EVALUAREA EFICIENȚEI ANTIMICROBIENE A UNOR NANOPARTICULE DE HIDROXIAPATITĂ, FUNCȚIONALIZATE CU IONI DE Fe, Co, Mn, Sn [307617]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

EVALUAREA EFICIENȚEI ANTIMICROBIENE A [anonimizat], Co, Mn, Sn

COORDONATOR ȘTIINȚIFIC:

CONF. DR. LIA-MARA DIȚU

ABSOLVENT: [anonimizat]

2018

CUPRINS

PARTEA I

1. INTRODUCERE …………………………………………………………………………………………………….2

2. FENOMENE DE ADERENȚĂ BACTERIANĂ ȘI IMPLICAȚII MEDICALE

2.1. ADERENȚĂ BACTERIANĂ…………………………………………………………………………3

2.1.1 ETAPELE ADERENȚEI BACTERIENE…………………………………………………5

2.1.2. STRUCTURI BACTERIENE IMPLICATE…………………………………………….8

2.1.3. ADERENȚA LA SUBSTRATURI INERTE …………………………………………22

2.2. BIOFILME BACTERIENE………………………………………………………………………….25

3. NANOPARTICULE

3.1. TIPURI DE NANOPARTICULE…………………………………………………………………33

3.2. UTILIZĂRI ALE NANOPARTICULELOR………………………………………………….34

PARTEA A II-A

4. INTRODUCERE……………………………………………………………………………………………………36

5. MATERIALE ȘI METODE…………………………………………………………………………………….37

6. REZULTATE ȘI DISCUȚII…………………………………………………………………………………….39

7. CONCLUZIE…………………………………………………………………………………………………………50

8. BIBLIOGRAFIE…………………………………………………………………………………………………….51

PARTEA I

[anonimizat], a dezvoltat în ultimii ani un interes crescut (Mounyr și colab., 2015).

[anonimizat]-o [anonimizat] : patologic sau fiziologic (Lazăr, 2001).

Hidroxiapatita este o substanță din ce în ce mai utilizată pentru inhibarea creșterii bacteriene. [anonimizat], [anonimizat], Mn, [anonimizat], în anumite situații efect antimicrobian mai ridicat. Astfel, [anonimizat], dar și asupra unei tulpini levurice, s-a [anonimizat], Mn, Fe și Sn.

Efectul inhibitor cel mai ridicat a [anonimizat]. În urma acestora, s-a [anonimizat] a biofilmului.

Scop: Evaluarea efectului antimicrobian al unor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu ioni metalici (Fe, Co, Mn, Sn);

Obiective

Evaluarea calitativă a efectului antimicrobian al unor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu ioni metalici (Fe, Co, Mn, Sn);

Evaluarea cantitativă a efectului antimicrobian și antiaderent al acestor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) prin determinarea valorilor concentrației minime inhibitorii (CMI) și a valorilor concentrației minime de eradicare a biofilmului (CMEB).

2. FENOMENE DE ADERENȚĂ BACTERIANĂ

ȘI IMPLICAȚII MEDICALE

2.1. ADERENȚA BACTERIANĂ

Mecanismul de aderență bacteriană se află sub atenția cercetătorilor de foarte mulți ani, aceștia ajungând la concluzia că multe dintre proprietățile celulelor bacteriene sunt implicate în acest proces (Esteban și colab., 2014).

Aderența bacteriană reprezintă un proces biologic important prin care microorganismele reușesc să colonizeze suprafețe, atât de origine vegetală cât și de origine animală. Aderența bacteriană este considerată o primă etapă în desfășurarea procesului infecțios, fiind studiată intens la speciile patogene de bacterii, iar din acest motiv, a fost considerată de unii cercetători, fie un factor de virulență, fie unul dintre factorii de agresivitate (Lazar, 2001).

Așadar, pentru prevenirea apariției unui proces infecțios, s-au adoptat noi metode de evitare a aderenței bacteriene la substrat, ce implică fie o serie de agenți chimici ce împiedică atașarea bacteriei la substratul gazdă, fie înlăturarea acesteia chiar de la debutul procesului infecțios (Abraham și colab., 2015).

Astfel, în cadrul proceselor de aderență bacteriană, celulele bacteriene patogene aderă la numeroase situsuri din organism, legându-se la celulele sensibile sau celulele gazdă, prin interacția dintre adezinele de pe suprafața bacteriei și receptorul pentru adezine prezent la nivelul celulei gazdă (Fig. 1). Unele adezine pot fi de timpul fimbriilor (Fig. 2). O data atașate de acestea, speciile bacteriene patogene se multiplică și sintetizează substanțe toxice, generând spre sfârșitul procesului, biofilme (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 1. Schema generală a fenomenului de aderență bacteriană (http://www.scritub.com/biologie/Factorii-de-patogenitate-ai-ba74834.php).

Aderența bacteriană la celulele epiteliale mucoase este cea mai frecventă cauză în apariția proceselor infecțioase, după studii recente ( Beachey, 1981). De asemenea, alte suprafețe ce pot fi colonizate de speciile patogene de microorganisme, în cadrul procesului de aderență bacteriană, mai pot fi și epiteliile keratinizate sau chiar smalțul dentar, la acesta din urmă find studiate in vivo mijloacele prin care se fixează bacteriile producătoare de carii (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 2. Aderența celulelor de Escherichia coli la nivelul celulei gazdă prin intermediul fimbriilor (https://abdominalkey.com/infections-of-the-urinary-tract/).

În afară de situsurile din organismele vii, bacteriile patogene implicate în procesele de aderență pot coloniza, în același timp, și dispozitive medicale, formând biofilme, aceste tulpini bacteriene fiind mult mai rezistente la tratamentul cu diferite substanțe antimicrobiene (Loza-Correa și colab., 2017).

În cazul aderenței bacteriene pe anumite dispozitive medicale sunt implicate atât proprietățile moleculelor celulei bacteriene, cât și proprietățile materialului dispus ca substrat, acestea din urmă fiind intens studiate de către cercetători, deoarece modificarea lor pot reduce aderența anumitor tulpini bacteriene (Esteban și colab., 2014).

Astfel, fenomenul de aderență nu implică doar interacția dintre două organisme vii, ci și dintre un organism viu, reprezentat de celula bacterină, și un substrat inert, cum sunt diferitele dispozitive medicale (Lazar, 2001).

Dar, procesul de aderență bacteriană prin intermediul adezinelor bacteriene este calea directă de alipire la celulele substratului gazdă, existând, astfel, și o cale indirectă prin intermediul glicocalixului, a opsoninelor sau a fibronectinei. Acest fenomen este realizat datorită prezenței unor sarcini electrice ale celor două componente implicate, sarcini care sunt complementare între ele. De obicei, sarcina electrică atribuită speciilor bacteriene este negativă, dar cu toate acestea, posedă la nivelul lor situsuri încărcate cu sarcini pozitive precum și molecule ce au caracter hidrofob (Chifiriuc și colab., 2011).

Caracterul hidrofob al unei celule bacteriene este influențat de diferitele structuri existente pe suprafața acesteia. Astfel, în cadrul procesului de aderență, bacteriile care au un puternic caracter hidrofob tind să adere la suprafețe hidrofobe, iar bacteriile ce posedă un caracter hidrofil, tind să adere tot la suprafețe hidrofile, aceste proprietăți fiind determinate de proteinele și polizaharidele prezente în compoziția capsulei bacteriene. De asemena, s-a mai constatat faptul ca hidrofobicitatea substratului la care adera celula bacteriană, are o influență mult mai mare în acest fenomen decât caracterul hidrofob a celulei bacteriene care poate fi modificat datorită diferitelor tipuri de fimbrii de pe suprafața acesteia (Esteban și colab., 2014).

2.1.1. ETAPELE ADERENȚEI BACTERIENE

Aderența bacteriană se realizează în două mari etape, acestea fiind etapa reversibilă si apoi cea ireversibilă. Etapa reversibilă constă în amplasarea celor doua componente implicate în acest proces, la o distanță de aproximativ 100 de Å, cele două componente fiind stabilizate de o forță slabă, de tip van der Waals dar și de forțele electrostatice de respingere (Fig. 3) (Marshall și colab., 1971). Strategia de atașare a bacteriilor în etapa reversibilă corespunde unui tip de aderență nespecifică și se obdervă în general la bacteriile aderate la suprafețele inerte, în timp ce etapa ireversibilă corespunde unui tip de aderență specifică, în cadrul căreia sunt implicate moleculele complementare ale celor doua componente. Această interacțiune stereospecifică a adezinelor bacteriene la receptorii pentru adezine de pe suprafața celulei gazdă, poate fi considerată una asemănătoare celei de tip antigen – anticorp sau de tip lacat – cheie (Lazăr, 2001).

Fig. 3. Tipurile de interacții ce apar în fiecare etapă a procesului de aderare a celulei bacteriene la substrat (https://www.cs.montana.edu/webworks/projects/stevesbook2/contents/chapters/chapter002/section002/blue/page001.html).

Atât bacteriile Gram pozitive cât și cele Gram negative au sarcină electrică negativă. În etapa reversibilă, deoarece bacteriile nu sunt încă atașate la substrat, acestea se află în continuă mișcare browniană dar și flagelară, iar fenomenul este menținut dacă sunt îndepărtate prin agitare. O dată ce mișcarea browniană a încetat, bacteriile sunt greu îndepartate de la substratul la care au aderat, acest lucru putând fi realizat doar cu ajutorul unor forțe mai puternice de agitare. Procesul de aderență se realizează prin intermediul unor glicoproteine formate în acel moment și a unor polizaharide extracelulare ce se găsesc la nivelul celui bacteriene (Chifiriuc și colab., 2011).

De asemenea, se consideră că celulele bacteriene ce se găsesc în stadiul exponențial de creștere, aderă mult mai repede la substratul gazdă, decât atunci când se găsesc în etapa staționară, deoarece în momentul în care se sintetizează adezine de novo, se consumă destul de multă energie în procesul metabolic (Lazăr, 2001).

Imediat după ce microorganismele au ajuns în etapa de legare ireversibilă, încep să își desfășoare ciclul de viață, și anume, încep sa crească și să se dividă rapid. În acest moment, se găsesc atât celule bacteriene care au aderat doar la substrat dar nu și între ele, realizând un strat continuu monocelular, dar și celule care au aderat atât la substrat cât și între ele, dând naștere biofilmelor sau a microcoloniilor (Fig. 4) (Lazăr, 2001).

După ce s-au realizat biofilmele, la nivelul acestora pot adera și alte specii bacteriene, atribuindu-i acestuia o structură mult mai complexă. (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 4. Etapele aderenței bacteriene (Lichter și colab., 2009).

După formarea biofilmelor, straturile profunde sunt reprezentate de specii bacteriene ce au metabolism anaerob, fiind considerate anoxice și astfel, cele mai multe celule bacteriene mor sau suferă procese de liză datorită înfometării. În consecință, aceste mecanisme determină emisia de gaze, în urma căreia se poate ajunge la destabilizarea structurală a biofilmului, urmată de dispersia agregatelor celulare la distanță. Mentinerea structurii biofilmelor este dată de prezența unor exopolizaharide care, nu numai că protejează de acțiunea substanțelor antimicrobiene și de desicație, dar menține și un pH optim în cadrul acestor structuri. (Lazăr, 2001).

2.1.2. STRUCTURI BACTERIENE IMPLICATE ÎN PROCESUL DE ADERENȚĂ

Procesul de aderență bacteriană la substratul celular se poate realiza fie prin mecanisme directe, fie prin mecanisme indirecte, ambele fiind desfășurate cu ajutorul unor structuri de pe suprafața celulei bacteriene (Fig. 5). Mecanismele directe implică structuri de tipul adezinelor specifice, în timp ce etapa indirectă se realizează cu ajutorul glicocalixului dar și prin intermediul unor molecule de matrice extracelulară, reprezentate de fibronectine sau opsonine (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 5. Atașarea celulei bacteriene la receptorul membranei celulei gazdă prin intermediul adezinelor bacteriene (http://textbookofbacteriology.net/pathogenesis_2.html)

Adezine

Adezinele bacteriene pot fi încadrate în două grupe, acestea fiind adezine proteice și adezine neproteice. Adezinele proteice sunt reprezentate de fimbrii, dar se consideră că, din aceeași categorie pot face parte si unele proteine din incluse în peretele celular al bacteriilor Gram pozitive sau din alcătuirea membranei externe a bacteriilor Gram negative (Chifiriuc și colab., 2011).

Fimbriile sunt structuri ce au o dimensiune cuprinsă între 10 și 200 nm si un diametru de 7 nm, sunt prezente într-un număr foarte mare, aproximativ 100-1000/celulă (Fig. 6) și sunt sub formă de apendice filmanetoase tubulare și rigide, fără flageli. Fimbriile conțin un număr variabil de proteine numite fimbriline ce au o greutate moleculară de aproximativ 16.6000 Da, aranjate după modelul helical (Lazăr, 2001). Fimbriile pot fi dispuse atât pericelular, când se găsesc în număr destul de mare, sau, pot avea și localizare de tip polară sau bipolară, când sunt într-un număr redus (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 6. Poziționarea fimbriilor și flagelilor în cadrul unei celule bacteriene (Comito, 2017).

Fimbriile intră în categoria lectinelor și sunt prezente doar pe suprafața celulelor bacteriene Gram negative, interacționînd doar cu receptori specifici (Chifiriuc și colab., 2011). Ele sunt codificate de un cluster genic denumit ,,fim’’ ce conține secvențe de ADN reglatoare și structurale (Lazăr, 2001). Activitatea genelor ce codifică pentru sinteza fimbriilor este indusă de temperatura corpului și inhibată de temperatura și pH-ul scăzut, dar și de osmolaritatea ridicată (Jean Peters, 2012).

Din punct de vedere structural, fimbriile au fost împărțite în 3 categorii:

Fimbrii rigide, regăsite la enterobacterii, ce au lumenul de 20 Å, iar diametrul cuprins între 5 și 10 µm;

Fimbrii flexibile, prezente la Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae și Neisseria meningitidis, cu diametrul de aproximativ 6 µm;

Fimbrii flexibile dar spiralate subțire, fără lumen dar cu un diametru de aproximativ 4 µm;

Cu alte cuvinte, există si fimbrii care cuprind și segmente flexibile dar și rigide (Chifiriuc și colab., 2011).

Studiile recente au arătat faptul că fimbriile sunt implicate în aderența non-specifică, facilitând aderarea bacteriei în special la substratul inert, abiotic, încă din prima etapă a acestui proces (Esteban și colab., 2014).

Cercetările asupra rolurilor fimbriilor au demonstrat că acești apendici filamentoși interacționează cu afinitate foarte mare cu epitopii, deoarece se găsesc în număr mare pe suprafața celulei, pot fi ușor de purificat, au caracter puternic imunogen dar și pentru faptul că au proprietăți importante în procesul de adeziune (Klemm și colab., 2000).

Cu alte cuvinte, unii cercetători au demonstrat și principiul conform căruia, fimbriile au un rol important în menținerea unui proces infecțios datorită densității mari pe suprafața celulei bacteriene, fiind nereceptivi la acțiunea unor tratamente cu diferiți compuși antimicrobieni (Barbercheck CR și colab., 2018). Pe lângă acestea, fimbriile menține adeziunea celulelor bacteriene asupra altor celule sau țesuturi, nu numai prin rezistența la acțiunea unor substanțe antimicrobiene ci și la diferite acte fiziologice cum ar fi tuse sau strănut. Fimbriile influențează virulența bacteriilor patogene și prin specificitatea de țesut, acest lucru a fost demonstrat prin izolarea unor celule de Escherichia coli provenite din infecțiile tractului urinar, ce aderau doar la acest tip de epiteliu. De asemenea, se consideră că antigenele din structura fimbriilor au roluri diferite, fie conferă rezistență la procesul de fagocitoză, prin mărirea gradului de virulență bacteriană, fie duc la formarea unor anticorpi anti-fimbrii ( Lazăr, 2001).

Diversitatea fimbrială este dată fie de greutatea moleculară a monomerilor de natură polipeptidică din alcătuirea strucuturii fimbriei fie de lungimea filamentului acesteia (Chifiriuc și colab., 2011). Exista mai multe tipuri de fimbrii, cele mai studiate fiind fimbria de tip 1, fimbriile P, S, de tip 1C și fimbriile de tip 3.

Fimbriile de tip 1 cuplează doar cu receptorii ce conțin manoză, fiind adesea prezente la speciile din Fam. Enterobacteriaceae, cu precădere la celulele de Escherichia coli, căreia îi conferă abilitataea de a adera la celulele mucoase din tractul urinar, gastrointestinal și ale orofaringelui. Pe lângă fimbriile de tip 1, la Escherichia coli se mai pot observa și fimbrii P, K 88, K 99 sau fimbrii de tip CFA. Cu alte cuvinte, resturile de D-manoză, din alcătuirea glicoproteinelor de la nivelul celulelor eucariote, interacționează cu fimbriile de tip 1 de pe suprafața celulelor bacteriene.

În majoritatea cazurilor, fimbriile de tip 1 favorizează aderența bacteriilor de mucoasa intestinului gros sau de tractul intestinal, în timp ce în cazul epiteliului căii urinare, acest mecanism nu este de cele mai multe ori reușit, datorită prezenței unei glicoproteine, numită Tamm – Horsfall, ce este produsă de rinichi dar eliberată în urină, cu rolul de a inhiba interacțiunea dintre fimbriile de tip 1 și receptorul specific, conducând la evitarea invadării rinichiului cu celule de Escherichia coli.

În structura fimbriilor de tip 1 se găsesc o mare cantitate de molecule fimbrilină identice. Ulterior, la bacteriile patogene, acestea au fost notate cu FimA, considerate drept componenta majoră, iar celelalte componente proteice observate în cantitate mai mică au fost notate cu FimF, Fim G și FimH, considerate componente minore. Datorită dispunerii componentei proteice FimH de-a lungul fimbriei și la capătul liber al acesteia, componenta este prevăzută cu situsul în care se dispune D-manoza de pe suprafața celulei eucariote și de aceea, se consideră faptul că proteina majoră are doar rol de susținere a adezinei (Lazăr, 2001).

Unii cercetători au dovedit printr-o serie de proceduri, cum ar fi supunerea celulelor bacteriene la diferite teste cu gentamicină sau modelarea cinetică, faptul că fimbriile de tip 1 sunt structuri importante în creșterea aderenței și în internalizarea macrofagelor (Vizcarra și colab., 2016).

Fimbriile de tip 1 conțin un operon cu 8 gene structurale (Jean Peters, 2012).

Fimbriile P (pili) reprezintă o altă clasă de fimbrii implicate în procesul de aderență bacteriană și se mai numesc și fimbrii Pap sau Gal-Gal. Au fost denumite fimbrii P deoarece au o structură asemănătoare cu cea a unui fir de păr. Fimbriile de tip P, având această conformație și fiind prezente la celulele de Escherichia coli, facilitează aderarea lor de mucoasa tractului urinar. Se numesc și fimbrii Pap datorită faptului că induce colonizarea tractului urinar cu celule bacteriene, conducând la apariția simptomelor specifice pielonefritei. Cea de-a treia denumire, și anume Gal-Gal, este asociată cu glicolipidele de pe suprafața țesutului renal, ce au sunt catalogate ca receptori pentru fimbrii, glicolipide ce contin α-Gal(1-4)-β-Gal. Acest mecanism explică de ce Escherichia coli, ce conține fimbrii de tip P în proproție de 80%, tinde, în cele mai multe cazuri , să colonizeze și să infecteze acest tip de țesut, lăsând urmări nedorite.

Un rol important al fimbriilor este acela că ajută bacteria să invadeze organismul gazdă prin implicarea majoră în lupta cu diverse celule ale sistemului de apărare al gazdei, mai ales cu fagocitele. În altă ordine de idei, fimbriile protejate de adezinele de tip Pap G interacționează cu un număr foarte mare de neutrofile ce sfarșesc prin eliminarea în urină, indicând, în urma examenului de laborator, o infecție urinară. Asociate cu fimbriile de tip P sunt și cele de tip 1C care sporesc derularea procesului de infecțiozitate.

Cu toate acestea, o tulpină bacteriană poate avea mai multe tipuri de fimbrii, fiecare dintre ele având proprietăți de legare diferite.

Agravarea procesului infecțios poate fi determinată și de diferitele stări sau variații de fază a fimbriilor. Astfel, acest fenomen explică de ce tulpinile de Escherichia coli pot infecta diferite segmente ale tractului urinar, evitând interacțiunea cu anticorpii ce aveau specificitate asupra tipurilor de adezine exprimate în etapa precedentă (Lazăr, 2001).

Unele experimente au demonstrat faptul că în urma interactiunii cu anticorpii celulei gazdă, fimbriile P determină o scădere a elasticitătii structurii sale, fapt ce reduce, într-o anumită măsură, abilitatea celulei bacteriene de a provoca infecții la nivelul tractului urinar (Mortezaei și colab., 2013).

Densitatea semnificatică de gene ce codifică pentru sinteza fimbriilor de tip 1 si P a fost evidențiată la tulpinile de Escherichia coli aflate în microflora intestinală timp de 3 saptămâni, în comparație cu tulpinile tranzitorii. De asemenea, persistența tulpinilor de Escherichia coli în microflora colonului uman este susținută în special de fimbriile de tip P (Nowrouzian și colab., 2003).

Fimbriile de tip S reprezintă singurul tip din această categorie de adezine ce nu au implicații în procesele de patogenitate. Denumirea vine de la afinitatea de lor de interacțiune cu anumite glicoconjugate cu acid sialic, dar legătura lor este blocată de anumiți inhibitori precum proteina Tamm – Horsfall, prezentă în urină în concentrație normală. Această categorie de fimbrii este observată la specia Escherichia coli.

Fimbriile de tip 3 reprezintă o altă clasă studiată în procesele de adeziune, sunt structuri netubulare, cu diametru mic și interacționează cu colagenul de tip V. Numeroși reprezentanți ai Fam Enterobacteriaceae, cum ar fi Enterobacter, Providencia, Seratia și mulți alții, produc fimbriile de tip 3. Acestea din urmă sunt codificate de gena mrkD. Spre deosebire de celelalte tipuri fimbriale ce se găseau preponderent la tulpinile de Escherichia coli, acestea pot fi observate la K oxytoca (Lazăr, 2001).

După cum spuneam în paragrafele anterioare, pe lângă adezinele de natură proteică, mai pot exista și adezine neproteice. Acestea din urmă sunt reprezentate de diferite substanțe cu structuri complexe, de natură glucidică, ce se găsesc în compoziția peretelui celular, atât la bacteriile Gram negative cât și la cele Gram pozitive. Cele mai cunoscute tipuri de adezine neproteice sunt date de diferite polizaharide din alcătuirea glicocalixului, capsulei sau din compoziția stratului mucos. S-a demonstrat conceptul că, în procesele de aderență bacteriană, adezinele neproteice au o eficiență mai redusă, comparativ cu adezinele proteice (Chifiriuc și colab., 2011).

Capsula reprezintă o componentă accesorie, de natură vâscoasă ce acoperă total celula bacteriană (Lazăr, 2001). Prin intermediul polizaharidului din compoziția sa, ce se leagă atât ionic cât și covalent, capsula este strâns legată de peretele celular al celulei bacteriene, iar la microscopul optic se observă drept un halou alb, aproape incolor, în jurul celulei (Fig. 7) (Chifiriuc și colab., 2011). În mediile solide, capsula determină un aspect lucios, fiind de consistență mucoasă în momentul în care este preluată cu ansa de pe mediu, în timp ce, în mediile lichide, prezența acestei componente accesorii se poate evidenția prin observarea unui lichid de tip siropos sau vâscos. Substanțele mucoase din alcătuirea capsulei sunt reprezentate, în majoritatea cazurilor, de către polizaharide, dar se pot și compuși cu structură mixtă sau chiar polipeptide (Lazăr, 2001).

Fig. 7. Evidențierea capsulei bacteriene la microscopul electronic, obiectiv 40X (https://www.sciencesource.com/archive/Bacterial-Capsules–LM-SS2520634.html).

S-au identificat mai multe structuri de tip capsular, și anume :

macrocapsulă, observabilă la microscopul optic, este strâns lipită de celulă, iar din această cauză, se depune o dată cu celulele atunci când suspensia se centrifughează și are o grosime mai mare de 0,2 µm;

microcapsula, observabilă la microscopul electronic unde este dispusă ca o pelicula polizaharidică aderentă de peretele celular,iar grosimea acesteia este mai mică de 0,2 µm;

stratul mucos nu este sub formă compactă, acesta fiind dispus în mod dezordonat în jurul celulei bacteriene, iar grosimea acestuia este neuniformă; spre deosebire de macrocapsulă, atunci când suspensia se centrifughează, stratul mucos se separă de celulele bacteriene;

zoogleea este o masă ce include un număr vast de celule bacteriene, iar consistența ei este de natură polizaharidică;

Capsula se găsește la numeroase celule bacteriene, atât Gram pozitive, cât și Gram negative, din sol și apă, dar în special, se regăsește la bacteriile patogene ce produc diverse tipuri de infecții pulmonare sau urinare ( Chifiriuc și colab., 2011).

S-a constatat faptul că, materialul capsular, în cadrul bacteriilor patogene, prin mecanism direct, inhibă interacțiunea fagocitului cu substratul, având, așadar, efect antifagocitar. Astfel, dacă materialul capsular lipsește la bacteriile patogene, acestea din urmă, își reduc foarte mult capacitatea de a adera la un anumit tip de substrat, pierzându-și capacitatea de virulență (Lazăr, 2001).

În ceea ce privesc genele ce codifică pentru sinteza capsulei bacteriene, acestea se găsesc într-un singur locus în cadrul cromozomului bacterian. Dar, diferite celule bacteriene pot avea gene și/sau mecanisme aproximativ asemănătoare pentru a determina sinteza capsulei bacteriene, iar acestea pot fi influențate de diferiți factori de mediu. Cercetarea genelor și mecanismelor implicate în sinteza capsulei bacteriene este în curs de desfășurarea deoarece capsula prezintă aplicații industriale majore (Wen și colab., 2015).

Glicocalixul cuprinde filamente de natură polizaharidică, unite de lipopolizaharidele fie din structura mureinei bacteriilor de tip Gram pozitive, fie de membrana externa a celor Gram negative, constituind o rețea cu rol în aderarea celulelor pe diverse substrate inerte sau pe celule (Fig. 8a și 8b). Doar în condiții naturale are loc sinteza glicocalixului la nivelul celulei bacteriene, iar dacă în cadrul peliculei sau a biofilmului în care sunt înglobate microorganismele, acestea au aderat cu ajutorul unui polimer ce conține anumite tipuri de polizaharide, atunci el poate fi denumit drept glicocalix.

Fig. 8a. Reprezentarea schematică a peretelui celular al bacteriilor Gram negative și Gram pozitive, pentru înțelegerea formării glicocalixului (https://www.shutterstock.com/es/image-illustration/bacteria-difference-grampositive-gramnegative-bacterial)

Acest fenomen de aderență a bacteriilor cu ajutorul glicocalixului este frecvent în procesul de formare a plăcii dentare. Astfel, după ce o mare diversitate specifică de streptococi invadează anumite suprafețe din cavitatea bucală, cum ar fi dinții sau limba, aceștia elimină polizaharide pentru consolidarea coloniei la acele suprafețe și astfel se formează biofilmul, respectiv placa dentară (Lazăr, 2001).

Diversitatea microcoloniilor bacteriene implantată într-o masă ce conține polimeri extracelulari, foarmează placa dentară, regăsită pe diferite suprafețe ale cavității bucale. Pentru prevenirea unor afecțiuni gingivale, este necesară înlăturarea biofilmului plăcii dentare.

Cercetătorii au demonstrat faptul ca îndepărtarea acestui biofilm cu diferite specii bacteriene, se poate face cu ajutorul bicarbonatului de sodiu (NaHCO3). Astfel, bicarbonatul de sodiu reduce vâscozitatea matricei ce conține diferite polizaharide, ducând, într-un final, la desprinderea acestuia (Bosma și colab., 2018).

Fig. 8b. Imaginea de ansamblu al glicocalixului la bacteriile Gram negative (după Costerton 1978).

Glicocalixul are un rol protector asupra coloniilor bacteriene, deoarece favorizează aderența acestora în diferite medii sterile. Un exemplu poate fi dat de protejarea acestora față de fluxul urinar. Un alt exemplu este reprezentat de protecția speciilor bacteriene de acțiunea mecanismelor de apărare a gazdei infectate. Cu alte cuvinte, apără celulele bacteriene atât de atașarea anticorpilor organismului gazdă, dar și de interacțiunea cu diferite leucocite, și astfel, fagocitarea celulelor bacteriene.

Legarea glicocalixului de anumite polizahaide, de pe suprafața stratului gazdă, se realizează cu ajutorul unor legături polare.

Potrivit lui Costerton, glicocalixul se formează doar în medii în care sunt prezente anumite tipuri de bacterii. Prezența glicocalixului constituie o sursă de nutriție, deoarece de acesta se atașează diferite molecule, cum ar fi ioni și molecule, fie sintetizate în mediu, fie recirculate, provenite din procesele de digestie a unor celule intrate în procesul de apoptoză (Lazăr. 2001).

Tot în procesul de aderență bacteriană, se formează, pe suprafața celulei ce urmează să colonizeze substratul gazdă, anumite exopolizaharide ce se găsesc sub formă de gel hidratant. Acestea formează structurile capsulare, pe care le-am prezentat în paragrafele anterioare, și pot fi considerați factori de virulență. Din acest motiv, această categorie de polizaharide prezintă două funcții, și anume:

funcția de aderare la suprafața celulei gazdă: în procesul de adeziune bacteriană intervin forțele London-Van der Waals ce contracarează forțele de respingere a celulei gazdă. În acest fenomen, un rol important îl au exopolizaharidele produse de bacterii ce intervin puternic în favorizarea interacțiunii dintre liganzi și receptori, și astfel, ajută celulele bacteriene să câștige lupta în batalia pentru atașarea de celula gazdă;

funcția de a proteja celula bacteriană de mecanismele de apărare a celulei gazdă: acest proces se realizează cu ajutorul capsulei ce restrictează includerea fagocitelor în celulele bacteriene, și astfel, nu mai este posibilă fagocitoza. Alte structuri care nu mai au acces la structura celulelor bacteriene sunt anticorpii. De asemenea, unele specii bacteriene îsi pot sintetiza o capsulă a cărei compoziție este apropiată de cea a constituienților celulelor gazdă, și astfel, este posibilă integrarea celulelor străine în substratul gazdă.

La bacteriile Gram pozitive, se găsesc niște structuri filamentoase, similar fimbriilor, localizate în glicolipidele din cadrul membranei (Fig. 9). Aceste structuri se numesc acizi lipoteichoici și intervin în fenomenul de aderență la această categorie de bacterii (Chifiriuc și colab., 2011).

Studii recente efectuate pe specia Streptococcus pneumoniae, au arătat faptul că absența acizilor lipoteichoici din structura membranei celulare, permite creșterea normală a acestei specii, dar fenomenul de virulență nu este tocmai favorizat. Studiile au fost realizate pe șoareci cu diferite tipuri de infecții și pneumonie acută (Heß și colab., 2017).

Fig. 9. Localizarea acizilor lipoteichoici în structura peretelui celular al bacteriilor Gram pozitive (https://microbeonline.com/teichoic-acid-of-gram-positive-bacteria-characteristics-and-medical-importance/).

Alte structuri implicate în procesele de aderență bacteriană la nivelul unui substrat inert sau la suprafața celulelor gazdă, sunt receptorii pentru adezine. Între cele două părți, interacțiunea se bazează pe un principiu, acela al complementarității spațiale (Chifiriuc și colab., 2011).

O altă ipoteză demonstrată a fost aceea că pot apărea mereu receptori noi, în urma infectării unor celule cu un anumit tip de virus, receptori care sunt inexistenți pe celulele cu dezvoltare normal.

Modul în care ligandul celulei bacteriene interacționează cu receptorul de pe suprafața celulei gazdă este aproape identic cu mecanismul de tip lacăt-cheie. Cu alte cuvinte, celula bacteriană poartă o informație de un anumit tip ce este ,,tradusă’’ de către celula gazdă. Acest fenomen nu apare doar între celulele microbiene și un tip de substrat ci și între celelalte categorii de celule din lumea vie. Această comunicare poate fi atât specifică cât și nespecifică, astfel, o celulă bacteriană poate interacționa cu orice tip de celulă, indifferent de organismal de la care provine (Lazăr, 2001).

Afinitatea bacteriilor pentru diferite țesuturi ale organismului gazdă, cum ar fi pentru tractul gastro-intestinal, respirator, depinde de diversitatea receptorilor de pe suprafața substratului gazdă (Nizet și Esko, 2009).

Cu alte cuvinte, unele celule bacteriene, cum ar fi Yersinia sp. sau Salmonella sp., au capacitatea de a infecta mai multe tipuri de cellule, provenite de la organisme de regnuri diferite, ceea ce reprezintă interacțiunea nespecifică, în timp ce alte specii bacteriene, de exemplu Streptococcus pyogenes sau chiar Escherichia coli, au specificitate pentru colonizarea unor celule cu o anumită proveniență sau localizare. Acest din urmă fenomen caracterizează interacțiunea specific (Chifiriuc și colab., 2011).

Un alt exemplu de interacțiune specifică, poate fi dat de Neisseria gonorrhoeae ce colonizează doar epiteliul oral și genital uman, iar acest lucru explică de ce alte mamifere nu pot fi infectate cu această bacterie (Lazăr, 2001).

Receptorii pentru adezine sunt localizați în stratul mucopolizaharidic al epiteliului mucos și fac parte din familia integrinelor. Din punct de vedere chimic, acestea pot fi atât glicoproteine cât și glicolipide, din structura membrane celulare (Fig. 10). Practic, integrinele sunt reprezentate de catene oligozaharidice ale glicoconjugatelor, localizate pe fața externă a membrane celulare. Receptorii pentru adezine sau așa numitele integrine, au roluri multiple, cum ar fi adeziunea colegenului de tip I, fibrinogenului, fibronectinei, etc. (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 10. Redarea fenomenului de aderență bacteriană cu ajutorul receptorilor specifici (Nizet și Esko, 2009).

Familia integrinelor reprezintă una din cele 5 familii ale receptorilor pentru adezine bacteriene. Celelalte familii sunt reprezentate de proteine imunoglobulinice, selectine, cadherinele dar și de mucinele. Rolul cel mai important al selectinelor este de a dirija mișcările leucocitelor, atât prin organe limfoide cât și prin cele nelimfoide, acest proces realizându-se prin medierea contactului dintre celulele vasculare de tip endotelial și leucocite. Cadherina facilitează adeziunea speciei bacteriene Listeria monocytogenes, fiind un receptor specific pentru internalină (proteină) din membrana externă a acesteia.

Pe langă funcția majoră de adeziune, integrinele au implicații și în mecanismele de vindecare, în raspunsul imun sau în alte procese biologice ca de exemplu în morfogeneza embrionului (Lazăr, 2001).

O echipă de cercetători au realizat o serie de experimente și au ajuns la concluzia că tratamentul pentru eradicarea integrinelor de pe suprafața celulelor este o soluție în prevenirea diferitelor boli, cum ar fi HIV, boli cardiovasculare, diferite cancere și boli inflamatorii (Pandolfi și colab., 2017).

Structura integrinelor este prezentată ca un heterodimer, ce conține două subunități (α și β). În structura fiecărei subunități intră trei domenii : un domeniu intracitoplasmatic, asociat grupărilor –COOH terminale, unul transmembranar și cel din urmă, domeniul extracelular (Fig. 11). Atunci când în mediu sunt prezenți ionii de Ca și Mg, cele 2 domenii extracelulare (unul al subunității α și celălalt al subunității β), servesc la interacțiunea cu ligandul, de pe suprafața celulei bacteriene (Lazăr, 2001).

Fig. 11. Reprezentarea grafică a structurii heterodimerice a integrinelor (http://studydroid.com/index.php?page=viewPack&packId=402681).

În forma sa normală, nativă, integrinele au o conformație închisă și afinitate scăzută pentru liganzi, fiind într-o stare inactivă (Jahed și colab., 2014).

Există 24 de tipuri de integrine, formate prin combinarea celor 18 subunități de tip α și 8 subunități de tip β (Rikitake și colab., 2011).

Integrinele formate din subunitățile α1β1 și α2β mediază interacțiunea dintre fibroblaste și colagen, iar cele formate din subunitățile α4β1 și α5β1 facilitează contactul fibroblastelor cu fibronectinele (Buckley și colab, 2017).

S-a demonstrat faptul ca integrinele β2 participă în special, în interacțiunile dintre celulele sau țesuturile sistemului imunitar. Acest tip de integrine se găsesc în citoplasmă, dar sunt transferate pe suprafața membranei atunci când celulele mieloide au interacționat cu stimuli inflamatori (Hogg, 1998).

Integrinele de tip β3 constituie un rol important în hipertrofia de miocard. Astfel, atunci când presiunea cardiacă crește, stimulează ubiquitinilarea proteinelor, salvând, astfel, viața cardiomiocitelor și funcția ventriculară (Stansfield și colab., 2014).

Marea majoritate a celulelor au mai multe tipuri de integrine pe suprafața lor, iar prezența celor două tipuri de subunități este esențială pentru desfășurarea normală a procesului de aderență. Acest proces de interacțiune între cele două componente ale celulelor se desfășoară în prezența unor cationi. Complexul reprezentat de proteină-integrină se realizeză prin intermediul unor secvențe de aminoacizi, recunoscute de integrine, secvențe care, de cele mai multe ori sunt Arg-Gli-Asp și se găsesc în fibrinogen, fibronectine, trombospondină, ș.a. (Mousa și colab., 2017).

Aceste secvențe de aminoacizi sunt prezente la toate proteinele de adeziune, doar că modul de orientare în spațiu este diferit, ceea ce înseamnă că integrinele recunosc anumiți liganzi, în funcție de tipul secvenței de aminoacizi, care au fost notate ,,RGD’’. Procesul de aderență în care este implicată această secvență, are un rol foarte important în relația dintre gazdă și parazit, deoarece în structura microorganismelor au fost sintetizate anumite structuri care sunt foarte asemănătoare cu secvențele RGD recunoscute de integrine, și astfel, interacțiunea dintre cele două tipuri de celule este mult mai ușor de realizat. Există anumite specii bacteriene, cum ar fi cea care declanșează tusea convulsivă (Bordetella pertussis), care prezintă pe suprafața ei o proteină numită hemaglutinina filamentoasă ce conține secvența RGD, recunoscută de integrinele celulelor ciliate din tractul respirator uman, sprijinind invadarea și colonizarea acestuia de către bacterie (Lazăr, 2001).

Fenomenul de activare a integrinelor se desfășoară în mai multe etapte, începând cu pasul de declanșare, semnalizare și în cele din urmă, terminându-se cu interacțiunea dintre integrine și reglatorii citoplasmatici, ce facilitează schimbarea afinității integrinelor pentru liganzi (Fig. 12). Primele două etape sunt modulate prin diferite căi de semnalizare, în timp ce pașii finali vizează domeniul transmembranar al integrinelor, continuandu-se cu interacțiunea dintre integrină și proteină (Shattil și colab., 2010).

Fig. 12. Reprezentarea schematică a procesului de activare a integrinelor (după Shattil și colab., 2010).

S-a descoperit o metodă experimentală ce permite identificarea și localizarea receptorilor glicoproteici și glicolipidici. Astfel, se utilizează un tip de glicoproteine, numite lectine, ce sunt legate de un compus fluorescent, lectine ce interacționează cu un rest de tip oligozaharidic.

Reglarea nivelului de aderență se efectuează prin mai multe metode. Acestea pot fi:

tratamentul cu diferite antibiotic, în cantități infime, ce conduce la transformarea unor funcții a mecanismelor de aderență bacteriană;

utilizarea unor anticorpi specifici, ce conferă o imunitate prelungită la următorul contact cu agentul patogen, respectiv microorganismul;

folosirea omologilor adezinelor, un exemplu poate fi dat de D-manoza care conferă restricția atașării unor specii bacteriene la celula gazdă, acest lucru fiind posibil datorită prezenței fimbriilor de tip 1 pe suprafața celulei bacteriene, ele având afinitate doar pentru receptorii cu manoză;

adăugarea acizilor de tip lipoteichoic ce blochează mecanismul de aderare a streptococilor la celula gazdă;

Cu toate acestea, printr-o serie de cercetări, s-a constat faptul că modul prin care o celulă bacteriană aderă la nivelul unei celule gazdă, se poate face și prin intermediul altor structuri, nu numai cu ajutorul receptorilor celulari. Acestea pot fi diverse componente celulare și căi de semnalizare sau citokine de tip inflamator (Chifiriuc și colab., 2011).

2.1.3. ADERENȚA LA SUBSTRATURI INERTE

În medicina modernă, infecțiile datorate dispozitivelor medicale, incomplet/incorect sterilizate, constituie o problemă destul de controversată. Acestea au un impact foarte mare asupra morbidității globale, dar și asupra investițiilor din rețelele de sănătate publică. Bacteriile au capacitatea de a adera la diverse suprafețe ale dispozitivelor medicale, conducând la formarea biofilmelor bacteriene, care manifestă o sensibilitate scăzută la acțiunea antibioticelor. Astfel, rezistența la antibiotice devine o problemă intens discutată.

Există o mare varietate a speciilor implicate în fenomenele de aderență la substraturi inerte. Așadar, din categoria bacteriilor Gram negative, cele mai multe specii implicate sunt cele ale genului Staphylococcus, iar în ceea ce privește categoria bacteriilor Gram pozitive, speciile genului Pseudomonas sunt cele mai răspândite în procesele de aderență la substratul inert. De multe ori, exceptând categoriile menționate, suprafețele neanimate mai pot fi colonizate și de diferiți agenți patogeni oportuniști, ce determină un grad înalt de virulență.

Toată această diversitate specifică, îngreunează mecanismul de eradicare a biofilmelor formate pe diverse suprafețe inerte, și astfel, au fost adoptate diverse strategii de înlăturare a coloniilor bacteriene de pe susubstraturile neanimate, ca de exemplu:

modificări împotriva adeziunii bacteriene pe suprafața biomaterialului, cu rol în respingerea atașării microorganismelor;

tratamentul cu diferite substanțe anti-bacteriene;

construirea de molecule ce interferă cu celulele bacteriene;

confecționarea unor materiale nanostructurate;

S-au testat diferite tipuri de materiale, în vederea scăderii procentului de aderență bacteriană pe diferite dispozitive medicale, și s-a constatat că materialele confecționate din sticlă-ceramică prezintă cel mai mic grad de atracție bacteriană, având multiple aplicații în medicina modernă. (Cabal și colab., 2014).

Cu alte cuvinte, atât proprietățile fizice, cât și cele chimice ale suprafețelor neanimate la care aderă speciile bacteriene, precum și capacitatea de aderență a microorganismelor influențată de complexitatea structurală și etapa de dezvoltare a creșterii, influențează în cea mai mare măsură colonizarea acestor tipuri de substrate, rezistența la activitatea unor substanțe cu efecte antimicrobiene dar și numărul bacteriilor care aderă și se răspândesc pe întreaga suprafață străină. S-a ajuns la concluzia că modificarea proprietăților suprafețelor de referință este cea mai bună modalitate de evitare a invadării microbiene, luând naștere, așa numitele biomateriale respingătoare de bacterii (Moriarty și colab., 2017).

Celulele bacteriene aderă la substraturi inerte sau neanimate, nespecific, mecanismul fiind caracterizat de etapa reversibilă a procesului de adeziune bacteriană (Lazăr, 2001).

În mod normal, antibioticele sunt cele care au capacitatea de distrugere a creșterii și multiplicării bacteriene, doar că, cei mai mulți pacienți folosesc în cantități mari și pentru perioade nedeterminate, antibiotice cu spectru larg de acțiune, ceea ce agravează și mai mult situația, ajungându-se de cele mai multe ori la fenomenele de rezistență la antibiotice. Formarea biofilmelor reduce foarte mult eficiența activității antibioticelor.

Apariția infecțiilor bacteriene provocate de implantarea diverselor dispozitive medicale sunt însoțite de costuri mari în ceea ce privește terapia antimicrobiană, precum și de numeroase intervenții chirurgicale. În prezent, nanotehnologia a avansat foarte mult, motiv pentru care, se confecționează din ce în ce mai multe dispozitive medicale ce împiedică aderența bacteriană, la nivelul lor (Bancina și colab., 2018).

Potrivit unor studii recente, oxidul de grafen este un compus ce are capacitate inhibitorie foarte mare asupra microorganismelor, în special a tulpinilor de Escherichia coli și a celor de Staphylococcus aureus (Fig. 13). Astfel, tratarea suprafețelor polimerice cu un astfel de compus, duce la eradicarea coloniilor bacteriene și îngreunarea formării biofilmelor. Acest compus antimicrobian supune speciile bacteriene la un stres oxidativ și este biodegradabil, nefiind toxicsau dăunător sănătății în cazul inhalării. Compusul este utilizat mai nou pentru sterilizarea diferitelor dispozitive medicale (Liu și colab., 2018).

Fig. 13. Eradicarea tulpinilor de E. coli cu oxid de grafen (după Liu și colab., 2018).

S-a mai demonstrat faptul că cei mai importanți ioni cu efecte antimicrobiene sunt Ag, Zn și chiar Cu, motiv pentru care, sunt incluși în compoziția diferitelor dispozitive medicale. Cu toate acestea, în cazul fabricării protezelor ortopedice, cel mai folosit este titanul pur, precum și aliajele sale, deoarece prezența acestuia împiedică aderența bacteriană, și mai mult, previne infecțiile cu diferite microorganisme (Ferraris și Spriano, 2016).

2.2. BIOFILME BACTERIENE

Biofilmele reprezintă o asociație de microorganisme aderate ireversibil la nivelul unui substrat și care sunt incorporate într-o matrice polizaharidică produsă chiar de acestea (Donland și Costerton, 2002).

Biofilmele se leaga la nivelul substratului prin procesul de aderență bacteriană, proces mediat de structuri numite adezine (Fig. 14a, 14b). Cu alte cuvinte, în cadrul biofilmului, bacteriile aderă atât între ele, cât și la suprafața animată sau la cea inertă. Biofilmul ia naștere datorită capacității speciilor bacteriene de a tolera mecanismele inhibitorii folosite atât de către antibiotice și diverse substanțe antimicrobiene, cât și de celulele implicate în apărarea gazdei (Chifiriuc și colab., 2011).

(a) (b)

Fig. 14. Observarea biofilomelor cu specii de S. aureus, S. epidermidis, P. aeruginosa (a) și P. aeruginosa (b) prin tehnici de microscopie electronică (http://www.bacteriainphotos.com/bacterial-biofilm.html#).

Biofilmele bacteriene sunt răspândite în aproape toate mediile, în special în organismul uman și pe dispozitive medicale, cum ar fi catetere, implanturi, stimulatoare cardiace, etc. (Macia și colab., 2018).

S-a constatat faptul că celulele bacteriene ale unei specii din structura biofilmului, diferă foarte mult față de aceeași specie bacteriană aflată în suspensie. Acest lucru se datorează faptului că, în cadrul biofilmului, celulele sunt înglobate într-o matrice polizaharidică, interacționează unele cu altele și astfel, apare o colaborare de tip metabolic, fiind adaptate la condițiile de mediu.

Așadar, speciile din colectivul microbian au capacitatea de a fi rezistente la acțiunea diferitelor substanțe cu efecte antimicrobicide, cât și la activitatea celulelor reprezentative pentru sistemul imunitar al organismului gazdă. Această caracteristică poate fi determinată de mai mulți factori, cum ar fi :

apariția unei creșteri multistratificată a bacteriilor, corelată cu agregarea celulelor bacteriene între ele;

sinteza unor enzime cu rol degradativ, de către speciile bacteriene;

sinteza substanțelor polizaharidice de către microorganisme, și înglobarea în masa acestora; le conferă protecție față de acțiunea diferitelor substanțe cu caracter antimicrobian;

la Escherichia coli s-a observat ca o dată ce bacteriile au devenit elemente constituiente ale unui biofilm, acestea au dobândit modificări la nivelul expresiei porinei Omp F, ceea ce a determinat capacitatea acestei specii de a fi rezistentă la acțiunea unor antibiotice (Lazăr, 2001).

De cele mai multe ori, biofilmele au capacitatea de a produce metan, dar și micropoluanți de tip biodegradabil (Rittmann, 2018).

În contextul rezistenței la antibiotice a biofilmelor bacteriene, s-au efectuat o serie de cercetări și s-a demonstrat faptul că biofilmele de suprafață uscată colonizate cu Staphylococcus aureus, sunt foarte puțin receptive la acțiunea temperaturii ridicate și la autoclavarea cu aburi, o densitate mică de celule bacteriene fiind ucisă, comparativ cu microorganismele de aceeași specie ce formează biofilme de suprafață umedă și inclusiv cele din suspensii (Almatroudi și colab., 2018).

În anul 2018, Wang și colab., au efectuat experimente ce vizează rolul exopolizaharidelor din biofilmul bacterian, deoarece, se considera că acesta este răspunzător de capacitatea de rezistență la antibiotice a comunității microbiene dintr-un biofilm. Așadar, au fost aduse spre observație două tipuri de biofilme, și anume, unele ce conțineau exopolizaharide și altele ce nu aveau exopolizaharide (EPS) în compoziția lor. Acestea au fost tratate cu diferite antibiotice și s-a demonstrat implicația conținutului de exopolizaharide în apărarea biofilmului bacterian față de acțiunea antibioticelor (Fig. 15). Cu alte cuvinte, exopolizaharidele sunt cele care ii conferă unui biofilm rezistența la tratamentul cu diferite substanțe antimicrobiene sau cu efect inhibitor (Wang și colab., 2018).

Fig. 15. Evidențierea rolului exopolizaharidelor prin intermediul acțiunii unor antibiotice (după Wang și colab., 2018).

Apariția unui biofilm necesită, într-o primă etapă, aderarea celulelor bacteriene la un substrat, care poate fi inert, neanimat sau viu. Astfel, pentru a coloniza suprafețele, bacteriile trebuie, mai întâi, să se deplaseze la substratul respectiv. Acest mecanism se realizează prin mai multe metode, cum ar fi:

prin procesul de difuziune, realizat cu ajutorul mișcărilor lente și dezordonate (browniene) a microorganismelor;

cu ajutorul unor curenți, numiți curenți de convecție; garantează mișcarea mai rapidă a bacteriilor, decât prin procesul de difuziune și poate fi corelată cu deplasarea unui lichid;

prin mișcări rapide, atunci când apare un gradient chimic;

Formarea biofilmelor presupune mai multe etape. Prima etapă este de aderență a bacteriilor la substrat, etapă ce are loc întâi printr-o fază reversibilă, în care există pozibilitatea înlăturării speciilor bacteriene aflate încă în mișcarea browniană, apoi se continuă cu faza ireversibilă, în care bacteriile aderente se înlătură de pe substrat doar cu ajutorul unor forțe puternice. Aceste procese ale primei etape în formarea biofilmului au fost descrise anterior, în capitolul ce vizează aderența bacteriană (Fig. 16). Ulterior, după ce microorganismele au aderat la substrat, aceste formează microcolonii bacteriene care încep să crească datorită capacității celulelor bacteriene de a se divide rapid, și care, se organizează treptat în multiple straturi (Chifiriuc și colab., 2011).

S-a dovedit faptul că, biofilmele se formează în special pe suprafețele biopolimerilor, iar utilizarea unor materiale protetice ce includ aceste biofilme, pot genera infecții deosebit de grave și dificil de tratat. De asemenea, eliberarea în organism a agregatelor bacteriene ancorate în glicocalix, produc afecțiuni grave care de cele mai multe ori pot fi la nivel pulmonar sau chiar congestii cerebrale. De aceea, perosnalul medical trebuie să se asigure că dispozitivele sau ustensilele medicale au fost corect sterilizate, pentru prevenirea apariției acestor afecțiuni. Se consideră că materialele medicale, după ce au fost sterilizate, nu trebuie să prezinte pe suprafața lor reziduuri de biofilme moarte în procesul de aseptizare, pentru că acestea, constituie un mediu prielnic colonizării unor noi bacterii și astfel, formării unui nou biofilm (Lazăr, 2001).

Fig. 16. Etapele procesului de formare a biofilmului și componentele implicate în acest proces (http://patomaniacosfls.blogspot.com/2010/04/biofilmes-sociedade-bacteriana.html).

Biofilmele pot fi localizate pe diverse substanțe inerte, cum ar fi o gamă vastă de materiale medicale, conducte de apă potabilă, sisteme de aer condiționat, suprafețe ale utilajelor industriale de producere și ambalare a unei game largi de alimente, etc. În aceste cazuri, speciile bacteriene predominante în biofilme sunt Legionella pneumophila, Listeria sp. Și chiar Enterococcus sp. Dacă materialele medicale, utilizate în diverse proceduri, nu sunt corect sterilizate, acestea pot produce infecții nosocomiale (Lazăr, 2001).

Infecțiile nosocomiale sunt considerate cauzele majore ale îmbolnăvirii infecțioase în întreaga lume. Acestea apar de cele mai multe ori la pacinții care sunt internați în spitale pe perioade lungi de timp, iar acest fenomen este asociat cu o morbiditate și o mortalitate crescută. Cele mai uzuale infecții nozocomiale apărute sunt infecțiile pulmonare sau pneumoniile (Fig. 17). Această afecțiune este cauzată de cele mai multe ori de sterilizarea incompletă/ incorectă a ustensilelor medicale folosite în procedurile de intubație traheală, ventilația mecanică, chirurgia toracică sau cea abdominală superioară (Chen și colab., 2017).

Doza antibioticelor utilizate în infecțiile nosocomiale trebuie să fie mult mai mare decât cea administrată în cazul eradicării celuleor bacteriene libere. În prezent, marile companii farmaceutice au sub observație doza de antibiotice necesară penetrării și eradicării biofilmului bacterian. De asemenea, o altă cale de împiedicarea declanșării unor afecțiuni nedorite de către biofilm, poate fi reprezentată nu numai de administrarea unei cantități corespunzătoare de antibiotice, ci și de modificarea activității genelor din cadrul genomului bacterian (Lazăr, 2001).

Fig. 17. Tipurile de infecții nosocomiale depistate în România, în anul 2012 (conform CNSISP).

Studii recente au arătat că infecțiile nosocomiale provoacă o creștere a morbidității și mortalității și în rândul nou-născuților. S-au răspândit diferite programe ce au ca scop atât detectarea și prevenirea infecțiilor nosocomiale, cât și micșorarea densității tulpinilor bacteriene rezistente la diverse antibiotice. Cu toate acestea, programele au un cost destul de ridicat și nu sunt accesibile programelor de sănătate din țările cu dezvoltare economică redusă. Aceste programe trebuie să includă două principii pentru a putea fi eficente în detectarea si prevenirea infecțiilor nozocomiale, și anume:

promovarea principiului conform căruia, antibioticele trebuie să fie administrate rațional, ce vizează perioada suficientă de expunere și cantitatea dozării antibioticelor;

adoptarea și sporirea unor norme corespunzătoare de igienă, pentru scăderea transmiterii bacteriene (Darmstadt și colab., 2015);

Conform cercetărilor din domeniul microbiologiei medicale, cel mai cunoscut tip de biofilm regăsit în organismul uman este cel reprezentat de placa dentară. În structura acestui tip de biofilm, sunt incluse peste 300 de specii bacteriene, constituind un procent de aproximativ 60-70 % din cantitatea biofilmului, ancorate în matrice. Toate speciile din structura biofilmului plăcii dentare provin fie din mucoasa bucală, de pe suprafața dintelui, salivă, etc. Cei mai multi reprezentanți bacterieni prezenți în acest tip de biofilm sunt cei din genul Streptococcus, în special Streptococcus gordonii, prezent încă de la început pe suprafața dintelui, dar și Streptococcus mutans ce excretă glucani de tip insolubil ce favorizează invadarea suprafeței dentare (Lazăr, 2001). Pe lângă mediul propice oferit de speciile bacteriene, formarea plăcii dentare are loc și în funcție de anumiți factori, cum sunt pH-ul, atmosfera dar și nutrienții prezenți (Marsh și colab., 2006).

În afară de reprezentanții genului Streptococcus, în structura biofilmului se găsesc în cantități mari și specii facultativ anaerobe, precum Neisseria sp, Abiotrophia sp, Gemella sp.,Rothia sp dar și obligat anaerobe, ca de exemplu Prevotella sp., Fusobacterium sp., Porphyromonas sp. sau Capnocytophaga sp. (Takeshita și colab., 2015).

În procesul de formării a plăcii dentare, au implicații o serie de enzime, numite glucozil transferaze, și anume dextranzaharoza, mutansitetaza, care contribuie la păstrarea și multiplicarea cantității de glucan ce atrage diversele specii de microorganisme. Streptococcus salivarius se reproduce în prezența resturilor de provenianță alimentară, producând un sediment de culoare gălbuie, rezistent la diverse mecanisme fiziologică desfășurate în cavitatea bucală, exceptând periajul dentar (Lazăr, 2001).

Periajul regulat al dinților împiedică formarea biofilmului la suprafața acestuia, și mai mult, previne apariția cariilor, gingivitei și chiar a periodontitei. S-a demonstrat experimental că soluțiile ce conțin bicarbonatul de sodiu (NaHCO3) în concentrații de 62-67%, înlătură cu ușurință biofilmul dentar, și previne apariția acestor afecțiuni (Bosma și colab., 2018).

Etapele aderenței bacteriene, în contextul formării biofilmului plăcii dentare, au loc asemeni etapelor generale de aderență. În faza reversibilă de legare a microorganismelor la suprafața dentară, sunt prezente atracțiile de tip electrostatic ce favorizează aderarea proteinelor din compoziția salivei, pe suprafața minerală a dintelui. Între smalțul dentar și peliculă, acizii teicoici, din structura bacteriilor Gram negative, formează punți cu Ca2+. În etapa ireversibilă, fimbriile au un rol foarte important, deoarece ajută bacteriile să interacționeze cu receptorii specifici localizați atât pe dinte, cât și pe peliculă (Lazăr, 2001).

În urma condițiilor alterate de mediu din structura biofilmului, populația bacteriană se schimbă și se produce fenomenul de creștere a biomasei în urma înmulțirii microorganismelor atașate (Takeshita și colab., 2015).

Structura biofilmului se modifică în funcție de condițiile de mediu, adică sub influnța factorilor externi și interni. Agregatele de celule bacteriene sau celulele formate în urma multiplicării pot fi eliberate din structura biofilmului, ca urmare a acțiunii unor curenți sau prin procesul de quorum sensing (Fig. 18). O dată eliberate din biofilm, agregatele nu își modifică capacitatea de rezistență la antibiotice, preformată în cadrul biofilmului (Chifiriuc și colb., 2011).

Fig. 18. Dispersia celulelor bacteriene din biofilm (după Toyofuku și colb., 2015).

Quorum sensing reprezintă una dintre cele mai folosite strategii de controlare a afecțiunilor cauzate de bacteriile tolerante la acțiunea antibioticelor. S-a încercat, producerea diverșilor compuși naturali și sintetici, enzime sau anticorpi pentru a combate bolile cauzate de infecțiile cu bacterii rezistente la compuți antimicrobieni, atât la plante cât și la animale (Defoirdt, 2018).

Altfel spus, quorum sensing este o modalitate de comunicare prezentă la o gamă largă de specii bacteriene patogene, prin care poate fi controlată activitatea genelor implicate în procesele de virulență. Așadar, cercetătorii încearcă oprirea acestui sistem pentru a micșora numărul afecțiunilor provocate de aceste microorganisme. Experimentele realizate cu privire la acest fenomen, au dovedit la specia bacteriană Pseudomonas aeruginosa inactivarea acestui mecanism prin tratarea cu trans-anitol inhibă activitatea factorilor de virulență (Aydemir și colab., 2018)

Fiecare celulă excretă feromoni, denumiți ,,molecule de quorum sensing’’. Atunci câand se acumulează o cantitate, din acești feromoni, necesară pentru a atinge pragul, vor interacționa cu proteinele cu rol de receptori, denumite ,,senzor’’ (Fig. 19).

La bacteriile Gram negative, sistemul de comunicare este de tip HL sau homoserin-lactonă, în timp ce la bacteriile Gram pozitive, lucrurile stau altfel. De exemplu, la unele specii ale genului Streptomyces, se produc butanolide, cu rol în modularea sintezei de antibiotice și a unor metaboliți existenți în etapa staționară de creștere. Sistemul quorum sensing a fost observat cu ușurință la microorganismele luminiscente, ca de exemplu Photobacterium sp, Vibrio fischeri sau V. harveyi, prezente în speciile de moluște sau speciile de pești ce trăiesc la adâncimi mari (Chifiriuc și colab., 2011).

Fig. 19. Schema simplificată a procesului de quorum sensing (http://mmg-233-2014-genetics-genomics.wikia.com/wiki/Quorum_Sensing).

Explicând altfel procesul, o celulă are capacitatea de a simți câte celule sunt prezente în jurul său datorită unor molecule cu rol de semnal eliberate în mediu. Atunci când acestea depistează un anumit număr de celule în jurul lor, modulează o serie de procese celulare, procesul depinzând de densitatea genică. Pe lângă procesele de virulență, fenomenul de quorum sensing reglează și procese precum creștere sau motilitate. De asemenea, o celulă bacteriană prezintă mai multe sisteme de tip quorum sensing care pot interacționa între ele (Prajapat și Saini, 2018).

3. NANOPARTICULE

În prezent, se utilizează cu mare succes în cât mai multe domenii, structuri cu mărimi cuprinse între 1 și 100 nm, denumite nanoparticule (Schmalz și colb., 2017). În funcție de dimensiunea nanoparticulelor, de cele mai multe ori, acestea posedă proprietăți diferite (McQuillian, 2010). În domeniul microbiologiei generale, nanoparticulele sunt utilizate în special nanoparticulele ce sunt asociate cu diferiți ioni metalici, deoarece, în urma unor experimente, s-a dovedit faptul că acestea interferă cu diferite etape ale procesului de creștere și multipilcare bacteriană sau cu procese metabolice (Ahmed și colab., 2016). De exemplu, pentru inhibarea creșterii tulpinilor bacteriene Gram negative, s-a utilizat penicilină nano-scalată (Rout și colab., 2017).

Nanotehnologiile apelează la informațiile din toate domeniile stiințifice, cum ar fi biologie, chimie, fizică, inginerie și chiar științele vieții (Pathak și Thassu, 2009).

3.1. TIPURI DE NANOPARTICULE

Nanoparticulele metalice

Cele mai eficiente proprietăți antibacteriene sunt date de nanoparticulele metalice, în care sunt prezenți ioni de argint (Ag), aur (Au), cupru (Cu), fier (Fe), precum și nanoparticulele asociate cu diverși compuși, cum ar fi oxidul de zinc, de cupru, de titan sau oxidul de fier. Această capacitate antimicrobiană a nanoparticulelor este dată de numărul mare de liganzi de pe suprafața acestora ce interacționează cu numeroși receptori ai bacteriilor (Agarwal și colab., 2018). De asemenea, nanoparticulele asociate cu ioni metalici, au două proprietăți foarte importante, și anume, au capacitatea de a forma agregate în mediul biologic și au o stabilitate coloidală destul de mică (Oliveira și colab., 2017).

Nanoparticulele lipidice

Nanoparticulele lipidice au o toxicitate foarte redusă, au caracter biodegradabil și trec foarte ușor prin bariera hematoencefalică, datorită structurii sale lipidice, în detrimentul altor molecule sau organisme străine ce nu pot trece de acest nivel. Sunt ușor de utilizat în tratamentul cu diferite medicamente, nu numai pentru că trec ușor în sânge, ci și datorită faptului că au dimensiuni foarte mici (Shankar și colab., 2018).

Nanoparticule polimerice

Nanoparticulele polimerice sunt des folosite în industria farmaceutică pentru producerea de antibiotice, deoarece se consideră că au efectul antimicrobian cel mai puternic asupra creșterii bacteriene. Se consideră faptul că nanoparticulele polimerice au caracter multivalent, astfel, asociații de astfel de tipuri funcționale pot recunoaște o gamă foarte extinsă de celule. Nanoparticulele polimerice se regăsesc sub formă de micelii sau vezicule și sunt utilizate în medicină și în metodele de diagnosticare a unor afecțiuni (Lam și colab., 2018).

3.2. UTILIZĂRI ALE NANOPARTICULELOR

Bionanotehnologia este un domeniu științific, din ce în ce mai studiat și vizează împletirea a două mari domenii, cum sunt biologia și nanotehnologia (McQuillian, 2010). Nanoparticulele asociate cu ioni metalici prețioși, de tipul aurului, argintului sau platinei, sunt utilizate într-o gamă largă de procese, cum ar fi senzori de natură chimică sau biologică, materiale optice sau diverși catalizatori (Le-The și colab., 2018).

Interacțiunile nanoparticulelor cu speciile bacteriene este de cele mai multe ori toxică, ceea ce confirmă caracterul antimicrobian al acestora. Cu toate acestea, procesul de inhibiție a creșterii bacteriene este în curs de cercetare, ne cunoscându-se cu exactitate acest mecanism (McQuillian, 2010).

În ceea ce privește nanoparticulele asociate cu diferiți compuși chimici, s-a observat faptul că cele care conțin atât CuO, cât și Fe, posedă capacități antimicrobiene asupra biofilmelor bacteriene, speciilor patogene de microorganisme, dar și asupra fungilor. Sinteza acestor tipuri de nanoparticule se bazează pe acțiunea radiațiilor X și UV (Pugazhendhi și colab., 2018).

S-a descoperit experimental că biosinteza nanoparticulelor poate fi realizată cu ajutorul unui proces ecologic și rentabil, în care plantele fermentează în urma infectării acestora cu diferite celule bacteriene. În acest caz, s-a folosit specia fungală Aspergillus oryzae. Astfel, lichidul fermentat, în prezența razelor X, au manifestat capacitatea de a reduce nanoparticulele de seleniu, fenomenul fiind observat prin apariția unei culori roșii. Capacitatea de inhibiție a proceselor microbiene observată la nanoparticulele de seleniu a fost testată la speciile bacteriene ce erau rezistente la actiunea diverselor antibiotice. Speciile microbiene la care au fost testate aceste mecanisme au fost Acinetobacter calcoaceticus, Staphylococcus aureus, Candida albicans și Aspergillus flavus. Astfel de nanoparticule pot fi utilizate cu succes în industria cosmetică, farmaceutică și în special în industria alimentară (Mosallam și colab., 2018).

De asemenea, se pot produce o serie de substanțe cu scop bactericid, utilizate pentru dezinfectarea canalelor prin care trec deșeurile fecale. Astfel, a fost testată activitatea antibacteriană a unor compuși pe bază de nanoparticule funcționalizate cu ioni de argint (Ag) asupra unor celule bacteriene de Enterococcus faecalis, și s-a dovedit efectul bactericid asupra acestor specii microbiene (Halkai și colab., 2018).

Funcția antimicrobiană a nanoparticulelor funcționalizate cu ioni de Ag, se datorează faptului că suprafața de contact a lor cu bacteriile este foarte mare. Nanoparticulele funcționalizate cu ioni de Ag au și alte aplicații, cum ar fi absorbția energiei provenite de la soare sau pot avea rolul de catalizatori în diferite reacții chimice (El-Naggar și colab., 2018).

Yoshikawa și colaboratorii au obținut experimental un vaccin pe bază de nanoparticule asociate cu acidul poliglutamic, eficient în combaterea cancerului. Ulterior, Goyal și echipa sa de cercetători au reușit să sintetizeze diferite seruri ce conțineau nanoparticule de hidroxiapatită tratate cu celobioză sau trehaloză, adsorbite pe albumină serica bovină (BSA). Acest ser, injectat în organisme mamaliene, declanșează sinteza de celule T-helper, și astfel, stimulează răspunsul imun. Alte nanoparticule pot fi asociate cu lipide și adăugate în compoziția unor medicamente. Altele pot fi înglobate în hidrogeluri, servind ca tratamente pentru diverse afecțiuni (Pathakk și Thassu, 2009).

De asemenea, nanoparticulele funcționalizate cu oxid de fier, inhalate de către organismul uman, pot provoca afecțiuni grave, cum sunt abolirea proceselor de migrare si diferențiere celulară (Soenen și colab., 2010).

Nanoparticulele sunt utilizate și în diferite aplicații termice. Astfel, în cadrul centralelor ce transformă energia solară în energie termică, aceste particule de ordinul nanometrilor au rol în creșterea temperaturii de topire a unor săruri utilizate în aceste procese. Alte utilizări sunt reprezentate de denomenul de absorbție a nitriților de pe diferite suprafețe (Mondragon și colab., 2018).

Proprietățile nanoparticulelor de a trece foarte ușor în bariera hemato-encefalică, au trezit interesul multor cercetători pentru producerea unor medicamente, menite să trateze boli neurodegenerative, precum Parkinson. Așadar, au fost testate o serie de nanoparticule funcționalizate cu oxid de cesiu și s-a constatat că acestea inhibă activitatea α-sinucleinei, a cărei activitate procoacă boala Parkinson (Kaushika și colab., 2018).

PARTEA A II-A

INTRODUCERE

În zilele noastre, hidroxiapatita devine un compus din ce în ce mai utilizat pentru inhibarea creșterii bacteriene. Acesta este folosit sub formă de nanoparticule, atât simplu, cât și dopat cu diverși ioni metalici, ca de exemplu cu Fe, Ag, Mn, Ti, Co, (Pandey și colab., 2018), asociat și cu o gamă largă de uleiuri volatile, cum ar fi cel de busuioc sau lavandă, recunoscute pentru proprietățile sale antimicrobiene (Predoi și colab., 2018).

De asemenea, hidroxiapatita poate fi funcționalizată și cu antibiotic. Studii recente au arătat faptul că hidroxiapatita, un compus bioactive, în combinație cu ciprofloxacina, antibiotic destul de puternic, au o activitate puternic antibacteriană (Ciocilteu și colab., 2018).

Pe langă efectele sale puternic antimicrobiene, complexul reprezentat de hidroxiapatită-cobalt (HAP Co) are un rol important și în procesele de regenerare a țesuturilor osoase (Kulanthaivel și colab., 2016).

Scop: Evaluarea efectului antimicrobian al unor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu ioni metalici (Fe, Co, Mn, Sn);

Obiective

Evaluarea calitativă a efectului antimicrobian al unor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu ioni metalici (Fe, Co, Mn, Sn);

Evaluarea cantitativă a efectului antimicrobian și antiaderență al acestor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) prin determinarea valorilor concentrației minime inhibitorii (CMI) și a valorilor concentrației minime de eradicare a biofilmului (CMEB).

5. MATERIALE ȘI METODE

Speciile bacteriene utilizate în experiment au fost:

Compușii cu efecte antimicrobiene oferiți spre testare au fost suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu ioni metalici:

Evaluarea calitativă a proprietăților antimicrobiene

În procesul de examinare calitativă au fost utilizate suspensii microbiene cu densitate standard Mc Farland 0.5 (1.5 x 108 CFU/ml), obținută, din culturi bacteriene și levurice de 24-48 h. Mediile în care au fost cultivate speciile, înainte de realizarea suspensiilor în apă fiziologică sterilă (AFS) au fost medii cu bulion nutritiv (NA) pentru speciile bacteriene, dar și mediu YPG pentru specia de levură. Suspensiile bacteriene bacteriene au fost inoculate la suprafața mediu Muller Hinton agarizat, respectiv YPG agarizat, turnat în placă Petri, prin metoda însămâțării în pânză. În fiecare placă Petri s-a inoculat, în picătură, un volum de 10 µl de compus, la concentrație 50 mg/ml. Următoarea etapă a fost de plasare a plăcilor de lucru la incubator, la o temperatură de 370 C, pe o durata de 24-48 h. Efectele antimicrobiene pozitive au fost date de prezența unui halou, considerat o zonă de inhibiție a creșterii microorganismelor.

Evaluarea cantitativă a proprietăților antimicrobiene

A doua etapă a experimentului a fost reprezentat de realizarea unor microdiluții binare ale compușilor testați, în vederea determinării valorilor concentrației minime inhibitorii (CMI) și valorilor concentrației minime de eradicare a biofilmului (CMEB), utilizând metoda microdiluțiilor, în plăci de 96 de godeuri, într-un volum final de 150 µl de bulion nutritiv, inoculta cu 15 µl de suspensie bacteriană de 107 CFU/ml. Analiza cantitativă a fost efectuată în mediul de bulion YPG pentru drojdii și bulionul Muller Hinton pentru bacterii, în conformitate cu Standardul de performanță pentru testarea sensibilității antimicrobiene (CLSI, 2017) și Metoda de referință pentru testarea sensibilității la antifungice, Standardul aprobat (document NCCLS M29). Plăcile au fost ulterior incubate la 370 C, pe o durata de 24-48 h, și valorile CMI au fost stabilite prin analiză cu ochiul liber și măsurarea spectrofotometrică (Abs 620nm). Fiecare experiment a fost efectuat în triplicat și repetat în cel puțin trei ocazii diferite.

Evaluarea cantitativă a proprietăților antiaderente

Plăcile din plastic de 96 plăci cu mai multe godeuri conținând diluții binare ale compușilor testați, într-un volum final de 150 µl au fost inoculate cu 15 µl suspensii microbiene de 107 CFU / ml preparate în soluție salină sterilă și inoculate și incubate timp de 24 de ore la 37 ° C. Ulterior, conținutul godeurilor a fost aruncat, godeurile au fost spălate de trei ori cu PBS și celulele bacteriene aderate la godeurile de plastic, au fost fixate cu metanol rece timp de 5 minute, colorate cu soluție de cristal violet 1% timp de 15 minute și apoi re-suspendate cu 33% acid acetic soluție (figura 20). Evaluarea efectului anti-aderență s-a realizat prin citirea absorbanței suspensiilor colorate la 490nm, utilizând spectrofotometrul BIOTEK SYNERGY-HTX ELISA, valorile obținute fiind proporționale cu numărul celulelor microbiene aderente.

Fig. 20. Etapa de tratare cu violet de gențiană 1%, sub hotă.

6. REZULTATE ȘI DISCUȚII

Obiectiv 1. Evaluarea calitativă a efectului antimicrobian al unor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu ioni metalici (Fe, Co, Mn, Sn)

În urma testării efectului inhibitorii a fiecărui compus testat asupra creșterii și dezvoltării tulpinilor microbiene de referință, s-au obținut următoarele valori ale zonelor de imnhibiție a creșterii :

Tabelul 3. Diametrele zonei de inhibiție pentru fiecare specie testate, exprimată în mm.

În urma datelor obținute, se poate observa că efectul inhibitor cel mai ridicat a fost dat de combinația HAP Co. Acesta a determinat cel mai mare diametrul al zonei de inhibiție, și anume 20 mm la tulpina standard S. aureus, 18 mm la B. cereus și la P. aeruginosa, 16 mm la E.coli și 15 mm la tulpina de C. albicans. Complexul HAP Fe a determinat un diametru de inhibiție mult mai mic, față de HAP Co, având acțiune antimicrobiană doar față de Bacillus cereus și Candida albicans. HAP Mn a prezentat un grad foarte mic de inhibiție doar asupra tulpinii Candida albicans, cu un diametru de 10 mm.

Complexul HAP Sn nu a determinat nici un diametru de inhibiție asupra nici unei tulpini microbiene, deoarece diametrul de inhibiție a acestuia asupra speciilor a fost de 0 mm.

În figura 21. (21a, 21b, 21c, 21d și 21e) se pot observa imagini cu placile Petri în care au fost inoculate tulpinile bacteriene și tratate fiecare cu cei 4 compuși antimicrobieni. La unele specii, se pot observa cu ochiul liber zonele de inhibiție a creșterii bacteriene, reprezentate de dimensiunea mărită a haloului, în timp ce la altele se observă o zonă foarte mică de inhibiție a creșterii sau chiar absentă.

a. b.

c.

d. e.

Fig. 21. Rezultatele inhibiției fiecărei specii : Staphylococcus aureus ATCC 25923 (21a), Bacillus cerereus B1079 (21b), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (21c), Escherichia coli ATCC 25722 (21d), Candida albicans ATCC 10231 (21e).

Obiectiv 2. Evaluarea cantitativă a efectului antimicrobian și antiaderent al acestor suspensii de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) prin determinarea valorilor concentrației minime inhibitorii (CMI) și a valorilor concentrației minime de eradicare a biofilmului (CMEB).

În etapa următoare, și anume în cea în care s-a utilizat metoda microdiluțiilor în plăcuțe cu 96 de godeuri, s-a determinat concentrația minimă inhibitorie a suspensiilor de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) testate, cu efecte antimicrobiene asupra tulpinilor microbiene de referință.

Tabel 4.Valorile concentrației minime inhibitorii pentru fiecare specie microbiană de referință.

Se poate observa că valorile concentrației minime inhibitorii (C.M.I.) sunt diferite în funcție de tulpină și de compusul testat. Concentrația minimă inhibitorie este caracterizată de efectul bacteriostatic, deoarece nu determină moartea celulei, precum concentrația minimă bactericidă, ci determină doar inhibarea creșterii și multiplicării bacteriene (Chifiriuc și colab., 2011).

În tabelul 4 sunt indicate valorile concentrației minime inhibitorii pentru fiecare specie microbiană studiată. Astfel, se observă faptul că cel mai puternic efect antimicrobian a fost dat de complexul format din hidroxiapatită-Co (HAP Co), în detrimentul celorlaltor tipuri de complexe antimicrobiene utilizate, valorile inhibitorii fiind cuprinse între 0.078125 mg/ml (la Pseudomonas aeruginosa) ajungând până la o concentrație de 0.625 mg/ml (la Bacillus cereus și Candida albicans). În afară de HAP Co, HAP Mn a fost al doilea complex ce a determinat inhibarea creșterii bacteriene, dar la o singură specie din cele de referință, și anume, la Candida albicans, concentrația inhibitorie fiind de 1.25 mg/ml. Celelalte tipuri de compuși testați au avut valori ale concentrației minime inhibitorii mai mari de 5 mg/ml. Aceste rezultate au fost reprezentate și sub formă de grafice, pentru fiecare specie în parte (Fig. 22a, 22b, 22c, 22d și 22e).

Fig. 22a. Reprezentarea grafică a variației concentrațiilor minime inhibitorii citite la spectrofotometru la absorbanța de 620 nm pentru Staphylococcus aureus ATCC 25923.

Fig. 22b. Reprezentarea grafică a variației concentrațiilor minime inhibitorii citite la spectrofotometru la absorbanța de 620 nm pentru Bacillus cereus B1079.

Fig. 22c. Reprezentarea grafică a variației concentrațiilor minime inhibitorii citite la spectrofotometru la absorbanța de 620 nm pentru Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

Fig. 22d. Reprezentarea grafică a variației concentrațiilor minime inhibitorii citite la spectrofotometru la absorbanța de 620 nm pentru Escherichia coli ATCC 25922.

Fig. 22e. Reprezentarea grafică a variației concentrațiilor minime inhibitorii citite la spectrofotometru la absorbanța de 620 nm pentru Candida albicans ATCC 10231.

Biofilmele reprezintă o asociație de microorganism aderate ireversibil la nivelul unui substrat și care sunt incorporate într-o matrice polizaharidică produsă chiar de acestea (Donland și Costerton, 2002). Biofilmele se leaga la nivelul substratului prin procesul de aderență bacteriană, proces mediat de structuri numite adezine (Chifiriuc și colab., 2011).

În experimentul realizat în cadrul lucrării de față, colorarea celulelor microbiene aderate la pereții godeurilor de plastic si reluarea acestora în soluție de acid acetic 33% a permis evaluarea capacității de a dezvolta biofilm la suprafațe abitoce a tulpinilor microbiene luate în studiu, în prezența concentrațiilor inhibitorii și subinhibitorii ale suspensiilor de nanoparticule de HAP testate (figurile 23a, 23b, 23c). Interpretarea rezultatelor în vederea determinării valorilor CMEB s-a realizat prin determinarea spectrofotometrică a densității optice a suspensiilor din godeuri, la lungimea de undă de 490 nm.

Fig.23a. Aspectul biofilmelor de Pseudomonas aeruginosa și Bacillus cereus după colorarea cu violet de gențiană 1% pregatit pentru citirea la spectrofotometru.

Fig. 23b. Aspectul biofilmelor de Staphylococcus aureus și Escherichia coli, după colorarea cu violet de gențiană 1%, pregatit pentru citirea la spectrofotometru.

Fig. 23c. Aspectul biofilmelor de Candida albicans, după colorarea cu violet de gențiană 1%, pregatit pentru citirea la spectrofotometru.

Valorile concentrației minime de eradicare a biofilmelor pentru tulpinile microbiene de referință utilizate în experiment au fost introduce în tabelul de mai jos, ceea ce a permis un studio comparative al acestor valori în funcție de tulpina microbiană testate și de suspensia de nanoparticule pe bază de HAP (Tabelul 5 ).

Tabel 5. Valorile concentrației minime inhibitorii în cadrul biofilmelor speciilor de referință.

În urma rezultatelor, se poate observa faptul ca și de această data, compusul reprezentat de combinația hidroxiapatită-Co (HAP Co) a prezentat activitate inhibitorie asupra tuturor tulpinilor de cercetat, oscilând în jurul valorilor de concentrație de 0.078125 mg/ml și 0.3125 mg/ml. De această dată, spre deosebire de valorile concentrațiilor din figura 4, se poate observa faptul că, pe lângă HAP Mn, și celelalte două complexe antimicrobiene au desfășurat activitate inhibitorie asupra speciilor de referință, chiar dacă la valori mai mici. Astfel, HAP Sn și HAP Fe a inhibat creșterea speciei bacteriene Staphylococcus aureus, cu o concentrație mai mica de această data, în timp ce la celelalte specii, valoarea concentrației a fost mai mare sau egala cu 5 mg/ml. Consider că spectrul mai larg de acțiune a compușilor microbieni asupra biofilmelor s-a fost datorat faptului că celulele prezente în aceste asociații microbiene au fost în numar mai redus decât în prima etapă, înainte de spălarea plăcuțelor cu godeuri. Aceleași rezultate au fost reprezentate grafic, pentru fiecare specie în parte (figurile 24a, 24b, 24c, 24d, 24e).

Fig. 24a. Reprezentarea grafică a variației concentrației minime inhibitorii de eradicare a biofilmelor, citite la spectrofotometru, a unei suspensii de Staphylococcus aureus ATCC 25923, tratată cu violet de gențiană 1%.

Fig. 24b. Reprezentarea grafică a variației concentrației minime inhibitorii de eradicare a biofilmelor, citite la spectrofotometru, a unei suspensii de Bacillus cereus B1079, tratată cu violet de gențiană 1%.

Fig. 24c. Reprezentarea grafică a variației concentrației minime inhibitorii de eradicare a biofilmelor, citite la spectrofotometru, a unei suspensii de Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, tratată cu violet de gențiană 1%.

Fig. 24d. Reprezentarea grafică a variației concentrației minime inhibitorii de eradicare a biofilmelor, citite la spectrofotometru, a unei suspensii de Escherichia coli ATCC 25922, tratată cu violet de gențiană 1%.

Fig. 24e. Reprezentarea grafică a variației concentrației minime inhibitorii de eradicare a biofilmelor, citite la spectrofotometru, a unei suspensii de Candida albicans ATCC 10231, tratată cu violet de gențiană 1%.

Acest lucru poate fi posibil chiar dacă biofilmele nu prezintă o sensibilitate prea ridicată la anumite substanțe antimicrobiene (Chifiriuc și colab., 2011). Activitatea antibacteriană a diferitelor hidroxiapatite dopate cu ioni (Fe, Cu, Zn, Ag) a fost testată, în cadrul altor experimente realizate de echipe de cercetători din întreaga lume, atât împotriva tulpinilor gram pozitive (S. aureus, Micrococcus luteus) (Tank,și colab., 2013) cât și a tulpinilor Gram negative (P. aeruginosa, Escherichia coli și Shigella flexneri) (Stânila și colab., 2011; Predoi și colab., 2017). De asemenea, studiile anterioare au demonstrat utilizarea ionilor Co (II) ca agent antibacterian și antiviral în diferite complexe organice (Kolmas și colab., 2014; Singh și colab., 2012).

4. CONCLUZII

Suspensia de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu Co a determinat cel mai mare diametrul al zonei de inhibiție, și anume 20 mm la tulpina standard S. aureus, 18 mm la B. cereus și la P. aeruginosa, 16 mm la E.coli și 15 mm la tulpina de C. albicans.

Valorile concentrația minimă inhibitorie (C.M.I.) sunt diferite de în funcție de tulpină și de compus testat. Cel mai eficient compus testat a fost, de asemenea, suspensia de nanoparticule pe bază de hidroxiapatită (HAP) dopate cu Co, valorile CMI fiind cuprinse între 0.078125 mg/ml (la Pseudomonas aeruginosa), ajungând până la o concentrație de 0.625 mg/ml (la Bacillus cereus și Candida albicans).

Valorile concentrației minime de eradicare a biofilmelor pentru tulpinile microbiene de referință au oscilat între 0.078125 mg/ml și 0.3125 mg/ml pentru majoritatea suspensiilor de nanoparticule testate.

Rezultatele obținute sugerează posibilitatea utilizării ionilor Co (II) în pricipal, dar și a ionilor de Mn, Fe, ca posibili agenit antimicrobieni, în diferite complexe organice.

BIBLIOGRAFIE

Abraham S. N. , Sharon N., Ofek I., Schwartzman J. D., 2015. Adhesion and Colonization. Molecular Medical Microbiology (Second Edition) , Pages 409–421. Volume 1.

Agarwal H., Menon S., Kumar S. V., Rajeshkumar S., 25 April 2018. Mechanistic study on antibacterial action of zinc oxide nanoparticles synthesized using green route. Chemico-Biological Interactions. Volume 286, Pages 60-70.

Ahmed K. B. A., Raman T., Veerappan A., 1 November 2016. Future prospects of antibacterial metal nanoparticles as enzyme inhibitor. Materials Science and Engineering: Volume 68, Pages 939-947.

Almatroudi A., Tahir S., Hu H. et al. February 2018. Staphylococcus aureus dry-surface biofilms are more resistant to heat treatment than traditional hydrated biofilms. Journal of Hospital Infection. Volume 98, Issue 2, Pages 161-167.

Aydemir D. H., Çifçi G, Aviyente V, Boșgelmez-Tinaz G., 2018. Quorum sensing inhibitor potential of trans-anethole aganist Pseudomonas aeruginosa. J Appl Microbiol. doi: 10.1111/jam.13892. PubMed PMID: 29694695.

Barbercheck CR, Bullitt E, Andersson M., 2018. Bacterial Adhesion Pili. Subcell Biochem;87:1-18. doi: 10.1007/978-981-10-7757-9_1. PubMed PMID: 29464555.

Beachey EH. 1981. Bacterial adherence: adhesin-receptor interactions mediating the attachment of bacteria to mucosal surface. J Infect Dis. Mar;143(3):325-45. Review. PubMed PMID: 7014727.

Bencina M., Mavric T., Junkar I., et al. 1 June 2018. The Importance of Antibacterial Surfaces in Biomedical Applications. Advances in Biomembranes and Lipid Self-Assembly.

Bosma M. L., Milleman K. R. Et al. , 04 June 2018. A randomised controlled trial to evaluate the plaque removal efficacy of sodium bicarbonate dentifrices in a single brushing clinical model. Nature.

Buckley D.C., 2017. Filler A. Fibroblasts and Fibroblast-like Synoviocytes. Kelley and Firestein's Textbook of Rheumatology (Tenth Edition), Pages 231–249.e4.Volume 1.

Cabal B., Alou L., Cafini F. et al. 25 June 2014. A New Biocompatible and Antibacterial Phosphate Free Glass-Ceramic for Medical Applications. Nature.

Chen Y., Shan X., Zhao J., Han X., Tian S., Chen F., Su X., Sun F., Huang L., Grundmann H., Wang H., Han L. 21 November 2017. Predicting nosocomial lower respiratory tract infections by a risk index based system. Nature.

Chifiriuc C. M., Mihăescu G., Lazăr V., 2011. Microbiologie și virusologie medicală. Ed. I. Pag. 88-99.

Ciocilteu MV, Mocanu AG, Mocanu A, Ducu C, Nicolaescu OE, Manda VC, Turcu-Stiolica A, Nicolicescu C, Melinte R, Balasoiu M, Croitoru O, Neamtu J., 2018. Hydroxyapatite-ciprofloxacin delivery system: Synthesis, characterisation and antibacterial activity. Acta Pharm.;68(2):129-144. doi:10.2478/acph-2018-0011. PubMed PMID: 29702474.

Darmstadt GL, Marchant T, Claeson M, Brown W, Morris S, Donnay F, Taylor M, Ferguson R, Voller S, Teela KC, Makowiecka K, Hill Z, Mangham-Jefferies L, Avan B, Spicer N, Engmann C, Twum-Danso N, Somers K, Kraushaar D, Schellenberg J., 2013. A strategy for reducing maternal and newborn deaths by 2015 and beyond. BMC Pregnancy Childbirth;13:216. doi: 10.1186/1471-2393-13-216. PubMed PMID: 24261785; PubMed Central PMCID: PMC3866510.

Defroidt T., April 2018. Quorum-Sensing Systems as Targets for Antivirulence Therapy. Trends in Microbiology. Volume 26, Issue 4, Pages 313-328.

Donlan RM, Costerton JW., 2002. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clin Microbiol Rev.;15(2):167-93. Review. PubMed PMID:11932229; PubMed Central PMCID: PMC118068.

El-Naggar Noura El-Ahmady, Hussein Mervat H., El-Sawah Asmaa Atallah. 2018. Phycobiliprotein-mediated synthesis of biogenic silver nanoparticles, characterization, in vitro and in vivo assessment of anticancer activities. Nature.

Esteban J., Pérez-Tanoira R., Pérez-Jorge-Peremarch C. Gómez-Barrena E., 2014. Bacterial Adherence to Biomaterials Used in Surgical Procedures. Microbiology for Surgical Infections Diagnosis, Prognosis and Treatment, Pages 41–57.

Ferraris S, Spriano S., 2015. Antibacterial titanium surfaces for medical implants. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016 Apr 1;61:965-78. doi:10.1016/j.msec.2015.12.062. Review. PubMed PMID: 26838926.

Halkai KR, Mudda JA, Shivanna V, Rathod V, Halkai R., 2018. Antibacterial Efficacy of Biosynthesized Silver Nanoparticles against Enterococcus faecalis Biofilm: An in vitro Study. Contemp Clin Dent;9(2):237-241. doi:10.4103/ccd.ccd_828_17. PubMed PMID: 29875567; PubMed Central PMCID: PMC5968689.

Heß N., Waldow F., Kohler P. T., 2017. Lipoteichoic acid deficiency permits normal growth but impairs virulence of Streptococcus pneumoniae. Nature.

Hogg N., 1988. Integrins. Encyclopedia of Immunology (Second Edition), Pages 1404–1409.

Jahed Z., Shams H., Mohammad M. M., Mofrad R.K., 2014. Mechanotransduction Pathways Linking the Extracellular Matrix to the Nucleus. International Review of Cell and Molecular Biology. Volume 310, Pages 171-220.

Kaushik AC, Bharadwaj S, Kumar S, Wei DQ., 2018. Nano-particle mediated inhibition of Parkinson's disease using computational biology approach.;8(1):9169. doi: 10.1038/s41598-018-27580-1. PubMed PMID: 29907754.

Klemm P., Schembri M. A., 2000. Fimbriae assisted bacterial surface display of heterologous peptides. International Journal of Medical Microbiology.Volume 290, Issue 3, Pages 215-221.

Kolmas J, Groszyk E, Kwiatkowska-Różycka D., 2014. Substituted Hydroxyapatites with Antibacterial Properties. BioMed Research International; 2014:178123. doi:10.1155/2014/178123.

Kulanthaivel S, Roy B, Agarwal T, Giri S, Pramanik K, Pal K, Ray SS, Maiti TK, Banerjee I., 2015. Cobalt doped proangiogenic hydroxyapatite for bone tissue engineering application. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016 Jan 1;58:648-58. doi:10.1016/j.msec.2015.08.052. PubMed PMID: 26478356.

Lam Shu J., Wong Edgar H.H., Boyer Cyrille, Qiao Greg G., 2018. Antimicrobial polymeric nanoparticles. Progress in Polymer Science. Volume 76, Pages 40-64.

Lazăr V., 2001. Microbiologie medicală. Pag. 47-74.

Le-The H., Berenschot E., Tiggelaar R. M., Tas N. R., van den Berg A., Eijkel J. C. T., 2018. Large-scale fabrication of highly ordered sub-20 nm noble metal nanoparticles on silica substrates without metallic adhesion layers. Nature.

Liu Y., Wen J., Gao Y., et al., 2018. Antibacterial graphene oxide coatings on polymer substrate. Applied Surface Science. Volume 436, Pages 624-630.

Loza-Correa M., Ramírez-Arcos S.., 2017. Detection of bacterial adherence and biofilm formation on medical surfaces. Biofilms and Implantable Medical Devices. Infection and Control, Pages 181–193.

Macia M. D., Pozo J. L., Diez-Aguillar M., Guinea J., 2018. Microbiological diagnosis of biofilm-related infectionsDiagnóstico microbiológico de las infecciones relacionadas con la formación de biopelículas. Enfermedades infecciosas y microbiologia clinica (English ed.) Volume 36, Issue 6, Pages 375-381.

Marsh EB, Freeman JM, Kossoff EH, Vining EP, Rubenstein JE, Pyzik PL, Hemingway C., 2006. The outcome of children with intractable seizures: a 3- to 6-year follow-up of 67 children who remained on the ketogenic diet less than one year. Epilepsia;47(2):425-30. PubMed PMID: 16499771.

Marshall S., 1971. Connubial cancer: coincidence vs contagion. JAMA.;218(12):1831-2. PubMed PMID: 5171454.

McQuillian J.., 2010. Bacterial Nanoparticle Interactions. Pag. 22-27.

Mondragón Rosa, Juliá J. Enrique, Cabedo Luis, Navarrete Nuria., 2018. On the relationship between the specific heat enhancement of salt-based nanofluids and the ionic exchange capacity of nanoparticles. Nature.

Moriarty T.F., Poulsson A.H.C., Rochford E.T.J. , Richards R.G., 2017. Bacterial Adhesion and Biomaterial Surfaces. Reference Module in Materials Science and Materials Engineering Comprehensive Biomaterials II, Pages 101–129. Volume 4.

Mortezaei N., Singh B., Bullitt E. et al., 2013. P-fimbriae in the presence of anti-PapA antibodies: new insight of antibodies action against pathogens. Nature.

Mosallam FM, El-Sayyad GS, Fathy RM, El-Batal AI., 2018. Biomolecules-mediated synthesis of selenium nanoparticles using Aspergillus oryzae fermented Lupin extract and gamma radiation for hindering the growth of some multidrug-resistant bacteria and pathogenic fungi. Microb Pathog.;122:108-116. doi: 10.1016/j.micpath.2018.06.013. PubMed PMID: 29894810.

Mousa S. A., Davis P. J., 2017. Integrin Antagonists and Angiogenesis. Anti-Angiogenesis Strategies in Cancer Therapeutics, Pages 99–123.

Nizet V, Esko JD. Bacterial and Viral Infections. In: Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, Hart GW, Etzler ME, editors., 2009. Essentials of Glycobiology. 2nd edition. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press. Chapter 39. PubMed PMID: 20301271.

Nowrouzian F., Hesselmar B., Saalman R. Et al., 2003. Escherichia coli in Infants' Intestinal Microflora: Colonization Rate, Strain Turnover, and Virulence Gene Carriage. Nature.

Oliveira J. F. A., Saito A., Bido A. T., Kobarg J., Stassen H.K., Cardoso M. B., 2017. Defeating Bacterial Resistance and Preventing Mammalian Cells Toxicity Through Rational Design of Antibiotic-Functionalized Nanoparticles. Nature.

Pandey A, Midha S, Sharma RK, Maurya R, Nigam VK, Ghosh S, Balani K., 2018. Antioxidant and antibacterial hydroxyapatite-based biocomposite for orthopedic applications. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2018 Jul 1;88:13-24. doi:10.1016/j.msec.2018.02.014. PubMed PMID: 29636127.

Pandolfi F., Franza L., Altamura S., et al., 2017. Integrating the Biology and Therapy of Cell–cell Interactions. Clinical Therapeutics. Volume 39, Issue 12, Pages 2420-2436.

Pathak Y., Thassu D., 2009. Drug Delivery Nanoparticles Formulation and Characterization. Pag 1-7.

Peters E. J., 2012. The effect of environmental conditions on Salmonella fimbriae and biofilm formation. pag. 2-4.

Prajapat M.K., Saini S., 2018. Logic of two antagonizing intra-species quorum sensing systems in bacteria. Biosystems.Volume 165, Pages 88-98.

Predoi D, Iconaru SL, Buton N, Badea ML, Marutescu L., 2018. Antimicrobial Activity of New Materials Based on Lavender and Basil Essential Oils and Hydroxyapatite. Nanomaterials (Basel);8(5). pii: E291. doi: 10.3390/nano8050291. PubMed PMID: 29710862; PubMed Central PMCID: PMC5977305.

Predoi D, Iconaru SL, Deniaud A, et al., 2017. Textural, Structural and Biological Evaluation of Hydroxyapatite Doped with Zinc at Low Concentrations. Fey T, ed. Materials;10(3):229. doi:10.3390/ma10030229.

Pugazhendhi A, Kumar SS, Manikandan M, Saravanan M., 2018. Photocatalytic properties and antimicrobial efficacy of Fe doped CuO nanoparticles against the pathogenic bacteria and fungi. Microb Pathog;122:84-89. doi: 10.1016/j.micpath.2018.06.016. PubMed PMID: 29894807.

Rikitake Y., Takai Y., 2011. Directional Cell Migration : Regulation by Small G Proteins, Nectin-like Molecule-5, and Afadin. International Review of Cell and Molecular Biology. Volume 287, Pages 97-143.

Rittmann B. E., 2018. Biofilms, active substrata, and me. Water Research. Volume 132, Pages 135-145.

Rout B., Liu C.H., Wu W.C., 2017. Photosensitizer in lipid nanoparticle: a nano-scaled approach to antibacterial function. Nature.

Schmalz A., Hickel R., van Landuy K. L., Reichl F.X., 2017. Nanoparticles in dentistry. Dental Materials. Volume 33, Issue 11, Pages 1298-1314.

Shankar R, Joshi M, Pathak K., 2018. Lipid Nanoparticles: A novel approach for brain targeting. Pharm Nanotechnol. doi:10.2174/2211738506666180611100416. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 29886842.

Shattil S. J., Kim C. Ginsberg M. H., 2010. The final steps of integrin activation: the end game. Nature.

Singh K, Kumar Y, Puri P, Sharma C, Aneja KR., 2012. Thermal, spectral, fluorescence, and antimicrobial studies of cobalt, nickel, copper, and zinc complexes derived from 4-[(5-bromo-thiophen-2-ylmethylene)-amino]-3-mercapto-6-methyl-5-oxo-[1,2,4]triazine. International Journal of Inorganic Chemistry;2012: 9 pages.873232.

Soenen SJ, Nuytten N, De Meyer SF, De Smedt SC, De Cuyper M., 2010. High intracellular iron oxide nanoparticle concentrations affect cellular cytoskeleton and focal adhesion kinase-mediated signaling. Small;6(7):832-42. doi:10.1002/smll.200902084. PubMed PMID: 20213651.

Stansfield W. E., Ranek M., Pendse A. Et al., 2014. The Pathophysiology of Cardiac Hypertrophy and Heart Failure. Cellular and Molecular Pathobiology of Cardiovascular Disease, Pages 51–78.

Stânila A, Braicu C, Stânila S, Pop RM., 2011. Antibacterial activity of copper and cobalt amino acids complexes. Notulae Botanicae Horti Agrobotanici Cluj-Napoca;39(2):124–129.

Takeshita T., Yasui M., Shibata Y. Et al., 2015. Dental plaque development on a hydroxyapatite disk in young adults observed by using a barcoded pyrosequencing approach. Nature.

Tank KP, Chudasama KS, Thaker VS, Joshi MJ., 2013. Cobalt-doped nanohydroxyapatite: synthesis, characterization, antimicrobial and hemolytic studies. Journal of Nanoparticle Research.; 15:1644–1655.

Vizcarra I. A. , Hosseini V., Kollmannsberger P., et al ., 2016. How type 1 fimbriae help Escherichia coli to evade extracellular antibiotics. Nature.

Wang L., Li Y., Zhu M., Zhu X., Qian C., Wenwei L., 2018. Responses of biofilm microorganisms from moving bed biofilm reactor to antibiotics exposure: Protective role of extracellular polymeric substances. Bioresource Technology. Volume 254, Pages 268-277.

Wen Z., Zhang J. R., 2015. Bacterial Capsules. Molecular Medical Microbiology (Second Edition), Pages 33–53. Volume 1.

http://www.bacteriainphotos.com/bacterial-biofilm.html#

http://mmg-233-2014-genetics-genomics.wikia.com/wiki/Quorum_Sensing

https://www.researchgate.net/figure/Environmental-factors-that-shape-biofilm-formations-Notes-The-image-shows-biofilm_fig1_279308459

http://www.saptamanamedicala.ro/articole/Infectiile-in-sectiile-de-terapie-intensiva–un-risc-in-plus-pentru-pacientul-critic.html

http://patomaniacosfls.blogspot.com/2010/04/biofilmes-sociedade-bacteriana.html

http://studydroid.com/index.php?page=viewPack&packId=402681

Teichoic Acid: Structure, Types, and Functions

https://www.shutterstock.com/es/image-illustration/bacteria-difference-grampositive-gramnegative-bacterial-224095714

http://www.scrigroup.com/educatie/biologie/Glicocalixul-comportamental14136.php

https://www.sciencesource.com/archive/Bacterial-Capsules–LM-SS2520634.html

https://www.quora.com/What-is-the-function-of-bacterial-fimbriae

https://www.cs.montana.edu/webworks/projects/stevesbook2/contents/chapters/chapter002/section002/blue/page001.html

http://textbookofbacteriology.net/pathogenesis_2.html

https://www.researchgate.net/figure/llustration-of-the-two-stages-of-bacterial-adhesion-Reprinted-with-permission-from-J-A_fig7_236145418

http://www.scritub.com/biologie/Factorii-de-patogenitate-ai-ba74834.php