EVALUAREA IN VITRO ȘI IN VIVO A POTENTIALULUI CITOTOXIC AL NANOPARTICULELEOR FEROMAGNETICE ASUPRA CELULELOR DE CANCER MAMAR CAPITOLUL 1 INTRODUCERE… [302393]

LUCRARE DE LICENTA

EVALUAREA IN VITRO ȘI IN VIVO A POTENTIALULUI CITOTOXIC AL NANOPARTICULELEOR FEROMAGNETICE ASUPRA CELULELOR DE CANCER MAMAR

CAPITOLUL 1

[anonimizat]-am propus explorarea in vitro a eficacității și citotoxicității nanoparticulelor feromagnetice asupra celulelor tumorale. Cercetările din ultimii zece ani ne arată interesul crescut asupra utilizării nanomaterialelor în multe domenii de cercetare.

[anonimizat], [anonimizat] o [anonimizat], ceea ce le face sa fie considerate nanomateriale fascinante.

Nanoparticulele feromagnetice pot avea următoarele întrebuințări :

[anonimizat] (Feridex)

sisteme de eliberare controlată a medicamentelor

agenți teragnostici

induc hipertermia în tratamenul cancerului.

[anonimizat].

[anonimizat], informațiile disponibile în prezent cu privire la potențiala lor toxicitate sunt încă limitate și au fost raportate date controversate. Cu toate că nanoparticulele feromagnetice au fost în mod tradițional considerate ca fiind biocompatibile, s-a demonstrat că exista o serie de factori cum ar fi :

influența acoperirii suprafeței nanoparticulelor

dimensiune sau doză

precum și alți factori experimentali:

[anonimizat].

[anonimizat]-encefalică. [anonimizat], genotoxicitatea, imunotoxicitatea, [anonimizat] o [anonimizat]. Pentru a înțelege pe deplin modul în care aceste nanomateriale interacționează cu sistemele celulare și ce consecințe au asupra sănătății va trebui sa se depună multă muncă.

NANOPARTICULELE FEROMAGNETICE

Notiuni introductive și generalități

Nanotehnologia este considerată în zilele noastre unul dintre cele mai inovatoare domenii ale științei și cercetării care a [anonimizat], bioingineria, [anonimizat]-ul de roboți si mașini. Nanoparticulele feromagnetice prezintă un interes crescut în ingineria biomedicală și în medicină deoarece au un rol important în studiile de dezvoltare a [anonimizat], localizare și urmărire în organism a unor structuri biologice (bacterii, virusuri, leucocite etc.), [anonimizat] . [anonimizat] a acestora. S-a constatat faptul că nanoparticulele feromagnetice reprezintă un instrument remarcabil în dezvoltarea de terapii de tipul „tumor-targeted” deoarece acestea au o [anonimizat]-țintă iar efectele secundare sunt diminuate. De aceea, pentru realizarea acestor nanostructuri, este foarte importantă alegerea unor materiale care să îndeplinească toate proptietățile fizice și chimice obligatorii pentru a asigura succesul acestora. Datorită studiilor din ultimii 50 de ani s-a costatat că nanoparticulele de diferite tipuri de oxid de fier au îndeplinit aceste criterii stricte, și anume: Fe3O4 (magnetită), ferimagnetită, nanoparticule superparamagnetice (cu dimensiuni sub 15 nm), α-Fe2O3 ,γ- Fe2O3 (feromagnetic), ε-Fe2O3, acestea reprezentând cele mai promițătoare și utilizate nanoparticule în domeniile de cercetare biomedicale .

De-a lungul timpului, interesul pentru obținerea de nanoparticule înglobate în forme bine definite, a crescut foarte mult datorită vastei aplicabilități atât în lumea biomedicală cât și în tehnologiile de toate tipurile. Există unele aspecte foarte importante ce pot influența performanța nanoparticulelor, precum : compoziția chimică, forma și structura nanoparticulelorv(Nica Valentin, 2009). Numeroase studii, (Nica Valentin, 2009), au demonstrat că se pot modifica proprietățile nanoparticulelor prin controlul formei nanostructurilor și a tipurilor de matrice, făcându-le astfel utilizabile în : biologie celulară, terapia cancerului, fotonică, electronică, stocarea informațiilor, optoelectronică și cataliză. Mediile nanoparticulate au proprietăți magnetice unice ce sunt total diferite de cele ale mediilor masive. Aceasta se datorează raportului mare suprafață/volum deoarece atomii de la suprafață interacționează diferit din punct de vedere magnetic cu atomii vecini. Materialele feromagnetice masive prezintă în general multiple domenii magnetice, în schimb, nanoparticulele magnetice pot fi alcătuite dintr-un singur domeniu magnetic.

După proprietățile magnetice, în natură există două categorii de substanțe (Croitoru et al, 2013):

substanțe paramagnetice

substanțe diamagnetice

Substanțele paramagnetice sunt cele care nu au toate momentele magnetice de spin cuplate, acestea amplificând inducția câmpului magnetic exterior, ex: Pb, O2, Al. Substanțele diamagnetice sunt cele care au toate momentele magnetice de spin cuplate conținând atomi lipsiți de moment magnetic permanent. Există un grup mic de substanțe din clasa celor paramagnetice, numite substanțe feromagnetice ce posedă proprietăți magnetice pronunțate, ex : fierul, cobaltul, nichelul. Spirella este un microorganism ce sintetizează feritin, care se acumuleaza în organe speciale numite magnetosomi (sunt considerați « ghizi «  magnetici, pentru orientare în spațiu după câmpul magnetic al pămânului pt albine, fluturi, delfini). În natură, majoritatea țesuturilor biologice, ca și apa, sunt diamagnetice. Glanda suprarenală a omului conține o anumită concentrație feromagnetică, funcție care nu a fost descoperită nici până în prezent.

Substanțele feromagnetice, precum metalele pure Fe, Co, Ni și aliajele lor prezintă o problemă majoră cum ar fi aceea a stabilității în timp doarece poate avea loc oxidarea, aglomerarea sau precipitarea. Pentru a preveni oxidarea se poate utiliza pasivizarea, iar unele metode de sinteză se realizează prin condensare din stare de vapori. S-a demonstrat că învelirea nanoparticulelor feromagnetice cu un strat non-oxidic determină creșterea coercivității. S-au dezvoltat metode prin care se sintetizează miezuri de nanoparticule magnetice învelite cu substanțe organice ce modifică gradul de aglomerare sau prcipitare .

Concentrația nanoparticulelor feromagnetice din interiorul matricii influențează proprietățile magnetice, precum magnetizația de saturație și magnetizația remanentă. Studiile au demonstrat că în cazul compozitelor feromagnetice, în interiorul particulei, câmpul este demagnetizat, ceea ce conduce la scăderea permeabilității efective, astfel s-a obținut o relație între permeabilitatea și fracția volumică a particulelor sferice înglobate. O nouă direcție de cercetare foarte importantă este aceea a învelișurilor de polimeri bidegradabili si biocompatibili .

Metode de obținere

Multe metode fizice și chimice au fost dezvoltate pentru fabricarea de nanoparticule . Cu toate acestea, substanțele chimice utilizate în aceste proceduri lasă reziduri toxice și poluează mediul înconjurător . Prin urmare se pot sintetiza nanoparticule pe cale biologică utilizând fungi, bacterii, actinomycete, alge și plante superioare. Aceste metode sunt rentabile si ecologice. Nanoparticulele constituite din oxizi metalici sunt utilizate pe scară largă în agricultură, în livrarea de medicamente, în cosmetologie, cristale fotonice, în industria alimentară, industria vopselelor, catalizatori etc

Nanoparticulele feromagnetice pot fi fabricate din extracte de plante sau microbi, cum ar fi ciupercile și microalgele. Ele pot fi acoperite cu polimeri solubili în apă pentru o mai mare solubilitate. De exemplu nanoparticulele acoperite cu polivinil alcool For instance, polyvinyl alcohol-coated nanoparticles nu au proprietăți de agregare, de aceea pot difuza cu ușurință prin membrana semipermeabilă într-un sistem viu. Forma și dimensiunile lor pot fi controlate prin menținerea temperaturii, ph-ul și concentrația componentelor reactive .

Citotoxicitatea nanoparticulelor feromagnetice variază în funcție de formă și anume pot fi sferice, în formă de mărgele și tije. Their cytotoxicity varies with shape such as spherical, beads, and rods Dimensiunea hidrodinamică și natura nanoparticulelor de oxid de fier : paramagnetice / diamagnetice, le face importante pentru aplicații specifice. De exemplu, nanoparticule cu o dimensiune hidrodinamică mai mare au citotoxicitate mai mică. Nanoparticulele superparamagnetice de oxid de fier au un mare potențial pentru a fi utilizate în cadrul instrumentelor și dispozitivelor medicale, ca sisteme de eliberare controlata a medicamentelor, precum și în tratamentul multor boli. Microbii și extractele din plante care conțin alcaloizi, flavonoide, saponine, cetone, aldehide, fenoli sau acizi, cum ar fi acidul citric și acizii ascorbic pot fi utilizate pentru sinteza nanoparticulelor. Nanoparticulele de oxid de fier pot fi folosite ca material ieftin pentru îndepărtarea coloranților din industria textilă, în tratamentul de contaminare a apelor uzate și purificarea apei freatice. Deoarece proprietățile nanoparticulelor de oxid de fier depind numai de numărul de electroni nepereche și mărimea particulelor în prezența și absența câmpului magnetic, acesta poate fi modificat prin acoperirea lor cu polimeri și prin aplicarea câmpului magnetic exterior. Aceste nanoparticule pot fi utilizate selectiv pentru separarea materialelor magnetice dintr-un depozit mare de substanțe nemagnetice..

Nanoparticulele feromagnetice mai pot fi sintetizate prin modificarea diverșilor parametri, cum ar fi mediul, raportul dintre Fe2+/Fe3+, prezența sau absența și concentrația sării de NaOH. Astfel, Alp și Aydogan au obținut soluții de Fe2+/Fe3+, în raport de 2/3 si 1/2 în aer, respectiv în atmosferă de N2. Aceștia au observat faptul că în cazul sintezei în atmosfera de aer, când se adaugă sarea la mediul de racție și raportul Fe2+/Fe3+ este 2/3, nanoparticulele de Fe3O4 sunt sferice similare cu cele obținute într-o atmosferă de N2 .

Imaginile TEM au arătat că dimensiunea particulei obținută în atmosfera de aer este puțin mai mică . Din nou, în conformitate cu imaginile de transmisie microscopică electronică (TEM), s-a constatat că raportul dintre ionii de fier are un efect asupra morfologiei. Mai mult decât atât, XRD (difracție prin raze X) și rezultatele FT-IR (spectroscopia cu infraroșu cu transformare Fourier) Fourier Transform Infrared Spectroscopy au arătat că structura cristalină a nanoparticulelor feromagnetice s-a schimbat din magnetit în hematit. De asemenea, dimensiunea și distribuția de saturație a magnetizării nanoparticulelor de oxid de fier au fost influențate de Na2SO4. Mai mult decât atât, atmosfera de N2 și tăria ionică au un efect pozitiv asupra valorii magnetizării de saturație a particulelor. Atunci când este adăugat mediul de precipitare N2 și Na2SO4, se obține o valoare mai mare a magnetizarii de saturație și o mai bună distribuție a dimensiunii.

Figura 1.1 Obținerea nanoparticulelor feromagnetice în atmosferă de N2 și aer

Proprietăți generale / Exemple

Soares și alții au studiat proprietățile nanoparticuleleor formate dintr-un miez magnetic de Fe3O4 și un strat polimeric reprezentat de chitosan pentru aplicații de hipertermie magnetică. Chitosanul este un biopolimer utilizat pe scară largă pentru aplicații biomedicale, ca înveliș pntru nanoparticulele magnetice și termice de oxid de fier. În urma studiilor, aceștia au observat că învelișul polimeric nu afectează proprietățile magnetice ale nanoparticulelor de oxid de fier, deoarece acestea nu-și schimbă compoziția lor de bază (magnetit) și își păstraeză de asemenea superparamagnetismul .

Din măsurătorile magnetice, Soares și alții, au concluzionat că aceste nanoparticule au generat căldură o dată cu aplicarea unui câmp magnetic alternativ. Mai mult decât atât, nanoparticulele feromagnetice cu înveliș de chitosan, nu își modifică diametrul hidrodinamic, nu își schimbă proprietățile fizice și chimice și pot acționa ca un sistem specializat de eliberare de medicamente .

Nanoparticulele de cobalt și oxid de fier (CoFe2O4) au fost unele dintre cele mai explorate nanomateriale datorita stabilității lor chimice excelente, duritate mecanică și potențial de generare a căldurii . Însă există informații limitate în ceea ce privește interacțiunea dintre aceste nanoparticule cu sistemele biologice . Există studii în care a fost investigată citotoxicitatea mediată de speciile reactive de oxigen (ROS) și răspunsul apoptotic al nanoparticulelor de cobalt și oxid de fier în celulele hepatice umane (HepG2) . Scăderea viabilității celulare și deteriorarea membranară a fost dependentă de doză și timp. De asemenea s-a constatat că a avut loc inducerea stresului oxidativ datorat ROS, depleția de glutation, scăderea activității enzimei superoxid bismutazei. Nivelurile ARNm al genei supresoare tumorale P53 și genele apoptotice au fost mai crescute iar pentru genele anti-apoptotice, mai scăzute. Expunerea la acetil-cisteină a abrogat modularea genelor apoptotice împreună cu prevenirea citotoxicității cauzate de nanoparticulele de cobalt și oxid de fier. Aceste mecanisme vor fi investigate în continuare pe modele animale.

Angioplastia cu balon este o procedură intervențională de primă linie în cazul ocluziilor vasculare. Acestea pot duce la infarct miocardic letal, accident vascular cerebral si stază venoasa periferică. Succesul acestui tratament pe termen lung este limitat de restenoză și hiperplazia neointimală. Au fost propuse terapii celulare care să rezolve aceste probleme; totuși, eficacitatea este slabă, în mare parte din cauza retenției slabe de celule. Riegler și alții au demonstrat că detectarea magnetică a celulelor stem mezenchimale duce la o creștere de 6 ori mai mare a numărului de celule reținute ulterior unei angioplastii cu balon la rozătoare, folosind un model permanent de magnet cu aplicabilitate clinică. Celulele marcate cu nanoparticule superparamagnetice de oxid de fier nu au avut efecte negative în ceea ce privește viabilitatea celulelor, diferențierea celulară sau tipul de secreție. Creșterea retenției de celule stem duce la o scădere a restenozării la trei săptămâni după aportul celular.

Proprietățile structurale ale nanoparticuleleor feromagnetice și mecanism de acțiune

Unele experimente au demonstrat potențialul nanoparticulelor feromagnetice de a fi controlate magnetic, ajunând astfel în locul dorit. Nanoparticulele feromagnetice fiind supuse unui câmp magnetic alternativ, absorb o mare cantitate de energie magnetică ce se transformă ulterior în energie termică. Astfel, în aceste condiții, acestea generează căldură datorită proprietăților lor magnetice și a dimensiunii, a amplitudinii și frecvenței câmpului magnetic, a ratei de răcire a sângelui în vasele tumorale. Nanoparticulele feromagnetice, având dimensiuni foarte mici și suprafețe unice, sub acțiunea câmpului magnetic alternativ, au generat acțiuni termice ridicate față de alte materiale. Pentru a permite aceste fenomene, câmpul magnetic alternativ aplicat de către Mahfoozur și alții, a necesitat o amplitudine de 10kA/m și o frecvență de 400 kHz. Această tehnică a fost utilă în tratarea cancerului de prostată. Nanoparticulele oxidice feromagnetice au și proprietatea de a transporta medicamente. Pătrund în organismul uman prin administrare pe cale arterială, intravenoasă sau orală iar prin intermediul unui câmp magnetic extern, pot fi dirijate direct către anumite zone astfel încât medicamentul transportat să acționeze numai asupra țesuturilor tumorale.

Nanoparticulele de oxid de fier au fost investigate pe scară largă datorită proprietăților magnetice și potențialului de diagnosticare .

Utilizarea nanoparticulelor feromagnetice în tratamentul cancerelor prin hipertermie a fost demonstrat de Gilchrist și alții în 1957 . În 2004 prima clinică în care s-a realizat tratamentul prin hipertermie magnetică a fost Charite-Medical University din Berlin (U. Gneveckow, A. Jordan, R. Scholz, V. Brüss, N. Waldöfner) și câțiva ani mai târziu Magforce a obținut aprobarea centrului European de reglementare pentru a trata pacienți cu tumori pe creier prin hipertermie magnetică (Magforce®: The nanomedicine company). În timp ce hipertermia magnetică a fost acceptată ca tehnică de tratare a tumorilor pe creier în Europa, aceasta nu este utilizată pe scară largă. De exemplu nu a fost acceptată în spitalele din SUA precum și din alte părția ale lumii.

În figura următoare (Fig. 1.2.) este o reprezentare schematică a celor mai importanți parametri de optimizare a proprietăților magnetice și structurale a nanoparticulelor magnetice, efectele interacțiunilor bipolare magnetice, exactitatea metodelor folosite în măsurătorile hipertermiei magnetice, de care este necesar să se țină cont în proiectarea nanoparticulelor feromagnetice pentru a optimiza eficiența de încălzire pentru diverse aplicații: hipertermie magnetică, transport de medicamente controlat magnetic, tratament termic pentru cancer, eradicarea biofilmului.

Figura 1.2. Ilustrarea parametrilor care influențează eficacitatea tratamentului prin hipertermie magnetică și diferite tipuri de aplicații biomedicale ale hipertermiei magnetice

Proprietățile magnetice intrinseci ale nanoparticulelor feromagnetice influențează starea de relaxare și histereză (fenomen cu caracter ireversibil care constă în faptul că succesiunea stărilor unei substanțe, determinate de variația unui parametru, diferă de succesiunea stărilor determinate de variația în sens contrar a aceluiași parametru, dex), modificând puterea disipată. Dimensiunea optimă și anizotropia depind de puterea și frecvența câmpului de curent alternativ aplicat. Interacțiunile magnetice bipolare promovează formarea nano-ansamblurilor organizate ca nano-clusteri și pot de asemenea să modifice comportamentul de relaxare a câmpului magnetic .

Modificarea dimensiunii nanoparticulelor feromagnetice modifică dramatic răspunsul acestora atunci când este aplicat un câmp magnetic alternativ. Magnetizarea nanoparticulelor de oxid de fier scade odată cu scăderea dimensiunii nanoparticulelor . Datorită dimensiunii lor mici, acestea prezintă o magnetizare de saturație scăzută datorită suprafeței și efectelor de spin interne . Schimbarea cuplajului spin-spin dă naștere unei dezorganizări magnetice la suprafața nanomaterialului, care nu este de obicei observată cu ușurință la cea mai mare parte de materiale magnetice . În plus, prezența unui strat magnetic modificat la suprafața nanoparticulelor duce la o coordonare incompletă a ionilor de metal, scazând astfel magnetizarea .

Reglarea compoziției chimice are efecte considerabile asupra proprietăților magnetice a nanoparticulelor de oxid de fier fiind importantă pentru optimizarea performanțelor lor în hipertermia magnetică. În mod specific, dezvoltarea puternică a nano-feritelor magnetice este importantă deoarece valorile SLP (puterii specific de pierdere) specific loss power cresc liniar cu magnetizarea. De-a lungul anilor, nanoparticulele alcătuire din ferită Fe3O4, au fost explorate pe larg datorită costurilor reduse și a biodisponibilității. O limitare a acestui sistem este reprezentată de magnetizarea de saturație care este relativ scăzută . Alte tipuri de ferite au fost investigate, inclusiv jacobsitele (MnFe2O4) care au o magnetizare mai ridicată. Pentru a înțelege mai bine efectul chimiei asupra naturii magnetice din nanoparticulele de oxid de fier, un prim pas este de a observa repartizarea magnetică în structura cristalină. Magnetita și jacobsita aparțin unei clase speciale de ferite numite spineli și sunt reprezentate de formula generală MFe2O4, unde M poate fi orice ion metalic bivalent.

Aplicații biologice

Aplicații terapeutice

Hipertermia este o tehnică simplă utilizată pentru a distruge celulele tumorale prin creșterea temperaturii lor la 41-45 ° C. Celulele vii sanătoase se pot reface în timp, pe când deteriorarea celulelor tumorale este un proces ireversibil . Această tehnică este mai eficientă atunci când nanoparticulele de oxid de fier (IONP) sunt mici și uniforme. Suprafața lor este în general biocompatibilă prin acoperirea lor cu polimeri organici sau molecule bioactive pentru eliberarea lor lentă .

Marcarea celulară și separarea celulelor

Separarea celulelor in vivo se poate face prin celule marcate cu substeanțe paramagnetice ce pot fi detectate prin RMN Ele pot fi marcate prin una dintre cele două tehnici:

a) atașarea particulelor magnetice la suprafața celulei

b) internalizarea particulelor magnetice biocompatibile prin endocitoză .

Gupta AK și Gupta M au demonstrat ca nanoparticulele supramagnetice derivatizate cu proteine, cum ar fi lactoferină, transferina, ceruloplasmina au o afinitate puternică pentru receptorii de pe fibroblastele umane de suprafață, care inhibă fagocitoza. Aceste nanoparticule mai mici cu dimensiunea de 20 nm au o valoare ridicată de magnetizare. Fierul în stare trivalentă în Fe2O3 se află în stare mare de spin cu cinci electroni nepereche in orbitalul d, dar în momentul în care este acoperit cu proteine, ajunge la o stare de spin scăzută, cu o schimbare ulterioară în repulsie și valoarea momentului magnetic de la 5,91 BM la 1.73 BM corespunzând unui electron nepereche. Aceasta se datorează formării complexului de Fe3 + cu proteina care fiind un ligand puternic forțează electronii să fie asociați în sus. Ca rezultat, Fe3 + este redus în dimensiune, dar aria suprafeței crește datorită complexarii cu proteine. Momentul magnetic și reducerea dimensiunii Fe2O3 pare a fi factorul cheie în procesul de internalizare și fagocitoză. S-a sugerat că refacerea țesuturilor se poate face fie prin sudură sau lipire când nanoparticule acoperite cu polimer sunt plasate între două suprafețe de țesut. Temperatura mai mare de 50 ° C, produce denaturarea țesuturilor și de asemenea absorbția luminii de către nanoparticule acoperite .

Tratamentul cancerului

Wu și alții au arătat că nanoparticule de fier acoperite cu aur suprimă creșterea celulelor canceroase în cazul cancerului oral si colorectal in vivo și in vitro . Deși celulele sănătoase sunt la fel de expuse la nanoparticule de fier, acestea nu sunt mult prea afectate și replicarea celulelor canceroase este inhibată. Citotoxicitatea se datorează proprietăților magnetice ale nanoparticulelor de fier elementar; oxidarea este întârziată prin acoperirea lor cu aur. Atunci când începe oxidarea nanoparticulelor de fier, citotoxicitatea scade față de celulele canceroase. De fapt, stratul de aur se dizolvă încet pentru a elibera nanoparticulelor de fier. Speciile reactive de oxigen (ROS) care sunt generate, declanșează procesul de citotoxicitate.

Scăderea potențialului membranei mitocondriale în celulele canceroase se produce atunci când sunt tratate cu nanoparticule de fier cu înveliș de aur (Fe @ Au), cu toate că nu este cunoscut în mod clar mecanismul prin care interferă cu funcția normală a mitocondriei. Din moment ce mitocondriile sunt componente sensibile la reacțiile redox, ele sunt vizate de Fe @ Au. Fierul este oxidat lent, iar din această cauză, are loc scăderea potențialului membranar. Citotoxicitatea Fe @ Au față de celulele canceroase este un proces ireversibil, în timp ce celulele sănătoase sunt de asemenea și ele afectate, dar se refac în termen de 24 de ore. Oxidarea nanoparticulelor de fier si generarea de ROS sunt procese simultane.

Fe@Au+mitochondria→ Fen+@AuO+mitochondria

Figura 1.3. Fe@Au induc citotoxicitate celulelor canceroase prin autofagia mediată a mitocondriilor

Nanoparticulele de fier învelite în aur, au provocat un șoc pentru mitocondire în termen de 4 ore, dar celulele canceroase nu au putut să se refacă. Mai mult a avut loc o autofagie secvețială și inhibarea celulelor canceroase .

Transportul controlat de medicamente

Mohmoudi și alții au studiat aplicarea nanoparticulelor de oxid de fier (Spion) în livrarea de medicamente. Medicamentele sunt legate pe suprafața Spion sau încapsulate în lipozomi magnetici și microsfere. SPION poate livra peptide, ADN, substanțe chimioterapeutice și medicamente radioactive și hipertermice. Acestea sunt concepute astfel încât medicamentul sau ligandul este legat la suprafața sa și ghidată cu un câmp magnetic extern la locul dorit. Nanoparticule intra în celulele țintă și livrează medicamentul acolo.

Ghidaj magnetic

Nanopaticulă Nanoparticulă acoperită

cu medicament Celula țintă

Medicamentul se dizolvă în interiorul celulei

Figura 1.4. Transportul de medicamente la celulele țintă prin intermediul nanoparticulelor

Diagnosticare

Calero și alții au studiat efectul internalizării nanoparticulelor feromagnetice de oxid de fier pe celule HeLa in vitro. Ei au evaluat, de asemenea, deteriorarea celulelor normale sănătoase și producția de ROS (specii reactive de oxigen). S-a constatat că internalizarea depinde de tipul de acoperire a nanoparticulelor și concentrația acestora. Încărcătura și suprafața nanoparticulelor sunt importante, deoarece particulele de la suprafață încărcate pozitiv sunt atrase în mod implicit spre o suprafață încărcată negativ. Calero și colab , au observat că nanoparticulele încărcate pozitiv sunt capabile să penetreze mai ușor celula HeLa decât cele încărcate negativ. Se poate înțelege că nanoparticulele încărcate pozitiv sunt mai mici decât speciile încărcate negativ, și prin urmare, fiind de dimensiuni mai mici, ele pot difuza cu ușurință în celule, demonstrat de Kenzaoui și colab într-un experiment separat. Internalizarea se realizează prin endocitoză . Deși un număr substanțial de nanoparticule se acumulează în citoplasmă, acestea nu ajung la nucleu, iar prejudiciul genotoxic al nanoparticulelor de oxid de fier se datorează producției de ROS care are loc, indiferent de tipul de celule, acoperirea sau concentrarea acestora. De aceea, astfel de materiale magnetice nanodimensionale pot fi utilizate în diagnosticul medical, în special în identificarea celulelor canceroase .

Efect antitumoral

S-a observat dintr-un studiu al celulelor canceroase expuse la nanoparticule de oxid de fier că moartea celulelor se produce prin necroză, mai degrabă decât apoptoza. Este de asemenea interesant faptul că, atunci cand celulele normale umane, fibroblastele, au fost expuse la nanoparticule de oxid de fier, a avut loc moartea unui număr nesemnificativ de celule sanătoase. Aceasta demonstreaza ca aceste nanoparticule pot fi folosite în condiții de sigurantă în tratamentul tumorilor fară a deteriora celulele sănătoase. Au fost tratate cu nanoparticule de oxid de fier celule canceroase de tipul A549 și a fost examinată generarea ROS (speciilor reactive de oxigen) prin intermediul unor sonde. Valoarea maximă a ROS care a fost generată după 24 h, la o rată de 100 μg / ml nanoparticule de oxid de fier care a indus ulterior autofagie .

Activitate antibacteriană

Efectul nanoparticulelor de oxid de fier asupra inactivării bacteriei Escherichia Coli în condiții aerobe și anaerobe a fost studiat de către Lee și colab . S-a observat că, în absența oxigenului, inactivarea E. coli a atins nivel maxim atunci când a fost expusă la 9 mg L-1 de nanoparticule de fier timp de 10 min. În prezența oxigenului, la o concentrație de 90 mg L−1 de nanoparticule de fier, timp de 90 de minute, a avut loc o inactivare neglijabilă asupra bacteriei. Aceasta se datorează în special prezenței oxigenului care oxidează Fe0→Fe2+ și absenței radicalului hidroxil. Nanoparticulele de fier sunt oxidate la FeO și Fe2O3 care formează un film pe suprafața nanoparticulelor ce împiedică stratul inferior de coroziune ulterioară .

Fe0 →FeO → Fe2O3

Cu toate acestea, atunci când un agent de chelare, cum ar fi ionul PO43-, este adăugat într-un sistem de aer saturat, activitatea biocidă a nanoparticulelor de fier este redusă, deoarece Fe(III) formează un chelat de metal insolubil cu PO43- . Dimpotrivă, când se adaugă ionul oxalat, C2O42-, activitatea bactericidă este îmbunătățită deoarece se formează un complex solubil cu ionul de fier .

Implicațiile nanoparticulelor feromagnetice în tratarea cancerului

Nanomaterialele au atras o atenție considerabilă în trecut datorită proprietăților unice: optice, electronice, magnetice, fizico-chimice.

Cea mai mare provocare în terapia cancerului este de a ținti în mod specific celulele tumorale, fără a distruge celulele sănătoase învecinate. Pentru tratamenul eficient al cancerului, una din cele mai promițătoare tehnici este aceea a sistemelor specifice de transport a medicamentelor. În cazul tratamentelor tradiționale, din cauza absorbției nespecifice a medicamentului chiar și de către celulele sănătoase, apar adesea efecte secundare grave și restrânge indicele terapeutic al multor medicamente împotriva cancerului. Prin urmare au fost studiate o varietate de sisteme de nanoparticule ce au ca scop îmbunătățirea livrării de medicamente .

Cancerul de sân este una dintre bolile cu rata de mortalitate cea mai mare în rândul femeilor la nivel mondial. Multe tratamente au fost folosite pentru tratarea acestuia dar toate aceste terapii convenționale au numeroase efecte secundare. De-a lungul timpului, o mulțime de compuși naturali au fost utilizați ca remediu împotriva cancerului. De exemplu: quercitina este o flavoproteină care se găsește în fructe de pădure, legume, struguri, semințe, nuci fiind cunoscută pentru proprietățile sale antioxidante, anticancerigene, antiinflamatoare, antidiabetice . Dar un mare inconvenient al acesteia este reprezentat de o biodisponibilitate mică, absorbție limitată, solubilitate mică în apă, stabilitate scăzută, timp de înjumătățire scurt și eliminare rapidă.

Avansarea în domeniul nanotehnologiei a permis explorarea de noi tehnici de sisteme de livrare a medicamentului. Cu ajutorul acestor nanomateriale vor fi depășite problemele de livrare de medicamente și de asemenea va spori eficiența terapeutică a acestora. .

Mai mult de atât, transportul controlat de medicamente poate de asemenea să mărească biodisponibilitatea medicamentelor în țesuturile tumorale și să reducă toxicitatea în țesuturile normale. S-a dovedit că acidul folic este un ligand specific pentru acest scop, deoarece multe celule canceroase cum ar fi cele localizate în țesutul ovarian, cervical, sân, plămân, rinichi, colorectal și creier, prezintă receptori ai acidului folic supra-exprimați . De asemenea, folații sunt factori cheie în replicarea ADN-ului și în proliferarea celulară. Astfel etichetarea cu acid folic a nanoparticulelor feromagnetice cu înveliș de quercetin, ar putea fi o abordare bună pentru inhibarea cancerului de sân .

Siguranța utilizării nanoparticuleleor feromagnetice

Datorită proprietăților lor fizico-chimice unice, nanoparticulele feromagnetice au numeroase aplicații actuale și potențiale aplicații viitoare, în special în domeniul biomedical, ceea ce le face cele mai fascinante nanomateriale. Printre alte utilizări, acestea sunt în prezent angajate în etichetarea de celule, transport controlat de medicamente, transportul genelor, biosenzori, terapie prin hipertermie, și diagnosticare, terapii împotriva cancerului si alte afecțiuni. Toate aceste aplicații medicale presupun internalizarea nanoparticulelor feromagnetice pentru un diagnostic și tratament eficient, ceea ce duce la creșterea potențialului de risc asociat cu expunerea organismului la aceste nanoparticule. Pe măsură ce aceste aplicații sunt în creștere, există o necesitate imperativă de a elucida efectele biologice nedorite ale acestora .

Cu toate acestea, în ciuda numeroaselor explorări, încă sunt informații insuficiente sau controversate la adresa potențialului lor toxic. Au fost revizuite efectele toxice raportate până în prezent de numeroase studii in vitro, in vivo și studii epidemiologice .Analiza tuturor datelor colectate subliniază lipsa de consesns în stabilirea mecanismelor toxice asociate cu expunerea la nanoparticulele feromagnetice, în principal din cauza variabilității mari a particulelor prezente în diferite studii. Compoziția chimică și stratul de la suprafață par a fi factori definitori ai toxicității. Nanoparticulele acoperite au toxicitate mai mică decât cele neacoperite. De asemena condițiile experimentale cum ar fi: tipul de celulă-țesut, concentrația, timpul de expunere, calea de administrare pot de asemenea influența rezultatele toxicității .

O atenție deosebită trebuie acordată procedurile tehnice utilizate pentru evaluarea toxicității, deoarece s-a dovedit recent că nanoparticulele feromagnetice interferă cu metodele utilizate în mod obișnuit pentru evaluarea citotoxicității și genotoxicității, care conduc la obținerea de rezultate fals-pozitive. Împreună cu numărul scăzut de studii publicate, în special cele efectuate în organisme vii, există într-adevăr o dificultate semnificativă pentru a realiza comparații și de a stabili un model de toxicitate pentru nanoparticulele feromagnetice, în principal din cauza diferitelor nanoparticule testate, dar de asemenea, lipsa standardizării metodologice.

Din cauza varietății de mecanisme care ar putea conduce la toxicitate celulară indusă de nanomaterial, este necesară o baterie de sisteme de testare armonizate pentru a stabili potențialul toxic prezumtiv la diferite niveluri. Mai mult, în scopul de a obține rezultatele în aceste investigații ale nanoparticulelor feromagnetice cu diferite învelișuri și caracteristici comparabile, este preferabilă utilizarea unor metode standardizate, inclusiv testarea corespunzătoare a interferențelor potențiale cu protocoale standard . Pe scurt, toxicitatea nanoparticuleleor feromagnetice, nu poate fi stabilită în mod corespunzător din moment ce rezultatele din studiile in vitro sunt adesea contradictorii, din studiile in vivo sunt limitate, iar studiile epidemiologice umane sunt aproape inexistente. Prin urmare, având în vedere importanța din prezent și promițătoarele aplicații viitoare, în special cele legate de scopuri biomedicale care implică introducerea directă a acestora în corpul uman, interacțiunile acestor nanomateriale cu sisteme celulare, precum și posibilele consecințe negative asupra sănătății în urma expunerii la aceste nanomateriale, necesită timp pentru a fi pe deplin înțelese și multă muncă depusă în acest domeniu .

CAPITOLUL 2

2. 1. Modelul CAM

Membrana corioalantoidiană (CAM) se formează în timpul dezvoltării straturilor mezodermale: alantoidiană și corionică. Această structură se extinde rapid generând o rețea vasculară bogată și oferă o interfață importantă pentru schimbul de gaze și deșeuri. Membrana corioalantoidiană permite studiul grefelor, creșterea tumorală și a metastazelor, vindecarea rănilor, livrarea de medicamente și analiza toxicologică, molecule angiogenice și anti-angiogenice.

Acest model este unul relativ simplu, rapid, ce necesită costuri scăzute și care permite examinarea unui număr mare de mostre farmacologice într-un timp scurt. Nu necesită proceduri administrative pentru obținerea aprobării comitetului de etică pentru experimentarea pe animale. Mai mult de atât, fiind în mod natural un sistem imunodeficient, pe embrionul de pui se pot efectua transplanturi de diferite țesuturi și de la diverse specii, fără răspunsuri imune .

2.1.1. Dezvoltare embrionică, structura morfologică și fiziologică

Alantoida embrionului de pui apare la aproximativ 3,5 zile de la incubare, ca o invaginare a peretelui ventral posterior endo-dermal. Împinge afară corpul embrionului, în coelomul extraembrionic. Vezicula alantoidiană se marește foarte rapid din zilele 4-10 de incubare și stratul mesodermal alantoidic fuzionează cu stratul adiacent mesodermal corionic și formează membrana corioalantoidiană (CAM). În acest dublu strat se dezvoltă o rețea vasculară foarte bogată care este conectată cu circulația embrionică prin două artere alantoidice și o venă alantoidică. Suprafața CAM se extinde rapid iar numărul de vase de sânge crește . Vascularizația CAM suferă trei faze de dezvoltare. În faza timpurie, multipli muguri capilari invadează mezenchimul, fuzionează și formează plexul capilar primar. În a doua etapă, mugurii nu mai sunt prezenți și sunt înlocuiți cu țesut microvascular în creștere . În ultima fază, țesutul vascular crește în dimensiune și formează ochiuri inter-capilare ce se împrăștie în mezoderm și cresc foarte rapid până în ziua 8 dând naștere plexului capilar . Acesta este intim asociat cu celulele epiteliului corionic și mediază schimbul de gaze cu mediul exterior. Proliferarea celulelor capilare este continuă și rapidă până în ziua 11 iar după aceea indicele mitotic scade rapid, sistemul vascular ajungând la aranjamentul final în ziua 18 , chiar înainte de eclozare .

La începutul dezvoltării embrionare, înainte de ziua 6 de incubare, CAM îndeplinește funcția de schimb de gaze de suprafață prin intermediul vascularizației . După aceea, vascularizția bogată și poziția alantoidei imediat subiacentă învelișului poros conferă o funcție respiratorie ridicată. Pe lângă schimburile respiratorii de oxigen și dioxid de carbon, alantoida servește și ca rezervor pentru produșii de excreție ai embrionului, uree, acid uric etc. Mai mult de atât, CAM este implicată în transportul ionilor de sodiu și clorură precum și mobilizarea calciului din înveliș pentru a începe mineralizarea osoasă .

2.1.2. Metode in ovo și ex ovo

Potrivit lui Hamburger și Hamilton, pentru embriogeneză, ouăle de pui feritilizate sunt plasate într-un incubator și sunt păstrate la umiditate constantă și la temperatură de 37 o C . În a treia zi, se face o fereastră pătrată în coaja oului, se elimină 2-3 ml de albumină pentru a favoriza detașarea CAM de coajă și punerea în evidență a vaselor de sânge. Fereastra este sigilată cu o bucataă de sticlă? și incubația continuă până în ziua experimentului. Această tehnică păstrează un mediu fiziologic intact. Cu toate acestea, ea limitează observarea zonei de transplant a grefei și microdisecția .

Embrionul și membranele extra-embrionice pot fi transferate în cutii Petri din ziua 3 sau 4 de incubație unde CAM se dezvoltă în partea de sus ca o membrană plată până ajunge la marginea vasului pentru a oferi un monostrat bidimensional în care se pot plasa multiple grefe . Astfel, accesibilitatea la nivelul embrionului este mult îmbunătățită din afara învelișului. Cu toate acestea, viabilitatea pe termen lung este adesesa mică pentru culturile în afara învelișului și o atenție deosebită trebuie acordată prevenirii uscării embrionului .

.

2.1.3. Creșterea tumorilor și metastazelor

Atunci când un mic fragment dintr-un organ al unui pui adult este transplantat pe CAM, acesta stimulează creșterea organelor embrionare omoloage . Atât țesuturi alogenice cât și xenogenice au fost grefate cu succes pe CAM, cum ar fi ficat, endometru, glandă suprarenală, cerebel, sau pielea intactă, precum și formarea de anastomoze periferice între vasele de sânge preexistente și cele ale gazdei, acest mecanism fiind implicat în revascularizarea grefelor embrionare .

O matrice celulară obținută din creier, aortă, femur, esofag, diafragmă, laringe, trahee pot fi transplantate pe CAM fără respingere și poate fi o matrice unde are loc creșterea celulară, angiogeneza și diferențierea celulară .

CAM a fost stabilită ca sistem experimental în tumorile biologice. Au fost comparate și evaluate creșterea, caracteristicile histologice, viabilitatea după retransplantul în gazda inițială și efectele asupra embrionului de pui, pentru celule de pui, șoarece și celule tumorale umane .

Grefarea de tumori solide sau de suspensii de celule tumorale pe CAM permite sudierea aspectelor morfologice ale interacțiunilor tumorilor cu vasele de sânge ale gazdei și identitatea vaselor de sânge care alimentează grefele. Formarea anastomozelor periferice între vasele gazdei și cele pre-existente donoare, este principalul și cel mai comun mecanism implicat în revascularizarea grefei unui organ embrionar pe CAM, întrucât germinarea vaselor derivate din CAM are loc numai în grefe de țesut tumoral .

Comparativ cu modelele de mamifere, unde creșterea tumorii durează adesea între 3 și 6 săptămâni, testele care folosesc embrioni de pui sunt mai rapide, xenogrefele tumorale devin vizibile în 2-5 zile de la inocularea celulelor tumorale. Tumorile grefate pe CAM rămân nevascularizate pentru câteva zile după care sunt penetrate de noi vase de sânge și începe o fază de creștere rapidă.

Celulele tumorale pot fi identificate în CAM, cât și în organele interne ale embrionului: plămâni, ficat și creier . Au fost utilizate nanoparticule virale pentru a vizualiza vascularizația nou formată în tumorile în expansiune cât și imagini de înaltă rezoluție. CAM poate fi utilizată ca model capabil de a studia dezvoltarea celulelor tumorale de cancer renal uman, cu scopul de a obține o completă caracterizare a fenotipului vaselor de sânge . Vasele de sânge intra-tumorale au fost colorate cu anticorpi anti desmin (detectează vasele ambelor specii) sau cu anti-CD31 pentru a detecta vasele de sânge umane sau cu isolectin SNA1 pentru a detecta vasele embrionului de pui. CAM a fost utilizată ca un sistem de test pentru chemosensivitatea tumorii , pentru studiul invaziei tumorale și al metastazelor și pentru neovascularizația implanturilor normale și tumorale. Prezența metastazelor în embrion a fost evaluată după 10 zile de la implantarea tumorii pe CAM și a fost testată capacitatea de inhibare a agenților chimioterapici asupra creșterii tumorii.

2.1.4. Molecule angiogenice și anti-angiogenice

Au fost raportate o varietate de compuși care pot stimula sau inhiba angiogeneza în CAM, inclusiv factori de creștere, hormoni, molecule naturale, agenți anti-canceroși, gaze, compuși organometalici, molecule pro-angiogenice, antibiotice, anticorpi și molecule mici sintetice. Agentul de testare este de obicei introdus sub forma unor discuri mici sau polimeri cum ar fi metilceluloza, alginatul, gelatina sau orice alt polimer. Un răspuns angiogenic are loc după 72-96 ore de la stimulare sub forma creșterii unei densități de vase de sânge în jurul implantului, vasele converg radial spre centru ca și spițele unei roți. Invers, atunci când un compus angistatic este testat, vasele devin mai puțin dense în jurul implantului după 72-96 ore și în cele din urmă dispar. Câteva tehnici calitative, cantitative și semicantitative au fost descrise pentru evaluarea angiogenezei. Tehnologiile imagistice permit vizualizarea perfuziei vasculare și vascularizația prin intermediul noilor agenți de contrast și imagistici care marchiază vasele de sânge selectiv și permit vizualizarea avestora la nivel microscopic. Este de remarcat faptul că cea mai dificilă parte în studiul dinamicii de creștere vasculară este cea din zona în care suprafața vasculară este subdivizată în zone concentrice, zona interioară transparentă este străvezie iar zona înconjurătoare este mai puțin transparentă, opacă. Aceasta este limitată la periferie de terminații sinusale, care au rezultat din lipsa unor sisteme de testare ușor cuantificabile, deoarece se formează în timpul dezvoltării embrionare timpurii între zilele 2 și 5 de incubare .

2.1.5. Sudiul transportului de medicamente și toxicologiei

Medicamentele transportate prim membrana corioalantoidiană pot trece în circulația sistemică după absorbție prin membrană și afecteză dezvoltarea embrionului de pui. Pe parcursul dezvoltării sistemelor de eliberare a medicamentelor, embrionii de pui pot fi folosiți pentru a evalua activitatea și toxicitatea medicamentulor atât asupra CAM și tumorilor grefate cât și asupra dezvoltării embrionului. Toxicitatea medicamentelor asupra embrionilor poate fi evaluată prin urmărirea numărului de embrioni morți și efectelor adverse asupra CAM, inclusiv inflamația și neovascularizarea. Sistemele de eliberare a medicamentelor se pot aplica local pe CAM sau pot fi injectate în cavitatea amniotică iar atunci când tumorile sunt grefate pe CAM, poate fi evaluată terapia anticanceroasă. Acest model poate fi utilizat pentru investigarea toxicității diferitelor substanțe, cum ar fi influența nicotinei și a fumului de țigară în dezvoltarea embrionilor de pui . În plus, poate fi evaluat efectul toxicității acute a glucozei iar CAM a fost acceptată ca substituent pentru testul Draize pe iepuri pentru testarea potențialului iritant al substanțelor. O corelație importantă a fost stabilită între valorile DL50 obținute în modelul CAM și cele obținute pe șoareci, ceea ce sugerează că studiul toxicității acute apărute la rozătoare poate fi evaluat în studii preliminare folosind modelul CAM.

2.1.6. Avantaje și limitări

Acest model este unul simplu, rapid și cu un cost scăzut ce permite investigarea unui număr mare de procese farmacologice într-un timp scurt. Nu necesită proceduri administrative pentru obținerea aprobării comitetului de etică pentru experimentele pe animale, deoarece în majoritatea țărilor embrionul de pui nu este considerat animal viu până în ziua 17 de dezvoltare . CAM nu este inervată și experimentele sunt finalizate înainte de dezvoltarea centrilor din creier asociați cu percepția durerii, ceea ce face ca acest sistem să nu necesite permisiunea pentru experimentele pe animale. Mai mult de atât, fiind în mod natural imunodeficient, embrionul de pui poate primi transplante de la diferite țesuturi și specii, fără răspunsuri imunologice.

Celulele limfoide timpurii derivate din sacul vitelin și splină sunt de obicei recunoscute de timus în ziua 8 și de bursa lui Fabricius (B cells) în ziua 11 . Celulele timusului sunt prezente până în ziua 11 și celulele responsabile de imunitate, până în ziua 13-14. . Până în ziua 12, fagocitele mononucleare se găsesc în sacul vitelin, splină, bursă, intestin, timus și în ficat .

Membrana corioalantoidiană de pui nu poate declanșa un răspuns imunologic împotriva celuleor tumorale străine până în ziua 12, dar poate răspunde celulelor tumorale prin infiltrarea monocitelor și celulelor inflamatorii, cum ar fi celule aviare heterofile (avian heterophils). Fiind în mod natural imunodeficient, embrionul de pui poate primi transplantele din diferite țesuturi și specii, fără răspunsuri imune. Mai mult de atât, CAM prezintă o vascularizație rapidă, permite dezvoltarea celuleor tumor plasate pe suprafața sa și permite observarea și analiza în timp real a schimbărilor ce au loc în morfologia masei canceroase .

Principala limitare sesizată a modelului CAM este reprezentată de o reacție inflamatorie nespecifică, care poate apărea dacă experimentul se extinde după 15 zile de incubare. Un răspuns inflamator nespecific este mult mai puțin probabil să apară atunci când materialul de testat este grefat pe CAM imediat ce aceasta începe să se dezvolte, în timp ce sistemul imunitar al gazdei este relati imatur.

Examinarea histopatologică în secțiunea CAM ajută la detectarea prezența infiltratului inflamator perivascular și reacția epiteliului corionic. CAM este de asemenea extrem de sensibil la modificarea factorilor de mediu, cum ar fi modificări ale presiunii de oxigen, ph-ul și osmolaritatea .

CAPITOLUL 3

CANCERUL MAMAR

Cancerul de sân s-a dovedit a fi cel mai frecvent tip cancer în randul femeilor, având simptome evocatoare tot mai frecvente. În SUA, în fiecare an, aproximativ 15 milioane de femei solicită servicii medicale din cauza îngrijorării provocate de cancerul de sân. Mai mult de 190.000 de femei sunt diagnosticate anual. Dintre aceste cazuri, 5 pana la 10 femei suportă biopsii care se dovedesc a fi benigne. De asemenea sunt solicitate îngrijiri medicale și pentru alte afecțiuni ale sânului cum ar fi: mastalgia (asociată cu un chist subiacent sau neasociată cu alte semne locale) și scurgere mamelonară .

.

Afecțiuni benigne ale sânului

Mastalgia, Chisturile, Nodulii – sunt afecțiuni obișnuite care apar de obicei împreună, fiind descrise sub termenul generic de boală fibrochistică mamară, aceasta putând fi asociată cu dezvoltarea cancerului de sân. Nu există dovezi care să confirme că tratarea acestora ar reduce riscul de apariție a cancerului de sân. Cea mai frecventă afecțiune mamară benigna este mastalgia. Premenopauzal durerea apare împreună cu ciclul menstrual sub forma intensificării disconfortulul premenstrual. Există cazuri în care durerea se asociază cu existența unor chisturi palpabile, ea putandu-se ameliora prin aspirarea conținutului chistului cu un ac fin. Lichidul aspirat va fi examinat citologic la femeile cu vârsta mai mică de 30 de ani iar modificările de volum, culoare, precum si reapariția chistului după aspirație trebuie ținute sub observație. Dacă fluidul se reacumulează rapid după aspirație sau conține sânge poate fi suspicionat un cancer localizat în peretele chistului, iar în acest caz chistul trebuie excizat. Alte cauze ale mastalgiei sunt cele hormonale. La cele mai multe dintre paciente, mastalgia se poate remite spontan după luni sau ani. Mastalgia poate fi ameliorată de Danazol, un androgen cu efecte adverse androgenice ușoare sau Tamoxifen, un antiestrogen cu puține efecte adverse. Aceste medicamente pot genera efecte adverse de lugă durată astfel încât necesită a fi administrate pe termen scurt. Dacă apare o sângerare de cauză necunoscută, ea trebuie investigată în scopul depistării unui posibil cancer de endometru. Limitarea aportului de substanțe ce conțin metilxantine, spre exemplu cafeaua, nu a dovedit niciun beneficiu în ameliorarea durerii .

.

Alte tumori benigne ale sânului sunt: fibroadenoamele, necroza grăsoasă și adenoza scleroasă. Pentru a fi siguri că nu este vorba de un cancer este necesară efectuarea biopsiei.

Scurgerea mamelonară este un simptom atât al afecțiunilor benigne cât și a celor maligne. Pentru diagnosticul diferențial, mamografia simplă sau cu substanță de contrast este extrem de utilă.

Infecțiile sânului apar cel mai frecvent în perioada postpartum sau după traumatisme. Dacă infecția apare în alt context, se pune problema unei afecțiuni subiacente, cum ar fi cancerul.

Ginecomastia este normală la barbați în perioada pubertății sau la senescență. Alte cauze ale ginecomastiei sunt reprezentate de diverse boli (in special hepatice), de consumul de marijuana sau de unele medicamente, precum : estrogeni, spironolactona, rezerpina, cimetidina, medicație antineoplazică .

.

Cancerul de sân – tipuri și factori de risc

Carcinomul în situ – este situat în întregime la nivelul ductului mamar, fără a determina si invazia țesuturilor normale adiacente. Este o formațiune tumorală întâlnită tot mai frecvent în zilele noastre, are o frecvență mai mare de 15% din totalul cazurilor de cancer de sân diagnosticate în SUA fiind mult mai frecvent in cazul tinerelor. Acestă creștere se datorează unui screening mai bun.

Carcinomul ductal în situ (CDIS) – are aspectul unei tumori palpabile și este localizată cel mai frecvent într-unul dintre cadranele sânului. Este considerat un precursor al cancerului invaziv dar fiind localizat, poate fi înlaturat în totalitate prin intervenție chirurgicală. Cauza frecventă a apariției CDIS este reprezentată de microcalcificările ce se pot observa pe mamografie. Această formă canceroasă apare la femeile în premenopauză și postmenopauză având o incidenâă de 43% în rândul femeilor cu vârsta cuprinsă între 40-49 de ani și 92% la femeile între 30 si 39 de ani.

Carcinomul lobular în situ (CLIS) – sau neoplazia lobulară, nu formează o tumoră palpabilă deci poate fi descoperit doar accidental. Microscopic, CLIS este diferit de CDIS. Intr-o proporție de 23-25%, pacientele cu CLIS dezvoltă cancer invaziv după o latență de pana la 40 de ani. Apare predominant la femeile în premenopauza. Acest cancer invaziv apare cu aceeași frecvență bilateral, fiind considerat mai mult un indicator al tendinței de apariție a cancerului decât un precursor.

Tumorile invazive ductale si lobulare – sunt tipuri histologice de cancer invaziv ce au frecvența cea mai crescută.

FACTORII DE RISC

Istoric familial de cancer de sân la rudele de gradul întâi ( femeile purtatoare de gene BRCA1 si BRCA2 ; femeile cu gena BRCA 1 prezintă același risc de a dezvolta cancer de ovar)

Istoric de cancer de sân în situ sau invaziv

Femeile cu o menarhă precoce, menopauză tardivă sau cu o primă sarcină tardivă

Istoric de afecțiune fibrochistică

Femeile care utilizeaza contraceptive orale prezintă un risc foarte mic de dezvoltare a cancerului de sân

Tratamentul de substituție cu estrogeni in postmenopauză

Factorii de mediu: alimentația, expunerea la radiații

CANCERUL DE SÂN LA BĂRBAȚI are o incidență de 1% față de cancerul la femei. Acest tip de cancer este de puține ori suspectat, de aceea atinge mai frecvent stadii avansate la bărbați, decât la femei. Prognosticul este același ca și pentru femeile care sunt depistate în același stadiu, iar tratamentul este aproape identic .

2.1.4 Simptome, semne și diagnostic

Mai mult de 80% din cancerele de sân sunt descoperite sub forma unui nodul chiar de către pacientă, fiind mai puțin frecventă prezența durerii, tumori cu creșterea sânului în dimensiuni sau condensări necircumscrise la nivel mamar. Daca în timpul examinării fizice se suspecteză existența cancerului, trebuie efectuată o biopsie, iar înaintea biopsiei, o mamografie pentru a ajuta la delimitarea zonelor de la nivelul sânului care trebuie biopsiate.

2.1.5 Screening

Examinarea sânilor poate fi facută atât de medic cât și de pacientă și începe cu inspecția vizuală pentru a putea identifica asimetria mărimii sânilor, inversiunea mamelonară și denivelările.

Mamografia de rutină – reduce cu 25-35% mortalitatea din cauza cancerului de sân în rândul femeilor asimptomatice cu vârsta de peste 50 de ani și cu un procentaj mai scăzut in cazul femeilor asimptomatice cu vârsta sub 50 de ani. Prin studiile de screening s-a dovedit că aproximativ 40% din cancere au fost detectate prin mamografie și nu prin examinare fizică. În cazul femeilor cu vârsta de peste 50 de ani, mamografia trebuie efectuată anual. Totuși , în cazul femeilor cu vârsta cuprinsă între 40 și 50 de ani există un dezacord în ceea ce privește screeningul. American Cancer Society recomandă pentru acest grup mamografia anuală, Național Cancer Institute recomandă mamografia la fiecare 1 sau 2 ani, iar American College of Physicians recomandă mamografia fară o anumită periodicitate, deoarece consideră că beneficiile mamografiei pentru acest grup sunt incerte.

Ecografia -ajută la diferențierea chisturilor mamare față de formatiunile solide. Dacă pacienta este asimptomatică, de obicei, chistul nu necesită tratament, însă unii medici consideră că toate chisturile trebuie aspirate, iar lichidul trimis la examen citologic. În cazul formațiunilor solide este necesară biopsia. Cu toate acestea ecografia nu este folosită ca test screening pentru cancer deoarece termografia și diafanografia ( transiluminarea) au o rată mare de rezultate fals- positive și fals- negative .

ASPIRINA (acidul acetil salicilic – AAS)

Aspirina (ASA), tot mai acceptată ca inhibitor predominant al ciclooxigenazei 1 (COX-1), are ca precursor acidului salicilic (SA), acesta neavând aceeași activitate. Acidul salicilic este larg răspândit în natură, fiind prezent în numeroase plante în diferite concentrații. Doze foarte mici și repetate de acid acetilsalicilic, produc inhibiția COX-1. Dovezile pentru profilaxia cancerului se bazează pe doze de cel puțin 75mg pe zi. La baza eficacității indubitabile în medicina preventivă stau mecanisme pleiotropice (capacitate a unei gene de a condiționa apariția concomitentă a mai multor caractere ereditare; pleiotropism) dar bariera utilizării acesteia este dată de toxicitatea gastro-intestinală. Formulările combinate ASA-SA poate îmbunătăți raportul risc-beneficiu pentru preparatele chemo-profilactice .

Scenariul actual de medicina preventivă pentru AAS

Recomandările curente pentru utilizarea aspirinei în prevenția primară sunt de a evalua raportul beneficiu-risc pentru subiecți individuali. Acest lucru necesită o echilibrare a riscului cardiovascular împotriva riscului gastrointestinal la doze mici de AAS sau pentru prevenirea cancerului colorectal,. Cazul de utilizare a acidului acetilsalicilic după diagnosticul cu cancer este o chestiune separată dar, din nou, necesită o evaluare atentă a riscurilor. Speranța ce are în vedere îmbunătățirea raportului beneficiu-risc pare să se bazeze tot mai mult pe funcția de agenți antiplachetari. Luarea în considerare a modului de a optimiza utilizarea AAS se pare că a ajuns într-un impas .

Farmacopeile specifică faptul că formulările acidului acetilsalicilic trebuie să aibă un conținut minim de acid salicilic. Efectul acidului acetilsalicilic asupra durerii și procesului inflamator identificat se bazează pe activitatea inhibitorie asupra ciclooxigenazei și a condus ulterior la o linie lungă de antiinflamatoare nesteroidiene. Descoperirea efectului rapid și permanent de inhibiție a agregării plachetare prin acetilarea COX-1 a condus la confirmarea faptului că acesta este principalul mod de acțiune. O astfel de acceptare se pare că se extinde la eficacitatea acestuia în cancerul colorectal și alte chemoprevenții, deși un număr mare de dovezi anterioare au arătat că în cancerul colorectal expresii aberante ale COX-2 au fost modulate de inhibiția COX-2 . Schimbara mecanismului de acțiune în funcție de doze accentuează apartiția eficacității anti-cancer, așa cum este utilizat pentru protecția bolilor cardiovasculare, având efecte directe minore asupra COX-2 . Cu toate acestea, perspectivele clinice curente asupra efectului inhibitor COX-1 și în funcție de doză asupra COX-2, distrag atenția de la potențialele beneficii ale acidului salicilic care este recunoscut pentru proprietățile sale antiinflamatorii, analgezice și antipiretice.

Acidul salicilic și metaboliții săi sunt constituenți normali ai sângelui uman și animal . Cu toate acestea s-a demonstrat că nivelul seric variază în funcție de dietă, vegetarienii prezentând niveluri mai ridicate fiind comparabile cu cele ale pacienților tratați cu doze mici de aspirină . Acest lucru poate avea o importanță epidemiologică în ceea ce privește prevalența cancerului colorectal. Acidul salicilic, persistă în corpul uman și în condiții de repaus alimentar prelungit, atrăgând atenția asupra rolului endogen . Având în vedere ce se știe despre acidul salicilic, este de așteptat ca efectele acidului acetilsalicilic să se datoreze puțin și acidului salicilic – al cărui rol principal este în mecanismul de apărare al plantelor, unde induce o rezistență sistemică dobândită și moarte celulară programată, fiind asemănător cu efectul asupra inflamației în sistemele animale.

Datorită unui rol major propriu al acidului salicilic în multe utilizări este susținut de prezența receptorilor acidului salicilic în țesuturile umane, în plante, fiind cunoscută modularea termogenezei și a mecanismelor inflamatorii în general. Principalul metabolit circulant al acidului acetilsalicilic este acidul salicilic cu un timp de înjumătățire de 2-30 de ore în funcție de formulare: timpul de înjumătățire pentru acidul acetilsalicilic este de 20 de minute și se datorează hidrolizei rapide a acestuia de către esterazele din ser. De asemenea are loc acetilarea mai multor biomolecule de către acidul acetilsalicilic , acest profil cinetic având un rol restrictiv in vivo pentru acetilarea non-COX la doze mici.

Există studii epidemiologice care demonstrează că utilizarea regulată a aspirinei este asociată cu o incidentă scazută de dezvoltare a cancerului . Un interes crescut au prezentat inhibitorii selectivi de COX-2 fiind considerați atât agenți de prevenire a cancerului cât și agenți terapeutici pentru pacienții cu boli maligne, fiind verificat profilul lor toxicologic. Aspirina prezintă numeroase mecanisme de acțiune care contribuie la efectul anti-cancer. Influențează de asemenea procese celulare ca apoptoza și angiogeneza care sunt cruciale pentru evoluția și creșterea formațiunilor tumorale. Există sugestii că aceste efecte pot apărea independent de inhibiția COX fiind pusă sub semnul întrebării strategia de a-și concentra atenția în special asupra inhibitorilor selectivi COX-2. Studii randomizate ale aspirinei, proiectate in principal asupra prevenirii bolilor cardiovasculare, au demonstrat o scădere a deceselor din cauza cancerului urmărite pe termen lung. Preocupările despre toxicitate, hemoragiile foarte grave, au limitat utilizarea aspirinei ca agent de prevenire a cancerului dar studii epidemiologice recente demonstrează că utilizarea regulată a aspirinei după diagnosticarea cu cancer îmbunătățește rezultatele avand rol de adjuvant iar raportul beneficiu risc poate fi diferit.

2.2.2 Efectele chemopreventive ale aspirinei

Deși a fost comercializată pentru prima dată în anul 1899, aspirina rămâne piatra de temelie a terapiei antiplachetare pentru tratamentul pacienților cu sindroame coronariene acute și cu rol secundar în prevenirea complicațiilor aterotrombotice la pacienții cu risc crescut .

Locul pe care îl ocupă aspirina în prevenirea primară rămâne controversat , organizațiile din America de Nord și Europa emit ghiduri de tratament contradictorii. Recent, U.S. Preventive Services Task Force(USPSTF) recomandă “inițierea utilizării de doze mici de aspirină pentru prevenția primară a bolilor cardiovasculare și a cancerului colorectal la adulții cu vârsta cuprinsă între 50 și 59 de ani care au 10% sau mai mult de 10 ani risc de boli cardiovasculare, care nu au un risc crescut de sângerare, care au o speranță de viață de cel puțin 10 ani și sunt dispuși să ia doze mici de aspirină zilnic timp de cel puțin 10 ani” . Această recomandare evidențiază efectul chemopreventiv al dozelor mici de aspirină atât pentru cancerul colorectal cât și pentru alte tipuri de cancere .

Surse care evidențiază efectul chemopreventiv al aspirinei

Cel puțin patru linii independente de dovezi sugerează faptul că utilizarea regulată a aspirinei are un efect protector împotriva dezvoltării cancerului colorectal:

Un număr mare de studii caz-control și o meta-analiză a acestora

Patru studii randomizate controlate la subiecți cu adenoame colorectale și meta-analiza lor

Studii randomizate controlate în cazul sindromului Lynch cu un post-proces de urmărire

O metaanaliză a 51 de studii randomizate controlate ce oferă date individuale ale pacientului, în prevenția evenimentelor cardiovasculare

În 1988, Kune și alții au descris asocierea între riscul cancerului colorectal și mai multe boli cronice, operații și diverse medicamente în rândul a 715 pacienți cu cancer colorectal și 727 subiecți de aceeași vârstă și sex utilizând date dintr-o bază vastă de studii pentru acest tip de cancer, Melbourne Colorectal Cancer Study. A existat un deficit statistic semnificativ între cazurile în care a avut loc utilizarea de medicamente care conțin aspirină și acest lucru a fost în concordanță cu ambele tipuri de cancere, de colon și rectal, atât pentru femei cât și pentru bărbați . Această constatare, fără o explicație mecanicistă, a fost confirmată de multe studii și meta-analiza acestora . În studiile caz-control, utilizarea regulată a aspirinei a fost asociată cu reducerea riscului pentru cancerul colorectal cu puțină eterogenitate a efectului în rândul studiilor . În mod similar, reduceri consistente au fost observate la cei cu risc pentru cancerul esofagian, gastric, biliar și cancer mamar. În general, cele mai mari efecte observate în studiile caz-control au fost pentru riscul de cancer gastro-intestinal . Până la sfârșitul secolului trecut, o bază solidă de dovezi au fost acumulate ca știință de bază, care sugerează un rol important al ciclooxigenazei (COX), în special COX-2, în carcinogeneza gastro-intestinală și epidemiologic, sugerând o asociere între utilizarea regulată a inhibitorilor COX (atât aspirina cât și antiinflamatoarele nesteroidiene tradiționale) și reducerea riscului de cancer gastro-intestinal, în special colorectal . Această dovadă a fost considerată suficient de convingătoare pentru companiile de medicamente, dezvoltând celecoxib și rofecoxib pentru a iniția pe termen lung trialuri randomizate (RCT randomized controller trials) pentru a testa efectul chemopreventiv al inhibitorilor COX-2 selectivi la pacienții cu adenoame colorectale sporadice. Această dovadă, a determinat de asemenea investigatori independenți pentru a sonda efectul chemopreventiv la doze relativ mici de aspirină(81 până la 325 mg o dată pe zi) în același cadru clinic. Rezultatele acestor trialuri randomizate au fost remarcabile, arătând o reducere a riscului cu 20%-40% în orice recurență de adenom , asociată cu 3 ani de tratament cu un inhibitor al COX indiferent de selectivitatea izoenzimei.

Studiite randomizate cu privire la coxibe au stabilit fără echivoc pericolul cardiovascular asociat cu acești agenți și a dus la oprirea altor studii anticanceroase în curs. În schimb, rezultatele studiilor pe aspirină au avut un impuls suplimentar pentru cercetările de bază și clinice în domeniul inhibitorilor COX și cancer. O meta-analiză pe datele individuale ale pacienților pe 4 studii randomizate pe aspirină având aproximativ 3.000 de participanți, cu istorii recente de adenom colorectal sau cancer al intestinului gros, au demonstrat că există un procent de 17% de reducere a riscului în recurența adenomului și un procent de 28% în ceea ce privește reducerea riscului de reapariție a leziunilor avansate, aceste efecte nefiind dependente de dozele chemopreventive, încadrandu-se în dozele utilizate zilnic în aceste studii . De fapt, o comparație directă între dozele mari (300-325 mg pe zi) și dozele mai mici (81-160 mg pe zi) de aspirină au arătat în mod semnificativ o reducere a riscului recurenței pentru orice tip de adenom (obiectivul principal al acestor analize) cand a fost utilizată aspirina în doze mai mici . Aceste constatări au furnizat dovezi convingătoare că aspirina în doze mici interferă cu un proces timpuriu în transformarea mucoasei intestinale normale în adenom, precursorul celor mai multe cancere colorectale (Figura 3.1).

O a treia dovadă pentru efectul chemopreventiv al aspirinei împotriva cancerului colorectal vine din partea CAPP2 (Colorectal Adenoma/Carcinoma Prevention Programme2) , studii randomizate cu 600 mg aspirină pe zi versus placebo pe pacienți cu sindromul Lynch, o formă majoră de ereditate a cancerului colorectal. Până la 5% din cazurile de cancer colorectal rezultă din sindromul Lynch, care este caracterizat printr-o nepotrivire în repararea genelor defecte . Deși nu a existat niciun beneficiu clinic pe perioada tratamentului programat, purtătorii unei mutații în cazul sindromului Lynch care au primit aspirină timp de până la patru ani , au prezentat o reducere semnificativă a incidenței apariției cancerului, fiind urmăriți pe o perioadă medie de 56 de luni, în concordanță cu prevenirea evenimentelor timpurii în carcinogeneza colorectală .

În limitele analizelor post-hoc a evenimentelor de cancer care nu au fost obiectivele pre-specificate în studiile aspirinei pentru prevenirea afecțiunilor cardiovasculare, rezultatele acestor studii indică următoarele aspecte :

Beneficii detectabile au fost observate la doze zilnice mai mici de 75 mg

Chemoprevenția evidentă a aspirinei a fost saturabilă la doze mici (dozele mai mari nu s-au devedit a fi mai eficiente.

Evidența efectului chemopreventiv al aspirinei a fost la bărbații cu risc ridicat de afecțiuni cardiovasculare tratați cu 75 mg de aspirină cu eliberare controlată, sistem special creat pentru a maximiza inhibiția COX-1 în circulația pre-hepatică și de a minimiza inhibiția COX-2 .

Mai mult decât atât, un studiu de sănătate pe termen lung a raportat o scădere a riscului cancerului colorectal în cazurile în care s-a utilizat alternativ într-o zi 100 mg aspirină și placebo. Astfel principalele caracteristici ale efectului chemopreventiv al aspirinei pare a recapitula caracteristicile efectului antiplachetar, care este, de lungă durată și cel mai important, saturabilitatea la doze mici . Punctele forte ale acestei analize includ coerența probelor din mai multe studii diferite, precum și faptul că acestea au fost evaluate ca intenție de tratament în cohorte, comparând grupurile în care nu toți pacienții au luat aspirina cu grupurile de control. Măsura retrospectivă a analizelor reprezintă un punct slab. Datele prospective suplimentare cu privire la efectele dozelor mici de aspirină privind incidența cancerului și a mortalității sunt în prezent colectate în cel puțin patru prevenții primare în studii randomizate în mai mult de 50.000 de pacienți asimptomatici, recrutați din cauza diabetului zaharat, vârsta înaintată sau cei care au un risc cardiovascular mai mare de 10 ani . Atât mărimea cât și durata (5-7.5 ani) acestor studii randomizate au dus la înregistrarea a aproximativ 3.000 de noi cazuri de cancer în timpul desfășurării, oferind astfel date statistice adecvate pentru a detecta efectul tratamentului cu aspirină .

Mecanism de acțiune

Datorită structurii sale poate inhiba proliferarea și induce apoptoza celulelor canceroase in vitro, independent de efectul inhibitor asupra biosintezei prostaglandinelor . Aceste efecte au fost detectate în principal la concentrații foarte mari de aspirină, concentrații ce nu sunt atinse în circulația sistemică in vivo, chiar și atunci când aspirina este administrată în doze anti-inflamatorii . De fapt, după un termen lung în care se administrează doze mici de aspirină(100 mg pe zi), acidul acetilsalicilic și acidul salicilic sunt detectați în circulația sistemică cu picuri plasmatice de 4,0 și 40 mm. Timpul de înjumătățire plasmatic al acidului acetilsalicilic este de numai 20 de minute, în timp ce al acidului salicilic este de 2 până la 4 ore. Biodisponibilitatea sistemică slabă a aspirinei se datorează hidrolizei rapide a acidului acetilsalicilic în acid salicilic în intestin, plasmă, de către esterazele hepatice.

Pe baza acestor caracteristici farmacocinetice, căile moleculare presupuse a fi implicate în efectele anticanceroase pot fi afectate de concentrații micromolare de acid acetil salicilic și efectul inhibitor poate persista până la 24 de ore, în ciuda timpului de înjumătățire scurt al medicamentului. Aceste cerințe pot fi îndeplinite de inactivarea ireversibilă a medicamentului țintă sau a celulelor țintă cu rată mică de sinteză de novo. Aceste ipoteze, cum ar fi lipsa dependenței de doză a efectului chemopreventiv , a condus la ipoteza că doze mici de aspirină produc un efect anticanceros prin inhibiția funcției plachetare, prin capacitatea sa de a inactiva ireversibil COX-1 prin acetilarea unui rest de serină Ser529 aflat în apropierea situsului catalitic al enzimei . Deși aspirina poate acetila un număr mare de proteine plasmatice, enzime și acidul dezoxiribonucleic in vitro , acest lucru necesită concentrații milimolare care sunt de aproximativ 100 până la 1000 de ori mai mari decât cele realizabile în urma unui regim cu deze mici .

Efectele protectoare ale aspirinei în doze mici împotriva cancerului par să reflecte prevenirea timpurie a apariției neoplasmului de-a lungul tractului digestiv, precum și o acțiune antimetastazică. Ambele efecte pot fi explicate prin efectul antiplachetar la deoze mici de aspirină (Figura 3.1.) . La doze mici de aspirină sunt inhibate prostaglandinele E2(PGE2) si tromboxan A2, prostaglandine ce conțin fosfolipide oxidate și sfingozin-1 fosfat ce pot contribui la diafonia(cross talk) printre trombocite, celule tumorale precum și alte celule din jurul tumorii. În acest context trebuie să se ia în considerare punerea în libertate a conținutului α granular al trombocitelor , care cuprinde o serie de proteine, inclusiv autacoide angiogenice și factori de creștere care pot induce expresia COX-2 în celulele adiacente ale mucoasei gastro-intestinale . Trombocitele activate, pot de asemenea elibera diferite tipuri de vezicule, inclusiv exozomi , care conțin un număr mare de acizi microribonucleici . Un eveniment important care are loc în tumorigeneză este biosinteza îmbunătățită a PGE 2. Această prostaglandină se leagă și activează proteina G și se cuplează cu receptorii EP1-4, al căror semnal poate influența caracterul aderent, migrator și invaziv al celulelor în timpul dezvoltării și progresiei cancerului , putând genera un micromediu care facilitează formarea și progresia tumorii prin invazia cu interferon de tip I și/sau celule T dependente de eliminarea tumorii. PGE 2 poate fi produsă de către ambele izoenzime COX iar deleția genelor fie pentru COX-1 fie pentru COX-2 conduce la reducerea tumorigenezei intestinale . Nivelurile de PEG2, dependente de creșterea concentrațiilor plasmatice de COX-1 _)(*Increased COX-1-dependent PGE2, reflectă de asemenea suprimarea enzimei catabolizatoare, 15-prostaglandin dehidrogenaza, care joacă un rol important în stadiile timpurii ale tumorigenezei intestinale. În contrast, expresia COX-2 este detectabilă într-un anumit subgrup de adenoame dar este semnificativ crescută în cancerul colorectal . Cu toate acestea, efectul anticanceros al aspirinei la doze mici nu poate fi explicat prin inhibiția dirctă asupra COX-2, deoarece nivelurile circulante ale medicamentului sunt insuficiente petru a acetila complet COX-2 iar acest proces poate fi rapid reversibil prin sinteza de noi proteine. Doze mici de aspirină pot de asemenea să acetileze COX-1 din celulele nucleate ale mucoasei intestinale, reducând astfel producția de PEG-2 locală . Cu toate acestea, dependența de doză și timp a acestui efect rămâne să fie mai mult investigată. Dovezile experimentale sunt în concordanță cu ipoteza că efectul anticanceros la doze mici de aspirină implică în primul rând inhibiția activării plachetare declanșate de leziuni ale mucoasei gastro-intestinale, imobilizarea și activarea celulelor stromale și interacțiunea cu celulele epiteliale.

Mai mult, inhibarea funcției plachetare poate interfera cu metastazele tumorale, în măsura în care formarea de agregate de trombocite în jurul celulelor tumorale circulante le protejează de acțiunea sistemului imunitar și promovează sechestrarea lor în endoteliu și extravazare. Diafonia crosstalk între trombocite și celulele canceroase induce un fenotip mesenchimal-like, dotând celulele canceroase cu o capacitate crescută de metastazare . Este interesant faptul că celulele canceroase mesenchimal-like, au o acțiune pro-agregantă asupra trombocitelor (in vivo, pe șoareci); această proprietate poate contribui la fomarea de agregate plachetare în jurul celulelor tumorale, facilitând astfel răspândirea metastazelor canceroase . De fapt, administrarea în doze mici de aspirină la soareci inhibă biosinteza prostaglandinelor trombocitare și această funcție a fost asociată cu reducerea formării metastazelor .

Figura 3.1. Modificarea fenotipică indusă de trombocitele implicate în carcinogeneza colorectală. Un potențial mecanism de acțiune al aspirinei în doze mici ca agent chemopreventiv

Trombocitele sunt activate ca răspuns la factorii de mediu, rupturii plăcii aterosclerotice sau fisurarea și deteriorarea mucoasei intestinale. Activarea acestora duce la eliminarea mediatorilor lipidici, incuzând prostaglandine: tromboxan A2 (TXA2) și prostaglandine E2 (PGE2), proteine α granulate (cum ar fi factoi angiogenici, factori atiangiogenici, factori de creștere, proteaze și numeroase citokine, diferite tipuri de vezicule incluzând exozomi bogați în microARN. Prin urmre trombocitele activate eliberează o varietate de mediatori care pot activa numeroase căi de semnalizare asociate cu modificarea fenotipică a compartimentului celular al stromei. Aceste evenimente modifică interacțiunile celulelor epiteliale și stromale și crează un micromediu care determină apariția neoplaziei intestinale. Un evenimet cheie este biosinteza îmbunătățită a PGE E2 in mucoasa intestinală, eveniment care are loc în stadiile inițiale ale dezvoltării tumorale prin intermediul activității COCS-1, în asociere cu supresia 15-PGDH. Mai târziu este indusă sinteza COCS-2 care stimulează producția de PGE2. Astfel, determinând transformarea adenomului colorectal în adenocarcinom. observate frecvnt Nivele crescute de nPGES-1 sunt concomitent cu supraexpresia COCS-2. Producția crscută de PGE2 de către celulele epiteliale intestinale transformate perturbă procesul apoptotic normal, permite celulelor afectate să acumuleze mutații genetice și ultimă instanță conduce la pierderea controlului proliferativ. Mai mult decât atât este posibil să deprime funcțiile imune și să faciliteze tumor immune escape . mediatorii derivați din plachete, de asemenea conduc la activarea tranziției epitelial-mezenchimală (EMT). Emt este un proces în care celulele epiteliale își pierd polaritatea și sunt convertite la un fenotip mezenchimal, eveniment decisiv în timpul apariției metastazelor. În celulele canceroase acest eveniment destabilizează joncțiunile celulare și permite emigrarea, dar în același timp deterimă apariția unor proprietăți celulă stem-like care facilitează colonizarea metastatică. Reglarea down a funcției plachetelor de către doze mici de aspirină oprește inducția cascadei evenimentelor moleculare și biologice asociate cu geneza tumorală și dezvoltarea metastazelor la nivelul compartimentului stromal și al celulelor epiteliale. Implicarea unui mecanism dependent de cocs în transformarea mucoasei colorectale normale în adenom este dovedită de trialuri randomizate cu doze mici de aspirină. Participarea mecanismelor cocs dependente în tranziția adenom-carcinom este susținută de studii observaționale și retrospective a trialurilor randomizate cu aspirină pentru prevenția bolilor cardiovasculare .

De completat cu o concluzie gennnnn

CAPITOLUL 4

Efectul nanoparticulelor feromagnetice, cu înveliș de acid salicilic, asupra xenogrefelor tumorale de cancer mamar, utilizând modelul CAM

Aristotel a raportat în „Historia animalium” teoria lui despre caracteristicile comune între embrionul de pui de găină și corpul uman. După mulți ani de experimentare, membrana corioalantoidiană a embrionului de pui de găină a devenit un model bine cunoscut pentru a studia și a înțelege bolile umane precum cancerul și afecțiunile cardiace . De asemenea modelul CAM este unul util pentru a studia angiogeneza, metastazele cancerului și de a vizualiza dinamica vascularizației și a fluxului de sânge tumoral iar recent a fost recunoscut ca model preclinic . Mai mult decât atât, Kue și alții susțin faptul că modelul CAM este unul adecvat, predictiv pentru testarea siguranței și stabilirea toxicității substanțelor farmaceutice .

Pentru a înțelege biologia cancerului și pentru a proiecta noi medicamente sau transportori de medicamente, modelul embrionului de pui de găină este un model in vivo care oferă o serie de avantaje majore : vascularizație bună, CAM este ușor de accesat, lipsa unui sistem imunitar dezvoltat, posibilitatea de a observa în timp real schimbările morfologice, dezvoltarea rapidă a xenogrefelor tumorale, manevrare ușoară, model rapid, reproductibilitate majoră și costuri mici .

MNPs (nanoparticulele feromagnetice) au utilitate semnificativă în domeniul medical (imagistică, transtortul de medicamente, teste imunologice), bazându-se în special pe proprietățile lor magnetice unice și biocompatibilitate in vivo . Profilul toxicologic favorabil al MNPs este crescut prin acoperirea acestora cu substanțe biocompatibile (lipide, protein, acid salicilic etc.) . Designul nanoparticulelor este implicat în alegerea modului de administrare și de asemenea în aplicațiile biomedicale viitoare. De exemplu un timp de înjumătățire lung al nanoparticulelor feromagnetice este util pentru detectarea tumorilor in vivo și imagistică eficientă . Pentru a spori biodisponibilitatea MNPs este necesară acoperirea suprafeței lor cu diferite molecule (PEG, dextran, amidon, ec. ) care să reziste la interacțiunile cu sistemul reticulo-endotelial .

Introducere

Metodele ușoare de sinteză, proprietățile fizice dependente de dimensiune și de asemenea aplicațiile biologice (farmaceutice, medicale), sunt aspecte care explică interesul crescut al oamenilor de știință pentru domeniul nanobiotehnologiei, în special pentru nanoparticulele magnetice . Biocompatibilitatea in vivo și proprietățile magnetice sunt principalele avantaje ale nanoparticulelor magnetice de oxid de fier (MNPs) în medicină, fiind utile pentru diagnosticare și tratament .

În funcție de metodele de funcționalizare a suprafeței și de structura chimică a învelișului, aplicațiile biomedicale ale MNPs pot fi:

Agenți de contrast în imagistică prin rezonanță magnetică

Distrugerea tumorilor prin încălzire și țintire

Inginerie tisulară

Separare celulară

Transportul medicamentelor

Emboloterapie

Numeroase studii in vitro și in vivo au urmărit citotoxicitatea, calea metabolică, distribuția la nivelul țesuturilor și intervalul de stabilitate al nanoparticulelor de oxid de fier funcționalizate cu diferite învelișuri (Fe3O4@PEG, Fe3O4@dextran, Fe3O4@polizaharide, etc.) . Studiile de evaluare a biocompatibilității au arătat că MNPs au o toxicitate foarte mică sau chiar deloc asupra celulelor și țesuturilor la concentrații mai mici de 10 µg/mL .

În ultimul deceniu, membrana corioalantoidiană a embrionului de găină (CAM) a fost utilizată pe scară largă ca model pentru a studia dezvoltarea tumorilor și a metastazelor și de asemenea pentru a investiga efectele unor substanțe anticanceroase . Modelul CAM este un model in vivo avantajos, fiind ușor de manevrat și ieftin, având de asemenea și avantaj etic prin reducerea numărului de animale implicate în studiile preclinice . Morfologia și dimensiunea suprafeței sunt parametri importanți pentru a investiga timpul de circulație în sânge și distribuția în țesuturi a nanoparticulelor . Nanoparticulele mai mari de 50 nm sunt reținute rapid de către macrofage, celulele Kupffer și celulele reticulo-endoteliale, în timp ce nanoparticulele cu diametrul mai mic de 50 nm sunt rapid extravazate prin fenestrațiile endoteliale .

Scopul lucrării de față este acela de a studia persisteța în sânge a nanoparticulelor de Fe3O4/acid salicilic cu un diametru hidrodimanic de peste 50 nm, injectate în vasele embrionare ale membranei corioalantoidiene de pui de găină, precum și capacitatea lor de fi conduse prin vasele CAM cu ajutorul unui câmp magnetic exterior, pentru a bloca alimentarea cu sânge a xenogrefei tumorale. Am folosit metoda de injectare intravenoasă deoarece este cea mai utilizată metodă de administrare, așa cum a fost raportat în studiile care investighează comportamentul biologic al MNPs funcționalizate pe modele animale .

Metode

Sinteza și caracterizarea nanoparticulelor

Pentru sinteza nanoparticulelor de Fe3O4 cu înveliș de acid salicilic a fost folosită sinteza Massart modificată . Toți reactivii folosiți (KOH, FeCl3, FeSO4, acid salicilic) au fost analizați din punct de vedere analitic, fiind procurați de la Sigma-Aldrich. Apa ultrapură utilizată în toate etapele sintezei a fost obținută utilizând purificatorul de apă Millipore Elix 5. Pentru toate etapele de sinteză au fost luate în considerare precauțiile speciale de curățenie pentru a evita contaminarea nanoparticulelor. Pe scurt, sărurile hidratate obținute în raport stoechiometric Fe II și Fe III (1,25 g FeSO4 și 2 g FeCl3) au fost dizolvate în apă ultrapură (250 ml), urmând precipitarea în condițiile de bază (10 g KOH, 0,5 g acid salicilic și 250 ml apă ultrapură) utilizând o baie de ultrasunete la 50 C. Au urmat mai multe etape de spălare (cu apă ultrapură) care au implicat sonication și separare magnetică pentru a elimina excesul de KOH și acid salicilic. Caracterizarea nanoparticulelor a implicat ICP-OES () pentru a evalua concentrația fierului, analiza HRTEM() pentru a stabili diametrul miezului și analiza DLS() pentru a evalua potențialul Zeta și diametrul hidrodinamic al SaMNPs din probă.

Analiza ICP-OES

Această metodă implică aducerea în stare de plasmă prin atomizarea și ionizarea probei nebulizate, (involves plasma atomization and ionization of the nebulized sample and first/second-order emission lines quantification, using Eschelle polychromator/CID-TEcooled array detector) și prima/a doua oară?? cuantificarea liniilor de emisie, folosind Eschelle policromator/ CID-TE detector de matrice răcită.

Condițiile experimentale sunt următoarele:

Thermo iCAP 6000

iTeva software

putere plasmatică 1150 W

plasmă radială

pompă peristaltică cu viteza 50 rpm

nebulizator cu fluxul de 1,5L/min

nebulizator toroidal

plasmă argon cu debit de 12L/min

Rezultatul analizei cantitative ICP-OES a fost obținut ca o medie de trei valori ( două dintre aceste valori au fost folosite și pentru a exclude posibilele interferențe de matrice). Calibrarea a fost realizată utilizând o soluție cu 23 de elemente ca material de referință.

Analiza DLS

Măsurătorile dimensiunilor particulelor au fost efectuate cu ajutorul DLS cu un dispozitiv Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd. United Kingdom). Diametrul mediu (Z-mediu) și indicele polidispersiei (Pdl) al nanoparticulelor în dispersie apoasă au fost determinate la un unghi de 90 ̊ . Toate măsurătorile au fost efectuate la 21 ̊ C și datele finale reprezintă media a trei masurători individuale.

Analiza HRTEM

Imaginile de înaltă rezoluție ale probei de SaMNPs sub formă de pulbere fină au fost obținute folosind HRTEM (FEI Tecnai G2 F30 S-TWIN care funcționează la 300 keV cu o rezoluție de 1 A°) echipat cu un spectrometru SAED și EDAX (pentru analiză prin dispersie energetică cu raze X, EDS).

Testul CAM

Timpul de persistență intravasculară a SaMNPs

Acest experiment a fost efectuat pentru a determina timpul de persistență intravasculară (ITP) a SaMNPs în vascularizația membranei corioalantoidiene de pui de găină. ITP indică de câte ori nanoparticulele pot fi acumulate la nivelul unui vas de sânge ales sub dirijarea unui câmp magnetic extern. Au fost utilizate trei loturi cu câte 10 ouă albe Leghorn, cărora le-au fost făcute ferestre pe partea de sus și ulterior sigilate, apoi au fost incubate până în ziua 12, când rețeaua vasculară a CAM este aproape complet dezvoltată pentru a permite injectarea intravasculară a SaMNPs. Fiecare lot de ouă a fost injectat cu trei doze diferite de soluție apoasă de SaMNPs și anume: 0,07 ml (primul lot), 0,15 ml (al doilea lot) și 0,20 ml (al treilea lot). Pe suprafața fiecărei CAM a fost identificată o bifurcație arterială ușor accesibilă, având același diametru, pe suprafața căreia s-a aplicat timp de 5 min un puternic câmp magnetic static (cu ajutorul unui magnet cilindric de 0.18 T NdFeB). Imediat după îndepărtarea câmpului magnetic, s-au obținut imagini intraarteriale ale agregatelor de SaMNPs după care ouăle au fost repuse în incubator pentru 15 minute până la următoarea reaplicare a magnetului. Această etapă a fost repetată până când nu s-au mai observat agregări ale SaMNPs în lumenul intraarterial după îndepărtarea magnetului. Suprafețele intraluminale ale agregatelor de nanoparticule au fost măsurate de patru evaluatori independenți utilizând software-ul Adobe Photoshop. (The relative areas of the intraluminal deposition surfaces of SaMNPs aggregates on the acquired images were measured by four independent evaluators using the AdobePhotoshopsoftware.) Ulterior, câte trei embrioni din fiecare grup au fost supuși tehnicilor histologice obișnuite iar depozitele de nanoparticule din viscere au fost identificate în secțiune cu ajutorul Hematoxilin & Eosin și colorației Albastru de Prusia on Hematoxylin & Eosin and Perls’ Prussian bluestained sections. Pentru a studia potențialul emboligen și biocompatibilitatea nanoparticulelor utilizate, restul de embrioni din fiecare grup au fost incubați și observați zilnic până la eclozare.

Nano-blocajul vascular

Pentru a studia capacitatea nanoparticulelor de oxid de fier cu înveliș de acid salicilic (SaMNPs) de a suprima alimentarea cu sânge a xenogrefei tumorale sub acțiunea câmpului magnetic static, a fost utilizat modelul CAM in vivo inoculat cu o linie celulară umană de cancer mamar: MDA-MB-231.

Celulele de adenocarcinom de sân uman (Sigma-Aldrich), MDA-MB-231 au fost cultivate pe mediu RPMI 1640 (invitrogen) conținând 10% FBS, 1% penicilină, 1% L-glutamină și 1% piruvat de sodiu (suplimentele au fost furnizate de către Gibco/BRL). Celulele au fost crescute în baloane-Flasks de cultură, într-un incubator The cells were grown in culture flasks maintained in a humidified incubator under optimal conditions (95 % air, 5 % CO2, and 37 C). Rata de viabilitate a celulelor folosite pentru dezvoltarea xenogrefelor tumorale pe suprafața CAM, a fost evaluată cu microscopie cu lumină inversă.

Douăzeci de ouă albe de pui Leghorn, neapărat fertillizate, au fost incubate în condiții corespunzătoare de umiditate (70 %) și temperatură (37,5 ̊C).

În ziua a 3-a, au fost făcute orificii pentu toate ouăle pe partea de sus, iar ferestrele deschise au fost sigilate cu bandă adezivă

În ziua a 6-a, CAM a fost inoculată cu trei picături (104 celule/picătură) din mediul de cultură ce conține MDA-MB-231 (suspensie de celule umane de cancer mamar)

Toate ouăle au fost incubate până în ziua a 11-a, după care a avut loc injectarea intravasculară a CAM cu o doză de 0,2 ml dispersie apoasă de SaMNPs

După 15 minute de la injectare, s-a aplicat un magnet cilindric de 0,18 T timp de 20 de minue pe o zonă de creștere tumorală ușor accesibilă de pe suprafața CAM, apoi ouăle au fost reintroduse în incubator

Zece ouă selectate aleatoriu nu au fost supuse acțiunii câmpului magnetic și au constituit grupul de control

Până în ziua a 16-a toate ouăle au fost observate zilnic cu un microscop stereo Zeiss

În ziua a 16-a au fost recoltate CAM-urile cu xenogrefele tumorale și fixate în formol 4% pentru 24 de ore

Analiza histologică

Embrionii de pui care au fost sacrificați, au fost fixați în formol și li s-a efectuat autopsia pentru examinarea morfologică și recoltarea viscerelor. Tehnici comune de procesare histologică și metoda colorației Albastru de Prusia au fost utilizate pentru a identifica depozitele SaMNPs intraviscerale și intravasculare. Pe scurt, după deparafinizare și rehidratare, diapozitivele au fost incubate într-un amestec volumetric 1/1 de 2% soluție apoasă de ferocianură de potasiu și 2% soluție acid clorhidric timp de 15 minute la 37˚C. După ce au fost foarte bine spalate, diapozitivele After thorough washing, the slides were counterstained in nuclear red, dehydrated, cleared, and mounted in a xylene-based mounting medium. Formalin fixed CAMs samples with breast cells xenografts were processed for paraffin embedding, cut into 5-lm-thick sections, and stained with Hematoxylin & Eosin for light microscopic examination.

Rezultate

Analiza cantitativă ICP-OES a evidențiat o concentrație de 356 mg/L de fier în dispersia apoasă de SaMNPs, acest conținut de fier fiind de asemenea confirmat cu ajutorul spectrului EDS (Figura 4.1. )

Figura 4.1. Spectrul EDS al probei de SaMNPs

Analiza DLS a arătat o medie a potențialului Zeta de 39,33 mV (±4,39 mV), valoarea Pdl de 0,17 (±0,003) și diametrul hidrodinamic de 51,63 nm (±0,1908 nm) . (Figura 4.2.)

Figura 4.2. a) nanoparticule de Fe3O4/acid salicilic dispersate în apă ultrapură (stânga) și precipitate sub acțiunea câmpului magnetic(dreapta); b) distribuția dimensiunii DLS; c) potențialul Zeta al SaMNPs

Imaginile HRTEM au arătat un diametru al miezului de 7-15 nm și aproximativ 2 nm a învelișului amorf. Imaginile SAED au demonstrat prezența structurii cristaline a Fe3O4. (Figura 4.3.)

Figura 4.3. Imaginile HRTEM ale nanoparticulelor de Fe3O4/acid salicilic. Săgețile din colțul din dreapta jos marchează o zonă amorfă, reprezentată probabil de resturile de degradare a învelișului

În Figura 4.4. sunt prezentate rezultatele ITP-urilor SaMNPs, măsurătorile fiind efectuate asupra vascularizației CAM. Se poate observa că valorile ITP sunt corelate cu dozele de SaMNPs care au fost injectate intravascular în CAM. Pentru doza de 0,07 mL SaMNPs administrată, acumularea magnetică și formarea de agregate nu a depășit 90 de minute din momentul injectării. Rezultatele obținute pentru dozele de 0,15 mL, respectiv 0,2 mL de SaMNPs administrate arată o tendință bruscă de scădere a acumulării și formării agregatelor intravasculare în timpul primelor 180 de minute după injectare, urmând apoi o scădere relativ constantă a nivelului de acumulare. Acumularea agregatelor sub acțiunea câmpului magnetic se poate observa chiar și după 24 de ore de la administrarea unei doze de 0,2 ml SaMNPs (resursă online 1).

Figura 4.4. Acumularea intravasculară a agregatelor SaMNPs sub acțiunea câmpului magnetic static în vascularizația CAM. Măsurătorile au fost efectuate pentru doze de 0.07, 0.15, și 0.2 mL

Analiza histologică cu microscopul fotonic a arătat că depozitele de SaMNPs (evidențiate cu Albastru de Prusia) s-au acumulat în ficat iar în viscere nu. (Figura 4.5.). De asemenea, au fost găsite câteva agregate SaMNPs libere în sânge. Măsurătorile medii ale depozitelor din ficat (efectuate pe 40 de câmpuri microscopice alese la întamplare din fiecare lot) au stabilit o relație de dependență între gradul de acumulare a MNPs în ficat și doza administrată. (Figura 4.5 d) ). Toți embrionii incubați au supraviețuit și puii eclozați nu au prezentat nicio modificare morfologică la nivel macroscopic.

Figura 4.5. Imagini ale secțiunilor realizate pe pui analizate din punct de vedere histologic cu ajutorul colorației Albastru de Prusia a) plămân, b) inimă și c) ficat; analiza prin intermediul microscopiei fotonice a identificat depozite albastre de SaMNPs numai în ficat (bar=100 µm); d) variația doză dependentă a numărului de depozite SaMNPs pe câmpurile microscopic( ×10 ) observată pe secțiunile pe ficat de pui

Abilitatea SaMNPs-urilor de a bloca vascularizația xenogrefei prin acumularea intravasculară sub acțiunea câmpului magnetic static a fost studiată pe modelul membranei corioalantoidiene de pui de găină. CAM a fost inoculată cu o linie celulară MDA-MB-231, celule umane de cancer mamar. Din toate ouăle supuse studiului, la un procent de 5% nu s-au dezvoltat xenogrefele tumorale iar 5,2% din embrionii de pui au murit după injectarea intravasculară a SaMNPs.

Examinarea stereomicroscopică zilnică a membranelor inoculate a arătat apariția clusterilor de celule tumorale din ziua 1 și creșterea acestora până în ziua a 3-a de la implantarea celulelor tumorale. (Figura 4.6. a) ). În lotul de control, creșterea tumorală continuă să se dezvolte având loc o invazie locală caracterizată de îngroșarea și opacifierea CAM înconjurătoare și formarea de noi creșteri tumorale care în final se vor uni și vor forma o masă tumorală masivă cu multiple zone de necroză la suprafață (Figura 4.6. c) ). Xenogrefa tumorală supusă acțiunii câmpului magnetic static a evoluat mult mai încet sau chiar s-au oprit din dezvoltare. Transparența și subțierea CAM din jurul xenogrefei, evidențiată prin examinarea stereomicroscopică pot fi considerate dovezi ale potențialului scăzut de invazie al acestora ( Figura 4.6. b) ). De asemenea, vasele blocate de agregatele SaMNPs conduse magnetic pot fi observate în grosimea învelișului CAM ce înconjoară xenogrefa umorală. (Figura 4.6. d) ). Analiza histologică a confirmat tendința de oprire din dezvoltare a creșterii tumorale după injectarea intravasculară și conducerea sub câmp magnetic a SaMNPs deoarece a fost blocată aprovizionarea vasculară a xenogrefei.

Figura 4.6. Xenogrefa tumorală de cancer mamar inoculată pe CAM. a) ziua a 3-a de creștere tumorală ; b) ziua a 5-a de creștere tumorală după injectarea intravasculară a SaMNPs și după acțiunea de 20 de minute a câmpului magnetic static ; c) ziua a 10-a a creșterii tumorale de control; d) ziua a 10-a a creșterii tumorale tratate Bar=1mm

După 5 zile de suprimare a fluxului sanguin a xenogrefei, pe secțiunile histologice efectuate prin xenogrefa tumorală și CAM înconjurător pot fi observate numeroase vase de sânge blocate (Figura 4.7. a), b) ). Cel mai mare diametru măsurat după 6 zile al arteriolelor care au rămas obstrucționate de aglomerarea SaMNPs a fost de 70 µm. Studiul histologic al tumorilor de control, a arătat o creștere marcată a dimensiunii masei tumorale asociată cu suprafețe mari de necroză intratumorală, îngroșarea și alterarea structurală a CAM, precum și prezența a numeroase vase de sânge intra- și peritumorale (Figura 4. 7. c) ).

Figura 4.7. Aspecte histologice din ziua a 10-a ale xenogrefelor tumorale de cancer mamar pe modelul CAM. a), b) xenogrefa tumorală după 5 zile de la nanoblocajul intratumoral al vaselor de sânge ; c) xenogrefe tumorale din grupul martor, arrowheads indică blocajul vaselor intratumorale iar săgețile îndică blocajul capilarelor CAM la locul de plasare a magnetului (a, c- colorație Hematoxylin & Eosin ; b- colorație cu Albastru de Prusia ; Bar=100µm)

Discuții

Embolizarea arterială și injectarea intratumorală directă a nanoparticulelor mediate au fost cele mai utilizate metode de plasare a nanoparticulelor magnetice în țesutul tumoral și metoda de administrare este decisivă în proiectarea unui nou tip de nanoparticulă.

Dispersia apoasă de nanoparticule de Fe3O4/acid salicilic sintetizată prezintă o distribuție omogenă, este stabilă în timpul depozitării la temperatura camerei și în condiții normale (mai multe luni fără precipitare) și se redispersează rapid după agregarea indusă magnetic. Învelișul de acid salicilic a fost utilizat deoarece prezintă o bună biodisponibilitate, fiind un component normal al serului și este asociat cu un risc scăzut pentru cancerul colorectal, de sân, esofagian, plămân, stomac și ovarian .

Am testat efectul nanoparticulelor fără strat de acoperire sau alte învelișuri, fără a avea însă vreun succes, deoarece embrionii de pui au murit la scurt timp după injectarea intravasculară a MNP sau atunci când a fost aplicat câmpul magnetic din cauză formării de emboli în sânge. De asemenea, am urmărit fabricarea MNP-urilor cu un diametru hidrodinamic mai mare de 50 nm deoarece experimentele anterioare au arătat că nanoparticulele cu un diametru hidrodinamic mai mic de 50 nm ar putea părăsi rapid vasele de sânge prin fenestrațiile endoteliale. Acest comportament a fost raportat și de către alti cercetători .

Imaginile HRTEM nu pot dezvălui structura învelișului organic din cauza eliminării rapide a acidului salicilic sub influența vidului înalt și bombardării cu un fascicul puternic de electroni utilizate pentru caracterizarea MNPs.

În Figura 4.3. se poate observa învelișul extern amorf ce se distinge la suprafața nanoparticulelor feromagnetice cristaline (cu o grosime de aproximativ 2 nm măsurată în imaginea HRTEM), dar cu siguranță aceasta nu este grosimea întregii cochilii responsabilă de diametrul hidrodinamic observat de către DLS. Supoziția noastră este că grosimea reală a învelișului nanoparticulelor feromagnetice dispersate (incluzând pe cel primar și posibil și cel secundar de acid salicilic, urmat de învelișul de solvatare al apei) este inclus în intervalul 10-25 nm.

Cunoașterea valorilor ITP ale MNPs sunt absolut necesare în proiectarea oricărui experiment in vivo care implică utilizarea acestor MNPs. Timpul cât acționează magnetul static asupra vaselor, a fost determinat experimental și reprezintă perioada maximă a acțiunii magnetului cu o anumită intensitate a câmpului magnetic, care să nu aibă efect de aderență al agregatelor de nanoparticule pe peretele vaselor.

Concentrația MNPs circulante scade dacă agregatele sunt fixate pe peretele vaselor de sânge, ceea ce ar modifica rezultatele testului. Am stabilit o perioadă de 5 minute ca fiind timpul optim de acțiune al câmpului magnetic pentru vasele cu un diametru între 0,5-1 mm utilizate în acest experiment.

Pentru rezulate cât mai bune ale acestui experiment a fost necesară selectarea vaselor de sânge cu același diametru pentru a avea valori constante ale vitezei fluxului de sânge, având în vedere faptul că dozele administrate de SaMNPs nu influențează caracteristicile hemodinamice și de asemenea puterea câmpului magnetic este constantă.

Permeabilitatea rețelei capilare din zona vascularizată de către artera studiată, este un argument solid pentru riscul embolic scăzut al nanoparticulelor noastre. Acest risc embolic scăzut se datorează probabil capacității de redispersare rapidă a agregatelor intravasculare, fapt susținut și de valoarea ridicată a potențialului Zeta al SaMNPs. Am observat existența unei doze prag de 0,15 mL de SaMNPs injectate intravascular iar la o doză mai mare, acestea au fost evidențiate pentru o perioadă mai lungă de timp în sânge. Doza prag poate fi argumentată prin rezultatele studiul histologic, care au arătat faptul că ficatul este principalul loc de stocare al SaMNPs în embrionul de pui și are o capacitate limitată de acumulare. Dezvoltarea normală a embrionului cu depuneri viscerale de SaMNPs și absența modificărilor morfologice ale puilor eclozați pot fi de asemenea considerate argumente solide a biocompatibilității SaMNPs sintetizate.

Analizele histologice ale xenogrefelor au arătat că pentru o expunere de 15 minute la acțiunea câmpului magnetic static, SaMNPs pot bloca numai arteriolele precapilare și rețeaua capilara pe care o alimentează. Nu a fost observat însă niciun blocaj al venuleleor post capilare. O scădere a fluxului de sânge ar putea explica absența metastazelor și creșterea lentă a xenogrefei în zona de nanoblocaj vascular. Cu toate acestea, CAM are o structură embrionică particulară ceea ce asigură o regenerare vasculară rapidă în zona afectată prin mecanisme de angiogeneză. Prin urmare, acest model nu este optim pentru a evalua pe termen lung capacitatea de efectul SaMNPs de nanoblocaj vascular pe creșterea xenogrefelor.

Concluzii

Dispersia apoasă de nanoparticule de Fe3O4/acid salicilic injectată intravenos la embrionii de pui de găină, este biocompatibilă și nu prezintă niciun risc embolic chiar și după agregarea sub câmp magnetic repetat. Persistența agregatelor în timp este dependentă de doză și au fost depozitate predominant în ficat. Aceste nanoparticule pot fi conduse ușor în zona tumorală sub acțiunea câmpului magnetic și pot bloca arteriolele tumorale mai mici de 70 µm pentru o perioadă lungă de timp.

Această lucrare evidențiază potențialul ridicat al nanoparticulelor de Fe3O4 cu înveliș de acid salicilic de nanoblocaj vascular și de asemenea versatilitatea modelului CAM pentru a studia proprietățile biologice ale nanoparticulelor administrate intravenos.