Protocolul de monitorizare este de 7 zile – dar dezvoltarea microorganismelor poate fi detectată dupa 8 ore.

Tabelul 2.2. Indicații de recoltare a hemoculturilor în funcție de etiologia suspectată

Factori ce pot influența rezultatul hemoculturii:

Metodologia folosită (manuală sau automatizată)

Volumul de sânge recoltat

Metodele de antisepsie

Identificarea probelor

Numărul de prelevări

Transportul probelor la laborator (cu refrigerare)

Transportul probelor la laborator s-a efectuat în cel mai scurt timp posibil de la recoltare.

Examenul direct macro și microscopic

Produsele recoltate au fost examinate macroscopic (pentru a observa unele modificări față de aspectul normal al produsului și pentru a ne informa asupra modului în care au fost prelevate probele) și microscopic folosind frotiurile colorate Gram, examinate ulterior la microscopul optic. Aceste examinări au avut ca scop restrângerea ariei de investigații și stabilirea modalităților ulterioare de diagnostic.

Izolarea germenilor

S-a efectuat pe medii lichide, solide, selective, neselective (bulion glucozat, geloză simplă, geloză tip Columbia, geloză-sânge de berbec 5 %, geloză chocolate, MacConkey, , Leifson, Istrate Meitert), care după însămânțare au fost incubate la 37 șC pentru 24 ore atât normal cât și în atmosferă de 5-10 % CO2[48].

Hemoculturile pozitive se prelucrează astfel:

Printr-un ac atașat flaconului se prelevează o cantitate de mediu din care se execută frotiuri și se însămânțează pe mediile de cultură.

Mediul prelevat se folosește pentru:

a) întindere de frotiuri pe lame de microscopie; acestea se examinează dupa colorare Gram. În raport cu rezultatul citirilor se fac repicări.

b) repicări pe medii solide și lichide în funcție de bacteria evidențiată microscopic: geloză-sânge/Columbia-sânge, agar-chocolat, Levine/MacConkey, Sabouraud cu Cloramfenicol, bulion thioglycolat cu resazurină.

c) plăcile se incubează, în funcție de bacteria evidențiată microscopic, la o temperatură de 35șC-37șC în condiții de aerobioză, în atmosferă cu 5-7% CO2 sau în anaerobioză (GasPack +amestec reducător) pentru 48-72 de ore apoi se examinează coloniile izolate.
d) teste necesare pentru identificare: ID catalază, trusa de identificare stafilococ, trusa de identificare streptococ, discuri de Optochin, factori X, V si XV, medii politrope pentru enterobacterii, reactia oxidazei, teste API ( API 20E , API 20NE, API NH, etc) teste pentru identificarea levurilor. Identificarea se poate face si automat pe sistemul Vitek2 Compact.

e) testarea sensibilității la antibiotice sau antifungice prin metoda difuzimetrică sau automată pe analizorul de bacteriologie VITEK 2 COMPACT (Biomerieux, SUA).

Identificarea

Identificarea germenilor s-a făcut pe baza caracterelor culturale, morfologice, biochimice și a unor teste de patogenitate.

Caractere de cultură

Tulpinile de Escherichia coli cresc pe medii obișnuite, lichide și solide la 37oC și pH = 6,7 în aerobioză. Creșterea în mediul lichid bulion glucozat se observă prin tulburarea uniformă a mediului, cu depozit slab și inel aderent de pereții tubului. Pe mediul gelozat dă colonii mari, rotunde, opace, bombate, lucioase (forma S). Pe mediile selective cu lactoză produc fermentarea acesteia cu virarea culorii indicatorului în galben. Pe mediul Levine (cu eozină și albastru de metilen), apar colonii închise la culoare, cu luciu metalic.

Caractere metabolice

Sunt germeni aerobi, facultativ anaerobi. Fermentează cu gaz glucoza, lactoza și zaharoza; produc constant indol și variabil lizin-decarboxilază; reacția la roșu metil este pozitivă; nu produc H2S; nu produc urează; nu produce fenil-alanin dezaminază; nu folosesc citratul ca sursă de carbon (Simmons negativ).

Uzual, se folosesc sisteme multitest (ex. mediile politrope):

TSI (Three Sugar Iron) care testează fermentarea glucozei, a lactozei și zaharozei.

MIU (Mobilitate, Indol, Urează)

MILF (Mobilitate, Indol, Lizină, Fenilalanină)

Creat în 1970, sistemul de identificare a reprezentat o adevărată revoluție în domeniul bacteriologiei, miniaturizând și standardizând tehnicile convenționale, complicat de realizat și interpretare. Identificarea se face pe baza caracterelor metabolice bacteriene.

Galeriile sunt recunoscute internațional ca un standard de referință în identificarea bacteriană. Galeriile 20 E cuprind 20 de microtuburi care conțin medii și/ sau substraturi sub formă deshidratată. În acestea sunt inoculate suspensii microbiene și după incubare la 37șC timp de 24 ore se citesc reacțiile biochimice care diferențiază speciile bacteriene: reducerea nitraților în nitriți, producerea de indol, enzime de ex. ureaza, beta-glucozidaze, beta-galactozidaze, proteaze, fermentarea glucozei, utilizarea unor substraturi (arabinoză, manoză, manitol, maltoză, gluconat, malat, citrat, fenil-acetat). În cazul unei reacții pozitive se produce o modificare de culoare specifică indicatorului utilizat.

Datele obținute din identificarea biochimică au fost introduse pe calculator pentru identificarea microorganismului, pe baza unui program pus la dispoziție de firma BioMerieux. Identificarea se face ținând cont de ultimele criterii în vigoare, recomandate pentru stabilirea încadrării taxonomice.

Caractere antigenice (serotiparea)

S-a realizat utilizând seruri imune standard polivalente și monovalente, specifice, prin reacția de aglutinare pe lamă.

Lizotiparea

Se bazează pe relația bacteriofag-bacterie de tip litic, folosind bacteriofagi standard anti-E. coli. Are importanță epidemiologică, pentru precizarea surselor de infecție.

Figura 2.1. Diagnosticul de laborator în infecțiile cu Escherichia coli

Antibiograma – determinarea sensibilității germenilor izolați la chimioterapice antiinfecțioase

S-a realizat antibiograma difuzimetrică pe subcultură standardizată prin metoda Kirby-Bauer (6, 39), având în vedere: compoziția mediului de cultură, pH-ul acestuia, densitatea inoculului, stabilitatea și difuziunea antibioticelor, durata și temperatura de incubare.

1) Principiu

O cantitate de substanță antibacteriană este depusă pe suprafața mediului de cultură solid, care a fost însămânțat în prealabil cu bacteria testată. Se produc concomitent două fenomene: difuzarea antibioticului în mediu și multiplicarea bacteriei. În zonele în care chimioterapicul antimicrobian realizează concentrații mai mari decât concentrația minimă inhibitorie (), creșterea bacteriei se va opri. Odată cu intrarea culturii în faza exponențială, bacteria se divide mai repede decât difuzează chimioterapicul și se acumulează o pânză vizibilă de cultură, care nu mai este influențată de modificări ulterioare ale concentrației de antibiotic. Circumferința zonei de inhibiție se stabilește încă de la primele ore de incubație ca loc geometric al punctelor în care antibioticul a atins în momentul critic al culturii. Astfel diametrul zonei de inhibiție variază invers proporțional cu .

Bacteria a fost încadrată în diversele categorii de sensibilitate: sensibilă, intermediar sensibilă și rezistentă prin raportarea diametrelor zonelor de inhibiție obținute la tabele interpretative. Aceste tabele sunt alcătuite pornind de la graficul punctelor de împrăștiere ale față de diametrul zonelor de inhibiție a 100-150 de tulpini selectate pentru a cuprinde gama de clinic semnificative. Pentru fiecare antibiotic este trasată dreapta de regresie și sunt proiectate punctele de ruptură ale pe diametrul zonelor de inhibiție. Astfel se procedează în tehnica descrisă de Kirby și Bauer, adoptată de National Committee for Clinical Laboratory Standards din SUA.

2) Materiale utilizate pentru efectuarea antibiogramelor

a) Cultură pură din tulpina de cercetat (inoculul), alcătuită dintr-un anumit număr de bacterii, densitatea fiind de 108 unități formatoare de colonii/ ml (UFC/ ml), a fost termostată la 37 șC, până la turbiditatea corespunzătoare etalonului 0,5 Mc Farland.

S-a folosit o tulpină de referință pentru controlul de calitate al testelor de sensibilitate la antibiotice reprezentată de Escherichia coli 25922,

b) Mediul de cultură turnat în plăci Petri, trebuie să asigure condiții nutritive necesare multiplicării bacteriilor, fără să interfere cu activitatea antimicrobiană a substanțelor testate.

Mediul pentru efectuarea antibiogramei recomandat de National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) este mediul Mueller-Hinton.

c) Trusă cu discuri de antibiotice ale firmei BioRad

Discurile de antibiotice au pe ambele fețe simbolul antibioticului, concentrația antibioticului fiind fixată în mod precis după examinarea curbelor de concordanță.

Pentru Escherichia coli s-au utilizat următoarele comprimate cu antibiotice: Amoxicilină (AMX), Amoxicilină+Acid clavulanic (), Ticarcilină (TIC), Ticarcilină+Acid clavulanic (), Piperacilină (PIP), Piperacilină+Tazobactam (TZP), Imipenem (IPM), Meropenem (MEM), Aztreonam (ATM), Cefalotin (CF), Cefazolin (CZ), Cefoxitin (), Cefuroxim (CXM), Cefamandol (MA), Cefotaxim (), Ceftazim (CAZ), Ceftriaxon (), Cefoperazonă (CFP), Cefepim (), Gentamicină (GM), Tobramicină (TM), Netilmicină (), Amikacină (AN), Ciprofloxacin (CIP), Norfloxacin (), Colistin (CS), Trimetoprim+Sulfametoxazol (SXT).

d) Tehnica de lucru

Inoculul s-a obținut din 4-5 colonii bine individualizate din cultura pură a tulpinii de cercetat, prelevate cu ansa bacteriologică și suspensionate în medii lichide cu bulion repartizat în tuburi. Acestea au fost etalonate din punct de vedere al turbidității corespunzător etalonului Mc Farland. Depunerea inoculului pe mediul de cultură solid din placa Petri s-a realizat cu ajutorul unui tampon de vată steril îmbibat în suspensia microbiană, descărcat în striuri paralele pe întreaga suprafață a plăcii. Plăcile însămânțate au fost lăsate timp de câteva minute pe masa de lucru (10-15 minute) la temperatura camerei, apoi s-au depus microcomprimatele la o distanță de 15 mm de marginea plăcii și 25 mm între ele, și s-au incubat la 37 °C timp de 24 ore.

Figura 2.2. Antibiograma prin metoda difuzimetrică. Etapele de lucru : 1- Recoltarea coloniilor ; 2- Obținerea inoculului ; 3 – Însămânțarea inoculului ; 4,5 – Aplicarea discurilor cu antibiotice ; 6,7 – Citirea rezultatelor.

e) Interpretarea

După incubare s-au măsurat diametrele zonelor de inhibiție a creșterii culturii microbiene cu ajutorul unei rigle, care au fost interpretate după tabelul de referință al firmei Sanofi. Pe baza relației stabilite între diametrul zonei de inhibiție și a fost posibilă încadrarea tulpinii cercetate în una din cele trei categorii: sensibilă, intermediar sensibilă, rezistentă.

S-au considerat a fi:

Sensibile tulpinile pentru care este inferioară concentrațiilor terapeutice. O asemenea tulpină nu pune, în general, probleme terapeutice.

Tulpinile intermediar sensibile au un apropiat de concentrația care se poate obține în sânge sau țesuturi. Aceste antibiotice se administrează în doze maxime netoxice sau în doze normale dacă are loc o concentrare fiziologică particulară a antibioticului în umori (exemplu: urină).

Tulpinile rezistente pentru care CMI este superioară concentrațiilor terapeutice – aceste antibiotice nu se vor administra bolnavului.

Metoda difuzimetrică a antibiogramei a furnizat date suplimentare privitoare la fenotipurile de rezistență pentru tulpinile de E. coli izolate.

Determinarea fenotipurilor de rezistență

Stabilirea fenotipurilor de rezistență dintr-o unitate medicală este absolut necesară pentru a lua o hotărâre corectă în alegerea chimioterapiei antiinfecțioase care să fie în folosul pacientului și să prevină dezastrul selectării de tulpini bacteriene cu multirezistență. Determinarea fenotipurilor s-a realizat prin analiza profilului de rezistență la antibiotice/chimioterapice pentru fiecare tulpină izolată și identificată, cu ajutorul unor tabele special concepute (39).

Tabelul 2.3. Detectarea fenotipurilor de rezistență la beta-lactamine pe baza antibiogramei tulpinilor de Escherichia coli

Metode de detecție a mecanismelor de rezistență

Metode de evidențiere a BLSE

Testele fenotipice sunt cele mai utilizate si constau în testarea sensibilității la antibiotice prin metoda Kirby Bauer, utilizând breakpointurile clinice și valorile cut-off, recomandate de standardul EUCAST si CLSI, dar metodele genotipice, respectiv evidențierea genelor care induc secreția acestor enzime prin PCR, reprezintă standardul de aur.11,23,24

teste de screening – testarea rezistenței cu discurile de cefalosporine (ceftriaxon≤25mm, cefotaxim≤27mm, ceftazidim≤22mm, cefpodoxim≤17mm, aztreonam≤27mm).

teste de confirmare – se bazează pe sinergia dintre cefalosporine și acidul clavulanic

Metoda dublului disc(testul de sinergie): pe geloză Muller-Hinton se plasează în centru un disc ce conține Amoxicilină-Clavulanat (20μg+10μg) și la o distanță de 20-35mm de centru, discuri cu ceftazidime, ceftriaxone, cefotaxim 30μg (metoda dopului de șampanie).

Metoda discului combinat: constă în compararea diametrului zonelor de inhibiție a unui disc cu cefalosporină cu și fără acid clavulanic (cefotaxim 30μg sau ceftazidim 30μg+10μg clavulanat). Dacă tulpina produce ESBL zona de inhibiție a discului cu acid clavulanic este cu cel puțin 5mm mai mare decât a discului fără inhibitor.

E-test: utilizează două stripuri de plastic care au ceftazidim/cefotaxim pe jumătate și ceftazidim/cefotaxim+acid clavulanic pe cealaltă jumătate sau ceftotaxim+acid clavulanic.

Mediul BLSE-AGAR: plăcile conțin în jumătatea stângă mediul selectiv MacConkey, suplimentat cu ceftazidim 2mg (culoare roșie necolonizat), iar în jumătatea dreaptă mediul Drigalski, suplimentat cu cefotaxime 1,5mg (culoare verde necolonizat). Astfel se poate detecta simultan rezistența la cefotaxime și ceftazidim. Dubla detecție crește sensibilitatea testului.25,26,30

Metode de evidentiere a Amp.C

Metoda fenotipică de screening nestandardizată este reprezentată de reducerea sensibilității la cefoxitin. O altă metodă este cea care folosește enzime care inhibă AmpC, precum Cloxacilina sau Acid boronic. Acești inhibitori sunt încorporați în discurile de cefoxitine 30 micrograme sau cefpodoxime 10 micrograme, și impregnați cu 20 microlitri din solutia de cloxacilin 200 micrograme sau acid phenylboronic 400micrograme. Creșterea zonei de inhibiție in jurul discului ce conține inhibitor față de discul de cefozitin/cefpodoxime,fară inhibitor este considerat pozitiv, tulpina fiind producătoare de AmpC(12,18,26,30,31).

c. Metode de evidențiere a carbapenemazelor

Metode screening: 1. în conformitate cu CLSI, o tulpină producătoare de Carbapenemaze prezintă: diametrul mai mic sau egal cu 21 mm la meropenem, imipenem, ertapenem.

Metode de confirmare:

1. -Crom ID CARBA este un mediu Bio Merrieux, pe care cresc doar tulpinile bacteriene producătoare de carbapenemaze.

2. -E-test- se utilizează pentru determinarea tulpinilor producătoare de carbapenemaze, dar interpretarea poate fi complicată pentru că pot apărea colonii mutante în zona de inhibiție MIC crescută (18,29,30,31).

3. – Hodge modificat recomandat de CLSI. Pe o placă Muller Hinton, inoculată cu o tulpină de referintă E.coliATCC25922, o tulpină producătoare de carbapenemază si una neproducătoare, respectiv K.pneumoniae ATCC BAA1705, și K.pneumonie ATCC1706, alături de tulpina izolată de la pacient, însămânțate liniar având discul de ertapenem plasat in centrul plăcii(33).

4. -CARBA NP-test. Are ca principiu o reacție colorimetrică dată de acidifierea mediului ca urmare a degradării imipenemului și virarea culorii indicatorului roșu fenol în galben. Este sensibilă 100% comparativ cu tehnicile moleculare ,este rapidă , în 2 ore se poate obține rezultatul și se poate adapta la orice laborator(22,32,34).

Toate aceste teste de confirmare, determină producerea de carbapenemaze fară o separare a lor pe clase. Astfel că metodele de mai jos permit decelarea producerii de carbapenemaze separat pe clase.

Metode de confirmare pentru clasa A

Metoda cu discul de meropenem de 10 μg și discul de meropenem 10 μg + acid boronic 600 μg. Un diametru mai mare sau egal de 5 mm între discul cu meropenem și discul de meropenem+acid boronic, înseamnă producerea în exces a carbapenemazelor cromozomiale sau plasmidice .23,32,34.

Metode de confirmare pentru clasa B

Evidențierea metalobetalactamazelor se bazează pe sinergia dintre inhibitorii de metalobetalactamaze ca EDTA sau acid dipicolinic și un carbapenem (imipenem sau meropenem). Detecția de MBL se bazează pe creșterea diametrului peste sau egal 5mm între discul de meropenem și meropenem+EDTA.

Metode de confirmare pentru clasa D

ChromID OXA-48 pe mediul cromogen produs de firma Bio Merieux, pe care cresc doar tulpinile secretante de carbapenemaze tip C –vezi bio merieux. Prima evaluare a mediilor cromogene CROM ID OXA, s-a efectuat in cadrul Congresului Societătii de Microbiologie Clinică și Boli Infectioase(ESCMID)- Berlin 27-30 aprilie 2013, comparându-se determinarea carbapenemazelor pe medii cromogene, cu metoda moleculară PCR, corespondența fiind de 98%.

Teste de confirmare: Testul PCR, standardul de aur pentru evidențierea genei ce codifică oxacilinaza.

Figura 2.3. Evidențierea carbapenemazelor clasele A și B (d.tulpină de Pseudomonas nesecretantă de carbapenemaze; c.tulpină de Pseudomonas secretantă de carbapenemază tip B; b. tulpină de Pseudomonas secretantă de carbapenemază tip A; a. tulpină de Pseudomonas secretantă de carbapenemază tip mixt A+B).

Figura 2.4. Metoda E-test

Figura 2.5. Metoda discului combinat(23,24)

Figura 2.6. Testul de sinergie ( Metoda „dopului de șampanie”)

Figura 2.7. Mediul ChromID OXA-48

Diagnosticul microbiologic automatizat

Incubatorul pentru hemoculturi Bactalert 3D cu detecția automatizată a pozitivării hemoculturilor

Pentru diagnosticul de laborator al hemoculturilor s-a folosit incubatorul automatizat Bactalert 3D, sistem special dedicat acestui tip de investigație.

BacT/ALERT 3D este un instrument automat de detecție microbiană, capabil să incubeze, să agite și să monitorizeze continuu (pe bază de reflectometri) aerob și anaerob prelevate de la pacienți suspectați de bacteriemie/fungemie/tuberculoză .

Principiul de detectie : Tehnologia colorimetrica, neinvazivă, timp de detecție mai rapid, detectia unei game mai largi de organisme, monitorizare continuă a aplicației. Flacoanele conțin un senzor LES (senzor emulsie lichidă), ce detectează producerea de CO2, senzor unic, patentat. Flacoanele sunt agitate continuu, facilitând creșterea bacteriană, în același timp fiind sub control și temperatura de incubare. Microorganismele care cresc în flacon produc CO2 și alți produși metabolici care reacționează cu senzorul; senzorul iși schimbă culoarea de la albastru/verde la galben strălucitor.

Figura 2.8. Sistem automatizat de incubare a hemoculturilor și detecție a pozitivării probelor Bactalert 3D

Se poate conecta la un sistem de realizare statistică și LIS

Instrumentul prezintă:

– un modul de incubare ce poate prelucra pană la 60 prelevate,

– tastatură, monitor, mouse, cititor extern coduri de bare, unitate back-up date.

-posibilitatea realizării automate a controlului de calitate al celulelor în care sunt introduse flacoanele (nefiind necesară intervenția operatorului),

– intervalul optim de funcționare al instrumentului este situat între +5o și 45oC,

– flacoanele introduse în instrument sunt recunoscute de acesta cu ajutorul unui cititor de cod de bare (codul se află pe partea laterală a flaconului).

Flacoanele și instrumentul sunt produse în conformitate cu standardele internaționale de calitate în vigoare ( ISO 9001, FDA și Quality System Regulations).

Pe același instrument se pot introduce pe lângă prelevate obținute pentru izolarea bacteriilor aerobe, anaerobe, fungi, fungi filamentosi și prelevate în care exista posibilitatea existenței speciilor de Mycobacterium (din sânge și lichide de puncție considerate in mod normal sterile).

Permite introducerea întarziată a flacoanelor în aparat – fals negativi

Prezentare flacoane:

– plastic incasabil, 70 grame, prezinta cod de bare datasabil, dublu

Dimensiuni:

Inaltime : 60,9 cm

Latime: 58,8 cm

Adancime: 49,7 cm

Greutate: 37 kg fara flacoane

Tabelul 2.4. Flacoanele de hemocultură utilizate împreună cu sistemul Bactalert 3D

Figura 2.9. Flacoanele de hemocultură utilizate împreună cu sistemul Bactalert 3D

Figura 2.10. Flacoanele de hemocultură utilizate împreună cu sistemul Bactalert 3D

Analizorul automat de microbiologie VITEK 2 COMPACT pentru identificare bacterii, antibiogramă prin CMI (concentrație minimă inhibitorie)

Specificații tehnice:

Sistem automat cu performanță ridicată, care identifică și testează sensibilitatea la antibiotice a bacteriilor izolate din prelevate: clinice, din industrie, mediu.

Capacitate: 30 teste

Testările se efectuează cu ajutorul cardurilor disponibile sistemului automat și anume:

identificare bacterii și fungi,

testarea sensibilității bacteriilor implicate semnificativ în domeniul clinic.

Soft-ul denumit Advanced Expert System (AES) este integrat în sistem . Acest soft validează rezultatele identificării și testării la antibiotice a bacteriilor comparativ cu baza de date extinsă a sistemului expert avansat (AES).

Prin alarmă sonoră și vizuală permite utilizatorului să cunoască pattern-ii neobișnuiți de rezistență ai speciilor bacteriene supuse testărilor (ex.: culturi bacteriene amestecate, rezistență nouă). Raportează mecanismele de rezistență specifice ale tulpinilor bacteriene supuse testărilor (ex.: P – lactamaze cu spectru extins, producătoare de penicilinaze).

Sistemul include: stația de lucru, un computer , un monitor și un printer.

Soft-ul este furnizat odată cu instrumentul de identificare și antibiograma și include programe de analiză și date de management pentru raportări de laborator/pacienți.

Interfața bidirecțională a computer-ului transferă rezultatele automat utilizatorilor sistemului de informații din laborator (LIS). Computer-ul, de asemenea poate furniza rapoarte legate de pacienții introduși în baza de date.

Sistemul de control al calității este disponibil pentru validarea kit-urilor utilizate la acest tip de sistem.

Descriere carduri de identificare

Carduri test de plastic ce conțin 64 microcelule. Fiecare microcelulă conține un substrat biochimic specific deshidratat. Cardul este unic identificat cu ajutorul unui cod de bare preaplicat.

Informațiile din codul de bare preaplicat includ tipul de card, numărul lotului, data expirării cardului și numărul unic de identificare al cardului. Lista speciilor microbiene identificate. Compoziția testului pe fiecare card.

Tabele de performanță ale testului.

Tabelul 2.5. Carduri de identificare folosite

Timpul mediu de obținere a rezultatelor – 6 până la 8 ore ( 80% din organismele obișnuite în 6 ore sau 95% din organismele obișnuite în 8 ore).

Inoculare card test:

Umplerea cardurilor cu suspensia bacteriană se realizează în incinta sistemului, automat cu ajutorul camerei de umplere prin vacuum din interiorul sistemului.

Principiu:

Dublă acțiune: aspirare prin vacuum a cardului și revenirea progresivă a cardului la presiunea atmosferică.

Timp de distribuție: 70 secunde pe 10 – carduri / caseta Incubarea cârdurilor : în incinta sistemului

Verificarea codurilor de bare ale cârdurilor

integrate în sistem (cititor/incubator)

scanarea internă a codului de bare a cardului, citirea automată a codului de bare a cardului și verificarea dublă a poziției cardului față de lista de lucru electronică Virtual Maintain Cassette

Sigilare carduri

integrate în sistem

tăierea și sigilarea automată a tubului de transfer în incinta sistemului

Incubator

integrat în sistem

după sigilare, cardurile sunt încărcate automat în caruselul de incubare

citirea cardului se realizează automat

Temperatura de incubare

35,5oC + 1oC

Capacitate

60 (număr maxim de carduri incubate simultan)

Poziția cardului

stabilită automat și inserată de instrument

Dispunerea cardului la sfârșitul analizei

ejectarea automată a cardurilor folosite în container

mutarea manuală, zilnică a materialului folosit în container ce conține produse cu risc ridicat de contaminare

Metoda de citire

turbidimetrică pentru testarea sensibilității la antibiotice a bacteriilor

colorimetrică pentru identificare specii bacteriene

Număr citiri

turbidimetrică: 48 puncte de citire (3 x 16) /citire automată/celulă

colorimetrie: 48 puncte de citire (3×16)/ citire automată /celulă

Pentru testarea sensibilității la antibotice a bacteriilor:

lungime de undă: 660nm

măsurare precizie: 2% 7 8

nivel de detecție bacteriană 5,10 – 5,10 UFC/ml (0,2 mcFarland până la 2 McFarland)

Pentru identificare specii bacteriene:

lungime de undă: 430 nm

lungime de undă: 568 nm pentru 4 teste Gram pozitivi

măsurare precizie: +/- 0,5%

valabilitatea capului de citire….> 80.000 carduri

mod de citire: automat

Specificație tehnică pentru cârdurile de ientificare si antibiograma

Descriere :

Cardurile pentru sistemul automatizat de identificare și antibiogramă trebuie sa permită realizarea testelor : de identificare a agenților patogeni bacterieni și de testare a sensibilității la antibiotice a acestora cu determinarea concentrației minime inhibitorii (CMI).

Configurție carduri:

CARDURI DE IDENTIFICARE:

Peste 150 specii baciligram negativi

Peste 120 specii coci gram poitivi

Peste 50 specii Fungi

Peste 25 specii de Neisseria și Haemophilus

Peste 40 specii bacili gram pozitivi

Peste 60 specii bacterii anaerobe + Corynebacterium

CARDURI DE ANTIBIOGRAMĂ CMI:

Pentru Bacili gram negativ

Pentru Coci gram pozitivi

Pentru pneumococ

Mod de prezentare : sub formă de carduri

Caracteristici fizice:

carduri cu 64 celule cu substrat biochimic pentru identificare

carduri cu 64 celule cu diferite diluții de antibiotice pentru testarea sensibilității bacteriilor la acestea și obținerea unei valori CMI

cititor de coduri de bare pentru identificare carduri, dată de expirare și de identificare număr unic de card, număr lot

furnizarea rezultatelor antibiogramei ca: sensibil, intermediar sau rezistent;

furnizarea valorilor CMI pentru antibioticele analizate;

Sa existe program de analiză si interpretare a rezultatelor antibiogramei și depistarea a mecansimelor de rezistență cu studiu de fenotip

Analiza, validarea, interpretarea și furnizarea rezultatelor identificărilor și antibiogramelor să fie

Inocularea automată a cardurilor de identificare și antibiogramă în incinta sistemului (pentru asigurarea trasabilități);

Sigilarea automată a cardurilor după inocularea în incinta sistemului (pentru asigurarea trasabilității)

Incubarea automată a cardurilor în incinta sistemului pentru asigurarea trasabilității;

Identificarea automată a codului de identificare a trusei în incinta sistemului pentru asigurarea trasabilității;

Citirea turbidimetrică în 48 puncte de citire (3 x 16) /citire automată/celulă la

660nm

Citire colorimetrică în 48 puncte de citire (3 x 16) /citire automată/celulă la 430nm

Citire automată a probelor minim o dată la fiecare 15 minute pe fiecare probă;

Valabilitatea capului de citire: > 80.000 carduri

Cardurile nu necesită reactivi adiționali în timpul lucrului;

Posibilitatea furnizării de rezultate începând de la 4-6 ore (80% din organismele obișnuite în 6 ore );

Furnizarea rezultatelor prin intermediul unui ecran;

Furnizarea rezultatelor prin intermediul unei imprimante;

Program de control al calității ;

Posibilitatea stocării rezultatelor în unitatea cantrală și asigurarea unui back-up al fiecărei zile de lucru .

Figura 2.11. Sistemul automat de identificare și antibiogramă VITEK 2 compact

Figura 2.12. Card de identificare pentru bacilili Gram negativ folosit de către sistemul Vitek 2 Compact

Figura 2.13. Card de antibiogramă pentru bacilili Gram negativ folosit de către sistemul Vitek 2 Compact

Figura 2.14. Buletin analiză identificării biochimice cu analizorul VITEK2 Compact a unei tulpini de Escherichia coli

Figura 2.15. Buletin antibiogramă pe analizorul VITEK2 Compact a unei tulpini de Escherichia coli BLSE +

Figura 2.16. Identificarea fenotipurilor de rezistență de către sistemul expert asociat analizorului VITEK 2 Compact

Rezultate

Astfel, dintre cele 3610 de seturi de hemoculturi recoltate, 767 (21,25%) au fost pozitive, izolându-se 790 tulpini bacteriene (Figura 3.1). Majoritatea infecțiilor sistemice au fost monomicrobiene (1196 probe), la unii pacienți izolându-se în hemoculturi seriate două specii bacteriene (396 probe) sau chiar 3 specii (45 probe).

Figura 3.1. Incidența infecțiilor sistemice în SCJU Craiova

Analizând incidența infecțiilor sistemice în funcție de secția de proveniență (Tabelul 3.1) se poate constatata că prevalența cea mai mare a fost în secția de Neurologie (32,00%), Urologie (26,19%%), urmată de ATI (27,07%),Nefrologie (26,00%), Chirurgie generală (25,49%). Cea mai scăzută incidență s-a înregistrat în secția de Chirurgie infantilă (8,33%) și Diabet și Boli de nutriție (15,22%) și Ginecologie (17,89%%), fapt explicabil prin prelevarea hemoculturilor pentru confirmarea unor suspiciuni clinice de endocardită și avort septic.

Tabelul 3.1.Incidența infecțiilor sistemice în funcție de secție

Etiologia bacteriană a infecțiilor invazive (Figura 3.2) a fost dominată de cocii gram pozitivi, stafilococi aurei (18,37%) și alte specii de stafilococi coagulazo-negativi (42,30%), aceștia din urmă fiind de cele mai multe ori contaminanți datorită recoltării incorecte, enterococi (6,73%). Klebsiella a fost izolată într-un procent de 8,02%, Escherichia coli (8,15%), Acinetobacter 5,17% și bacilii Gram negativ nefermentativi 2,85%, cunoscându-se faptul că bacilii Gram negativi sunt rar implicați în infecțiile invazive.

Figura 3.2. Etiologia bacteriană a infecțiilor sistemice în anii 2017-2019

Rezistența la antibiotice a Staphylococcus aureus

În ceea ce provește rezistența la antibiotice a Staphylococcus aureus, se poate observa din Figura 3.3 că aceștia au avut o rezistență crescută la Penicilină (97.67%) și Oxacilină (71.07%), în general la beta-lactamine datorită proporției crescute de stafilococ aureu meticilino-rezistent (MRSA), Rifampicină (56.43%), Eritromicină (80.85%) și Claritromicină (69.11%). Rezistențe scăzute s-au înregistrat la Linezolid (2.67%) și Vancomicină (0%), antibiotice care merg bine pe stafilococi.

Figura 3.3. Rezistența la antibiotice a Staphylococccus aureus

Rezistența la antibiotice a enterococilor

În ceea ce provește rezistența la antibiotice a Enterococcus spp., se poate observa din Figura 3.3 că aceștia au avut o rezistență crescută la Penicilină (91,68%), Eritromicină (100%) și Claritromicină (100%). Rezistențe înalte s-au constatat de asemenea la chinolone: Ciprofloxacin (68,63%), Levofloxacin (82,35%), Moxifloxacin (68,75%), Norfloxacin (97,67%) și Ofloxacin (100%). Rezistențe scăzute s-au înregistrat la Linezolid (11,76%) și Teicoplanină (38,09%) (10,69%). O mențiune specială o merită rezistența de 21,60%, care constiyuie o populație specială de enterococi multirezistenți denumiți enterococi vancomicino-rezistenți (VRE). Aceștia sunt germeni de spital în general, infecția cu VRE având un prognostic grav.

Figura 3.3. Rezistența la antibiotice a Enterococcus spp.

Rezistența la antibiotice a Enterobacteriaceelor

Rezistența la beta-lactamine a Enterobacteriaceelor

Figura 3.4. Rezistența Enterobacteriaceelor la peniciline

În ceea ce privește rezistența la cefalosporine a tulpinilor izolate, se remarcă din Figura 3.4 că a existat o discrepanță evidentă între rezistența crescută la cefalosporinele de generația 1 (53,84% rezistență la Cefazolin) și 2 (79,17% rezistență la Cefuroxim) și cea la cefalosporinele din generațiile 3 (40,1% la Ceftazidim, 50,00% la Cefotaxim, 42,40% la Ceftriaxon) și 4 (34,43% la Cefepim), explicată prin producerea de beta-lactamaze care hidrolizează preferențial cefalosporinele din generațiile 1 și 2.

Figura 3.5. Rezistența Enterobacteriaceelor la cefalosporine de generația 1, 2, 3 și 4

Analizând rezistența la carbapeneme a tulpinilor de Enterobacteriaceae la carbapeneme s-a constatat (Figura 3.5) că rezistența cea mai crescută s-a înregistrat la Imipenem (29,35%), urmat de Ertapenem (25,00%) și Imipenem (24,81%).

Figura 3.6. Rezistența Enterobacteriaceelor la carbapeneme

Monobactamii reprezentați de aztreonam au fost rezistenți în procent de 36,54% (Figura 3.6). De remarcat că deși Aztreonamul nu este disponibil ca antibiotic în România, el a fost testat în cadrul testului de ESBL tip „ghost-zone”.

Figura 3.7. Rezistența Enterobacteriaceelor la monobactami

Rezistența tulpinilor de Enterobacteriaceae izolate la aminoglicozide (Figura 3.7) a fost relativ scăzută, înregistrându-se o rezistență de 25,00% la Amikacină, 25,92% la Gentamicină și 38,46% la Tobramicină. De remarcat că tulpinile de Enterobacteriaceae rezistente la Amikacină sunt de interes epidemiologic pentru controlul infecțiilor asociate îngrijirilor medicale, rezistența enterobacteriilor la amikacină fiind rară.

Figura 3.8. Rezistența Enterobacteriaceelor la aminoglicozide

Un procent de 17,80% dintre tulpinile de Enterobacteriaceae au fost rezistente la Tigeciclină (Figura 3.8).

Figura 3.9. Rezistența Enterobacteriaceelor la tigeciclină

Examinând rezistența tulpinilor de Enterobacteriaceae la chinolone, se poate constata din Figura 3.9 că aceasta a fost moderată, fiind ceva mai mare la Norfloxacin (38,37%) față de Ciprofloxacin (39,42%).

Figura 3.10. Rezistența Enterobacteriaceelor la chinolone

Rezistența la antibiotice a bacililor Gram-negativ nefermentativi

Figura 3.11. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la peniciline

În ceea ce privește rezistența la cefalosporine a BGNNF, se remarcă din Figura 3.11 că a existat o discrepanță evidentă între rezistența crescută la cefalosporinele de generația 1 (60,00% rezistență la Cefazolin) și 2 (60,00% rezistență la Cefuroxim) și cea la cefalosporinele din generațiile 3 (28,57% la Ceftazidim, 25,00% la Cefotaxim, 15,33% la Ceftriaxon) și 4 (9,36% la Cefepim), explicată prin producerea de beta-lactamaze care hidrolizează preferențial cefalosporinele din generațiile 1 și 2.

Figura 3.12. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la cefalosporine de generația 1, 2, 3 și 4

Analizând rezistența la carbapeneme a tulpinilor de BGNNF la carbapeneme s-a constatat (Figura 3.12) că rezistența cea mai crescută s-a înregistrat la Meropenem (33,33%), urmat de Ertapenem (27,78%) și Imipenem (25,00%).

Figura 3.13. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la carbapeneme

Monobactamii reprezentați de aztreonam au fost rezistenți în procent de 30,30% (Figura 3.13). De remarcat că deși Aztreonamul nu este disponibil ca antibiotic în România, el a fost testat în cadrul testului de ESBL tip „ghost-zone”.

Figura 3.14. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la monobactami

Rezistența tulpinilor de BGNNF izolate la aminoglicozide a fost scăzută (Figura 3.14), înregistrându-se o rezistență de 10,00% la Amikacină, 16,67% la Gentamicină și Tobramicină.

Figura 3.15. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la aminoglicozide

Un procent de 41,67% dintre tulpinile de BGNNF au fost rezistente la Tigeciclină (Figura 3.15).

Figura 3.16. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la tetracicline

Examinând rezistența tulpinilor de BGNNF la chinolone, se poate constata din Figura 3.16 că aceasta a fost scăzută, fiind ceva mai mare la Norfloxacin (10,33%) față de Ciprofloxacin (7,09%).

Figura 3.17. Rezistența bacililor Gram negativ nefermentativi la chinolone

Din Tabelul 3.2 se poate constata că rezistența la antibiotice a germenilor Gram negativi a fost crescută în special pentru derivați de penicilină și cefalosporine din generațiile 1 și 2. Germenii Gram pozitiv au fost rezistenți la aminoglicozide, macrolide. Rezistența la Vancomicină a fost de 10,69%, incluzând enterococii vancomicino-rezistenți și nici o tulpină de stafilococi.

Tabelul 3.2. Rezistenta la antibiotice a bacteriilor izolate

Concluzii

Rezultatele obținute în urma studiului ne permit să concluzionăm următoarele:

Infecțiile sistemice bacteriene reprezintă o importantă cauză de mortalitate intraspitalicească, în secțiile de Terapie Intensivă.

În etiologia infecțiilor sistemice pe primul loc se situează cocii Gram pozitiv, stafilococul aureu ocupând locul I. Enterobacteriaceae precum și bacilii Gram negativ non-fermentativi au fost implicate într-un procent scăzut.

Testarea sensibilității la antibiotice arată o rezistență relativ crescută la beta-lactamine (peniciline, cefalosporine de generațiile 1 și 2), datorită fenomenului de selecție a rezistenței la chimioterapice antiinfecțioase și scăzută la carbapeneme, aminoglicozide și fluorochinolone.

Stabilirea fenotipurilor de rezistență a relevat asocierea acestora în multe cazuri. Astfel, fenotipul de rezistență prin secreția de beta-lactamaze cu spectru extins a fost asociat cu secreția de cefalosporinaze plasmidice și cromozomiale (AmpC), precum și fenotipuri de rezistență la aminoglicozide și fluorochinolone.

Pentru prevenirea infecțiilor de spital este absolut necesară colaborarea între medicii clinicieni, de laborator, epidemiologi, infecționiști și farmaciștii de spital pentru a stabili fenotipurile circulante în unitatea sanitară și adaptarea antibioterapiei la specificul microflorei locale.

III. Bibliografie

Laupland KB, Church DL. Population-Based Epidemiology and Microbiology of Community-Onset Bloodstream Infections. Clin Microbiol Rev 2014; 27(4):647-64;

Mayr FB, Yende S, Angus DC. Epidemiology of severe sepsis. Virulence 2014; 5(1):4-11;

Mikulska M, Del Bono V, Bruzzi P, Raiola AM, Gualandi F, Van Lint MT. Bacigalupo A, Viscoli C. Mortlity after bloodstream infections in allogeneic haematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. Infection 2012; 40(3):271-8;

Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide surveillance study. Clin Infect Dis 2004; 39:1093;

Ani C, Farshidpanah S, Bellinghausen Stewart A, Nguyen HB. Variations in Organism-Specific Severe Sepsis Mortality in the United States: 1999–2008. Crit Care Med 2015; 43(1):65-77;

European Centre for Disease Prevention and Control Point prevalence survey of healthcare-associated infections and antimicrobial use in European acute care hospitals Stockholm: ECDC; 2013.

de Kraker MEA, Jarlier V, Monen JCM, Heuer OE, van de Sande N, Grundmann H. The changing epidemiology of bacteraemias in Europe: trends from the European Antimicrobial Resistance Surveillance System. Clin Microbiol Infect 2013; 19(9):860-8;

Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M. The Epidemiology of Sepsis in the United States from 1979 through 2000. N Engl J Med 2003; 348(16):1546-54;

Carlet J, Pulcini C, Piddock LJ. Anibiotic resistance: a geopolitical issue. Clin Microbiol Infect. 2014; 20(10):949-53;

Giacobbe DR, Del Bono V, Trecarichi EM, De Rosa FG, Giannella M, Bassetti M, Bartoloni A, Losito AR, Corcione S, Bartoletti M, et al.. Risk factors for bloostream infections due to colistin-resistant KPC-producing Klebsiella pneumoniae: results from a multicenter case-control-control study. Clin Microbiol Infect 2015; 21:1106.e1-8;

Girmenia C, Rossolini GM, Piciocchi A, Bertaina A, Pisapia G, Pastore D, Sica S, Severino A, Cudillo L, Ciceri F, et al.. Infections by carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae in SCT recipients: a nationwide retrospective survey from Italy. Bone Marrow Transplant 2015; 50(2):282-8;

Tumbarello M, Trecarichi EM, De Rosa FG, Giannella M, Giacobbe DR, Bassetti M, Losito AR, Bartoletti M, Del Bono V, Corcione S, et al.. Infections caused by KPC-producing Klebsiella pneumoniae: differences in therapy and mortality in a multicentre study. J Antimicrob Chemother 2015; 70:2133-43;

Metzger KE, Rucker Y, Callaghan M, Churchill M, Jovanovic BD, Zembower TR, Bolon MK. The burden of mucosal barrier injury laboratory-confirmed bloodstream infection among hematology, oncology, and stem cell transplant patients. Infect Control Hosp Epidemiol 2015; 36(2):119-24;

Pappas PG, Kauffman CA, Andes DR, Clancy CJ, Marr KA, Ostrosky-Zeichner L, Reboli AC, Schuster MG, Vazquez JA, Walsh TJ, et al.. Clinical Practice Guideline for the Management of Candidiasis: 2016 Update by the Infectious Diseases Society of America. 2016; 62(4):e1-e50;

Opota O, Croxatto A, Prod'hom G, Greub G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin Microbiol Infect 2015; 21(4):313-22;

Akova M. Epidemiology of antimicrobial resistance in bloodstream infections. Virulence 2016; 7(3):TK ;

Bassetti M, Righi E, Carnelutti A. Bloodstream infections in the intensive care unit. Virulence 2016; 7(3):TK ;

Gustinetti G, Mikulska M. Bloodstream infections in neutropenic cancer patients: a practical update. Virulence 2016; 7(3):TK ;

Gudiol C, Aguado JM, Carratalà J. Bloodstream Infections in patients with solid tumors. Virulence 2016; 7(3):TK;

[20] Bartoletti M, Giannella M, Lewis R, Viale P. Bloodstream infections in patients with liver cirrhosis. Virulence 2016; 7(3):TK ;

[21] Taramasso L, Tatarelli P, Di Biagio A. Bloodstream Infections in HIV-Positive Patients. Virulence 2016; 7(3):TK ;

[22] Kritikos A, Manuel O. Bloodstream infections after solid organ transplantation. Virulence 2016; 7(3):TK ;

[23] Yahav D, Eliakim-Raz N, Leibovici L, Paul M. Bloodstream infections in older patients. Virulence 2016; 7(3):TK ;

[24] Bassetti M, Molinari MP, Mussap M, Viscoli C, Righi E. Candidaemia in internal medicine departments: the burden of a rising problem. Clin Microbiol Infect 2013; 19:E281-4;

[25] Del Bono V, Giacobbe DR. Bloodstream infections in internal medicine. Virulence 2016; 7(3):TK ;

Rugină, S., Infecții nosocomiale – de la concepte la practică. 2004, Constanța: Editura Muntenia.

Kaspersen, E.R., J. Raeder, and V. Dahl, Guidelines for treatment of sepsis. Tidsskr Nor Laegeforen, 2018. 138(4).

Wenzel, R.P. and M.B. Edmond, The impact of hospital-acquired bloodstream infections. Emerg Infect Dis, 2001. 7(2): p. 174-7.

Nielsen, S.L., et al., The daily risk of bacteremia during hospitalization and associated 30-day mortality evaluated in relation to the traditional classification of bacteremia. Am J Infect Control, 2016. 44(2): p. 167-72.

Gradel, K.O., et al., No specific time window distinguishes between community-, healthcare-, and hospital-acquired bacteremia, but they are prognostically robust. Infect Control Hosp Epidemiol, 2014. 35(12): p. 1474-82.

Leibovici, L., et al., Bacteraemia caused by hospital-type micro-organisms during hospital stay. J Hosp Infect, 2000. 44(1): p. 31-6.

Fleischmann, C., et al., Assessment of Global Incidence and Mortality of Hospital-treated Sepsis. Current Estimates and Limitations. Am J Respir Crit Care Med, 2016. 193(3): p. 259-72.

Buetti, N., et al., National Bloodstream Infection Surveillance in Switzerland 2008-2014: Different Patterns and Trends for University and Community Hospitals. Infect Control Hosp Epidemiol, 2016. 37(9): p. 1060-7.

Cahill, T.J. and B.D. Prendergast, Infective endocarditis. Lancet, 2016. 387(10021): p. 882-93.

Tong, S.Y., et al., Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clin Microbiol Rev, 2015. 28(3): p. 603-61.

Kamal AM, et al., Double therapy with pegylated Interferon and Ribavirin for chronic hepatitis C. A pharmacogenenetic guide for predicting adverde events. Farmacia, 2017. 65(6): p. 877-884.

Sader, H.S., et al., SENTRY antimicrobial surveillance program report: Latin American and Brazilian results for 1997 through 2001. Braz J Infect Dis, 2004. 8(1): p. 25-79.

Sahoo, K.C., et al., Geographical variation in antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from stool, cow-dung and drinking water. Int J Environ Res Public Health, 2012. 9(3): p. 746-59.

Junie, L.M., Basic Bacteriology and Virology 2011, Cluj-Napoca: Editura Medicala Universitara "Iuliu Hatieganu".

Frederiksen, M.S., et al., Changing epidemiology of pediatric Staphylococcus aureus bacteremia in Denmark from 1971 through 2000. Pediatr Infect Dis J, 2007. 26(5): p. 398-405.

Roșu, L., Microbiologie medicală – Bacteriologie. Note de curs. 2002, Craiova: Ed. Medicală Universitară.

Qu, T.T., et al., [Genotypes of aminoglycoside-modifying enzyme and clinical study of high-level gentamycin resistant enterococcus]. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, 2006. 35(1): p. 76-82.

Schwarz, F.V., V. Perreten, and M. Teuber, Sequence of the 50-kb conjugative multiresistance plasmid pRE25 from Enterococcus faecalis RE25. Plasmid, 2001. 46(3): p. 170-87.

Werner, G., B. Hildebrandt, and W. Witte, Linkage of erm(B) and aadE-sat4-aphA-3 in multiple-resistant Enterococcus faecium isolates of different ecological origins. Microb Drug Resist, 2003. 9 Suppl 1: p. S9-16.

Maravic, G., Macrolide resistance based on the Erm-mediated rRNA methylation. Curr Drug Targets Infect Disord, 2004. 4(3): p. 193-202.

Yague Guirao, G., et al., [Implication of ermX genes in macrolide- and telithromycin-resistance in Corynebacterium jeikeium and Corynebacterium amycolatum]. Rev Esp Quimioter, 2005. 18(3): p. 236-42.

Saribas, Z., F. Tunckanat, and A. Pinar, Prevalence of erm genes encoding macrolide-lincosamide-streptogramin (MLS) resistance among clinical isolates of Staphylococcus aureus in a Turkish university hospital. Clin Microbiol Infect, 2006. 12(8): p. 797-9.

Hooper, D.C., Fluoroquinolone resistance among Gram-positive cocci. Lancet Infect Dis, 2002. 2(9): p. 530-8.

Agerso, Y., A.G. Pedersen, and F.M. Aarestrup, Identification of Tn5397-like and Tn916-like transposons and diversity of the tetracycline resistance gene tet(M) in enterococci from humans, pigs and poultry. J Antimicrob Chemother, 2006. 57(5): p. 832-9.

Moore, I.F., D.W. Hughes, and G.D. Wright, Tigecycline is modified by the flavin-dependent monooxygenase TetX. Biochemistry, 2005. 44(35): p. 11829-35.

Cordina, C., et al., Tigecycline-resistant Enterococcus faecalis associated with omeprazole use in a surgical patient. J Antimicrob Chemother, 2012. 67(7): p. 1806-7.

Mollmann, S., et al., Complete Genome Sequence of Corynebacterium imitans DSM 44264, Isolated from a Five-Month-Old Boy with Suspected Pharyngeal Diphtheria. Genome Announc, 2014. 2(6).

Taj, Y., F.E. Abdullah, and S.U. Kazmi, Current pattern of antibiotic resistance in Staphylococcus aureus clinical isolates and the emergence of vancomycin resistance. J Coll Physicians Surg Pak, 2010. 20(11): p. 728-32.

Castanheira, M., et al., Occurrence and molecular characterization of fusidic acid resistance mechanisms among Staphylococcus spp. from European countries (2008). J Antimicrob Chemother, 2010. 65(7): p. 1353-8.

Watanabe, Y., et al., Impact of rpoB mutations on reduced vancomycin susceptibility in Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol, 2011. 49(7): p. 2680-4.

Zhanel, G.G., et al., New lipoglycopeptides: a comparative review of dalbavancin, oritavancin and telavancin. Drugs, 2010. 70(7): p. 859-86.

Apfalter, P., [MRSA/MRSE-VISA/GISA/VRSA-PRP-VRE: current gram positive problem bacteria and mechanism of resistance, prevalence and clinical consequences]. Wien Med Wochenschr, 2003. 153(7-8): p. 144-7.

Severin, A., et al., High level oxacillin and vancomycin resistance and altered cell wall composition in Staphylococcus aureus carrying the staphylococcal mecA and the enterococcal vanA gene complex. J Biol Chem, 2004. 279(5): p. 3398-407.

Kang, M., et al., Molecular characteristics of vancomycin-resistant Enterococcus faecium from a tertiary care hospital in Chengdu, China: molecular characteristics of VRE in China. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2014. 33(6): p. 933-9.

Lessard, I.A. and C.T. Walsh, VanX, a bacterial D-alanyl-D-alanine dipeptidase: resistance, immunity, or survival function? Proc Natl Acad Sci U S A, 1999. 96(20): p. 11028-32.

Levine, D.P., Vancomycin: a history. Clin Infect Dis, 2006. 42 Suppl 1: p. S5-12.

Berscheid, A., et al., Generation of a vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus (VISA) strain by two amino acid exchanges in VraS. J Antimicrob Chemother, 2014. 69(12): p. 3190-8.

Kim, H.J., M. Kwon, and J. Yu, Elucidation of the RNA target of linezolid by using a linezolid-neomycin B heteroconjugate and genomic SELEX. Bioorg Med Chem, 2007. 15(24): p. 7688-95.

Toh, S.M., et al., Acquisition of a natural resistance gene renders a clinical strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus resistant to the synthetic antibiotic linezolid. Mol Microbiol, 2007. 64(6): p. 1506-14.

Seedat, J., et al., Rapid emergence of resistance to linezolid during linezolid therapy of an Enterococcus faecium infection. Antimicrob Agents Chemother, 2006. 50(12): p. 4217-9.

Sinclair, A., C. Arnold, and N. Woodford, Rapid detection and estimation by pyrosequencing of 23S rRNA genes with a single nucleotide polymorphism conferring linezolid resistance in Enterococci. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(11): p. 3620-2.

Werner, G., et al., Detection of mutations conferring resistance to linezolid in Enterococcus spp. by fluorescence in situ hybridization. J Clin Microbiol, 2007. 45(10): p. 3421-3.

Willems, R.J., et al., Mutations in the DNA mismatch repair proteins MutS and MutL of oxazolidinone-resistant or -susceptible Enterococcus faecium. Antimicrob Agents Chemother, 2003. 47(10): p. 3061-6.

Canton, R., et al., A potential role for daptomycin in enterococcal infections: what is the evidence? J Antimicrob Chemother, 2010. 65(6): p. 1126-36.

Fischer, A., et al., Daptomycin resistance mechanisms in clinically derived Staphylococcus aureus strains assessed by a combined transcriptomics and proteomics approach. J Antimicrob Chemother, 2011. 66(8): p. 1696-711.

Asghar, A.H., Frequency and antimicrobial susceptibility patterns of bacterial pathogens isolated from septicemic patients in Makkah hospitals. Saudi Med J, 2006. 27(3): p. 361-7.

Ambler, R., The structure of beta-lactamasae. Vol. 289. 1980, London: Philos. Trans. R.Soc. p. 321-331.

48. Bals, M., Laboratorul Clinic în infecții. 1982, București: Editura Medicală. p. 223-232.

Gupta, K., et al., MRSA nasal carriage patterns and the subsequent risk of conversion between patterns, infection, and death. PLoS One, 2013. 8(1): p. e53674.