EVALUAREA BIOLOGICĂ ȘI A PROFILULUI FARMACOTOXICOLOGIC ÎN CAZUL DERIVAȚILOR DE IZONIAZIDĂ ADMINISTRAȚI ÎN SUSPENSIE [308219]

Capitolul 8

EVALUAREA BIOLOGICĂ ȘI A PROFILULUI FARMACOTOXICOLOGIC ÎN CAZUL DERIVAȚILOR DE IZONIAZIDĂ ADMINISTRAȚI ÎN SUSPENSIE

Compușii cu structură de izonicotinoilhidrazonă, a căror sinteză este prezentată în capitolul 4, [anonimizat]-se pe de o [anonimizat] 25177, și pe de altă parte determinarea toxicității acute prin stabilirea DL 50, [anonimizat], [anonimizat], masculi, rasa Swiss. În plus, s-a determinat biocompatibilitatea in vitro a [anonimizat].

Astfel, în această etapă de analiză a [anonimizat], [anonimizat] o parte, dar și asupra toxicității acute și cronice a izoniazidei, pe de altă parte.

8.1. MATERIALE ȘI METODE

8.1.1. Evaluarea acțiunii antimicrobiene <in vitro>

[anonimizat], [anonimizat]:

[anonimizat] 90% din cazurile totale de tuberculoză;

[anonimizat] 5% din cazurile totale de tuberculoză;

[anonimizat] 3% [anonimizat];

[anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], Mycobacterium mungi (Briffotaux J., et al, 2017).

[anonimizat] (Tortoli E., 2019).

Micobacteriile sunt bacili Gram +, acido-[anonimizat], necapsulați, nesporulați, aerobi, având dimensiuni cuprinse între 1-10 μm în lungime și 0,2-0,6 μm lățime (Talip B.A., et al., 2013). Condițiile optime de dezvoltare a bacililor tuberculoși sunt temperatura de 37,5-38 0C și pH 7-7,5, condiția de aerobioză fiind obligatorie.

,

8.1.1.1. Metoda concentrațiilor absolute

Studiul a [anonimizat], Iași.

Acest test a fost efectuat pentru izoniazida părinte (HIN) [anonimizat] (HIN-a, HIN-b și HIN-c), utilizând ca tulpină microbiană Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177. Scopul acestei determinări este de a [anonimizat]. Astfel, au fost folosite diluții de 1, 2 și 4 μg/ ml în DMSO (dimetilsulfoxid): diluțiile de 1 și 2 μg/ ml pentru HIN ([anonimizat], J. P., Carleton, F.J., 2007), în timp ce pentru derivații HIN-a, HIN-b și HIN-c, au fost testate toate cele trei diluții. Mediul de cultură folosit pentru această metodă a [anonimizat], Lowenstein-Jensen. [anonimizat], va furniza un mediu solid potrivit pentru inoculare.

Din fiecare diluție a [anonimizat] 0,5 ml au fost repartizați în câte o eprubetă, apoi eprubetele au fost așezate în poziție orizontală, astfel încât soluțiile să inunde panta de mediu. Eprubetele au fost ținute în această poziție, la frigider, pentru 48 de ore, astfel încât soluțiile să fie absorbite de mediul de cultură. Apoi, în fiecare eprubetă astfel pregătită, au fost repartizați câte 0,2 ml dintr-un inoculum standardizat al tulpinii de referință.

Eprubetele au fost incubate la 37ș C, în poziție orizontală, pentru alte 48 ore și apoi până la 28 zile în poziție verticală. Citirea a fost făcută prin comparație între epruba martor (cu DMSO- eprubeta nr. 23), pentru care creșterea bacteriană a fost apreciată cu 3+ (cultura confluentă) și eprubetele cu diluțiile în DMSO (HIN – eprubetele 1,2; HIN-a – eprubetele 3,4,5; HIN-b – eprubetele 6,7,8 și HIN-c – eprubetele 9,10,11).

8.1.1.2. Determinarea Concentrațiilor Minime Inhibitorii (CMI)

În plus față de metoda concentrațiilor absolute, pentru a verifica dacă modificările chimice efectuate asupra structurii izoniazidei au influențat activitățile antimicobacteriene odată cu obținerea noilor compuși sintetizați, s-au determinat concentrațiile minime inhibitorii (CMI) împotriva speciei de Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177. Acest parametru constituie un factor deosebit de important în stabilirea dozelor și a căilor de administrare în cazul infecțiilor microbiene.

Mediul folosit pentru această determinare a fost Middlebrook 7H9 (cunoscut pentru creșterea rapidă a micobacteriilor) potrivit tehnicii de lucru descrise în literatura de specialitate (Jhamb SS., et al., 2014). Pentru facilitarea creșterii micobacteriilor a fost folosit un supliment de creștere constituit din: acid oleic, albumină, dextroză și catalază.

Înițial au fost preparate diluții succesive ale izoniazidei și derivaților corespunzători, cuprinse între 25 to 0.012 μg/ mL, direct în plăci de microtitrare cu 96 de godeuri, într-un volum de 50 μL de mediu Middlebrook 7H9. Pentru fiecare probă s-a adăugat ulterior un inocul (50 μL) de Mycobacterium tuberculosis. Plăcile astfel preparate au fost protejate cu parafilm și apoi incubate la 37 °C timp de 8 zile. După această perioadă s-a adăugat câte 10 μL amestec proaspăt de 1:1 – Reactiv Alamar Blue 0.1 mg/ml și Tween 80 10 %, probele fiind apoi incubate din nou pentru alte 24 de ore la 37ș C.

La finalul experimentului, rezultatele au fost interpretate pe baza colorației rezultate: colorația albastră indică lipsa creșterii bacteriene în timp ce colorația roz indică prezența creșterii bacteriene. Concentrația Minimă Inhibitorie a fost definită ca fiind cea mai mică concetrație de substanță activă capabilă să prevină dezvoltarea bacteriilor, prin urmare capabilă să prevină apariția colorației roz. Fiecare determinare a fost realizată în triplicat, pentru a se asigura acuratețea rezultatelor.

8.1.2. Efectuarea screeningului toxicologic. Determinarea toxicității acute și cronice

Derivații de izoniazidă (HIN.a, HIN.b și HIN.c) obținuți și descriși anterior, au fost evaluați in vivo comparativ cu izoniazida (HIN), din punct de vedere toxicologic, determinându-se doza letală 50. Studiul s-a realizat în colaborare cu disciplina de Farmacologie, Facultatea de Medicină, Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași.

Găzduirea și manipularea animalelor, administrarea compușilor testați în suspensie și sacrificarea acestora, s-a realizat conform ghidurilor privind deontologia și etica studiului pe animale de laborator (Legea nr. 206/27 mai 2004, EU/2010/63 – CE86/609/EEC) precum și prin obținerea avizului Comisiei de Etică a Cercetării U.M.F. “Grigore T. Popa” Iași, eliberat în data de 17.04.2018.

Screeningul toxicologic s-a realizat pe șoareci albi, masculi, rasa Swiss cu greutatea cuprinsă între 25-30 g. Animalele au fost ținute pe toată perioada experimentului în cuști curate de polietilenă, folosindu-se câte o cușcă pentru fiecare lot. Înainte de începerea experimentului, aceștia au fost aclimatizați timp de 7 zile, primind în tot aceast interval, hrană și apă ad libitum. De asemenea, un aspect important a constituit menținerea condițiilor ambientale de laborator, constante, pe parcursul desfășurării experimentului, temperatura înregistrată fiind de (24 ± 2 șC), cu ciclu de 12 h lumină – 12 h întuneric și umiditate relativă de 40-70%.

Toxicitatea acută, respectiv determinarea dozei letale 50, constă în administrarea compușilor în concentrații aflate în progresie geometrică, pentru a calcula doza care ucide 50% din șoareci. Compușii testați au fost administrați pe cale orală, în concentrații cuprinse între 175-2000 mg/kg corp, sub formă de suspensii, în soluție de CMC-Na 1% iar rata de supraviețuire a fost urmărită pe o perioadă de 24 de ore, 48 de ore, 72 de ore, 7 zile și 14 zile de la administrare.

În ceea ce privește calcularea DL50, s-a utilizat metoda aritmetică Karber, folosindu-se următoarea formulă de calcul (Cheaburu Yilmaz C.N., et al. 2017):

DL50 =DL100- Σ(a x b)/n

(1)

unde,

a = diferența dintre două doze succesive de substanță administrată;

b = media numărului de animale moarte din două loturi succesive;

n = numărul de animale dintr-un lot;

DL100 = doza letală 100 (reprezentând cantitatea de substanță care produce moartea tuturor animalelor din lotul de experiență).

Interpretarea rezultatelor de la determinarea DL 50, s-a realizat raportând valorile obținute, la clasificarea toxicității substanțelor farmaceutice, după Grossel SS, Crowl DA. 1994 (tabel 8.I).

Tabel 8.I. Gradul de toxicitate al substanțelor farmaceutice raportat la DL 50 (mg/kg corp)

Toxicitatea substanțelor farmaceutice variază în mod invers proporțional cu valorile dozelor letale 50 obținute. Astfel, cu cât valoarea DL 50 este mai mare, cu atât toxicitatea compușilor scade.

Toxicitatea cronică

Pe baza rezultatelor obținute în cadrul testului de toxicitate acută, s-a urmărit toxicitatea cronică a compușilor obținuți, prin administrarea acestora în doze de 1/10 din DL 50, prin gavaj oral. Astfel, substanțele au fost dispersate în soluție de CMC-Na 1% și administrate în priză unică, timp de 30 de zile, folosind următoarele doze:

17,52 mg/kg corp – doza folosită pentru Izoniazida (HIN);

35,234 mg/kg corp – doza folosită pentru HIN-a;

177,88 mg/kg corp – doza folosită pentru HIN-b;

125,15 mg/kg corp – doza folosită pentru HIN-c;

Experimentul s-a desfășurat pe șoareci albi, masculi, specia Swiss cu greutatea cuprinsă între 25-30 g, crescuți în condiții identice de laborator și aclimatizați timp de 7 zile înainte de începerea experimentului.

În ceea ce privește derularea procedurile experimentale, s-a urmărit în mod deosebit, respectarea reglementările Ordonanței privind protecția animalelor folosite în scopuri științifice sau în alte scopuri experimentale, emisă de Guvernul României în 2002.

Organizarea loturilor de animale care au primit substanțe în suspensie de CMC-Na 1%

Studiul a fost desfășurat, după următoarea schemă de lucru:

Lot 1- HIN suspensie (17,52 mg/kg corp);

Lot 2 – HIN.a suspensie (35,234 mg/kg corp);

Lot 3 – HIN.b suspensie (177,88 mg/kg corp);

Lot 4 – HIN.c suspensie (125,15 mg/kg corp);

Lot 5 – CMC-Na 1% (0,1 ml/kg corp);

Lot 11 – control netratat.

Primele 4 loturi au primit izoniazida părinte și cei trei derivați (HIN-a, HIN-b și HIN-c), în timp ce lotul 5 a fost păstrat ca și martor, primind o soluție pură de carboximetilceluloză sodică 1% iar lotul 11 a fost păstrat ca și control netratat. Toate cele șase loturi au fost incluse în experiment, pentru o perioadă de 30 de zile, administrarea probelor efectuându-se zilnic, în priză unică.

La sfârșitul experimetului șoarecii au fost anesteziați prin administrare de ketamină i.p. 100 mg/kg corp. În cadrul eutanasierii, s-a avut în vedere respectarea Protocolului AVMA de Eutanasie (elaborat în anul 1933) și a cerințelor cuprinse în cadrul acestuia: metoda aplicată să fie nedureroasă, să producă imediat starea de inconștiență, oprirea inimii, a respirației și moartea (Flecknell P., et al., 2015).

De asemenea, în cadrul procedurii de eutanasiere, s-a urmărit utilizarea unor camere speciale de necropsie, izolate, pentru a nu provoca agitație și în rândul altor animale. În plus, persoanele care au fost implicate în această procedură, au respectat protocolul de eutanasiere în vederea cauzării unui minim de suferință animalului.

După administrarea anestezicului (ketamină i.p 100 mg/kg corp) care a indus în câteva secunde starea de inconștiență, s-a urmărit absența semnelor vitale, oprirea bătăilor inimii, a respirației și absența reflexelor.

Pentru confirmarea decesului s-a ținut cont de următoarele aspecte:

Evaluarea ritmului cardiac, timp de cel puțin cinci minute, prin palparea directă, a pulsului din artera carotidă sau din cea femurală, sau prin palparea cardiacă directă;

Un semn neurologic reprezintă constricția pupilei animalului. Instalarea morții animalelor determină dilatarea pupilelor acestora, fără a mai răspunde la stimuli luminoși.

La finalul experimentului s-au recoltat produse biologice, fragmente din ficat, rinichi, cord, plămâni și creier în vederea determinărilor biochimice și histo-patologice. Astfel, după imobilizare prin fixarea membrelor, a fost deschis toracele împreună cu zona abdominală pentru recoltarea organelor. Organele au fost fixate în formol tamponat 10% pentru a putea fi analizate din punct de vedere histopatologic.

Resturile rezultate în urma prelucrării probelor recoltate (țesuturi, reactivi) au fost colectate în containere speciale pentru inactivare și predate personalului responsabil pentru colecctarea și distrugerea lor (Protocole d'amendement à la convention européenne sur la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales ou à d'autres fins scientifiques, Strasbourg, 22.06.1998).

8.1.3. Efectuarea studiului histopatologic

În cazul evaluării toxicității acute, au fost examinate fragmente de creier, cord, rinichi, pulmon și ficat. În scopul evaluării efectului administrării compușilor selectați sub formă de suspensiee, asupra toxicității cronice tisulare, s-a realizat un studiu histopatologic pe fragmente de țesut hepatic, pentru identificarea eventualelor modificări morfologice.

Conform protocolului experimental, după sacrificarea animalelor au fost prelevați ficații, fixați în formol neutru 10% timp de 48 de ore și ulterior prelucrați urmărind etapele specifice tehnicii histopatologice, în cadrul Laboratorului de Histologie, U.M.F. Iași. Prima etapă a constat în includerea fragmentelor tisulare prelevate în parafină. Blocurile de parafină obținute au fost secționate la microtom, la 2-3 microni grosime, secțiunile obținute fiind etalate pe lame, după care s-au colorat specific cu H&E. Examenul microscopic s-a efectuat utilizând un microscop Nikon Eclipse 50i, pentru a observa dacă există alterări tisulare care să evidențieze impactul administrării substanțelor în suspensie de CMC-Na 1%.

Colorația cu Hematoxilin-eozină (Mogoantă L., et al, 2007).

Soluții folosite:

1. Hemalaun Mayer acid

– hematoxilină cristalizată…………………………………………..1,0g

– apă distilată……………………………………………………………1000 ml

– iodat de sodiu(NaIO3)……………………………………………..0,2g

– alaun de sodiu sau de potasiu…………………………………….50g

– acid citric………………………………………………………………..1g

– cloralhidrat……………………………………………………………..50g

Adăugarea cu precizie a cantității de NaIO3 este foarte importantă. O cantitate mai mare va supraoxida hematoxilina și în consecință nucleii se vor colora în maroniu palid. Soluția de hemalaun supraoxidată va avea o culoare maronie.

Se adaugă hematoxilina în apă distilată, se fierbe 15 minute iar apoi se lasă să se răcească. După răcire se adaugă NaIO3 și se lasă la cald 10 minute. Urmează apoi adăugarea celorlalte substanțe în ordinea indicată mai sus, numai după ce ne-am asigurat că cel adăugat anterior s-a dizolvat complet. În final, soluția trebuie să aibă o culoare violet-roșiatică.

2. Soluția Eozină-Floxină

a. Soluția stoc Eozină Y

-eozină………………………………………………………………………….1,0g

-apă distilată………………………………………………………………….100ml

-alcool 95%…………………………………………………………………..300ml

Se dizolvă eozina în apă caldă. După răcire se adaugă alcoolul.

b. Soluția stoc Floxină

-floxină………………………………………………………………………..1,0g

-apă distilată…………………………………………………………………100ml

-alcool 95%…………………………………………………………………..300ml

Pentru dizolvarea floxinei, soluția trebuie încălzită.

c. Soluția de lucru eozină-floxină

-eozină stoc…………………………………………………………………..450ml

-floxină stoc…………………………………………………………………..50ml

-acid acetic glacial…………………………………………………………..2ml

Tehnica de colorare:

– deparafinarea țesutului în 3 băi succesive de benzen;

– hidratare în 3 băi succesive de alcool (absolut, 95% și 80%);

– înlăturarea pigmentului hemosiderinic din țesut;

-colorare cu hemalaun Mayer, 10-20 minute(după fixare în formalină, timpul de colorare este mai scurt);

– spălare în apă de robinet curgătoare, 15-20 minute;

– colorare cu soluție de lucru eozină-floxină, 15 sec;

– spălare scurtă în apă;

– deshidratare prin trecere rapidă printr-o baie de alcool 80%, 2 băi de alcool 95% și 3 băi de alcool absolut;

– clarificare în amestec de alcool absolut/xilen (1/1) și apoi în câteva băi de xilol;

– montare.

În ceea ce privește interpretarea rezultatelor obținute la microscop, nucleii se vor colora în albastru violet iar citoplasma și diferitele elemente ale țesutului conjunctiv în nuanțe de roz.

8.1.4. Evaluarea biocompatibilității in vitro a probelor utilizând analiza viabilității celulelor MTT

Studiul a fost realizat în colaborare cu Institutul Național de Cercetare- Dezvoltare pentru Științe Biologice, București.

Cultură de celule și materiale

Pentru analiza biocompatibilității și examinarea morfologiei celulare a probelor a fost utilizată o linie stabilizată de fibroblaste de șoarece NCTC (929 clone), cultivate în baloane de cultură tisulară T-25 la o densitate de 4×104 celule/ml în Mediul Minim Esențial (MEM) (Sigma-Aldrich) suplimentat cu ser fetal bovin 10% (Biochrom) și antibiotice 1% (penicilină, streptomicină și neomicină achiziționate de la Sigma-Aldrich).

Celulele în plăci cu 24 de godeuri, au fost incubate pentru 24 ore la 37 °C și 95% umiditate relativă în atmosferă de aer care conține 5% CO2, pentru a induce adeziunea celulară. Biocompatibilitatea probelor a fost evaluată utilizând bromura de tiazolil tetrazoliu MTT Cell Proliferation Assay (Sigma-Aldrich), în timp ce pentru morfologia celulară a fost utilizată soluția de colorare Hematoxilina – Eosina (Sigma). Evaluarea citotoxicității probelor sub formă neîncapsulată (izoniazidă și derivați utilizați ca atare) a fost efectuată prin expunerea celulelor cultivate direct la eșantioane, urmată de evaluarea viabilității celulelor MTT.

Metoda de proliferare a celulelor MTT, constă într-o reducere celulară a dehidrogenazei mitocondriale de către reactivul tetrazoliu, în celule metabolice active și formarea precipitatului formazan care necesită adăugarea unui agent de solubilizare, pentru a genera o soluție adecvată pentru înregistrarea absorbanței. Intensitatea soluție albastră-purpurie, obținută după dizolvarea precipitatului în izopropanol, este direct proporțională cu numărul de celule viabile, în condiții de cultură standard.

Pentru testul de biocompatibilitate in vitro al derivaților de izoniazidă, probele au fost dizolvate mai întâi în DMSO și apoi în mediul de cultură, cu obținerea unei concentrații finale de 1.75 mg / mL. Probele astfel obținute au fost sterilizate prin filtrare, înainte de a fi utilizate în experiment.

După 24 de ore de incubare a celulelor, mediul a fost înlocuit cu câte 500 μL soluție 1.75 mg / mL, corespunzătoare derivaților de izoniazidă. În paralel cu probele, s-au folosit și culturi celulare tratate cu peroxid de hidrogen H2O2 (0.03%), ca și control pozitiv, precum și celule netratate folosite ca și cultură control. Plăcile au fost incubate la 37° C, iar evaluarea cantitativă a citotoxicității a fost făcută după timpul dorit de expunere a probelor (24, 48 și 72 de ore), utilizând bromura de tiazolil tetrazoliu. Morfologia celulelor a fost evaluată după 72 ore, utilizând un microscop inversat. Toate testele au fost efectuate în triplicat.

Analiza proliferării celulelor MTT

Pentru analiza proliferării celulelor MTT, mediul de cultură a fost înlocuit cu mediu proaspăt cu conținut de bromura de tiazolil tetrazoliu iar plăcile au fost incubate la 37 ° C, timp de 3 ore. În continuare, un volum de 500 μL izopropanol a fost adăugat la fiecare probă, pentru a dizolva cristalele de formazan formate. Densitatea optică (OD), a fiecărei soluții colorate, a fost citită la 570 nm, utilizând un cititor de microplăci de tipul Mithras LB940 (Berthold, Germany). Viabilitatea celulară a fost cuantificată utilizând următoarea formulă:

Viabilitatea celulară (%) = ODprobă / ODcontrol × 100,

unde: ODprobă = densitatea optică a probei;

ODcontrol = densitatea optică a controlului netratat (Tihan G.T., et al., 2018).

Colorația Hematoxilin-Eozină

Culturile celulare analizate după 72 ore de experiment, au fost spălate mai întâi cu soluție de PBS (tampon fosfat salin), fixate cu soluție picrică-formaldehidă (40%) (Sigma) și colorate cu coloranți Hematoxilin și Eosin (Avwioro G., 2011). Fotografiile au fost făcute utilizând un microscop cu fază inversă (Nikon) și o cameră foto AxioCam MRc, urmărindu-se morfologia celulară.

8.1.5. Evaluarea parametrilor biochimici

Pentru investigarea afectării funcției hepatice au fost determinate nivelurile serice ale enzimelor: TGP, TGO și fosfataza alcalină. Astfel, pentru obținerea serului, sângele a fost colectat în tuburi de centrifugare și centrifugat la 3000 rpm timp de 20 min. În continuare, probe serice proaspete au fost utilizate pentru determinarea activității enzimelor TGP, TGO și fosfatazei alcaline. Aceste evaluări ale parametrilor biochimici sunt deosebit de importante întrucât deteriorarea integrității structurale a ficatului este frecvent apreciată prin determinarea activității aminotransferazelor serice (TGP și TGO) (Amin A., Hamza AA., 2005).

Transaminazele numite și aminotransferaze reprezintă o clasă de enzime ce au capacitatea de a “transfera” gruparea aminică (-NH2) de la un aminoacid la un ceto-acid cu formarea unui alt aminoacid corespunzător cetoacidului și a unui nou cetoacid corespunzător aminoacidului. Transaminazele fac parte din categoria enzimelor plasmatice nefuncționale datorită faptului că, în condiții normale, acțiunea lor nu se manifestă în plasmă.

Reacția generală pe care o catalizează aceste enzime se poate schematiza astfel:

Reacțiile se pot realiza folosind ca și materiale biologice: serul nehemolizat, lichidul cefalorahidian sau alte medii biologice ce conțin enzimele respective.

Transaminazele cu valoare clinică importantă, cel mai des dozate în laborator sunt:

-alaninaminotransferaza (ALAT) sau transaminaza glutamic-piruvică (TGP)

-aspartataminotransferaza (ASAT) sau transaminaza glutamic-oxalacetică (TGO) (Tutunaru D., 2007; Tutunaru D, Chesaru B.I. 2010).

Alaninaminotransferaza (ALAT)/ Transaminaza Glutamic-Piruvică (TGP)

Reacția catalizată de această enzimă se poate schematiza astfel:

În cadrul acestei reacții, TGP catalizează reacția de transfer a grupării amino de la alanină la acidul alfa-cetoglutaric cu obținerea acidului glutamic și acidului piruvic.

Determinarea activității TGP

Metoda colorimetrică cu 2,4- dinitrofenilhidrazina: Metoda Reitman-Frenkel

Principiul metodei

Acidul piruvic obținut se cuplează cu 2,4-dinitrofenilhidrazina cu formarea dinitrofenilhidrazonei corespunzătoare care în mediu alcalin dă o colorație roșie, colorimetrabilă, a cărei intensitate variază direct proporțional cu cantitatea de acid cetonic (piruvic).

Reactivi necesari

Substrat pentru TGP (alanină, acid alfacetoglutaric), Tampon de trietanolamina, Soluție de NaOH 2N, Soluție de NaOH 0,4 N, Soluție de 2,4-dinitrofenilhidrazina, Soluție stoc de piruvat de sodiu 2 mM.

Tehnică de lucru

Se pregătesc patru eprubete: proba (P), standard (S), blanc pentru probă (Bp), blanc pentru reactivi (Br) și se pipetează în fiecare câte 0,5 ml substrat. În eprubeta probă se introduc 0,1 ml ser iar în eprubeta standard 0,1 ml soluție standard piruvat. Se incubează toate eprubetele la 37șC timp de 30 de minute după care se adaugă 0,5 ml reactiv: soluție de 2,4-dinitrofenilhidrazina și se lasă în repaus 20 de minute la temperatura camerei. După adăugarea a câte 5 ml NaOH în fiecare eprubetă se măsoară extincția probei, standardului și blancului probă, față de blancul de ractivi, la 520 nm.

Calcul

Se calculează producția de piruvat în µmoli/min/l, obținând activitatea enzimatică în U transaminazice:

Activitate enzimatică a TGP= (Ep-EBp) / (Es- EBp) x 66,7.

unde 66,7 este concentrația acidului piruvic rezultat din reacția pentru TGP.

Valori normale. Variații fiziologice. Variații patologice.

Valori normale: la adulți între 2-16,5 U/l

la copii < 5 ani între 0,2-13 U/l

Variații patologice. Creșterea valorii TGP peste cea normală reflectă modificări patologice celulare, semnalând faza inițială de “leziune biochimică”. Creșterea devine și mai semnificativă în momentul fazei de necroză celulară. Tranzaminaza TGP întâlnită cu preponderență în ficat și mai puțin în miocard, prezintă o creștere sanguină în: bolile parenchimului hepatic, hepatită virală în formă acută, hepatită toxică sau necroză, hepatite cornice, ciroze, icter mecanic (Tutunaru D., 2007; Tutunaru D, Chesaru B.I. 2010).

Aspartataminotransferaza (ASAT)/ Transaminaza Glutamic-Oxalacetică (TGO)

Reacția catalizată de această enzimă se poate schematiza astfel:

În cadrul acestei reacții, TGO catalizează reacția de transfer a grupării amino de la acidul aspartic la acidul alfa-cetoglutaric cu obținerea acidului glutamic și acidului oxalacetic.

Determinarea activității TGO

Metoda colorimetrică cu 2,4- dinitrofenilhidrazina: Metoda Reitman-Frenkel

Principiul metodei

Acidul oxalacetic rezultat trece spontan printr-un proces de decarboxilare in acid piruvic. Acidul piruvic obținut se cuplează cu 2,4-dinitrofenilhidrazina cu formarea dinitrofenilhidrazonei corespunzătoare care în mediu alcalin dă o colorație roșie, colorimetrabilă, a cărei intensitate variază direct proporțional cu cantitatea de acid cetonic (piruvic).

Reactivi necesari

Substrat pentru TGO (acid aspartic, acid alfacetoglutaric), Tampon de trietanolamina, Soluție de NaOH 2N, Soluție de NaOH 0,4 N, Soluție de 2,4-dinitrofenilhidrazina, Soluție stoc de piruvat de sodiu 2 mM.

Tehnică de lucru

Se pregătesc patru eprubete: proba (P), standard (S), blanc pentru probă (Bp), blanc pentru reactivi (Br) și se pipetează în fiecare câte 0,5 ml substrat. În eprubeta probă se introduc 0,1 ml ser iar în eprubeta standard 0,1 ml soluție standard piruvat. Se incubează toate eprubetele la 37șC timp de 30 de minute după care se adaugă 0,5 ml reactiv: soluție de 2,4-dinitrofenilhidrazina și se lasă în repaus 20 de minute la temperatura camerei.

După adăugarea a câte 5 ml NaOH în fiecare eprubetă se măsoară extincția probei, standardului și blancului probă, față de blancul de ractivi, la 520 nm.

Calcul: Se calculează producția de piruvat în µmoli/min/l, obținând activitatea enzimatică în U transaminazice:

Activitate enzimatică a TGO= (Ep-EBp) / (Es- EBp) x 33,3

unde 33,3 este concentrația acidului piruvic rezultat din reacția pentru TGO.

Valori normale. Variații fiziologice. Variații patologice.

Valori normale: la bărbați între 27-45 U/l

la femei între 22-35 U/l

la copii între 3 luni – 1 an: până la 28 U/l

Variații patologice. Transaminaza TGO întâlnită în toate țesuturile, în special în ficat și miocard apare în cantități crescute în sânge în: infarctul de miocard, embolie cerebrală, distrofie musculară, leziunile parenchimului hepatic.

Creșteri importante ale TGO apar și în hepatite virale acute, hepatopatii toxice, în timp ce creșteri moderate apar în hepatite cronice, ictere, afecâiuni distrofice musculare, după traumatisme, anemii hemolitice, mononucleoză infecțioasă.

Observații: Creșterea TGP este mai importantă decât cea a TGO, în hepatite infecțioase datorită lezării membranelor celulare în timp ce creșterea TGO este mai importantă decât creșterea TGP în hepatite infiltrative datorită lezării membranelor celulare și mitocondriale (Tutunaru D., 2007; Tutunaru D, Chesaru B.I. 2010).

Fosfataza alcalină

Fosfatazele sunt un grup de enzime cu un rol semnificativ în eliberarea acidului ortofosforic din cadrul compușilor ce conțin funcții ester, acționând ca și esteraze sau din cadrul compușilor care conțin funcții de tip anhidride, acționând ca și anhidraze. Fosfataza alcalină, alături de cea acidă reprezintă cele mai importante enzime din acest grup.

Reacția catalizată de fosfataza alcalină, se poate schematiza astfel:

Fosfat de p-nitrofenil + H2O = p-nitrofenol + fofat anorganic corespunzător

Determinarea activității fosfatazei alcaline

Metoda spectrofotometrică

Principiul metodei

Fosfataza alcalină reprezintă un termen folosit în cazul unui grup de enzime reactive la pH alcalin, care catalizează hidroliza monoesterilor de tipul monofosfaților organici, punând în libertate p-nitrofenol și fosfatul anorganic corespunzător. Intensitatea colorației obținute este direct proporțională cu cantitatea de p-nitrofenol rezultată din această reacție (colorație galbenă), reflectând activitatea enzimatică.

Reactivi necesari

Tampon de dietilamină 1 M (pH 9,8), clorura de magneziu și soluție de fosfat de p-nitrofenil.

Tehnică de lucru

O eprubetă care conține 1 ml amestec de reactivi și 20 μL ser, se agită și se incubează pentru 1 minut la 37 șC. După acest interval scurt, se măsoară absorbanța la lungimea de undă de 410 nm, folosind ca și martor apa distilată. Aceste citiri se vor repeta la 1, 2 și 3 minute pentru a se putea calcula variația absorbanței la fiecare minut (ΔA).

Calcul: ΔA/ min= (A1+A2+A3) : 3

În funcție de această variație se poate calcula concentrația probei Cp exprimată în UI/L:

Cp UI/L= ΔA/min * 3000 (Tutunaru D., 2007; Tutunaru D, Chesaru B.I. 2010).

Valori normale. Variații fiziologice. Variații patologice.

Valori normale: la bărbați între 70-175 U/l

la femei între 55-170 U/l

la copii în perioada de creștere: până la 700 U/l.

Variații fiziologice. O creștere fiziologică a fosfatazei alcaline se poate observa la femeile însărcinate, în trimestrul trei de sarcină datorită trecerii transplacentare de la făt la mama, întrucât activitatea enzimei osului fetal este crescută. De asemenea, variații fiziologice apar și la copii în perioada de creștere, până la 17 ani, când are loc formarea țesutului osos.

Variații patologice. Creșteri ale fosfatazei alkaline apar în diferite afecțiuni osoase: fracturi, osteomalacia sau rehitismul femeii însărcinate, rahitismul infantile, metastaze osoase, osteoporoza. De asemenea, astfel de creșteri se pot înregistra și în diferite afecțiuni hepatice precum hepatita toxică, metastaze hepatice, ciroză biliară (Tănăsescu GH., Costescu G., 1966).

Metode statistice pentru evaluarea parametrilor biochimici

Datele obținute au fost încărcate și prelucrate cu ajutorul funcțiilor statistice din SPSS 18.0 la pragul de semnificație de 95%.

În calculul diferenței semnificative dintre două sau mai multe grupuri, în funcție de distribuția seriilor de valori, la pragul de semnificație de 95%, pentru variabilele cantitative se aplică:

testul t-Student – test parametric care compară valorile medii înregistrate în 2 grupuri cu distribuții normale;

testul F (ANOVA) utilizat în situația în care se compară 2 sau mai multe valori medii din grupuri cu distribuții normale;

Testul 2 este un test neparametric care compară 2 sau mai multe repartiții de frecvențe provenite din aceeași populație, se aplică când evenimentele așteptate se exclud. Uneori când o frecvență din formula de calcul este mică, se aplică Yates pentru corecția formulei, pentru a obține o estimare mai mare a diferenței.

Corelația Kruskall-Wallis compară variabile ordinale din 3 sau mai multe grupuri.

Coeficient de corelație „Pearson” (r) reprezintă corelația a 2 variabile din același grup, corelația directă/indirectă fiind dată de semnul coeficientului.

Regresia liniară multiplă are drept scop de a evidenția relația dintre o variabilă dependentă (explicată, endogenă, rezultativă) și o mulțime de variabile independente (explicative, factoriale, exogene, predictori).

8.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

8.2.1. Evaluarea acțiunii antimicrobiene <in vitro>

Izoniazida reprezintă un agent bactericid, al cărui mecanism de acțiune include inhibarea sintezei acidului micolic, acesta constituind o componentă importantă a peretului celular din Mycobacterium tuberculosis, cu funcție vitală pentru supraviețuirea bacteriilor (Susmita S., et al., 2016).

8.2.1.1. Metoda concentrațiilor absolute

Rezultatele obținute în cazul evaluării acțiunii antimicrobiene sunt prezentate în figura 8.1.

Fig. 8.1. Acțiunea antimicrobiană a izoniazidei și derivaților săi (HIN-a, HIN-b and HIN-c)

Creșterea bacililor tuberculoși este foarte lentă, primele colonii încep să apară pe mediul solid după 10-15 zile, devenind mature abia după 3-4 săptămâni. Pe mediul Löwenstein-Jensen folosit la acest test, coloniile de M. tuberculosis au aspect de colonii uscate, proeminente, de culoare gălbuie.

De la eprubeta nr. 1 pana la eprubeta nr. 11 nu a existat creștere, ceea ce ne- a determinat să declarăm tulpina sensibilă la diluțiile testate (1, 2 și 4 μg/ ml). Pe de altă parte, solventul folosit la prepararea diluțiilor substanțelor testate (eprubeta nr 23), după 28 de zile de incubare, a permis creșterea tulpinii bacteriene Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177.

În concluzie, toți compușii sunt activi pe tulpina testată, la toate cele trei concentrații testate, ceea ce înseamnă că reacțiile de condensare ale izoniazidei cu cele trei benzaldehide aromatice, nu au influențat negativ efectul terapeutic al izoniazidei părinte.

8.2.1.2. Determinarea Concentrațiilor Minime Inhibitorii (CMI)

Chiar dacă s-a constatat că activitatea derivațior de izoniazidă este puțin mai scăzută decât izoniazida mamă, datorită unor valori ale concentrației minime inhibitorii mai mari (tabelul 8.II), acestea se încadrează în limitele impuse de Programul Global de Descoperire a Medicamentelor Antituberculoase noi, și anume 6,25 μg/ml, ca limită superioară pentru evaluarea activității anti-tuberculoase a noilor compuși terapeutici (Matei L., et al. 2013).

Tabel 8.II. Activitatea in vitro a HIN-ului și a derivaților săi împotriva M. tuberculosis

În plus, activitatea acestora este similară sau chiar superioară cu cea a altor derivați de izoniazidă menționați în literatura de specialitate: noi tioamide ca derivați de izoniazidă, cu valori ale CMI cuprinse între 0,391 și 6,25 μg / ml (Matei L., et al., 2013); noii hibrizi de isoniazid- azol cu valori ale CMI cuprinse între 0,195 și 1,56 μM sau cu cea a unui nou hibrid de izoniazid-pirol, care a fost găsit activ cu o valoare CMI de 3,2 μg / ml (Hu Y-Q., et al., 2017). De asemenea, în lucrarea lor, Castelo-Branco F.D., et al., 2018, au arătat o activitate crescută împotriva Mycobacterium tuberculosis pentru noi hydrazide, derivați ai izoniazidului, cu valori ale CMI de 3,59 și, respectiv, 6,91 μM.

În acest caz, al derivaților de izoniazidă obținuți prin condensarea cu diferite benzaldehide, este important de subliniat, că cel mai activ compus, HIN-a (cu o valoare a CMI-ului de 0,84 μg / ml), este obținut prin condensarea izoniazidei cu benzaldehidă, pentru care inelul aromatic este nesubstituit, în timp ce substituția inelului aromatic cu grupări atrăgătoare de electroni (-NO2 pentru HIN-b și -Br pentru HIN-c) are o influență negativă asupra activității antimicrobiene, determinând valori mai mari ale CMI mai mari, de 4,166 μg / ml și respectiv 1,785 μg / ml (tabelul 3), dar care totuși se încadrează în limita menționată mai sus de 6,25 μg / ml.

În concluzie, toți compușii sunt activi pe tulpina de referință, Mycobacterium tuberculosis ATCC 25177, la diferite Concentrații Minime Inhibitorii, ceea ce înseamnă că reacția de condensare cu cele trei benzaldehide nu afectează negativ efectul terapeutic al izoniazidei. Așadar, compușii pot fi considerați biologic activi și cu potențială utilizare în tratamentul tuberculozei.

8.2.2. Efectuarea screeningului toxicologic. Determinarea toxicității acute.

Stabilirea DL 50 este o etapă importantă pentru evaluarea profilului toxicologic al unei substanțe active. Valorile DL 50 ale celor trei derivați precum și cea a izoniazidei, sunt prezentate în figura 8.2. și tabelul 8.III.

Fig 8.2. Valorile DL 50 ale HIN-ului (INH) și derivaților HIN-a (INH-a), HIN-b (INH-b) și HIN-c (INH-c)

Tabel 8.III. Valorile dozei letale (DL50 în mg/kg corp) obținute pentru derivații HIN.a, HIN.b, HIN.c și izoniazidei (HIN)

Prin analiza datelor prezentate, se poate observa că toxicitatea derivaților HIN.a, HIN.b și HIN.c este mai scăzută, având valori ale DL50 cuprinse în intervalul 352,34-1778,8 mg/kg corp, față de izoniazida, compusul de plecare (HIN) a cărei DL50 este de 175,2 mg/kg corp.

Astfel prin condensarea izoniazidei cu cele trei benzaldehide aromatice, s-a obținut reducerea semnificativă a toxicității acute a acesteia, compușii rezultați, respectiv HIN-b și HIN-c, putând fi încadrați în categoria substanțelor cu toxicitate moderată, în timp ce HIN-a face parte alături de izoniazida părinte (HIN), din categoria substanțelor foarte toxice.

Astfel comparativ cu izoniazida, utilizată ca model structural, compușii sintetizați, derivați cu structură hidrazonică (HIN.a, HIN.b și HIN.c) sunt de până la aproximativ 10 ori mai puțin toxici (cazul compusului HIN. b).

În concluzie, substituția nucleului aromatic cu grupare nitro (cazul compusului HIN.b), a avut influența cea mai favorabilă asupra toxicității izoniazidei.

Studiul histopatologic (toxicitatea acută)

În cazul evaluării DL, au fost examinate fragmente de creier, cord, rinichi, pulmon și ficat (figura 8.3) prelevate de la animalele de laborator folosite la testul toxicității acute.

Raportat la lotul control, s-a constatat faptul că la nivel cerebral, cardiac și hepatic, administrarea dozelor de izoniazidă nu a determinat modificări; în schimb, la nivel pulmonar și renal apar anumite modificări. Astfel, desenul pulmonar este accentuat, cu distrucția spațiilor și pereților alveolari, congestie vasculară și zone de inflamație. La nivel renal, s-au evidențiat necroze tubulare însoțite de arii inflamatorii, care se extind adânc în parenchimul renal, urmând de cele mai multe ori traiectul tubilor renali.

Control netratat Doza letală Izoniazida (HIN)

Fig. 8.3. Reactivitatea țesutului cerebral (A), cardiac (B), hepatic (C), pulmonar (D) și renal(E) la evaluarea dozei letale la lotul control/lot DL. Col.HE, x20.

8.2.3. Determinarea toxicității cronice. Efectuarea studiului histopatologic

Ficatul are un rol important în metabolism și detoxifiere, și prin urmare este susceptibil producerii de leziuni. Tipurile de leziuni hepatice produse de medicamente pot varia de la adaptarea hepatică la leziunile hepatocelulare. Prevenirea și gestionarea leziunilor hepatice includ o serie de pași care ar trebui respectați: selecția pacienților și adaptarea regimurilor pentru optimizarea beneficiile, educația personalului și a pacienților, accesul rapid la îngrijirea pacienților și nu în ultimul rând, buna monitorizare clinică și biochimică a acestora.

Una dintre principalele efecte secundare ale izoniazidei este hepatotoxicitatea, aceasta constituind o cauză majoră de întrerupere a tratamentului în cadrul tuberculozei. Studiile genetice umane au arătat că în metabolizarea și hepatotoxicitatea HIN-ului este iplicat citocromul P450 2E1 (CYP2E1). Izoniazida sau izonicotinil hidrazina (arilhidrazina) prezintă o absorbție orală rapidă, atingând concentrații plasmatice maxime în 1-2 ore de la administrare, cu metabolizare prin sistemul enzimatic N-acetiltransferaza (NAT), în principal la nivel hepatic. Această calea metabolică majoră determină transformarea finală a izoniadizei, la acid izonicotinic și monoacetilhidrazină. În cazul acidul izonicotinic are loc conjugarea cu glicină în vederea eliminării din organism, iar în cazul metabolitului toxic, monoacetilhidrazina, poate urma una din cele trei căi metabolice ce determină acetilarea continuă și producerea diacetilhidrazinei, a hidrazonei sau a unui metabolit oxidat. Dacă primii doi metaboliți, diacetilhidrazina și hidrazona, sunt ușor eliminați din organism, metabolitul oxidat formează intermediari ce au capacitatea de a se lega de proteinele hepatice. Această legare are ca rezultat producerea unei macromolecule antigenice străine sistemului imunitar ce se îndreptă spre distrugerea complexului metabolit-proteină. Tot acest proces afectează ficatul, acesta fiind mecanismul pentru hepatotoxicitate în tratamentul cu izoniazidă (Susmita S., et al., 2016).

Pentru a evalua impactul administrării compușilor analizați, administrați în formă liberă, neîncapsulată, asupra producerii de leziuni hepatice, au fost examinate fragmente de ficat, prelevate de la primele 6 loturi luate în studiu și detaliate la secțiunea Material și metode.

Studiul histopatologic al fragmentelor de ficat prelevate de la fiecare lot în parte, a permis evaluarea modificărilor induse de administrarea cronică de izoniazidă și derivații acesteia, în suspensie.

Toxicitatea hepatică provocată de HIN poate să se manifeste prin apariția necrozei celulară, steatoză sau ambele maladii. Metaboliții acestui medicament, printre care hidrazina și acetilhidrazina au și efecte distructive asupra celulelor hepatice. În experimentele realizate pe animale, s-a raportat o corelație pozitivă și semnificativă între nivelele plasmatice de hidrazină și severitatea distrugerii celulelor hepatice, cauzate de tratamentul cu izoniazidă (Hossein K.J., et al. 2017).

Raportându-ne la datele din literatura de specialitate prezentate mai sus, în ceea ce privește toxicitatea izoniazidei, în continuare vor fi analizate fragmente de ficat prelevate de la animalele care au primit pe parcursul celor 30 de zile izoniazida și derivații săi, și se va urmări în mod special prezența sau absența necrozei celulare și a steatozei microveziculare.

Lotul control netratat (lotul 11) a relevat o morfologie hepatică normală, cu cordoane de hepatocite care radiază de la vena centrolobulară și o configurație normală a parenchimului hepatic (Fig.8.4, Fig.8.5).

Fig. 8.4. Lot control. Morfologie hepatică normală.Col.HE, x20.

Hepatocitele au dimensiuni uniforme, cu citoplasmă eozinofilă și/sau granulară, cu unul sau mai mulți nuclei rotunzi/ ovalari, situati central. Acestea sunt dispuse sub formă de cordoane radiare si sunt tapetate pe doua fețe de sinusoide.

Fig. 8.5. Lot control. Venă centrolobulară, cordoane radiare de hepatocite. Col.HE, x20.

Lotul 1 (care a primit HIN) a prezentat alterări consistente la nivel hepatic: parenchimul hepatic prezintă zone întinse de inflamație și necroză celulară (Fig.8.6, Fig.8.7), precum și arii bine definite de steatoză microveziculară, care atestă toxicitatea izoniazidei asupra țesutului hepatic (Fig.8.8).

Fig. 8.6. Lot 1. Ficat-zone de necroză celulară. Col.HE, x20.

Fig. 8.7. Lot 1. Ficat- Venă centrolobulară. Cordoane radiare de hepatocite care converg către vena centrolobulară.Col.HE, x20

Fig.8.8. Lot 1-Secțiune la nivel hepatic. Steatoză microveziculară. Col.HE, x20.

În acest caz, secțiunea realizată la nivel hepatic (figura 8.8) evidențiază steatoză microveziculară, considerată totuși a fi o leziune reversibilă (Andert A., et al.,2017) după întreruperea tratamentului. Astfel, hepatocitele prezintă în citoplasma vezicule mici, optic goale cu limite nete situate in jurul nucleului.

Lotul 2 (care a primit HIN-a) a prezentat, de asemenea, semn de suferință tisulară hepatică, relevată prin frecvente congestii vasculare, inflamații difuze (Fig.8.9) și debut de necroză celulară (Fig.8.10). Congestia vasculară este dată de acumularea de hematii in lumenul vaselor sangvine.

Fig. 8.9. Ficat-Lot 2. Congestie la nivelul venei centrolobulare, nuclei picnotici.

Fig. 8.10. Lot 2. Ficat-necroze celulare. Col.HE, x20.

Lotul 3 (care a primit HIN-b) a relevat prezența de infiltrat inflamator limfocitar perivascular (Fig.8.11) precum și de inflamații peri- și intrasinusoidale, congestii capilare, necroze manifestate prin nuclei picnotici si/ sau umbre nucleare (Fig.8.12).

Fig. 8.11. Ficat-lot 3. Inflamații perivasculare. Col.HE, x20.

Fig. 8.12. Lot 3- ficat. Inflamații peri și intrasinusoidale, congestii capilare, necroze.

Col.HE, x20.

Lotul 4 (care a primit HIN-c) a prezentat cele mai reduse semne de alterare a parenchimului hepatic, comparativ cu celelalte loturi similare: doar o ușoară congestie vasculară (Fig.8.13). Morfologia normală în cazul acestui lot, este caracterizată prin prezența hepatocitelor dispuse sub formă de cordoane radiare, având dimensiuni uniforme, cu citoplasma eozinofila și/sau granulară, focal cu vacuole citoplasmatice optic goale și unul sau mai mulți nuclei situați central, rotund / ovalari, congestia vasculară fiind redusă.

Fig.8.13. Lot 4-ficat. Hepatocite de aspect

normal. Ușoară congestie vasculară.

Lotul 5 (care a primit o soluție simplă de CMC-Na 1%) nu a prezentat modificări ale citoarhitectoniei hepatice (Fig.8.14, Fig.8.15):

Fig.8.14. Lot 5-ficat. Morfologie normală. Col.HE, x20

Morfologia normală în cazul acestui lot este capacterizată prin prezența de hepatocite cu dimensiuni uniforme, cu citoplasma eozinofilă și/sau granulară, focal cu vacuole citoplasmatice optic goale (de grasime) și unul sau mai mulți nuclei situați central, rotund/ ovalari. Hepatocitele sunt dispuse sub formă de cordoane care converg spre vena centrolobulară care prezintă infiltrat hematic intraluminal.

Fig.8.15. Ficat-lot 5. Morfologie normală.

Comparând aceste șase loturi între ele, putem concluziona că afectarea hepatică cea mai redusă a prezentat lotul de animale care a primit derivatul HIN-c, prezentând doar o ușoară congestie vasculară. Prin urmare, condesarea izoniazidei cu brom-benzaldehida a avut influența cea mai favorabilă asupra toxicității compusului părinte, la nivel tisular.

Pe de altă parte steatoza microveziculară a fost sesizată doar în cazul lotului de animale care a primit izoniazidă în suspensie, în timp ce necroza celulară lipsește în totalitate în cazul compusului HIN-c, fiind totuși prezentă la administrarea derivaților HIN-a și HIN-b precum și la administrarea izoniazidei părinte. Dacă în cazul HIN-ului zonele de necroză celulară au fost extinse ca întindere, în cazul derivaților HIN-a și HIN-b s-a descris doar un debut de necroză celulară.

Deși condensarea cu brom-benzaldehida s-a dovedit a fi cea mai favorabilă, putem afirma faptul că și utilizarea benzaldehidei și a nitro-benzaldehidei, în modificarea chimică a izoniazidei, influențează favorabil atât reducerea zonelor de necroză celulară cât și dispariția steatozei microveziculare.

8.2.4. Evaluarea biocompatibilității in vitro a probelor utilizând analiza viabilității celulelor MTT

Tabel 8.IV. Viabilitatea celulară (%) pentru derivații de izoniazidă neîncapsulați la 24 h, 48 h și 72 h

(unde: 80-100% este pentru compuși non-citotoxici, 50-80% pentru compuși ușor citotoxici, 30-50% pentru citotoxicitate moderată și <30% pentru compuși cu citotoxicitate severă) (ISO 10993-5, Geneva 2003).

Evaluarea biocompatibilității in vitro, prin contactul probelor cu fibroblaste de șoarece NCTC (929 clone), pentru o perioadă de 24 ore, indică o viabilitate celulară crescută, în cazul derivaților de izoniazidă, testați la concetrația finală de 1.75 mg / mL. Astfel, în cazul probelor HIN-b și HIN-c, viabilitatea celulară este mai mare (87,73%, respectiv 88,97%) comparativ cu cea a controlului negativ HIN (84,02%).

După 48 și 72 de ore de testare, pulberile analizate, în special HIN-a și INH-b, au indus o citotoxicitate crescătoare, cu valori ale viabilității celulare cuprinse între 55,30% și 61,16% (la 48 ore) și 50,58% și 53,14% (la 72 ore), valori similare cu cele ale compusului de referință HIN (55,15% la 48 de ore și 46,04% la 72 de ore) (tabel 8.IV), toate aceste valori încadrând probele testate la limita dinte compușii ușor citotoxici și moderat citotoxici.

Cea mai necitotoxică probă, la toate cele trei intervale (24, 48 și 72 de ore) a fost HIN-c, pentru care s-a înregistrat o viabilitate celulară de 88,97% (la 24 ore), respectiv la 72,47% (la 72 ore). Aceste valori, încadrează compusul HIN-c la limita dintre compușii non-citotoxici și ușor citotoxici. De remarcat este faptul ca în cadrul testului in vivo de toxicitate cronică, același derivat HIN-c a prezentat cele mai reduse semne de alterare a parenchimului hepatic, comparativ cu celelalte loturi (HIN, HIN-a și HIN-b) similare: doar o ușoară congestie vasculară.

Fig. 8.16. Morfologia celulelor colorată cu hematoxilină-eozină după 72 de ore de incubare cu derivați de izoniazidă și izoniazidă (compusul de referință)

După cele 72 de ore de expunere a celulelor NCTC în prezența derivaților de izoniazidă, urmând apoi colorarea cu hematoxilină-eozină, imaginile microscopice au arătat o morfologie normală, specifică celulelor NCTC netratate, cu formă rotundă și poligonală.

Dintre toate probele analizate, respectiv toți cei trei derivați de izoniazidă, cea mai mare rată de proliferare, similară cu cea a controlului netratat, o prezintă compusul HIN-c. Aspectul morfologiei celulare, în cazul utilizării acestei probe, confirmă rezultatul viabilității obținut prin testul MTT, sugerând astfel o bună biocompatibilitate cu fibroblastele NCTC.

Pe de altă parte, aceste interpretări ale evaluării biocompatibilității in vitro, confirmă încă o dată rezultatele obținute la testul in vivo de toxicitate cronică, în care compusul HIN-c s-a remarcat prin cea mai scăzută capacitate de alterare a parenchimului hepatic.

.

8.2.5. Evaluarea parametrilor biochimici

Integritatea celulară a ficatului animalelor incluse în acest studiu a fost evaluată prin testarea activității enzimelor hepatice: TGP, TGO și fosfataza alcalină.

Activitatea enzimelor hepatice poate crește pănă la zece ori în afecțiunile hepatice. Deși TGP și TGO se află în concentrații crescute la nivelul hepatocitelor, doar TGP descrie funcționarea normală a ficatului deoarece TGO este prezentă mai mult la nivelul miocardului, musculaturii scheletice, a creierului și rinichilor (Lindblom P., et al., 2007). Astfel, TGP reprezintă indicatorul de citoliză hepatică cel mai frecvent folosit în depistarea chiar și a unor leziuni hepatice minore.

Alaninaminotransferaza (ALAT)/ Transaminaza Glutamic-Piruvică (TGP)

Date descriptive TGP

Rezultatele testului Skewness în intervalul -2< p <2 sugerează faptul că seriile de valori ale TGP au fost omogene (tabelul 8.V , fig.8.17. ):

la lotul 1 – HIN

variații în intervalul 97,14 – 121,45 U/L

media 106,20 U/L ± 9,52

valoarea mediană 104,47 U/L;

la lotul 2 – HIN-a

variații în intervalul 79,22 – 111,45 U/L

media 91,09 U/L ± 12,82

valoarea mediană 87,69 U/L;

la lotul 3 – HIN-b

variații în intervalul 78,45 – 100,20 U/L

media 86,75 U/L ± 9,96

valoarea mediană 82,52 U/L;

la lotul 4 – HIN-c

variații în intervalul 74,03 – 99,56 U/L

media 84,87 U/L ± 11,19

valoarea mediană 81,14 U/L;

la lotul 5 – CMC-Na

variații în intervalul 19,94-31,56 U/L

media 27,01 U/L ± 4,29

valoarea mediană 28,40 U/L;

la lotul 11 – Control netratat

variații în intervalul 19,86-28,96 U/L

media 23,70 U/L ± 3,97

valoarea mediană 23,0 U/L.

Tabel 8.V. Indicatori statistici ai TGP (U/L) pentru probele administrare în formă neîncapsulată

Fig. 8.17. Valori medii ale TGP pentru probele administrare în formă neîncapsulată

În cazul administrării substațelor în formă neîncapsulată, în suspensie de CMC-Na 1% (0,1 ml/kg corp), prin analiza rezultatelor obținute (tabel 8.V, figura 8.17) se constată că cele mai mari valori medii ale TGP s-au regăsit la lotul de animale care a primit izoniazidă (106,20 U/L- lot 1-HIN), valori semnificativ mai crescute comparativ cu cele înregistrate în celelate grupuri studiate, care au primit derivații corespunzători: HIN-a (91,09 U/L), HIN-b (86,75 U/L) și HIN-c (84,87 U/L).

Cele mai mici valori medii ale TGP s-au regăsit la lotul Control netratat (23,70 U/L- lot 11) și lotul CMC-Na 1% (0,1 ml/kg corp) (27,01 U/L- lot 5).

Aspartataminotransferaza (ASAT)/ Transaminaza Glutamic-Oxalacetică (TGO)

Date descriptive TGO

Rezultatele testului Skewness în intervalul -2< p <2 sugerează faptul că seriile de valori ale TGO au fost omogene (tab. 8.VI, fig. 8.18):

la lotul 1 – HIN

variații în intervalul 156,14-181,11 U/L

media 166,58 U/L ± 10,56

valoarea mediană 164,55 U/L;

la lotul 2 – HINa

variații în intervalul 144,0-172,09 U/L

media 154,89 U/L ± 10,10

valoarea mediană 153,30 U/L;

la lotul 3 – HINb

variații în intervalul 134,57-168,95 U/L

media 152,18 U/L ± 11,43

valoarea mediană 150,58 U/L;

la lotul 4 – HINc

variații în intervalul 144,92-159,84 U/L

media 151,21 U/L ± 5,13

valoarea mediană 149,86 U/L;

la lotul 5 – CMC-Na

variații în intervalul 64,32-86,03 U/L

media 73,87 U/L ± 8,14

valoarea mediană 72,20 U/L;

la lotul 11 – Control netratat

variații în intervalul 64,28-82,29 U/L

media 74,76 U/L ± 7,35

valoarea mediană 77,41 U/L.

Tabel 8.VI. Indicatori statistici ai TGO (U/L) pentru probele administrare în formă neîncapsulată

Fig. 8.18. Valori medii ale TGO pentru probele administrare în formă neîncapsulată

În ceea ce privește stabilirea valorilor TGO, în cazul administrării substațelor în suspensie de CMC-Na 1% (0,1 ml/kg corp), prin analiza rezultatelor obținute (tabel 8.VI, figura 8.18) se constată că cele mai mari valori medii ale s-au regăsit la lotul de animale care a primit izoniazidă (166,58 U/L – lot 1-HIN), valori mai crescute comparativ cu cele înregistrate în celelate grupuri studiate, care au primit derivații corespunzători: HIN-a (154,89 U/L), HIN-b (152,18 U/L) și HIN-c (151,21 U/L).

Cele mai mici valori medii ale TGO s-au regăsit la lotul Control netratat (74,76 U/L – lot 11) și lotul CMC-Na 1% (0,1 ml/kg corp) (73,87 U/L – lot 5).

Fosfataza alcalină

Date descriptive fosfatază alcalină

Rezultatele testului Skewness în intervalul -2< p <2 sugerează faptul că seriile de valori ale fosfatazei alcaline au fost omogene (tab. 8.VII , fig. 8.19):

la lotul 1 – HIN

variații în intervalul 164,33-204,35 U/L

media 189,74 U/L ± 15,15

valoarea mediană 193,56 U/L;

la lotul 2 – HINa

variații în intervalul 156,80-200,47 U/L

media 185,55 U/L ± 17,70

valoarea mediană 189,29 U/L;

la lotul 3 – HINb

variații în intervalul 170,21-199,54 U/L

media 185,44 U/L ± 9,80

valoarea mediană 186,37 U/L;

la lotul 4 – HINc

variații în intervalul 156,75-199,23 U/L

media 179,70 U/L ± 16,42

valoarea mediană 183,74 U/L;

la lotul 5 – CMC-Na

variații în intervalul 87,36-101,40 U/L

media 96,69 U/L ± 5,15

valoarea mediană 98,37 U/L;

la lotul 11 – Control netratat

variații în intervalul 90,82-103,54 U/L

media 97,21 U/L ± 5,49

valoarea mediană 98,21 U/L.

Tabel 8.VII. Indicatori statistici ai fosfatazei alcaline (U/L) pentru probele administrare în formă neîncapsulată

Fig. 8.19. Valori medii ale fosfatazei alcaline

pentru probele administrare în formă neîncapsulată

Cele mai mari valori medii ale fosfatazei alcaline s-au regăsit la lotul HIN (189,74 U/L- lot 1), valori semnificativ mai crescute față de cele înregistrate în grupurile CMC-Na (96,69 U/L; p=0,001), Martor (98,16 U/L; p=0,001) și Control netratat (97,21 U/L; p=0,001) care au fost cele mai mici valori medii ale fosfatazei alcaline (tab. 8.VII , fig. 8.19).

8.3. CONCLUZII

Pe baza rezultatelor obținute se poate afirma că derivații studiați se încadrează în grupul substanțelor cu grad redus de toxicitate. Analizând influența modulărilor structurale, realizate pe nucleul izoniazidei, asupra gradului de toxicitate, se poate observa că introducerea unor benzaldehide aromatice, pe structura izoniazidei, prin intermediul unei legături azometinice, a avut o influență favorabilă, toți compușii obținuți fiind mai puțin toxici decât aceasta. Condensarea izoniazidei cu cele trei benzaldehide aromatice a dus la reducerea semnificativă a toxicității acute, prin doze letale de până la zece ori mai mari. Astfel, DL 50 a crescut semnificativ, de la 175,2 mg/kg corp (în cazul HIN-ului) la 1778,8 mg/kg corp (în cazul compusului HIN-b. În plus, la testul de toxicitate cronică, a fost observată dispariția zonelor de steatoză microveziculară pentru toți cei trei derivați analizați. În ceea ce privește evaluarea biocompatibilității in vitro, utilizând testul de viabilitate celulară MTT, s-a evidențiat cea mai non-citotoxică probă, HIN-c, în timp ce aspectele morfologiei celulare, în cazul administrării cronice a acestei probe, sugerează o bună biocompatibilitate.

Chiar dacă activitatea antimicrobiană a scăzut odată cu introducerea grupărilor atrăgătoare de electroni, la pozițiile 2 și 4 din structura benzaldehidelor utilizate, prin înregistrarea valorilor CMI mai mari în cazul noilor derivați, acest lucru se întâmplă concomitent cu reducerea semnificativă a toxicității acestor compuși. Din acest punct de vedere, compusul cel mai activ a fost HIN-a, obținut prin condensarea izoniazidei cu benzaldehida aromatică.

Toate aceste rezultate ne conduc spre concluzia că obiectivul studiului a fost finalizat cu succes, respectiv, a fost realizată obținerea unor noi derivați de izoniazidă cu profil farmacotoxicologic îmbunătățit.