Evaluarea Compozitiei Microbiotei Normale Si Rolul Acesteia în Mentinerea Homeostaziei la Nivelul Tractului Genital

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator științific

Lector dr. DIȚU Lia-Mara

Absolvent

ZLOTU Oana

-2016-

UNIVERSITATEA DIN BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENȚĂ

Evaluarea compoziției microbiotei normale și rolul acesteia în menținerea homeostaziei la nivelul tractului genital

Coordonator științific

Lector dr. DIȚU Lia-Mara

Absolvent

ZLOTU Oana

-2016-

CUPRINS

INTRODUCERE

În vederea susținerii proiectului de diplomă am realizat o lucrare cu titlul “Evaluarea compoziției microbiotei normale și rolul acesteia în menținerea homeostaziei la nivelul tractului genital”. Ne-am decis să abordăm această temă deoarece suntem de părere că este important să știm când și de ce un microorganism poate deveni patogen și mai ales ce efecte poate avea acesta asupra sănătății noastre.

Lucrarea de licență cuprinde 4 mari capitole în care primele două vizează aspectele teoretice iar capitolul 3 include ramura practică.

În primul rând am decis să prezentăm noțiuni generale ce surprind microbiota normală a organismului uman raportându-ne în principal la microorganismele ce se găsesc în mod frecvent localizate pe suprafața corpului dar și la nivelul diferitelor mucoase. Am focalizat noțiunile asupra tractului urogenital femel și am continuat prin a prezenta în cadrul capitolului intitulat „Microbiota normală a tractului urogenital” informații despre compoziția și funcțiile microbiotei de la acest nivel raportându-ne mai ales la speciile genului Lactobacillus, care se găsesc în mod obișnuit în tractul urogenital feminin. Am făcut apel la complicațiile clinice care pot apărea în anumiți parametrii ce depind de tipul agentului infecțios, de starea fiziologică a gazdei și de condițiile de mediu și am concentrat investigațiile asupra vaginitelor și vaginozelor. Studiul vaginozelor este adiționat de caracterizarea speciilor microbiene ce determină infecții și distrug homeostazia tractului genital feminin.

Referitor la ramura practică a acestei lucrări, intenția a fost de a analiza microscopic diferiți agenți patogeni de la mai mulți pacienți care acuzau o anumită simptomatologie. Am realizat frotiuri colorate Gram respectând protocolul care viza folosirea unor materiale și metode stabilite pe baza cărora am putut ajunge la un set de rezultate completate cu discuții competente. Această parte a lucrării este inițiată de diagnosticul infecțiilor genitale.

Concluziile, partea de ansamblu a lucrării, sunt prezentate într-o manieră simplistă ce concretizează esența lucrării cu ideile principale din aceasta. Sunt susținute de investigațiile realizate, observarea și identificarea anumitor structuri cu semnificație clinică și caracterizarea diferitelor specii bacteriene cu potențial patogen.

Considerăm că lucrarea este de interes din punctul de vedere al conținutului, problemele tratate fiind susține de un bogat material clar prezentat. În elaborarea lucrării de licență au fost valorificate o serie de lucrări din literatura de specialitate autohtonă și străină, precum și contribuțiile noastre personale.

Doresc să îi mulțumesc în mod special doamnei lector dr. Dițu Lia-Mara pentru disponibilitatea, sugestiile, îndrumările dar și pentru timpul acordat, ajutorul dumneaei fiind indispensabil. Doresc să o menționez și pe doamna Podgoreanu Paula care ne-a împartășit din cunoștințele ei teoretice dar și practice și să îi mulțumesc pe această cale pentru implicare.

Scopul lucrării de față a fost evaluarea compoziției microbiotei normale și modificările acesteia induse de starea de infecție la nivelul tractului genital feminin. În acest sens, obiectivele lucrării au fost reprezentate de cunoașterea microbiotei normale a tractului urogenital și rolurile acesteia pentru organismul uman.

Obiectivele ce gravitează în jurul proiectului sunt:

O1: Evaluarea compoziției microbiotei normale și rolul acesteia pentru organismul uman;

O2: Clarificarea diferențelor dintre vaginite și vaginoze cu accent pe speciile microbiene implicate;

O3: Stabilirea unei statistici legate de agentul patogen, vârsta și boala în care este implicat;

O4: Formarea de deprinderi pentru lucrul în laborator în diagnosticul infecțiilor genitale;

CAPITOLUL 1: Microbiota normală a organismului uman

Corpul uman conține între 0,8 până la 2 kg de celule bacteriene vii însă raportate la o valoare numerică, bacteriile sunt apreciate la 1014 celule, fiind cu un grad de mărime peste numărul total de celule al organismului uman (1013) (Chifiriuc și colab., 2011).

În timpul vieții intrauterine, orice organism este steril, însă, în cursul nașterii și imediat după, el este colonizat de un număr mare de microorganisme localizate pe suprafața corpului dar și la nivelul diferitelor mucoase. Aceste microorganisme asociate atât organismului animal cât și uman aparțin la două categorii majore:

Microbiota permanentă, autohtonă, normală, cuprinde totalitatea microorganismelor (bacterii, microfungi, protozoare) asociate unui animal care în mod normal nu produc boli infecțioase. Se referă la acele micoorganisme care sunt asociate în mod constant și normal cu organismul uman sănătos, această asociere realizându-se în cursul evoluției macroorganismului.

Microbiota tranzitorie este constituită din acele microorganisme străine, alohtone, ce pătrund în organism din mediul extern (Ardelean, 2008). Pot proveni din aer, sol, sau de la alte animale iar unele pot fi patogene (Mihăescu și colab., 2007). Există situații în care microorganismele alohtone sunt prezente în tranzit fără să contribuie semnificativ la activitatea ecosistemului la ale cărui condiții nu se pot adapta ci doar supraviețui temporar.

Corpul uman prezintă atât situsuri colonizate cât și situsuri sterile (cavitatea pericardică, peritoneală, vezica urinară, lichidul cefalorahidian). Totuși, cea mai mare parte a corpului nostru este caracterizată de un număr mare de microorganisme care asigură buna funcționare a organismului. Există situații în care situsurile sterile în mod normal sunt contaminate cu celule bacteriene al căror număr poate să crească ajungându-se la starea de infecție și ulterior de boală.

Microbiota normală a organismului uman prezintă un caracter dinamic ce este dat de variația calitativă și cantitativă a microorganismelor această variație fiind corelată cu starea fiziologică a individului, cu vârsta acestuia dar și cu sexul.

COMPOZIȚIA MICROBIOTEI NORMALE

1.1.1 Microbiota normală a tegumentului

Pielea prezintă o valoare a pH-ului ce oscilează în jur de 5,6 fiind un factor ce poate inhiba dezvoltarea anumitor specii bacteriene (Volk, 1973). Acest organ este expus unor variații extreme de temperatură, umiditate, dezinfectanți chimici și din acest motiv nu conferă condiții favorabile dezvoltării microorganismelor, populația fiind mai mică numeric și mai simplă din punct de vedere al speciilor constitutive, comparativ cu alte situsuri din organism (Mihăescu și colab., 2007).

Pe tegument sunt zone uscate și lipsite de păr, arii bogate în glande sebacee ori zone cu o densitate mare a glandelor sudoripare însă bacteriile proliferează cel mai bine într-un mediu umed. Astfel, pielea feței, aria perirectală sau perigenitală au o microbiotă mai complexă. Pe suprafața pielii predomină bacteriile Gram pozitive precum: Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Propionibacterium. Bacteriile Gram negative, având un perete celular subțire, nu sunt protejate de acțiunea detergenților sau a altor factori externi, supraviețuirea lor fiind îngreunată (Mihăescu, 2000).

Copii sunt tentați să atingă diferite obiecte, să facă schimb de lucruri între ei, să se joace și să exploreze locuri cât mai noi. Din acest motiv, ei intră în contact cu o varietate mare de microorganisme mai ales la nivelul mâinilor. O mamă tehnician de la un laborator de microbiologie a realizat o cultura de microorganisme după o amprentă de pe palma băiatului ei după ce acesta s-a jucat. Rezultatul este prezentat în figura 1 (Rivas, 2015).

Fig. 1. Diferite colonii bacteriene rezultate după însămânțarea prin atingere a unui mediu de cultuă cu microorganismele de pe palma unui copil de 8 ani (Rivas, 2015)

1.1.2 Microbiota normală a conjunctivei

În contrastul faptului că ochiul este expus mediului extern și implicit microorganismelor, el este rar infectat. Microbiota normală este reprezentată de S. epidermis, Neisseria sp., Proteus sp., Corynebacterium și se remarcă faptul că există un număr limitat de specii microbiene. Una dintre explicații se referă la faptul că secrețiile ochiului sunt deosebit de bogate în enzima numită lizozim care cauzează liza unor bacterii. De asemenea, ochiul este protejat și de spălarea cu ajutorul lacrimilor care ajută la eliminarea multor agenți cu potențial patogen (Volk, 1973).

1.1.3 Microbiota normală a tractului digestiv

Cavitatea bucală este un mediu bogat în nutrienți în care pH-ul, temperatura și umiditatea sunt destul de stabile iar bacteriile se dezvoltă și cresc cu ușurință. Un astfel de mediu se găsește și în faringe și esofag unde se adaugă microbiota din alimentele ingerate. Aici se găsesc specii de Gemella, Actinomyces, Actinobacillus, Lactobacillus, Bacteroides, fungi precum Candida albicans dar și protozoare reprezentate de Entamoeba gingivalis și Trichomonas tenax.

În stomac, datorită acidului clorhidric, se asigură o valoare a pH-ului foarte mică (pH acid) ceea ce face ca densitatea microorganismelor să fie una scăzută. Stomacul unor oameni este colonizat de către Helicobacter pylori care în anumite condiții determină instalarea unei forme de ulcer care poate conduce la cancer gastric (Ardelean, 2008). Există o predominanță de Lactobacillus sp., Veillonella sp. și Clostridium sp. care sunt rezistente la acest mediu înalt acid. Sunt și specii care se găsesc în stare latentă în stomac cum ar fi Escherichia coli, Klebisiella sp., Bacteroides sp. și Peptococcus sp. care se vor dezvolta în situsurile inferioare ale tractului digestiv (Zilberstein și colab. 2007). Un studiu actual a concluzionat că intestinul uman conține foarte multe microorganisme (Fig. 2), numărul lor depășind 35 000 de specii de bacterii (Jandhyala și colab., 2015).

Microbiota intestinului subțire este limitată ca număr de specii cauza fiind peristaltismul intestinal și pH-ul acid care permit tranzitul rapid al microorganismelor către intestinul gros. Sunt frecvente speciile anaerobe precum Lactobacillus, Streptococcus, Candida albicans, Bifidobacterium, Clostridrium.

La nivelul intestinului gros lipsesc protozoarele dar există aproximativ 1011 celule bacteriene predominând specii ale genului Enterococcus, Bifidobacterium, Bacteroides fragilis (Mihăescu și colab., 2007). Fusobacterium sp. se găsește în rect, Enterococcus în colonul transversal, Peptococcus în cel sigmoid iar speciile genului Bacteroides sunt localizate în rect și colonul sigmoid (Zilberstein și colab. 2007).

Fig. 2. Principalele specii bacteriene din microbiota normală a tractului digestiv (Jandhyala și colab., 2015).

1.1.4 Microbiota normală a tractului respirator

Epiteliul respirator este expus zilnic volumului de aer inspirat care este mai mult sau mai puțin încărcat cu microorganisme aparținând genurilor Staphylococcus, Streptococcus Candida, Lactobacillus și Neisseria care sunt specii tranzitorii. Aceste microorganisme pătrunse în corp odată cu aerul inspirat sunt oprite la nivelul epiteliului nazal dar în multe situații ele trec de această barieră fizică, străbat laringele, ajung în trahee și ulterior sunt înghițite datorită activității cililor celulelor epiteliale care determină circulația ascendentă a secrețiilor mucoase către orofaringe. În orofaringe se găsesc bacili Gram pozitivi (Corynebacterium sp., Actinomycetes sp., Propionibacterium sp., Actinobacillus sp., Lactobacillus sp.) și Gram negativi anaerobi (Porphyromonas sp., Prevotella sp., Haemophilus influenzae, Bacteroides sp., Fusobacterium sp.)

Plămânul se consideră a fi steril pentru că orice bacterie ajunsă la nivelul arborelui traheobronșic este fagocitată. Sunt însă și microorganisme rezistente la acest proces iar printre acestea se numără Mycobacterium tuberculosis și Streptococcus pneumoniae, specii care poseda mecanisme de supraviețuire în fagocite sau se opun fagocitozei (Chifiriuc și colab., 2011).

1.1.5 Microbiota normală a tractului urogenital

Exceptând uretra și vaginul, tractul urogenital este steril. În microbiota vaginală predomină specii de Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Porphyromonas deoarece ei se multiplică ușor în mediul acid oferit de vagin. Pe lângă aceste bacterii anaerobe se găsesc și microorganisme aerobe ca Staphylococcus sp., Candida sp., Mycoplasma sp., Streptococcus sp. (Tabelul 1). La nivelul uretrei se disting un număr mare de lactobacili, streptococi și stafilococi coagulazo-negativi. Speciile de Trichomonas se găsesc în cantitate redusă la acest nivel dar în momentul în care proliferează devin responsabile de producerea vaginitei (Mihăescu, 2007).

Tabelul 1. Specii bacteriene predominante în microbiota normală la om (Todar, 2009)

++ = 100% ; + =25% ; +/- = rare (5%); * = potențial patogen

1.2 ROLUL MICROBIOTEI NORMALE

În anul 1885, L. Pasteur era de părere că viața animalelor și implicit a omului este imposibilă în lipsa microorganismelor. Pentru a contrabalansa această idee, s-a recurs la obținerea, creșterea și ulterior analizarea unor animale ce nu prezintă microorganisme viabile, acestea denumindu-se axenice (germ-free) (Mihăescu, 2007).

S-a constatat că apar o serie de diferențe între animalele normale și cele axenice în sensul că, cele din urmă sunt de talie mai mare, fenomenele de îmbătrânire sunt mai lente, creșterea, longevitatea și capacitățile de reproducere fiind deseori superioare celor convenționale. Un punct cu totul aparte se concretizează în faptul că cecumul rozătoarelor germ-free este mult mai mare în comparație cu cele normale însă atunci când li se inoculează microorganisme ca Streptococcus faecalis, E. coli sau Proteus vulgaris acesta capătă dimensiunile corespunzătoare unui cecum normal. Un prim rol ce se desprinde din acest experiment este acela că microbiota normală asigură tonusul peretelui intestinal (Chifiriuc și colab., 2011).

Chiar daca s-a demonstrat că putem supraviețui fără să fim colonizați problema constă în faptul că rezistența la infecții atinge minimalismul.

Între macroorganism și microorganism se stabilesc relații de mutualism (simbioză), implicarea acestora având efecte benefice în mod colateral. S-au făcut studii asupra animalelor axenice și s-a arătat că microorganismele au diverse roluri pe care le îndeplinesc în macroorganism:

Antrenează mecanismele de apărare ale gazdei. Animalele sterile sintetizează cu până la 50% mai puține imunoglobuline decât în mod normal;

Stimulează dezvoltarea organelor cu care vine în contact ca de exemplu intestinul. Animalele axenice prezintă modificări anatomice la acest nivel;

Bacteriile din intestinul gros hidrolizează ureea ajunsă prin difuzia din sângele capilarelor în CO2 și NH3, amoniacul fiind apoi utilizat în biosinteze;

Favorizează eliminarea colesterolului prin intermediul fecalelor (Chifiriuc și colab., 2011);

Microbiota normală grăbește tranzitul digestiv care este mult mai rapid decât la animalele germ-free. Mecanismul nu este cunoscut dar se speculează că este rezultatul acțiunii sinergice a unor constituenți chimici sau fizici din alimentație și a produșilor finali de metabolism bacterian, asupra proceselor de neurotransmitere la mușchii netezi;

Între gazdă și populațiile de microorganisme de la nivelul sistemului digestiv se formează un sistem ecologic în cadrul căruia se realizează o serie de interacțiuni complexe, antagonice și sinergice care asigură echilibrul sistemului. Acest echilibru este esențial pentru sănătatea individului;

Microorganismele de la nivelul intestinului gros au un rol major în fermentația compușilor ce nu pot fi degradați de enzimele din stomac. Fermentația este asigurată de o comunitate complexă de bacterii care atacă hexozele cu producerea de acizi grași volatili (valeric, caproic, propionic, izobutiric, acetic, izovaleric), metan, CO2 . O fracție din acești acizi grași sunt absorbiți prin peretele colonului, trec în sânge urmând ca apoi să fie metabolizați de organismul gazdă;

Rata de turnover a eritrocitelor depinde de prezența microbiotei normale și de activitatea enzimatică a acesteia. Înlocuirea eritrocitelor la animalele convenționale este de două ori mai ridicată decât la cele germ-free (Mihăescu, 2000);

Unele alimente nu pot fi degradate în totalitate de sucurile digestive, acest rol nutritiv fiind îndeplinit de anumite bacterii. Au rol în metabolismul glucidelor nedigestibile care includ polizaharide mari ca de exemplu celuloza, pectinele, hemiceluloza, gume etc (Bull și colab., 2014);

Sintetizează diverse vitamine (vitamina K, tiamina, biotina, roboflavina etc.) ce sunt utile pentru metabolismul gazdei și favorizează absorbția nutrienților;

Microbiota indigenă poate împiedica colonizarea altor bacterii, fungi sau protozoare în vederea competiției pentru hrană, astfel realizându-se o protecție a macroorganismului față de un posibil agent infecțios. De exemplu Staphylococcus epidermidis de la nivelul pielii are capacitatea de a inhiba formarea coloniilor de Staphylococcus aureus prin producerea unei serin proteaze (Stanford și colab., 2013) De asemenea, speciile de Lactobacillus din vagin produc peroxid de hidrogen și acid lactic care determină scăderea pH-ului având efecte inhibitorii asupra creșterii microorganismelor cum ar fi Gardnerella vaginalis, C. albicans, Escherichia coli (Ma și Forney, 2012);

Pe lângă rolul benefic pe care îl au, microorganismele au și influențe negative asupra macroorganismului:

Bacteriile pot fi responsabile de apariția cancerului deoarece secretă substanțe cancerigene rezultate de exemplu din urma metabolizării unor aminoacizi (metionina metabolozată sub formă de S-etil etionina, tirozina sub formă de fenoli) sau prin formarea N-nitrozo compușilor (Chifiriuc și colab., 2011);

Există riscul apariției disbiozelor când situsurile sterile în mod normal devin colonizate de componentele microbiotei autohtone. Un exemplu concret se referă la streptococii viridans care populează tractul respirator superior. Dacă aceștia pătrund în sânge se vor localiza în final pe valvele cardiace și produc endocardită infecțioasă;

Fenomenul de translocare din intestin reprezintă o reală problemă pentru persoanele imunosupresate determinând complicații infecțioase grave. Microorganismele capabile de translocație sunt E. coli, Proteus mirabilis, Enterococcus sp., Lactobacillus sp., Salmonella sp., Candida albicans, K. pneumoniae (Chifiriuc și colab., 2011);

Pătrunderea unui microorganism patogen în organismul gazdă poate fi favorizată de microorganismele indigene. În această situație se încadrează Entamoeba histolytica care este întotdeauna comensală în intestinul gros al animalelor de laborator. Stabilirea ei în organismul gazdă este strâns legată de microbiota rezidentă. Acesta este motivul pentru care animalele axenice sunt foarte rezistente la infecții (Mihăescu, 2000).

Acestea fiind spuse, putem sublinia că deși microbiota permanentă are un caracter non-invaziv, ea fiind doar colonizatoare, există cazuri în care pot apărea diferite abateri de la regula generală și apar afecțiuni din punct de vedere al sănătății organismului.

CAPITOLUL 2. Microbiota normală a tractului urogenital

2.1 COMPOZIȚIA MICROBIOTEI NORMALE A TRACTULUI UROGENITAL

2.1.1 Microbiota normală a tractului urinar

La omul sănătos, atât la femeie cât și la bărbat, rinichiul, ureterele și vezica urinară sunt sterile. Această stare se menține datorită:

– fluxului urinar în sens unic;

– micțiunea periodică;

– pH-ul acid;

– concentrația crescută de uree;

– activitățile antibacteriene a celulelor din mucoasa uretrei.

Excepția o reprezintă porțiunea inferioară a uretrei (Ardelean, 2008), bacteriile și fungii de la acest nivel fiind condiționat patogene. La femei, în această zonă se întâlnesc frecvent microorganisme aparținând microbiotei vaginale. În etiologia infecțiilor tractusului urinar sunt implicate Escherichia coli, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter aerogenes, Pseudomonas aeruginosa, enterococi, stafilococi coagulazo-negativi, S. aureus, Candida albicans etc. Pot exista contaminări ocazionale care sunt mai frecvente la femeie din cauza traiectului scurt al uretrei.

O gamă foarte largă de infecții este cauzată de E. coli care poate produce uretrocistite și prostatite. Speciile din genurile precum Klebsiella și Proteus sunt ureazo-pozitive și alcalinizează urina favorizând formarea caliculilor (Buiuc, 1992, Schäffler, 1994).

2.1.2 Microbiota normală a tractului genital

Uterul și trompele uterine sunt sterile dar în ceea ce privește vaginul, acesta este colonizat de o microbiotă diversificată și abundentă ce depinde de vârsta macroorganismului, pH-ul și nivelele hormonale care reprezintă factori discriminatori pentru tipurile de microbiotă din vagin (Davis, 1996). De asemenea, s-a arătat prin metode independente de cultură că există mai multe tipuri distincte de comunități vaginale cu o compoziție și o frecvență a speciilor semnificativ diferită ce variază în funcție de grupurile etnice.

Se presupune că diferențele în compoziția speciilor se poate corela cu modul în care comunitățile vaginale răspund la perturbări precum utilizarea de antibiotice, contraceptive hormonale și alte metode de contracepție, activitatea sexuală, dușurile dar și factori intrinseci cum ar fi sistemul imunitar înnăscut și adaptativ al gazdei.

În cazul majorității femeilor, în vagin se găsesc ca fiind dominante speciile de Lactobacillus, așa numiții bacili Döderlein. Există însă o gamă largă de alte specii cunoscute care aparțin comunităților microbiene vaginale dar funcțiile ecologice și rolul lor asupra dinamicii comunității globale sunt în mare parte nedeterminate (Ma și Forney, 2012).

Vaginul este un lumen elastic cu o lungime de aproximativ 7,5 cm. Elasticitatea acestuia este data de structura fibromusculară a lumenului vaginal care este alcătuit din 3 straturi: un strat exterior areolar, un strat mijlociu cu mușchi netezi și o căptușeală interioară ce prezintă epiteliu scvamos. Vaginul este fluidizat cu ajutorul glandelor lui Bartholin situate în apropierea deschiderii vaginale.

Fiziologia vaginului depinde de schimbarea de la nivelul straturilor epiteliale ale mucoasei dar și de ciclul menstrual. La momentul ciclului menstrual se constată o creștere a pH-ului la valoarea 6 în ziua a doua și o scădere ulterioară a acestuia la 4 în ziua a patra. Schimbările dinamice ale mediului vaginal în timpul menstruației conduc către schimbări drastice în ecologia microbiotei vaginale (Kumar și colab., 2011).

Până în prezent, cele mai multe studii despre microbiota vaginală s-au focalizat asupra femeilor de vârstă reproductivă. Se consideră că modificările în componența și funcția microbiotei vaginale sunt ulterioare stimulării epiteliului vaginal de către estrogen cu producerea de glicogen (Hickey și colab., 2015). Glicogenul rezultat este metabolizat de către lactobacili în acid lactic care este necesar pentru menținerea unui pH vaginal corespunzător care este de fapt un mecanism primar pentru inhibarea creșterii organismelor patogene (Thomas, și colab., 2011).

Glicogenul este un analog al amidonului găsit la animale și reprezintă principala sursă de nutrienți pentru microorganismele prezente în lumenul vaginului. Mucusul total conține glicoproteine, mucopolizaharide (adică glicogen), electroliți precum și o cantitate mare de apă. Stratul de mucus oferă elemente nutritive pentru microbiota vaginală dar acționează și ca receptori pentru aceasta. Un exemplu concret îl constituie proteina Tamm horsefall (THP) care se găsește în urina umană și în regiunea vaginală favorizând adeziunea lui E. coli la aceste regiuni. Proteina THP nu este secretă de epiteliul vaginal, dar prezența ei în vagin este atribuită contactului regulat al structurilor vaginale externe cu urina. (Kumar și colab., 2011) .

În anul 1892, Döderlein a descris un microorganism pe care l-a izolat dintr-o probă vaginală de la câteva femei gravide. Acest microorganism a primit numele de bacilul Döderlein dar ulterior a fost redenumit ca Lactobacillus. În plus față de acesta, în vagin se mai găsesc și alte specii anaerobe descoperite pentru prima dată la sfârșitul secolului al XIX-lea de către Menage și Kronig. Mai târziu, în jurul anului 1923, Curtis a constatat că unele femei suferă de un sindrom de scurgere a secrețiilor vaginale, sindrom pe care el l-a numit scurgere albă și a constatat, în cazul acestor femei, că există o lipsă relativă de bacili Döderlein. Gardner și Duke au fost primii care au asociat vaginita nespecifică cu Haemophilus vaginalis, redenumit mai târziu Gardnerella vaginalis (Martin , 2012).

Pentru a analiza corect microbiota normală a unei persoane de sex feminin trebuie luate în considerare stadiile de maturizare biologică ale acesteia. Se disting astfel mai multe etape în viața unei femei:

2.1.2.1 Perioada cuprinsă între naștere și prepubertate

Orice organism aflat în interiorul uterului este steril. Imediat după nașterea pe cale naturală el este colonizat de o serie de microorganisme provenite de la mamă care ulterior vor face parte din microbiota normală a nou-născutului.

Pe lângă nașterea pe cale naturală există și cezariana care se realizează doar în anumite condiții medicale. În mod normal ea nu trebuie să depășească 15% din totalul nașterilor dar cu toate acestea sunt puține state care nu trec peste această referință. Problema constă în faptul că nou-născutul nu mai este expus microbiotei vaginale aparținând mamei iar acest lucru duce la modificări ce țin de microbiota intestinală care afectează mai departe dezvoltarea sistemului imun al copilului. Totuși, în revista Nature Medicine se publică un articol care încearcă să aducă o rezolvare pentru acest impediment. Se propune o colonizare a nou-născuților cu microorganisme vaginale, colonizare realizată de personalul medical. Ideea constă în folosirea unei fașe sterile care este incubată pentru puțin timp în vaginul mamei iar după intervenția chirurgicală copii sunt tamponați cu fașa respectivă. S-a constatat că microbiota normală este similară copiilor născuți pe cale naturală (Marin, 2016).

Perioada dintre naștere și prima lună de viață este corelată cu o microbiota specifică unui pH=5 ce favorizează dezvoltarea speciilor de Lactobacillus asociate cu un ecosistem vaginal sănătos. Prezența acestor specii sugerează faptul că timp de o lună după naștere epiteliul vaginal produce glicogen care ulterior este convertit în acid lactic (Thoma și colab., 2011) însă, după prima lună de viață secreția de glicogen este stopată până la pubertate.

După o lună de viață se constată o creștere a pH-ului (se instalează un mediu alcalin) iar lactobacilii au o frecvență joasă pentru că nu mai există glicogen în vagin. Se găsesc microorganisme aerobe cât și anaerobe, dintre acestea, cele mai des întâlnite fiind Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli, Corynebacterium sp. (Davis, 1996), Gardnerella vaginalis și Mobiluncus sp. (Thoma și colab., 2011). Altfel spus, microbiota normală a tractului urogenital în perioada copilăriei conține microorganisme similare celor de pe piele și celor intestinale (Rathod, 2012).

Speciile de stafilococi patogeni sunt cel mai adesea hemolitici, coagulează plasma și produc o multitudine de enzime extracelulare și toxine (Chifiriuc și colab., 2011). De exemplu, toxina PSMγ este o peptidă de 24 de aminoacizi care este pe de o parte implicată într-un tip de enterocolită și pe de altă parte în liza neutrofilelor (Otto, 2009).

Infecțiile cu diferite specii de stafilococi la nivelul aparatului genital poate provoca metrite, anexite, mastite iar la nivelul tractului urinar determină apariția cistitei, prostatitei, pielonefritei, abcesului renal și para-renal. Speciilor de stafilococi le este caracteristică capacitatea de a produce un pigment galben-auriu, alb sau galben lămâi.

Staphylococcus epidermidis este o specie bacteriană ce se găsește la nivelul tractului urogenital și nu numai făcând parte din familia Staphylococcaceae din ordinul Bacillales (Chifiriuc și colab., 2011) și aparțin stafilococilor coagulazo-negativi. Staphylococcus aureus este coagulazo-pozitiv și provoacă cele mai multe infecții cu stafilococ la om (Bîlbîe și colab., 1985).

2.1.2.2 Pubertatea

În această etapă se remarcă schimbări hormonale ce mediază modificări fizice și fiziologice ce duc la apariția menstruației. În cursul acestei perioade se înregistrează o creștere a nivelului de estrogen, creștere ce are loc până când se ajunge la concentrațiile înregistrate la femeia adultă. Secreția de glicogen este reluată iar pH-ul este în scădere. Din acest motiv se dezvoltă streptococi, peptostreptococi, stafilococi, corinebacterii, Lactobacillus acidophilus (Davis, 1996). L. acidophilus este folosit în iaurturi pentru tratarea unor infecții vaginale acesta fiind capabil și de sinteza unor bacteriocine ce acționează ca inhibitori împotriva unor drojdii și mucegaiuri (Lee, 2009).

De remarcat este faptul că pot apărea schimbări în compoziția microbiotei vaginale chiar înainte de prima menstruație deoarece debutul endocrin se instalează înainte de menarhă și duce la acumularea de glicogen la nivelul epiteliului vaginal (Thoma și colab., 2011). Totuși, menarha în sine nu indică o finalizare a pubertății pentru că influențele hormonale asupra comunităților microbiene vaginale pot continua timp de câteva luni sau chiar ani după menarhă (Hickey și colab., 2015).

2.1.2.3 Femeia adultă

Cele mau multe studii ale microbiotei normale a tractului urogenital s-au raportat la femeia de vârstă reproductivă și se foloseau metodele de cultivare a populațiilor microbiene. Recent, cunoștințele despre diversitatea microbiană s-au extins enorm datorită utilizării unor abordări independente de cultură, bazate pe analiza secvențelor genei ARNr 16S. Această metodă presupune extragerea directă a materialului genetic din probele biologice sau din mediu urmată de amplificarea secvențelor ARNr 16S folosind primeri care se atașează la regiunile înalt conservate ale genei, după care se realizează secvențierea pentru a caracteriza apoi diversitatea bacteriană (Ma și Forney, 2012).

Valoare pH-ului vaginal la femeia adultă este menținută între 4,4 și 4,6 iar mediul rezultat este corespunzător dezvoltării microorganismelor acido-rezistente, în special lactobacili dar și enterobacterii, bacterii anaerobe , Candida albicans, Proteus mirabilis, Escherichia coli (Ardelean, 2012), Lactobacillus crispatus, Lactobacillus iners, L. gasseri, L. jensenii, Prevotella bivia, Atopodium vaginae, Gardnerella vaginalis (Ma și Forney, 2012).

2.1.2.4 Femeia însărcinată

Nașterea este o perturbare biologică majoră dar este un eveniment critic în ciclul de viață al omului și a celorlalte animale.

Există studii care arată că unele filotipuri au o abundență relativă care diferă între femeile însărcinate și cele care nu sunt gravide. Se descriu astfel patru filotipuri de lactobacili (L. vaginalis, L. jensenii, L. crispatus, L. gasseri) care au o abundență mai mare la gravide (Romero și colab., 2014). Când o femeie rămâne însărcinată, mediul vaginal conține frecvent Proteus, Bacteroides și ocazional Candida albicans (Schäffler, 1994).

2.1.2.5 Femeia aflată la menopauză

Caracterul dinamic al microbiotei vaginale depinde de vârsta femeii. Cu cât aceasta se apropie mai mult de vârsta de 45 de ani, cu atât ciclul menstrual poate fi întrerupt sau poate înceta pentru totdeauna. Condiția de încetare permanentă a menstruației în care există o pierdere completă a activității foliculare se numește menopauză (Kumar și colab., 2011).

Apariția menopauzei este marcată de scăderea cantității de glicogen secretat și de o creștere a pH-ului formând un mediu asemănător celui dinaintea pubertății (Davis, 1996). Modificarea acestor parametrii duc la o scădere a lactobacililor. S-a constatat că femeile aflate la menopauză sunt mai predispuse la infecții urogenitale, validându-se astfel teoria conform căreia colonizarea vaginului de către lactobacili reprezintă o protecție împotriva agenților patogeni.

Vaginul femeii aflate la menopauză este caracterizat de mai multe microorganisme cu potențial patogen cum ar fi specii ale genului Bacteroides Prevotella și Gardnerella ce sunt asociate cu vaginoza bacteriană precum și specii din genul Enterococcus și E .coli asociate cu infecții ale tractului urinar.

Chiar dacă lactobacilii protejează organismul în fața unor infecții vaginale, acest lucru nu este suficient deoarece nu împiedică complet colonizarea altor specii pentru că agenții patogeni sunt capabili să coexiste cu microorganismele comensale. Pentru întărirea acestei idei, exemplul cel mai concret se referă la o probă vaginală suspectă de vaginoză bacteriană în care s-a găsit G. vaginalis dar și o specie de Lactobacillus (Cribby și colab., 2008).

2.2 FUNCȚIILE MICROBIOTEI NORMALE

Speciile de Lactobacillus au un rol major în protejarea mediului vaginal de potențialii agenți patogeni și se referă la producerea de acid lactic care conduce către un pH scăzut. Acidul lactic ne protejează împotriva HIV și a agenților patogeni cum ar fi Neisseria gonoree, deci putem spune ca el acționează ca un microbicid (Ma și Forney, 2012). S-a demonstrat, în condiții de laborator, că acidifierea mediului prin creșterea numărului de lactobacili poate inhiba proliferarea organismelor patogene precum C. albicans, Escherichia coli și Mobiluncus sp. (Boris și Barbés, 2000);

Producția de acizi care determină scăderea pH-ului are efecte inhibitorii asupra creșterii microorganismelor cum ar fi Gardnerella vaginalis, Peptostreptococcus sp. și Bacteroides sp. Lactobacilii formează un biofilm care blochează atașarea altor bacterii, inclusiv a celor patogene;

Se consideră că expunerea bacteriilor Gram negative la acid lactic ar avea efecte stimulatoare asupra sistemului imunitar înnăscut al organismului gazdă. Se pare că L. crispatus, Prevotella bivia și Atopobium vaginae sunt bacterii cheie care reglează imunitatea înnăscută într-un mod specific speciei (Ma și Forney, 2012);

Este bine cunoscut faptul că printre cele mai comune proprietăți ale lactobacililor se numără și capacitatea acestora de a elibera peroxid de hidrogen denumit și apă oxigenată sau perhidrol care este produs în condiții anaerobe (Ma și Forney, 2012). Această substanță poate fi inhibitorie sau toxică pentru bacteriile adiacente, ciuperci, virusuri sau celule de mamifere, în special în prezența peroxidazei și halogenurilor. Peroxidaza folosește H2O2 pentru a oxida halogenura. În urma acestei reacții rezultă o substanță cu proprietăți toxice puternice (Boris și Barbés, 2000);

Există studii care au arătat că lactobacilii au capacitatea de a adera la celulele epiteliale determinând astfel o excludere prin competiție a agenților patogeni. Mecanismele aderării nu sunt pe deplin înțelese însă unii autori consideră că atașarea lactobacililor la celulele epiteliale este mediată de glicoproteine și carbohidrați. Alți autori au raportat că acidul lipoteicoic este implicat în aderență;

S-a demonstrat că fragmentele peretelui celular ale unui lactobacil blochează aderența uropatogenilor la celulele uroepiteliale. Mai mult, bacilii Döderlein concurează pentru receptorii celulelor vaginale cu Gardnerella vaginalis și Candida albicans, lacticii având o afinitate mai mare pentru acești receptori (Boris și Barbés, 2000);

S-a constatat că la femeile negre există un număr mai mic de lactobacili dar au o gamă diversă de bacterii facultativ anaerobe sau strict anaerobe care sunt asociate cu un pH mai mare de până la 5,5 ce îndeplinesc roluri similare cu a lactobacililor. Această proporție ajunge la 40% și include specii din genurile Atopobium, Corynebacterium, Anaerococcus, Peptoniphilus, Prevotella, Gardnerella, Sneathia, Eggerthella, Mobiluncus și Finegoldia. (Ma și Forney, 2012);

O altă funcție importantă a microbiotei normale a tractului urogenital o constituie capacitatea microorganismelor de a sintetiza bacteriocine, substanțe bacteriocin-like și biosurfactanți;

– Bacteriocinele sunt proteine bacteriene care au un spectru îngust de activitate, inhibând tulpini alea aceleași specii. Această proteină are capacitatea de a suprima dezvoltarea altor bacterii reprezentând astfel un avantaj pentru microorganismele implicate în fermentație incluzându-se aici și tractul genital femel (Boris și Barbés, 2000). Tot ele pot funcționa ca molecule semnal deoarece, atunci când se atinge o concentrație mare inhibă creșterea unor bacterii iar când concentrația de bacteriocine este mică ele pot intermedia comunicarea dintre bacterii, mecanism ce poartă numele de sensibilitate la cvorum (Dobson și colab., 2012);

– O substanță bacteriocin-like tinde să aibă un spectru mai larg de activitate decât bacteriocinele și au fost descrise ca fiind produse de lactobacili. Rolul lor este acela de a inhiba atât bacterii Gram pozitive cât și Gram negative dar și fungi;

– Biosurfactanții sunt compuși eliberați de microorganisme ce au tendința de a se acumula la nivelul interfețelor din diferite clase de biosurfactanți deosebindu-se pe baza structurii lor chimice. Rolul lor este de a facilita asimilarea de substraturi nemiscibile cu apa, prezentând activitate antibiotică împotriva diferitelor microorganisme. Biosurfactanții ar putea avea rol și în adeziunea microbiană ca de exemplu în cazul lactobacililor care sunt capabili să înlocuiască aderarea (Boris și Barbés, 2000);

MALADII ALE TRACTULUI UROGENITAL

Este bine-cunoscut faptul că există foarte multe microorganisme pe Pământ iar o parte dintre ele se dezvoltă în asociație cu organismele superioare uneori fiind patogene pentru acestea. Un organism patogen descrie două proprietăți importante: patogenitatea și virulența.

Patogenitatea (gr. „pathos” – boală și „geneia” – născut) este un caracter calitativ, de specie și reprezintă capacitatea unui agent patogen de a genera un proces infecțios, decelabil din punct de vedere clinic, la o gazdă receptivă.

Virulența (lb. latină „virulentus” – otrăvitor) este proprietatea unei tulpini aparținând unui microorganism patogen de a se localiza, de a se multiplica si eventual de a invada celulele și țesuturile gazdei, determinând o stare patologică pentru gazda respectivă (Chifiriuc și colab., 2011).

Speciile microbiene care se găsesc la nivelul tractului vaginal joacă un rol important în menținerea sănătății și prevenirea infecției. Echilibrul de la acest nivel este ușor de perturbat iar cauzele sunt diverse (Tabelul 2). Acestea duc, în cazul femeilor, la secreții vaginale anormale , ulcerații la nivelul mucoasei care produc disconfort local și durere în timpul actului sexual, sau boală inflamatorie pelvină. O infecție a tractului genital superior conduce către infertilitate, sarcini extrauterine și dureri cronice pelvine. La barbați, infecțiile genitale pot provoca scurgeri uretrale, ulcere genitale dureroase și anumite boli ale ganglionilor limfatici genitali (Ronald și Alfa, 1996)

Într-o secreție vaginală normală se disting frecvente celule epiteliale acoperite de un număr mare de lactobacili Gram pozitivi dar se observă și rare leucocite (Fig.3). Când pe frotiu se observă un număr relativ mic de celule epiteliale, lactobacili Gram pozitivi rari sau chiar absenți și frecvente leucocite, atunci se pune problema unei inflamații care poartă denumirea de vaginită. Situația devine mai complicată în cazul vaginozei care este o infecție caracterizată de absența lactobacililor Gram pozitivi ce sunt substituiți de microorganisme Gram negative, un număr relativ de leucocite precum și o cantitate mică de celule epiteliale prezente în secreția vaginală.

O femeie cu un vagin normal are scurgeri vaginale zilnice, de obicei, cu un aspect lăptos sau limpede, fără miros neplăcut și reprezintă un mod prin care organismul se menține sănătos (Gor, 2015). Se estimează că speciile de Lactobacillus reprezintă până la 95% din microbiota vaginală sănătoasă la femeile de vârstă reproductivă și mențin echilibrul în ecosistemul vaginal (Bautista și colab., 2016).

Fig. 3. Frotiu colorat Gram cu secreție vaginală normală

(original, 1000x)

VAGINITA

Vaginita este una din cele mai frecvente motive pentru care femeile solicită îngrijiri medicale. Această afecțiune este caracterizată de o inflamație a mucoasei vaginale care uneori poate implica și vulva (Razzak și colab., 2011).

Cauzele apariției vaginitelor sunt prezentate în tabelul 2 însă cele mai frecvente sunt: vaginoza bacteriană (40-45%), candidoza vaginală (20-25%), trichomoniaza (15-20%) dar există și un procent de femei care rămân nediagnosticate. (Gor, 2015). Vaginita se caracterizează printr-o serie de simptome: mâncărime, senzație de arsură, iritație, scurgeri și disconfort.

O secreție vaginală fiziologică care se diferențiază de una anormală, patologică este alcătuită din: substanțele excretate de glandele sebacee, sudoripare , glandele Bartholin, celule exfoliate, mucus cervical, secreții ale cavității endometriale și a trompelor uterine.

O caracteristică importantă a acestor secreții este că nu aderă de pereții vaginului și în concluzie nu modifică pH-ul normal (3,8-4,5). Atât cantitatea cât și fluiditatea scurgerilor poate varia pe parcursul ciclului menstrual. De exemplu, mucusul cervical devine mai fluid în jurul ovulației iar femeile confundă frecvent această modificare a consistenței secreției vaginale și o corelează cu o scurgere anormală. La fel se întâmplă și atunci când femeia este stresată deoarece, acest factor crește rata de descuamare a celulelor iar cantitatea pare anormală. În general, femeile nu au alte simptome dacă scurgerile sunt fiziologice.

În condiții patologice (în cazul unei inflamații), secrețiile vaginului aderă la pereții acestuia și sunt însoțite de iritație, prurit, miros neplăcut, culoare de la alb la galben până la gri sau verde iar consistența poate fi apoasă sau groasă (Carr, 1998).

În funcție de cauza apariției, în literatura de specialitate s-au descris 3 categorii de vaginită:

Specifică – atunci când este produsă de fungi (ex. Candida sp.), protozoare (ex. Trichomonas vaginalis),bacterii (ex. Treponema pallidum), virusuri (ex. Papilomavirus) etc.

Nespecifică – care apare prin multiplicarea florei vaginale normale

Produsă de corpi străini (neinfecțioasă) – în cazul în care femeia folosește dispozitive contraceptive (de exemplu dispozitivul intrauterin) sau, la fetițe, prin introducerea accidentală a corpilor străini în vagin (Bautista și colab., 2016).

Tabelul 2 : Tipul și cauzele vaginitelor (Owen și Clenney, 2004)

2.3.1.1 Vaginită atrofică

Reprezintă o afecțiune a mucoasei vulvei și vaginului și este cauzată de deficitul de estrogeni. Apare la orice vârstă dar cu frecvență mare, de aproximativ 40%, la femeile aflate la menopauză. Poate apărea și la femeile aflate la pre-menopauză care iau medicamente antiestrogenice sau care au suferit intervenții chirurgicale ce au avut ca rezultat scăderea nivelului de estrogen (Fig.4). Astfel, mucoasa vaginală se subțiază, devine netedă și roz deschis până la alb (Carr, 1998) dar se constată și o creștere a valorii pH-ului vaginal care conduce către diverse simptome ca: arsură la urinare, poliurie, sângerare după actul sexual, actul sexual dureros, scurgeri vaginale, durere, mâncărime sau senzații de arsură (Brotman, 2014). Femeile cu vaginită atrofică pot raporta o secreție apoasă, galbenă sau gri, subțire (Mac Bride și colab., 2010).

Fig. 4: Mecanismul propus pentru cascada efectelor în cazul vaginitie atrofice (Mac Bride și colab., 2010)

Epiteliul vaginal este un epiteliu scvamos, startificat, care până la menopauză este umed și gros. La menopauză, nivelul de estrogeni se reduce iar epiteliul vaginal se subțiază. Celulele descuamate se descuamează, mor și eliberează glicogen. Glicogenul este hidrolizat la glucoză care este descompusă în acid lactic prin acțiunea lactobacililor. Fără această cascadă pH-ul din vagin crește și rezultă o pierdere însemnată de lactobacili și o creștere a altor bacterii, inclusiv streptococi B, stafilococi, difteroizi și coliformi care pot provoca infecții vaginale și inflamații

După menopauză, elasticitatea vaginului este redusă și crește țesutul conjunctiv. Scăderea nivelului de estrogeni determină și o scădere a fluxului sanguin vaginal precum și o scădere a lubrifierii vaginale.

Vaginita atrofică este considerată de unii autori ca fiind o formă avansată de atrofie vaginală care este însoțită de o serie de simptome suplimentară. Se estimează că 20-60% dintre femeile aflate la menopauză suferă de vaginită atrofică iar 20-25% dintre acestea solicită tratament medical (Sobel și Sobel, 2014).

Pe frotiu se evidențiază un număr relativ mic de celule epiteliale, lactobacili Gram pozitivi rari sau chiar absenți și frecvente leucocite (Fig. 5).

Fig. 5. Frotiu cu vaginită atrofică (sursa: http://www.clinicaladvisor.com/cmece-features/tissue-changes-associated-with-vaginal-atrophy/article/177880/)

Tratamentul se face cu cremă sau tablete ce conțin estrogeni. Acestea oferă de obicei ameliorarea completă a simptomelor în câteva săptămâni. Între timp, pacienții pot folosi lubrifianți sau creme hidratante. În cazuri foarte rare s-a constatat că în urma administrării unui medicament cu estrogeni pot apărea efecte secundare cum ar fi hiperplazia endometrială (Owen și Clenney, 2004).

VAGINOZA

Investigările asupra microbiotei vaginale au început în urmă cu 150 de ani când s-a diferențiat pe baza studiilor cu ajutorul culturilor bacteriene și a microscopului cu lumină femeile cu microbiotă normală de cele cu microbiotă anormală. Aceasta din urmă a devenit cunoscută sub numele de “vaginoză bacteriană” (Martin, 2012).

2.3.2.1 Vaginoza bacteriană (BV)

Un vagin sănătos este caracterizat de mai multe tipuri de microorganisme care trăiesc în echilibru. Vaginoza bacteriană, anterior numită vaginită nespecifică (Baurah și colab., 2014), este o perturbare a ecosistemului vaginal, în care lactobacilii sunt înlocuiți de o suprainfecție a microorganismelor vaginale. Acestea pot fi tranzitorii sau devin persistente. Reprezintă cea mai frecventă cauză de scurgeri vaginale anormale la femeile de vârstă reproductivă.

Fiziologic, secreția vaginală conține mucus, celule epiteliale descuamate și lactobacili (Phillip, 2002). Diferite studii au arătat că speciile bacteriene asociate vaginozei bacteriene se dispun sub forma unor biofilme dense în timp ce speciile de lactobacili sunt distribuite slab la nivelul epiteliului (Cribby și colab., 2008).

Microorganismele care înlocuiesc lactobacilii sunt specii anaerobe precum Gardenella vaginalis, Mobiluncus curtisii, Mulieris, Mycoplasma hominis (Bautista și colab., 2016) dar pot fi și specii aerobe sau microaerofile (Baruah și colab., 2014).

Un studiu realizat în anul 2011 de către Razzak și colaboratorii săi a arătat că la 24% dintre pacientele cu vaginită s-a constatat și infecție determinată de o creștere a speciei aerobe Staphylococcus aureus urmată de bacili Gram negativi și coci Gram pozitivi. De asemenea, s-a constatat că la femeile care au vaginită au și o suprainfecție a bacteriei E. coli. Dacă pe frotiul cu secreție vaginală se observă prezența lui Klebsiella pneumonie, atunci, una dintre cauze poate fi administrarea de antibiotice (în special cele β-lactamice) care inhibă creșterea altor agenți patogeni oportuniști. Totuși Klebsiella este o bacterie rezistentă la o gamă largă de antibiotice deoarece produce o mare cantitate de β-lactamază.

Printre cele mai comune metode de contracepție se numără și dispozitivele intrauterine care pe lângă faptul că previn o sarcină nedorită ele predispun femeia la vaginoze bacteriene. Cea mai frecventă specie care a fost izolată de la femeile care utilizau dispozitive intrauterine a fost Pseudomonas aeruginosa. Simptomele asociate sunt scurgerile vaginale anormale și mirosul neplăcut al acestora (Razzak și colab., 2011).

Prezența lactobacililor în vaginul unei femei denotă un mediu vaginal sănătos. Totuși, din cauza capacității lor de a produce substanțe inhibitorii, aceste bacterii sunt capabile să inhibe și alte microorganisme vaginale normale. Trebuie luat în considerare că nu toate speciile de lactobacili au un rol important în protejarea vaginului prin blocarea atașării agenților patogeni și inhibarea dezvoltării acestora prin substanțele produse. Unele specii nu exprimă aceste proprietăți la aceeași intensitate și există diferențe semnificative între specii și între tulpini de la o singură specie.

Gardnerella vaginalis este singura specie din genul Gardnerella care a fost sugerată ca fiind principala cauză a vaginozei bacteriene, deși, rata de izolare a acestui organism de la pacienții cu vaginoză bacteriană este variabilă (între 6 și 94%), datorită pe de o parte materialelor și metodelor folosite și pe de altă parte criteriilor pentru stabilirea diagnosticului. Un aspect important al vaginozei bacteriene este faptul că prevalența acesteia se apropie până la 76,8% la femeile de vârstă reproductivă (Baruah și colab., 2014).

Cu toate că majoritatea agenților patogeni care cauzează vaginoze bacteriene sunt endogeni, speciile genului Mobiluncus sunt unice la pacienții cu această infecție, ele nefiind găsite la pacienții fără vaginoză. Mobiluncus are formă de virgulă, este Gram variabil sau Gram negativ. Gardnerella vaginalis este organismul principal cauzator de vaginoză deoarece se găsește aproape la toate femeile simptomatice cu BV (Plourd, 1997).

Interesul față de vaginoza bacterană a crescut în ultimul timp din cauza consecințelor care sunt adiționate acestei infecții. De exemplu, infecția lichidului amniotic, ruperea prematură a membranelor, nașterea prematură, greutate scăzută la naștere etc. S-a constatat că femeile care suferă de vaginoză bacteriană au o sensibilitate crescută la achiziționarea HIV și a altor agenți infecțioși cu transmitere sexuală, cum ar fi Neisseria gonorrhoeae și Chlamydia trachomatis.

Factorii responsabili pentru o prevalență mai mare a vaginozei sunt: igiena precară, malnutriția, salubritatea necorespunzătoare dar și nivelul scăzut al statutului socio-economic.

Printre criteriile individuale utilizate pentru a diagnostica vaginoza bacteriană, pH-ul ridicat este recunoscut ca fiind criteriul cel mai sensibil, dar cel mai puțin specific. În prezent, pH-ul vaginal a fost dovedit a fi semnificativ pentru această infecție. Majoritatea persoanelor cu vaginoză bacteriană au un pH cuprins între 5,0 și 5,5. O parte mai mică dintre femei care au aceeași afecțiune au pH-ul între 4,5 și 6,0. Un pH mai mare de 4,5, în majoritatea cazurilor, poate fi abordat ca o corelație cu vaginoza bacteriană. Colorarea Gram are o sensibilitate de 89-93% și o specificitate 70-83%, această tehnică fiind cea mai puțin costisitoare și cea mai interpretativă metodă de laborator.

Depistarea precoce și tratamentul vaginozei bacteriene par să aibă un rol în reducerea complicațiilor asociate cu această infecție. Există situații în care se instalează vaginoza recurentă deoarece unele microorganisme sunt rezistente la tratamentul cu metronidazol sau clindamicină (Baruah și colab., 2014).

În urma mai multor cercetări s-a găsit o asociere semnificativă între celulele „clue” și vaginoza bacteriană. Celulele „clue” sunt celule epiteliale vaginale care prezintă la frontierele ei dar și pe restul suprafeței bacterii atașate aparținând microbiotei normale.

Se știe de mult timp că, în cazul BV, bacteriile interacționează cu celulele epiteliale. De fapt, prezența celulelor „clue” exfoliate reprezintă o caracteristică calitativă de diagnosticare a bolii. G. vaginalis poate fi responsabil de formarea acestor celule deoarece a fost detectată pe suprafața celulelor epiteliale vaginale exfoliate mai frecvent și la niveluri mai mari decât celelalte microorganisme.

Această bacterie este asociată în mod pozitiv cu prezența celulelor „clue” (Gilbert și colab., 2013). Celulele „clue” prezintă pe suprafața lor cocobacili Gram variabili care le conferă celulelor epiteliale un aspect granular.

Din punct de vedere al semnificației clinice, detectarea celulelor „clue” reprezintă procedura cea mai utilă în detectarea BV (Khan și colab., 2007.

Gardnerella vaginalis și formarea celulelor „clue”(Fig. 6).

Fig. 6. Frotiu colorat Gram cu secreție vaginală cu aspect de G. vaginalis

Se observă celulele epiteliale vaginale acoperite de cocobacili Gram variabili (original, 1000x)

2.3.2.2 Vaginoză cu protozoare

Trichomonas vaginalis este un parazit ce face parte din clasa Flagelatelor fiind un protozoar piriform delimitat la exterior de o membrană numită periplast. Acest microorganism determină apariția unor afecțiuni numite trichomoniaze care sunt infecții ale tractului urogenital. Are o dimensiune de 15µ și o lățime de 7µ (Burta și colab., 2007), formă de pară (Fig.3) cu extremitatea anterioară lățită iar cea posterioară efilată. În regiunea anterioară se observă un nucleu care are 5 cromozomi și un complex kinetosomal de la care pornesc 3-5 flageli egali din punct de vedere al mărimii, un flagel recurent, parțial fixat pe marginea membranei ondulante (Fig 7).

Fig. 7. Frotiu colorat Gram cu Trichomonas vaginalis (original, 1000x)

În citoplasma parazitului se găsesc lizozomi, aparatul Golgi dar și hidrogenosomi care sunt organite ce produc hidrogen, prelucrează o parte din metabolismul carbonului și sunt sediul fosforilării. Deoarece Trichomonas vaginalis are capacitatea de a fagocita, în citoplasma acestuia se găsesc vacuole digestive cu bacterii, particule alimentare, leucocite și hematii (Rădulescu și Mayer, 1992).

Se prezintă doar sub formă vegetativă întrucât nu s-au identificat forme chistice. Condițiile de viață și de înmulțire sunt reprezentate de un mediu umed, cu pH de 4,9-6,5 și temperaturi de 35-37oC (Moldoveanu, 2012).

Organismul se poate cultiva ușor în medii nutritive care au un pH optim și în care există antibiotice care inhibă creșterea altor organisme. S-a constatat ca pH-ul este un factor cheie în limitarea creșterii in vitro. La o valoare a pH-ului de 5,5 până la 5,8 trăiesc organismele cele mai mici, mobile și robuste, iar la un pH al mediului mai scăzut sau mai crescut decât cel optim se observă exemplarele mari și mai puțin mobile. Trichomonas vaginalis este facultativ anaerob, creșterea sa fiind inhibată la concentrați mari de oxigen deoarece îi lipsește catalaza (Rădulescu și Mayer, 1992).

Transmiterea acestui parazit se face în proporție de 95% pe cale sexuală, acesta fiind motivul pentru care trichomoniaza este una din cele mai frecvente afecțiuni genitale, exprimată clinic mai ales de persoanele de sex feminin. Modalitatea secundară de transmitere se face prin articole proaspăt contaminate (Moldoveanu, 2012).

Există o serie de factori care favorizează apariția trichomoniazei prin creșterea pH-ului vaginal, acesta având valori mai crescute cu tendință spre alcalinizare (Radulescu și Meyer, 1992). Aceștia sunt menstruația, sarcina și infecțiile cu anaerobi care înlocuiesc lactobacilii (Moldoveanu, 2012).

Incidența infecției cu Trichomonas vaginalis a fost în scădere în ultimii 20 de ani iar în prezent acest lucru reprezintă doar 10-25% din infecțiile vaginale în funcție de populația studiată. Totuși, s-au raportat 170 de milioane de cazuri de infecție la nivel mondial și afectează atât tractul urogenital al femeilor cât și pe cel al bărbaților (Garber, 2005). În cazul femeilor, flagelatul infectează epiteliul vaginal, uretra, glandele Bartholin și rar endocervixul. (Rădulescu și Meyer, 1992).

Din punct de vedere al patogeniei, parazitul folosește adezinele pentru a recunoaște și adera de celula epitelială. Aderarea microorganismului de celula epitelială este o etapă inițială și crucială în stabilirea infecției și patogeniei bolii, cea din urmă manifestându-se doar prin contactul direct al parazitului cu celula țintă. Trichomonas vaginalis prezintă atât intracelular cât și la nivelul membranei o activitate proteolitică mare datorată unor cistein proteinaze care sunt determinanți importanți ai virulenței parazitului (Rădulescu și Meyer, 1992).

Există mai mulți factori de risc care sunt implicați în apariția acestei afecțiuni: statutul socio-economic, numărul de parteneri sexuali, fumatul dar și rasa umană. Astfel persoanele care fumează sunt mai predispuse la infecțiile cu Trichomonas iar afro-americanii, chiar și după ce li s-a ajustat venitul și nivelul de educație, tot fac frecvent această infecție (Carr, 1998).

Infecția cu Trichomonas vaginalis este extrem de contagioasă și este asociată cu bolile cu transmitere sexuală. La persoanele asimpotomatice infecția cu acest protozoar poate crește riscul de dobândire de HIV (Owen și Clenney, 2004). Mai mult decât atât, acest parazit poate crește riscul transmiterii HIV pe cale maternă la copil (Garber, 2005).

O proporție de 20% până la 50% dintre persoanele infectate sunt asimptomatice. Atunci când scurgerile sunt prezente, acestea sunt urât mirositoare și de obicei abundente, lipsite de conținut și pot avea culoarea albă, gri, galbenă sau verde (culorile alb și verde se datorează prezenței celulelor albe din sânge) (Gor, 2015). Secreția vaginală conține un număr mare de leucocite polimorfonucleare (Fig. 8) și de paraziți. (Rădulescu și Meyer, 1992). Pruritul este un simptom mai frecvent în cazul femeilor cu trichomoniază decât a celor care au vaginoză bacteriană dar mai puțin frecvent decât la femeile cu vaginită micotică (Carr, 1998).

Fig. 8. Frotiu cu secreție vaginală. În centru de observă T. vaginalis care este înconjurat de un număr mare de polimorfonucleare (original, 1000x)

Fenomenul acut al acestei afecțiuni se moderează treptat, rămânând doar secreția macroporulentă în care abundă în paraziți. Leucoreea se accentuează postmenstrual și în timpul sarcinii.

Evoluția cronică la femei este adiționată de avort spontan, sterilitate temporară și dispareunie. La bărbați, boala evoluează asimptomatic iar în formele cronice pot apărea uretitele sau prostatitele. În mod frecvent, la ambele sexe s-a observat o infecție mixtă Trichomonas vaginalis-Candida albicans (Moldoveanu, 2012). Secreția pierde aspectul purulent deoarece numărul de leucocite și paraziți scade, rămânând doar celule epiteliale descuamate și floră microbiană. După un examen genital se bifează inflamația vulvei, care prezintă eritem și edem. Vaginul si cervixul sunt eritematoase cu puncte de dimensiuni mici, hemoragice și ulcerații (Rădulescu și Meyer, 1992).

Fetițele se pot contamina în timpul nașterii dacă mama este infectată sau dacă trăiesc în condiții neigienice. Infecția este prezentă la fetițe numai în primele luni de viață sau după instalarea pubertății deoarece parazitul nu poate supraviețui decât pe un substrat estrogenizat. (Rădulescu și Meyer, 1992). Trichomoniaza este rar întâlnită la copii aflați la pubertate și din acest motiv dacă este prezentă această infecție, trebuie suspectat abuzul sexual (Gor, 2015).

Trichomoniaza în timpul sarcinii a fost corelată cu travaliul prematur și greutatea scăzută la naștere a nou-născutului. Tratarea acestei infecții cu metronidazol este de cele mai multe ori ocolită și se caută metode alternative care să aibă cât mai puține efecte secundare (Owen și Clenney, 2004). La femeile gravide, cele mai frecvente simptome sunt febra, inflamația mucoasei uterine și secreția anormală, urât mirositoare. Infecțiile cronice pot conduce la sterilitate temporară deoarece parazitul fagocitează spermatozoizii sau reduce motilitatea lor prin metaboliții eliberați (Rădulescu și Meyer, 1992).

La bărbați, Trichomonas vaginalis este localizat în uretră și prostată. Acestea nu reprezintă un habitat favorabil deoarece este lipsit de nutrienți. După 48 de ore de la un contact sexual cu o femeie infectată, parazitul este prezent in secreția uretrală în proporție de 70 % din bărbați iar după 5 zile, doar la 30 % dintre ei. La majoritatea bărbaților infecția este asimptomatică. La cei minoritari se produce o uretită caracterizată de secreție uretrală purulentă, fluidă, insoțită de o senzație de arsură pe uretră care este intensificată în timpul micțiunii. Aceste simptome sunt caracteristice infecției acute. În evoluția cronică, infecția ajunge în prostată iar secreția devine purulentă, apoi seroasă.

În momentul în care flagelatul ajunge în vagin se produce o degenerare și descuamare a epiteliului vaginal adiționată de apariția unui infiltrat inflamator al mucoasei. Acestora li se adaugă modificări exudative, proliferative, leziuni necrotice și hemoragice. Parazitul se găsește în vagin fie aderat la celulele epiteliale, fie liber în secreția vaginală dar în cazuri foarte rare poate fi găsit în interiorul celulelor epiteliale. În acest caz celulele epiteliale au aspect malign pentru că sunt binucleate, au nucleul hipertrofiat, hipercromatic și prezintă halou perinuclear. Cu toate acestea, nu s-a stabilit o relație cauzală între cancerul cervical și infecțiile cu Trichomonas (Rădulescu și Meyer, 1992).

Aspectele macroscopice descriu faptul că peretele vaginal apare congestionat, sensibil, la suprafața mucoasei observându-se aglomerări fibrinoleucocitare care conțin paraziți și hematii. Microscopic se constată faptul că epiteliul vaginal este erodat și se observă coloniile de paraziți in masele fibrinoleucocitare. La nivelul chorionului se disting zone de vascularizare intensă, cu regiuni hemoragice și infiltrate leucocitare.

Tratamentul standard pentru trichomoniază este metronidazolul dar acesta poate cauza hipersensibilitate. Se mai poate folosi tinidazol sau paromomicină dar și acestea au efecte secundare precum ulcerațiile locale sau vulvite (Owen și Clenney, 2004).

2.3.2.3 Vaginoză fungică

Fungii sunt reprezentați ca fiind agenți patogeni la plante, insecte și vertebrate. Creșterea fungilor in țesuturile animale și umane se numește micoză. Gravitatea acesteia variază astfel încât poate produce un disconfort minim sau poate periclita viața (Chifiriuc și colab., 2011)

Genul Candida însumează aproximativ 150 de specii, o parte dintre acestea fiind componente ale microbiotei normale a tractului digestiv a tegumentelor și a mucoaselor la om. Colonizarea este timpurie, imediat după naștere. Speciile de Candida pot fi localizate în primul rând la nivelul membranelor mucoase, dar și în piele sau plămân. Această micoriză poate produce procese patologice bucale, tonsilare si vaginale. La om, cea mai întâlnită specie fungică care poate fi și patogenă este Candida albicans care poate produce candidoză în anumite condiții. Persoanele cu candidoză sunt imunocompromise.

Din punct de vedere morfologic, pe preparatele microscopice, Candida albicans se prezintă sub formă de filamente cilindrice simple sau ramificate de aproximativ 3-5 microni grosime și de 50-600 microni lungime, alcătuite din celule așezate cap la cap. La extremitatea unor filamente sau chiar între filamente, se observă chlamidosporii (Fig. 9) caracteristici grupului C. albicans sub formă de celule sferice sau ovoide, de 5-7 microni diametru, ce sunt foarte refringente (Duca și colab., 1979).

Fig. 9. Candida albicans cu chlamidiospori

(sursa: https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/media/File:Candida_albicans_2.jpg)

Tulpinile de Candida albicans prezintă două particularități importante: patogenitate și virulență. Acestea se datorează capacității microorganismului de a adera la suprafața celulelor gazdă de a produce factori de virulență solubili implicați în progresia infecției, ca de exemplu, fosfolipazele și proteazele. Patogenitatea și virulența sunt susținute și de proprietatea de înmugurire deoarece formarea hifelor reprezintă un mecanism de evitare a mecanismelor de apărare a gazdei (Chifiriuc, și colab.,2011)

Cel puțin o dată în timpul vieții, o femeie adultă se confruntă cu vaginita micotică, 80% din situații fiind cauzate de Candida albicans dar pot fi implicate și Candida tropicalis sau Candida glabrata. O proporție de 15% până la 20% dintre femei au colonizarare asimptomatică iar tipurile de tulpină sunt similare la femeile simptomatice și asimptomatice. Candida albicans este descrisă ca având o aderență mai mare la celulele epiteliale vaginale decât C. tropicalis și C. glabrata și din acest motiv se explică de ce acest microorganism se regăsește la un număr din ce în ce mai mare de infecții (Carr și colab., 1998).

Pacientele cu vaginită fungică raportează una sau mai multe din următoarele simptome: prurit (50%), umflătură (24%), disurie (33%). Secreția vaginală, atunci când este prezentă este de obicei groasă și albă (Owen și Clenney, 2004).

Chiar dacă simptomele infecției fungice nu sunt legate strict de numărul microorganismelor, cele mai multe femei purtătoare simptomatice au un număr mare de drojdii prezente în probele preluate. Această afecțiune este inițiată de dezvoltarea excesivă a speciilor de drojdie și este însoțită de scurgeri vaginale, mâncărimi și eritem (Rathod și colab., 2012),

Exista o serie de factori care cresc sensibilitatea la infecțiile vaginale cu drojdii, de exemplu, în cazul femeilor gravide sau a celor care își administrează contraceptive orale. Explicația se referă la faptul că estrogenul sporește capacitatea celulelor de candida să adere la celulele epiteliale vaginale, urmând ca ulterior să apară infecția. S-a dovedit că mai multe tulpini de Candida prezintă receptori pentru hormonii de reproducere feminini, care pot facilita virulența si formarea miceliilor de drojdie. Tot în cadrul acestor factori care cresc susceptibilitatea la candidoze se încadrează și antibioticele cu spectru larg (ampicilina, tetraciclină, cefalosporine, clindamicină) care produc dezechilibre ale microbiotei vaginale normale. Unul dintre cele mai importante roluri ale microbiotei vaginale se referă la prezența lactobacililor care previn colonizarea acestui mediu de către celule fungice prin producerea unei proteine speciale, proteină care permite atașarea lactobacilului de celulele mucoasei în detrimentul drojdiilor.

Infecțiile vaginale cu drojdii sunt cauzate și de diabetul zaharat, glicozurie, obezitate dar și de infecțiile cu HIV. Din acest punct de vedere este indicat ca tuturor femeilor care au infecții vaginale fungice în mod repetat sau care sunt greu de tratat să li se realizeze o testare HIV deoarece vaginoza micotică care recidivează a fost corelată ca o complicație a infecției cu HIV. La polul opus se află multe femei care deși nu sunt predispuse la unul dintre acești factori, ele tot suferă de infecții frecvente cu fungi (Carr și colab., 1998).

Toate regimurile de tratament standard pentru candidoză fără complicații sunt eficace, rezultând o rată de vindecare clinică de aproximativ 80 de procente. Majoritatea medicamentelor sunt disponibile fără prescripție medicală însă multe femei preferă fluconazolul (Rathod, 2012).

Candidoza recurentă este descrisă ca fiind o infecție fungică care apare de mai mult de 4 ori într-un an. Pentru tratarea acesteia trebuie luat în considerare dacă femeia suferă de diabet zaharat necontrolat, imunodeficiență, dacă utilizează contraceptive orale sau se tratează cu antibiotice pentru că toate acestea pot întreține reapariție candidozei (Owen și Clenney, 2004).

Simptomele asociate candidozei recurente pot fi, mai degrabă, cauza unei reacții de hipersensibilitate decât o infecție invazivă, această reacție fiind asociată cu creșterea secreției vaginale. Spălăturile vaginale a 18% până la 20% dintre paciente cu candidoză recurentă au dezvoltat IgE anti-candida, sugerând un răspuns imediat de hipersensibilitate. Reinfecția este atribuită unui rezervor persistent care poate fi reprezentat de partenerul sexual sau poate avea localizare intestinală sau rectală (Carr și colab., 1998).

Există situații în care unele femei susțin că au infecție cu levuri în condiții de stres sau înainte de menstruație. În acest sens au fost propuse mai multe teorii pentru a explica aceste evenimente clinice însă etiologia exactă nu este cunoscută.

De-a lungul timpului s-a considerat că a existat o schimbare în speciile de drojdie care cauzează infecții. De exemplu, s-au raportat creșteri de 10% cu C. glabrata și C. tropicalis în anul 1970 până la 20% în 1980 (Carr și colab., 1998).

Pe parcursul mai multor decenii, cele mai multe articole publicate au prezentat că speciile de Candida pot fi prezente în vaginul unei femei în asociere stabilă cu epiteliul genital. De cele mai multe ori, aceste celule sunt transportate din vagin în intestin. Rata de transport variază în funcție de drojdie și crește după pubertate și în timpul sarcinii, ceea ce sugerează un rol important pentru fiziologia gazdei în cazurile de candidoză vaginală.

Aproape de la începutul studiilor s-a descris o relație între nivelurile de estrogen și colonizarea bacteriană. Această relație este valabilă și pentru speciile de Candida. De exemplu, s-a demonstrat că șobolanii sunt rezistenți la colonizarea cu specii de Candida cu excepția cazului în care animalele au o cantitate suficientă de estrogeni pentru a provoca cornificare vaginală (Larsen și Monif., 2001).

Dacă prevalența speciilor de Lactobacillus este mare (mai ales în timpul anilor de reproducere și în perioada sarcinii), s-a constatat că și prevalența speciilor de Candida este mare. Logic ar fi ca drojdia să fie dominată de bacilii Döderlein sub acțiunea peroxidului de hidrogen dar se pare că lactobacilii co-există cu celula micotică. Totuși, speciile de Candida sunt mai puțin sensibile la efectele microbicide le peroxidului de hidrogen decât sunt producătorii de non-catalază cum ar fi N. gonorrhoeae și Streptococcus agalactie. Acest lucru se datorează probabil faptului că apa oxigenată deteriorează membranele celulare nefiind împiedicată de catalaza intracelulară.

În mod normal, candidoza vulvovaginală apare în asociere cu o creștere semnificativă a numărului de unități formatoare de colonii de specii de Candida care sunt prezente în formă invazivă. Orice influență microbiologică care permite înmulțirea celulelor fungice duce la apariția simptomelor specifice candidozei și orice efect microbiologic care suprimă numărul de drojdii ar putea asigura ca acestea să rămână la statutul de organism comensal (Larsen și Monif., 2001).

Într-un studiu al microbiotei gastrice la șoareci, s-a constatat că există două zone de țesut distincte care sunt colonizate de o cultură aproape pură dintr-o specie de Lactobacillus și o cultură aproape pură de drojdie. În decursul acestui experiment eliminarea lactobacilului prin tratament cu antibiotice. După această etapă s-a constatat că golul lăsat de către lactobacili a fost preluat de drojdie. Acest lucru sugerează faptul că speciile de Lactobacillus au un efect antagonist asupra speciilor de Candida (Savage, 1969).

În figura 10 este ilustrată o infecție fungică care este însoțită de un număr foarte mare de leucocite dar care prezintă și frecvente celule epiteliale. Din analiza acestui frotiu se constată că bacilii Gram pozitivi sunt rari deoarece aceștia au fost substituiți de coci Gram negativi. Prezența leucocitelor într-o cantitate mai mare decât în mod normal indică o infecție, în acest caz fiind vorba de o infecție fungică.

Fig. 10. Frotiu colorst Gram cu celule levurice

În cazul candidozelor se poate aplica un tratament cu irigații ce conțin o soluție slabă de kaliu permanganic iar seara se introduce în vagin un ovul cu stamicin timp de 10-15 zile (Duca, 1979).

CAPITOLUL 3. Aspecte practice

INTRODUCERE

În ramura teoretică a lucrării cu titlul  „Evaluarea compoziției microbiotei normale și rolul acesteia în menținerea homeostaziei la nivelul tractului genital” s-au descris aspecte legate de caracterizarea generală a microbiotei normale cu accent pe microbiota normală a tractului urogenital dar și noțiuni privind maladiile induse de dezechilibrul acestei microbiote. Partea practică iși propune să realizeze o statistică privind vârsta pacientelor și agentul patogen implicat în maladia microbiană. De asemenea, se urmăresc și modificările care apar în urma infecției cu microorganismul patogen.

Scopul lucrării de față a fost evaluarea compoziției microbiotei normale și modificările acesteia induse de starea de infecție la nivelul tractului genital feminin. În acest sens, obiectivele lucrării au fost reprezentate de cunoașterea microbiotei normale a tractului urogenital și rolurile acesteia pentru organismul uman.

Obiectivele ce gravitează în jurul proiectului sunt:

O1: Evaluarea compoziției microbiotei normale și rolul acesteia pentru organismul uman;

O2: Clarificarea diferențelor dintre vaginite și vaginoze cu accent pe speciile microbiene implicate;

O3: Stabilirea unei statistici legate de agentul patogen, vârsta și boala în care este implicat;

O4: Formarea de deprinderi pentru lucrul în laborator în diagnosticul infecțiilor genitale;

3.1 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECȚIILOR GENITALE

Microbiota normală a tractului genital feminin este influențată de pH-ul și concentrația de estrogeni a mucoasei care se află în strânsă legătură cu vârsta, astfel:

prepubertar și postmenopauză – microbiota este dominată de stafilococi și corinebacterii, reprezentând de fapt aceeași microbiotă ca cea de pe suprațața epiteliului;

la femeile active sexual microbiota se modifică, fiind alcătuită din Enterobacteriaceae, streptococi, stafilococi și bacterii anaerobe reprezentate de lactobacili, bacili anaerobi nesporulati dar și de coci anaerobi. Lactobacilii reprezintă microbiota vaginală normală la aceste femei;

Infecțiile tractului genital feminin pot fi clasificate în funcție de mai multe criterii, cele mai importante fiind:

1. După originea agentului infecțios:

a) infectii endogene, determinate de microorganisme din flora vaginala normala;

b)  infectii exogene, cauzate in special de microorganisme cu transmitere sexuala:

– bacterii (Neisseria gonorrhoeae, Treponema pallidum)

– virusuri (Papillomavirus)

– protozoare (Trichomonas vaginalis).

2. După localizarea infecției:

a) infecții genitale joase: exemplu: infecții vulvare, bartholinita, vaginita, vaginoza;

b) infecții genitale inalte: endometrite și endomiometrite (Synevo, 2010);

Diagnosticul infecțiilor genitale joase

În cabinetele de ginecologie se realizează recoltarea produselor patologice, cel mai adesea din fundul de sac vaginal posterior, folosindu-se un instrumentar adecvat.

Există două teste rapide care pot indica un diagnostic corect și se pot efectua în momentul recoltării, chiar în cabinetul de consultație. Acestea sunt:

Determinarea pH-ului secreției vaginale cu ajutorul unei hârtii speciale numită hârtie indicator, care poate detecta infecția cu T. Vaginalis sau prezența vaginozei;

Testul aminelor volatile (“whiff test”) – peste secreția vaginală recoltată pe vată se adaugă câteva picături de KOH 10%. În momentul în care se degajă un miros neplăcut de pește alterat, atunci se poate suspecta o vaginoză (Buiuc, 1999);

Secreția vaginală recoltată poate fi examinată în stare nativă sau sub formă de frotiu. Examinarea în stare nativă permite observarea mobilității, formei și dimensiunii microorganismului. Tehnica presupune introducerea tamponului cu secreție vaginală într-un recipient cu mediu de îmbogățire a unor microorganisme din care se va afectua un preparat proaspăt de tip lamă lamelă. Examinarea se face cu obiectivul de 10x și 40x și permite evidențierea parazitului Trichomonas vaginalis, a levurilor și a reacției inflamatorii. Reacția inflamatorie este intensă în trichomoniază, discretă în candidoză și absentă în vaginoză.

Examinarea secreției vaginale sub formă de frotiu implică colorarea lamelor. Pentru aprecierea florei vaginale , lamele vor fi colorate Gram iar pentru aprecierea reacției inflamatorii, lamele se vor colora Giemsa (Forbes și colab., 2002).

3.2 MATERIALE ȘI METODE

Pentru realizarea acestei lucrări, s-au folosit probe ce aparțin la 71 de paciente anonime cu vârsta cuprinsă între 18 și 77 de ani. Probele provin de la laboratorul privat de analize medicale Iancului strânse pe o durată de 3 luni, respectriv ianuarie, februarie și martie din anul 2016.

Pentru examinarea frotiurilor s-au urmărit aspecte legate de:

vârsta pacientei;

numărul relativ și aspectul celulelor epiteliale vaginale;

prezența sau absența leucocitelor;

prezența sau absența bacililor Gram negativi și cocilor Gram pozitivi;

prezența sau absența levurilor precum și a protozoarelor;

alte date cu privire la diagnosticul bacteriilor (Mareș, 2007);

Diagnosticul de laborator al infecțiilor miocrobiene se bazează pe câteva etape care trebuie respectate și realizate corect (Fig. 11).

Fig. 11 . Etapele diagnosticului de laborator al infecțiilor microbiene (original).

În decursul studiului ne-am focalizat asupra a 3 etape:

1. Recoltarea

2. Colorarea frotiurilor

3. Evaluarea probelor

1. Recoltarea reprezintă punctul de întâlnire dintre laboratorul de microbiologie și clinică. O recoltare incorectă este corelată cu imposibilitatea microbiologului de a ajunge la un diagnostic valid. Pentru a elimina această eroare, trebuie să se cunoască:

– în ce produse patologice se găsesc bacterii;

– momentul optim de recoltare;

– dacă proba este sterilă sau conține floră normală;

– care este procedeul cel mai corect de recoltare;

– cantitatea necesară pentru fiecare probă;

– procedeele de conservare și de transport;

Examenul direct poate fi macroscopic și microscopic

Examenul macroscopic este foarte important atât din punct de vedere al diagnosticului în sine cât și pentru alegerea mediului de cultură cel mai corespunzător izolării bacteriilor (Mareș, 2007).

În cazul secrețiilor vaginale, examenul microscopic are rol de diagnostic. Examenul microscopic implică realizarea de frotiuri și colorarea lamelor pentru o mai bună evidențiere a microbiotei sau preparate proaspete lamă lamelă pentru infecțiile cu Trichomonas vaginalis.

Un examen microscopic corect include stabilirea unui scor/grad al microbiotei normale. Acest scor este diferit de sistemul de clasificare Papanicolau.. Există:

Scor 1 – microbiota normală echilibrată cu lactobacili Gram pozitivi;

Scor 2-3 – microbiotă dezechilibrată cu rari lactobacili Gram pozitivi;

Scor 4 – microbiota este complet dinstribuită

A realiza un frotiu înseamnă a etala, în strat subțire, pe o lamă de sticlă o porțiune mică din produsul patologic, în acest caz secreția vaginală. Această etapă este urmată de uscarea, fixarea și colorarea frotiului.

Raportul preliminar permite un diagnostic aproximativ care se realizează în cazuri speciale sau la cererea clinicianului.

Din proba cu secreție vaginală se folosește un inocul pentru însămânțarea pe medii de cultură potrivite pentru a se ajunge la colonii pure, izolate. În acest moment, cand avem siguranța că în acea colonie există o singură specie microbiană, putem realiza o antibiogramă cu identificarea microorganismului, rezultatul fiind transmis clinicianului.

2. Colorarea

Pentru identificarea agenților patogeni, s-au folosit frotiuri cu secreție vaginală care au fost colorate Gram.. Colorația Gram este folosită în microbiologie pentru examenul microscopic al bacteriilor, care a permis ulterior clasificarea acestora în funcție de afinitatea peretelui bacterian.

Principiul constă în faptul că violentul de gențiana (colorant bazic) pătrunde în celula bacteriană fixată în prealabil și reacționează cu componenții acizi din citoplasmă care, după tratarea cu soluție Lugol (iodură de potasiu), formează un complex stabil intracelular. Complexul insolubil este specific bacteriilor Gram pozitive care nu se decolorează cu alcool-acetonă. Bacteriile Gram negative în care nu se formează acest complex stabil se decolorează și trebuie recolorat cu alt colorant de contrast (fuxina) (Buiuc și Panzaru, 2009). Rezultatul se referă la faptul că bacteriile Gram positive vor fi violet iar cele Gram negative vor fi roșii (Fig. 12).

Materiale necesare

– cultură microbiană

– lame de sticlă curate și degresate

– pipete Pasteur sau anse bacteriologice

– flacără

– soluții: violet de gențiana, soluție Lugol, metanol, fuxină diluată (1/10)

– microscop

– ulei de imersie (Buiuc și Panzaru, 2009).

Modul de lucru

1. Frotiurile pot fi fixate prin încălzire sau cu metanol;

2. Frotiurile se pot usca în aer sau se mențin pe o platină încălzitoare electrică, la 60ºC, până la uscare

3. Dacă frotiurile sunt uscate în aer se vor trece de două sau trei ori printr-o flacără. Trebuie evitată supraîncălzirea lamei pentru a nu denatura frotiul.

4. Se lasă lama să se răcescă înainte de colorare;

5. Fixarea cu metanol previne liza eritrocitelor. Pentru fixare, se adaugă câteva picături de metanol pe lamă, se lasă în contact timp de 1 minut, apoi se varsă și se lasă lama să se usuce la aer;

6. Se inundă frotiul fixat anterior, cu violet de gențiana. Se lasă în contact 60 secunde;

7. Se varsă soluția de violet de gențiana și se clătește lama ușor cu apă de robinet. Clătirea trebuie realizată cu mare atenție deoarece o clătire excesivă poate determina îndepărtarea violetului de gențiana din celulele Gram pozitive. Apa se varsă pe unul din capetele lamei, oblic, pentru a asigura o curgere lentă peste frotiu.

8. Se clătește apoi cu soluție Lugol, timp de 3-5 secunde;

9. Se inundă frotiul cu soluție Lugol și se lasă în contact 30 secunde;

10. Se spală cu apă de robinet;

11. Se toarnă soluție alcool-acetonă peste frotiu, într-un capăt al lamei, oblic, până când soluția care se scurge la capatul opus devine clară. Timpul de decolorare variază în funcție de grosimea frotiului (în general 8-10 secunde);

12. Se spală cu apă de robinet;

13. Se inundă lama cu soluție de safranină 0,4 %, timp de 30 secunde;

14. Se îndepărtează colorantul (safranină 0,4%) cu un jet de apă de robinet ;

15. Se usucă lama în aer, în poziție verticală, iar apoi se șterge reversul acesteia cu un șervețel îmbibat în alcool sau acetonă.

16. Se apaugă ulei de imersie peste frotiu

17. Se observă preparatul la microscop la obiectiv de 100x (Mareș, 2007)

Fig. 12. Colorarea bacteriilor Gram pozitive și Gram negative (original)

Evaluare probe

Pentru evaluarea probelor s-au luat în considerare observații legate de aspectul celulelor epiteliale vaginale, prezența sau absența microbiotei lactobacilare, prezența sau absența agenților patogeni precum protozoare și/sau levuri, modificări ale microbiotei normale dar și informații legate de posibilitatea unei inflamații.

3.3 REZULTATE ȘI DISCUȚII

Toate frotiurile analizate conțin secreție vaginală iar în decursul studiului s-au observat frotiuri normale, frotiuri cu T. vaginalis, altele cu specii de Candida iar altele cu G. vaginalis.

Frotiu cu secreție vaginală normală

Pe frotiul colorat Gram se identifică bacili Gram pozitivi, drepți sau ușor curbați, având o grosime și o lungime variabilă și care, uneori, pot fi filamentoși, reprezentând microbiota lactobacilara (bacili Döderlein). Celulele epiteliale vaginale sunt relativ frecvente și sunt acoperite de lactobacili Gram pozitivi. Nu se observă celule leucocitare deoarece nu există o infecție care să determine sinteza lor (Fig.13). Există și cazuri în care ele pot exista în mod normal dar într-un număr foarte mic (Synevo, 2010).

Fig. 13. Frotiu cu secreție vaginală normală (original, 1000x)

Frotiu cu Trichomonas vaginalis (Trichomoniază)

Trichomonas vaginalis se observă cel mai bine pe preparatul nativ dar poate fi identificat și prin colorație Gram. În acest caz, microorganismul este identificat după forma și aspectul său. Are formă rotund-ovală cu dimensiuni de 7-23/5-15 μm. Are 4 flageli anteriori și unul posterior precum și o membrană ondulantă și un axosti. Are citoplasmă palidă și nucleu central. Se observă celule epiteliale relativ frecvente dar frotiul prezintă și un număr foarte mare de leucocite ceea ce indică o reacție inflamatorie (Fig. 14).

Fig. 14. Frotiu cu secreție vaginală în care se observă T.vaginalis și frecvente leucocite

Frotiu cu Candida sp.

Pe frotiu se observă adesea celule epiteliale și leucocite rare până la relativ frecvente. Flora microbiană prezintă frecvenți bacili Gram pozitivi și rari coci Gram pozitivi. În unele cazuri se pot observa și cocobacili Gram pozitivi. În cazutl candidozei, levura este frecventă și apare înmugurită (Fig.15) izolată, uneori filamentoasă (Fig.16).

Fig. 15. Frotiu cu secreție vaginală în care se observă celule levurice inmugurite(original, 1000x)

Fig. 16. Frotiu cu secreție vaginală în care se observă levuri dispuse în filamente (Synevo, 2010).

Frotiu cu Gardnerella vaginalis

Pentru acest tip de frotiu este suficient să observăm celulele „clue” (Fig. 17). Acestea sunt celule epiteliale vaginale acoperite de cocobacili Gram labili (variabili). Celulele epiteliale și leucocitele sunt rare până la relativ frecvente. Microbiota normală cu lactobacili Gram pozitivi este substituită de microorganisme Gram negative.

Fig. 17. Frotiu cu aspect de Gardnerella vaginalis. (original, 1000x)

Rezultatele obținute în urma analizării lamelor cu secreție vaginală normală și anormală au fost folosite în realizarea unei statistici cu privire la intervalul de vârstă în care s-au identificat cele mai multe modificări ale microbiotei normale induse de anumiți agenți patogeni. Pentru acest lucru am realizat un grafic (Fig. 16) în care, pe axa abscisei se regăsesc intervalele de vârstă iar pe axa ordonatei sunt notate numărul de cazuri patologice corespunzătoare unui agent patogen,

Fig. 18. Reprezentarea grafică a infecțiilor cu Trichomonas vaginalis, Candida sp.și Gardnerella vaginalis pentru intervale diferite de vârstă (original)

Din interpretarea acestui grafic se observă că din cele 18 cazuri de secreție vaginală patologică, un singur frotiu prezintă infecție cu T. Vaginalis. Cele mai multe infecții sunt cele cu Candida sp. (în special Candida albicans) și cu G. vaginalis.

Luând în considerare intervalul de vârstă în care se identifică cele mai multe maladii genitate datorate microbiotei autohtone sau alohtone, putem spune că mai frecvente infecții se regăsesc la femeiele de vârstă reproductivă și active sexual. Deci, cu cât activitatea sexuală este mai frecventă, cu atât sunt mai frecvente infecțiile genitale.

Pentru o privire de ansamblu, s-a realizat o diagramă cu distribuția cazurilor normale și patologie (Fig. 19) și s-a calculat raportul (R) dintre cazurile cu secreție vaginală provenite de la femei sănătoase din punct de vedere clinic și cazurile cu secreție vaginală anormală folosind formula:

R 2,944

Acest raport ne sugerează că frotiurile cu secreție vaginală anormală sunt de aproximativ de 3 ori mai puține decât frotiurile cu secreție vaginală normală, incidența acestora depinzând de mai mulți factori:

– vârstă

– igienă

– alimentație

– medicamente

– produse de îngrijire personală

– pilule contraceptive, dispozitive intrauterine, etc.

Fig. 19. Raportul dintre cazurile cu secreție vaginală normală și cele cu secreție vaginală anormlă

CONCLUZII

Microbiota normală a organismului uman prezintă un caracter dinamic ce este dat de variația calitativă și cantitativă a microorganismelor această variație fiind corelată cu starea fiziologică a individului, cu vârsta acestuia dar și cu sexul. Fiecare situs nesteril are propria microbiotă normală.

Microbiota normală de la nivelul tractului urogenital este indispensabiă sănătății acestui tract. Speciile de Lactobacillus îndeplinesc diverse roluri de protecție a tractului genital prin mecanisme ca producerea de acid lactic, peroxid de hidrogen, bacteriocine, substanțe bacteriocin-like și biosurfactanți dra și prin competiția spațiu și nutrienți cu alte microorganisme potențial patogene

În decursul vieții unei femei, microbiota urogenitală este tranzitorie, fiind influențata de secreția de estrogeni care este stopată sau nu în funcție de vârstă.

Dezechilibrele microbiotei normale a tractului urogenital influențează în mod direct sănătatea organismului. Pot apărea maladii de tip inflamator precum vaginitele dar și boli infecțioase ca vaginita bacteriana, candidoza și trichomoniaza.

În esență, cele mai multe infecții sunt cele Candida sp. și cele cu Gardnerella vaginalis. În decursul studiului am constatat că din cele 71 de paciente, o singură persoană era infectată cu T. Vaginalis, 8 persoane au fost infectate cu Candida sp. și 9 cazuri se întâlnesc la pacientele care au fost diagnosticate cu Gardnerella vaginalis, adică cu vaginoză bacteriană.

Infecțiile genitate sunt corelate în mod direct cu activitatea sexuală deoarece cele mai multe infecții s-au identificat la femeile active din punct de vedere sexual.

BIBLIOGRAFIE

Ardelean I., 2008, Microbiologie medicală, Microbiologie generală vol.II, Edit. Ars Docendi, 71-91.

Baruah F.K., Sharma A., Das C. Hazarika N.K., Hussain J.H., 2014. Role of Gardnerella vaginalis as an etiological agent of bacterial vaginosis. Iran J Microbiol. 6(6), 409-414.

Bautista C.T., Wurapa E., Sateren W.B., Morris S., Hollingsworth B., Sanchez, J.L., 2016. Bacterial vaginosis: a synthesis of the literature on etiology, prevalence, risk factors, and relationship with chlamydia and gonorrhea infections. Mil Med Res. 3:4.

Bîlbîe V., Pozsgi N., Algeorge G., și colab., 1985, Bacteriologie medicală, Editura Medicală, 2, 17-19.

Boris S., Barbés C., 2000. Role played by lactobacilli in controlling the population of vaginal pathogens. Microbes and Infection. 2, 543-546.

Brotman R.M., Shardell M.D, Gajer P. Fadrosh D., Chang K., Silver M.I., Viscidi R.P., Burke A.E., Ravel J., Gravitt P.E., 2014. Association between the vaginal microbiota , menopause status and signs of vulvovaginal atrophy. Menopause. 21(5), 450-458.

Buiuc D., Panzaru C., 2009,   Colorații, coloranți și reactivi pentru microscopie, micrometrie, Tratat de microbiologie clinică. Ediția III, 1173-1215.

Buiuc D., Neguț M., 1999, Diagnosticul de laborator al infecțiilor tractusului genital feminin. Tratat de Microbiologie Clinică. Ediția 1, Editura medicală, 304-318, 672-675.

Buiuc D., 1992, Microbiologie generală, Microorganisme patogene și investigarea etiologică a infecțiilor, Editura Didactică și Pedagogică, 439-466.

Bull M..J., Plummer N.T., 2014. Part 1: The Human Gut Microbiome in Health and Disease. Integr Med (Encinitas). 13(6), 17-22.

Burta L., Marusca P., Pelea D., 2007, Parazitologie, Curs de microbiologe pentru Medicină Dentară, Editura Universității din Oradea, 113-116.

Burton J.P., Cadieux P.A., Reid G., 2003. Improved Understanding of the Bacterial Vaginal of Women before and after Probiotic Instillation. Appl. Environ. Microbiol. 69, 97-101.

Carr P.L., Felsenstain D., Friedman R.H., 1998. Evaluation and Management of Vaginitis. J Gen Intern Med. 13(5), 335-346.

Chifiriuc C., Mihăescu G., Lazăr V., 2011, Microbiota normală a organismului uman, Microbiologie și virologie medicală, Editura Universității din București, 71-145.

Cribby S., Taylor M., Reig G., 2008. Vaginal microbiota and the Use of Probiotics. Interdiscip Perspect Infect Dis. 2008.

Davis C., 1996, Normal Flora, Medical Microbiology, 6.

Dobson A., Cotter P.D., Ross R.P., Hill C., 2012. Bacteriocin Production: a Probiotic Train?. Appl Environ Microbiol. 78(1), 1-6.

Duca E., Duca M., Furtunescu G., 1979, Micologie medicală, Microbiologie medicală, Editura Didactică și Pedagogică, 938-942.

Forbes B.A., Sahm D.F., Weissfeld A.S., 2002.  Bailey and Scott’s Diagnostic Microbiology. Genital tract infec. 939-953.

Garber G.E., 2005. The laboratory diagnosis of Trichomonas vaginalis.  Can J Infect Dis Med Microb. 16(1):35-38.

Gilbert N.M., Lewis W.G., Lewis A.L., 2013. Clinical Features of Bacterial Vaginosis in a Murine Model of Vaginal Infection with Gardnerella vaginalis. Journal List. 8(13).

Gor H.B., 2015. Vaginitis, Medscape.

Hickey R.J., Zhou X., Settles M.L, 2015. Vaginal Microbiota of Adolescent Girls Prior to the Onest of Menarche Resemble Those of Reproductive-Age Women. mBio. 6(2)

Jandhyala S.M., Talukdar R., Subramanyam C., Vuyyuru H., Sasikala M., Reddy D.N., 2015. Role of the normal gut microbiota. World J Gastroenterol. 21(29), 8787-8803.

Khan J.K. Shah R., Gautman M., Patil S., 2007. Clue cells. Indian J Sex Transm Dis. 28(2).

Kumar N., Behera B., Sagiri S.S., Pal K., Ray S.S., 2011. Bacterial vaginosis: Etiology and modalities of treatment-A brief note. J Pharm Bioallied Sci. 3(4), 496-503.

Larsen B., Monif G.R.G., 2001. Understanding the Bacterial Flora of the Female Genital Tract. Clin Infect Dis. 32(4), 69-77.

Lee K.Y., 2009, Handbook of probiotics and prebiotics, Edit. Johm Wiley & Sons, 441-443.

Ma B., .Forney L.J., Ravel J. 2012. The vaginal microbiome: rethinking health and diseases. Annu Rev Microbiol. 66, 371-389.

Mac Bride M.B., Deborah J.R., Lynne T., ShusterL.T., 2010. Vulvovaginal Atrophy. Mayo Clinic Proceeding.  85(1): 87–94.

Mareș M., 2007, Tehnici de laborator în micologia medicală, Edit. PIM, 2007, 28-31.

Marin A.F., 2016. Soluții pentru nou-născuții prin cezariană. Viața medicală. 8 (1362).

Martin D.H, 2012. The Microbiota of the Vagina and Its on Women’s Health and Diseases. Am J Med Sci. 343(1), 2-9.

Mihăescu G., 2000, Microbiota normală a mamiferelor, Microbiologie generală și virologie, Editura Universității din București, 496-529.

Mihăescu G. și colab., 2007, Noțiuni de ecologie a microorganismelor, Microbiologie generală, Editura Universității din București, 397-441.

Moldoveanu M., 2012, Virusologie, bacteriologie și parazitologie pentru asistenți medicali, Edit. ALL, 186-177.

Otto M., 2009. Staphylococcus epidermis – the 'accidental'  pathogen. Nature Reviews Microbiology. 7 (8): 555–567.

Owen M.K., Clenney T.L., 2004. Management of vaginitis. Am Fam Physician. 70(11), 2125-2132.

Phillip E., 2002, Polymicrobial Diseases, Chaper 7. Vaginosis as a Mixed Infection.

Plourd D.M., 1997. Practical Guide to Diagnosing and Treating Vaginitis. MedGenMed. 1(2).

Rathod S.D., Klausner J.D., Krupp K., Reingold A.L., Madhivanan P., 2012. Epidemiologic Features of Vulvovaginal Candidiasis among Reproductive-Age Women in India. Infect Dis Obstet Gynecol. 2012(2012).

Razzak M.S.A, Al-Charrakh A.H., Al-Greitty B.H., 2011. Relationship between lactobacilli and opportunistic bacterial pathogenes associated with vaginitis. N Am J Med Sci. 3(4), 185-192.

Rivas A., 2015. Germs On Hands: 8-Year-Old Boy's Handprint Reveals Various Bacteria After Playing Outside. Medical Daily.

Romero R., Hassan S.S., Gajer P.,  Tarca A.L., Fadrosh D.W., Nikita L., Galuppi M., Lamont R.F., Chaemsaithong P., Miranda J., Chaiworapongsa T., Ravel J., 2014. The composition and stability of the vaginal microbiota of normal pregnant women is different from that of non-pregnant women. Microbiome. 2.

Ronald A.R., Alfa M.J., 1996, Chapter 97, Microbiology of the Genitourinary System, Medical Microbiology. Ediția 4.

Schäffler A., Altekrüger J., 1994, Microbiologie medicală și imunologie, Manual prescurtat și index pe obiecte, Edit. ALL, 17-19.

Sanford J.A, Gallo R.L., 2013. Function of the skin microbiota in health and disease. Semin Immunol. 25(5), 370-377.

Savage D.C., 1969. Microbial Interference Between Indigenous Yeast and Lactobacilli in the Rodent Stomach. J Bacteriol June. 98(3), 1279-1283.

Synevo, 2010, Referinele specifice tehnologiei de lucru utilizate.

Sobel R., Sobel J., 2014, Skin, Mucosa and Menopause, Atrophic Vaginitis in the Monopause, 175-180.

Thoma M.E., Gray R.H., Kiwanuka N. Aluma S., Wang M.C., Sewankambo N., Wawer M.J., 2011. Longitudinal changes in vaginal microbiota composition assessed by Gram-stain among never sexually active pre- and postmenarcheal adolescents in Rakai, Uganda. J Pediatr Adolesc Ginecol. 24(1), 42-47.

Todar K., 2009, Online textbook of bacteriology.

Vinturache A.E., Gyamfi-Bennerman C., Hwang J., Mysorekar I.U., Jacobsson B., 2016, Mathernal microbiome – A pathway to preterm birth, Seminars in Fetal & Neonatal Medicine, 21, 94-99.

Volk A., Wheeler F., 1973, The Normal Microbial Flora of the Human Body, Basic Microbiology, Edit. J.B. Lippincott Company, 311-322.

Zilberstein B., Quintanilha A.G., Pajecki D., Moura E.G., Alves P.R., Maluf F.F., 2007. Digestive tract microbiota in healthy volunteers. Clinics. 62(1), 44-57.

http://www.clinicaladvisor.com/cmece-features/tissue-changes-associated-with-vaginal-atrophy/article/177880/

https://en.wikipedia.org/wiki/Candida_albicans#/media/File:Candida_albicans_2.jpg