Evaluarea In Vitro a Profilului Citokinic al Celulelor Epiteliale In Infectia Bacteriana

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

MASTER: BIOLOGIE MEDICALA

LUCRARE DE DISERTAȚIE

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

Evaluarea in vitro a profilului citokinic al celulelor epiteliale în infecția bacteriană

CUPRINS

Introducere

Stafilococii patogeni sunt responsabili de apariția unor boli la oameni și animale, datorită secreției de toxine sau prin înmulțirea rapidă și invadarea țesuturilor.

Toxinele stafilococice sunt principal cauză a toxiinfecțiilor alimentare. Bacteriile se pot dezvolta pe alimente depozitate necorespunzător, sau în alimentele cu un conținut redus de apa.

Un exemplu de specie cu patogenitate ridicată este Staphylococus aureus ce reprezintă cauza majoră a infecțiilor nosocomiale în spitale precum și din unitățile de îngrijire medicală.

Staphylococcus aureus este o bacterie condiționat patogenă, adică produce infecții doar atunci când barierele apărării naturale a organismului nu mai fac față. În această situație, bacteria pătrunde în organism și poate determina o multitudine de tipuri de infecții, a căror gravitate și localizare este foarte variată.

S. aureus este un patogen important, mai ales ca urmare a răspândirii în întreaga lume a tulpinilor care sunt rezistente la toate antibioticele utilizate în clinică (tulpinile MRSA, VRSA – meticillin – and vancomycin-resistant Staphylococcus aureus) . Având în vedere importanța și incidența înaltă a infecțiilor invazive cu S. aureus meticilino-rezistent (33,3% în 2008) (date furnizate prin participarea a 35 de spitale din țară la rețeaua europeanăEARSS-(EuropeanAntimicrobialResistanceSurveillanceSystem) (www.earss.rivm.nl), găsirea unor noi strategii terapeutice pentru infecțiile stafilococcice reprezintă o prioritate.

"Tendința oamenilor de a dezvolta infecții cronice cu Staphylococcus aureus este bine cunoscută și se manifestă cel mai frecvent prin dermatită cronică sau infecție cronică la nivelul tractul respirator superior. Rolul reacțiilor imune în patogeneza infectii cronice S. aureus rămâne neclar. În reacțiile imune, un rol foarte important este jucat de citokine răspuns a limfocitelor Th și monocite / macrofage". (A. Szkaradkiewicz & T. M. Karpiński & A. Zeidler & A. K. Szkaradkiewicz & H. Masiuk & S. Giedrys-Kalemba).

Citokinele sunt molecule de comunicare intercelulare, prezente în mod normal în organism, fiind secretate de o mare diversitate de celule, nu numai de celulele imune. Rolul citokinelor este acela de-a controla activitatea unor populații și subpopulații leucocitare și de a participa astfel la apărarea imună împotriva celulelor canceroase. Citokinele folosite în imunoterapie sunt  produse artificial în laborator. Deși terapiile pe bază de citokine oferă rate de răspuns moderate, ele încă rămân tratamente eficiente, potențial curative, pentru pacienții cu melanom metastazat sau carcinom renal avansat. Totuși, efectele secundare ale terapiei cu citokine sunt considerabile și asemanatoare simptomelor infecțiilor sistemice. (Gheorghița Izvoranu).

Citokinele sunt componente care participă la păstrarea homeostaziei mediului intern. Spre deosebire de hormoni, a căror acțiune se manifestă la distanță, citokinele acționează la nivel local. Citokinele sunt eliberate de un spectru larg de celule: micro- și macrofage,limfocite, fibroblaști, celule endoteliale și care au efect pro- sau antiinflamator.

Găsirea unor alternative terapeutice la utilizarea substanțelor antimicrobiene reprezintă o necesitate pentru controlul infecțiilor asociate cu formarea de biofilme determinate de S. aureus.

Capitolul 1 Genul Staphylococcus sp

1.1Caracterizarea generală a genului Staphylococcus sp

Genul Staphylococcus sp aparține familiei Micrococcaceae ,denumirea genului provine din limba greacă și semnifică dispunerea cocilor în grămezi asemănătoare unor ciorchine de strugure, (diviziunea celulară – se produce în trei planuri perpendiculare și nu permite separarea completă a celulelor fiice). Există 27 de specii și 7 subspecii.

Grupe de interes medical:

– Stafilococi coagulazo-pozitivi→ Staphylococcus aureus

– Stafilococi coagulazo-negativi:

1.Grupul Staphylococcus epidermidis cu speciile:

Staphylococcus epidermidis sensu stricto

Staphylococcus.auricularis

Staphylococcus capitis

Staphylococcus hominis

Staphylococcus lugdunensis

Staphylococcus haemolyticus

Staphylococcus warneri etc.

2.Grupul Staphylococcus saprophyticus cu speciile:

Staphylococcus.saprophyticus

Staphylococcus xylosus

Staphylococcus.cohnii

3.Grupul Staphylococcus intermedius cu speciile:

S.scheleiferi etc.

4.Grupul Staphylococcus simulans cu speciile:

S.simulans etc (clasificare dupa F.Toma Sacare)

Speciile de stafilococi cel mai frecvent izolate în clinică sunt S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. saprophyticus.

Stafilococii patogeni sunt adeseori hemolitici, coagulează plasma și produc o diversitate de enzime extracelulare și toxine. Forma cea mai comună de intoxicație alimentară este produsă de o enterotoxină termostabilă secretată de Staphylococcus.

Celulele sunt sferice, cu un diametru ce variază între 0,8-1 μm, imobile, nesporulate, așezate în aglomerări asemănătoare ciorchinelui de strugure. În mediu lichid se găsesc sub forma cocilor izolați, a diplococilor, tetradelor sau a lanțurilor. Se colorează intens Gram pozitiv (fig.1).

Fig.1 Aspectul stafilococilor pe frotiuri din cultură pură, colorate Gram(x1500).

Celulele îmbătrânite tind să fie Gram-negative. Stafilococii cresc pe majoritatea mediilor bacteriologice, în aerobioză și microaerobioză, la 370C și fermenteză glucidele. Cultura de Staphylococcus este o populație de celule heterogene ca dimensiuni, în ceea ce privește capacitatea de a sintetiza pigmenți sau enzime, proprietățile hemolitice, rezistența la medicamente și virulența. Variabilitatea se datorează condițiilor de mediu. La 250C, majoritatea tulpinilor de stafilococ patogen sintetizează un pigment carotenoid galben-citrin (fig.2). Acest pigment este produs de majoritatea tulpinilor de S. aureus, precum și de S. saprophyticus. Stafilococii coagulazo-negativi formează pe mediu solid colonii albe, translucide (Howard and Kloos, 1987) (fig.2).

Fig.2. S. aureus producător de pigment auriu (stg.), și S. xylosus (dr.) pe geloză sânge.

S. aureus fermentează manitolul, în timp ce speciile de stafilococ coagulazo-negative (CNS) nu au această proprietate.

1.2. Caracterizarea generală a speciei Staphylococcus aureus

Descoperit în 1880 de chirurgul scoțian Alexander Ogston, Staphylococcus aureus este un microorganism larg răspândit. S. aureus face parte din genul Staphylococcus, familia Micrococcaceae . Este o bacterie de formă sferică, tip coc, facultativ aerobă, Gram pozitivă, cu diametru de 0,5 -1,5 micrometri. La microscopul optic apar sub formă de ciorchine de strugure. Este considerat un microorganism oportunist și poate fi întâlnit frecvent în microbiota tegumentară și mucoase, cu precădere în nazofaringe. S. aureus poate determina o multitudine de boli ca rezultat al infectării unor țesuturi variate din corp.( Buiuc & Neguț, 2009)

S. aureus subspecia aureus este agentul patogen major al infecțiilor dobândite în comunitate și al celor nosocomiale. Denumirea speciei este dată de sinteza unui pigment auriu în condiții favorabile de creștere. Multe colonii se pigmentează numai după o incubare prelungită. Pigmentul nu se sintetizează în bulion și nici în anaerobioză. Unele tulpini de S. aureus nu produc pigment auriu, iar în condiții nefavorabile de creștere, unele tulpini își pot pierde capacitatea de a produce hemolizina și/sau coagulaza.

Stafilococii produc catalază (spre deosebire de streptococi), fermentează lent glucoza cu producere de acid, fără gaze. Speciile patogene secretă o mare diversitate de substanțe extracelulare.

1.3. Etapele infectării cu Staphylococcus aureus și factorii de virulență implicați

Această bacterie posedă numeroși factori de virulență, care pot media colonizarea gazdei,

invazia mucoaselor și a țesuturilor lezate, diseminarea în organism și evitarea sistemului imun. Stafilococii au capacitatea de a se multiplica și de a se disemina în țesuturi; pot sinteza unui număr mare de tipuri de molecule toxice sau cu activitate enzimatică, codificate de gene plasmidiale sau cromosomale, conțin polizaharide și proteine antigenice, stimulatoare ale sintezei anticorpilor opsonizanți. Peptidoglicanul parietal este chemoatractant pentru PMN și activează C.

1.3.1 Factorii de virulență prezenți la Staphylococcus sp. sunt clasificați în mai multe categorii:

-particularități biochimice ce favorizează supraviețuirea în macrofage (pigmentogeneza, producerea catalazei; fosfatazei alcaline care determină scăderea pH în focarul de infecție);

-mecanisme de evitare a răspunsului imun al gazdei (proteina A;microcapsula, coagulazele libere și legate (clumping factor);

– invazine (hialuronidaza este factor de invazie care acționează la începutul infecției, pentru că procesul inflamator inhibă acțiunea acestei enzime, stafilokinaza sau fibrinolizina, care acționează ca factor de difuzie, leucocidinele; proteazele; lipazele, beta-lactamazele);

-exotoxine (alfa-toxina, -toxina, leucocidina, toxinele exfoliative, toxina sindromului de șoc toxic, enterotoxine).

Virulența este rezultatul unei combinații de factori extracelulari și toxici și a proprietăților invazive. Spectrul manifestărilor clinice este foarte diversificat: la un capăt al spectrului este intoxicația alimentară datorată ingestiei enterotoxinei preformate în alimentele contaminate; la cealaltă extremitate este bacteriemia stafilococică cu abcese diseminate în toate organele.

Tulpinile invazive produc coagulază, pigment și hemolizină. Cele neinvazive (S. epidermidis) nu produc coagulază și nici hemolizină, sunt patogeni oportuniști, fiind implicate în producerea unor infecții asociate protezelor ortopedice, cardiovasculare sau la persoanele imunosupresate.

S. aureus posedă cea mai largă varietate de mecanisme de virulență dintre toate microorganismele patogene pentru om și astfel reprezintă un model pentru studiul patogenezei bolilor infecțioase. Factorii de virulență (~ 70) sunt exprimați în mod coordonat în cursul diferitelor etape ale infecțiilor determinate.

S. aureus cuprinde stafilococii coagulazo- pozitivi, patogeni pentru om și animale, de regulă hemolitici. Adeseori colonizează asimptomatic gazdele umane, cu statutul de comensal pe tegument și în cavitățile nazale. 20% dintre indivizii umani sunt colonizați persistent (pentru o perioadă lungă de timp), 60% sunt purtători intermitenți, iar 20% nu sunt colonizați. Purtătorii nazali de S. aureus joacă un rol cheie în dezvoltarea infecțiilor cu S. aureus. În primele două zile de viață, tegumentul nou-născuților este colonizat cu stafilococi (inclusiv S. aureus) de la persoanele de contact sau din mediu (Greenwood și colab., 1994). Vehicularea pe cale nazală la nou-născuți, cât și la persoanele mai în vârstă, este de obicei persistentă (timp de mai multe luni sau mai mulți ani). Alte situsuri de colonizare ale S. aureus pot fi: pliurile pielii, perineu, axile, vagin și tractul gastrointestinal. Deși este un membru frecvent al microbiotei normale, S. aureus este un patogen oportunist, ce produce un spectru larg de boli umane și animale. Factorii predispozanți pentru dezvoltarea acestor infecții sunt reprezentați de:

(1) deficiențe de opsonizare (hipogamaglobulinemie),

(2) leziuni ale pielii (arsuri, eczeme, incizii chirurgicale),

(3) prezența de corpi străini (catetere intravenoase, dispozitive protetice),

(4) infecții virale (gripa),

(5) boli cronice (boli maligne, boli cardiace, SIDA, diabetul mellitus, alcoolism);

(6) abuzul de droguri intravenoase.

Cu excepția sindroamelor toxemice, care sunt datorate producerii de superantigene, patogeneza S. aureus este rezultatul acțiunii combinate a diferiților factori de virulență asociați celulei bacteriene și extracelulari. Proteinele extracelulare aparțin unuia dintre următoarele tipuri: receptine, toxine și enzime.

1.3.2 Patogeneza infecțiilor cu S. aureus cuprinde:

colonizarea

internalizarea

invazia și diseminarea sistemică

toxigeneza.

1.3.2.1 .Colonizarea

Aderența S. aureus la celulele eucariote și la dispozitivele medicale implantate reprezintă o etapă importantă în inițierea infecției stafilococice. Adezinele mediază colonizarea și condiționează persistența S. aureus in diferite situsuri ale organismului uman. Capacitatea S. aureus de a adera la proteinele plasmatice și la proteinele matricei extracelulare depozitate pe biomateriale este un factor important în patogeneza infecțiilor asociate cu dispozitivele medicale (L.G. Harris, 2002). Aderența este mediată de două tipuri de adezine, numite și receptine (Kronwall & Johnsson, 1999). Din primul grup fac parte moleculele MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules), cunoscute și sub denumirea de receptine asociate suprafeței celulare. Adezinele MSCRAMMs sunt atașate covalent la peptidoglicanul peretelui celular, iar liganzii pot fi reprezentați de molecule de elastină, colagen, laminină, fibrinogen, fibronectină. Din familia de adezine MSCRAMMs fac parte: (1) proteina A, (2) proteinele de legare a fibronectinei (FnBPs: FnbpA și FnbpB), (3) factorii clumping ClfA și ClfB, (4) proteina de legare a colagenului și (5) proteina de legare a sialoproteinei osului (Bpb).

Adezinele din cel de-al doilea grup sunt cunoscute sub denumirea de receptine secretate sau molecule de aderență secretate (Secretable Expanded Repertoire Adhesive Molecules – SERAMs), și sunt ancorate necovalent la suprafața celulei gazdă. Din această familie fac parte: proteina extracelulară de legare a fibrinogenului (extracellular fibrinogen binding protein, Efb), Eap (extracellular adherence protein), Emp (extracellular matrix binding protein) și coagulaza.

Proteina A (Spa) este o proteină majoră a suprafeței celulare, fiind prezentă la aproape toate tulpinile de S. aureus. Manifestă o specificitate crescută de legare la domeniul Fc al IgG (subclasele 1, 2, 4, adică 95% din IgG total), cu rol în evitarea fagocitozei. De asemenea, proteina A leagă factorul von Willebrand (vWF), precum și proteina gC1qR, prezentă pe suprafața trombocitelor aderate, cu rol în patogeneza bolilor endovasculare stafilococice.

Proteinele de legare a fibronectinei – FnBPs (fibronectin binding proteins), sunt localizate la suprafața celulei bacteriene, fiind exprimate numai în faza exponențială foarte timpurie de creștere. Toate tulpinile de S. aureus izolate din clinică posedă cel puțin una din cele două FnBPs (FnbpA, FnbpB). FnbpA mediază aderența la valvele lezate ale inimii și promovează internalizarea S. aureus în celulele epiteliale.

Factorii clumping (ClfA și B) sunt receptine asociate suprafeței celulei bacteriene cu rol de adezine principale, care mediază legarea S. aureus la fibrinogen, tapetează rapid suprafețele biomaterialelor implantate și astfel contribuie la atașarea S. aureus la aceste implanturi.

Proteina de legare a colagenului este importantă în patogeneza infecțiilor musculoscheletale (artrită septică, osteomielită). Strategiile terapeutice care au ca scop inhibiția legării colagenului ar putea fi utile în prevenirea și tratamentul infecțiilor musculoscheletale.

Proteina de legare a sialoproteinei osoase (Bpb) este implicată în patogeneza infecțiilor osoase (osteomielită) și articulare (artrită septică).

Proteina de legare a elastinei (EbpS) facilitează colonizarea de către S. aureus a țesuturilor lezate bogate în elastină (plămâni, piele).

Receptine secretate. Proteina extracelulară de legare a fibrinogenului (Efb) (anterior denumită Fib) este produsă în mod constitutiv de tulpinile de S. aureus în cursul fazei postexponențiale de creștere, fiind secretată în mediu. Inhibă specific agregarea plachetară și leagă fragmentul C3b, inhibând astfel activarea căilor clasice și alternative ale complementului.

Coagulaza este secretată de către majoritatea tulpinilor patogene de S. aureus, fiind o receptină bifuncțională: leagă fibrinogenul și coagulează plasma, cu formarea cheagului de fibrină. Coagulaza nu este o enzimă, ci o proteină extracelulară (forma liberă), ce se leagă la protrombina gazdei pentru a forma complexul reactiv echimolar stafilotrombina. Activitatea proteazică caracteristică trombinei este activată în acest complex și are ca rezultat conversia fibrinogenului la fibrină, ceea ce duce la formarea cheagului de fibrină, produsul final al coagulării. O mică proporție a coagulazei se găsește sub formă legată pe suprafața celulelor bacteriene (factorul clumping) unde poate reacționa cu protrombina. Coagulaza produce coagularea plasmei recoltată cu oxalat sau citrat, prin legarea de protrombină. Complexul devine activ enzimatic și inițiază polimerizarea fibrinogenului și formarea rețelei de fibrină. Sinteza coagulazei este un factor de virulență și conferă potențial invaziv. Factorul de aderență (clumping factor) este diferit de coagulază și determină depunerea fibrinei pe suprafața stafilococului, modificând rata ingestiei de către fagocite. Coagulaza liberă are rol în coagularea plasmei și în blocarea accesului factorilor bactericizi din plasma extravazată și a leucocitelor la locul agresiunii stafilococice în exudatul inflamator.

S. aureus posedă o receptină secretată multifuncțională cunoscută sub mai multe denumiri: proteina extracelulară de aderență (Eap) sau molecula analogă cu CMH clasa II (Map), sau p70. Adezina Eap are capacitatea de se lega la o varietate de proteine ale matricei extracelulare, precum și la proteinele plasmatice: fibronectina, fibrinogenul și protrombina. De asemenea, Eap poate forma oligomeri și ulterior se poate lega la câteva structuri de pe suprafața S. aureus, mediind astfel, atât aderența S. aureus la dispozitivele protetice tapetate cu proteine gazdă, cât și agregarea intercelulară a S. aureus. Această adezină joacă câteva roluri importante în patogeneza infecțiilor cu S. aureus: (1) are rol în internalizarea S. aureus în celule epiteliale și fibroblaste; (2) modulează răspunsului imun prin inhibiția recrutării neutrofilelor și a răspunsului de hipersensibilitate întârziată; (3) interferă cu funcția celulelor T, conducând la boli cronice ca artrita sau osteomielita. O funcție nouă, recent descrisă pentru această adezină este cea de potențial inhibitor al angiogenezei.

Polizaharide extracelulare

Celulele prezintă fimbrii și o microcapsulă ce poate fi evidențiată la celulele din culturi de patru ore în bulion nutritiv, prin tehnica colorației negative cu tuș de India. Microorganismele implicate în infecții invazive, produc de regulă polizaharide capsulare extracelulare, cunoscute sub denumirea de capsulă, slime sau glicocalix. Termenul slime este de obicei utilizat pentru a desemna exopolizaharidele strâns asociate celulei bacteriene, care măresc vâscozitatea mediului de cultură lichid însămînțat cu tulpina care posedă acest factor de virulență. Producerea slime este implicată în aderență și în colonizarea dispozitivelor medicale.

Capsula este un factor major al virulenței bacteriene, cu rol antifagocitar. Majoritatea tulpinilor de S. aureus izolate din clinică (peste 90%) prezintă la exteriorul peretelui celular o capsulă polizaharidică. Tulpinile cu capsulă propriu-zisă produc colonii mucoide (tulpini M) și sunt rezistente la fagocitoză. Majoritatea izolatelor produc colonii nemucoide pe mediul agarizat și au microcapsulă (O’Riordan și colab., 2004).

1.3.2.2.Internalizarea

Capacitatea S. aureus de a evita mecanismele imunității umorale ale gazdei prin internalizare și supraviețuire intracelulară reprezintă a doua etapă a infecției, ce conduce la persistența bacteriei pe termen lung. Infecțiile cu S. aureus reapar în pofida tratamentului corespunzător cu antibiotice. O asemenea persistență rămâne frecvent neexplicată. O posibilă cauză poate fi capacitatea S. aureus de a supraviețui în interiorul celulelor gazdă.

S. aureus este cunoscut în principal ca un patogen extracelular, dar s-a observat că, in vitro, poate invada o varietate de fagocite neprofesioniste: celule epiteliale, fibroblaste, osteoblaste și celule endoteliale. Astfel, S. aureus este internalizat, invadează fagocitele neprofesioniste printr-un mecanism ce necesită interacția specifică între anumite adezine (FnBPs, Eap) și celulele gazdă, ulterior are loc procesul de transducție a semnalului celulelor gazdă prin proteina tirozin-kinază, au loc rearanjamente ale citoscheletului și preluarea bacteriei în endosom. S. aureus are capacitatea de a scăpa din endosom, de a se multiplica și supraviețui în citoplasma celulei gazdă. Totuși, nu se cunoaște mecanismul prin care membrana endosomului este lezată. S. aureus internalizat în linii de celule epiteliale pulmonare are capacitatea de a se multiplica; această caracteristică având un rol important în frecvența și persistența infecțiilor invazive. S. aureus internalizat poate persista, scăpând mecanismelor de apărare a gazdei, sau se multiplică și ulterior se diseminează.

Procesul internalizării este urmat de modificări profunde în metabolismul celulelor endoteliale, incluzând sinteza IL-1, IL-6 și IL-8) și a moleculelor de aderență celulară – ICAM-1 (intercellular adhesion molecules) și VCAM-1 (vascular-cell adhesion molecules).

1.3.2.3.Invazia și diseminarea sistemică

În primele ore după infecție, stafilococii sunt îndepărtați din circulația sangvină, în parte datorită fagocitozei, dar și prin aderarea bacteriilor la țesuturile organelor gazdă. Stafilococii care scapă procesului de fagocitoză se multiplică în țesuturile infectate și generează răspunsuri proinflamatorii mediate de citokinele și chemokinele eliberate de către macrofage, neutrofile și alte celule imunitare. Migrarea masivă a leucocitelor la situsul infecției este însoțită de necroză și de formarea unui strat de fibrină la periferia leziunii pentru a preveni diseminarea microbiană și a permite îndepărtarea resturilor de țesut necrotic. Activarea timpurie a răspunsului imun înnăscut limitează extinderea focarelor de infecție și scade severitatea infecțiilor stafilococice. Stafilococii ajunși în circulație se pot atașa prin mecanisme mediate de MSCRAMMs de celulele endoteliului. După endocitarea de către celulele endoteliale, bacteriile elaborează enzime proteolitice care facilitează răspândirea către țesuturile adiacente. Factorul tisular este exprimat de către celulele endoteliale, facilitând depozitarea fibrinei și formarea de vegetații. După endocitarea stafilococilor, celulele endoteliale activate exprimă receptori Fc și molecule de aderență VCAM și ICAM și eliberează IL-1, IL-6 și IL-8, cu efect chimiotactic pozitiv pentru leucocite care migrează prin diapedeză la nivelul leziunii endoteliale. Atât macrofagele tisulare, cât și monocitele circulante eliberează IL-1, IL-6, IL-8 și TNF-α după expunerea la stafilococi. Citokinele eliberate în circulație de către monocite sau macrofage, precum și de către celulele endoteliale, contribuie la instalarea sindromului septic și vasculitei asociate cu boala stafilocociccă sistemică.

Invazinele- S. aureus secretă o serie de proteine extracelulare, denumite invazine (proteaze, lipaze, nucleaze, colagenaze, coagulază, stafilokinază, hialuronidază) cu rol în degradarea componentelor tisulare și în invazie (fig.4). Coagulaza și stafilokinaza sunt două receptine secretate, care frecvent sunt considerate exoenzime, dar nu sunt enzime adevărate, ci receptine, deoarece se legă și activează enzimele gazdă prin formarea de complexe cu acestea.

Structuri antigenice extracelulare:

Exoproteine: sunt proteine accesorii, imunogene, sintetizate pe medii la

sfârsit de fază exponentială/început de fază stationară. În tesut pot fi sintetizate pe tot parcursul fazei exponentiale.

Coagulaza liberă este o proteină extracelulară cu rol de enzimă care coagulează plasma citratată (formează cu protrombina complexul numit stafilotrombină). Contribuie la localizarea si persistenta infectiei prin crearea unui strat protector de fibrină în jurul stafilococilor, strat care îi protejează fată de fagocite. De asemenea coagulaza liberă intervine în formarea trombilor cauzatori de tromboflebită supurată.

Hidrolaze:

Stafilokinaza – produsă prin conversie lizogenică, lizează cheagul de fibrină convertind plasminogenul în plasmină.

Nucleaza – are activitate endo- si exonucleazică asupra ADN si ARN;

Hialuronidaza – hidrolizează mucopolizaharidele tisulare ceea ce imprimă caracterul de invazivitate tulpinilor producătoare.

Lizostafina – enzimă produsă de Staphylococcus simulans.

Lipaze – contribuie la supravietuirea stafilococului la nivelul dermului. Au rol important în mecanismul de producere al furunculelor.

1.3.2.4.Toxigeneza

Supraviețuirea S. aureus în cursul infecției depinde de capacitatea acestuia de a depăși mecanismele de apărare a gazdei. S. aureus produce o varietate largă de toxine și proteine, care inactivează celulele sistemului imunitar prin eliberarea de citokine mediată de superantigene, sau prin citotoxicitate directă, în cazul acțiunii hemolizinelor (Bhatia și Zahoor, 2007). Funcția principală a hemolizinelor este de a converti componentele tisulare în nutrienți disponibili metabolismului bacterian. Unele tulpini produc una sau câteva exoproteine suplimentare, reprezentate de toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1), enterotoxinele stafilococice (SEA…SEE și SEG…SEQ), toxinele exfoliative (ETA, ETB) și leucocidina Panton-Valentine. Funcția principală a toxinelor este de a inhiba răspunsul imun al gazdei față de S. aureus, dar fiecare toxină exercită și funcții biologice specifice, responsabile de manifestări clinice particulare.

Hemolizinele sunt citotoxine cu efect citopatic și citolitic pentru o diversitate de celule: eritrocite, leucocite, macrofage, hepatocite, limfocite, limfoblaste, fibroblaste, neutrofile și plachete (fig.3). Tulpinile de stafilococi patogene pentru om prezintă cel mai frecvent asociația de α și δ hemolizine (82%).

α-hemolizina (α – toxina) are acțiune litică asupra eritrocitelor de berbec și de iepure, foarte slabă asupra hematiilor umane, dar este foarte agresivă față de toate țesuturile, inclusiv față de macrofage și trombocite. Monocitele sunt rezistente la acțiunea α-hemolizinei. Efectele se datorează, în mare parte, formării porilor cu diametrul de 1–2 nm, ce conduc la alterarea balanței ionice a celulei. Efectul final asupra gazdei este edemul pulmonar sau sindromul de distres respirator. Un alt mecanism prin care α-toxina poate conduce la edem este contracția celulelor endoteliale determinată de pierderea ATP, împreună cu influxul de calciu. În final, fluxul de calciu activează nucleazele celulare, conducând la moartea apoptotică a celulelor. Are acțiune citotoxică selectivă asupra celulelor musculare netede din pereții vaselor de sânge conducând la vasoconstricție și ulterior la ischemie și necroză tisulară. În plus, α-toxina își exercită efectul asupra plachetelor sangvine putând conduce la eliberarea factorilor procuagulării prin influxul ionilor de calciu. α-toxina este dermonecrotică și neurotoxică, determinând distrugerea tecii de mielină. Un alt efect al α –toxinei este acela de a promova aderența neutrofilelor la celulele endoteliale în reacția inflamatorie timpurie. Toxinele formatoare de pori (alfa și gamma-hemolizina) determină eliberarea de mediatori inflamatori, cum ar fi fosfolipaza A2, prostaglandina I2, factorul de activare a plachetelor, leucotriena B4 și oxidul nitric. Toți acești mediatori pot contribui la debutul final al artritei septice.

β-hemolizina (β-toxina) este hemolitică pentru eritrocitele de berbec, dar nu și pentru cele de iepure și umane. Este o sfingomielinază C, a cărei activitate este intensificată prin incubarea la + 4C, după tratamentul timp de 18-20 ore la 37C, de unde rezultă denumirea de hemoliză cald-rece. Sensibilitatea diferită a eritrocitelor la β-hemolizină poate fi explicată prin conținutul diferit în sfingomielină al eritrocitelor mamaliene.

γ-hemolizina și leucocidina Panton-Valentine (PVL) aparțin familiei de toxine sinergohimenotropice, care lezează membrana celulelor gazdă prin acțiunea sinergică a două tipuri de proteine.

PVL este prezentă la tulpinile de S. aureus comunitare, fiind asociată cu leziuni necrotice ale pielii sau mucoaselor și cu pneumonia hemoragică severă necrotică.

δ-hemolizina (δ–toxina, δ-lizina) determină lezarea membranei celulare a eritrocitelor umane, de berbec, de iepure, precum și a diferitelor structuri subcelulare: organite legate de membrană, sferoplaști, protoplaști. De asemenea are acțiune citolitică asupra neutrofilelor, limfocitelor, trombocitelor și macrofagelor. Circa 97% dintre tulpinile de S. aureus produc această toxină citolitică, a cărei sinteză este controlată de sistemul de quorum sensing. Are activitate dermonecrotică.

Superantigene – toxine pirogenice

Toxina sindromului de șoc toxic (TSST-1) și enterotoxinele stafilocicce (SEs) sunt superantigene pirogenice – PTSAgs (pyrogenic toxin superantigens) înrudite structural, cu proprietăți toxice specifice, pirogene, superantigenice și sensibilitate la șocul endotoxic.

Calitatea de superantigen a toxinelor constă în capacitatea de a stimula nespecific proliferarea limfocitelor T prin legarea la o regiune specifică variabilă a lanțului β a RCT (fig. 63). Consecutiv legării are loc eliberarea masivă a citokinelor proinflamatorii, caracteristice pentru un raspuns de tip Th1: TNF-α, IL-6 și IFN-γ, mediatoare ale patofiziologiei sindromului de șoc toxic stafilococic (STSS).

Fig.3. Ilustrarea schematică a mecanismului molecular al acțiunii superantigenelor. Superantigenul stimulează nespecific un număr mare de clone de celule T, deoarece leagă încrucișat receptorul celulei T (RCT) și molecula CMH II a celulei care prezintă antigenul. Legarea superantigenului cu RCT și cu molecula CMH este nespecifică, în afara situsului de recunoaștere a antigenelor obișnuite. Celulele T activate eliberează citokine ce mediază starea de șoc și leziunile tisulare.

TSST-1 este un superantigen produs de anumite tulpini de S. aureus, precum și de anumite tulpini de Str. pyogenes. Toxina activează un număr mare de limfocite Th, se leagă direct de moleculele CMH II, fară a mai necesita internalizarea și prelucrarea, determinând activarea limfocitelor și eliberarea consecutivă a unor cantități mari de IL-2 și de IL-1 din macrofage.

Enterotoxinele au activitate proteazică, sunt difuzibile și manifestă tropism față de mucoasa intestinală. Enterotoxinele sunt cauza frecventă a intoxicațiilor alimentare. Au fost identificate 17 enterotoxine stafilococice (SEA…SEE și SEG…SEQ). Au calitate de superantigene, se leagă de moleculele CMH II și induc stimularea policlonală a limfocitelor T și manifestările de sindrom de șoc toxic; au proprietăți de superantigene, prezintă numeroase variante antigenice și sunt produse de 50% dintre tulpinile de S. aureus, atunci când contaminează produse alimentare bogate în glucide și proteine.

Toxinele exfoliative/epidermolitice A și B (produse de tulpinile de S. aureus ce aparțin grupului fagic II) sunt superantigene asociate cu sindromul pielii opărite (sindromul Ritter) (Lina et al., 2007; King et al., 2009). Sindromul cuprinde trei entități clinice (necroliza epidermală toxică, eritemul scarlatiniform și impetigo – bube dulci) și se manifestă prin febră, eritem și blistere, care se pot rupe cu formarea unei zone dure de culoare roșie. Uneori copiii afectați prezintă o secreție conjunctivală mucopurulentă. Ambele proteine au proprietăți de superantigene; are proprietăți de superantigen.

Rezistența la factori fizico-chimici. Stafilococii rezistă la uscăciune timp de săptămâni și chiar luni în produse biologice uscate (puroi, spută), dar și în praful de cameră și chiar în nisipul plajelor. Sunt distruși prin expunere la 60C, timp de 30 min., în prezența fenolului 5%, timp de 10 min. și a alcoolului etilic de 70o, timp de 1 oră. Tolerează până la 9% concentrație NaCl. Sensibilitatea la medicamente este variabilă. Rezistența la penicilină (de exemplu, meticilina) este foarte frecventă printre tulpinile de S.aureus.

Structura antigenică. Tulpinile care produc infecții invazive sintetizează material capsular și devin astfel rezistente la fagocitoză. Acidul ribitol-teichoic, derivat al acidului teichoic, este principalul antigen polizaharidic care conferă specificitate de specie pentru S. aureus.

1.4. Rezistența la antibiotice a tulpinilor de S. aureus

Rezistența la penicilinele stabile la penicilinaze a fost denumită în trecut rezistența la meticilină. În prezent se folosește termenul MRSA (methicillin resistant Staphylococcus aureus) sau S. aureus rezistent la oxacilină. Stafilococii sensibili la penicilină sunt sensibili și la alte peniciline, precum și la cefalosporine, cefemi și carbapenemi. Tulpinile rezistente la penicilină, dar sensibile la cefoxitin sunt rezistente la penicilinele sensibile la penicilinaze, dar sensibile la penicilinele stabile la penicilinaze (oxacilină, meticilină, dicloxacilină, nafcilin), la cefeme și carbapenemi, precum și la combinațiile dintre un β-lactam și un inhibitor al β-lactamazei. Circa 90% dintre tulpinile de S. aureus produc β-lactamază și sunt rezistente la penicilină. Tulpinile rezistente la cefoxitin manifestă rezistență la toți β-lactamii. Astfel, sensibilitatea/rezistența unei tulpini de S. aureus la β-lactami poate fi dedusă prin testarea numai la cefoxitin și penicilină.

Tulpinile MRSA prezintă o frecvență crescută în spitale și în unitățile de îngrijire pe termen lung. Pot determina infecții grave, iar opțiunile de tratament sunt limitate.

Rezistența S. aureus la macrolide poate fi datorată efluxului activ (codificat de gena msrA), care conferă rezistență numai la macrolide și la steptograminele de tip B, sau modificării țintei ribosomale când apare mecanismul de rezistență MLSB (macrolide-lincosamide-streptogramin B), asociat cu rezistența inductibilă sau constitutivă la agenții MLSB.

Tulpinile care prezintă o rezistență constitutivă la MLSB (MLSBc) manifestă in vitro rezistență la toți acești agenți. Rezistența MLSB inductibilă se instalează dupa expunerea la un macrolid. Tulpinile cu rezistență MLSB inductibilă (MLSBi) prezintă in vitro rezistență la membrii grupului de macrolide cu 14 și 15atomi de C (ex.: eritromicina), în timp ce sunt sensibile la membrii macrolidelor cu 16 atomi de C, la lincosamide și la steptograminele de tip B.

Diagnosticul de laborator. Probele utilizate sunt puroiul, sângele, aspiratul traheal, LCR. Pe frotiuri se observă coci Gram-pozitivi, dar S. aureus nu se distinge morfologic de S. epidermidis. Cultivarea pe mediu agarizat cu sânge generează colonii după 18 ore la 370C. Hemoliza și pigmentația apar după câteva zile la temperatura camerei. S. aureus (dar nu alți stafilococi) fermentează manitolul. Probele se cultivă pe mediu cu 7,5% NaCl. În mediul salin crește numai S. aureus, celelalte microorganisme fiind inhibate.

Testul catalazei se folosește pentru a detecta prezența citocrom-oxidazei, enzimă caracteristică bacteriilor aerobe. Eliberarea O2 semnifică testul pozitiv.

Testul coagulazei se realizează prin amestecul plasmei de iepure sau al plasmei umane cu citrat, diluată 1:5, cu un volum egal cu cultură bacteriană dezvoltată în mediul lichid, incubat la 370C. Reacția este pozitivă dacă coagularea se produce în 1-4 ore . Ca martor se folosește amestecul de plasmă cu bulionul steril. De asemenea, evidențierea colagulazei libere se poate realiza pe medii speciale (mediul Bair Parker sau mediul Coagulase Mannitol) (fig. 9,10).

Fig. 8. Detectarea fermentării manitolului și a prezenței coagulazei libere pe mediul mannitol-coagulase la S.

.

Detectarea coagulazei legate se poate realiza printr-un test rapid de aglutinare neimună, care constă în amestecul unei anse de cultură crescută pe mediu solid, cu o suspensie de particule de latex sau hematii sensibilizate cu fibrinogen. În prezența coagulazei parietale, fibrinogenul va fi transformat în fibrină insolubilă care va antrena particulele insolubile colorate, generând apariția unor grunji vizibili cu ochiul liber și clarificarea soluției.

Termonucleaza stafilococică se evidențiază pe geloză cu ADN cu sau fără albastru de toluidină. În geloză se decupează godeuri, în care se depun 5 µl cultură de S. aureus crescută în mediu lichid și inactivată termic prin menținere pe baie de apă la 100 oC timp de 30 min, iar hidroliza ADN este revelată fie prin precipitarea ADN cu HCl 1N (reacția pozitivă constă în apariția unui halou în jurul godeului după câteva minute), sau dacă mediul conține albastru de toluidină, se va observa un halou roz în jurul godeului, în timp ce restul mediului rămâne colorat în albastru (fig. 9).

Testarea sensibilității la antibiotice se realizează sistematic pentru tulpinile izolate din infecții cu simptomatologie clinică evidentă, pe mediu Müller Hinton. Rezistența la penicilină, mediată enzimatic se poate confirma prin testul cromogenic rapid, în timp ce rezistența la oxacilină, mediată neenzimatic, prin producerea unei proteine modificate care leagă penicilina (PBP2a) se poate detecta atât prin metode fenotipice (disc difuzimetrică, cu ajutorul discurilor de oxacilină sau de cefoxitin, prin diluție în agar sau în mediu lichid a oxacilinei, prin E-test sau cu ajutorul mediilor cromogenice) sau moleculare (evidențierea genei mecA). Rezistența la oxacilină implică raportarea rezistenței pentru toate antibioticele β-lactamice, indiferent de rezultatele testării fenotipice, în timp ce sensibilitatea la oxacilină poate fi extrapolată pentru toate β-lactamicele.

Detectarea tulpinilor cu sensibilitate redusă la vancomicină necesită utilizarea unei metode cantitative care să permită stabilirea valorii CMI. De menționat că doar tulpinile cu CMI ≥ 32µg/ml pot fi evidențiate ca rezistente prin metoda clasică, disc difuzimetrică, în timp ce cele cu CMI <32µg/ml necestă o metodă cantitativă (CMI în mediu lichid sau E-test sau diluție în agar) (CLSI, 2009, 2010) (fig. 12).

Fig. 13Tulpină de S. aureus cu fenotip de rezistență la meticilină, penicilinp și MLSBi.

Tulpinile cu rezistență MLSB inductibilă (MLSBi) se evidențiază prin plasarea alăturată a discurilor de eritromicină și clindamicină. Apariția unei zone de antagonism între cele două antibiotice indică fenotipul de rezistență inductibilă la lincosamide și streptogramine B (fig.13).

1.5 Epidemiologie, prevenire, control

Rezervorul de infecție este constituit de omul bolnav sau de purtătorul sănătos de Staphylococcus aureus.

Transmiterea se realizează:

– Direct – prin picături nazo-faringiene;

– Indirect – prin aer, praf, obiecte, mână, insecte.

Poate pătrunde în organism pe orice cale, în functie de poarta de intrare constituindu-se si patologia specifică.

Profilaxia:

– Generală – măsuri de strictă asepsie, antisepsie, igienă individuală, aplicarea măsurilor de decontaminare, dezinfectie si sterilizare în unitătile sanitare.

– Specială – eradicarea portajului nazal de Staphylococcus aureus a personalului sanitar si a pacientilor spitalizati, cu precădere în sectiile de risc: terapie intensivă, chirurgie cardiovasculară, săli de operatie, de pansamente etc.

– Specifică – imunizarea activă cu anatoxină stafilococică, vaccine antistafilococic polivalent, autovaccin ce conferă un anumit grad de protectie la aproximativ 50% din cei imunizati.

Capitolul 2 Aderența bacteriană și rolul citokinelor în infecțiile bacteriene

Încă de la naștere, oamenii trăiesc într-o biosferă microbiană compusă din nenumărate microorganisme (bacterii, fungi, virusuri, protozoare). Compoziția mediului nu este statică, în mod constant având loc modificări calitative și cantitative. Bacteriile de interes medical constituie o mică parte a lumii microbiene; în corelație cu gazda, acestea pot fi: bacterii saprofite, bacterii comensale, bacterii înalt patogene, bacterii patogen-oportuniste. Adeziunea bacteriană se referă la capacitatea unor specii bacteriene de a adera la diferite tipuri de suprafețe prezente în mediul înconjurător. Patogenitatea microbiană este considerată ca un mecanism biochimic, prin care microorganismele condiționeazå apariția bolii. Nu toți patogenii au șanse egale de a-și exprima această capacitate, patogenitatea microbianå fiind un complex multifunc¡ional, iar infecția fiind dependentă de relația microorganism-gazdă.

2.1 Bioflime bacteriene

Aderența la un substrat reprezintă o etapă inițială a formării biofilmului microbian.

Biofilmul -comunitate microbiană sesilă alcătuită din celule atașate ireversibil la un substrat, la o interfață sau între ele, încorporate într-o matrice de substanțe polimerice extracelulare pe care le-au produs și manifestă un fenotip modificat cu privire la rata de creștere și de transcriere a genelor (Donland și Costerton, 2002).

Fig… Mecanismul

de formare a biofi lmului

microbian (după Finkel,

J.S., Mitchell, A.P. –

Nature Reviews

Microbiology, 2011, 9,

109-118)

Mecanismul

de formare a biofi lmului

microbian (după Finkel,

J.S., Mitchell, A.P. –

Nature Reviews

Microbiology, 2011, 9,

109-118)

Mecanismul

de formare a biofi lmului

microbian (după Finkel,

J.S., Mitchell, A.P. –

Nature Reviews

Microbiology, 2011, 9,

109-118)

2.1.1 Etapele formării unui biofilm.

Pentru a forma biofilmul, bacteriile trebuie să adere la un substrat. Condiția inițială este deplasarea microorganismelor din mediu la suprafața substratului, care se poate realiza prin trei mecanisme:

prin difuziune – consecința mișcării browniene a celulelor bacteriene – asigură deplasarea lentă într-un mediu staționar, ca și în cursul procesului de sedimentare, în care poate reprezenta singurul mod de contact al microorganismelor cu diferite substraturi;

prin curenți de convecție, asociată cu circulația lichidului în care sunt suspendate, poate asigura un transport cu câteva ordine de mărime mai rapid decât cel precedent;

mișcarea activă, cea mai rapidă, poate duce la contacte întâmplătoare sau orientate chimiotactic în cazul existenței unui gradient chimic în regiunea interfacială.

Fig.14 Mecanismul de formare a biofimului microbian

În condiții naturale, orice suprafață inițial ,,curată”, este acoperită în scurt timp de molecule adsorbite, în general, de natură proteică. Încă din faza în care se găsesc la oarecare distanță de substrat, microorganismele sunt expuse forțelor generale fizico-chimice. Aderența la substrat este inițial reversibilă, în sensul unei depuneri pe suprafața suport, cu menținerea în continuare a mișcării browniene și flagelare și cu posibilitatea de îndepărtare prin agitare ușoară sau chiar prin propria mobilitate. Un rol important în procesul de aderență au atât interacțiunile London-van der Waals, care sunt de regulă atractive, tensiunea superficială*, legăturile covalente, cât și forțele electrostatice de respingere. În mediile naturale, datorită structurilor învelișului celular, atât bacteriile Gram-negative cât și cele Gram-pozitive sunt încărcate electronegativ. Energia potențială rezultată din interacțiunea lor este variabilă și în funcție de concentrația electroliților determină comportarea bacteriilor în raport cu substratul.

Etapa de legare ireversibilă sau permanentă este caracterizată prin încetarea mișcării browniene și prin posibilitatea îndepărtării bacteriilor aderente numai sub acțiunea unor forțe puternice de agitare. Aderența este favorizată de prezența polizaharidelor extracelulare și a glicoproteinelor preformate sau sintetizate de novo pe suprafața celulei care aderă. Fenomenul explică tendința superioară de aderență la substrat, a bacteriilor în faza exponențială de creștere, comparativ cu cele aflate în faza staționară, îmbătrânite sau moarte (fig.19).

Fig.15 Prezentarea corelațiilor dintre densitatea bacteriană, faza de creștere a unei culturi asincrone, în sistem discontinuu, și etapele formării biofilmului microbian (după Costerton și colab., 1999).

După legarea fermă, bacteriile încep să crească și să se multiplice rapid. Celulele legate ireversibil de substrat, dar nu și între ele, formează un strat continuu monocelular care acoperă toată suprafața expusă a substratului. Celulele legate atât de substrat, cât și între ele formează microcolonii și biofilme. Ulterior, biofilmele rezultate din creșterea pluristratificată a bacteriilor pot fi colonizate și de alte specii incapabile, per se, să colonizeze suprafețe străine, care pot contribui la organizarea mai complexă a biofilmului. Se adaugă, uneori, cantități importante de polimeri specifici cu structură reticulată sau fibrilară, care ancorează suplimentar celulele de substrat și unele de altele (fig.16).

Fig. 16. Diagramă prezentând etapele dezvoltării unui biofilm de Ps. aeruginosa 1. Atașarea inițială, reversibilă, a celulelor la substrat. 2. Sinteza exopolizaharidelor care determină atașarea ireversibilă. 3. Formarea microcoloniilor. 4. Maturarea arhitecturii biofilmului. 5.Dispersia celulelor din biofilm (După Caiazza și colab., 2007, http://www.dartmouth.edu/~gotoole/swarm.html).

Când biofilmul devine suficient de gros, straturile profunde devin anoxice și conțin predominant specii anaerobe. Mai devreme sau mai târziu, cel puțin celulele de la baza sistemului devin înfometate și mor. Anoxia, moartea multor celule și producerea de gaze pot destabiliza biofilmul, determinând detașarea și desprinderea lui de suprafețele solide. Creșterea poate fi reluată având un caracter ciclic (Zarnea, 1994).

Fig. 17. Modalități de desprindere a celulelor din biofilm (după Costerton și colab., 1999)

2.1.2 Proprietățile biofilmelor

Biofilmele bacteriene sunt foarte heterogene în ceea ce privește structura, fiziologia, ecologia și parametrii fizico-chimici.

Arhitectura biofilmelor este heterogenă atât în spațiu cât și în timp, schimbându-se constant datorită acțiunii unor factori interni și externi. Tolker-Nielsen și colab. au studiat rolul motilității celulare asupra arhitecturii biofilmului, examinând interacțiile dintre Ps. aeruginosa și Ps. putida prin microscopie confocală de baleiaj cu raze laser. Cocultivarea celor două organisme într-un sistem de creștere continuă, a avut inițial ca rezultat formarea unor mici microcolonii ale fiecărei specii, însă în timp coloniile au devenit mixte, datorită migrării celulelor de la o microcolonie la alta.

Biofilmele sunt dinamice din punct de vedere funcțional și răspund la schimbarea condițiilor mediului. Celulele bacteriene pot fi diseminate din biofilm prin eliberarea celulelor rezultate din diviziune, prin dispersie datorită gradientului concentrației nutrienților, procesului de quorum sensing, sau prin diseminare în agregate, datorită curenților de curgere. Agregatele celulare păstrează sensibilitatea scăzută față de substanțele antimicrobiene, caracteristică biofilmului. Biofilmele pot de asemenea, să migreze pe suprafețe prin modalități foarte variate.

Expresia genică este diferită la bacteriile incluse în biofilm față de cele planctonice. Brőzel și colab. (1995, citați de Stoodley, 2002) au evaluat schimbările expresiei genice la celulele atașate de Ps. aeruginosa și au arătat că în timpul diferitelor etape ale aderenței, nivelul de expresie a peste 70 de gene s-a modificat.

Sauer și colab.(2002) au arătat că biofilmele mature de Ps. aeruginosa prezintă un profil proteic radical diferit de acela al bacteriilor planctonice crescute în chemostat. Aproximativ 50% din proteomul detectat (peste 800 de proteine) prezintă diferențe de expresie de șase ori mai mari sau chiar mai mult. Dintre acestea, peste 300 de proteine au fost detectate în eșantioanele de biofilm matur, dar nu la bacteriile planctonice.

Printre genele exprimate la un nivel înalt în celulele biofilmelor mature sunt cele care codifică proteine implicate în traducerea mesagerilor, în metabolism, în transportul membranar și/sau în secreție și reglarea genică.

2.1.3 Comunicarea bacteriană în biofilm

Bacteriile comunică intens unele cu altele și utilizează o abordare comună pentru a facilita supraviețuirea în medii ostile. O ierarhie de căi de semnalizare de la celulă la celulă reglează dez- voltarea bacteriilor, metabolismul, formarea biofilmelor, expresia virulenței și o multitudine de alte funcții esențiale în populațiile de bacterii. Noțiunea că bacteriile pot comunica reciproc și pot coordona modelele proprii de asalt împotriva gazdelor sensibile este bine cunoscută. Aceste rețele de semnalizare reprezintă o strategie de supraviețuire, prin care agenții patogeni se sustrag de la apărarea anti- microbiană și copleșesc gazda. Aceste semnale de comunicare pot depăși barierele de specie și chiar barierele de regn. Moleculele comunicării prin semnale pot regla programele de transcripție ale genomului uman în avantajul agentului patogen. Hormonii de stres umani și citokinele pot fi detectați de către sistemele sensibile a comunicării prin sem- nale. Prin acest mecanism, agentul patogen poate detecta starea fiziologică a gazdei, oferind posibilitatea de a invada atunci când pacientul este cel mai vulnerabil. Aceste sisteme microbiene de comunicare destul de sofisticate, pot fi dovedite a fi datorate agenților patogeni, conducând la obiective convenabile pentru intervenția terapeutică în lupta noastră continuă de a controla agenții patogeni microbieni .

O componentă centrală a comunicării bacteriene este cunoscută sub numele de comunicare prin semnale (QS). Aceasta este definită ca fiind capacitatea de a detecta extracelular, micromoleculele de semnal și de a modifica expresia genelor, ca răspuns la densitatea populației bacteriene. Elemente ale aparatului bacterian de comunicare prin semnale QS sunt cunoscute că servesc unei mari varietăți de funcții, dincolo de o simplă estimare a densității de celule. Bacteriile utilizează semnale QS pentru a coordona expresia genelor lor.

Mai mult decât atât, aceste semnale sensibile sunt utilizate pentru a inhiba sau activa programe de transcripție printre tulpinile bacteriene concurente și alte specii existente în cadrul aceluiași micromediu . Comunicarea poate trece chiar și de granițele regnului, moleculele efectoare bacteriene ale sistemului QS, pot modifica programele de transcripție găsite în celulele eucariote epiteliale și celulele immune efectoare. Agenți microbieni potențial patogeni se confruntă cu decalaje largi în încercarea de a invada cu succes o gazdă umană. Un repertoriu impresionant al apărarii antibacteriene întâmpină orice microorganism care traversează bariera epitelilă umană. Ca răspuns, o multitudine de arme defensive și ofensive destul de ingenioase sunt exprimate de către invadatorii microbieni. Un agent patogen trebuie să se sustragă răspunsurilor celulare și umorale înnăscute și dobândite ale sistemului imunitar ale gazdei, replicarea la o rată suficientă pentru a copleși mecanisme de eliminare ale gazdei, provoacă un prejudiciu țesuturilor.

Mulți agenți patogeni, inclusiv Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacteroides, Yersinia, Burkholderia și Enterococcus spp., și alți agenți patogeni importanți clinic, cum sunt stafilococii și streptococii, conțin gene QS. Comunicarea de la celulă la celulă prin intermediul sistemelor QS ar putea contribui la reglarea globală a mai multor gene bacteriene, inclusiv genele de virulență, în condițiile specifice de mediu și de creștere. Până la 15% din cadrele de citire deschise la bacterii sunt controlate de molecule QS. Moleculele de

semnal QS pot promova creșterea tulpinilor bac- teriene și pot inhiba simultan creșterea altor bacterii, sau chiar fungi, organisme care concurează pentru aceeași nișă ecologică.

Produsul genei QS reglează o multitudine de programe de transcripție la bacterii in vitro și probabil, in vivo. Sistemul QS controlează formarea biofilmelor, potențialul de creștere, sporulația, expresie rezistenței la antibiotice, transferul de ADN, expresia virulenței, autoliza, toleranța la stres oxidativ, activitatea metabolică, mobilitatea, sinteza antibioticelor de către bacteriile producătoare de antibiotice, comportamentul sesil față de cel planctonic și, cel mai important, factorii genetici determinanți de virulență.

Celulele biofilmului își coordonează comportamentul prin molecule pentru semnalizare destinate „comunicării” intercelulare. Comunicarea intercelulară este un aspect esențial al conviețuirii într-o comunitate bacteriană și este mediată prin semnale chimice denumite și „feromoni bacterieni” sau autoinductori. Există dovezi că unele semnale chimice, produse de către celule și eliminate în mediul extern, pot fi interpretate nu doar de membrii aceleiași specii, ci și de alte specii microbiene și poate chiar de organisme mai complexe (comunicare inter-regn).

QS este un sistem de reglare ubiquitar în lumea bacteriilor, care prezintă două componente implicate în transducția semnalului: o componentă proteică receptoare (senzor), cu un domeniu extracelular care „recepționează” semnalele extracelulare și un domeniu intracelular cu acțiune enzimatică de histidin-kinază, localizată membranar; o componentă proteică reglatoare (efector), localizată în citoplasmă, cu rol activator sau represor al transcrierii genice, prin modificarea conformației specifice a ADN sau prin interacțiune cu ARN- polimeraza.

Fig. 18 Celula de comunicare-molecula semnal (quorum sensing și comunicare cu diferite bacteria în formarea biofilmelor)

Fiecare celulă dintr-o populație bacteriană produce o anumită cantitate de feromon (autoinductor) care se acumulează pe măsura creșterii densității celulare. La atingerea stării de quorum bacterian, feromonii (denumiți în acest caz factori de quorum) vor atinge concentrația prag necesară pentru a interacționa cu proteine receptoare (senzor). Sub influența feromonilor, proteina-senzor se activează printr-un proces de autofosforilare. Proteina efectoare activată prin fosforilarea domeniului aminoterminal va interacționa direct cu ADN bacterian, modulând activitatea anumitor gene.

Cel mai studiat sistem de comunicare interbacteriană, prin intermediul feromonilor, este sistemul homoserin-lactonelor (HL) și al derivaților lor, funcțional la bacteriile Gram-negative.

Sistemele QS, la bacteriile Gram- pozitive, implică semnale chimice diferite de HL. Unele specii de Streptomyces sintetizează compuși difuzibili similari autoinductorilor, denumiți generic, butanolide, care intervin în reglarea producerii antibioticelor și a metaboliților generați în faza staționară. Cel puțin două peptide secretate de B. subtilis sunt necesare pentru inducerea stării de competență și sporulare. La S. aureus un singur octapeptid este suficient pentru declanșarea expresiei coordonate a mai multor factori de virulență. Feromonii oligopeptidici sunt necesari și pentru transferul conjugativ la Enterococcus faecalis. Sporularea la Myxococcus xanthus necesită, de asemenea, integrarea unor semnale extracelulare, dintre care cel puțin unul este constituit din aminoacizi.

Primul sistem QS a fost evidențiat la bacteriile luminiscente (Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Photobacterium sp.) care trăiesc în simbioză în organele luminoase ale unor specii de pești marini de mare adâncime și ale diferitelor specii de moluște. Aceste bacterii produc lumină (prin activarea genelor ce codifică luciferaza) numai în stare simbiotică. În stare liberă, când densitatea bacteriană este scăzută, bacteriile nu produc luciferază. Aceleași bacterii, cultivate în condiții de laborator, la atingerea unei densități critice, își activează genele pentru luciferază, consecința fiind creșterea bruscă de circa 100 de ori a cantității de lumină eliberate de fiecare celulă. Prin adăugarea la o cultură bacteriană cu densitate mică a unui supernatant de cultură bacteriană cu densitate mare, celulele și-au activat genele pentru luciferază, demonstrându-se astfel reglarea acestui proces fiziologic prin intermediul unui factor solubil (feromon) ce se acumulează în mediul de cultură pe măsura creșterii densității culturii bacteriene. Aceste observații explică de ce bacteriile luminescente nu pot produce lumină atunci când trăiesc în stare liberă și la densități scăzute în mediul marin.

Rolul feromonilor nu se limitează numai la controlul bioluminiscenței, ci și al altor procese fiziologice extrem de variate: (i) expresia coordonată a anumitor factori de virulență de către bacteriile patogene sau oportuniste ca răspuns la contactul cu celulele eucariote ale gazdei sensibile, inclusiv formarea biofilmelor mature, care implică procese de „diferențiere” a celulelor incluse în biofilm (fig. ), (ii) inducerea competenței pentru procesul de transformare bacteriană, (iii) sporularea, (iv) transferul plasmidelor conjugative, (v) procese metabolice dependente de densitatea celulară, (vi) biosinteza antibioticelor, (vii) motilitatea (twitching, swarming, swirming).

Fig18. Ilustrarea rolului mecanismului de quorum sensing în formarea biofilmului de către o specie Gram-negativă. Deși celulele planctonice secretă semnale chimice (HSL – homoserin lactone), concentrația scăzută a moleculelor de semnalizare nu modifică expresia genică. În biofilm densitatea celulară este mare, astfel încât HSL secretate ating concentrații mai mari. Moleculele HSL sunt recepționate de celulele din biofilm și determină schimbări în activitatea genetică a celulei (după Costerton și Dircks, 2004).

Deoarece unul dintre cele mai importante roluri ale mecanismelor de QS, atât la bacteriile Gram-negative, cât și la cele Gram-pozitive, este reprezentat de reglarea expresiei coordonate a factorilor de virulență și evitarea mecanismelor de apărare antiinfecțioase ale gazdei, în prezent aceste mecanisme reprezintă ținta dezvoltării unor noi strategii anti-patogenice, bazate pe blocarea mecanismelor de semnalizare intercelulară la diferite niveluri (blocarea sintezei moleculelor de semnalizare prin administrarea unor analogi ai acestora, inhibarea propagării semnalului mediat de feromoni prin diminuarea concentrației extracelulare a acestora, inhibarea recepționării semnalelor prin utilizarea unor molecule competitive (cu structură asemănătoare feromonilor bacterieni) sau necompetitive (cu structură chimică diferită) capabile să interfere cu legarea moleculelor de semnalizare la proteina senzor sau cu transmiterea semnalului la proteina reglatoare.

Una dintre cele mai importante consecințe ale formării biofilmelor este rezistența crescută a celulelor incluse în biofilm, atât la mecanismele de apărare ale gazdei cât și la dozele convenționale de antibiotice și biocizi, celulele manifestând proprietatea de rezistență față de substanțele antimicrobiene. Mecanismul protecției sau rezistenței la factorii antimicrobieni, pentru care termenul mai corect ar fi toleranță sau rezistență fenotipică (foarte diferită de rezistența propriu-zisă la antibiotice, determinată genetic) este subiectul unor dezbateri curente.

Pentru a explica mecanismele rezistenței fenotipice (comportamentale) sau a rezistenței celulelor incluse în biofilme la substanțe antimicrobiene, au fost emise mai multe ipoteze, care au formulat factorii determinanți ai rezistenței comportamentale, diferiți de factorii genetici de rezistență (fig.19):

aderența la substrat și agregarea bacteriilor între ele;

exopolimerii secretați care protejează celulele; această ipoteză, formulată adesea în trecut, conform căreia structura mucoidă ar constitui o barieră de difuzie față de moleculele antimicrobiene, este respinsă azi de unii autori;

enzimele degradative, fie provenind de la o singură specie și acumulate în concentrații mari, fie, provenind de la specii difertie și acționând sinergic;

aderența celulară însăși determină modificări fiziologice (intrarea în stare de latență metabolică a celulelor din straturile profunde ale biofilmului, subexprimarea porinelor, supraexprimarea pompelor de eflux) care explică fenomenul de rezistență a microorganismelor din biofilme.

Fig.19 Mecanismele rezistenței biofilmelor la antibiotice: i) permeabilitatea redusă a matricei biofilmului pentru antibiotice, care acționează doar la nivelul straturilor superficiale; activitate redusă a antibioticelor datorită condițiilor locale (reziduuri microbiene, pH, pCO2, pO2 etc); distrugerera antibioticului de către enzimele inactivatoare acumulate în interiorul biofilmului; rata de creștere redusă a celulelor din biofilm (populație persister); eliminarea activă a antibioticului prin intermediul pompelor de eflux exprimate de celulele crescute în biofilm; activarea răspunsului la stres care se manifestă prin supra-exprimarea unor mecanisme de rezistență la antibiotice (de exemplu, enzime inactivatoare) (după Pozo și Patel, 2007).

Biofilmele sunt omniprezente; aproape fiecare specie de microorganisme are mecanismele prin care acestea pot adera la suprafețe și între ele. Biofilmele se pot forma pe aproape orice suprafață mobilă într-un mediu apos nesteril (sau foarte umed). Biofilmele sunt prezente pe dinții celor mai multe animale, în formarea plăcii dentare, caz în care pot produce carii și boli gingivale. Biofilmele au fost găsite a fi implicate într-o mare varietate de infecții microbiene în organism, estimând 80% din totalul infecțiilor.

Procesele infecțioase comune în care au fost implicate biofilme includ infecțiile tractului urinar, infecții de cateter, infecții la nivelul urechii medii, în formarea plăcii dentare, a gingivitei; cele date de lentile de contact sunt implicate mai puțin frecvent, în procese mult mai letale, cum ar fi endocardita, infecțiile din fibroza chistică și infecții ale dispozitivelor permanente, cum sunt protezele comune, valvele cardiace și implanturi dentare. Mai recent, s-a constatat că biofilmele bacteriene pot afecta vindecarea rănilor cutanate și reduc eficiența în tratarea antibacteriană a rănilor infectate ale pielii .

2.2 Rolul citokinelor în procesul patologic infecțios

Infecția este pătrunderea și multiplicarea unui agent patogen infecțios în organism (care nu este urmată în mod obligatoriu de boală). Procesul infecțios, este o noțiune mai largă, definită ca: "totalitatea proceselor biologice care se desfășoară în organism după invadarea sa de agenții patogeni diverși" (Zilber), sau "un complex de interacțiuni ce rezultă din contactul microorganismului cu gazda."(Topley) . Deci, procesul infecțios, ca expresie a interrelațiilor între micro și macroorganism, poate fi conceput ca o confruntare între agentul patogen, înzestrat cu o serie de proprietăți agresive (infecțiozitate, virulență etc) și organismul uman, dotat cu proprietăți variabile de apărare, care se opune agresorului, în anume condiții de mediu, care condiții pot funcționa ca factori favorizanți sau frenatori în apariția procesului infecțios.

Stafilococii au capacitatea de a coloniza in general la nivelul pielii si membranelor mucoase umane sau a altor animale. Acestia sunt clasificati in functie de capacitatea de producere a coagulazei in pozitivi pentru coagulaza (ex. S. aureus) si negativi pentru coagulaza(ex. S. epidermis).

Citokinele sunt proteine sau glicoproteine, cu greutate moleculară mai mare de 5 kDa, ce pot fi secretate de orice celulă a organismului, cu posibila excepție a eritrocitelor, care se leagă și activează o varietate de celule. Citokinele sunt componente care participă la păstrarea homeostaziei mediului intern. Spre deosebire de hormoni, a căror acțiune se manifestă la distanță, citokinele acționează la nivel local. Citokinele sunt eliberate de un spectru larg de celule: micro- și macrofage,limfocite, fibroblaști, celule endoteliale și care au efect pro- sau antiinflamator. Au fost descrise peste 100 de citokine la ora actuală , dintre care cele mai importante sunt interleukinele, interferonii și chemokinele.

Fig. 20. Exemple de interleukine

Interleukinele (IL):

proinflamatorii sunt: IL-1, IL-6 și împreună cu o altă citokină , TNFα (factorul de necroză tumorală ) sunt produse de macrofagele actívate și au următoarele acțiuni:

-cresc sinteza și expresia moleculelor de adeziune la suprafața celulelor endoteliale în vederea

atragerii leucocitelor în focarul inflamator (procesele de rostogolire, aderare și migrare în interstițiu)

-declanșează reacția de fază acută , prin acțiune pe:

hipotalamus: febr – sunt pirogeni endogeni

măduva osoas : leucocitoză cu neutrofilie (datorită eliberării din depozitele medulare)

hepatocit: crește sinteza proteinelor de fază acută (proteina C-reactivă , fibrinogen, α1-

antitripsina/antichimotripsina, α2-haptoglobina, ceruloplasmina).

– induc proliferarea fibroblaștilor + stimularea sintezei de colagen (rol în procesul de cicatrizare).

Stimulează aderarea la endotelii, prin creșterea expresiei receptorilor,

În celula endotelială, stimulează pe intervale mari de timp COX → intensificarea produc-ției de PGI2 pe perioade mari de timp,

Stimulează proprietățile procoagulante ale endoteliilor locale (crește exprimarea factoru-lui von Willebrand → favorizează aderarea plachetară → macroagregate aderente la en-doteliile normale,

Scad foarte mult expresia trombomodulinei, care este internalizată → creșterea tendinței la hipercoagulabilitate în vasele locale; trombomodulina își exercită activitatea împreună cu proteinele C și S; în lipsa trombomodulinei, nu se mai activează proteinele C și S → hipecoagulabilitate; apar macrotrombi fibrino-plachetari obstruanți la periferia focarului inflamator și astfel se împiedică diseminarea microorganismelor locale în țesuturi sau va-se (localizarea focarului microbian). Dacă obstrucțiile sunt prea numeroase și interesează vase de calibru mai mare, se poate aunge la apariția de microfocare de necroză. Acești microtrombi constituie bariera fibrino-leucocitară.

TNFα este o citokina proinflamatorie al carui nume deriva din capacitatea de a distruge celulele tumorale si de a induce necroza hemoragica in  tumorile transplantate la soarece și are o acțiune proprie – stimulează degranularea leucocitelor (eliberarea de enzime) și producția acestor celule de RLO; prin eliberarea crescută de enzime și RLO, apare și un al doilea efect: enzimele pot altera și celulele locale → leziuni.

Determinarea nivelului seric de TNF-α constituie un marker pentru raspunsul inflamator sistemic (SIRS) asociat cu sepsisul, traumatismele si insuficienta cardiaca. Anumite studii au indicat asocierea concentratiei de TNF-α in lichidul cefalorahidian cu gradul de activitate in scleroza multipla; pe de alta parte, determinarea TNF-α ar putea fi utila in diferentierea meningitei bacteriene de alte cauze de meningita.

Studiile efectuate pe animale au aratat ca TNF-α este implicat in patogenia poliartritei reumatoide si a bolilor inflamatorii intestinale, datorita efectul proinflamator exercitat prin activarea celulelor endoteliale si inducerea chemotaxiei neutrofilelor. Din acest motiv, tratamentul acestor afectiuni include si inhibitori ai TNF-α:  fie anticorpi monoclonali anti- TNF-α (infliximab, adalimubab), fie proteine de fuziune anticorp-receptor, respectiv TNFRII-IgG1 (etanercept).Nivelul TNF-α poate fi utilizat in diagnosticarea unor afectiuni imune si in monitorizarea tratamentelor doar in corelatie cu date clinice si paraclinice complementare.

IL-8 – în focar, sursele sunt mastocitele, celulele endoteliale are trei efecte importante:

Stimulează intens aderarea leucocitelor la endoteliile locale, prin stimularea expresiei re-ceptorilor de adeziune pe suprafața celulelor endoteliale aflate strict în fața focarului in-flamator (SE, SP, ICAM) și crește expresia unor receptori de adeziune leucocitari (LFA1),

În concentrații mari, poate stimula degranularea leucocitelor, cu eliberarea enzimelor în focar → liza microorganismelor care încă nu au fost fagocitate,

Stimulează producția și eliberarea de RLO → cu același effect.

antiinflamatorii sunt IL-6,IL-10, TGFβ .

În protecția antiinflamatorie, un rol foarte important îl au interleukinele antiinflamatorii IL6 :

este produsă de macrofage (care sunt sursă de IL1, IL6, TNFα),

fiind foarte solubilă, trece rapid în circulație și ajunge la ficat, unde stimulează producția hepatocitară de proteine de fază acută (inhibitori enzimatici care ajung în focar, unde au acțiune modulatoare;

inhibitorii sunt: α1-antitripsina, α1-antichemotripsina, α2-antiplasmina, α2-macoglobulina; cu contribuția acestora se realizează protecția celulelor somatice locale.

2.2.2. Interferonii (IFN)-citokine cu rol major în apărarea antivirală a organismului, există 3 tipuri principale:

IFNα- si IFNβ- – eliberați de macrofage și de celulele infectate viral, rol de creștere a

producției de proteine antivirale de către celulele indemne din vecinătate.

IFN-γ – produs de limfocite cu rol de creștere a activității bactericide și virulicide a macrofagelor.

2.2.3.Chemokinele: proteine cu GM mică cu rol chemotactic și de favorizare a migrării leucocitelor în focarul inflamator.

2.3. Profilul citokinic în infecția bacteriană

Interactia dintre agentii patogeni bacterieni si celulele organismului gazda conduce in mod invariabil la eliberarea uneia sau mai multor citokine, citokinele produse efectiv depinzand in principal de natura bacteriei sau celulelor bacteriene implicate. Numerosi agenti patogeni bacterieni prezinta capacitatea de a modifica sinteza de citokine de catre organismul gazda, de a degrada citokinele pro-inflamatorii, sau de a utiliza receptorii pentru citokine ca porti de intrare pentru invazia celulara (Hale, 1991). Manipularea retelei de citokine in avantajul agentului patogen invaziv reprezinta un alt exemplu al importantei citokinelor pro-inflamatorii in protectia organismului gazda fata de invazia microbiana (Wilson si colab., 1998).

Citokinele sunt implicate în toate etapele procesului patologic. Ele își produc efectele biologice numai după ce se leagă la receptorii specifici de mare afinitate de pe suprafața celulelor țintă, activează căile de semnalizare celulară și eventual comută un set particular de gene. Genele activate codifică sinteza unei varietăți de proteine: receptori de aderență intercelulară, proteaze, factorul de agregare plachetară, enzimele ce metabolizează lipidele, NO-sintaza și citokine, inclusiv citokina stimulatoare inițială. Efectele citokinelor sunt diverse: stimularea diviziunii și diferențierii celulei, inhibiția diviziunii sau apoptoza, stimularea chemokinezei (deplasarea orientată a celulei).

Afinitatea receptorilor de citokine pentru liganzii specifici este foarte înaltă (10-9-10-15). Majoritatea celulelor au un număr mic (sute sau câteva mii) de receptori. Activarea celulelor și producerea efectelor in vivo este indusă de un număr mic de molecule, care se fixează pe receptorii specifici.

Denumirea multor citokine reflectă activitatea biologică atribuită: TNF α (factorul de necroză tisulară) are efecte proinflamatorii, dar are o slabă activitate citotoxică (necrotică); TGF β (factorul de creștere al celulelor T) este un inhibitor al diviziunii celulelor epiteliale, astfel că denumirile citokinelor nu reflectă totdeauna efectele lor.

Citokinele proinflamatorii, IL-1, IL-6, TNF (cea mai puternică este IL-6) îndeplinesc următoarele funcții:

stimulează ficatul să sintetizeze proteinele de fază acută. Proteinele de fază acută au rolul de opsonine și favorizează fagocitoza;

induc sinteza moleculelor de aderență intercelulară: moleculele familiei selectinelor P și E, care leagă liganzii glucidici ai leucocitelor și determină încetinirea deplasării și fenomenul de rostogolire pe suprafața endoteliului, în focarul inflamator. Alți receptori endoteliali de aderență sunt moleculele de aderență intercelulară ICAM și VCAM (vascular cell adhesion molecules). Aceștia se leagă cu afinitate înaltă de contrareceptorii membranei leucocitului, denumiți β-integrine, o familie de proteine heterodimerice (Henderson, 1996). Interacțiunea dintre integrine și ICAM determină oprirea leucocitelor circulante și trecerea în țesutul conjunctiv (diapedeză). Leucocitele circulante exprimă constitutiv β2-integrine, dar într-o conformație nefuncțională. β2-integrinele pot fi activate sub acțiunea unor factori chimiotactici (IL-8). Se crede că bacteriile comensale induc sinteza unor citokine inhibitorii ale reacției inflamatorii.

Citokinele au o redundanță enormă. Ele se activează în cascadă și constituie o rețea complexă ce mediază interacțiunile dintre celule. Citokinele produse de o celulă induc sinteza în celulele sensibile a unui set de citokine, care include citokina de inițiere.

Citokinele antiinflamatorii inhibă procesul inflamator: IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, TGF β.

Efectele antiinflamatorii s-au studiat in vitro, asupra substratului celular sensibil.

Infecția stafilococică este intens inflamatorie, induce afluxul neutrofilelor și în consecință, piogenă. S. aureus scapă acțiunii fagocitelor neutrofile și, de la locul infecției primare, invadează țesuturile. Creșterea frecvenței septicemiilor cu bacterii Gram-pozitive se datorează capacității sale de a coloniza cateterele intravasculare și materialele implantate chirurgical, precum și rezistenței la meticilină. Antigenele inductoare ale inflamației sunt acizii lipoteichoici (ALT), peptidoglicanul parietal, toxinele secretate inductoare ale șocului septic, peptidele formil-metionil și ADN bacterian. ADN bacterian are proprietăți proinflamatorii și inițiază artrita. Inflamația este stimulată de citokinele secretate de monocite/macrofage: TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8. IL-8 este atractant puternic pentru neutrofile, iar MCP-1 (proteina-1 chemoatractantă macrofag/monocit) și MIP-1 (proteina-1 inflamatorie a macrofagelor) sunt atractante pentru monocite la situsul inflamației.

Concentrația serică maximă a citokinelor induse de bacteriile Gram-pozitive se realizează la 50-75 de ore, iar pentru cele Gram-negative, la 1-5 ore. TNF-α are rol determinant pentru evoluția procesului inflamator indus de bacteriile Gram-negative, iar pentru bacteriile Gram-pozitive, efectele TNF-α se produc în cooperare cu celelalte citokine proinflamatorii.

Fagocitele profesioniste (neutrofilele și macrofagele) leagă antigenele de S. aureus (LTA) prin intermediul receptorului membranar TLR-2 (Toll-like receptor-2) (Fournier și Philpott, 2005). Primul receptor al familiei Toll a fost identificat la Drosophila melanogaster, foarte rezistentă la infecțiile microbiene, deoarece sintetizează peptide antimicrobiene. Sinteza peptidelor este reglată de un receptor Toll, iar mutantele Toll- sunt sensibile la infecțiile fungice și bacteriene. De aceea, Toll este un receptor esențial pentru recunoașterea imună înnăscută la D. melanogaster.

Hang L, Wullt B, Shen Z, Karpman D, Svanborg C, consideră că examinarea profilul citokinic al mucoasei celulelor epiteliale din tractului urinar uman are ca scop diferențierea între producția constitutivă și boli legate de citokine în aceste țesuturi. Secțiunile au fost din pelvis renal, ureterul, vezică sau uretră obținute de la 22 de pacienți care au suferit intervenții chirurgicale ale tractului urinar și au fost colorate cu anticorpi monoclonali la interleukina (IL) -1beta, IL-4, IL-6, IL-8, interferonul gama (IFNgama ) și transformarea factorului de crestere beta (TGFbeta). Secțiunile au fost clasificate în funcție de prezența sau absența bolii în țesut. Rezultatele arată că celulele epiteliale din toate părțile tractului urinar produc în mod constitutiv IL-8 și TGF beta și sugerează că producerea de alte citokine variază cu boala pacientului. Producția de citokine oferă baza pentru un răspuns rapid al gazdei , în apărarea împotriva atacurilor de microbi sau de agenți toxici.

Studiul realizat de A. Szkaradkiewicz & T. M. Karpiński & A. Zeidler & A. K. Szkaradkiewicz & H. Masiuk & S. Giedrys-Kalemba urmareste descrierea nivelul de circulație a citokinelor produse de limfocite Th (IFN-γ, IL- 4, IL-10, IL-17A), precum și nivelurile de citokine produsă de monocite / macrofage (TNF-α, IL-1β, IL-12), la pacienți cu infecții cronice cauzate de Staphylococcus aureus. Studiile au fost efectuate pe pacienții adulți, inclusiv 50 de pacienți cu dermatită cronică supurativă, 40 de pacienți cu infecții cronice ale tractului respirator și 25 persoane sanatoase (grupul de control).

Nivelul citokinelor serice în sânge au fost măsurate prin testul ELISA. S. aureus a fost detectată în culturi de exudate dermice supurative sau pe frotiuri faringiene. Clase de sisteme Agr în tulpinile S. aureus au fost identificate folosind reacția în lanț a polimerazei (PCR). În ambele grupe de pacienți, în medie, nivelurile de IFN-γ au fost dublate, în timp ce nivelurile de IL-17A au crescut de 2,5 ori,cu toate acestea, nu a fost însoțită de un nivel crescut de TNF α sau IL-12. Datele indică faptul că dezvoltarea S. infectie aureus in randul pacientilor studiati a fost legat de un răspuns citokinic sărăcit de monocite / macrofage, în timp ce ,cea indusă de limfocite patogene Th17 / Th1 poate fi responsabilă pentru promovareaunui răspuns inflamatoriu.

Capitolul 3 Materiale și metode utilizate

3.1 Materiale necesare

Pentru culturile bacteriene: tuburi, pipete, vârfuri, medii de cultură, incubator, tulpini bacteriene de interes.

Pentru obținerea supernatanțelor bacteriene: culturi bacteriene, filtre, pipete, vârfuri, tuburi pentru colectarea supernatanțelor.

Pentru obținerea sedimentului celular: pipete, vârfuri, tuburi de centrifugă de 15 ml, centrifugă, culturi de celule Hep2 infectate cu diferite tulpini bacteriene/supernatante bacteriene, tripsină, incubator setat la 37˚C, TFS 1X steril.

Materiale utilizate pentru subcultivarea celulelor eucariote Hep2

-linia celulara Hep

-Vase de cultură

– Mediu de creștere complet , pre – încălzit la 37 ° C- mediu DMEM (Dulbecco’s Modified Essential Medium – Sigma) suplimentat cu 10 % ser fetal de vițel (Sigma),

-Tuburi sterile de unică folosință , de 15 ml

– soluție de albastru de tripan 0,4% (W/V) în ser fiziologic tamponat,

– tampon fosfat salin (TFS),

– soluție de lucru tripsină-EDTA : 0,5 g tripsină și 0,2 g EDTA 4Na/l soluție NaCl 0,9%,

– apă distilată,

-sticlărie de laborator, hemocitometru, plăci cu 24 de godeuri, pipete automate,

– hotă,

– incubator cu 37 ° C si atmosferă umedă de 5 % CO2

– tuburi Eppendorf.

-Reactivi și echipamente pentru a determina numarul de celule viabile și totale, cum ar fi Countess®Automate Cell Counter , Trypan albastru și hemacitometru

sau contor Coulter®( Beckman Coulter).

Pentru extracția ARN: tuburi de 1,5 ml, centrifugă, termobloc, vortex, pipete, vârfuri, gheață, etanol 95%, freezer, kit de extracție.

Pentru reverstranscriere: pipete, vârfuri, gheață, Thermal cycler, probele de ARN, kit de reverstranscriere.

Pentru qRT-PCR: pipete, vârfuri, mănuși, hotă, plăci cu 96 de godeuri, centrifugă pentru plăci, tuburi de 0,2 ml, H2O nuclease-free, aparat de qRT-PCR, kit-uri specifice.

3.2 Metode folosite

3.2.1 Testarea capacității de aderență și invazie a tulpinilor S. aureus testate

♦ Metoda care are la bază infectarea unei culturi de celule eucariote in vitro, presupune îndepărtarea bacteriilor neaderate după incubare initiala timp de 2 ore și determinarea capacității de invazie (dupa eliminarea bacteriilor aderate prin tratament cu gentamicina) sau de aderență și invazie bacteriană, prin însămânțarea suspensiilor rezultate după liza celulelor monostratului și determinarea UFC/ml.

Pentru testarea capacității de aderență și invazie s-a utilizat un protocol adaptat după Lazăr, 2003.

Ca și substrat celular sensibil s-au utilizat culturi de celule Hep2, care dupa dezghețare au fost menținute în mediu DMEM:F12 cu adaos de 10% ser fetal de vițel (Sigma).

Acestea au fost cultivate în plăci cu 6 godeuri sterile, la o densitate 3x105celule /godeu Monostratul celular a fost utilizat în momentul când nivelul de confluență a atins 80-90%.

Tulpinile de S. aureus izolate din specimene clinice au fost crescute peste noapte (16-18h) în bulion LB. După incubare probele au fost diluate în TFS până la o concentrație de 0,5McFarland (107–108) și 10μl din această suspensie au fost utilizați pentru a inocula un godeu ce conține celule Hep. Fiecare probă a fost lucrată în triplicat: un eșantion fiind lucrat pentru evidențierea capacității de aderență, unul pentru aderență și invazie, iar ultimul fiind utilizat doar pentru evidențierea capăcității de invazie.

♦ După repartizarea suspensiilor bacteriene peste monostratul celular, toate cele trei variante experimentale (Aderență, Aderență+Invazie și Invazie) au fost incubate la 37oC, 2 ore. In acest timp, bacteriile aderă la suprafața celulelor eucariote și invadează sau nu substratul celular.

După 2 ore de incubare s-a îndepărtat surplusul de suspensie bacteriana, iar monostratul celular a fost spălat de 3 ori cu TFS steril. In acest moment placutele au fost tratate diferit in functie de scopul urmarit :

pentru testul de aderență – placile au fost tratate cu metanol 100%, 5 minute pentru fixare. După expirarea celor 5 minute s-a îndepărtat metanolul și placutele au fost colorate cu soluție Giemsa 10% (Sigma Aldrich, Germania), 20 minute. După îndepărtarea colorantului placuțele au fost uscate și analizate la microscop cu OI, utilizând un microscop Axiolab (Zeiss).

pentru testul de aderență și invazie – monostratul celular a fost spălat de 3 ori cu TFS pentru îndepărtarea bacteriilor neaderate. După ultima spălare s-a adăugat soluție Triton X100 1% (Sigma Aldrich, Germania) pentru a liza celulele eucariote și s-a incubat timp de 5 minute la 37oC. Ulterior s-au realizat diluții zecimale în TFS din fiecare godeu (până la diluția 10ˉ⁸). Din diluțiile pare (10⁻2, 10⁻⁴, 10⁻⁶, 10⁻⁸) au fost însămânțate în spot (câte 3 replici tehnice per diluție; un spot=10μl) în plăci Petri cu agar LB. După însămânțare, plăcile Petri au fost incubate 24h la 37oC. Citirea rezultatelor s-a realizat prin cuantificarea numărului de colonii crescute la fiecare diluție, pentru fiecare replică și calcularea numărului de UFC raportat la 1 ml.

pentru testul de invazie – placutele au fost spălate de 3 ori cu TFS, după care s-a realizat un tratament cu soluție de Gentamicină 100ug/ml, timp de o oră 37˚C. După expirarea perioadei de incubare, placuțele au fost lucrate la fel ca și cele pentru Aderență și Invazie (s-au realizat dilutii zecimale însămânțate în spot in meduiu LB si incubare 24 h la 370C). Citirea rezultatelor s-a realizat prin cuantificarea numărului de colonii crescute la fiecare diluție, pentru fiecare replică și calcularea numărului de UFC raportat la 1 ml.

Pentru testele de aderenta celulara si invazie a fost utilizata linia celulara Hep2

Linia celulara umana (Hep2), a fost menținuta în cultură în mediu DMEM (Dulbecco’s Modified Essential Medium – Sigma) suplimentat cu 10 % ser fetal de vițel (Sigma) și incubate la 37°C, 5% CO2, în atmosferă umedă.

Subcultivarea, sau pasajul celulelor implică dispersia monostratului, separarea celulelor și transferarea acestora în noi vase de cultură. Procedura este necesară atunci când o populație de celule ajunge la monostrat (a ocupat aproape toata aria suprafeței unui vas de cultură).

Detașarea celulelor ajunse la confluență se poate realiza mecanic cu dispozitive de raclaj sau chimic, prin tratament cu tripsină sau cu tripsină-EDTA.

Dispersia mecanică implică utilizarea unei spatule sterile din silicon sau plastic care să fragmenteze monostratul în agregate. Metoda nu este adecvată menținerii culturilor continue, ale căror celule au membranele sensibile la manipularea mecanică, deoarece adeseori acest proces comprimă sau lizează celulele. Această tehnică este adesea utilizată la finalul experimentelor, pentru testările preliminarii.

Dispersia enzimatică utilizează enzime proteolitice precum tripsina, colagenaza și/sau DN-azele, care duc la obținerea unui număr satisfăcător de celule, cu o distrugere tisulară redusă. Soluția de enzime este o soluție salină ce conține 0,5-2% Ca2+-Mg2+ (PBS) suplimentată cu un chelator de cationi (EDTA). Celulele sunt lăsate în contact cu enzima o perioadă nu mai mare decât cea indicată (aproximativ 10 minute) deoarece enzimele pot afecta membranele celulare. Inactivarea enzimelor este realizată prin neutralizarea activității soluției prin adăugarea unui mediu proaspăt ce conține ser. Fig.21. descrie protocolul utilizat de obicei pentru dispersia enzimatică a monostratului de celule.

Soluția stoc (10x) conține 25 g tripsină pe litru de ser fiziologic (0,9 NaCl) fara calciu și magneziu. Tripsina 1:250 semnifică : o parte tripsină poate digera 250 părți caseină. Stocul de tripsină se păstrează înghețat în porții mici (5-10 ml). Tripsina (obținută din intestin de porc) se controlează pentru a nu fi contaminată cu parvovirusuri porcine sau micoplasme. Soluția stoc de tripsină se sterilizează prin filtrare.

Soluția de lucru tripsină-EDTA conține 0,5 g tripsină și 0,2 g EDTA 4Na per litru soluție NaCl 0,9%. Soluția EDTA se sterilizează la autoclav.

↓

↓

↓

↓

↓

Fig.21 Diagrama protocolului utilizat pentru dispersia enzimatică a monostratului de celule. DME-10 = mediu Eagle modificat Dulbecco ce conține 10% ser fetal de vițel. PBS = soluție tampon fosfat salin. * = diluție 1:10 în PBS a concentratului 10X tripsină-EDTA (după Butler, 2005). https://www.google.ro/search?sourceid=chromepsyapi2&ion=1&espv=2&ie=UTF-8&q=culturi%20de%20celule%20capitolul%2012&oq=culturi%20de%20celule%20capitolul%2012&aqs=chrome..69i57.9528j0j8

Fig.22 Protocolului utilizat pentru dispersia enzimatică a monostratului de celule.

https://www.google.ro/search?sourceid=chrome-psyapi2&ion=1&espv=2&ie=UTF-8&q=culturi%20de%20celule%20capitolul%2012&oq=culturi%20de%20celule%20capitolul%2012&aqs=chrome..69i57.9528j0j8

Protocolul de urmat este :

Se înlătură mediul de cultură.

Se spală monostratul cu soluție EDTA 0,02% la 37oC pentru a înlătura urmele de ser, Ca, Mg din mediu care inhibă tripsina (1 minut).

Se adaugă 1 ml tripsină (soluție de lucru) la o suprafață de 20-40 cm2 și se lasă 5-15 minute la 37 oC până la desprinderea celulelor (pelicula de tripsină acoperă monostratul). Reactivul este încălzit în prealabil; se foloseste suficient reactiv pentru a acoperi stratul de celule ( aproximativ 0,5 mL per 10cm2 ). Se agită ușor recipientul pentru a obține o acoperire completă a stratului de celule. Notă: timpul efectiv de incubare variază în funcție de linia de celule utilizată.

Observați celulele la microscop pentru detașare. Dacă celulele sunt mai puțin de 90 % detașare, crește-ți timpul de incubare câteva minute, verificați pentru disociere la fiecare 30 secunde. Ați putea,de asemenea,să agitati vasul pentru a accelera detașarea de celule.

Când ≥ 90% dintre celulele s-au detașat, înclinați vasul pentru câteva secunde pentru a permite celulelor să se scurgă. Adăugați echivalentul a 2 volume (de două ori volumul utilizat pentru reactiv de disociere) pre – încălzit. Dispersează mediul prin pipetarea peste suprafața stratului de celule de mai multe ori .

Se procedează la dispersia celulelor prin aspirare-pipetare cu o pipetă Pasteur. Se reiau celulele în circa 5 ml mediu proaspăt.

Se transferă 0,1 ml din suspensia celulară într-un tub de diluție și se adaugă 0,4 ml albastru de tripan (diluție 1:5). Se amestecă bine și se aspiră un eșantion cu pipeta Pasteur.

Pe hemocitometrul în prealabil curățat cu alcool 95%, bine uscat, se fixează lamelele acoperitoare. Se plasează pipeta Pasteur în dreptul orificiului de încărcare într-un unghi de 45o și se așteaptă umplerea completă a camerei. Se așteaptă un minut așezarea celulelor. Hemocitometrul constă din două camere acoperite cu o lamelă. Fiecare cameră este împărțită printr-o grilă compusă din 9 pătrate mari cu aria individuală de 1 mm2 și cu o adâncime de 0,1 mm. În consecință, volumul fiecărui pătrat va fi de 0,1 mm3. Astfel, împărțind numărul mediu de celule dintr-un pătrat la volumul său vom obține concentrația unei culturi celulare exprimată în celule/ml.

Cu obiectivul 40x se numără celulele colorate și cele clare din 5 pătrate mari. Se obține numărul total de celule din grilă. Erorile în calculul numărului de celule pot proveni din :

– dispersarea inadecvată a celulelor (prezența agregatelor) ;

– diluția inadecvată a suspensiei celulare ;

– umplerea inadecvată a camerei hemocitometrului ;

– hemocitometru și lamelă curățate insuficient (prezența de bule de aer, grăsimi, etc)

Se numără celulele de pe liniile despărțitoare din josul și din dreapta pătratelor ; agregatele sunt considerate o singură celulă. Trebuie să se obțină între 20-60 de celule pe pătrat. Dacă sunt mai multe, numărătoarea este dificilă și suspensia celulară trebuie diluată.

Procedând la fel, se numără numai celulele clare (vii) din 5 pătrate mari. Se obține numărul total al celulelor vii.

Concentrația suspensiei inițiale se determină astfel :

Număr de celule / ml = (număr total de celule/5) x (1/diluția suspensiei) x 104.

3.2.2 Determinarea viabilității celulare.

Albastrul de tripan este una din substanțele recomandate pentru determinarea viabilității celulare în testul de excludere a colorantului. Principiul metodei rezidă în faptul că celulele vii nu se colorează în timp ce celulele moarte prind colorantul. Trebuie notat că afinitatea albastrului de tripan pentru proteinele din ser (componenta esențială a mediului de cultivare a celulelor) este mai mare decât pentru proteinele celulare. De aceea, diluarea celulelor de numărat într-o soluție salină fără ser (Hanks, de obicei) sau mai bine, centrifugarea și resuspendarea lor în soluția Hanks este recomandabilă înainte de numărătoare.

Soluția de albastru de tripan este 0,4% (W/V) în ser fiziologic tamponat.

Protocolul este următorul :

– se prepară o suspensie celulară în soluția Hanks, de obicei o suspensie stoc din care pot fi făcute diluții astfel încât densitatea celulelor în hemocitometru să fie între 20-50 per pătrat ;

– suspensia stoc se diluează 1/5 adăugând la 0,2 ml suspensie celulară, 0,5 ml soluție tripan și 0,3 ml soluție Hanks ;

– se așteaptă 5-10 minute ; prelungirea timpului de colorare poate afecta viabilitatea ;

– se numără în hemocitometru, de obicei în cinci pătrate mărginite de linii triple. Numărătoarea se face cu obiectivul 40 și ocularul 10. Nu se numără două din marginile triple ale pătratelor. Se ține separat socoteala celulelor vii (necolorate) și moarte (colorate) (Figura 19)

– fiecare pătrat umple un volum de 0,1 mmc ; pentru a exprima rezultatul per ml se înmulțește cu 104.

Viabilitatea celulară se determină după formula :

% celule viabile = 100 x număr de celule vii / număr total de celule.

Pentru a ajusta densitatea noii culturi celulare se va folosi formula :

Vf x Cf = Vi x Ci

Vf = volumul suspensiei dorite ;

Cf = concentrația dorită ;

Vi = volumul suspensiei inițiale ;

Ci = concentrația suspensiei inițiale calculată anterior.

Deci Vf va fi obținut diluînd volumul inițial.

3.2.3 Subcultura de celule în suspensie

Deoarece celulele sunt deja suspendate în mediul de creștere nu este necesar tratamentul enzimatic al acestora pentru a le detașa de suprafața vasului de cultură, întregul proces fiind mai rapid și mai puțin traumatizant pentru celule. Hranirea celulelor la 2 până la 3 zile se poate realiza prin diluarea directă a celulelor din vasul de cultură, cu impartirea in mai multe vase de cultura, sau prin retragerea unei părți din mediu din vasul de cultură și diluarea celulelor rămase, până la o densitate de însămânțare adecvată pentru linia celulară. De obicei, perioada de latență pentru următoarele pasaje este mai scurtă decât cea observată în aderența celulară.

3.2.4 Înghețarea celulelor-Crioconservare

Majoritatea liniilor celulare sunt înghețate pentru timp nedefinint și apoi decongelate pentru continuarea cultivării. În funcție de gradul utilizării și necesitatea altor investigații, achiziționarea unui ultracongelator este utilă. Aceste ultracongelatoare mențin temperatura imediat sub punctul critic la care se formează gheața (-130oC) și sunt echipate cu alarme și sisteme de rezervă în cazul avariilor mecanice. Pentru laboratoarele independente, un congelator cu azot lichid (LN2) este convenabil, dar necesită adaugare de azot lichid datorită evaporării constante.

Liniile celulare și culturile primare sunt crioconservate atunci când sunt obținute condițiile optime pentru cultură.

Protocol

Procedura pentru subcultivarea monostraturilor este realizată după tehnica descrisă mai sus și prezentată în fig.23.Monostraturile sunt dispersate prin imersia într-o soluție tamponată de tripsină, neutralizată cu mediu de creștere ce conține ser (mediu de creștere complet), și centrifugate (400g pentru 10 minute). Supernatantul este îndepărtat și sedimentul este resuspendat în mediu de creștere complet ce conține o substanța anti-îngheț precum dimetilsulfoxid (DMSO) sau glicerină. Celulele sunt resuspendate în DME-10 plus DMSO 10% la o la o concentrație de 1-3 x 106 celule/ml în criotuburi sterile de 2 mL, cu capac cu filet. Criotuburile sunt marcate și înghețate lent la o rată controlată de -1 grad C/minut într-o cameră de congelare automată.

Fig.23.Etapele de înghețare

Aceste camere sunt de obicei disponibile ca accesorii ale congelatoarelor cu azot lichid. Alternativ, criotuburile sunt înghețate în vapori de azot prin plasarea lor într-un recipient și poziționarea acestui recipient la nivelul porțiunii care se îngustează a canistrei cu azot. Este important ca nivelul azotului lichid să nu fie foarte mare deoarece ar îngheța celulele prea rapid. În ziua următoare, tuburile sunt sigilate în criorecipiente și imersate în azot lichid.

3.2.5 Dezghetarea se face după următorul protocol:

-Criotubul cu celulele se introduce rapid in baia de apa, la +37oC;

-se dilueaza foarte lent cu mediu, 1/20 (celulele dezghetate sunt sensibile la actiunile mecanice si osmotice)

-Se centrifugheaza imediat dupa dilutie, pentru a minimiza efectul crioprotectantului

-Se determina viabilitatea celulelor. O viabilitate acceptabila pentru reluarea normala a culturii este de > 65%.

Celulele sunt direct numărate, iar densitatea lor este ajustată prin adăugarea mediului proaspăt. La fiecare 2-4 săptămâni se centrifughează și resuspendă celulele neaderente în mediu proaspăt.

3.3 Obținerea culturilor bacteriene

Culturile bacteriene folosite în studiu au fost obținute din hemoculturi, plagi sau portaje fiind prelevate de la pacienți internați în spitalul Fundeni. Tulpinile izolate au fost identificate cu ajutorul testelor Api. Ulterior tulpinile validate au fost menținute în colecția de culturi a Laboratorului de Microbiologie din Facultatea de Biologie (în mediu de conservare). Pentru experimente au fost utilizate doar tulpinile validate de S. aureus .

3.4 Obținerea supernatantelor bacteriene

Mediatorii bacterieni solubili au fost obținuți din culturi de Staphylococcus aureus în 10 ml mediu. La 24 de ore a fost estimată cantitativ creșterea bacteriană prin numărarea celulelor viabile: s-au realizat diluții zecimale care au fost ȋnsǎmȃnțate pe mediu solid în trei exemplare. A fost folosită o suspensie de cultură bacteriană ajustată de 1×109 CFU/ml densitate. Suspensia bacteriană a fost centrifugată la 5000g si supernatantul bacterian rezultat a fost sterilizat prin filtrare (Φ = 0.22 µm). Filtratele bacteriene au fost menținute la 4˚C până în momentul folosirii.

3.5 Realizarea modelului experimental

Tratament celule: 5×105 celule THP1 au fost insamantate in T25, in 5 ml mediu RPMI suplimentat cu 10% ser fetal bovin la care s-au adaugat 1,25ml supernatant bacterian filtrat sau suspensie de corpi bacterieni. Cultura a fost mentinuta la 370C, 5% CO2, timp de 48 ore.

După expirarea timpului de incubare culturile celulare au fost sacrificate. Au fost preluați cei 6,25 ml din fiecare plăcuță și au fost transferați cu o pipetă într-un tub de centrifugă de 15 ml. Celulele aderate la fundul plăcuței au fost desprinse prin tratament mecanic, prin pipetare cu jet de câteva ori. Suspensia de celule a fost transferatǎ în tub peste restul de celule.

Tuburile au fost ulterior centrifugate 5 minute, la 300xg. Supernatantul a fost îndepărtat, iar sedimentul celular a fost spălat cu TFS 1X steril. Tuburile au fost centrifugate din nou la 300xg, 5 minute. Supernatantul a fost aruncat, iar sedimentul celular s-a utilizat ȋn continuare pentru extracția ARN.

3.5.1 Extractia ARN-ului total folosind reactivul TriReagent

Toate operațiunile se realizează în hota de extracție. Pregătirea eșantioanelor se face utilizând 5-10 x106 celule pentru 1 ml de TriReagent. Omogenatul poate fi stocat o luna la -700C. Pentru decongelare se lasă omogenatul 5 minute la temperatura ambianta. 1,6 ml de solutie de liza TriReagent este transvazată într-un tub de 2 ml cu fund rotund împreună cu eșantionul biologic.

Extractia ARN total: sub hota de extracție, se adaugă la 1,6 ml de soluție 320μl cloroform. Soluția este vortexată 10s, se incubează timp de 15 min la temperatura ambiantă, se centrifughează la temperatura de 4°C, 12000 x g timp de 15 min.

Se vor separa trei faze :

– faza apoasa (ARN);

– interfaza (ADN

– faza organica (proteine)

Transferul fazei apoase se face fără a se atinge inelul alb din mijloc, într-un tub nou de 2 ml cu fund rotund.

Precipitarea ARN-ului se face cu 1 volum de izopropanol, amestecând soluțiile prin răsturnarea de mai multe ori, incubare timp de 10 min la temperatura ambianta, centrifugare la temperatură de 4°C, 12000 x g timp de 15 min și eliminarea supernatantului fără a se atinge peletul cu o pipeta de 1000 μl.

Etapa I de spalare: se adaugă peste peletul de ARN total 1 ml etanol de 75%, se vortexeaza cateva secunde pentru desprinderea peletului, se centrifughează la temperatura de 4°C, 12000 x g timp de 5 min și se elimină supernatantul.

Etapa II de spalare: se adaugă peste peletul de ARN total 1 ml etanol de 75%, se vortexează cateva secunde pentru desprinderea peletului, se centrifughează la temperatura de 4°C, 12000 x g timp de 5 min și se elimină supernatantul, se centrifughează rapid pentru a colecta ARN-ul în partea de jos a tubului, se elimină urmele de etanol cu o pipeta de 10 μl ți se lasă 5 minute să se usuce în aer liber.

Eluarea: se efectuează prin adăugarea peste sedimentul de ARN a 100μl de apă RNAase free și dizolvarea peletului de ARN prin aspirare repetată cu pipeta.

Se păstrează tubul pe gheață până se termină toată seria de probe după care se congelează la –80°C.

3.5.2 Stabilirea concentrației și puritǎții ARN extras utilizând spectroscopia de absorbție

Puritatea și concentrația acizilor nucleici a fost evaluată prin măsurarea absorbanței probei la diferite lungimi de undă. Măsurarea A260 cuantifică ADN relativ pur în micrograme. Citirea absorbanței nu poate discrimina între ADN și ARN, dar raportul A la 260 și 280nm poate fi utilizată ca indicator al purității acizilor nucleici. Proteinele, spre exemplu, au un maxim de absorbție la 280 nm care va reduce raportul A260/A280. Absorbanța la 325 nm indică impurități în soluție sau pe placa de citire; contaminanții conținând peptide legate sau nuclee aromatice ca de exemplu proteine sau fenol absorb la 230 nm.

Pentru a determina concentrația ARN s-a utilizat A260 utilizând următoarea ecuație, bazatǎ pe legea Lambert-Beer: A= ECl

Pentru ARN monocatenar: C(µg/µl)=A260/0.025

Raportul 1,8-1,9 și 1,9-2,0 indică o puritate mare a preparatelor ADN și RN respective. Contaminanții care absorb la 280 nm (proteine) scad acest raport. Absorbanța la 230 reflectă contaminarea probelor cu fenol sau uree, pe când absorbanța la 325 nm sugerează contaminarea cu impurități.

Măsurarea concentrației probelor ARN extrase (Aparatul utilizat: Nanodop ASP-2680)

3.5.3 Reverstranscriere

Revers transcrierea s-a efectuat cu sistemul de sinteză SuperScript First – Strand pentru RT – PCR . Următoarea procedură este bazată pe protocolul kitului.

Pregătiți următorul amestec de ARN/primer în fiecare tub:

-ARN total =5 g

2. Se incubează probele la 65C timp de 5 minute și apoi pe gheață timp de cel puțin 1 minut .

3. Se prepară un amestec de reacție . Pentru fiecare reacție :

4. Adăugați amestecul de reacție cu amestecului ARN / primer, iar apoi se pune la temperatura camerei timp de 2 minute.

5. Adăugați 1 l ( 50 unități ) de SuperScript II RT în fiecare eprubetă , se amestecă și se incubează la 25 ° C timp de 10 min .

6. Se incubează tuburile la 42C timp de 50 min , se încălzește si se inactivează la 70C timp de 15 min , iar apoi se introduc pe gheață.

7. Adăugați 1 l RNaza H și se incubează la 37C timp de 20 min .

ADN complementar (ADNc) obținut va fi păstrat la 4°C pentru perioade scurte de timp, sau la -20°C pentru perioade mai lungi.

3.5.4 qRT-PCR -Real-Time PCR

Principiul real-time PCR – Tehnica real-time PCR utilizează primeri specifici pentru amplificarea secvenței țintă, iar în tandem cu aceștia, construcții oligonucleotidice speciale sau alte tipuri de molecule incluse în mediul de reacție indică acumularea produsului PCR (Burns et al., 2004). Astfel,de-a lungul mai multor cicluri de amplificare,construcțiile oligonucleotidice care sunt de asemena specifice secvenței țintă, vor determina modificarea semnificativă a semnalului fluorescent (Burns et al., 2004). Teoretic, în cadrul amplificării, acumularea produșilor PCR se desfășoară exponențial. În practică însă, reacția nu atinge niciodată eficiență maximă. Mai mult, după 30-40 cicluri de amplificare intervine fenomenul de plafonare (Ahmed, 2002) care afectează reacțiile în mod independent și diferit (Figura ..

Fig24.. Cinetica reacțiilor de amplificare. În cazul amplificării paralele a mai multor repetiții ale aceleiași probe, curbele de răspuns sunt foarte asemănătoare în faza exponențială (portocaliu).Spre sfârșitul reacției profilurile sunt însă extrem de diferite (roșu).

Caracterul cantitativ al metodei real-time PCR este conferit de posibilitatea stabilirii unei corelații directe între cantitatea produsului de amplificare acumulat și numărul inițial de copii ale moleculei țintă (Weighardt, 2004).

Metodologia real-time PCR utilizată astăzi este o îmbunătățire a tehnicii inițiale create de Higuchi et al. și reprezintă cea mai performantă strategie de cuantificare a acizilor nucleici (Cankar et al., 2006; Miraglia et al., 2004, și Anklam et al., 2002, în Engel et al., 2006; Kubista et al., 2006; Weighardt, 2004; Alary et al., 2002). Pe lângă precizia cuantificării, a crescut și capacitatea de analiză, iar incidența erorilor și a rezultatelor fals pozitive este mult redusă (Cankar et al., 2006; Alary et al., 2002).

Deoarece amplificarea și detecția sunt combinate într-o singură analiză (sistem închis), riscul de contaminare este de asemenea redus. Tehnica este utilizată în special pentru detecția patogenilor, analiza expresiei genice, analiza polimorfismului determinat de o singură nucleotidă (singlenucleotidepolymorphism/SNP),analiza aberațiilor cromozomiale etc. Real-time PCR este de asemenea cea mai utilizată și mai precisă metodă de cuantificare a conținutului MG al diferitelor materii prime sau procesate de origine vegetală destinate consumului alimentar al oamenilor sau animalelor (Cankar et al., 2006; SR EN SO 21570:2006, Kubista at al., 2006; Deisingh și Badrie, 2005).

Amestecurile de reacție au fost lucrate în dublu exemplar (duplicat) pentru fiecare probă în parte.

Real Time PCR a fost realizat cu ABI 7300 Real Time PCR System utilizând Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) și kit-ul pre-validat Taqman Gene Expression Assays (Applied Biosystems), pentru IL-1 (Assay ID: Hs00174097_m1); IL-2 (Assay ID: Hs00174114_m1); IL-4 (Assay ID: Hs00174122_m1); IL-6 (Assay ID: Hs00174131_m1); IL-8 (Assay ID: Hs00174103_m1); IL-10 Assay ID: Hs00174086_m1; TNF-a (Assay ID: Hs00174128_m1); ca gene țintǎ și 18S ca și control endogen (Applied Biosystems 4326315E). Fiecare probǎ s-a lucrat în triplicat. Expresia a fost normalizatǎ dupǎ celulele THP1 netratate. Nivelul expresiei genelor au fost reprezentat ca valori log10 (deoarece log10 pentru 1 este 0, nivelul expresiei calibratorului aparand cu 0 în grafic).

Pregătirea amestecului de reacție:

Tabel.1 Amestecurile de reacție pentru fiecare probă

După pipetare plăcuțele se agită manual câteva secunde, apoi sunt centrifugate aproximativ un minut la viteză mare, pentru ca toate componentele amestecului să ajungă pe fundul godeului.

Aparatul utilizat pentru reacția de qRT-PCR: 7300 Real-Time PCR System, de la Applied Biosystems.

Rezultatele obținute au fost interpretate cu programul: 7300 System SDS Software.

Capitolul 4 Rezultate și discuții

4.1 Stabilirea capacitatii de aderenta si invazie a tulpinilor bacteriene utilizate

Pentru testarea capacității de aderență și invazie s-au utilizat culturi de celule Hep2 ,ca și substrat celular sensibil, cultivate în plăci cu 6 godeuri sterile, la o densitate 3x105celule / godeu Monostratul celular a fost utilizat în momentul când nivelul de confluență a atins 80-90%. Celulele Hep2 au fost inoculate cu tulpini de 24 h de S. aureus izolate din portaje / specimene clinice (10 µl dintr-o concentrație de 0,5McFarland (107–108)). Celulele aderate / invadante, au fost puse in evidenta prin coloratie Giemsa si analizate la microscop cu OI, utilizând un microscop Axiolab (Zeiss). (figurile….).

Toate tulpinile de S aureus analizate au aderat la substratul celular, manifestând pattern-uri de aderență multiple și indice de aderență intr-un range foarte mare, demonstrând dualismul acestui pathogen ce prezinta capacitatea de a coloniza epiteliile și mucoasele gazdei, dar si capacitatea de invazie. Pentru tulpinile aderente, paternn-ul exprimat a fost preponderent agregativ si difuz.

Fig.25 Celulele aderate / invadante, au fost puse in evidenta prin coloratie Giemsa si analizate la microscop cu OI, utilizând un microscop Axiolab (Zeiss).

Cuantificarea capacitatii de aderență și invazie a fost realizata prin insamantarea in spot a dilutiilor zecimale a trituratelor celulare infectate cu bacterii (fig.26). Citirea rezultatelor s-a realizat prin cuantificarea numărului de colonii crescute la fiecare diluție, pentru fiecare replică și calcularea numărului de UFC raportat la 1 ml. De ademenea, cuantificarea invaziei (dupa tratamentul cu gentamicina) a fost realizata prin insamantarea in spot a dilutiilor zecimale a trituratelor celulare infectate cu bacterii. Citirea rezultatelor s-a realizat prin cuantificarea numărului de colonii crescute la fiecare diluție, pentru fiecare replică și calcularea numărului de UFC raportat la 1 ml. Rezultatele testelor de aderenta si invazie pentru cele 6 tulpini bacterine sunt prezentate in tabelul ….

Tabel 2. Cuantificarea capacitatii de aderenta si invazie a tulpinilor de S. aureus.

Fig.26 .Însamantarea in spot a dilutiilor zecimale a trituratelor celulare infectate cu bacterii

4.2 Studiul efectelor supernatantelor de S. aureus aspura liniei monocitare THP1.

Cultura bacteriană este rezultatul creșterii și multiplicării într-un mediu lichid sau solid, a unei mici cantități inițiale de celule, care constituie inoculul. S-au utilizat culturi bacteriene discontinui (obținute prin cultivarea în mediul nutritiv lichid sau solidifica, într-un volum fix, nereînnoit). Odată cu creșterea culturii bacteriene, compoziția chimică a mediului se modifică: scade cantitatea de substanțe nutritive și se acumulează cataboliți, care pot fi toxici. În cultura discontinuă, numărul de celule viabile variază continuu, ritmul de diviziune fiind condiționat de concentrația nutrienților, observandu-se 3 faze:in faza inițială in care cantitatea nutrientilor este foarte mare si mediul oferă condțtii optime, dar se diminuează treptat, până la 0, pe măsura epuizării nutrienților și a acumulării cataboliților. De asemenea, in cultura discontinuă, ciclul celular este sincron numai în primele cicluri de diviziune celulară, ulterior aparand decalaje și ritm asincron de diviziune, cu celule aflate in diferite faze ale ciclului de creștere și multiplicare, cu vârste diferite si număr de generații celulare limitat.

Comunicarea între bacterii se realizează prin intermediul unor molecule semnal cu greutate moleculară mică, denumite feromoni sau autoinductori (AI), pe care bacteriile le secretă. Bacteriile în mod specific eliberează, detectează și răspund la acumularea acestor molecule în mediul extracelular. QS reprezintă mecanismul ce le permite bacteriilor să simtă densitatea populației bacteriene înconjurătoare cu ajutorul moleculelor semnal și să răspundă în mod coordonat la această informație prin reglarea expresiei diferitelor gene.

Moleculele de semnalizare QS aparțin unor familii distincte de compuși chimici: (i) acil- homoserin-lactone (AHL) la bacteriile Gram-negative, (ii) oligopeptide AIP (autoinducing peptides) la bacteriile Gram-pozitive, (iii) AI2, o molecula de semnalizare implicată în comunicarea între speciile bacteriene, fiind prezentă atât la bacteriile Gram-negative cât și la cele Gram-pozitive și (iv) butanolide, compuși difuzibili similari autoinductorilor, sintetizați de unele specii de Streptomyces, care intervin în reglarea producției de antibiotice și de metaboliți generați în faza staționară de creștere.

Sistemul agr (accessory gene regulator) este primul reglator global al expresiei genelor de virulență detectat la stafilococci și codifică elaborarea mecanismului de QS dependent de densitatea bacteriană. S. aureus utilizează o AIP modificată postranslațional, ce conține un inel tiolactonic spre a regla producerea factorilor de virulență ca raspuns la creșteri ale densității populației bacteriene. Locusul agr are 3-kb și este alcătuit din regiuni înalt conservate și din regiuni hipervariabile în rândul tulpinilor de S. aureus. Secvența regiunii hipervariabile este ținta amplificării PCR pentru definirea tipurilor agr. Variația de secvență în genele agrB, agrD și agrC a condus la identificarea a cel puțin 4 grupe de specificitate agr la S. aureus, în care octapeptidele produse de un grup inhibă expresia agr din alte grupe prin inhibiție competitivă. Fiecare grup are caracteristică o secvență de aminoacizi specifică feromonului, în care numai structura tiolactonică (sau structura lactonei) este conservată.

Expresia reglatorului agr contribuie la patogeneza infecțiilor stafilococcice în câteva modele experimentale: abces subcutan murin, artrite septice și endocardite la iepure. Astfel, tulpinile mutante agr obținute pe aceste modele de infecție prezintă o virulență atenuată comparativ cu tulpinile parentale corespunzatoare, ceea ce indică că expresia exoproteinelor de fază post-exponențială este esențială pentru patogeneza bolii stafilococcice. Expresia agr este implicată în invazia și apoptoza celulelor epiteliale.

Stimularea celulelor THP1 cu supernatante provenite de la tulpina bacteriena 4, tulpina non-invaziva, prezinta o crestere a nivelului interleukinelor. Aceasta tulpină este singura care produce o crestere a expresiei tuturor citokinelor. Interesant este faptul ca aceasta tulpina nu invadeaza, si in plus, prezinta un indice scazut de aderenta.

Citokina cu cel mai crescut nivel de expresie a fost interleukina 6, citokina de faza acuta. Nivelul de expresie al IL-6 a fost crescut de catre supernatantul bacterian 4, dar si de supernatantele tulpinilor 5 (non-invaziva si putin aderenta) si de supernatantele tulpinii 1 (aderenta si invaziva). Totusi, IL-8 si TNFa sunt inhibate de catre supernatantele produse de tulpinile bacteriene 1 si 5, spre deosebire de supernatantul tulpinii 4 (care produce o crestere a nivelului de expresie al IL-8 si TNFa) ceea ce sugereaza ca si alti factori bacterieni pot influenta.

Fig 27. Cunantificarea expresiei citokinelor IL-1, IL-6, IL-8, IL-18, TGF-b1, TNFa induse de tratamentul cu SN bacteriene. Citokinele sunt prezentate in diverse culori.

Stimularea celulelor THP1 cu corpi bacterieni de S. aureus provenite de la proba bacteriana 4, non-invazivă prezzintă o creștere a interleukinelor. Această probă este singura care produce o creștere a expresiei tuturor citokinelor. Citokina cu cel mai ridicat nivel de expresie a fost IL-1b. Nivelul de expresie IL-1b a fost crescut de către corpii bacterieni de S. aureus pentru proba 4, dar se poate observa și o ușoară creștere pentru proba 5. Nivelul de expresie IL-8 a fost crescut de către corpii bacterieni de S. aureus pentru proba 4.

Fig.28: Reprezentare grafică a nivelului de expresie genică pentru celulele infectate cu corpi bacterieni de S. aureus. Citokinele sunt prezentate in diverse culori.

Concluzii

Tulpinile de S aureus au prezentat capacități de aderență diferite la substratul celular, fapt demonstrat de pattern-uri de aderență variate, precum și de indici de aderență diferiți, ceea ce a permis utilizarea a 6 tulpini in studiile ulterioare.

Relația dintre S. aureus și gazda sa se caracterizează prin diversitate: diversitatea izolatelor de S. aureus, predispoziția gazdei, diversitatea simptomelor, dar și gradul diferit de severitate a acestora (Holtfreter et al., 2010).

Purtătorii de S. aureus dezvoltă mai multe episoade de infecție, cu propria tulpină, însă în cele mai multe cazuri gravitatea acestor infecții este redusă. Nepurtătorii dezvoltă mai rar infecții stafilococice, însă, în general, infecțiile acestora sunt mai severe decât în cazul purtătorilor. Explicația pare a consta în background -ul pacientului, în cazul pacienților purtători de S. aureus existând deja un fond imun activat (Dryla et al. , 2005).

În reacțiile imune, un rol foarte important este jucat de citokine răspuns a limfocitelor Th și monocite / macrofage. La rândul său, patogenitatea S. aureus este determinată de mai mulți factori de virulenta, în patogen rămânând sub controlul sistemului de reglementare global AGR (accessory gene regulator). (A. Szkaradkiewicz & T. M. Karpiński & A. Zeidler & A. K. Szkaradkiewicz & H. Masiuk & S. Giedrys-Kalemba).

Descoperirea fenomenului de quorum sensing la bacterii a condus la deschiderea unei noi perspective de dezvoltare a unor strategii terapeutice anti-patogenice.

Stimularea celulelor THP1 cu supernatante provenite de la tulpina bacteriena 4, tulpina non-invaziva, prezinta o crestere a nivelului interleukinelor. Aceasta tulpină este singura care produce o crestere a expresiei tuturor citokinelor. Interesant este faptul ca aceasta tulpina nu invadeaza, si in plus, prezinta un indice scazut de aderenta.

Bibliografie

Adam G. Peres, Joaquın Madrenas -The broad landscape of immune interactions with Staphylococcus aureus: From commensalism to lethal infections,2013

Ahmed N., Dobrindt U., Hacker J., Hasnain S.E. 2008. Genomic fluidity and pathogenic bacteria: applications in diagnostics, epidemiology and intervention. Nature Reviews Microbiology. 6:387-394

Bacterial Adaptation during Chronic Respiratory Infections -Louise Cullen and Siobhán McClean ,2015

Balotescu M.C., Israil A. 2001. Fenomenul de quorum-sensing bacterian. Bact. Virusol. Parasitol. Epidemiol., 2001, 47: 5

Baron S. 2006. NCBI » Bookshelf » Medical Microbiology » Bacteriology » Bacterial Pathogenesis » Detection of Endotoxin in Medical Solutions

Bhakdi S., Tranum-Jensen J. 1991. Alpha-toxin of Staphylococcus aureus. Microbiol. Rev. 55(4): 733-751.

Brooks, G. F., Caroll, K. C. Butel J. S., Morse S. A. 2007. Jawetz, Melnick & Adelberg Medical Microbiology, 2007, 24th Edition, Mc Graw Hill – Lange International Edition.

Buiuc D. și Neguț M. 2008. Tratat de Microbiologie medicală, ed. a II-a, Ed. medicală, București–81.

Caiazza N.C., Merritt J.H., Brothers K.M., O'Toole G.A. 2007. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol.189(9):3603-12. Epub 2007 Mar 2.

Caplan-Tacu Dana Magdalena, Valentina Florea, Ciufecu C. – „Imunoterapia – Imunoprofilaxia”, Editura Ex Ponto, Constanța, 2001.

CRISTIAN RADU SISEA,DORU PAMFIL-Testarea OMG, Editura Bioflux,Cluj-Napoca,2009

Cotar A. 2010. Teză de doctorat – Implicațiile fenomenului de quorum sensing and response în exprimarea coordonată a factorilor de patogenitate și virulență la tulpini de Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa-rezumat

Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; Freshney RI, John Wiley& Sons 5th Edition 2005 th

Dinges, M. M., Orwin, P.M., Schlievert, P.M. 2000. Exotoxins of Staphylococcus aureus – Clin. Microbiol. Rev., January 2000, 13: 16-34.

Dr. Ana Maria Trandafir- Adeziunea bacteriană Rev., medicală română, 2007

Fiziopatologia reacțiilor de apărare ale organismului (I)-curs,Universitatea de Medicină si Farmacie "Victor Babeș", Timișoara

Fournier B., Philpott D.J. 2005. Recognition of Staphylococcus aureus by the Innate Immune System – Clin. Microbiol. Rev. 18: 521-540.

Genetica microorganismelor și inginerie genetică microbiană-Note de curs și tehnici de laborator

G. Zarnea– Tratat de microbiologie generala, vol. I.; II.;III, Ed. Academiei, 1984

Isvoranu Ghe.2010. Teză de doctorat-Modularea celulelor limfoide cu tandemuri de cytokine în vederea distrugerii celulelor tumorale la mamifere-rezumat

Lazăr,Veronica, Microbiologie medicală. Ed. Univ. București,2007

Lazăr, Veronica- Quorum sensing in biofilms e How to destroy the bacterial citadels or their cohesion/power?,2011

L. Caetano M. Antunes,1 Rosana B. R. Ferreira,1 Michelle M. C. Buckner and B. Brett Finlay-Quorum sensing in bacterial virulence,2010

Mark L. Hanke and Tammy Kielian-Deciphering mechanisms of staphylococcal biofilm evasion of host immunity,2012

Gr.Mihaescu, Carmen Chifiriuc, Lia Mara Ditu, 2007, Microbiologie Generala, Editura Universitatii din Bucuresti, p 144-151, p 421-426

MIHĂESCU, G., Imunologie și Imunochimie. Editura Universității din București,2003

Molecular Biology of the Cell – 4 ed., Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P – Garland Science, 2002

O’Riordan K., Lee J.C. 2004. Staphylococcus aureus Capsular Polysaccharides. Clin. Microbiol. Rev. 7: 218-234.

Todd J. K. 1998. Toxic scock syndrome. Clin. Microbiol. Rev.: 432-446.

Todar’s Online Textbook of Bacteriology, Kenneth Todar University of Wisconsin-Madison Department of Bacteriology, 2005

Peacock S. J., de Silva, L., Lowy, F.D. 2001. What determines nasal carriage of Staphylococcus aureus?Trends Microbiol. 9:605–610.

Săcărea Toma Felicia-Bacteriologie medicală,Ed. University Press, Târgu-Mureș,2006

Sergiu Emil GEORGESCU,Marieta COSTACHE-LUCRĂRI PRACTICE BIOCHIMIA ACIZILOR NUCLEICI ȘI BIOLOGIE MOLECULARĂ, 2009

Short Protocols in Cell Biology – 1st ed., Bonifacino JS, Dasso M, Harford JB, Lippincott-Schwartz J, Yamada KM, John Wiley & Sons 2004

Steven T. Rutherford1 and Bonnie L. Bassler-Bacterial Quorum Sensing.Its Role in Virulence and Possibilities for Its Control,2012

TRIzol® Reagent

Verkaik NJ, van Wamel WJB & van Belkum A. -Immunotherapeutic approaches against Staphylococcus aureus Immunotherapy, 2011, Vol. 3(9), pag. 1063-1073

Wilson, M., Seymour, R., Henderson, B. 1998. Bacterial perturbation of cytokine networks. Infect.Immun. 66: 2401-2409

[anonimizat]

http://www.vanderbilt.edu/viibre/CellCultureBasicsEU.pdf

http://stomatologie.medica.ro/reviste_med/download/stoma/2012.4/Stoma_Nr-4_2012_Art-14.pdf

http://www.bio.unibuc.ro/pdf/Masterat_2014/microbiologie_generala.pdf

http://www.justmed.eu/microbi.php

www.protocol-online.org

www.invitrogen.com/cellculturebasics

www.lifetechnologies.com/support

http://www.patologiegenerala.ro/cursuri/imuno-c2.pdf

http://microbio.ucoz.com/Prelegeri/Romana/Imunitatea.Sistemul_imun09.pdf

http://www.patologiegenerala.ro/cursuri/imuno-c2.pdf

http://stomatologie.medica.ro/reviste_med/download/stoma/2012.1/Stoma_Nr-1_2012_Art-11.pdf

http://rmr.medica.ro/reviste_med/download/rmr/2007.1/RMR_Nr-1_2007_Art-06.pdf

http://materiale-studiu.microumftgm.ro/Medicina%20generala%20-%20SR/Bacteriologie%20speciala/Books/Bacteriologie%20speciala.pdf

http://www.fasebj.org/content/8/13/1041.long

http://www.doxologia.ro/sanatate/documentar/despre-infectiile-cu-stafilococ-auriu

http://www.bio.unibuc.ro/pdf/micro/documente_de_studiat/Lazar_Microbiologie%20medicala.pdf

https://www.google.ro/search?sourceid=chrome-psyapi2&ion=1&espv=2&ie=UTF-8&q=culturi%20de%20celule%20capitolul%2012&oq=culturi%20de%20celule%20capitolul%2012&aqs=chrome..69i57.9528j0j8

http://xa.yimg.com/kq/groups/21209408/426838591/name/Cap+12+final.doc