Evaluarea citotoxicității induse de nanoparticule și polifenolul liber [307344]

[anonimizat]. Acestea sunt intens investigate datorită capacitații lor de a livra un anumit medicament la o [anonimizat], putând interacționa cu sistemele biologice fără a induce efecte negative. [anonimizat], [anonimizat], însă există multe studii în care sunt utilizate și pentru administrarea direcționată de medicamente (Paul și Sharma, 2010; Mody și colab., 2010; Flores și colab., 2019).

[anonimizat]-a lungul timpului aplicabilitatea acestor particule s-a extins și spre tratarea bolilor cardiovasculare. [anonimizat], fenomen ce stă la baza apariției diferitelor afecțiuni ale inimii. [anonimizat] E-selectina sau VCAM-1, fie indirect prin direcționarea fizică a nanoparticulelor magnetice (Kessner și colab., 2001; Voinea și colab., 2005; X. Yu și colab., 2016). [anonimizat], reglarea acestora reprezintă o altă abordare cercetată la momentul actual (Matoba și colab., 2017).

Studiile realizate în cadrul acestei teze au vizat validarea in vitro a [anonimizat]. Obiectivele specifice au fost reprezentate de:

Evaluarea citotoxicității induse de nanoparticule și polifenolul liber;

Evaluarea modificărilor morfologice induse de nanoparticule și polifenol liber prin microscopie de fluorescență;

[anonimizat], citometrie în flux și prin efectuarea testului de adeziune a monocitelor la celulele endoteliale.

CAPITOLUL I.

BOLILE CARDIOVASCULARE

Bolile cardiovasculare (BCV) [anonimizat], [anonimizat], dar și o [anonimizat] a mortalității globale și contribuie într-o proporție mare la reducerea calității vieții (McAloon și colab., 2016).

BCV nu reprezintă o [anonimizat]. [anonimizat] o incidență crescută după vârsta de 30 de ani (Thomas și colab., 2018).

Boala arterială coronariană

Boala arterială coronariană (BAC), [anonimizat]ul. În BAC, majoritatea indivizilor nu prezintă simptomatologie timp de zeci de ani, semnele acestei afecțiuni fiind observate doar în starea avansată a bolii. După decenii de progresie, plăcile ateromatoase încep să limiteze fluxul sângelui către miocard sau mai grav, devin instabile, se pot rupe și pot determina formarea de trombi care blocheaza curgerea sangelui determinand infarctul de miocard (Libby și Theroux, 2005).

Angina

Durerea asociată cu o formă foarte avansată a bolii arteriale coronariane este cunoscută sub denumirea de angină, și, de obicei, se prezintă ca o senzație de presiune în piept, dureri la nivelul brațului și maxilarului, precum și alte forme de disconfort (Parikh și Kadowitz, 2014).

Accidentul vascular cerebral

Accidentul vascular cerebral (AVC) este o vătămare neurologică acută în care alimentarea cu sânge a unei părți a creierului este întreruptă, fie prin blocarea arterială, fie printr-o leziune (hemoragie). Acea regiune a creierului perfuzată de o arteră blocată sau lezată nu mai poate primi oxigen transportat de sânge; prin urmare, celulele creierului sunt deteriorate sau devin necrotice, afectând funcția acelei părți a creierului. Această afecțiune poate provoca leziuni neurologice permanente sau poate duce chiar la deces dacă nu este diagnosticată și tratată la timp. AVC pot fi clasificate în două mari categorii: ischemice și hemoragice. Ischemia poate fi datorată trombozei, embolismului sau hipoperfuziei sistemice (reducerea fluxului de sânge către toate părțile corpului). De asemenea, hemoragia poate avea loc la nivel intracerebral sau subarahnoidian (Nason, 2007). Aproximativ 80% din accidentele vasculare cerebrale sunt datorate ischemiei (El-Koussy și colab., 2014).

Boala cardiacă reumatică

Boala cardiacă reumatică (BCR) este o afecțiune în care valvele inimii sunt influențate de febra reumatică declanșată de infecția streptococică. Febra reumatică este o boală inflamatorie care poate afecta multe dintre țesuturile conjunctive ale corpului – în special cele ale inimii, articulațiilor, creierului sau pielii. Orice persoană poate dezvolta febră reumatică acută, însă apare de obicei la copii cu vârste cuprinse între 5 și 15 ani și poate dura pe parcursul întregii vieți (Liu și colab., 2015).

Boala cardiacă congenitală

Boala cardiacă congenitală (BCC) cuprinde o serie de anomalii diferite ce afectează structura și funcția inimii, acestea fiind cauzate de o dezvoltarea anormală sau dezorganizată a miocardului înainte de naștere. În unele cazuri, cum ar fi coarctația de aortă, simptomele pot sa nu apară timp de mai mulți ani, iar leziuni, precum un mic defect septal ventricular, pot să nu provoace niciodată probleme, neafectând calitatea vieții indivizilor. Unele boli cardiace congenitale pot fi tratate cu medicamente, în timp ce altele necesită intervenții chirurgicale (Sun și colab., 2015).

Boala arterială periferică

În boala arterială periferică (BAP), arterele care furnizează sânge picioarelor se îngustează sau se blochează complet. Îngustarea arterei apare de obicei în partea superioară a piciorului. Boala este cauzată de o acumulare treptată de lipide în pereții arterei. În stadiile avansate ale bolii, ruperea ateromului poate determina formarea unui cheag de sânge (trombus), blocând complet artera. Persoanele cu boală arterială periferică sunt predispuse la îngustarea altor artere din corp, iar ingustarea arterelor ce furnizează sânge inimii poate provoca angină sau atac de cord (Morley și colab., 2018). Afectarea arterelor de la nivelul gatului poate interfera cu fluxul sângelui către creier, provocând, în acest fel, un AVC. (Fowkes și colab., 2017).

Tromboza venoasă profundă

Tromboza venoasă profundă (TVP) presupune dezvoltarea unui trombus la nivelul unei vene profunde, cel mai adesea în zona inferioară a piciorului sau a brațului(Stubbs și colab., 2018). Este neobișnuit ca TVP să provoace probleme suplimentare, dar potențialele complicații includ embolismul pulmonar și sindromul post-trombotic. Embolismul pulmonar apare în urma formării unui trombus, ce se desprinde și circulă în fluxul sangvin, conducând la blocarea arterelor pulmonare. Sindromul post-trombotic apare în momentul în care TVP afectează valvele venoase, astfel încât sângele nu mai circulă ascendent și rămâne în partea inferioară a piciorului. Acest lucru poate conduce la apariția durerii, inflamației și ulcerelor la nivelul piciorului (Borgel și colab., 2019).

Ateroscleroza

Patologia ce stă la baza bolilor cardiovasculare este ateroscleroza și, în funcție de artera afectată, se poate manifesta drept boală cardiacă aterosclerotică sau boală cerebrovasculară ori periferică (Strong și colab., 1999).

Ateroscleroza este o boală cronică ce implică arterele mari și mijlocii, fiind declanșată timpuriu în decursul vieții. Pe măsură ce progresează, structura arterelor normale este modificată, iar plăcile aterosclerotice se formează cu îngustarea localizată a vasului afectat. Ateroscleroza prezintă manifestări locale, dar factorii care determină implicarea preferențială a unei regiuni vasculare asupra alteia, precum și dezvoltarea leziunilor aterosclerotice în anumite zone ale unei artere specifice nu sunt pe deplin elucidate (Zaromitidou și colab., 2016).

Cea mai importantă întrebare ce necesită urgent un răspuns este: de ce arterele umane sunt vulnerabile la modificările aterosclerotice? Deoarece majoritatea bolilor transmisibile sunt tratate cu succes și speranța medie de viață a crescut, impactul bolilor cardiovasculare reprezintă una dintre cele mai mari probleme de sănătate la momentul actual. În urmă cu câteva decenii, prin Framingham Heart Study s-au furnizat date valoroase cu privire la prevenirea primară a bolilor cardiovasculare aterosclerotice și a fost introdus termenul de factor de risc cardiovascular. Identificarea mai multor factori de risc asociați stilului de viață modern, cum ar fi hiperlipidemia, fumatul, hipertensiunea, obezitatea, diabetul zaharat, lipsa exercițiilor fizice, anxietatea și depresia susțin această ideea în care ateroscleroza este o boală a urbanizării (Mahmood și colab., 2014). Cu toate acestea, factorii de risc cunoscuți, cum ar fi vârsta înaintată, istoricul familial al bolilor cardiovasculare, sexul masculin sau anomaliile genetice (hipercolesterolemia familială) denotă și o contribuție genetică în debutul aterosclerozei. Prin urmare, atât factorii genetici, cât și cei de mediu sunt implicați în patogeneza aterosclerozei, în timp ce interacțiunea lor poate reprezenta cauza eterogenității pe care aceasta o prezintă (Greenland și colab., 2003).

1.1. Structura unei artere normale

Peretele arterial cuprinde trei straturi: tunica internă (intima), tunica mijlocie (media) și tunica externă (adventicea).

Intima este formată din endoteliu, țesut conjunctiv (colagen, laminină, fibronectină și alte molecule ale matricei extracelulare) și un strat bazal de țesut elastic numit lamina elastică internă care separă tunica internă de cea mijlocie. Endoteliul este reprezentat de un strat subțire de celule endoteliale ce servește drept suprafață de contact cu sângele. Datorită locației sale strategice, endoteliul reprezintă principalul reglator al homeostaziei vasculare, având proprietăți structurale și funcționale ce pot fi modificate ca răspuns la stimulii locali și sistemici (Deanfield și colab., 2007).

Media este caracterizată prin prezența straturilor concentrice de celule musculare netede vasculare (VSMC) și a matricei extracelulare (MEC) bogată în elastină. Aceasta este receptorul final al semnalelor care reglează tonusul vascular și este separată de adventice prin intermediul laminei elastice externe (Marcu-Lapadat, 2015).

Adventicea este stratul exterior al peretelui vascular și este formată din fibroblaste, fibre de colagen, mastocite, terminații nervoase și vasa vasorum. Au fost identificate funcții importante ale adventicei, printre care se numără participarea la traficul celulelor prin peretele arterial și rolul acesteia în semnalizarea între celulele endoteliale vasculare, celulele musculare netede și țesutul conjunctiv înconjurător. În plus, acest strat este implicat și în mecanismul de reparare al vasului după lezare (Majesky și colab., 2011).

Fig. 1 Structura unei artere normale (preluat și modificat după Taki și colab., 2017)

Ateroscleroza este o boală complexă, cu informații lipsă în ceea ce privește profilul patofoziologic. Pentru a preveni sau trata complicațiile aterosclerotice, este importantă clarificarea și înțelegerea mecanismelor implicate în patogeneză. Celulele endoteliale, VSMC și macromolecule MEC arteriale (colagen, proteoglicani și elastină) sunt componentele unei artere normale ce joacă un rol crucial în dezvoltarea aterosclerozei. Acumularea lipidelor, recrutarea leucocitelor și mecanismele hemodinamice și inflamatorii ale fluxului local sunt elemente esențiale ale formării leziunii aterosclerotice, în timp ce angiogeneza și mineralizarea plăcilor contribuie la evoluția ateromului (Zaromitidou și colab., 2016).

S-a arătat că, o alterare a funcției endoteliului duce la transportul și acumularea excesivă a lipoproteinelor de densitate mică (LDL) în subendoteliul arterial. Reținerea și acumularea acestor particule în subendoteliu conduce la modificarea lor oxidativă cu formarea LDL oxidat (Ox-LDL), declanșând o cascadă inflamatorie, activând astfel celulele endoteliale, care semnalizează recrutarea și migrarea monocitelor. Monocitele transvazate în subendoteliu fagocitează atât lipidele normale cât și pe cele modificate oxidativ devenind într-o primă etapa macrofage și mai târziu celule „spumoase” (foam cells), râspunzătoare de progresia leziunilor aterosclerotice (Manduteanu și Simionescu, 2012).

Formarea plăcii aterosclerotice

Leziunile aterosclerotice identificate cel mai precoce din punct de vedere histologic sunt reprezentate de striurile formate de celulele spumoase asamblate în tunica internă a vasului de sânge. Acestea se dezvoltă timpuriu în segmentele arterelor ce prezintă o îngroșare a intimei. Formațiunile pot rămâne stabile de-a lungul vieții, pot progresa în plăci aterosclerotice avansate, iar uneori pot chiar regresa. Lipoproteinele acumulate în MEC îmbogățită cu proteoglicani și colagen formează leziunea aterosclerotică inițială denumită îngroșarea patologică a intimei. Infiltrarea macrofagelor, fagocitarea lipoproteinelor acumulate în subendoteliu și apoptoza lor ulterioară au ca rezultat dezvoltarea unui nucleu bogat în lipide, care prin combinarea cu așa numitul cap fibros de colagen, constituie leziunea avansată numită fibroaterom (Johnson, 2014).

Rolul endoteliului

Endoteliul joacă un rol crucial în inițierea și în progresia aterosclerozei, datorită funcției de barieră între fluxul sangvin și straturile arteriale. Celulele endoteliale normale detectează schimbările din micromediu și reglează funcții importante, cum ar fi tonusul vascular, adeziunea celulelor circulante, coagularea, fibrinoliza, inflamația peretelui vasului și răspunsul la modificările hemodinamice. În plus, datorită poziționării strategice, celulele endoteliale controlează transportul tuturor moleculelor între lumen și intimă (Deanfield și colab., 2007).

Pentru a iniția procesul aterosclerotic, LDL trebuie să traverseze endoteliul și să se acumuleze la nivelul subendoteliului. Permeabilitatea crescută a endoteliului reprezintă o caracteristică a disfuncției endoteliale și o precondiție pentru preluarea crescută a LDL. Cei mai importanți factori care pot afecta funcția endotelială normală sunt fumatul, hiperlipidemia, hipertensiunea arterială și diabetul de tip 2. Este de remarcat faptul că, deși acești factori afectează întreaga arteră, ateroscleroza apare însă în zone specifice ale vaselor (regiuni curbate, ramuri și zone de bifurcație), caracterizate în principal de o perturbare a fluxului sangvin. Dimpotrivă, leziunile aterosclerotice se dezvoltă rar în regiunile arteriale ce prezintă puține ramuri și un flux sangvin laminar (de exemplu artera mamară internă) (Zaromitidou și colab., 2016).

Mecanosenzorii poziționați pe suprafața celulelor identifică stimulii de forfecare endotelială (endothelial shear stress – ESS) și activează căile intracelulare ateroprotectoare sau cele ce determină predispoziția la ateroscleroză. ESS scăzut promovează un fenotip endotelial predisupus la formarea aterosclerozei (activare endotelială). Totodată, un nivel scăzut de ESS determină supraexprimarea genelor ce codifică receptorul LDL (R-LDL). Numărul mare al moleculelor de R-LDL de la nivelul membranei plasmatice contribuie la creșterea permeabilității endoteliale pentru LDL. Acest aspect promovează apariția unor modificări fenotipice, prin care celulele endoteliale trec de la forma fusiformă la cea poligonală, precum și lărgirea joncțiunilor dintre celule (Manduteanu și Simionescu, 2012). S-a observat o creștere a activității mitotice și apoptotice a celulelor endoteliale în zonele susceptibile la ateroscleroză. Acest inconvenient, împreună cu localizarea prelungită a LDL în apropierea endoteliului, contribuie la creșterea permeabilității membranei. Astfel, în hiperlipidemie, particulele LDL traversează endoteliul și încep să se acumuleze în subendoteliu (Chatzizisis și colab., 2007).

Activarea endotelială promovează instalarea aterosclerozei precoce nu numai prin influențarea acumulării extracelulare de LDL, ci și prin diminuarea proprietăților ateroprotectoare asigurate de oxidul nitric (NO) derivat din endoteliu. Mai exact, NO sintetizat în celulele endoteliale normale modulează tonusul vascular (favorizează vasodilatația), împiedică transmigrarea leucocitelor către intimă prin reducerea expresiei moleculelor de adeziune și scade proliferarea VSMC (Halcox, 2012). În timp ce fluxul normal al sângelui determină creșterea expresiei genelor implicate în producția de NO, fluxul perturbat și nivelul scăzut al ESS acționează într-o manieră opusă (Manduteanu & Simionescu, 2012). Totodată, celulele endoteliale activate promovează procesul aterosclerotic prin creșterea sintezei de specii reactive de oxigen (ROS) și secreției de citokine și chemokine, care declanșează migrarea și activarea monocitelor. O altă caracteristică aterogenă a activității endoteliale este eliberarea de factori de creștere, precum factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF, platelet-derived growth factor), ce induc proliferarea VSMC și sinteza crescuta a componentelor MEC. Acumularea de VSMC și molecule ale MEC, în special proteoglicani, este cunoscută sub denumirea de îngroșarea intimei sau hiperplazia intimei (Reinoso, 2012).

Rolul particulelor LDL

Acumularea de colesterol în subendoteliu este un pas esențial pentru inițierea aterosclerozei. În mod normal, particulele LDL transportă colesterol prin fluxul sangvin la diferite țesuturi periferice. În zonele în care endoteliul este disfuncțional, LDL poate fi preluat pe calea R-LDL sau prin difuzie, fiind transcitat pe partea luminală a celulelor endoteliale sau poate pătrunde printre celulele ale căror joncțiuni au fost afectate, astfel acumulându-se localizat în subendoteliul arterial. Proteoglicanii încărcați negativ ai MEC leagă LDL, rezultând în retenția lipoproteinelor, un pas cheie pentru inițierea aterosclerozei. Interacțiunea LDL-proteoglican determină încapsularea LDL în subendoteliu și prelungește timpul de retenție. Astfel, LDL sunt susceptibile la modificarea oxidativă generată de ROS și de o serie de enzime, cum ar fi NO-sintaza (NOS), NADPH oxidazele, lipoxigenazele și mieloperoxidazele existente la acest nivel (Tsimikas și Miller, 2011). În plus, sub reglare proteoglicană, LDL modificat formează agregate sub acțiunea diferitelor lipaze și proteaze, precum fosfolipaza secretorie A2 (sPLA2) și sfingomielinaza. De asemenea, s-a observat că în prezența nivelurilor crescute de glucoză asociate diabetului de tip 2, particulele LDL pot fi glicozilate și non-enzimatic (Williams și Tabas, 1995).

Ox-LDL prezintă proprietăți pro-aterogene care agravează patologia aterosclerotică. În special, Ox-LDL induce expresia factorului tisular (CD142) și agregarea plachetară, limitează acțiunile biologice benefice ale NO și promovează lezarea endotelială și apoptoza celulelor. De asemenea, Ox-LDL influențează și substratul genetic prin creșterea expresiei genelor asociate inflamației. Moleculele chemotactice, cum ar fi proteina chemoatractantă monocitară-1 (MCP-1, Monocyte Chemotactic Protein-1), și PDGF, determină recrutarea și proliferarea monocitelor și a VSMC. În acest context, macrofagele exprimă receptori scavenger membranari pentru Ox-LDL, în timp ce VSMC cresc concentrația de colagen de la nivelul MEC. În general, Ox-LDL amplifică și mai mult activarea endotelială, inflamația și trombogenitatea (Zaromitidou și colab., 2016).

Fig. 2 Inițierea aterosclerozei (preluat și modificat după Libby și colab., 2019)

Rolul inflamației

Macrofagele derivate din monocite

LDL modificat este identificat ca un agent patogen și astfel se inițiază un răspuns inflamator. Primul pas în procesul de inflamație este recrutarea leucocitelor, în mare parte reprezentate de monocite. Celulele endoteliale cu funcție normală nu sunt susceptibile la transmigrarea monocitelor. Celulele endoteliale activate și acumularea LDL modificat în subendoteliu alterează micromediul endoteliului în favoarea aderenței și migrării monocitelor prin declanșarea expresiei moleculelor de adeziune de la nivelul membranei celulareși prin inițierea secreției de citokine chemoatractante. Moleculele cunoscute a fi implicate în adeziunea monocitelor sunt molecula de adeziune celulara vasculara-1 (VCAM-1, Vascular Cell Adhesion Molecule-1), molecula de adeziune intercelulara-1 (ICAM-1, Intracellular Cell Adhesion Molecule-1) și membrii familiei selectinelor (P- și E-selectine). Pentru ca monocitele să pătrundă în endoteliu, trebuie să se realizeze inițial secreția de chemokine. MCP-1 și fractalkina sunt principalele chemokine implicate în transmigrarea monocitelor prin stratul endotelial (Moore și colab., 2013).

Odată ce monocitele depășesc bariera endoteliului și ajung în subendoteliu, acestea vor diferenția în macrofage. Macrofagele din leziunea aterosclerotică prezintă o eterogenitate fenotipică ce este definită de stimulii din mediu. Clasificarea lor se bazează pe markerii de suprafață pe care îi exprimă, pe moleculele pe care le secretă și pe funcțiile lor biologice. Cel mai abundent fenotip din subendoteliu este M1, care este indus de o varietate de stimuli precum citokinele pro-inflamatorii (-interferon-γ – IFN-γ și factorul de necroză tumorală-α – TNF-α -), cristale și esteri de colesterol și LDL modificat. Macrofagele M1 joacă un rol esențial în răspunsul imun împotriva agenților patogeni în timpul unei infecții, mediind producerea de ROS. În leziunile aterosclerotice, LDL modificat induce activarea macrofagelor M1, ceea ce duce la deteriorarea țesuturilor. Cristalele și esterii de colesterol promovează fenotipul M1 prin declanșarea inflamazomului NLRP3 ce activează la rândul său caspaza-1, urmată de activarea TLR4 (Toll-Like Receptor 4) sau NF-κB (Nuclear Factor kappa B). LDL oxidat duce la diferențierea M1 prin blocarea factorului Kruppel-like 2 și prin stimularea căii TLR4 (Chinetti-Gbaguidi și colab., 2015). Macrofagele care exprimă fenotipul M1 sunt caracterizate ca fiind pro-inflamatoare și secretă o serie de citokine, precum IL-6 (Interleukina-6), IL-1β (Interleukina-1β) și TNF-α, acestea agravând în continuare ateroscleroza. M2 este un fenotip diferit, indus de stimuli precum IL-4 și IL-10 și prezintă proprietăți anti-inflamatoare, inclusiv eliminarea celulelor apoptotice (Zizzo și colab., 2012). S-a observat că fenotipul monocitelor este influențat de stimulii din mediu care, la rândul lor, pot fi modulați de macrofagele activate. În plus, macrofagele pot trece cu ușurință de la un fenotip la altul ca răspuns la modificările din mediu, o funcție cunoscută sub numele de plasticitate (Porcheray și colab., 2005).

Macrofagele derivate din monocite internalizează particulele LDL, formând celulele spumoase. Deși macrofagele exprimă receptori pentru LDL, formarea celulelor spumoase nu este mediată prin intermediul acestora, deoarece sunt subexprimați timpuriu de colesterolul acumulat. Internalizarea particulelor LDL modificate este mediată de receptorii scavenger, în timp ce particulele LDL agregate și cele native sunt internalizate prin fagocitoză și, respectiv, prin pinocitoză. Receptorii scavanger care participă la formarea celulelor spumoase sunt: Receptorul Scavanger A (SRA), CD36, membrii clasei B1 (SRB1), și Receptorul-1 de tip lectină (LOX1) (Spann și colab., 2012). Odată ce veziculele cu lipoproteine sunt internalizate de macrofage, acestea sunt transferate ulterior în endozomi sau lizozomi, unde sunt supuse hidrolizei sub acțiunea lipazei lizozomale cu eliberarea colesterolului liber. Ulterior, colesterolul liber este re-esterificat în reticulul endoplasmatic (RE) sub acțiunea colesterol aciltransferazei-1 (ACAT1) pentru a forma esteri ai colesterolului, fiind în cele din urmă depozitați în picăturile lipidice (Weber și Noels, 2011). Re-esterificarea în RE este o etapă esențială împotriva citotoxicității colesterolului liber. Enzima NCEH (Neutral cholesterol ester hydrolase) transformă esterii colesterolului în colesterol liber, care poate fi eliminat din macrofage prin transportorii ATP binding cassette (ABC) de clasă A1 și G1, favorizând procesul cunoscut sub numele de transport invers de colesterol. Acumularea de esteri ai colesterolului în macrofage datorită hipercolesterolemiei oferă în final aspectul de celule spumoase (X. H. Yu și colab., 2013).

Internalizarea continuă a lipoproteinelor agravează disfuncția endotelială și inflamația. LDL modificat funcționează ca un ligand pentru căile de semnalizare TLR care mediază eliberarea citokinelor pro-inflamatorii și chemokinelor. În particular, activarea combinată a TRL4, TRL6 și CD36 de către Ox-LDL declanșează calea NFκB și expresia chemokinelor care amplifică recrutarea monocitelor. In prezența Ox-LDL, fosfolipidelor oxidate și acizilor grași, macrofagele suferă o activare a stresului de RE, ceea ce va supraexprima TLR2, TLR6 și CD36, promovând apoptoza celulelor, eveniment marcant în apariția bolii aterosclerotice avansate. Cu toate acestea, integrarea colesterolului liber în membrana macrofagelor poate iniția de asemenea activarea TLR. Mai mult, lipoproteinele contribuie la inflamație și aterogeneză prin activarea inflamazomului. Mai exact, această cale este indusă de cristalele de colesterol, rezultând în secreția de IL-1β și IL-18 (Maxfield și Tabas, 2005).

Mecanismele ateroprotectoare

Macrofagele prezintă anumite mecanisme pentru a contrabalansa acumularea de lipoproteine și apariția inflamației și pentru a menține homeostazia tisulara. Oxisterolul și desmosterolul, molecule intermediare în biosinteza colesterolului, induc activarea răspunsului anti-inflamator mediat de Receptorul X hepatic (LXR). În special, factorul de transcriere LXR reglează supraexprimarea transportorilor ABCG1 și ABCA1, implicați în efluxul și transportul invers de colesterol de la țesuturile periferice la ficat, procese mediate de lipoproteinele de densitate înaltă (HDL) și apolipoproteina A1 (Kunjathoor și colab., 2002).

Retenția macrofagelor

Progresia aterosclerozei este interconectată cu numărul de macrofage rezidente. Până de curând s-a considerat că majoritatea macrofagelor de la nivelul leziunilor aterosclerotice provin din recrutarea și transmigrarea din circulație. Conform noilor descoperiri, cea mai mare parte din macrofagele rezidente provin ca urmare a proliferarării celulare, precedată activarea acestora și de internalizarea lipidelor. Mecanismul exact implicat în proliferarea macrofagelor nu este pe deplin elucidat, dar preluarea de LDL modificat prin intermediul SRA pare să joace un rol cheie. Mai mult decât atât, acumularea de colesterol promovează retenția macrofagelor prin expresia netrinei-1 și a semaforinelor 3E (SEMA3E), reglând astfel numărul de macrofage care populează leziunea. Cu toate acestea, numărul macrofagelor scade din cauza migrării și apoptozei. Macrofagele migrează prin tunica mijlocie în adventice sau direct în lumen, sub acțiunea unor stimuli încă necunoscuți (Zaromitidou și colab., 2016).

Limfocitele T

În ateroscleroză mecanismele inflamatoare implică nu numai monocitele, ci și limfocitele T, limfocitele B, celulele dendritice și mastocitele. Markerii pro-inflamatori eliberați de macrofage declanșează transmigrarea limfocitelor T în intimă, unde acestea vor secreta citokine care amplifică și mai mult inflamația (imunitatea înnăscută). Lipoproteinele modificate și proteinele de șoc termic (Hsp) sunt identificate ca antigene de către TLR4 în celulele dendritice, ceea ce duce la activarea limfocitelor (imunitate adaptativă). Trebuie menționat că o mică parte din celulele dendritice internalizează lipoproteinele și se transformă în celule spumoase. Subgrupele limfocitelor localizate în leziuni aterosclerotice sunt T helper-1 (Th1), T helper-2 (Th2) și limfocitele T reglatoare (Treg). Th1 predomină în leziuni și prezintă proprietăți pro-aterogene secretând IFN-γ și TNF-α. Pe de altă parte, Th2 și Treg induc producerea de molecule ateroprotectoare precum IL-10, IL-4, IL-13 sau factorul de creștere transformator (TGF-β) (Tse și colab., 2013).

Apoptoza și eferocitoza macrofagelor

Apoptoza macrofagelor din intimă joacă un rol important în progresia aterosclerozei. Celulele apoptotice sunt în mod normal eliminate de macrofagele M2 și, într-un procent mai scăzut, de celulele dendritice. Înglobarea celulelor apoptotice de către celulele fagocitare este cunoscută sub numele de eferocitoză, servind la îndepărtarea imediată și eficientă a celulelor apoptotice înainte de pierderea integrității membranare și eliberarea conținutului inflamator. Astfel, eferocitoza contrabalansează efectele nocive ale apoptozei. Acest echilibru rămâne intact în leziunile precoce, dar este perturbat în plăcile avansate (Tabas, 2010). Factorii declanșatori ai procesului nu sunt identificați pe deplin. Stresul oxidativ și acumularea de colesterol par să ghideze macrofagele spre apoptoză prin stimularea semnalizării TLR2/4 și a stresului de RE prelungit. De asemenea, eferocitoza defectuoasă poate rezulta și din stresul oxidativ sau în urma legării incorecte dintre receptor și ligand. Deși numărul macrofagelor este redus odată cu apoptoza, în celulele cu eferocitoză defectă dimensiunea nucleului necrotic este crescută de debriurile celulare. În consecință, dezechilibrul dintre apoptoză și eferocitoză are efecte dăunătoare asupra progresiei leziunilor aterosclerotice (Moore și Tabas, 2011).

Rolul celulelor musculare netede vasculare

Pe lângă toate celelalte componente menționate anterior, și VSMC au un rol esențial în toate stadiile bolii aterosclerotice. În mod obișnuit, acestea sunt localizate în tunica mijlocie și reglează tonusul vascular. Anumiți stimuli, cum ar fi acumularea lipidelor în subendoteliu, stresul de forfecare sau semnalele provenite de la nivelul citokinelor secretate de celulele endoteliale si macrofage pot determina trecerea VSMC de la un fenotip „contractil” la unul „sintetic”. Această modificare are ca rezultat migrarea lor din medie spre intimă, unde proliferează excesiv, produc și secretă proteoglicani și colagen. Îmbogățirea MEC cu proteoglicani contribuie la retenția de LDL, în timp ce depunerea de colagen este implicată în îngroșarea intimei și în formarea capului fibros. În plus, VSMC eliberează o serie de molecule de adeziune și citokine implicate în recrutarea monocitelor și în proliferarea macrofagelor, cum ar fi PDGF, TGF-β și MCP-1. Similar macrofagelor, și un număr mic de VSMC internalizează particule LDL modificate și se transformă în celule asemănătoare celor spumoase (Virmani și colab., 2002).

Moleculele matricei sunt produse de VSMC ca răspuns la diferiți stimuli. Degradarea MEC este realizată de metaloproteinaze (MMP), endopeptidaze secretate în principal de macrofagele activate. Această degradare facilitează transmigrarea și proliferarea celulelor în timpul progresiei aterosclerotice. Mai mult, remodelarea arterială ca răspuns la factorii pro-aterosclerotici este realizată de MMP care fragmentează lamina elastică internă (Zaromitidou și colab., 2016).

Fig. 3 Progresia aterosclerozei (preluat și modificat după Libby și colab., 2019)

Neovascularizarea

Neovascularizarea presupune formarea de noi vase în peretele arterial și este declanșată în principal de hipoxia atribuită îngroșării intimei și creșterea dimensiunii plăcii. Pe măsură ce distanța între suprafață și stratul interior crește, furnizarea de oxigen în regiunile distale devine mai puțin eficientă. În plus, activarea macrofagelor determină creșterea necesităților de oxigen, agravând în continuare hipoxia și conectând inflamația cu neovascularizarea (Xu și colab., 2015). În aceste condiții, factorul inductibil al hipoxiei (HIF1) declanșează producerea factorului de creștere endotelial vascular (VEGF) care semnalează celulelor endoteliale și VSMC să inițieze dezvoltarea noilor vase. Acest proces este în mare parte asociat cu leziunile aterosclerotice mai avansate, însă angiogeneza poate fi întâlnită și în leziunile timpurii. Formarea de noi vase asigură leziunii aterosclerotice aportul de oxigen și nutrienți necesari, promovând astfel creșterea plăcii. Mai mult, vasele nou formate sunt predispuse la rupere din cauza unei integrități structurale compromise care duce la hemoragie în interiorul plăcii și creștere acesteia din urmă (Nakashima și colab., 2002).

Abordări tradiționale în tratamentul bolilor cardiovasculare

În prezent, descoperirile majore ale secolului XX în boala cardiacă sunt cele pe care se bazează cardiologia clinică modernă. O descoperire esențială a fost importanța impulsurilor electrice în cardiologie, atât în ceea ce privește activitatea electrică propriu-zisă a inimii, căt și implantarea stimulatoarelor cardiace („pacemaker”). Alte progrese chirurgicale care au fost esențiale pentru tratamentul bolilor cardiovasculare includ operația pe cord deschis și laparoscopia. Totodată, și tratamentele medicamentoase au evoluat rapid, în special utilizarea aspirinei pentru a preveni atacurile de cord și accidentele vasculare cerebrale în anii '70, precum și continuarea dezvoltării de medicamente terapeutice trombolitice, cum ar fi streptokinaza (Nason, 2007).

Opțiunile curente de tratament includ modificări ale stilului de viață (alimentație echilibrată, exerciții fizice, renunțarea la fumat, reducerea stresului psihosocial), tratament anti-hipertensiv și anti-diabetic, farmacoterapie cu reducerea lipidelor plasmatice, terapie antiplachetară și revascularizare intervențională sau chirurgicală. Medicamentele de scădere a nivelului de lipide sunt indicate pentru prevenția primară și secundară și includ statine, inhibitori ai PCSK9 (proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) și ezetimib (Libby și colab., 2019).

Statinele reprezintă prima linie de tratament farmacologic. Cu toate acestea, ele au efecte secundare care limitează doza, cum ar fi miopatiile, ale căror mecanisme nu sunt încă înțelese complet. Statinele exercită așa-numitele efecte pleiotropice, care nu pot fi direct atribuite scăderii nivelului de LDL. De exemplu, o serie de studii clinice au arătat că statinele îmbunătățesc disfuncția endotelială la pacienții cu risc coronarian (Davignon, 2004). Reducerea fenotipului disfuncțional este mediată prin inducerea NOS și a trombomodulinei, sub influența statinelor. Efectele pleiotropice ulterioare asupra celulelor endoteliale includ scăderea CD40, reducerea secreției de IL-1β și IL-6 și reducerea ROS. Acest lucru duce la îmbunătățirea ateroprotecției prin inactivarea caii de semnalizare YAP/TAZ, observându-se o expresia redusă a VCAM-1, ceea ce conduce la suprimarea disfuncției endoteliale. Statinele inhibă enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A (HMG-CoA) reductaza implicată în calea de sinteză a colesterolului, iar acest lucru va determina împiedicarea translocării YAP/TAZ din citoplasmă în nucleu și automat și a transcrierii genice. Concentrațiile de statină utilizate în acest studiu au depășit doza eficace folosită în general pentru tratamentul pacienților (Sorrentino și colab., 2014). O modalitate terapeutică viitoare pentru creșterea concentrației locale de statine presupune utilizarea unor tehnologii ce implică eliberarea de medicamente la țintă, un exemplu fiind nanocarrierii (Wolf și Hunziker, 2020).

Efectele asupra VSMC includ migrarea și proliferarea redusă, dar și scăderea ROS (Wassmann și colab., 2001). Efectele asupra macrofagelor includ reducerea secreției de MMP și de IL-1β, IL-6 și TNF-α (Rezaie-Majd și colab., 2002). Efectele pleiotropice scad inflamația vasculară, ducând la un nivel redus de Proteină ​​C Reactivă (CRP). Nivelurile de CRP și IL-6 circulante au scăzut atât la persoanele sănătoase, cât și la pacienții cu boli cronice în urma tratamentului cu statină. În plus, statinele au arătat efecte anti-inflamatoare directe prin scăderea expresiei TLR4 și prin reglarea căii de semnalizare TLR4/Myd88/NF-κB în multiple tipuri de celule implicate în ateroscleroză (Wolf și Hunziker, 2020).

Medicamentul Ezetimib are rolul de a reduce preluarea colesterolului în intestin, având efecte moderate asupra nivelurilor plasmatice ale LDL și poate fi utilizat ca o a doua linie de potențare a tratamentului cu statină (Cannon și colab., 2015).

Inhibitorii PCSK9 reprezentați de anticorpi monoclonali împotriva PCSK9, cum ar fi Evolocumab sau Alirocumab, duc la reciclarea receptorilor LDL de la nivelul hepatocitelor și sunt foarte potenți în scăderea LDL (studiul clinic FOURIER; ClinicalTrials.gov, numărul NCT01764633, completat) (Sabatine și colab., 2017). În studiul clinic GLAGOV (ClinicalTrials.gov, numărul NCT01813422, completat), acestea au fost administrate la 968 de participanți în combinație cu o statină, rezultând niveluri foarte scăzute de LDL (0,93 mmol/L) și o reducere cu 0,95% a ateromului coronarian după 76 de săptămâni de tratament (Nicholls și colab., 2016). Cu toate acestea, nu a fost observată nicio modificare în compoziția plăcii coronariene (Nicholls și colab., 2018). În plus, inhibitorii PCSK9 sunt costisitori și în prezent sunt recomandați numai pentru subgrupuri specifice de bolnavi (pacienți cu hipercolesterolemie familială sau hipercolesterolemie rezistentă la tratament) (Sabatine și colab., 2017). Medicamentele aprobate recent pentru tratamentul hipercolesterolemiei familiale homozigote sunt reprezentate de Lomitapida, o moleculă mică ce are drept țintă proteina microzomală de transfer a trigliceridelor (MTP), și Mipomersen, oligonucleotidă care țintește ARNm al apolipoproteinei B. Cu toate acestea, mipomersen are o multitudine de efecte secundare hepatotoxice (Hegele și Tsimikas, 2019).

Odată ce ruperea plăcii sau eroziunea duc la formarea trombusului și la ocluzia ulterioară a vaselor, angioplastia cu balon poate fi o opțiune imediată de tratament. De asemenea, angioplastia poate fi realizată simultan cu introducerea unui stent. Probleme relevante, cum ar fi restenoza rezultată din hiperplazia neointimală, remodelarea negativă sau reculul elastic sunt întâlnite frecvent, însă pot fi reduse prin utilizarea unor stenturi farmacologic active care determină eliberarea de medicamente imunosupresoare și inhibitoare ale proliferării precum Sirolimus sau Paclitaxel. Chirurgia cardiotoracică de bypass coronarian este necesară pentru cazurile severe, în care angioplastia cu balon și implantul unui stent nu sunt fezabile, și este mai severă în ceea ce privește rezultatul pe termen lung (Wolf și Hunziker, 2020).

CAPITOLUL II.

TIPURI DE NANOPARTICULE

Nanoparticulele sunt de mai multe tipuri în funcție de morfologia, mărimea și proprietățile lor chimice. În general acestea se clasifică în 2 mari categorii: nanoparticule organice și anorganice (Khan și colab., 2019).

Nanoparticule anorganice

Nanoparticulele anorganice sunt hidrofile, biocompatibile și mai stabile în comparație cu materialele organice. Sistemele drug delivery (DDS) concepute pentru a crește eficacitatea medicamentelor și pentru a reduce efectele adverse au evoluat odată cu dezvoltarea de noi materiale. Progresul recent în domeniul nanotehnologiei a condus la introducerea diverselor nanoparticule anorganice drept sisteme excelente de livrare a medicamentelor (Paul și Sharma, 2010). Toate nanoparticulele anorganice au o structură tipică core-shell. Miezul poate conține metale precum oxidul de fier, aurul și quantum dots (QDs) sau coloranți fluorescenți organici încapsulați în silice. Nucleul central determină proprietățile fluorescente, optice, magnetice și electronice ale particulei. Învelișul este de obicei format din metale sau polimeri organici care protejează miezul de interacțiunile chimice cu mediul extern și/sau servește ca substrat pentru conjugarea cu biomolecule, cum ar fi anticorpi, proteine sau oligonucleotide (Núñez și colab., 2018).

Nanoparticule magnetice

Oxidul de fier (III) (Fe2O3) este un compus anorganic de culoare maro-roșiatică, de natură paramagnetică și, de asemenea, unul dintre cei trei oxizi principali de fier, alături de FeO și magnetită (Fe3O4). Datorită dimensiunii lor de ordinul nanometrilor, proprietăților magnetice și biocompatibilității, nanoparticulele de oxid de fier superparamagnetice (SPION) sunt considerați a fi candidați promițători pentru diverse aplicații biomedicale, cum ar fi agenți de contrast pentru RMN cu rezoluție îmbunătățită, administrarea țintită de medicamente și imagistică, terapie genică, urmărirea celulelor stem după injectare, tehnologii de separare magnetică (de exemplu secvențierea rapidă a ADN), depistarea timpurie a inflamației, cancerului, diabetului și aterosclerozei. În general, nanoparticulele superparamagnetice sunt asemănătoare sondelor imagistice și pot fi utilizate ca agenți de contrast deoarece intensitatea semnalului de rezonanță magnetică este modulată în mod semnificativ, fără niciun compromis în ceea ce privește stabilitatea in vivo (Mody și colab., 2010).

Nanoparticulele de oxid de fier (ION) simple sunt citotoxice, tind să se aglomereze și suferă oxidări suplimentare, astfel încât materialele alese pentru sinteza stratului învelitor au un rol important. În ultimii ani, diverse materiale au fost propuse în acest scop, însă majoritatea nanoparticulelor destinate aplicațiilor medicale sunt acoperite cu diferiti compuși biocompatibili, precum derivați ai dextranului . În general, învelișul nu este magnetic și este mai gros decât miezul de oxid de fier, determinând în mare măsură dimensiunea finală a particulei (Laurent și colab., 2014).

După injecția intravenoasă (iv), ION-urile se dispersează liber în compartimentul intravascular iar biodistribuția lor ulterioară este determinată în principal de mărimea, geometria și chimia acoperirii nanoparticulelor. Datorită raportului mare suprafață-volum al ION, proteinele plasmatice precum opsoninele sunt adsorbite rapid, acestea crescându-și afinitatea față de sistemul fagocitar mononuclear. ION acoperite cu dextran sunt preluate în principal de monocitele circulante sau de macrofagele rezidente din țesutul hepatic, splină, măduvă sau ganglioni limfatici (Weissleder și colab., 2014). Acumularea specifică la nivelul organelor este predeterminată de mărimea nanoparticulelor: cele mari tind să se acumuleze în splină prin filtrare mecanică, în timp ce nanoparticulele mai mici sunt înlăturate cu preponderență din sânge prin extravazare și eliminarea renală (Laurent și colab., 2014).

După internalizarea lor de către macrofage, ION sunt metabolizate pe cale lizozomală. Oxidul de fier al miezului este reținut și încorporat progresiv în depozitul de fier al corpului, așa cum a fost demonstrat în cazul ferumoxitolului. Ulterior, acesta va fi eliminat într-un mod analog fierului endogen. Degradarea învelișului este determinată de compoziția sa specifică. De exemplu, dextranul și derivații săi sunt degradați de enzimele intracelulare și sunt în final eliminați pe cale renală (Alam și colab., 2012).

Nanoparticule organice

Nanoparticulele organice pot fi definite ca fiind particule ce au în alcătuirea lor compuși organici (în principal lipide sau polimeri) cu diametrul cuprins între 10 nm și 1 µm (Rajesh și Shatrohan, 2014).

Natura oferă o gamă largă de exemple de nanoparticule organice, cum ar fi agregatele proteice, picăturile lipidice, emulsiile de lapte sau structuri organizate mai complex (virusurile). Una dintre cele mai importante caracteristici ale nanoparticulelor organice este aceea de a oferi modalități relativ simple pentru încapsularea materialelor. Acest lucru, împreună cu eventualele proprietăți biodegradabile ale moleculelor ce pot fi utilizate pentru fabricarea nanoparticulelor organice, determină ca acestea să fie sisteme atrăgătoare pentru administrarea de medicamente și aplicații biomedicale (Mitragotri și Stayton, 2014).

Nanoparticulele organice diferă conceptual de cele anorganice în ceea ce privesc metodele de sinteză. Acestea din urmă sunt sintetizate în mod normal prin precipitarea sărurilor anorganice legate într-o matrice. Natura legăturii atomilor poate fi diferită (covalentă, metalică, etc.), dar, oricare ar fi aceasta, structura anorganică determină apariția unui aranjament tridimensional. Din acest punct de vedere, dintre nanoparticulele organice, dendrimerii se aseamănă nanoparticulelor anorganice. Majoritatea nanoparticulelor organice sunt alcătuite dintr-un număr mai mare de molecule organice ce formează o structură unitară prin autoasamblare sau legare chimică. Autoasamblarea și prezența moleculelor zwitterionice, cu regiuni polare și nepolare, drept componente principale ale nanoparticulelor, precum și capacitatea de încapsulare a altor molecule organice sunt elemente cheie pentru fabricarea multor dintre nanoparticulele organice (Romero și Moya, 2012). De asemenea, față de nanoparticulele anorganice, cele organice prezintă un caracter dinamic ce apare din cauza naturii slabe a interacțiunilor de la nivelul structurii. Miceliile și veziculele pot fuziona și genera particule mai mari. Adăugarea continuă a unui agent tensioactiv la o soluție micelară poate duce într-adevăr la creșterea dimensiunii și poate determina modificarea formei acestora, de la o formă sferică la una cilindrică în momentul în care se atinge concentrația micelară critică (CMC) (Ribeiro și colab., 2018).

Lipozomi

Lipozomii sunt vezicule sferice, cu diametrul de 50–500 nm și alcătuite dintr-un bistrat lipidic, ce se formează în momentul în care lipidele sunt emulsionate într-un mediu apos. Formarea lipozomilor este un proces spontan inițiat de interacțiunile dintre moleculele de apă și moleculele lipidice amfifile (Wang și Wang, 2014). După finalizare, un volum apos rămâne încapsulat în miezul fiecărui lipozom. Acest aspect oferă lipozomilor capacitatea de a reține selectiv soluții pentru încapsulare, formând baza pentru administrarea medicamentelor (Rajesh și Shatrohan, 2014). Acest sistem de administrare a fost demonstrat pentru prima dată în anii '60 și reprezintă unul dintre puținele sisteme traduse cu succes în studiile clinice. Lipidele utilizate în mod obișnuit pentru sinteza lipozomilor includ fosfolipide, în special fosfatidilcolina, ce poate fi naturală (fosfatidilcolina din ou) sau sintetică (1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolină, DOPC). Proprietățile lipozomilor, cum ar fi permeabilitatea, sarcina electrică a suprafeței și hidrodinamica sunt determinate în principal de compoziția fosfolipidelor de la nivelul bistratului (Sun și colab., 2014). Lipozomii pot fi stabilizați steric prin consolidarea bistratului cu ajutorul unui polimer amfifilic cu catenă lungă, conținând polietilenglicol (PEG) la un capăt, care poate concomitent să reducă opsonizarea și să prelungească timpul de circulație plasmatică (Wang și Wang, 2014).

În ciuda aparentei simplități în funcționalizare, proprietatea care diferențiază lipozomii de alte DDS mediate de nanoparticule (nano-DDS) o reprezintă mecanismul lor de preluare de catre celule. Deoarece bistratul lipidic al lipozomilor este asemănător cu cel al celulelor, aceștia pot fi internalizați cu ușurință. În urma internalizării prin endocitoză, lipozomii fie ajung in compartimentul endolizozomal unde bistratul lor lipidic va fi perturbat de mediul acid, fie pot fuziona cu membranele diferitelor organite. Procesul de fuziune poate să nu apară în cazul în care lipozomii sunt funcționalizați cu anumiți compuși care împiedică această interacțiune, ceea ce a determinat necesitatea unor mecanisme suplimentare de evitare endozomală (Sun și colab., 2014).

Nanoterapia

Administrarea medicamentelor și a altor agenți terapeutici a reprezentat strategia centrală a medicinei contemporane, bazată pe conceptul conform căruia, într-o anumită boală, celulele defecte și moleculele secretate de acestea coexistă cu celulele normale. Chiar și după înțelegerea profundă a mecanismelor de dezvoltare a bolii și a țintelor terapeutice, medicamentele trebuie să depășească barierele fiziologice pentru a ajunge la zona de interes. Dintr-un alt aspect, orice medicament are o anumită toxicitate potențială ce poate limita doza administrată și, prin urmare, eficacitatea terapeutică (Matoba și colab., 2017).

În momentul în care are loc dezvoltarea unei leziuni aterosclerotice, permeabilitatea stratului endotelial al peretelui arterial crește, ceea ce permite ca mai multe lipoproteine și particule mici, cum ar fi nanoparticulele să migreze în tunica internă. Extinderea leziunilor aterosclerotice necesită oxigen și nutrienți, astfel apare fenomenul de neoangiogeneză. Vasele nou formate sunt fragile, ceea ce duce la creșterea efectului EPR (enhanced permeability and retention), promovând în continuare expansiunea leziunilor. Migrarea nanoparticulelor în leziunile aterosclerotice prin intermediul efectului EPR este considerată un proces de țintire nespecific (passive targeting). Recunoașterea nanoparticulelor prin legarea lor la celulele sau moleculele specifice din leziuni datorită liganzilor de suprafață este considerat a fi un proces de țintire specific (active targeting) (Zhang și colab., 2017).

Direcționarea medicamentelor către organele sau celulele bolnave poate reduce potențialele efectele adverse; astfel, utilizarea DDS îmbunătățește eficacitatea și siguranța agenților terapeutici (Matoba și colab., 2017).

Oncologia a fost primul domeniu care a valorificat proprietățile nanoparticulelor pentru administrarea de medicamente precum Doxil – lipozomi ce au doxorubicină încapsulată, aprobat de FDA („Food and Drug Administration”) în 1995 pentru tratamentul sarcomului Kaposi. Utilizat pe scară largă pentru tratamentul unor multiple mieloame și a altor forme maligne, medicamentul permite preluarea preferențială de către celulele canceroase și limitează expunerea inimii la acesta, reducând astfel riscul cardiotoxicității indusă de doxorubicină și insuficiență cardiacă (Flores și colab., 2019). Au fost introduse un număr mai mare de 50 de terapii bazate pe nanoparticule utilizate pentru o varietate de afecțiuni medicale, inclusiv infecții, boli renale cronice și chiar afecțiuni psihiatrice (Gabizon și colab., 2003).

Nanotehnologia s-a extins și în domeniul bolilor cardiovasculare. Nanoformulările comercializate în prezent pe bază de fenofibrat (de exemplu Tricor®; Ling și colab., 2013) sunt utilizate la pacienții cu hipertrigliceridemie pentru a ajuta la depășirea provocărilor reprezentate de solubilitatea și absorbția medicamentelor. O serie de DDS folosite în scopul terapeutic al bolilor vasculare sunt în curs de dezvoltare. În plus, nanoparticulele „teranostice” multifuncționale presupun administrarea combinată a agenților terapeutici și imagistici. Aceste nanoparticule pot servi la combinarea tratamentului cu informații din una sau chiar mai multe modalități imagistice pentru a evalua într-un mod mai amănunțit boala. Cercetările anterioare au evidențiat posibilitatea utilizării nanomaterialelor în imagistica cardiovasculară, inclusiv potențialul acestora de a identifica separat plăcile vulnerabile cu risc de rupere (Flores și colab., 2019).

În funcție de interacțiunile care apar pe suprafața lor, nanoparticulele sunt capabile să modifice fiziologia țesuturilor și celulelor. În momentul sintezei nanoparticulelor pentru imagistică sau aplicații terapeutice, un aspect important îl constituie alegerea materialelor deoarece acestea trebuie să dețină o masă moleculară și compoziție chimică corespunzătoare, precum și modificări suplimentare ale grupărilor funcționale (Singh și colab., 2016). Aceste sisteme au o aplicabilitate ridicată pentru administrarea medicamentelor slab solubile sau a celor cu toxicitate ridicată la zonele țintă, reducând astfel posibilele efecte secundare (Parnami și colab., 2014).

Deoarece BCV este una dintre principalele cauze ale mortalității și reprezintă aproape 1/3 din toate decesele la nivel mondial, este necesară introducerea unor tehnici noi, precum nanotehnologia, pentru detectarea incipientă și tratarea mai multor tipuri de BCV. Terapia țintită, ingineria tisulară sau imagistica moleculară sunt tehnologii utilizate în detecția și tratamentul problemelor care apar în interiorul corpului. Nanoparticulele pot realiza țintirea și eliberarea controlată de medicamente și pot îmbunătăți biodisponibilitatea multor agenți terapeutici sau de diagnostic. Administrarea selectivă la nivel endotelial al agenților terapeutici ar putea oferi un instrument util pentru modificarea funcției vasculare în diferite boli cardiovasculare, astfel încât multe grupuri de cercetare sunt interesate în această abordare (Voinea și colab., 2005; Calin și colab., 2015; Singh și colab., 2016).

Aplicațiile recente ale nanotehnologiei în medicină au dus la dezvoltarea de nano-DDS, ce modifică in vivo cinetica agenților terapeutici și de diagnostic. Unul dintre cele mai importante motive pentru utilizarea nano-DDS este capacitatea de a ținti zona afectată, folosind fiziologia și proprietățile fiziopatologice unice pentru anumite procese ale bolii. Nanoparticulele sunt considerate de interes datorită proprietăților lor intrinseci, inclusiv capacitatea de a-și adapta dimensiunea, raportul dintre suprafață și volum sau capacitatea de a modifica proprietățile fizico-chimice ale acestora. Nanoparticulele transportă agenții terapeutici pe suprafața sau în interiorul lor, acest lucru fiind realizat prin interacțiuni necovalente, conjugare sau încapsulare (Cartaya și colab., 2019). Nano-DDS pot fi compuse dintr-o varietate de materiale și substanțe, inclusiv lipide (pentru a forma micelii sau lipozomi), polimeri, dendrimeri, nanotuburi de carbon și nanoparticule metalice (Matoba și colab., 2017). Nanoparticulele utilizate drept vehicule pentru administrarea medicamentelor trebuie să fie stabile, biocompatibile, non-imunogene și să poată fi modificate pentru a se adapta livrării terapeutice situs specifice. În acest sens, nanoparticulele pot fi funcționalizate cu diferite molecule pentru a realiza administrarea și acumularea de medicamente într-o anumită zonă de interes. Această funcționalizare a particulei cu un ligand implică adesea un peptid, o proteină, un anticorp sau un alt partener care interacționează cu un receptor sau un epitop supraexprimat la zona de interes. Pe de altă parte, direcționarea fizică folosește forțele externe, precum câmpurile electromagnetice, pentru a controla localizarea și eliberarea încărcăturii, prin intermediul nanoparticulelor magnetice (X. Yu și colab., 2016).

Dezvoltarea tehnologiilor nanoterapeutice pentru prevenirea și tratamentul bolilor este încă în stadii incipiente. Marea majoritate a nanoterapiilor aprobate sunt comercializate pentru tratamentul cancerului, unde toxicitatea medicamentului reprezintă un aspect important. Un exemplu de nanoterapie este reprezentată de încapsularea lipozomală a medicamentului Irinotecan (Onivyde®) pentru tratamentul cancerului de pancreas. Această încapsulare permite o creștere a biodisponibilității și a timpului de circulație a medicamentului, scăderea acumulării în zonele adiacente și reducerea efectelor secundare. Astfel, cercetarea în domeniul BCV s-a orientat de asemenea în direcția utilizării acestor modalități terapeutice atractive (Cartaya și colab., 2019).

S-a stabilit că aproximativ 60% din numărul infarctelor miocardice acute apar ca urmare a ruperii sau fisurării fibroateromului. Plăcile predispuse la rupere se caracterizează prin acumularea abundentă de celule imune înnăscute, reprezentate în principal de monocite sau macrofage, formarea miezului lipidic și activarea mai multor proteinaze care degradează MEC. În acest sens a fost dezvoltat un model de șoarece pentru studiul lezării plăcii aterosclerotice, folosind o dietă bogată în grăsimi și perfuzie cu angiotensină II la șoareci ApoE deficienți (ApoE-/-) pentru a evalua rolurile monocitelor și macrofagelor inflamatorii în timpul destabilizării și ruperii plăcii (Matoba și colab., 2017).

Monocitele sunt componente ale sistemului imun înnăscut și sunt clasificate în cel puțin două subtipuri majore la șoareci: monocite inflamatoare (Ly6Chi CCR2+) și non-inflamatoare (Ly6Clow CX3CR1hi). La om, monocitele CD14++ CD16- (CCR2+) și monocitele CD14+ CD16+ (CX3CR1hi) sunt descrise ca omologii celor de la șoarece în conformitate cu expresia receptorilor de chemokine, deși similitudinile lor funcționale nu au fost pe deplin determinate. După cum a fost menționat în capitolul anterior, macrofagele derivate din monocite prezintă două subtipuri corespunzătoare eterogenității monocitelor: macrofage activate clasic (M1) și macrofage activate alternativ (M2). S-a observat că transferul de monocite inflamatoare determină mărirea capului fibros de la nivelul arterelor brahiocefalice în modelul de șoarece, sugerând un rol critic pe care acestea îl joacă în destabilizarea plăcii. Prin urmare, reglarea acestor celule imune înnăscute este o strategie terapeutică promițătoare pentru a preveni rupturile plăcii la pacienții cu boală coronariană (Katsuki și colab., 2014).

Studiile axate pe țintirea endoteliului activat sunt realizate în principal prin conjugarea anticorpilor monoclonali sau a regiunilor variabile ale lanțului L (light) la nivelul lipozomilor (imunolipozomi, ILP) sau nanoparticulelor polimerice (imunoparticule, IP). Țintele principale ale acestor nanoparticule includ molecula de adeziune endotelială a trombocitelor (PECAM-1, Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1) și ICAM-1. PECAM-1 și ICAM-1 sunt glicoproteine ​​transmembranare exprimate în membrana celulelor endoteliale. PECAM-1 este implicat în permeabilitatea endotelială vasculară și transmigrarea leucocitelor ca răspuns la procesul inflamator. ICAM-1 contribuie la adeziunea leucocitelor activate la celulele endoteliale în zonele care prezintă inflamație. ICAM-1 este exprimat în mod constitutiv în celule endoteliale vasculare aflate în stare normală, însă poate fi rapid supraexprimat ca răspuns la activarea inflamatoare a endoteliului mediată de NF-κB prin intermediul citokinelor, oxidanților și circulației dereglate. Direcționarea nanoparticulelor către PECAM-1 și ICAM-1 oferă avantajul țintirii medicamentelor atât pentru tratamentul preventiv cât și pentru terapie (Cartaya și colab., 2019).

Miezul placii aterosclerotice este caracterizat de disfuncție endotelială în combinație cu inflamația cronică. Prin urmare, strategiile de direcționare includ funcționalizarea IP cu anticorpi peptide mici cu afinitate cunoscută pentru proteinele ​​supraexprimate în urma procesului de inflamație, cum este cazul E-selectinei (Kessner și colab., 2001; Tsoref și colab., 2018) sau VCAM-1 (Voinea și colab., 2005; Nahrendorf și colab., 2006). E-selectina prezintă o creștere triplă a expresiei în aorta șoarecilor ApoE-/- supuși unui regim alimentar bogat în grăsimi. Recent a fost dezvoltat un copolimer direcționat către E-selectină capabil de a reduce procesul aterosclerotic prin scăderea semnificativă a zonei nucleului necrotic din placă, reducerea recrutării leucocitelor și modificarea macrofagelor spre un fenotip anti-inflamator (Tsoref și colab., 2018). Totodată, direcționarea eficientă a IP la VCAM-1 de la nivelul endoteliului activat a fost raportată atât in vitro, cât și in vivo. Anumiți agenții terapeutici care vizează VCAM-1 au fost folosiți cu succes pentru imagistica prin rezonanță optică și magnetică a plăcii aterosclerotice la șoarecii ApoE-/- dar și pentru administrarea cu succes a moleculelor de micro ARN (miRNA) în scop terapeutic (Nahrendorf și colab., 2006). Kheirolomoom și colab. au arătat capacitatea unui carrier încărcat cu medicament de a inhiba dezvoltarea aterosclerozei la șoarecii ApoE-/- fără efecte secundare majore (Kheirolomoom și colab., 2015). Markerul angiogenic integrină αvβ3 a fost, de asemenea, utilizat ca țintă deoarece este exprimat de celulele endoteliale vasculare și macrofagele prezente în regiunile aterosclerotice. Capacitatea de direcționare aterosclerotică la nivelul integrinei αvβ3 a fost studiată pe șoarecii ApoE-/-, folosind IP încărcate cu nanoparticule cu oxid de fier și funcționalizate cu un fluorofor pentru imagistica prin rezonanță magnetică, respectiv imagistica optică. Astfel, a fost evidențiată o țintire eficientă a plăcii aterosclerotice după injectarea acestor IP în vena codală a șoarecilor (Cartaya și colab., 2019).

În cazul în care nu se acționează în niciun mod asupra reducerii inflamației, acest lucru determină leziuni periculoase din punct de vedere clinic, cu un risc crescut de destabilizare a plăcii și tromboză. Studiul recent CANTOS (Canakinumab Anti-Inflammatory Therapy Outcomes Study) a demonstrat beneficiul suprimării inflamației în bolile cardiovasculare la pacienții cu susceptibilitate ridicată (Ridker și colab., 2017). Cu toate acestea, țintirea inflamației are și un potențial semnificativ de a inhiba imunitatea înnăscută a gazdei și de a compromite apărarea împotriva infecțiilor, iar acest lucru a fost confirmat de frecvența deceselor cauzate de infecție sau sepsis din rândul pacienților care au primit tratament anti-inflamator sistemic. Datorită capacității lor de a realiza livrarea locală a medicamentului, nanoparticulele care țintesc procesul aterosclerotic pot fi capabile de a depăși aceste obstacole (Kasikara și colab., 2018).

Colagenul de tip IV este o proteină subendotelială importantă a membranei bazale ce este expusă în urma apariției procesului inflamator și a leziunilor vasculare. Prin combinarea unei peptide capabile de a recunoaște colagenul de tip IV și o peptidă derivată din anexina A1, s-a observat o creștere de 70% a selectivității nanoparticulelor pentru leziunile aterosclerotice, în raport cu splina și ficatul. Nanoparticulele țintite au suprimat în mod eficient stresul oxidativ prezent în placă, necroza și fibroza. Într-un alt studiu folosind un sistem similar de țintire a colagenului de tip IV, nanoparticule care au încorporat citokina anti-inflamatoare IL-10, au avut un efect protector similar asupra aterosclerozei avansate la șoarecii deficienți pentru receptorul LDL (Ldlr-/-), pe lângă îmbunătățirea eliminării resturilor apoptotice mediate de macrofage, Astfel, atenuarea inflamației locale a părut, de asemenea, să aibă un efect pro-eferocitic. Studiile de toxicitate pe termen scurt nu au evidențiat nicio modificare a nivelului de citokine din sânge, ceea ce sugerează că nanoterapia cu IL-10 este specifică zonelor cu inflamație și pare să nu compromită apărarea organismului. Într-un studiu care a utilizat nanoparticule concepute pentru atenuarea inflamației cauzate de producerea de ROS, administrarea unor radicali liberi a dus la scăderea apoptozei celulare în plăcile șoarecilor ApoE-/-. În urma internalizării nanoparticulelor la nivelul VSMC și macrofagelor, acestea au determinat scăderea preluării celulare de Ox-LDL și transformarea ulterioară în celule spumoase. Nanoparticulele au reușit astfel să depășească eliminarea rapidă și timpul de retenție scurt al agentului terapeutic liber în plăcile aterosclerotice. În plus, beneficiile lor asupra progresiei și stabilității plăcii au fost observate fără efecte secundare, evaluate prin teste de chimie clinică normală, hematologie și viabilitate a șoarecilor în urma tratamentului (Wang și colab., 2018).

Nanoparticulele care vizează inflamația au fost, de asemenea, formulate sub formă de nanoparticule „teranostice”. Într-un model de ateroscleroză la iepure, s-au dezvoltat lipozomi detectabili cu ajutorul imagisticii prin rezonanță magnetică pentru eliberarea prednisolonului la nivelul peretelui vasului inflamat. După o singură doză au fost remarcate scăderi rapide și susținute ale inflamației plăcii ce au fost atribuite unei reduceri a MCP-1 și a numărului de macrofage, efecte observate într-un grad mult mai mic la iepurii tratați cu corticosteroid liber (Lobatto și colab., 2015). În urma evaluării farmacocinetice și toxicologice la șobolani și iepuri sănătoși, lipozomii conținând prednisolon au fost utilizați în studii clinice, însă nu au indus efecte măsurabile asupra inflamației peretelui arterial în studiile din faza I/II. Optimizarea dozei și a programului de tratament la modelele de animale de talie mare ar fi putut duce la o înțelegere mai detaliată a indicelui terapeutic și a dozei necesare pentru a obține un răspuns mai eficient. În ciuda lipsei beneficiilor aduse de tratament, imagistica multimodală a demonstrat o acumulare a nanoparticulelor în macrofagele din placă fără efecte adverse, servind astfel ca un ghid pentru măsurarea eficacității bazate pe imagistică și demonstrând fezabilitatea direcționării nanoparticulelor către zonele aterosclerotice umane (Flores și colab., 2019).

Într-un studiu care a avut drept scop inhibarea recrutării leucocitelor în placa aterosclerotică, Sager și colab. au sintetizat nanoparticule pe bază de polimeri la nivelul cărora au încorporat molecule de siRNA (small interfering ARN) care acționează asupra moleculelor de adeziune celulară. Compuse dintr-o varietate de polimeri sintetici sau naturali, nanoparticulele polimerice sunt mai rezistente la degradare și oferă o arhitectură mai ușor de modificat în comparație cu lipozomii. La șoarecii ApoE-/- care au suferit ligatură coronariană, tratamentul cu nanoparticule încapsulate cu siRNA care vizează molecule de adeziune a redus semnificativ inflamația vasculară după infarctul miocardic. Scăderea acumulării de leucocite a dus, de asemenea, la o scădere a leziunilor tisulare și a formării miezului necrotic. În ansamblu, aceste studii exemplifică posibilitatea ca atât inflamația plăcii, cât și acumularea de celule apoptotice să poată fi abordate direct folosind nanoparticule țintite (Sager și colab., 2016).

Bariere biologice

Deși nanoparticulele terapeutice sunt de obicei injectate intravenos în organism, există mai multe căi de administrare a acestora: administrare intravenoasă, intraperitoneală, dermică sau transdermică, orală și prin mucoasă. În toate cazurile, nanoparticulele se confruntă cu diferite bariere biologice, cum ar fi pielea, mucusul, sângele sau MEC, pe lângă barierele celulare și subcelulare. În consecință, Nano-DDS convenționale au avut un succes destul de limitat până în prezent (Park și Na, 2015).

Sistemul reticuloendotelial

Nanoparticulele sunt de obicei preluate de ficat, splină și alte componente ale sistemului reticuloendotelial (RES) în funcție de caracteristicile suprafeței lor (Brannon-Peppas și Blanchette, 2012). În general, nanoparticulele hidrofobe de dimensiuni mari prezintă obstacolul absorbției lor inevitabile de către RES, ce este compus în principal din monocite, macrofage și celule fagocitice și este localizată în țesutul conjunctiv reticular al ficatului, splinei și măduvei osoase. În plus, sarcina de suprafață joacă un rol important în preluarea de către RES deoarece bariera de filtrare este acoperită de un strat de glicoproteine ​​polianionice, care resping majoritatea particulelor anionice mari. Pentru a depăși această limitare, suprafața nanoparticulelor a fost modificată folosind polimeri hidrofili, neutri și inerți din punct de vedere bologic, precum PEG, care, de asemenea, poate reduce rata de eliminare din sânge (Park și Na, 2015).

Barieră endolizozomală

Endocitoza este unul dintre mecanismele de preluare a diferitelor molecule de către celule. Această cale este mediadă de vezicule cunoscute sub numele de endozomi, cu un pH intern de aproximativ 5, care se maturează într-un mod unidirecțional, de la endozomi timpurii până la endozomi târzii, înainte de a fuziona cu lizozomii, care conțin anumite enzime digestive (Gruenberg și Van Der Goot, 2006). Nano-DDS care pătrund în celule prin calea endocitică sunt prinse în endozomi și ajung în final în lizozomi, unde au loc procese active de degradare enzimatică. Acest lucru detemină o administrare limitată a agenților terapeutici la țintele intracelulare. În prezent se lucrează la dezvoltarea unor strategii de eliberare a acestor nanoparticule direct în citosol, ceea ce le-ar permite să evite calea endocitică și astfel ar fi protejate împotriva degradării (Park și Na, 2015).

CAPITOLUL III.

COMPUȘI BIOACTIVI CU ACȚIUNE ANTI-INFLAMATOARE

Rolul produselor naturale ca remedii a fost recunoscut încă din cele mai vechi timpuri. A existat un interes public și științific considerabil în utilizarea produselor naturale pentru combaterea diferitelor afecțiuni, precum bolile cardiovasculare sau cancerul. Produsele naturale cu activitate anti-inflamatoare au fost folosite de mult timp ca remedii populare pentru febră, durere, migrenă sau artrită (Yuan și colab., 2006).

Polifenoli

Polifenolii sunt cei mai des întâlniți antioxidanți din dietele umane. Aceștia sunt clasificați în diferite grupuri ca acizi fenolici, flavonoizi, lignani și stilbene. Acizii fenolici sunt compuși naturali din regnul vegetal, cu asemănări structurale unice precum prezența unei grupări carboxilice în cazul acizilor cafeic, galic, p-coumaric, vanilic, ferulic și protocatehuic.

Acidul protocatehuic

Acidul protocatehuic (PCA) este un compus identificat frecvent în dieta umană, prezent în multe fructe, cum ar fi prunele (Prunus domestica L.), coacăzele (Ribes uvacrispa L.) sau strugurii (Vitis vinifera). Acest compus este unul dintre componentele biologic active ale unor plante medicinale, inclusiv cele utilizate în fitoterapie, cum ar fi nalba africană (Hibiscus sabdariffa L.), ginkgo japonez (Ginkgo biloba L.) și sunătoarea (Hypericum perforatum L.). Acest polifenol prezintă o serie de efecte terapeutice asociate cu activitatea anti-oxidantă, anti-bacteriană, anti-diabetică, anti-îmbătrânire, anti-fibrotică, anti-virală, anti-inflamatoare, analgezică, anti-aterosclerotică sau hepatoprotectoare (Kakkar și Bais, 2014).

Activitate anti-oxidantă

PCA este considerat un component activ al extractelor din plante tradiționale chinezești, observându-se diversele efecte farmacologice care pot fi strâns corelate cu activitatea sa anti-oxidantă. Suplimentarea dietei cu PCA din Hibiscus s-a constatat a fi benefică în îmbunătățirea activității anti-oxidante și inhibarea stresului oxidativ la nivelul mușchilor scheletici indus de exercițiile fizice la șobolanii Sprague-Dawley (Hsieh și colab., 2006).

Activitate anti-diabetică

PCA la o concentrația de 1% și 2%, atunci când este administrat șoarecilor tratați cu D-galactoză timp de 8 săptămâni, a determinat scăderea nivelurilor de ROS, carboximetil lizină, pentozidină, sorbitol, fructoză și metilglioxal. Polifenolul prezintă, de asemenea, proprietăți anti-inflamatoare în acest sens prin eliberarea scăzută de IL-1β, TNF-α și prostaglandina E2 în creier. PCA la o concentrația de 2% și 4%, administrat șoarecilor diabetici timp de 12 săptămâni, a fost util în prevenirea complicațiilor diabetice asociate glicării (Tsai și Yin, 2012). Într-un alt studiu, cianidin-3-glucozida și PCA au exercitat activități asemănătoare insulinei prin reglarea GLUT4 și prin activarea PPAP𝛾, dovedind o relație de cauzalitate între acest factor de transcriere și adiponectină (Scazzocchio și colab., 2011).

Activitate anti-inflamatoare și anti-aterosclerotică

PCA s-a dovedit a avea efecte anti-inflamatoare promițătoare în diferite modele de inflamație la șobolani. Nivelul parametrilor biochimici (glutationul, superoxid dismutaza, catalaza, peroxidarea lipidică și NO din țesuturile hepatice și alanin-aminotransferaza serică) care apar în timpul diferitelor tipuri de inflamație a fost fie inhibat, fie restabilit semnificativ odată cu pre-tratamentul cu PCA (Lende și colab., 2011). Datorită activității sale anti-inflamatoare, PCA are și un efect anti-aterogen. Antocianinele și metaboliții lor (acizii protocatehuic, galic și vanilic) au fost evaluați în ceea ce privește efectul lor asupra factorilor implicați în ateroscleroză, incluzând inflamația, adeziunea celulară, chemotaxia, disfuncția endotelială, activitatea estrogenică/anti-estrogenică și activitate inhibitoare a enzimei de conversie a angiotensinei (ACE). S-a constatat că PCA inhibă adeziunea monocitelor la celule endoteliale aortice de șoarece activate cu TNF-α, acest lucru fiind asociat cu inhibarea expresiei de VCAM-1 și ICAM-1, și, de asemenea, reduce capacitatea de legare a NF-κB (Liu, 2004).

Aldehida protocatehuică (PA) a fost testată în ceea ce privește efectul asupra VSMC în urma activării cu PDGF, observându-se o atenuare semnificativă a proliferării și migrării celulelor musculare la o concentrație relevantă farmacologic (100 𝜇M). La nivel molecular, s-a observat o scădere a expresiei moleculelor căilor de semnalizare PI3K/Akt și MAPK, ambele reglând enzime cheie asociate cu migrarea și proliferarea celulelor (Moon și colab., 2012).

CAPITOLUL IV.

MATERIALE ȘI METODE

Studiul prezentat în această teză a fost efectuat în Laboratorul de BioNanoTehnologii Medicale și Farmaceutice, Departamentul de Biopatologia și Terapia Inflamației (BTI) al Institutului de Biologie și Patologie Celulară „Nicolae Simionescu”, in cadrul sub-proiectului ”Nanobioparticule inteligente concepute pentru vectorizarea compusilor bioactivi in terapia inflamatiei vasculare”, din cadrul proiectului complex PCCDI „Terapii inteligente pentru boli non-comunicabile, bazate pe eliberarea controlata de compusi farmacologici din celule incapsulate dupa manipulare genetica sau bionanoparticule vectorizate”, PN-III-P1-1.2-PCCDI-2017-0697, Contract nr. 13PCCDI/2018 (UEFISCDI), director sub-proiect Dr. Manuela Călin. Experimentele aferente studiului au fost realizate în condiții de biosecuritate conform legislației de protecție a mediului.

Nanoparticulele testate, nanoparticule de magnetită (MNP) cu proprietăți paramagnetice au fost sintetizate în cadrul Institutul de Chimie Macromoleculară "Petru Poni" Iași, Centrul de cercetări avansate pentru bionanoconjugate și biopolimeri, sub îndrumarea Dr. Adrian Fifere. Înainte de inițierea studiilor in vitro ce reprezintă subiectul prezentei lucrări de disertație și care au avut drept scop evaluarea efectului biologic al nanoparticulelor simple sau funcționalizate cu acid protocatehuic (PCA) asupra liniilor celulare umane EA.hy926 și THP-1, nanoparticulele au fost caracterizate și validate în ceea ce privește dimensiunea lor, eficiența de încărcare și cinetica de eliberare a polifenolului.

Modelul celular in vitro

Tipurile celulare utilizate în acest studiu sunt reprezentate de linia celulară de monocite umane THP-1, utilizată în mod frecvent pentru a investiga in vitro răspunsul și funcția monocitelor și macrofagelor din sistemul cardiovascular, și linia celulară endotelială umană EA.hy926 obținută prin fuziunea dintre celulele umane primare izolate din vena ombilicală și clona rezistentă la tioguanină a celulelor epiteliale pulmonare A549 (expuse la PEG). Linia EA.hy926 este utilizată intens în studiile care vizează endoteliul vascular deoarece posedă proprietăți asemănătoare celulelor endoteliale, precum expresia factorului Von Willebrand, factorului de coagulare VIII, activatorului tisular al plasminogenului (tPA) și trombomodulinei.

Celulele au fost decongelate din stocul personal al laboratorului și cultivate în condiții standard de creștere, prin incubare la 370C, în atmosferă umedă cu 5% CO2, conform recomandărilor de la producători (ATCC® – American Type Culture Collection). Monocitele THP-1 sunt menținute în mediu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, suplimentat cu 10% ser fetal bovin (SFB) inactivat termic și 1% antibiotic (Penicilina-Streptomicină și Neomicină), denumit în continuare mediu de cultură complet RPMI. Tratamentul obișnuit pentru inactivarea termică a serului presupune încălzirea acestuia la 56°C timp de 30 de minute într-o baie de apă cu agitare ocazională, iar acest lucru are drept scop inactivarea componentelor sistemului complement și a altor potențiali inhibitori ai proliferării celulare. Celulele EA.hy926 sunt cultivate în mediu Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM) cu 0,1 % glucoză în compoziție, îmbogățit cu 10% SFB și 1% antibiotic (Penicilina-Streptomicină și Neomicină), denumit în continuare mediu de cultură complet DMEM. Monocitele sunt celule aflate în suspensie, astfel încât acestea au fost cultivate în plăci Petri netratate, în timp ce celulele endoteliale au fost cultivate în plăci Petri special tratate în vederea aderării acestora.

În scopul menținerii viabilității celulelor THP-1, mediul de cultură a fost schimbat o dată la 2 zile, iar în momentul atingerii unei confluențe de 80-90% acestea au fost propagate prin împărțirea lor în noi recipiente de cultură. Acest lucru se realizează deoarece o densitate celulară crescută duce la epuizarea factorilor de creștere din mediu și la apariția inhibiției de contact, fenomen caracterizat de încetarea proliferării celulare.

Deoarece EA.hy926 sunt celule aderente, acestea trebuie desprinse de placa de cultură printr-un tratament enzimatic cu tripsină, încălzită în prealabil la 37oC în baia de apă, și un tratament chimic cu EDTA (acid etilen-diamino-tetraacetic). Tripsina este o protează ce acționează asupra proteinelor din MEC, ducând la perturbarea conexiunilor celulă-matrice, în timp ce EDTA este un chelator de Ca2+ care acționează prin întreruperea contactelor intercelulare formate prin intermediul moleculelor de adeziune celulară Ca2+- dependente.

În urma finalizării studiilor in vitro aferente studiului de față, liniile celulare utilizate au fost supuse protocolului de crioconservare în vederea stocării acestora pe termen îndelungat. Monocitele THP-1 au fost numărate cu ajutorul unei camere de numărare, centrifugate și resuspendate într-un volum adecvat de mediu de congelare ce conține 70% mediu RPMI, 20% SFB inactivat termic și 10% dimetilsulfoxid (DMSO), ce este un agent crioprotector. Într-un mod similar, celulele endoteliale EA.hy926 au fost inițial tripsinizate în vederea desprinderii de pe placa de cultură, centrifugate și apoi resuspendate în 70% mediu DMEM, 20% SFB și 10% DMSO. În final, 1 ml din suspensia celulară a fost transferat în criotub în vederea stocării în azot lichid, la o temperatură de -163oC.

Compușii de testat

Nanoparticulele testate în acest studiu sunt nanoparticule de magnetită (oxid fero-feric) cu proprietăți paramagnetice, stabilizate prin acoperirea cu polimerul natural dextran. Acestea au fost sintetizate prin metoda co-precipitării în cadrul Institutului de Chimie Macromoleculară "Petru Poni" Iași, fiind caracterizate prin stabilirea eficienței de încărcare și cineticii de eliberare. S-a determinat o eficiență de încărcare a PCA pe MNP de 87%. Studiile de eliberare au arătat că o cantitate de 0,114 mg PCA (figura 4) a fost eliberată pe parcursul a 48 de ore de incubare în tampon fosfat salin (PBS), la pH 7,4 și la 37oC . Nanoparticulele au fost funcționalizate extemporaneum cu acidul protocatehuic, iar protocolul de funcționalizare a constat în:

Fig. 4 Structura chimică a acidului protocatehuic

(https://www.selleckchem.com/products/protocatechuic-acid)

Soluțiile apoase de nanoparticule simple (MNP) și PCA (1 mg MNP / 1 mg PCA în 1 mL H2O ultra pură) au fost amestecate și omogenizate pentru 20 de minute, la 900 rpm și la temperatura camerei.

Ulterior, nanoparticulele funcționalizate cu acidul protocatehuic (MNP-PCA) au fost separate din soluție prin centrifugare la 10.000 rpm, la 4oC, pentru 10 minute, urmând a fi realizate 2 etape de spălare prin resuspendarea nanoparticulelor în H2O ultra pură.

În final nanoparticulele au fost dispersate prin sonicare pe baie de apă pentru 3 minute, cu formarea unei soluții stoc de concentrație 1 mg/mL.

Evaluarea citotoxicității nanoparticulelor și polifenolului liber și a modificărilor morfologice induse în celule de către tratament

Prepararea soluțiilor pentru tratament

Soluțiile stoc de MNP și polifenol liber au fost preparate conform tabelului 1, în timp ce MNP-PCA au fost obținute conform modului de lucru descris in secțiunea 2. Dexametazona (Dex) a fost utilizată drept control pozitiv, fiind un agent anti-inflamator bine cunoscut.

Tabel 1. Prepararea soluțiilor stoc

Pentru a evalua efectul nanoparticulelor asupra macrofagelor, acestea din urmă au fost tratate timp de 24 de ore cu diferite concentrații ale polifenolului: 250 µM, 300 µM, 350 µM, 400 µM și 450 µM. Eficiența de încărcare a PCA este de 87%, astfel încât la 1 mg de nanoparticule se vor încorpora 0.87 mg de polifenol, echivalentul unei concentrații finale de 5645 µM.

Toate soluțiile de nanoparticule au fost raportate la cantitatea de polifenol încorporată conform tabelului 2.

Tabel 2. Prepararea soluțiilor de nanoparticule și polifenol liber

Pentru a determina concentrația optimă de lucru a Dex pentru a fi utilizată în experimentele ulterioare drept control pozitiv cu acțiune anti-inflamatoare, s-au testat un număr de 6 diluții pornind de la o soluția stoc de 50 µM conform tabelului 3:

Tabel 3. Prepararea soluțiilor de dexametazonă

Activarea monocitelor în vederea obținerii macrofagelor M1 și aplicarea tratamentului

Celulele cultivate în plăci de cultură au fost numărate cu ajutorul unei camere de numărare Bürker – Türk și ulterior au fost centrifugate 5 minute, la 1050 rpm și la o temperatură de 24oC. Sedimentul celular a fost resuspendat într-un volum adecvat de mediu de cultura complet RPMI, astfel încât să se însămânțeze câte 0,8 x 105 celule/cm2 în plăci de 24 de godeuri.

Pentru a putea activa monocitele către fenotipul M1, celulele au fost pre-tratate inițial cu 100 nM 12-miristat-13-acetat de forbol (Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA) pentru a obține macrofage M0, iar după 48 de ore de incubare cu PMA a fost adăugat amestecul de endotoxine bacteriane LPS (Lipopolizaharide) de concentrație 20 ng/ml timp de 24 de ore.

Plăcile de cultură au fost examinate cu ajutorul microscopului optic Zeiss Primo Star iar după confirmarea activării monocitelor, mediul de cultură a fost îndepărtat din fiecare godeu și înlocuit cu soluțiile de MNP, MNP-PCA și PCA, preparate conform procedurii descrise anterior în subcapitolul 2, într – un volum de 400 µl/godeu, în duplicat. Controlul experimental a fost reprezentat de macrofage M0 și M1 netratate, în cazul cărora mediul de cultură a fost reîmprospătat. De asemenea, a existat și un control pozitiv reprezentat de dexametazonă.

Evaluarea efectului citotoxic al nanoparticulelor

Citotoxicitatea nanoparticulelor simple (MNP), a celor funcționalizate (MNP-PCA) și a polifenolului liber (PCA) asupra macrofagelor a fost evaluată folosind testul de determinare a activității lactat dehidrogenazei (LDH). Enzima LDH este o oxidoreductază care catalizează reacția reversibilă piruvat – lactat. În condiții patologice, celulele eliberează LDH în fluxul sangvin după deteriorarea țesuturilor sau hemoliza globulelor roșii. Principiul testului implică cuantificarea activității LDH pe baza reducerii NAD+ la NADH și oxidării substratului LDH la o sare de tetrazoliu, aceasta din urmă putând fi cuantificată spectrofotometric din mediul de cultură în cazul în care membrana celulelor este compromisă. Intensitatea culorii galbene generată de sarea de tetrazoliu în volumul de reacție este proporțională cu nivelurile de NADH din mediile de cultură, respectiv cu activitatea enzimatică a LDH.

După 24 de ore în care macrofagele au fost tratate cu MNP, MNP-PCA și PCA liber, mediul de cultură a fost recoltat și centrifugat 5 minute la 10.000 rpm și la 4oC pentru a sedimenta eventualele celule rămase în mediu.

Mediile, soluțiile de concentrații diferite de standard (NADH) și reactivii au fost pipetați într-o placă de 96 de godeuri. Intensitatea culorii galbene generate în urma reacției enzimatice a LDH a fost înregistrată la lungimea de undă de 450 nm, cu ajutorul cititorului de plăci TECAN Infinite M200Pro.

Evaluarea modificărilor morfologice induse de nanoparticule

Pentru evidențierea modificărilor morfologice induse de tratamentul cu nanoparticule a fost examinat microscopic fenotipul (aspect global, formă, raport citoplasmă/nucleu, etc) macrofagelor derivate din monocitele THP-1 supuse tratamentului cu nanoparticule și polifenol liber, comparativ cu celulele netratate.

După 24 de ore de incubare cu MNP, MNP-PCA și PCA, mediul de cultură a fost îndepărtat și s-au realizat 3 etape de spălare cu PBS 1X.

Celulele au fost fixate cu o soluție proaspătă de 4% paraformalehidă, timp de 30 de minute la 4oC și spălate de 2 ori cu PBS 1X.

Membrana celulelor a fost permeabilizată, la rece, prin incubarea celulelor fixate cu o soluție de 0.5% Triton-X 100, timp de 5 minute, urmată de 3 etape de spălare cu PBS 1X.

În scopul evidențierii filamentelor de actină, macrofagele au fost incubate, la temperatura camerei, cu o soluție de 200 ng/ml faloidină-FITC, timp de 40 de minute.

După 3 etape de spălare cu PBS 1X, nucleii celulelor au fost marcați prin incubarea, la temperatura camerei, cu o soluție de 1 µg/ml Hoechst, timp de 10 minute.

După o ultimă etapă de spălare, vizualizarea fluorescentă a probelor a fost realizată la microscopul inversat Olympus IX81, iar captarea imaginilor a fost realizată cu Softul Olympus cellSens.

Evaluarea potențialului anti-inflamator al nanoparticulelor

Evaluarea adeziunii monocitelor la celulele endoteliale

Celulele EA.hy926 au fost însămânțate în placă de 24 de godeuri la o densitate de 105celule/cm2, lăsate să adere timp de 24 de ore și tratate cu 10 ng/ml TNF-α timp de 18 ore, cu scopul activării acestora.

Nanoparticulele magnetice au fost funcționalizate cu PCA conform descrierii din subcapitolul 2 și ulterior au fost realizate diluții corespunzătoare concentrației de 350 µM. În continuare, acestea, împreună cu MNP și PCA liber au fost adăugate în mediul de cultură timp de 24 de ore. Fiecare experiment a fost realizat în triplicat.

După trecerea celor 18 ore de activare cu TNF-α, mediul a fost îndepărtat, iar peste celulele endoteliale s-au adăugat monocite THP-1 (1,25×105 celule/cm2) marcate fluorescent. Marcarea a fost realizată prin incubarea cu 1 µg din acetoximetil esterul 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(6')-carboxifluoresceinei (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(-6)-Carboxyfluorescein Acetoxymethyl Ester, BCECF-AM) per 106 monocite, timp de 30 de minute la 37oC.

În final, monocitele care nu au aderat la celulele endoteliale au fost îndepărtate prin spălarea monostratului cu mediu complet RPMI cald. Vizualizarea fluorescentă a fost realizată la microscopul inversat Olympus IX81, captarea imaginilor a fost realizată cu Softul Olympus cellSens, iar numărarea monocitelor s-a realizat cu ajutorul programului ImageJ.

Tehnica citometriei în flux

Pentru a evalua răspunsul anti-inflamator al macrofagelor polarizate conform protocolului descris în secțiunea 2.1.2. și tratate cu MNP, MNP-PCA și PCA la concentrații de 350 µM, au fost analizate citokinele IL-6 și IL-1β eliberate în mediul de cultură la 1 oră și 24 de ore de la tratament cu ajutorul tehnicii citometriei în flux. În acest scop au fost utilizate kit-urile Human Flex Set pentru IL-6 și IL-1β în combinație cu kit-ul Human Soluble Protein Master Buffer, conform următorului protocol de lucru:

Inițial s-a realizat reconstituirea standardului în 4 ml de tampon furnizat de kit urmată de diluția serială a acestuia:

Fig. 5 Diluția serială a standardului (preluat și modificat din manualul de instrucțiuni).

În continuare s-a realizat reconstituirea bead-urilor de captură furnizate de kit și incubarea probelor cu acestea timp de 1 oră, urmată de incubarea cu reactivul de detecție cuplat cu ficoeritrină (PE) timp de 2 ore. Ambele etape au fost realizate la temperatura camerei.

În final, în urma spălării și centrifugării (5 minute la 200 x g), probele au fost resolubilizate în 300 µl tampon de spălare și ulterior transferate în tuburi de citometrie în flux, fiind analizate la citometrul GalliosTM (Beckman Coulter) prin utilizarea filtrului pentru PE. Prelucrarea datelor s-a realizat în softul Kaluza 1.5 (Beckman Coulter).

Fig. 6 Reprezentarea grafică a principiului pe care se bazează kit-ul Human Flex Set (preluat și modificat din manualul de instrucțiuni).

Tehnica Western Blotting

O altă modalitate de evaluare a potențialului anti-inflamator al nanoparticulelor utilizate în acest studiu asupra macrofagelor a fost reprezentată de cuantificarea citokinei IL-1β prin tehnica Western Blotting.

Macrofagele, odată activate, au fost incubate cu soluția de nanoparticule timp de 1 oră și 24 de ore, fiind ulterior lizate în tampon adecvat metodelor imunologice (Radioimmunoprecipitation assay buffer, RIPA) și sonicate în vederea eliberării conținutului celular.

Concentrația proteică totală a fost determinată prin metoda acidului bicinchoninic (BCA), iar pentru a putea cuantifica moleculele de interes s-a realizat inițial electroforeza în gel de poliacrilamida, în condiții denaturante (sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE). Pentru separarea proteinelor s-au preparat geluri de separare în gradient de concentrație 5-20%, în timp ce gelul de concentrare a avut concentrația de 3%. Astfel, s-au încărcat volume de proba cu o concentrație de 30 µg de proteină per godeu, urmată de separarea în câmp electric pe baza maselor moleculare.

După separarea proteinelor în gel, acestea au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză cu diametrul porilor de 0.45 μm în sistem semi-uscat. Membranele au fost spălate în tampon salin-Tris (TBS), la care s-a adăugat 0.1% detergent Tween 20 (TBS-T) și incubate timp de 1 oră în tampon TBS-T cu 3% albumină serică bovină (BSA) în scopul blocării eventualelor situsuri care nu coincid cu proteina de interes.

După etapele de spălare și blocare ale membranei s-a realizat incubarea peste noapte cu un anticorp primar anti-proteina de interes la 4oC și sub agitare continuă. A doua zi, după îndepărtarea anticorpului primar și spălarea membranelor, acestea au fost incubate timp de 1 oră la temperatura camerei cu o soluție de anticorp secundar conjugat cu peroxidaza din hrean (HRP) anti-specia în care a fost dezvoltat anticorpul primar.

În final, membranele au fost incubate cu substratul chemiluminescent al HRP și developate utilizând analizorul de imagini G:BOX Chemi XX6. Densitometrarea ulterioară a benzilor corespunzătoare proteinelor de interes s-a realizat în programul TotalLab TL120, iar valorile obținute au fost ulterior raportate la o proteina housekeeping reprezentată de β-actină.

CAPITOLUL V.

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Studiul realizat în cadrul acestei teze a avut drept scop validarea și evaluarea in vitro al efectului biologic al unor nanoparticule magnetice acoperite cu dextran, dezvoltate în scopul administrării țintite a polifenolului PCA în vederea atenuării proceselor inflamatorii (de la nivelul ateromului), care stau la baza debutului și progresiei aterosclerozei.

În acest scop, viabilitatea celulară a macrofagelor derivate din monocite, tratate pentru 24 de ore cu nanoparticule funcționalizate cu PCA a fost evaluată cantitativ printr-o metodă spectrofotometrică (testul LDH). Evaluarea citotoxicității induse de tratamentul cu diferite concentrații de MNP, MNP-PCA și PCA liber timp de 24 de ore a permis identificarea concentrației optime de polifenol încorporat în nanoparticule ce a fost utilizată în studiile ulterioare pentru evaluarea potențialului anti-inflamator al acestora.

Astfel, studiile realizate în acest sens au vizat (i) evaluarea citotoxicității induse de nanoparticulele libere și funcționalizate cu polifenolul și de către polifenolul liber, (ii) evaluarea modificărilor morfologice induse de nanoparticule libere/funcționalizate și polifenol liber prin microscopie de fluorescență și (iii) evaluarea potențialului anti-inflamator al nanoparticulelor libere/funcționalizate și polifenolului liber prin cuantificarea citokinelor pro-inflamatorii IL-1β și IL-6 folosind tehnica citometriei în flux și/sau Western Blotting și prin efectuarea testului de adeziune a monocitelor la celulele endoteliale, bazat pe tehnica microscopiei de fluorescență.

Polarizarea macrofagelor

Diferențierea monocitelor în macrofage reprezintă o etapă esențială în dezvoltarea plăcii de aterom. Polarizarea macrofagelor presupune procesul prin care acestea își modifică fenotipul ca răspuns la stimulii din micromediul vascular. Macrofagele prezintă un nivel ridicat de plasticitate astfel încât pot fi stimulate pentru a trece in vitro către un fenotip pro-inflamator (M1) sau anti-inflamator (M2) prin expunerea la diferiți factori precum factorul de stimulare a coloniilor de granulocite-macrofage (GM-CSF), LPS sau IFN-, respectiv IL-4, IL-10 sau TGF-β, în funcție de studiile dorite. Astfel, în studiile noastre, monocitele THP-1 au fost activate pentru inducerea fenotipului M1 prin incubarea pentru 48 de ore cu 100 nM PMA (diferențierea monocitelor în macrofage, M0) și pentru 24 de ore cu 20 ng/ml LPS (M1). PMA este un diester ce are capacitatea de a activa protein kinaza C (PKC), acționând într-o manieră similară diacilglicerolului (DAG), având rol în activarea unor factori de transcriere precum p38 sau NF-κB (Bhattacharya și colab., 2018) care vor crește expresia receptorilor de adeziune de la nivelul membranei plasmatice a monocitelor (Pinto și colab., 2020). LPS este o componentă a membranei bacteriilor Gram-negative ce declanșează secreția de citokine pro-inflamatorii a macrofagelor M1 (Meng și Lowell, 1997).

După tratamentul cu cei 2 inductori pro-inflamatori, celulele au fost examinate la microscopul optic în vederea validării fenotipului pro-inflamator M1, iar imaginile au fost captate folosind obiectivele 10x, 20x și 40x. După cum se poate observa din figura 7 există o diferențiere clară a monocitelor în macrofage evidențiată în principal prin aderarea celulelor stimulate cu PMA, respectiv PMA și LPS, de suprafața plăcii de cultură, celulele neactivate rămânând în continuare în suspensie.

Fig. 7 Diferențierea monocitelor THP-1 în macrofage M0 și macrofage M1 în urma incubării cu PMA 100 nM, respectiv cu PMA 100 nM și LPS 20 ng/ml.

Astfel, după incubarea timp de 48 de ore a monocitelor cu PMA are loc o creștere a nivelului de expresie al moleculelor de adeziune (cum ar fi β1-integrina, conform Bhattacharya și colab., 2018), acest lucru determinând aderarea celulelor. În același timp, monocitele THP-1 atașate la suprafața netratată a plăcilor de cultură au prezentat forme poligonale și un volum citoplasmatic crescut, caracteristice macrofagelor M1, în comparație cu controlul nestimulat care și-a păstrat forma sferică în suspensie.

Activarea monocitelor a fost confirmată și prin tehnicile de Western Blotting și citometrie în flux în urma analizării nivelului de citokine pro-inflamatorii specifice macrofagelor M1, rezultate ce sunt prezentate în continuare în subcapitolele 5 și 6. Prin urmare, protocolul de polarizare al macrofagelor a fost validat, iar modelul celular astfel stabilit a fost utilizat în experimentele ulterioare. Un aspect ce trebuie menționat este inexistența unei metode standardizate de cuantificare a polarizării macrofagelor in vitro, astfel încât sunt necesare determinări ce presupun evaluarea expresiei anumitor proteine membranare, a unor citokine secretate (IL-1β, IL-6 sau TNF-α în cazul macrofagelor M1 și IL-4, IL-10 sau IL-12 în cazul macrofagelor M2) și activității unor enzime specifice (arginaza sau NO-sintaza).

Evaluarea citotoxicității induse de nanoparticule și polifenol liber

Macrofagele derivate din monocite prin activarea cu PMA si LPS au fost incubate pentru 24 de ore cu MNP, MNP-PCA și PCA liber la diferite concentrații (250 µM, 300 µM, 350 µM, 400 µM și 450 µM), în vederea evaluării efectului lor citotoxic prin intermediul testului LDH. Pe lângă incubarea cu nanoparticule și polifenol liber, celulele au fost tratate și cu diferite concentrații de dexametazonă : 0.25 µM, 1.25 µM, 2.5 µM, 5 µM, 10 µM și 20 µM, în vederea stabilirii unei concentrații optime de lucru. Dexametazona este un glucocorticoid cu acțiune anti-inflamatorie utilizat în acest caz drept control pozitiv pentru compararea efectului anti-inflamator al nanoparticulelor încărcate cu polifenol.

La finalul celor 24 de ore de tratament, mediile de cultură au fost prelevate și prelucrate pentru investigarea viabilității celulare, conform protocolului descris în secțiunea 2.1.3. Prelucrarea statistică a datelor în softul GraphPad Prism 7.04 a permis reprezentarea grafică a rezultatelor și interpretarea lor în contextul studiat. Astfel, după cum se poate observa din figura 8, indiferent de concentrația de dexametazonă aplicată, aceasta nu a determinat scăderea viabilității celulare a macrofagelor în raport cu celulele netratate.

Fig. 8 Viabilitatea celulară a macrofagelor după 24 de ore de tratament cu dexametazonă la concentrațiile de 0.25 µM, 1.25 µM, 2.5 µM, 5 µM, 10 µM și 20 µM (* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, comparații în raport cu macrofagele M1)

Mai mult, la concentrațiile de 1.25 µM, 2.5 µM, 5 µM și 10 µM poate fi remarcată o creștere statistic semnificativă a viabilității celulare, evidențiată în grafic printr-o activitate enzimatică a LDH mai scăzută (aproximativ 15% pentru 1.25 µM, 2.5 µM și 10 µM, p < 0.05, și 20% pentru 5 µM, p < 0.01) (figura 8).

După cum se poate remarca în figura 9, tratamentul cu MNP, MNP-PCA și PCA liber nu a indus un efect citotoxic asupra macrofagelor THP-1 comparativ cu celulele control. Acest lucru este susținut de literatura de specialitate, întrucât dextranul este un polimer cu o biocompatibilitate ridicată (Estevanato și colab., 2012). Mai mult decât atât, MNP-PCA la concentrațiile de 250 µM, 300 µM și 350 µM au redus semnificativ cantitatea de LDH eliberată în mediul de cultură, astfel reversând efectul citotoxic al inductorilor pro-inflamatori.

Fig. 9 Viabilitatea celulară a macrofagelor după 24 de ore de tratament cu MNP, MNP-PCA și PCA liber la concentrațiile de 250 µM, 300 µM, 350 µM, 400 µM și 450 µM (* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001, comparații în raport cu macrofagele M1)

Polifenolul liber a determinat o îmbunătățire a viabilității celulare comparativ cu celulele control netratate la toate cele 5 concentrații testate, observându-se o tendință similară cu cea a dexametazonei. Cu toate acestea, concentrația unde a fost observată cea mai mică activitate a enzimei LDH este cea de 350 µM, astfel încât această concentrație a fost aleasă pentru a fi utilizată în experimentele ulterioare.

Evaluarea modificărilor morfologice induse de nanoparticule prin intermediul microscopiei de fluorescență

Potențialele modificări morfologice induse de tratamentul cu MNP, MNP-PCA și PCA liber timp de 24 de ore asupra macrofagelor M1 au fost evaluate prin raportarea la celule control, care au fost doar stimulate cu PMA și LPS în vederea activării si obținerii fenotipului pro-inflamator (control). Potențialele modificări au fost analizate prin incubarea celulelor cu o soluție de faloidină cuplată cu FITC (Izotiocianat de fluoresceină), urmată de incubarea cu o soluție de DAPI (4,6-diamidină-2-fenilindol), așa cum a fost descris în cadrul secțiunii 2.1.4. Faloidina este o toxină ce se leagă cu specificitate crescută de filamentele de actină ale citoscheletului, în timp ce DAPI este un compus fluorescent care se leagă cu afinitate crescută la regiunile bogate în adenină și timină ale ADN, marcând astfel nucleii celulelor.

După cum se poate remarca în imaginile de microscopie din figura 10, după 24 de ore de la incubarea cu MNP, MNP-PCA și PCA liber, celulele prezintă o morfologie normală, caracteristică macrofagelor M1, la fel cum se poate observa și în cazul controlului. Astfel, atât nanoparticulele, cât și polifenolul liber nu au indus modificări morfologice asupra macrofagelor testate.

Fig. 10 Imagini de microscopie de fluorescență în care este reprezentat citoscheletul macrofagelor după 24 de ore de incubare cu MNP-PCA, MNP și PCA, controlul fiind reprezentat de macrofagele M1 netratate (filamentele de actină au fost marcate cu faloidină-FITC și sunt reprezentate prin culoarea verde, în timp ce nucleii au fost marcați cu DAPI și sunt reprezentați prin culoarea albastră)

Evaluarea efectului nanoparticulelor asupra adeziunii monocitelor la celulele endoteliale

Unul dintre procesele esențiale, care stă la baza inițierii și progresiei ateromului, constă în infiltrarea celulelor imune din sânge în subendoteliul regiunii vasculare afectate. Acest lucru apare în momentul în care celulele endoteliale devin disfuncționale și predispuse la aderarea celulelor imune circulante, reprezentate cel mai adesea de neutrofile și monocite.

Acest fenomen poate fi evaluat in vitro prin marcarea florescentă a monocitelor , incubarea acestora cu celulele endoteliale în cultură și examinarea prin tehnica de microscopie de fluorescență. În studiul de față, celulele endoteliale EA.hy926 au fost pre-incubate cu 10 ng/ml TNF-α în scopul activării lor, iar apoi au fost tratate timp de 24 de ore cu MNP, MNP-PCA și PCA liber la concentrația de 350 µM. Către finalul incubării celulelor endoteliale cu MNP, MNP-PCA și PCA, monocitele THP-1 au fost marcate cu fluorocromul BCECF-AM și adăugate peste celulele endoteliale tratate.

După prelucrarea statistică a datelor și reprezentarea grafică, se poate observa din figura 11 cum tratamentul celulelor endoteliale cu TNF-α a determinat o creștere a semnalului fluorescent, corelat cu numărul de monocite aderate la celulele endoteliale, ca rezultat al activării lor. Atât în cazul nanoparticulelor încărcate, cât și în cazul polifenolului liber există o reducere statistic semnificativă (60% pentru MNP-PCA și 50% pentru PCA, p < 0,01) a numărului de monocite aderate, evidențiat prin scăderea semnalului fluorescent (Figura 11) comparativ cu celulele control. În ceea ce privește nanoparticulele magnetice neîncărcate, acestea nu au determinat modificări semnificative ale numărului de monocite aderate față de controlul netratat.

Fig. 11 Efectul tratamentului cu MNP, MNP-PCA și PCA liber timp de 24 de ore asupra adeziunii monocitelor THP-1 la celulele endoteliale EA.hy26 (## p ≤ 0.01, celule neactivate vs. celule activate cu TNF-α, ** p ≤ 0.01, comparații în raport cu celulele endoteliale activate cu TNF-α).

Evaluarea potențialului anti-inflamator al nanoparticulelor

Citometria în flux

Potențialul anti-inflamator al nanoparticulelor funcționalizate cu PCA, cât și a celor simple, a fost investigat prin determinarea nivelurilor secretate de IL-1β și IL-6, cu ajutorul tehnicii de citometrie în flux. În acest scop, macrofagele M1 au fost tratate timp de 1 oră, 10 ore și 24 de ore cu MNP, MNP-PCA și PCA liber. Mediul de cultură a fost prelevat la fiecare timp experimental și analizat în vederea evaluării efectului biologic al nanoparticulelor, prin cuantificarea nivelului citokinelor pro-inflamatorii IL-1β și IL-6 . Stimularea macrofagelor M0 cu LPS determină activarea unor factori de transcriere (ERK, p38, NFkB; Amoroso și colab., 2012) care vor determina sinteza citokinelor pro-inflamatorii. Celulele stimulate eliberează în mediul de cultură diferite citokine, a căror cantitate poate fi determinată cu ajutorul unor bead-uri. Fiecare bead prezintă la nivelul suprafeței sale un anticorp de captură specific proteinei de interes, în acest caz proteinele fiind reprezentate de IL-1β și IL-6. Totodată, fiecare anticorp este cuplat cu un fluorocrom a cărui intensitate fluorescentă specifică este înregistrată de detectorul citometrului.

Datele obținute folosind tehnica citometriei în flux sunt reprezentate grafic în figura 12, unde se poate observa cum tratamentul cu nanoparticule, în special cele funcționalizate, au determinat o creștere a nivelului de citokine pro-inflamatorii la 10 ore de la aplicarea tratamentului față de celulele M1 dar și față de celulele tratate cu nanoparticule pentru o oră (Figura 12).

Fig. 12 Concentrațiile de IL-1β (A) și IL-6 (B) ce se regăsesc în mediul de cultură după 1 oră, 10 și 24 de ore de la incubarea cu tratamentul cu MNP-PCA, MNP și PCA.

În schimb, după 24 de ore de la incubarea cu nanoparticule, este remarcată o scădere a expresiei citokinelor IL-1β și IL-6 în raport cu timpul experimental de 10 ore, însă nu și în raport cu macrofagele M1 netratate. Cu toate acestea, atât MNP, cât și MNP-PCA nu au indus un efect citotoxic asupra celulelor după 24 de ore de incubare, după cum a fost prezentat în subcapitolul anterior. Mai mult decât atât, tratamentul a condus la reducerea secreției enzimei LDH în mediul de cultură, evidențiată prin scăderea activității sale enzimatice comparativ cu macrofagele control. Acest fenomen a fost observat și în alte studii similare (Dobrovolskaia, 2015), însă cauza nu a fost încă elucidată, fiind necesare experimente suplimentare care să indice mecanismele moleculare din spatele acestui proces.

Tehnica Western Blotting

Efectul biologic al nanoparticulelor încărcate cu polifenol și al celor simple în ceea ce privește capacitatea de a reduce inflamația a fost evaluat și prin cuantificarea nivelurilor intracelulare ale IL-1β cu ajutorul tehnicii Western Blotting. Similar rezultatelor obținute prin citometria în flux, datele generate în urma developării membranelor și densitometrării benzilor corespunzătoare proteinei de interes au arătat o creștere a sintezei citokinei IL-1β după 10 ore de la incubarea cu nanoparticulele magnetice.

După cum se poate remarca în graficul din figura 13, creșterea expresiei proteinei IL-1β este observată atât în raport cu primul timp experimental testat (1 oră), cât și în raport cu ultimul timp experimental (24 de ore). Astfel, la 10 ore de la tratament, MNP, MNP-PCA și PCA liber, induc un efect pro-inflamator exacerbat ca rezultat al creșterii sintezei IL-1β (Figura 13). Pe de altă parte, expresia citokinei IL-1β este redusă atunci când macrofagele sunt expuse tratamentului cu nanoparticule si polifenol liber pentru 24 de ore față de timpul experimental anterior (10 ore). Cu toate acestea, conform rezultatelor obținute și prin citometrie în flux, nivelurile proteinei IL-1β în mediul de cultură și in lizatele celulare rămân în continuare mai ridicate comparativ cu macrofagele M1 control. De asemenea, celulele răspund într-un mod diferit la tratamentul cu nanoparticule și polifenol liber față de tratamentul cu dexametazonă, unde se poate remarca un efect anti-inflamator semnificativ redus, scădere ce este dependentă de timp.

Fig. 13 Expresia proteică a IL-1β raportată la β-actină după 1 oră, 10 și 24 de ore de la incubarea cu tratamentul cu MNP-PCA, MNP și PCA (* p ≤ 0.05, *** p ≤ 0.001, **** p ≤ 0.0001).

.

CAPITOLUL VI.

CONCLUZII ȘI PERSPECTIVE

Studiul prezentat a avut drept scop validarea și testarea in vitro al efectului biologic pe care îl exercită nanoparticulele magnetice acoperite cu dextran, simple sau funcționalizate cu un polifenol asupra macrofagelor derivate din monocite. Răspunsul celulelor supuse tratamentului cu nanoparticule simple și funcționalizate cu PCA a fost evaluat în principal comparativ cu macrofagele M1 netratate, dar și cu celule tratate cu polifenol liber și dexametazonă, ce este un compus cu proprietăți anti-inflamatoare bine studiate.

În scopul stabilirii unei concentrații optime de lucru a nanoparticulelor funcționalizate cu PCA pentru a putea fi folosită în studiile ulterioare, au fost testate mai multe concentrații ale MNP în raport cu concentrația de polifenol încorporată. Astfel, concentrația optimă a fost determinată prin intermediul testului LDH și a fost de 350 µM, însă niciuna dintre concentrațiile testate nu au avut un efect citotoxic. Macrofagele, odată activate cu PMA și LPS în vederea obținerii fenotipului pro-inflamator M1, au fost incubate pentru diferiți timpi experimentali cu MNP, MNP-PCA și PCA liber la concentrația menționată mai sus și au fost investigate din punctul de vedere al potențialului anti-inflamator. Astfel, studiile realizate în cadrul acestei teze au vizat investigarea efectului indus de tratamentul cu aceste nanoparticule magnetice prin (i) evaluarea modificărilor morfologice de la nivelul citoscheletului cu ajutorul microscopiei de fluorescență, (ii) evaluarea citotoxicității prin intermediul testului colorimetric LDH, (iii) evaluarea potențialului anti-inflamator prin (a) numărul monocitelor aderate la celulele endoteliale și prin (b) cuantificarea nivelurilor secretate de citokinele IL-1β și IL-6 și a nivelurilor intracelulare de IL-1β, prin intermediul tehnicilor de citometrie în flux și Western Blotting.

Tratamentul celulelor endoteliale cu MNP-PCA timp de 24 de ore a dus la o scădere drastică a numărului de monocite aderate la celulele endoteliale activate, rezultat ce susține potențialul anti-inflamator al MNP-PCA asupra celulelor endoteliale. Pe de altă parte, MNP-PCA au determinat în macrofage un efect pro-inflamator, efect manifestat prin creșterea expresiei de citokine pro-inflamatorii, în macrofagele tratate comparativ cu cele control. Acest efect a fost observat după 10 și 24 de ore de tratament cu nanoparticule, prin sinteza crescută a IL-1β, cât și printr-un nivel crescut al concentrației citokinelor IL-6 și IL-1β cuantificate din mediul de cultură. Cu toate acestea, s-a putut observa cum la 24 de ore de tratament cu MNP-PCA, nivelul citokinelor inflamatorii secretate de macrofagele M1 este semnificativ scăzut față de cel determinat la 10 ore. În plus, la 48 de ore de tratament al macrofagelor M1 cu MNP-PCA s-a determinat o concentrație de IL-6 semnificativ redusă față de cea masurată în M1 netratate (date preliminare prezentate în figura 14). În schimb, nivelul de IL-6 măsurat în M1 expuse la MNP simple se menține ridicat. O posibilă explicație a rezultatelor obținute poate fi pusă pe seama acțiunii pro-inflamatorii a MNP per se, acțiune care este anulată la 48 de ore de incubare a macrofagelor cu MNP-PCA, probabil datorită timpului mai îndelungat necesar pentru acțiunea polifenolului PCA transportat intracelular de MNP.

Fig 14 Grafic reprezentând datele preliminare obținute după 48 de ore de tratament cu nanoparticule magnetice (** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001).

În concluzie, folosirea nanoparticulelor magnetice ca DDS reprezintă o perspectivă atrăgătoare în tratamentul afecțiunilor de la nivelul sistemului cardiovascular datorită proprietăților lor unice care pot fi exploatate pentru direcționarea lor specifică la zonele vasculare afectate. Cu toate acestea, pentru a putea utiliza acești nanocarrieri funcționalizați cu PCA pentru studii in vivo este necesară reducerea efectului pro-inflamator asupra macrofagelor observat inițial. O posibilă abordare poate consta în adăugarea unui strat acoperitor suplimentar (Escamilla-Rivera și colab., 2016) care să permită eliberarea compusului biologic activ și să protejeze în același timp celula de efectele negative observate, posibil ca rezultat al oxidării fierului din nanoparticula de magnetită.