Evaluarea Microtoxinelor Si a Bisfenolului A din Vinurile Rosii

II. CONTRIBUȚII PERSONALE

EVALUAREA MICOTOXINELOR ȘI A BISFENOLULUI A 

DIN VINURILE ROȘII

În partea experimentală s-a urmărit determinarea în patru probe de vin, din diferite soiuri de struguri roșii, provenite din comerț, a:

micotoxinelor Aflatoxina B1 și Zearalenona,

Bisfenolului A.

Desfășurarea cercetării a avut loc în cardulUniversității de Medicină și Farmacie din Timișoara și aUniversității de Științe Agricole și Medicină Veterinarădin Timișoara. 
Durata studiului: mai-iunie 2015

Pe tot parcursul lucrului în laborator trebuiesc respectate normele de igienă și protecție a muncii pentru evitarea contaminării probelor din exterior cât șiprotejarea față de accidente nedorite.

II.1. MATERIALE ȘI METODE

Produsele destinate analizei în scopul determinăriimicotoxinelor și a Bisfenolului A, alături de Resveratrol, din cadrul cercetării provin din comerț șisunt reprezentate de:

DULCE DE DEALU MARE (fetească neagră), produs de firmaOenoterra Dealu Mare, cu 11% vol. alcool, fără etichetădescriptivă a ingredientelor, prezintă mențiunea: ”Conține sulfiți”, constituie PROBA 1, figura II.1;

SÂNGE DE TAUR (vin de masă), produs în RepublicaMoldova și îmbuteliat de Domeniile Viticole Tohani, cu 10% vol. alcool, fără etichetă descriptivă aingredientelor, prezintă mențiunea: “Conține sulfiți”, constituie PROBA 2, figura II.2;

CASTEL HUNIADE (merlot/pinot noir), produs de CrameleRecaș, cu 12% vol. alcool, fără etichetă descriptivă aingredientelor, prezintă mentinunea: “Conține sulfiți”, constituie PROBA 3, figura II.3;

PREMIAT DEALURILE HUȘI (fetească neagră), produs de Speed – Casă de vinuri Huși, cu 11% vol. alcool, fărăetichetă descriptivă a ingredientelor, prezintă mențiunea“Conține sulfiți”, constituie PROBA 4, figura II.4.

Figura II.1 Proba 1

Figura II.2 Proba 2

Figura II.3 Proba 3

Figura II.4 Proba 4

Mostrele de vin utilizate ca probe au fost ținute înprealabil 24 de ore în recipiente de plastic, latemperatura camerei.

A. Identificarea micotoxinelor prin procedeul imunoenzimatic ELISA

Pentru analiza micotoxinelor s-au utilizat Kit-urile ELISA Zearalenon și ELISA Aflatoxin, produse de R-Biopharm, cat. no. R 5505. Această metodă este o metodă imunoenzimatică de analiză cantitativă a celor două micotoxine.

Kitul este compus din:

o plăcuță cu 48 godeuri;

Soluții standard gata de utilizare: Zearalenone standard – 0 ppb (zero standard) – doar standard 1este inclus în Kit și Aflatoxin standard – 0ppb. Curbele de calibrare (B/B0) vor fi luate în considerare din certificatul de calitate din Kit.

Conjugatul concentrat 3 ml;

Anticorpul concentrat 3 ml;

Substrat cromogen 10 ml;

Soluție de stopare, conține acid sulfuric 1N, 14 ml.

Kitul de analiză se păstrează la tempeaturi de 2-8°C până la utilizare.

Modul de lucru:

Se introduc suficiente godeuri în plăcuța kitului.

Se utilizează un singur godeu pentru o probă.

Se notează poziția standardelor și a probelor în plăcuță.

Se pipetează cu ajutorul micropipetei, 50 µl în cazul standardelor sau 20 µl în cazul probelor, în fiecare godeu. Se utilizează pentru fiecare standard sau probă un alt vârf pentru micropipetă.

Se introduce 50 µl din conjugatul concentrat în fiecare standard sau probă.

Se adaugă 50 µl soluție anticorp concentrat, după care se agită ușor, manual și se lasă în repaus timp de 10 min. la temperatura camerei.

După trecerea celor 10 minute se aruncă lichidul din godeuri și se spală de 3 ori cu 250 µl apă distilată deionizată. După fiecare spălare plăcuța cu godeuri se usucă.

Se adaugă 100 µl substrat cromogen și se agită ușor, manual, apoi se lasă în repaos 5 minute la întuneric.

La final se adaugă 100 µl soluție de stopare, lichidul din godeuri schimbându-și culoarea în galben.

Probele trebuie citite în timp de 10 minute de la adăugarea soluției de stopare.

Citirea probelor se realizează la lungimea de undă 450 nm cu ajutorul aparatului ELISA PR 1100 (figura II.5).

Figura II.5 Aparat ELISA utilizat la determinareamicotoxinelor

B. Identificarea Bisfenolului A

Măsurătorile analitice calitative, în vederea identificării Bisfenolului A în cele patru probe de vin provenite de pe piața de consum, s-au realizat cu spectrometrul de masă hibrid cuadrupolar cu timp de zbor QTOF Micro/Micromass achiziționat de la firma Waters (Manchester, UK), echipat cu o sursă de ionizare prin nanoelectropulverizare (nanoelectrospray-nanoESI) cu infuzie directă a probelor în spectrometrul de masă. Toate experimentele nanoESI s-au efectuat folosind capilare de sticlă cu pereții interior în formă de omega, achiziționate de la firma AnalytikVertrieb (Germania), care au fost dimensionate și pregătite pentru infuzia probelor.

Probele de analizat au fost introduse în volume de 10-15 L în capilarul de sticlă cu ajutorul pipetei automate, căreia i se atașează un vârf special „gel loader tip” lung și subțire, potrivit ca dimensiune diametrului interior al capilarului. Instrumentul a fost setat pentru a înregistra datele la o viteză de o scanare/s. Pentru fiecare spectru de masă, semnalul a fost achiziționat timp de 5 minute. Toate spectrele de masă au fost înregistrate în tehnica ionilor negativi. Parametrii au fost ajustați și optimizați pentru a asigura o ionizare eficientă a moleculelor, pentru a reduce la minim fragmentarea ionilor în sursă, variind potentialul aplicat contraelectrodului conic (cone voltage) în intervalul de 20-50 V, iar procesul de electropulverizare (ESI) a fost inițiat prin aplicarea unei tensiuni variabile pe firul de oțel introdus în soluție in inetrvalul 1000-2000 V.

Experimentele MS/MS pentru izolarea si fragmentarea Bisfenolului A au fost realizate prin disocieri induse prin ciocnire (Collision induced dissociation CID) la energii joase, iar gazul de ciocnire folosit a fost argonul la o presiune de 12 psi. Ionii au fost izolați prin setarea domeniului de rezolutie LM-HM la 10 și respectiv 10, iar energia de ciocnire a fost variată în intervalul 20-40 eV pentru a furniza un set complet de ioni fragment-diagnostic pentru structura analizată. Scala m/z a spectrului de masă a fost calibrată prin utilizarea soluției standard de polietilenglicol (PEG) tuning mix. Referința a furnizat un spectru cu o acoperire ionică mare a scalei m/z, atât pentru MS cât și pentru CID MS/MS. Acuratețea medie în determinarea masei moleculare a fost situată în intervalul normal pentru un instrument QTOF MS.

II.2. REZULTATE SI DISCUTII

A. Rezultate

• În scopul determinării prezenței unor micotoxine (Aflatoxinei B1 și Zearalenonei) în probele de vin s-a utilizat aparatul ELISA PR100.

Figura II.6 Curba de calibrare a Aflatoxinei B1

Figura II.7 Curba de calibrare a Zearalenonei

Datele experimentale au indicat faptul că niciuna din probele analizate nu au conținut Zearalenonă. Aflatoxina B1 a fost identificată în toate cele patru probe, în cantitățile reflectate in figurile de mai jos:

Figura II.8 Rezultatele Identificarii Aflatoxinei B1 în probele de vin prin analiză imunoenzimatică

Astfel rezultă cantitatea de Alflatoxină B1 în fiecare probă analizată:

Proba 1: 1,25 ppb;

Proba 2: 0,657 ppb;

Proba 3: 1,21 ppb;

Proba 4: 0,274 ppb.

Figura II. 9 Identificarea Aflatoxinei în probele de vin prin analiză imunoenzimatică

• În cadrul determinării calitative a bisfenolului A încele patru probe de vin cu spectrofotometrul de masă a rezultat:

▪ pentru proba de vin 1:

Figura II.10 Spectrul MS1 al probei

Figura II.11 Spectrul MSI al probei cu evidențierea Aflatoxinei B1

▪ pentru proba de vin 2:

Figura II.12 Spectrul MSI al probei

Figura II.13 Spectrul MS/MS al probei cu izolarea BPA

▪ pentru proba de vin 3:

Figura II.14 Spectrul MSI al probei

Figura II.15 Spectrul MS/MS al probei cu izolarea BPA

Figura II.16 Spectrul MSI al probei cu evidențierea Zearalenonei identificate

▪ pentru proba de vin 4:

Figura II.17 Spectrul MSI al probei

Figura II.18 Spectrul MS/MS al probei cu izolarea BPA

Figura II.19 Spectrul MSI al probei cu evidențierea Resveratrolului identificat

Analiza probelor de vin cu spectrometrul de masă a scos la iveală:

în proba 1: prezența Aflatoxinei B1;

în proba 2: s-a identificat prezența Bisfenolului A;

în proba 3: atât Bisfenolul A, cât și Zearelonona;

în proba 4: Bisfenol A și Resveratrol (compus netoxic).

Discuții

Evaluarea din punct de vedere microbiologic și a concentrațiilor de toxici a produselor destinate ingerării de către populație este necesară pentru a garanta produselor o calitate și o conservabilitate mai bună, cât și pentru a garanta siguranță consumatorilor. 
Toxinele vizate sunt micotoxinele și Bisfenolul A, datorită interesului patologic dezvoltat în știință,  cu precădere în ultimul deceniu. 
În urma cercetării experimentale ELISA s-au indentificat în toate cele patru probe concentrații variabile deAflatoxină B1, micotoxină cu acțiuni negative asupra sănătății omului (are cel mai mare potențial toxic din grupul aflatoxinelor), plantelor și mediului înconjurător. Aceasta se acumulează la nivelul diferitelor organe interne putând produce afecțiuni ale rinichilor, plămânilor, inimii și SNC. Caracteristica majoră care o pune în studiul numeroaselor cercetări științifice este potențialul cancerigen, mai ales la nivel hepatic, care apare în urma ingerării cronice de alimente și băuturi ce o conțin. 
Spectrometul de masă a evidențiat prezența în probele de vin studiate (în afara Aflatoxinei B1) a Bisfenolului A, Zearalenonei, cât și a Resveratrolului (singura substanță fără potențial toxic dintre cele prezente în probele analizate). 
Bisfenolul A poate contamina vinurile în urma contactului dintre vin și materialele plastice, cele mai comune căi fiind reprezentate de îmbutelierea și consumul în recipiente de plastic, motiv pentru care probele luate în studiu au fost expuse temperaturii camerei în recipiente de plastic înainte de analizare. 
Resveratrolul a fost luat în calcul în studiul de fațăpentru a verifica, încă o dată, dacă procesele din cadrul producției de vinuri au fost realizate corespunzător întrucât acest compus se degradează în urma prezenței fungilor patogeni în mediul de diluție. 
În urma studiului de față, a rezultat că proba 1 analizată este caracterizată doar de prezența Aflatoxinei B1, cea de-a două probă de prezența Aflatoxinei B1 și a Bisfenolului A, iar cea de-a treia de un conținut mixt de Bisfenol A, Aflatoxină B1 și Zearalenonă. În ultima probă, alături de Aflatoxina B1 și Bisfenolulul A, este identificat compusul netoxic Resveratrol. 
Dat fiind cadrul legal în care se încadrează România, prezența micotoxinelor în produsele de consum trebuie să fie nulă ori cel puțin să se încadreze în limitele impuse de UE. Vinurile luate în studiu se încadrează în limitele legale, însă prezența lor, chiar și în cantități mici poate duce la efecte grave asupra populației prin provocarea de micotoxicoze și efectele pe termen lung imunosupresoare, genotoxice, teratogene și cancerigene posibile. 
Bisfenolul A nu este supus unor reglementări stricte înțară noastră, în ceea ce privește existența sa în alimente și băuturi, însă este evaluat și cercetat de UE din cauza efectelor potențiale nocive asupra organismului uman, pentru a determina exact necesitatea unor viitoare reglementări ale existenței sale în aceste produse de consum larg.