Evaluarea Genotipurilor Vhc Circulante In Romania

ACADEMIA ROMANA INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET

INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE ”STEFAN S. NICOLAU”

TEZA DE DOCTORAT

Coordonator:

Prof. Univ. Dr. Simona Maria Ruta

Doctorand:

Delia Codruta Vagu

Bucuresti

-2014-

ACADEMIA ROMANA INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://www.sfatulmedicului.ro/images/File/Parteneri/Institut Virusologie Nicolau/institutul de virusologie 1.gif" \* MERGEFORMATINET

INSTITUTUL DE VIRUSOLOGIE ”STEFAN S. NICOLAU”

TEZA DE DOCTORAT

Evaluarea genotipurilor VHC circulante in Romania

Coordonator:

Prof. Univ. Dr. Simona Maria Ruta

Doctorand:

Delia Codruta Vagu

Bucuresti

-2014-

Cuprins

CUVINTE CHEIE: Virus hepatitic C, genotipuri VHC, factori de risc, populatia generala, transplant hepatic, consumatori de droguri injectabile, coinfectie VHC/HIV, metabolismul fierului.

PARTEA GENERALA

CAPITOLUL 1 – EPIDEMIOLOGIEA, TRANSMITEREA SI ISTORIA NATURALA A INFECTIEI CU VHC

1.1. Introducere

Intre anii 1970-1973 au fost identificate doua virusuri, respectiv virusul hepatitei A (virusul hepatitei infectioase) si B (virusul hepatitei serice); si s-a crezut ca hepatita poate fi controlata. Totusi, in conditiile riguroase de igiena din mediul spitalicesc, apareau hepatite post-transfuzionale de etiologie necunoscuta care au fost grupate si denumite hepatite non A-non B (NANB) [Feinstone,1975].

Inocularea cimpanzeilor (Pan troglodytes) cu plasma concentrata (factor VIII contaminat) provenita de la pacientii cu hepatita NANB a determinat cresteri ale transaminazelor serice si a indicat faptul ca un nou agent infectios era responsabil de acesta afectiune [Alter,1978; Hollinger, 1978]. Din serul cimpanzeilor si al oamenilor infectati au fost izolate si vizualizate prin microscopie electronica particule sferice de 33-70 nm, particulele virus-like, dar realitatea structurilor vizualizate a fost controversata [Prince A.M., 1996].

Lipsa unui sistem de culturi celulare potrivit pentru agentul NANB si disponibilitatea limitata a cimpanzeilor, au impiedicat timp de peste 16 ani caracterizarea agentului etiologic al hepatitelor NANB. In anul 1989, cu ajutorul unei noi strategii de clonare a acizilor nucleici proveniti din plasma cimpanzeilor infectati, a fost caracterizat genomul agentului etiologic al hepatitelor NANB si a fost denumit virusul hepatitei C (VHC). S-a stabilit ca VHC este un virus mic anvelopat, de 55-65 nm, alcatuit dintr-o capsida cu simetrie icosaedrica si genom cu ARN simplu spiralat de polaritate pozitiva. Inca de la descoperirea sa, VHC a fost incadrat in familia Flaviviridae, care contine 3 genuri: Flavivirus, Pestivirus si Hepacivirus, toti membrii avand caracteristici structurale si virusologice comune. VHC este membru al genului hepacivirus, alaturi de virusul tamarin, GB-B (VGB-B), un virus inca neclasificat care a fost descoperit odata cu virusul GB-A (VGB-A) la un chirurg cu hepatita activa [Thiel, 2005].

In ultimii ani, dezvoltarea unor modele de culturi celulare in vitro, au permis explorarea si intelegerea intregului ciclu replicativ VHC [Zhong, 2005; Wakita, 2005; Lindenbach, 2005].

Infectia cu VHC reprezinta la ora actuala o problema majora de sanatate publica, 170-200 milioane de persoane sunt infectate, aproximativ 3% din populatia globului.

Infectia primara evolueaza spre hepatita acuta, frecvent asimptomatica si ulterior spre hepatita cronica, la peste 70% dintre pacienti. Aceasta persistenta a virusului determina deseori aparitia hepatitei cronice active [NIHCDCS, 2002], astfel incat, la ora actuala, VHC este cea mai frecventa cauza a bolii hepatice progresive, cu evolutie spre ciroza si hepatocarcinom, reprezentand principala indicatie de transplant hepatic in SUA si Europa.

Tratamentul pacientilor cu hepatita cronica VHC este justificat prin riscul crescut de evolutie al acesteia catre boala hepatica terminala.Terapia standard, desi se administreaza timp indelungat si se bazeaza, in general, pe asocierea interferonului (mai nou a interferonului pegylat) cu ribavirina, are eficienta scazuta, aproximativ 50% dintre pacienti reusind sa elimine virusul si sa obtina raspuns virusologic sustinut. In anul 2011, doua medicamente cu biodisponibilitate orala, Telaprevir (produs de Vertex Pharmaceuticals) si Boceprevir (produs de Schering Plough/Merck) au fost aprobate de catre Administratia Alimentelor si Medicamentelor din S.U.A. (FDA) si de catre Agentia Europeana a Medicamentului (EMA) in tratamentul pacientilor infectati cu genotipul 1 VHC, in combinatie cu interferonul pegylat si cu ribavirina [Sarrazin, 2007; Susser, 2009], determinand imbunatatirea ratelor de raspuns la tratament. In prezent, odata cu intelegerea ciclului replicativ, au fost identificate noi tinte antivirale specifice pentru fiecare etapa a ciclului viral, astfel incat, au aparut agentii terapeutici cu actiune antivirala directa (STAT-C) si eficienta pan-genotipica (includ: inhibitori ai proteazei NS3-4A, analogi nucleozidici (NI) si analogi non-nucleozidici (NNI) inhibitori ai polimerazei virale NS5B si inhibitori ai NS5A).

Studiile moleculare au aratat ca VHC se caracterizeaza prin variabilitate genetica mare, care pe parcursul evolutiei a determinat emergenta diferitelor genotipuri, subtipuri si cvazispecii virale, care surmonteaza sistemului imun al gazdei, cu implicatii in stabilirea persistentei virale, a rezistentei la agentii antivirali si in realizarea unui vaccin antiviral. Studiul variabilitatii virale detine o importanta stiintifica deosebita in lupta contra infectiei VHC, permitand o mai buna intelegere a epidemiologiei acesteia si a implicatiilor clinice specifice in functie de genotipul VHC.

1.2. Epidemiologia infectiei cu virusul hepatitei C (VHC)

Infectia cu VHC se caracterizeaza prin variatii mari ale distributiei geografice, atat in ceea ce priveste incidenta, cat si si prevalenta, datorate in mare masura diferentelor legate de factorii de risc care contribuie la transmiterea infectiei. Epidemiologia VHC se afla intr-o continua evolutie si parametrii ca prevalenta, incidenta, distributia genotipurilor si factorii de risc au suferit schimbari majore in ultima perioada.

In majoritatea tarilor, din cauza datelor epidemiologice limitate, prevalenta exacta nu este cunoscuta, astfel incat, aceasta a fost estimata folosind date din populatia generala a regiunii geografice respective. In prezent, exista diferente semnificative in distributia geografica a infectiei VHC, care variaza intre <1% in Nordul Europei si >5% in Nordul Africii. In tarile dezvoltate, respectiv in Australia, Japonia, Turcia, majoritatea tarilor din vestul Europei si Statele Unite ale Americii, prevalenta globala a infectiei VHC a fost estimata ca fiind 2,2% [Sievert, 2011; Cornberg, 2011]. In schimb, in majoritatea tarilor din estul Europei, America de Sud, anumite tari din Africa, din Orientul Mijlociu si din sudul Asiei, s-a raportat o prevalenta mai mare de 3% [Sievert, 2011; Cornberg, 2011; Shepard, 2005; Madhava, 2002; Kershenobich, 2011]. Cea mai mica prevalenta este raportata in Marea Britanie si Scandinavia (0,01%-0,1%) [Anonymous, 2004], iar cea mai mare in Egipt, >10% [Sievert, 2011] unde exista un caracter omogen al infectiei VHC, cu un genotip rar intalnit in restul tarilor – 4a, ceea ce – pledeaza pentru o raspandire epidemica, legata cel mai probabil de refolosirea seringilor utilizate in campania de eradicare a schistosomiazei intre anii 1960-1970 [Frank, 2000].

Spre deosebire de statisticile mondiale care arata ca Romania se situeaza intr-o zona de risc intermediar, cu o prevalenta a infectiei VHC de 3,23% (aproximativ 500000 de persoane), studiile nationale publicate in ultimii ani, sugereaza o prevalenta mai ridicata, cu diferente importante in functie de regiunea geografica, astfel cea mai crescuta rata s-a inregistrat in Moldova (4,25%), urmata de Muntenia si Dobrogea (3,35%), iar cea mai mica rata se intalneste in Transilvania si Banat (2,63-3,22%) [Gheorghe, 2010].

Prevalenta globala medie nu reflecta riscul de transmitere a VHC, in schimb variatiile si paternul prevalentei in functie de varsta, reflecta diferentele geografice si temporale in achizitia infectiei VHC. De exemplu, tari diferite ca Statele Unite, Australia, Turcia, Spania, Italia si Japonia au o prevalenta medie globala asemanatoare (1-1,9%), dar prezinta tipuri diferite ale prevalentei pe grupe de varsta. In Statele Unite, Australia si in Europa de nord si vest, prevalenta cea mai mare se inregisteaza in randul persoanelor cu varsta cuprinsa intre 30 si 49 de ani, in timp ce, persoanele pana in 20 de ani sau peste 50 de ani prezinta o prevalenta mai scazuta decat media [Armstrong, 2006; Alter,1998; Dore, 2003; Gerard, 2005; Payan, 2005], sugerand ca majoritatea infectiilor VHC s-au produs in ultimii 20-40 de ani, in randul adultilor tineri, iar variatiile de prevalenta in aceste tari se intalnesc datorita factorilor de riscdiferiti. In Taiwan, Spania, Italia, Japonia si China, prevalenta creste odata cu varsta [Dominguez, 2001; Sun, 2001; Sagnelli, 2005; Zhang, 2005; Okayama, 2002], majoritatea infectiilor fiind raportate la persoane cu varsta peste 50 de ani, ceea ce sugereaza ca riscul de achizitionare a infectiei a fost mai mare in urma cu 40-60 de ani. In tarile cu acest tip de epidemiologie, cele mai mari variatii ale prevalentei se intalnesc in functie de zona geografica. De exemplu, in sudul Italiei, intr-o regiune in care prevalenta globala a VHC a fost calculata la 16,2% s-a observat ca la persoanele cu varsta sub 30 de ani rata infectiei este de 1,2%, cu mult mai mica decat in grupul persoanelor cu varsta peste 60 de ani, unde este de 42,1%. Variatiile de prevalenta se datoreaza folosirii pana in anul 1970 a seringilor din sticla sau a tratamentelor stomatologice posibil cu instrumentar insuficient sterilizat [Maio, 2000].

Avand in vedere faptul ca infectia acuta VHC este dificil de diagnosticat, majoritatea pacientilor fiind asimptomatici, si ca boala cronica poate aparea la mai multi ani fata de momentul achizitiei infectiei, determinarea incidentei actuale a VHC si a evolutiei sale temporale este dificil de stabilit, dar este de o mare importanta in estimarea morbiditatii si mortalitatii asociate infectiei VHC.

In majoritatea regiunilor, numarul infectiilor acute este in general subestimat, astfel incat, s-a incercat crearea unor modele matematice pentru estimarea incidentei VHC. De exemplu, in SUA, a fost utilizat atat un model bazat pe raportarea incidentei infectiilor acute VHC in functie de grupa de varsta (prin determinarea nivelului de ARN VHC, in timp ce anticorpii anti-VHC au fost negativi), cat si un altul, care stabileste in urma unui studiu national observational, seroprevalenta in funtie de grupa de varsta (Ancheta de Evaluare a Sanatatii si a Starii de nutritie – NHANES). Prin aplicarea acestor modele, s-a observat cresterea incidentei cazurilor noi de infectie cu VHC de la sfarsitul anilor 1960 pana la inceputul anilor 1980 [Armstrong,2000]. De asemenea, a fost raportata o incidenta scazuta a infectiei VHC, inainte de anul 1965 (18/100000 locuitori), ulterior observandu-se o crestere constanta a cazurilor de noi imbolnaviri cu VHC pina in 1989 (130/100000 locuitori). Incepind cu anul 1989, incidenta scade drastic, cu mai mult de 80% [Alter, 1997; Armstrong, 2006]. Ultimul studiu NHANES realizat intre anii 2003-2010, pe 30074 participanti, a estimat ca 2,7 milioane de persoane au hepatita C cronica, cu 500000 mai putin, comparativ cu numarul raportat de ancheta observationala realizata anterior, intre anii 1999-2002 [Maxine M. Denniston, 2014]. Potrivit Centrului pentru Controlul si Prevenirea Bolilor (CDC), cu ajutorul modelului Markov, s-a estimat ca seroprevalenta infectiei VHC a atins apogeul in SUA in anul 2001, cand au fost raportate 3,6 milioane persoane cu hepatita C cronica, si ca acest numar va scadea la jumatate pina in anul 2030 [Davis, 2010].

In Australia, rata de noi imbolnaviri cu VHC a pastrat o crestere constanta pina in anul 2001 [Law, 2003]. Astfel incat, intre anii 1995-2001, s-a observat o crestere rapida intre 17000-20000 de cazuri nou diagnosticate. Ulterior, in anul 2005, numarul acestora a scazut la 15000 [AGDHA, 2006] si la 10114 in anul 2012 [http://www.hepatitisaustralia.com/].

Studii analitice observationale realizate in zonele hiperendemice din Taiwan si din Japonia au raportat o rata de incidenta de 110 la 10000 locuitori, respectiv 36 noi cazuri la 10000 persoane, varsta medie a persoanelor fiind de 50 de ani in Taiwan si de 60 in Japonia [Sun, 2001; Okayama,2002 , Tanaka, 2004; Tsai, 2007].

In Egipt, in nordul tarii, incidenta a fost de 0,8 la 1000 de locuitori, iar prevelenta infectiei VHC a fost de 9%; in Delta Nilului, de 6,8 la 1000 de locuitori si prevalenta a fost de 24%. S-a observat ca mai mult de 60% din cazurile diagnosticate cu infectie acuta VHC au fost intalnite la persoane care nu au implinit inca 20 de ani [Mohamed, 2005], si ca exista o incidenta crescuta (1410/100000 locuitori) in randul copiilor mai mici de 10 ani care locuiesc intr-o familie cu unul dintre parinti cu anticorpi anti-VHC pozitivi [Meky, 2006].

In conformitate cu rapoartele OMS, s-a estimat ca in Europa exista o incidenta medie a infectiei VHC de 6,19/100000 locuitori [95% CI, 4,90-7,48] [Muhlberger, 2009] si o seroprevalenta crescuta in randul consumatorilor de droguri injectabile (IDU), raportandu-se rate de 50% in Cipru [Demetriou, 2010], 59,8% in Franta [Jauffret-Roustide, 2009], si 83,2% in Italia [Camoni, 2010].

Deoarece evolutia infectiei VHC este indelungata, in tari ca Japonia si Italia, unde majoritatea infectiilor VHC s-au produs cu mai mult de 30 de ani in urma, este posibil ca magnitudinea complicatiilor hepatice determinate de VHC sa fi atins deja punctul lor maximal, insa in Statele Unite, unde incidenta maxima este mai recenta, nu se poate inca anticipa procentul bolnavilor care vor suferi diferite complicatii datorate infectiei cronice cu VHC. In Egipt, unde ratele infectiei VHC se pastreaza la cote constant ridicate, la toate grupele de varsta, este foarte probabil ca rata complicatiilor sa ramana ridicata mai multe decenii. In Europa, datele despre amplitudinea infectiei VHC sunt limitate, iar infectia VHC este subestimata de catre autoritatile sanitare, se pare insa ca, in prezent s-a atins apogeul complicatiilor hepatice ale acestei infectii [Nikolai, 2009].

1.3. Cai de transmitere ale VHC

Modul de transmitere a infectiei VHC se modifica de la un an la altul, de la tara la tara; chiar si in interiorul aceluiasi stat s-a observat o dinamica in ceea ce priveste factorii implicati in achizitia infectiei.

Cei mai frecventi factori de risc implicati in transmiterea infectiei VHC la nivel global sunt transfuziile de sange de la donorii netestati pentru VHC (cea mai frecventa cale de transmitere inainte de anul 1992,), drogurile injectabile, injectiile terapeutice cu ace nesterile (folosirea acelor nesterilizate fiind insotita frecvent de icter.) si alte proceduri medicale invazive (Tabelul 1).

In timp ce in tarile dezvoltate, infectia cu VHC se transmite cu precadere in urma consumului de droguri injectabile si a transfuziei de sange, in tarile in curs de dezvoltare, utilizarea injectiilor terapeutice cu ace nesterile si a altor proceduri invazive (piercing, tatuare, scarificare, lovirea sau taierea cu un obiect contaminat cu sange) raman calea cea mai comuna de transmitere a infectiei.

Centrul pentru Control si Preventie din SUA estimeaza ca fara existenta politicilor de testare si preventie, aproximativ 1 milion de persoane cu infectie VHC ar deceda din cauza bolilor secundare determinate de virus, pe cand diagnosticarea, preventia si tratamentului corespunzator, ar duce la scaderea cu 70% a riscului de evolutie spre carcinom hepatocelular si cu 50% a mortalitatii [Ngo-Metzger, 2013].

Tabelul 1. Factori de risc implicati in transmiterea infectiei cu VHC.

1.3.1. Utilizarea drogurilor injectabile

In prezent, utilizarea drogurilor injectabile reprezinta calea cea mai eficienta de transmitere a VHC. In majoritatea tarilor dezvolate, unde unitatile de sange transfuzate sunt riguros testate si unde s-au implementat masuri de asigurare a asistentei medicale de buna calitate, principalul factor de risc si mod de transmitere a infectiei VHC ramane consumul de droguri injectabile [Alter, 2011]. In medie, intre anii 2010-2011, consumul de droguri injectabile determina 58% din numarul total de infectii VHC si 41% din cazurile de infectii acute [EMCDDA, 2013].

In China, tara cu cel mai mare numar de IDU, in Mexic, in Pakistan si in Tailanda, mai mult de 80% dintre IDU prezinta anticorpii anti-VHC [Nelson, 2011].

In cadrul unui studiu realizat in SUA, intre anii 1979-2002, s-a raportat ca aproximativ 590000 de tineri, cu varsta cuprinsa intre 18-29 ani, declara in antecedente consum de droguri injectabile si ca aproximativ jumatate (cca 265000 persoane) dintre ei sunt infectati VHC [Armstrong, 2007; Page, 2013]. Alt studiu subliniaza faptul ca seroprevalenta creste o data cu durata consumului de droguri ajungand la 98,7% pentru cei cu istoric al consumului mai mare de 30 de ani [Tseng, 2007].

Intr-o comunicare recenta, Centrul European de Monitorizare a Drogurilor si a Dependentei de Droguri (EMCDDA), raporteaza ca seroprevalenta anticorpilor anti-VHC in randul IDU a fost intre 18% si 80%. Mai mult de jumatate dintre tarile care au raportat aceste date nationale, au o rata a seroprevalentei mai mare de 40%; doar Republica Ceha, Ungaria si Slovenia, au sub 30 % [EMCDDA, 2013]. Aceste variatii importante depind de factorii geografici, comportamentul la risc, statusul socio-economic, subliniindu-se eficienta transmiterii prin contact direct cu sange contaminat [Sutton, 2008].

In Romania, in cadrul unui studiu de tip ancheta comportamentala si serologica [BSS, 2013], in randul IDU din Bucuresti, prevalenta infectiei VHC a fost de 79,3%, majoritatea persoanelor infectate au fost de sex masculin (85,4%), cu varsta cuprinsa intre 35 si 44 ani, cu un istoric indelungat de injectare (peste 10 ani), principalul drog utilizat fiind heroina.

Tarile care se confrunta cu infectii VHC in randul populatiei tinere au in vedere consumul intravenos de droguri ca principala cauza de raspandire a virusului. Multi dintre acesti utilizatori nu stiu ca sunt infectati, astfel incat, screening-ul VHC si tratamentul abuzului de substante sunt de maxima importanta. De asemenea, implementarea in anumite tari a programului de schimb de seringi folosite cu altele sterile, a fost corelata cu reducerea incidentei VHC [Hagedorn and Rice, 2000].

1.3.2. Transfuziile de sange

In trecut, transfuziile de sange sau derivate de sange, reprezentau principalul factorul de risc pentru transmiterea infectiei VHC. La inceputul anilor ’90, implementarea screening-ul donorilor de sange pentru anticorpii anti-VHC, a determinat reducerea ratei de transmitere post-transfuzionala a infectiei VHC de la 3,84%/pacient la 0,5%/pacient (ajungand la 0,03% pe unitate de sange transfuzata) [Donahue, 1992]. De exemplu, in SUA, in jurul anului 1999, s-a introdus testarea donorilor de sange prin determinarea ARN VHC cu ajutorul tehnicii Rt-PCR, utila in perioada de fereastra serologica, inainte de aparitia seroconversiei, obtinandu-se eliminarea aproape completa a transmiterii iatrogene a VHC [Stramer, 2004]. De asemenea, in Anglia, dupa implementarea acestor testari moleculare, numarul donatorilor infectati VHC a scazut de la 1:520000 (1993-98) la 1:30 milioane (1999-2001) [Soldan, 2003]. In anul 2003, in tarile dezvoltate, riscul de transmiterele a infectiei VHC a fost estimat a fi cuprins intre 1:500000 si 1:1000000 unitati de sange transfuzat [Pomper, 2003]. Patru ani mai tarziu, in anul 2007, Parlamentul European a adoptat o declaratie in sensul abordarii terapeutice si diagnostice a VHC. Declaratia, intitulata ''Recomandarile Consiliului in privinta screeningului VHC", releva faptul ca VHC este in mod uzual subdetectat si ca multi pacienti raman nediagnosticati. Astfei incat, Centrul European de Preventie si Control al Bolilor (ECDC), in primul sau raport, a subliniat importanta supravegherii unitare la nivel european a infectiei VHC. Implementarea acestor masuri de supraveghere unitara au determinat in prezent, o seroprevalenta a anticorpilor anti-VHC in sangele donatorilor cuprinsa intre 0.001% si 7.5% [http://www.euro.who.int/en/health-topics/Health-systems/blood-safety/data-and-statistics].

La nivel mondial, 39 din cele 159 de tari care raporteaza date nationale, in special tarile in curs de dezvoltare, nu au programe de testare pentru infectiile transmisibile prin transfuzie de sange, respectiv pentru hepatitele C/B, HIV si sifilis, astfel incat, transfuziile de sange inca raman importante cai de achizitie ale infectiei VHC [http://www.who.int/worldblooddonorday/media/who_blood_safety_factsheet_2011.pdf].

1.3.3. Contactul sexual

Una dintre cele mai controversate arii ale epidemiologiei VHC este reprezentata de transmiterea sexuala a infectiei VHC, mai putin de 0,01% dintre cuplurile heterosexuale, monogame dobandesc in acest mod infectia [Vandelli, 2004]. Desi analiza filogenetica permite stabilirea variantelor virale inrudite genetic intre partenerii sexuali, studiile referitoare la transmiterea sexuala a infectiei VHC sunt controversate din cauza existentei factorilor de risc intricati, respectiv: folosirea in comuna in cadrul cuplurilor a aparatelor de ras, a echipamentelor de injectare etc.

Intr-un studiu in care au fost incluse 500 persoane cu anticorpi anti-VHC pozitivi si anticorpi anti-HIV negativi, impreuna cu partenerii lor sexuali, s-a observat ca prevalenta maxima a infectiei VHC in randul acestora din urma, a fost de numai 1,2%, iar incidenta maxima de 0,07%/an sau 1/190000 contacte sexuale [Terrault, 2013].

Totusi, exista factori care pot creste riscul transmiterii sexuale a infectiei VHC, respectiv: numarul mare de parteneri sexuali intr-o perioada scurta de timp, concomitent cu prezenta bolilor cu transmitere sexuala [Danta, 2007], esec in utilizarea prezervativului, existenta unor leziuni locale, in special la nivelul mucoasei vaginale [Quer, 2003; Halfon, 2001] si prezenta coinfectiei VHC/HIV.

In mai multe orase din Europa, studiile au raportat ca in randul comunitatii de homosexuali, seroprevalenta infectiei VHC variaza intre 4 si 8%, fiind mai mare decat in populatia generala [Boesecke, 2011].

Desi, infectia HIV determina scaderea raspunsul imun celular, astfel incat creste probabilitatea achizitiei infectiei VHC, totusi, este dificil de demonstrat existenta unei cresteri a ratei de transmitere heterosexuala a VHC la un partener neinfectat [Lackner, 2009; Danta, 2011]. De exemplu, in SUA s-a observat cresterea incidentei infectiei VHC in randul homosexualilor HIV pozitivi, cel mai probabil din cauza practicilor sexuale agresive, consumul de droguri injectabile fiind exclus [Garg, 2013].

1.3.4. Transmiterea perinatala

Riscul transmiterii perinatale de la mamele ARN VHC pozitive la fat este estimat a fi de 3-10%. Transmiterea infectiei se realizeaza in special in semestrului III de sarcina, in momentul nasterii sau imediat dupa nastere, fiind influentata de anumiti factori, respectiv de: incarcarea virala mare, durata travaliului, sexul noului nascut, ruptura prematura a membranelor si genotipul virusului [Murakami, 2012]. In cazul mamelor co-infectate HIV, acest risc se coreleaza cu imunosupresia si poate ajunge pana la 20%. Nu exista dovezi ca operatia de cezariana ar reduce riscul de transmitere si ca alaptatul la san ar reprezenta un factor de risc pentru dobandirea infectiei VHC [Ohto, 1994; Pembrey, 2005, El-Shabrawi, 2013].

1.3.5. Hemodializa

Este cunoscut faptul ca pacientii care participa la programele de hemodializa cronica au o rata mai mare a infectie VHC. Desi in acest grup populational, nu s-a stabilit o strategie optima de prevenire a transmiterii VHC, prevalenta anticorpilor anti-VHC ajungand la 15%; totusi in ultimii anii, a fost observata o scadere a acesteia [Fissell, 2004].

1.3.6. Transplantul de organe

Pacientii care au primit transplant de organe de la donatori cu anticorpi anti-VHC pozitivi prezinta un risc crescut de dobandire a infectiei VHC, astfel incat, s-au dezvoltat strategii pentru testarea si utilizarea selectiva a organelor provenite de la acestia [Pereira, 1991]. Transplantul de organe de la persoane cu anticorpii anti-VHC pozitivi, a fost initial indicat doar recipientilor seropozitivi pentru infectia VHC, observandu-se de exemplu, in cazul transplantului renal ca rata de supravietuire la 10 ani, nu a fost influentata de prezenta infectiei VHC [Marco Carbone, 2011].

Recent, in cazul transplantului hepatic, s-a raportat ca la persoanele transplantate din cauza infectatiei VHC, rata de supravietuire nu este afectata, indiferent daca ficatul primit este de la un donor seropozitiv sau seronegativ pentru infectia VHC. In schimb, recipienitii fara infectie VHC care primesc ficat de la un donor cu anticorpi anti-VHC pozitivi, au cel mai scazut scor al modelului pentru boala hepatica terminala (MELD). In urma stabilirii unui model de supravietuire adjustat, s-a ajuns la concluzia ca, mortalitatea nu va creste in cazul unui pacient transplantat din cauza cirozei VHC daca ficatul primit este de la un donor infectat VHC [Northrup, 2008].

1.3.7. Alte cai de transmitere

Utilizarea echipamentului contaminat in cursul procedurilor medicale invazive, a procedurilor din cadrul medicinii traditionale, a tatuarii si a piercing-ului [Haley, 2001] sunt potentiale cai de transmitere ale infectiei VHC, dar fara a reprezenta un risc crescut pentru dobandirea acesteia. Cu toate acestea, pot exista situatii exceptionale de transmitere a infectiei VHC, asa cum s-a intamplat in anul 2007, la o clinica privata de endoscopie din Nevada, unde au fost refolosite seringile de unica folosinta la mai multi pacienti [MMWR, 2008; Fischer, 2010]

Personalul medical este expus riscului de achizitie a infectiei VHC dupa inteparea accidentala cu instrumente nesterilizate, totusi, incidenta aparitiei anticorpilor anti-VHC este sub 2%. Expunerea la VHC fara existenta unei leziuni de continuitate la nivelul tegumentelor, nu a fost asociata cu transmiterea VHC.

1.3.8. Particularitatiile transmiterii infectiei VHC in Romania

La noi in tara, transmiterea VHC, prezinta un trend descendent datorat in primul rand imbunatatirii calitatii serviciilor medicale. Infectia VHC se intalneste cu o prevalenta mai mare la femei, datorita probabil riscului nosocomial sporit, asociat intreruperilor ilegale de sarcina (pana in anul 1989). De asemenea, in randul locuitorilor din zonele rurale, prevalenta a fost crescuta, din cauza varstei medii ridicate, a accesului limitat la serviciile medicale si a folosirii pe scara larga a seringilor din sticla inainte de anul 2000. Factorii de risc pentru achizitia infectiei VHC, cel mai frecventi implicati sunt: interventiile chirurgicale, tratamentele stomatologice invazive, tratamentele injectabile multiple, transfuziile de sange, iar recent, la fel ca in tarile dezvoltate, s-a adaugat si consumul de drogururi injectabile [Gheorghe, 2010]. In ultimii ani, desi a crescut consumul de droguri, exista date limitate cu privire la prevalenta bolilor cu transmitere parenterala prin sange si derivate de sange in randul consumatorilor de droguri injectabile (IDU). In Bucuresti, Agentia Nationala Anti-drog (ANA), a raportat o scadere a numarului de IDU de la 19265 in anul 2011 la 10583 in 2012, o treime fiind cu varsta sub 25 de ani, subliniindu-se faptul ca in randul acestora reutilizarea injectilor reprezinta o practica frecventa, astfel incat prevalenta infectiei VHC are o tendinta ascendenta de la 68,5% in 2011 la 82,4% in 2012 [ANA, 2013].

1.4. Istoria naturala a infectiei VHC

Istoria naturala a infectiei VHC in general, incepe cu o faza acuta, frecvent asimptomatica, doar jumatate dintre pacientii viremici prezinta nivele crescute ale transaminazelor, astfel incat, diagnosticarea se face intr-un stadiu tardiv cand infectia devine cronica, iar optiunile terapeutice limitate.

Infectia acuta cuprinde perioada de sase luni care urmeaza achizitiei infectiei VHC. In majoritatea tarilor dezvoltate, desi incidenta este subestimata din cauza raportarilor limitate, totusi se atinge o rata de 15 cazuri noi la 100000 de persoane per an [Armstrong, 2000]. La un interval de 1-3 saptamani, de la expunerea la factorii de risc ai infectiei VHC, desi simptomele sunt frecvent nespecifice (oboseala, icter, stari asemanatoare gripei, dispepsie si dureri abdominale), poate fi detectat acidul nucleic viral, respectiv nivelul de ARN VHC [Santantonio, 2008]. Primul semn al lezarii hepatice, un nivel crescut de alanin aminotransfera (ALT), apare abia dupa 4-12 saptamani de la infectare, existand intotdeauna fluctuatii sub 1000 UI/L ale acestei transaminaze fara a fi asociate unor leziuni hepatice grave. Evolutia spre hepatita fulminanta este rara, iar seroconverisa, respectiv aparitia anticorpilor anti-VHC apare dupa 4-10 saptamani.

Dupa faza acuta a infectiei VHC, urmeaza fie vindecarea in primele 3 luni (eliminarea definitiva a virusului, normalizarea transaminazelor si mentinerea anticorpilor anti-VHC detectabili multi ani, cu scaderea progresiva a valorii lor) [Gerlach, 2003, Santantonio, 2006], fie cronicizarea in aproximativ 55%-85% din cazuri [McHutchison, 2004; Seeff, 2002].

Evolutia spre rezolutie spontana a infectiei VHC depinde de anumiti factori favorizanti, respectiv de: prezenta simptomelor in faza acuta, a genotipului IL28B C/C favorabil [Thomas, 2009] si de eficienta raspunsului imun [Santantonio, 2008]. Daca prezenta coinfectiei HIV, impiedica eliminarea infectiei VHC [Schnuriger, 2009; Danta, 2008], rolul altor factori precum: tipul expunerii, marimea inoculului, varsta, sexul si expunerea ulterioara la VHC, sunt controversati (Tabelul 2). Un aspect important este reprezentat de faptul ca eradicarea infectiei VHC, spontana sau in urma tratamentului, nu confera protectie, iar reinfectiile cu alte genotipuri sunt frecvente, ceea ce face dificila dezvoltarea unui vaccin eficient.

S-a demonstrat ca, desi nu exista integrare VHC in genomul uman, dezvoltarea unei hepatite C oculte este posibila. La nivel hepatic, VHC se replica activ, fiind posibila cuantificarea nivelului de ARN VHC cu ajutorul tehnicilor moleculare ultrasensibile, in timp ce in plasma, profilul este cel al unei hepatite C vindecate (anticorpii anti-VHC fiind prezenti, transaminazele normale si nivelul de ARN VHC nedetectabil). Diagnosticarea si definirea infectiei oculte VHC ridica suspiciuni asupra eradicarii infectiei si poate avea importante implicatii clinice. Datele din literatura arata ca, rata de recidiva in cazul pacientilor cu succes terapeutic este extrem de scazuta, doar de 2%-3% [Welker, 2009], iar potentialul de evolutie al bolii hepatice este scazut [Pham, 2010; Carreño, 2012]. In anul 2009, a fost descrisa hepatita oculta „criptogenica”, profilul constand in: absenta anticorpilor anti-VHC si a ARN VHC de la nivelul plasmei, acesta din urma, fiind cuantificat in ficat si in polimorfonucleare. Odata obtinuta vindecarea, in marea majoritate a cazurilor, nu a mai fost posibila detectia virusului, nici la nivel hepatic si nici la nivelul polimorfonuclearelor [De Marco, 2009; Castillo, 2004].

Tabelul 2. Factori care influenteaza rata de cronicizare a infectiei VHC.

Hepatita C cronica se defineste prin persistenta viremiei detectabile mai mult de 6 luni. Infectia cu VHC este responsabila la nivel global de 27% din cazurile de ciroza si de 25% din cazurile de carcinom hepato-celular (CHC), determinand mai mult de 350000 de decese anual. Aceste procente pot fi mai ridicate in tarile cu prevalenta crescuta a infectiei, de exemplu in Japonia mai mult de 90% din cazurile de CHC sunt secundare infectiei VHC [Perz, 2006].

In Romania, infectia VHC reprezinta principala cauza a hepatitei cronice (in 64% din cazuri), a cirozei hepatice (in 59% din cazuri) si a indicatiilor pentru transplant (in 35% din cazuri). In plus, pe baza unui model decizional Markov, s-a estimat ca prevalenta cirozei hepatice secundare VHC si a CHC vor continua sa creasca pina in anul 2030 de la 88124 si 1708 cazuri in 2009 la 146209 si 2686 cazuri in 2030 [Gheorghe, 2010].

Manifestarile hepatitei cronice C, variaza de la forma asimptomatica la ciroza si CHC, progresia bolii fiind lenta. Astfel, aproximativ 20-30% din indivizii infectati cronic dezvolta ciroza dupa o perioada de 20-30 ani [Seeff, 2002]. Dupa diagnosticarea cirozei hepatice, supravietuirea la 10 ani este de 80%, la 20 de ani de 40%, cu aparitia progresiva a complicatiilor: hipertensiune portala, insuficienta hepatica cu encefalopatie cronica si CHC. In randul acestor pacienti cirotici, rata de aparitie a carcinomului este intre 1-4%/an [Degos, 2000], astfel incat, se impune recomandarea, din 6 in 6 luni, a masurilor de screening, atat serologic (determinarea alfa fetoproteinei, valori peste 400 mg/dl fiind sugestive pentru aceasta patologie), cat imagistic [Gebo, 2002].

Nu sunt inca deplin intelese diferentele mari in ceea ce priveste progresia bolii hepatice; insa pot fi explicate prin interactiunea complexa dintre factorii gazdei cu cei virali. Dintre factorii implicati in progresia bolii detaliem o parte (insa posibil exista si altii):

Varsta si sexul pacientului: varsta mai inaintata in momentul dobandirii (peste 25) de ani si sexul masculin detremina o progresie mai rapida a bolii hepatice [Svirtlih, 2007]. De exemplu, dupa o perioada de 25 de ani, femeile infectate cu VHC la o varsta frageda, neconsumatoare de alcool, dezvolta ciroza intr-un procent scazut, de 2%, in aceeasi perioda de timp rata progresiei pentru barbatii infectati mai tarziu in viata este semnificativ mai mare, respective de 17% [Wiese 2005, Seeff 2001]. La sexul feminin, odata cu debutul menopauzei, rata de progresie a fibrozei hepatice creste substantial, in schimb terapia de substitutie cu estrogeni si sarcinile multiple pot incetini evolutia bolii hepatice [Di Martino, 2004].

Originea etnica: la pacientii afro-americani s-a observat ca progresia bolii este mai lenta si modificarile histologice mai putin severe [Sterling, 2004, Terrault, 2008].

Inflamatia hepatica: raspunsul inflamator local este influentat probabil de raspunsul imun celular indreptat impotriva antigenelor virale VHC, posibil dependent de alti determinanti genetici, cum ar fi expresia HLA [Hraber, 2007]. In conformitate cu aceasta constatare, nu a fost stabilita inca o corelatie directa, intre nivelul ALT-ului si stadiul bolii hepatice, observandu-se ca un nivel normal al acestei transaminaze, nu se coreleaza intotdeauna cu existent unui ficat sanatos si ca pacientii cu valori persistent normale ale ALT-ului prezinta o progresie lenta a bolii hepatice, [Mathurin, 1998; Puoti, 2012].

Consumul de alcool, cafea, tigari si marijuana: Consumul de alcool creste replicarea VHC, determinand o evolutie mai rapida spre fibroza hepatica. In special, un consum zilnic de 40-50 g reprezinta unul dintre factorii declansatori importanti ai progresiei bolii hepatice, astfel incat, consumul chiar si moderat trebuie interzis pacientilor cu hepatita cronica C, neexistand o cantitate admisa [Gitto, 2008]. Consumul de peste 15 tigari/zi si cel de cannabis determina cresterea activitatii necro-inflamatorii hepatice si ulterior a scorului de fibroza hepatica [Hézode, 2005]. In ultima perioada au fost studiate proprietatiile hepatoprotectoare ale cafelei, astfel incat, consumul regulat a doua cesti pe zi, de cafea proaspat macinata si nu de espresso, se asociaza cu scaderea valoriilor aspartat aminotransferazei (AST), ALT-ului si gama-glutamiltranspeptidazei (GGT) si implicit cu scaderea progresiei bolii hepatice [Modi, 2010; Anty, 2012; El-Serag, 2014]. Mecanismul implicat pare a fi degradarea proteinelor Smad2 si Smad3, care sunt mediatori ai factorului tumoral de crestere TGF-β [Gressner, 2010].

Co-infectiile: progresia bolii este accelerata in cazul pacientilor co-infectati HIV si VHB, determinand cresterea morbiditatii si a mortalitatii. Desi nu este inca clar daca coinfectia VHC/VHB determina progresia fibrozei hepatice, totusi, s-a observat o crestere semnificativa a riscul de aparitie a cirozei si a CHC [Schuppan, 2008]. Infectia VHC este prezenta la mai mult de un sfert dintre persoanele infectate cu HIV, determinand accelerarea progresiei bolii hepatice. Chiar daca tratamentul antiretroviral controleaza replicarea HIV si determina restaurarea statusului imun, scazand rata de morbiditate, totusi progresia rapida spre ciroza nu este inlaturata [Hernandez, 2011; Thein 2008b; Deng 2009].

Alti factori care apartin gazdei:

Prezenta polimorfismului genetic al anumitor gene poate influenta rata de evolutie spre fibroza. In urma unor studii la nivelul genomului uman a fost identificat un polimorfism nucleotidic unic (SNP) situat in regiunea promotorului IL28B, la 3 kb in amonte de gena IL28B (rs12979860). Prezenta alelei T a fost asociata cu evolutia spre boala hepatica terminala, in schimb alela C, confera protectie si determina frecvent cleareance viral, spontan sau in urma tratamentului [Thomas, 2009; El-Awady, 2012].

prezenta steatozei, a rezistentei la insulina, a diabetului zaharat non-insulinodependent, a obezitatii abdominale si a supraincarcarcarii cu fier cresc rata de progresie a fibrozei hepatice [Kawaguchi, 2011; Vagu, 2013].

Factori legati de virus: nivelul viremiei pare a nu influenta progresia bolii, dar genotipul 3 este asociat cu accelerarea progresiei fibrozei, in timp ce multiplele cvasispecii determina trecerea de la faza acuta la cea cronica a infectiei [Bochud, 2009].

Factori de mediu: exista anumite diferente geografice ale progresiei bolii hepatice, de exemplu, s-a observat ca in Japonia, CHC este detectat mai frecvent decat in SUA, desi o explicatie clara nu exista momentan [Lim YS, 2008].

In istoria naturala a infectiei cu VHC sunt intalnite uneori manifestarile extrahepatice, dar pana in prezent, nu s-a stabilit daca acestea sunt produse direct de virus sau ca urmare a progresiei bolii hepatice. Replicarea virala a fost observata si in tesuturile extrahepatice, de exemplu in maduva osoasa, sistemul nervos central, glandele endocrine, nodulii limfatici, splina, macrofage, monocite, astfel incat infectia VHC a fost frecvent asociata cu modificari ale statusului imun, cu bolii imunologice sau autoimune [Sansonno, 2005]. Cel mai frecvent intalnita este crioglobulinemia, la peste 50% dintre pacienti. Forma simptomatica a bolii apare doar la 1% din cazuri si se manifesta prin: senzatie de slabiciune, rash cutanat/eruptie cutanata de scurta durata (tranzitorie), dureri articulare, edeme renale, neuropatie, sindrom Raynaud, prezenta in ser a crioglobulinelor, a factorului reumatoid si a titrului scazut de complement seric. Alte posibile manifestari extrahepatice [Zignego AL, and Craxi A, 2008] diagnosticate la pacientii cu hepatita C sunt:

tiroidita autoimuna, prezenta autoanticorpilor circulanti

glomerulonefrita membrano-proliferativa

porfiria cutanata tardiva, lichenul plan

diabetul zaharat

CAPITOLUL 2 –STRUCTURA VIRUSULUI HEPATITEI C

2.1. Structura si organizarea genomica a virusului hepatitei C

VHC este un virus cu genom ARNss cu polaritate pozitiva, anvelopat, cu o capsida icosaedrica. Virionii au forma sferica si diametrul de 50-55 nm [Heller, 2005; Wakita, 2005; Yu, 2007], iar in vivo, in sangele indivizilor infectati, circula fie liber, fie legati de: lipoproteinele de densitate foarte joasa (VLDL), cele de densitate joasa (LDL), de imunoglobuline [Bradley, 1991; Thomssen, 1992; Thomssen, 1993; Agnello, 1999; Andre, 2002]. Prin ultracentrifugare in gradient de sucroza, s-a stabilit ca densitatea virionilor VHC variaza intre 1,06 si 1,25g/ml. Particulele cu densitate joasa contin virioni infectiosi si se asociaza in principal cu lipide si lipoproteine, in timp ce, particulele cu densitate mare se asociaza cu imunoglobuline si probabil au o infectivitate mai mica [Hijikata, 1993; Andre, 2002].

S-a observat ca proportia intre particulele cu densitate mica si cele cu densitate mare variaza in cursul infectiei, in functie de stadiul bolii hepatice. Aceste observatii sugereaza ca asocierea dintre lipoproteine si VHC este extrem de importanta pentru infectivitate, deoarece VHC intra in hepatocit prin receptorul LDL [Agnello, 1999; Nahmias, 2006]. De altfel, se presupune ca asocierea cu LDL si/sau VLDL protejeaza virusul impotriva neutralizarii de catre anticorpii specifici anti-VHC [Tao, 2009].

Pentru traducerea proteinelor virale, genomul VHC serveste direct ca ARNm si contine un singur cadru de citire deschis (ORF), care codifica un polipeptid format din aproximativ 3000 de aminoacizi, flancat de regiunile 5’ si 3’ netraduse (NTR). Regiunile netraduse contin secvente nucleotidice cu rol important in reglarea replicarii virale, sunt inalt conservate si reprezinta tinte ideale pentru perfectionarea tehnicilor de diagnostic molecular si pentru dezvoltarea noilor agenti terapeutici sau a potentialelor vaccinuri anti-VHC.

In timpul replicarii virale, poliproteina este clivata de enzime virale si celulare, in 3 proteine structurale (proteina core si proteinele anvelopei: E1, E2) si 7 proteine nestructurale (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B). Proteinele structurale sunt parti importante ale virionilor, in timp ce proteinele nestructurale sunt implicate in replicarea si morfogeneza virala [Moradpour, 2007]. A fost descrisa o proteina suplimentara, proteina F (frameshift) sau ARF (cadru de citire alternativ-alternate reading fram), rezultata prin traducerea regiunii core intr-un cadru de citire alternativ [Varaklioti, 2002; Branch, 2005; Chang, 2013; Hoffman, 2011] (Figura 1).

Figura 1. Organizarea genomica a VHC.

Regiunea 5’netradusa este o regiune inalt conservata a genomului VHC, formata din 341 de nucleotide, localizata in amonte fata de codonul ce initiaza traducerea cadrului de citire deschis (ORF), fiind necesara unei replicari virale eficiente. Aceasta regiune are o structura secundara complexa cu 4 domenii distincte (I-IV) [Fukushi, 1994; Honda, 1999] ce contin numeroase bucle (stem-loops) si un pseudo-nod. Domeniile II, III, IV impreuna cu primele 12-30 nucleotide ale regiunii ce codifica proteina core formeaza situsul intern de intrare ribozomala (IRES), implicat in legarea de subunitatea 40s a ribozomilor si initierea traducerii poliproteinei [Fukushi, 1994; Honda, 1999].

Interactiunile specifice ale IRES cu factorii eucariotici de initiere a sintezei proteice eIF2 si 3 (GTP si ARNt initiator) [Spahn, 2001; Otto, 2002; Sizova, 1998], sugereaza posibilitatea modularii celulare a traducerii poliproteinei virale. Daca mutatiile aparute in domeniul IV au impact redus asupra activitatii IRES, cele din domeniul III, de exemplu G266A sau G268U, pot scadea activitatea acestuia [Barria, 2009].

Traducerea ARN-ului determina sinteza poliproteinei virale. Studii in vitro, arata ca un microARN specific (miRNA) izolat in special din ficat, respectiv miR-122, are capacitatea de a creste replicarea virala in urma legarii de IRES [Jopling, 2005]. In vivo, cantitatea intrahepatica de miR-122 si nivelul plasmatic de ARN VHC, nu s-au corelat, in schimb pacientii care nu raspund la tratamentul standard VHC, au o concentratie intrahepatica de miR-122 semnificativ scazuta [Sarasin-Filipowicz, 2009].

Regiunea 3’netradusa contine aproximativ 225 nucleotide fiind formata din trei domenii diferite din punct de vedere functional: o regiune variabila, un tract poli U/UC si o coada X cu o structura inalt conservata [Kolykhalov, 2000; Blight, 1997]. Regiunea variabila, formata din aproximativ 40 de aminoacizi (aa), este bine conservata in cadrul aceluiasi genotip si nu parea a fi esentiala replicarii virale, desi mici deletii la acest nivel duc la o scadere semnificativa a eficientei replicarii virale [Friebe, 2002]. Lungimea regiunii poli U/UC variaza de la 30 la 80 nucleotide in functie de tulpina de VHC [Kolykhalov, 2000]. Coada X, un domeniu inalt conservat format din 98 nucleotide, este compus din trei bucle (stemloops) (SL1-SL3), deletia sau substitutia nucleotidica in aceasta zona generand mutatii letale pentru virus [Kolykhalov, 2000; Friebe, 2002; Yi, 2003]. Intre SL2 si o portiune complementara a NS5B a fost descrisa o interactiune numita „kissing-loop” [Friebe, 2005], care induce o structura tertiara genomului VHC, esentiala replicarii virusului in vitro [Friebe, 2005; You, 2008].

Proteina core cuprinde 3 domenii distincte: un domeniu hidrofil N-terminal de 120aa, un domeniu hidrofob C-terminal de aproximativ 50aa si un domeniu format din aminoacizii restanti (aproximativ 20aa) care functioneaza ca peptida semnal pentru proteina E1. Domeniul C-terminal este responsabil de asocierea proteinei core cu membrana reticulului endoplasmic. La nivelul acestuia, in timpul traducerii, proteina core este clivata de o peptidaza semnal celulara (SP) [McLauchlan, 2002; Yasui, 1998]. Poliproteina de 191aa, cunoscuta si ca p23 este in continuare procesata de peptidil- peptidaza-semnal (SPP) care va elimina secventa semnal E1, rezultand proteina core matura de 179aa [McLauchlan, 2002; Weihofen, 2002], cu o greutate de 21 kDa. Domeniul N-terminal are rol in asamblarea particulei virale si legarea ARN-ului viral [Ait-Goughoulte, 2006].

Doua domenii au fost identificate in forma matura a proteinei core. Domeniul I, de aproximativ 120aa are probabil functii reglatorii, fiind implicat atat in morfogeneza virala (asamblarea particulei virale, legarea ARN-ului viral), cat si in modularea traducerii genomului viral [Ait-Goughoulte, 2006; Hope, 2000]. Domeniul II, localizat intre aminoacizii 120-175, este o regiune cu caracter hidrofobic care formeaza doua alfa-helixuri. Are rol in asocierea proteinei core de membrana reticulul edoplasmatic si de particulele lipidice [Ait-Goughoulte, 2006 ; Boulant, 2006; Jhaveri, 200] .

Analize genetice mai amanuntite arata faptul ca proteina core poate fi implicata in diverse procese celulare: semnalizare celulara, apoptoza, metabolism lipidic si carcinogeneza [Tellinghuisen, 2002]. Top of Form

Glicoproteinele E1 si E2. Dupa regiunea core, se gaseste portiunea codanta pentru cele doua glicoproteine ale anvelopei, E1 (gp35; 192aa) si E2 (gp70; 363aa ). Aceste doua glicoproteine transmembranare, cu un capat C terminal si unul N terminal, sunt clivate din poliproteina precursoare de catre o peptidaza semnal celulara, in timpul traducerii din reticulul endoplasmatic. Glicoproteinele E1 si E2 sunt alcatuite dintr-un domeniu hidrofilic mare (160aa si respectiv 334aa) si un domeniu transmembranar, situat in regiunea C-terminala, de 30 aa, responsabil de atasarea la reticulul endoplasmatic. E1 si E2 interactioneaza si formeaza un heterodimer care este prezent la suprafata reticulului endoplasmatic, fiind implicat in adsorbtia virusului la presupusii sai receptori: tetraspanina CD81 si un receptor lipoproteic cu densitate scazuta, ce determina fuziunea anvelopei virale cu membrana celulei gazda [Lindenbach, 2005; Cocquerel, 2006; Blanchard, 2006; Wunschmann, 2000]. E1 si E2, in interiorul reticulului endoplasmatic trec printr-o glicozilare N-linkata (Duvet, 2002). In E2 au fost identificate trei regiuni hipervariabile, HVR1, HVR2 si HVR3 ce difera prin mai mult de 80% in secventa lor de aminoacizi in cadrul genotipurilor si subtipurilor (Weiner, 1991; Kato, 2001). HVR1 este formata din primii 27aa ai E2; HRV2 este formata din 7aa (pozitia 91-97), iar regiunea recent descoperita HVR3, localizata intre celelalte 2, este alcatuita din 35aa, fiind cea mai putin variabila [Troesch, 2006]. Variabilitatea crescuta a acestor domenii reflecta expunerea acestora la anticorpii specifici anti-VHC, de exemplu, s-a demonstrat ca regiunea HVR2 ar fi cea mai importanta tinta pentru anticorpii neutralizanti [Shimizu, 1996b; Khan, 2014]. Dezvoltarea unor vaccinuri eficiente, inductoare de anticorpi neutralizanti, ramane si la ora actuala o provocare, deoarece in genomul viral apar in permanenta mutatii sub presiunea raspunsului imun umoral.

Proteina p7 este un oligomer membranar de 63aa, localizat in reticulul endoplasmatic intre E2 si NS2, unde formeaza un canal ionic [Haqshenas, 2007; Pavlovic, 2003; Griffin, 2003]. Proteina p7 nu este indispensabila replicarii virale, dar este esentiala formarii de particule virale infectioase [Sakai, 2003; Haqshenas, 2007]. Studii recente au evidentiat ca proteina p7 pare a avea un rol important in asamblarea virala si in eliberarea virionilor infectiosi [Wozniak, 2010]. Functiile proteinei p7 fac din ea o potentiala tinta pentru terapiile viitoare. De exemplu, studiile clinice in care se utilizeaza o molecula (BIT225) care inhiba activitatea functiei de canal ionic a proteinei p7, raporteaza rezultate promitatoare [Luscombe, 2010].

NS2 (p21) este o proteina transmembranara neglicozilata, cu o lungime de 217 aa si greutate moleculara de 21-23 kDa. Impreuna cu capatul amino-terminal al proteinei NS3, formeaza cistin proteaza NS2-3 care va cliva poliproteina precursoare intre NS2 si NS3 [Grakoui, 1993b]. Capatul N-terminal al proteinei NS2 este rezultatul separarii sub actiunea peptidazelor semnal celulare a legaturii intre p7 si NS2. NS2 are un timp de viata scurt, isi pierde activitatea proteazica dupa ce se auto-cliveaza de NS3 si se pare ca are un rol important in morfogeneza virala [Pietschmann, 2006; Jones, 2007].

NS3-NS4A. Proteina NS3 (p70,631aa) este constuita dintr-un domeniu cu activitate serin-proteazica in treimea amino-terminala (de 189aa) si un domeniu cu activitate helicazica/ATP-azica in cele doua treimi carboxi-terminale (de 442aa). Activitatea serin-proteazica a NS3 depinde de formarea unui heterodimer stabil cu regiunea NS4A care este alcatuita din 54aa [Failla, 1995] si mediaza legarea domeniului NS3 la reticulul endoplasmatic, rezultand o crestere semnificativa a stabilitatii NS3 [Wölk, 2000]. Domeniul NS3 este implicat in numeroase interactiuni dintre gazda si virus, fiind o tinta majora pentru noile terapii antivirale cu actiune directa [Poordad, 2011; Bacon, 2011; Jacobson, 2011; Forns, 2014]. NS4A protejeaza proteaza NS3 de actiunea proteolitica si creste activitatea acesteia, prin schimbarea conformationala a situsului catalitic. Proteaza NS3-NS4A catalizeaza clivarea poliproteinei VHC la jonctiunea intre NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A si NS5A/NS5B [Neddermann, 1997]. Functia proteazica a NS3 este esentiala infectivitatii virale. Helicaz-ATP-aza NS3 face parte din superfamilia 2 de helicaze, DExH box. Enzimele din aceasta familie sunt in masura sa separe catenele de ARN cu polaritate pozitiva, de cele cu polaritate negativa in timpul replicarii virale si sa elimine structurile secundare ale ARN-ului cu scopul de a permite accesul ARN polimerazei la regiunile 5' si 3' noncodante. Pentru realizarea acestor modificari conformationale helicaza NS3 foloseste energia obtinuta din hidrolizarea ATP [Serebrov &Pyle, 2004; Jennings, 2008].

NS4B (p27) este o proteina membranara formata din 261aa, cu patru domenii transmembranare [Welsch, 2007], dintre care cel N-terminal are caracter amfipatic, mentinand proteina atasata de reticulul endoplasmatic [Hugle, 2001]. Se presupune ca determina modificarea membranelor reticulului endoplasmatic, ducand la formarea unui complex replicativ, in care vor interactiona proteinele structurale si cele nestructurale ale VHC [Egger, 2002; Gosert, 2003]. Regiunea NS4B este esentiala replicarii virale [Paredes, 2008; Aligo, 2009] si de aceea este o tinta interesanta in dezvoltarea terapiilor antivirale sau a vaccinurilor [Gu, 2013].

NS5A (p56; 458aa) este o zinc metalo-proteina fosforilata, membranara, fara activitate enzimatica, dar cu rol important in formarea complexului replicativ si in asamblarea particulei virala. Are doua forme: o forma de 56 kDa putin fosforilata si una hiperfosforilata de 58 kDa care regleaza in sens negativ replicarea virala [Appel, 2005b]. Proteina contine 3 domenii, dintre care doar cele doua fosforilate au fost caracterizate din punct de vedere structural [Tellinghuisen, 2008]. Domeniul I de la capatul N-terminala al NS5A (aa 1-30) contine un α-helix amfipatic necesar si suficient pentru asamblarea complexului replicativ, prin coordonarea interactiei intre proteinele non-structurale virale cu proteinele celulare, ca de exemplu cu proteina hVAP-A. Aceasta proteina celulara, localizata in reticulul endoplasmatic si in aparatul Golgi, interactioneaza atat cu NS5A, cat si cu NS5B, fiind implicata in traficul intracelular vezicular [Hamamoto, 2005]. NS5A si NS5B se leaga in mod egal si de hVAP-B, ceea ce determina scaderea expresiei genice a NS5B si diminuarea productiei de ARN viral [Hamamot, 2005]. Domeniul III are un rol semnificativ in asamblarea particulei virale, eliminarea acestuia ducand la stoparea productiei de virioni infectiosi, cu acumularea proteinelor VHC la suprafata picaturilor lipidice [Appel, 2008]. NS5A actioneaza probabil prin recrutarea unor kinaze specifice (fosfatatidilinositol kinaza 4, subtipul IIα-PI4KIIIα), stimuland activitatea acestora si productia locala de fosfatidil inozitol fosfat [Gao, 2010; Moradpour, 2007]. Acesta determina recrutarea unor factori celulari de tipul ciclofilinelor A si B, care va provoca izomerizarea cis-trans, necesara replicarii virale. Se presupune ca membranele intracelulare reprezinta un suport pentru complexul replicativ [Moradpour, 2007], modificari conformationale ale acestora generand formarea asa-numitei retele membranare (“membranous web”), bogata in steroli [Reiss, 2011].

De asemenea, NS5A contine o regiune alcatuita din 40aa, regiune ce determina sensibilitate la IFN alfa (ISDR), care are un rol important in raspunsul la terapia cu IFN alfa [Enomoto, 1996], prin inhibarea protein-kinazei R [Gale, 1998]. Noii agenti terapeutici care vizeaza acest domeniu, probabil vor deveni, cele mai eficiente molecule anti VHC descoperite [http://www.natap.org/2013/HCV/013113_03.htm].

NS5B este o proteina membranara formata din 591aa. Ea reprezinta ARN polimeraza ARN dependenta [Behrens, 1996]. Regiunea C-terminala se fixeaza in membrana reticulului endoplasmatic, iar situsurile active ale polimerazei sunt localizate in citoplasma [Schmidt-Mende, 2001]. Domeniile citoplasmatice prezinta o structura 3D de “mana-dreapta”, cu subdomeniile: ”palma”, “degete”, “police” [Ago, 1999; Bressanelli, 1999]. Subdomeniile “degete” si “police” formeaza un loc inchis, activ, un tunel spre care este ghidat ARN-ul monocatenar avand rol in legarea nucleotidelor trifosforice care asigura sinteza catenelor negative si pozitive de ARN viral [Lesburg, 1999]. NS5B este o enzima predispusa la incorporari nucleotidice gresite, cu o rata de 10-3 per nucleotid, per generatie. Nu dispune de niciun mecanism de corectie a incorporarilor gresite de nucleotide, ceea ce genereaza un numar mare de mutatii. Acestea, impreuna cu replicarea virala crescuta explica heterogenitatea genomica ridicata a VHC. ARN-polimeraza ARN-dependenta reprezinta una dintre tintele importanta pentru noilor terapii cu actiune antivirala directa [Biswal, 2006; Stedman, 2014].

Proteina F (frameshift) sau ARF (cadru de citire alternativ) sau core+1 este o proteina cu o durata de viata scurta de aproximativ 10 min [Roussel, 2003], rezultata in urma schimbului ribozomal -2/+1 intre codonii 8 si 11 din regiunea core fiind descrisa suplimentar fata de cele 10 proteine VHC [Walewski, 2001; Varaklioti, 2002]. Determinarea anticorpilor anti-F in plasma persoanelor infectate, arata ca pe parcursul infectiei in vivo, proteina se exprima [Komurian-Pradel, 2004; Gao, 2008]. Functiile proteinei ARF in cadrul ciclul replicativ, raman a fi elucidate. Desi pare a nu fi esentiala pentru replicarea virala sau pentru producerea de virioni infectiosi, totusi poate actiona ca un factor reglator fiind implicata in cronicizarea infectiei [Vassilaki, 2008; Branch, 2005].

2.2. Ciclul replicativ al virusului hepatitis C

Ciclul replicativ al virusului hepatitei C a fost dificil de investigat din cauza absentei unui model animal si a unor sisteme de replicare in vitro. Descoperirea recenta a unor astfel de sisteme a oferit posibilitatea analizei detaliate a etapelor replicarii virale.

2.2.1. Modele de studiu ale ciclului viral

Studiul virusului hepatitei C a fost initiant in anii '70, existenta acestuia confirmandu-se in anul 1989. Ulterior, au trecut mai mult de 10 ani pana la identificarea receptorilor celulari specifici celulei gazda care potenteaza infectivitatea virala, si mai mult de 20 ani pina la descoperirea unui sistem in vitro de replicare a virusului si de formare a particulelor virale.

Izolarea virusului pe animale de laborator

Cimpanzeul este singurul animal care poate dezvolta o infectie VHC ce reproduce infectia umana din punct de vedere al semnelor clinice si al progresiei bolii. ARN-ul viral a fost detectat la cateva zile dupa contactul infectant, fiind insotit de cresterea transaminazelor [Farci, 1996]. Raspunsurile imune (celulare si umorale) sunt asemanatoare cu cele umane, dar procentul de cronicizare este mai scazut, iar leziunile hepatice inflamatorii sunt minore. Din cauza costurilor ridicate si a considerentelor etice, acest model animal de izolare virala a fost abandonat.

Au fost dezvoltate noi modele animale, ca de exemplu, soarecii imunosupresati carora li s-a distrus ficatul si li s-a transplantat o xenogrefa de hepatocite umane infectate cu VHC, obtinandu-se titruri virale ridicate si infectii persistente [Mercer, 2001], dar si acest model, s-a dovedit a fi dificil de implementat.

Alte modele de studiu ale biologiei VHC

Sunt cunoscute mai multe tipuri de interactiuni VHC – celula gazda care au permis studierea glicoproteinelor anvelopei virale (E1, E2) [von Hahn T, 2008]. Ulterior, prin eliminarea domeniului transmembranar E2 a fost secretata forma solubila (sE2) si au fost identificati 2 receptori presupusi a fi specifici VHC (SR-BI si CD81) [Michalak JP, 1997] (Tabelul 3).

Modificand un sistem baculovirus, s-a reusit producerea unor cantitati mari de particule asemanatoare VHC (VHC-LP) care codifica proteinele structurale ale VHC (capsida, E1 si E2) si o parte din IRES. Proteinele produse se auto-asambleaza in particule virale care nu se pot replica, dar care reprezinta potential candidati pentru producerea unui vaccin [Elmowalid, 2007].

VHCpp (pseudo-particulele VHC) au fost realizate cu scopul studierii fazelor timpuri ale replicarii virale, prin transfectia a trei vectori in linia celulara 293T [Bartosch, 2003a]. Primul vector exprimă proteinele retrovirale gag si pol, responsabile de inmugurirea virala prin membrana plasmatica si de incapsidarea ARN-ului. Al doilea vector contine semnalul de incapsidare necesar pentru formarea de particule virale in amonte de gena reportoare (proteina cu fluorescenta verde – Green Fluorescent Protein (GFP) sau luciferaza). Al treilea vector codifica glicoproteinele E1 si E2, necesare tropismului viral si fuziunii VHCpp cu membrane celulara (Figura 2).

Figura 2. Model experimental pentru producrea pseudo-particulelor VHC [adaptat dupa Ashfaq et al., 2011].

Linia celulara 293T secreta aproximativ 105 VHCpp/ml care pot infecta linia Huh-7 si care sunt neutralizate de anticorpii monoclonali anti-E1, E2. Acest model reprezinta totodata un instrument important pentru identificarea inhibitorilor internalizarii VHC si pentru studiul mecanismelor fuziunii virale [Bartosch, 2003b; Owsianka, 2005].

Sistemele replicon permit replicarea genomului VHC modificat in diferite linii celulare hepatice, identificarea tipurilor celulare permisive pentru infectia VHC si a mutatiilor adaptative care insotesc infectia VHC in vitro [Lohmann, 1999].

Repliconii pot fi subgenomici (cu proteine nestructurale) sau genomici (includ intreg genomul VHC). Ambele tipuri de repliconi contin gena pentru enzima neomicin fosfo-transferaza. Realizarea unui replicon bicistronic care include regiunea IRES a virusului encefalomiocarditei care a fost inserata inaintea genelor non-structurale VHC derivate dintr-o gena promotor T7, a permis transfectia linei celulare Huh-7 si observarea replicarii ARN VHC in prezenta antibioticului G418 [Lohmann, 1999]. Alte studii au confirmat aceste rezultate si au demonstrat ca nivelul ridicat al replicarii virale se coreleaza cu aparitia unor mutatii adaptive in regiunile NS3, NS5A si NS5B [Blight, 2003] care amplifica replicarea in vitro, insa clona nu a fost infectioasa in vivo la cimpanzei [Bukh, 2002, Lohmann, 2003]. Mutatiile adaptative din regiunea NS5A determina rezistenta la interferon [Blight, 2002].

Anul 2005 a fost determinant pentru dezvoltarea unui sistem celular ce permite reproducerea in vitro a unui ciclu infectios complet, utilizand o tulpină VHC, care produce si elibereaza particule infectioase in culturi celulare Huh-7 (VHCcc) [Wakita, 2005; Lindenbach, 2005; Zhong, 2005]. Tulpina clonata a fost izolata de la un pacient japonez infectat cu genotipul 2a si diagnosticat cu infectie VHC acuta severa. Aceasta clona unica a fost raspunzatoare de producerea hepatitei fulminante japoneze 1 (JFH-1). Descoperirea VHCcc a reprezentat inceputul studiului in vitro al intregului ciclul de viata al VHC. Spre deosebire de toate modelele VHC testate anterior, infectia cu JFH-1 a celulelor hepatoma determina eliberarea de particule virale progenitoare infectioase, atat pentru cimpanzei, cat si pentru soarecii transplantati cu hepatocite umane infectate [Lindenbach, 2006].

HCVcc confirma concluziile majore rezultate in urma studiului modelului VHCpp si permite identificarea de noi co-receptori VHC. Izolarea cu succes a JFH-1 a deschis calea dezvoltarii mai multor tipuri de VHCcc carora li s-a imbunatatit cinetica si randamentul prin crearea unor himere folosind regiunea C-NS2 dintr-un izolat viral diferit, dar tot cu subtipul 2a, numite J6 [Lindenbach, 2005].

Genele structurale ale JFH1 par a avea o capacitate intrinseca de asamblare si/sau eliberare a virusului mai mica. Această ipoteza este sustinuta intr-un studiu recent in care productia in cultura de virus himeric intergenotipic si intragenotipic a fost comparata cu cea a JFH1 [Pietschmann, 2006]. Titrurile cele mai mari au fost obtinute cu J6JFH1 recombinant.

Tabelul 3. Modele de studiu ale ciclului replicativ al VHC.

In vitro, a fost creat un sistem complet de replicare HCVcc folosindu-se genotipul 1a al VHC, numit H77-S si care s-a dovedit a fi infectios pentru cimpanzei, totusi, cu un grad de infectiozitate mai scazut comparativ cu JFH-1 [Aly, 2012].

De exemplu, pe modele de soareci umanizati (cu gene si tesuturi transferate de la om), care exprima proteinele CD81 si occludina (OCLD) a fost demonstrata internalizarea VHC, doar ca in vivo, infectia este limitata de catre raspunsurile imune mediate celular si umoral. Scaderea imunitatii acestor soareci cu ajutorul imunosupresoarelor determina obtinerea unei viremii detectabile in cel mult cateva saptamani. Acest model ofera noi oportunitati pentru studiul infectiei VHC, reprezentand o platformă preclinica importanta pentru testarea noilor molecule antivirale si pentru evaluarea eficacitatii unui potential vaccin [Dorner, 2013].

Dezvoltarea acestor sisteme in vitro a sporit considerabil intelegerea noastra cu privire la anumite aspecte cheie ale ciclul de viata al VHC.

2.2.2. Ciclul replicativ

Elucidarea ciclul replicativ detine importante implicatii clinice, mai ales, din cauza identificarii potentialor tinte pentru noile molecule terapeutice. Principalele proteine implicate in etapele ciclului replicativ VHC sunt enumerate mai jos, o parte fiind detaliate pe parcursul acestui capitol [Kim, 2013; Hoffman, 2011]:

Proteinele structurale:

E1/E2 – glicoproteine transmembranare (Inconjoara particula virala, avand rol important in internalizarea virala via receptori de adeziune si fuziune).

Proteinele non-structurale:

p7 – Proteina care formeaza canal ionic (Importanta in asamblarea si eliberarea virusului).

NS2/NS3 – Proteaza virala (Tinta cheie pentru noile molecule antivirale).

NS4A – Cofactor al proteazei NS3 (Formeaza un complex stabil cu NS3).

NS4B – Induce formarea retelei membranoase.

NS5A – Zn metalo-proteina dimerica (Leaga ARN-ul viral, diferitii factori din partea gazdei in vecinatatea proteinei core si a picaturilor lipidice).

NS5B – ARN polimeraza ARN dependenta (Sinteza unui nou genom viral).

Proteinele implicate in atasarea virusului:

HVR1 – Regiunea hipervariabila din cadrul glicoproteinei E2 (Posibil rol de epitop neutralizant, initiaza atasarea virala la receptori/co-receptori).

LVP – Complex de lipoproteine (apoE, apoB, apoC1, apoC2, and apoC3) (Influenteaza internalizarea VHC).

LDLR – Receptor pentru LDL (Ataseaza VHC si declanseaza internalizarea).

Proteinele implicate in etapa de internalizarea a virusului:

SRB1 – Receptor glicoproteic, cunoscut ca fiind receptorul principal pentru HDL (Impreuna cu CD81 promoveaza atasarea de regiunea E2 a virusului).

CD81 – Include 4 domenii transmembranare (Implicat in atasare, morfogeneza, replicarea si diferentiere, rol in atasarea de E2).

CLDN1 – Proteina care formeaza un schelet de jonctiuni stranse (Posibil interactioneaza cu CD81, dar nu interactioneaza direct cu VHC).

OCLN – Proteina care formeaza un schelet de jonctiuni stranse (Implicata intr-o etapa mai tarzie a internalizarii, dupa SRB1 si CD81).

EGFR – Receptor tirozin kinazic (RTK) (Reglementeaza interactiunile dintre CD81 si CLDN1 precum si fuziunea membranelor; transmiterea intercelulara a VHC).

EphA2 – Receptor tirozin kinazic (RTK) (Reglementeaza interactiunile dintre CD81 si CLDN1 precum si fuziunea membranelor; transmiterea intercelulara a VHC).

NPC1L1 – Receptor hepatocitar pentru colesterol (Factor pentru internalizarea VHC).

2.2.2.1. Etapa de eclipsa

Replicarea VHC incepe cu interactiunea dintre glicoproteinele anvelopei virale (E1, E2) si receptorii de la nivelul membranei plasmatice. Modul de intrare a virusului in celula tinta se realizeaza in etape, iar adsorbtia virusului la celula tinta reprezinta primul pas al fazei de eclipsa. Virionii VHC liberi sau legati de apolipoproteine, interactioneaza in cascada cu numerosii receptori prezenti la suprafata celulei hepatice [Zeisel, 2013]. Este posibil ca legarea de celula tinta sa fie initiata de interactiunea dintre glicoproteina anvelopei E2 cu glicozaminoglicanul heparan sulfat (GAGs), prezent pe suprafata celulei gazda [Barth, 2003; Heo, 2004] sau cu receptorii pentru lipoproteine (LDLR), insa candidatul cel mai potrivit pentru a indeplini functia de receptor al VHC este tetraspanina CD81, o molecula de 25kD, ubicuitara, exprimata pe suprafata unui numar mare de celule, inclusiv a hepatocitelor si a limfocitelor [Pileri, 1998]. Atasarea experimentala a anticorpilor anti-CD81 de CD81 inhiba intrarea VHC in celulele Huh-7 si in celulele hepatocitare umane primare [Cormier, 2004; Zhang, 2010; Lindenbach, 2005; Flint, 2006]; in timp ce liniile hepatocitare HepG2, care nu exprima CD81, devin sensibile la infectie, prin transfectarea cu CD81 [Wakita, 2005].

Susceptibilitatea hepatocitelor fata de VHC este determinata nu numai de prezenta tetraspaninei CD81, dar si de numarul de molecule CD81 de pe suprafata lor [Laguno, 2007]. Daca exprimarea simultana de CD81 si EWI-2wint, va determina blocarea internalizarii virusului in celula hepatica, atunci absenta acestui inhibitor natural al CD81, respectiv a EWI-2wint, ar putea explica internalizarea virusului in hepatocit si hepatotropismul VHC [Potel, 2013]. CD81 are rol important in infectivitatea virala deoarece activeaza GTP-aza proteinei rho care determina remodelarea filamentelor de actina si relocarea complexului E2/CD81 interhepatocitar unde se realizeaza contactul celula-celula si unde se afla CLDN1 si OCLD. CD81 activeaza intracelular calea de semnalizare Ras (GTPaza mica)/Raf (serin-treonin protein kinaza (c-Raf))/MEK (mitogen-activated protein kinase (protein-kinaza activata de mitogeni))/ERK (extracellular signal-regulated kinase (kinaza reglata de semnalele extracelulare)), implicata in etapa post-internalizare si posibil in replicarea virala [Brazzoli, 2008]. Rolul exact al CD81 in mecanismele replicarii virale urmeaza a fi elucidat, totusi, in hepatocitele care exprima receptorul CD81, replicarea virala este mai eficienta [Zhang, 2010]. Studii recente au aratat ca CD81 este necesar, dar nu este suficient in etapa de intrare a virusului si ca sunt necesari co-factori, de exemplu, receptorul scavenger tip I (SR-BI) [Bartosch, 2003b; Hsu, 2003; Kapadia, 2007].

Multe molecule implicate in metabolismul lipidic sunt esentiale in aceasta etapa: receptorul scavenger tipul 1 clasa B (SR-B1) (principalul receptor pentru HDL), receptorul LDL si, mai recent identificat, receptorul Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1L1), exprimat doar in hepatocitele umane si in cele provenite de la primate. Se presupune ca NPC1L1 mediaza indepartarea colesterolului asociat virionilor si determina modificari structurale ce faciliteaza internalizarea virusului [Sainz, 2012].

SR-BI este o proteina exprimata pe suprafata majoritatii celulelor animale. Actioneaza ca un receptor pentru LDL si pentru HDL [Rhainds, 2004] evidentiind rolul lor in infectivitatea virala. Mecanisme alternative de splicing ale transcriptului SR-BI, duc la exprimarea unei izoforme secundare ale receptorului, SR-BII, care, de asemenea poate fi implicata in etapa de intrare a virusului in celula tinta [Grove, 2007]. Mecanismele exacte ale interactiunii intre E2, respectiv intre regiunea HVR1 si SR-BI raman necunoscute, anumite studii sugereaza ca legarea virusului la SR-BI este absolut necesara interactiunii simultane sau ulterioare a virusului cu CD81 [Kapadia, 2007; Zeisel, 2007]. In anul 2008, Murao raporteaza ca expresia endogena a SR-BI de la nivelul hepatocitelor este supresata in urma tratamentului cu IFN-α, demonstrandu-se astfel interrelatia existenta intre tratamentul cu IFN-α, internalizarea VHC si expresia co-receptorului SR-BI [Murao, 2008]. Cu toate acestea, anticorpi anti SR-BI blocheza doar partial intrarea virusului, ceea ce sugereaza ca SR-BI nu este singurul receptor implicat in legarea VHC [Barth, 2006].

Factorul celular claudin-1 (CLDN-1) este o proteina integral membranara care formeaza un schelet de jonctiuni stranse si care este inalt exprimata in special la nivel hepatic [Furuse, 1998]. Expresia acestui receptor in liniile celulare non-hepatocitare, determina cresterea susceptibilitatii acestora fata de VHCpp. Testele de inhibitie arata ca implicarea in procesul de internalizare a CLDN-1, apare dupa receptorii SR-BI si CD81 [Evans, 2007]. Totusi, date recente sugereaza ca proteina CLDN-1 actioneaza ca si un component ce permite transferul intercelular al virusului VHC, independent de receptorul CD81 [Timpe, 2008]. Odata ce liniile celulare Huh-7 sunt infectate cu VHC, s-a observat o scadere a expresiei de CLDN-1, prevenind astfel aparitia unei suprainfectii [Liu, 2009]. Alte molecule din familia claudinelor sunt: claudina-6 si 9 (CLDN-6 si 9), exprimate atat la nivel hepatic, dar si in celulele care nu exprima CLDN-1 pe suprafata lor membranara, cum ar fi celulele mononucleate din sangele periferic [Meertens, 2008]; care participa la internalizarea virusului (Zheng, 2007). Neutralizarea virusului, posibil nu se realizeaza din cauza tropismul diferit al acestor receptori, atunci cand se folosesc doar strategii terapeutice anti CLDN-1 [Haid, 2014].

Occludina faciliteaza internalizarea prin endocitoza clatrin-mediata [Liu, 2009] datorita interactiunii cu glicoproteina E2, este asemanatoare din punct de vedere al structurii tridimensionale cu claudinele. De asemenea, occludina umana determina cresterea susceptibilitatii celulelor murine pentru VHCpp [Ploss, 2009].

Glicoproteina E2 se leaga de receptorii: L-SIGN/CD209L si DC-SIGN/CD209 [Lozach, 2003]. DC-SIGN este o proteina membranara de 44 kDa, cu un domeniu citoplasmatic N-terminal scurt si un domeniu lectinic C-terminal dependent de calciu, fiind exprimata mai ales pe suprafata celulelor mieloide, participand la activarea limfocitelor T. L-SIGN se exprima pe suprafata celulelor endoteliale hepatice si a ganglionilor limfatici, avand structura in proportie de 77% similara cu DC-SIGN. Aceste doua lectine Ca-dependente nu sunt exprimate la nivelul ficatului, astfel incat, nu pot media direct internalizarea VHC in celula hepatica, sugereazandu-se ca ar contribui in vivo la captarea si transferul VHC in celulela hepatica [Cormier, 2004].

Studiul lui Saunier din anul 2003, raporteaza faptul ca o linie de celule fibroblastice rezistente la infectie, devine permisiva dupa transfectia ambelor subunitati ale receptorului pentru asialoglicoproteine [Saunier, 2003].

Legarea si internalizarea virionilor, probabil, implica mai multe molecule, astfel incat rolul fiecareia ramane a fi definit [Barth, 2006], deoarece intelegerea acestor mecanisme va permite identificarea de noi tinte moleculare si dezvoltarea de noi agenti terapeutici care sa blocheze internalizarea virusului, asa cum a fost realizat in cazul virusul imunodeficientei umane. O aplicatie interesanta a acestor noi descoperiri ar fi preventia reinfectarii grefei dupa transplantul hepatic.

Dupa legarea de diferiti factori ai gazdei are loc internalizarea VHC, intr-o maniera dependenta de pH, prin endocitoza mediata de clatrina [Blanchard, 2006; Meertens, 2006, Lavillette, 2007]. Mediul acid endozomal probabil declanseaza fuziunea glicoproteinelor E1-E2 cu membrana endozomala.

Rezultatul fuziunii anvelopei virale cu membrana endozomala este reprezentat de eliberarea in citoplasma celulara a genomului viral. Asa cum se intampla in cazul tuturor virusurilor ARN cu polaritate pozitiva, genomul viral este elementul central al traducerii, replicarii si asamblarii.

2.2.2.2. Etapa de crestere logaritmica a VHC se desfasoara astfel:

1. ARN-ul viral simplu spiralat cu polaritate pozitiva este eliberat in citoplasma si va servi direct ca ARNm in procesul de traducere a proteinelor virale. Traducerea ARN VHC este mediata de situsului intern de intrare in ribozomi (IRES), care stabileste legaturi cu mai multe proteine celulare si virale [Otto, 2004].

IRES se leaga la subunitatea ribozomala 40S, care prezinta factorii eucariotici de initiere 2 si 3 (Eif2 SI Eif3), GTP si ARNt initiator, rezultand complexul preinitiator 48S [Spahn, 2001; Otto, 2002; Sizova, 1998]. Subunitatea ribozomala 60S impreuna cu 48S formeaza complexul activ translational necesar sintezei in reticulul endoplasmic a poliproteinei VHC [Dibrov, 2014; Niepmann, 2013].

2. Poliproteina precursoare este tradusa de catre proteazele virale si peptidazele gazdei (peptidaza- si peptid-peptidaza- semnal) in 10 proteine virale functionale Core, E1, E2, p7, NS2-NS5B. Proteina virala F (sau proteina ARF) rezulta dintr-un cadru alternativ de citire, in primii codoni ai regiuni codante core [Walewski, 200; Varaklioti, 2002].

Traducerea si apoi clivajul poliproteinei se produce la nivelul structurilor membranare si veziculelor peri-nucleare. Cele doua enzime virale sunt responsabile de separarea proteinelor non-structurale NS2-NS5 din poliproteina precursoare. Cistin-proteaza NS2-NS3 zinc dependenta, continind proteina NS2 si portiunea N-terminala a NS3, cliveaza jonctiunea dintre NS2 si NS3 [Santolini, 1995], in timp ce, serin proteaza NS3 separa restul proteinelor functionale [Bartenschlager, 1993; Tomei, 1993], necesitind ca si co-factor pe NS4A [Bartenschlager, 1995; Tomei, 1996].

ARN-polimeraza ARN dependenta si NS5B se asociază cu proteinele celulare ale celulei gazda, pentru a forma complexul replicativ viral [Gosert, 2003]. Alte componente importante in aceasta etapa sunt si:

NS4B care participa la formarea unei panze membranare derivate din reticulul endoplasmic si care contine majoritatea proteinelor nestructurale [Egger, 2002]

Regiunea 3’netradusa [Friebe, 2005; You, 2008]

Regiunea 5´netradusa (ambele regiuni netraduse par a lucra impreuna la o interactiune ARN-ARN cu raza lunga de actiune, ce poate da nastere unei circularizari temporare a genomului) [Diviney, 2008]

microRNA122 [Jopling, 2005]. Studiile au raportat ca in urma administrarii IFN-β la o linie celulara hepatoma umana, se observa reducerea semnificativa a nivelurile de expresie a miR-122, fiind pentru prima data cand s-a demonstrat existenta unei corelatii clare intre miR-122 si nivelul de ARN VHC plasmatic [Pedersen, 2007; Jopling, 2005].

3. Replicarea virala este coordonata de catre NS5B, ARN polimeraza ARN dependenta (RdRp). Asocierea intre fidelitatea scazuta de transcriere a acestei enzime (rata incorporarii gresite de nucleotide este 10-3 per nucleotid per generatie virala), cu rata foarte rapida a replicarii virale (1010-1012 virioni pe zi, cu un timp de injumatatire de 2-3 ore), genereaza o mare variabilitate virala. ARN polimeraza ARN dependenta utilizeaza ARNss genomic cu polaritate pozitiva ca matrita pentru sinteza unui intermediar replicativ cu polaritate negativa [Lohmann, 2013]. Un rol important in sinteza catenelor negative, este detinut de helicaza NS3 care ajuta la desfacerea unor structuri secundare in matrita de ARN [Jin, 1995; Kim, 2013]. Noile molecule de ARN antisens sunt folosite, fie ca si matrite pentru sinteza de catene pozitive din care ulterior se vor forma noi particule virale (virionii progeni), fie pot fi folosite ca si ARNm pentru traducerea poliproteinei si sinteza de proteine virale.

2.2.2.3. Faza de platou

Ultima etapa a replicarii virale – numita faza de platou- este initiata de interactiunea intre proteina core si ARN-ul genomic, care determina inceperea asamblarii virale. Virionii, asamblati in membranele lipidice intracelulare derivate din reticulul endoplasmic sau aparatul Golgi, sunt eliberati ulterior din celula gazda. Etapele finale ale ciclului replicativ, asamblarea si eliberarea virionilor infectiosi, sunt, inca putin intelese.

Date recente sugereaza ca asamblarea virala care este multistadiala are loc in reticulul endoplasmic [Gastaminza, 2008] in stransa legatura cu reteaua membranoasa in care are loc replicarea VHC si ca probabil este declansata de interactiunea dintre proteina core si NS5A, astfel incat, ARN-ul viral se poate lega de proteina core, declansandu-se formarea nucleocapsidei [Shimoike, 1999].

Acesta interactiune se realizeaza datorita faptului ca asamblarea virionilor are loc in proximitatea moleculelor lipidice unde se acumuleaza proteina core din cauza domeniul sau hidrofob de la capatul C-terminal [Hourioux, 2007]. ARN-ul viral este dus de la locul de replicare de catre proteina core cu ajutorul particulelor lipidice, iar NS5A, care are capacitatea de a lega ARN-ul, poate fi eliberata din complexul replicativ pentru a se muta pe suprafata particulelor lipidice. NS3 se alatura procesului, urmat de glicoproteinele E1, E2 si de NS2, pentru a produce un nou virion matur si infectios [Bartenschlager, 2011; Jones, 2010].

Proteina C pare sa recruteze proteinele nestructurale, ARN-ul viral si complexul de replicare la nivelul particulelor lipidice [Miyanari, 2007], iar asamblearea si inmugurirea particulelor virale se va realiza in apropierea acestora. Astfel incat, ciclul replicativ ar putea fi dependent de calea de sinteza a VLDL in hepatocitele umane. In vitro, s-a observat ca, proteine, precum MTP (proteina de transfer microzomala pentru trigliceride), apoproteina B sau apoproteina E interactioneaza cu proteinele virale la nivelul veziculelor de replicare, iar inhibarea prin ARN interferent a acestor proteine are un feedback negativ asupra producerii virusului [Chang, 2007].

In modelul in vitro HCVcc, replicarea unui genom din care s-a eliminat secventa p7 permite formarea de virioni progeni, dar acestia sunt retinuti in citoplasma celulei, demonstrandu-se astfel ca, proteina p7 care formeaza un canal ionic, pare a detine un rol important in eliberarea virionilor [Steinmann, 2007; Gentzsch, 2013].

Prin analogie cu alte Flaviviridae, virionii progeni sunt asamblati in vezicule formate prin inmugurirea membranelor intracelulare si eliberati in mediul extracelular prin exocitoza [Lindenbach, 2013] (Figura 3).

Figura 3. Ciclul replicativ al VHC [adaptat dupa Pereira&Jacobson, 2009].

CAPITOLUL 3 – VARIABILITATEA GENETICA A VHC

3.1. Variabilitatea genetica a VHC

Variabilitatea genetica a VHC se manifesta la mai multe niveluri, fiind responsabila pentru aparitia si diversificarea diferitelor genotipuri. Acestea, in general sunt specifice unui anumit areal geografic si sunt asociate cu anumiti factori de risc.

Evolutia VHC este influentata de numerosi factori de selectie, asociati atat cu adaptarea virusului la gazda umana, cat si cu posibilitatea VHC de a suporta mutatii adaptative rapide, rezultate in urma procesului de drift genetic. Acestea sunt responsabile de diversitatea pe care o prezinta diferitele genotipuri VHC care sunt determinate de evolutia rapida a regiunii hipervariabile a proteinei E2 si de impiedicarea recunoasterii virusului de catre anticorpi [Simmonds, 2004].

Exista doua modele prin care s-a demonstreaza modul de aparitie al mutatiilor si evolutia VHC. Primul model, cel al evolutiei Darwiniene, este reprezentat de mutatiile intamplatoare care se transmit la descendenti. Diversificarea continua a populatiilor virale duce la o concurenta intre diferitele variante virale si la selectia variantelor cel mai bine adaptate la mediul lor, astfel incat, daca gena mutanta este avantajoasa, aceasta va ajunge sa predomine in populatie. Acest proces este facilitat atat de rata crescuta a productiei virale, de ordinul a 1012 virioni pe zi in timpul infectiei, cat si de lipsa de fidelitate a ARN polimerazei virale, ceea ce inseamna ca fiecare ARN sintetizat intr-o celula infectata contine in medie o mutatie pe molecula ARN [Domingo, 2007].

Mutatiile se acumuleaza la nivelul genomului in timpul ciclurilor successive ale replicarii virale. Cele mai multe mutatii sunt letale, determinand ca majoritatea particulelor virale produse sa fie defective. In schimb, mutatiile neletale sunt transmise la descendenti si se acumuleaza in timp.

Al doilea model este modelul mutatiilor neutre, care nu au un efect semnificativ asupra fenotipului, dar care devin permanente in populatie in mod random. Asadar membrii ai aceleiasi specii, proveniti din areale diferite, pot fi foarte diferiti din punct de vedere genetic, dar similari ca morfologie si comportament. Mutatiile neutre sunt responsabile de distanta genetica ce se observa la speciile de VHC provenite din zone geografice si epidemiologice diferite [Kimura, 1983].

Diversitatea genetica a VHC.

Productia si selectia continua de noi variante virale este responsabila de aparitia genotipurilor VHC si diversificarea lor in timpul evolutiei [Simmonds, 2001].

VHC prezinta o multitudine de populatii virale, strans inrudite din punct de vedere functional si morfologic, dar foarte diverse din punct de vedere genetic. Metoda de electie pentru atribuirea unui anumit genotip consta in analiza filogenetica a regiunilor: core/E1, NS5B sau a intregului genom. Au fost identificate 6 genotipuri majore VHC (notate 1-6). In Vietnam [Tokita, 1994], Thailanda [Apichartpiyakul, 1994] si Indonezia [Tokita, 1996] au fost izolate noi genotipuri diferite de cele majore: respectiv, genotipurile 7a, 8a, 9a si 11a, considerare membre ale genotipului 6, iar genotipul 10a fiind atribuit genotipului major 3 [Simmonds, 2005;Murphy, 2007]. Definirea unui nou genotip necesita secventierea intregii secvente a noii variante, scotind in evidenta faptul ca aceasta apartine unui grup separat, recombinarea fiind exclusa.

In cadrul fiecarui genotip au fost identificate numeroase subtipuri (notate a, b, c, etc) si peste 100 de cvasispecii (notate 1,2,3, etc) [Simmonds, 2004]. Diferenta intre genotipuri este de 30-35% in secventa nucleotidelor, intre subtipuri de 20-25%, iar izolatele desemneaza mutatii care prezinta o variatie a secventelor intre 2-15% la pacientii cu acelasi subtip. Aceste diferente sunt relativ constante de-a lungul intregului genom (Figura 4).

VHC, ca multe virusuri ARN circula in gazda sa sub forma unor cvasispecii virale, care reprezinta un pool de variante virale genetic distincte, dar strans inrudite, existente la un pacient infectat, care au un grad de divergenta de 1-5% in secventa nucleotidica. Intr-adevar, prezenta simultana a diferitelor variante virale si viteza cu care apar noi variante, permit selectarea rapida si continua a acelora perfect adaptate la mediul in care virusului se replica [Domingo, 2007], favorizandu-i astfel supravietuirea.

Figura 4. Arborele filogenetic al tulpinilor VHC construit pe baza analizei genomului complet, disponibil in anul 2010.

Evolutia variantelor virale se realizeaza in doua etape:

prima etapa este cea de introducere a noilor mutatii la nivelul genomului viral ca urmare a lipsei de corectie a ARN polimerazei virale

a doua etapa este cea de selectie a variantelor virale cu mutatii aparute sub actiunea presiunii de selectie naturala sau indusa artificial.

Variabilitatea genetica a VHC nu este distribuita uniform de-a lungul genomului, fiind strans asociata cu functia, intensitatea si modul de actiune a presiunii de selectie. Anumite regiuni ale genomului sunt supuse unor presiuni de selectie mai puternice, spre exemplu, regiunea HVR1 de la nivelul glicoproteinei E2, tinta anticorpilor anti-VHC. Presiunea de selectie puternica din aceasta regiune, ii determina variabilitatea pe parcursul infectiei si sub tratamentul antiviral [Chambers, 2005]. In acelasi timp, rolul acestei regiuni in atasarea de receptorii celulei gazda, impune conservarea structurii sale tridimensionale [Penin, 2001; Callens, 2005]. Regiunile inalt conservate determina o selectie negativa, eliminand orice variatie care ar putea diminua „fitness-ul” replicativ al genomului. Pe de alta partea, selectia pozitiva favorizeaza anumite mutatii intr-o regiune specifica, crescand rata de evolutie si determinand, fie fixarea unor variante virale favorabile (d.p.d.v. al virusului), fie diversificarea continua a variantelor virale alternative.

Principalele forte care guverneaza variabilitatea genetica a VHC pot fi clasificate ca fiind: intrinsece (constrangeri genomice functionale) sau extrinsece, atat naturale (imunitatea innascuta, anticorpii si limfocitele T), cat si induse artificial (medicamentele antivirale si imunosupresoare). In ultimii ani, studiile incearca sa identifice mutatiile specifice si variantele genetice responsabile pentru diferitele fenotipuri clinice care ar permite imbunatatirea diagnosticului, tratamentului si a managementului clinic al pacientilor infectati [Candelas, 2010]. Capacitatea de adaptare a cvasispeciilor virale la schimbarile din mediu joaca un rol important în fiziopatologia infectiei, atat in mecanismele de persistenta virala, cat si in rezistenta la tratamentul antiviral sau recidiva infectiei după transplant.

3.2. Genotipurile VHC

Studiile au aratat ca genotipurile sunt cel mai adesea specifice regiunilor geografice si se asociaza cu factori de risc particulari, iar subtipurile sunt legate mai ales de procesele mutationale neutre ce au avut loc de-a lungul timpului. Analiza filogenetică a genotipurilor VHC a permis o mai buna intelegere a aparitiei, diversificarii tipurior, subtipurilor, precum si a distributiei lor la nivel mondial. La ora actuala, distributia geografica a diferitelor genotipuri VHC este complexa, dar in acelasi timp bine stabilita si reflecta istoria epidemiologica a virusului [Smith, 1997; Simmonds, 2001].

Genotipurile 1a, 1b, 2 si 3 sunt raspandite pe scara larga la nivel mondial, cu precadere in tarile dezvoltate, aproximativ 60% dintre persoanele infectate, prezinta subtipurile 1a si 1b. [Esfahani, 2010; Simmonds, 2004]. Aceste asa zise „subtipuri epidemice”, se pare ca au fost transmise cu rapiditate prin sange infectat, derivate de sange si consum de droguri injectabile [Smith, 1997; Pybus, 2005; Magiorkinis, 2009]. Multe alte subtipuri mai putin frecvente, sunt considerate „endemice” si au circulat pe perioade lungi de timp in anumite zone clar delimitate: tulpini endemice ale subtipul 4 in Africa Centrala si Orientul Mijlociu, subtipul 5, in Africa de Sud avand o prevalenta de aproximativ 40% [Smuts & Kannemeyer, 1995] si subtipul 6, in Asia de Sud-Est, in special in Vietnam si Hong-Kong [Tokita, 1994; Wantuck, 2014]. Intr-un studiu din Vietnam, genotipul 1 a fost totusi prevalent, urmat de genotipurile 6-9 si 2. Genotipurile 10 si 11 au fost izolate in Indonezia [Tokita, 1996; Pybus, 2009] (Tabelul 4).

Tabelul 4. Distributia la nivel mondial a genotipurilor VHC [Zein, 2000; Simmonds, 2001].

In nordul Americii si al Europei, prevalent este subtipul 1a, urmat de 2b si 3a. In schimb, in sud-estul Europei, majoritar este subtipul 1b, urmat de genotipurile 2 si 3. In nordul Africii, de exemplu, in Tunisia predomina subtipul 1b, intr-o proportie de 79%, urmat de 1a, 2a, 2b, 3a si 4 [Ayed, 2003]. In Maroc, subtipul 1b este identificat la aproximativ 47% dintre pacienti [Sekkat, 2008]. In Japonia, 1b este raportat in proportie de 73%, urmat de genotipul 2 si apoi de subtipul 1a [Ohno, 1997].

Subtipurile 2a si 2b sunt relativ frecvente in nordul Americii, in Japonia si in Europa, iar genotipul 2c a fost izolat in nordul Italiei [Osella, 1999; Ansaldi, 2005].

Subtipul 3a este endemic in sud-estul Asiei, dar a fost identificat in Europa si SUA, frecvent in radul consumatorilor de droguri injectabile [Simmonds, 2004].

In Romania, un raport recent realizat in urma a doua studii arata ca, genotipul 1 sau 1b a fost gasit aproape exclusiv la pacientii cu hepatita cronica C (99,13% din 461 de pacienti participanti in studiul ENMS au avut genotip 1, fara a fi identificat subtipul, iar in studiul ACHIEVE, 93,46% din cei 153 pacienti au avut subtipul 1b) [Grigorescu, 2009].

Majoritatea infectiilor din Africa de Vest sunt cauzate de genotipul 2 [Candotti, 2003; Mellor, 1995; Ruggieri, 1996; Wansbrough-Jones, 1998], iar in Africa Centrala (Camerun, Congo, Gabon) predomina genotipurile 1 si 4. In ambele cazuri, se remarca o diversitate considerabila a subtipurilor, fapt ce reflecta, atat variabiliatea genetica a genotipurilor 1, 2 si 4, cat si prezenta indelungata a virusului in populatia respectiva [Bukh, 1995; Stuyver, 1994].

In Martinica, genotipul 4 izolat, prezinta o variabilitate genetica semnificativa, sugerandu-se existenta unei origini stravechi in populatia respectiva [Martial, 2004]. La nivelul Europei, genotipul 4 se presupune ca a aparut cu aproximativ un deceniu in urma, in randul toxicomanilor, predominand subtipurile 4a si 4d [Morice, 2001; Tamalet, 2003; van Asten, 2004]. De exemplu, in Spania, au fost izolate tulpinile 4c si 4d; in Italia, 4d; iar in Sicilia genotipul 4 a fost prevalent [Argentini, 2000; Fernandez-Arcas, 2006].

3.3. Originea genotipurilor

Similar cu alte virusuri si in cazul VHC nu exista nici o dovada istorica, arheologica sau paleontologica a originii sale. Analiza distributiei geografice si calcularea ratei de modificare a secventei nucleotidice (rata de modificare a unei secvente a fost calculata la 1,44× 10-3 schimbari in cadrul nucleotidelor pe situs, pe an, in cadrul intregului genom si 4,1 si 7,1× 10-4 schimbari pe situs, pe an, in regiunile NS5 si respectiv E1) [Okamoto, 1992; Smith, 1997] permite estimarea datei la care anumite genotipuri au patruns si s-au raspandit in diferite populatii. Numarul mare de variatii in cadrul genotipurilor 1, 2 si 4 intalnite in Africa subsahariana sau in cazul genotipurilor 3 si 6 in sud-estul Asiei, sugereaza ca infectia VHC este endemica in aceste regiuni de foarte mult timp.

Teoria mutatiilor neutre prevede o rata constanta in timp a modificarilor intr-o secventa, astfel incat, poate fi estimata data la care anumite genotipuri au patruns si s-au raspandit in diferite populatii. Smith si colaboratorii au studiat 40 de secvente ale regiunii NS5 izolate de la pacienti infectati cu genotipul 1b, din Europa, USA, Japonia si Asia. S-a stabilit ca nu exista o grupare filogenetica specifica unei anumite regiuni geografice sau tari, (demonstrandu-se astfel raspindirea rapida a subtipului 1b) si ca timpul de divergenta a variantelor este 60-70 de ani [Smith, 1997].

Divergenta de secventa a genotipului 4a in Egipt, este compatibila cu introducerea VHC in aceasta populatie in timpul tratamentului pentru schistosomiaza din anii 1950 si 1960 [Frank, 2000; Ray, 2000; Pybus, 2005]. In schimb, pentru variante ale genotipului 2 prezente in vestul Africii a fost calculat un timp de divergenta de aproximativ 200-250 de ani. Folosind diverse metode de corectie, momentul in care virusul a intrat in populatie este calculat a fi cuprins intre 500-2000 de ani [Smith, 1997], iar divergenta genotipurilor in subtipuri de 300 de ani. In prezent, nu este posibila determinarea cu precizie a unui areal geografic sau temporal pentru tulpina ancestrala a VHC. Cu toate acestea, distributia geografica precum si diferentele antigenice si biologice intre subtipurile VHC se coreleaza cu infectia pe termen lung si cu divergenta scazuta a subtipurilor virale intre diferite regiuni geografice.

3.4. Recombinarea genetica

Recombinarea genetica este un fenomen comun multor familii de virusuri ARN care necesita existenta oportunitatii epidemiologice si a compatibilitatii biologice, fiind necesara o singura celula infectata cu cel putin doua variante diferite ale virusului.

In tarile vestice, circula multiple variante virale, respectiv: subtipurile 1a si 3a in randul utilizatorilor de droguri injectabile, iar subtipurile 1b, 2a, 2b, 2c, 4a in zona mediteraneana. In aceste zone, primoinfectia este caracterizata de expuneri repetate, intr-un interval scurt de timp la VHC, stiindu-se faptul ca, infectia cu VHC, inclusiv forma cronica, nu protejeaza impotriva reinfectiilor, asa cum a fost demonstrat in cazul cimpanzeilor infectati experimental [Gao, 2007], a pacientilor hemofilici sau a celor cu talasamie tratati cu sange si derivate ale acestuia [Kao, 1996; Lai, 1994; Moreno, 2009] si a celor care utilizeaza droguri intavenoase [Grebely, 2012]. In ultimii ani, au fost raportate numeroase variante inter-genotipice [Kageyama, 2006; Noppornpanth, 2006; Legrand-Abravane, 2007], inter-subtipice [Colina, 2004] sau inter-cvasispecii [Moreno, 2006], a caror implicatii clinice nu sunt inca cunoscute.

Initial, studiile au raportat ca o divergenta de secventa mai mare de 20%, asa cum se observa intre subtipurile 1a si 1b, determina incompatibilitate intre aceste variantele virale si imposibilitatea generarii unui replicon viabil [Gates, 2004]. In ciuda acestor observatii, in vivo, s-au descoperit urmatoarele forme recombinate (inter/intra-genotipice): 1a/1b la un pacient din Peru [Colina, 2004], 1a/1c in urma secventierii complete a 89 de genomuri virale disponibile in Genbank [Cristina, 2006], 2k/1b, varianta formata din gene structurale ale genotipului 2 si gene nestructurale ale genotipului 1b, izolata in randul consumatorilor de droguri injectabile din St. Petersburg, Rusia [Kalinina, 2004; Raghwani, 2012; Kurbanov, 2008a], 2i/6p in Vietnam [Noppornpanth, 2006], 2b/1b in Manila si Filipine [Kageyama, 2006], 2/5 la un pacient din Franta [Legrand-Abravanel, 2007] si 2b/6w in Taiwan [Lee, 2010]. In anul 2008, a fost analizata secventaVHC, AY651061, care s-a dovedit a nu fi doar un simplu izolat 1c; ci o structura genomica complexa, un virus mozaic recombinant 1a/1c cu 5 puncte potentiale de rupere a genomului intre regiunea core si NS3 [Ross, 2008a].

Un singur studiu realizat pe soareci umanizati infectati cu tulpina recombinanta 2k/1b, a raportat o sensibilitate buna a acestei tulpini la tratamentul cu interferon α pegylat si ribavirina [Kurbanov, 2008b].

In realitate, potentialul de recombinare a VHC si frecventa acestui fenomen ar putea sa fie subapreciate deoarece variantele recombinate sunt greu de identificat daca implica tulpini ale aceluiasi subtip, mai ales in zonele cu o mare diversitate a VHC, unde nu sunt cunoscute toate variantele de secventa.

Recombinarea genetica ar putea ridica o problema importanta in ceea ce priveste genotiparea VHC. Testele de genotipare care evalueaza o singura regiune, ca 5’UTR , core sau NS5B, ar putea sa devina inexacte, iar in cazul testarii rezistentei la interferon numai acelea care genotipeaza regiunile responsabile de susceptibilitatea la tratament, ar putea sa isi pastreze utilitatea [Simmonds, 2004].

3.5. Impactul genotipurilor asupra evolutiei naturale a infectiei VHC

De-a lungul timpului, majoritatea diferentelor de secventa nucleotidica intre subtipurile VHC s-au acumulat probabil din cauza mutatiilor adaptative, rezultate in urma procesului de drift genetic. In ciuda similaritatii caracteristicilor principale ale VHC (structura, replicarea, transmiterea si abilitatea de a stabili infectii persistente); un grad ridicat de diversitate genetica caracterizeaza infectia VHC, cu posibile diferente biologice si un important impact clinic [Simmonds, 2004].

Impactul clinic al genotipurilor VHC a fost studiat la mai multe niveluri: epidemiologia si transmiterea infectiei, diagnosticarea acesteia, raspunsul la tratamentul standard cu interferon, evolutia naturala a infectiei VHC etc.

3.5.1. Epidemiologia si transmiterea infectiei VHC

In urma anchetelor epidemiologice, a fost demostrata importanta stiintifica a genotiparii, atat pentru intelegerea evolutiei naturale a infectiei, cat si pentru stabilirea caii de transmitere a virusului.

In 1994, Ohto si colaboratorii au raportat pentru prima data ca la 6 din 7 familii studiate a existat transmitere verticala a infectiei VHC. In consecinta, din acel an, genotiparea VHC a fost recomanda si s-a efectuat doar in cazul transmiterii intrafamiliale (mama-copil, sot-sotie) [Akahane, 1994; Ohto, 1994].

Utilizand o metoda cu sensibilitate crescuta, secventierea nucleotidica, s-a determinat apropierea genetica intre diferite genotipuri si modul de transmitere al infectiei VHC, astfel incat s-a sugerat ca genotipurile 3a si 1a sunt frecvent izolate in randul consumatorilor de droguri injectabile, iar genotipul 1b la pacientii cu transmitere parenterala a infectiei [Pawlotsky, 1995; Watson, 1996; Berg, 1997].

3.5.2. Diagnosticul

Infectia VHC reprezinta la ora actuala o problema de sanatate publica, in acest sens, diagnosticarea corecta este de maxima importanta.

Tehnica ELISA de detectie a anticorpilor anti-VHC foloseste proteine virale recombinate de la un singur genotip (cu precadere subtipul 1a). Stiindu-se faptul ca infectia VHC se caracterizeaza printr-o mare diversitate genetica, se ridica urmatoarea intrebare: Cat de eficiente sunt aceste metode de diagnosticare in cazul altor variante VHC?

Prima si a doua generatie de teste ELISA, s-au dovedit mai putin sensibile in cazul diagnosticarii pacientilor infectati cu genotipul 2 sau 3 [Maertens, 1997]. De asemenea, s-a raportat ca scaderea reactivitatii in cazul genotipului 4 este de aproximativ 40%, iar pentru genotipul 6 de 35% [McOmish, 1993].

In cazul testelor ELISA de generatie a treia, Dhaliwal et al. au observat scaderea reactivitatii de 5 ori in cazul genotipurilor 2 si 3, comparativ cu genotipul 1 [Dhaliwal, 1996].

Sensibilitatea specifica a fiecarui genotip poate determina subdiagnosticarea pacientilor infectati cu alte genotipuri decat genotipul 1. Indiferent de generatia testului ELISA folosit, numarul rezultatelor fals negative nu a fost pina in prezent cuantificat.

3.5.3. Tratamentul cu Interferon

Cea mai importanta diferenta intra-genotipica este observata in cazul raspunsului la tratamentul cu interferon singur/in combinatie cu ribavirina [Poynard, 1998; Manns, 2001; Fried, 2002; Hadziyannis, 2004b]. Genotipul 1 determina un raspuns virusologic in urma monoterapiei cu interferon (IFN) in 10-20% din cazuri, iar in urma terapiei combinate, interferon pegylat (PegIFN) si ribavirina (RBV) in 40-45% din cazuri. Pentru genotipurile 2 si 3, ratele de raspuns virusologic sustinut (RVS) sunt de 50% si respectiv 70-80%. Totusi, pacientii infectati cu genotipul 3 au o arata de raspuns la tratament mai scazuta, in comparatie cu cei infectati cu genotipul 2 (79% versus 83%) [Zeuzem, 2004].

Genotipul 4 pare sa detina o sensibilitate intermediara la terapia standard, intre genotipul 1 si genotipul 2/3, astfel incat RVS variaza intre 40% [Alfaleh, 2004] si 79% [Diago, 2004; Kamal, 2009; Legrand-Abravanel, 2005; Trapero-Marugan, 2007].

Mai putin studiate, genotipurile 5 si 6 afecteaza un procent semnificativ al populatiei din Africa de Sud si din sud-estul Asiei. Genotipul 5 pare sa aiba o rata de raspuns la tratament mare, asemanatoare cu genotipurile 2 si 3, in timp ce genotipul 6 se afla la un nivel intermediar, avand RVS superior genotipul 1 si aproximativ asemanator cu cel obtinut in cazul genotipului 3 [Mauss, 2012; Zhou, 2011; Nguyen, 2010].

Genotipurile 1 si 4 au nevoie de doze mai mari si o durata mai lunga de tratament pentru obtinerea unui raspuns terapeutic favorabil, in schimb, genotipurile 2 si 3 sunt mai sensibile la tratament si au rata raspunsului virusologic sustinut mai mare dupa o perioada mai scurta de terapie [Hadziyannis, 2004].

Proteina virala NS5A contine la capatul carboxi-terminal, o regiune alcatuita din 40aa (2209-2248aa) care determina sensibilitate la IFN alfa (ISDR) si care detine un rol cheie in cazul raspunsul la terapia cu IFN alfa. Enomoto si colab. au descoperit ca tulpinile rezistente la IFNalfa au in regiunea ISDR, secvente similare cu tulpinile prototip ale genotipului 1 (HCV- J, HC- J4 si HCV- JTa) si ca mutatiile in aceasta regiune determina sensibilitate fata de terapia cu IFN. De exemplu, s-a observat ca, intre regiunea ISDR a genotipului 2 si tulpinile prototip ale genotpului 1b, exista o diferenta de 14aa si o deletie de 4aa [Enomoto, 1996]. Pe de o parte, rezultatele raportate de Enomoto au fost confirmate de alte studii japoneze, iar pe de alta parte, date contradictorii au fost raportate din alte zone geografice (in special din Europa si USA), sugerandu-se faptul ca factorii geografici ar influenta sensibilitatea fata de terapia cu IFN a genotipului 1b [Watanabe, 2001; Halfon, 2000]. Un studiu filogenetic, realizat in anul 2009, care cuprinde toate secventele genomice aflate in baza de date (n=345), stabileste o relatie invers proportionala intre vechimia genotipului si rata de raspuns la tratament, astfel ca, in ordine descrescatoare a vechimii ar fi: genotipul 2 (cel mai vechi) care raspunde cel mai bine la terapie, apoi genotipurile 3, 5 si 6, cu raspuns intermediar si in cele din urma, genotipurile mai nou descoperte, 1 si 4 cu rata cea mai scazuta de raspuns virusologic [Pang, 2009].

Probemele ridicate anterior, vor fi depasite intr-un viitor apropiat, deoarece mai mult de 30 de molecule cu actiune antivirala directa sunt in diferite etape ale studiului clinic, astfel incat, ne asteptam ca cel mai potrivit regim fara interferon (initial pentru genotipului 1) si agenitii terapeutici cu actiune pan-genotipica sa fie aprobati [Lok, 2014; Pawlotsky, 2014].

3.5.4. Evolutia naturala a infectiei VHC

In literatura de specialitate exista putine date cu privire la patogenitatea si importanta diferitelor genotipuri VHC in progresia bolii hepatice. Majoritatea studiilor sunt transversale (cross-sectionale), comparandu-se stadiile de evolutie ale bolii hepatice (steatoza/ciroza/CHC) cu frecventa implicarii anumitor genotipuri [Terrault, 2008; Thein, 2008]. Severitatea bolii hepatice a fost corelata cu amplificarea locala a proceselor apoptotice, in special in cazul pacientilor infectati cu genotipul 1b [Raimondi, 2009].

In ultimii ani, genotipul 3 pare a fi asociat cu un risc mai crescut de progresie a fibrozei [Bochud, 2009] si a steatozei hepatice [Leandro, 2006; Poynard, 2003]. Aceasta relatie intre genotipul 3 si steatoza hepatica, este secundara unor mecanisme citopatice, care determina acumularea trigliceridelor la nivelul hepatocitelor [Jackel-Cram, 2007; Abid K, 2005].

In mod cert, prezenta infectiei VHC cu genotipuri multiple determina o evolutie mai grava, cu decompensarea mai rapida a cirozei si cresterea ratei de mortalitate [Accapezzato 2002].

3.5.5. Perspectivele dezvoltarii unui vaccin anti-hepatita C

In prezent, nu exista vaccin anti VHC din cauza abilitatii virusului de a stabili infectii persistente, ca urmarea a marii sale variabilitati si a raspunsurilor imune celulare si umorale. Deoarece anticorpii virali indreptati impotriva proteinelor codificate de regiunile NS4 si NS3 ale genotipului 1, nu recunosc proteine provenite de la alt genotip VHC, se impune descoperirea unui vaccin multivalent anti-VHC, care sa fie imunogen impotriva genotipurilor majore si sa prezinte epitopi cross-reactivi.

La nivelul glicoproteinei E2, au fost identificati doi epitopi importanti in dezvoltarea unui vaccin terapeutic. Epitopul I este implicat in procesul de neutralizare si are o structura inalt conservata intre diferitele genotipuri, in schimb, epitopul II este extrem de variabil, generand anticorpi care interfera cu anticorpii epitopului I. Pacientii cu hepatita C cronica dezvolta anticorpi initial impotriva epitopului II si abia tarziu apar cei protectori impotriva epitopului I. Daca anticorpii specifici epitopului II ar fi epuizati din plasma pacientilor, aceasta va contine doar anticorpi pentru epitopul I, conferind protectie fata de o eventuala reinfectie VHC [Zhang, 2009]. Noile studii realizate pe soareci umanizati carora li s-a administrat de la o peroana infectata VHC anticorpi monoclonali impotriva anumitor epitopi din regiunile E1 si E2, au demonstrat ca acesti anticorpi au activitate neutralizanta cross-genotipica, inhiband totodata si replicarea virala [Perotti, 2008; Law, 2008].

CAPITOLUL 4 – DIAGNOSTICUL INFECTIEI VHC

Diagnosticul infectiei VHC se bazeaza in mod frecvent pe determinarea serologica a anticorpilor specifici antivirali (de obicei, anti-VHC de tip IgG), cu ajutorul metodelor imunenzimatice, a celor de imunobloting si a tehnicilor rapide bazate pe imunocromatografie. Recent, un test rapid pentru detectia anticorpilor anti-VHC IgG a fost aprobat de Agentia americana pentru Siguranta Alimentelor si Medicamentelor (FDA) si utilizat in practica clinica [Smith, 2011]. Desi in prezent, testele serologice au o sensibilitate foarte mare, de 99%, un rezultat pozitiv trebuie confirmat intotdeauna printr-un test molecular, cu scopul de a diferentia hepatita C cronica, de infectia VHC vindecata.

Testele moleculare, cele care detecteaza acidul nucleic viral (NAT) si care pot pune diagnosticul de hepatita acuta VHC sunt folosite pentru evaluarea indicatiei, duratei si prognosticului terapiei antivirale [Terrault, 2005], deoarece pot fi atat calitative (cu sensibilitate inalta, recomandate in diagnosticul initial al hepatitei C, in aprecierea RVS si in screeningul transfuziilor de sange si al transplantului de organe), cat si cantitative (determina numarul de copii de ARN VHC per ml plasma, fiind utilizate in monitorizarea terapiei antivirale). In majoritatea laboratoarelor clinice, aceste tehnici necesita personal instruit, aparatura de laborator si reactivi costisitori, nefiind efectuate de rutina.

In cazul pacientilor cu indicatie de terapie antivirala, urmatoarea etapa in cadrul diagnosticului de laborator, este reprezentata de genotiparea VHC; atat durata cat si doza terapiei fiind dependente de genotipul VHC implicat.

In viitor, se urmareste dezvoltarea unor teste serologice care sa puna diagnosticul de infectie acuta VHC. Rezultate promitatoare au fost raportate in urma utilizarii unui test serologic care detecteaza antigenul VHC core [Hosseini-Moghaddam, 2011] .

4.1. Teste serologice

Testele serologice utilizate de rutina au la baza tehnicile imunoenzimatice de tip ELISA (enzyme-linked immunoassay), in care anticorpii anti-VHC din plasma pacientului sunt legati de proteine VHC recombinate peliculizate pe un suport solid. Detectia acestora se realizeaza cu ajutorul unor anticorpi secundari (anti IgG uman) marcati enzimatic. Enzima din componenta conjugatului va reactiona cu un substrat, dand nastere unui compus colorat. Intensitatea culorii – masurata spectrofotometric – fiind direct proportionala cu cantitatea de anticorpi din proba testata.

Prima generatie de teste imunoenzimatice contine proteine recombinate din regiunea NS4 a genomului VHC (C100-3). Desi sunt identificati anticorpii anti-VHC, in aproximativ 80% din cazurile de hepatita posttransfuzionala, scazand considerabil transmiterea pe aceasta cale, testele de prima generatie au sensibilitatea si specificitatea redusa [Barrera, 1991].

Testele ELISA de generatie 2 si 3 folosec mai multe proteine virale din regiunile core, NS3 si NS4A, astfel incat, s-a crescut mult sensibilitatea si specificitatea tehnicii [Alter, 1992]. Singura diferenta intre aceste doua generatii de tehnici ELISA, consta in faptul ca cele de generatie 3 contin o proteina suplimentara din regiunea NS5 [Barrera, 1995]. Testele de generatie 2 detecteaza prezenta anticorpilor incepand cu saptamana a 10-a dupa contactul infectant si au o sensibilitate de aproximativ 95%, iar testele de generatie 3 reusesc sa depisteze anticorpii din ser incepand cu saptamana 4-6 post-infectie si au o sensibilitate de peste 99% [Colin, 2001].

In prezent, aceasta metoda este automatizata, poate fi folosita pentru un volum mare de teste, fiind eficienta in special in cazul pacientilor imunocompetenti. In randul pacientilor hemodializati sau imunosupresati pot fi obtinute si rezultate fals negative [Ghany, 2009], in timp ce, in randul populatiei cu prevalenta scazuta a infectiei VHC [MMWR, 1998] si in cazul pacientilor cu diferite tulburari (ex. prezenta in ser a factorului reumatoid) se obtin rezultate fals pozitive. Pentru a elimina erorile de diagnostic, sunt indicate testele imunoblot.

Testele imunoblot, INNO-LIA Ab III (Innogenetics), DECISCANT HCV (Sanofi-Pasteur) si Lia Tek HCV (Organon) sunt recomandate strict cu scopul eliminarii rezultatelor fals pozitive obtinute in urma testelor ELISA. Sensibilitatea acestor teste este mai mica decat cea a testelor ELISA, astfel incat riscul de aparitie a reactiilor fals negative creste.

Tehnica consta in peliculizarea in benzi separate a proteinelor virale structurale si nonstructurale din regiunile: core, NS3, NS4 si NS5 pe o membrana de nitroceluloza.

Un rezultat pozitiv semnifica reactivitate la cel putin 2 proteine si confirma prezenta anticorpilor specifici anti-VHC.

In timp ce un rezultat indeterminat/echivoc, inseamna reactivarea unei singure proteine, prezenta anticorpilor anti-VHC fiind incerta, posibil din urmatoarele cauze: reactivitate specifica in cursul fazei de seroconversie (la repetarea testului se va obtine un rezultat pozitiv); la pacientii imunodeprimati sau in cazul unei reactivitati nespecifice [Gerlach, 2003]. Testul trebuie repetat la un interval de 1-2 luni pentru a determina statusul definitiv al anticorpilor anti-VHC. In situatia unui test RIBA indeterminat, se recomanda

cuantificarea nivelului de ARN VHC; un rezultat negativ indicand absenta anticorpilor specifici anti-VHC, deci un rezultat fals-pozitiv obtinut la testele de screening [ARUP Laboratories, 2010].

Testele imunoblot fiind teste serologice, pot fi efectuate din aceasi proba utilizata si la screening. Totusi, nu sunt folosite de rutina deoarece au sensibilitate scazuta, necesita personal instruit, costul este ridicat si au durata lunga de executie. In anul 2013, raportul CDC, recomanda abandonarea testelor immunoblot, astfel incat, singurele teste suplimentare aprobate de catre FDA, pentru a confirma/infirma infectia VHC vor fi cele care detecteaza nivelul de ARN VHC [http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm6218a5.htm].

4.2. Teste rapide

Cu toate ca testele EIA de generatia a-3 a au sensibilitatea si specificitatea excelenta, raportarea rezultatului se face dupa cel putin o zi de la recoltare si nu la prima vizita a pacientului. Din aceasta cauza, a aparut nevoia dezvoltarii unor teste rapide, cu raportare imediata, in maxim o ora de la recoltare si care sa nu necesite aparatura speciala si costisitoare.

Cele 3 teste rapide (OraSure, Chembio si Medmira) folosite pentru detectia anticorpilor anti-VHC IgG, contin proteine recombinante rezultate din regiunile structurale si nonstructurale ale genomului viral (regiunea core, NS3, NS4 si NS5) au specificitatea de > 99% si sensibilitatea intre 86% si 99% [Smith, 2011].

Recent, FDA a aprobat utilizarea in practica clinica curenta a testului rapid,OraQuick (OraSure Technologies), pentru detectia anticorpilor anti-VHC la persoane cu varsta mai mare de 15 ani, expusi la factori de risc pentru infectia VHC sau care prezinta semne si simptome specifice acesteia. Testarea poate fi realizat din sange venos sau integral sau sange din pulpa degetului [www.fda.pov/Safetv/Recalls/IndustrvGuidancc/default.htm.; Shivkumar, 2012].

Este important de subliniat faptul ca, testele rapide nu sunt recomandate in screeningul populatiei generale si ca un rezultat pozitiv indica prezenta anticorpilor anti-VHC, dar nu pune diagnosticul de infectie acuta.

4.3. Tehnicile moleculare de detectie a ARN VHC

Organizatia Mondiala a Sanatatii (OMS) a stabilit un standard international de exprimare a incarcaturii virale ARN VHC sub forma de Unitati Internationale (UI/ml) cu scopul uniformizarii rezultatelor si asigurarii managementul optim al terapiei antivirale (Tabelul 5) [Saldanha, 2005].

Determinarea calitativa a ARN VHC se poate face prin metode RT-PCR (Reverse-Transcription PolymeraseChain Reaction, reactie de amplificare genica precedata de reverstrancriere, AmplicorTM HCV 2.0, produs de Roche Molecular systems) sau TMA (Transcription Mediated Amplification – reactie de amplificare genica mediata de transcriere, VersantTM HCV, produs de Siemens Medical Solutions Diagnostics). Prin aceste metode, ARN-ul viral este transformat prin transcriere inversa intr-un lant de ADN dublu-catenar complementar (ADNc). Acesta este procesat intr-o reactie enzimatica ciclica, in final rezultind un numar mare de copii; prin PCR, se sintetizeaza copii de ADN dublu catenar, iar prin TMA copii de ARN monocatenar. Testele moleculare calitative au fost pana de curand preferate celor cantitative datorita costului mai redus, a pragului minim de pozitivitate acceptat de 50 UI/mL si a sensibilitatii egale pentru toate genotipurile.

Determinarea cantitativa a ARN VHC se poate realiza cu ajutorul a doua tipuri de tehnici moleculare: cele care au la baza amplificarea tintei (PCR competitiv si real-time PCR) sau cele bazate pe amplificarea semnalului (tehnica ADN ramificat – branched DNA assay – bDNA). Prin real time PCR, fiecare ciclu de amplificare duce la emiterea unui semnal fluorescent, iar numarul de semnale din ciclu este proportional cu viremia din proba initiala. Odata cu evolutia metodelor cantitative, acestea au devenit ultrasenzitive, limita inferioara de detectie fiind de 5 UI/mL si au determinat scaderea utilitatii metodelor calitative. Pentru tehnica TMA, limita de detectie minima este de 5-10 UI/ml, cu o sensibilitate de 96-100% si o specificitate de peste 99,5%.

Tabelul 5. Sisteme de evaluare a viremiei HCV in functie deproducator si de metoda.

bDNA – tehnica ADN ramificat; b) qPCR – PCR cantitativ; c) RT-PCR – reactie de amplificare genica precedata de reverstrancriere; d) TMA – reactie de amplificare genica mediata de transcriere

4.4. Noi directii de urmat in diagnosticul infectiei VHC

Detectia antigenului VHC core. Recent au fost implementate teste pentru detectia nucleocapsidei virale/proteinei core care contine 191aa [Muerhoff, 2002; Shah, 2003].

In Europa, compania Abbot comercializeaza o platforma automata pe care se poate obtine prin chemiluminescenta, determinarea cantitativa a antigenului core VHC. Intr-un grup de donatori de sange a fost testat antigenul core VHC, in primele 2 saptamani de la presupusul contact infectant, in perioada acuta a infectie. S-a raportat o sensibilitate a determinarii intre 80% si 99% si o specificitate intre 96% si 100%. Desi initial, s-a comunicat ca testul are aceasi sensibilitate pangenotipica, studii recente raporteaza o diagnosticare mai eficienta a infectiei VHC cu genotipul 1 [Hosseini-Moghaddam, 2011].

Tehnicile bazate pe nanoparticule (quantum dot, nanoparticulele cu aur) s-au dezvoltat in directia detectiei unor biomarkeri, inclusiv a celor specifici infectiei VHC [Azzazy, 2006]. Quantum dots (QDs) sunt nanoparticole fabricate din materiale semiconductoare care atunci cand sunt excitate, emit in functie de marimea lor, lumina cu o anumita lungime de unda [Al Olaby, 2011].

Printre tehnologiile testate in scopul diagnosticarii eficiente a infectiei VHC se numara si aptamerele. Acestea sunt oligonucleotide, scurte, monocatenare care pot adopta structura tridimensionala si pot recunoaste moleculele tinta: compusi chimici cu masa moleculara mica, proteine sau chiar celule. Au fost utilizati in diferite aplicatii diagnostice datorita capacitatii lor de a se lega de molecula tinta cu mare afinitate si specificitate [Shi, 1999].

O metoda care se bazeaza pe interactiunea QD-aptamer si-a demonstrat inalta specificitate si sensibilitate in detectia proteinei NS3 VHC [Roh, 2010].

4.5. Genotiparea VHC

Pana in prezent, au fost descrise sase genotipuri VHC (1-6), multiple subtipuri si cvasispecii. Deoarece distributia geografica, evolutia bolii, durata terapiei, cat si doza de ribavirina variaza in functie de genotipul viral, identificarea corecta a acestora a devenit o testare obligatorie pentru orice pacient cu indicatie de tratament [Bowden, 2006].

Metoda de genotipare de referinta ramane secventierea anumitor regiuni genomice (in mod curent: 5’UTR, core, E1, NS5), deoarece secventierea intregului genom este dificila si costisitoare. Astfel incat, tinand cont, atat de constrangerile tehnice cat si de cele financiare, au fost identificate si preferate metodele rapide pentru determinarea genotipurilor.

Metodele imunoenzimatice indirecte (serotiparea), folosite doar in scop de cercetare, determina secventele nucleotidice specifice regiunii NS4, utilizand anticorpi specifici pentru un anumit genotip. Aceasta metoda (Serotype HCV 5'NC – Abbott-Murex) diferentiaza doar cele 6 genotipuri majore si are sensibilitate si specificitate scazuta (mai ales la persoanele imunocompromise) [Cavalheiro, 2007].

Genotiparea cu ajutorul enzimelor de restrictie pentru determinarea polimorfismului lungimii fragmentelor de restrictie (RFLP). In cadrul aceastei metode, un fragment de ADN amplificat prin PCR este digerat cu endonucleaze, enzime de de restrictie care recunosc situsuri specifice de clivare pentru fiecare genotip [Xavier, 1998]. Prin restrictia unor fragmente PCR, amplificate in regiuni ca 5’ UTR sau NS5, se obtin fragmente de diferite lungimi care se vizualizeaza in gel de agaroza.

In practica clinica, genotipul este determinat cu ajutorul kiturilor comerciale ce analizeaza fie direct secventele regiunii non-codante 5' (Trugene 5'NC HCVgenotyping kit, Bayer), fie prin hibridizare inversa, folosind teste specifice de genotip (INNO-LiPA HCV II Immunogenetics sau Versant HCV Genotyping Assay Bayer). Initial, testele INNO-LIPA vizau doar secvente nucleotidice specifice regiunii genomice 5´ non-codante a VHC (5´UTR), determinand un anume grad de neconcordanta. In prezent, sunt adaugate noi sonde moleculare pentru detectia altor regiuni ale genomului VHC (respectiv, pentru proteina non-structurala NS5B si pentru proteina structurala core) care permit o diferentiere clara intre genotipurile si subtipurile VHC [Bowden, 2006].

Genotiparea prin tehnica de hibridizare inversa (VersantTM HCV Genotype 2.0 (LiPA), Siemens Medical Solutions Diagnostics). Acesta tehnica foloseste ampliconi biotinilati, hibridizati cu ajutorul sondelor oligonucleotidice specifice regiunilor 5’UTR si core ale diverselor genotipuri VHC, fixate pe un strip de nitroceluloza. Dupa hibridizare, fragmentele fixate de ADNc biotinilat sunt detectate printr-o reactie de culoare. Testul identifica cu o specificitate crescuta genotipurile 1-6 si peste 15 subtipuri virale. De asemenea, poate discrimina cu inalta specificitate subtipurile derivate din genotipul 1 (96.8% dintre probele de genotip 1 au fost identificate corect la nivel de subtip). In 10 pana la 25% din cazuri, subtipul nu este identificat corect, fapt fara importanta clinica deoarece pentru stabilirea schemei terapeutice si a prognosticului, numai genotipul este luat in considerare [Bouchardeau, 2007].

Secventierea cu scopul determinarii genotipului VHC foloseste ampliconi ai regiunilor 5'NC, NS5B si core. Aceste regiuni pe de o parte sunt suficient de conservate pentru dezvoltarea primerilor specifici, iar pe de alta parte sunt suficient de diverse, astfel incat sa permita determinarea genotipurilor si subtipurilor virale [Stéphane, 2007]. Secventele obtinute sunt aliniate si supuse analizei filogenetice, conform careia asemanarile intre 2 izolate sunt cu atat mai numeroase cu cat intre ele exista legaturi de inrudire mai stranse. Dupa compararea secventelor de acizi nucleici se aplică programe informatice bazate pe modele matematice complexe (analiza de parcimonie, analiza asemanarii maxime si analiza de distanta) care permit reconstituirea filogeniei secventelor [Felsenstein, 1993]. De exemplu, secventierea regiunii core permite o identificare a subtipurilor in 96% din cazuri [Ross, 2008b].

Genotipara cu ajutorul kiturilor comerciale ce analizează direct secventele regiunii 5'non-codante (Trugene 5'NC HCVgenotyping kit, Bayer). Genotiparea prin metoda Trugene implica analiza directa a secventei nucleotidice din regiunea 5’UTR a genomului viral. Acuratetea nu este totala deoarece testul determina doar secventa nucleotidica a regiunii 5’UTR, lasand nedetectate alte regiuni genomice. Nu este folosita in practica clinica, ci doar in scop de cercetare [Simmonds, 2005; Stéphane, 2007; Nolte, 2003].

Genotiparea cu ajutorul metodei Real-Time PCR (Abbott RealTime HCV Genotype II, Abbott Diagnostics Europe) a fost utilizata in cercetare, iar din anul 2013, a fost validata de catre FDA si pentru diagnosticul clinic. Acest test permite atat determinarea genotipurilor 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 si 6; cat si cuantificarea virala, insa o valoare a viremiei mai mica de

6 053 UI/ml, compromite eficienta si scade sensibilitatea determinarii [Raymond, 2004].

4.6. Diagnosticul infectiei VHC acute si cronice

Diagnosticul infectiei acute este foarte important, deoarece rata de obtinere a RVS in urma terapiei antivirale este semnificativ crescuta in aceasta perioada, comparativ cu cea obtinuta in faza cronica a infectiei [Ghany, 2009]. Avand in vedere ca detectia doar a anticorpilor anti-VHC este insuficienta, acestia sintetizandu-se la cateva saptamani de la contactul infectant; se recomanda determinarea simultana a prezentei in sangele pacientului, atat a anticorpilor anti-VHC, cat si a acidului nucleic viral. Detectia in dinamica a nivelului de ARN VHC este indicata in special la populatia care prezinta factori de risc pentru achizitionarea infectiei VHC, respectiv; la consumatorii de droguri injectabile sau la persoanele care au trecut printr-un transplant de organe [Lewis-Ximenez, 2010].

Majoritatea pacientilor testati in momentul prezentarii la medic, au anticorpi anti-VHC pozitivi si ARN VHC pozitiv, astfel incat este dificil de identificat stadiul infectiei. Spre deosebire de infectia acuta VHB, in care determinarea anticorpilor anti-HBc de tip IgM stabileste diagnosticul de infectie acuta; in infectia cu VHC, anticorpii specifici de tip IgM sunt prezenti atat in faza acuta, cat si in cea cronica a acesteia [Quinti, 1995]. S-a stabilit ca anticorpii de tip IgM nu pot fi folositi ca markeri ai infectie acute, astfel incat, se recomanda determinarea in dinamica a nivelului de ARN VHC, a titrului de anticorpi anti-VHC sau a aviditatii anticorpilor anti-VHC de clasa IgG [McGovern, 2009; Coppola, 2009].

Testul imunoenzimatic multiplex de determinarea a aviditatii anticorpilor anti-VHC IgG este alcatuit dintr-un mix de antigene din regiunea core, NS3 si NS4 si are drept scop corelarea reactivitatii virale cu stadiul infectiei VHC, observandu-se o crestere a titrului de anticorpi odata cu progresia bolii [Klimashevskaya, 2007; Araujo, 2010].

Hepatita cronica C trebuie investigata la pacientii cu semne clinice, anatomo-patologice sau biochimice de boala hepatica cronica, folosindu-se initial testele imunoenzimatice de identificare a anticorpilor anti-VHC (recomandat este testul rapid de detectie a anticorpilor anti-VHC, OraQuick HCV, OraSure Technologies sau metodele ELISA de generatie a 3-a) [http://www.cdc.gov/hepatitis/resources/mtgsconf/hcvsymposium2011.htm.].

Deoarece anticorpii raman prezenti mai multi ani, chiar si dupa rezolutia infectiei VHC si nu poate fi diferentiata infectia cronica de una vindecata, se indica pentru confirmarea diagnosticului, testul molecular de detectie a nivelului de ARN VHC (Tabelul 6).

Noile ghiduri terapeutice recomanda determinarea incarcaturii virale la inceputul, in timpul si la incheierea terapiei. O viremie scazuta este un factor de prognostic pozitiv pentru obtinerea raspunsului virusologic sustinut. Genotiparea se efectueaza la inceputul terapiei si poate stabili tipul tratamentului antiviral (tripla terapie cu PegIFN, RBV si un inhibitor de proteaza/polimeraza virala pentru genotipul 1b, dubla terapie cu PegIFN si RBV pentru geneotipurile 2,3), durata terapiei si doza de ribavirina [McHutchison, 2002; Terrault, 2005; Jacobson, 2013].

Tabelul 6. Interpretarea testelor de diagnostic in cazul infectiei VHC.

CAPITOLUL 5 – TERAPIA INFECTIEI VHC

5.1. Consideratii generale

Dupa descoperirea virusului hepatitei C, in anul 1989 si dupa aparitia primelor teste de diagnostic in anul 1991, tratamentul infectiei VHC a avut o evolutie revolutionara. Daca initial, s-a administrat doar interferon (IFN) de 3 ori pe saptamana, in anul 1998, odata cu adaugarea ribavirinei (RBV), s-a inregistrat un progres major in obtinerea clearence-ului viral. Trei ani mai tarziu, a aparut interferonul pegilat (PegIFN) rezultat prin atasarea interferonului la o molecula de 12 kDa de polietilen glicol care-i creste durata de actiune, fiind necesara doar o singura administrare pe saptamana. In cazul genotipul 1 VHC, terapia combinata, PegIFN cu RBV a reprezentat tratamentul standard (SoC), pana la aparitia in anul 2011, a primei generatii de inhibitori de proteaza virala (PI), telaprevir si boceprevir, folositi in combinatie cu acesta. In prezent, EMA a aprobat alte trei medicamente, simeprevir, inhibitor de proteaza de generatia a II a (doar pentru genotipul 1), sofosbuvir, inhibitor al polimerazei virale (cu activitate pan-genotipica) si daclatasvir (inhibitor NS5A) recomandand folosirea acestora in combinatie cu SoC. PegIFN va reprezenta un medicament de baza al regimurilor terapeutice in anii 2014 si 2015; insa, in viitor, utilizarea lui probabil va disparea definitiv, deoarece scheme terapeutice fara interferon (“interferon-free”) sunt testate in studii clinice avansate. Ribavirina va ramane un medicament adjuvant in multe scheme terapeutice, utila atat in cresterea ratei de vindecare a infectiei, cat si pentru scurtarea duratei de tratament [Pawlotsky, 2014]. Cum un vaccin nu este inca disponibil, tratamentul antiviral trebuie sa urmareasca eradicarea infectiei VHC, scaderea ratei de progresie a bolii hepatice si cresterea sperantei de viata [Kanwal, 2011; Backus, 2011; Morgan, 2010].

Obtinerea raspunsului virusologic sustinut (RVS), definit ca nivel de ARN VHC nedetectabil la 24 de saptamani de la finalizarea terapiei, reprezinta obiectivul principal al tratamentului, fiind asociat cu un clearance viral durabil, in 98% din cazuri [George, 2009]. Urmarirea pacientilor post-tratament a evidentiat ca in aproximativ 99% din cazuri, pacientii care au obtinut RVS, au un nivel de ARN VHC nedetectabil, la 5 ani de la finalizarea tratamentului si nu au semne de boala [Dieterich, 2009]. O analiza recenta a pacientilor care au obtinut RVS si a celor cu esec terapeutic, a evidentiat la primii, o scadere: cu 77% a mortalitatii cauzata de progresia bolii hepatice, cu 79% a CHC si cu 84% a decompensarii hepatice [Singal, 2010].

Decizia de a initia sau nu terapia antivirala este individualizata, fiind descrisi anumiti factori predictivi ai raspunsului la tratament care apartin atat gazdei, cat si virusului (Tabelul 7).

Tabelul 7. Factori predictivi ai raspunsului la tratamentul antiviral.

In practica clinica, o importanta deosebita detin urmatorii markeri predictivi ai eficientei terapeutice (Tabelul 8).

Tabelul 8. Markeri predictivi ai eficientei terapeutice [Adaptat dupa Ghany, 2009].

5.2. Trecut si prezent in tratamentul standard

5.2.1. Tratamentul cu PegIFN/RBV

Tratamentul pentru hepatita C cronica, pina in anul 2011 conform ghidurilor terapeutice (EASL 2011, NICE 2010, AASLD 2009), a constat in administrarea interferonului alfa pegylat (PegIFN) si a ribavirinei (RBV) pentru 48 de saptamani (in cazul genotipurilor 1,4,5 si 6 ) sau pentru 24 de saptamani (in cazul genotipurilor 2 si 3), determinand un RVS de 40%-50% pentru cei cu genotip 1 sau ≥ 80% pentru genotipurile 2 si 3 [Hadziyannis, 2004]. Exista 2 tipuri comerciale de peg-interferon (PegIFN α-2b si PegIFN α-2a), care nu au diferente in rata de obtinere a RVS. In functie de varianta comerciala folosit, PegIFN se administreaza o data pe saptamana in doza fixa sau tinandu-se cont de greutatea corporala. Dozele de ribavirina se ajusteaza in functie de greutatea corporala, dar fara a fi mai mici de 11mg/kg [Ferenci, 2008] (Tabelul 9).

Tabelul 9.Medicamente aprobate in tratamentul hepatitelor cronice C (2008).

Componentele cheie care determina succesul terapeutic sunt: durata terapiei standard (72, 48, 24, 12 saptamani in functie de genotipul VHC), schemele terapeutice diferentiate in functie de genotipul VHC si managementul optim al efectelor adverse severe [Ferenci, 2008].

In cazul genotip 1 VHC, se urmareste extinderea duratei de tratament de la 24 la 48 sau 72 de saptamani cu scopul imbunatatirii ratei de raspuns terapeutic. Dupa ce s-a comparat eficienta si siguranta tratamentului combinat (PegIFN plus ribavirina) administrat timp de 48 de saptamani versus 72 de saptamani [Berg, 2006; Pearlman, 2007; Sanchez-Tapias, 2006], s-a observat scaderea semnificativa a ratei de recadere odata cu extinderea terapiei, in special la acei pacienti care au ARN VHC pozitiv la 4 saptamani de la initierea tratamentului [Sanchez-Tapias, 2004]. Intr-un studiu, Berg si colaboratorii au raportat ca pacientii cu RVT, dar cu ARN VHC detectabil in saptamana 12 de tratament obtin un RVS semnificativ mai mare cand durata acestuia este de 72 de saptamani, comparativ cu cea de 48 de saptamani (29% vs 17%, p = 0,04). Dezavantajul major ar fi ca o durata a tratamentului mai mare de un an, poate creste mult rata de abandon si poate scadea intentia de a urma aceasta terapie [Berg, 2006; Sanchez-Tapias, 2004]. De asemenea, in cazul genotipului 1 ar fi posibila reducerea duratei de tratament la 24 de saptamani, doar pentru acei pacienti cu valori scazute ale viremiei la debutul terapiei si care au obtinut RVR [Ferenci, 2008; Jensen, 2006; Zeuzem, 2006].

Pentru pacientii infectati cu genotipul 2 sau 3, tratamentul standard este cel cu PegIFN si ribavirina, durata terapiei fiind mai scurta decat in cazul infectiei cu genotipul 1 (24 saptamani vs. 48 saptamani), iar RVS este mai mare (80% vs. 40-50% in cazul celor infectati cu genotipul 1) [Hadziyannis, 2004]. Durata terapiei poate fi modificata, daca se obtine RVR, observandu-se cresterea ratei de RVS dupa16 saptamani [von Wagner, 2005], 14 saptamani [Dalgard, 2008] sau chiar 12 saptamani de tratament [Mangia, 2005]. Tratamentul pacientilor infectati cu genotipul 2 sau 3 este individualizat, deoarece genotipului 2 determina rate mai crescute de RVS [Mangia, 2005; Zeuzem, 2004], iar pacientii care nu au obtinut RVT (in special cei infectati cu genotipul 3 si care au incarcatura virala inalta) necesita o perioada mai mare de 24 de saptamani de terapie (e.g., 48 saptamani).

Pacientiilor infectati cu genotipul 4, 5 sau 6 VHC, li se recomanda terapia combinata cu PegIFN/RBV pe o durata de 48 de saptamani la fel ca si in cazul genotipului 1 [Kamal, 2005; Bonny, 2006; Thu, 2012]. Genotipul 4 pare sa detina o sensibilitate intermediara la terapia standard, astfel incat RVS variaza intre 40% [Alfaleh, 2004] si 79% [Diago, 2004; Legrand-Abravanel, 2005; Trapero-Marugan, 2007; Kamal, 2009], genotipul 5 detine o rata mare de raspuns la tratament, asemanatoare genotipurilor 2 si 3, in timp ce genotipul 6 se afla la un nivel intermediar, avand RVS superior genotipul 1 si aproximativ asemanator cu cel obtinut in cazul genotipului 3 [Mauss, 2012; Zhou, 2011; Nguyen, 2010].

Toate studiile subliniaza importanta aderentei la tratament ca fiind unul dintre factorii cei mai importanti asociati unui succes terapeutic. Regula 80/80/80 defineste aderenta si include pacientii care au primit mai mult de 80% din dozele de IFN, mai mult de 80% din cele de ribavirina si care au urmat tratamentul mai mult de 80% din durata lui. Pacientii care au indeplinit regula 80/80/80, pot obtine 63% raspuns virusologic sustinut, comparativ cu rata de 52% observata la cei cu aderenta mai mica de 80% [McHutchison, 2002].

5.2.2. Noii agenti terapeutici cu actiune directa (STAT-C)*

Odata cu intelegerea ciclului replicativ, s-a incercat gasirea unor tinte antivirale specifice fiecarei etape a acestuia, astfel incat, au aparut agentii terapeutici cu actiune antivirala directa (STAT-C) care includ: inhibitori ai proteazei NS3-4A, analogi nucleozidici (NI), analogi non-nucleozidici (NNI) si inhibitori ai NS5B.

In anul 2011, FDA a aprobat pentru genotipul 1, doi agenti terapeutici, cu bariera genetica scazuta pentru dezvoltarea rezistentei, care fac parte din primul val al primei generatii de inhibitori ai proteazei NS3-4A (care se ataseaza de centrul catalitic al enzimei si blocheaza procesele post-translationale ale poliproteinei la nivelul situsurilor de scindare: NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A si NS5A/NS5B, determinand inhibarea eliberarii proteinelor functionale non-structurale).

Boceprevir (Victrelis™, Merck) (BOC) se administreaza pe cale orala (800 mg de trei ori pe zi, impreuna cu mancare) pentru o perioada de 24-44 de sapatamani in combinatie cu PegIFN alfa 2a si ribavirina. Strategia terapeutica presupune initiarea tratamentului cu interferon si ribavirina, mentinerea lui timp de 4 saptamani, ulterior, adaugandu-se si boceprevirul. Acesta etapa de 4 saptamani, in care se administreaza doar PegIFN alfa 2b si ribavirina are drept scop reducerea replicarii virale, inlaturarea selectiei mutantelor rezistente, identificarea pacientilor care au obtinut RVR si a celor cu sanse mari de obtinere a RVS fara adaugarea unui inhibitor de proteaza [Susser, 2009; http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ucm255413.htm].

Telaprevir (Incivek™, Vertex Pharmaceuticals Inc.) (TVR) are biodisponibilitate orala (750 mg, 2 tablete de 375-mg, de 3 ori pe zi) se administreaza timp de 12 saptamani in combinatie cu PegIFN alfa si ribavirina si este activ si asupra genotipului 2 [Jacobson, 2011]. Durata tratamentului depinde de nivelul ARN VHC:

daca nivelul de ARN VHC este nedetectabil in saptamanile 4 si 12 de tratament, se administraza tripla terapie in primele 12 saptamani, apoi dubla terapie (PegIFN plus ribavirina) inca 12 saptamani.

daca nivelul de ARN VHC este detectabil, dar mai mic de 1000 UI/ml, in saptamanile 4 si 12, se administreaza tripla terapie timp de 12 saptamani, urmata de dubla terapie pentru inca 36 de saptamani [http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ucm256328.htm].

In prezent, tripla terapie reprezinta terapia standard in cazul pacientilor infectati cu genotipul 1 VHC, determinand cresterea ratei de obtinere a raspunsului virusologic sustinut (RVS) la pacientii naivi, la cei cu raspuns partial, cu recaderi sau fara raspuns virusologic anterior (Tabelul 10) [Pearlman, 2012; Bacon, 2011; Zeuzem, 2011].

Tabelul 10. Tripla terapie cu inhibitorii de proteaza (telaprevir or boceprevir), interferon pegylat alfa-2a si ribavirina (PegIFN/RBV) – studii clinice de faza 3.

eRVR (raspuns virusologic rapid extins) – nivelul ARN VHC nedetectabil in saptamanile 4 si 12; b) RVS- raspuns virusologic sustinut

Al doilea val al inhibitorilor de prima generatie, sunt in diferite stadii ale dezvoltarii clinice, au activitate asupra genotipurilor 1, 2 si 4, niciodata asupra genotipului 3, o bariera genetica scazuta si rezistenta incrucisata atat intre ele cat si cu TVR sau BOC. Unul dintre acestia este Simeprevir (Janssen), aprobat in noiembrie 2013 in SUA si in mai 2014 in Europa, fiind recomandat impreuna cu PegIFN/RBV, doar in cazul infectiei cu genotipul 1 VHC. Simeprevir se administreaza oral, in doza unica de 150 mg, timp de 24-48 de saptamani, in functie de raspunsurile terapeutice anterioare (12 saptamani de tripla terapie, restul timpului administrandu-se doar PegIFN/RBV). In faza 3 a studiilor QUEST-1 si QUEST-2, rata de RVS obtinuta la pacientii naivi a fost de 80%. Au fost observate diferente in rata de obtinere a RVS intre subtipurile genotipului 1, astfel ca pentru genotipul 1a, RVS a fost de 75%, iar pentru genotipul 1b de 85%. La subtipul 1a, eficienta terapeutica este redusa semnificativ, pina la o valoare de 58%, daca se identifica polimorfismul Q80K (acesta fiind prezent intr-o treime din cazuri) [Jacobson, 2013; Manns, 2013; Rosenquist, 2014]. Ceilalti inhibitori ai proteazei NS3-4A de prima generatie sunt detaliati in Tabelul 11.

Tabelul 11. Inhibitori ai proteazei NS3-4Ade prima generatie.

RVT-raspuns virusologic timpuriu; b)RVS- raspuns virusologic sustinut; c)RVR-raspuns virusologic rapid

A doua generatie de inhibitori de proteaza virala cuprinde moleculele: MK-5172 (Merck) si ACH-2684 (Achillion), cu activitate pan-genotipica, inclusiv asupra genotipului 3, o bariera genetic mai inalta si alt profil de rezistenta.

ACH-2684 /Achillion Pharmaceuticals, s-a dovedit a fi bine tolerat cu un bun profil de siguranta, cu activitate pan-genotipica, determinand o scadere a viremiei cu mai mult de 3 log10 (IU/ml) [Achillion Pharmaceuticals, 2012; Huang, 2010].

MK-5172/ Merck & Co. La pacientii infectati cu genotipurile 1 si 3, se observa o scadere a viremiei cu 4-5 log10. Este activ pe majoritatea tulpinilor care au dezvoltat rezistenta la inhibitorii de proteaza de prima linie [Ludmerer, 2012].

Recaderea in urma triplei terapii determina aparitia mutantelor rezistente cu rezistenta incrucisata la compusii din aceasi clasa. Multe dintre aceste mutatii contin un fitness replicativ scazut, astfel incat odata cu terminarea tratamentului, vor fi eliminate [Sarrazin, 2007; Sarrazin, 2010b]. Desi, anumite mutatii pot fi izolate intr-un procent scazut (<1%), inaintea tratamentului cu inhibitori de proteaza NS3/4A, importanta lor clinica nu a fost pe deplin elucidata, se pare ca ar determina scaderea ratei de obtinere a RVS [Gaudieri, 2009]. De exemplu, varianta Q80K, izolata la 10% dintre infectiile cu genotip 1 (in special 1a), determina scaderea ratei de RVS, dupa tripla terapie cu simeprevir [Lenz, 2011]. O mutatie in pozitia R155 [Sarrazin, 2010b], ii confera virusului rezistenta la aproape toti inhibitori NS3/4A (BI 201355, boceprevir, MK-7009, RG7227, telaprevir si TMC 43535), mai putin la MK-5172, produs de Merck, aflat in studiu clinic de faza I si la ACH-2684, produs de Achillion, aflat intr-o faza preclinica a studiilor clinice [Kuntzen, 2008]. Pina in prezent, au fost descrise patru mutatii de rezistenta la tratamentul cu telaprevir (V36A/M/L, T54A, R155K/M/S/T si A156S/T), care probabil determina modificarea centrului catalitic al proteazei, impiedicand atasarea inhibitorilor de proteaza [Welsch, 2008]. Bariera genetica difera semnificativ intre subtipuri; de exemplu, mutatia asociata rezistentei la telaprevir in majoritatea cazurilor este R155K, iar pentru aparitia ei, subtipului 1a necesita o schimare nucleotidica, in timp ce subtipul 1b necesita 2 modificari nucleotidice, astfel ca, in terapia cu telaprevir singur sau combinat cu PegIFN/RBV, mutatiile apar cu o freceventa mai crescuta in cazul subtipului 1a, comparativ cu subtipul 1b [Romano, 2012].

Inhibitorii polimerazei NS5B

Analogi nucleozidici (NI) competitioneaza cu nucleotidele celulare, fiind integrate in lantul ARN aflat in curs de elongare, producand intreruperea directa a acestuia. Deoarece centrul activ al NS5B este o regiune inalt conservata a genomului VHC, NI sunt eficienti impotriva diferitelor genotipuri si subtipuri VHC. Acesti compusi aflati in faza II si III a studiilor clinice, au eficienta antivirala mai scazuta decat inhibitorii de proteaza si o bariera genetica in dezvoltarea rezistentei, relativ ridicata (Tabelul 12).

Tabelul 12. Analogi nucleozidici.

RVT – raspuns virusologic timpuriu; b)RVS – raspuns virusologic sustinut;c) RVC – raspuns virusologic complet (scaderea incarcarii virale (ARN-HCV) sub 50UI/mL dupa 12 saptamani)

Din aceata clasa face parte, Sofosbuvir (Sovaldi™), aprobat de FDA in decembrie 2013 si de EMA in august 2014, administrat oral in doza de 400 mg zilnic. Se recomanda fie in combinatie cu PegIFN/RBV, 12 saptamani pentru tratamentul pacientilor naivi infectati cu genotipul 1 sau 4; fie doar impreuna cu RBV, in cazul infectiilor cu genotip 2 (timp de 12 saptamani) sau 3 (pentru 24 de saptamani). Rata de RVS este de aproximativ 90%, pentru pacientii naivi cu genotipurile 1 si 4; de 95% pentru genotipul 2 si de 63% in cazul genotipului 3 [Lawitz, 2013; Lawitz, 2013b]. De exemplu, in studiul VALENCE, s-a urmarit rata de obtinere a RVS atat la pacienti naivi, cat si la cei experimentati (nu au raspuns anterior la SoC), obtinandu-se rezultatele prezentate in Tabelul 13 [Zeuzem, 2013].

Tabelul 13. Rezultatele obtinute in studiul VALENCE.

In SUA, Sofosbuvir este primul compus aprobat in cazul regimurilor fara interferon [http://www.gilead.com/w/media/Files/pdfs/ medicines/liver-disease/sovaldi/sovaldi_pi.pdf].

Inhibitorii non-nucleozidici (NNI) realizeaza inhibitia NS5B prin legarea la situsurile allosterice ale enzimei, cu schimbarea conformationala a proteinei si reducerea activitatii ei. Prezinta cel putin 4 situsuri de legare, astfel incat, diferiti inhibitori de polimeraza pot fi utilizati in combinatie sau succesiv pentru a controla dezvoltarea rezistentei.

NNI au o bariera genetica scazuta, o activitate virala ineficienta, sunt activi doar in cazul infectiei cu genotipul 1a si 1b si ar putea fi utilizati doar in combinatie cu alte STAT-C (Tabelul 14).

Tabelul 14. Inhibitorii non-nucleozidici.

RVT – raspuns virusologic timpuriu; b)RVS – raspuns virusologic sustinut;c) RVC – raspuns virusologic complet (scaderea incarcarii virale (ARN-HCV) sub 50UI/mL dupa 12 saptamani)

Inhibitorii NS5A. Daclatasvir (BMS 790052) este in faza 3 a studiilor clinice, se administreaza o data pe zi impreuna cu tratamentul standard (PegIFN/RBV), este activ pe genotipurile 1 si 4 VHC si determina o scadere rapida a viremiei VHC [Nettles, 2008]. Alti agenti antivirali din aceasta clasa se afla in prezent in studii clinice de faza 1: PPI461 (activ pentru toate genotipurile) si GSK2336805 (activ pentru genotipurile 1a, 1b, 2a si 4) [Lalezari, 2011].

Inhibitorii ciclofilinei B. Ciclofilina B este implicata in plierea multor proteine. S-a demonstrat ca ciclofilina B amplifica activitatea NS5A, in timp ce inhibitorii ei au efect antiviral, actionand asupra replicarii virale. Debio-025 este un inhibitor de ciclofilina, fara activitate imunosupresoare, dar cu efect antiviral atat la pacientii monoinfectati VHC, cat si la cei coinfectati VHC/HIV. Studiile clinice au raportat ca pacientii infectati cu genotipurile 1, 3 si 4 tratati timp de 28 de zile cu Debio-25 si IFN pegylat alfa obtin o scadere semnificativa a incarcarii virale [Flisiak, 2009].

Noi derivati ai ribavirinei. Se stie ca tratamentul cu ribavirina determina in unele cazuri, anemie hemolitica, efect advers ce impune reducerea dozei de antiviral sau chiar oprirea tratamentului. Cu scopul de a evita acest lucru a fost dezvoltat un prodrog al ribavirinei, numit taribavirina. Taribavirina este transformata in ribavirina la nivel hepatocitar, determinand concentratii plasmatice mai scazute si implicit scaderea ratei de anemie hemolitica (7%-15% vs. 24% cu RBV), insa administrarea ei este sigura doar in cazul pacientilor cu boala hepatica compensata. Dozele de taribavirina se adapteaza in functie de greutatea corporala, iar eficienta drogului este comparabila cu cea a ribavirinei [Marcellin, 2010].

Noi formule de interferon. In viitor, rolul PegIFN in tratamentul infectiei VHC este incert. Cu toate acestea, mai multe companii farmaceutice dezvolta noi formule de interferon cu tolerabilitate, farmacocinetica si profil al reactiilor adverse mult imbunatatite. Noile formule ar putea fi cu toxicitatea mai scazuta, mai putin costisitoare, cu o capacitate crescuta de a mentine supresia virala, si cu o frecventa de administrare scazuta (o data sau de doua ori pe luna) (Tabelul 15).

Tabelul 15. Noi formule de interferon utilizate in tratamentul pacientilor cu hepatita cronica VHC.

Combinarea STAT-C cu Mecanisme Diferite de Actiune. In cazul pacientilor cu hepatita C cronica, similar infectiei HIV (unde exista terapia HAART-terapia antiretrovirala foarte activa), sunt in desfasurare numeroase studii clinice care evalueaza eficienta anumitor regimuri terapeutice formate din combinatii de antivirale cu moduri diferite de actiune, cu scopul de a determina o crestere a ratei de obtinere a RVS, si o reducere a duratei de tratament.

In urma studiilor realizate, s-a raportat ca eradicarea infectiei este posibila dupa 8-12 saptamani de tripla terapie cu STAT-C [Ohara, 2011], din cauza productiei inalte de virioni si a clearance-ului viral realizat in doua etape (in primele 36 de ore se produce o scadere brusca cu 3,5 log10 a incarcarii virale, urmata de eliminarea virionilor liberi si consecutiv, a hepatocitelor infectate).

Perspectivele terapeutice [Zeuzem, 2010] se bazeaza pe:

Terapia quadrupla, consta in asociere terapiei standard (PegIFN/RBV) cu doi agenti STAT-C cu bariera genetica scazuta. Rezultatele obtinute in urma unor studii efectuate pe pacientii naivi, infectati cu genotipul 1, tratati cu PegIFN/RBV +daclatsvir (inhibitor NS5A) + asunaprevir (inhibitor NS3-4A), arata o rata de RVS de aproximativ 95% [Lok, 2014]. In cazul pacientilor experimentati (cei cu raspuns partial sau fara raspuns la tratament), administrarea PegIFN/RBV + danoprevir (inhibitor NS3-4A) + mericitabine (analog nucleozidic), determina un RVS mai mare de 70% pentru cei cu subtip 1a si mai mare de 95% pentru cei cu subtip 1b [Feld, 2012].

Combinatii terapeutice fara interferon. In cazul pacientilor cu intoleranta, contraindicatie sau cu raspuns virusologic foarte scazut la administrarea IFN, se pot recomanda regimuri terapeutice fara interferon care sunt in studii clinice de faza II sau III (Tabelul 16) [Pawlotsky, 2014]. Principalul punct slab al regimurilor fara interferon este reprezentat de aparitia rezistentei incrucisate fata de principalele mutatii aparute in urma terapiei cu telaprevir sau boceprevir (respectiv, la R155K si D168A), fiind deja raportate pentru faldaprevir, simeprevir, asunaprevir si ABT-450 [Sarrazin, 2012].

Regimurile bazate pe analogi nucleotidici/nucleozidici care au bariera genetica inalta, se administreaza fie impreuna cu ribavirina, fie in combinatie cu 1 sau 2 agenti STAT-C cu sau fara RBV (cel mai probabil ribavirina va fii administrata, deoarece contribuie prin activitatea ei antivirala la obtinerea si mentinerea raspunsului virusologic sustinut si la scaderea ratei de recadere).

Regimuri fara NI, bazate pe combinarea a 2 sau 3 agenti STAT-C cu bariera de rezistenta scazuta care se potenteaza reciproc, determinand un efect antiviral puternic.

Tabel 16. Regimurile terapeutice fara interferon aflate in diferite faze ale studiului clinic, in anii 2014-2015.

5.3. Recomandariile terapeutice pentru anul 2014-2015, in functie de genotipul VHC, sunt urmatoarele [EASL, 2014]:

Pentru genotipul 1:

PegIFN/ribavirin + sofosbuvir: 12 saptamani

PegIFN/ribavirin + simeprevir: 12 saptamani, urmate de alte 12 saptamani de PegIFN/RBV la pacientii naive/relapseri sau de 36 saptamani de PegIFN/RBV pentru pacientii cu raspuns partial/fara raspuns

PegIFN/ribavirin + daclatasvir (doar pentru genotipul 1b): 12 saptamani, urmate de alte 12 saptamani de PegIFN/RBV sau suplimentar inca 12 saptamani de PegIFN/RBV + daclatasvir

Sofosbuvir + ribavirin: 24 saptamani in cazul pacientilor cu intolerant la IFN, nu exista alt regim fara interferon disponibil

Sofosbuvir + simeprevir: 12 saptamani (RBV poate fi adaugata la pacientii fara raspuns anterior/cei cu ciroza)

Sofosbuvir + daclatasvir: 12 saptamani in cazul pacientilor naive, 24 de saptamani pentru cei experimentati (trebuie inclusi si cei fara raspuns la tratamentul cu TVR/BOC) (RBV poate fi adaugata la pacientii fara raspuns anterior/cei cu ciroza)

Acest ghid terapeutic propus de EASL, nu include anumite regimuri terapeutice pe cale de a fi aprobate la sfarsitul anului 2014 sau la inceputul anului 2015, respectiv: sofosbuvir/ledipasvir, ABT-450/ritonavir/ombitasvir si dasabuvir.

Pentrul genotipul 2:

Sofosbuvir + ribavirin: 12 saptamani (16-20 saptamani in cazul pacientilor cu ciroza, in special cu esec terapeutic anterior)

PegIFN/ribavirin + sofosbuvir: 12 saptamani la pacientii cu ciroza/cei experimentati

Pentru genotipul 3:

Sofosbuvir + ribavirin: 24 saptamani (indiferent de profilul pacientului, poliexperimentat/cu ciroza)

PegIFN/ribavirin + sofosbuvir: 12 saptamani

Sofosbuvir + daclatasvir: 12 saptamani (24 saptamani pentru pacientii experimentati)

Pentru genotipul 4:

PegIFN/ribavirin + sofosbuvir 12 saptamani

PegIFN/ribavirin + simeprevir: 12 saptamani, urmate de alte 12 saptamani in cazul pacientilor naive/relapseri, sau 36 de saptamanide PegIFN/RBV pentru cei cu raspuns partial/fara raspuns

PegIFN/ribavirin + daclatasvir: 12 saptamani, urmate de alte 12 saptamani de PegIFN/RBV sau suplimentar inca 12 saptamani de PegIFN/RBV + daclatasvir

Sofosbuvir + ribavirin: 24 saptamani in cazul pacientilor cu intolerant la IFN

Sofosbuvir + simeprevir: 12 saptamani (RBV poate fi adaugata la pacientii fara raspuns anterior/cei cu ciroza)

Sofosbuvir + daclatasvir: 12 saptamani in cazul pacientilor naivi, 24 de saptamani pentru pacientii experimentati (RBV poate fi adaugata la pacientii fara raspuns anterior/cei cu ciroza)

Pentru genotipul 5/6:

PegIFN/ribavirin + sofosbuvir 12 saptamani

Sofosbuvir + ribavirin: 24 saptamani in cazul pacientilor cu intolerant la IFN

Cunoasterea in detaliu a ciclului replicativ VHC, a condus la dezvoltarea unor compusi cu actiune antivirala specifica (STAT-C) si a agentilor terapeutici care tintesc in mod specific anumite proteine ale gazdei, astfel incat, infectia cronica VHC, posibil va fi eradicata, cu atat mai mult cu cat replicarea VHC este strict localizata intracitoplasmatic la nivelul hepatocitelor si nu exista rezervoare virale extracelulare (spre deosebire de HIV care prezinta ADN proviral integrat in limfocite sau VHB care are ADNc integrat in genomul hepatocitului). S-a observat ca rata de obtinere a RVS are un traiect ascendent, iar din anul 2013, noile regimuri terapeutice determina o eradicare a infectiei VHC intr-un procent mai mare de 90% din cazuri (Figura 5).

Figura 5. Evolutia agentilor terapeutici anti VHC [figura adaptata dupa FDA, 2011].

5.4. Hepatita acuta

In cazul hepatitei C acute, scopul tratamentului este de a preveni cronicizarea infectiei. Se recomanda tratamentul cu PegIFN timp de 24 de saptamani, nefiind necesara asocierea ribavirinei, reusindu-se evitarea evolutiei spre cronicizare in aproximativ 90% din cazuri [Wiegand, 2006]. Pacientii simptomatici prezinta o sansa mai mare de a obtine vindecare spontana [Gerlach, 2003; Hofer, 2003], in schimb, persoanele asimptomatice au cel mai mare risc de evolutie spre hepatita C cronica.

Prevenirea evolutiei infectiei acute VHC spre cronicizare este posibila intr-un numar mic de cazuri, pe de o parte pentru ca hepatita C este diagnosticata de regula in stadii tardive, cand devine simptomatica, iar pe de alta parte, deoarece anumiti pacienti diagnosticati cu hepatita acuta VHC prezinta contraindicatie pentru tratamentul cu interferon (in special: consumatorii de droguri si cei cu afectiuni neuropsihiatrice) [Broers, 2005; Wiegand, 2006].

Numeroase intrebari cu privitoare la abordarea terapeutica a hepatitei acute C isi vor gasi raspunsul, probabil in urma studiilor clinice aflate in derulare (Tabelul 17).

Tabelul 17. Intrebari cu privire la abordarea terapeutica a hepatitei acute C [Cornberg, 2009].

5.5. Coinfectia VHC/HIV

Infectia HIV accelereaza progresia infectiei VHC si determina cresterea ratei de morbiditate si mortalitate in randul acestor pacienti. Pentru acest grup special, in care infectia VHC este in principal cu genotipurile 2, 3 sau 4, terapia cu PegIFN/RBV ramane de baza, determinand un RVS de 50%. In schimb, in cazul pacientilor coinfectati cu genotipul 1 VHC, tripla terapie (PegIFN/RBV+BOC/TVR) este recomandata, determinand un RVS de 70% [Sulkowski, 2013]. S-a observat, in studii clinice de faza II, ca in urma administrarii de PegIFN/RBV+simeprevir/sofosbuvir/faldaprevir, rata de RVS este comparabila cu cea obtinuta in cazul monoinfectiei VHC [Jacobson, 2013 ; Sulkowski, 2013; Rockstroh, 2013]. Interactiunea intramendicamentoasa intre agentii terapiei HAART si STAT-C, impune o selectie riguroasa a acestora si o monitorizare stricata.

5.6. Coinfectia VHC/VHB

Coinfectia VHC/VHB reprezinta o provocare din cauza interactiunii complexe intre aceste doua virusuri. Nu s-a stabilit inca nici un tratament standard, decizia fiind luata in functie de virusul dominant. Terapia standard, PegIFN/RBV s-a dovedit a fi eficienta, dar odata cu descoperirea agentilor antivirali cu actiune directa se deschide o noua cale.

5.7. Pacientii transplantati

Terapia antivirala consta in combinatia standard, PegIFN/RBV, care determina eradicarea virusului intr-un procent de 15-20% la pacientii cu genotip 1 si de 20-30% in cazul genotipului 3 [Everson, 2005; Forns, 2003]. Desi toxicitatea creste considerabil, tripla terapie determina o imbunatatire importanta a RVS. In prezent, mai mult de 93% dintre pacientii care primesc 400 mg/zi de sofosbuvir + RBV, pentru 24 de saptamani, au obtinut un nivel de ARN VHC nedetectabil in momentul transplantului [Curry, 2013]. De asemenea, odata cu aparitia recurentei VHC post-transplant, administrarea de sofosbuvir + daclatasvir, determina obtinerea de RVS [Fontana, 2013].

5.8. Pacientii cu hepatita C cronica si ciroza

Pacientii cu ciroza hepatica prezinta anumite particularitati: au capacitatea redusa de a elimina virusul, o rata de RVS substantial scazuta si numeroase reactii adverse la tratamentul antiviral. Cu cat boala hepatica este mai severa cu atat tratamentului devine o necesitate.

Regimurile terapeutice aprobate in prezent, sunt bazate pe interferon, astfel ca, se recomanda:

Pentru genotipul 1:

PegIFN/RBV+BOC

PegIFN/RBV+sofosbuvir (80% RVS) [Lawitz, 2013]

PegIFN/RBV+TVR

PegIFN/RBV+simeprevir (65 % RVS vs 40% obtinut cu SoC) [Manns, 2013]

Pentru genotipul 2 si 3:

PegIFN/RBV (62% RVS pentru genotipul 2; 34% RVS pentru genotipul3) sau sofosbuvir +RBV (91%RVS pentru genotipul 2, respectiv 34% pentru genotipul 3) [Lawitz, 2013; Gane, 2013].

Pentru genotipul 4:

PegIFN/RBV±sofosbuvir

Aceste combinatii cu agenti STAT-C au crescut semnificativ rata de RVS. Rezultatele sunt tot mai promitatoare, studiul COSMOS, raporteaza o rata de 100 % in cazul pacientilor cu genotip 1 VHC si cu fibroza F3/F4, tratati cu simeprevir+sofosbuvir+RBV, pentru 24 de saptamani [Lawitz, 2013]. In studiul TURQUOISE II, la pacientii naivi, cirotici, cu genotip 1, combinatia de 3 agenti STAT-C (ABT-450+ombitasvir+dasabuvir ±RBV), determina un RVS de 96% dupa 24 saptamani de tratament [http://abbvie.mediaroom.com].

Din pacate majoritatea pacientilor infectati VHC traiesc in zone geografice, in care diagnosticarea, monitorizarea, cat si noile terapii nu vor fi disponibile in viitorul apropiat; astfel incat, se asteapta moleculele generice, care, asa cum s-a intamplat in cazul infectiei HIV, au permis la nivel mondial accesul la terapia HAART (de exemplu, in India, s-a anuntat deja, producerea moleculei generice de sofosbuvir, la un pret de 5% din valoarea moleculei originale).

CERCETARI PERSONALE

INTRODUCERE

Hepatita C reprezinta o problema majora de sanatate publica din cauza numarului mare de noi infectii in fiecare an. In Romania, prevalenta infectiei VHC in populatia generala este crescuta, variind intre 2,5 % si 5,1%, cu diferente majore intre mediul rural si cel urban, ceea ce poate reflecta, fie nivelul diferit de testare intre aceste zone, fie indicii de performanta scazuti ai laboratoarelor, in confirmarea unui test serologic pozitiv, fie asocierea unor factori precum: nivelul de igiena, accesul la serviciile medicale de specialitate, utilizarea la domiciliu a tratamentelor empirice si statusul socio-economic scazut. Tinand cont ca majoritatea persoanelor infectate au varsta cuprinsa intre 40 si 49 de ani, este posibil ca numarul bolilor hepatice terminale si al deceselor consecutive infectiei cronice cu VHC, sa creasca substantial in urmatorii 10-20 de ani [Gheorghe, 2009].

In ultimi ani, la nivel european, dar si national, epidemiologia infectiei VHC si parametrii epiemiologici (prevalenta, incidenta, distributia genotipurilor, factorii de risc importanti in achizitia VHC) s-au schimbat in mod semnificativ [Gheorghe, 2010], pe de-o parte, ca urmare a imbunatatiri serviciilor sanitare, si prin urmare a diagnosticarii crescute a infectiei cronice, iar pe de alta parte, datorita cresterii numarului de utilizatori de droguri injectabile (IDU) si a migratiei continue a populatiei din zonele endemice.

In prezent, datele despre genotipurile VHC circulante in Romania sunt putine si limitate la anumite grupuri populationale, sugerand dominanta genotipului 1b (gasit in > 90% din cazurile tratate), asociat majoritar infectiilor achizitionate parenteral, inainte de 1990.

In aceste conditii, studiul de fata si-a propus:

Stabilirea genotipurilor VHC prevalente in populatia generala din Romania si asocierea cu anumiti factori de risc pentru achizitia infectiei VHC;

Identificarea genotipurilor virale circulante la grupe vulnerabile, cu risc inalt pentru achizitia infectiei VHC: utilizatorii de droguri injectabile;

Evaluarea influentei genotipurilor virale asupra progresiei bolii hepatice, prin studiul pacientilor cu transplant hepatic si stabilirea unor corelatii intre genotipul infectant si markerii surogat ai evolutiei fibrozei, atat la pacienti monoinfectati VHC, naivi terapeutic, cat si la pacienti coinfectati HIV/VHC.

CAPITOLUL 6 – STUDIUL ASUPRA EPIDEMIOLOGIEI MOLECULARE A INFECTIEI VHC IN ROMANIA *

6.1. Introducere

Epidemiologia infectiei VHC este intr-o continua transformare din cauza aparitiei, in tarile dezvoltate economic, a unui nou factor de risc important in achizitia acesteia; respectiv, a consumului de droguri injectabile (IDU) [Esteban, 2008]. Totusi, in Romania, tara cu prevalenta a infectiei VHC de 3,23% in populatia adulta, exista putine informatii disponibile referitoare la distributia genotipurilor si a subtipurile VHC. Date provenite din analiza unor subgrupuri incluse in studii europene (ENMS si ACHIEVE) au sugerat ca genotipul 1/1b este aproape exclusiv detectat la pacientii cu hepatita cronica C din Romania (99,13% din 461 pacienti, in studiul ENMS, aveau genotipul 1, fara identificarea subtipului; in timp ce 93,46% dintr-un lot de 153 de pacienti, in studiul ACHIEVE, au avut subtipul 1b) [Grigorescu, 2009]. Desi alte studii locale, realizate pe loturi restranse de pacienti au identificat predominanta tipului 1b [Iancu, 2002]; in ultima vreme, s-a constatat o oarecare schimbare in spectrul genotipurilor, din cauza aparitiei subtipului 1a. De asemenea, studii anterioare realizate de catre grupul nostru de cercetare, au pus in evidenta circulatia acestui subtip, mai ales la persoanele tinere. Istoria reconstruita a epidemiei VHC inregistreaza o crestere exponentiala a subtipurilor 1a si 3a care tind sa inlocuiasca subtipul 1b, majoritar in tarile europene, cu precadere in randul utilizatorilor de droguri injectabile. Rata de dublare a numarului de infectii cu aceste genotipuri a fost estimata ca fiind de 7 ani [Pybus, 2005].

In acest context, ne-am propus analiza epidemiologiei moleculare a infectiei VHC, cu evidentierea dinamicii circulatiei genotipurilor virale si asocierii acestora cu factorii de risc importanti pentru achizitia infectiei.

6.2. Material si metoda

Am efectuat un studiu retrospectiv, care a cuprins 241 pacienti infectati VHC, diagnosticati intre septembrie 2004 – octombrie 2008 si care au prezentat replicare virala activa (respectiv, un nivel ARN VHC detectabil). La inrolarea in studiu, toti pacientii au completat un chestionar standardizat despre o serie de caracteristici socio-demografice si factori de risc posibil corelati cu achizitia infectiei (Tabelul 18).

Tabelul 18. Chestionar – Caracteristicile socio-demografice si factorii de risc implicati in achizitia infectiei VHC.

Consimtamantul informat aprobat de Comitetul de Bioetica al Institutului de Virusologie Stefan S. Nicolau, a fost obtinut de la toti pacientii inclusi in studiu.

Evaluarea cantitativa a ARN VHC plasmatic s-a realizat prin tehnica RT-PCR (cu ajutorul kitului comercial Cobas Amplicor VHC Monitor, vers 2.0, Roche, Germania, avand intervalul de linearitate cuprins intre 600-700000 UI/mL si o limita inferioara de detectie de 600 UI/mL).

Genotiparea secventelor VHC a fost realizata cu ajutorul unui test comercial VERSANT™ HCV Genotype 2.0 Assay, Siemens. Acesta utilizeaza hibridizarea cu sonde moleculare cu specificitate pentru regiunile conservate, pentru evidentierea profilului specific unui anumit genotip, utilizand doua fragmente de ADN viral biotinilat de 240 si, respectiv, 270 perechi de baze din regiunile 5´NTR si core.

Pentru analiza statistica s-au folosit teste univariate, determinandu-se coeficientul Chi2 al lui Pearson („testul chi-patrat Pearson al asocierii”) si testul exact Fisher. Pentru valoarea lui p ne interesează valoarea lui p two-tail (test bidirectional). Datele au fost analizate cu ajutorul programului SPSS, versiunea 11.

6.3. Rezultate

6.3.1. Caracteristicile demografice ale lotului de pacienti

83,8% dintre pacientii acestui studiu provin din mediul urban, cu varsta medie de 42,6 ± 14,9 ani, 83% dintre ei au varsta cuprinsa intre 20-59 ani, iar 62% au fost de sex feminin (raportul F/M=1,62). Datele raportate de noi au fost in conformitate cu cele din studiile anterioare, in care s-a aratat existenta unei prevalente VHC diferita semnificativ, intre zonele rurale si cele urbane (3,8% si respectiv, 2,6%) [Gheorghe, 2010]. Analiza distributiei in functie de varsta este prezentata in figura de mai jos (Figura 6).

Figura 6. Distributia pacientilor in functie de varsta.

In cadrul lotului studiat, varsta pacientilor de sex feminin este mai ridicata decat a celor de sex masculin (72,2 % dintre femei, comparativ cu 39,8 % dintre barbati au > 40 de ani, p <0,001, OR = 4,9% CI =2,05-7,63) (Figura 7).

Figura 7. Distributia in functie de varsta si sex.

6.3.2. Caracteristicile virusologice

93,2% dintre pacientii cu anticorpii anti-VHC pozitivi care au reactivitate inalta in testele de triaj (DO/CO ≥ 3) prezinta profil complet in testele de confirmare, iar 92,6% dintre ei au avut un nivel detectabil de ARN VHC.

61,2% dintre pacienti au avut incarcare virala mare (10- 10 IU/ml) si nu au existat diferente semnificative statistic intre valoarea viremiei la pacientii cu varsta <40 de ani, comparativ cu a celor care au varsta mai mare de 40 de ani (p=0,63, OR=1,34, 95%CI=0,75 – 2,41). Distributia pacientilor in functie de nivelul de ARN VHC poate fi urmarita in tabelul de mai jos.

Tabelul 20. Distributia pacientilor in functie de incarcarea virala.

La toti pacientii cu o incarcare virala mai mare de 1000 IU/ml a fost evaluat genotipul VHC, insa rezultate reproductibile au fost obtinute pentru probele cu valori ale ARN VHC de 1,6 x 104-1,4 x 106IU/ml.

2,8% dintre pacienti au prezentat incarcare virala nedetectabila, in acest caz, neputand fi determinat genotipul viral.

6.3.3. Genotipurile virale

Genotipul 1b ramane prevalent in Romania, fiind identificat la 92,6% dintre pacienti; genotipul 1a, la 5,4%; in timp ce, genotipurile 4a si 3a au fost identificate la 1,2%, respectiv 0,8% dintre acestia (Figura 8).

Figura 8. Distributia genotipurilor VHC in lotul studiat

Pacientii infectati cu genotip 1b, au avut varsta medie mai mare, comparativ cu cei la care am izolat subtipuri non 1b, acest aspect sprijinind ideea de introducere timpurie a infectiei VHC in Romania.

Subtipul 1a a fost identificat la pacientii mai tineri, astfel incat 84,6% dintre cei infectati cu acest subtip au varsta ≤40 ani, iar genotipurile non 1b au fost identificate la 36,8% dintre ei (p=0,007, OR = 7,4). Am observat ca varsta medie a pacientilor infectati cu genotipurile 1a si 3a (28,4±11,5ani, respectiv 24,5±0,5 ani) este mai mica decat in cazul genotipurilor 1b si 4a (43,5±14,6 ani, respectiv 46,5±30,4 ani, p<0,001) (Tabelul 21).

Tabelul 21. Caracterizarea pacientilor in functie de varsta.

Din cauza gradului inalt de conservare la nivelul 5'UTR intre diferitele subtipuri VHC, metodele de genotipare comerciale, posibil au o putere de rezolutie mai slaba in diferentierea unor subtipuri; insa, in acest studiu, in cazul tuturor probelor testate, rezultatele obtinute prin metoda comerciala au fost concordante, cu cele obtinute, prin secventierea regiunii core, de catre colectivul de cercetare de la INCDMI Cantacuzino, in cadrul proiectului CEEX, nr. 158/2006. 

6.3.4. Analiza filogenetica

Colectivul de cercetare de la INCDMI Cantacuzino a realizat caracterizarea moleculara cu ajutorul analizei filogenetice, prin calcularea distantei genetice intre secventele din regiunea core, rezultand urmatorul arbore filogenetic al tulpinilor VHC circulante pe teritoriul Romaniei, comparativ cu cele apartinand bazei de date GenBank (Figura 9).

Figura 9. Analiza filogenetica in regiunea core a tulpinilor VHC de pe teritoriul Romaniei, comparativ cu alte tulpini ale bazei de date GenBank, folosind urmatoarele numere de acces.Arborele filofgenetic a fost creat prin metoda UPGMA, folosind programul Mega 4 pe baza maximei verosimilitudini (“maximum likelihood”).

Datele acestui studiu pledeaza pentru corectitudinea informatiilor oferite de metodele comerciale, rapide si standardizate de genotipare si ofera premizele unei monitorizari adecvate a epidemiologiei moleculare a infectiei VHC.

6.3.5. Identificarea cailor de transmitere a VHC si a focarelor de infectie in Romania

In acest scop, am evaluat factorii de risc implicati in achizitia infectiei VHC la toti pacientii inclusi in studiu, pe baza chestionarului care a cuprins informatii legate de caracteristicile socio-demografice, datele clinice, biochimice si virusologice ale acestora.

21,2 % dintre pacienti au raportat un singur factor de risc, in timp ce restul au avut mai multi factori de risc intricati. De exemplu, interventiile chirurgicale au o pondere importanta in achizitia infectiei VHC cu ambele genotipuri (atat 1b, cat si 1a). Ordinea descrescatoare a prevalentei factorilor de risc este urmatoarea (Figura 11):

tratamentele stomatologice invazive (62,2%);

tratamentele injectabile multiple (37,8 %);

interventiile chirurgicale majore (21,6 %);

transfuziile de sange si derivate de sange primite inainte de anul 1990 (13,7 %);

body piercing-ul si tratamentele cosmetice (9,1 %);

multiplii parteneri sexuali si bolile cu transmitere sexuala in antecedente (1,2%).

Figura 10. Distributia genotipurilor VHC in functie de factorii de risc pentru achizitia infectiei VHC.

De asemenea, am observat ca:

femeile comparativ cu barbatii sunt mai frecvent expuse la factori de risc cu transmitere parenterala: transfuzii, interventii chirurgicale majore, tratamente parenterale multiple ( 68,5 % vs 43,5 %, p < 0,001, RR = 1,513; 95 % CI = 1,2 – 1,905).

interventiile chirurgicale si tratamentele stomatologice la risc sunt frecvent implicate in achizitia infectiei cu genotipul 1b VHC (p < 0,001, RR = 1,546; 95 % CI = 1,256 – 1,09) (Figura 12).

Figura 11. Distributia genotipurilor in functie de intreventiile chirurgicale si stomatologice la risc.

un nou factor de risc observat este reprezentat de utilizarea de droguri injectabile, identificat in antecedentele unui numar de 17 pacienti, cu varsta cuprinse intre 20-35 ani. Desi insuficient probata, in mare parte datorita reticentei in recunosterea unui comportament la risc asociat cu sanctiuni legale si stigmat social, aceasta cale de transmitere a infectiei VHC se raspandeste in special in Bucuresti, unde Agentia Nationale Antidrog (ANA) a estimat un numar mai mare de 24000 de persoane (aproximativ 1% din populatia capitalei) consumatoare de heroina (IDU). Acest comportament la risc ar putea conduce la o explozie a infectiilor cu asa numitii „blood borne pathogens” (HIV, VHB, VHC).

cei 17 pacienti (7,1%) care au ca si factor de risc pentru achizitia infectiei VHC, consumul de droguri injectabile, sunt semnificativ mai tineri comparativ cu cei expusi transmiterii parenterale, avand varsta medie de 28,4 ani versus 43,5 ani (95% CI = [ -15,77 – 14,91], p < 0,001).

13% dintre toti pacientii de sex masculin, comparativ cu 3,4% dintre femei, au raportat consumul de droguri injectabile (p = 0,007, OR = 0,23, 95 % CI = 0,08 – 0,68).

la persoanele VHC pozitive care au recunoscut utilizarea de droguri injectabile, s-a identificat in 84,6% din cazuri genotipul 1a, si doar in 19,7 % dintre infectii a fost izolat gentipul 1b, p = 0,003).

aceste rezutate semnaleaza posibilitatea unor shifturi majore la nivelul distributiei cladelor dominate cu posibilitatea expansiunii rapide a unei tulpini care a circulat anterior la nivel scazut, fie prin propagare in rindul unei grupe de persoane cu risc inalt- utilizatorii de droguri injectabile intravenos, pina atunci slab reprezentate la nivel populational, fie prin dobindirea unei eficiente mai mari de transmitere.

transmiterea sexuala a VHC nu este concludenta. Majoritatea studiilor care afirma aceasta cale se refera la grupe de populatie in care rolul altor factori care actioneaza in transmiterea VHC nu poate fi ignorat, respectiv in randul: consumatorilor de droguri injectabile, homosexualilor si a celor coinfectati VHC/HIV. In cuplurile discordante din punctul de vedere al serologiei VHC, prevalenta anticorpilor anti-VHC la ambii parteneri dupa 10-15 ani de convietuire este de numai 2-3%, ceea ce semnifica un risc anual de 0,2-0,3%. Dintre pacientii inclusi in acest studiu, numai la 2,8%, am identificat ca si factor de risc calea de transmitere heterosexuala, asociata insa intotdeauna cu un alt factor, in contextul unor multiple antecedente legate de transmiterea parenterala.

nu am avut posibilitatea evaluarii transmiterii materno-fetale, intre pacientii inclusi in studiu neexistand femei gravide.

6.4. Discutii

Desi rezultatele genotiparii, demonstreaza ca genotipul 1b este inca predominant in cadrul epidemiei de hepatita C din Romania, se observa aparitia unei cresteri exponentiale a subtipurilor 1a, 3a si 4a care tind sa inlocuiasca subtipul 1b. In studiul nostru, subtipurile non-1b apar, in special, in mediul urban, din cauza raspindirii cu rapiditate a unor noi cai de achizitie ale infectiei VHC, cum ar fi: consumul de droguri injectabile, tatuajele si piercing-ul.

In Romania, in anul 2010, o monitorizare de rutina a prezentei bolilor infectioase in randul IDU, arata ca infectia VHC depaseste media europeana si are o prevalenta in crestere, de la 45,8% la 65,7% intre anii 2005-2010 [EMCDDA, 2010]. De asemenea, s-a estimat ca in Bucuresti, aproximativ 1% din populatia orasului (aproximativ 24000 de persoane) isi injecteaza heroina, posibil, acest comportament determinand o explozie a infectiilor cu asa numitii “blood borne pathogens" (VHC, VHB, HIV). Am observat ca pacientii din acest studiu, infectati cu genotipurile non-1b sunt mai tineri, provin din mediul urban si au ca factor de achizitie a infectiei VHC, in principal consumul de droguri injectabile. Datele obtinute sunt in concordanta cu raportarile ANA, care arata ca in Romania, heroina este utilizata in special de catre tineri, aproximativ 70% din cererile pentru tratament de substitutie, in cazul dependentei de heroina, sunt inregistrate in randul persoanelor cu varsta sub 29 de ani. De asemenea, si debutul consumului de heroina apare la o varsta tanara: 42% dintre subiecti fiind incadrati in grupa de varsta 15-19 ani [EMCDDA, 2010].

Prin analogie cu epidemia HIV, nu trebuie neglijata posibilitatea aparitiei unor shifturi majore la nivelul distributiei cladelor dominate cu expansiunea rapida a acestor tulpini (non-1b) care au circulat anterior la nivel scazut, fie prin propagare in rindul unei populatii cu risc inalt, fie prin dobindirea unei transmiteri mai eficiente. De exemplu, in Europa de Vest, prevalenta infectiei cu genotipul 1a, deja a depasit pe cea cu genotipul1b. In plus, in randul IDU din diferite tari vest europene: Regatul Unit [Cochrane, 2002], Austria [Haushofer, 2001], Germania [Huppe, 2008, Wiese, 2005] si Italia [Cenci, 2003], s-a inregistrat o crestere usoara a prevalentei genotipului 3 (intre 12% si 35%). Informatii similare au fost raportate si in urma studiilor realizate in Europa de Est:

in Republica Ceha, in ultimii 15 ani, se observa o crestere a prevalentei genotipurilor 1a (13,3%) si 3a (19,7%), in paralel cu aparitia si cresterea incidentei consumului de droguri injectabile [Nēmecek, 2009].

in Polonia, proportia genotipului 1b a scazut (57,5%) in favoarea genotipului 3a (31,3%), in principal, dar nu exclusiv, in randul IDU [Chlabicz, 2008].

rapoartele recente din Slovacia au subliniat prezenta intr-un procent crescut a genotipului 3 (de 60,9%) in randul IDU [Gazdik, 2009],

in Rusia, genotipul 3a pare să fi depasit ca si prevalenta genotipul 1a in randul populatiei tinere si IDU (56,9% si respectiv 11,9%) [Paintsil, 2009].

Rezultatele obtinute in acest studiu sunt confirmate de secventierea realizata in regiunile 5’NTR si core de catre un colectiv de la Institutul Cantacuzino. Arborii filogenetici rezultati au aratat ca tulpinile 1b predomina si se inrudesc cu tulpini din alte regiuni geografice, fara a forma o grupare specifica. Aceasta observatie fiind in conformitate cu rapoartele altor tari europene [Esteban, 2008] si sugereaza ca transmiterea globala a infectiei VHC, implica atat transfuziile de sange si derivate de sange netestate corespunzator, cat si folosirea de ace si seringi nesterilizate. Existenta tulpinii 4a in Romania a fost pentru prima data raportata dupa evaluarea prin RFLP a regiunea 5’NTR si prin secventiere a regiunii NS5B [Oprisan,2009], fiind apropiata genetic de tulpini 4a din Egipt, mai precis de tulpina de referinta ED43 care provine de la un egiptean politransfuzat in anii ’80 in Cairo. Este posibil ca tulpina sursa sa fi fost importata la noi din aceasta regiune. Desi, genotipul 4 este intalnit frecvent in tarile din Orientul Mijlociu si din Africa, in ultima perioada a fost izolat si in cateva tari europene, respectiv in Italia, Franta, Grecia si Spania, cu precadere in randul IDU si a emigrantilor; prevalenta sa fiind de 10-24% [Antaki, 2010].

Doar un sfert dintre pacientii inclusi in acest studiu au avut un singur factor de risc pentru achizitia infectiei VHC; in schimb, la majoritatea au fost identificati mai multi factori de risc intricati, astfel incat modificarile in evolutia epidemiei, pot fi detectate prin asocierea potentialilor factori de risc cu genotipurile VHC circulante.

Prezenta multiplilor factori de risc intricati determina circulatia concomitenta a mai multor subtipuri care pot genera infectii multiple, cu apariția recombinantilor (CRF) care pot deveni dominanti in unele zone geografice (exista deja date globale asupra emergentei recombinantilor intergenotipici-de tip 2k/1b, cat si intragenotipici 1a/1b) [Colina, 2004; Kalinina, 2004]. Recombinarea joaca rolul unui mecanism evolutiv al acestui virus ARN, determinand adaptarea lui la conditiile gazdei, cu posibile implicatii in istoria naturala a infectiei VHC, prin modificarea rezistentei la tratamentul cu interferon si a evolutiei catre boala hepatica cronica sau neoplasm.

Varsta medie mai mare a populatiei de sex feminin, asociata cu prevalenta ridicata a infectiei VHC, poate duce la concluzia ca aceasta a fost achizitionata pe cale iatrogena, inainte de anul 1989, mai ales, din cauza adresabilitatii mai mari a femeilor catre medic si a tipului de patologie caracteristica sexului feminin.

In acest studiul, transfuzia de sange ramane factorul de risc cel mai frecvent intalnit in randul pacientilor nou diagnosticati. Atat timp cat screeningul donatorilor nu se va face cu teste moleculare de detectie a ARN VHC, existenta unei ferestre serologice prelungite, expune primitorii de sange la riscul achizitiei infectiei VHC. Tratamentele parenterale multiple si interventiile stomatologice nu reprezinta factori de risc semnificativi pentru achizitia infectiei VHC, fiind uniform distribuiti in antecedentele pacientilor cu hepatita C. Studiul nostru nu a identificat focare de infectie transmise parenteral. Identificarea legaturii epidemiologice certe intre tratamentele injectabile multiple si transmiterea VHC este de importanta deosebita pentru stabilirea filiatiei epidemiologice a cazurilor si a eficientei masurilor de control a raspandirii VHC in Romania, fiind cunoscut faptul ca astfel de manevre executate in conditii improprii, pot conduce la epidemii iatrogene majore (ilustrative sunt cazurile: Egiptului unde tratamentul in masa al schistosomiasei cu un compus tartar emetic administrat intravenos cu seringi refolosibile, a dus la infectarea a peste 10% din populatie cu VHC, si al Libiei-Benghazi- unde a fost recent raportata o epidemie nosocomiala de amploare cu HIV, aproximativ 40% din cei 441 copii infectati HIV, au avut si anticorpii anti-VHC pozitivi) [Oliveira, 2006; Darwish, 2001].

6.5. Concluzii

Rezultatele genotiparii demonstreaza ca, desi genotipul 1b (in 92,6% din cazuri) este inca predominant; in cadrul epidemiei de hepatita C din Romania, se observa o crestere accelerata a infectiilor cu noi subtipuri : 1a, in 5,4% din cazuri; iar 4a si 3a la 1,2%, respectiv 0,8% dintre acestia. Date ulterioare de filogenie, au adus argumente pentru introducerea recenta a tulpinilor VHC apartinand subtipului 1a, probabil dintr-o sursa comuna mai multor tari europene.

Majoritatea pacientilor prezinta mai multi factori de risc importanti in achizitia infectiei VHC, astfel incat, modificarile in evolutia epidemiei, pot fi detectate prin asocierea potentialilor factori de risc cu genotipurile VHC circulante, de exemplu:

tratamentele parenterale multiple si interventiile stomatologice invazive

s-au asociat in mod semnificativ cu achizitia infectiei cu genotipul 1b;

consumul de droguri injectabile, reprezinta un nou factor de risc, asociat cu achizitia genotipurilor non 1b; persoanele infectate fiind semnificativ mai tinere comparativ cu cele expuse transmiterii posttansfuzionale sau parenterale (varsta medie de 28,4 ani versus 43,5 ani).

CAPITOLUL 7 – STUDIUL ASUPRA GENOTIPURILOR VHC CIRCULANTE IN RANDUL CONSUMATORILOR DE DROGURI INJECTABILE

7.1. Introducere

In ultimii ani, la nivel european, prevalenta infectiei VHC a atins o rata de 7,8/100000 de locuitori [ECDC, 2013], populatia cea mai afectata fiind cea cu varsta medie cuprinsa intre 25-44 ani. Principalul factor de risc pentru achizitia infectiei VHC, in special in tarile din Europa de Nord, este consumul de droguri injectabile [Esteban, 2008].

Prevalenta infectiei VHC in populatia generala din Romania este medie, de aproximativ 3,23%. Cu toate acestea, sunt putine date despre seroprevalenta infectiei VHC in randul consumatorilor de droguri injectabile (IDU), acest factor de risc fiind in crestere.

Conform datelor prezentate in capitolul anterior, desi in populatia generala continua sa predomine infectiile cu genotipul 1b, asociate transmiterii parenterale, un nou grup de risc pare sa se contureze – cel al utilizatorilor de droguri injectabile (IDU).

Tinand cont de cele mentionate anterior, prezentul studiu si-a propus identificarea seroprevalentei infectiilor virale cu cale de transmitere parenterala (VHC, VHB si HIV) si determinarea genotipurilor VHC circulante in randul acestui grup particular de risc.

7.2. Material si metoda

In acest sens, am analizat doua loturi de IDU:

primul lot, constituit intre anii 2008-2009, cuprinde 45 IDU monitorizati la centrul de adictie CAIA (Centrele de Asistentă Integrata a Dependentei) Pantelimon,

al doilea lot, constituit intre anii 2011- 2014, este alcatuit din 123 IDU, internati in Spitalul Victor Babes din Bucuresti, pentru infectii severe sistemice si sindrom de citoliza hepatica. Pentru toti pacientii s-au obtinut date legate de:

caracteristicile socio-demografice (varsta, sex, educatie),

consumul de droguri (perioada consumului de droguri, tipul de drog folosit, varsta la prima administrare a acestora),

alti potentiali factori de risc implicati in achizitia infectiilor virale cu transmitere prin sange si derivate de sange (VHC/VHB/HIV).

Consimtamantul informat a fost obtinut de la toti participantii. Studiul a fost aprobat de catre Comitetul de Bioetica al Institutului de Virusologie Stefan S. Nicolau.

Markeri virali testati. La initierea studiului, toate persoanele incluse au fost testate pentru:

infectia VHB: anticorpi anti-HBc totali, anticorpi anti-HBs si AgHBs.

infectia VHC: anticorpi anti-VHC,

infectia cu virusul imunodeficientei dobandite (HIV): anticorpi anti-HIV

infectia cu virusul HTLV care determina leucemie/limfom cu celule T: anticorpi anti-HTLV I&II.

Toti IDU cu AgHBs negativ, au fost testati pentru anticorpii anti-HBs. Daca AgHBs si/sau anticorpii anti-HBc au fost reactivi, am determinat si markerii de replicare virala activa: AgHBe si nivelul ADN VHB plasmatic. Determinarea markerilor serologici s-a realizat cu ajutorul tehnicilor imunoenzimatice de generatia a treia (EIA- kitul comercial de la DIA PRO diagnostic, Bioprobes, Italia).

Pentru cuantificarea ADN VHB am folosit metoda comerciala de amplificare a ADN-ului viral, Cobas AMPLICOR HBV Monitor test, Roche, cu intervalul de detectie intre 300-200000 copii/mL si cu limita inferioara de cuantificare de 300 copii ADN VHB/mL.

Pentru IDU cu anticorpi anti HIV prezenti (ELISA, urmata de confirmare prin Western Blot), s-a cuantificat nivelul incarcarii virale, ARN HIV prin metoda comerciala de amplificare TaqMan® HIV-1 Test, v2.0, avand domeniul de linearitate intre 20 – 10000000 copii/ml, cu limita inferioara de detectie la 20 copii/ml.

In cazul infectiei VHC, in conformitate cu recomandarile OMS, toate probele a caror densitate optica a avut un index de cut-off mai mic decat 3 (S/CO <3,0), sunt considerate inca reactive pentru anticorpii anti-VHC si sunt confirmate print metoda imunoblot, folosind kitul comercial DECISCAN HCV PLUS, BIO-RAD, Franta.

In cazul probelor pozitive, s-a detrerminat incarcarea virala VHC. Pentru primul lot, ARN VHC a fost cunatificat prin RT-PCR cantitativ cu testul Cobas Amplicor HCV Monitor, vers 2.0, Roche, care are limitele de detectie ale determinarii cantitative intre 600-700000 UI/ml si o limită inferioara de detectie de 600 UI/ml, iar pentru al doilea lot, a fost utilizata metoda real-time PCR, folosind testul comercial COBAS TaqMan HCV Test, v2.0, Roche, avand domeniul de linearitate intre 25 si 391 milioane UI ARN VHC/ml si limita inferioara de detectie de 25 UI ARN VHC /ml .

Genotiparea VHC a fost realizată prin tehnica de hibridizare inversa utilizand kitul comercial VERSANT ® HCV Genotype 2.0 Assay (LiPA), de la Siemens Medical Solutions Diagnostics in conformitate cu instructiunile producatorului.

Analiza statistica. Datele au fost colectate in Office excel 2010 iar prelucrarea statistica s-a efectuat;

pentru primul lot, cu ajutorul programul GraphPad InStat 3 utilizandu-se urmatoarele teste: Fisher (pentru a analiza tabelele de contingenta), Mann-Whitney (pentru compararea a două valori medii) si Kruskal – Wallis (pentru a compara valorile medii ale incarcaturii virale in infectii de diferite genotipuri VHC). Valoarea lui p <0,05 a fost considerata semnificativa statistic.

pentru cel de-al doilea lot, prelucrarea statistica s-a efectuat in IBM SPSS Statistics v.20. Pentru analiza univariata, date continui, s-a folosit t-test si ANOVA, iar pentru datele categoriale, testul chi-square. Nivelul de semnificatie statistica a fost p<0,05.

7.3. Rezultate

7.3.1. Primul lot de pacienti constituit*

7.3.1.1. Caracterizarea lotului de pacienti

In cadrul primului lot analizat, raportul barbati/femei a fost de 6,5; iar varsta medie a subiectilor de 27,6 ± 3,7 ani (variind intre 20-38 ani). Aproximativ un sfert (31,1%) dintre ei au avut varsta sub 25 de ani. Jumatate dintre persoanele incluse in studiu au absolvit liceul, dar nu au un loc de munca si aproximativ 95,5% dintre ei provin din mediul urban.

Durata medie a consumului de droguri a fost estimata la 9,8 ± 3,5 ani (intervalul fiind intre 1-18 ani); doar un singur pacient a raportat injectarea recenta de droguri (<1 an), iar 20% dintre ei, au inceput consumul de droguri inainte de implinirea varstei de 15 ani. Folosirea in comun a echipamentelor de injectare a fost declarata de 31,1% dintre participanti. Nu exista diferente semnificative statistic in functie de sex, din punct de vedere al caracteristicilor demografice si al istoricului injectarii drogurilor.

In ceea ce priveste statusul marital, 11,2% dintre IDU sunt casatoriti si numai 8,9% au avut o relatie stabila in ultimul an, in timp ce 50% declara ca au intretinut relatii sexuale cu mai mult de 10 parteneri, numarul mediu al acestora fiind de 10,52 ± 8,2 (variind intre 1-50). 13,3% dintre ei au avut in antecedente o boala cu transmitere sexuala.

Alti posibili factori de risc raportati, asociati in mod independent cu achizitia pe cale parenterala a infectiei VHC au fost: tatuajele (in 57,8% din cazuri), multiplele tratamente stomatologice invazive (in 55,6% din cazuri), piercing-ul (in 31,1% din cazuri) si interventiile chirurgicale (in 26,7% din cazuri). Nici unul dintre subiectii din studiu nu a primit transfuzii de sange sau transplant de organe (Figura 13).

Figura 12. Factori de risc importanti in achizitia infectiei VHC.

7.3.1.2. Markerii serologici ai infectiilor virale

Prevalenta anticorpilor anti-VHC pozitivi este crescuta, la 88,9% dintre IDU.

55,6% dintre IDU, au avut anticorpii anti-HBc reactivi, sugerandu-se o infectie VHB, anterioara sau prezenta, a carei prevalenta este similara indiferent de durata consumului de droguri. Nici un IDU nu a prezintat anticorpi anti-HIV pozitivi si doar la unul au fost identificati anticorpii anti-HTLV 1 si 2 reactivi (Figura 14).

Figura 13. Prevalenta infectiilor virale.

Numai 12% dintre subiecti au fost purtatori cronici de AgHBs, cu AgHBe negativ si doar 8,9% dintre ei au avut incarcare virala detectabila. Un singur pacient a fost diagnosticat cu hepatita B oculta caracterizata prin: prezenta ADN VHB si absenta AgHBs. 68% dintre cei care au trecut prin infectia VHB au o evolutie favorabila si au prezentat urmatorul profil serologic: anticorpi anti-HBc pozitivi, anticorpi anti-HBs prezenti, cu titrul mediu de 49,99 mUI/mL (titrul protector fiind > 10 UI/mL). 55% dintre IDU au avut markerii serici pentru ambele infectii VHC si VHB.

Diferentele dintre debutul consumului de droguri si seroprevalenta infectiilor VHC si VHB, nu s-au dovedit a fi semnificative statistica, de exemplu, la cei cu o perioada a consumului de droguri <10 ani, prevalenta anticorpilor anti-VHC a fost de 84,2%, iar in randul IDU cu istoric al consumului de droguri >10 ani, de 92,3%, p=0,64 (Tabelul 22).

Tabelul 22. Markeri serologici in functie de durata consumului de droguri.

Prevalenta anticorpilor anti-VHC este de 100% in randul persoanelor cu varsta <25 de ani. Media nivelului de ARN VHC a avut cea mai mare valoare la cei cu varsta peste 40 de ani, diferenta nu a atins insa semnificatia statistica (2,1 ± 4,2 ×105 pentru IDU din grupa de varsta 20-25 de ani vs. 1,6±5,5×105 pentru cei din grupul de varsta 25-30 si respectiv, 6,21±8,2×105 pentru cei cu varsta >30 de ani, p=0,13). Niciun pacient cu varsta >30 de ani nu prezinta AgHBs pozitiv sau ADN VHB detectabil (Tabelul23).

Tabelul 23. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de varsta.

Intre cei co-infectati VHC/VHB si cei cu monoinfectie VHC, nu exista diferente semnificative statistic din punct de vedere al:

caracteristicilor socio-demografice (de exemplu: varsta medie in primul grup este de 26,9±3,7 ani vs. 26,6±3,7 ani in cel de-al doilea grup, iar durata medie a consumului de droguri a fost estimata la 9,3±3,5 ani in primul grup vs. 10,9±3,3 ani in cazul celor monoinfectati)

multiplilor factori de risc important in achizitia infectiilor virale

57,8% dintre subiecti au avut ARN VHC detectabil. In cazul pacientiilor monoinfectati VHC, incarcatura virala a fost semnificativ mai mare, comparativ cu a celor co-infectati VHC/VHB (4,8 × 106 ± 8,4 × 105 UI /mL vs. 2,3 x 106 ± 4,7 x 105 UI / mL, p = 0,05). Nu am gasit nicio asociere semnificativa intre valoarea viremiei si durata consumului de droguri (9,6 ± 2,8 ani la cei cu viremie mica vs. 10 ± 3,4 ani in cazul celor cu incarcatura virala mare, p= 0,74).

7.3.1.3. Genotipurile VHC

In cazul celor 26 de IDU care au prezentat incarcare virala detectabila, la nivel >2000 UI/ml, a fost determinat genotipul VHC. In ordinea descrescatoare a prevalentei, rezultatele au aratat prezentagenotipului 1b la 50% dintre IDU, a genotipului 1a la 23,1%, a genotipului 4 la 11,5% si a genotipului 3a la 7,7% (2/26) dintre ei. Pentru doi pacienti nu a fost posibila diferentierea intre subtipul 1a sau 1b (Figura 15, Figura 16).

Figura 14. Distributia genotipurilor VHC.

Asocierea unui anumit genotip VHC, cu factorii importanti pentru progresia bolii (varsta la debutul consumului de droguri injectabile, durata mare a consumului de droguri injectabile, co-infectia cu VHB), nu determina diferente semnificative statistic, cel mai probabil datorita dimensiunii reduse a acestui prim lot studiat (Tabelul 24).

Tabelul 24. Caracterizarea parametrilor investigati in functie de genotipul VHC.

Cu toate acestea, pacientii infectati cu subtipul 3a tind sa fie mai tineri, comparativ cu restul (varsta medie a lor fiind de 24,5 ± 0,5 ani vs. 27,5 ± 2,8 ani in cazul celor infectati cu subtipului 1b, de 27,6 ± 3,7 ani pentru cei cu subtipul 1a si de 27,8 ± 3,6 ani pentru cei cu genotipul 4​​). De asemenea, am observat ca incarcatura virala medie a fost mai mare la pacientii infectati cu genotipuri 1a si 1b (4,9 x 106 si 2,1 × 106UI/ml), comparativ cu cei infectati cu genotipurile 3a si 4 (1,3 × 105 si respectiv 1,03 x 105 UI/ml, p = 0,48).

Figura 15. Profilul genotipurilor VHC utilizand kitul VERSANT™ HCV Genotype 2.0 Assay.

7.3.2. Al doilea lot de pacienti

7.3.2.1. Caracterizarea lotului de pacienti

In cadrul celui de al doilea lot, au fost monitorizati intre 2011-2014, 123 IDU, cu varsta medie de 29,95±14,23 ani (variind intre 15-45 ani), 87% (107/123) dintre ei sunt barbati, aproximativ 89% (109/123) provin din mediul urban, 70% (86/123) dintre ei sunt necasatoriti, iar 77% (95/123) declara ca au intretinut multiple contacte sexuale neprotejate. Cu toate ca jumatate dintre IDU sunt absolventi de liceu, 89% (109/123) nu au loc de munca. Chiar daca durata medie a consumului de droguri a fost de 8,07 ± 4,9 ani (intervalul fiind intre 2 luni-17 ani); iar in cazul a 8 IDU injectarea drogurilor este recenta (<1 an), doar 13,8% (17/123) declara debutul consumului de droguri inainte de implinirea varstei de 15 ani.

Posibilii factori de risc asociati cu achizitia infectiei VHC, in ordine descrescatoare a prevalentei sunt: folosirea in comun a echipamentelor de injectare (in 87% din cazuri), tatuajele (in 74,8% din cazuri), detentia (in 65% din cazuri), piercing-ul (la 50,4% dintre IDU), multiplele tratamente stomatologice invazive (in 40,6% din cazuri) si transfuziile de sange/interventiile chirurgicale (la 30,8% dintre IDU). Nici unul dintre subiectii studiului nu a primit transplant de organe (Figura 17).

Figura 16. Prevalenta factorilor de risc pentru infectia VHC.

*Tratam.stomat.=tratamente stomatologice invazive; Interv chirurg.=interventii chirurgicala

7.3.2.2. Markerii serologici ai infectiilor virale

Prevalenta anticorpilor anti-VHC este de 96% (118/123) si a anticorpilor anti-HBc de 65,8% (81/123). Aproape jumatate, 45% (36/81) dintre cei care au trecut prin infectia VHB raman purtatori cronici de AgHBs.

73% (90/123) prezinta anticorpi anti-HIV, 56% (55/90) fiind cu replicare virala activa. Valoarea medie a numarului de CD4 este de 563,44±437,29/ml; 38,2% (47/123) au un numar de CD4 mai mare de 500/ml, in timp ce doar 15% (19/123) au mai putin de 200 celule CD4/ml (Figura 18).

Figura 17. Seroprevalenta infectiilor virale si ai markerilor serici ai acestora.

7.3.2.3. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de anul internarii

In functie de anul internarii (2011-iunie 2014), am remarcat ca nu exista diferente semnificative intre carcateristicile socio-demografice (sexul masculin, varsta medie la debutul utilizarii drogurilor), anumiti factorii de risc implicati in achizitia infectiei VHC, prevalenta infectiei VHC si valoarea medie a incarcarilor virale (ARN VHC/ARN HIV).

Notam ca in anul 2011, comparativ cu ceilalti ani, am gasit rate semnificativ crescute ale prevalenta infectiei VHB (51,3% in anul 2011 vs 25% in 2012 vs 15,1% in 2013 vs 18,5%

pina in iunie 2014, p=0,011). Prevalenta infectiei HIV a inregistrat cresteri semnificative de la an la an (61,5% in anul 2011 vs 75% in 2012 vs 72,7 % in 2013 si respectiv 88,9% in 2014, p=0,008). Seroprevalenta anticorpilor anti-VHC a fost in mod constant peste 90%, iar in anul 2013, a atins o valoare de 100%.

De asemenea, am obtinut diferente semnificative intre ani, din punct de vedere al frecventei:

Pierciengului, cea mai ridicata rata fiind identificata in anul 2011 (66,6% vs. 50% pentru 2012, 51,5% pentru anul 2013 si 25,9% pina in iunie 2014, p=0,014);

Interventiilor stomatologice la risc (46,1% in anul 2011 vs. 62,5% in 2012 vs. 33,3% in 2013 vs. 22,2% in 2014, p=0,021);

Consumului mix de heroina si etnobotanice (77% in anul 2011 vs. 83,3% in 2012 vs. 100% in 2013 vs. 89% in 2014, p=0,032).

Prevalenta consumului de etnobotanice a inregistrat cresteri constante incepind cu anul 2011, ajungand in prezent la o rata de 96,3% depasind pe cea a consumului de heroina (92,6%). In lotul studiat, am identificat 5% (6/123), consumatori doar de etnobotanice, 8% (10/123), consumatori doar de heroina si 87% (107/123) dintre IDU au declarat un consum mix (etnobotanice si heroina) (Tabelul 25).

In functie de anul internarii, testul de dependenta liniara (Linear-by-Linear Association) a evidentiat o tendinta anuala, semnificativ descendenta a frecventei interventiilor stomatologice la risc (p=0,02) si a piercingului (p=0,008), in timp ce, consumul de etonobotanice (p=0,023) si seroprevalenta infectiei HIV (p=0,001) inregistreaza un trend semnificativ ascendent.

Tabelul 25. Caracterizarea lotului de IDU in functie de anul internarii.

* p semnificativ (<0.05) (Teste aplicate chi square pentru variabilele categoriale si t-test pentru variabilele continui)

7.3.2.4. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de grupa de varsta

Prevalenta infectiilor virale (VHC, VHB si HIV) difera semnificativ in functie de varsta participantiilor la studiu, astfel incat, IDU cu varsta mai mare de 35 de ani prezinta cele mai mari rate, de peste 80%, ale seroprevalentei infectiilor HIV si VHB si rate de peste 90% ale prevalentei anticorpilor anti-VHC (Figura 19). Subliniem ca toti pacientii cu varsta peste 35 de ani au un nivel detectabil de ARN VHC.

Figura 18. Seroprevalenta infectiilor virale in functie de varsta.

Frecventa multiplilor factori de risc importanti in achizitia infectiei VHC nu prezinta diferite semnificativ intre aceste grupe de varsta. Doar contactele sexuale neprotejate prezinta o tendinta semnificativ ascendenta odata cu inaintarea in varsta (p=0,017; la testul de dependenta liniara).

Desi nu au atins o semnificatie statistica, subliniem ca genotipurile non-1b, prezinta cea mai mare rata a prevalentei in randul persoanelor cu varsta <35 de ani (36,1% pentru grupa de varsta 15-24 vs. 31,3% pentru grupaa 25-34 si respectiv, 25% pentru IDU > de 35 de ani, p=0,796) (Tabelul 26).

Tabelul 26. Caracterizarea lotului de IDU in functie de grupa de varsta.

* p semnificativ (<0,05) (Teste aplicate chi square pentru variabilele categoriale si t-test pentru variabilele continui)

1post-hoc Tukey test : diferente semnificative (p<0,05) intre 15-24 si grupurile 25-34 si >35, dar nu si intre 25-34 si >35

2post-hoc Tukey test: diferente semnificative (p<0,05) intre >35 si grupurile 15-24 si 25-34 dar nu si intre 15-24 si 25-34

7.3.2.5. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de infectiile virale

Dintre cei 118 IDU care au prezentat anticorpi anti-VHC pozitivi, doar 15,2 % (18/118) au fost diagnosticati cu monoinfectie VHC, iar 56,8 % (67/118) au avut co-infectaie VHC/HIV. Nu am gasit diferente statistic semnificative intre IDU monoinfectati si cei cu dubla infectie VHC/HIV din punct de vedere al multiplilor factori de risc importanti in achizitia infectiilor virale (Figura 20).

Figura 19. Distributia factorilor de risc intre cele doua grupe (monoinfectati VHC-coinfectati VHC/HIV).

Consum mix(H.+E.)=consum mix (heroina+etnobotanice); C.S.N.=contacte sexuale neprotejate; E.I.in comun=utilizarea de echipamente de injectare in comun (seringi si ace); T.S.I.=tratamente stomatologice invazive; I.CH/T.S.=interventii chirurgicale/transfuzii de sange.

In privinta caracteristicilor socio-demografice, sexului masculin s-a asociat cu prezenta coinfectiei VHC/HIV, diferenta fiind la limita semnificatiei statistice (94,4% pentru cei cu monoinfectie vs. 80,5% pentru cei coinfectati, p=0,084). Intre aceste doua grupuri, diferentele dintre varsta medie la internare, varsta medie la debutul consumului de droguri si factorii de risc importanti in achizitia infectiei VHC nu au atins semnificatia statistica (Tabelul 27).

Valoarea medie a nivelului de ARN VHC a fost mai mare la IDU coinfectati VHC/HIV (1,9X106±3,9X106), comparativ cu nivelul viremiei obinute de cei monoinfectati VHC (1,9X105±4,4X105), diferenta fiind la limita semnificatiei statistice (p=0,09).

Tabelul 27. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de infectiile virale.

* p semnificativ (<0,05) (Teste aplicate chi square pentru variabilele categoriale si t-test pentru variabilele continui)

**numar prea mic de pacienti (probabil limiteaza obtinerea semnificatiei statistice)

7.3.2.6. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de nivelul de ARN VHC

Viremia VHC a fost determinata la 88 IDU si am obtinut un nivel detectabil (>25UI/mL) la 63 (71,6%) dintre ei.

Nu am obtinut diferente semnificative statistic intre IDU cu viremie VHC nedetectabila si cei cu un nivel de ARN VHC detectabil, din punct de vedere al caracteristicilor socio-demografice sau al factorilor de risc importantai in achizitia infectiei VHC.

In randul IDU cu ARN VHC detectabil, prevalenta infectiei HIV este mai mare (73%), comparativ cu a celor cu ARN VHC nedetectabil (51%, p=0,042). In schimb, prevalenta infectiei VHB s-a asociat semnificativ cu un nivel nedetectabil al viremiei VHC (79% vs. 23% rata seroprevalentei VHB in cazul pacientilor cu viremie detectabile, p=<0,001) (Tabelul 28).

In grupul de IDU coinfectati VHC/HIV, cu ARN VHC nedetectabil, comparativ cu cei coinfectati VHC/HIV, dar cu cu ARN VHC detectabil, am gasit valori scazute ale:

varstei medii la debutul consumului de droguri (15,75±6,85 vs. 19,05±6,23; p=0,346),

duratei medii de utilizarie a drogurilor (42,0±28,57 luni, respectiv 78,41±58,04; p=0,237),

numarului mediu al limfocitelor CD4/mmc (365,2±173,28 vs. 609,63±503,75; p=0,29).

In schimb, valoarea medie a viremiei HIV este mai mare (3,4X105±3,08X105 IU/mLvs. 2,9X105±4,8X105 IU/mL; p=0,87). Diferente observate in urma analizei nu au fost semnificative statistic, insa probabil ca semnaleaza recenta achizitie a infectiei HIV.

Tabelul 28. Distributia factorilor de risc importanti in achizitia VHC in functie de nivelul de ARN VHC.

* p semnificativ (<0,05) (Teste aplicate chi square pentru variabilele categoriale si t-test pentru variabilele continui

7.3.2.7. Genotipurile VHC

Identificarea genotipului VHC a fost posibila la 61 IDU care au avut incarcare virala detectabila, mai mare de 200 UI/mL. 36,1% (22/61) dintre IDU sunt infectati cu genotipul 1b, 29,5% (18/61) cu genotipul 1a, 11,4% (7/61) au genotip mix 1 (a+b), 8,2% (5/61) cu genotipul 4, iar cu subtipul 3a, 14,7% (9/61) dintre ei (Figura 21).

Figura 20. Distributia genotipurilor VHC incadrul lotului.

Desi anumiti factorii de risc, au fost mai frecvent implicati in achizitia genotipurilor VHC non 1b (tatuajele, detentia, utilizarea de seringi si ace in comun), totusi diferente semnificative statistic am obtinut doar in cazul piercingului (frecventa pentru IDU cu subtip 1b a fost de 36,4% vs. 66,7% pentru cei cu subtipuri non 1b, p=0,024) (Figura 22).

Intre IDU cu genotip 1b si cei cu genotipuri non 1b, prevalenta celorlalti factori de risc implicati in achizitia infectiei VHC (respectiv: interventiile stomatologice la risc, transfuziile de sange/interventiile chirurgicale inainte de 1989, tatuajele, contactele sexuale neprotejate), nu au avut semnificatie statistica.

Figura 21. Distributia factorilor de risc in functie de genotipul VHC.

T.H.=toxicomanie cu heroina; T.E.=toxicomanie cu etnobotanice; C.S.N.=contacte sexuale neprotejate; E.I.in comun=utilizarea de echipamente de injectare in comun (seringi si ace); T.S.I.=tratamente stomatologice invazive; I.CH/T.S.=interventii chirurgicale/transfuzii de sange

Subtipurile non1b, au fost identificate preponderent in randul barbatilor (92,3% vs. 81,8% pentru cei cu genotip 1b, p=0,205), cu varsta medie la debutul consumului de droguri injectabile de 19,07± 6,68

Prevalenta infectiei HIV a fost mai mare in randul IDU cu genotipuri non 1b (81,8% vs. 89,7% pentru cei cu genotip 1b, p=0,470), iar valoarea medie a ARN HIV, de asemenea, a inregistrat valori crescute (3,9X105±7,1X105vs. 3X105±5,1X105 fata de cei cu genotip 1b, p=0,463).

In acelasi timp, media viremiei VHC, in randul IDU cu genotipuri non 1b a avut valoarea semnificativ mai mica comparartiv cu cea a celor cu genotip 1b (1,7X106±2,2X106 vs. 3,5X106±6,04X106, p=0,005) (Tabelul 29).

Tabelul 29. Caracterizarea lotului in functie de prevalenta genotipurilor VHC.

* p semnificativ (<0,05) (Teste aplicate chi square pentru variabilele categoriale si t-test pentru variabilele continui;

7.4. Discutii

In anul 2012, in conformitate cu datele ultimului raport al Agentiei Nationala Antidrog (ANA), in Bucuresti au fost declarati 10583 IDU, 55% fiind consumatori de heroina. Profilul consumatorului de heroina ramane nemodificat comparativ cu anii anteriori: majoritatea sunt barbati, cu varsta cuprinsa intre 30 si 39 de ani, cu nivel de scolarizare scazut, someri/fara loc de munca, varsta debutului consumului de droguri fiind intre 15-19 ani si cu o perioada mare de consum (peste 6 ani). Deoarece anticorpii anti-VHC au fost identificati la 82,4% dintre IDU, Romania a fost incadrata in randul tarilor europene cu o prevalenta crescuta a infectiei VHC [EMCDDA, 2013].

In acest studiul, am analizat evolutia infectiilor virale, cu precadere a infectiei VHC in randul consumatorilor de droguri injectabile din Bucuresti, intre anii 2008-2009 (pe un prim lotul care cuprindea 45 de IDU) si respectiv intre 2011-iunie 2014 (pe al doilea lot format din 123 IDU).

In cadrul primului lot, prevalenta infectiei VHC a fost de 88,9%, rate superioare fiind inregistrate la cei cu istoric de injectare a drogurilor cu o durata mai mare de 10 ani. Datele obtinute sunt in conformitate cu cele din rapoartele recente ale Agentiei Nationale Antidrog, care arata o corelatie directa intre prevalenta infectiei VHC si durata consumului de droguri [EMCDDA, 2010]. Rapoartele europene, descriu aparitia anticorpilor anti-VHC rapid, imediat dupa initierea consumului de droguri [Sutton, 2008], oferind posibilitatea stabilirii unei strategii directe cu scopul de a controla raspandirea infectiei VHC.

Procentul persoanelor care folosesc in comun seringile/echipamentele injectabile a fost relativ scazut (31,1%), fapt care ar putea reflecta eficienta serviciilor de preventie. Cu toate acestea, datele identificate de noi nu pot fi extrapolate la nivelul intregii populatii IDU din Romania, deoarece:

aceasta organizatie non-guvernamentala care se ocupa cu schimbul echipamentelor de injectare a drogurilor se afla doar in capitala,

in farmacii, vanzarea fara prescriptie medicala a echipamentelor injectabile nu este supusa nici unei monitorizari nationale [UNGASS, 2010].

Desi genotipul 1b este inca prevalent (50%), am observat introducerea unor noi subtipuri, 1a (23,1%), 3a (7,7%) si 4 (11,5%), care nu au fost raportate anterior in populatia generala si care pot determina schimbari majore in distributia subtipului dominanat.

La nivel european, distributia genotipurilor VHC este diferita, fiind identificate mai multe genotipuri circulante, respectiv: genotipul 1b care ramane majoritar, genotipurile 2 si 4a in bazinul mediteranean. In ultimii ani, a fost observata cresterea frecventei genotipurilor 1a si 3a; in anumite tari vest europene, prevalenta subtipul 1a depasind deja pe cea a subtipului 1b.

Rapoarte din Regatul Unit [Cochrane, 2002], Austria [Haushofer, 2001], Germania [Huppe, 2008] si Italia [Cenci, 2003] subliniaza o anumita crestere constanta a prevalentei genotipului 3a (intre 12-35%), in special in randul IDU.

In ultimii 15 ani, in tarile est-europene, a fost descrisa aceeasi evolutie ascendenta a prevalentei genotipului 3a, asociata frecvent consumului de droguri injectabile, astfel ca in Republica Ceha rata a fost de 19,7 % [Nemecek, 2009], in Polonia de 31,3% [Chlabicz, 2008], in Serbia si Muntenegru de 23,2% [Svirtlih, 2007], iar in Bosnia si Hertegovina de 33,3 % [Ahmetagić, 2009].

In Rusia, genotipul 3a pare sa fi depasit prevalenta genotipului 1a (56,9% si respectiv 11,9%), in special, in randul tinerilor si a IDU [Paintsil, 2009].

In acest studiul, pacientii infectati cu subtipul 3a au o viremie mai mica si sunt mai tineri comparativ cu restul, indicand introducerea recenta a acestui subtip.

Prevalenta crescuta a subtipului 1a in randul IDU, impreuna cu emergenta de noi subtipuri virale, subliniaza posibila schimbare majora in distributia genotipurilor VHC circulante, cu extinderea celor cu o prevalenta scazuta anterior, dar care prezinta o transmitere eficienta in anumite grupe populationale. In mod secundar, aceste genotipuri minore pot fi raspindite si in populatia generala, chiar din randul IDU, determinand circulatia concomitenta a mai multor genotipuri virale si posibil, aparitia recombinantilor [Colina, 2004; Kalinina, 2004].

Interesant este faptul ca, aproape jumatate dintre participantii din acest studiu au raportat mai mult de 10 parteneri sexuali si peste 10% dintre ei au fost diagnosticati cu o boala cu transmitere sexuala in antecedente. Astfel incat, in prezent, importanta transmiterii pe cale sexuala a infectiei VHC trebuie reanalizata, in special in randul homosexualilor [Van de Laar, 2007; Danta, 2007], deoarece rata de transmitere a VHC creste in urma raporturilor sexuale cu leziuni traumatice si ulcerative secundare. Din cauza, practicilor sexuale neprotejate, frecvent intalnite in randul IDU, ar fi posibila introducerea genotipurilor non 1b VHC si in populatia generala.

In cadrul acestui lot, prevalenta co-infectiilor VHC/VHB si respectiv VHC/HIV este extrem de scazuta. Doar 12% dintre participanti au fost purtatori cronici de AgHBs. Rezultatele obtinute sunt in concordana cu datele publicate in anul 2010 de catre ANA si EMDCCA, in care s-a subliniat ca in ultimii ani, in randul IDU, a fost inregistrata o prevalenta scazuta (de 10,3%) a infectiei VHB [EMCDDA, 2010]. Mentionam faptul ca incidenta infectiei VHB a scazut semnificativ in randul copiilor cu varsta sub 15 ani (de la 81 la 11 la 100 000 de locuitori per an) dupa implementarea programului de imunizare anti-VHB a nou nascutilor incepand cu anul 1995 [Pitigoi, 2008].

Nicio persoana din acest studiu nu a prezentat anticorpi anti-HIV pozitivi. Diferenta observata in cadrul prevalentei infectiilor virale cu transmitere prin sange si derivate din sange, poate fi explicata in mai multe moduri:

in urma expunerii la echipamente injectabile infectate, transmiterea infectiei VHC este de 5-20 de ori mai mare decat a infectiei HIV, probabil din cauza titrului mai mare de particule VHC infectante si a celulelor susceptibile pentru infectia VHC, asa cum a fost demonstrat pe culturi celulare [Paintsil, 2010];

anumiti factori genetici ai celulei gazda pot influenta susceptibilitatea fata de o anumita infectie virala. De exemplu, un titru crescut al chemokinei CCL3L1 se coreleaza cu o susceptibilitate scazuta a populatiei IDU pentru achizitia infectiei HIV [Huik, 2010].

Epidemia HIV din Romania are caracteristici unice, datorita ratei crescute de transmitere parenterala in randul populatiei pediatrice. Studii anterioare realizate de catre grupului nostru de cercetare subliniaza o prevalenta scazuta (0,8%) a infectiei VHC in randul populatiei seropozitive [Ruta, 2005]. Aceasta prevalenta scazuta poate fi responsabila in prezent, de lipsa unei legaturi epidemiologice intre cei cu infectie VHC si cei cu infectie HIV. De fapt, intre anii 1992-2010, la noi in tara, in randul a 3959 IDU testati, au fost identificate doar 21 de noi cazuri de infectie HIV, ceea ce reprezinta un un numar semnificativ mai mic comparative cu cei 31521 IDU seropozitivi diagnosticati in Europa [CNLAS, 2010; EuroHIV, 2007].

Similar cu datele obtinute dupa analiza primului lot, in cel de-al doilea lot, au fost mai multi barbati tineri (varsta medie: 26,7±6,3 ani), cu durata consumului de droguri mare de 6,5 ± 4,5 ani, 70% fiind absolventi de liceu, necasatoriti, someri si cu multiplii factori de risc intricati importanti in achizitia infectiei VHC.

In randul IDU, in ultimii 2 ani, aspectul epidemiologic al infectiior virale s-a schimbat substantial, astfel incat, in cel de-al doilea lot, am observat ca cei cu varsta mai mare de 35 de ani au avut cele mai mari rate ale seroprevalentei infectiilor VHC, VHB si HIV, respectiv 96% (118/123) pentru infectia VHC, 65,8% (80/123) pentru VHB si de 73,1% (90/123) pentru HIV.

Pe parcursul studiului, de la un an la altul, am observat ca seroprevalenta infectiei VHB prezinta cresteri semnificative, iar pentru infectia HIV se inregistreaza un trend progresiv ascendent al ratei anticorpilor anti-HIV. Aproape 40% dintre cei cu infectie HIV, au numarul de CD4/mmc>500, sugerandu-se o achizitie recenta a acesteia [CNALS, 2011].

Datele obtinute in acest studiu sunt concordante cu cele raportate de ANA in anul 2012, indicandu-se urmatoarele tendinte [EMCDDA, 2013]:

cresterea semnificativa pentru infectia VHB (de la 14,9% în 2011 la 24,5%);

cresterea pentru infectia VHC (peste media europeana, de la 68,5% în 2011 la 82,4%);

cresterea alarmanta pentru infectia HIV (peste media europeana, de la 12% in 2011 la 24,9%),

cresterea alarmanta a IDU cu multiple infectii virale.

De asemenea, am observat o modificare in preferintele de consum, deoarece toxicomania cu heroina nu a mai fost prevalenta. La 87% dintre IDU, a fost identificat consumul mixt, etnobotanice cu heroina, astfel incat, se poate afirma ca prevalenta crescuta a infectiilor virale (VHC, VHB si HIV) se datoreaza in mare parte acestor modificari. Consumul de etnobotanice se asociaza cu o crestere a frecventei de injectare si implicit cu o crestere a riscului de achizitie a infectiilor virale [BSS, 2013]; acesta fiind semnificativ mai mare in ultima perioada, deoarece programul de schimb de seringi a fost stopat, din cauza lipsei de fonduri.

Similiar cu ceea ce am observat in lotul studiat, in ultimul raport BSS, s-a subliniat schimbarea preferintei de consum in randul IDU; daca in anul 2009, 97% dintre IDU erau consumatori de heroina, in prezent, etnobotanicele (noile substante cu proprietati psihoactive) sunt prevalente.

Cresterea prevalentei infectiilor cu virusurile hepatitice B/C care afectează o mare parte a populatiei lumii, precum si co-infectia HIV/hepatite virale reprezinta o problema prioritara de sanatate publica, in special pentru grupul de IDU care constituie populatia cheie afectata de hepatitele virale B si C, iar recent, si de HIV. Datele obtinute in acest studiu, indica potentialul urias de aparitie a unor valuri epidemice HIV/hepatite virale in randul IDU, cu posibila raspindire rapida si in cadrul populatiei generale.

Daca in literatura de specialitate, prevalenta infectiei HIV in randul IDU cu anticorpi anti-VHC pozitivi, a avut limitele intre 8% si 50% [Hagan, 2005], in acest studiul, rata a fost mai mare, de 73,7%, probabil, indicandu-se faptul ca infectia HIV a fost transmisa mai degraba prin intermediul echipamentelor de injectare folosite in comun, decat pe cale sexuala.

In acest grup populational, prevalenta infectiei HIV trebuie atent monitorizata, toate tarile est europene, vecine cu Romania, au raportat prevalente crescute ale acesteia. De exemplu, in Ucraina si Estonia, tari cu prevalenta cresuta a infectiei HIV (>20%), se subliniaza faptul ca trendul ratei este in continua crestere si ca aproximativ 84% dintre persoanele nou diagnosticate sunt IDU cu varsta sub 26 de ani [Nieburg, 2012; Jolley, 2012].

Desi genotipul 1b este inca prevalent (36,1%), am observat introducerea unor noi subtipuri, 1a (29,5%), 3a (14,7%) si 4 (8,2%). Aceeasi tendinta in distributia genotipurilor a fost raportata si in Europa de Vest, astfel incat, genotipul 1b desi majoritar, totusi are o prevalenta in scadere, in timp ce frecvanta genotipurilor 3 si 4 este in crestere [Esteban, 2008].

In acest studiu, persoanele infectate cu genotipurile 3a si 4 sunt mai tinere la internare, comparativ cu cele care au genotipul 1a si 1b indicand probabil introducerea recenta a acestor subtipuri in cadrul grupului. De asemenea, peste 60% dintre participantii de sex masculin au avut varsta sub 20 de ani si infectie VHC cu genotipuri non 1b. Un studiu recent, realizat pe 22000 de pacienti infectati VHC, a aratat ca frecventa genotipul 3 a fost de 4,3% la persoanele cu varsta peste 70 de ani si de 20,6% la cei cu varsta cuprinsa intre 21-30 de ani, sugerandu-se ca aceasta crestere s-ar datora achizitiei recente a infectiei VHC [Germer, 2011]. Intr-un studiu realizat in anul 2011, pe un lot alcatuit din 460 IDU din San Francisco, au fost obtinute date similare, astfel ca genotipul 1b ramane majoritar in special in randul IDU cu varsta mai mare, iar in randul consumatorilor tineri, cu achizitie recenta a infectiei VHC, au aparut genotipurile non 1b [Dias, 2011].

In acest studiu, genotipurile non 1b s-au asociat in mod semnificativ doar cu piercing-ul, in schimb, anumiti factori de risc pentru achizitia infectiei VHC (tatuajele, detentia,folosirea de seringi/echipamente de injectare in comun), desi au o rata a prevalentei mai mare, nu au atins semnificatia statistica.

Modificarea distributie genotipurilor VHC in randul IDU, determina o alta abordare terapeutica. Daca la dubla terapie, cu interferon pegylat si ribavirina (PEG-IFN si RBV) genotipul 1a raspunde mai bine, comparativ cu subtipul 1b, odata cu introducerea triplei terapii (PEG-IFN/RBV+inhibitori de proteaza – Telaprevir (TVR)/Boceprevir (BOC)), situatia se schimba, deoarece genotipul 1a are bariera de rezistenta scazuta, determinand aparitia mutatiilor de rezistenta si cresterea procentului de recaderi [Sarrazin, 2010].

De asemenea, dupa introducerea triplei terapii, conceptul conform caruia genotipul 3 ar fi usor de tratat s-a modificat, deoarece a fost raportata o eficienta scazuta in cazul utilizizarii BOC, respectiv lipsa oricarei eficiente terapeutice pentru TVR. Din aceasta cauza, ghidurile terapeutice din anul 2014, propun a nu se administra BOC, TVR si simeprevir; in schimb recomanda utilizarea combinatiei: sofosbuvir + RBV ± PegIFN timp de 12/24 de saptamani, obtinandu-se rate ale RVS de 60% in cazul pacientilor experimentati cu ciroza sau de 87% pentru cei fara ciroza, iar in cazul pacientilor naivi, rata de raspus virusologic depaseste valoarea de 90%. O noua optiune terapeutica, cu o rata a RVS de peste 89%, este reprezentata de combinatia: daclatasvir + sofosbuvir ± RBV, aflata inca in studiu clinic de faza 3 [Lawitz, 2013; Lawitz, 2013b, Sulkowski, 2014].

In viitor, alternativa terapeutica in cazul pacientilor cu genotipuri non 1b, probabil va fi reprezentata de regimurile fara interferon bazate pe asocierea RBV cu inhibitorii nucleotidici de polimeraza virala NS5B, care determina un RVS mai mare de 80% [EASL, 2014; Foster, 2011; Silva, 2013; Manns, 2013].

7.5. Concluzii

Studiul evidentiaza o prevalanta alarmanta a infectiei VHC (88,9% pentru primul lot, respectiv 96% in cel de-al doilea lot) la IDU si o schimbare a profilului pacientului infectat VHC: majoritatea sunt barbati, cu varsta cuprinsa intre 30 si 39 de ani, cu nivel de scolarizare scazut, someri/fara loc de munca, varsta debutului consumului de droguri fiind intre 15-19 ani si cu o perioada mare de consum (peste 6 ani).

In perioada 2011-2014, se remarca o prevalenta crescuta a infectiilor VHB si HIV (de exemplu; in randul IDU cu varsta mai mare de 35 de ani seroprevalenta VHB a fost de: 65,8% vs. 12% in perioada 2009-2010 si seroprevalenta HIV, de 73,1%vs. 0% in perioada 2009-2010).

Este necesara implementarea, cat mai rapid posibil a masurilor de reducere a riscurilor de raspindire a infectiilor virale in randul IDU, respective a: programelor de informare a IDU asupra factorilor de risc importanti in achizitia infectiilor virale, a programelor de tratament de substitutie, a celor de screening la nivel national cu ajutorul unitatilor mobile, a programelor de schimb/distribuire de ace si seringi sterile si de recuperare si distrugere a celor folosite; a consilierii HIV, a programelor de crestere a adresabilitatii IDU la asistenta medicala primara.

Analiza genotipurilor VHC circulante au arata emergenta unor noi subtipuri VHC (1a, 3a si 4) in randul IDU. Consumul de etnobotanice observat in ultimii ani, posibil reprezenta o legatura intre cresterea frecventei de injectare si a prevalentei infectiilor virale. Piercingul pare a fi un factor de risc important, fiind semnificativ implicat in achizitia genotipurilor non 1b.

Diversificarea subtipurilor virale circulante in Romanaia intr-o perioada relativ scurta de timp, are un impact major asupra evolutiei infectiei VHC, deoarece introducerea noilor subtipuri intr-un grup populational vulnerabil, poate determina schimbari majore in epidemiologia moleculara a infectiei la nivelul populatiei generale, cu impact clinic important asupra progresiei bolii hepatice si a raspunsului la tratment. Se impune o supraveghere atenta a genotipurilor circulante si o adaptare corespunzatoare a strategiilor terapeutice.

CAPITOLUL 8 – IMPACTUL GENOTIPURILOR VHC ASUPRA EVOLUTIEI CLINICE POST TRANSPLANT HEPATIC – CORELATII CU FACTORI GENETICI AI GAZDEI

8.1. Introducere

Pacientii cu infectie VHC pot avea o evolutie extrem de variata, de la vindecare spontana, la status de purtator asimptomatic (“symptom free-HCV carrier”), si cel mai frecvent infectie cronica, ce poate progresa catre ciroza si carcinom hepatocelular (CHC).

In tarile dezvoltate, din vestul Europei si din America de Nord, ciroza hepatica secundara infectiei VHC este cea mai frecventa indicatie de transplant hepatic (TH), reprezentand 35-50% din totalul acestora, fiind singura metoda terapeutica salvatoare [Brown, 2004; Gheorghe, 2004].

Intr-un raport recent, s-a aratat ca supravietuirea la 3 ani postTH a fost de 78% in cazul a 7459 primitori cu anticorpi anti-VHC pozitivi si de 82% pentru 20734 primitori neinfectati VHC [http://www.unos.org/]. Prognosticul pacientilor transplantati pentru ciroza VHC este influentat negativ, de recidiva infectiei VHC la nivelul grefei si de absenta unui tratament antiviral eficient [Rubin, 2011].

Tratamentul antiviral poate fi indicat in doua situatii: in primul rand, pretransplant, la pacientii de pe lista de asteptare (pentru a preveni reinfectia grefei) si in al doilea rand, in perioada posttransplant, cand a fost diagnosticata recurenta infectiei VHC. In ambele situatii, terapia standard (PegIFN/RBV) ofera rezultate suboptimale.

Tripla terapie (TT), bazata pe asocierea inhibitorilor de proteaza BOC/TVR cu PegIFN/RBV, recomandata pacientiilor cu genotipul 1, determina imbunatatirea cu aproximativ 30% a ratei de RVS. Cu toate acestea, preTH, TT s-a dovedit mai putin eficienta in cazul pacientilor cu ciroza hepatica, mai ales la cei care, anterior, au avut raspuns virusologic nul (situatie frecvent intalnita in randul celor transplantati), iar postTH, TT determina numeroase reactii adverse grave care duc la intreruperea tratamentului [Crespo, 2012; Verna, 2012; Coilly, 2014].

Recent, au fost raportate primele date, referitoare la eficienta si profilul de siguranta al noilor regimuri fara interferon (sofosbuvir+RBV) din perioada pre/posttransplant, rezultatele dovedindu-se incurajatoare [Curry, 2013; Forns, 2013].

Dupa TH, severitatea hepatiei C recurente si progresia accelerata a bolii este multifactoriala si depinde:

de donor sau de grefa hepatica (varsta, steatoza, timpul prelungit de ischemie, grefa de marime redusa versus ficat intreg),

de primitor in perioada pretransplant (genotipul 1b, incarcarea virala mare, varsta, rasa, sexul, polimorfismul IL28B)

de primitor in perioada posttransplant (incarcarea virala mare, infectia cu cytomegalovirus, cu virusul Epstein-Barr, sindromul metabolic)

de medicatia imunosupresoare [Nobuhisa, 2012; Charlton, 2011].

In urma unor studii la nivelul genomului uman a fost identificat un polimorfism nucleotidic unic (SNP) situat in regiunea promotorului IL28B, la 3 kb in amonte de gena IL28B (rs12979860) ce a fost asociat cu o diferenta semnificativa in rata de obtinere a raspunsului virusologic sustinut la pacientii infectati cu genotipul 1 VHC. Purtatorii alelei CC prezinta o rata de succes la tratamentului standard de 2-3 ori mai mare, in comparatie cu purtatorii genotipurilor TT sau CT (55-80% vs. 20-40%) [Ge, 2009; Suppiah, 2009; Balagopal, 2010].

Obiectivul acestui studiu a fost evaluarea impactul genotipului viral si al factorilor virali asociati asupra evolutiei bolii hepatice la pacientii cu transplant hepatic si corelarea acestor parametrii cu factorii genetici ai gazdei – in particular, cu polimorfismul IL28B.

8.2. Material si metoda

In perioada 2010-2013, au fost recrutati 84 de pacienti transplantati din cauza cirozei hepatice VHC, si am stabilit:

distributia genotipurilor CC/TT/CT la donatori si recipienti

influenta polimorfismului IL28B asupra raspunsului la terapia standard in perioada postTH

concordanta/discordanta dintre polimorfismele IL-28B la donor- receptor cu evolutia postTH (respectiv cu stadiul fibrozei si cu nivelul de ARN VHC).

Pentru toti pacientii au fost determinate:

1. stadiul fibrozei hepatice – cu ajutorul FibroScan-ului/biopsiei hepatice. FibroScan (elastografia) (EchoSens, Paris, France) este o tehnica non-invaziva, nedureroasa care permite cuantificarea fibrozei hepatice pe baza analizei deplasarii unei unde elastice de soc care se propaga in tesutul hepatic. Un ficat mai dur, determina un grad mai ridicat de fibroza. Rezultatul se exprima in kilopascali, iar la pacientii cu hepatita cronica C variaza intre 2,4-75kPa, avand o valoare medie de 7,5 kPa [Sandrin, 2001]. Studiile au raportat o valoare prag pentru ciroza ≥12,5kPa [Ziol, 2005; Castéra, 2005]. In cazul biopsiei hepatice, probele au fost fixate in formol si parafina si examinate de cate un anatomopatolog cu experienta. In conformitate cu scorul METAVIR, fibroza se clasifica in 5 stadii: F0: fara fibroza, F1: fibroza perisinusoidala fara septuri, F2: fibroza portala si periportala cu rare septuri, F3: fibroza portala si periportala cu numeroase septuri, F4: ciroza.

2. nivelul de ARN VHC- cu ajutorul RT-PCR-ului (COBAS Taqman VHC, Roche , avand limita de cuantificare: de la 43 UI/ml pana la 6,9 x 107 UI / ml, limita de detectie -18 UI/ml, cu o rata de pozitivitate mai mare de 95%).

3. nivelul de ALT (alaninaminitransferaza sau transaminaza glutampiruvica -TGP) o enzima hepatica determinata pe analizorului automat Roche Modular P printr-o metoda spectrofotometrica (kinetica) standardizata IFCC (International Federation for Clinical Chemistry) cu piridoxal fosfat (limita normala fiind pina la valoarea de 40 U/L).

4. scorul MELD (Model for End-Stage Liver Disease), in perioada preTH, deoarece in registrele organizatiei Eurotransplant organele sunt alocate pacientilor dupa scorul MELD, care ia in consideratie functia renala, bilirubina serica si gradul de instalare a coagulopatiei. Scorul MELD este folosit mai ales pentru estimarea severitatii leziunilor hepatice si a probabilitatii de supravietuire la pacientii in asteptarea transplantului hepatic, fiind calculat dupa urmatoarea formula: Scorul MELD = 10 x ((0,957 x ln(Creatinina)) + (0,378 x ln(Bilirubina)) + (1,12 x ln(INR)) + 6,43. Informatii suplimentare si modul de calcul se pot gasi pe site-ul UNOS – The United Network for Organ Sharing (http://www.unos.org).

5. genotiparea VHC a fost realizată prin tehnica de hibridizare inversa utilizand kitul comercial VERSANT ® HCV Genotype 2.0 Assay (LiPA), de la Siemens Medical Solutions Diagnostics in conformitate cu instructiunile producatorului

6. polimorfismul IL28B -sangele a fost recoltat pe EDTA, in vacutainere de 10 ml, centrifugat la 4200 rpm, timp de 10 minute, iar concentratul leucocitar (buffy coat) a fost separat si utilizat la extractia ADN-ului genomic folosind kitul QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Genotiparea rs12979860 s-a realizat prin tehnica real-time PCR folosind kitul comercial, Custom TaqMan® SNP Genotyping Assays de la Applied Biosystems si termocycler-ul ABI 7500 Fast real dupa instructiunile firmei producatoare (respectiv, primerul forward: TGTACTG-AACCAGGGAGCTC; primerul reverse: GCGCGGAGT- GCAATTCAAC; sonda VIC: TGGTTCGCGCCTTC si sonda FAM: TGGTTCACGCCTTC).

Studiul a fost realizat cu acordul Comitetului de Cercetare Etica din cadrul Institutului St. S. Nicolau si a Institutului Clinic Fundeni. Toti pacientii si-au exprimat consimtamantul scris.

Analiza statistica. Datele pacientilor au fost colectate in Excel, iar analiza statistica s-a realizat cu programul IBM SPSS v.20. Pentru variabilele nominale s-a utilizat testul Fisher, iar pentru cele cantitative si pentru diferentele dintre grupuri s-a aplicat unul dintre testele non parametrice: Pearson, chi patrat, Kruskal Wallis. Valoarea lui p <0,05 a fost considerata semnificativa statistic.

8.3. Rezultate

8.3.1. Caracterizarea lotului de pacienti

Am analizat 84 de pacienti transplantati hepatic (primitori/recipienti) din cauza complicatiilor infectiei VHC, care au fost infectati cu genotipul 1 b VHC.

Varsta medie a primitorilor a fost de 53,23 ±6,67 ani (variind intre 28 si 70 de ani), mai mult de jumatate dintre ei fiind barbati (raportul barbate/femei=1,2). In cazul donatorilor, 55,9% au fost barbati, cu varsta medie de 40,74 ±13,62.

Au fost efectuate doar 12 TH cu segmente de la donator viu (LDLT). Aproximativ 60% (49/84) dintre pacienti au avut un scor MELD cuprins intre 16-25.

PreTH, aproape toti pacientii (94%) au avut fibroza intr-un stadiu F0-F2 (Tabelul 30).

Tabelul 30. Caracterizarea pacientilor inainte de TH.

8.3.2. Distributia polimorfismelor IL28 B

Polimorfismul IL28B a fost determinat la toti cei 84 de primitori si la 36 de donatori. Genotipul IL28B predominant a fost CT, atat in randul primitorilor: 53,5% (45/84); cat si al donatorilor, 50% (18/36) (Tabelul 31; Figura 23).

Figura 22. Distributia polimorfismului IL28B.

Comparand frecventa polimorfismului la perechile donor-receptor, am observat ca rata cea mai mare de 55,6% (20/36) este intalnita in cazul donorului non-CC cu receptor non-CC, in schimb, combinatia favorabila postTH, din punct de vedere al evolutiei clinice, donor CC cu receptor CC a fost identificata doar la 3/36 (8,3%) perechi (Tabelul 31).

Tabelul 31. Distributia genotipurilor IL28B.

Tinand cont de distributia polimorfismului IL28B in cadrul lotului studiat, in perioada preTH, am observat ca primitorii homozigoti TT, comparativ cu cei heterozigoti CT si cei homozigoti CC, prezinta diferente semnificative statistic ale valorii medii de ALT (respectiv, 200,00 U/L vs. 98,77 U/L pentru CT vs. 70.00 U/L pentru CC, p=0.005) (Figura 24).

Figura 23. Relatia intre valoarea medie a ALT-ului si polimorfismul IL28B.

De asemenea, in perioada preTH, am obtinut valori semnificativ mai mari ale nivelului de ARN VHC in cazul primitorilor cu genotip favorabil CC (4,60 log10 UI/ml vs. 6,48 log10 UI/ml pentru TT vs. 6,24 log10 UI/ml pentru CT, p=0,011) (Tabelul 32).

Tabelul 32. Caracterizarea recipientilor preTH in functie de polimorfismul IL28B.

* ANOVA (F test)

**Person chi2

Comparand acesti doi parametrii cu semnificatie statistica, respectiv valoarea medie a ALT-ului si nivelul de ARN VHC, in functie de polimorfismul IL28B al primitorului, inainte si dupa TH, am observat ca valoarea medie a nivelului de ARN VHC scade semnificativ dupa TH (pentru genotipul rs12979860 CCpreTH avem o valoare de 4,60 log10 UI/ml, postTH, de 4,37 log10 UI/ml, pentru rs12979860 CT, preTH 6,24 log10 UI/ml vs. 4,62 log10 UI/ml postTH, iar pentru rs12979860 TT, 6,48 log10 UI/ml preTH vs. 4,51 log10 UI/ml postTH, p=<0.001) (Tabelul 33).

Tabelul 33. Diferente intre valoarea parametriilor de laborator pre si post TH si polimorfismul IL28B.

*paired sample t-test

8.3.3. Corelatiile intre IL28 B si evolutia bolii hepatice post-transplant

PreTH, am observat ca 93% (69/74) dintre primitorii cu genotipul rs12979860 non CC, nu au avut un stadiu avansat al fibrozei hepatice (F0-F2) si ca nici un pacient homozigot CC nu a fost diagnosticat cu fibroza hepatica in stadiu avansat (F3-F4). In functie de polimorfismul IL28B, diferenta intre stadiile fibrozei hepatice, nu a avut semnificatie statistica (p=0,43).

PostTH, am remarcat o progresie a fibrozei hepatice, 40% (30/75) dintre primitorii rs12979860 non CC au fost diagnosticati cu fibroza in stadiu avansat (F3-F4). Diferenta intre stadiile fibrozei hepatice in functie de IL28B nu a atins semnificatia statistica (p=0,18) (Tabelul 34).

Tabelul 34. Stadiul fibrozei hepatice in functie de polimorfismul IL28B pre si post TH.

*Person chi2

8.3.4. Impactul polimorfismului IL28 B asupra raspunsului terapeutic

In perioada postTH, tratamentul antiviral standard, cu PegIFN/RBV, a fost administrat la 46 dintre pacientii transplantati, fiind initiat odata cu diagnosticarea unei fibroze >2.

S-au obtinut urmatoarele raspunsuri terapeutice:

13 (28,2%) pacienti cu RVS

34 (73,9%) cu raspuns virusologic timpuriu (RVT)

18 (39,1%) cu recadere virusologica

11 (23,9%) nu au raspuns la tratament.

Rata de obtinere a RVS in functie de distributia polimorfismului IL2B, a fost de 5% pentru cei homozigoti CC si de 26% pentru cei cu genotipuri rs12979860 non CC. Mai mult de 60% dintre cei care nu au obtinut RVS au genotipuri rs12979860 non CC si aproximativ 5% sunt homozigoti CC. Diferenta intre aceste doua grupuri nu a atins semnificatia statistica (p=0,36) (Figura 25).

Figura 24. Rata de RVS in conformitate cu genotipul IL28B.

Raspunsul virusologic timpuriu (RVT), un bun factor predictiv pentru obtinerea RVS, a avut o rata de 10% pentru primitorii cu genotip rs12979860 CC si de peste 60% pentru cei cu genotip rs12979860 non CC.

In cazul tuturor pacientilor care nu au obtinut RVT, au fost identificat genotipurile rs12979860 non CC. Diferenta intre aceste doua grupuri nu a avut semnificatie statistica (p=0,15) (Figura 26).

Figura 25. Rata de RVT in conformitate cu genotipul IL28B.

Toti cei 11 pacienti care nu au obtinut raspuns virusologic la tratament, au fost identificati cu genotipuri rs12979860 non CC. Tinand cont de distributia polimorfismului IL28B, diferenta intre pacientii care nu au raspuns la tratament si cei cu raspuns virusologic nu a atins semnificatia statistica (Figura 27).

Figura 26. Procentul pacientilor fara raspuns virusologic in conformitate cu genotipul IL28B.

8.3.5. Corelatiile intre profilul IL28 B al cuplului donator – primitor si evolutia post-transplant

Am identificat polimorfismul IL28B la 36 de perechi donator – primitor, ulterioar am stabilit doua grupuri, pe care le-am definit astfel:

Grupul CC (recipientrs12979860 CC –donator rs12979860 CC)

Grupul non CC:

Primitor rs12979860 CC – Donator rs12979860 CT/TT

Primitor rs12979860 CT/TT – Donator rs12979860 CC

Primitor rs12979860 CT/TT – Donator rs12979860 CT/TT

In privinta sinergismului intre genotipurile IL28B din cadrul perechilor donator – primitor si evolutia clinica postTH (din punct de vedere al incarcarii virale VHC si al fibrozei hepatice), am observat la pacientii din grupul CC, comparativ cu cei din grupul non CC, un nivel mai scazut al viremiei si o rata mai scazuta de progresie a fibrozei hepatice, fara a se atinge insa semnificatia statistica (Figura 28).

Figura 27. Asocierea intre polimorfismul IL28B al perechilor donator – receptor si evolutia clinica postTH.

8.4. Discutii

O serie de factori care tin de organismul gazda, inclusiv un anumit pattern genetic, par a detine un rol importanta in evolutia infectiei VHC si in raspunsul la tratamentul antiviral. Un polimorfism nucleotidic unic (rs12979860) situat in amonte de gena IL28B, a fost asociat cu raspunsul la tratamentul antiviral, cu recurenta postTH si cu evolutia postTH [Charlton, 2011; Duarte-Rojo, 2012].

Mecanismele exacte care stau la baza actiunii acestui polimorfism nu sunt inca pe deplin elucidate, se pare ca determina anumite schimbari la nivelul: virusului, raspunsului imun si a caii de semnalizare a interferonului, care vor afecta imunitatea generala a organismului si apararea antivirala de la nivelul ficatului. Transplantul hepatic ofera un model unic pentru studiul polimorfismului IL28B din cauza sinergismului intre alelele C si T provenite atat de la primitor, cat si de la donator, permitand analiza separata a impactului genotipului primitorului si donatorului in evolutia postTH [Cyr, 2011].

Studiile recente sugereaza faptul ca polimorfism IL-28B poate reprezenta un factor predictiv atat al recurentei, cat si al raspunsului la tratamentul antiviral posttransplant hepatic. S-a observat ca genotip CC determina o intarziere a recurentei infectiei VHC cu 2 pana la 5 ani si ca polimorfismul recipientului reprezinta un factor predictiv al evolutiei fibrozei, genotipul TT asociindu-se cu aparitia mai rapida a fibrozei hepatice [Charlton, 2011; Lange, 2011]. De asemenea, s-a sugerat existenta unei stranse asocieri intre polimorfismul IL28B la perechi donor-receptor si gradul de severitate al recurentei VHC, oferind astfel posibilitatea utilizarii acestui polimorfism in optimizarea evolutiei postTH si in alocarea grefei hepatice [Charlton, 2011; McGilvray, 2012; Dill, 2011].

Pe linga polimorfismul IL28B, si alti factori pot fi predictivi ai evolutiei clinice postTH [Habib, 2006]. In urma analizei lotului de pacienti, am observat ca in afara de sexul masculin care este predominant, nu au fost prezenti alti factori predictivi asociati cu o evolutie negativa postTH (respectiv, varsta primitorului mai mare de 65 de ani, varsta donatorului mai mare de 50 de ani, scorul MELD > de 25).

In acest studiu, genotipul rs12979860 CT este predominant atat in randul primitorilor, cat si in cel al donatorilor. Interesant este faptul ca primitorii cu genotip rs12979860 CC reprezinta numai 13,1% din totalul pacientilor inclusi in studiu, procent, mult mai scazut decat cel raportat in populatia generala, respectiv de 51% [Ge, 2009] sau in randul donatorilor din studiul (36,1%), sugerand faptul ca populatia infectata VHC cu indicatie de TH, pare a fi imbogatita cu genotipuri IL28B heterozigote.

O posibila explicatie ar fi ca prezenta genotipului rs12979860 CC la persoanele infectate VHC, determina o evolutie spre vindecare spontana a infectiei sau un raspuns mai bun la terapia antivirala, neajungandu-se la boala hepatica terminala si implicit la TH. Aceasta ipoteza este sustinuta de studiile recente care au raportat rolul esential al polimorfismului IL28B in controlul infectiei VHC [Rauch, 2010; Thompson, 2010].

Comparand polimorfismul IL28B la perechi donor-primitor, am constatat ca mai mult de 50% dintre perechi sunt formate din donor non CC si primitor non CC, ceea ce poate sugeraza o evolutie nefavorabila postTH. Determinarea polimorfismului IL28B pereche la donator si primitor, inainte de initierea terapiei antivirale, pare a fi importanta in practica clinica ajutand medicii in clasificarea pacientilor cu sanse mai mari de obtinere a RVS. Studii suplimentare sunt necesare pentru a evalua valoarea predictiva a polimorfismului IL28B atunci cand sunt recomandate noile regimuri terapeutice cu agenti cu actiune antivirala directa.

Examinand impactul polimorfismului Il28B asupra stadiului fibrozei hepatice, am obeservat ca nici un primitor cu genotipul rs12979860 CC, nu a avut fibroza intr-un stadiu avansat (F3-F4). Rezultatele obtinute sunt in conformitate cu cele din alte studii, de exemplu, Duarte-Rojo si colab., au raportat ca, genotipul rs12979860 CC determina postTH o viremie mai scazuta dupa recurenta infectiei VHC si o prevalenta mai scazuta a fibrozei hepatice in stadiu avansat [Duarte-Rojo et al, 2012].

Interactiunea intre polimorfismul IL28B al donatorului si al primitorului si evolutia postTH, reprezinta un subiect foarte dezbatut. In studiul de fata, in grupului rs12979860 CC am observat un nivel mai scazut de ARN VHC si o rata mai mica a progresiei fibrozei hepatice, aceste diferente neatingand insa semnificatia statistica. In studii realizate pe loturi mai mari de pacienti, s-a demonstrat ca postTH, polimorfismul CC pereche donator-receptor reprezinta un biomarker favorabil al evolutiei bolii hepatice si se asociaza in mod semnificativ cu un raspuns mai bun la terapia antivirala standard [Firipi, 2013; M. Coto-Llerena, 2011].

8.5. Concluzii

Toti pacientii supusi transplantului hepatic au fost infectati cu genotipul 1b VHC. Genotipul IL28 CT a fost predominant, atat in randul primitorilor, cat si in cel al donatorilor. PreTH, primitorii homozigoti TT, au un nivel de ALT si de ARN VHC semnificativ crescut, comparativ cu celelalte genotipuri, in schimb postTH, doar viremia sufera diferente semnificative in functie de polimorfismul IL28B (valori mai mici fiind obtinute pentru genotipurile CT si TT).

Peste jumatate dintre recipientii transplantului hepatic au avut un profil IL28 B concordant cu cel al donatorilor. La 40% dintre acestia s-a observat progresia fibrozei hepatice catre stadii avansate, in perioada postTH. In cazul pacientilor cu genotip concordant CC a fost observat un nivel mai scazut al viremiei si o rata mai mica a progresiei fibrozei hepatice.

CAPITOLUL 9 – IMPACTUL CLINIC AL GENOTIPULURILOR VIRALE ASUPRA EVOLUTIEI BOLII HEPATICE LA PACIENTI CU INFECTIE CRONICA VHC

9.1. Introducere

Pina in anul 2011, terapia standard in hepatita cronica C s-a bazat pe administrarea de interferon-α pegylat (PegIFN) asociat cu ribavirina (RBV), timp de 24-48 saptamani. Deoarece tratamentul este grevat de numeroase efecte adverse, multi pacienti nu au reusit sa finalizeze tratamentul, o parte insa nu au indeplinit conditiile de eligibilitate, in timp ce altii l-au refuzat.

In plus, exista diferente majore in rata de raspuns la terapie, in functie de genotip, astfel incat, genotipul 1 determina raspuns virusologic sustinut (RVS) in aproximativ 50-55% din cazuri, daca tratamentul dureaza 48 de saptamani; iar genotipurile 2 si 3, ating rate de RVS de 70% daca tratamentul standard este indicat pe o perioada de 24 de saptamani. In Romania, majoritatea pacientilor aflati pe lista de asteptare si a celor tratati cu terapia standard, PegIFN/RBV, sunt infectati cu genotipul 1b.

In ultimii ani, abordarea terapeutica a pacientiilor infectati cu genotipul 1 VHC a suferit schimbari majore, odata cu introducerea medicamentelor cu actiune antivirala directa (STAT-C). Administrarea unei combinatii bazata pe inhibitori ai proteazei virale NS3/4, ai polimerazei virale NS5B sau ai proteinei NS5A impreuna cu ribavirina, cu/fara PegIFN (“IFN free”), determina succes terapeutic in peste 90% din cazuri.

In paralel cu aparitia noilor STAT-C cu actiune pan-genotipica, care sunt usor de administrat, intr-o singura doza zilnica si pentru intervale scurte (de 3 luni), s-a observat ca markerii clasici de predictie ai succesului la tratament isi pierd impactul si importanta clinica (respectiv: genotipul, incarcarea virala la baseline, polimorfismul IL28B).

In continuare, pacientii greu de tratat, raman cei cu fibroza avansata, ciroza si comorbiditati (in special cei coinfectati HIV).

Tinand cont de cele mentionate, ne-am propus evaluarea unor markeri surogat care pot fi predictori pentru evolutia bolii hepatice, atat in randul persoanele monoinfectate VHC, netratate, cat si la pacienti coinfectati VHC/HIV.

9.2. Investigarea posibilelor corelatii intre markeri serici ai metabolismul fierului, si severitatea afectarii hepatice la pacienti naivi cu hepatita C cronica.

Ficatul reprezinta cel mai important depozit de fier din organism, o treime din cantitatea totala de fier din organism este depozitata la nivelul: hepatocitelor, celulelor mezenchimale perivasculare si a celulelor sistemului reticuloentotelial [Franchini, 2008; Mitsuyoshi, 2013]. De asemenea, ficatul detine un rol important in cadrul metabolismului fierului deoarece atat transferina (cea mai importanta proteina transportoare a fierului), cat si feritina (proteina principala de depozit a fierului) sunt sintetizate la acest nivel.

Numeroase studii au raportata ca un nivel crescut al markerilor serici ai metabolismului fierului (respectiv: feritina, sideremia si coeficientul de saturatie al transferinei), precum si acumularea hepatocitara a fierului, apare frecvent la pacienti cu hepatita cronica C si determina agravarea evolutiei bolii hepatice [Bonkovsky, 2002; Fabris, 2001; Metwally, 2004].

Intrucat stadiile III si IV ale fibrozei hepatice pot trece nediagnosticate, semnele si simptomele clinice sunt minime sau neexistente, detectia fibrozei hepatice severe si a cirozei detine o importanta prognostica majora [Di Bisceglie, 2000], riscul de decompensare hepatica fiind foarte mare.

9.2.1. Material si metoda

Au fost inclusi in studiu 85 de pacienti infectati cronic cu VHC, netratati, cu replicare virala activa confirmata prin prezenta ARN VHC, cuantificat cu ajutorul RT-PCR-ului (COBAS Taqman VHC, Roche – limita de cuantificare: de la 43 UI/ml pana la 6,9 x 107 UI / ml, limita de detectie -18 UI/ml, cu o rata de pozitivitate mai mare de 95%).

Identificarea genotipului VHC s-a efectuat cu ajutorul unui test comercial de hibridizare inversa Versant VHC genotip 2.0 test, Bayer Healthcare Division, in conformitate cu instructiunile producatorului.

Gradul fibrozei hepatice si activitatea necro-inflamatorie au fost apreciate folosind scorurile – FibroTest (FT) si ActiTest (AT), care au la baza un algoritm care combina rezultatele obtinute in urma determinarii unor markeri biochimici serici.

Astfel, FT masoara gradul fibrozei prin combinarea urmatorilor parametri: alfa-2macroglobulina, haptoglobina, apolipoproteina A1, bilirubina totala, gama-glutamil-transpeptidaza-GGT, iar AT estimeaza gradul activitatii necro-inflamatorii prin asocierea alanin-aminotransferazei (ALT) la markerii de mai sus. Rezultatele testului includ un scor de fibroza si unul de activitate necro-inflamatorie, ale caror valori sunt cuprinse in intervalul 0-1 (de la absenta bolii sau o afectare minima pana la fibroza sau activitate necroinflamatorie severa), cu posibila conversie in sistemul METAVIR de la F0 la F4 pentru fibroza hepatica si A0 la A3 pentru activitatea necro-inflamatorie. FT identifica aproximativ 70% dintre pacientii cu semne histologice de fibroza moderata pana la severa, si aproximativ 90% dintre pacientii cu ciroza. Pentru AT, valoarea predictiv negativa pentru excluderea activitatiinecro-inflamatorii semnificative este de 85% [Poynard, 2008].

Cu ajutorul analizorului automat Roche Modular P, am determinat urmatrii parametrii biochimici: ALT, AST, fierul seric si capacitatea nesaturata/latenta de legare a fierului (UIBC). Feritina a fost determinata prin electrochemiluminescenta (Roche Elecsys-E170), iar transferina serica printr-o metoda imunoturbidimetrica (Roche modulare pe analizor ECLIA). Capacitatea totala de legare a fierului (TIBC) a fost calculata ca fiind suma dintre valoarea fierului seric si valorea UIBC.

Studiul a fost realizat cu acordul Comitetului de Cercetare Etica din cadrul Institutului St. S. Nicolau, toti pacientii si-au exprimat consimtamantul scris.

Analiza statistica.

Datele pacientilor au fost colectate in Excel, iar analiza statistica s-a realizat cu programul IBM SPSS v.20. Pentru compararea valoriilor medii s-a utilizat testului Student (T Test) folosind teste paramentrice si nonparametrice, iar relatia dintre predictorii infectiei cronice VHC, markerii serici si gradul de fibroza a fost stabilita cu ajuorul analizei de regresie liniara multipla. O valoare p <0,05 a fost considerata semnificativa statistic.

9.2.2. Rezultate

9.2.2.1. Caracterizarea lotului de pacienti

Varsta medie a pacientilor a fost de 49,5 ± 12,5 ani (variind intre 20 – 72 ani); mai mult de jumatate dintre ei au fost de sex masculin (raportul barbati/femei = 1,5). Doar 29/85 pacienti (34,1%) au avut fibroza hepatica severa si 23/85 (27,1%) au avut activitatea necro-inflamatorie severa. Saptesprezece pacienti (20%) au avut nivel seric normal de ALT, in timp ce, 21/85 (24,7%) au avut un nivel ridicat de ALT (de doua ori mai mare decat limita superioara a valorii normale, LSN, care este de 40 U/L). Nivelul de ARN VHC a fost crescut (> 5,77 log 10 UI/ml) la 56 dintre pacienti (65,9%), iar genotipul 1 a fost prevalent (subtipul 1b a fost identificata in 97,6% din cazuri, 1a in 1,2% si genotipuri mixte la 1,2% dintre pacienti) (Tabelul 35).

Tabelul 35. Caracterizarea pacientilor inclusi in studiu.

Aproape un sfert dintre pacienti, 24/85 (24,7%) au avut niveluri ridicate ale fierului seric, 61/85 (71,7%) prezentand valori normale caracteristice grupei de varsta si sex (variind intre 59-158 pg /dl), in timp ce restul (3/85, respectiv 3,5%), au avut un nivel sub 59 pg/dl. Numai patru pacienti (4,7%) au avut nivelul feritinei serice mai mare de 400 ng/L, in timp ce 73/85 (85,9%) au avut valori normale (intre 3-40 ng/L), iar 8/85(9,4%) au avut valori sub 30 ng/L. Saisprezece pacienti (18,8%) au avut valoarea transferinei serice mai mare decat 3,6 g/l, iar restul, 69/85 (81,1%) au avut un nivel normal (variind intre: 2-3,6 g/l).

La 30/85 pacienti (35,3%), nivelul TIBC a fost mai mic de 228 g/dl, fara a avea anemie, in timp ce 55/85 (64,7%) dintre ei au prezentat valori normale (intre 228-428 g/dl) (Tabelul 36).

Tabelul 36. Caracterizarea pacientilor inclusi in studiu in functie de markerii metabolismului fierului.

9.2.2.2. Corelatii intre stadiul fibrozei si markerii serici ai metabolismului fierului

34,1% dintre pacienti au prezentat fibroza severa (stadiul F3/4), acestia comparativ cu cei care nu prezinta fibroza sau au o fibroza usoara, sunt mai in varsta (varsta medie 56,25 ± 7,55 ani vs. 46,19 ± 13,18 ani; p <0,001), au niveluri mai mari de ALT (valoarea medie a ALT-ului este de 110,10 ± 107,91 UI/L vs. 59,46 ± 41,10 UI L; p <0,001), sideremia si feritina semnificativ crescute (p <0,05, respectiv p <0,001 ) si niveluri mai scazute ale TIBC (p <0,05) (Tabelul 37).

Tabelul 37. Corelatii intre stadiul fibrozei si markerii serici ai metabolismului fierului.

9.2.2.3. Corelatii intre activitatea necro-inflamatorie si markerii serici ai metabolismului fierului

23/85 pacienti (27,1%) au activitate necro-inflamatorie severa (definita printr-un scor A3,la ActiTest), incarcatura virala mare (valoarea medie: 1 4×106 ± 0,7 x 106) si varsta medie mai mare (52,59 ± 11,28 ani vs 48,43 ± 12,83 ani, p> 0,999), comparativ cu pacientii cu activitate necro-inflamatorie absenta/moderata.

In studiul nostru, activitatea necro-inflamatorie severa a fost direct corelata cu cei trei markeri serici ai metabolismului fierului (sideremia, p<0,001; TIBC, p <0,05; feritina, p <0,001) [Tabelul 38].

Tabelul 38. Corelatii intre activitatea necro-inflamatorie si markerii serici ai metabolismului fierului.

Nu a existat nicio corelatie semnificativa statistic intre nivelul de ARN VHC si stadiul fibrozei sau cu activitatea necro-inflamatorie. La pacientii cu fibroza semnificativa si activitate necro-inflamatorie severa, valorile crescute ale sideremiei si ale feritinei s-au asociat cu valori crescute ale transaminaze, insa fara semnificatie statistica.

Folosind analiza de regresie multiliniara, nivelurile serice ale feritinei, transferinei si sideremiei au fost selectate automat ca si variabile independente, fiind buni predictori pentru fibroza avansata si activitatea necro-inflamatorie severa. Aceeasi analiza statistica a exclus automat valorile transaminazelor (intotdeauna valori crescute insotesc fibroza semnificativa si activitatea necro-inflamatorie severa), varsta, viremia VHC si sexul.

Modelul predictiv care foloseste nivelurile serice ale transferinei si feritinei a avut semnificatie statistica mai mare in cazul fibrozei severe (F (2,28) = 366,317, p <0,001, R2adj = 0,963) vs. fibroza absenta/moderata (F0/F1/F2) (F (2,57) = 91,141, p <0,001, R2 adj = 0,760).

Pentru activitatea necro-inflamatorie severa (A3) (F (2,22) 591,976, p <0,001, R2 adj = 0,982) comparativ cu cea absenta/moderata (A0/A1/A2) (F (1,63) = 96,668, p <0,001 R2 adj = 0,603), semnificatie statistica mai mare a fost obtinuta in functie de nivelul transferinei si sideremiei.

9.2.3. Discutii

Analiza pacientilor monoinfectati VHC, a aratat ca, desi majoritatea au valori ale sideremiei in limite normale, valorile crescute ale feritinei si transferinei ar putea fi markeri precoce ai severitatii bolii hepatice, fiind corelate cu gradul de fibroza si cu activitatea necroinflamatorie. Aceste rezultate sunt in conformitate cu o serie de alte studii [Fujita, 2007; Guyader, 2007, Liu, 2012; Büyükasik, 2011; Lange, 2012] care au raportat, la pacientii cu hepatita cronica C, o acumulare hepatica de fier usoara/moderata, asociata cu o evolutie clinica nevaforabila si o crestere semnificativa a riscul de carcinom hepatocelular. Exista tot mai multe dovezi ca o crestere, chiar si usoara, a cantitatii de fier la nivel hepatic poate influenta negativ evolutia clinica, mai ales daca se asociaza si alti factori hepatotoxici (cum ar fi hepatitele cronice virale). Cu toate ca rolul fierului in homeostazia organismului este esential, pina in prezent, nu a fost inca complet elucidata patogeneza acumularii fierului in cazul hepatiei cronice C. O explicatie posibila pentru aceste cresteri este ca in functie de activitatea necro-inflamatorie se poate elibera fierul si feritina de la nivelul hepatocitelor deteriorate, proces sustinut si de nivelul crescut de ALT.

In plus, acumularea de fier in cazul infectiei cronice VHC [Price, 2009], provoaca leziuni hepatice ca urmare a stresului oxidativ, care determina cresterea gradului de necroza/apoptoza hepatocitara, activarea celulelor stelate hepatice si a fibrogenezei prin proliferarea actinei si a colagenului [Fujita, 2008; Ramm, 2005]. Interactiunea intre hepcidina (principalul reglator al homeostaziei fierului via caii IL6/STAT 3) si feroportina (molecula transportoare transmembranara a fierului) joaca un rol crucial in reglarea eliberarii fierului de la nivelul enterocitelor si in fagocitoza, astfel incat, anumite mutatii la nivelul genelor care regleaza metabolismul fierului pot determina modificari ale parametriilor serici ai acestuia [Pietrangelo, 2010]. Rezulatele sugereaza ca parametrii serici ai metabolismului fierului pot reprezenta markeri surogat pentru severitatea bolii hepatice; in special daca sunt monitorizati in dinamica, pentru a exclude alte interferente.

9.2.4. Concluzii

Fibroza hepatica severa este prezenta la un procent mare de pacienti cu hepatita C cronica netratati si se asociaza independent cu nivelul de feritina si de transferina, indicand faptul ca acesti doi parametrii serici pot fi markeri predictivi ai evolutiei bolii hepatice, in special in grupul de pacienti infectati VHC care raspund greu la tratament: cei infectati cu genotip 1b, cu prognostic nefavorabil.

9.3. Evaluarea markerilor de prognostic pentru evolutia naturala a infectiei VHC la pacienti HIV pozitivi

Hepatita C cronica este una din cauzele importante de mortalitate si morbiditate in randul pacientilor infectati HIV, la care se observa rate semnificativ crescute de ciroza si raspunsuri mai slabe la terapia standard cu PegIFN si RBV, comparativ cu persoanele monoinfectate VHC [Sultana, 2013; Chung, 2004; Carrat, 2004]. Accelerarea leziunilor hepatice la pacientii co-infectati VHC/HIV, se datoreaza atat activarii sistemului imun si acumularii limfocitelor T citotoxice CD8 la nivelul hepatocitelor, secundar infectiei HIV, cat si replicarii directe a virusului HIV la nivelul hepatocitelor si in celulele stelate hepatice inducand apoptoza [Operskalski, 2011].

Scopul acestui studiu a constat in monitorizarea markerilor virusologici si biochimici predictivi ai evolutiei bolii hepatice secundare infectiei VHC la pacienti coinfectati HIV.

9.3.1. Material si metoda

Datele socio-demografice, clinice si biochimice au fost colectate din dosarele medicale a 83 de pacienti coinfectati HIV/HCV, internati pentru infectii oportuniste, intr-una din principalele clinici de Boli Infectioase din Bucuresti, in perioada 2009-2011.

Nivelul de ARN VHC a fost cuantificat prin RT-PCR (CobasAmplicor CobasAmplicor Monitor VHC, vers 2.0, Roche;intervalul de linearitate fiind intre 600-700000 UI/ml, limita de detectie inferioara fiind de 600 UI/ml). Genotipurile VHC au fost identificate utilizand testul comercial LINEAR ARRAY Hepatitis C Virus Genotyping Test, Roche, care poate identifica cele 6 genotipuri majore VHC.

In cazul infectiei HIV, viremia a fost determinata prin real-time PCR cu ajutorul testului COBAS Taqman HIV-1, Roche, intervalul de liniaritate fiind intre 48 – 10 milioane de copii ARN HIV/ml, limita de detectie inferioara fiind de 48 de copii/ml).

Statusul imun a fost evaluat prin citometrie in flux, determinandu-se numarulde celule CD4/mm3, cu ajutorul testului CD3 FITC/ CD8 PE/ CD45 PerCP/CD4 APC Reagent, Becton-Dickinson.

Evaluarea gradului de fibroza hepatica s-a realizat cu un test non-invaziv simplu si ieftin numit FIB-4 care combina valori biochimice standard (Varsta [ani] x AST [UI/L] / plachete [x 109/l] x (ALT (1/2)[UI/L]) [Sterling, 2006; Bruno, 2011; Khairy, 2012]. Un index<1,45 arata o fibroza minima, in timp ce un scor FIB-4> 3,25 indica fibroza semnificativa.

Pentru nivelul de ALT, limita superioara a normalului (LSN) a fost de 30 UI/L pentru barbati si de 19 UI/L pentru femei, valorile crescute au fost definite dupa criteriile ACTG [Prati, 2002], de la gradul 1 (1.2 – 2.5×LSN) la gradul 4 (> 10xLSN).

Analiza statistica. Datele pacientilor au fost colectate intr-un fisier Excel, iar pentru analiza statistica s-a utilizat programul GraphPadInStat 3, respectiv testul Fisher (pentru tabelele de contingenta) si testul ANOVA si t-test (pentru diferenta dintre medii). O valoare p< 0,05 a fost considerata semnificativa statistic.

9.3.2. Rezultate

9.3.2.1. Caracterizarea lotului de pacienti

Varsta medie a pacientilor coinfectati VHC/HIV a fost de 35,5 ± 11 ani; 74,7% dintre ei fiind de sex masculin; 79,5% din mediul urban, cu un nivel mediu de educatie (mai mult de jumatate au absolvit liceul) si mai mult de jumatate (68,7% dintre ei) nu au fost casatoriti.

Durata medie a infectiei VHC a fost de 6,1±4,7 ani, iar pentru infectia HIV, aproximativ la fel, de 6,5±4,9 ani. Majoritatea pacientilor inclusi in studiu au incarcarea virala HIV mare (medie fiind de 5,2 log10 copii/ml), mai mult de jumatate primesc tratament antiretroviral combinat si nici unui pacient nu i s-a administrat tratament anti VHC. Doar 31,8% dintre cei care au primit tratament antiretroviral au avut viremia HIV nedetectabila.

La initierea studiului, valoarea medie a viremiei VHC a fost mare de 6,3 log10 UI/ ml, 53% dintre pacienti au avut valori mai mari de 600000 UI / ml, in timp ce, doar 14,5% au avut ARN VHC nedetectabil. Nivelul de ARN VHC a fost semnificativ mai mare la pacientii ajunsi in stadiul SIDA (6,4 vs. 6,1 si 6 log10 UI/mL pentru cei in stadiul A, respectiv B al infectiei HIV, p=0,04), si la cei fara tratament antiretroviral (6,5 vs. 5,9 log10 UI/ml in cazul pacientilor tratati; p=0,04). Nu s-a obtinut nicio corelatie statistic semnificativa intre valorile viremiilor VHC si HIV.

In cazul unui singur barbat de 40 de ani, dependent de heroina, s-a identificat genotipul 4, la restul pacientilor a fost izolat genotipul 1 VHC, care raspunde cel mai greu la tratamentul standard cu PegIFN/RBV.

41% dintre pacienti au avut valori normale ale ALT-ului si doar la 28,9% valorile au fost crescute, in special la cei carora li s-a administrat tratament antiretroviral.

9.3.2.2. Corelatii intre fibroza hepatica si anumiti markeri virusologici

34,9% dintre pacienti, au avut fibroza hepatica semnificativa (valoarea scorului FIB>3,25), in timp ce la 32,5% indexul a fost <1,45, definind un grad minim de fibroza. Valorile crescute al scorului FIB-4 s-au asociat cu o viremie VHC mare (6,1 vs. 4,9 log10 UI / ml; p=0,008) si cu scaderea semnificativa a numarului de celule CD4 la pacienti (432 vs. 232 celule/mm3; p=0,004). Un scorul FIB4>3,25 a fost observat in special in randul pacientilor cu tratament antiretroviral (68,9% vs 29,6%, p=0,007); acesta determinand doar scaderea valorii medii a incarcaturii virale VHC, nu si obtinerea unui nivel nedetectabil de ARN VHC (Tabelul 39).

Tabelul 39. Asocierea intre fibroza hepatica si anumiti markeri virusologici.

9.3.2.3. Impactul imunosupresiei induse de HIV asupra progresiei bolii hepatice secundara infectiei VHC

In plus, fibroza semnificativa s-a asociat cu scaderea statusului imun, acest fapt, posibil afecteaza decizia de initiere a tratamentului antiviral, tinand cont ca majoritatea studiilor despre eficienta/siguranta terapeutica in aceasta populatie speciala, s-au desfasurat la persoane cu numar de celule CD4 mai mare de 200/mm3. In cadrul grupului format din pacienti coinfectati VHC/HIV, cu status imun bun, studiile raporteaza ca terapia antiretrovirala poate determina o reducere semnificativa a activitatii necroinflamatorie secundara infectiei VHC si o posibila crestere a gradului de fibroza hepatica din cauza restaurarii imunitatii si a hepatotoxicitatii rezultate din actiunea cumulativa a medicatiei [Sulkowski, 2008, Operskalski, 2011]. Aceste observatii sunt in conformitate cu alte studii care evidentiaza faptul ca rata de clearance spontan al VHC, replicarea VHC si gradul fibrozei hepatice sunt influentate negativ de infectia HIV [Soriano, 2007; Operskalski, 2011; Thein, 2008] (Tabelul 40).

Tabel 40. Impactul imunosupresiei induse de HIV asupra progresiei bolii hepatice secundara infectiei VHC.

9.3.3. Discutii

Recent in Romania s-a observat o crestere alarmanta a numarului pacientilor coinfectati VHC/HIV, majoritatea fiind utilizatori de droguri injectabile [Oprea, 2013]. Studiul de fata a identificat o serie de factori nefavorabili ai evolutiei infectiei VHC, respectiv:

prezenta aproape exclusiv (in 98,8% din cazuri) a genotipului 1 VHC;

incarcari virale VHC mari la initierea studiului (>600000 UI/ml in 53% dintre cazuri);

un grad avansat al fibrozei hepatice (valori ale indicelui compozit FIB-4 mai mari de 3,25 in 34,9% dintre cazuri);

prezenta imunosupresiei severe (in 52,2% dintre cazuri).

In general, un procent scazut de persoane co-infectate VHC/HIV, obtin raspuns virusologic sustinut dupa administrarea terapiei standard pentru infectia VHC (PegIFN si RBV), acest regim terapeutic fiind in acelasi timp si foarte greu tolerat. Ratele scazute de RVS, intre 27%-40%, se pot datora fie activarii sistemului imun de catre infectia HIV, fie inducerii caii proinflamatorii de catre VHC cu un raspuns aberant la tratamentul cu IFN [Torriani, 2004; Kottilil, 2009]. Cu toate acestea, analize retrospective, efectuate pe biopsii hepatice seriate, au demonstrat ca tratamentul infectiei VHC poate stopa evolutia fibrozei hepatice si induce regresia acesteia, dar in acelasi timp, poate favorizeza progresia infectiei HIV si evolutia spre SIDA [Ingiliz, 2012; Thein, 2008; d'Arminio, 2009]. In conditiile in care scopul unui tratament antiviral eficient este de a preveni complicatiile pe termen lung (evolutia spre ciroza dupa un interval mediu de doua decenii), ramane o provocare abordarea terapeutica a persoanelor dificil de tratat (pacienti coinfectati cu HIV, cei cu ciroza, cu insuficienta renala etc.). Deoarece noile regimuri terapeutice, in care se recomanda agenti cu actiune directa, sunt extrem de costisitoare, accesul va fi limitat in majoritatea tarilor. Terapia standard utilizata, in prezent, pentru majoritatea pacientilor coinfectati VHC/HIV ramane cea cu PegIFN/RBV, rata de RVS fiind de numai 50% [Torriani, 2004; Núñez, 2007].

Aprobarea primilor inhibitori de proteaza pentru pacientii monoinfectati VHC cu genotipul 1, a determinat ca si in cazul pacientilor coinfectati VHC/HIV sa fie recomandata tripla terapie, observandu-se cresteri semnificative ale ratei de RVS [Cotte, 2013, Poizot-Martin, 2013]. In anul 2014, noile regimuri STAT-C, au fost recomandate in tarile dezvoltate din punct de vedere economic, in cazul pacientiilor coinfectati VHC/HIV, astfel incat se asteapta ca abordarea si reusita terapeutica sa se modifice substantial. Prima molecula aprobata este un inhibitor al polimerazei virale, sofosbuvir. In studiul PHOTON, recomandarea combinatiei terapeutice: sofosbuvir+RBV, la pacientii naivi, coinfectati HIV/VHC genotip 1, cat si la cei naivi si exprimentati terapeutic coinfectati HIV/VHC genotipul 2/3, a determinat o rata a RVS la 12 saptamani de 76%, 88% si respectiv 67% [Sulkowski, 2013]. Tot in anul 2014, au fost aprobate alte doua DAA: un inhibitor de proteaza virala de generatia a doua, simeprevir si un inhibitor al NS5A – daclatasvir. In studiul C212, in care s-a recomandat, simeprevir+PegIFN/RBV, pentru pacientii coinfectati HIV/VHC genotip1, naivi, cu recadere, cu raspuns virusologic partial sau nul la tratamentul anterior, rata de RVS la 12 saptamani, a fost de 79%, 87%, 70%, si respectiv 50% [Dieterich, 2013]. Alte medicamente cu actiune directa antivirala au determinat rezultate promitatoare: in studiul STARTVerso, in care s-a recomandat utilizarea combinatiei terapeutice: faldaprevir (inhibitor proteaza virala de generatia a doua)+Peg/IFN/RBV la pacientii coinfectati HIV/VHC genotipul 1 naivi sau cu recadere la tratamentul anterior, inclusiv la cei cu ciroza hepatica, rata de RVS la 4 saptamani a fost de aproximativ 74% [Rockstroh, 2013].

In Romania, lista de asteptare in vederea obtinerii terapiei anti VHC depaseste 5000 de pacienti, majoritatea fiind monoinfectati, cu boala hepatica avansata si evolutie rapida spre ciroza. Numarul pacientilor tratati este scazut in principal din cauza lipsei fondurilor, astfel incat cresterea acestui grup populational special, format din persoane co-infectate VHC/HIV se asteapta sa aiba un important impact economic. Viitorul obstacol nu va consta in siguranta si eficacitatea noilor regimuri anti VHC, ci mai degraba va fi de ordin economic, deoarece aceste terapii de ultima generatie sunt extrem de costisitoare [Gheorghe, 2012; Sultana, 2012].

9.3.4. Concluzii

Pacientii coinfectati VHC/HIV din Romania prezinta o serie de factori asociati cu evolutia nefavorabila a infectiei VHC (prezenta genotipului 1 in 98,8% din cazuri, a incarcarii virale VHC mari la initierea studiului, a unui grad avansat al fibrozei hepatice si a imunosupresiei severe).

Nivelul avansat al fibrozei hepatice se asociaza cu o viremie VHC inalta, cu scaderea semnificativa a numarului de celule CD4 si cu tratamentul antiretroviral.

Aceste aspecte sunt cu atat mai importante cu cat recent, in Romania, a fost raportata o crestere semnificativa a numarului pacientilor coinfectati VHC/HIV, majoritatea fiind utilizatori de droguri injectabile.

CONCLUZII GENERALE

In urma analizei epidemiologiei moleculare a infectiei VHC, am observat ca genotipul 1b este inca predominant in cadrul epidemiei de hepatita C din Romania. Majoritatea pacientilor infectati cu genotipul 1b, au avut mai multi factori de risc intricati, transfuzia de sange ramanand factorul de risc cel mai frecvent intalnit. In schimb, tratamentele parenterale multiple si interventiile stomatologice nu reprezinta factori de risc semnificativi pentru achizitia infectiei VHC, fiind uniform distribuiti in cadrul lotului. Identificarea legaturii epidemiologice certe intre tratamentele injectabile multiple si transmiterea VHC detine o importanta deosebita in stabilirea filiatiei epidemiologice a cazurilor si in implementarea unor masuri eficiente de control a raspandirii VHC in Romania, avand importante implicatii in evolutia naturala si sub tratament a infectiei.

In Romania, toti pacientii care au fost supusi transplantului hepatic secundar hepatitei cronice C, sunt infectati cu genotipul 1b; asociat unui prognostic rezervat. In perioada posttransplant:

Factorii genetici ai gazdei joaca un rol major in evolutia bolii hepatice, determinarea polimorfismului IL28B al primitorului poate sa identifice pacientii cu risc de agravare a bolii hepatice posttransplant.

Nu exista impact semnificativ al polimorfismului IL28B asupra raspunsului virusologic obtinut in urma tratamentului cu PegIFN/RBV.

Concordanta intre genotipul favorabil CC IL28 B al donorului si genotipul CC al primitorului conditioneaza o evolutia favorabila postTH.

Datele subliniaza importanta alocarii unei grefe hepatice cu genotip favorabil in cazul pacientilor infectati VHC cu indicatie de TH, acest lucru determinand imbunatatirea semnificativa a evolutiei postTH.

La pacienti cu hepatita C cronica infectati cu genotipul 1b, netratati, niveluri serice crescute ale sideremiei, feritinei si transferinei sunt asociate independent atat cu stadiul fibrozei, cat si cu activitatea necro-inflamatorie, indicand faptul ca acesti parametrii serici pot fi markeri predictivi ai evolutiei bolii hepatice.

La pacienti coinfectati VHC/HIV au fost identificati o serie de factori asociati cu evolutia nefavorabila a infectiei VHC (prezenta incarcarii virale VHC mari, a unui grad avansat al fibrozei hepatice si a imunosupresiei severe). Toate aceste caracteristici arata ca rata de clearance spontan a VHC, nivelul de replicare virala si gradul fibrozei hepatice sunt influentate negativ de catre infectia HIV.

In ultimi ani, epidemiologia infectiei VHC si parametrii epidemiologici (prevalenta, incidenta, distributia genotipurilor, factorii de risc importanti in achizitia VHC) s-au schimbat in mod semnificativ, in mare parte datorita cresterii numarului de utilizatori de droguri injectabile (IDU) si a migratiei continue a populatiei din zonele endemice.

A fost evidentiata o prevalanta alarmanta a infectiei VHC in randul utilizatorilor de droguri injectabile. Majoriatatea pacientilor din acest grup de risc sunt barbati, cu varsta cuprinsa intre 30 si 39 de ani, cu nivel de scolarizare scazut, someri/fara loc de munca, cu debutului consumului de droguri intre 15-19 ani si cu o perioada mare de consum (peste 6 ani). Odata cu introducerea etnobotanicelor, utilizate in asociere cu heroina, se remarca o crestere masiva a frecventei coinfectiei HIV/VHC. Este necesara implementaea rapida a metodelor durabile de reducere a riscurilor in cadrul acestui grup populational, cu scopul de a limita tendinta de crestere alarmanta a infectiilor virale cu transmitere parenterala.

La utilizatorii de droguri injectabile, genotipul 1b tinde sa fie inlocuit de subtipurile 1a, 3a si 4a. Recentele valuri epidemice HIV/hepatite virale pot determina o raspindire rapida a noilor genotipuri si in cadrul populatiei generale.

In conditiile diversificarii subtipurilor virale circulante se impune o supraveghere atenta in vederea detectiei rapide a unor recombinanti intra/inter-genotipici, fiind deja raporatate date la nivel global, asupra emergentei recombinatilor – de tip 1a/1b si 2k/1b, precum si o adaptare corespunzatoare a strategiilor terapeutice.

Circulatia concomitenta a mai multor subtipuri virale, creaza premizele aparitiei unor infectii multiple, cu aparitia recombinantilor care pot deveni dominanti intr-un areal geografic, cu impact clinic important asupra progresiei bolii hepatice si a raspunsului la tratment.

BIBLIOGRAFIE

Abbvie completes largest Phase III program of an all-oral interferon-free therapy for the treatment of hepatitis C genotype 1. Available: http://abbvie.mediaroom.com/ 2014-01-31-AbbVie-Completes-Largest-Phase-III-Programof- an-All-Oral-Interferon-Free-Therapy-for-the-Treatment-of- Hepatitis-C-Genotype-1. Accessed, January 31, 2014.

Abid K, Pazienza V, et al., (2005), An in vitro model of hepatitis C virus genotype 3a-associated triglycerides accumulation, J Hepatol; 42(5): 744–751.

Accapezzato D., Fravolini F., et al., (2002); Hepatitis C flare due to superinfection by genotype 4 in an HCV genotype 1b chronic carrier, European Journal of Gastroenterology & Hepatology, Volume 14 – Issue 8 – pp 879-881.

Achillion Pharmaceuticals. Achillion Announces Additional Proof-of-Concept Data With ACH-2684 for the Treatment of Hepatitis C. Press release. May 21, 2012.

AGDHA (Australian Government Department of Health and Ageing), 2006. National Notifiable Diseases Surveillance System (available at www9.health.gov.au/cda/Source/CDA-index.cfm).

Agnello V., Abel G., et al., (1999), Hepatitis C virus and other Flaviviridae viruses enter cells via low-density lipoprotein receptor, Proc Natl Acad Sci U S A; 96:12766-71.

Ago H., Adachi T., Yoshida A., et al., (1999), Crystal structure of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus, Structure with Folding and Design 7, 1417–1426.

Ahmetagić S., Salkić N., Čičkušić E., et al., (2009), Hepatitis C virus genotypes in chronic hepatitis C patients and in first time blood donors in Northeastern Bosnia and Herzegovina, Bosnian Journal of Basic Medical Sciences; 9(4):278–282.

Ait-Goughoulte M., Hourioux C., Patient R., et al., (2006), Core protein cleavage by signal peptide peptidase is required for hepatitis C virus-like particle assembly, J Gen Virol.;87(Pt 4):855-60.

Akamatsu N., Sugawara Y., (2012), Liver Transplantation and Hepatitis C, International Journal of Hepatology Volume, Article ID 686135, 22 pages.

Alfaleh F. Z., Hadad Q., et al., (2004), Peginterferon alpha-2b plus ribavirin compared with interferon alpha-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C in Saudi patients commonly infected with genotype 4, Liver Int; 24(6): 568-74.

Aligo J., Jia S., Manna D., Konan K.V., (2009), Formation and function of hepatitis C virus replication complexes require residues in the carboxy-terminal domain of NS4B protein, Virology; 393:68–83.

Aly H.H., Shimotohno K., Hijikata M., et al., (2012), In vitro models for analysis of the hepatitis C virus life cycle, Microbiology and Immunology; 56: 1–9

Alter H.J., Holland P.V., Purcell R.H., et al. (1978), Transmissible agent in non-A, non-B hepatitis., Lancet, 1:459-463.

Alter H.J., (1992), New kit on the block: evaluation of second-generation assays for detection of antibody to the hepatitis C virus, Hepatology; 15:350–3.

Alter M.J., (2007), Epidemiology of hepatitis C virus infection, World J Gastroenterol; 13:2436–41.

Alter M.J., (1997), Epidemiology of hepatitis C, Hepatology; 26: 62S-65S;

Alter M.J., (2002), Prevention of spread of hepatitis C, Hepatology; 36: S93-S98.

Alter M.J., (2002), The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1999 through 2002, Ann Intern Med2006; 144: 705-714.

Andre P., Komurian-Pradel F., Deforges S., et al. (2002), Characterization of low- and very-low-density hepatitis C virus RNA-containing particles, J Virol;76:6919-28.

Anonymous. Hepatitis C: RKI-Ratgeber Infektionskrankheiten, Epidemiologisches Bulletin 2004;17:141.

Ansaldi F., Bruzzone B., Salmaso S., et al. (2005), Different seroprevalence and molecular epidemiology patterns of hepatitis C virus infection in Italy, J Med Virol; 76:327–332.

Anty R., Marjoux S., Iannelli A. et al. (2012), Regular coffee but not espresso drinking is protective against fibrosis in a cohort mainly composed of morbidly obese European women with NAFLD undergoing bariatric surgery, J Hepatol.; 57: 1090–1096.

Apichartpiyakul C., Chittivudikarn C., Miyajima H., et al. (1994), Analysis of hepatitis C virus isolates among healthy blood donors and drug addicts in Chiang Mai, Thailand, J Clin Microbiol; 32,2276–2279.

Appel N., Pietschmann T., Bartenschlager R. (2005b), Mutational analysis of hepatitis C virus nonstructural protein 5A: potential role of differential phosphorylation in RNA replication and identification of a genetically flexible domain, J Virol; 79:3187–3194.

Appel N., Zayas M., Miller S., et al. (2008), Essential role of domain III of nonstructural protein 5A for hepatitis C virus infectious particle assembly, PLoS Pathog 4:e1000035..

Araujo A.C., Astrakhantseva I.V., Fields H.A., et al. (2010), Distinguishing Acute from Chronic Hepatitis C Virus (HCV) Infection Based on Antibody Reactivities to Specific HCV Structural and Nonstructural Proteins, Journal of Clinical Microbiology; 49:54–7.

Argentini C., Dettori S., et al. (2000), Molecular characterisation of HCV genotype 4 isolates circulating in Italy, J Med Virol; 62(1): 84-90.

Armstrong G.L., Alter M.J., McQuillan G.M., et al., (2000), The past incidence of hepatitis C virus infection: implications for the future burden of chronic liver disease in the United States, Hepatology; 31: 777-782.

Armstrong G.L., Wasley A., Simard E.P., et al., (2006), The prevalence of hepatitis C virus infection in the United States, 1999 through 2002, Ann Intern Med; 144: 705-714.

Armstrong G.L., (2007), Injection drug users in the United States, 1979–2002: an aging population., Arch Intern Med.; 167(2): 166–73.

ARUP Laboratories. Test Directory. Hepatitis C Virus Antibody, RIBA. www.aruplab.com. Ref Type: Internet Communication, 2010.

Ashfaq et al., (2011), In-vitro model systems to study Hepatitis C Virus, Genetic Vaccines and Therapy, 9:7.

Ayed K., Gorgi Y., Ben Abdallah T., et al., (2003): Hepatitis C virus infection in hemodialysis patients from Tunisia: national survey by serologic and molecular methods, Transplant Proc; 35:2573–2575.

Azzazy H.M., Mansour M.M., Kazmierczak S.C., (2006), Nanodiagnostics: a new frontier for clinical laboratory medicine, Clin Chem; 52:1238–46.

Backus L.I., Boothroyd D.B., Phillips B.R., et al., (2011), A sustained virologic response reduces risk of all-cause mortality in patients with hepatitis C, Clin Gastroenterol Hepatol; 9:509 – 516.e1

Bacon B., Gordon S., Lawitz E., et al., (2011), Boceprevir for Previously Treated Chronic HCV Genotype 1 Infection, N Engl J Med; 364:1207-17.

Balagopal A., Thomas D.L., Thio C.L.,(2010),IL28B and the control of hepatitis C virus infection, Gastroenterology; 139(6):1865–1876.

Barrera J.M., Bruguera M., Ercilla M.G., et al., (1991), Incidence of non-A, non-B hepatitis after screening blood donors for antibodies to hepatitis C virus and surrogate markers, Ann Intern Med; 115:596–600.

Barrera J.M., Francis B., Ercilla G., et al., (1995), Improved detection of anti- HCV in post-transfusion hepatitis by a third-generation ELISA, Vox Sang; 68:15–8.

Barria M. I., Gonzalez A., et al., (2009), Analysis of natural variants of the hepatitis C virus internal ribosome entry site reveals that primary sequence plays a key role in capindependent translation, Nucleic Acids Res; 37(3): 957-71.

Bartenschlager R., Ahlborn-Laake L., Mous J., et al., (1993), Nonstructural protein 3 of hepatitis C virus encodes a serine-type proteinase required for cleavage at the NS3/4 and NS4/5 junctions, J Virol; 67:3835-44.

Bartenschlager R., Lohmann V., Wilkinson T., et al., (1995), Complex formation between the NS3 serinetype proteinase of the hepatitis C virus and NS4A and its importance for polyprotein maturation, J Virol; 69:7519-28.

Bartenschlager R., Penin F., Lohmann V., et al., (2011), Assembly of infectious hepatitis C virus particles, Trends Microbiol; 19: 95-103.

Bartenschlager R.,Lohmann V., (2000), Replication of hepatitis C virus, Journal of General Virology 81: 1631-1648.

Barth H., Liang T.J., Baumert T.F., (2006), Hepatitis C virus entry: molecular biology and clinical implications, Hepatology; 44: 527–535.

Bartosch B., Dubuisson J., Cosset F.L., (2003a), Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1–E2 envelope protein complexes, J Exp Med; 197, 633–642.

Bartosch B., Vitelli A., Granier C., et al., (2003b), Cell entry of hepatitis C virus requires a set of co-receptors that include the CD81 tetraspanin and the SR-B1 scavenger receptor, J Biol Chem; 278, 41624–41630.

Behrens S. E., Tomei L., De Francesco R., (1996), Identification and properties of the RNA-dependent RNA polymerase of hepatitis C virus, EMBO Journal 15, 12–22.

Berg T., Andreone P., Pol S., et al., (2011), Predictors of virologic response with telaprevir-based combination treatment in HCV genotype 1-infected patients with prior peginterferon/ribavirin treatment failure: post-hoc analysis of the phase III realize study. Hepatology;54:375A-376A.

Berg T., Hopf U., Stark K., et al., (1997), Distribution of hepatitis C virus genotypes in German patients with chronic hepatitis C: correlation with clinical and virological parameters, J Hepatol; 26:484–491.

Berg T., von Wagner M., et al.,(2006), Extended treatment duration for hepatitis C virus type 1: comparing 48 versus 72 weeks of peginterferon-alfa-2a plus ribavirin, Gastroenterology; 130(4): 1086-97.

Biswal B.K., et al., (2006), Non-nucleoside inhibitors binding to hepatitis C virus NS5B polymerase reveal a novel mechanism of inhibition, J. Mol. Biol. 361:33–45.

Blanchard E., Belouzard S., Goueslain L., et al., (2006), Hepatitis C virus entry depends on clathrinmediated endocytosis. J Virol;80:6964-72.

Blight K.J., Rice C.M., (1997), Secondary structure determination of the conserved 98-base sequence at the 3´terminus of hepatitis C virus genome RNA, J Virol;71:7345-52.

Blight K.J., McKeating J.A., Rice C.M., (2002), Highly permissive cell lines for subgenomic and genomic hepatitis C virus replication, J. Virol.; 76:13001-13014.

Blight K.J., McKeating J.A., Marcotrigiano J., (2003), Efficient replication of hepatitis C virus genotype 1a RNAs in cell culture, J. Virol.; 77, pp. 3181–3190.

Bochud P.Y., Cai T., Overbeck K. et al., (2009), Genotype 3 is associated with accelerated fibrosis progression in chronic hepatitis C, J Hepatol.; 51: 655–666.

Boesecke C., Vogel M., (2011), HIV and hepatitis C co-infection: acute HCV therapy, Curr Opin HIV AIDS;6:459-64. (Abstract).

Bonkovsky H.L., (2002), Iron as a comorbid factor in chronic viral hepatitis, Am J Gastroenterol.;97(1):1-4.

Bonny C., Fontaine H., Poynard T., et al., (2006), Effectiveness of interferon plus ribavirin combination in the treatment of naive patients with hepatitis C virus type 5. A French multicentre retrospective study, AlimentPharmacol Ther; 24: 593–600.

Bouchardeau F., Cantaloube J. F., et al.,(2007), Improvement of hepatitis C virus (HCV) genotype determination with the new version of the INNO-LiPA HCV assay, J Clin Microbiol;45(4): 1140-5.

Boulant S., Montserret R., et al., (2006), Structural determinants that target the hepatitis C virus core protein to lipid droplets, J Biol Chem; 281(31): 22236-47.

Bowden D.S., Berzsenyi M.D., (2006), Chronic hepatitis C virus infection: genotyping and its clinical role, Future Microbiol; 1: 103-12.

Bradley D., McCaustland K., Krawczynski K., et al., (1991), Hepatitis C virus: buoyant density of the factor VIII-derived isolate in sucrose, J Med Virol; 34:206-8.

Branch A. D., Stump D. D., et al., (2005), The hepatitis C virus alternate reading frame (ARF) and its family of novel products: the alternate reading frame protein/F-protein, the double-frameshift protein, and others." Semin Liver Dis; 25(1): 105-17.

Brazzoli M., A. Bianchi, et al. (2008), CD81 is a central regulator of cellular events required for hepatitis C virus infection of human hepatocytes, J Virol; 82(17): 8316-29.

Bressanelli S., Tomei L., Roussel A., et al., (1999), Crystal structure of the RNAdependentRNA polymerase of hepatitis C virus. Proceedings of theNational Academy of Sciences, USA; 96, 13034±13039.

Broers B., Helbling B., Francois A., et al., (2005), Barriers to interferon-alpha therapy are higher in intravenous drug users than in other patients with acute hepatitis C, J Hepatol; 42:323-28.

Bronowicki J.P., Pol S., Thuluvath P., (2011),Asunaprevir (ASV; BMS-650032), an NS3 protease inhibitor, in combination with peginterferon and ribavirin in treatment-naive patients with genotype 1 chronic hepatitis C infection)., J Hepatol; 54: S472.

Brown R.S., (2005), Hepatitis C and liver transplantation, Insight Rev Nat; 436: 973-8.

Bruno R., Sacchi P., Cima S., et al., (2011), Correlation between FIB4, liver stiffness and metabolic parameters in patients with HIV and hepatitis C virus co-infection, DigLiver Dis.; 43(7):575-8.

BSS – Behavioural Surveillance Survey, Raport National Antidrog, Agentia Nationala Antidrog, 2013.

Bukh J., (1995), Genetic heterogeneity of hepatitis C virus: quasispecies and genotypes, Semin Liv. Dis. 15: 41-63.

Bukh J., Pietschmann V., Lohmann T., et al., (2002), Mutations that permit efficient replication of hepatitis C virus RNA in Huh-7 cells prevent productive replication in chimpanzees, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, pp. 14416–14421.

Büyükasik N., Nadir N., Akin F., et al., (2011), Serum iron parameters in cirrhosis and chronic hepatitis, Turk J Gastroenterol; 22(6): 606-611.

Callens N., Ciczora Y., et al., (2005), Basic residues in hypervariable region 1 of hepatitis C virus envelope glycoprotein e2 contribute to virus entry, J Virol 79(24): 15331-41.

Camoni L., Regine V., Salfa M.C., et al., (2010), Continued high prevalence of HIV , HBV and HCV among injecting and noninjecting drug users in Italy, Ann Ist Super Sanita; 46:59-65.

Candotti D., Temple J., Sarkodie F., et al., (2003), Frequent recovery and broad genotype 2 diversity characterize hepatitis C virus infection in Ghana, West Africa, J Virol 77:7914–7923.

Carbone M.,Cockwell P.,Neuberger J., (2011), Hepatitis C and Kidney Transplantation, Int J Nephrol.; 2011: 593291.

Carrat F., Bani-Sadr F., Pol S., et al., (2004), Pegylated interferon alfa-2b vs standard interferon alfa-2b, plus ribavirin, for chronic hepatitis C in HIV-infected patients: a randomized controlled trial, JAMA; 292(23):2839- 48.

Carreño V., Bartolomé J., Castillo I., et al., (2012), New perspectives in occult hepatitis C virus infection, World J Gastroenterol; 18:2887-2894. 

Castéra L., Vergniol J., Foucher J., et al., (2005), Prospective comparison of transient elastography, Fibrotest, APRI and liver biopsy for the assessment of fibrosis in chronic hepatitis C, Gastroenterology; 128343–350.350.

Castillo I., Pardo M., et al., (2004), Occult hepatitis C virus infection in patients in whom the etiology of persistently abnormal results of liver-function tests is unknown, J Infect Dis; 189(1): 7-14.

Cavalheiro N.P., (2007), Hepatitis C: genotyping, Brazilian Journal of Infectious Diseases; 11(Suppl. 1), 25-27. 

CDC. Viral Hepatitis Resource Center: 2011 HCV Symposium. Atlanta, GA: US Department of Health and Human Services, CDC; 2011. Available at http://www.cdc.gov/hepatitis/resources/mtgsconf/hcvsymposium2011.htm.

Cenci M., De Soccio G., Recchia O., (2003), Prevalence of hepatitis C virus (HCV) genotypes in central Italy, Anticancer Res; 23: 5129- 5132.

Centers for Disease Control and Prevention. Recommendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-related chronic disease. MMWR 1998; 47(RR-19):1–33.

Chambers T. J., Fan X., et al. (2005), Quasispecies heterogeneity within the E1/E2 region

as a pretreatment variable during pegylated interferon therapy of chronic hepatitis C virus infection, J Virol; 79(5): 3071-83.

Chang K.M., (2013 ), Hepatitis C virus: virology and life cycle, Clin Mol Hepatol.; 19: 17-25.

Chang K.S., Jiang J., Cai Z., et al., (2007), Human apolipoproteine is required for infectivity and production of hepatitis C virus in cell culture, J. Virol.; 81:13783-13793.

Charlton M.R., Thompson A., Veld B.J., et al., (2011), Interleukin-28B Polymorphisms Are Associated With Histological Recurrence and Treatment Response Following Liver Transplantation in Patients With Hepatitis C Virus Infection, Hepatology;53:317-324.

Chen T. M., Tung J. N., (2009), Older age per se has negative effect on hepatitis C patients treated with peginterferon and ribavirin, Am J Gastroenterol; 104(8): 2117-9.

Chlabicz S., Flisiak R., Kowalczuk O., et al., (2008), Changing HCV genotypes distribution in Poland – Relation to source and time of infection, J Clin Virol.; 42(2):156–159.

Chung R.T., Andersen J., Volberding P., et al., (2004), Peginterferon Alfa-2a plus ribavirin versus interferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C in HIV-coinfected persons, N Engl J Med.; 351(5):451-9.

Cochrane A., Searle B., Hardie A., et al., (2002), A genetic analysis of hepatitis C virus transmission between injection drug users, J Infect Dis; 186: 1212-1221.

Cocquerel L., Voisset C., Dubuisson J., (2006), Hepatitis C virus entry: potential receptors and their biological functions, J. Gen. Virol.; 87, 1075-1085.

Coilly A., Roche B., Dumortier J., et al., (2014), Safety and efficacy of protease inhibitors to treat hepatitis C after liver transplantation: A multicenter experience, J Hepatol; 60:78-86.

Colin C., Lanoir D., Touzet S., et al., (2001), Sensitivity and specificity of third-generation hepatitis C virus antibody detection assays: an analysis of the literature, J Viral Hepat; 8:87–95.

Colina R., Casane D., Vasquez S., et al., (2004), Evidence of intratypic recombination in natural populations of hepatitis C virus, J. Gen. Virol.; 85:31–37.

Coppola N., Pisapia R., Tonziello G., et al., (2009), Improvement in the aetiological diagnosis of acute hepatitis C: a diagnostic protocol based on the anti-HCV-IgM titre and IgG Avidity Index, Journal of Clinical Virology; 46:222–9.

Cormier E. G., Tsamis F., Kajumo F., et al., (2004), CD81 is an entry coreceptor for hepatitis C virus, Proc Natl Acad Sci U S A; 101, 7270–7274.

Cornberg M., Razavi H.A., Alberti A., et al., (2011), A systematic review of hepatitis C virus epidemiology in Europe, Canada and Israel, Liver Int; 31(Suppl 2):30–60.

Cornberg M., Manns M.P., Wedemeyer H., (2009), Standard therapy for HCV infection, Hepatology.

Coto-Llerena M., Pérez-del-Pulgar S., Crespo G., et al., (2011), Donor and Recipient IL28B Polymorphisms in HCV-Infected Patients Undergoing Antiviral Therapy before and after Liver Transplantation, American Journal of Transplantation,11: 1051–1057.

Cotte L., (2013), High end-of-treatment (EOT) response rate with telaprevir-pegIFN-RBV in treatmentexperienced HIV co-infected patients with HCV genotype 1: ANRS HC26 telapreVIH study. AASLD 2013. Washington, DC, Abstract 1108.

Crespo G., Marino Z., Navasa M., et al., (2012), Viral hepatitis in liver transplantation, Gastroenterology; 142:1373-1383.

Cristina J., Colina R., (2006), Evidence of structural genomic region recombination in Hepatitis C virus, Virol J.; 3:53.

Curry M.P., Forns X., Chung R., et al., (2013), Pretransplant sofosbuvir and ribavirin to prevent recurrence of HCV infection after liver transplantation, Hepatology; 58:314A (Abstract 213).

Cyr D.D., Lucas J.E., Thompson J.W., et al., (2011), Characterization of serum proteins associated with IL28B genotype among patients with chronic hepatitis C, PloS One; 6(7):e21854.

Dalgard O., Bjoro K., et al., (2008), Pegylated interferon alfa and ribavirin for 14 versus 24 weeks in patients with hepatitis C virus genotype 2 or 3 and rapid virological response, Hepatology; 47(1): 35-42.

Danta M., Rodger A.J., (2011), Transmission of HCV in HIV-positive populations, Curr Opin HIV AIDS; 6(6):451-8.

Danta M., Brown D., Bhagani S., (2007), Recent epidemic of acute hepatitis C virus in HIV-positive men who have sex with men linked to high-risk sexual behaviours, AIDS; 21:983–991.

Danta M., Semmo N., Fabris P., et al., (2008. ),Impact of HIV on host-virus interactions during early hepatitis C virus infection, J Infect Dis; 197, 1558–1566 10.1086/587843.

d'Arminio Monforte A., Cozzi-Lepri A., Castagna A., et al., (2009), Risk of developing specific AIDS-defining illnesses in patients coinfected with HIV and hepatitis C virus with or without liver cirrhosis, Clin Infect Dis.; 49(4):612-22.

Darwish M.A., Faris R., Darwish N., et al., (2001), Hepatitis C and cirrhotic liver disease in the Nile delta of Egypt: a community-based study, Am J Trop Med Hyg.; 64:147–53.

Davis G.L., et al., (2010), Aging of hepatitis C virus (HCV)-infected persons in the United States: a multiple cohort model of HCV prevalence and disease progression, Gastroenterology; 138(2): p. 513-21, 521 e1-6.

De Marco L., Gillio-Tos A., et al.(2009), Occult HCV infection: an unexpected finding in a population unselected for hepatic disease, PLoS One; 4(12): e8128.

Degos F., Christidis C., Ganne-Carrie N., et al., (2000), Hepatitis C virus related cirrhosis: time to occurrence of hepatocellular carcinoma and death, Gut; 47:131–136.

Demetriou V.L., van de Vijver D.A., Hezka J., et al., (2010), Hepatitis C infection among intravenous drug users attending therapy programs in Cyprus, J Med Virol; 82:263-270.

Denniston M.M., Jile R.B., Drobeniuc J., et al., (2014), Chronic Hepatitis C Virus Infection in the United States, National Health and Nutrition Examination Survey 2003 to 2010, Ann Intern Med.;160(5):293-300.

Deuffic S., Buffat L., Poynard T., et al., (1999), Modeling the hepatitis C virus epidemic in France, Hepatology; 29: 1596-1601.

Di Bisceglie A.M., (2000), Natural history of hepatitis C: its impact on clinical management, Hepatology; 31(4):1014-8.

Diago M., Hassanein T., et al. (2004), Optimized virologic response in hepatitis C virus genotype 4 with peginterferon-alpha2a and ribavirin, Ann Intern Med; 140(1): 72-3.

Dias P.T., Hahn J.A., Delwart E., et al., (2011), Temporal changes in HCV genotype distribution in three different high risk populations in San Francisco, California, BMC Infectious Diseases; 11:208.

Dibrov SM, Parsons J, Carnevali M, (2014), Hepatitis C Virus Translation Inhibitors Targeting the Internal Ribosomal Entry Site, J. Med. Chem.; 57, 1694−1707.

Dieterich D., Rockstroh J.K., Orkin C., et al., (2013), Simeprevir (TMC435) plus peginterferon/ribavirin in patients co-infected with HCV genotype-1 andHIV-1: primary analysis of the C212 study, 14th European AIDs Conference (EACS 2013), Brussels, 16-19.

Dieterich D. T., Rizzetto M., Manns M. P., (2009), Management of Chronic Hepatitis C Patients Who have Relapsed or Not Responded to Pegylated Interferon Alfa Plus Ribavirin, J Viral Hepat.; 16(12):833-43.

Dill M.T., Duong F.H., Vogt J.E., et al., (2011), Interferon-induced gene expression is a stronger predictor of treatment response than IL28B genotype in patients with hepatitis C, Gastroenterology; 140:1021-1031.

Diviney S., Tuplin A., Struthers M., et al., (2008), A hepatitis C virus cis-acting replication element forms a long-range RNA–RNA interaction with upstream RNA sequences in NS5B, J Virol; 82: 9008–9022.

Domingo E., Gomez J., (2007), Quasispecies and its impact on viral hepatitis, Virus Res 127(2): 131-50.

Dominguez A., Bruguera M., Vidal J., et al., (2001), Community-based seroepidemiological survey of HCV infection in Catalonia, Spain, J Med Virol; 65: 688-693.

Donahue J.G., Muñoz A., Ness P.M., et al., (1992), The declining risk of post-transfusion hepatitis C virus infection, N Engl J Med; 327(6): p. 369-73.

Dore G.J., MacDonald M., Law M.G., et al., (2003), Epidemiology of hepatitis C virus infection in Australia, Aust Fam Physician; 32: 796-798.

DornerM.,HorwitzJ.A., DonovanB.M., et al., (2013), Completion of the entire hepatitis C virus life cycle in genetically humanized mice, Nature; 501,237–241.

Duarte-Rojo A., Veldt B.J., Goldstein D.D., et al., (2012), The Course of Posttransplant Hepatitis C Infection: Comparative Impact of Donor and Recipient Source of the Favorable IL28B Genotype and Other Variables, Transplantation; 94(2):197–203.

Duvet S., Op de Beeck A., Cocquerel L., et al., (2002), Glycosylation of the hepatitis C virus envelope protein E1 occurs posttranslationally in a mannosylphosphoryldolichol-deficient CHO mutant cell line, Glycobiology; 12:95-101.

EASL, J Hepatology, 2014;60:392-420.

Egger D., Wolk B., Gosert R., et al., (2002), Expression of hepatitis C virus proteins induces distinct membrane alterations including a candidate viral replication complex, Journal of Virology; 76 (12), 5974–5984.

El-Awady M.K., Mostafa L., Tabll A.A., et al., (2012), Association of IL28B SNP With Progression of Egyptian HCV Genotype 4 Patients to End Stage Liver Disease, Hepat Mon.; 12(4): 271-7.

Elmowalid G.A., Qiao M., Jeong S.H., et al., (2007), Immunization with hepatitis C virus-like particles results in control of hepatitis C virus infection in chimpanzees, Proc Natl Acad Sci USA; 104:8427.

El-Serag H., Kuzniarek J., Ramsey D.J., et al., (2014), Beverage Intake and the Risk of Advanced Fibrosis in HCV: Coffee, Tea, or Sodas? Digestive Disease Week (DDW 2014). Chicago, Abstract 775.

El-Shabrawi M.H., Kamal N.M., (2013), Burden of pediatric hepatitis C, World J Gastroenterol ;19(44):7880-7888.

EMCDDA – European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction, Annual report on the state of the drugs problem in Europe, Lisbon, 2010.

Enomoto N., Sakuma I., Asahina Y., et al., (1996), Mutations in the nonstructural protein 5A gene and response to interferon in patients with chronic hepatitis C virus 1b infection, N Engl J Med; 334:77-81.

Esteban J., Sauleda S., Quer J., (2008), The changing epidemiology of hepatitis C virus infection in Europe, J Hepatol; 48:148–62.

EuroHIV, HIV/AIDS Surveillance in Europe. Mid-year report 2007 No. 76. Saint-Maurice: French Institute for Public Health Surveillance; 2007.

European Association for the Study of the Liver, EASL Clinical Practice Guidelines: Management of hepatitis C virus infection, J Hepatol 2014;60:392-420.

European Centre for Disease Prevention and Control, Surveillance and Prevention of Hepatitis Band C in Europe. Stockholm: ECDC; 2013.

European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) and National Antidrug Agency from Romania (NAA), National Report on Drugs Situation for Romania, New Developments, Trends and In-depth Information on Selected Issues, REITOX, Bucharest, 2010.

European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction (EMCDDA) and National Antidrug Agency from Romania (NAA). National report on drugs situation for Romania, New developments, trends and in-depth information on selected issues. Bucharest: REITOX; 2013.

Evans M. J., von Hahn T., et al. (2007), Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry, Nature; 446(7137): 801-5.

Everson G., Cooper C., Hézode C., et al., (2012), Rapid and sustained achievement of undetectable HCV RNA during treatment with ritonavir-boosted danoprevir/Peg-IFNα-2A/RBV in HCV genotype 1 or 4 patients: DAUPHINE week 12 interim analysis. The EASL International Liver Congress 2012, Barcelona.

Everson G.T., Trotter J., Forman L., et al., (2005), Treatment of advanced hepatitis C with a low accelerating dosage regimen of antiviral therapy, Hepatology; 42:255–262.

Fabris C., Toniutto P., Scott C.A., et al., (2001), Serum iron indices as a measure of iron deposits in chronic hepatitis C, Clin Chim Acta; 304(1-2):49-55.

Failla C., Tomei L., De Francesco R., (1995), An amino-terminal domain of the hepatitis C virus NS3 protease is essential for interaction with NS4A, Journal of Virology 69, 1769-1777.

Fan X., Mao Q., Zhou D., et al., (2009), High diversity of hepatitis C viral quasispecies is associated with early virological response in patients undergoing antiviral therapy, Hepatology; 50:1765-72.

Farci P., Shimoda A., Wong D., et al., (1996), Prevention of hepatitis C virus infection in chimpanzees by hyperimmuneserum against the hypervariable region 1 of the envelope 2 protein, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA;93, 15394±15399.

Feinstone S.M., Kapikian A.Z., Purcell R.H., et al., (1975), Transfusion-associated hepatitis not due to viral hepatitis type A or B, N Engl J Med, 292:767-770.

Feld J.J., Jacobson I.M., Jensen D.M., et al., (2012), Up to 100% SVR4 rates with ritonavir-boosted danoprevir (DNVr), mericitabine (MCB) and ribavirin (R) t/- peginterferon alfa-2a (40KD) (P) in HCV genotype 1-infected partial and null responders: results from the MATTERHORN study. Hepatology; 56:231A–232A.

Felsenstein J., (1993), PHYLIP Inference Package version 3.5. Department of Genetics, University of Washington, Seattle, Wash., USA.

Ferenci P., Laferl H. et al., (2008), Peginterferon alfa-2a and ribavirin for 24 weeks in hepatitis C type 1 and 4 patients with rapid virological response, Gastroenterology; 135(2): 451-8.

Fernandez-Arcas N., Lopez-Siles J., et al. (2006), High prevalence of hepatitis C virus subtypes 4c and 4d in Malaga (Spain): phylogenetic and epidemiological analyses, J Med Virol 78(11): 1429-35.

Firpi R.J., Dong H., Clark V., et al., (2013), CC genotype donors for the interleukin-28B single nucleotide polymorphism are associated with better outcomes in hepatitis C after liver transplant, Liver Int.; 33(1): 72–78. doi:10.1111/liv.12013.

Fischer G.E., Schaefer M.K., Labus B.J., et al., (2010),Hepatitis C virus infections from unsafe injection practices at an endoscopy clinic in Las Vegas, Nevada, 2007–2008,Clin Infect Dis;51:267-273.

Fissell R.B., Bragg-Gresham J.L., Woods J.D., et al., (2004), Patterns of hepatitis C prevalence and seroconversion in hemodialysis units from three continents: the DOPPS, Kidney Int; 65(6):2335.

Flint M., vonHahn T., Zhang J., et al., (2006), Diverse CD81 proteins support hepatitis C virus infection, J Virol 80:11331–11342.

Flisiak R., Feinman S.V., Jablkowski M., (2009), The cyclophilin inhibitor Debio 025 combined with PEG-IFN alpha2a significantly reduces viral load in treatment naive hepatitis C patients, Hepatology; 49:1460-1468.

Fontana R.J., Hughes E.A., Bifano M., et al., (2013), Sofosbuvir and daclatasvir combination therapy in a liver transplant recipient with severe recurrent cholestatic hepatitis C, Am J Transplant;13:1601–1605.

Forns X., Fontana R.J., Moonka D., et al., (2013), Initial evaluation of the sofosbuvir compassionate use program for patients with severe recurrent HCV following liver transplantation, Hepatology; 58(Suppl 1):732A (Abstract 1084).

Forns X., Garcia-Retortillo M., Serrano T., et al., (2003), Antiviral therapy of patients with decompensated cirrhosis to prevent recurrence of hepatitis C after liver transplantation, J Hepatol;39:389–396.

Forns X., (2014), Gastroenterology. 2014;doi:10.1053/j.gastro.2014.02.051.


Foster G.R., Hezode C., Bronowicki J.P., et al., (2011), Telaprevir alone or with peginterferon and ribavirin reduces HCV RNA in patients with chronic genotype 2 but not genotype 3 infections, Gastroenterology; 141:881-9.e1.

Franchini M, Targher G, Capra F, et al., (2008), The effect of iron depletion on chronic hepatitis C virus infection, Hepatol Int.; 2(3):335-40.

Frank C., Mohamed M. K., et al. (2000), The role of parenteral antischistosomal therapy in the spread of hepatitis C virus in Egypt, Lancet; 355(9207): 887-91.

Friebe P., Bartenschlager R., (2002), Genetic analysis of sequences in the 3' nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication, J Virol 2002;76:5326-38.

Friebe P., Boudet J., Simorre J.P., et al., (2005), Kissing-loop interaction in the 3' end of the hepatitis C virus genome essential of RNA replication, J Virol.;79:380-92.

Fried M.W., (2002), Side effects of therapy of hepatitis C and their management. Hepatology36(5 Suppl 1):S237-244.

Fujita N., Sugimoto R., Ma N., et al., (2008), Comparison of hepatic oxidative DNA damage in patients with chronic hepatitis B and C, J Viral Hepatol.; 15:498-507.

Fujita N., Sugimoto R., Urawa N., et al., (2007), Hepatic iron accumulation is associated with disease progression and resistance to interferon/ribavirin combination therapy in chronic hepatitisC, J Gastroenterol, Hepatol.; 22: 1886-93.

Fukushi S., Katayama K., Kurihara C., et al., (1994), Complete 5' noncoding region is necessary for the efficient internal initiation of hepatitis C virus RNA, Biochem Biophys Res Commun;199:425-32.

Gale M. J., Blakely Jr., Kwieciszewski S. M., et al., (1998), Control of PKR protein kinase by hepatitis C virus nonstructural 5A protein : molecular mechanism of kinase regulation, Molecular and Cellular Biology; 18, 5208–5218.

Gane E., Rouzier R.,Stedman C.,et al.,(2010),Ritonavir boosting of low dose RG7227/ITMN-191, HCV NS3/4A protease inhibitor, results in robust reduction in HCV RNA at lower exposures than provided by unboosted regimens, J Hepatol.; 52: S16-S17.

Gane E.J., Rodriguez-Torres M., Nelson D.R., (2008),Antiviral activity of the HCV nucleoside polymerase inhibitor R7128 in HCV genotype 2 and 3 prior non-responders: interim results of R7128 1500mg BID with PEG-IFN and ribavirin for 28 days. Hepatology; 48: ALB10.

Gane E., Lawitz E., Rodriguez-Torres M., et al., (2013), Phase 3 randomized controlled trial of all-oral treatment with sofosbuvir+ribavirin for 12 weeks compared to 24 weeks of peg+ribavirin in treatment-naive GT2/3 HCV-infected patients (FISSION), 48th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL 2013), Amsterdam, Abstract 5.

Gao M., Nettles R.E., Belema M.,et al., (2010), Chemical genetics strategy identifies an HCV NS5A inhibitor with a potent clinical effect, Nature; 465: 96–100.

Gao D. Y., Zhang X. X., et al.(2008), Assessment of specific antibodies to F protein in serum samples from Chinese hepatitis C patients treated with interferon plus ribavarin, J Clin Microbiol; 46 (11): 3746-51.

Gao F., Nainan O. V., et al. (2007), Recombinant hepatitis C virus in experimentally infected chimpanzees, J Gen Virol; 88(Pt 1): 143-7.

Garg S., et al., (2013), Prevalent and incident hepatitis C virus infection among HIV-infected men who have sex with men engaged in primary care in a Boston community health center. Clin Infect Dis, online edition.

Gastaminza P., Cheng G., Wieland S., et al., (2008), Cellular determinants of hepatitis C virus assembly, maturation, degradation, and secretion, J Virol.; 82:2120-9.

Gates, A. T., Sarisky, R. T. & Gu, B. (2004). Sequence requirements for the development of a chimeric HCV replicon system, Virus Res; 100, 213–222.

Gaudieri S., Rauch A., Pfafferott K., et al., (2009), Hepatitis C virus drug resistance and immune-driven adaptations: relevance to new antiviral therapy, Hepatology; 49:1069-82.

Ge D., Fellay J., Thompson A.J.,et al., (2009), Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance, Nature.; 461:399–401.

Gebo K.A.,Chander G., Jenckes M.W., et al., (2002), Screening tests for hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C: a systematic review, Hepatology; 36 (5 suppl 1):S84 S92.

Gentzsch J., Brohm C., Steinmann E., et al., (2013), Hepatitis C Virus p7 is Critical for Capsid Assembly and Envelopment, PloS Pathog 9(5): e1003355.

George S.L., Bacon B.R., Brunt E.M., et al., (2009), Clinical, virologic, histologic, and biochemical outcomes aft er successful HCV therapy: a 5-year follow-up of 150 patients, Hepatology; 49 : 729 – 38.

Gerard C., Delwaide J., Vaira D., et al., (2005), Evolution over a 10 year period of the epidemiological profile of 1,726 newly diagnosed HCV patients in Belgium, J Med Virol; 76: 503-510.

Gerlach J.T., Diepolder H.M., Zachoval R., et al., (2003), Acute hepatitis C: high rate of both spontaneous and treatment-induced viral clearance, Gastroenterology; 125:80–8.

Germer J.J., Mandrekar J.N., Bendel J.L., et al., (2011), Hepatitis C Virus Genotypes in Clinical Specimens Tested at a National Reference Testing Laboratory in the United States, J Clin Microbiol.

Ghany M.G., Strader D.B., Thomas D.L., et al., (2009), Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C: an update, Hepatology; 49:1335–74.

Ghafoor K.A., Whidby J., et al. (2014), Structure of the core ectodomain of the hepatitis C virus envelope glycoprotein 2, doi:10.1038/nature13117.

Gheorghe L., Csiki I., Iacob S., et al., (2009), Estimarea complicatiilor pe termen lung ale infectiei cu VHC in Romania, J Gastrointest Liver Dis;18 (Suppl 1): 60.

Gheorghe L., Csiki I.E., Iacob S., et al., (2010), The prevalence and risk factors of hepatitis C virus infection in adult population in Romania: a nationwide survey 2006 – 2008, J Gastrointestin Liver Dis.; 19: 373-379.

Gheorghe L., Iacob S.,Popescu I., (2004), Living donor liver transplantation and hepatitis C, Rom J Gastroenterol; 13 (4): 317-27.

Gheorghe L., Pascu O., Ceausu E., et al., (2010), Access to peginterferon plus ribavirin therapy for hepatitis C in Romania between 2002-2009, J Gastrointestin LiverDis.;19(2):161-7.

Gitto S., Micco L., Conti F., et al., (2008), Alcohol and viral hepatitis: A mini-review, Dig Liver Dis.

González-Candelas F., López-Labrador F.X., et al., (2010), Clinical Relevance of Genetic Heterogeneity in HCV, Future Virology.; 5(1):33-49. 

Gosert R., Egger D., Lohmann V., et al., (2003 ), Identification of the hepatitis C virus RNA replication complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons, Journal of Virology 77 (9), 5487–5492.

Grakoui A., McCourt D.W., Wychowski C., et al., (1993b), A second hepatitis C virus-encoded proteinase, Proc Natl Acad Sci USA; 90:10583-7.

Grebely J., Prins M., Hellard M., et al., (2012), Towards a hepatitis C virus vaccine: insights from studies of hepatitis C virus reinfection in injection drug users, Lancet Infect Dis; 12: 408-414.

Gressner O.A., (2010), In the search of the magic bullet. Gastroenterology; 139: 1453–1457.

Griffin S.D., Beales L.P., Clarke D.S., et al., (2003), The p7 protein of hepatitis C virus forms an ion channel that is blocked by the antiviral drug, Amantadine. FEBS Lett.; 535:34-8.

Grigorescu M., (2009), HCV genotype 1 is almost exclusively present in Romanian patients with chronic hepatitis C. J. Gastrointestin, Liver Dis.; 18(1):45–50.

Grove J., Huby T., Stamataki Z., et al., (2007), Scavenger receptor BI and BII expression levels modulate hepatitis C virus infectivity, J Virol.; 81: 3162-9.

Gu Z., Graci J.D., Lahser F.C., et al., (2013), Identification of PTC725, an Orally Bioavailable Small Molecule That Selectively Targets the Hepatitis C Virus NS4B Protein, Antimicrob Agents Chemother.; 3250–3261. 

Guyader D., Thirouard A.S., Erdtmann L., et al., (2007), Liver iron is a surrogate marker of severe fibrosis in chronic hepatitis C, J Hepatol.; 46: 587-595.

Habib S.,Berk B.,Chang H., et al., (2006), MELD and Prediction of Post–Liver Transplantation Survival, Liver Transpl.; 12:440-447.

Hagan H., Thiede H., Des Jarlais D.C., (2005), HIV/hepatitis C virus co-infection in drug users: risk behavior and prevention, AIDS, 19 (Suppl 3), pp. S199–207.

Hadziyannis S. J., Sette H., Jr., et al. (2004b), Peginterferon-alpha2a and ribavirin combination therapy in chronic hepatitis C: a randomized study of treatment duration and ribavirin dose, Ann Intern Med; 140(5): 346-55.

Haid S., Grethe C., Dill M.T., et al., (2014), Isolate-dependent use of claudins for cell entry by hepatitis C virus, Hepatology; 59(1):24-34).

Haley R.W., Fischer R.P., (2001), Commercial tattooing as a potentially important source of hepatitis C infection.Clinical epidemiology of 626 consecutive patients unaware of their hepatitis C serologic status, Medicine (Baltimore); 80(2):134.

Halfon P., Halimi G., Bourliere M., et al., (2000), Integrity of the NS5A (amino acid 2209 to 2248) region in hepatitis C virus 1b patients non-responsive to interferon therapy, Liver; 20:381–6.

Halfon P., Riflet H., Renou C., et al., (2001), Molecular evidence of male-to-female sexual transmission of hepatitis C virus after vaginal and anal intercourse, J ClinMicrobiol; 39: 1204-1206.

Hamamoto I., Nishimura Y., Okamoto T., et al., (2005), Human VAP-B is involved in hepatitis C virus replication through interaction with NS5A and NS5B, J Virol 79:13473–13482.

Haqshenas G., Mackenzie J.M., Dong X., et al., (2007), Hepatitis C virus p7 protein is localized in the endoplasmic reticulum when it is encoded by a replication-competent genome, J Gen Virol.; 88:134-42.

Haushofer A.C., Kopty C., Hauer R., et al., (2001), HCV genotypes and age distribution in patients of Vienna and surrounding areas, J Clin Virol.; 20: 41-47.

Heller T.S., Saito J., Auerbach T., et al., (2005), An in vitro model of hepatitis C virion production, Proc Nat. Acad Sci USA;102:2579-83.

Hepatitis Australia, A guide to current and emerging hepatitis C treatments in Australia. 2012.

Hernandez M.D., Sherman K.E., (2011), HIV/hepatitis C coinfection natural history and disease progression, current Opinion in HIV & AIDS: Volume 6 – Issue 6 – p 478–482.

Hijikata M., Shimizu Y. K., et al. (1993), Equilibrium centrifugation studies of hepatitis C

virus: evidence for circulating immune complexes, J Virol.; 67(4): 1953-8.

Hofer H., Watkins-Riedel T., Janata O., et al., (2003), Spontaneous viral clearance in patients with acute hepatitis C can be predicted by repeated measurements of serum viral load, Hepatology; 37:60-4.

Hoffman B., Liu Q., (2011), Hepatitis C viral protein translation: mechanisms and implications in developing antivirals, Liver Int 31: 1449-1467.

Hollinger F.B., Gitnick G.L., Aach R.D., et al., (1978), Non-A, non-B hepatitis transmission in chimpanzees: a project of the Transfusion-transmitted Viruses Study Group, Intervirology; 10:60-68.

Honda M., Beard M.R., Ping L.H., et al., (1999), A phylogenetically conserved stem-loop structure at the 5´ border of the internal ribosome entry site of hepatitis C virus is required for capindependent viral translation, J Virol;73:1165-74.

Hope R.G., McLauchlan J., (2000), Sequence motifs required for lipid droplet association and protein stability are unique to the hepatitis C virus core protein., J Gen Virol.; 81(Pt 8):1913-25.

Hosseini-Moghaddam S., Iran-Pour E., Rotstein C., et al., (2011), Hepatitis C core Ag and its clinical applicability: potential advantages and disadvantages for diagnosis and follow-up? Rev Med Virol. [Epub ahead of print].

Hraber P., Kuiken C., Yusim K., (2007), Evidence for human leukocyte antigen heterozygote advantageagainst hepatitis C virus infection, Hepatology; 46(6):1713.

Hsu M., Zhang J., Flint M., et al., (2003), Hepatitis C virus glycoproteins mediate pH-dependent cell entry of pseudotyped retroviral particles, Proc Natl Acad Sci USA;100:7271-6.

Huang M.J., Podos S., Patel D., et al., (2010), ACH-2684: HCV NS3 protease inhibitor with potent activity against multiple genotypes and known resistant variants,Hepatology; 52:1204A.

Hugle T., Fehrmann F., Bieck E., et al., (2001), The hepatitis C virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein, Virology 284 (1), 70–81.

Huik K., Sadam M., Karki T., et al., (2010), CCL3L1 Copy Number is a strong genetic determinant of HIV seropositivity in caucasian intravenous drug users, J. Infect. Dis.; 201(5):730–739.

Huppe D., Zehnter E., Mauss S., et al., (2008), Epidemiology of chronic hepatitis C in Germany-an analysis of 10,326 patients in hepatitis centers and outpatient units, Z Gastroenterol; 46: 34-44.

Iancu L.S., Pandele G.I., Stanciu C., et al., (2002), Hepatitis C virus serotypes in Romanian patients with chronic hepatitis and cirrhosis, Rev Med Chir SocMed Nat; 106(1):79-82.

Ingiliz P., Valantin M.A., Preziosi P., et al. (2012), Influence of interferon-based therapy on liver fibrosis progression in HIV/HCV coinfected patients: a retrospective repeated liver biopsy analysis. J Hepatol.; 56(1):49-54.

Jackel-Cram C., Babiuk L.A., Liu Q., (2007), Up-regulation of fatty acid synthase promoter by hepatitis C virus core protein: genotype-3a core has a stronger effect than genotype-1b core, J Hepatol.; 46(6): 999–1008.

Jacobson I., Dore G.J., Foster G.R., et al., (2013), Simeprevir (TMC435) with peginterferon/ribavirin for chronic HCV genotype-1 infection in treatment-naive patients: results from QUEST-1, a phase III trial, J Hepatol;58:S574.

Jacobson I., McHutchinson J., Dushiko G., et al., (2011), Telaprevir for Previously Untreated Chronic Hepatitis C Virus Infection, N Engl J Med;364:2405-16.

Jacobson I., Ghalib R.M., Rodriguez-Torres M., et al., (2013), SVR results of a once-daily regimen of simeprevir (TMC435) plus sofosbuvir (GS-7977) with or without ribavirin in cirrhotic and non-cirrhotic HCV genotype 1 treatment-naive and prior null responder patients: the COSMOS study., 64th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases, Washington DC, abstract LB-3.

Jacobson I., Pockros P.J., Lalezari J., et al., (2010), Virologic response rates following 4 weeks of filibuvir in combination with pegylated interferon alfa-2a and ribavirin in chronically infected HCV genotype 1 patients, J Hepatol2010. 52 (suppl 1): S465.

Jauffret-Roustide M., Le Strat Y., Couturier E., et al., (2009), A national crosssectional study among drug-users in France: epidemiology of HCV and highlight on practical and statistical aspects of the design, BMC Infect Dis;9:113.

Jennings T. A., Chen Y., Sikora D., et al., (2008), RNA unwinding activity of the hepatitis C virus NS3 helicase is modulated by the NS5B polymerase, Biochemistry 47, 1126–1135.

Jensen D.M., Wedemeyer H., Herring R.W.,et al. (2010), High rates of early viral response, promising safety profile and lack resistance-related breakthrough in HCV GT1/4 patients treated with RG7128 plus pegIFN alfa-2a (40KD)/RBV: planned week 12 interim analysis from the PROPEL study, 61st Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases. Boston, Abstract 81.

Jensen D. M., Morgan T. R., et al., (2006), Early identification of HCV genotype 1 patients

responding to 24 weeks peginterferon alpha-2a (40 kd)/ribavirin therapy, Hepatology; 43(5): 954-60.

Jhaveri R., Qiang G., et al., (2009), Domain 3 of hepatitis C virus core protein is sufficient

Jin L and Peterson DL. Expression, isolation, and characterization of the hepatitis C virus ATPase/RNA helicase, Arch Biochem Biophys 1995;323:47-53.

Jolley E., Rhodes T., Platt L., et al., (2012), HIV among people who inject drugs in Central and Eastern Europe and Central Asia: a systematic review with implications for policy, BMJ Open; 2: e001465.

Jones C.T., Murray C.L., Eastman D.K., et al. (2007), Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus, J Virol;81:8374-83.

Jones D.M., McLauchlan J., (2010), Hepatitis C virus: assembly and release of virus particles, J Biol Chem 285: 22733-22739.

Jonsson J.R., Purdie D.M., Clouston A.D., et al., (2008), Recognition of genetic factors influencing the progression of hepatitis C: potential for personalized therapy, Mol Diagn Ther;12(4):209.

Jhaveri R., Qiang G., et al. (2009), Domain 3 of hepatitis C virus core protein is sufficient

for intracellular lipid accumulation, J Infect Dis; 200(11): 1781-8.

Jopling C. L., Yi M., et al. (2005), Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a

liver-specific MicroRNA, Science; 309(5740): 1577-81.

Kageyama S., Agdamag D. M., et al.,(2006)., A natural inter-genotypic (2b/1b) recombinant of hepatitis C virus in the Philippines, J Med Virol; 78(11): 1423-8.

Kalinina O., Norder H., Magnius L.O., (2004), Full-length open reading frame of a recombinant hepatitis C virus strain from St Petersburg: proposed mechanism for its formation, J. Gen. Virol.; 85:1853–1857.  

Kamal S.M., El Tawil A.A., Nakano T., et al., (2005), Peginterferon {alpha}-2b and ribavirin therapy in chronic hepatitis C genotype 4: impact of treatment duration and viral kinetics on sustained virological response, Gut; 54: 858–66.

Kamal S. M.,(2009), Hepatitis C genotype 4 therapy: increasing options and improving outcomes, Liver Int; 29 Suppl 1: 39-48.

Kanwal F., Hoang T., Kramer J.R., et al., (2011), Increasing prevalence of HCC and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C virus infection, Gastroenterology; 140 : 1182 – 1188.e1.

 Kao J.H., Chen P.J., Wang J.T., et al., (1996), Superinfection by homotypic virus in hepatitis C virus carriers: studies on patients with post-transfusion hepatitis, J Med Virol; 50: 303-308.

Kapadia S.B., Barth H., Baumert T., et al., (2007), Initiation of hepatitis C virus infection is dependent on cholesterol and cooperativity between CD81 and scavenger receptor B type I, J Virol;81:374-83.

Kato T., Furusaka A., Miyamoto M., et al., (2001), Sequence analysis of hepatitis C virus isolated from a fulminant hepatitis patient, J Med Virol;64:334-9.

Kawaguchi Y., Mizuta T., (2011), Interaction between hepatitis C virus and metabolic factors, World Journal of Gastroenterology; 2888-2901.

Kershenobich D., Razavi H.A., Sanchez-Avila J.F., et al., (2011), Trends and projections of hepatitis C virus epidemiology in Latin America, Liver Int.; 31(Suppl 2):S18–29.

Khairy M., Abdel-Rahman M., El-Raziky M., et al., (2012), Non-Invasive Prediction of Hepatic Fibrosis in Patients With Chronic HCV Based on the Routine Pre-Treatment Workup, Hepat Mon.;12(11):e6718).

Kim C.W., Chang K.M., (2013 ), Hepatitis C virus: virology and life cycle, Clin Mol Hepatol 19: 17-25.

Kimura M., (1983), The Neutral Theory of Evolution, Cambridge University Press, Cambridge.

Klimashevskaya S., Obriadina A., Ulanova T., et al., (2007), Distinguishing Acute from Chronic and Resolved Hepatitis C Virus (HCV) Infections by Measurement of Anti-HCV Immunoglobulin G Avidity Index, Journal of Clinical Microbiology; 45:3400–3.

Kolykhalov A.A., Mihalik K., Feinstone S.M., et al., (2000), Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo, J Virol.;74:2046-51.

Komurian-Pradel F., Rajoharison A., Berland J.L., et al., (2004), Antigenic relevance of F protein in chronic hepatitis C virus infection, Hepatology; 40:900-9.

Kottilil S., Yan M.Y., Reitano K.N., et al., (2009), Human immunodeficiency virus and hepatitis C infections induce distinct immunologic imprints in peripheral mononuclear cells, Hepatology; 50(1):34-45.

Kuntzen T, Timm J, Berical A, et al., (2008), Naturally occurring dominant resistance mutations to hepatitis C virus protease and polymerase inhibitors in treatment-naïve patients. Hepatology 2008;48:1769-78.

Kupek E., (2004), Transfusion risk for hepatitis B, hepatitis C, and HIV in the State of Santa Catarina, Brazil, 1991-2001, The Brazilian Journal of Infectious Diseases.; 8(3):236-240.

Kurbanov F., Tanaka Y., et al. (2008a), Detection of hepatitis C virus natural recombinant RF1_2k/1b strain among intravenous drug users in Uzbekistan, Hepatol Res; 38(5): 457-464.

Kurbanov F., Tanaka Y., et al. (2008b), Molecular epidemiology and interferon susceptibility of the natural recombinant hepatitis C virus strain RF1_2k/1b, J Infect Dis 198(10): 1448-56.

Lackner A.A., Mohan M., Veazey R.S., (2009), The gastrointestinal tract and AIDS pathogenesis, Gastroenterology; 136(6):1965-78.

Lagging M., Romero A. I., Westin J.,et al., (2006),IP-10 predicts viral response and therapeutic outcome in difficult-totreatpatients with HCV genotype 1 infection, Hepatology44, 1617-1625.

Laguno M., Larrousse M.,et al.,(2007), Predictive value of early virologic response in HIV/hepatitis C virus-coinfected patients treated with an interferon-based regimen plus ribavirin, J Acquir Immune Defic Syndr; 44(2): 174-8.

Lai M.E., Mazzoleni A.P., Argiolu F., et al., (1994), Hepatitis C virus in multiple episodes of acute hepatitis in polytransfused thalassaemic children, Lancet 343:388–390.

Lalezari J., Hazan L., Kankam M.,et al., (2011),High rapid virologic response (RVR) with ACH-1625 daily dosing plus pegIFN-Alpha 2A/RBV in a 28-day phase 2A trial, 62nd Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases. San Francisco. Abstract 1341.

Lalezari J.P., Agarwal K., Dusheiko G., (2011), Dose-ranging trial of PPI- 461, a potent new pan-genotypic HCV NS5A inhibitor, in patients with HCV genotype-1 infection, Hepatology; 54:400A.

Lange C., Kutalik Z., Morikaw K., et al., (2012), Serum Ferritin Levels Are Associated With a Distinct Phenotype of Chronic Hepatitis C Poorly Responding to Pegylated Interferon-Alpha and Ribavirin Therapy, Hepatol.; 55:1038-47.

Lange C.M., Moradpour D., Doehring A., et al., (2011), Impact of donor and recipient IL28Brs12979860 genotypes on hepatitis C virus liver graft reinfection, J Hepatol; 55: 322–7.

Larrey D., Levin J., Lohse A., et al., (2010),4 week therapy with the non-nucleosidic polymerase inhibitor BI 207127 in combination with peginterferon alfa2A and ribavirin in treatment naïve and treatment experienced chronic HCV GT1 patients, Journal of Hepatology, 52 (suppl 1): S466.

Lavillette D., Pecheur E. I., et al. (2007), Characterization of fusion determinants points to the involvement of three discrete regions of both E1 and E2 glycoproteins in the membrane fusion process of hepatitis C virus, J Virol; 81(16): 8752-65.

Law M, Maruyama T, Lewis J, et al. (2008), Broadly neutralizing antibodies protect against hepatitis C virus quasispecies challenge, Nature Medicine;14(1):25–27.

Law M., Dore G., Bath N., et al., (2003), Modelling hepatitis C virus incidence, prevalence and long-term sequelae in Australia, 2001, Int J Epidemiol; 32: 717-724.

Lawitz E.,Gaultier I.,Poordad F.,et al.,(2011),1220 ABT-450/ritonavir (ABT-450/R) combined with pegylated interferon alpha-2A and ribavirin (SOC) after 3-day monotherapy in Genotype 1 HCV-infected treatment-naive subjects: 12-week interim efficacy and safety results, J Hepatol; 54: S482.

Lawitz E., Lalezari J.P., Hassanein T., et al., (2011), Once-daily PSI-7977 plus Peg/RBV in treatment-naïve patients with HCV GT1: robust end of treatment response rates are sustained post-treatment, Hepatology; 54(suppl 1):225.

Lawitz E., Mangia A., Wyles D., et al., (2013), Sofosbuvir for Previously Untreated Chronic Hepatitis C Infection, N Engl J Med; 368:1878-1887.

Lawitz E., Poordad F., Brainard D.M., et al., (2013b), Sofosbuvir in combination with PegIFN and ribavirin for 12 weeks provides high SVR rates in HCV-infected genotype 2 or 3 treatment-experienced patients with and without compensated cirrhosis: results from the LONESTAR-2 study, Hepatology; 58(Suppl 1):1380A.

Lawitz E., Ghalib R., Rodriguez-Torres M., et al., (2014), Simeprevir plus sofosbuvir with/without ribavirin in HCVgenotype 1 prior null-responder/treatment-naive patients (COSMOS study): primary endpoint (SVR12) results in patients with Metavir F3-4 (Cohort 2), 49th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver (EASL 2014). London, Abstract O165.

Leandro G., Mangia A., Hui J., et al., (2006), Relationship between steatosis, inflammation, and fibrosis in chronic hepatitis C: a meta-analysis of individual patient data. Gastroenterology. 2006; 130: 1636–1642.

Lee Y. M., Lin H. J.,et al.(2010), Molecular epidemiology of HCV genotypes among injection drug users in Taiwan: Full-length sequences of two new subtype 6w strains and a recombinant form_2b6w, J Med Virol; 82(1): 57-68.

Legrand-Abravanel F., Nicot F.,et al.(2005), Pegylated interferon and ribavirin therapy for chronic hepatitis C virus genotype 4 infection, J Med Virol; 77(1): 66-9.

Legrand-Abravanel F., Claudinon J.,et al.(2007), New natural intergenotypic (2/5) recombinant of hepatitis C virus, J Virol; 81(8): 4357-62.

Lenz O., Fevery B., Vigen L., et al., (2011), TMC435 in combination with peginterferon alpha-2a/ribavirin in treatment-naive patients infected with HCV genotype 1: virology analysis of the Pillar study, Hepatology; 54:985.

Lesburg C.A., Cable M.B., Ferrari E., et al., (1999), Crystal structure of the RNA-dependent RNApolymerase from hepatitis C virus reveals a fully encircled active site, Nature Structural Biology; 6, 937±943.

Lewis-Ximenez L.L., Lauer G.M., et al., (2010), Prospective follow-up of patients with acute hepatitis C virus infection in Brazil, Clinical Infectious Diseases; 50:1222–30.

Lim Y.S., Kim W.R., (2008), The global impact of hepatic fibrosis and end-stage liver disease, Clin Liver Dis;12(4):733.

Lindenbach B.D., (2013), Virion assembly and release, Curr Top Microbiol Immunol;369:199–218.

Lindenbach B.D., Evans M.J., Syder A.J., et al., (2005), Complete replication of hepatitis C virus in cell culture, Science New York; 309, 623-626.

Lindenbach B.D., Meuleman P., Ploss A., et al., (2006); Cell culture-grown hepatitis C virus is infectious in vivo and can be recultured in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, pp. 3805–3809.

Liu H., Trinh T.L., Dong H., et al., (2012), Iron regulator hepcidin exhibits antiviral activity against hepatitis C virus, PLoS One; 7(10):e46631.

Liu S., Yang W., et al., (2009), Tight junction proteins claudin-1 and occludin control hepatitis C virus entry and are downregulated during infection to prevent superinfection, J Virol; 83(4): 2011-4.

Lo S., Lin H.H., (2001), Variations within hepatitis C virus E2 protein and response to interferon treatment, Virus Res.; 75:107–12.

Lohmann V., Körner F., Koch J.O., et al., (1999), Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line, Science;285:110-3.

Lohmann V., (2013), Hepatitis C virus RNA replication, Curr Top Microbiol Immunol;369:167–198.

Lohmann V., Hoffmann S., Herian U., et al.,  (2003), Viral and cellular determinants of hepatitis C virus RNA replication in cell culture, J Virol; 77: 3007–19.

Lortholary O., Pallier C., Deny P., (2001), Phylogenetic analyses confirm the high prevalence of hepatitis C virus (HCV) type 4 in the Seine-Saint-Denis district (France) and indicate seven different HCV-4 subtypes linked to two different epidemiological patterns, J Gen Virol 82:1001–1012.

Lok A.S.F., (2014), New all-oral HCV therapies for genotype 1: A final good-bye to interferon, Clinical Liver Disease, 3: 137–140.

Lozach P.Y., Lortat-Jacob H., de Lacroix de Lavalette A., et al., (2003), DC-SIGN and L-SIGN are high affinity binding receptors for hepatitis C virus glycoprotein E2, J Biol Chem;278:20358-66.

Ludmerer S., Liverton N., McCauleya J., (2012), Discovery of MK-5172 a next generation HCV NS3/4a protease inhibitor: raising the bar of this important class of molecules, International Conference on Viral Hepatitis, New York, Abstract 79328.

Luscombe C.A., Huang Z., Murray M.G., et al., (2010), A novel Hepatitis C virus p7 ion channel inhibitor, BIT225, inhibits bovine viral diarrhea virus in vitro and shows synergism with recombinant interferon-alpha-2b and nucleoside analogues, Antiviral Res;86(2):144-53.

Madhava V., Burgess C., Drucker E.., (2002), Epidemiology of chronic hepatitis C virus infection in sub-Saharan Africa, Lancet Infect Dis; 2:293–302.

Maertens G, Stuyver L., (1997), Genotypes and genetic variation of Hepatitis C virus. In: Harrison TJ, Zuckerman AJ (eds), The Molecular Medicine of Viral Hepatitis, England: Wiley;183-233.

Magiorkinis G., Magiorkinis E., Paraskevis D.,et al., (2009), The global spread of hepatitis C virus 1a and 1b: a phylodynamic and phylogeographic analysis, PLoS Med;6:e1000198.

Maio G., d'Argenio P., Stroffolini T., et al., (2000), Hepatitis C virus infection and alanine transaminase levels in the general population: a survey in southern Italian town, J Hepatol.;33:116-20.

Mangia A., Santoro R.,et al.(2005), Peginterferon alfa-2b and ribavirin for 12 vs. 24 weeks in HCV genotype 2 or 3, N Engl J Med;352(25): 2609-17.

Manns M, Lee A., (2010), Sustained viral response (SVR) rates in genotype 1 treatment-naïve patients with chronic hepatitis C (CHC) infection treated with vaniprevir (MK-7009), a NS3/4a protease inhibitor, in combination with pegylated interferon alfa-2a and ribavirin for 28 days, http://www.natap.org/2010/AASLD/AASLD_24.htm.

Manns M., Marcellin P., Poordad F., et al., (2013), Simeprevir (TMC435) with peginterferon/ribavirin for treatment of chronic HCV genotype-1 infection in treatment-naive patients: results from QUEST-2, a phase III trial, J Hepatol.;58:S568.

Manns M.P., Cornberg M., (2013), Sofosbuvir: the final nail in the coffin for hepatitis C?, Lancet Infect Dis.;13:378-379.

Manns M.P., McHutchison J.G., Gordon S.C., et al., (2001), Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa- 2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: A randomised trial, Lancet; 358:958–965.

Marcellin P., Gish R.G., Gitlin N., et al., (2010), Safety and efficacy of viramidine versus ribavirin in ViSER2: randomized, double-blind study in therapy-naive hepatitis C patients, J Hepatol.;52:32-8.

Martial J., Morice Y., Abel S., et al., (2004), Hepatitis C virus (HCV) genotypes in the Caribbean island of Martinique: Evidence for a large radiation of HCV-2 and for a recent introduction from Europe of HCV-4, J Clin Microbiol; 42:784–791.

Mauss S., Berger F., Vogel M., et al., (2012), Treatment results of chronic hepatitis C genotype 5 and 6 infections in Germany, Z Gastroenterol.;50(5):441-4.

McGilvray I., Feld J.J., Chen L., et al., (2012), Hepatic cell-type specific gene expression better predicts HCV treatment outcome than IL28B genotype, Gastroenterology;142:1122-1131.e1.

McGovern B.H., Birch C.E., Bowen M.J., et al., (2009), Improving the Diagnosis of Acute Hepatitis C Virus Infection with Expanded Viral Load Criteria. Clinical Infectious Diseases; 49:1051–60.

McHutchison J.G., Patel K., et al., (2008), Clinical trial: interferon alpha-2b continuous long-term therapy vs. repeated 24-week cycles for re-treating chronic hepatitis C, Aliment Pharmacol Ther; 27(5): 422-32.

McHutchison J.G., Poynard T.,et al.,(2002), Hepatic HCV RNA before and after treatment with interferon alone or combined with ribavirin, Hepatology; 35(3): 688-93.

McLauchlan J., Lemberg M.K., Hope G., et al., (2002), Intramembrane proteolysis promotes trafficking of hepatitis C virus core protein to lipid droplets, EMBO J; 21 (15): 3980-8. 

Medrano J., Neukam K., Rallon N., et al., (2010), Modeling the probability of sustained virological response to therapy with pegylated interferon plus ribavirin in patients coinfected with hepatitis C virus and HIV, Clin InfectDis.; 51(10):1209-16.

Meertens L., Bertaux C., Dragic T., (2006), Hepatitis C virus entry requires a critical postinternalization step and delivery to early endosomes via clathrin-coated vesicles, J Virol.;80:11571-8.

Meertens L., Bertaux C., Cukierman L.,et al., (2008), The tight junction proteins claudin-1, -6 and -9 are entry cofactors for the Hepatitis C virus, J Virol.; 82: 3555–3560.

Mercer D.F., et al., (2001), Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers, Nat Med; 7: 927–933.

Metwally M.A., Zein C.O., Zein N.N., (2004), Clinical significance of hepatic iron deposition and serum iron values in patients with chronic hepatitis C infection, Am J Gastroenterol.;99(2):286-91.

Michalak J.P., Wychowski C., Choukhi A., et al., (1997), Characterization of truncated forms of hepatitis C virus glycoproteins, Journal of General Virology;78(9):2299–2306.

Middleton T, He Y, Beyer J. Factors affecting HCV viral load response to the non-nucleoside polymerase inhibitors ABT-072 and ABT-033. J Hepatol2011,54 (suppl 1):S483-S484.

Middleton T, He Y, Beyer J. Factors affecting HCV viral load response to the non-nucleoside polymerase inhibitors ABT-072 and ABT-033. J Hepatol2011,54 (suppl 1):S483-S484.

Mitsuyoshi H., Yasui K., Yamaguchi K., et al., (2013), Pathogenic Role of Iron Deposition in Reticuloendothelial Cells during the Development of Chronic Hepatitis C, Int J Hepatol; 2013:686420.

Miyanari Y., Atsuzawa K.,et al.,(2007), The lipid droplet is an important organelle for

hepatitis C virus production, Nat Cell Biol; 9(9): 1089-97.

Modi A.A., Feld J.J., Park Y., et al., (2010), Increased caffeine consumption is associated with reduced hepatic fibrosis, Hepatology.; 51: 201–209.

MMWR Morb Mortal Wkly Rep,(2008),Acute hepatitis C virus infections attributed to unsafe injection practices at an endoscopy clinic—Nevada, 2007; 57:513-517.17.

Mohamed M.K., Abdel-Hamid M., Mikhail N.N., et al., (2005), Intrafamilial transmission of hepatitis C in Egypt, Hepatology; 42: 683-687.

Moradpour D., Penin F., Rice C.M., (2007), Replication of hepatitis C virus. Nat Rev Microbiol;5:453-63.

Moradpour D., (2001), The hepatitis C virus nonstructural protein 4B is an integral endoplasmic reticulum membrane protein, Virology; 284 (1), 70–81.

Moreno M.P., Casane D., Lopez L., et al., (2006), Evidence of recombination in quasispecies populations of an Hepatitis C virus patient undergoing anti-viral therapy, Virol J.;3:87. 

Morgan T.R., Ghany M.G., Kim H.Y., et al., (2010), Outcome of sustained virological responders with histologically advanced chronic hepatitis C, Hepatology 2010; 52 : 833 – 44 .

Morice Y., Roulot D., Grando V., et al., (2002), Detection of HCV core antigen in human serum and plasma with an automated chemiluminescent immunoassay, Transfusion; 42:349–56.

Muhlberger N., Schwarzer R., Lettmeier B., et al., (2009), HCV -related burden of disease in Europe: a systematic assessment of incidence, prevalence, morbidity, and mortality, BMC Public Health;9:34.

Murakami J., Nagata I., Iitsuka T., et al., (2012), Risk factors for mother-to-child transmission of hepatitis C virus: maternal high viral load and fetal exposure in the birth canal, Hepatol Res; 42:648-657.

Murao K., Imachi H.,et al.,(2008), Interferon alpha decreases expression of human scavenger receptor class BI, a possible HCV receptor in hepatocytes, Gut; 57(5): 664-71.

Murphy D.G., Willems B., Deschenes M., et al., (2007), Use of sequence analysis of the NS5B region for routine genotyping of hepatitis C virus with reference to C/E1 and 5' untranslated region sequences, J Clin Microbiol.;45:1102-1112.

Nahmias Y., Casali M., Barbe L., et al., (2006), Liver endothelial cells promote LDL-R expression and the uptake of HCV-like particles in primary rat and human hepatocytes. Hepatology.;43:257-65.

National AIDS Committee, Department for AIDS monitoring from Romania, Statistic data on HIV/AIDS infection in Romania. Bucharest: CNLAS; 2010. (in Romanian).

National AIDS Treatment Advocacy Project Organisation (NATAP). ANA-598 HCV non-nuke Phase 2b study preliminary data results, 2011. Available from: http://www.natap.org/2011/HCV/101411_01.htm.

Neddermann P.,Tomei L.,Steinkuhler C.,et al., (1997), The nonstructural proteins of the hepatitis C virus: structure and functions, Biol Chem; 378 (6):469-76.

Negro F., Alberti A., (2011), The global health burden of hepatitis C virus infection; Data used with permission from John Wiley and Sons, Liver Int; 31(2 Suppl):1–3.

Nelson P.K., Mathers B.M., Cowie B., et al., (2011), Global epidemiology of hepatitis B and hepatitis C in people who inject drugs: results of systematic reviews, Lancet; 378:571–83.

Nemecek V., Strunecky O., (2009), Genotypic heterogeneity of hepatitis C virus (HCV) from blood donors in the Czech Republic, Epidemiol. Mikrobiol. Imunol.; 58(2):63–72.

Nettles R., Chien C., Chung E., et al., (2008), BMS-790052 is a first-in-class potent hepatitis C virus (HCV) NS5A inhibitor for patients with chronic HCV infection: Results from a proof-of-concept study, Hepatology; 48(suppl): LB12–LB12). 33A.

Ngo-Metzger Q., Ward J.W., Valdiserri R.O., (2013), Expanded Hepatitis C Virus Screening Recommendations Promote Opportunities for Care and Cure, Ann Intern Med.;159:364-365.

Nguyen N.H., VuTien P., Garcia R.T., et al., (2010), Response to pegylated interferon and ribavirin in Asian American patients with chronic hepatitis C genotypes 1 vs 2/3 vs 6, J Viral Hepat.;17:691–697.

Niepmann M., (2013), Hepatitis C virus RNA translation, Curr Top Microbiol Immunol;369:143–166.

Nieburg P., Carty L., (2012), Injection Drug Use in Ukraine, http://csis.org/publication/injection-drug-use-ukraine.

NIHCDCS – National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: Management of hepatitis C. Gastroenterology 2002. 123(6): 2082-209.

Nolte F.S., Green A.M., Fiebelkorn K.R., et al., (2003), Clinical evaluation of two methods for genotyping Hepatitis C virus based on analysis of the 5'noncoding region, Journal of Clinical Microbiology;41:1558-64.

Noppornpanth, S., T. X. Lien, et al. (2006). "Identification of a naturally occurring recombinant genotype 2/6 hepatitis C virus." J Virol 80(15): 7569-77.

Northrup P.G., et al, (2008), Hepatitis C positive liver transplant recipients who receive grafts from donors with hepatitis C antibodies have similar outcomes to hepatitis C negative donors, Hepatology; 48(4): 540A.

Nunez M., Miralles C., Berdun M.A., et al, (2007), for the PRESCO study group: Role of weight-based ribavirin dosing and extended duration of therapy in chronic hepatitis C in HIVinfected patients: The PRESCO trial, AIDS Res Hum Retrovir; 23: 972-982.

Ohara E., Hiraga N., Imamura M., et al., (2011), Elimination of hepatitis Cvirus by short term NS3-4A and NS5B inhibitor combinationtherapy in human hepatocyte chimeric mice, J Hepatol.; 54: 872–878.

Ohno T., Mizokami M., Wu R.R., et al., (1997), New hepatitis C virus (HCV) genotyping system that allows for identification of HCV genotypes 1a, 1b, 2a, 2b, 3a, 3b, 4 5a, and 6a, J. Clin. Microbiol; 35, 201–207.

Ohto H., Terazawa S., Sasaki N., et al., (1994), Transmission of hepatitis C virus from mothers to infants.The Vertical Transmission of Hepatitis C Virus Collaborative Study Group, N Engl J Med;330(11):744.

Okamoto H., Kurai K., Okada S., et al., (1992), Full-length sequence of a Hepatitis C virus genome having poor homology to reported isolates: comparatively study of four distinct genotypes, Virology; 188:331–341.

Okayama A., Stuver S.O., Tabor E., et al., (2002), Incident hepatitis C virus infection in a community-based population in Japan, J Viral Hepat.; 9: 43-51.

Oliveira T., Pybus O.G., Rambaut A., et al., (2006), Benghazi Study Group;  Molecular epidemiology: HIV-1 and HCV sequences from Libyan outbreak, Nature; 444(7121):836-7.

Operskalski E.A., Kovacs A., (2011), HIV/HCV co-infection: pathogenesis, clinical complications, treatment, and new therapeutic technologies, Curr HIV/AIDS Rep.;8(1):12-22.

Oprea C., et al., (2013), Ongoing outbreak of multiple blood-borne infections in injecting drug users in Romania, Public Health, http://dx.doi.org/10.1016/j.puhe.2013.08.018.

Oprisan G., Szmal C., Dinu S., et al., (2009), Comparative methods for genotyping hepatitis C virus isolates from Romania. Roum Arch Microbiol Immunol 2009; 68: 151-157.

Osella A.R., Misciagna G., Leone A., et al., (1997), Epidemiology of hepatitis C virus infection in an area of Southern Italy, J Hepatol.; 27: 30-35.

Otto G.A., Lukavsky P.J., Lancaster A.M., et al., (2002), Ribosomal proteins mediate the hepatitis C virus IRES-HeLa 40S interaction, RNA;8:913-23.

Otto G.A., Puglisi J.D., (2004), The pathway of HCV IRES-mediated translation initiation, Cell;119:369–380

Owsianka A., Tarr A.W., Juttla V.S., et al., (2005), Monoclonal antibody AP33 defines a broadly neutralizing epitope on the hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein, J Virol 79; 11095–11104

Page K., Morris M., Hahn J.A., et al., (2013), Injection drug use and hepatitis C virus infection in young adult injectors: using evidence to inform comprehensive prevention, Clinical Infectious Diseases; 45, S32-S38.

Paintsil E., He H., Peters C., et al., (2010), Survival of Hepatitis C Virus in Syringes: Implication for Transmission among Injection Drug Users, J. Infect. Dis.; 202(7):984–990.

Paintsil E., Verevochkin S.V., Dukhovlinova E., et al., (2009), Hepatitis C virus infection among drug injectors in St. Petersburg, Russia: social and molecular epidemiology of an endemic infection, Addiction; 104: 1881–1890.

Pang P.S., Planet P.J., et al., (2009), The evolution of the major hepatitis C genotypes correlates with clinical response to interferon therapy, PLoS One; 4(8): e6579.

Paredes A.M., Blight K.J., (2008), A Genetic Interaction between Hepatitis C Virus NS4B and NS3 Is Important for RNA Replication, J Virol. 2008 November; 82(21): 10671–10683. 

PavlovicD., Neville D.C., Argaud O., et al., (2003), The hepatitis C virus p7 protein forms an ion channel that is inhibited by long-alkyl-chain iminosugar derivatives, Proc Nat. Acad Sci USA;100:6104-8.

Pawlotsky J.M., Taskiris L., Roudot-Thoraval F., et al., (1995), Relationship between hepatitis C virus genotypes and sources of infection in patients with chronic hepatitis C, J Infect Dis.;171:1607–1610

Pawlotsky J.M., (2014), New Hepatitis C Therapies: The Toolbox, Strategies, and Challenges, Gastroenterology;146:1176–1192.

Payan C., Roudot-Thoraval F., Marcellin P., et al., (2005), Changing of hepatitis C virus genotype patterns in France at the beginning of the third millenium: The GEMHEP GenoCII Study, J Viral Hepat; 12: 405-413.

Pearlman L., (2012), Protease inhibitors for the treatment of chronic hepatitis C genotype-1 infection: the new standard of care–review, The Lancet Infectious Diseases; 12(9):717-728.

Pearlman B.L., Ehleben C., et al. (2007), Treatment extension to 72 weeks of peginterferon and ribavirin in hepatitis c genotype 1-infected slow responders, Hepatology; 46(6): 1688-94.

Pedersen I.M., Cheng G., Wieland S., et al., (2007), Interferon modulation of cellular microRNAs as an antiviral mechanism, Nature; 449: 919-922.

Pembrey L., Newell M.L., Tovo P.A., (2005), The management of HCV infected pregnant women and their children European paediatric HCV network, J Hepatol.;43(3):515.

Penin F., Combet C.,et al., (2001), Conservation of the conformation and positive charges of hepatitis C virus E2 envelope glycoprotein hypervariable region 1 points to a role in cell attachment, J Virol; 75(12): 5703-10.

Pereira B.J., Milford E.L., Kirkman R.L., et al., (1991), Transmission of hepatitis C virus by organ transplantation, N Engl J Med;325(7):454.

Pereira A.A., Jacobson I.M. (2009); New and experimental therapies for HCV, Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology 6, 403-411. 

Perotti M., Mancini N., Diotti R.A., et al., (2008), Identification of a broadly cross-reacting and neutralizing human monoclonal antibody directed against the hepatitis C virus E2 protein, Journal of Virology; 82(2):1047–1052.

Perz J.F., Armstrong G..L, Farrington L.A., et al., (2006), The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosisand primary liver cancer worldwide, J Hepatol; 45:529–38

Pham T.N., Coffin C.S., et al., (2010), Occult hepatitis C virus infection: what does it mean?, Liver Int; 30(4): 502-11.

Pietrangelo A., (2010), Hereditary hemochromatosis: pathogenesis, diagnosis, and treatment, Gastroenterol.; 139: 393-408.

Pietschmann T., Kaul A., et al. (2006), Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras, Proc Natl Acad Sci USA; 103(19): 7408-13.

Pileri P., Uematsu Y., et al., (1998), Binding of hepatitis C virus to CD81, Science; 282(5390): 938-41.

Pitigoi D., Rafila A., Pistol A., et al., (2008), Trends in hepatitis B incidence in Romania, 1989–2005, Eurosurveillance; 13(1–3):70–7.

Ploss A., Evans M.J.,et al.,(2009), Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required for infection of mouse cells, Nature; 457(7231): 882-6.

Poizot-Martin I., (2013), W48 Response Rate of Boceprevir-PegIFN-RBV in Treatment-Experienced HIV Coinfected Patients with HCV genotype 1: ANRS-HC27 BocepreVIH Study, 64th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver diseases, Washington, USA; abstract 1105.

Pomper G.J., Wu Y., Snyder E.L., (2003), Risks of transfusion-transmitted infections: 2003, Curr Opin Hematol.; 10(6):412.

Poordad F., McCone J., Bacon B., et al., (2011), Boceprevir for Untreated Chronic HCV Genotype 1 Infection, N Engl J Med.; 354:1195-206.

Potel J., Rassam P., Montpellier C., et al., (2013), EWI-2wint promotes CD81 clustering that abrogates Hepatitis C Virus entry, Cellular Microbiology; 15: 1234–1252.

Poynard T., Muntenau M., Morra R., et al., (2008), Methodological aspects for the interpretation of liver fibrosis non-invasive biomarkers: a 2008 update, Gastroenterol Clin Biol.; 32: 8–21.

Poynard T., Marcellin P.,et al.,(1998), Randomised trial of interferon alpha2b plus ribavirin for 48 weeks or for 24 weeks versus interferon alpha2b plus placebo for 48 weeks for treatment of chronic infection with hepatitis C virus. International Hepatitis Interventional Therapy Group (IHIT), Lancet; 352(9138): 1426-32.

Poynard T., Ratziu V., McHutchison J., et al., (2003), Effect of treatment with peginterferon or interferon alfa-2b and ribavirin on steatosis in patients infected with hepatitis C, Hepatology.; 38: 75–85.

Prati D., Taioli E., Zanella A., et al., (2002), Updated definitions of healthy ranges for serum alanine aminotransferase levels, Ann Intern Med.; 137(1):1-10.

Price L., Kowdley K., (2009), The role of iron in the pathophysiology and treatment of chronic hepatitis C, Can J Gastroenterol.; 23(12): 822–28.

Prince A.M., Huima-Byron T., Parker T.S., et al., (1996), Visualization of hepatitis C virions and putative defective interfering particles isolated from low-density lipoproteins, J Viral Hepat; 3:11-17.

Puoti C., Guarisco R., Spilabotti L., et al., (2012), Should we treat HCV carriers with normal ALT levels ? The “5Ws” dilemma,J Viral Hepat.;19(4):229-235. 

Pybus O.G., Barnes E., Taggart R., et al., (2009), Genetic history of hepatitis C virus in East Asia, J Virol.; 83:1071-1082.

Pybus O.G., Cochrane A., Holmes E.C., et al., (2005), The hepatitis C virus epidemic among injecting drug users, Infect Genet Evol.; 5:131-139.

Quer J., Murillo P., Esteban J.I., et al., (2003), Sexual transmission of hepatitis C virus from a patient with chronic disease to his sex partner after removal of an intrauterine device, Sex Transm Dis.; 30: 470-471.

Quinti I., Hassan N., Salman D., et al., (1995), Hepatitis C virus-specific B cell activation: IgG and IgM detection in acute and chronic hepatitis C, Journal of Hepatology; 23:640–7.

Raghwani J., Thomas X.V., Koekkoek S.M., et al., (2012), Origin and Evolution of the Unique Hepatitis C Virus Circulating Recombinant Form 2k/1b, J Virol.; 86(4): 2212–2220.

Raimondi S., Bruno S., Mondelli M.U., et al., (2009), Hepatitis C virus genotype 1b as a risk factor for hepatocellular carcinoma development: a meta-analysis, J Hepatol.; 50: 1142–1154.

Ramm G.A., Ruddell R.G., (2005), Hepatotoxicity of iron overload: mechanisms of iron induced hepatic fibrogenesis, Semin Liver Dis.; 25:433–449.

Rauch A., Kutalik Z., Descombes P., et al., (2010), Genetic variation in IL28B is associated with chronic hepatitis C and treatment failure: A genome-wide association study, Gastroenterology; 138: 1338–1345.

Ray S.C., Arthur R.R., et al., (2000), Genetic epidemiology of hepatitis C virus throughout

Egypt, J Infect Dis,; 182(3): 698-707.

Raymond H.W., Cimmins C., (2004), Evaluation of the Abbott Molecular Diagnostics Real Time PCR Assay for HCV Quantitative Viral Load and HCV Genotyping, Poster S30, Clinical Virology Symposium.

Reiss S., Rebhan I., Backes I., et al., (2011), Recruitment and activation of a lipid kinase by hepatitis C virus NS5A is essential for integrity of the membranous replication compartment, Cell Host & Microbe.; 9(1):32-45..

Rhainds D., L. Brissette,(2004), The role of scavenger receptor class B type I (SR-BI) in lipid trafficking. defining the rules for lipid traders, Int J Biochem Cell Biol; 36(1): 39-77.

Rockstroh J.K., Nelson M., Soriano V, et al., (2013), STARTVerso 4 phase III trial of faldaprevir plus peginterferon alfa-2a and ribavirin (PR) in patients with HIV and HCV genotype 1 coinfection: end-of-treatment response, Hepatology;58(Suppl 1):741A.

Roh C., Lee H.Y., Kim S.E., (2010), Quantum-dots-based detection of hepatitis C virus (HCV) NS3 using RNA aptamer on chip, Journal of chemical technology and biotechnology, vol. 85, no8, pp. 1130-1134. 

Roingeard P., Hourioux C., (2008), Hepatitis C virus core protein, lipid droplets and steatosis, Journal of Viral Hepatitis; 15: 157–164.

Romano K.P., Ali A., Aydin C., et al., (2012), The molecular basis of drug resistance against hepatitis C virus NS3/4A protease inhibitors, PLoS pathogens;8:e1002832.

Rosenquist A., Samuelsson B., Johansson P.O., et al., (2014), Discovery and development of simeprevir (TMC435), a HCV NS3/4A protease inhibitor, J Med Chem.; 57:1673–1693.

Ross R.S., Verbeeck J., et al.,(2008a), Evidence for a Complex Mosaic Genome Pattern in a Full-length Hepatitis C Virus Sequence, Evol Bioinform Online; 4: 249-54.

Ross R.S., Viazov S.,et al., (2008b), Towards a better resolution of hepatitis C virus variants: CLIP sequencing of an HCV core fragment and automated assignment of genotypes and subtypes, J Virol Methods; 148(1-2): 25-33.

Roussel J., Pillez A., et al., (2003), Characterization of the expression of the hepatitis C virus F protein, J Gen Virol 84 (Pt 7): 1751-9.

Rubín A., Aguilera V., Berenguer M., (2011), Liver transplantation and hepatitis C, Clin Res Hepatol Gastroenterol; 35(12):805-12.

Ruggieri A., Argentini C., Kouruma F., et al., (1996), Heterogeneity of hepatitis C virus genotype 2 variants in West Central Africa (Guinea Conakry), J Gen Virol.; 77:2073–2076.

Ruta S.M., Matusa R.F., Sultana C., et al., (2005), High prevalence of hepatitis B virus markers in Romanian adolescents with HIV, Med. Gen. Med.; 7:68–72.

Sagnelli E., Stroffolini T., Mele A., et al., (2005), The importance of HCV on the burden of chronic liver disease in Italy: a multicenter prevalence study of 9,997 cases, J Med Virol.; 75: 522-527.

Sainz B., Barretto N., Martin D., et al., (2012), Identification of the Niemann-Pick C1-like 1 cholesterol absorption receptor as a new hepatitis C virus entry factor, Nature medicine; 18, 281-285.

Sakai A., Claire M.S., Faulk K., et al., (2003), The p7 polypeptide of hepatitis C virus is critical for infectivity and contains functionally important genotype-specific sequences, Proc Nat. Acad Sci USA;100:11646-51.

Saldanha J., Heath A., Aberham C., et al., (2005), World Health Organization collaborative study to establish a replacement WHO internationalstandard for hepatitis C virus RNA nucleic acid amplification technology assays, Vox Sang.; 88:202–4.

Sanchez-Tapias J., Ferenci P., et al., (2007), How can we identify HCV genotype 1 patients who may benefit from an extended treatment duration with peginterferon alfa-2a ?, J Hepatol.; 46(Suppl 1): S243.

Sandrin L., Tanter M., Gennisson J.L., et al., (2002), Shear elasticity probe for soft tissues with 1D transient elastography, Ultrason Ferroelectr Freq Control.; 49436–446.446.

Sansonno D., Dammacco F., (2005), Hepatitis C virus, cryoglobulinemia, and vasculitis: immune complex relations, Lancet Infect Dis.; 5:227-36.

Santantonio T., Wiegand J., Gerlach J.T., (2008), Acute hepatitis C: current status and remaining challenges, J Hepatol.; 49(4):625-33.

Santolini E., Pacini L., Fipaldini C., et al., (1995), The NS2 protein of hepatitis C virus is a transmembrane polypeptide, J Virol.; 69:7461-71.

Sarasin-Filipowicz M., Krol J., et al.,(2009), Decreased levels of microRNA miR-122 in individuals with hepatitis C responding poorly to interferon therapy, Nat Med.; 15(1):31-3.

Sarrazin C., Kieffer T.L., Bartels D., et al., (2007), Dynamic hepatitis C virus genotypic and phenotypic changes in patients treated with the protease inhibitor telaprevir, Gastroenterology; 132:1767–1777.

Sarrazin C., Zeuzem S., (2010b), Resistance to direct antiviral agents in patients with hepatitis C virus infection, Gastroenterology; 138:447-62.

Sarrazin C., Hézode C., Zeuzem S., Pawlotsky J. M., (2012), Antiviral strategies in hepatitis C virus infection, Journal of Hepatology, vol. 56, supplement 1, pp. S88–S100.

Saunier B., Triyatni M., Ulianich L., et al.,  (2003),Role of the asialoglycoprotein receptor in binding and entry of hepatitis C virus structural proteins in cultured human hepatocytes, J Virol.; 77, 546–559.

Schmidt-Mende J., Bieck E., Hugle T., et al., (2001), Determinants for membrane association of the hepatitis C virus RNA-dependent RNA polymerase, J Biol Chem; 276, 44052–44063.

Schuppan D., Afdhal N.H., (2008), Liver cirrhosis,Lancet; 371(9615):838-51.

Seeff L.B., (2002), Natural history of chronic hepatitis C, Hepatology; 36(5 suppl 1):S35–S46.

Sekkat S., Kamal N., Benali B., et al., (2008), Prevalence of anti-HCV antibodies and seroconversion incidence in five haemodialysis units in Morocco, Nephrologie et Therapeutique.; 4(2):105–110.

Serebrov V., Pyle A.M., (2004), Periodic cycles of RNA unwinding and pausing by hepatitis C virus NS3 helicase, Nature; 430:476–480.

Shah D.O., Chang C.D., Jiang L.X., et al., (2003), Combination HCV core antigen and antibody assay on a fully automated chemiluminescence analyzer, Transfusion; 43:1067–74.

Shepard C.W., Finelli L., Alter M., (2005), Global epidemiology of hepatitis C virus infection, Lancet Infect Dis.; 5:558–67.

Sherman K.E., Sulkowski M.S., Zoulim F., et al., (2011), Follow-up of svr durability and viral resistance in patients with chronic hepatitis c treated with telaprevir-based regimens: interim analysis of the extend study, Hepatology; 54:485A-486A.

Shi H., Hoffman B.E., Lis J.T., (1999), RNA aptamers as effective protein antagonists in a multicellular organism, Proc Natl Acad Sci U S A; 96:10033–8.

Shimizu Y.K., Igarashi H., Kiyohara T., et al., (1996b), A hyperimmune serum against a synthetic peptide corresponding to the hypervariable region 1 of hepatitis C virus can prevent viral infection in cell cultures, Virology; 223:409-12.

Shivkumar S., Peeling R., Jafari Y., et al., (2012), Accuracy of rapid and point-of-care screening tests for hepatitis C: a systematic review and meta-analysis, Ann Intern Med;157:558–66.

Sievert W., Altraif I., Razavi H., et al., (2011), A systematic review of hepatitis C virus epidemiology in Asia, Australia and Egypt, Liver Int.; 31 (Suppl 2):61–80.

Silva M.O., Treitel M., Graham D.J., et al., (2013), Antiviral activity of boceprevir monotherapy in treatment-naive subjects with chronic hepatitis C genotype 2/3, J Hepatol.;59:31-37.

Simmonds P., Bukh J., Combet C., et al., (2005), Consensus proposals for a unified system of nomenclature of hepatitis C virus genotypes, Hepatology;42:962-73.

Simmonds P., Mellor J., Sakuldamrongpanich T., et al., (1996), Evolutionary analysis of variants of hepatitis C virus found in South-East Asia: comparison with classifications based upon sequence similarity, J Gen Virol.; 77: 3013-3024.

Simmonds P., (2004), Genetic diversity and evolution of hepatitis C virus – 15 years on, J Gen Virol.; 85:3173-88.

Simmonds P., (2001), The origin and evolution of hepatitis viruses in humans, J Gen Virol., 82:693- 712.

Singal A.G., Volk M.L., Jensen D., et al., (2010), A sustained viral response is associated with reduced liverrelated morbidity and mortality in patients with hepatitis C virus, Clin Gastroenterol Hepatol.;8:280-288.

Sizova D.V., Kolupaeva V.G., Pestova T.V., et al., (1998), Specific interaction of eukaryotic translation initiation factor 3 with the 5' nontranslated regions of hepatitis C virus and classical swine fever virus RNAs, J Virol.;72:4775-82.

Smith B.D., Drobeniuc J., Jewett A., et al., (2011), Evaluation of three rapid screening assays for detection of antibodies to hepatitis C virus, J Infect Dis.; 204:825–31.

Smith B.D., Teshale E., Jewett A., et al., (2011), Performance of premarket rapid hepatitis C virus antibody assays in 4 national human immunodeficiency virus behavioral surveillance system sites, Clin Infect Dis.; 53:780–6.

Smith D.B., Pathirana S., Davidson F., et al., (1997), The origin of hepatitis C virus genotypes, J Gen Virol.;78(Pt 2):321-328.

Smuts H.E., Kannemeyer J., (1995), Genotyping of hepatitis C virus infection in South Africa, J Clin Microbiol.;33:1679–81. 

Soldan K., et al., (2003), Estimation of the risk of hepatitis B virus, hepatitis C virus and human immunodeficiency virus infectious donations entering the blood supply in England, 1993-2001, Vox Sang; 84(4): p.274-86.

Soriano V., Puoti M., Sulkowski M., et al., (2007), Care of patients coinfected with HIV and hepatitis C virus: 2007 updated recommendations from the HCV-HIV International Panel, AIDS; 21(9):1073-89.

Soza A., Arrese M., Gonzalez R., et al., (2004), Clinical and epidemiological features of 147 Chilean patients with chronic hepatitis C, Ann Hepatol.; 3(4):146-51.

Spada E., Mele A., Ciccozzi M., et al., (2001), Changing epidemiology of parenterally transmitted viral hepatitis: results from the hepatitis surveillance system in Italy, Dig Liver Dis.; 33: 778-784.

Spahn C.M., Kieft J.S., Grassucci R.A., et al., (2001), Hepatitis C virus IRES RNA-induced changes in the conformation of the 40s ribosomal subunit, Science; 291:1959-62.

Steinmann E., Penin F.,et al., (2007), Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly

and release of infectious virions, PLoS Pathog.; 3(7): e103.

Stéphane C., Pawlotsky J.M., (2007), Hepatitis C virus: Virology, diagnosis and management of antiviral therapy, World J Gastroenter;13(17):2461-6.

Stedman C., (2014), Sofosbuvir, a NS5B Polymerase Inhibitor in the Treatment of Hepatitis C, Ther Adv Gastroenterol;7(3).

Sterling R.K., Lissen E., Clumeck N., et al., (2006), Development of a simple noninvasive index to predict significant fibrosis in patients with HIV/HCV coinfection, Hepatology; 43(6):1317-25.

Sterling R.K., Stravitz R.T., Luketic V.A., et al., (2004), A comparison of the spectrum of chronic hepatitis C virus between Caucasians and African Americans. Clin Gastroenterol Hepatol.; 2(6):469.

Stramer S.L., Glynn S.A., Kleinman S.H., et al., (2004), Detection of HIV-1 and HCV infections among antibody-negative blood donors by nucleic acid-amplification testing, N Engl J Med.; 351:760-768.

Stuyver L., Van Arnhem W., Wyseur A., et al., (1994), Classification of hepatitis C viruses based on phylogenetic analysis of the envelope 1 and nonstructural 5B regions and identification of five additional subtypes, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA; 91, 10134~10138.

Sulkowski M., et al., (2013), All-Oral Therapy With Sofosbuvir Plus Ribavirin For the Treatment of HCV Genotype 1, 2, and 3 Infection in Patients Co-infected With HIV (PHOTON-1). 64th Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver diseases, Washington, SA; abstract 212.

Sulkowski M., Rodriguez-Torres M., Lalezari J.P., et al., (2013), Alloral therapy with sofosbuvir plus ribavirin for the treatment of HCV genotype 1, 2, and 3 infection in patients co-infected with HIV (PHOTON-1), Hepatology; 58(Suppl 1):313A.

Sulkowski M.S., Sherman K.E., Dieterich D.T., et al., (2013), Combination therapy with telaprevir for chronic hepatitis C virus genotype 1 infection in patients with HIV: a randomized trial, Ann Intern Med.;159:86-96.

Sulkowski MS., (2008), Management of hepatic complications in HIVinfected persons, J Infect Dis.; 197 Suppl 3:S279-93.

Sultana C., Erscoiu S.M., Ceausu S., Ruta S., (2012), HIV/HCV coinfection in Romania – can we afford not to treat?, J Gastrointestin LiverDis.; 21(4):441-2.

Sultana C., Erscoiu S.M., Grancea C., et al., (2013), Predictors of Chronic Hepatitis C Evolution in HIV Co-Infected Patients From Romania, Hepat Mon.;13(2)e8611.

Sultana C., Oprisan G., Szmal C., Vagu C., et al., (2011), Molecular Epidemiology of Hepatitis C Virus Strains from Romania, JGLD; 20(3) 261-266.

Sultana C., Vagu C., Temereanca A., et al., (2012), Hepatitis C virus genotypes in injecting drug users from Romania, Central European Journal of Medicine;6(5):672-678.

Sun C.A., Chen H.C., Lu S.N., et al., (2001), Persistent hyperendemicity of hepatitis C virus infection in Taiwan: the important role of iatrogenic risk factors, J Med Virol.; 65: 30-34.

Suppiah V., Moldovan M.,et al., (2009), IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy, Nat Genet.; 41(10): 1100-4.

Susser S., Welsch C., Wang Y., et al., (2009), Characterization of resistance to the protease inhibitor boceprevir in hepatitis C virus-infected patients, Hepatology; 50:1709–1718.

Sutton A.J., Hope V.D., Mathei C., et al., (2008), A comparison between the force of infection estimates for blood-borne viruses in injecting drug user populations across the European Union: a modelling study, J. Viral Hepat.; 15(11):809–816.

Svirtlih N., Delic D., Simonovic J., et al., (2007), Hepatitis C virus genotypes in Serbia and Montenegro: The prevalence and clinical significance, World J Gastroentero.; 13(3):355–360.

Svirtlih N., Jevtovic D., Simonovic J., et al., (2007), Older age at the time of liver biopsy is the important risk factor for advanced fibrosis in patients with chronic hepatitis C, Hepatogastroenterology; 54(80):2324.

Shimoike T., Mimori S., Tani H., et al., (1999), Interaction of hepatitis C virus core protein with viral sense RNA and suppression of its translation, J. Virol.; 73 (12), pp. 9718–9725.

Tamalet C., Colson P., Tissot-Dupont H., et al., (2003), Genomic and phylogenetic analysis of hepatitis C virus isolates: A survey of 535 strains circulating in southern France, J Med Virol.; 71:391– 398.

TanakaJ., Kumagai J., Katayama K., et al., (2004), Sex- and age-specific carriers of hepatitis B and C viruses in Japan estimated by the prevalence in the 3,485,648 first-time blood donors during 1995–2000, Intervirology; 47: 32–40.

Tanaka Y., Nishida N.,et al., (2009), Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C, Nat Genet.; 41(10): 1105-9.

Tao W., Xu C., Ding Q., et al., (2009), A single point mutation in E2 enhances hepatitis C virus infectivity and alters lipoprotein association of viral particles, Virology; 395:67–76.

Tellinghuisen T.L., Foss K.L., Treadaway J., (2008), Regulation of hepatitis C virion production via phosphorylation of the NS5A protein, PLoS Pathog.; 4:e1000032.

Tellinghuisen T.L., Rice C.M., (2002), Interaction between hepatitis C virus proteins and host cell factors, Curr Opin Microbiol.; 5:419–427.

Terrault N.A., Pawlotsky J.M., McHutchison J., et al., (2005), Clinical utility of viral load measurements in individuals with chronic hepatitis C infection on antiviral therapy, J Viral Hepat; 12:465-72.

Terrault N.A., Im K., Boylan R., et al., (2008), Fibrosis progression in African Americans and Caucasian Americans with chronic hepatitisC, Clin Gastroenterol Hepatol.; 6: 1403–1411.

Terrault N.A., Dodge J.L., Murphy E.L., et al., (2013), Sexual transmission of hepatitis C virus among monogamous heterosexual couples: The HCV partners study, Hepatology, 57: 881–889. 

Testing for HCV Infection: An Update of Guidance for Clinicians and Laboratorians, May 10, 2013 / 62(18);362-365, http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/mm6218a5.htm

Thein H.H., Yi Q., Dore G.J., (2008), Natural history of hepatitis C virus infection in HIV-infected individuals and the impact of HIV in the era of highly active antiretroviral therapy: a meta-analysis, AIDS; 22(15):1979-91.

Thein H.H., Yi Q., Dore G.J., et al., (2008), Estimation of stage-specific fibrosis progression rates in chronic hepatitis C virus infection: a meta-analysis and meta-regression, Hepatology; 48: 418–431.

Thiel H.J., Collett M.S., Gould E.A., et al., (2005), Family Flaviviridae, In: Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J et al., Virus Taxonomy: VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, San Diego: Academic Press; 979-996.

Thomas D.L., Thio C.L., Martin M.P., et al., (2009), Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus, Nature; 461(7265):798-801.

Thompson A.J., Muir A.J., Sulkowski M.S., et al., (2010), Interleukin-28B polymorphism improves viral kinetics and is the strongest pretreatment predictor of sustained virologic response in Hepatitis C Virus- 1 patients, Gastroenterology; 139: 120–129.

Thomssen R., Bonk S., Propfe C., et al., (1992), Association of hepatitis C virus in human sera with lipoprotein, Med Microbiol Immunol.;181:293-300.

Thomssen R., Bonk S., Thiele A., (1993), Density heterogeneities of hepatitis C virus in human sera due to the binding of beta-lipoproteins and immunoglobulins, Med Microbiol Immunol.;182:329-34.

Thu Thuy P.T., Bunchorntavakul C., Tan Dat H., et al., (2012), A randomized trial of 48 versus 24 weeks of combination pegylated interferon and ribavirin therapy in genotype 6 chronic hepatitis C, Jhepatol.; 56: 1012–8.

Timpe J.M., Stamataki Z.,et al.(2008), Hepatitis C virus cell-cell transmission in hepatoma cells in the presence of neutralizing antibodies, Hepatology; 47(1): 17-24.

Tokita H., Okamoto H., Iizuka H., et al., (1996), Hepatitis C virus variants from Jakarta, Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups, Proc Natl Acad Sci U SA; 91, 11022–11026.

Tomei L., Failla C., Santolini E., et al., (1993), NS3 is a Serine protease required for processing of hepatitis C virus polyprotein, J Virol.; 67:4017-26.

Tomei L., Failla C., Vitale R.L., et al., (1996), A central hydrophobic domain of the hepatitis C virus NS4A protein is necessary and sufficient for the activation of the NS3 protease, J Gen Virol.; 77:1065-70.

Torriani F.J., Rodriguez-Torres M., Rockstroh J.K., et al., (2004), Peginterferon Alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection in HIV-infected patients, N Engl J Med.; 351:438-50.

Trapero-Marugan M., Moreno-Monteagudo J. A.,et al.,(2007), Clinical and pathological characteristics and response to combination therapy of genotype 4 chronic hepatitis C patients: experience from a spanish center, J Chemother.; 19(4): 423-7.

Troesch M., Meunier I.,et al.,(2006), Study of a novel hypervariable region in hepatitis C virus (HCV) E2 envelope glycoprotein, Virology; 352(2): 357-67.

Tsai M.C., Kee K.M., Chen Y.D., et al., (2007), Excess mortality of hepatocellular carcinoma and morbidity of liver cirrhosis and hepatitis in HCV-endemic areas in an HBV-endemic country: geographic variations among 502 villages in southern Taiwan, J Gastroenterol Hepatol.; 22: 92–8.

Tseng F.C., O'Brien T.R., Zhang M., et al., (2007), Seroprevalence of hepatitis C virus and hepatitis B virus among San Francisco injection drug users, 1998 to 2000, Hepatology; 46: 666–71.

U.S. National Institutes of Health. ClinicalTrial.gov, Phase 2b study ofBMS-986094 and daclatasvir, with or without ribavirinfor thetreatment of patients with chronic hepatitis C, available from http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01629732.

U.S. National Institutes of Health-ClinicalTrial.gov. Efficacy and safety study of GS-9256 and GS-9190 Alone and in Combination With Ribavirin for 28 Days in Patients With Chronic Hepatitis C Virus Infection. Available from: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01072695.

UNGASS. Country Progress Report for Romania, Reporting period: January 2008–December – 2009. Romania: UNGASS; 2010.

US Food and Drug Administration. Approval of Incivek (telaprevir), a direct acting antiviral drug (DAA) to treat hepatitis C (HCV). Available from: http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ucm256328.htm.

US Food and Drug Administration. Approval of Victrelis (boceprevir), a direct acting antiviral drug (DAA) to treat hepatitis C virus (HCV). Available from: http://www.fda.gov/ForConsumers/ByAudience/ForPatientAdvocates/ ucm255413.htm

Van Asten L., Verhaest I., Lamzira S., et al., (2004), Spread of hepatitis C virus among European injection drug users infected with HIV: A phylogenetic analysis, J Infect Dis.; 189:292–302.

Van de Laar T.J., Van der Bij A.K., Prins M., (2007), Increase in HCV incidence among men who have sex with men in Amsterdam most likely caused by sexual transmission, J. Infect. Dis.; 196:230–238.

Vandelli C., Renzo F., Romano L., et al., (2004), Lack of evidence of sexual transmission of hepatitis C among monogamous couples: results of a 10-year prospective follow-up study, Am J Gastroenterol.; 99(5):855.

Vagu C., Sultana C., Ruta S., (2013), Serum Iron Markers in Patients With Chronic Hepatitis C Infection, Hepat Mon.; 13(10): e13136.

Varaklioti A., Vassilaki N., Georgopoulou U., et al., (2002), Alternate translation occurs within the core coding region of the hepatitis C viral genome, J Biol Chem.;17713-21.

Vassilaki N., Friebe P., et al.(2008), Role of the hepatitis C virus core+1 open reading frame and core cis-acting RNA elements in viral RNA translation and replication, J Virol.; 82 (23): 11503-15.

Verna E., Terry N., Lukose T., et al., (2012), High early response rates with protease inhibitor triple therapy in a multicenter cohort of HCV-Infected patients awaiting liver transplantation, Hepatology;56 (Suppl 1):218A (Abstract 252).

Von Hahn T., Rice C.M., (2008), Hepatitis C virus entry, J Biol Chem.; 283: 3689-3693.

Von Wagner M., Huber M., et al.,(2005), Peginterferon-alpha-2a (40KD) and ribavirin for 16 or 24 weeks in patients with genotype 2 or 3 chronic hepatitis C, Gastroenterology; 129(2): 522-7.

Wakita T., Pietschmann T., Kato T., et al., (2005), Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome, Nat Med.;11:791-6.

Walewski J.L., Keller T.R., Stump D.D., et al., (2001), Evidence for a new hepatitis C virus antigen encoded in an overlapping reading frame, RNA;7:710-21.

Wansbrough-Jones M.H., Frimpong E., Cant B., et al., (1998), Prevalence and genotype of hepatitis C virus infection in pregnant women and blood donors in Ghana, Trans R Soc Trop Med Hyg.; 92, 496–499.

Wantuck J. M., Ahmed A., Nguyen M. H., (2014), The Epidemiology and Therapy of Chronic Hepatitis C Genotypes 4, 5 and 6, Aliment Pharmacol Ther.;39(2):137-147. 

Watanabe H., Enomoto N., Nagayama K., et al., (2001), Number and position of mutations in the interferon (IFN) sensitivity-determining region of the gene for nonstructural protein 5A correlate with IFN efficacy in hepatitis C virus genotype 1b infection, J Infect Dis.; 183:1195–203.

Watson J.P., Brind A.M., Chapman C.E., et al., (1996), Hepatitis C virus: epidemiology and genotypes in the north east of England, Gut; 38:269–276.

Weiner A.J., Brauer M.J., Rosenblatt J., et al., (1991), Variable and hypervariable domains are found in the regions of HCV corresponding to the flavivirus envelope and NS1 proteins and the pestivirus envelope glycoproteins, Virology; 180:842-8.

Weihofen A., Binns K.,  Lemberg M.K., et al. (2002), Identification of Signal Peptide Peptidase, a Presenilin-Type Aspartic Protease; Science 21: 2215-2218.

Welker M. W., Zeuzem S., (2009), Occult hepatitis C: how convincing are the current data?, Hepatology; 49(2): 665-75.

Welsch C., Albrecht M., Maydt J., et al., (2007), Structural and functional comparison of the non-structural protein 4B in flaviviridae, J Mol Graph Model.; 26(2):546-57.

Welsch C., Domingues F.S., Susser S., et al., (2008), Molecular basis of telaprevir resistance due to V36 and T54 mutations in the NS3-4A protease of the hepatitis C virus, Genome Biol.; 9:R16.

Welsch S., Müller B., Kräusslich H.G., (2007), More than one door—Budding of enveloped viruses through cellular membranes, FEBS Lett.; 581: 2089–2097.

Wiegand J., Buggisch P., Boecher W., et al., (2006), Early monotherapy with pegylated interferon alpha- 2b for acute hepatitis C infection: the HEP-NET acute-HCV-II study, Hepatology; 43:250-6.

Wiese M., Grüngreiff K., Güthoff W., et al., (2005), Outcome in a hepatitis C (genotype 1b) single source outbreak in Germany – a 25-year multicenter study, J Hepatol.; 43: 590-598.

Williams I.T., Bell B.P., Kuhnert W., et al., (2011), Incidence and transmission patterns of acute hepatitis C in the United States, 1982–2006, Arch Intern Med.; 171:242–8.

Wölk B., Sansonno D., Kräusslich H.G., et al., (2000), Subcellular localization, stability, and transcleavage competence of the hepatitis C virus NS3-NS4A complex expressed in tetracyclineregulated cell lines, J Virol.;74:2293-304.

World Health Organization. Blood safety key global facts and figures in 2011. Geneva, Switzerland,Available:http://www.who.int/worldblooddonorday/media/who_blood_safety_factsheet_2011.pdf .

Wozniak A.L., Griffin S., Rowlands D., et al., (2010), Intracellular Proton Conductance of the Hepatitis C Virus p7 Protein and Its Contribution to Infectious Virus Production, PLoS Pathog.; 6(9): e1001087.

Wünschmann S., Medh J.D., Klinzmann D., et al., (2000), Characterization of hepatitis C virus (HCV) and HCV E2 interactions with CD81 and the low-density lipoprotein receptor, J Virol.; 74:10055-62.

Xavier F., Bukh J., (1998), Methods for determining the hepatitis C genotype, Viral Hepatitis Rev.; 4:1-19.

Yasui K., Wakita T., Tsukiyama-Kohara K., et al., (1998), The native form and maturation process of hepatitis C virus core protein, J Virol.; 72:6048–6055.

Yi M., Lemon S.M., (2003), 3' Nontranslated RNA signals required for replication of hepatitis C virus RNA, J Virol.; 77:3557-68..

You S., Rice C.M., (2008), 3´ RNA elements in hepatitis C virus replication: kissing partners and long poly(U), J Virol.; 82:184-95.

Yu X., Qiao M., Atanasov I., et al., (2007), Cryo-electron microscopy and three-dimensional reconstructions of hepatitis C virus particles, Virology; 367:126-34.

Zarkesh-Esfahani S.H., Kardi M.T., Edalati M., et al., (2010), Hepatitis C virus genotype frequency in Isfahan province of Iran: a descriptive cross-sectional study, Virol J.; 7:69.

Zein N.N., (2000), Clinical significance of hepatitis C virus genotypes, Clin Microbiol Rev.; 13(2): 223-35.

Zeisel M.B., Felmlee D.J., Baumert T.F., (2013), Hepatitis C virus entry, Curr Top Microbiol Immunol.; 369:87–112.

Zeisel M.B., Koutsoudakis G.,et al.,(2007), Scavenger receptor class B type I is a key host factor for hepatitis C virus infection required for an entry step closely linked to CD81, Hepatology; 46(6): 1722-31.

Zeuzem S., Andreone P., Pol S.,et al., (2011),Telaprevir for retreatment of HCV infection,N Engl J Med.; 364:2417-2428.

Zeuzem S., Buggisch P., Agarwal K., (2010), Dual, triple, and quadruple combination treatment with a protease inhibitor (GS-9256) and a polymerase inhibitor (GS-9190) alone and in combination with ribavirin (RBV) or PegIFN/RBV for up to 28 days in treatment-naive, genotype 1 HCV subjects, The 61st Annual Meeting of the American Association for the Study of Liver Diseases. Boston, Abstract LB-1.

Zeuzem S., Dusheiko G., Salupere R., et al., (2013), Sofosbuvir+ribavirin for 12 or 24 weeks for patients with HCV genotype 2 or 3: the VALENCE trial, Hepatology; 58(Suppl 1).

Zeuzem S., Buti M.,et al., (2006), Efficacy of 24 weeks treatment with peginterferon alfa-2b plus ribavirin in patients with chronic hepatitis C infected with genotype 1 and low pretreatment viremia, J Hepatol.; 44(1): 97-103.

Zeuzem S., Hultcrantz R., et al., (2004), Peginterferon alfa-2b plus ribavirin for treatment of chronic hepatitis C in previously untreated patients infected with HCV genotypes 2 or 3, J Hepatol.; 40(6): 993-9.

Zeuzem S., Berg T.,et al.,(2009), Expert opinion on the treatment of patients with chronic

hepatitis C, J Viral Hepat.; 16(2): 75-90.

Zhang M., Sun X.D., Mark S.D., et al., (2005), Hepatitis C virus infection, Linxian, China, Emerg Infect Dis.; 11: 17-21.

Zhang P., Zhong L., Struble E.B., et al., (2009), Depletion of interfering antibodies in chronic hepatitis C patients and vaccinated chimpanzees reveals broad cross-genotype neutralizing activity, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America; 106(18):7537–7541.

Zhong J., Gastaminza P., Cheng G., et al., (2005), Robusthepatitis C virus infection in vitro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA; 102, pp. 9294–9299.

Zhang Y.Y., Zhang B.H., et al., (2010), Novel function of CD81 in controlling hepatitis C virus replication, J Virol.; 84(7): 3396-407.

Zheng A., Yuan F.,et al., (2007), Claudin-6 and claudin-9 function as additional coreceptors for hepatitis C virus, J Virol.; 81(22): 12465-71.

Zhong J., Gastaminza P., Cheng G., et al., (2005), Robusthepatitis C virus infection in vitro.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America; 102, 9294-9299.

Zhou Y.Q., Wang X.H., Hong G.H., et al., (2011), Twenty-four weeks of pegylated interferon plus ribavirin effectively treat patients with HCV genotype 6a, J Viral Hepat.;18:595–600.

Zignego A.L., Craxi A., (2008), Extrahepatic manifestations of hepatitis C virus infection, Clin Liver Dis.;12(3):611.

Ziol M., Handra‐Luca A., Kettaneh A., et al., (2005), Non‐invasive assessment of liver fibrosis by stiffness measurement: a prospective multicentre study in patients with chronic hepatitis C, Hepatology; 4148–54.54.

Home

http://www.fda.pov/Safetv/Recalls/IndustrvGuidancc/default.htm.. Accessed 15 April 2012.

http://www.natap.org/2013/HCV/013113_03.htm 

http://www.cnlas.ro/images/doc/romania_30december2011.pdf

PUBLICATII

Understanding the molecular targets for new therapeutical agents in hepatitis c infection,Vagu C, Sultana C , Ruta S ., Roum Arch Microbiol Immunol., 2013 Jan-Mar;72(1):5-24.

Serum Iron Markers in Patients With Chronic Hepatitis C Infection,Codruta Vagu , Camelia Sultana and Simona Ruta, Hepat Mon., Oct 2013; 13(10): e13136.

Hepatitis C virus genotypes in injecting drug users from Romania , Camelia Sultana, Codruta Vagu, Aura Temereanca, Camelia Grancea, Josefina Slobozeanu and Simona Ruta, Central European Journal of Medicine, October 2011, Volume 6, Issue 5, pp 672-678.

Molecular Epidemiology of Hepatitis C Virus Strains from Romania,Camelia Sultana, Codruta Vagu, Aura Temereanca, Camelia Grancea, Josefina Slobozeanu and Simona Ruta, Journal of Gastrointestinal and Liver Diseases, 2011 Sep;20(3):261-6.

Hepatology 2009, first romanian edition, translated into romanian by Sultana C., Ruta S., Vagu C., Manolescu L., Temereanca A., Popescu C.

COMUNICARI STIINTIFICE

Impact of donor-recipient factors on the outcome of liver transplantation in chronic HCV infected patients, Vagu C., Iacob S., Sultana C., Neagu A., Diaconu C., Dima S., Gheorghe L., Paslaru L., Popescu I., Ruta S., ACADEMICIAN NICOLAE CAJAL SYMPOSIUM IX edition, 12 – 14 May, 2014.

The impact of recipient IL28B polymorphism on the post transplant evolution of patients with HCV infection, Codruta Vagu, Speranta Iacob, Camelia Sultana, Liana Gheorghe, Irinel Popescu, Simona Ruta, oral presentation, NICOLAE CAJAL SYMPOSIUM 2013.

Preliminary study on the prevalence of HCV infection among IDUs in Bucharest, Codruta Vagu, Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Camelia Grancea, Aura Temereanca, Josefina Slobozenu, Simona Ruta The 4rd Symposium “Acad. Nicolae Cajal”, May 8-10, 2010, Bucharest.

HCV viral infection and genotypes among IDU patients form Bucharest, Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Codruta Vagu, Camelia Grancea, Aura Temereanca, Josefina Slobozeanu, Simona Ruta, Matei Bals Medical Days, 13-16 octombrie 2010, Bucuresti.

Involvement in acquisition risk factors for HCV infection with different genotypes, Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Codruta Vagu, Camelia Grancea, Aura Temereanca, Simona Ruta, National Conference of Infectious Diseases, Timisoara, 2009.

Non invasive markers for evaluation of fibrosis stage in chronic hepatitis C, Codruta Vagu, C. Sultana, A. Temereanca , A. Nastase, C. Florescu, L.L. Paslaru, S. Ruta; poster,NICOLAE CAJAL SYMPOSIUM 2012.

Studiu preliminar asupra prevalentei infectiei VHC in randul consumatorilor de droguri injectabile din Bucuresti, Codruta Vagu, Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Camelia Grancea,Aura Temereanca, Josefina Slobozeanu, Simona Ruta , poster,Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Brasov, octombrie 2009.

ANEXA 1. LISTA TABELELOR DIN TEZA

Tabelul 1. Factori de risc implicati in transmiterea infectiei cu VHC.

Tabelul 2. Factori care influenteaza rata de cronicizare a infectiei VHC.

Tabelul 3. Modele de studiu ale ciclului replicativ al VHC.

Tabelul 4. Distributia la nivel mondial a genotipurilor VHC.

Tabelul 5. Sisteme de evaluare a viremiei HCV in functie deproducator si de metoda.

Tabelul 6. Interpretarea testelor de diagnostic in cazul infectiei VHC.

Tabelul 7. Factori predictivi ai raspunsului la tratamentul antiviral.

Tabelul 8. Markeri predictivi ai eficientei terapeutice.

Tabelul 9.Medicamente aprobate in tratamentul hepatitelor cronice C (2008).

Tabelul 10. Tripla terapie cu inhibitorii de proteaza (telaprevir or boceprevir), interferon pegylat alfa-2a si ribavirina (PegIFN/RBV) – studii clinice de faza 3.

Tabelul 11. Inhibitori ai proteazei NS3-4A de prima generatie.

Tabelul 12. Analogi nucleozidici.

Tabelul 13. Rezultatele obtinute in studiul VALENCE.

Tabelul 14.Inhibitorii non-nucleozidici.

Tabelul 15. Noi formule de interferon utilizate in tratamentul pacientilor cu hepatita cronica VHC.

Tabelul 16. Regimurile terapeutice fara interferon aflate in diferite faze ale studiului clinic, in anii 2014-2015.

Tabelul 17. Intrebari cu privire la abordarea terapeutica a hepatitei acute C

Tabelul 18. Chestionar – Caracteristicile socio-demografice si factorii de risc implicati in achizitia infectiei VHC.

Tabelul 19. Primeri utilizati in cele doua runde de PCR in cadrul secventierii regiunii core.

Tabelul 20. Distributia pacientilor in functie de incarcarea virala.

Tabelul 21. Caracterizarea pacientilor in functie de varsta.

Tabelul 22. Markeri serologici in functie de durata consumului de droguri.

Tabelul 23. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de varsta.

Tabelul 24. Caracterizarea parametrilor investigati in functie de genotipul VHC.

Tabelul 25. Caracterizarea lotului de IDU in functie de anul internarii.

Tabelul 26. Caracterizarea lotului de IDU in functie de grupa de varsta.

Tabelul 27. Caracterizarea lotului de pacienti in functie de infectiile virale.

Tabelul 28. Distributia factorilor de risc importanti in achizitia VHC in functie de nivelul de ARN VHC.

Tabelul 29. Caracterizarea lotului in functie de prevalenta genotipurilor VHC.

Tabelul 30. Caracterizarea pacientilor inainte de TH.

Tabelul 31. Distributia genotipurilor IL28B.

Tabelul 32. Caracterizarea recipientilor preTH in functie de polimorfismul IL28B.

Tabelul 33. Diferente intre valoarea parametriilor de laborator pre si post TH si polimorfismul IL28B.

Tabelul 34. Stadiul fibrozei hepatice in functie de polimorfismul IL28B pre si post TH.

Tabelul 35. Caracterizarea pacientilor inclusi in studiu.

Tabelul 36. Caracterizarea pacientilor inclusi in studiu in functie de markerii metabolismului fierului.

Tabelul 37. Corelatii intre stadiul fibrozei si markerii serici ai metabolismului fierului.

Tabelul 38. Corelatii intre activitatea necroinflamatorie si markerii serici ai metabolismului fierului.

Tabelul 39. Asocierea intre fibroza hepatica si anumiti markeri virusologici.

ANEXA 2. LISTA FIGURILOR DIN TEZA

Figura 1. Organizarea genomica a VHC.

Figura 2. Model experimental pentru producerea pseudo-particulelor VHC.

Figura 3. Ciclul replicativ al VHC.

Figura 4. Arborele filogenetic al tulpinilor VHC construit pe baza analizei genomului complet, disponibil in anul 2010.

Figura 5. Evolutia agentilor terapeutici anti VHC.

Figura 6. Distributia pacientilor in functie de varsta.

Figura 7. Distributia in functie de varsta si sex.

Figura 8. Distributia genotipurilor VHC in lotul studiat.

Figura 9. Analiza filogenetica in regiunea core a tulpinilor VHC de pe teritoriul Romaniei.

Figura 10. Distributia genotipurilor VHC in functie de factorii de risc pentru achizitia infectiei VHC.

Figura 11. Distributia genotipurilor in functie de intreventiile chirurgicale si stomatologice la risc.

Figura 12. Factori de risc importanti in achizitia infectiei VHC.

Figura 13. Prevalenta infectiilor virale.

Figura 14. Distributia genotipurilor VHC.

Figura 15. Profilul genotipurilor VHC utilizand kitul VERSANT™ HCV Genotype 2.0Assay.

Figura 16. Prevalenta factorilor de risc pentru infectia VHC.

Figura 17. Seroprevalenta infectiilor virale si ai markerilor serici ai acestora.

Figura 18. Seroprevalenta infectiilor virale in functie de varsta.

Figura 19. Distributia factorilor de risc intre cele doua grupe (monoinfectati VHC-coinfectati VHC/HIV).

Figura 20. Distributia genotipurilor VHC incadrul lotului.

Figura 21. Distributia factorilor de risc in functie de genotipul VHC.

Figura 22. Distributia polimorfismului IL28B.

Figura 23. Relatia intre valoarea medie a ALT-ului si polimorfismul IL28B.

Figura 24. Rata de RVS in conformitate cu genotipul IL28B.

Figura 25. Rata de RVT in conformitate cu genotipul IL28B.

Figura 26. Procentul pacientilor fara raspuns virusologic in conformitate cu genotipul IL28B.

Figura 27. Asocierea intre polimorfismul IL28B al perechilor donator – receptor si evolutia clinica postTH.