Evaluarea imunohistochimică a instabilității microsatelite în neoplaziile colonice Conducător Stiințific Conf. Dr. TĂBAN SORINA Asist. Univ. Dr…. [304681]

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

“VICTOR BABEȘ” DIN TIMIȘOARA

FACULTATEA DE MEDICINĂ

Departamentul Morfologie Microscopică

Disciplina de Morfopatologie

JURUBIȚA DENISA

LUCRARE DE LICENȚĂ

Conducător Stiințific

Conf. Dr. TĂBAN SORINA

Asist. Univ. Dr. GHEJU ADELINA

T i m i ș o a r a

2 0 1 8

UMFVBT

FACULTATEA DE MEDICINĂ

Departamentul Morfologie Microscopică

Disciplina de Morfopatologie

JURUBIȚA DENISA

LUCRARE DE LICENȚĂ

Evaluarea imunohistochimică a instabilității microsatelite în neoplaziile colonice

Conducător Stiințific

Conf. Dr. TĂBAN SORINA

Asist. Univ. Dr. GHEJU ADELINA

T i m i ș o a r a

2 0 1 8

CUPRINS

ABREVIERI ȘI SIMBOLURI………………………………………………………………..IV

INTRODUCERE…………………………………………………………………………………….V

PARTEA GENERALĂ………………………………………………………………………………

ANATOMIA ȘI HISTOLOGIA COLONULUI…………………………..6

CANCERUL DE COLON…………………………………………………………7

II.1 EPIDEMIOLOGIE……………………………………………………………………..7

II.2 FACTORI DE RISC……………………………………………………………………7

II.3 CARCINOGENEZA TUMORILOR COLONICE………………………….8

II.4 MORFOPATOLOGIA TUMORILOR COLONICE……………………..10

SINDROMUL LYNCH……………………………………………………………12

III.1 ISTORIC………………………………………………………………………………..13

III.2 DIAGNOSTICUL SINDROMULUI LYNCH…………………………….14

III.3 PROGRAM DE SCREENING PENTRU S. LYNCH …………………16

STADIALIZARE ȘI TRATAMENT………………………………………..17

IV.1 TRATAMENT CHIRURGICAL………………………………………………17

IV.2 TERAPIE ADJUVANTA…………………………………………………………17

IV.3 PROGNOSTIC……………………………………………………………………….18

PARTEA SPECIALĂ………………………………………………………………………………..

SCOPUL LUCRĂRII……………………………………………………………………19

MATERIAL ȘI METODE…………………………………………………………….20

LOT DE STUDIU…………………………………………………………………20

PROCEDURA………………………………………………………………………20

INTERPRETARE………………………………………………………………….21

REZULTATE……………………………………………………………………………….22

ASPECTE CLINICE……………………………………………………………..22

ASPECTE MICROSCOPICE…………………………………………………26

ASPECTE IMUNOHISTOCHIMICE………………………………………31

DISCUȚII…………………………………………………………………………………….36

CONCLUZII………………………………………………………………………………..38

BIBLIOGRAFIE……………………………………………………………………………………39

[anonimizat] – [anonimizat] colorectal

LV – Limfovascular

MLH1 – MutL homolog 1

MMR – Mismatch Repair (repararea erorilor de împerechere)

MSI – Microsatellite Instability (instabilitate microsatelită)

MSH2 – MutS homolog 2

MSH6 – MutS homolog 6

MSS – Microsatellite Stable (stabil microsatelitar)

PCR – Polymerase chain reaction (reacție de polimerizare în lanț)

PMS2 – Postmeiotic segregation 2

INTRODUCERE

Cancerul colorectal reprezintă o problemă importantă de sănătate publică, având o incidență crescută, atât la sexul masculin, unde este situat pe locul 3 ca frecvență la nivel global, cât și la sexul feminin, la care este situat pe locul 2 [1].

În ciuda incidenței ridicate, opțiunile de tratament pentru cancerele colorectale avansate rămân limitate și deseori nu prezintă succes, aceste cazuri având un prognostic rezervat. Prin urmare, trebuie utilizați diverși biomarkeri pentru a conferi un diagnostic precoce, a aprecia factorii de prognostic și pentru a identifica tratamentele cele mai eficiente și individualizate pentru pacienți.

Se consideră că mai mult de 95% din totalul cancerelor colorectale se dezvoltă din polipi adenomatoși [2]. Progresele importante în cunoașterea carcinogenezei cancerului colorectal, a tranziției de la polipii adenomatoși la cancerul colorectal și a timpului necesar acestei transformări constituie bazele unui nou mod de abordare a diagnosticului.

Un rol important în carcinogeneza tumorilor colorectale îl are instabilitatea microsatelită, care determină aproximativ 15% din cazuri. Microsateliții reprezintă secvențe scurte repetitive de ADN non-codant care pot genera erori în cursul replicării, dacă genele sistemului de reparare al acestor erori de împerechere prezintă mutații. Genele care codifică proteine în cadrul acestui sistem sunt: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2 [3].

Instabilitatea microsatelită poate apărea sporadic sau în cadrul Sindromului Lynch, un sindrom ereditar care predispune la cancere colorectale și cu alte localizări extracolonice. Tumorile care prezintă un grad înalt de instabilitate microsatelită au caracteristici morfopatologice și epidemiologice distincte, ceea ce le influențează atât prognosticul, cât și opțiunile de tratament.

De aceea, importanța screening-ului pentru instabilitatea microsatelită este recunoscută și acesta ar trebui inclus în protocoalele de diagnostic ale cancerului colorectal. O metodă de diagnostic ieftină și eficientă este evaluarea prin imunohistochimie, care reprezintă un pas înainte spre era diagnosticelor și terapiei oncologice individualizate pentru fiecare pacient.

Scopul lucrării de față este determinarea frecvenței instabilității microsatelite în lotul de studiu constituit din cazuri cu cancer colorectal într-un stadiu incipient, prin analiza imunohistochimică a markerilor MLH1 și MSH2 și corelarea acestor rezultate cu caracterele clinice și morfopatologice ale tumorilor.mmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmmm

PARTEA GENERALĂ

I. ANATOMIA ȘI HISTOLOGIA COLONULUI

Intestinul gros reprezintă ultima porțiune a tubului digestiv și se întinde de la joncțiunea ileo-cecală, până la nivelul orificiului anal. Principalele roluri ale acestuia sunt absorbția apei și a electroliților, precum și depozitarea și eliminarea materiilor fecale.

Intestinul gros formează cadrul colic, care înconjoară ansele intestinului subțire și începe la nivelul fosei iliace drepte, printr-o porțiune de formă saculară, cecul, care prezintă o prelungire, apendicele vermiform. Cecul se continuă cu colonul, care ascensionează de-a lungul flancului drept, iar subhepatic formează flexura colică dreaptă. După această încurbare spre stânga, colonul prezintă o porțiune transversală, care, la nivelul splinei formează flexura colică stângă și apoi coboară spre fosa iliacă stângă și se continuă în cavitatea pelvină cu o porțiune sub forma literei S, colonul sigmoid, urmată de rect.

La adult, intestinul gros are o lungime de 1-1,5 m, deși există variații individuale considerabile. Acesta prezintă câteva diferențe față de intestinul subțire: este mai bine fixat; are un calibru mai mare; stratul muscular extern se constituie în trei benzi longitudinale care poartă denumirea de taenia coli; pe suprafață prezintă numeroase proeminențe grăsoase, apendicele epiploice, iar peretele colonic prezintă îngustări saculare, care se numesc haustre [4].

Referitor la structura histologică, intestinul gros respectă modelul prezent în celelalte porțiuni ale tubului digestiv. Astfel este constituit din patru tunici: mucoasă, submucoasă, mulculară și seroasă. Tunica mucoasă, spre deosebire de cea a intestinului subțire, nu prezintă vilozități sau plici. Este constituită dintr-un epiteliu simplu cilindric, care prezintă o margine în perie subțire și conține celule caliciforme, cu rol în formarea mucusului, mai numeroase decât la nivelul intestinului subțire. Criptele lui Lieberkuhn sunt drepte si neramificate, iar la bază prezintă celule endocrine, argentafine. Celulele Paneth sunt absente. În lamina propria se găsesc numeroase leucocite și ocazional, foliculi limfoizi. Submucoasa este formată din țesut conjunctiv, care conține structuri nervoase, vasculare și vase limfatice. Musculara propria prezintă un strat intern, cu fibre musculare circulare și unul extern, cu fibre longitudinale, organizat în cele trei tenii, care la nivelul rectului vor forma un strat continuu. Tunica seroasă este constituită din peritoneu visceral, cu excepția rectului, care prezintă adventice[5].

II. CANCERUL DE COLON

II.1 EPIDEMIOLOGIE

Cancerul reprezintă una din cauzele cele mai importante de deces atât în țările dezvoltate, cât și în cele în curs de dezvoltare și incidența sa este în continuă creștere datorită în principal îmbătrânirii și creșterii populației.

Cancerul de colon prezintă o incidență mare la nivel mondial, fiind situat pe locul trei la bărbați și pe locul doi la femei. În anul 2013, au fost înregistrate 1,6 milioane cazuri de cancer colorectal, cauzând 771 000 de decese[1].

Cele mai mari rate de incidență sunt în Australia/ Noua Zeelandă, Europa și America de Nord. Incidența este scăzută în Africa, în Asia Centrală și de Sud. Incidența este mai mare la bărbați decât la femei în majoritatea țărilor[6].

Incidența cancerului de colon este maximă între 60 și 70 de ani, mai puțin de 20% din cazuri fiind diagnosticate îninte de 50 de ani[7].

II..2 FACTORI DE RISC

Probabilitatea dezvoltării cancerului colorectal este influențată atât de factori genetici, cât și de factori de mediu. Deși impactul susceptibilității genetice este mult mai mare decât impactul factorilor dobândiți, marea majoritate a cazurilor de cancer colorectal ar putea fi prevenite prin modificări ale factorilor de mediu. Sindroamele ereditare, antecedentele familiale și bolile inflamatorii intestinale sunt principalii factori de risc, în prezența acestora fiind recomandat screening-ul [8].aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa Sindroamele colorectale ereditare cuprind numeroase anomalii genetice specifice care sunt asociate cu dezvoltarea cancerului de colon, generând aproximativ 10% din cazuri. Cea mai comună formă este Sindromul Lynch, care reprezintă doar 2% -5% din cazurile de cancer colorectal. Antecedentele familiale, pe lângă sindroamele genetice cunoscute până în prezent, constituie un factor de risc foarte important pentru dezvoltarea neoplaziilor colonice, determinând până la 25% din cazuri. Astfel, indivizii care au membri de familie de gradul întâi diagnosticați cu CRC au un risc de 2-3 ori mai mare de a dezvolta CRC decât populația generală[8].
Deși cancerul colorectal, comparativ cu alte tipuri de cancer, include un procent mare de cazuri ereditare, marea majoritate a cazurilor sunt sporadice, reprezentând până la 70% din total. Factorii de risc implicați în mecanismele neoplaziilor sporadice sunt în principal factori de mediu. Cancerul colorectal este puternic asociat cu un stil de viață occidental, cu fumatul, consumul de alcool și obezitatea. Aportul ridicat de carne roșie prelucrată, cereale rafinate și zaharuri este legat de creșterea riscului de cancer colorectal. Înlocuirea acestora cu carnea de pui, peștele sau proteinele vegetale ca sursă primară de proteine; grasimile nesaturate ca sursă primară de lipide; iar cerealele integrale, legumele și fructele ca sursă primară de carbohidrați, pot reduce riscul de apariție a cancerului colorectal [9].

II.3 CARCINOGENEZA TUMORILOR COLONICE

Evenimentele moleculare care determină dezvoltarea adenocarcinoamelor colonice sunt heterogene și includ anomalii genetice și epigenetice.

Au fost descrise trei căi principale prin care se realizează carcinogeneza, calea APC/ β-catenină, care este activată în secvența clasică de malignizare a adenoamelor colonice, calea instabilității microsatelite și fenotipul hipermetilant al insulelor CpG. Carcinoamele colorectale pot apărea și printr-o combinație a acestor mecanisme [7][10].

CARCINOGENEZĂ PRIN INSTABILITATE CROMOZOMIALĂ CALEA APC/ βCATENINĂ

Apare la aproximativ 50-60% din cancerele colorectale sporadice. Acest mecanism este caracterizat de aneuploidii, care reprezintă un număr anormal de cromozomi într-o celulă și pierderea heterozigozității, adică pierderea unei alele parentale printr-o non-disjuncție apărută în timpul mitozei, printr-o deleție sau o recombinare între doi cromozomi omologi sau diferiți. Disfuncția sistemului de reparare al ADN-ului și scurtarea în exces a telomerilor pot duce de asemenea la instabilitate cromozomială [10]. Evenimentul inițiator al carcinogenezei este reprezentat de inactivarea genei supresoare tumorale APC. Gena APC (Adenomatous polyposis coli), codifică o proteină responsabilă de reglarea concentrației proteinei β-catenină, care previne activarea cu o frecvența prea mare a genelor care stimulează diviziunea celulară. [7]

CARCINOGENEZA PRIN INSTABILITATE MICROSATELITĂ

Majoritatea ADN-ului din celulele umane, aproximativ 97%, este non-codant, adică nu codifică proteine. Un exemplu de ADN non-codant îl reprezintă telomerele, secvențe de ADN situate la capetele unui cromozom și care au rolul de a proteja regiunile de ADN codant în timpul diviziunii celulare. ADN-ul non codant poate fi format și din secvențe repetitive de nucleotide. Acesta este împărțit în două mari clase, în funcție de lungimea secvenței care se repetă [11].

Prima clasă este reprezentată de minisateliți, care constau în repetiția unor secvențe de până la 100 de perechi de baze azotate (pb). Numărul locilor minisatelitari în genomul uman haploid a fost estimat la aproximativ 1500. Minisateliții prezintă o variabilitate imensă între oameni neînrudiți, constituindu-se într-un fel de „amprentă genetică” și putând fi folosiți pentru stabilirea paternității, ca probe în medicina legală, în diverse studii populaționale sau arheologice [11].

A doua mare clasă sunt microsateliții, denumiți și secvențe scurte în tandem, de 2 până la 6 nucleotide. În genomul uman, microsateliții apar foarte frecvent, repetițiile a câte două nucleotide apărând aproximativ la fiecare 30 000 pb. Au fost identificate multiple patologii legate de amplificarea microsateliților. Aceasta se produce în timpul replicării ADN și este determinată de „alunecarea” ADN polimerazei, care cauzează în funcție de sensul alunecării, bucle de deleție sau inserție [11]. Aceste erori se pot repeta în replicări succesive și pot da naștere unor secvențe aberante de microsateliți. De aceea există sistemul de reparare a erorilor de împerechere (MMR-Mismatch Repair System), format din proteine care corecteză aceste greșeli de replicare. Mutații ale genelor care codifică aceste proteine determină instabilitatea microsatelită, implicată în generarea de neoplazii.

Astfel, în cadrul Sindromului Lynch apar mutații de linie germinală în genele MSH2, MLH1, MSH6 și PMS2, gene supresoare tumorale ale sistemului MMR.

FENOTIP METILANT AL INSULELOR CpG

Instabilitatea microsatelită poate apărea și în alt context decât prin mutații ereditare de linie germinală. În 15% dintre cancerele de colon sporadice, apare hipermetilarea localizată a promotorilor (regiuni ADN care inițiază transcripția unei anumite gene)[12]. Hipermetilarea insulelor CpG, adică a regiunii promotoare formate din alăturarea citozinei la guanină, are ca rezultat inactivarea transcripțională a genei MLH1, care are rol de supresie tumorală și face parte din sistemul MMR [7].

II.4 MORFOPATOLOGIA NEOPLAZIILOR COLONICE CU INSTABILITATE MICROSATELITĂ

Adenocarcinomul colonic este cea mai frecventă tumoră malignă a tractului gastrointestinal și este o cauză majoră de morbiditate și mortalitate în întreaga lume. Astfel, peste 80% din tumorile maligne colonice sunt adenocarcinoame cu punct de plecare celulele epiteliale ale mucoasei [7].

Cancerul colorectal se dezvoltă pornind de la leziuni premaligne care avansează spre cancer invaziv printr-un proces în mai multe etape care implică o serie de mutații genetice care se acumulează de-a lungul timpului [7].

Precursorii adenocarcinoamelor cu instabilitate microsatelită cauzată fie prin mutații de linie germinală, fie prin hipermetilarea insulelor CpG, sunt polipii sesili serați (sessile serrated polyps – SSP). Aceștia sunt mai mari decât polipii hiperplazici și sunt localizați preponderent în colonul proximal. Diagnosticul se bazează pe caracterele arhitecturale microscopice ale acestora: „zimțarea”, dilatarea și ramificarea criptelor la bază, dobândind un aspect de L, T inversat sau de „ancoră”, epiteliul intens mucosecretor și proliferarea aberantă. Acești polipi nu prezintă modificări nucleare displazice. [13]

Marea majoritate a carcinoamelor colorectale sunt diagnosticate prin biopsiere endoscopică sau polipectomie, de aceea stabilirea caracterului invaziv al tumorii este dificil de efectuat dacă rezecția este superficială sau nu a fost bine orientată. Un adenocarcinom colonic este considerat invaziv când a invadat submucoasa.

Carcinoamele colonice prezintă câteva variante care sunt frecvent asociate cu instabilitatea microsatelită. Acestea sunt adenocarcinoamele mucinoase și cele medulare.

Adenocarcinoamele mucinoase (coloide), reprezintă o variantă de carcinom colonic în care peste 50% din volumul tumoral este constituit din mucină extracelulară. Tumorile care prezintă o componentă mucinoasă importantă, dar mai redusă (10-50%) sunt clasificate ca având diferențiere mucinoasă. Aceste tumori apar cu o frecvență ridicată în cadrul sindromului Lynch și se comportă ca tumori bine diferențiate în acest context. Adenocarcinoamele mucinoase care nu prezintă instabilitate microsatelită au un comportament mai agresiv[13].

Carcinoamele medulare sunt un alt subtip histologic puternic asociat cu instabilitatea microsatelită. Acestea sunt slab diferențiate, constituite din plaje de celule epiteloide cu nuclei mari, veziculoși, nucleoli proeminenți și citoplasmă abundentă. În mod caracteristic, acestea prezintă un bogat infiltrat peritumoral cu limfocite. Deși sunt slab diferențiate, au de obicei un prognostic favorabil [13].

Cei mai folosiți markeri imunohistochimici pentru adenocarcinoamele colonice sunt CK 20, CK 7, CDX2. Cel mai comun imunofenotip este cel pozitiv pentru CK 20 și negativ pentru CK 7. Reducerea sau absența espresiei CK 20 ar putea fi asociată cu tumorile care au un grad înalt de instabilitate microsatelită [13].

CDX2 este un marker de diferențiere intestinală și este pozitiv în peste 90% din adenocarcinoame, dar nu este specific pentru localizarea la nivelul colonului. Carcinoamele medulare sunt frecvent CK 20 negative și CDX2 negative [13].

III. SINDROMUL LYNCH

Aproximativ 2 până la 5% dintre cancerele colorectale iau naștere datorită unui sindrom genetic ereditar transmis autozomal dominant cu penetranță mare, care poartă denumirea de Sindrom Lynch. Acesta apare datorită unor mutații produse la nivelul gameților în cadrul genelor care codifică proteine din sistemul de reparare al erorilor de împerechere: MLH1, MSH2, MSH6 și PMS2. Sindromul Lynch predispune la cancer colorectal și multiple neoplazii extracolonice: cancer de endometru, gastric, ovarian. Cancerele colorectale din cadrul acestui sindrom sunt caracterizate de o progresie adenom-carcinom de 1:1, în comparație cu cele sporadice, unde aceasta este de 30:1. Pacienții diagnosticați cu sindrom Lynch au un risc de până la 80% de cancer colorectal sau cu alte localizări și acesta debutează la o vârstă tânără, în medie de 46 de ani[14].

Grafic 1. Riscul de a dezvolta cancer în cadrul S. Lynch comparativ cu populația generală [1][15]

Mutațiile în genele MLH1 și MSH2 sunt cele mai frecvente, apar la aproximativ 70% din cazurile de sindrom Lynch. Pacienții cu mutații MSH2 sunt mai predispuși la neoplazii extracolonice și prezintă un risc mai mic de cancer colorectal decât cei cu mutație MLH1. MSH6 predispune mai ales la cancere gastrointestinale și de endometru, care debutează la vârste mai înaintate și la pacienți care frecvent nu îndeplinesc criteriile Amsterdam [16].

Este important ca pacienții care prezintă aceste caracteristici să fie identificați datorită necesității consilierii genetice, a riscului ridicat de a dezvolta o neoplazie sincronă sau metacronă la nivelul colonului (riscul este de 30% după 10 ani de la prima tumoră și crește la 50% după 15 ani)[14] sau a altor organe și a diferențelor de prognostic și terapie [7].

III.1 ISTORIC

Sindromul Lynch a început să fie studiat în anul 1895 de către Aldred Scott Warthin, șeful departamentului de Anatomie Patologică al Facultății de Medicină din Ann Arbor. Croitoreasa lui, Pauline Gross, de origine germană se temea că și ea va suferi de cancer, la fel ca mulți alți membri ai familiei sale. Într-adevăr și ea a murit de cancer endometrial la o vârstă fragedă. Warthin a început să urmărească îndeaproape această familie, pe care a numit-o Familia G, iar în 1913 a publicat un arbore genealogic, care evidențiază faptul că multiple generații au fost afectate de neoplazii maligne ale colonului, stomacului și uterului. Pedigree-ul a inclus 10 membri, dintre care 2 au suferit de cancer uterin, 2 au avut cancer gastric, iar unul a avut un "cancer abdominal". Descendenții tuturor celor 5 pacienți cu cancer au avut, de asemenea, multiple tipuri de cancer. Niciunul dintre descendenții celor sănătoși nu a dezvoltat cancer. [14]

Pornind de la această familie, Warthin a observat ca din 3600 de cazuri de cancer diagnosticate în laboratorul său între 1895 și 1912 aproximativ 15% dintre aceștia au avut un istoric familial pozitiv de carcinom. Astfel, Warthin a concluzionat că există "o anumită influență a eredității asupra cancerului". [17]

Într-un studiu suplimentar publicat în anul 1925, Warthin a examinat 146 de persoane din Familia G și a arătat că aproximativ 32% dintre ei au dezvoltat cancer la o vârstă medie de 37.9 ani. În cazul cancerului de colon, acesta era localizat preponderent la nivel proximal.[17]

Până în anii ‘60 au existat doar rapoarte ocazionale despre această formă de cancer colorectal și existența acestuia era îndoielnică. În anii 1966-1967, medicul Henry T. Lynch a remarcat aceste aglomerări familiale de cancer și a devenit interesat de "familia G" a lui Warthin. Astfel, a organizat o reuniune de familie pentru a afla mai multe despre aceștia. Efectuând o investigație genetică detaliată a familiei, a obținut date despre mai mult de 650 de membri ai familiei, 95 dintre aceștia fiind afectați de o neoplazie. Lynch a constatat o predominanță a cancerelor de colon, uter și stomac și a recunoscut transmiterea dominant autozomală. În 1985, Lynch a folosit pentru prima dată termenul de "cancer colorectal ereditar non-polipozic" pentru această boală, care a devenit termenul acceptat timp de mulți ani.[17]

Când baza genetică a bolii a fost descoperită și a fost recunoscut faptul că nu toate aglomerările familiale de cancer colorectal reprezintă aceeași boală, termenul de sindrom Lynch a fost aplicat familiilor cu mutații de linie germinativă în gene de reparare a erorilor de împerechere ADN (MMR). În 2005, Douglas et al. a suplimentat studiile anterioare despre Familia G cu date privind 929 de descendenți ai progenitorului originar și a raportat mutația de linie germinativă în gena MSH2, descoperită la aceștia. Așadar, după un secol de la primele cercetări ale lui Warthin, Familia G este diagnosticată cu sindromul Lynch.[17]

III.2 DIAGNOSTICUL SINDROMULUI LYNCH

În 1989 a fost conceput "Grupul internațional de colaborare pentru cancerul colorectal ereditar non-polipozic" și a avut prima întâlnire la Amsterdam în 1990. Medicul Hans Vasen din Olanda și alți clinicieni din cadrul acestui grup au acumulat și caracterizat aglomerările familiale de cancer colo-rectal și au dezvoltat "Criteriile Amsterdam", valoroase pentru identificarea familiilor care suferă de sindromul Lynch. În anul 1999 aceste criterii au fost revizuite pentru a include cazuri de cancer cu alte localizări [17].

Criteriile Amsterdam II [18]

Cel puțin trei rude cu cancer asociat sindromului cancerului colorectal non-polipozic ereditar (HNPCC): cancer colorectal, endometrial, gastric, de ureter / pelvis renal, intestin subțire:

1. Unul este o rudă de gradul întâi al celorlalte două;

2. Cel puțin două generații succesive afectate;

3. Cel puțin unul dintre cancerele asociate sindromului trebuie diagnosticat la o vârstă mai mică de 50 de ani;

4. FAP trebuie exclus din toate cazurile de cancer colorectal;

5. Diagnosticul de cancer colorectal stabilt anatomo-patologic.

Criteriile Bethesda revizuite stabilesc când o tumoră ar trebui testată pentru instabilitate microsatelită (este de ajuns un criteriu pentru a recomanda testarea) [18]:

Cancer colorectal diagnosticat înaintea vârstei de 50 ani

Prezența de cancere colorectale sincrone sau metacrone sau a altor tumori asociate cu cancerului colorectal non-polipozic ereditar, indiferent de vârstă

Cancer colorectal cu grad înalt de instabilitate microsatelită diagnosticat înainte de 60 de ani

Cancer colorectal diagnosticat la una sau mai multe rude de gradul I, care prezintă o tumoră asociată cancerului colorectal non polipozic ereditar, indiferent de vârsta

Cancer colorectal diagnosticat la două sau mai multe rude de gradul I sau II, care prezintă tumori asociate cancerului colorectal non polipozic ereditar

Diagnosticul de sindrom Lynch este stabilit pe baza criteriilor Amsterdam II și analiza instabilității microsatelite, urmărind recomandările Bethesda revizuite. Criteriile Bethesda sunt mai sensibile decât cele Amsterdam și totuși aproximativ 10% dintre pacienții cu sindrom Lynch nu le îndeplinesc. Recent a fost propusă testarea tuturor cancerelor colorectale pentru instabilitate microsatelită, indiferent de vârsta pacientului și istoricul familial [16].

Instabilitatea microsatelită este definită ca modificarea lungimii secvențelor microsatelitare și se poate analiza prin testare moleculară bazată pe reacția de polimerizare în lanț, care utilizează probe de țesut tumoral fixat la parafină. Se analizează markerii din grupul Bethesda, și anume, două repetiții mononucleotidice ( BAT 25 și BAT 26) și trei dinucleotidice (D2S123, D5S346, D17S250), prin comparație între probe ADN din țesut normal și țesut tumoral de la acelasi pacient. [13]

Tumora este clasificată ca având un grad înalt de instabilitate microsatelită dacă doi sau mai mulți din cei 5 markeri (>40%) prezintă instabilitate, grad redus dacă doar unul este afectat și este considerată stabilă microsatelitar dacă toți markerii sunt normali. Sensibilitatea testului PCR este de 55-84%. Aceasta poate fi crescută prin utilizarea a 3 sau mai mulți markeri pentru repetițiile mononucleotidice [13].

O analiză indirectă pentru instabilitatea microsatelită este metoda imunohistochimică. Aceasta determină prezența proteinelor MMR în țesutul tumoral. Acestea sunt prezente în toate celulele normale și nu sunt exprimate în celulele tumorale care prezintă instabilitate microsatelită [13].

Tumorile din cadrul sindromului Lynch nu prezintă niciodată mutații BRAF. Testarea pentu mutațiile BRAF exclude diagnosticul de sindrom Lynch și poate diferenția între acesta și tumorile sporadice cu instabilitate microsatelită [13].

Profilul imunohistochimic al tumorii primare este concordant cu cel din metastaze și analiza acestora poate fi o alternativă bună daca tumora primară nu este disponibilă. Se recomandă evaluarea imunohistochimică înaintea celei moleculare, care se poate realiza ulterior în mod țintit [16].

III.3 PROGRAM DE SCREENING RECOMANDAT PACIENȚILOR CU S. LYNCH

Colonoscopie la fiecare 1 – 2 ani începând cu vârsta de 20 – 25 de ani, sau cu 2-5 ani mai devreme de vârsta primului diagnostic de cancer colorectal în familie. Screening-ul prin colonoscopie reduce cu 63% incidența cancerului colorectal la acești pacienți, scade în mod semnificativ mortalitatea, iar dacă se detectează o neoplazie, aceasta se găsește de obieci în stadii incipiente [19].

Educarea pacientelor pentru recunoașterea simptomelor de cancer endometrial (sângerare anormală sau sângerare postmenopauză). Screening anual prin biopsie pentru cancer endometrial, de la 25 – 35 ani. Histerectomia profilactică la pacientele cu risc ridicat este o metodă de reducere a riscului de cancer, care trebuia luată în considerare. Momentul optim pentru realizarea acesteia se alege împreună cu pacienta în funție de mai mulți factori: dorința de procreere, comorbidități, istoric familial și gena mutantă (riscul de cancer endometrial variază în funcție de gena mutantă din cadrul sindromului Lynch) [20].

Endoscopie digestivă superioară de la 35 de ani, în cazul în care cancerul gastric face parte din fenotipul familial. Este utilă testarea și tratarea infecției cu H. Pylori [19].

Pacienții trebuie încurajați să discute cu rudele lor despre riscul familial de cancer și opțiunile de diagnostic și consiliere genetică.

IV.STADIALIZARE ȘI TRATAMENT

IV.1 TRATAMENTUL CHIRURGICAL AL CANCERULUI DE COLON

Tratamentul de elecție pentru cancerul de colon operabil, care nu determină fenomene obstructive și nu prezintă metastaze, este colectomia. Extensia acesteia este decisă în funcție de localizarea tumorii. Cel mai frecvent se realizează colectomie parțială cu anastomoză sau colostomie. Intervenția chirurgicală se poate realiza și laparoscopic de către un chirurg cu experiență, cu condiția ca tumora să nu genereze obstrucție sau să fie local invazivă. [21]

Riscul de a dezvolta o a doua neoplazie colonică la pacienții cu sindrom Lynch este de 16-19% în primii 10 ani, chiar și la cei care sunt supravegheați prin colonoscopie periodică. Tratamentul de elecție pentru acești pacienți este colectomia totală cu anastomoză ileorectală [19].

IV.2 TERAPIA ADJUVANTĂ

În stadiul I cancerul de colon nu necesită chimioterapie adjuvantă. În stadiul II cu risc redus pacientul poate fi ținut sub observație după intervenția chirurgicală sau se poate administra o combinație de 5-fluorouracil și leucovorin. In acest stadiu nu se recomandă scheme de terapie care contin oxiplatin datorită riscului crescut de reacții adverse în raport cu beneficiul. În stadiul II cu risc înalt (T4, tumoră cu grad redus de diferențiere, invazie limfovasculară etc.), se recomandă 5-FU/LV sau schema de chimioterapie FOLFOX (5-FU, LV, Oxiplatin), iar în stadiul II, după intervenția chirurgicală, se recomandă FOLFOX sau CapeOx (Capecitabină/Oxiplatin), timp de 6 luni. În stadiile avansate (T4b) se ia în considerare chimioterapiea cu una din schemele FOLFOX sau CapeOx, în speranța că tumora va putea fi convertită la un stadiu operabil [21].

Tumorile care prezintă un grad înalt de instabilitate microsatelită sunt mai frecvent diagnosticate în stadiul II decât în stadiul III, iar cele diagnosticate în stadiul IV reprezintă un procent redus (între 3.5%-5%), de unde rezultă că aceste tumori nu sunt predispuse la metastazare [21].

Un studiu retrospectiv care a analizat pacienți cu cancer de colon cu un grad înalt de instabilitate microsatelită, a arătat că acești pacienți nu au avut un beneficiu semnificativ statistic dacă au urmat chimioterapie adjuvantă cu 5-Fluoruracil, ci au avut o supraviețuire la 5 ani mai mică decât cei care au fost tratați exclusiv chirurgical. Astfel, pacienților care prezintă instabilitate microsatelită și sunt diagnosticați în stadiul II cu risc redus, nu le este indicată chimioterapia adjuvantă cu 5-FU [21].

Pentru pacienții cu boală metastatică și instabilitate microsatelită se recomandă folosirea pembrolizumabului sau a nivolumabului ca opțiuni terapeutice de linia a 2-a sau a 3-a. Acest tip de terapie se utilă deoarece tumorile cu instabilitate microsatelită prezintă o multitudine de mutații care codifică proteine. Aceste proteine ar putea deveni ținta sistemului imunitar dacă celulele tumorale nu ar exprima pe suprafață liganzii PD-L1 și PD-L2 (Programmed Death ligand), care se leagă de receptorii PD-1 și PD-2 de pe suprafața celulelor T efectoare și suprimă acest răspuns imun. De aceea au fost sintetizați acești doi anticorpi monoclonali IgG4 umanizați, care au capacitatea de a se lega de PD-1 și 2 cu afinitate mare și astfel previn interacțiunea acestuia cu liganzii de pe celulele tumorale [22].

IV.3 PROGNOSTIC

Cel mai important factor de prognostic al cancerului de colon este stadiul în care se află pacientul la diagnostic. Supraviețuirea la 5 ani a pacienților cu cancer colorectal este între 50-60%, mai mare în stadiile incipiente (75%-90%), decât în cele avansate când este sub 15% [23].

Se pare că instabilitatea microsatelită reprezintă un factor de prognostic pozitiv în stadiile I și II, acești pacienți având o supraviețuire la 5 ani mai bună decât cei diagnosticați cu cancer colorectal stabil microsatelitar [24]. Metastazele la distanță apar într-un procent mai mic de cazuri pentru tumorile cu instabilitate microsatelită (15% vs 44,7% pentru metastazele hepatice și 10% vs 42,5% pentru cele pulmonare) și incidența recurenței după tratament este mai scăzută [25].

PARTEA SPECIALĂ

SCOPUL LUCRĂRII

Aproximativ 12-17% dintre cancerele colorectale prezintă instabilitate microsatelită. Un mic procent dintre acestea, în jur de 2-5% sunt ereditare, încadrate în sindromul Lynch, iar restul sunt cancere sporadice [3].

Instabilitatea microsatelită apare datorită unor mutații în cadrul genelor care codifică proteine din sistemul de reparare al erorilor de împerechere: MLH1, MSH2, MSH6 și PMS2. Sindromul Lynch predispune la cancer colorectal și multiple neoplazii extracolonice. Cancerele colorectale din cadrul acestui sindrom sunt caracterizate de o progresie adenom-carcinom de 1:1, în comparație cu cele sporadice, unde aceasta este de 30:1 [14].

Desi tendința în era modernă a patologiei este de a subclasifica tumorile din punct de vedere molecular, ar trebui sa ne asiguram ca am utilizat toate metodele simple și ieftine pe care le avem la îndemână, pentru a evalua anumiți factori de prognostic în cancerul colorectal. Un astfel de factor prognostic este instabilitatea microsatelită (MSI).

Deși pentru testarea instabilității microsatelite se recomandă inițial teste genetice (gold standard), Colegiul American al Patologilor recomandă testarea imunohistochimică a acestor cazuri, folosind un panel de patru anticorpi: MLH1, MSH2, MSH6 și PMS2, care detectează prezența sau absența producției proteice [26]. Modalitatea de diagnostic a instabilității microsatelite prin imunohistochimie are câteva avantaje comparativ cu testarea prin PCR. Este larg răspândită, rapidă, ieftină și nu necesită un laborator de biologie moleculară. Imunohistochimia prezintă o bună sensibilitate, peste 90% și o specificitate de 100%, comparabile cu testarea PCR [27].

Lucrarea de față își propune să determine frecvența instabilității microsatelite în lotul de studiu constituit din cazuri de cancer colorectal în stadii incipiente, prin analiză imunohistochimică și corelarea acestor rezultate cu caracterele clinice și morfopatologice ale tumorilor.

MATERIAL ȘI METODE

2.1 LOT DE STUDIU

Acest studiu este unul retrospectiv, constituit din cazuri cu cancer colorectal într-un stadiu incipient, diagnosticate anterior prin endobiopsie, apoi operate clasic (rezecție intestinală standard cu limfadenectomie regională), în intervalul 2010-2018 la Spitalul Clinic de Urgență “Pius Brînzeu” Timișoara. În studiu au fost incluse 35 cazuri de cancer colorectal diagnosticate in stadii incipiente.

Datele clinice au fost obținute din biletul de însoțire al materialului bioptic și din foile de observație clinică, iar materialul prelucrat este reprezentat de blocurile de parafină prelevate din tumoră (au fost selectate cazuri care să includă leziune tumorală, dar și epiteliu colonic non-tumoral).

În studiul nostru am urmărit anumite date clinice: vârsta, sexul, mediul de viață, localizarea tumorală. Dintre aspectele histopatologice evaluate semnalăm aspectul macroscopic, invazia tumorală în profunzimea peretelui intestinal (pT), invazia limfo-vasculară (LV), metastazele din limfonodulii regionali (pN).

2.2 PROCEDURA

Pe lamele colorate hematoxilină-eozină (HE) am analizat nivelul invaziei pentru stadializare, gradul tumoral, invazia perineurală, invazia limfo-vasculară, metastazele din limfonodulii regionali. Stadiul pTNM a fost stabilit conform sistemului TNM al American Joint Committee on Cancer (AJCC).

Prelucrarea inițială a materialului bioptic a fost realizată prin fixare cu formaldehidă (formol 10%), cu includere ulterioară în parafină, secționare la microtom (secțiuni subțiri, cu grosime de 4 microni) și colorate hematoxilină-eozină (HE).

Reacțiile imunohistochimice au fost realizate prin tehnica de colorare automată cu ajutorul aparatului LEICA BOND MAX SYSTEM. Tehnica imunohistochimică s-a efectuat prin deparafinarea și rehidratarea secțiunilor tisulare. Deparafinarea a presupus următoarele etape: deparafinarea la termostat, la o temperatură de 56 grade Celsius, timp de o oră, urmată de spălarea și îndepărtarea parafinei în băi de benzen la temperatura camerei timp de o oră. Rehidratarea tisulară prin băi succesive de alcool a avut ca scop aducerea secțiunilor tisulare în condiții similare cu cele ”in vivo”. Demascarea antigenului, utilă pentru îndepărtarea resturilor de parafină și distrugerea punților metilenice care determină modificări conformaționale ale epitopilor, s-a realizat prin digestie enzimatică, utilizând proteinaza. Au fost utilizate soluții de demascare cu pH6 sau pH9, având un timp de demascare variabil între 5 și 20 minute.

După răcirea secțiunilor și spălarea cu apă distilată a acestora, automatul de imunohistochimie a fost programat pentru a realiza următoarele etape ale tehnicii: blocarea peroxidazei endogene cu apă oxigenată 3% timp de 5 minute, incubarea cu anticorpul primar – 15 minute, incubarea cu anticorpul secundar – 8 minute, incubarea cu anticorpul terțiar – 8 minute, aplicarea cromogenului- diaminobenzidină – 10 minute, contracolorarea cu hematoxilină – 5 minute. La finalul programului, secțiunile sunt introduse în alcool absolut, 5 minute, apoi uscate și clarefiate în benzen, 5 minute. Montarea se realizează folosind un mediu de montare permanent.

2.3 INTERPRETARE

Pentru studiul imunohistochimic, am selectat câte un bloc de parafină pentru fiecare caz, din care am efectuat două secțiuni adiționale care au fost întinse pe lame silanizate. S-a efectuat un panel de doi anticorpi pentru a dovedi instabilitatea microsatelită a acestor cazuri: MLH1 și MSH2. Mutațiile în genele MLH1 și MSH2 sunt cele mai frecvente, apar la aproximativ 70% din cazurile de sindrom Lynch. Aceși anticorpi sunt anticorpi monoclonali (pentru MLH1 am utilizat clona ES05, iar pentru MSH2 am utilizat clona 25D12), sub forma unor soluții “ready to use”, cu o diluție prestabilită pentru a fi folosite în cadrul sistemelor Leica BOND Max.

Conform protocolalelor Colegiului American al Patologilor (CAP) pentru interpretare imunohistochimică [28], orice colorare nucleară, chiar și o colorare ușoară este considerată pozitivă (fără pierderea expresiei) și doar absența absolută a colorării nucleare trebuie considerată negativă (pierderea expresiei). Se recomandă ca fiecare secțiune aleasă să conțină și țesut colonic normal, pentru un control intern (mucoasa intestinală normală, limfocitele, centri germinativi ai unor foliculi limfoizi și celulele stromale sunt pozitive în mod normal la acești anticorpi).

Sunt considerate cazuri instabile microsatelitar, cazurile în care colorația nucleilor este negativă la minim unul dintre anticorpii utilizați. Expresia proteinelor a fost grupată în trei categorii: fără pierderea expresiei proteice, pierderea expresiei pentru ambele colorații imunohistochimice, pierderea expresiei de tip mixt MLH1/MSH2. Tumora este clasificată ca având un grad înalt de instabilitate microsatelită dacă doi markeri prezintă instabilitate, grad redus dacă doar unul este afectat și este considerată stabilă microsatelitar (MSS) dacă toți markerii sunt pozitivi. Cazurile în care s-a observat pierderea expresiei pentru ambele colorații imunohistochimice (MSH1, MLH2) sau pierderea expresiei de tip mixt, fie MLH negativ/fie MSH2 negativ, au fost încadrate în subtipul tumorilor instabile microsatelitar (MSI).

REZULTATE

3.1 ASPECTE CLINICE

Studiul se întinde pe o perioadă de 9 ani, din 2010 până în 2018. În această perioadă, în baza de date a Serviciului de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic Județean de Urgență din Timișoara au fost înregistrate 35 de cazuri de polipi colorectali malignizați. În anii 2012 și 2017 au fost diagnosticate cele mai multe cazuri, câte 7 în fiecare an.

Grafic 2. Distribuția cazurilor diagnosticate între anii 2010-2018

Dintre acestea, 29 de cazuri provin de la persoane cu domiciliul în mediul urban, iar 6 de la persoane cu domiciliul în mediul rural.

Grafic 3. Distribuția cazurilor pe medii de viață

Vârstele pacienților sunt cuprinse între 50 și 89 de ani, incidența maximă, de 34%, fiind întâlnită la categoria de vârstă cuprinsă între decadele 6 și 7 de viață. Această distribuție este reprezentată în tabelul 1 și graficul 4.

Tabel 1. Distribuția cazurilor pe grupe de vârstă

Grafic 4. Distribuția cazurilor pe grupe de vârstă

Referitor la distribuția cazurilor pe sexe, redată în graficele 5 și 6, majoritatea cazurilor, în număr de 20 (57%), au apărut la pacienți de sex masculin, iar 15 cazuri (43%) au fost înregistrate la persoane de sex feminin.

Grafic 5. Distribuția cazurilor pe sexe

Grafic 6. Distribuția cazurilor pe sexe în procente

Din totalul de 35 de cazuri, la 13 dintre acestea, leziunile au fost situate la nivelul colonului sigmoid, 12 au prezentat polipi la nivelul rectului, 4 la nivelul colonului ascendent, iar la nivelul colonului descendent și transvers au fost înregistrate câte 3 cazuri. Astfel, majoritatea tumorilor, în procent de 80% au fost localizate la nivelul colonului stâng, 11% la nivelul colonului drept și 9% au provenit din colonul transvers. Aceste date sunt redate în tabelul 2 și graficele 7 și 8 .

Grafic 7. Distribuția cazurilor în funcție de localizarea tumorală

Tabel 2. Distribuția cazurilor în funcție de localizarea tumorală

Grafic 8. Distribuția cazurilor în funcție de localizarea tumorală

3.2 ASPECTE MICROSCOPICE

În cadrul sistemului TNM de stadializare a cancerului colorectal, T descrie extensia tumorii în grosimea peretelui intestinal. Astfel, în lotul nostru de pacienți, 29 au prezentat tumori încadrate în stadiul pT1, cu invazie în submucoasă, 5 au fost diagnosticate în stadiul incipient pTis, de carcinom intramucos sau in situ, iar într-un singur caz tumora s-a extins până la musculara propria, fiind încadrată în stadiul pT2.

Grafic 9. Distribuția cazurilor în funcție de stadiul T din cadrul criteriilor TNM

Figura 1. Polip colonic malignizat, pT1, colorație HE

Pentru o stadializare corectă a cancerului colorectal se recomandă examinarea a cel puțin 12 limfonoduli regionali. Metastazele limfonodulare sunt reprezentate în sistemul TNM de criteriul N. În studiul nostru 74% din cazuri (26) sunt în stadiul N0 și nu prezintă metastaze limfonodulare, 23% (8) sunt cazuri aflate în stadiul N1, care prezintă metastaze în mai puțin de 3 limfonoduli, iar un singur caz (3%) a fost diagnosticat în stadiul N2, cu metastaze în mai mult de 4 limfonoduli [7].

Tabel 3. Distribuția cazurilor în funcție de stadiul N

Grafic 10. Distribuția cazurilorîn funcție de stadiul N

Leziunile precursoare cancerului colorectal sunt polipii adenomatoși, care prezintă mai multe modele arhitecturale de organizare. Cei cu potențialul cel mai ridicat de malignizare sunt polipii viloși, care au un model de creștere cu proiecții papilare dispuse perpendicular pe musculara mucoasei. Polipii adenomatoși tubulari prezintă glande de formă rotunjită (tubulară), separate între ele prin lamina propria de aspect normal. Aceștia tind să fie de dimensiuni mai mici și pediculați, spre deosebire de cei viloși, care sunt mai frecvent sesili și au dimensiuni mai mari. Există și un pattern de creștere mixt, tubulo-vilos. [7] În lotul nostru, majoritatea tumorilor, în procent de 86%, prezintă pattern de creștere tubulo-vilos, 8% tubular și 6% vilos.

Grafic 11. Distribuția în funcție de pattern-ul de creștere

Tabel 4. Distribuția în funcție de pattern-ul de creștere

Figura 2. Polip colonic malignizat, tubular, colorație HE

Adenocarcinoamele bine diferențiate se caracterizează prin formare de glande în peste 95% din masa tumorală. Pentru cele moderat diferențiate acest procent este între 50-90%, iar cele slab diferențiate sunt tumori solide cu mai puțin de 50% glande în masa tumorală. Gradul de diferențiere tumorală reprezintă un element de prognostic independent de stadiu [13]. Majoritatea tumorilor studiate de noi, în număr de 22 (63%) au fost bine diferențiate, iar restul de 13 (37%) au fost moderat diferențiate.

Grafic 12. Distribuția cazurilor în funcție de gradul de diferențiere

Figura 3. Polip colonic malignizat, G1, colorație HE

Metastazarea tumorală la distanță, pe cale hematogenă, reprezintă cauza cea mai importantă de mortalitate în cancer, iar prezența embolilor tumorali în teritoriul vascular este primul pas în această direcție. În studiul nostru 12 dintre pacienți au prezentat emboli endovasculari, pe când în celelalte 23 de cazuri aceștia nu au existat.

Grafic 13. Distribuția cazurilor în funcție de prezența embolilor tumorali endovasculari

3.3 ASPECTE IMUNOHISTOCHIMICE

Din totalul de 35 de cazuri, 9 cazuri (26%) prezintă instabilitate microsatelită (MSI), iar 26 (74%) sunt stabile microsatelitar (MSS). Dintre cele 9 cazuri, 3 (33%) sunt negative la ambele reacții imunohistochimice (MLH1, MSH2), deci cu grad înalt de instabilitate microsatelită, iar restul de 6 (67%) sunt negative doar la MSH2, deci cu un grad scăzut de instabilitate microsatelită.

Figura 4. Polip colorectal malignizat. Imunomarcaj cu MLH1-reacție pozitivă la nivelul nucleilor. Tumoră MSS

Figura 5. Polip colorectal malignizat. Imunomarcaj cu MLH1-reacție intens pozitivă la nivelul nucleilor. Tumoră MSS

În lotul studiat au fost incluși 20 de barbați și 15 femei, iar dintre cei care au prezentat instabilitate microsatelită, 5 sunt bărbați și 4 sunt femei. Nu s-a observat o asociere semnificativă între sexul pacienților și instabilitatea microsatelită. Vârsta medie a pacienților din studiu a fost 67,47, iar vârsta medie a celor care prezintă MSI este 67,44 ani. Nici în legătură cu vârsta nu s-a găsit o asociere semnificativă.

Figura. Polip colorectal malignizat. Imunomarcaj cu MLH1-reacție pozitivă la nivelul nucleilor. Tumoră MSS.

Tumorile care prezintă instabilitate microsatelită sunt mai frecvent asociate cu localizarea pe colonul drept. Astfel, 3 din cele 4 tumori localizate la nivelul colonului ascendent sunt instabile microsatelitar, ceea ce reprezintă un procent de 33,33% din tumorile MSI, în comparație cu 3,84% în grupul MSS. Tumorile cu localizare la nivelul colonului descendent, sigmoid și rect au fost mai frecvente în lotul pacienților MSS (88,46%), decât în cel al pacienților MSI (55,55%). Există deci, o asociere semnificativă statistic între localizarea tumorală la nivelul colonului drept și MSI ( p=0,016).

Grafic 14. Asocierea dintre localizarea tumorală și instabilitatea microsatelită

Figura 6. Polip colorectal malignizat. Imunomarcaj cu MLH1-reacție negativă. Control intern pozitiv la nivelul limfocitelor. tumoră MSI

Figura 7. Polip colorectal malignizat. Imunomarcaj cu MLH1-reacție negativă. Control intern pozitiv la nivelul limfocitelor. Tumora MSI

Figura 8. Polip colorectal malignizat. Imunomarcaj cu MSH2-reacție negativă. Control intern pozitiv la nivelul limfocitelor. Tumora MSI

Referitor la gradul de diferențiere tumorală nu s-a găsit nicio asociere între acesta și statutul MSI. Astfel, 66,66% (n=6) dintre tumorile MSI sunt bine diferențiate și 33,33% (n=2) sunt moderat diferențiate. Același lucru este valabil și pentru asocierea dintre stadiul N al tumorilor. În cadrul grupului MSI 77,7% din tumori au fost în diagnosticate în stadiul N0 și 22,2% în stadiul N1. În grupul MSI 77,7% (n=7) dintre tumori sunt în stadiul pT1 și 22,2% (n=2) se află în stadiul pTis, pe când în grupul MSS doar 11,53% din tumori erau in stadiul pTis.

A fost observat un grad mai redus de invazie limfovasculară în grupul MSI, comparativ cu cel MSS, dar acest aspect nu este semnificativ statistic (p=0,89). Dintre tumorile MSI 88,8% nu au prezentat invazie limfovasculară, fiind încadrate ca LV0 și 11,11% au fost încadrate ca LV1, pe când în grupul MSS doar 57,69% dintre tumori erau LV0, restul de 42,3% prezentând invazie limfovasculară (LV1).

Grafic 15. Asocierea dintre gradul invaziei limfovasculare și instabilitatea microsatelită

DISCUȚII

Studiul nostru și-a propus să determine frecvența cazurilor de polipi colorectali malignizați cu instabilitate microsatelită, care s-a dovedit a fi de 26%, în cadrul Serviciului de Anatomie Patologică al Spitalului Clinic Județean de Urgență din Timișoara.

Rezultatele obținute au fost asemănătoare cu cele din studiul efectuat de Hashmi et al care a evaluat statusul MSI pentru 100 de pacienți și a descoperit un grad înalt de instabilitate microsatelită la 34% dintre aceștia. Incidența diferită a mutației între studiile noastre ( 26% vs 34%) ar putea fi pusă pe seama diferenței de etnie. [26]. Frecvența pierderii expresiei proteice este diferită de la un studiu la altul, variind de la valori de 15% în studiile din tările vestice [29] la valori de 21% în Singapore [30].

Stadiul TNM este cel mai important factor în evaluarea prognostică a pacienților care prezintă cancer colorectal și direcționează planul de tratament, însă răspunsul la terapie prezintă o variabilitate considerabilă, cel mai probabil datorată heterogenității moleculare a tumorilor. De aceea este nevoie de biomarkeri prognostici care să orienteze deciziile terapeutice cum ar fi utilitatea chimioterapiei adjuvante [27].

Instabilitatea microsatelită reprezintă un astfel de biomarker important în evaluarea pacienților cu cancer colorectal. Pentru cazurile cu sindrom Lynch, această evaluare este esențială, deoarece criteriile clinice nu oferă certitudinea de a depista toate aceste cazuri, iar impactul diagnostic nu se răsfrânge doar asupra pacientului care trebuie să fie urmărit mai îndeaproape pentru că prezintă un risc substanțial de a dezvolta alte tumori colonice sau extracolonice, ci și asupra familiei acestuia care trebuie supusă unui screening riguros. Pentru cancerele colorectale sporadice, instabilitatea microsatelită are implicații atât în aprecierea prognosticului, care este mai favorabil, cât și în alegerea unei scheme de tratament, deoarece numeroase studii contraindică folosirea chimioterapiei adjuvante cu 5-fluorouracil la pacienții cu cancerele incipiente, iar în cancerele mai avansate ar putea face utilă alegerea unei terapii imunologice țintite.

Deoarece datele despre instabilitatea microsatelită în cancerele colorectale din România și Europa de Est sunt puține, ne-am propus să studiem frecvența acestei mutații pe un lot de 35 de pacienți prin metode imunohistochimice, utilizând doi markeri, MLH1 și MSH2 și să corelăm aceste date cu particularitățile clinice și morfopatologice ale acestora. Din cele 35 de tumori analizate, 9 au prezentat instabilitate microsatelită. Acestea au fost localizate preponderent la nivelul colonului drept, au fost diagnosticate într-un stadiu mai incipient și au prezentat un grad mai mic de invazie limfovasculară.

Una dintre limitele studiului o constituie inaccesibilitatea efectuării colorațiilor imunohistochimice pentru testarea expresiei tuturor genelor reparatoare ale ADN potențial implicate în apariția sindromului Lynch. Este posibil ca un număr de cancere din grupul studiat, să manifeste lipsa expresiei imunohistochimice pentru alte gene reparatoare ale ADN (MSH6, PMS2).

Hashmi et al a observat de asemenea o asociere semnificativă între localizarea tumorală în colonul drept și gradul înalt de instabilitate microsatelită (p=0.013). În schimb nu a fost observată o asociere între sexul pacienților, vârsta lor, gradul de diferențiere tumorală, invazia în limfonodulii regionali și instabilitatea microsatelită. Deoarece aceste criterii clinice și morfopatologice nu pot fi utilizate pentru screening-ul pacienților care ar putea prezenta instabilitate microsatelită, screening-ul prin imunohistochimie este eficient și important de efectuat [21].

Spre deosebire de alte studii, în care tumorile MSI aveau un grad scăzut de diferențiere (subtip medular sau mucinos), în studiul nostru a predominat gradul 1 de diferențiere (tumori bine diferențiate, G1). Din cele nouă cazuri instabile microsatelitar, șase au fost bine diferențiate. [31][32].

Totuși, studiul nostru nu a inclus și o evaluare genetică, pentru a putea delimita cazurile ereditare de cele sporadice. Într-un studiu ulterior, ne propunem să depistăm cazurile care prezintă mutația BRAF v006, pentru a face distincția între cazurile sporadice de cancer colorectal și posibilele cazuri de sindrom Lynch.

CONCLUZII

Din totalul de 35 de cazuri selectate de cancer colorectal într-un stadiu incipient, 26% prezintă instabilitate microsatelită (MSI), iar 74% sunt stabile microsatelitar (MSS). Dintre cele 9 cazuri, 33% sunt cu grad înalt de instabilitate microsatelită, iar 67% sunt cu grad scăzut de instabilitate microsatelită.

Tumorile care prezintă instabilitate microsatelită sunt mai frecvent asociate cu localizarea la nivelul colonul drept (33,33% dintre tumorile MSI vs. 3,84% dintre tumorile MSS).

Tumorile cu MSI au prezentat mult mai rar aspecte de invazie limfovasculară (88,8% dintre tumorile MSI sunt LV0 vs 57,67% dintre tumorile MSS).

Vârsta medie a pacienților incluși în acest studiu a fost de 67,47 ani, similară cu vârsta medie a celor care prezintă MSI (67,44 ani).

Nu am observat nicio asociere între vârstele pacienților, sexul acestora, gradul de diferențiere tumorală, stadiul T, stadiul N și statusul MSI, prin urmare criteriile clinice și morfologice nu pot fi folosite cu acuratețe pentru screening-ul pacienților cu MSI.

Colorațiile imunohistochimice pot identifica pacienții cu cancer colorectal instabil microsatelitar, care ar trebui testați ulterior pentru mutațiile genelor MMR, cu scopul de a depista un eventual sindrom Lynch.

Rezultatele studiului nostru recomandă efectuarea tehnicilor de imunohistochimice pentru depistarea instabilității microsatelite in toate cazurile de carcinoame colo-rectale, aceste testări fiind relativ usor de efectuat si interpretat, cu specificitate și sensibilitate crescute. Scopul principal al acestor investigații este de a identifica pacienții și implicit membrii familiilor acestora, care prezintă risc inalt de dezvoltare a neoplaziilor colonice și extracolonice specifice sindromului Lynch, intr-un stadiu incipient.

BIBLIOGRAFIE

Global Burden of Disease Cancer Collaboration. Global, Regional, and National Cancer Incidence, Mortality, Years of Life Lost, Years Lived With Disability, and Disability-Adjusted Life-years for 32 Cancer Groups, 1990 to 2015A Systematic Analysis for the Global Burden of Disease Study. JAMA Oncol. 2017;3(4):524–548. doi:10.1001/jamaoncol.2016.5688

Aarons CB, Shanmugan S, Bleier JI. Management of malignant colon polyps: Current status and controversies. World Journal of Gastroenterology : WJG. 2014;20(43):16178-16183. doi:10.3748/wjg.v20.i43.16178.

Boland CR, Goel A. Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2010;138(6):2073-2087.e3. doi:10.1053/j.gastro.2009.12.064.

Drake, Richard; Vogl, A. Wayne; Mitchell, Adam W. M. Gray's Anatomy for Students E-Book. London: Churchill Livingstone; 2009.

Ross, M. H., & Pawlina, W. Histology: A text and atlas : with correlated cell and molecular biology. Baltimore, MD: Lippincott Wiliams & Wilkins 2006. Pag 597-601

Jemal, A. , Bray, F. , Center, M. M., Ferlay, J. , Ward, E. and Forman, D. (2011), Global cancer statistics. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 61: 69-90. doi:10.3322/caac.20107

Kumar, Vinay, Abul K. Abbas, and Jon C. Aster. Robbins and Cotran Pathologic Basis of Disease. Ninth edition. Philadelphia, PA: Elsevier/Saunders, 2015. Pag. 810-815

Hadjipetrou A, Anyfantakis D, Galanakis CG, Kastanakis M, Kastanakis S. Colorectal cancer, screening and primary care: A mini literature review. World Journal of Gastroenterology. 2017;23(33):6049-6058. doi:10.3748/wjg.v23.i33.6049.

Chan AT, Giovannucci EL. Primary Prevention of Colorectal Cancer. Gastroenterology. 2010;138(6):2029-2043.e10. doi:10.1053/j.gastro.2010.01.057.

Tariq K, Ghias K. Colorectal cancer carcinogenesis: a review of mechanisms. Cancer Biology & Medicine. 2016;13(1):120-135. doi:10.28092/j.issn.2095-3941.2015.0103.

Ramel C. Mini- and microsatellites. Environmental Health Perspectives. 1997;105(Suppl 4):781-789.

Sinicrope FA, Sargent DJ. Clinical implications of microsatellite instability in sporadic colon cancers. Current opinion in oncology. 2009;21(4):369-373. doi:10.1097/CCO.0b013e32832c94bd.

Fleming M, Ravula S, Tatishchev SF, Wang HL. Colorectal carcinoma: Pathologic aspects. Journal of Gastrointestinal Oncology. 2012;3(3):153-173. doi:10.3978/j.issn.2078-6891.2012.030.

Sehgal R, Sheahan K, O’Connell PR, Hanly AM, Martin ST, Winter DC. Lynch Syndrome: An Updated Review. Genes. 2014;5(3):497-507. doi:10.3390/genes5030497.

Kohlmann W, Gruber SB. Lynch Syndrome. 2004 Feb 5 [Updated 2018 Apr 12]. In: Adam MP, Ardinger HH, Pagon RA, et al., editors. GeneReviews® [Internet]. Seattle (WA): University of Washington, Seattle; 1993-2018.

Vasen HFA, Möslein G, Alonso A, et al Guidelines for the clinical management of Lynch syndrome (hereditary non-polyposis cancer) Journal of Medical Genetics 2007;44:353-362.

Boland CR, Lynch HT. The History of Lynch Syndrome. Familial cancer. 2013;12(2):145-157. doi:10.1007/s10689-013-9637-8.

Abdel-Rahman, Wael M. et al.The genetics of HNPCC: Application to diagnosis and screening Critical Reviews in Oncology / Hematology , Volume 58 , Issue 3 , 208 – 220

Giardiello, Francis M. et al. Guidelines on Genetic Evaluation and Management of Lynch Syndrome: A Consensus Statement by the US Multi-Society Task Force on Colorectal Cancer Gastroenterology , Volume 147 , Issue 2 , 502 – 526

Dawn Provenzale, Samir Gupta, Dennis J.Ahnen et al. Genetics/Familial High-Risk Assessment: Colorectal, NCCN Guidelines Version 2.2017-August 2017

Al B. Benson,III,Alan P.Venook, Lynette Cederquist et al, Colon Cancer NCCN Guidelines Version 2.2017-March 13 2017

Raphaël Colle, Romain Cohen, Delphine Cochereau et al, Immunotherapy and patients treated for cancer with microsatellite instability,Bulletin du Cancer, Volume 104, Issue 1, Pages 42-51, 2017, ISSN 0007-4551,

Binefa, Gemma et al. “Colorectal Cancer: From Prevention to Personalized Medicine.” World Journal of Gastroenterology : WJG 20.22 (2014): 6786–6808. PMC. Web. 23 May 2018.

Copija, Angelika et al. “Clinical Significance and Prognostic Relevance of Microsatellite Instability in Sporadic Colorectal Cancer Patients.” Ed. Peter J. K. Kuppen. International Journal of Molecular Sciences 18.1 (2017): 107. PMC. Web. 23 May 2018.

Kim, Chang Gon et al. “Effects of Microsatellite Instability on Recurrence Patterns and Outcomes in Colorectal Cancers.” British Journal of Cancer 115.1 (2016): 25–33. PMC. Web. 23 May 2018.

Hashmi, Atif Ali et al. “Mismatch Repair Deficiency Screening in Colorectal Carcinoma by a Four-Antibody Immunohistochemical Panel in Pakistani Population and Its Correlation with Histopathological Parameters.” World Journal of Surgical Oncology 15 (2017): 116. PMC. Web. 23 May 2018.

Kawakami, Hisato, Aziz Zaanan, and Frank A. Sinicrope. “MSI Testing and Its Role in the Management of Colorectal Cancer.” Current treatment options in oncology 16.7 (2015): 30. PMC. Web. 23 May 2018.

Gandhi JS1, Goswami M2, Sharma A et al, Clinical impact of Mismatch repair protein testing on Outcome of early staged CRC, Springer 2017

Guastadisegni C, Colafranceschi M, Ottini L et al. Microsatellite instability as a marker of prognosis and response to therapy: a meta-analysis of colorectal cancer survival data. Eur J Cancer. 2010;46:2788–98. doi: 10.1016/j.ejca.2010.05.009.)

Chew MH, Koh PK, Tan M, Lim KH, Carol L, Tang CL. Mismatch repair deficiency screening via immunohistochemical staining in young Asians with colorectal cancers. World J Surg. 2013;37(10):2468–75. doi: 10.1007/s00268-013-2134-2

Boland CR. Clinical uses of microsatellite instability testing in colorectal cancer: an ongoing challenge. J Clin Oncol. 2007;25:754–6.

Alexander J, Watanabe T, Wu TT, et al. Histopathological identification of colon cancer with microsatellite instability. Am J Pathol. 2001;158:527–35