Evidentierea Unor Tipuri DE Plastide In Celule Vegetale

EVIDENȚIEREA UNOR TIPURI DE PLASTIDE

ÎN CELULE VEGETALE

CUPRINS

I. INTRODUCERE

Putem afirma că plantele joacă cel mai important rol în ciclul vieții. Fără plante nu ar exista viața pe Pământ. Ele sunt producătorii primari care susțin existența celorlalte forme de viață, întrucât sunt singurele organisme capabile să-și producă singure hrana necesară. Organismele animale, incapabile de acest lucru, depind direct sau indirect de plante. Prin intermediul acestui proces complex numit fotosinteză plantele transformă energia solară, dioxidul de carbon din atmosferă, apa și mineralele din sol în resurse de hrană proprie și oxigen. 

Culoarea verde, caracteristică plantelor, se datorează pigmentului numit clorofilă, care se află din abundență în frunzele plantelor. Clorofila a mai fost numită și „rază solară lichidă” pentru considerentul că absoarbe energia soarelui.

Organismele vii aparținând regnului vegetal sunt alcătuite din mai multe tipuri de celule. Între acestea se disting, în principal, două tipuri: primul tip este reprezentat prin celule care sunt responsabile de efectuarea activităților metabolice specifice plantei, iar tipul secund este format din celule non-active din punct de vedere metabolic care se constituie ca suport mecanic sau participă la tranzitul sevei prin plantă. Celulele cu activitate metabolică, conțin toate organitele celulare cu importanțã biochimică. Organitele celulare caracteristice plantelor, cu rol în biogeneza pigmentului, sunt plastidele. Mai exact, plastidele constituie o familie de organite celulare care au ca și precursori proplastidele, din care se dezvoltă: cloroplastele, cromoplastele, amiloplastele și etioplastele.

Sub aspect morfologic, vizibil la miscroscop, în plastidă se distinge o „membrană limitantă dublă” (internă și externă), iar în interior este substanța fundamentală localizată în „stroma”. La nivelul stromei se aflã formațiuni lenticulare (discoidale) denumite „grana” care conțin diverse substanțe chimice: clorofilă, proteine, fosfolipide, amidon, etc.

Toate cloroplastele conțin pigmentul clorofilă. Numele acesteia provine din cuvintele grecești: chloros = verde și phyllon = frunză. Pigmenții sunt compuși chimici pentru a căror biogeneză este necesară lumina cu anumite lungimi de undă din spectrul vizibil al luminii. Acest fapt le conferă proprietatea de a sintetiza compuși „colorați”. Similar, în diverse plastide se formează coloranți care sunt specifici pentru flori, fructe etc. Aceștia conferă țesuturilor vegetale culoarea specifică.

Există trei clase principale de pigmenți implicați în procesul de fotosinteză: clorofilele – pigmenți verzi; carotenoidele – pigmenți de culoare roșie, portocalie sau galbenă și includ compusul familiar carotenul care dă morcovilor culoarea specifică; antocianii – pigmenți flavonoidici vacuolari solubili în apă care, în funcție de anumite particularități ale structurii chimice, pot prezenta culoare roșie sau albastră. Aceștia se găsesc în mare parte în flori (petale, stamine), în fructe, dar și în frunze și rădăcini. Toți acești pigmenți sunt prezenți sub formă de cromoproteine (complecși pigment-proteină) având o componentă proteică și o componentă non-proteică (prostetică).

Datorită importanței acestui component al celulei vegetale, am ales ca temă pentru lucrarea de licență evidențierea diferitelor tipuri de plastide în țesuturi specifice: asimilatoare sau de depozitare, în diferite organe vegetale: frunză, rădăcină tuberizată, petale florale, pețiol, fruct, tubercul, etc. Pentru atingerea acestui scop, mi-am propus următoarele obiective:

II. STUDIU DOCUMENTAR

Capitolul 1. PLASTIDE

1.1. Originea plastidelor

Plastidele sunt organite citoplasmatice care caracterizează regnul vegetal și nu au echivalenți cunoscuți în regnul animal. Plastidele joacă un rol fundamental în lumea vie, cloroplastele fiind sediul fenomenului de fotosinteză. În procesul de fotosinteză se produc substanțe organice din CO2, apă, nitrați și alți compuși anorganici, printr-un mecanism de conversie a energiei luminoase, emisă de soare, în energie chimică. Energia solară devine astfel disponibilă sub formă de compuși organici, fotosinteza fiind un proces compensator de energie dintre lumea vie și cea lipsită de viață. Pentru asimilarea CO2 de către plante este necesară prezența luminii și a pigmentului verde, clorofila (H. Iugen, 1799). Balanța globală de energie a biosferei nu poate fi menținută fără contribuția plantelor verzi (Anghel I., 1979).

Spre deosebire de originea mitocondriei, ale căror detalii sunt încă în dezbatere, nu mai există nici o îndoială că plastidele sunt derivate din conviețuirea cianobacteriilor într-o celulă eucariotă gazdă, cu un nucleu, citoschelet și mitocondrion. Așa numita origine endosimbiotică primară, a plastidelor (Figura 1.1.), poate fi considerată punctul de lansare a sintezei eucariotelor, în sensul că toate plastidele canonice par să fie derivate din acest eveniment, fie direct sau indirect.

Pastidele primare sunt caracterizate de prezența a două membrane, se găsesc în algele roșii, alge glaucofite și alge verzi, grupul din urmă fiind descendentul unicelular care a dat naștere plantelor superioare. Acest ansamblu este menționat la plante ca arheoplastide. (Figura 1.2.).

Un transfer intracelular de gene (EGT) a fost un factor major în integrarea cianobacteriilor ca plastide în celula eucariotă gazdă. În timp ce plastidul rareori codifică mai mult de 200 de proteine, o mie sau mai multe proteine nucleu-codificate sunt necesare pentru a servi unui sistem complet de funcționare a plastidului. Genomul nuclear de la endosimbiontul primar, prezintă sute de gene endosimbiote derivate, multe proteine plastidiale codate, precum și alte componente care au evoluat nonplastidial.

Speculațiile că fotosinteza s-a răspândit în întregul regn vegetal, datează din anii 1970. Un canadian, Sarah Gibbs, a remarcat mai întâi că clorofila a și b pigmentează plastidele, algele comune. Dezacordul dintre evoluția plastidelor și celula gazdă în care locuiește, a determinat apariția endosimbiozei secundare, de exemplu, mișcarea plastidelor de la un eucariot la altul.(Figura 1.1.). În cazul Euglena, aceste plastide sunt într-adevăr derivate dintr-o algă verde, care a fost înghițită de un organism unicelular non-fotosintetic apropiat al euglenei (Figura 1.2.).

Chlorachniophytes este un grup de alge amoebo-flagelate, care de asemenea dispun de plastide verzi de origine endosimbiotică secundară (Figura 1.2.). În acest caz, nu există nici o îndoială cu privire la mecanismul de captare a organitelor: spre deosebire de Euglena, celulele clorachniofite posedă încă un nucleu de la endosimbioza algelor verzi. Plastidele de la Euglena și Chlorachniophyte posedă 3-4 membrane plastidiale, față de cele 2 membrane care înconjoară toate plastidele primare cunoscute.

Nu mai puțin de 6 linii filogenetice de alge sunt cunoscute că dețin plastide provenite de la algele roșii; acestea includ criptofitele, haptofitele, apicomplexanele, dinoflagelatele și Chromera velia (Figura 1.2.). Apicomplexanele sunt un grup de captare a ”paraziților” non-fotosintetici, multe dintre acestea au o rămășiță dintr-un plastid cu 4 membrane, cu rol în fi biosinteza acizilor grași. Plastidele apicomplexane posedă încă un genom, destul de redus, iar genele sunt extrem de derivate și dificil de plasat cu exactitate în filogeneza moleculară.

Doar aproximativ 50% dintre speciile de dinoflagelate cunoscute sunt fotosintetice, dar din cele care sunt, majoritatea au 3 membrane și plastide pigmentate cu piridinină. Alte dinoflagelate posedă ceea ce este denumit ca plastid terțiar (Figura 1.1.C). Acestea conțin plastide care au fost luate de la criptofite, haptofite și stamenofite. Altele posedă plastide secundare seriale (Figura 1.1.D), precum Lepidodinium, care deține un plastid provenit de la algele verzi parazinofite. Gradul integrării prin edosimbioză a acestor organisme în celulele gazdă, variază considerabil: plastidele piridinice sunt reduse și dezvăluie câteva indicii cu privire la originea lor, în timp ce plastidele terțiare de la Kryptoperidinium și speciile înrudite sunt, în mod clar, provenite recent de la diatomee și dețin mitocondrii și încă un nucleu.

O presupusă rămășiță de la un plastid piridinic original, este păstrată într-o celulă gazdă ca un „punct de ochi”. În final, s-a descoperit o nouă algă numită Chromera velia care deține un plastid aparent originar din algele roșii. Acest organism reprezintă o legătură importantă între plastidele de la dinoflagelate și apicomplexane.

Fig. 1.1. Evoluția plastidelor prin endosimbioză primară, secundară și terțiară

A.) Originea endosimbiozei primare a plastidelor, prin preluarea unei cianobacterii cu membrană dublă, într-o celulă eucariotă gazdă non-fotosintetizatoare; B.) Endosimbioza secundară implică acapararea unei eucariote ce conține plastidul primar, de către o a doua eucariotă non-fotosintetică. Toate plastidele primare cunoscute sunt înconjurate de o membrană dublă, iar în cazul algelor glaucofite, de un strat de peptidoglicani; C.) Endosimbioza terțiară apare atunci când un plastid endosimbiot secundar este încorporat de o celulă eucariotă gazdă, care poate sau nu să posede un plastid; D.) Endosimbioza secundară în serie într-o celulă eucariotă ce conține și un endosimbiot cu un plastid primar; E.) Transferul endosimbiotic de gene și proteine în alge ce conțin plastide secundare. CB – cianobacterii; M – mitocondrion; NU – nucleu gazdă; PL – plastid; NM – nucleomorf; PPC – compartiment periplastidial; ERAD – reticul endoplasmatic asociat cu mecanisme de degradare a proteinelor; TIC și TOC – translocon al membranei interne, respectiv al membranei externe a cloroplastului.

Ca și la haptofite și heterokonte, membrana plastidială ultraperiferică a criptofitului este continuată cu sistemul de endomembrane al celulei gazdă, care este împânzit de ribozomi. La cele mai multe alge ce conțin plastide secundare, procesul transferului de gene de la nucleomorf la nucleul gazdă, a dispărut după ce s-a realizat complet.

Fig. 1.2. Ipoteza originii și răspândirii fotosintezei la eucariote

Figura 1.2. prezintă 6 supergrupuri de eucariote, cu unul sau mai multe grupuri purtătoare de plastide. Arborele topologic este un consens bazat pe publicarea analizelor filogenetice și filogenomice, în august 2008, precum și pe caracterele discrete, cum ar fi transferul genelor laterale, înlocuirea genelor edosimbiotice, pigmentația plastidelor etc. Endosimbioza secundară, terțiară sau serială, implică endosimbioza algelor verzi și roșii codate pe culori, bazate pe ipoteza lui Sanchez Puerta și Delwiche. Liniile întrerupte, indică incertitudinea dintre relațiile organismului și plastid. Semnele de întrebare (?), indică incertitudinea cu privire la prezența plastidelor și/sau originii fotosintetice, precum și la proveniența plastidelor secundare roșii, dintr-un strămoș comun de criptofite sau haptofite (John M. Archibald, 2009).

Algele albastre-verzi și bacteriile fotosintetizatoare sunt lipsite de plastide, dar conțin structuri lamelare la nivelul cărora se localizează pigmenți. P. Heim (1947) a descris în celulele unor ciuperci structuri asemănătoare cromoplastelor, care conțin pigmenți carotenoizi, uneori sub formă cristalină. În funcție de pigmenții pe care-i conțin, plastidele se împart în cloroplaste, cromoplaste și leucoplaste (Anghel I., 1979).

1.2. Diviziunea plastidelor

Diviziunea plastidelor are loc cu ajutorul a două mecanisme moleculare:

un mecanism intern situat pe partea stromală a învelișului intern al membranei

un mecanism extern situat pe învelișul extern al membrane

Mecanismul citoplasmatic al diviziunii plastidelor

De-a lungul evoluției, plastidele și-au păstrat elemente din echipamentul de diviziune provenite de la celulele bacteriene, iar importanța mecanismului stromal de diviziune este bine stabilită. Mai surprinzătoare a fost identificarea unui mecanism de divizare divizare citoplasmatic pe învelișul membranei externe. Primele dovezi pentru existența acestui mecanism, a fost evidențierea unui inel exterior, în cloroplaste. Inelul exterior constă într-un ansamblu de filamente de 5-7 nm, bobinat în jurul situsului de constricție ce rămâne asociat cu un sept pe toată durata procesului de diviziune. Se crede că, principala componentă a învelișului exterior este o proteină de 56 Kda, deși acest lucru rămâne să fie identificat, iar rolul inelului exterior rămâne necunoscut.

Recent, au fost identificate 2 componente ale mecanismului citoplasmatic de diviziune, PDV1 și PDV2. PDV1 este localizat în situsul de divizare a inelului discontinuu din cloroplastele celulelor din frunzele tinere, în curs de dezvoltare. PDV1 prezintă un omolog la Arabidopsis, numit PDV2. PDV1 și PDV2 sunt unice în plante și mușchi și dețin 2 regiuni scurte de conservare la capătul N- și C- terminal al proteinelor. Studii detaliate a localizării PDV1, au arătat că acesta este integrat în învelișul exterior al membranei cloroplastelor.

PDV1 a fost identificat printr-un screening genetic pentru mutanții de Arabidopsis cu defecte ale diviziunii cloroplastelor, similare cu arc5. ARC5 este o proteină dinamin-like cu un domeniu de GTP-ază la capătul N-terminal și a fost emisă o ipoteză conform căreia, energia eliberată prin hidroliza GTP-ului ar permite ARC5 să acționeze ca o enzimă mecanochimică în etapa finală de fisiune. ARC5 este localizată la nivelul inelului discontinuu de la situsul de diviziune al cloroplastelor, pe suprafața învelișului exterior a membranei citoplasmatice. Identificarea recentă de componente citoplasmatice necesare pentru diviziunea plastidelor, oferă o bază solidă pentru analiza continuă a acestui mecanism unic.

Mecanismul stromal al diviziunii plastidelor este prezentat în figura 1.3.

Fig.1.3. Mecanismul diviziunii cloroplastelor la plantele superioare

Modalitatea de asamblare a complexelor de diviziune (etapele 1-6); (b) Localizările și interacțiunea proteinelor cunoscute în diviziunea plastidelor; (c) O vizualizare transversală a situsului de constricție a cloroplastelor; OEM – înveliș membranar exterior; IEM – înveliș membranar interior (Yue Yang and col., 2008).

Coordonarea dintre cele 2 mecanisme de diviziune constă într-o interacțiune directă dintre proteinele cunoscute (de exemplu, între ARC6 și PDV1), prin solicitarea de proteine neidentificate în spațiul intermembranar sau prin acțiunea de semnalizare a componentelor.

Fig. 1.4. Mecanismul stromal și citoplasmatic de diviziune a plastidelor

Primul pas al mecanismului de diviziune stromal, este asamblarea AtFtsZ1-1 (F1) și AtFtsZ2-1 (F2), care formează un inel Z în centrul cloroplastului. ARC6 (6) și ARC3 (3) interacționează specifice cu AtFtsZ2-1, respectiv AtFtsZ1-1. Plasarea inelului Z, necesită acțiunea combinată a AtMinE1, AtMinD1 și posibil a ARC3, care formează un complex ce se localizează la polii plastidului. GC1 este localizat în partea stromală a învelișului interior al membranei și formează dimeri. PDV1 și PDV2 sunt localizați la nivelul inelului pe suprafața citoplasmatică, pe învelișul exterior al membranei și preia ARC5 de la situsul de diviziune, pentru a constitui mecanismul de diviziune citoplasmatic. (Jodi Maple and col., 2007).

Controlul anterograd (nucleu-organite) al proprietăților plastidelor, include sistemul de reglare OGE (organite exprimate genic) care intervine în mai multe stadii. Importul post-trascripțional de proteine în cloroplaste, este facilitat de complexul Tic-Toc.

OGE, inclusiv transcripția, modularea transcrierii, maturizarea și prelucrarea, precum și translația proteinelor codificate de plastid, sunt în mare parte procese mediate de factori nuclear-codificați. Evenimentele post-translaționale, cum ar fi ansamblul de complexe multi-proteice din membrana tilakoidală, necesită factori nuclear-codificați de asamblare. Datele actuale sprijină concluzia că reglarea OGE-ului are loc, în principal, la nivelul post-transcripțional.

Controlul retrograd, constă în influența organitelor asupra nucleului, în acest caz, influența cloroplastului asupra genomului nuclear. Se presupune că, semnalele plastidului reglează transcrierea genelor nucleare pentru proteinele cp, ca răspuns la starea metabolică și dezvoltarea organitului (Tatjana Kleine and col., 2009).

Fig. 1.5. Conceptul de semnalizare anterogradă și retrogradă

Clasificarea plastidelor

După natura substanțelor elaborate, A. Nougarède (1969) a grupat plastidele în patru clase:

plastide clorofiliene (cloroplaste), care conțin pigmentul verde – clorofila – și elaborează în procesul de fotosinteză amidon. Plastidele clorofiliene se găsesc la algele verzi, roșii, brune, la mușchi și în organele aeriene ale plantelor superioare;

plastide amilifere (amiloplaste), care se diferențiază în organele subterane ale plantelor vasculare (în special în ribozomi și tuberculi) și formează amidon;

proteoplaste, care produc substanțe proteice;

cromoplaste, care conțin pigmenți carotenoizi și se găsesc în fructele și florile plantelor.

A. Obré (1971) considera încă două clase, și anume: oleoplaste, care conțin lipide și sterinoplaste, care conțin steroli.

În feoplastele algelor brune clorofila este asociată și mascată de fucoxantină, iar în rodoplastele algelor roșii de ficoeritrină (pigment roșu) și ficocianină (pigment albastru).

Plastidele plantelor superioare își pot modifica natura în cursul vieții lor, în funcție de condițiile ecofizice în care sunt crescute plantele. De pildă, plastidele amilifere din celulele rădăcinii, transferate la lumină, capătă un aspect morfologic și structural asemănător cloroplastelor și vor sintetiza clorofilă. Amiloplastele, în anumite condiții, se pot transforma, de asemenea, în cromoplaste (A. Nougarède, 1969).

Primele observații asupra plastidelor au fost efectuate de A. van Leeuwenhoek (1632 – 1723) la alga verde Spirogyra. Contribuții importante referitoare la originea și structura plastidelor au fost aduse de A. Meyer (1883) și A. Schimper (1885).

A. Schimper (1885) a identificat în frunzele plantelor verzi, în afară de cloroplaste, și o serie de corpusculi galbeni, portocalii și chiar incolori, ceea ce l-a determinat să înlocuiască termenul de „cromatofori” cu cel de „plastide”.În funcție de prezența sau absența culorii, A. Schimper (1885) a clasificat plastidele în: cloroplaste, leucoplaste și cromoplaste, având capacitatea de a se transforma unele în altele. A. Schimper a observat că leucoplastele pot deveni verzi, iar cloroplastele galbene, leucoplastele fiind considerate tipul de origine din care rezultă cloroplastele și cromoplastele.

Totalitatea plastidelor din citoplasma unei celule constituie plastidomul (Anghel I., 1979).

Capitolul 2. LEUCOPLASTE

Leucoplastele sunt plastide incolore, lipsite de pigmenți, prezente în celulele parenchimatice din organele subterane ale plantelor superioare (bulbi, tuberculi, rizomi), în celulele țesuturilor embrinonare din vârful rădăcinilor și tulpinilor, în citoplasma sporilor și gameților femeli, în parenchimul seminal. Leucoplastele se găsesc, de asemenea, în celulele plantelor parazite care au pierdut capacitatea de fotosinteză.

A. Guilliermond (1933) a studiat diferențierea leucoplastelor din celulele epidermei frunzelor, florilor și învelișul bulbilor și a constatat că leucoplastele au același indice de refracție ca mitocondriile. Uneori leucoplastele devin filamentoase, fiind asemănătoare condriocontelor, dar de dimensiuni mai mari. Aceste modificări sunt reversibile. Asemănările reliefate l-au determinat pe A. Guilliermond (1933) să considere că leucoplastele sunt o categorie specială de mitocondrii.

Datorită indicelui lor de refracție superior citoplasmei, leucoplastele pot fi identificate relativ ușor „in vivo”, în special în țesuturile lipsite de cloroplaste, ca și prin colorarea cu coloranți vitali cum sunt verdele Janus, violet de Dahlia, metil violet. În țesuturile care nu conțin clorofilă, leucoplastele pot fi observate în momentul în care se acumulează amidon.

În mod frecvent, în leucoplaste se acumulează amidon. Sunt specii la care amidonul nu constituie substanța sa de rezervă. Așa sunt, de exemplu, reprezentanții familiei Compositae (Dahlia, Cichorium, Scorzonera) în rădăcinile cărora se acumulează – substanță de rezervă caracteristică acestor plante (Anghel I., 1979).

2.1. Morfologie și ultrastructură

Forma leucoplastelor este adesea sferică, ovoidală sau fusiformă, aspectul lor modificându-se pe măsura acumulării substanțelor de rezervă (amidon sau cristale proteice). Sub acțiunea luminii leucoplastelor se transformă în cloroplaste (prin diferențierea structurilor lamelare și acumularea pigmenților verzi) sau în cromoplaste. Leucoplastele sunt delimitate de o membrană dublă în interiorul căreia se găsește stroma. Membrana internă formează criste asemănătoare celor de la mitocondrii, mai lungi sau mai puțin numeroase. Stroma este fin granulată sau fibroasă. Procesul de sinteză a pigmenților carotenoizi este însoțit de degradarea ireversibilă a plastidelor. În plastide are loc, de asemenea, sinteza de substanțe paraplasmatice. Substanțele de rezervă cel mai des întâlnite sunt amidonul, grăsimile și proteinele.

Cloroplastele, leucoplastele și cromoplastele se pot transforma în amiloplaste, oleoplaste sau proteoplaste (Anghel I., 1979).

Amiloplaste

În principiu, orice plastidă poate să se transforme în amiloplaste. În celulele multor specii se întâlnesc plastide care asimilează amidon, altele care nu-l produc niciodată. Capacitatea leucoplastelor de a produce și acumula amidon depinde de specie, țesut și condițiile mediului ambiant. De pildă, în cloroplastele din frunzele de grâu nici în zilele călduroase glucidele produse în procesul de fotosinteză nu sunt convertite în amidon ci se acumulează în vacuole sub formă de zaharoză. În boabele și unele țesuturi din tulpinile de grâu se acumulează cantități mari de amidon, în timp ce în cloroplastele din frunzele de sfeclă-de-zahăr amidonul se acumulează ziua și este hidrolizat noaptea. Amidonul se acumulează în stroma leucoplastelor (amiloplastelor) sub forma unor granule foarte voluminoase, localizate în vacuolele care se diferențiază în stromă, dar lipsite de membrană înconjurătoare. Într-un leucoplast se formează un granul de amidon sau mai multe, acestea putând fi granule simple sau compuse (Anghel I., 1979).

Proteoplaste

A. Schimper (1882) a descris atât în cloroplaste, cât și în leucoplaste o serie de incluziuni rombonice și acirculare care prezentau un indice de refracție scăzut, formă și reacție de culoare caracteristice substanțelor de natură proteică pe care le dețin.

Proteinele se acumulează în leucoplastele din celulele rădăcinilor și în cloroplastele din țesuturile expuse la lumină. Au fost evidențiate, de asemenea, proteine în leucoplastele din sacul embrionar de la Lilium candidum. Inițial, în proteoplastide se acumulează proteine în matrice sub forma unui fascicul fibros care, ulterior, se condensează într-un cristal acircular, larg răspândit în celulele rădăcinilor de la speciile familiilor Orchidaceae, Boraginaceae, în frunzele tinere de la Phayus sp., și în sacul embrionar de la Lilium candidum.

În leucoplaste s-au evidențiat de asemenea granule foarte fine, care se presupune a fi de natură proteică și care conțin fier și au fost definite ca fitoferitine (Anghel I., 1979).

Oleoplaste

În plastidele din celulele diferitelor țesuturi vegetale se acumulează lipide. Astfel, s-au evidențiat lipide în celule endospermului semințelor plantelor oleaginoase (Cucurbita pepo, Helianthus annuum, Linum ussitatissimum, Juglans regia). Uleiurile eterice se găsesc sub forma unor picături refrigerente, volatile, cu indice de refracție mare, în celulele scoarței de Cinnamomum zeylanicum, în celulele frunzelor de Citrus limon, Pimpinella anisum et.

În mod frecvent, în oleoplaste se întâlnesc fosfolipide și steroizi. În plastidele diatomeelor, în procesul de fotosinteză, se acumulează lipide. Se consideră că acumularea lipidelor evidențiază un proces de degenerare a plastidelor (Anghel I., 1979).

2.2. Potențial metabolic

Amidonul este substanța de rezervă caracteristică regnului vegetal. După locul de depozitare, poate fi un amidon autohton sau de asimilație, format în cloroplastele celulare și un amidon de migrație (de rezervă) depozitat în alte organe (rizomi, bulbi, semințe, tuberculi). Forma amidonului este specifică, recunoscându-se ușor planta producătoare. Se întâlnesc forme rotunde, ovale, lenticulare, poliedrice etc. Conținutul în amidon (la toate plantele fotosintetizante) este variabil. Cel mai mult se află în orez (70 – 80 %), apoi în grâu (63 – 67%), porumb (60 – 66 %), fasole (42-43 %) și cartof (13-25 %).

Amidonul este un polizaharid de rezervă, specific organismelor vegetale, care se găsește atât în țesuturile fotosintetice, cât și, mai ales, în majoritatea țesuturilor de rezervă (semințe, tuberculi etc). Extragerea amidonului se face din părțile plantelor bogate în acest compus:

semințe: amidonurile cerealiere (porumb, orez, secară, grâu etc);

amidonurile leguminoase (de exemplu din mazăre);

rădăcini și tuberculi: amidonul de cartofi, amidonul de tapioca;

tulpini: amidonul de sago;

fructe: amidonul de banane.

Ponderea amidonului în aceste țesuturi ale plantelor este influențată de originea botanică, varietatea plantei, condițiile pedoclimatice etc.

Funcția amidonului în plante este aceea a unui compus de rezervă energetică, necesară păstrării vitalității semințelor în timpul depozitării și este utilizat la germinare, până la dezvoltarea frunzelor care, prin fotosinteză, pot ulterior sintetiza zaharuri simple. Pentru îndeplinirea acestei funcții, planta își sintetizează amidonul sub formă de granule, acesta fiind modul convenabil de a-l utiliza, ulterior, treptat ca substrat pentru enzime. Granulele se caracterizează prin formă și dimensiuni diferite în funcție de zestrea genetică și de activitatea enzimatică a celulelor în care se formează.

Amidonul este un amestec format din doi polimeri cu structuri primare diferite: amiloza moleculă liniară și amilopectină moleculă ramificată.

În cazul tipurilor obișnuite de amidon, amiloza și amilopectină se găsesc în proporții de 25-28%, respectiv 72-75%. În cazul unor genotipuri de porumb, orez și de mazăre s-a dovedit existența unui material cu structură intermediară structurii amilozei și amilopectinei. Totodată, există genotipuri numite ceroase, la care ponderea amilopectinei ajunge la 98-99% (amidon ceros: porumb, sorg, orez), sau la alte genotipuri conținutul în amiloză este mărit până la 70-80%.

2.3. Beneficii aduse sănătății consumatorului

Leucoplastele stochează cantități mari de amidon care vor fi utilizate pentru a furniza energia necesară creșterii plantelor de cartof, în următorul sezon de creștere. Amidonul este slab solubil în apă, deci leucoplastele servesc drept „chiuvete” pentru zaharuri, fiind produse în tulpini și frunze în timpul sezonului de creștere. Leucoplastele din apropierea suprafeței cartofului pot fi transformate în cloroplaste, atunci când sunt expuse la o intensitate luminoasă suficientă.

Amidonul are o deosebit de mare importanță practică deoarece el reprezintă alimentul de bază și sursa energetică principală a plantelor și animalelor. Are mare valoare economică pentru industria hârtiei, textile, a alcoolului, etc. În industria farmaceutică este folosit ca excipient pentru prepararea antibioticelor, vitaminelor și drajeurilor. Se mai utilizează în dermatologie și cosmetică. În industria alimetară amidonul este utilizat ca:

agent de îngroșare (sosuri, supe, cremă)

stabilizator coloidal (dresinguri pentru salate)

agent pentru reținerea umidității produse tip ”cake”

agent de gelifiere (rahat ,produse gumate)

agent de legare (vafe)

agent de acoperire (produse zaharoase).

Capitolul 3. CROMOPLASTE

Cromoplastele sunt plastide care conțin în exclusivitate sau preponderent pigmenți carotenoizi, care le oferă o culoare roșie sau galbenă. Pigmenții carotenoizi, sau izomeri ai acestora, sunt foarte diferiți, putând forma granule dispuse în stroma cromoplastelor sau sub formă cristalizată.

Cromoplastele sunt prezente în diferite celule ale plantelor, care cresc atât la lumină cât și la întuneric, cel mai frecvent fiind localizate în mezofilul și epiderma plantelor florilor, pericarpul frunzelor coapte și mult mai rar în organele vegetative, rădăcini, tulpini, frunze. Cromoplastele pot fi evidențiate cu ușurință în celulele plantelor de Tropaeolus majus, în fructele coapte de Sorbus domestica, Rosa canina, Solanum dulcamara, Citrullus vulgaris. Forma cromoplastelor este determinată, în ultimă instanță, de modul în care se prezintă și se distribuie pigmenții carotenoizi și xantofilieni. De exemplu, cromoplastele de Lilium (crin), sunt globulare și conțin pigmenți carotenoizi, cele din petalele de Tulipa (lalea), sunt alungite și conțin xantofilă. Cromoplastele din florile de Amaryllis sau fructele de Capsicum sp., Solanum sp., sunt fusiforme, romboide sau semilunare, iar pigmenții carotenoizi sunt uniform răspândiți. A. Fre-Wyssling și K. Mühlethaler (1965) consideră cromoplastele ca un rezultat final al procesului de îmbătrânire a plastidelor, având rol pasiv în viața celulei (Anghel I., 1979).

3.1. Morfologie și ultrastructură

Cromoplastele sunt organite înconjurate de o membrană care poate fi formată din una, două sau chiar mai multe membrane elementare, în grosime totală de 320 – 400 Å. Cromoplaste cu o singură membrană elementară se întâlnesc în celulele petalelor de Ranunculus repens, în fructele de Citrullus vulgaris, Capsicum annuum; cromoplaste cu două membrane elementare s-au evidențiat în celulele petalelor de Chrysanthemum sp.

În stroma cromoplastelor, care se caracterizează printr-o densitate electronică mică, s-au evidențiat formațiuni fibrilare (la Capsicum annuum) sau lamelare (la Citrullus vulgaris). Principalul constituent al stromei îl reprezintă globulele osmiofile în care se găsesc dizolvați pigmenți carotenoizi.

În cursul diferențierii cromoplastelor din cloroplaste are loc dezorganizarea parțială sau totală a structurilor lamelare interne, iar în locul acestora se formează globule cromolipidice.La unele specii (Chrysanthemum sp.), la sfârșitul diferențierii cromoplastelor, cristele dispar iar stroma devine fluidă. După unii cercetători, stroma este dispusă numai la periferia cromoplastelor sau printre globulele cromolipidice. (Anghel I., 1979).

Fig.3.1. Geneza cromoplastelor din celule de la Chrysantemum

(a – transformarea cloroplastelor în cromoplaste : 1 – acumularea pigmenților în globulele lipidice, 2 – distrugerea lamelelor clorofiliene și creșterea numărului de globuli pigmentari, 3 – cromoplaste adulte; b – formarea cromoplastelor din proplastide : 4 – plastidă tânără cu structură nedefinită și care deja conține globuli lipidici, 5 – acumularea a numeroși globuli pigmentari, 6 – cromoplastă adultă cu o structură identică cu cea rezultată dintr-o plastidă diferențiată).

3.2. Pigmenți caracteristici

Cromoplastele sunt plastide care acumulează pigmenți carotenoidici, colorați în galben, potocaliu sau roșu, ce dau aceste colorații în organele vegetale în care sunt prezente, precum flori, fructe sau unele rădăcini.

Datorită solubilității lor în lipide și solveții acestora, se mai numesc lipocromi și totodată reprezintă importante surse de vitamina A. Denumirea de carotenoide derivă de la numele științific al morcovului (Daucus carota) din rădăcinile căruia s-au extras pentru prima dată carotenoidele.

Din punct de vedere chimic, carotenoidele fac parte din clasa terpenoidelor, fiind formate din 8 unități izoprenoidice, cele mai răspândite fiind cele cu 40 de atomi de C (tetraterpene) și au mai multe duble legături conjugate. În structura carotenoizilor, la unul sau la ambele capete ale moleculei, pot exista și cicluri iononice sau pentaciclice.

După natura lor chimică, carotenoidele pot aparține clasei:

Hidrocarburilor – licopenul din roșii și β-carotenul din morcov

Derivaților hidroxilați – xantofile

Cetonelor – cantaxantina

Expoxizilor – violaxantina

Derivaților furanici – flavoxantina

În grupa pigmenților carotenozi și a derivaților acestora sunt incluse circa 70 de compuși care se găsesc în cromoplaste, în stare liberă, dizolvați în lipide sau cristalizați și sub formă de compuși caroteno-proteici sau glicozide carotenoidice.

În cromoplaste se observă o mare varietate de pigmenți carotenoidici, cum ar fi: licopen la roșii, capsicentina la ardeiul roșu, rodoxantina în arilul roșu de tisa, crocentina din stigmatele de șofran, taraxantina din florile de păpădie, criptoxantina din fructele de papalau, bixina din semințele de Brixa orellana.

Principala funcție a carotenoidelor din cromoplaste este aceea de a da culoare organelor în care sunt prezente, ceea ce explică marea lor varietate. Carotenoidele în stare polimerizată și oxidată, contribuie la formarea sporopoleninei din granulele de polen.

Dintre pigmenții carotenoizi cu 40 de atomi de C identificați în legume și fructe, cel mai cunoscut și răspândit este β-carotenul.

β-carotenul este alcătuit dintr-o catenă cu 11 legături conjugate și are la ambele capete câte un ciclu cu dublă legătură, denumit ciclul β-iononic. Se găsește în proporție mai ridicată în morcovi, determinând culoarea portocalie a acestora.

α-carotenul are la un capăt al catenei ciclul β-iononic, iar la celălalt capăt un ciclu α-iononic. În felul acesta, α-carotenul are în molecula sa 10 duble legături conjugate și o dublă legătură izolată. Culoarea acestui pigment este mai deschisă decât a β-carotenului.

Licopenul are catena atomilor de carbon aciclică, cu 13 duble legături în moleculă, din care numai 11 conjugate. Se găsește în proporție mare în tomate (2,8 – 4,3 mg/100 g parte edibilă), însă a mai fost identificată în circa 70 de specii de plante. Licopenul are acțiune antioxidantă, anticancerigenă, antitumorală, cancer preventivă și este un colorant foarte bun pentru unele specii de fructe (Wouter G. van Doorm and col., 2010).

3.3. Potențial metabolic

În timpul tranziției de la cloroplaste la cromoplaste, au fost conservate mai multe căi metabolice. Un exemplu este ciclul Calvin, care formează zaharuri din CO2, calea oxidativă a fosfat pentozei (OxPPP) care utilizează 6 atomi de carbon de la glucoză pentru a forma zaharuri cu 5 atomi de carbon și reducerea echivalenților, precum și mai multe aspecte din metabolismul lipidic (Fig.4.2.). Activitățile enzimelor din ciclul Calvin au fost determinate în plastidele izolate din ardei dulce. În tomatele coapte sunt active mai multe enzime din ciclul Calvin: hexokinaza, fructokinaza, fosfoglucoizomeraza, pirofosfat fosfofructokinaza, triosofosfatizomeraza, gliceraldehid 3-fosfatdehidrogenaza, fosfogliceratkinaza și glucozo 6-fosfatdehidrogenaza. Activitatea glucozo 6-fosfat dehidrogenaza (G6PDH), o componentă cheie a OxPPP, a fost în cantitate mai mare în cromoplastele tomatelor roșii coapte, decât în frunzele și fructele verzi. Analizele proteomice au demonstrat că un set complet de proteine implicate în OxPPP sunt prezente în cromoplastele izolate din tomate (Fig.4.2.).În plastidele nonfotosintetice, ciclul Calvin ar putea produce reductanți, precursori ai nucleotidelor și aminoacizi aromatici pentru a putea permite ciclului OxPPP să funcționeze optim.

Fig.4.2. Proteomul cu implicații în ciclului Calvin, în cromoplastele din tomate

Proteinele sunt indicate de pătrățelele albe din interiorul cadranelor negre și reprezentate decodul unigen SGN (Sol Genomics Network). Numerele reprezintă poziția proteinelor în ciclul Calvin.

Amidonul tranzitor se acumulează în tomatele tinere și suferă o degradare aproape completă la maturitate. De fapt, acumularea amidonului, rezultă în urma unui dezechilibru între sinteza și degradarea lui. Enzimele capabile să degradeze amidonul au fost identificate în plastidele din tomate. În plus, tomatele roșii pot sintetiza amidon pe toată perioada degradării acestuia, arătând faptul că aceste două mecanisme pot coexista. Enzimele găsite în cromoplastele tomatelor sunt: ADP-glucozo pirofosforilaza, amidon sintetaza și enzime de ramificare a amidonului. În plus, sistemul de furnizare a zaharurilor neutre pe calea biosintezei amidonului, include în totalitate transloconul glucozo-6P, care aduce zaharurile din citosol. Prezența transloconului activ de glucozo-6P, dar nu și glucozo-1P, a fost demostrată și în cromoplastele din Ranunculus acer (Piciorul cocoșului). Deși unele granule de amidon pot fi prezente în tomatele coapte, cantitatea lor este puternic redusă. Explicația cea mai probabilă este că amidonul suferă o scădere rapidă datorită degradării intense. Această ipoteză este susținută de prezența în cromoplastele din tomate, a mai multor proteine implicate în degradarea amidonului (Fig.4.3.). Deosebit de interesantă este prezența unei dikinaze glucan-apă (GWD), fosfo-glucan-dikinaza (PWD) și fosfo-glucan-fosfataza (PGP), care facilitează acțiunea β-amilazelor. Mutante ale acestor proteine acumulează cantități mari de amidon. În acord cu ipoteza de mai sus, activitatea β-amilazei a fost determinată pe parcursul coacerii fructelor de mere și pere, până în momentul dispariției amidonului. Prezența unui glucozo-translocon pentru exportul zaharurilor produse prin degradarea amidonului, reprezintă un alt suport pentru funcționarea căilor metabolice a amidonului în cromoplaste. În fructele de măsline, o expresie a genei transportoare de glucoză a fost observată la maturitate, atunci când cromoplastele au fost lipsite de amidon.

Fig.4.3. Prezentarea proteomului pentru calea de sinteză și degradare a amidonului și a transloconilor de zaharuri din cromoplastele proteome din tomate. Proteinele sunt indicate de pătrățelele albe din interiorul cadranelor negre și reprezentate de numele lor generic și de codul SGN (Sol Genomics Network). Numerele reprezintă poziția proteinelor în ciclul Calvin.

Metabolismul lipidic este, de asemenea, foarte activ în cromoplaste. În cromoplaste sunt sintetizate noi membrane din veziculele generate din membrana internă, cum ar fi cele care participă la formarea structurilor de stocare a carotenoidelor. Proteinele cheie pentru sinteza de fosfolipide, glicolipide și steroli, au fost identificate împreună cu unele proteine implicate în calea lipoxigenazei (LOX). În cromoplastele tomatelor, toate proteinele implicate în calea LOX conduc la formarea de arome volatile.

Calea shikimat, care este prezentă doar la microorganisme și plante, este o punte între metabolismul carbohidraților și cel al compușilor aromatici. Aceasta conduce la biosinteza de aminoacizi aromatici precum tirozina, triptofanul și fenilalanina. Aminoacizii aromatici derivați din această cale sunt precursori ai unui număr important de metaboliți secundari. Tirozina este un precursor al tocoferolilor și tocotrinolilor. Triptofanul este implicat în sinteza de alcaloizi indoli, care sunt esențiali pentru formarea de glucozinolaze, terpenoidaze și derivați ai triptaminei. Fenilalanina este un precursor pentru mai multe clase de flavonoide, inclusiv antociane. Aceasta este, de asemenea, un precursor pentru biosinteza de compuși volatili, care sunt importanți în aroma fructelor și mirosul florilor, eugenol, 2-fenilacetaldehidă și 2-feniletanol.

În fructele de tomate, de exemplu, 2-fenilacealdehida și 2-feniletanolul sunt formate prin intermediul fenilalanininei de către un aminoacid aromatic, precum decarboxilaza, respectiv o fenilacetaldehidă, reductaza. Cu toate acestea, nu există nici un indiciu că sinteza de metaboliți secundari derivă din calea shikimată, care are loc în cromoplaste.

În timpul coacerii fructelor, s-a observat o sinteză crescută de α-tocoferol. Biosinteza de α-tocoferol a fost localizată în învelișul membranar al Capsicum annum, și un set complet de proteine au fost prezente în cromoplastele tomatelor. Acumularea de α-tocoferol, prin protejarea membranelor lipidelor împotriva oxidării, poate contribui la întârzierea senescentă (Wanping Bian and col., 2011).

3.4. Beneficii aduse sănătății consumatorului

Carotenoidele extrase din plante, se pot utiliza frecvent ca și coloranți alimentari naturali, sau în hrana animalelor pentru că se acumulează în dermă sau dau o culoare comercială (pete de pe tegumentul de păstrăvi, pielea păsărilor devine mai galbenă), la fel și intensitatea colorării galbenușului de ou.

Una dintre principalele surse de vitamina A (sub formă de β-caroten și α-caroten), precum și de criptoxantină, este dovleacul. Astfel, 100 de grame de pulpă de dovleac asigură aproximativ 71% din necesarul zilnic de vitamina A. Studii epidermologice au arătat că o dietă bogată în vitamina A și carotenoizi este asociată cu scăderea incidenței de cancer, ateroscleroză, cataractă și degenerare maculară și conferă o protecție antioxidantă foarte eficientă.

Alimentația bogată în vitamina A protejează de apariția emfizemului pulmonar mai ales la fumători sau la cei care sunt expuși la fumatul pasiv, arată un studiu realizat la Kansas State University.

B-carotenul este un puternic antioxidant și antiinflamator, motiv pentru care protejează față de apariția complicațiilor diabetului și chiar reglează glicemia. Cercetările recente arată cum consumul de carotenoizi este invers proporțional cu rezistența la insulină și hiperglicemia.

Consumul de alimente bogate în criptoxantină, care se găsește în cantități mari în dovleac, porumb, papaya, ardei grași, roșii, mandarine, portocale și piersici, scade semnificativ riscul de cancer pulmonar, conform unui studiu publicat în septembrie 2003 în revista „Cancer Epidiology, Biomarkers and Prevention”, realizat pe 63.256 de adulți în Shanghai, timp de 8 ani, perioadă în care au fost diagnosticate 482 de cazuri noi de cancer pulmonar.

Persoanele cuprinse în acest studiu, care au avut o alimentație bogată în alimente ce conțin criptoxantină, au avut un risc de a dezvolta cancer pulmonar cu 27% mai mic decât restul persoanelor cuprinse în studiu. Chiar și fumătorii care au consumat alimente ce conțin criptoxantină, au avut un risc cu 37% mai mic de a dezvolta cancer pulmonar, decât fumătorii care au consumat preponderent alte alimente.

Din punct de vedere farmaceutic sunt importante carotenoidele ca precursori (provitamine), ai vitaminei A, altele intervin în mecanismul vederii, ca de exemplu Heleniena (dipalmitatul de luteină din petalele de crăițe, Tagetes patula) din care se prepară medicamentul Heligal.

4. CLOROPLASTE

Cloroplastele sunt cele mai răspândite plastide, fiind prezente în toate celulele organelor verzi. Cloroplastele se află în țesuturile verzi din frunze, tulpini, flori și fructe și, uneori în rădăcinile aeriene (ca la Phillodendron), sau acvatice (ca la Elodea). La microscopul fotonic, cloroplastele plantelor superioare au forma unor discuri lenticulare cu diametrul de 3-10 µ și grosimea de 1-4 µ.

La alge se observă o diversitate foarte pronunțată în privința formei si numărului de cloroplaste, aceste caracteristici fiind folosite în taxonomie. În mod frecvent, cloroplastele de la alge sunt circulare sau eliptice în celulele care conțin mai multe cloroplaste.

La algele verzi cloroplastele au formă extrem de variată (spiralată, filamentoasă, stelată etc.), fiind caracteristică pentru anumite specii și au fost denumite cromatofori. De exemplu, în celulele de Spirogyra se găsesc 1-6 cloroplaste sub formă de panglică spiralată, cu marginile puternic ondulate; Zygnema și Cosmarium conțin în fiecare celulă doi cromatofori cu aspect stelat (Zygnema) și lobat (Cosmarium); Chlorella și Chlamydomonas au un singur cromatofor sub formă de cupă care înconjoară nucleul. Celulele de Draparnaldia și Ulothrix conțin o plastidă circulară cu marginile mai mult sau mai puțin dințate; în celulele de Mougeotia, Mesocarpus se află cromatofori sub forma unor lame perforate; Oedogonium și Cladophora conțin un cromatofor sub forma unui cilindru perforat care-i oferă un aspect reticulat. La algele brune, plastidele (feoplastele) sunt mici și lenticulare, iar rodoplastele de la algele roșii au formă de panglică sau lenticulară.

Cloroplastele din celulele unor specii de alge verzi conțin una sau mai multe structuri proteice denumite pirenoizi, în jurul cărora se depozitează granule de amidon. La unele alge verzi, cum este Chlamydomonas sp., pirenoizii sunt înconjurați de granule de amidon. La algele brune pirenoizii sunt extraplastidiali, iar la algele roșii sunt intraplastidiali dar nu sunt implicați în elaborarea amidonului.

Numărul de cloroplaste la o celulă este variabil, fiind caracteristic pentru o anumită specie și tip de țesut. Algele verzi unicelulare conțin 1-2 cloroplaste. La numeroase specii, și în special la algele verzi și diatomee, numărul, forma și mărimea sunt caractere de specie și se folosesc drept criterii în taxonomie și pentru identificarea gradului de poliploidie.

Numeroase specii de alge, în special formele mobile, au pe suprafața cromatoforului o pată roșie-deschisă de pigment carotenoid, care reprezintă un fotoreceptor organic. În țesutul asimilator de la algele brune și roșii se găsește un număr mai mare de plastide; unele pteridofite, cum este Selaginella, au o singură plastidă în celulele meristematice și 1-2 în celulele diferențiate. Briofitele au un număr nedefinit de cloroplaste elipsoidale sau lenticulare, cu excepția speciilor genului Anthoceros, la care fiecare celulă conține numai o plastidă în formă de cupă. La plantele superioare numărul de cloroplaste este variabil. În celulele palisadice de Ricinus sunt circa 36 și ajung la peste 100 la alte specii (Anghel I., 1979).

4.1. Morfologie și ultrastructură

Cloroplastele din plante sunt înconjurate de două membrane, exterioară și interioară. Acestea sunt separate de un spațiu intermembranar. În interiorul plastidului se află stroma, care este un fluid apos (Figura 4.4.). Stroma conține mai multe membrane ER-like (asemănătoare cu membrana reticulului endoplasmatic) numite tilakoide. Spațiul dintre două membrane tilakoide se numește lumen tilakoid. În multe plante, tilakoidele produc membrane suprapuse numite grane (Figura 4.4.). Mecanismul fotosintetic se află atât în tilakoide cât și în grană.

Cloroplastele mai conțin și picături de material osmofilic legate de un singur strat de lipide (jumătate de membrană). Aceste structuri sferice se numesc plastoglobuli (Figura 4.4.B). Aceștia sunt rezultatul degradării membranei și conțin lipide și proteine. Granulele de amidon se formează în matrice (Figura 4.4.A) și nu sunt legate de nici o membrană.

Fig. 4.4. Structura cloroplastelor. (A) În acest cloroplast sunt prezentate amiloplastele indicate de săgețile scurte. Stroma este lichidul din interiorul învelișului interior. În aceasta se află stroma tilakoidelor (indicată de săgețile lungi subțiri), care este o structură ER-like dublumembranară. Aceste tilakoide sunt conectate la grană (săgețile lungi groase), care sunt stive de tilakoide pliate (www.faculty.uca.edu). (B) Un cloroplast cu plastoglubuli mici (organisme ce conțin în principal lipide și proteine), indicate de săgeți subțiri. În alte cloroplaste și gerontoplaste, acești plastoglubuli pot avea un diametru mult mai mare (www.botit.botany.wisc.edu).

Stromulele (tubulii umpluți ai stromei) sunt proeminențe mobile și interconexiuni între cloroplastele plantelor, de obicei cu un diametru de 0,35 – 0,85 mm și cu o lungime variabilă. Acești tubuli lungi și subțiri nu conțin membrane tilakoide sau clorofilă. Stromulele permit transferul de molecule, la fel de mari ca ribulozo-1,5-bifosfat carboxilaza/oxidaza (Rubisco; 560 kDa) între cloroplastele interconectate. În plus, stromulele măresc suprafața învelișului cloroplastelor pentru transport și le ancorează în punctele corecte de fixare din celula vegetală. Ultrastructura altor plastide din plante au fost discutate în detaliu într-un studiu realizat de Wise (2007) și Pyke (2009).

În contrast cu cloroplastele din plantele multicelulare, cloroplastele din mai multe celule ale algelor, atât la speciile care sunt simbionte cât și la cele care nu sunt, conțin structuri numite pirenoide, care sunt implicate în formarea amidonului. În plus, în celulele algelor simbionte, tilakoidele care formează grana de obicei lipsesc, iar plastoglobulii sunt fie puțini, fie lipsesc (Wouter G. van Doiorm and col., 2010).

Fig. 4.5. Ultrastructura cloroplastului

(1 – membrana externă, 2 – spatiul intermembranar, 3 – membrana internă, 4 – stroma, 5 – lumen, 6 – membrana tilacoidală, 7 – granum, 8 – tilacoidul intergranar, 9 – amidon, 10 –ribozom, 11 – ADN plastidial, 12 – plastoglobulă).

Fig.4.6. Cloroplast complet dezvoltat

4.2. Pigmenți caracteristici

În cloroplastele plantelor se găsește clorofila b, împreună cu clorofila a. Clorofila a și b, dizolvate în eter sulfuric, prezintă un spectru de absobție cu două maxime : unul în albastru violet, care variază între 420 și 462 nm, altul în roșu, cuprins între 665 și 645 nm. O frunză sau o suspensie de cloroplaste in vivo prezintă un maximum de absorbție în roșu în apropiere de 681 nm. Se consideră că pigmenții clorofilieni se combină cu o proteină, ceea ce explică marea lor stabilitate. În soluție clorofila se alterează foarte repede prin fotooxidare. Deplasarea benzilor de absorbție a clorofilei se datorește deplasării moleculelor de pigmenți care sunt dispuse una lângă alta în structura plastidelor.

Prin fragmentarea cloroplastelor de la alge și plante superioare și a cromatoforilor bacteriilor fotosintetizante din genul Rhodospirillium, s-a reușit localizarea pigmenților clorofilieni.

S-a constatat că pigmenții clorofilieni sunt localizați la nivelul structurilor lamelare sau veziculare. Plastidele din plantele etiolate, lipsite de structuri lamelare, nu conțin clorofilă. Odată cu diferențierea lamelelor, prin transferarea plantelor la lumină are loc apariția clorofilei.

La algele roșii și albastre-verzi, pe lângă clorofilă s-au evidențiat și alți pigmenți fotosintetizanți ca acceptori de fotoni primari a căror energie de excitare este ulterior transferată clorofilei a. Acești pigmenți, solubili în apă, sunt cromoproteine, ale căror grupări prostetice sunt ficobiline similare pigmenților biliari.

4.3. Potențial metabolic

Fotosinteza este procesul fundamental și unic în natură, prin care plantele verzi degajă oxigenul și sintetizează substanțele organice din carbonul absorbit sub formă de dioxid de carbon, înglobând în ele energia solară fixată cu ajutorul pigmenților asimilatori.

Ecuația fundamentală a fotosintezei este următoarea:

CO2 + H2O + Săruri minerale + Lumină = Substanțe organice + O2 + Energie chimică

Energia chimică provine din transformarea energiei luminoase de către celulele vegetale care se înmagazinează ca energie potențială în substanțe organice sintetizate.

Importanța fotosintezei:

asigură circuitul materiei și energiei în natură

purifică atmosfera, deoarece utilizează dioxidul de carbon rezultat din respirația viețuitoarelor și degajă oxigen

este singura cale cunoscută de absorbție și înmagazinează energiei solare în biomasă

Fotosinteza se desfășoară în toate organele plantelor care conțin pigmenți verzi: frunze, tulpini, ramuri tinere, sepale, fructe necoapte, etc.

Etapele fotosintezei sunt :

fotofosforilarea

fotoliza apei

fixarea și tranformarea CO2 în glucide

Fotofosforilarea reprezintă formarea ATP-ului (din ADP și fosfat anorganic – Pi) și NADPH + H+ ( din NADP+ și H rezultat din fotoliza apei).

2 H2O + 2 NADP+ + 2 ADP + 2 Pi + lumină → 2 NADPH + 2 H+ + 2 ATP + O2

Fig.4.7. Fotofosforilarea

Mecanismul fosforilării se poate realiza ciclic sau aciclic. În foforilarea ciclică, lumina absorbită de clorofilă determină eliminarea unui e- cu potențial energetic mare, care va fi captat de substanțe cu structură chinonică și prin intermediul citocromilor „b6” și „f” din cloroplaste se reîntoarce cu un potențial energetic mai mic în clorofilă, simultan cu formarea ATP-ului.

Fotoliza apei reprezintă descompunerea apei în H2 și O2 cu ajutorul luminii și clorofilei, proces precedat de activarea clorofilei prin absorbția energiei luminoase când devine instabilă și elimină surplusul de enrgie sub formă de e- cu potențial energetic mare. Reacția de fotoliză este sursa principală de oxigen în natură.

Fixarea și tranformarea CO2 în glucide pornește de la esterul ribulozo-1,5-difosforic.

Procesul de formare a glucidelor este un proces ciclic, esterul regenerându-se prin cicluc Calvin-Benson. Se observă că triozele servesc atât la sinteza glucozei cât și la refacerea esterului ribulozo-1,5-difosforic.

Fig.4.8. Ciclul Calvin-Benson

Primul produs organic al fotosintezei este acidul 3-fosgogliceric din care se formează ulterior:

aldehidă 3-fosfoglicerică → ester-fructozo-1,6-difosforic → glucide

prin decarboxilare și defosforilare → CH3COOH → acizi grași → lipide

aldehidă 3-fosfoglicerică care prin reducere formează glicerol

aminoacizi și ulterior protide, din cetoacizii ce apar în metabolismul glucidic prin aminare reductivă sau transaminare.

4.4. Beneficii aduse sănătății consumatorului

Culoarea verde, caracteristică plantelor, se datoreazaă pigmentului numit clorofilă, care se găsește din abundență în frunzele plantelor. Clorofila a fost numită și „raza solară lichidă” pentru considerentul că absoarbe energia soarelui. Clorofila absoarbe lumina atât de puternic, încât maschează alte culori mai puțin intense.

Clorofila are o misiune în detoxifierea internă a organismului, având astfel importanță în menținerea funcțiilor vitale și a sănătății.

Detoxifierea internă reprezintă totalitatea proceselor care neutralizează, transformă și elimină substanțele nocive (dăunatoare) din organism, prin unul sau mai multe din următoarele căi:

respiratorie 

gastrointestinală 

urinară 

tegumentară și glandulară

limfatică

Clorofila și derivații acesteia denumiți clorofiline (sărurile de sodiu și/sau de cupru ale clorofilei)  au capacitatea de a forma complecși moleculari stabili cu anumite substanțe chimice nocive, unele cu acțiune cancerigenă, precum hidrocarburile policiclice aromatice găsite în fumul de țigară, unele amine heterociclice găsite în carnea prajită și aflatoxina B1. Legătura dintre clorofila sau clorofiline și aceste substanțe cu potențial cancerigen se referă la capacitatea de curațire a acestora din urmă din tractul gastrointestinal cu ajutorul clorofilei și , reducându-se astfel cantitatea de subsanțe nocive ce pot provoca cancer care ajunge la țesuturi.

Clorofilinele sunt unele dintre substanțele cu cel mai pronunțat caracter antioxidant care au fost studiate pâna acum. Cercetătorii au demonstrat că, substanțele de tip clorofilina pot neutraliza in vitro acțiunea oxidanților. Rezultate din studiile efectuate pe animale sugerează faptul că suplimentarea dietei cu clorofilă poate scădea stresul oxidativ indus de substanțele chimice carcinogene și de radiații.

Extern, acționează ca dezodorizant, dezinfectant și tonic cutanat iar intern, stimulează respirația, ajută la epurarea reziduurilor și contribuie la combaterea anemiei.

1. Anemia

Băuturile bogate în clorofilă reprezintă unul dintre cele mai bune stimulente pentru refacerea globulelor roșii. Datorită compoziției foarte asemănătoare cu aceea a hemoglobinei, precum și prin faptul că aceste băuturi se absorb cu extreme de mare ușurință în organism, un tratament de 1-2 luni cu “elixir verde” poate modifica radical în bine starea celor care suferă de anemie. Se mai recomandă consumul de frunze de țelină, curele cu verdețuri de 2-3 săptămâni, băutura din mlădițe de grâu sau ovăz, frunzele de pătrunjel și salată consumate ca atare sau sub formă de macerat.

2. Intoxicațiile lente datorate alimentației greșite, colita de putrefacție

Mâncarea gătită, precum și alimentele “moderne” (conservate, cu conservanți sau coloranți sintetici) se descompun (mai plastic spus “se strică”) în intestin mai repede decât vegetalele naturale. În intestin, carnea putrezește și se degradează mai repede decât orice alt aliment. Pentru cei mai mulți dintre oameni, după câteva zeci de ani de viață colonul este deja mult încărcat cu sedimente ce nu pot fi eliminate, constituind o continuă sursă de toxicitate a corpului. Verdețurile, germenii, legumele și fructele proaspete, precum și “băuturile verzi”,care sunt adevărate concentrate de clorofilă, prin acțiunea lor drenoare și prin efectele antiseptice și antiputride stopează și elimină problemele generate de o astfel de alimentație.

3. Afecțiunile ficatului (hepatita cronică și acută, ciroza hepatică)

Se recomandă extractele lichide (realizate prin metoda prezentată mai sus) din urzică și păpădie. Conținutul în fier și potasiu al acestora, precum și valențele lor regenerante vor determina efecte notabile în cazurile unor sechele post-hepatice. Alte plante bogate în clorofilă indicate în aceste boli sunt: brusturele, sparanghelul, frunzele de țelină.

4. Mirosurile corporale neplăcute

Sunt eliminate cu rapiditate prin programul rapid de purificare a organismului. Dintre cele mai eficiente surse de clorofilă sunt mlădițele proaspete de cereale, în special cele de grâu și ovăz. Acestea se recoltează atunci când au dimensiunea de 10-15 cm și se prepară în modul prezentat mai sus.

5. Tulburările de ciclu menstrual, eczeme care apar pe fondul dezechilibrelor endocrine, acneea în toate formele. În special ciclul menstrual lung și dureros, hemoragiile uterine și tulburările gonadelor și cortico-suprarenalelor care au tendința de a reveni și de a rezista tratamentelor clasice, pot fi mult ameliorate prin consumarea zilnică a unei cantități de 1-1,5 litri de macerat vegetal proaspăt timp de minim 3 săptămâni. Ca o alternativă, se recomandă realizarea unei cure pe bază de sucuri și crudități, cură ce trebuie să dureze o perioadă de minim 2-3 luni de zile.

6. Gastrita, ulcerul gastric și alte afecțiuni ale stomacului

Studii recente realizate în Germania pe zeci de pacienți suferinzi de ulcer gastric au evidențiat faptul că extractele cu clorofilă pot accelera foarte mult procesul de regenerare și însănătoșire. Diminuarea considerabilă a durerilor s-a produs într-un interval cuprins între 24 și 72 de ore de la administrarea extractelor, iar la 78% dintre pacienții ce au participat la experiment, ulcerele s-au vindecat complet într-o perioadă cuprinsă între 2 și 7 săptămâni de la începerea tratamentului intensiv.

7. Rănile și infecțiile cu vindecare dificilă

Încă din anii ’50, numeroase laboratoare testau capacitatea clorofilei de a distruge prompt germenii nedoriți, constatând că bacteriile nu pot supraviețui în contact cu clorofila. S-a remarcat că folosirea extractelor cu clorofilă, inclusiv în uz extern conduce la reducerea durerii, diminuarea inflamațiilor și eliminarea mirosurilor neplăcute cauzate de unele infecții (mai ales cele dentare). Cercetările în această direcție au evidențiat efecte notabile în ameliorarea infecțiilor vaginale, rectale, în tratarea sinuzitelor cronice și acute și chiar în infecțiile unor țesuturi din vecinătatea inimii.

“Băuturile verzi”, chiar dacă nu sunt recomandate ca remediu unic, pot ajuta la refacerea mai rapidă a țesuturilor și pot accelera mult vindecarea lor. Rezultate notabile au fost obținute cu frunzele proaspete de pătrunjel, țelină, varză de Bruxelles, sucul de orz verde (preparat din plantă atunci când aceasta atinge înălțimea de 20-30 de cm). În 1980, dr. Chiu Nan Lai, de la Universitatea din Texas menționa într-un raport faptul că atât clorofila, cât și alți nutrienți care se găsesc în alimentele verzi reprezintă veritabile bariere de protecție împotriva chimicalelor toxice și radiațiilor. El a constatat că extractele realizate din mlădițe de grâu și alte vegetale de culoare verde, stopează efectele mutagene șigeneratoare de cancer ale mai multor substanțe chimice recunoscute ca fiind carcinogene. În plus, cercetări mai recente realizate în mai multe laboratoare din lume au evidențiat faptul că vegetalele verzi (proaspete) și extractele naturale bogate în clorofilă reprezintă adevărați agenți anti-oxidanți care diminuează într-o măsură considerabilă efectele agresiunilor produse asupra organismului de către poluare, fumul de țigară, alimente prăjite excesiv, etc.

III. STUDIU EXPERIMENTAL

5. MATERIALE ȘI METODE

5.1. Materiale vegetale

Materiale necesare: pătlăgea roșie (Lycopersicum esculentum), morcov (Daucus carota), tubercul de cartof (Solanum tuberosum), porumb (Zea mays), grâu (Triticum aestivum), frunze de ficus (Ficus elastica), frunze de garoafă (Dianthus sp.), sfeclă roșie (Beta vulgaris), alge: Elodea canadensis, Chlorella, Spirogyra, iederă (Hedera helix), curpen de pădure (Clematis vitalba).

5.2. Instrumentar de laborator și sticlărie de laborator

lame și lamele de sticlă

bisturiu

brici anatomic

pensă

sticle de ceas

ac spatulat

lamă de ras

pipetă

vas Petri

măduvă de soc

5.3. Reactivi (coloranți)

clorură de zinc iodată

floroglucină

acid clorhidric concentrat

reactiv Genevez

alcool etilic absolut

alcool etilic 90%, 80%, 70%, 55%, 35% ,15%

cloroform

parafină

fixator Carnoy

alcool-cloroform 2:1 ,1:1, 2:1

cloroform-parafină 1:1

albumină-glicerinată

xilol

xilol-alcool 2:1 , 1:1

balsam de Canada

violet de gențiană sau hematoxilină

5.4. Aparatură și echipamente de laborator

Aparatul de laborator utilizat pentru vizualizare și fotografierea preparatelor :

Microscop optic cu cu contrast de faza Olympus Model CKX41

Fig.5.1. Microscop optic cu contrast de fază Olympus Model CKX41

Secționarea materialului vegetal, în scopul relizării preparatelor permanante, s-a realizat cu:

Microtom Slee Mainz CUT 6062

Fig.5.2. Microtom Slee Mainz CUT 6062

5.5. Metode de obținere a preparatelor

Preparate proaspete (provizorii)

Preparate permanente (durabile)

5.5.1. Preparatele proaspete

Tehnica obținerii preparatelor provizorii necesită un volum de muncă mai mic decât în cazul obținerii preparatelor durabile. Preparatele provizorii au în general durabilitate mai mică; ele sunt necesare analizelor rapide, care cer o orientare de ansamblu asupra elementelor structurale.

Materiale necesare : material proaspăt sau conservat (fixat) în prealabil în alcool etilic 70% ,cum ar fi: frunze sau fragmente de frunze sau rădacini, tulpini, etc.Mai puțin utilizate ca fixator (conservant) sunt: formol (în proporție de 8 părți apă și una formol) sau lichidul glicerinat (părți egale de alcool, glicerină pură și apă.

Modul de lucru: Organele sau fragmentele de organe conservate sau proaspete, cu simetrie radială, ca rădăcina și tulpina, se taie cu bisturiul în fragmente de 10-20 mm, dacă dorim să efectuăm secțiuni transversale și de 5-7 mm, dacă dorim să obținem secțiuni longitudinale. în cazul frunzelor (de exemplu, frunza de cireș, spanac, sfeclă, etc.) se detașează cu foarfecele un fragment din lamină, paralel cu nervurile secundare.

Materialul de analizat (rădăcină, tulpină, frunză) se secționează cu ajutorul briciului sau cu o lamă de ras și al unui fragment de măduvă de soc.

Măduva de soc poate fi utilizată uscată în cazul când secționăm material proaspăt sau îmbibată cu alcool etilic 70% în cazul materialului conservat. Înainte de a o folosi, se taie cu bisturiul în fragmente de 20-30 mm. Fiecare fragment de măduvă se secționează apoi în lung cu o lamă de ras (nu cu bisturiul) în două. jumătăți egale, între care se introduce materialul de secționat.

Cu ajutorul briciului anatomic sau al unei lame de ras, putem efectua trei tipuri de secțiuni :

transversale, când briciul trece perpendicular pe axa organului.

longitudinal-radiale, (longitudinal-mediane), când planul secțiunii, paralel cu axa, trece prin centrul organului respective.

longitudinal-tangențiale (tangențiale), când planul secțiunii, paralel cu axa, nu atinge centrul organului respectiv.

Pentru secționarea unei frunze fragmentul decupat din lamina frunzei se introduce între jumătățile de soc, suprapunându-1 cu nervura peste axa longitudinală a măduvei de soc. Se prinde apoi măduva de soc între degetele mâinii stângi, iar cu briciul, ținut în mâna dreaptă, se efectuează secțiuni.

În cazul când efectuăm secțiuni transversale prin organe cilindrice consistente (rădăcini sau tulpini), procedăm astfel: cu ajutorul unui ac spatulat sau bisturiu se face în lungul axei longitudinale a fiecărei jumătăți de soc câte un șănțuleț care să nu depășească jumătate din grosimea materialului de secționat. Se introduce fragmentul de organ în șănțulețul unei jumătăți și se acoperă cu cealaltă jumătate. Apoi, cu degetele mâinii stângi, se prinde socul în care se află acum materialul de secționat, iar cu briciul, ținut în mâna dreaptă, se fac secțiuni.

În cazul secțiunilor longitudinale, se așază materialul orizontal între cele două jumătăți ale măduvei de soc; vom avea grijă să nu apăsăm puternic pe cele două jumătăți ale măduvei de soc în care a fost introdus materialul vegetal.

Secționarea materialului introdus în măduva de soc se face cu ajutorul briciului sau cu o lamă de ras.

Secționarea materialului cu ajutorul briciului

În cazul când avem la dispoziție un brici, se procedează astfel: briciul se deschide sub un unghi de 90° sau 180°, se prinde cu degetele mâinii drepte de locul de fixare a lamei briciului în mîner, în așa fel încât degetul mic să se fixeze pe gâtul lamei (tăișul fiind către observator), iar celelalte degete pe partea opusă acestuia.

Înainte de a începe secționarea materialului, lama briciului se umectează cu apă distilată (sau cu apă de la robinet) în vederea reținerii secțiunilor pe brici sau lamă. Pentru o mai mare stabilitate în secționare, sprijinim coatele pe masa de lucru sau le ținem apropiate de corp.

Se apropie baza tăișului de măduva de soc, apoi se secționează măduva și materialul, trăgând tăișul de la baza varfului. Prima secționare trebuie făcută dintr-o singură mișcare, în așa fel încât secțiunea să nu fie oblică. Este foarte important să obținem secțiuni fine, uniforme si perfect perpendiculare sau paralele cu axa longitudinală a materialului. De aceea, ținem măduva de soc în poziție verticală în așa fel încât lama briciului să treacă prin materialul de secționat, paralel cu suprafața mesei de lucru.

Cu ajutorul unei pense sau ac spatulat se culeg secțiunile de pe lama briciului și se pun într-un vas Petri sau sticlă de ceas, în care se află apa. În vederea selectării celor mai bune se scot cate 4-6 secțiuni din vasul în care au fost puse și se așează pe o lamă, într-o picătură de apă. Secțiunile care nu sunt corespunzătoare se îndepărtează cu ajutorul unui ac spatulat sau simplu.

Uneori cele mai fine secțiuni rămase pe lamă se rulează; derularea se face în mediu lichid, cu ajutorul unui ac simplu sau spatulat.

Secțiunile selectate se javelizează se spală bine, se colorează, se spală de colorant cu apă distilată, apoi se introduc într-un lichid (respectiv mediul în care se montează secțiunile); în cazul preparatelor proaspete, acesta poate fi apă distilată, de robinet, apă glicerinată sau glicerină.

Pentru pregătirea preparatelor proaspete se pun pe lamă 1-2 picături din lichidul pe care îl avem la dispoziție. În acesta se introduc secțiunile, după care prindem lamela de două laturi opuse, o înclinăm până atinge mediul de includere și o lăsăm să cadă ușor peste secțiuni.

Dacă între lamă și lamelă se formează bule de aer, acestea se elimină bătând ușor lamela cu acul spatulat (pensă, băț de chibrit, etc). Eventuala apă în exces se absoarbe cu o fâșie de hârtie de filtru sau sugativă.

Preparatul astfel pregătit se analizează la microscop.

Dacă se evaporă apa în timpul analizei preparatului, se completează adăugând cu pipeta 1-2 picături la una din marginile lamelei.

Cromoplaste la Daucus carota

Materiale necesare : rădăcini tuberizate de morcov, lame și lamele de sticlă, brici anatomic, vas Petri cu apă.

Mod de lucru : se fac secțiuni transversale foarte fine prin rădăcina tuberizată de morcov. Imediat după secționare se pun în vasul Petri cu apă. După ce am efectuat un număr mai mare de secțiuni, alegem pe cea mai fină, de dimensiunile unei lamele și o punem pe lamă într-o picătură de apă. Se acoperă cu lamela. Cu obiectivul mic prindem o porțiune de țesut cât mai clară, se analizează cu obiectivul de 40.

Amiloplaste

Mod de lucru: Cu ajutorul unui bisturiu sau ac spatulat se rade puțin din endospermul de analizat (grâu, porumb, orz, ovăz, fasole etc.) sau din țesutul de depozitare (cartof). Masa obținută se pune pe lamă într-o picătură de apă. Masa de amidon să nu fie prea densă pentru că granulele se suprapun și îngreunează analiza.

La unul din capetele lamei punem o picătură de iod în iodură de potasiu, apoi cu ajutorul lamelei sau al acului spatulat se aduce spre masa de amidon o picatură din colorant. Se amestecă bine cu materialul până când se colorează omogen, după care se acoperă cu lamela. Excesul de colorant se îndepărtează cu hartie de filtru.

Colorarea nu trebuie să fie intensă, deoarece aceasta ar îngreuna analiza granulelor de amidon. Colorarea materialului se poate face și altfel: ținem o fișie de hîrtie de filtru pe una din laturile lamelei, în timp ce pe latura opusă punem o picătură de colorant puternic diluat.

Hârtia de filtru absoarbe apa de sub lamelă, care este înlocuită de soluția de iod în iodură de potasiu. Aceasta pătrunde sub lamelă colorând în albastru granulele de amidon.

Fig.5.3. Diferite granule de amidon:

simple: 1 și 4 – Solanum tuberosum; 5 – la Triticum aestivum; 6 – Phaseolus vulgaris; 7 – Zea mays; semicompuse: 2 și 3 – Salanum tuberosum;

compuse: S – Oryza sativa; V – Avana sativa; gp – granule parțiale; se – straturi concentrice;

h – hil.

Cromoplaste la Lycopersicum esculentum

Materiale necesare: fructe coapte de pătlăgea, lame și lamele de sticlă, brici anatomic, ac spatulat.

Mod de lucru: Pătlăgeaua roșie se spală cu apă de la robinet; cu ajurorul unui bisturiu se îndepărtează peretele extern pe o anumită porțiune, după care se face o secțiune foarte fină prin partea cărnoasă.

Se pune secțiunea pe lamă, într-o picătură de apă, peste care se așează lamela. La microscop vom observa un număr mare de celule mezo-endocarpice, în majoritate izolate, care conțin câte un nucleu, numeroase cromoplaste și granule de amidon.

Cloroplastele sunt cele mai răspândite în celulele plantelor superioare și sunt de formă diferită: lenticulară, de clopot, panglică în spirală, stea, etc.

La Chlorella sp. are formă de ceașcă, la Chlamydomonas sp. – de clopot, la Closterium sp. – de semilună, la Spirogyra sp. – de panglică în spirală, la Zygnema sp. – de stea, la Cladophora sp. – de cilindru perforat sau reticulat, la Ulotrix – de inel, etc.

Mod de lucru : Pentru evidențierea cloroplastelor se fac preparate proaspete din algele respective și se analizează la microscop, mai întâi cu obiectivul 10 , apoi cu 40.

5.5.2. Preparate durabile (permanente)

Preparatele durabile sunt necesare analizelor care se desfășoară pe o perioadă mai lungă de timp, în vederea evidențierii amănuntelor structurale, pe secțiuni fine sau foarte fine și seriate.

Pentru efectuarea preparatelor durabile se folosește la includerea secțiunilor una din substanțele: gelatină glicerinată, glicerină, soluție saturată de levuroză (zaharoză) sau balsam de Canada. Cea mai frecvent folosită în montarea preparatelor permanente este gelatină glicerinată.

5.5.3. Preparate durabile montate în gelatină glicerinată.

Cu ajutorul unui bisturiu sau ac spatulat desprindem din gelatină glicerinată un bloculeț cu latura de 3 – 4 mm (mai exact, în funcție de mărimea secțiunii și de dimensiunile lamelei) și se pune în mijlocul unei lame curate. Lama cu bloculețul de gelatină se trece de câteva ori prin flacăra unei lămpi de spirt până la completa topire a gelatinei.

Pentru a se evita formarea bulelor de aer în secțiuni procedăm la înlocuirea apei cu glicerină.

Pentru aceasta vom trece succesiv materialul printr-o soluție apoasă de glicerină, în următoarele proporții: 1:3, 1:2, 1:1 și glicerină pură. Din glicerină pură secțiunile colorate și spălate se trec pe lamă în gelatină glicerinată topită, folosind o pensă sau un ac spatulat.

În cazul când apar bule de aer în gelatina glicerinată topită, acestea vor fi înlăturate prin atingerea lor cu vârful unui ac simplu înroșit la flacăra unei lămpi de spirt. După toate aceste operații, peste secțiunile montate în gelatină glicerinată se pune o lamelă și se lutează .

După o altă variantă, gelatina glicerinată sub formă de bloculeț se așează pe lamelă. Aceasta se încălzește treptat la flacăra unei lămpi de spirt până când gelatina devine lichidă. Ca și în varianta precedentă, trebuie să evităm fierberea, pentru a nu provoca formarea bulelor de aer.

Secțiunile colorate, spălate și îmbibate cu glicerină se așază pe lamă. Lamela cu gelatină topită se așează cu multă atenție peste secțiuni, în așa fel încât să le acopere complet.

Se recomandă o atenție sporită la topirea gelatinei, atât pe lamă cât și pe lamelă, în sensul că încălzirea trebuie întreruptă exact în momentul când gelatina s-a topit complet. În acest fel evităm fierberea și carbonizarea gelatinei, care duc la formarea bulelor de aer și a unor impurități.

O altă variantă pe care o recomandăm constă în folosirea gelatinei topite în prealabil într-un vas cu apă fierbinte sau la termostat .

5.5.4. Preparate durabile montate în glicerină.

După colorare secțiunile sunt spălate cu apă distilată sau cu apă de la robinet și se așează pe lamă. Peste secțiuni se pun una, două picături de glicerină, după care se aplică lamela. Pentru păstrare îndelungată, preparatele montate în glicerină se lutează.

5.5.5. Preparate durabile obținute prin împarafinare

În secționarea materialului cu mâna, se obțin secțiuni mai mult sau mai puțin fine. Când lucrările de laborator cer secțiuni foarte fine și în serie, se recurge la includerea materialului în parafină și secționarea lui cu ajutorul microtomului.

Includerea în parafină se desfășoară în următoarele etape caracteristice:

fixarea materialului

deshidratarea

clarificarea

împarafinarea

includerea

Indiferent de substanța folosită pentru includere, înainte de a începe operațiile enumerate, materialul proaspăt, care urmează a fi inclus, trebuie fixat într-un lichid special (fixator).

Fixarea

Materialul se fixează imediat după ce a fost detașat de plantă, în mod practic se procedează la introducerea organului vegetal pe care dorim să-l secționăm într-o eprubetă sau sticluță în care se află un lichid fixator. Ca fixatori cei mai des utilizati sunt : Carnoy, Navașin, alcool 70%.

Înainte de utilizare, pe fiecare sticluță se lipește o etichetă pe care se notează (cu creionul negru), denumirea plantei, locul, data și ora recoltării, fixatorul utilizat. Apoi se închide recipientul cu un dop de plută sau cauciuc. Se recomandă să se lucreze cu organe mici. În cazul când acestea sunt mari se taie în mai multe fragmente.

Fixarea se face în mod obișnuit la temperatura de 18 – 20°C în laborator sau direct pe teren, iar durata fixării este în funcție de mărimea organului. În general, fixarea materialului vegetal nu trebuie să depășească 24 de ore. În urma fixării cu un fixator adecvat, procesele celulare vitale sunt întrerupte, păstrându-se nealterată structura constituenților celulari.

Spălarea

Materialul fixat în Carnoy se trece prin băi succesive de:

alcool de 90%,

alcool absolut de două ori

alcool absolut – cloroform

parafină

Materialul fixat în alcool 70% se trece :

în alcool 80%,

în alcool 90%

în alcool 95%,

alcool absolut de două ori

Materialul fixat în Navasin se spală în apă de robinet, procedându-se la scoaterea cu o pensă a materialului vegetal din sticluța în care a fost fixat și se pune într-un vas perforat, pe care îl închidem cu un dop de plută. În lipsa unui astfel de vas, se pune într-un săculeț de tifon pe care îi legăm la gură. Vasul perforat sau săculețele care conțin materialul fixat se pun într-un vas mai mare peste care se lasă să curgă apa de robinet timp de 24 de ore. Prin spălare se elimină excesul de fixator care ar împiedica o bună adsorbție a colorantului pe organitele celulare respective.

Totalitatea operațiilor ce urmează spălării trebuie să țină seama de următoarele două considerente:

– materialul de secționat este îmbibat cu apă

– pentru a-1 include în parafină trebuie înlocuită apa din țesuturi cu o substanță perfect miscibilă cu parafina.

Etapele prin care trece materialul până la includerea lui în parafină sunt:

Deshidratarea

Procesul de deshidratare constă în scoaterea apei din țesuturi cu ajutorul alcoolului etilic în concentrații crescânde și succesive.

Mod de lucru: Cu o pensă se scoate materialul din vasul perforat sau din săculețele de tifon și se pune într-un flacon (eprubetă), în care se află alcool etilic cu concentrație de 15%. Flaconul se închide apoi cu un dop de plută și se lasă până când materialul devine submers.

După aceea, cu o pipetă sau prin decantare, înlăturăm alcoolul de 15% și adăugăm peste materialul vegetal din flacon, alcool 35%. Flaconul se astupă ca și în cazul precedent și se lasă până când materialul vegetal devine submers.

Se repetă operația de înlocuire și adăugare a alcoolului de concentrație crescândă trecând materialul prin alcool 55%, 70%, 80%, 90%, 95%, alcool absolut de două ori.

Materialul vegetal

alcool etilic 15%

Repaus ( până materialul devine submers)

Înlocuire cu alcool 35%

Repaus ( până materialul devine submers)

Înlocuire alcool 35%

Repaus ( până materialul devine submers)

Treceri succesive ale materialului vegetal, timp de 5-10 min,

prin băi de alcool 55%, 70%, 80%, 90%, 95%, alcool absolut de două ori

Tratarea cu alcool – cloroform

Această etapă constă în tratarea cu cloroform în scopul clarificării și înlocuirii alcoolului intrat în material, înlocuirea alcoolului se face cu cloroform capabil să formeze un amestec cu alcoolul și permite dizolvarea și pătrunderea parafinei în țesuturi.

Mod de lucru : Alcoolul absolut se elimină cu ajutorul unei pipete sau prin decantare. Peste materialul vegetal se adaugă un amestec de alcool absolut – cloroform în proporție de 2 :1 (două părți alcool absolut și o parte cloroform) și se lasă în sticluța astupată cu dop de plută, până când materialul devine submers.Se înlocuiește apoi amestecul de alcool – cloroform (2:1) cu un amestec de alcool absolut și cloroform în proporție de 1:1.

materialul vegetal

alcool absolut-cloroform 2:1

repaus ( până materialul devine submers)

înlocuire cu alcool absolut-cloroform 1:1

înlocuire cu alcool absolut-cloroform 1:2

cloroform pur de două ori

Includerea în parafină

Cuprinde două faze:

impregnarea (îmbibarea)

montarea în parafină.

Impregnarea (îmbibarea) cu parafină.

Pentru impregnarea materialului vegetal cu parafină sunt necesare următoarele operații:

se înlătură cu ajutorul unei pipete amestecul de cloroform pur

se pune peste material un amestec de cloroform și parafină supraîncălzită în proporție de 1:1 și se lasă 12 – 48 ore (după mărimea materialului), la temperatura camerei (vasul în care se găsesc secțiunile se închide cu dop de plută)

se scoate dopul și se introduce vasul (sticluța) în termostat la temperatura de topire a parafinei, unde se lasă timp de 2 – 4 ore (după mărimea materialului) pentru impregnarea completă cu parafină a materialului respectiv

cu pensa încălzită la flacăra unei lămpi de spirt, se scoate materialul din amestecul de cloroform-parafină 1:1 și se pune în alt vas (vas mic Petri) cu parafină curată supraîncălzită și se lasă în termostat de la 15 min până la câteva ore (după mărimea materialului).

Vas cu materialul vegetal

Cloroform pur

Cloroform-parafină supraîncălzită 1:1

Repaus 12-48 h, t° camerei

termostatare la 57°C, 2-4 h

includere în parafină pură,

termostatare timp de 15 min pâna la câteva ore

Montarea în parafină. ( includerea propriu-zisă).

Pentru includerea materialului în parafină ne servim de o băiță din porțelan sau confecționată din carton, hârtie , etc .

Includerea în parafină presupune succesiunea de operații:

se unge cu glicerină, în strat foarte subțire partea interioară a băiței

se încălzesc fundul și părțile laterale trecându-le de câteva ori prin flacăra unei lămpi de spirt sau se pune băița pe o platină șofantă (placă încălzitoare) sau încălzită cu ajutorul unei lămpi de spirt sau a unui bec Bunsen.

se toarnă în băiță parafină curată topită

cu pensa încălzită la flacăra unei lămpi de spirt (de fiecare dată) se ia materialul și se pune distanțat pe fundul băiței

se trece cu pensa încălzită (sau un ac spatulat încălzit) de câteva ori în jurul materialului orientat, pentru a topi complet parafina și a se înlătura eventualele bule de aer care s-ar fi format la introducerea materialului

se suflă ușor pe suprafața parafinei până când începe să se solidifice, mai exact până când se formează o pojghiță

se prinde cu două degete băița de pe placa încălzitoare și se introduce cu partea bazală (circa ¼ din înățimea ei) într-un cristalizor cu apă rece de la robinet

se scufundă complet băița în apa cristalizor, netezind concomitent cu degetul suprafața parafinei printr-o ușoară presare.

se trece cristalizorul cu băița sub un robinet și se lasă să curgă apa rece într-un jet moderat până la completa întărire a parafinei.

se scoate baița din apă și se desprinde din ea blocul de parafină prin introducerea unui ac spatulat la colțurile lui.

Un bloc de parfină omogenă, bun de secționat, nu trebuie să fie opac, trebuie să nu conțină bule de aer și să nu fie străbatut de vine albicioase.

Blocul de parafină cu material vegetal inclus se păstrează în plicuri etichetate până în momentul secționării lui.

Secționarea la microtom a materialului împarafinat și lipirea secțiunilor pe lame.

Operația de secționare a blocurilor de parafină în care am inclus materialul analizat cuprinde succesiv:

1). tăierea blocului.

2). secționarea propriu-zisă.

1). Tăierea blocului presupune urmatoarele operații:

cu ajutorul unui bisturiu sau a unei lame de ras se taie blocul în bloculețe care conțin materialul cu parafina în jur.

se ia un bloculeț cu material vegetal inclus, se trece de câteva ori cu fața opusă celei pe care este situat materialul prin flacăra unei lămpi de spirt și se lipește apoi printr-o ușoară apăsare de portbloculeț.

cu un ac spatulat încălzit se topește puțin din parafina de la baza bloculețului, pentru o mai bună fixare a bloculețului de portbloculeț.

Se înțelege că fixarea bloculețului se va face avându-se în vedere direcția în care se va secționa :

dacă îl lipim vertical vom efectua secțiuni transversale

dacă bloculețul va fi lipit pe laturi (culcat), vom obține secțiuni longitudinale

Operația de fasonare în vederea secționării se realizează cu ajutorul unui bisturiu bine ascuțit tăiem parafina de pe portbloculeț sub forma unei prisme a cărei suprafața de secționare trebuie să fie pătrată sau dreptunghiulară, după foma materialului inclus.

Subliniem că este foarte important ca cel puțin două din marginile de secționat să fie paralele cu muchia cuțitului microtomului.

În acest fel marginile secțiunilor se vor lipi între ele și vom obține o bandă (panglică) de secțiuni successive.

Dacă suprafața de secționare a bloculețului este de formă geometrică neregulată sau cilindrică, secțiunile nu se lipesc între ele, fiind nevoiți să ne ocupăm de fiecare în parte, riscând în același timp să pierdem unele stadii intermediare.

2). Secționarea propriu-zisă a materialului vegetal

Calitatea secționării este de cea mai mare importanță . De aceea secționarea materialului vegetal trebuie făcută cu multă atenție.

Se fixează port-bloculețul la microtom, apoi se orientează cu ajutorul șuruburilor ce permit înclinații ale port-bloculețului în așa fel încât suprafața de secționat să fie perfect paralelă cu lama cuțitului. Apoi se stabilește grosimea în microni la care dorim să efectuăm secțiunile, după care începem secționarea materialului cu ajutorul microtomului.

Prin învârtirea roții microtomului materialul se taie în secțiuni succesive lipite între ele și sub formă de panglică.

Utilizarea microtomului CUT Slee Mainz 6062

Conexiunea electrică:

Conectare la sursa de curent a cablului de alimentare N/20 al microtomului și apăsarea comutatorul principal N/21 pentru a porni funcționarea motorului.

Baza suportului de cuțit: se realizează prin introducerea bazei suportului de cuțit în ghidaj și apoi fixarea mânerul N/8.

Suportul lamelor detasabile/ suportul standard de cutit:

Introducerea suportului lamelor detașabile în ghidajul bazei suportului de cuțit și apoi fixațrea mânerului N/9. Reglarea unghiului prin dechiderea articulația N/9, rotirea butonul negru N/31 și apoi închiderea articulației N/31.

Introducerea cuțitului:

Deschiderea cele două suruburi negre, introducerea cuțitul printr-o parte și fixare apoi prin înșurubarea a celor două suruburi negre. Reglarea înălțimii poate fi realizată folosind șuruburile N/32. Montarea lamei detașabile se realizează prin slăbirea mânerului N/11 și introducerea acesteia între plăcile N/10 și apoi fixarea mânerul N/11 la loc.

Introducerea casetei în clema universală

Deschiderea clemei universale prin mutarea într-o parte a pârghiei N/3, introducerea casetei și mutarea pârghiei N/3 inapoi la locul inițial.

Reglarea orientării. Slăbirea pârghiei N/4 pentru orientarea clemei universale a casetei. Rotirea pârghiei N/5 către dreapta sau stânga pentru reglare, iar pârghia N/6 trebuie rotită pentru reglarea mai sus sau mai jos. După ce am ajuns la poziția corectă, fixam articulația N/4.

Fig. 5.4. Designul microtomului și componentele implicate în diferite etape de lucru

Introducerea probei în clema standard ca obiect Introducerea probei în clema standard de obiect și apoi fixarea acesteia prin rotirea șurubului N/30.

Apropierea specimenului

Primul pas este acela de slabire a pârghiei N/8 și mutarea bazei suportului de cuțit către probă. Dacă cuțitul microtomului este aproape de probă, se va proceda la închiderea pârghiei N/8.

Avansarea fină se realizează prin folosirea butoanele N/13 și N/16 pentru a muta specimenul către cuțitul/lama microtomului, iar N/17 trebuie folosit pentru apropierea finală (încet).

Reglarea grosimii de feliere se face prin apasarea M-N/14, iar pentru a face reglarea necesară, apăsare + sau – pentru a ajunge la grosimea dorită.

Reglarea grosimii de taiere Pentru reglarea și pentru a ajungea la forma dorită a specimenului, apăsăm + N/18 sau – N/15.

Tăiere motorizată cu microtomul 6062 Prin apăsarea butonul verde N/28 pentru conectarea motorul.

Selectarea vitezei între 1 și 99 rot/min

Apăsare buton N/25 pentru a reglarea vitezei de tăiere și apăsare simultană și + N/18 sau – N/15 pentru a afișarea vitezei de tăiere dorită.

Avansarea rapidă a probei

Pentru o apropiere finală rapidă a specimenului către cuțitul sau lama microtomului,se realizează prin apăsarea butonului N/26 (viteza cea mai mare), apoi apăsare N/24 și în acelasi timp butonul M-N/14. Când proba a fost feliată în întregime, se întrerupe apăsarea butonului M-N/14, iar microtomul se va întoarce la viteza normală de tăiere.

Tăierea cu ajutorul microtomului

Selectarea funcției de oprire la partea superioară N/25, oprire la partea inferioară N/26 sau o singură tăiere N/27, apoi apăsarea butonului N/24 pentru a porni tăierea probei și pentru oprirea tăierii, apasarea tot a butonului N/24.

Fragmentele de panglică de pe lama cuțitului sunt luate cu o pensulă umectată în apă distilată și puse pe o lamă de sticlă în prealabil unsă cu albumină glicerinată. Ele vor fi așezate într-o ordine firească, pe mai multe șiruri paralele, pe o suprafață cât să le cuprindă lamela.

În privința efectuării panglicii din secțiuni succesive există două posibilități:

fie că obținem benzi lungi pe care le așezăm pe o hârtie neagră și apoi le fragmentăm proporțional cu mărimea lamelei.

fie că efectuăm de la început fragmente de bandă alcătuite dintr-un număr constant de secțiuni, proporționale cu suprafața lamelei.

În timpul secționării se pot întâmpla unele situații nedorite, cum ar fi:

imposibilitatea de a obține o panglică din secțiuni successive.

ruperea secțiunilor din cauza parafinei prea uscate, în care caz la secționarea bloculețului se produce un zgomot caracteristic.

încrețirea secțiunilor sau obținerea unor secțiuni cu goluri de parafină.

În cazul când secțiunile nu se lipesc într-o succesiune firească, aceasta se datorează suprafeței de tăiere a bloculețului, fie parafinei prea tari, casante. În această situație se va încălzi mai bine camera de lucru sau vom apropia de microtom o lampă electrică.

Dacă această măsura nu este suficientă, se va mări grosimea secțiunilor (dacă timpul de cercetare permite acest lucru).

Ruperea secțiunilor se poate datora materialului de cercetat, care a fost ținut prea mult timp în fixator, în alcool absolut sau în termostat. Adesea se poate ca temperatura din termostat să fie mult prea mare decât punctul de topire al parafinei, producând același efect; în acest caz se recomandă mărirea grosimii secțiunilor și încălzirea camerei de lucru, așa cum am specificat mai sus.

Încrețirea secțiunilor este determinată fie de dimensiunile prea mari ale suprafeței de secționare a bloculețului de parafină, fie din cauza secțiunilor prea subțiri. Acest neajuns poate fi remediat prin încălzirea ușoară, treptată a lamei pe care a fost lipită panglica, sau prin mărirea grosimii de secționare.

Prezența golurilor în interiorul materialului indică o împarafinare prost făcută. La secționare, țesutul din apropierea acestor goluri se rupe. Se recomandă în acest caz umplerea golurilor cu parafină topită sau cel mai indicat reîmparafinarea materialului respectiv.

Lipirea secțiunilor pe lamă

Secțiunile obținute, izolate sau în serie se lipesc pe lamă în ordinea în care au fost făcute, pentru a putea urmări sau reconstitui ușor structura firească a organului secționat. Pentru ca secțiunile să se lipească de lamă se folosește în mod curent albumina glicerinată.

Aceasta se utilizează în felul următor:

pe o lamă curată și bine ștearsă punem cu ajutorul unei baghete de sticlă o picătură de albumină glicerinată

picătura se întinde imediat cu degetul într-un strat foarte subțire, pe întreaga suprafață a lamei

Albumina din acest amestec are rolul de a lipi secțiunile pe lamă (la cădură, albumina se coagulează fixând pe sticlă secțiunile), iar glicerina împiedică uscarea lichidului de pe lamă.

Pe lama asfel pregătită se așează secțiunile în așa fel încât începutul fiecarui șir să fie așezat în stânga noastră, pentru a ști întotdeauna care este succesiunea lor normală.

Fragmentele de panglică vor fi așezate pe lamă în funcție de mărimea lamelelor pe care le avem la dispoziție, astfel încât în final secțiunile să fie complet acoperite de lamelă.

Pentru întinderea panglicii ne folosim de o pensulă și un ac spatulat. Vom avea grijă să nu atingem decât marginile parafinei și nu secțiunile din ea. Tot cu ajutorul unei pensule umectate apropiem cât se poate secțiunile sau fragmentele de panglică pentru a nu lăsa spații între ele.

După aceea, pe două laturi ale suprafeței ocupate de panglică cu secțiuni, se pun 3 – 4 picături de apă distilată. Apa pătrunde între lamă și parafină și întinde secțiunile, fiind posibilă orientarea definitivă a acestora.

Se trece apoi lama de câteva ori prin flacăra unei lămpi de spirt, având grijă să nu se topească parafina. Secțiunile se întind perfect în apă ușor încălzită, iar după evaporarea ei, acestea vor adera mai bine la lamă.

Lamele astfel pregătite sunt lăsate câteva zile să se usuce complet, într-un loc ferit de praf. În acest timp se evaporă complet apa, iar secțiunile rămân lipite definitive lipite de lamă.

Deparafinarea secțiunilor

După uscarea lamelor, secțiunile sunt opace, deoarece sunt îmbibate cu parafină.

Pentru clarificarea lor se procedează astfel:

se trece fiecare lamă prin flacăra unei lămpi de spirt, atât cât să se topească parafina din jurul secțiunilor

se lasă să se răcească, după care lamele se pun într-un vas cu xilol pentru deparafinat;

se lasă 1 – 2 ore, timp în care xilolul dizolvă parafina din jurul și din interiorul secțiunilor.

Menționăm că trecerea prin flacăra unei lămpi de spirt a lamelor cu secțiunile uscate se recomandă mai ales în cazul unor secțiuni groase. Această operație duce la scoaterea parafinei din țesuturi și la lipirea perfectă a secțiunilor.

Cu o pensă se scoate câte o lamă deparafinată și se trece în vasul cu xilol-alcool 1:1 unde se lasă câteva minute, apoi în alcool absolut. Această operație se face în vederea înlocuirii xilolului cu alcool absolut.

Trecerea lamei prin flacăra

răcire

deparafinare în xilol pur 1-2 h

introducerea lamelor în xilol-alcool 1:1 5-10 min,

alcool absolut

Colorarea secțiunilor

Dacă colorantul se află în soluție alcoolică, de exemplu 70%, lamele cu secțiuni vor trece din alcool absolut în alcool 85%, 80%, 70%, după care sunt trecute direct în colorant.

Dacă colorantul pe care-1 folosim este în soluție apoasă, lamele cu secțiuni trec printr-o serie de etape cu scopul de a le hidrata mai întâi și apoi de a le colora.

În acest caz, pentru hidratare, se utilizează bateria de hidratare care conține seria de alcool etilic în concentrații diferite, descrescânde. Se lucrează succesiv, cu câte o lamă, în felul următor: cu o pensă se scoate lama din xilol-alcool 1:1 și se introduce și se scoate de câteva ori în vasul cu alcool absolut. Se procedează la fel trecând prin alcool 95%, 80%, 70%, 55%, 35%, 15%, apă curată.

Din apă curată, lamele cu secțiuni se pot colora în funcție de scopul cercetării cu violet de gențiană, fuxină, etc. În cazul colorării cu violet de gențiană se pune lama (cu secțiunile spre observator) pe o hârtie de filtru, sugativă sau hârtie simplă. Se adaugă apoi peste secțiuni 1- 2 picături de violet de gențiana sau fuxină. După câteva minute se spală, prin scufundări și scoateri succesive într-un vas cu apă.

Deshidratarea

După colorare, urmează spălarea lamelor cu apă de la robinet, se procedează la deshidratare, în vederea montării lor în balsam de Canada. Pentru aceasta preparatele se trec prin seria de alcool 15% -95%, apoi alcool absolut de două ori.

Înlocuirea alcoolului cu xilol

Reprezintă ultima etapă până la montarea în balsam de Canada .

Pentru înlocuirea alcoolului etilic cu xilol, se utilizează bacteria cu alcool – xilol astfel: lamele scoase din alcool absolut se trec prin vasele cu alcool absolut – xilol 2:1, apoi xilol – alcool absolut 1:1 și xilol pur ( de două ori).

Montarea în balsam de Canada

Cu ajutorul unei pense se scoate lama din xilol pur și se pune pe o hârtie de filtru sau sugativă. Apoi cu o baghetă de sticlă se pun 1 – 2 picături de balsam de Canada, după care se acoperă cu lamela, se șterge lama și se notează și se lasă câteva zile să se usuce.

5.5.6. Tehnica adaptată pentru preparate permanente

Obținerea de preparate permanente prin tehnica adaptată se realizează prin parcurgerea următoarelor etape:

A. Fixarea, prepararea și secționarea probelor

Fixarea în formaldehidă 40% timp de 3 zile.

Trecerea în alcool 87% pentru deshidratare timp de 1 zi.

Introducerea în acetonă. Prima baie 20 minute. A doua baie tot 20 minute la temperatura de 600C care are rolul de a înlocui alcoolul absolut.

Introducere în baia de benzen pentru clarificare, 3 băi în cursul unei zile.

Tamponare pentru eliminarea resturilor de benzen.

Introducerea în băile de parafină – 4 băi. Se realizează 3 băi a 2 ore și cea de a patra timp de 24 ore la termostat la temperatura de 560C.

Includerea în parafină între barele de metal LEUCKART, și adăugare în parafină o mică cantitate (5-10%) ceară de albine care are rolul de a îmbunătăți consistența blocului și va permite o bună secționare. Suportul de sticlă trebuie încălzit, de asemenea și pensa cu care se lucrează. După solidificare se răcește sub jet de apă.

Secționarea blocului mare cu piese în blocuri mai mici și fasonarea marginilor.

Pregătirea lamelelor și aplicare unei picături de albumină Mayer și întinderea acesteia pe toată

suprafața lamei. Albumina Mayer se realizează din 50 g albuș de ou + 50g glicerină și 1 g salicilat de sodiu dizolvat în puțină apă distilată. La final se filtrează. Se mai poate folosi o soluție apoasă de gelatină 0,1 – 0,2%.

Secționarea la microtom.

Se alege într-un vas cu apă încălzită din banda obținută la microtom porțiunile cu cele mai

puține striuri. Se lasă ca secțiunile să se întindă. Manipularea se face cu ajutorul unor ace spatulate. Se manipulează astfel ca secțiunile alese să se fixeze bine pe lamă.

Se lasă lamele la uscat la termostat la temperatura de 37°C timp de 24 ore.

B. Colorarea cu violet de gențiană/ fuxină

Deparafinarea se realizează prin trecerea lamelor cu fețele libere alipite prin băi succesive de:

xilol pur 5-10 minute

xilol-alcool 1:1, 5-10 minute

xilol-alcool 1:2, 5-10 minute

alcool absolut de două ori, 5-10 minute

Colorarea Dacă colorantul se află în soluție alcoolică, de exemplu 70%, lamele cu secțiuni vor trece din alcool absolut în alcool 85%, 80%, 70%, după care sunt trecute direct în colorant.

Colorare cu violet de gențiană după trecere prin băi succesive de

alcool 85%

alcool 80%

alcool 70%

Aplicarea colorantului, repaus 1-2 minute, urmată de spălare și tamponare.

Deshidratarea

După colorare, urmează spălarea lamelor cu apă de la robinet, se procedează la deshidratare, în vederea montării lor în balsam de Canada. Pentru aceasta preparatele se trec prin seria de alcool 70%, 80%, 95%, apoi alcool absolut de două ori.

Înlocuirea alcoolului cu xilol.

Reprezintă ultima etapă până la montarea în balsam de Canada .

Pentru înlocuirea alcoolului etilic cu xilol, se utilizează bacteria cu alcool – xilol astfel: lamele scoase din alcool absolut se trec prin vasele cu alcool absolut – xilol 2:1, apoi xilol – alcool absolut 1:1 și xilol pur ( de două ori), fiecare pentru 5-10 minute.

Montarea în balsam de Canada

Cu ajutorul unei pense se scoate lama din xilol pur și se pune pe o hârtie de filtru sau sugativă.

Apoi cu o baghetă de sticlă se pun 1 – 2 picături de balsam de Canada, după care se acoperă cu lamela, se șterge lama și se notează și se lasă câteva zile să se usuce.

5.6. Extracția clorofilei

Materiale vegetale:

Iederă (Hedera helix)

Garoafă (Dianthus sp.)

Ciuma apelor (Elodea canadensis)

Fig.5.6. Hedera helix

1. Iedera este un arbust agățător cu o tulpină foarte lungă care poate ajunge și până la 20 m lungime. Frunzele iederei sunt acoperite de peri, sunt rotunde, groase și lucioase iar florile sunt cărnoase, mici și au o culoare galben-verzuie.  Această plantă face parte din familia araliaceelor și crește spontan în locurile cu o umiditate crescută și cu soluri umbroase. 

Printre afecțiunile împotriva căreia luptă iedera se numără crampele abdominale, tusea, inflamațiile, arsurile sau luxațiile. Iedera este eficientă și pentru boli de ficat sau pentru boli de urechi.

Fig.5.7. Dianthus sp.

2. Garoafa este o plantă erbacee aparținând familiei Caryophyllaceae. Tulpina ajunge la 1 metru înălțime, are frunzele înguste și ascuțite dispuse în opoziție și flori ce pot avea o gamă amplă de culori. Din fericire, petalele de la orice garoafă parfumată, după ce li s-a îndepărtat partea de la baza florii care este puțin amăruie, pot fi adăugate la salatele de fructe sau la prăjiturile cu fructe, la sandwich-uri, supe, sosuri, sau pot fi folosite pentru a face siropuri florale, oțet, lichior sau vin. Mirosul puternic picant-dulce este folosit în săpunuri și parfumuri. 

Fig.5.8. Elodea Canadensis

Elodea canadensis este o plantă perenă, submersă, dar uneori și plutitoare, cu tulpina ramificata. Frunzele sale sunt de culoare verde intens și sunt mici, ovale și dispuse câte trei în verticil pe tulpină. Florile sunt mici, albe și plutesc la suprafața apei.

Elodea canadensis se utilizează în scopuri ornamentale, pentru a îmbunătăți calitatea apei, este o sursă de hrană pentru păsări de apă, castori.

Reactivi

Acetonă 85%

Eter

Sulfat de sodiu (Na2SO4)

Extracția clorofilei

Materialul de analizat se cântărește (extracția s-a realizat dintr-un gram de produs vegetal), se mojarează (se adaugă nisip de cuarț) și apoi se adaugă acetonă 85% și se continuă mojararea până ce țesutul este măcinat. Conținutul din mojar se transferă din pâlnia Buchner și se filtrează la vid. Repetați procedura până când țesutul este lipsit de culoarea verde și spălările sunt incolore. (Este recomandabil să se reia reziduul cel puțin o dată cu acetonă nediluată și apoi să se adauge la sfârșit H2O suficientă pentru a aduce concentrația de acetonă la 85%). Atunci când extracția este completă, din filtrat se pipetează o porțiune de 25-50 mL în pâlnia care conține aproximativ 50 mL eter. Se adaugă H2O cu atenție până când este evident că toti pigmenții solubili în grăsime au intrat în stratul eteric. Se îndepărtează stratul apos. Stratul eteric din pâlnie se spală cu cca. 100 mL H2O. Se continuă spălarea soluției de eter până când toată acetona este eliminată (5-10 spălări), apoi se transferă soluția de eter la balon cotat de 100 ml, se diluează la volum și se agită.

Determinarea spectrofotometrică

60 mL din soluția de eter care conține pigmentul se tratează cu un vârf de spatulă de Na2SO4 anhidru într-un pahar Berzelius. După limpezire, se decantează soluția eterică și se citește extincția la 660 și 642,5 nm. Dacă este necesar, soluția eterică se diluează cu eter anhidru astfel încât extincția să aibă valoarea de 0,2-0,8 la lungimea de undă utilizată (valoarea optimă este aproximativ 0,6 la 660 nm). Instrumentul se etalonează cu solventul folosit pentru fiecare lungime de undă (660,0 și 642,5 nm).

Metoda de calcul a concentrației de clorofilă

Calculul clorofilei totale și a componentelor a și b (mg/l):

Clorofila totală = 7,12 A660 + 16,8 A642

Clorofila a = 9,93 A660 – 0,777 A642

Clorofila b = 17,6 A642 – 2,81 A660

Capitolul 6. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Plastidele sunt organite specifice celulei vegetale, incolore (leucoplastele) sau colorate (cloroplastele și cromoplatele), totalitatea lor reprezentând plastidomul celular. Varietatea plastidelor se datorează următorilor factori:

–    structura genetică a speciei care determină formarea unui anumit tip de plastide;

–    stadiul de diferențiere celulară;

–    mediul exterior care poate induce formarea unui anumit morfotip plastidial.

De obicei, într-o celulă se află un singur tip de plastide, deoarece condițiile genetice și ecofiziologice sunt egale. Urmărind evoluția plastidelor în micromediul celular se poate afirma ca există numai un singur tip de plastide care se prezintă sub aspecte diferite și se pot transforma unele în altele.

Cromoplastele se formează ca rezultat al acumulării carotenoizilor în proplastide, în leucoplaste sau în cloroplastele îmbătrânite, când începe a se distruge clorofila și crește conținutul de carotenoizi. Cromoplastele din celulele rădăcinii de morcov se formează din proplastide.

6.1. Evidențierea cromoplastelor

Am realizat o serie de preparate microscopice proaspete între lamă și lamelă, în vederea evidențierii cromoplastelor la Daucus carota, Lycopersicum esculentum, Beta vulgaris și am obținut următoarele imagini :

Fig.6.1. Cromoplaste la Daucus carota

Fig.6.2. Cromoplaste la Daucus carota

În Fig.6.1. și Fig.6.2. obținute prin secțiuni fine din rădăcinile tuberizate de morcov, se observă celule poligonale, parenchimatice în care se află numeroase cromoplaste de formă aciculară, sferică sau paralelipipedică și sunt bogate în pigmenți carotenoizi și cantofile care le conferă culoarea galben-portocalie.

La sfecla roșie (Beta vulgaris) se observă cromoplaste uriașe, care ocupă aproape tot volumul celular, colorate intens în roșu-violet, datorită pigmenților antocianici acumulați (Fig.6.3 și Fig.6.4.).

Fig. 6.3. Cromoplaste la Beta vulgaris

Fig. 6.4. Cromoplaste la Beta vulgaris

La Lycopersicum esculentum (Fig.6.5. și Fig.6.6.) cromoplastele sunt mici, roșii-portocalii, de formă sferică sau ovoidă și conțin licopen sau caroten, în funcție de gradul de coacere al fructului.

Fig.6.5. Cromoplaste la Lycopersicum esculentum

Fig.6.6. Cromoplaste la Lycopersicum esculentum

La Lycopersicum esculentum am realizat și preparate permanente prin tehnica adaptată și în urma vizualizării la microscopul cu contrast de fază OLYMPUS CKX41 am obținut imagini mai clare, în care cromoplastele sunt mult mai evidente, forma lor fiind mai clară. (Fig.6.7., Fig.6.8. și Fig.6.9. )

Fig.6.7. Cromoplaste la Lycopersicum esculentum

Fig.6.8. Cromoplaste la Lycopersicum esculentum

Fig.6.9. Cromoplaste la Lycopersicum esculentum

Evidențierea amiloplastelor

Pentru evidențierea amiloplastelor am realizat preparate proaspete între lamă și lamelă la Solanum tuberosum, Zea mays, Triticum aestivum, Pisum sativum și în urma vizualizării la microscop am obținut următoarele imagini:

Fig.7.1. Granule de amidon la Solanum tuberosum

Amidonul care se formează în cloroplaste este cunoscut sub denumirea de amidon autohton. Cea mai mare cantitate de amidon se găsește însă în organele plantelor (semințe, tulpini și frunze normale sau metamorfozate etc). Acesta este amidonul de rezervă. Forma pe care o îmbracă amidonul de rezervă este aceea de grăuncioare, forma acestora fiind caracteristică fiecărei specii de plantă.

Fig.7.2. Granule de amidon la Solanum tuberosum

Granulele de amidon din tuberculii de cartof sunt ovale, mari, cu hil sferic, foarte mic, aproape punctiform și excentric. Straturile mai întunecate, care alernează cu cele mai deschise la culoare, conțin o cantitate mare de apă (Fig.7.1. și Fig.7.2.).

La porumb (Zea mays), granulele de amidon sunt mai mici, poligonale, cu hilul stelat, lobat, așezat în centrul granulului. Striurile concentrice sunt mai puțin evidente, iar granulele au tendința de a se grupa în conglomerate. (Fig.7.3.).

Fig.7.3. Granule de amidon la Zea mays

Fig.7.4. Granule de amidon la Triticum aestivum

La grâu (Triticum aestivum) în Fig.7.4., granulele sunt sferice, cu hilul sferic așezat central.

La mazăre (Pisum sativum) se văd granule de forme variate: elipsoidale, ovale, mai mult sau mai puțin sferice sau chiar neregulate. Hilul este alungit și ramificat, împărțind granulele în “lobi” sau sectoare (Fig.7.5.).

Fig.7.5. Granule de amidon la Pisum sativum

Din preparatul permanent la Solanum tuberosum realizat prin tehnica adaptată se observă mult mai clar forma ovală a granulelor de amidon și hilul sferic al acestora (Fig.7.6.).

Fig.7.6. Granule de amidon la Solanum tuberosum

Evidențierea cloroplastelor

Pentru evidențierea cloroplastelor am realizat preparate proaspete între lamă și lamelă la plante inferioare : Spirogyra sp., Cladophora sp. (alge), Elodea canadensis (plantă acvatică) și plante superioare: Dianthus sp., Hedera helix, Clematis vitalba, Ficus elastica și le-am analizat la microscop cu obiectivul de 40, obținând următoarele imagini:

Fig.7.7. Cloroplaste la Spirogyra sp.

Algele sunt plante inferioare, organisme fotosintetizatoare care posedă pigmenți clorofilieni, dar care sunt stocați în organite speciale – cromatofori – asemănătoare cloroplastelor de la plantele superioare, dar cu forme diferite (spiralată, panglică, ceașcă sau cupă, scară, etc.). Cromatoforii pot avea central, o formațiune specifică, pirenoidul care este echivalentul centrelor catalitice din membrana tilacoidală a cloroplastelor de la plantele superioare.

Dintre alge, am selectat ca reprezentative pentru ecosistemele locale (bălțile Dunării, lunca Siretului, etc.), algele pluricelulare Spirogyra sp. și Cladophora sp. La Spirogyra sp. cloroplaste au formă de panglică dispusă în spirală, cu îngroșări din loc în loc (pirenoizii). (Fig.7.7., Fig.7.8., Fig.7.9. și Fig.8.1.).

Fig.7.8. Cloroplaste la Spirogyra sp.

Fig.7.9. Cloroplaste la Spirogyra sp.

Fig.8.1. Cloroplaste la Spirogyra sp.

La Cladophora sp. care este tot o algă pluricelulară, cu tal ramificat am observat cloroplaste cu formă de cilindru masiv, perforat și foarte bogat în clorofilă (Fig.8.2., Fig.8.3., Fig.8.4. și Fig.8.5.). În contrast cu cloroplastele din plantele multicelulare, cloroplastele din mai multe celule ale algelor, atât la speciile care sunt simbionte cât și la cele care nu sunt, conțin structuri numite pirenoide, care sunt implicate în formarea amidonului.

Fig.8.2. Cloroplaste la Cladophora sp.

Fig.8.3. Cloroplaste la Cladophora sp.

Fig.8.4. Cloroplaste la Cladophora sp

Fig.8.5. Vârf de tal la Cladophora sp cu numeroase cloroplaste

La plantele superioare cloroplastele au structură tipică. La Elodea canadensis (Fig.8.6. și Fig.8.7.) în toate organele există un parenchim acvifer, care asigură flotabilitatea organelor vegetale submerse, deoarece Elodea este o plantă acvatică. Cloroplastele sunt numeroase, dispuse periferic, sub pereții celulari pentru a avea acces imediat la radiațiile luminoase și a facilita captarea acestora. Ele au formă sferică și execută miscări intracelulare, în jurul vacuolelor.

Fig.8.6. Cloroplaste în mezofil foliar la Elodea canadensis

Fig.8.7. Cloroplaste parenchim acvifer la Elodea canadensis

În urma vizualizării la microscop a preparatelor proaspete cu Elodea canadensis, am constatat existența unor peri pe suprafața epidermei (Fig.8.8. și Fig.8.9.).

Fig.8.8. Peri la Elodea canadensis

Fig.8.9. Peri la Elodea candensis

La plantele superioare numărul de cloroplaste este variabil, de exemplu, în celulele palisadice de Ricinus sunt circa 36 și ajung la peste 100 la alte specii. Spre deosebire de plantele inferioare, cloroplastele din plantele superioare nu conțin pirenoide (structuri care sunt implicate în formarea amidonului).

La plantele superioare, forma cloroplastelor este în general sferică (Fig.9.3. și Fig.9.4.), ovală (Fig.9.1. și Fig.9.2.) , lenticulară sau discoidală. Uneori cloroplastele au aspect de halteră cu partea mediană gâtuită.

Cloroplastele sunt mai mari la plantele crescute la umbră, dar și conținutul lor de clorofilă este mai mare comparativ cu indivizii crescuți la lumină. Cloroplastele din plantele superioare au dimensiuni mult mai mici spre deosibire de plantele inferioare,

Fig.9.1. Cloroplaste la Clematis vitalba

Fig.9.2. Cloroplaste la Dianthus sp.

Fig. 9.3. Cloroplaste la Hedera helix

Fig.9.4. Cloroplaste la Ficus elastica

Extracția clorofilei

Prin extracție cu acetonă 85% dintr-un gram de material vegetal s-au obținut următoarele cantități de extract de clorofilă filtrat: 78 mL pentru Dianthus sp., 52 mL pentru Elodea candensis și 60 mL pentru Hedera helix.

Tabel 6.1. Determinarea cantitativă a extractului de clorofilă din diferite surse vegetale

Pentru toate extractele clorofiene obținute, din diferite surse vegetale s-a măsurat spectrofotometric absorbanța la lungimile de undă de 660 nm, respectiv 642 nm.

Tabel 6.2. Absorbanța determinată spectrofotometric

Pe baza valorilor obținute spectrofotometric și utilizând formulele de calcul de mai jos, s-a evaluat clorofila totală, respectiv raportul dintre clorofilele a și b :

Clorofila totală = 7,12 A660 + 16,8 A642

Clorofila a = 9,93 A660 – 0,777 A642

Clorofila b = 17,6 A642 – 2,81 A660

Calculul clorofilei totale, a clorofilei a și a clorofilei b la cele 3 materiale vegetale :

Dianthus sp.

Clorofila totală = 7,12 0,789 + 16,8 0,276 = 5,617 + 4,636 = 10,253

Clorofila a = 9,93 0,789 – 0,777 0,276 = 7,834 – 0,214 = 7,619

Clorofila b = 17,6 0,276 – 2,81 0,789 = 4,856 – 2,217 = 2,640

Elodea candensis

Clorofila totală = 7,12 0,256 + 16,8 0,092 = 1,822 + 1,545 = 3,367

Clorofila a = 9,93 0,256 – 0,777 0,092 = 2,542 – 0,071 = 2,470

Clorofila b = 17,6 0,092 – 2,81 0,256 = 1,619 – 0,719 = 0,9

Hedera helix

Clorofila totală = 7,12 0,916 + 16,8 0,331 = 6,521 + 5,560 = 12,081

Clorofila a = 9,93 0,916 – 0,777 0,331 = 9, 095– 0,257 = 8,838

Clorofila b = 17,6 0,331 – 2,81 0,916 = 5,825 – 2,573 = 3,278

În urma calculării clorofilei totale, a clorofilei a și respectiv, a clorofilei b (pe baza absorbanței), la extractele realizate dintr-un gram de material vegetal, cele mai mari cantități de clorofilă au fost înregistrate de Hedera helix (clorofilă totală: 12,081 mg/L, clorofila a: 8,838 mg/L, clorofila b: 3,278 mg/L), urmat îndeaproape de Dianthus sp. (clorofilă totală: 10,253 mg/L, clorofila a: 7,619 mg/L, clorofila b: 2,640 mg/L) și pe ultimul loc aflându-se Elodea candensis (clorofilă totală: 3,367 mg/L, clorofila a: 2,470 mg/L, clorofila b: 0,9 mg/L).

Tabel 6.3. Valorile clorofilelor a și b obținute din 1 g material vegetal

Fig.10. Determinarea cantitativă a raportului clorofilă a:b dintr-un gram material vegetal

Tabel 6.4. Valori ale clorofilei obținute din 1 g material vegetal

Fig.11. Determinarea cantitativă a clorofilelei totale la extractul obținut dintr-un gram

material vegetal

Capitolul 7. CONCLUZII

Prin analiza unui număr mare de surse vegetale și efectuarea de preparate proaspete, respectiv preparate permanente și vizualizarea acestora la microscop, am evidețiat diferite tipuri de plastide în celulele vegetale.

Plastidele sunt organite specifice regnului vegetal și conferă celulelor, respectiv organismelor care le dețin, capacitatea de fotosinteză, reacție unică în natură, ce convertește energia luminoasă în energie chimică și prin care se asimilează carbonul anorganic, din CO2, în carbon organic din structura compușilor glucidici.

Au fost utilizate metode moderne efectuare a preparatelor durabile, cu ajutorul unor echipamente performate ca microtomul automat CUT Slee 6062 și microscopul cu contrast de fază Olympus CKX41.

A fost elaborată o tehnică nouă, adaptată pentru efectuarea preparatelor permanente împarafinate, pentru o analiză fină, detaliată, a plastidelor celulare.

Au fost puse în evidență toate tipurile de plastide: amiloplaste, leucoplaste, cromoplaste, cloroplaste, cele mai bune rezultate obținându-se prin tehnica adaptată personal, în laboratorul de Biologie Celulară al Platformei de Cercetare Bioaliment.

Amiloplastele sunt plastide ce depozitează amidonul și au rol în metabolismul glucidic celular. Ele au fost observate în tulpinile subterane de la Solanum tuberosum, mai precis, în parenchimul de depozitare din tuberculi și s-au descris ca fiind amiloplaste ovale, cu hil circular dar dispus excentric, cu striuri vizibile, cu grade diferite de refringență, în jurul hilului.

Forma și structura amiloplastelor diferă în funcție de specie. Astfel ele pot fi solitare sau grupate, concrescute ca la grâu (Triticum aestivum) unde granulele sunt sferice, cu hilul sferic așezat central.

La porumb (Zea mays), granulele de amidon sunt mai mici, poligonale, cu hilul stelat, lobat, așezat în central. Striurile concentrice sunt mai puțin evidente, iar granulele au tendința de a se grupa în conglomerate.

La mazăre (Pisum sativum) se văd granule de forme variate: elipsoidale, ovale, mai mult sau mai puțin sferice sau chiar neregulate. Hilul este alungit și ramificat, împărțind granulele în “lobi” sau sectoare.

Cromoplastele dețin o gamă largă de pigmenți vegetali de tipul carotine, xantofile, ficocianine, ficoeritrine cu rol deosebit în fiziologia plantei, dar cu potențială utilizare în diverse ramuri ale industriei alimentare, textile, cosmetice, farmeceutice.

Cromoplastele au fost evidențiate la Daucus carota (unde au formă aciculară, sau paralelipipedică), la Lycopersicum esculentum (unde sunt de formă sferică sau ovoidă) și la Beta vulgaris (unde sunt masive, poligonale).

Cloroplastele reprezintă grupul predominant de plastide în regnul vegetal, conțin pigmenți clorofilinici, dintre care clorofila a este prezentă la toate plantele verzi, fie că sunt inferioare, fie că sunt superioare, alături de ale tipuri de pigmenți, în funcție de specie.

Au fost evidențiați cromatoforii plantelor inferioare, la algele verzi pluricelulare Spirogyra sp. (unde au formă spiralată cu pirenoizi) și Cladophora sp.(unde au formă de cilindru masiv, perforat)

La planta acvatică Elodea canadensis, cloroplastele au formă sferică, sunt numeroase, dispuse imediat sub membrana plasmatică pentru a facilita captarea undelor luminoase ce vor fi convertite în energie chimică în procesul de fotosinteză.

Au mai fost observate cloroplaste în tesut asimilator foliar de la Dianthus sp., Hedera helix, Clematis vitalba, Ficus elastica.

Metoda de extracție a clorofilei s-a dovedit a fi eficientă deoarece în toate cazurile analizate, raportul dintre clorofila a și clorofila b a fost de aproximativ 3:1, raport corespunzător pentru plantele superioare, în conformitate cu literatura de specialitate.

Cea mai mare concentrație de clorofilă a fost evidențiată la Hedera helix (12,081 mg/L), iar cea mai scăzută la Elodea candensis (3,367 mg/L).

Bibliografie

Anghel, I., Toma, N., „Citologie vegetală” Editura Didactică și Pedagogică București, 1979.

Anghel, I., Andrei, M., Popescu I., Stoica, E., „Lucrari practice de biologie vegetala”, Editura Didactică și Pedagogică București, 1981.

Andrew J. Simkin, Joël Gaffé, Jean-Pierre Alcaraz, Jean-Pierre Carde, Petre M. Bramley, Paul D. Fraser, Marcel Kuntz, „Phytochemistry”, Volume 68, Issue 11, June 2007, Pages 1545-1556;

Crișu Bota, A., Bologa C., 2010, Biologie celulară Îndrumător de lucrări practice.

C. van der Tol, W. Verhoef, A. Rosema, „Agricultural and Forest Meteorology”,Volume 149, Issue 1, 4 January 2009, Pages 96-105;

Iván Gómez, Félix L. Figueroa, Pirjo Huovinen, Nancy Ulloa, Viviana Morales, „Aquaculture”, Volume 244, Issues1-4, 28 February 2005, Pages 369-382;

Jodi Maple, Simon Geir Moller, „Membrane Traffiking”, Volume 581, Issue 11, 22 May 2007, Pages 2162-2167;

John M. Archibald, „The Puzzle of Plastid Evolution”, Volume 19, Issue 2, R81-R88, 27 January 2009;

Mirco Montefiori, Tony K. McGhie, Ian C. Hallett, Guglielmo Costa, „Changes in Pigments and Plastid Ultrastructure During Ripening of Green-Flashed and Yellow-Fleshed Kiwifruit”, Volume 119, Issue 4, 17 February 2009, Pages 377-387;

Sălăgeanu N., Atanasiu L., ,,Realizări recente și perspective în fotosinteză”, Universitatea București, 1972.

Takuya Matsumoto, Fumihiko Shinozaki, Tomoko Chikuni, Akinori Yabuki, Kiyotaka Takishita, Masanobu Kawachi, Takeshi Nakayama, Isao Inouye, Tetsuo Hashimoto, Yuji Inagaki, „Green-colored Plastids in the Dinoflagellate Genus Lepidodinium are of Core Chlorophyte Origin”, Volume 162, Issue 2, April 2011, Pages 268-276;

Thomas Fester, Swanhild Lohse, Kristine Halfmann, „Phytochemistry”, Volume 68, Issue 1, January 2007, Pages 92-100;

Thanh Thi Nguyen, Gregory Nugent, Teodoro Cardi, Philip John Dix, „Plant Science”, Volume 168, Issue 6, June 2005, Pages 1495-1500;

Tatjana Kleine, Christian Voigt, Dario Leister, „Trends in Genetics”, Volume 25, No. 4, 18 March 2009, Pages 185-192;

Wanping Bian, Cristina Barsan, Isabel Egea, Eduardo Purgatto, Christian Chervin, Mohamed Zouine, Alain Latché, Mondher Bouzayen, Jean-Cloude Pech, „Metabolic and Molecular Events Occurring during Chromoplast Biogenesis”, 2011.

Wouter G. van Doorm, Kohki Yoshimoto, „Ageing Research Reviews”, Volume 9, Issue 2, April 2010, Pages 117-130;

Yasuo Suzuki, Tsutomu Kimura, Daisuke Takahashi, Hirofumi Terai, „Ultrastructural Evidence for the Inhibition of Chloroplast-to-Chromoplast Conversion in Broccoli Floret Sepals by Ethanol Vapor”, Volume 35, Issue 3, March 2005, Pages 237-243;

Yue Yang, Jonathan M. Glynn, Bradley JSC Olson, Aaron J. Schmitz, Katherine W. Osteryoung, „Plastid Division: Across Time and Space”, Volume 11, Issue 6, December 2008, Pages 577-584;

Surse internet :

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_botanicCloroplaste.html

http://www.sciencedirect.com

www.springerlink.com

http://www.terapii-naturiste.com

www.wikipedia.com

Lista tabelelor

Lista figurilor

Bibliografie

Anghel, I., Toma, N., „Citologie vegetală” Editura Didactică și Pedagogică București, 1979.

Anghel, I., Andrei, M., Popescu I., Stoica, E., „Lucrari practice de biologie vegetala”, Editura Didactică și Pedagogică București, 1981.

Andrew J. Simkin, Joël Gaffé, Jean-Pierre Alcaraz, Jean-Pierre Carde, Petre M. Bramley, Paul D. Fraser, Marcel Kuntz, „Phytochemistry”, Volume 68, Issue 11, June 2007, Pages 1545-1556;

Crișu Bota, A., Bologa C., 2010, Biologie celulară Îndrumător de lucrări practice.

C. van der Tol, W. Verhoef, A. Rosema, „Agricultural and Forest Meteorology”,Volume 149, Issue 1, 4 January 2009, Pages 96-105;

Iván Gómez, Félix L. Figueroa, Pirjo Huovinen, Nancy Ulloa, Viviana Morales, „Aquaculture”, Volume 244, Issues1-4, 28 February 2005, Pages 369-382;

Jodi Maple, Simon Geir Moller, „Membrane Traffiking”, Volume 581, Issue 11, 22 May 2007, Pages 2162-2167;

John M. Archibald, „The Puzzle of Plastid Evolution”, Volume 19, Issue 2, R81-R88, 27 January 2009;

Mirco Montefiori, Tony K. McGhie, Ian C. Hallett, Guglielmo Costa, „Changes in Pigments and Plastid Ultrastructure During Ripening of Green-Flashed and Yellow-Fleshed Kiwifruit”, Volume 119, Issue 4, 17 February 2009, Pages 377-387;

Sălăgeanu N., Atanasiu L., ,,Realizări recente și perspective în fotosinteză”, Universitatea București, 1972.

Takuya Matsumoto, Fumihiko Shinozaki, Tomoko Chikuni, Akinori Yabuki, Kiyotaka Takishita, Masanobu Kawachi, Takeshi Nakayama, Isao Inouye, Tetsuo Hashimoto, Yuji Inagaki, „Green-colored Plastids in the Dinoflagellate Genus Lepidodinium are of Core Chlorophyte Origin”, Volume 162, Issue 2, April 2011, Pages 268-276;

Thomas Fester, Swanhild Lohse, Kristine Halfmann, „Phytochemistry”, Volume 68, Issue 1, January 2007, Pages 92-100;

Thanh Thi Nguyen, Gregory Nugent, Teodoro Cardi, Philip John Dix, „Plant Science”, Volume 168, Issue 6, June 2005, Pages 1495-1500;

Tatjana Kleine, Christian Voigt, Dario Leister, „Trends in Genetics”, Volume 25, No. 4, 18 March 2009, Pages 185-192;

Wanping Bian, Cristina Barsan, Isabel Egea, Eduardo Purgatto, Christian Chervin, Mohamed Zouine, Alain Latché, Mondher Bouzayen, Jean-Cloude Pech, „Metabolic and Molecular Events Occurring during Chromoplast Biogenesis”, 2011.

Wouter G. van Doorm, Kohki Yoshimoto, „Ageing Research Reviews”, Volume 9, Issue 2, April 2010, Pages 117-130;

Yasuo Suzuki, Tsutomu Kimura, Daisuke Takahashi, Hirofumi Terai, „Ultrastructural Evidence for the Inhibition of Chloroplast-to-Chromoplast Conversion in Broccoli Floret Sepals by Ethanol Vapor”, Volume 35, Issue 3, March 2005, Pages 237-243;

Yue Yang, Jonathan M. Glynn, Bradley JSC Olson, Aaron J. Schmitz, Katherine W. Osteryoung, „Plastid Division: Across Time and Space”, Volume 11, Issue 6, December 2008, Pages 577-584;

Surse internet :

http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_botanicCloroplaste.html

http://www.sciencedirect.com

www.springerlink.com

http://www.terapii-naturiste.com

www.wikipedia.com