Etiologia Infectiilor de Tract Respirator Superior Evidentiata Prin Exudatul Faringian Nazal

Cuprins

Introducere

CAPITOLUL I. STADIUL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL INFECȚIILOR

TRACTULUI RESPIRATOR SUPERIOR

Infectii streptococice

Etiologie

Epidemiologie

1.1.3. Patogenie

Tablou clinic

1.1.5. Streptococii de grup B – Streptococcus agalactiae

Streptococii negrupabili

1.2. Diagnosticul de laborator al infecțiilor produse de streptococi

1.3. Exudatul faringian

CAPITOLUL II. ETIOLOGIA INFECȚIILOR DE TRACT RESPIRATOR SUPERIOR EVIDENȚIATĂ PRIN EXUDATUL FARINGIAN – NAZAL

2.1. Materiale și metode de cercetare

2.1.1. Metode și materiale folosite

2.2. Rezultate

Concluzii

Bibliografie

Introducere

O infectie a tractului respirator superior (ITRS) nu este un termen specific pentru a descrie infecțiile acute care implică nasul, sinusurile paranazale, faringele, laringele, traheei și bronhiile (Mossad, 2008). ITRS cum ar fi durere în gât, durere de urechi, laringita, răceala, otita medie și sinuzita sunt cele mai frecvente infecții ale tuturor bolilor umane și printre principalele cauze din seviciile de sănătate la nivel mondial și au fost în mod frecvent documentate (Huston et al, 1999;. Brunton, 2005, Mossad, 2008; Mungrue et al., 2009).

Infectiile tractului respirator superior recurente la copii constituie o gravă problemă la nivel mondial. Adulții dezvolta o medie de două până la   patru răceli anual (Mossad, 2008). S-a raportat că majoritatea ITRS de cele mai multe ori sunt de origine virală cu rinovirus, virusul paragripal, coronavirus, adenovirus, virusul sincitial respirator si a virusul gripei (Clark et al, 2004;.. Lykova et al, 2003).

În afară de viruși, au fost raportate bacterii patogeni care produc ITRS și acestea includ Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa și unele Enterobacteriaceae (Isenberg și D-Amato, 1985; Ndip colab., 2003). Streptococi beta-hemolitic Grupa A provoacă 5% până la 10% din cazuri de faringite la adults. (Wessels MR, 2011). Secreția faringiană este unul dintre produsele cel mai frecvent prelucrate în bacteriologie, atât în sectorul privat, cât și în cel de stat și se observă o diversitate în protocoalele de lucru și interpretare a acestora cu consecințe asupra perceperii utilității examenului bacteriologic din partea colectivului medical și al populației în general. Din aceste considerente, este nevoie de evaluarea importanței examenului bacteriologic al secreției faringiene.

CAPITOLUL 1

STADIUL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL INFECȚIILOR

TRACTULUI RESPIRATOR SUPERIOR

Infectii streptococice

Infecțiile streptococice reprezintă un capitol important al patogeniei umane, fiind foarte frecvente, cuprind o mare parte a populației. Streptococii sunt coci grampozitivi dispuși în lanțuri, imobili, nesporulați, aerobi și facultativ anaerobi. Ei determină o multitudine de tablouri clinice: angine, scarlatină, infecții cutanate, supurații cu diverse localizări, toxiinfecții alimentare, septicemii, endocardite, infecții urinare. Există numeroase specii și tipuri de streptococi patogeni pentru om. O specie de streptococ poate produce mai multe boli.

Etiologie

Streptococii patogeni pentru om fac parte din genul Streptococcus, familia Streptococcaceae. Specia tip reprezentativă este Streptococcus pyogenes.

Clasificarea streptococilor se poate face în funcție de caracterele microbiologice sau în funcție de tabloul clinic pe care îl determină. (Lazar, 2001).

Clasificarea în funcție de capacitatea de liză asupra hematiilor din mediile de cultură cu agar-sânge (Lazar, 2001):

– b hemoliză – caracterizată de liză completă în jurul coloniei;

– a hemoliză – caracterizată prin liză parțială, de aspect verzui, în jurul coloniei;

– g hemoliză – caracterizată prin lipsa totală a hemolizei în jurul coloniei.

Lancefield a clasificat streptococii b hemolitici în grupe pe baza antigenelor polizaharidice specifice. Grupele au fost notate A – H și K – T. Majoritatea streptococilor patogeni pentru om aparțin grupei A. (Sitkiewicz si colab., 2010)

Clasificarea clinică a streptococilor (Lazar, 2001).:

Streptococi din grupa A. Ei colonizează de obicei faringele și determină faringită, angină, scarlatină, piodermită, infecții ale plăgilor, septicemii, reumatism articular acut, glomerulonefrită acută. Cel mai frecvent este implicat S. pyogenes.

Streptococi din grupa B. Ei colonizează tractul urogenital, gastrointestinal și faringele. Determină septicemie perinatală, meningita nou-născutului, endocardită bacteriană subacută, infecții ale tractului urinar, septicemii la adult. Specia reprezentativă este S. agalactiae.

Streptococii din grupele C și G colonizează de obicei faringele și determină faringite, iar la imunodeprimați, produc meningită, endocardită, abcese, glomerulonefrită acută.

Streptococii din grupa D se împart în două categorii:

a) enterococi (specia reprezentativă este S. faecalis) sunt prezenți în flora normală a intestinului. Pot determina septicemii nosocomiale, infecții urinare la cei cu afecțiuni renovezicale cronice, endocardite.

b) nonenterococi (specia reprezentativă este S. bovis) determină endocardite la bolnavii cu cancer de colon.

Streptococii a hemolitici, denumiți și streptococi viridans (S. salivarius, S. sanguis și S. mutans) determină endocardite și carii dentare (produc substanța mucoidă din placa dentară). Ei colonizează faringele și sunt prezenți în salivă.

Streptococii microaerofili sunt Peptostreptococii, ei produc g hemoliză și colonizează mucoasa bucală, intestinală și vaginul. Ei pot produce abcese cerebrale, pulmonare și hepatice, gangrena sinergică (împreună cu stafilococul auriu), fasceite necrotice, abcese peritonsilare.

În produse patologice se prezinta sub forma de coci sferici Gram pozitivi asezati izolat, in perechi, lanturi scurte. Pe geloza cu sânge de berbec sau de cal formeaza, dupa 18 ore de incubare aeroba la 37ºC, colonii mici (0,5mm) inconjurate cu o zona larga de β-hemoliza (Fig. 1). Tulpinile capsulate formeaza colonii mucoide, rotunde, stralucitoare, fluide cu tendinta la confluare. Aceste colonii prin liza acidului hialuronic capsular devin turtite, cu suprafata mamelonata si contur neregulat, colonii matt. Tulpinile necapsulate formeaza colonii mici, rotunde, opace, stralucitoare, glossy.

Fig.1. stanga: Streptococcus pyogenes, .coloratie Gram; dreapta: colonii de Streptococcus pyogenes pe geloza-sânge, prezenta β-hemoliza (dupa Todar, 2011).

Structura streptococilor b hemolitici grupa A

Celula bacteriană este formată din capsulă, perete celular, membrana citoplasmatică, citoplasmă și nucleu. Capsula conține acid hialuronic cu rol în virulentă și neantigenic. Peretele celular este format din proteina M, polizaharide și peptidoglican.

Proteină M este cel mai important factor de virulentă și determină rezistența streptococului la fagocitoză. În funcție de proteina M streptococii din grupul A sunt împărțiți în 80 de tipuri. Fată de proteina M apare imunitate specifică de tip. Proteină M mai posedă un determinant nespecific, comun, denumit MAP, care determină reacțiile imunologice încrucișate cu țesuturile gazdei.

Polizaharidul peretelui celular (substanța C) este un antigen puternic și determină apariția de anticorpi mai târziu, mai ales în cazul bolilor poststreptococice. Acești anticorpi pot fi evidențiați prin reacții de precipitare, aglutinare și RIA.

Peptidoglicanul determină leziuni cardiotoxice, este antigenic și pirogen.

Membrana citoplasmatică este formată din structuri proteice și glicoproteice care împreună cu componentele peretelui celular, determină reacții încrucișate cu structurile celulelor umane (sarcolema celulelor miocardice, valvele cardiace, membrana bazală glomerulară). Aceste reacții încrucișate stau la baza patogeniei bolilor poststreptococice. (Buiuc, 2003).

Citoplasma conține proteine, enzime și o endostreptolizină. Nucleul conține materialul genetic al bacteriei (ADN, ARN, nucleoproteine). Componentele extracelulare sunt reprezentate de enzimele și toxinele secretate de streptococi.

Enzimele streptococice sunt:

– Streptolizina O (SLO) determină hemoliza b, este identică tuturor grupurilor, este toxică (cardiotoxică și leucotoxică), anticorpii specifici (ASLO) sunt utili pentru diagnostic. (Dmitriev si colab., 2006)

– Streptolizina S (SLS) este hemolitică și toxică (efect letal în 24 – 48 de ore) și nu este antigenică. (Ginsburg, 1999).

– Hialuronidaza – antigenică, determină anticorpi neprotectori, dar utili pentru diagnostic. Are rol în răspândirea și virulenta streptococilor.

– Streptochinaza – este antigenică, activează sistemul fibrinolitic. Este utilizată în tratamentul trombozelor acute.

– Streptodornaza (DNA – ază) – este antigenică, anticorpii sunt utilizați pentru diagnostic. Ea scindează dezoxiriboproteinele din exudate și este utilizată ca fibrinolitic.

– Proteinaza – este antigenică, fără rol patogenic important.

Toxinele streptococice sunt toxinele eritrogene A, B și C secretate de streptococi din grupul A (tulpinile lizogene). Ele determină manifestările toxice din scarlatină. Sunt antigenice și determină anticorpi protectori.

Epidemiologie

Streptococii sunt răspândiți pe tot globul. Piodermitele și infecțiile cutanate sunt mai frecvente în zonele tropicale, iar anginele și amigdalitele în zonele temperate și reci. Incidența maximă a infecțiilor streptococice este la vârstele 5 – 15 ani. Infecțiile streptococice sunt endemoepidemice.

Sursele de infecție sunt reprezentate de bolnavi sau purtători asimptomatici (incidența purtătorilor de streptococ b hemolitic în populație poate atinge 30 – 60% în colectivitățile de copii).

Transmiterea se face direct (picăturile Pflügge) sau indirect prin: aer contaminat, obiecte contaminate (rufărie, batiste, prosoape, mâini, seringi, pense, bisturie). Transmiterea digestivă prin alimente determină epidemii de angină și scarlatină cu caracter exploziv sau toxiinfecții alimentare.

Streptococii din grupul B se pot transmite intrapartum de la femeile purtătoare de S. agalactiae în canalul vaginal la nou născut. Receptivitatea este generală.

Patogenie

Patogenia infecțiilor cu streptococ b hemolitic grupa A este complexă, fiind determinată de multitudinea și varietatea caracterelor patogenice ale acestora. Caracterele de patogenitate ale streptococilor sunt reprezentate de toxine și enzime, precum și de capsula bacteriană.

Streptococii care produc toxina eritrogenă pot determina apariția scarlatinei. Producerea unor cantități mari de hialuronidază favorizează apariția septicemiilor.

Imunitatea și receptivitatea fată de toxinele, enzimele și antigenele streptococice modifică și uneori complică tabloul clinic. Imunitatea antitoxică fată de toxina eritrogenă se obține pasiv, transplacentar de la mamă sau după trecerea prin boală(scarlatină) sau prin imunizare pasivă cu anatoxină scarlatinoasă ( care este variabilă și insuficientă).

Imunitatea antibacteriană fată de fracțiunea M se obține prin infecții repetate, cu vârsta. Anticorpii antiMAP apar și cresc după o infecție acută și pot fi evidențiați prin reacția de aglutinare cu latex. (Lazar, 2001).

Anticorpii ASLO încep să crească în a doua săptămână de boală și ating titrul maxim în săptămâna a treia și a patra . Menținerea unui titru peste 200 unități/ml ridică suspiciunea de reumatism poliarticular acut sau glomerulonefrită acută. Titrarea anticorpilor fată de celelalte enzime streptococice (streptodornază, hialuronidază) ajută la stabilirea diagnosticului. Titrul anticorpilor este crescut la bolnavi și este scăzut la purtătorii sănătoși de streptococ b hemolitic grupa A.

În infecțiile streptococice poate să apară o stare de hipersensibilitate, exprimată prin apariția de autoanticorpi, mecanism ce stă la baza sindroamelor poststreptococice.

În concluzie, același streptococ b hemolitic grupa A care dispune de toate caracterele de patogenitate și virulentă poate declanșa, în funcție de răspunsul organismului gazdă, următoarele boli:

a) scarlatină, angină, otită, septicemie la persoanele fără imunitate antitoxică și antibacteriană;

b) angină, otită, septicemie, la persoanele cu imunitate antitoxică, dar fără imunitate antibacteriană;

c) purtător de streptococ b hemolitic grupa A la persoanele cu imunitate antitoxică și

antibacteriană (niciodată scarlatină);

Poarta de intrare în infecțiile streptococice poate fi tegumentul, nazofaringele sau tractul digestiv. Boala poate avea aspect local sau se poate generaliza (septicemie), sau este de la început generală (scarlatină). Propagarea streptococilor b hemolitici grupa A se poate face local (din aproape în aproape pe tegument și mucoase), regional (la ganglionii limfatici) sau pe cale sanguină.

Tablou clinic

Angina streptococică reprezintă cea mai frecventă manifestare. Incubația este de 2 – 4 zile. Debutul este în general brusc și se caracterizează prin odinofagie importantă, răgușeală, cefalee, curbatură, febră, anorexie, greată, vărsături, dureri abdominale. (Cunningam, 2000).

Faringele este intens eritematos (“roșu că flacăra”), edemetiat, țesutul limfoid este hipertrofiat, amigdalele sunt eritematoase cu exudat galben-gri, punctat sau confluent. Este însoțită de adenopatie laterocervicală. La copiii mici, simptomele sunt rinoree, febră scăzută și tulburări digestive, frecvent, semene de otită medie. Evoluția este autolimitată în 3 – 4 zile.

Se poate complica cu: sinuzită, otită medie, mastoidită, adenită cervicală supurată, abces periamigdalian, bacteriemie, meningită purulentă, șoc toxicoseptic determinat de SLA (asemănător TSS. Stafilococic): șoc, detresă respiratorie, hipocalcemie, trombocitopenie, insuficientă renală, descuamarea pielii, deces în 6 – 10% din cazuri. Poate fi urmată de complicații nesupurative: reumatism articular acut și glomerulonefrită acută.

Scarlatina

Scarlatina rezultă din infecția cu o tulpină de streptococ beta-hemolitic grupa A care elaborează exotoxină pirogenica (toxina eritrogenica), fiind caracterizată clinic prin apariția enantemului și exantemului scarlatinos în context febril, asociate uneori cu complicații grave.

Agentul etiologic al scarlatinei aparține genului streptococcus pyogenes (streptococ de grup A LANCEFIELD) coc Gram pozitiv, non-motil, neformator de spori, catalazo-negativi. În culturi pe plăci cu agar-sânge produce zone de hemoliză completă (beta). Microorganismul este acoperit de o capsulă din acid hialuronic, care este un factor accesoriu de virulență, întârziind fagocitoza de către leucocitele polimorfonucleare și macrofagele gazdei. Peretele celular are o structură complexă conținând multe substanțe antigenice. Carbohidratul specific de grup este un dimer al ramnozei și Nacetilglucozaminei.

Antigenul major de virulență este proteina M, care determină diviziunea streptococilor de grup A în 80 serotipuri .

Imunitatea se bazează pe dezvoltarea anticorpilor opsonici îndreptați împotriva activității antifagocitice a proteinei M. Imunitatea este specifică de tip și durabilă probabil indefinit.

Exatoxina pirogenică streptococică (EPS), anterior cunoscută că toxina eritrogenică (DICK) este responsabilă pentru erupția (rash) din scarlatina. Producția toxinei este indusă prin lisogenie cu un bacteriofag temperat. Există 3 toxine distincte serologic (A-C), ale căror efecte pot fi neutralizate de anticorpi. Hemolizinele (streptolizina O și S) au efect asupra eritrocitelor. Dozarea anticorpilor ASLO este extrem de utilă ca indicator al infecțiilor streptococice recente. Anticorpii elaborați față de cinci din produsele extracelulare sunt utilizați în serodiagnosticul infecției streptococice: ASLO, anti-DNaza B, antihialuronidaza, anti-NADaza (nicotinamida/adenina/dinucleotidaza) și antistreptokinaza.

La pacienții netratați cu antibiotice eficace, apar anticorpii specifici de tip, între 4 și 8 săptămâni după infecție.

Boala apare primar la copiii de 5-15 ani vârsta, cu un vârf de incidență în primii ani de școală și în anotimpul rece. Sursa de infecție este reprezentată de bolnav sau purtătorul sănătos de germen (15-20% dintre școlari).

Calea de transmitere este aerogenă, prin contact direct, mai ales via picături de salivă sau secreții nazale infectante. Aglomerația favorizează răspândirea inter-persoane a germenului.

După inhalare sau ingestie, streptococii se atașează la celulele epiteliale respiratorii prin fibrilii de suprafață și acidul lipoteichoic al peretelui celular. Fibrilii conțin epitopi antifagocitari ai proteinelor M specifice de tip, care împreuna cu acidul hialuronic capsular rezistă fagocitozei. Streptolozinele facilitează răspândirea infecției prin interferența cu tromboza locală și formarea puroiului (DNaza), ca și digestia crescută a țesutului conjunctiv (hialuronidaza, proteaza). Exotoxinele pirogenice serologic distincte (A-C) produc erupția la gazdele neimunizate.

Producerea erupției este dependentă în parte de reacția de hipersensibilizare a gazdei și pălește prin sinteză antitoxinelor specifice de către gazdă. Aceste toxine produc și pirogenicitate, ca și citotoxicitate, măresc efectele endotoxinei și au fost asociate cu sindromul șocului toxic.

Incubația variază de la 1 la 7 zile, cu o medie de 3 zile. Debutul este acut și se caracterizează prin: febră 39°-40°C; vărsături; cefalee; stare toxică; frisoane; faringită (enantem) ± dureri abdominale.

Perioada de erupție (rash) survine la 12-48 ore de la debut, cu rash tipic. Febra urcă abrupt la 39°6-40°C, a doua zi, iar la bolnavii netratați revine la normal în 5-7 zile, pe când la cei cu penicilinoterapie, temperatura este normală în 12-24 ore după începerea tratamentului.

Enantemul este constituit de: amigdalele congestionate, edematoase, care pot fi acoperite cu exudat alb-gri; faringele inflamat, eventual acoperit cu o membrană în cazurile severe. Limba este roșie și edemațiată, inițial acoperită cu un depozit alb, prin care sunt proiectate papilele edemațiate (limba saburală), apoi depozitul se descuamează și persistă limbă roșie cu papile proeminente (limba zmeurie). Palatul și uvula sunt edemațiate, roșii și acoperite cu peteșii.

Exantemul (erupția) este roșu, difuz, punctat sau fin papulos, dispărând la presiune, aspru la palpare. Inițial apare în axile, inghinal și pe gât în 24 ore este generalizat. Fruntea și obrajii apar congestionate, cu paloare circumorală (masca de scarlatina).

În general leziunile punctate nu apar pe față, palme și plante. Rash-ul este mai intens în axile și la plăcile de flexiune, unde apar linii cu peteșii, prin fragilitate capilară. Testul RUMPEL-LEEDS de fragilitate capilară este pozitiv. În cazuri severe apar leziuni veziculoase mici (miliary sudamina) pe abdomen, mâini și picioare.

Descuamația începe pe față, cu aspect furfuraceu, la sfârșitul primei săptămâni, trece pe trunchi și în final pe mâini și picioare. Durata și extinderea descuamației variază cu intensitatea erupției și se poate prelungi la 6 săptămâni.

Scarlatina poate urma infecției plăgilor (scarlatina chirurgicală), arsurilor, infecțiilor streptococice cutanate sau sepsis-ului puerperal (postpartum). În aceste cazuri lipsesc manifestările faringiene și amigdaliene.

Injecția intradermică de antitoxină specifică, neutralizează toxina și pălește rash-ul (reacția SCHULTZ-CHARLTON) nu se mai utilizează în prezent. Susceptibilitatea la scarlatina poate fi testată prin administrarea toxinei eritrogene intracutanat, ceea ce duce la eritem local (test DICK pozitiv). Nu apare nici o reacție la persoanele imune la toxină. Nu se mai utilizează în prezent.

Formele clinice severe pot fi asociate cu diseminarea locală sau hematogenă a streptococului (scarlatina septică) sau cu toxemie profundă (scarlatina toxică) și se caracterizează prin febra înalta, și toxicitate sistemică marcată. În evoluție apar artrita, icterul și foarte rar hidropsul vezicular. În era antibioticelor aceste forme severe de boala sunt rare.

Complicații

a) prin mecanism toxic – apar în prima săptămână, consecința acțiunii directe a eritrotoxinei: artrită, nefrită, miocardită, hepatită, suprarenalită "encefalită" ( = encefalopatie toxică, cu convulsii și comă);

b) prin mecanism septic – apar prin multiplicarea și invazia bacteriană:

1. de vecinătate: otită, oto-mastoidita, adenită, periadenită, adenoflegmon, meningită;

2. la distanță (prin bacteriemie): artrite septice, glomerulonefrită în focar bronhopneumonie, pericardită, peritonită, meningită purulentă, abces cerebral, septicemie;

c) prin mecanism imuno-alergic – apar la 2-3 săptămâni de la debutul bolii: RAA±cardită reumatismală, glomerulo-nefrita difuză acută, eritemul nodos. (Gvozdenovic si colab., 2010).

Date epidemiologice includ noțiunea de epidemie, contact infectant cu un bolnav sau purtător sănătos de streptococ piogen și receptivitatea la boală. Diagnosticul clinic se bazează pe prezența semnelor clinice majore: febră, enantem și exantem tipice.

Diagnosticul de laborator:

– leucograma evidențiază leucocitoza cu neutrofilie și eozinofilie moderată;

– culturile din exudatul nazofaringian pe agar-sânge pun în evidență streptococul piogen beta hemolitic de grup A, asociate cu teste rapide de detecție antigenică;

– răspunsul imunologic poate fi măsurat prin titrul ASLO, care crește peste 166 unități TODD, în primele 3-6 săptămâni după infecție;

– creșterea VHS și a proteinei C reactive; – examenul de urină evidențiază modificările specifice complicațiilor renale;

Diagnosticul diferențial implică eliminarea exantemelor virale, a erupțiilor medicamentoase, a sindromului șocului toxic stafilococic și a bolii KAWASAKI. Exantemele virale luate în discuție includ rujeola, rubeola, mononucleoza infecțioasă, exantemele enterovirale, rozeola.

Scarlatina severă trebuie diferențiată de sindromul șocului toxic – like streptococic, asociat cu toxine pirogenice, care prezintă stare toxică, febră, șoc, fasciita necrotizanta, pneumonie, rash (eritem difuz sau local, maculopapulos, petesial, descuamație) și disfuncție multiorganică (rinichi, plămân, SNC). Infecția cu Arcanobaterium Haemolyticum produce tonsilită, faringită și rash scarlatiniform la adolescenții și adulții tineri. Arsurile solare severe pot fi pot fi confundate cu scarlatina.

Tratament

– izolare obligatorie în spital 7 zile, cu repaus la pat;

– regim alimentar hidro-lacto-zaharat în perioada febrilă, urmat de regim normal;

– antibioticoterapia cu penicilină (de elecție) 10 zile – prin injecții intramusculare cu penicilină G 0.6-1.6 M.U.I/zi, la 6-8 sau 12 ore, timp de 6 zile, urmate de benzatin penicilină (Moldamin) 0.6 M.U I/ la copii sub 25 kg sau 1.2 MU.i la copii mai mari și adulți. (Bisno si colab., 1996).

Se repetă moldaminul la 14 și 21 zile de la debutul terapiei.

Penicilină G poate fi înlocuita, în afebrilitate, cu penicilină V: la copil 100.000 u.i/kg /zi sau 3-4 M.U.I la adult, la 4-6 ore.

La bolnavii alergici la penicilină se utilizează tratamentul alternativ cu eritromicină 40 mg/kg/24h la copii, sau 2g/zi la adulți, clindamicina 30mg/kg/24h sau cefadroxil monohidrat 15 mg/kg/24h la copii.

Formele hipertoxice beneficiază de asocierea corticoterapiei cu penicilinoterapia intravenoasă și terapie intensivă.

Dispensarizarea foștilor bolnavi este obligatorie timp de 3 săptămâni, pentru depistarea complicațiilor tardive, în special prevenirea RAA – cu control clinic, TA, examen de urină, VSH, ASLO, exudat faringian.

Contacții de scarlatina vor fi tratați cu penicilină orală G sau V (400.000/u/doza)x4/zi, timp de 10 zile. Alternativ, se poate administra 600.000 u de benzatinpenicilina, în combinație cu 600.000 u de procainpenicilina apoasă, într-o singură injecție intramusculară, cu utilitate în epidemiile instituționale.

Eradicarea stării de purtător poate fi asigurată de tratamentul cu un antibiotic nonpenicilinic: cefalosporine, eritromicină sau clindamicina, sau cu amoxicilină/clavulanat sau o combinație de penicilină + rifampicina.

Pneumonia streptococică este mult mai rară astăzi. Apare ca o complicație a gripei, rujeolei, varicelei, tusei convulsive. Clinic se manifestă prin stare generală alterată, febră, curbatură, dispnee, tuse, dureri toracice, hemoptizii. Se poate complica cu empiem pleural, mediastinită, pericardită purulentă.

Streptococii de grup B – Streptococcus agalactiae

Acest grup de streptococi cuprinde mai multe specii dintre care de interes medical este Streptococcus agalactiae.

Streptococcus agalactiae face parte din flora comensală a omului. Se izolează frecvent din vagin, rect, uretră, mai rar din faringele omului sănătos și de pe tegumente. Se găsește la 30-40% din flora perineală a omului sănătos.

Sunt coci gram pozitivi, prezentând aceeași dispoziție cu restul speciilor (în lanțuri, sau în diplo). Se dezvoltă pe agar sânge și formează colonii b-hemolitice.

Cresc bine pe medii bogate in nutrienti, si in contrast cu coloniile formate de S. pyogenes, coloniile S. agalactiae sunt mucoide, cu o zona ingusta de β-hemoliza. Unele specii (1%-2%) sunt nehemolitice, desi prevalenta lor poate fi subestimata pentruca speciile nehemolitice nu sunt in mod obisnuit incluse in grupa B (Murray si colab., 2005).

Fig. 3. Streptococcus agalactiae pe geloza-sânge (dupa Murray si colab., 2005).

Streptococcus agalactiae are în peretele celular polizaharidul C, care îl definește ca grup, dar spre deosebire de Streptococcus pyogenes este lipsit de proteinele M, T și R. La suprafață prezintă a capsulă care împarte specia în tipuri antigenice (I-IV). Ca și Streptococcus pyogenes, prezintă la suprafață C5a-peptidaza, enzimă care prin hidroliza C5a va scădea influxul leucocitar în focarul infecțios.

Factorii de virulență sunt mai puțin definiți ca cei ai Streptococcus pyogenes. Capsula are rol în capacitatea de invazie a tulpinilor. Afectează cu deosebire nou-născutul și femeia gravidă.

La nou-născut produce o infecție precoce, care apare imediat după naștere cu septicemie și o formă tardivă care apare la câteva zile sau săptămâni după naștere și se manifestă cu meningită, otită, pneumonie. (Jackson si colab., 1995) Contaminarea nou-născutului se produce de la personalul de îngrijire, de la mama purtătoare vaginală de Streptococcus agalactiae,  sau chiar între nou-născuți. La femei, produce avort, septicemie post-partum sau post-abortum. La persoanele în vârstă și la cele imunocompromise (cu diabet, neoplasme, SIDA) poate determina infecții ale tractului urinar, pneumonii, meningită, endocardită, osteomielită, artrită, abcese, empiem etc.

Este bacteriologic și reprezintă o urgență în cazul infecțiilor neonatale. Constă în examen microscopic direct, izolarea germenelui din produsul recoltat (LCR, hemoculturi, lichid amniotic, secreții gastrice, puroi), identificare (pe geloză-sânge, dau colonii mucoide, de culoare gri deschis, înconjurate de o zonă mică de β-hemoliză) și antibiogramă.

Pentru identificarea prezumptivă, se folosește testul CAMP (care este pozitiv),  iar pentru identificarea definitivă, determinarea grupului prin testul Lancefield, cu ajutorul serului anti-grup B, în reacția de aglutinare, sau precipitare. 

Au fost de asemenea perfecționate metodele moleculare pentru detectarea directă a streptococilor de grup B din LCR și hemoculturi pozitive.

Datorită frecvenței crescute a portajului vaginal și intestinal la femeia gravidă, se recomandă efectuarea unor culturi de control din secreția vaginală, începând cu ultimul trimestru de sarcină și instituirea antibioterapiei (la mamă și apoi la nou-născut) în caz de necesitate.

Streptococcus agalactiae este sensibil la penicilina G și amoxicilină și deseori rezistent la macrolide și tetracicline. În terapie se recomandă asocierea penicilinelor cu aminoglicozidele.

Streptococii negrupabili

Streptococii viridans (alfa-hemolitici) denumiți și streptococi orali, sunt lipsiți de antigenul de grup. Sunt comensali ai mucoasei orofaringiene, dar și ai celei intestinale și genitale. Cele mai importante specii cu rol în patologia umană sunt: Streptococcus mitis, oralis, sanguis, salivarius, mutans, milleri (anginosus) etc.

Au fost izolați din hemoculturi, dar și din alte culturi provenind din sedii sterile (lichid pleural). Sunt principalii agenți etiologici ai endocarditelor subacute, la pacienții cu valvulopatii. Pătrund în circulație cu ocazia unor extracții dentare, intervenții în sfera ORL, etc., și se grefează la nivelul valvelor cardiace lezate sau a protezelor valvulare. 

Streptococcus mutans secretă dextrani în cantitate foarte mare, care formează matricea care stă la baza formării plăcii dentare. Este cel mai frecvent  asociat cariilor dentare.

Streptococcus milleri este un agent patogen frecvent asociat infecțiilor purulente, precum și infecțiilor neonatale (septicemii, meningite).

Streptococii orali sunt sensibili la penicilina G și macrolide, prezentând un nivel scăzut de rezistență la aminiglicozide (care se administrează de obicei în asociere cu penicilinele).

Streptococcus pneumoniae (pneumococul) face parte din familia Streptococacceae, genul Streptococcus și face parte din grupul mitis de streptococi orali, fiind  izolat prima dată din spută în anul 1881 de Louis Pasteur în Franța și G.M. Sternberg în SUA. Este un microorganism care face parte din flora orofaringiană normală la majoritatea populației dar poate fi și un important agent patogen uman. Este cauza a mai mult de 80% din pneumoniile bacteriene, a numeroase cazuri de otite medii, meningite și septicemii. Reprezintă o cauză importantă de morbiditate și mortalitate.

Pneumococii sunt coci gram pozitivi, încapsulați, 0,5-1,2 mm în diametru, ovali sau lanceolați, dispuși în perechi sau lanțuri scurte. Pe frotiurile efectuate din culturi îmbătrânite, pneumococii apar gram negativi. Tulpinile încapsulate dau naștere unor colonii mari, (1-3 mm diametru pe geloză-sânge, mai mici, pe geloză-sânge-chocolat) rotunde, nepigmentate; tulpinile neîncapsulate dau naștere unor colonii mici, aplatizate.

Pneumococii produc hemoliză alfa pe geloză-sânge în aerobioză și hemoliză beta prin incubare în anaerobioză.

Tulpinile virulente prezintă o capsulă polizaharidică, diferită antigenic, pe baza căreia s-au identificat principalele tipuri serologice. Până în prezent s-au identificat peste 80 de serotipuri.

Peptidoglicanul peretelui celular al pneumococilor este identic cu cel al cocilor gram pozitivi, cu alternarea subunităților N-acetilglucozamină cu acidul N-acetilmuramic. Alt component major ale peretelui celular este acidul teichoic bogat în glucozamine, fosfați și colină. Colina joacă un rol esențial în hidroliza peretelui celular. În absența colinei, enzima autolitică a pneumococului este incapabilă să asigure încetarea diviziunii celulare. În peretele celular al pneumococilor există două tipuri de acid teichoic: unul la suprafața celulei și cel de-al doilea, legat de lipidele membranei plasmatice. Tipul de acid teichoic de la suprafața celulară (substanța C) are specificitate de specie și precipită fracțiunea globulinică a serului (proteina C-reactivă), în prezența calciului.

Tabel 1: Factori de virulență ai Str. pneumoniae

Patogenitate

Pneumonia. Se estimează că anual apar aproximativ 500.000 cazuri de pneumonie cuStreptococcus pneumoniae în SUA. Este în general localizată la nivelul lobului inferior al plămânului (pneumonie lobară). Bronhopneumonia este mai frecventă la copii și persoanele vârstnice. În general, după o terapie antimicrobiană eficientă, vindecarea survine în 2-3 săptămâni. Mortalitatea este cauzată de Streptococcus pneumoniae, tipul 3 și apare în general la persoanele vârstnice sau la pacienții cu bacteriemie în antecedente. Invazia pleurală apare la 25% din cazurile de pneumonie pneumococică iar empiemul este o complicație rară.

Sinuzite și otite medii. Aceste afecțiuni apar, în general, după o infecție virală a tractului respirator superior legată de infiltrarea de leucocite polimorfonucleare și obstrucția sinusului și a canalului cohlear. Otitele medii sunt mai frecvente la copii în timp ce sinuzitele pot apărea la orice vârstă.

Meningite. Meningitele pot apărea la orice vârstă, cu toate că sunt în principal afecțiuni pediatrice. Aproximativ 15% din meningitele care apar la copii și 30-50% din meningitele adulților sunt cauzate de Streptococcus pneumoniae.

Septicemia. Apare la 25-30% din pacienții cu pneumonie pneumococică și la mai mult de 80% din pacienții cu meningite. Nu apare în urma sinuzitelor și a otitelor medii.

Epidemiologie

Există un portaj natural nazofaringian. Transmiterea se realizează pe cale respiratorie (interpersonală), de la purtătorii sănătoși sau persoanele bolnave, mai ales în colectivități închise (creșe, grădinițe, școli, cazărmi militare). 

Diagnostic de laborator este bacteriologic.

Examen microscopic: Este caracteristic: pune în evidență coci gram pozitivi, lanceolați, dispuși în diplo, sau în lanțuri scurte.

Cultivare: Are necesități nutritive deosebite (crește pe agar cu infuzie de cord-creier, agar chocolat, în atmosferă de CO2). Coloniile tinere sunt -hemolitice, rotunde, umede, mucoide.  Pe măsură ce îmbătrânesc, coloniile se autolizează (ceea ce permite păstrarea cu dificultate a tulpinilor în viață).

Identificare: Diagnosticul diferențial cu S.viridans impune efectuarea testului de sensibilitate la optochin și a solubilității la bilă. 

Detectarea antigenului: Capsula polizaharidică solubilă a pneumococului poate fi detectată rapid prin teste imunoenzimatice și prin contraimunoelectroforeză sau latex-aglutinare (reactivii fiind incluși în diverse truse comerciale), direct din LCR la bolnavii cu meningită.

Metodele moleculare de detectare directă a pneumococilor din LCR și hemoculturi pozitive au fost de asemenea perfecționate.

Sensibilitatea la antibiotice

Majoritatea tulpinilor de Streptococcus pneumoniae sunt sensibile la penicilină și eritromicină. S-au semnalat tulpini rezistente la penicilină, eritromicină, azitromicină, deci efectuarea antibiogramei este obligatorie.

Cu toată eficacitatea terapiei antimicrobiene, mortalitatea în cazul afecțiunilor pneumococice este ridicată, îndeosebi la persoanele vârstnice, imunocompromiși (splenectomizați), sau persoane debilitate. Din această cauză se practică o imunizare cu vaccin polizaharidic polivalent (23 tipuri). Vaccinul asigură o protecție de lungă durată (până la 5 ani). La copiii cu hipogamaglobulinemie sau splenectomizați se recomandă tratamentul cu penicilină orală pentru că aceștia nu răspund foarte bine la vaccinare și infecțiile pneumococice sunt frecvente.

Apariția tulpinilor rezistente la penicilină (prin modificarea PLP) impune o modificare a atitudinii terapeutice mai ales în meningite și impune administrarea cefalosporinelor III (cefotaxim, ceftriaxonă în doze crescute).  S-a remarcat de asemenea o creștere a nivelului de rezistență la macrolide (30% tulpini rezistente la eritromicină), tetraciclină și cotrimoxazol, ceea ce contraindică utilizarea acestor agenți antimicrobieni în tratamentul de primă intenție a infecțiilor de tract respirator. 

1.7. Diagnosticul de laborator al infecțiilor produse de streptococi

Streptococcus pyogenes (streptococul de grup A)

Diagnosticul de laborator presupune izolarea și identificarea germenilor prin diagnostic bacteriologic și evidențierea anticorpilor antistreptococici prin diagnostic serologic.

Semnificația clinică. Streptococii piogeni produc infecții cu localizări variate și manifestări clinice diverse. Infecțiile acute, cu localizare respiratorie (faringita, scarlatina), pot evolua spre complicații grave, prin mecanism alergic, de tipul reumatismului articular acut, carditei reumatismale, glomerulonefritei acute, eritemului nodos, coreei și purpurei streptococice. Infecțiile cu localizare cutanată (erizipel, impetigo, intertrigo, pemfigus), precum și cele genitale post-abortum și post-partum, nediagnosticate la timp și incorect tratate pot evolua spre complicații poststreptococice supurative, care se manifestă precoce (celulite, flegmoane, abcese, septicemii etc.).

Recoltarea. Exudatul faringian se recoltează dimineața, înainte ca pacientul să mănânce. Se vor șterge amigdalele și peretele posterior al faringelui, evitându-se atingerea cu tamponul faringian a limbii, a luetei și contaminarea lui cu salivă. La purtătorii sănătoșise recoltează exudatul nazo-faringian, nazal.

În infecțiile plăgilor (plăgi chirurgicale, arsuri etc.), precum și în alte afecțiuni purulente(otite, sinuzite) produsul patologic este puroiul, care se recoltează cu un tampon.

În afecțiunile superficiale ale pielii (impetigo, ectima, pemfigusul nou-născuților) se îndepărtează crusta și se recoltează conținutul vezicular prin frecarea fermă a tamponului de leziune. Manevra este dureroasă, dar necesară pentru a asigura un număr cât mai mare de germeni în probă.

LCR, sângele, urina etc. se recoltează conform metodologiei uzuale.

După recoltare, produsul patologic se va expedia la laborator. Transportul diferă în funcție de natura prelevatului. Tampoanele utilizate pentru recoltarea exudatelor (faringian, nazo-faringian, nazal și din leziunile cutanate) se vor transporta în maximum două ore. Dacă acest interval se va prelungi, tampoanele se introduc în eprubete ce conțin un mediu selectiv îmbogățit:

•    mediu Pick (bulion glucozat 0,2%, hematiii de iepure sau berbec, azid de sodiu și cristal violet);

•    bulion Todd-Hewitt (bulion, glucoză 0.2%, neopeptonă, infuzie de cord de bou).

Aceste medii conțin substanțe care favorizează dezvoltarea streptococilor (bulionul, glucoza, hematiile) și substanțe care inhibă flora de asociație (cristalul violet inhibă creșterea stafilococilor, iar azidul de sodiu pe cea a bacililor gram negativi).

LCR, sângele, urina, sputa și alte produse lichide se vor transporta imediat sau în interval de maximum o oră de la recoltare.

Examenul direct. Examenul macroscopic se poate aplica unui număr restrâns de produse patologice, ca de pildă în afecțiunile purulente în care se va observa aspectul seros al puroiului și în meningite, când LCR este tulbure, opalescent.

Examenul microscopic. Examenul direct al exudatului faringian, nazal și din leziunile cutanate are valoare redusă, datorită existenței în aceste zone a streptococilor nepatogeni, care nu diferă morfologic de cei patogeni. Prin urmare examenul microscopic nu este uzual.

Tehnicile actuale permit însă detectarea directă a S.pyogenes din exudatele faringiene. Kiturile utilizate în acest scop conțin materialele necesare extracției antigenului de grup A din prelevatul faringian prin mijloace enzimatice sau chimice. Detectarea serogrupului se face fie prin metoda Elisa, fie prin latex-aglutinare sau coaglutinare. Totuși aceste teste rapide au valoare orientativă, diagnosticul bacteriologic fiind obligatoriu.

LCR și urina vor fi centrifugate și din sediment se vor efectua frotiuri colorate Gram care relevă leucocite, coci gram pozitivi, ovalari, dispuși izolat sau în lanțuri, uneori fagocitați.

Izolarea germenilor. Streptococii necesită, în general, medii de izolare cu sânge datorită faptului că le lipsește catalaza. Se utilizează medii îmbogățite cu glucoză (care le stimulează înmulțirea) și lichide organice (sânge de iepure, cal, oaie, ser, lichid de ascită), care asigură aportul de aminoacizi și vitamine. Astfel de medii sunt geloza-sânge, bulionul Todd-Hewitt, mediul SSP (mediu selectiv pentru streptococ și pneumococ care conține geloză, acid nalidixic, cristal violet, glucoză, sânge difibrinat de berbec) etc.

Mediul de izolare se alege în funcție de produsul însămânțat. Cel mai frecvent se utilizează geloză-sânge de oaie 5%. Exudatele faringiene recoltate se pot însămânța în prima zi în mediu Pick care favorizează înmulțirea streptococilor în dauna altor specii. A doua zi se fac treceri pe geloză sânge. Incubarea se face în atmosferă de CO2 10%.

Identificarea se bazează pe caracterele culturale și structura antigenică.

Caractere culturale. Pe geloză-sânge de oaie streptococul de grup A dezvoltă colonii mici, pulverulente (diametrul în jur de 0,5 mm), transparente sau translucide, bombate cu zona largă de hemoliză clară de tip beta, ce depăsește de 2-4 ori diametrul coloniei. Privite la lupă, aceste colonii pot prezenta 4 aspecte: colonii “mucoide” (rotunde, convexe, opace), “matt” (plate, confluente, cu suprafața mamelonată),“glossy” (mici, rotunde, lucioase, cu centrul ridicat, de consistență apoasă) și colonii “R”, rugoase, (plate, cu margini neregulate).

Primele două tipuri sunt caracteristice streptococilor virulenți, iar ultimele aparțin streptococilor lipsiți de antigen M (nevirulenți). Aceste aspecte culturale variază însă considerabil, în funcție de mediul utilizat și atmosfera de incubare. Astfel, pe geloză sânge de cal coloniile sunt mari, mucoase cu diametru de 1-2 mm cu o zonă de hemoliză clară în jur.

Diferențierea bolnavilor de purtătorii sănătoși se poate face și prin aprecierea semicantitativă a creșterii culturale, un număr redus de colonii indicând, de obicei, starea de portaj.

Identificarea grupului. Testul sensibilității la bacitracină. Este o metodă simplă, larg utilizată, care diferențiază streptococii de grup A, sensibili, de restul grupurilor rezistente la bacitracină.

Se repică sub lupă câteva colonii de streptococi betahemolitici într-o eprubetă cu bulion glucozat 0,2%. După incubare la 37°C, timp de 18-24 ore se examinează cultura, care prezintă aspect caracteristic (mediu limpede, cu depozit pe fundul și pereții eprubetei). Se controlează puritatea culturii printr-un frotiu colorat Gram sau cu albastru de metilen, apoi se însămânțează foarte dens cu ansa pe o placă cu geloză-sânge. În mijlocul ariei însămânțate se depune un microcomprimat de bacitracină și se incubează placa la 37°C până a doua zi, când se citește și se interpretează. Dacă tulpina de cercetat aparține grupului A, creșterea ei va fi inhibată pe o arie cu diametrul de minimum 10 mm în jurul microcomprimatului. Dacă creșterea se produce și în jurul microcomprimatului de bacitracină, germenul cercetat aparține altui grup serologic.

Însămânțarea pe mediul Todd-Hewitt, cu adaos de trimetoprim și sulfametoxazol, permite diferențierea grupurilor A și B, rezistente, de grupurile C și G, sensibile. Dar există rezerve în privința utilizării acestei metode, deoarece este costisitoare și prelungește timpul de incubație, ceea ce întârzie obținerea rezultatelor.

Metode bazate pe reacții Ag-Ac. Determinarea grupului se face prin reacții de precipitare sau aglutinare. Aceste reacții antigen-anticorp impun contactul direct dintre Ag de grup (polizaharidul C) și Ac omolog (ser anti-grup A, anti-grup B etc.). Deoarece antigenul de grup se găsește în profunzimea peretelui celular al streptococilor, în stratul intermediar, el trebuie descoperit de sub stratul proteic care îl acoperă și nu permite contactul cu serul specific anti-grup. Extracția polizaharidului se poate realiza chimic (cu HCl sau formamidă) la cald, sau enzimatic.

Reacții de precipitare. Metoda Lancefield este o reacție de precipitare în inel în care se pune în contact Ag de grup (polizaharidul C) cu seruri antistreptococice specifice de grup, extracția carbohidratului realizându-se cu HCl, la cald. Este foarte rar utilizată deoarece există tehnici mai simple și mai precise.

Reacții de aglutinare (prin extracția enzimatică a polizaharidului C) sunt cele mai utilizate după testul la bacitracină.

Metoda coaglutinării (testul STREPTIC) este o reacție de aglutinare pe lamă, cu seruri antistreptococice absorbite pe proteina A a stafilococilor. Este metoda cea mai accesibilă și prin urmare cel mai frecvent utilizată în țara noastră. Institutul “Cantacuzino”, București, comercializează în acest scop trusa ”STREPTIC”, care conține 1 flacon cu extract pancreatic și 4 flacoane cu seruri antistreptococice de grup A, B, C și G.

Se însămânțează câteva colonii din tulpina de cercetat în bulion glucozat de 0,2%, la care se adaugă extract pancreatic. Eprubeta se incubează la 37°C până a doua zi, apoi se centrifughează. Supernatantul se decantează, iar sedimentul se aspiră cu pipeta Pasteur, se depune câte o picătură din acesta pe lamă și se pune în contact cu o picătură din fiecare ser specific de grup. Antigenul de grup, extras enzimatic, în contact cu anticorpii adsorbiți pe stafilococi vor produce în câteva minute o reacție de aglutinare vizibilă cu ochiul liber, la serul de grup corespunzător.

Metoda latex-aglutinării este tot o reacție de aglutinare pe lamă, dar în care anticorpii specifici de grup au ca suport particule inerte de latex-polistiren, tehnica și interpretarea fiind similare cu coaglutinarea.

Recent s-au introdus teste imunologice rapide de identificare a streptococului piogen direct din produsul patologic. Deși sunt mai costisitoare decât cultura pe geloză-sânge, ele prezintă avantajul rapidității în obținerea rezultatului (permit evidențierea antigenelor streptococice într-un interval de 10-15 minute, fără a impune apelarea la un laborator bacteriologic). Dintre aceste teste menționăm: Ventrex, Directogen, Phadirect Strept A, Clearview etc. Deși sunt specifice și sensibile, ele au eficacitate mai slabă decât cea a culturii în diagnosticul infecțiilor streptococice și depistarea purtătorilor. De aceea, cea mai sigură metodă de identificare a streptococilor piogeni rămâne cea bacteriologică.

Practic, laboratoarele de bacteriologie din țara noastră utilizează două metode de identificare a grupului serologic: testul la bacitracină pentru streptococii de grup A și coaglutinarea pentru streptococii non grup A.

Determinarea tipului este necesară în scop epidemiologic la streptococii de grup A. Astfel, se efectuează:

•    tipajul M, prin reacție de precipitare în tuburi capilare, cu seruri anti-M specifice de tip adsorbite, sau prin dublă difuzie, cu seruri neadsorbite;

•    tipajul T se efectuează prin reacție de aglutinare pe lamă, în prezența serurilor anti-T adsorbite. O tulpină poate fi aglutinată cu un singur ser, identificându-se astfel tipul, sau cu mai multe seruri, când se realizează paternele T. În țara noastră tipajul se efectuează la centrul de referință ”Institutul Cantacuzino”, care identifică paternele T;

• PCR petntru clasificarea germenilor non-M tipabili.

Sensibilitatea la antibiotice. În cazul izolării streptococilor de grup A, antibiograma nu este necesară deoarece până în prezent nu s-au semnalat tulpini rezistente la penicilină. Pacienții alergici la penicilină pot fi tratați cu eritromicină. După identificarea serogrupului A prin testul la bacitracină, examenul bacteriologic se consideră încheiat și se poate elibera buletinul de analiză cu rezultatul definitiv.

În cazul izolării streptococilor de grup C și G, precum și a streptococilor negrupabili, antibiograma este obligatorie.

Diagnosticul serologic. Datorită faptului că în evoluția complicațiilor post-streptococice tardive germenii sunt greu evidențiabili în cultură, se urmărește determinarea anticorpilor antistreptococici prin teste serologice. Se pun în evidență anticorpii prezenți în ser atât față de componentele endocelulare cât și față de produșii extracelulari streptococici. Astfel se determină anticorpii:

•    anti-SLO (ASLO), fie prin reacție de neutralizare în tuburi (reacție de referință care utilizează ca indicator hematiile de iepure), fie printr-o metodă rapidă de aglutinare pe lamă. Reacția dă informații despre o infecție streptococică recentă, când se evidențiază creșterea în dinamică a titrului, despre eficiența terapiei antistreptococice, precum și asupra stadiului evolutiv al complicațiilor poststreptococice tardive. Este cea mai utilizată reacție de diagnostic serologic în infecțiile cu S. pyogenes.

•    anti-MAP, prin reacție de latex-aglutinare, au valoare în diagnosticul retrospectiv al infecției acute, când titrul ASLO este normal sau crescut nesemnificativ. Se mențin mult timp în ser;

•    anti-C, prin reacție de aglutinare, au evoluție similară cu anticorpii anti-MAP, prezența lor semnificând constituirea unei valvopatii cronice;

•    anti-DN-ază au titrul crescut semnificativ în glomerulonefrita acută post-streptococică, spre deosebire de titrul ASLO, care în acest caz are valori mult mai mici;

•    anti-SK, determinați prin test de neutralizare, au valori paralele cu titrul ASLO.

Evidențierea și titrarea anticorpilor ASLO se menține ca metodă de rutină. Numai în cazurile în care rezultatele reacției ASLO nu concordă cu suspiciunea clinică, se apelează la alte metode serologice. Utilizarea concomitentă a mai multor teste, crește șansa diagnosticului etiologic.

Reacția ASLO. Reprezintă metoda de rutină în serodiagnosticul infecțiilor streptococice produse de serogrupurile A, C, G. Este o reacție de neutralizare in vitro care se bazează pe proprietatea anticorpilor ASLO de a anihila efectul litic al antigenului (streptolizina O) asupra hematiilor (de iepure).

Reacția are loc în tuburi, în care se pun în contact diluții din serul de cercetat cu cantitatea standard (o unitate combinantă) de streptolizină O (SLO). După o scurtă perioadă de incubare necesară cuplării specifice dintre Ac și Ag se adaugă suspensia de hematii ca mijloc revelator. În cazul existenței Ac în ser se produce neutralizarea SLO. Aceasta nu-și poate exercita acțiunea litică asupra hematiilor, ceea ce se traduce vizual prin lipsa hemolizei în tuburi (hematiile se depun în buton pe fundul eprubetelor). În eprubetele în care, la diluțiile respective, Ac sunt insuficienți pentru a neutraliza SLO, efectul litic al acesteia se observă prin prezența hemolizei.

Tehnica reacției. Materiale necesare:

•    sângele, recoltat prin puncție venoasă cu seringa sterilă, uscată sau spălată cu ser fiziologic, se depune într-o eprubetă sterilă. După centrifugare, serul se decantează în altă eprubetă sterilă și se inactivează 30 minute la 56°C. Se evită posibilitatea contaminării serului, întrucât serurile contaminate pot conține inhibitori care conduc la rezultate false. Serul trebuie să fie limpede, fără hematii și nehemolizat;

•    soluție rivanol 0,4% necesară pentru tratarea serului cu scopul îndepărtării inhibitorilor nespecifici. 0,2 ml ser inactivat se tratează cu 0,7 ml soluție rivanol. Se lasă în contact 10-15 minute la temperatura camerei, timp în care apare un precipitat. Se centrifughează și se decantează. Supernatantul se diluează cu 1,1 ml soluție salină izotonică tamponată și se obține astfel diluția 1/10. Din aceasta se prepară diluțiile de lucru 1/100 și 1/500 (vezi schema reacției);

•    hematii difibrinate de iepure, spălate de 2-3 ori cu ser fiziologic. După spălare se readuce suspensia la volumul inițial și se prepară o diluție 5% în ser fiziologic. În lipsa hematiilor de iepure se pot utiliza hematii de berbec sau de om de grup 0.

•    streptolizina O (livrată de Institutul “Cantacuzino” în stare liofilizată și activată) se utilizează ca atare, prin solvirea conținutului din fiolă în apă distilată sau ser fiziologic în cantitatea indicată pe fiolă. Se repartizează în fiecare tub al reacției câte 0,5 ml (cantitatea corespunde unei unități combinante);

•    ser fiziologic steril pentru spălarea hematiilor și realizarea diluțiilor din serul de cercetat;

•    eprubete:      ›    16/16 câte 3 bucăți pentru diluțiile inițiale de lucru

                               (1/10, 1/100,1/500)

                          ›    12/12 câte 10 pentru fiecare ser de cercetat

                          ›    4 eprubete pentru tuburile martor;

•    pipete gradate de 1 ml și 10 ml.

Martorii reacției:

•    Martor pozitiv:     ser cu titrul ASLO ridicat peste valoarea normală.

•    Martor negativ:    ser cu titrul ASLO mai mic decât valoarea normală.

•    Martor hematii:    tub cu hematii + ser fiziologic.

•    Martor antigen:    tub cu hematii + SLO.

Citirea reacției se face în doi timpi:

•    prima citire după scoaterea eprubetelor de la termostat;

•    citirea definitivă a 2-a zi dupa păstrarea probei la +4°C.

Titrul ASLO este dat de ultima diluție (ultimul tub) în care lipsește complet hemoliza.

Citirea martorilor:

•    Martor pozitiv:     hemoliză absentă (hematii depuse în buton).

•    Martor negativ:    hemoliză completă.

•    Martor hematii     hematii depuse în buton.

•    Martor SLO:        hemoliză completă.

Interpretarea rezultatelor. Titrurile normale ASLO se situează între 166-200 u/ml. Ele variază în funcție de vârstă, arie geografică, sezon. Astfel, sub vârsta de 14 luni o infectie streptococică nu determină creșterea ASLO, iar sub 2 ani creșterile rămân nesemnificative. În infecțiile cutanate titrul ASLO este normal.

Titrul ASLO > 200 u/ml dă informații despre:

•    o infecție streptococică în antecedentele recente ale pacientului, când se înregistrează creșterea în dinamică a titrului. După o angină streptococică titrul ASLO crește în 2-3 săptămâni, atinge nivelul maxim la 5 săptămâni și scade apoi lent, până la 6-12 luni (în cazul în care boala se vindecă);

•    instalarea sau agravarea unei complicații poststreptococice (cu excepția coreei, când ASLO este normal);

•    eficiența tratamentului. Antibioticoterapia instituită precoce face că titrul ASLO să crească mai puțin, iar corticoterapia determină revenirea mai rapidă la valori normale. În infecțiile streptococice netratate titrurile ating valori maximale (până la 2500 u/ml);

•    starea de purtător sănătos.

Valori fals pozitive se pot înregistra în hiperlipemii, hiper-g-globulinemii (mielom multiplu). Valori fals negative (ASLO normal ) apar la 15-20% din totalul infecțiilor streptococice.

Reacția ASO-LATEX este o metodă rapidă de evidențiere a anticorpilor ASLO prin latex-aglutinare pe lamă. Se utilizează trusa ASO-LATEX comercializată în țara noastră, dar pot fi efectuate determinări bazate pe aceeași metodă folosind alte truse, denumirea lor variind în funcție de firma producătoare. Kitul menționat servește la punerea în evidentă pe lamă, a anticorpilor ASLO din ser nediluat (metoda calitativă) sau la determinarea semicantitativă a acestora.

Serul de cercetat se pune în contact, pe lamă, cu reactivul ASO-LATEX (suspensie de particule uniforme de latex, sensibilizate în prealabil cu SLO stabilizată). Particulele de latex fac posibilă observarea cu ochiul liber a reacției Ag-Ac.

Citirea se face după aproximativ 2 minute. Dacă serul de cercetat conține anticorpi ASLO în cantitate suficientă, suspensia își pierde aspectul omogen și aglutinarea particulelor devine evidentă. O granulație care depășește pe cea a controlului negativ indică prezența a cel putin 200 u ASLO/ml. Lipsa aglutinarii indică un titru < 200 u ASLO/ml.

Trusa conține de asemenea, un martor pozitiv (soluție de g-globulină umană cu titrul ASLO > 200 u/ml) și un martor negativ (soluție de g-globulină umană cu titrul ASLO < 200 u/ml).

Streptococcus agalactiae (streptococul de grup B)

S. agalactiae este un germen comensal al intestinului, vaginului, uretrei (la bărbat), perineului și căilor respiratorii superioare.

Semnificația clinică. S. agalactiae poate fi cauza unor infecții severe la nou-născuți și adulți. La nou născuți contaminarea are loc în timpul nașterii cu flora tractului genital matern.

Infecțiile neo-natale îmbracă două forme clinice, în funcție de calea și momentul contaminării. Forma predominantă precoce, la 10 zile după naștere este pneumonia, streptococul fiind de origine maternă, iar cea tardivă, la două săptămâni după naștere, meningita, de proveniență nosocomială. Bacteriemia este prezentă în ambele cazuri și prognosticul este grav.

La femei tinere provoacă infecții urogenitale, iar la bătrâni cu diverse tare, meningite, infecții respiratorii, endo- și miocardite acute, septicemii.

Recoltarea și examenul direct. În general se recoltează secreții vaginale și cervicale și LCR.

Izolarea și identificarea. Se face pe geloză-sânge și geloză chocolat. Se poate însămânța mediu de îmbogățire Todd-Hewit cu extract de drojdie, colistin și acid nalidixic și apoi pe mediile solide menționate. După însămânțare mediile se incubează la 37°C pentru 24 ore, în aerobioză sau în atmosferă cu CO2. Identificarea se bazează pe caracterele culturale și structura antigenică.

Caractere culturale. Pe geloză sânge streptococii de grup B dezvoltă colonii ceva mai mari decât ale streptococilor de grup A, cu hemoliză variabilă.

Structura antigenică. Identificarea grupului se face prin metode screening și metode bazate pe reacții antigen anticorp (aceleași cu cele utilizate pentru identificarea grupurilor A,C,G).

Metode screening. Testul CAMP. Hemoliza incompletă a’ reprezintă primul indiciu de recunoaștere a acestor germeni, pe ea bazându-se identificarea streptococilor de grup B prin testul CAMP. Streptococii de grup B produc o proteină termostabilă difuzibilă, numită CAMP-factor, care intensifică zona de hemoliză incompletă produsă de b-hemolizina stafilococului auriu. Testul se poate efectua prin:

a)  metoda convențională: pe o placă cu geloză-sânge de oaie se însămânțează în striuri perpendiculare tulpina de identificat și o tulpină de S. aureus producătoare de b-hemolizină;

b)  pe geloză-sânge se însămânțează cu ansa într-un striu unic tulpina de cercetat și la distanță de 3-4 mm de striu se depune un disc impregnat cu b-hemolizină stafilococică.

Placa însămânțată printr-una din cele două modalități se incubează în aerobioză sau în atmosferă de CO2 și a doua zi se citește. La joncțiunea dintre zona de hemoliză a’ a streptococilor și hemoliza incompletă a stafilococului apare o zonă de hemoliză totală (test pozitiv). Testul este prezumptiv deoarece dă rezultate pozitive și la alte grupe de streptococi. De aceea identificarea streptococilor de grup B trebuie confirmată prin alte metode.

Pigmentogeneza. Se urmărește pe medii ce conțin amidon în prezența căruiaS.agalactiae produce un pigment roșu-portocaliu. La mediu se mai poate adăuga metronidazol și gentamicină, antibiotice la care S.agalactiae este natural rezistent și care vor împiedica dezvoltarea florei asociate.

Testul hipuratului de Na este pozitiv (hidrolizează hipuratul de Na).

Identificarea tipului. La streptococii de grup B s-au descris până în prezent 5 tipuri antigenice după natura polizaharidului de tip (capsular sau de înveliș): Ia, Ib, Ic, II și III. Ele se identifică la centrul de referință Cantacuzino prin reacții de precipitare cu seruri hiperimune specifice de tip.

Sensibilitatea la antibiotice. Testararea sensibilității este obligatorie, mai ales datorită faptului că s-au semnalat tulpini tolerante sau chiar rezistente la penicilină. În formele grave penicilina poate fi înlocuită sau asociată cu un aminoglicozid.

Streptococii viridans

Streptococii viridans, denumiți și streptococi orali sunt comensali ai cavității bucale, intestinului, pielii și căilor genitale. Printre speciile care joacă un rol etiologic predominant în formarea cariilor dentare și a paradontopatiilor se numără S.mutans, S.sanguis, S. anginosus (S. milleri).

Streptococii viridans sunt identificați frecvent ca agenți etiologici ai endocarditei subacute. Pătrunși în circulație cu ocazia extracțiilor dentare, a intervențiilor în sfera ORL sau maxilo-facială și chiar a traumatismelor minore, se grefează la nivelul valvulelor cardiace la persoanele cu risc (cardiopatie valvulara) sau a protezelor valvulare. Diagnosticul endocarditei subacute se face prin hemoculturi.

S. anginosus este agent patogen întâlnit în infecții purulente (abcese, peritonite, pleurezii, artrite) și infecții neonatale (septicemii și meningite).

Diagnosticul de laborator al acestor afecțiuni este bacteriologic și se efectuează numai atunci când germenii se izolează din lichide organice care sunt în mod normal sterile.

Izolarea se face prin insămânțarea produselor patologice pe geloza-sânge. După incubarea plăcilor la 37°C, 24 de ore se examinează caracterele culturale. Prezența de colonii mici, cu hemoliza a (viridans=verde) sugerează prezența streptococilor viridans sau a pneumococilor. Pentru precizarea diagnosticului se cercetează sensibilitatea la optochin și biloliza (teste de diferentiere cu pneumococii). Pentru stabilirea speciei se cercetează propietățile biochimice (prin sistemul API). Streptococii viridans se pot identifica prin excludere : nu sunt b hemolitici, sunt insolubili în bilă, nu sunt sensibili la optochin, nu au antigen de grup, nu tolereaza NaCl 6.5%, nu cresc la 10°C și 45°C, majoritatea au testul la bilă esculină negativ. Când se evidențiază aceste particularități se confirmă prezența S. viridans.

 Streptococcus pneumoniae

Semnificația clinică. Comensal al căilor respiratorii superioare la om, S. Pneumoniae poate deveni virulent atunci când este încapsulat. Este principalul agent etiologic al meningitelor la copii, produce infecții respiratorii (pneumonia francă lobară, bronhopneumonii), uretrite etc. Diagnosticul acestor infecții este bacteriologic.

Recoltarea. Se recoltează spută, LCR, exudate, sângele etc., în funcție de localizarea infecției.

Examenul direct macroscopic este util în pneumonii, deoarece sputa are un aspect ruginiu caracteristic.

Examenul microscopic al frotiurilor colorate Gram din spută evidențiază PMN și diplococi gram pozitivi, lanceolați, dispuși în lanțuri scurte sau perechi izolate, încapsulați. Au aspect caracteristic, ca două flăcări de lumânare care se ating cu bazele.

Izolarea se face pe geloză sânge iar incubarea, de preferință, în atmosferă de CO2, la 37°C, timp de 24 ore.

Identificarea. Caractere culturale. Pe geloza-sânge pneumococul dezvoltă colonii mici, netede, mucoide, cu diametrul în jur de 1 mm, cu zona de liză a în jur. Coloniile tinere sunt bombate, dar prin învechire se aplatizează și au centrul deprimat datorită elaborării de autolizine. Aceste aspecte culturale (cu excepția proprietății autolitice) se întâlnesc și la streptococii viridans, ceea ce impune efectuarea testelor de diferențiere.

Testul la optochin. Se repică în striuri dese pe o placă cu geloză-sânge câteva colonii izolate din tulpina de cercetat.În mijlocul ariei însămânțate se depune un microcomprimat de optochin. Se incubează 24 ore la 37°C. Testul este pozitiv (germenii sunt sensibili la optochin) dacă în jurul microcomprimatului de optochin cultura este inhibată pe o arie de minimum 20 mm. Este un test foarte specific, care diferențiază pneumococii (sensibili) de streptococii viridans (rezistenți la optochin).

Biloliza (solubilizarea prin bilă sau săruri biliare). Se însămânțează tulpina de cercetat în două eprubete cu bulion glucozat. A doua zi se adaugă într-o eprubetă 1 ml bilă sau 1 ml săruri biliare (dezoxicolat sau taurocolat de Na 10%), iar în cealaltă eprubetă ser fiziologic (tub martor). După o oră de incubare la termostat se compară cele două eprubete. Dacă în bulion s-au dezvoltat pneumococi, tubul în care s-au adăugat săruri biliare se va limpezi, comparativ cu martorul care rămâne opac. Bila sau sărurile biliare favorizează elaborarea autolizinelor, care vor determină liza pneumococilor. În cazul streptococilor viridans, testul este negativ.

Boala experimentală la șoarece. Șoarecele alb este foarte sensibil la infecția cu S. pneumoniae. Se injectează la baza cozii tulpina de cercetat. Șoarecele face în 2 zile o septicemie mortală. Prin hemocultură se izolează S. pneumoniae, iar pe amprentele din splină se văd diplococii incapsulați cu dispoziție caracteristică.

Identificarea tipului serologic se poate face fie direct din produsul patologic (dacă acesta este lichid), fie din cultura de 10-14 ore în mediu lichid (dar pe medii speciale pe care pneumococul poate sintetiza capsula).

Se utilizează reacția de aglutinare pe lamă prin tehnica de “umflare a capsulei”. Pe o lamă se pun în contact o picătură din cultura de cercetat sau produs patologic și o picătură din serul specific de tip. Operația se repetă pentru fiecare ser de tip. Apoi se adaugă câte o picătură de albastru de metilen la fiecare amestec Ag-Ac. După 10 minute se examinează la microscop, la obiectivul cu imersie.

Acolo unde tipul antigenic întâlnește serul omolog se observă aglutinarea pneumococilor și prezența unei capsule bine delimitate, mult mărită comparativ cu celelalte seruri.

Sensibilitatea la antibiotice. S.pneumoniae este sensibil la penicilină. Au fost semnalate și tulpini rezistente motiv pentru care efectuarea antibiogramei devine obligatorie.

Genul Enterococcus

Genul Enterococcus, intrat recent în taxonomie, include 12 specii, din care 10 s-au izolat în infecții umane: endocardite, infecții uro-genitale, meningite și infecții neonatale. A făcut parte din genul Streptococcus, grupul D. Dintre speciile cu habitat uman, E. faecalis șifaecium constituie grupul enterococilor care au capacitatea de a se dezvolta pe medii cu concentrații de NaCl 6,5% sau pe medii cu bilă 40%.

Izolarea se face pe geloză sânge, coloniile fiind mici, cu hemoliză variabilă. Identificarea se bazează pe structura antigenică (enterococii au polizaharidul de grup D) și pe caracterele biochimice. Genul Enterococcus este definit prin caractere biochimice ilustrate în tabelul 12. Identificarea speciei în cadrul genului se face pe baza formării de acid din manitol, sorbitol, sorboză și a hidrolizei argininei etc.

Sensibilitatea la antibiotice. Cu toate că enterococii sunt sensibili la vancomicină, penicilină, nici unul din aceste antibiotice nu atinge concentrații serice eficiente terapeutic în infecțiile grave ca, de pildă, în endocardite. În tratamentul acestora se recomandă asocierea penicilinei, a vancomicinei cu un aminoglicozid. Testarea sensibilității la antibiotice este utilă datorită apariției tulpinilor rezistente prin plasmide.

1.1.7 Exudatul faringian

Exudatul faringian este un lichid rezultat în urma unui proces inflamator faringian. Scopul explorator este depistarea germenilor patogeni de la nivelul faringelui în vederea tratamentului; depistarea persoanelor sănătoase purtătoare de germeni

Examenul microbiologic al exudatului faringian se efectuează pentru: diagnosticul faringitelor și anginelor streptococice, confirmarea diagnosticului de difterie, depistarea purtătorilor de S. pyogenes, diagnosticul unor viroze respiratorii. recoltarea se face nu numai în angine , ci și în alte boli care pot fi declanșate de o infecție faringiană (nefrite, RAA),scarlatină

Exudatul faringian se prelevă înainte sau după 4 ore de la toaleta cavității bucale sau ingestia de alimente sau lichide.

Materiale necesare: mască, mănuși de protecție, sterile, nesterile) spatulă linguală, eprubetă cu tampon faringian, eprubete cu medii de cultură, ser fiziologic sau glicerină 15%, tăviță renală, tava medicală, sursa de lumina

Tehnica de recoltare: Se așează pacientul pe scaun cu fața spre sursa de lumină, gâtul în ușoara extensie și ceafa sprijinită de spătar sau perete. Se deprimă baza limbii cu apăsătorul și, în timp ce pacientul pronunță vocala “a”, se șterg ferm cu tamponul amigdalele și peretele posterior al faringelui, insistând asupra zonelor inflamate, ulcerate sau cu depozite purulente; dacă există false membrane, acestea se desprind ușor, tamponandu-se mucoasa subiacentă; atât la introducerea cât și la scoaterea tamponului, se evită atingerea bazei limbii și a palatului moale. Se introduce tamponul în tubul protector simplu sau prevăzut cu mediu de transport (Amies sau Stuart), care se etichetează corespunzător. Se prelevă: un tampon simplu fără mediu de transport, din care se va efectua testul rapid pentru detectarea antigenului streptococic de grup A; un tampon simplu, de la nivelul zonei ulcerate, din care se vor efectua extemporaneu două frotiuri pentru examenul microscopic, în vederea diagnosticării anginei Vincent; un tampon prevăzut cu mediu de transport pentru efectuarea culturii.

Transportul probelor către laborator se face în maximum 2 ore de la prelevare. Deși probele prelevate pe tampoane în tuburi ce conțin mediu de transport pot fi păstrate până la 24 ore, este recomandat ca însămânțările pe mediile de cultură să se facă imediat ce probele ajung la laborator, pentru o mai sigură recuperare a microorganismelor urmărite.

Diagnosticul de laborator

Examen direct: Frotiul efectuat din produsul patologic, în scop orientativ, are importanță pentru produsele normal sterile; se efectuează 2 frotiuri: unul colorat Gram și celălalt albastru de metilen, ultimul important pentru studiul elementelor celulare. Colorația Gram evidențiază: coci Gram pozitivi sferici, așezați în lanțuri, nesporulati, flora de asociație (alți coci sau bacili), polimorfonucleare (PMN), celule epiteliale întregi sau detritusuri. În cazul exudatului faringian, frotiul servește numai pentru diagnosticul diferențial (pentru eliminarea altei etiologii microbiene).

De remarcat faptul că pe un astfel de frotiu nu se poate face diferențierea între streptococii hemolitici și streptococul viridans, un comensal obligatoriu al căilor respiratorii superioare. Examenul microscopic colorat Gram din probele de exudat faringian nu este recomandat deoarece nu se poate face o diferențiere între patogenii suspectați și flora normală de la acest nivel. Excepție fac următoarele situații: corelarea rezultatelor microscopiei cu izolarea predominantă și în cantitate mare în cultură a unei specii de Candidă (albicans sau tropicalis)( Dumitru Buiuc, Marian Negut, 2008); diagnosticul anginei fuso-spirochetozice – examinarea microscopică a frotiului colorat Gram, urmărind prezența bacililor Gram negativi fusiformi și a spirochetelor, în contextul unei reacții inflamatorii (idem, Betty A. Forbes et all, 2007), diagnosticul anginei difterice – frotiu efectuat extemporaneu ce trebuie trimis la laborator împreună cu tampoanele și biletul de trimitere care are obligatoriu notată suspiciunea clinică.

Metoda directă, rapidă pentru detectarea antigenului Streptococ betahemolitic de grup A este latexaglutinarea, cu o sensibilitate ce variază între 80-95% și o specificitate de 98%. Obținerea unui rezultat pozitiv permite inițierea promptă a terapiei; un rezultat negativ impune, însă, efectuarea culturii.

Se utilizează următoarele medii de cultură: medii de îmbogățire – mediul Picke (cristal violet și azidă de sodiu), medii de izolare complexe (bulion glucozat, geloză sânge).

Sunt recomandate:

Geloza-sânge cu cristal violet (1μg/mL), care inhiba stafilococii.

Geloza-sânge cu sulfametoxazol (23,75μg/mL) si trimetoprim (1,25μg/mL) inhiba stafilococii, streptococii viridans si bacilii gram-negativi, dar inhiba si unele tulpini de streptococi β-hemolitici grup C sau G, care sunt sensibile la cotrimoxazol. De aceea aplicarea unei rondele cu cotrimoxazol (din trusa pentru antibiograma difuzimetrica) pe primul cadran de epuizare favorizează repetarea coloniilor β-hemolitice în zona de difuzare a chimioterapicelor si evita riscul rezultatelor fals negative, aria selectivă fiind limitata.

Geloza-sânge cu 3,5% clorura de sodiu favorizează, cu rezultate superioare altor medii selective, izolarea streptococilor β-hemolitici cauzatori de faringite (grup A, B, C, G) prin inhibarea microbiotei de asociatie, mai ales a streptococilor orali, inclusiv streptococii β-hemolitici din grupul S. milleri (Buiuc si colab., 2008).

Însămânțarea produsului patologic se face: fie în suprafața mediilor, fie în condiții de semi anaerobioză pentru produsele patologice lichide din cavități închise (puroi otic, mastoidian, sinusal, LCR). Produsul patologic se depune la fundul unei plăci goale, peste care se toarnă sânge sau se incubează în atmosferă de CO2 5%.

Urmează incubarea la 370C 18-20 de ore și etapa de identificare.

Tampoanele introduse în mediul de îmbogățire se incubează 3-5 ore la 370C, după care se fac treceri pe geloza-sânge, care se incubează 18-20 de ore la 370C. Procesul depistarii S. pyogenes creste de la 63% in culturile aerobe si 98% in cele anaerobe prin manifestarea β-hemolizei si la coloniile tulpinilor care produc numai streptolizina oxigen labila.

Identificare

Se examinează atent plăcile în lumina reflectată și prin transparență, urmărind coloniile mici (0,5-1,0mm diametru), transparente sau opace, înconjurate cu o zonă largă de β-hemoliza (Fig. 6, 7). La examen sub lupa, suprafață coloniilor poate fi neregulat mamelonată (colonii matt), lucioasă și cu relief acuminat (colonii glossy) sau mucoidă. Majoritatea coloniilor sunt opace și ansa le mobilizează întregi. În absența coloniilor β-hemolitice, la prima sau la a doua citire a culturilor, se vă urmării cu atenție hemoliza din jurul punctelor de înțepare a mediului. Dacă la acest nivel constatam hemoliza β, se impune repicarea culturii din profunzimea înțepăturii cu incubare anaerobă a subculturii. Poate fi o tulpină de S. pyogenes producătoare exclusiv de streptolizina O.

Fig. 5. S. pyogenes-coloratie Gram Fig. 6. S. pyogenes, streptococ de grup A

(dupa Buiuc, 2003). colonii β-hemolitice pe geloza-sange (dupa

Buiuc, 2003)

Caractere de cultură

Medii lichide: tulbură ușor mediul cu formarea unui depozit;

Pe medii solide: pe geloză sânge streptococul de grup A poate să determine:

• colonii mucoide: colonii rotunde, cu suprafața convexă, lucioase, de consistență mucoasă, filantă; sunt caracteristice streptococilor încapsulați, virulenți și cu proteină M;

• colonii „mtt“: colonii turtite, apoase, cu suprafață neregulată, mamelonată, cu tendința de confluare (aspect de hartă geografică);

• colonii „glossy“: colonii rotunde, bine delimitate, mici, lucioase, cu suprafață conică; corespund streptococilor neincapsulati, cu conținut variabil de proteina M;

• colonii „rough“: colonii turtite, uscate, cu margini dințate și cu suprafața rugoasă, care se detașează în totalitate de pe suprafața mediului, lăsând pe locul respectiv o amprentă;

Pe același mediu (geloză sânge) streptococii pot să determine sau nu hemoliză, care poate fi:

– β hemoliza: coloniile sunt înconjurate de o zonă completă, clară, de hemoliză, cu diametrul variabil în raport cu grupul antigenic;

– α hemoliză: coloniile sunt înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă cu înverzirea mediului și a coloniei. După menținerea peste noapte la +40C poate să mai apară la exterior un alt inel de hemoliza completă.

– α’ hemoliză: colonii înconjurate de o zonă de hemoliză incompletă cu aspect voalat, încețoșat. Îi spune hemoliză incompletă pentru ca în zona de hemoliză din jurul coloniei se observă hematii intacte, nelizate.

– y hemoliză: dată de streptococi nehemolitici.

Streptococii β-hemolitici cu colonii mici, punctiforme, aparțin tulpinilor unor specii din “grupul anginosus” , mai ales speciilor S. anginosus și S. conslellatus.

Streptococii grup B formează colonii alb-cenușii, mai puțin acuminate, uneori mai mari, mai ușor de emulsionat decât ale streptococilor grup A, cu zona îngustă de α’-hemoliza. Până la 3% din tulpinile izolate de la om sunt chiar nehemolitice. Unele tulpini incubate anaerob sau cultivate pe agar-columbia formează colonii pigmentate în roșu-cărămiziu.

Streptococii grup D formează colonii alb-cenușii cu diametrul de cca 1 mm, transparente, care se opacifiază în cultura bătrână, nehemolitice sau α-hemolitice.

Streptococii viridans formează colonii mici (0,1-0,5mm diametru), bombate, cenușii, uzual α-hemolitice, ocazional nehemolitice.

Coloniile pneumococilor, gri-opace, au cca 1 mm diametru, sunt α-hemolitice asemănătoare, când sunt tinere, cu ale streptococilor viridans. După incubare în atmosferă cu 5% CO2 zona de α-hemoliza este mai largă. Progresiv, uneori în câteva ore, coloniilor pneumococilor devin crateriforme datorită autolizei enzimatice. Coloniile tulpinilor care formează mai mult polizaharid capsular sunt mai mari, fiind mai virulente formează colonii transparente mucoide, la care autoliza este mai rapidă și frecvent completă încât pe suprafața mediului rămâne numai urma coloniilor (Marchese și colab., 2011)

La S. suiș, ca și la unii enterococi, pe agar cu sânge de cal coloniile sunt β-hemolitice, în timp ce pe agar cu sânge de berbec sunt α- sau nehemolitice.

Streptococii deficienți nutritiv, genul Abiolrophia, cultivă numai pe agar- sânge suplimentat cu 10 μg/mL piridoxal hidrocloric și 100 μg/mL cisteină. Pe agar-sânge uzual creșterea este satelită striului de Staphylococus aureus.

Caractere biochimice

Testul sensibilității la bacitracina diferențiază streptococii β-hemolitici de grup A de cei β-hemolitici non-grup A.

Se prelevă 3-4 colonii β-hemolitice sau o ansă din cultura în bulion. Se etalează inoculul pe placă cu agar-sange. Se plaseza apoi în centrul ariei însămânțate un disc cu bacitracina. Se incubează 18-20 de ore la 370C

Test pozitiv: zona de inhibiție cu diametrul de minim 11 mm în jurul discului.

Test negativ: zonă de inhibiție cu diametrul mai mic de 11 mm sau lipsa zonei de inhibiție în jurul microcomprimatului cu bacitracina.

Streptococii de grup A sunt sensibili la bacitracina.

Testul CAMP se folosește pentru identificarea streptococilor de grup B. Streptococii de grup B produc un factor difuzibil, factorul CAMP, care acționează sinergic cu β-lizina stafilococică, determinând liza completă a hematiilor de berbec sau de bou.

Se însămânțează un striu din tulpină indicatoare de stafilococ auriu pe un diametru al plăcii. Tulpinile de testat și tulpinile martor se însămânțează în striuri fine, liniare, de cca 2 cm lungime, perpendicular pe striul tulpinii indicator, dar fără a o atinge. Se incubează plăcile la 370C peste noapte.

Test pozitiv: lărgirea cuneiformă în vârf de săgeată sau în flacără a ariei de hemoliză produsă de cultura stafilococului.

Test negativ: nici o modificare a hemolizei.

Testul poate fi pozitiv și pentru alte grupuri: E, P, U, V. Dintre streptococii β-hemolitici test CAMP pozitiv mai dau numai S.canis si S. porcius (Murray si colab.,2005).

Fig. 7. Testul CAMP pentru streptococi de grup B

Stanga: reactie pozitiva; dreapta: reactie negativa (dupa Howard, 1987).

Testul PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphtylamida) diferențiază streptococii de grup A , de cei β-hemolitici non-grup A. Este mai specific decât testul la Bacitracina. Streptococii β-hemolitici de grup A hidrolizează substratul PYR în L-pirolidona și β-naphtylamida, care prin reacție cu reactivul PYR (p-dimetilamino-cinamaldehida) dă culoare roșie. Se suspensionează o ansă încărcată cu cultura într-un tub cu bulion PYR. Se incubează 4 ore la 370C, apoi se adăuga o picătură de reactiv PYR. Substratul PYR (L-pyrrolidonyl-β-naphtylamida) este hidrolizat de 100% din streptococii grup A, dar de nici unul din streptococii β-hemolitici non-A. Enterococii, Aerococcus si Gemella dau testul PYR pozitiv (Buiuc si colab., 2008).

Test pozitiv: culoare roșie – purpurie după 2 minute de la adăugarea reactivului PYR.

Test negativ: apariția oricărei culori.

Testul SXT (sulfametoxazol-trimetoprim) este folosit pentru diferențierea streptococilor de grup A și B, de ceilalți streptococi β-hemolitici; majoritatea streptococilor de grup A și B sunt rezistenți la SXT atunci când sunt incubați în atmosferă normală.

Se prelevă 2-3 colonii sau o ansă din cultura pură și se însămânțează o placă cu agar-sange. Se depune în mijlocul ariei însămânțate un disc cu SXT. Se incubează peste noapte în atmosferă normală la 370C.

Test pozitiv (germeni sensibli la SXT): orice zonă de inhibiție în jurul discului cu SXT. Ex: streptococii de grup C ori G.

Test negativ (rezistent la SXT): creștere până la disc. Exemplu: streptococii de grup A ori B.

Fig. 8. Testul sensibilitatii la bacitracina si sulfametoxazol-trimetoprim. Streptococ de grup A (dupa Buiuc, 2003).

Testul bila-esculina se folosește pentru identificarea streptococilor de grup D și a enterococilor, fiind probabil testul cel mai fidel.

Enterococii și streptococii de grup D cresc pe mediul cu 40% bila și hidrolizează esculina cu eliberare de glucoză și un compus neglucidic (esculetina-dihidroxicumarina), care reacționează cu sărurile de fier dând naștere unui produs de culoare neagră.

Se însămânțează cu 1-3 colonii panta mediului agar-esculina sau jumătatea unei plăci cu agar bila-esculina. Se incubează la 370C peste noapte și încă 24 de ore în cazul unui rezultat negativ.

Test pozitiv: creșterea și inegrirea mediului din placa sau a cel puțin ½ din panta.

Test negativ: lipsa de inegrire a mediului din placa sau a pantei.

Testul hipuratului de sodium diferențiază streptococii de grup B de alți streptococi β-hemolitici.

Hipuricaza hidrolizează hipuratul de sodiu în benzoat de sodiu și glicina. Ninhidrina dezamineaza oxidativ glicina, rezultând aldehida corespunzătoare, CO2, NH3, hidrindantina (forma redusă a ninhidrinei). NH3 da cu ninhidrina și hidrindantina un complex colorat purpuriu.

Se suspensionează cultura de testat în 0,4 ml soluție 1% hipurat de sodiu, până se obține o soluție lăptoasă. Se incubează suspensia 2 ore la 370C. Apoi se adaugă 0,2 ml din soluția de ninhidrina și se reincubeaza 10-l50 minute la 370C. Se urmărește virajul culorii.

Test pozitiv: culoare intens purpurie-hidroliza hipuratului.

Test negativ: culoare nemodificată.

Testul sensibilității la vancomicina diferențiază genurile Streptococcus și Enterococcus care sunt sensibile la vancomicina, de genurile Leuconostoc și Pediococus care sunt rezistente.

Se prelevă cu ansa 5-l0 colonii bine izolate sau un tampon bine scurs din cultura de bulion. Se însămânțează ½ din placa de testare (plăci cu agar Mueller-Hinton). Se plasează prin presare ușoară, în centrul ariei însămânțate, un disc cu vancomicina. Se incubează peste noapte la 370C în atmosferă cu 5% CO2.

Test pozitiv (sensibilitate): apariția oricărei zone de inhibiție în jurul microcomprimatului.

Test negativ (rezistentă): creștere până la discul cu vancomicina.

Testul toleranței la sare este pozitiv pentru majoritatea speciilor de Enterococcus, care se dezvoltă în bulion cu 6,5% NaCl în 24-72 ore la 370C, în timp ce tulpinile de Streptococcus nu se dezvoltă.

Tehnica: Pe un mediu cu 6,5% NaCl se însămânțează 2-3 colonii de microorganism. Se incubează 3 zile la 370C, cu urmărire zilnică pentru turbiditate și virajul indicatorului (bromcrezol purpur).

Test pozitiv: turbiditate cu sau fără virajul indicatorului de la purpuriu la galben. Ex. Enterococcus faecalis.

Test negativ: absența turbidității și modificării de culoare. Ex: Streptococcus viridans.

Enterococul se dezvoltă la 100C și 450C, ceea ce-l diferențiază de speciile de Pediococcus care se dezvoltă numai la 450C sau de Leuconostoc care se dezvoltă numai la 100C.

Caractere antigenice

Identificarea grupului streptococic se face pe baza antigenului polizaharidic C, care împarte steptococii în streptococi grupabili: notați cu literele A-W (cu excepția literelor I și J) și streptococi negrupabili, lipsiți de antigenul de grup.

Antigenul specific de grup (polizaharidul C sau acidul teichoic) poate fi identificat prin diferite reacții antigen-anticorp.

Metode folosite:

Reacția de precipitare în tuburi de precipitare

În mediu lichid seruri imune de referință sunt puse să reacționeze cu antigenul de testat, aflat tot în fază lichidă. Extractul antigenic se poate obține prin metoda Lancefield (extracție acidă la 1000C), sau metoda Fuller (extracție cu formaldehida la 1600C) sau prin autoclavare (15 min. La 1210C).

În tuburi de precipitare se pipeteaza extractul antigenic 0,1-0,2 ml într-un număr de tuburi egal cu numărul antiserurilor de referință. Se pipeteaza apoi o cantitate egală din fiecare antiser în tubul corespunzător, ci grija, astfel încât cei doi reactivi să nu se amestece (se ține tubul înclinat și se lasă serul să se prelingă pe peretele acestuia). Serul, cu o densitate mai mare decât a extractului antigenic, se va depune la fundul tubului fără ca cei doi reactivi să se amestece.

După 15 min de incubare la temperatura camerei, se urmărește apariția inelului de precipitare la interfața dintre cei doi reactivi. În caz de dubiu, se agită tuburile, se incubează 2 ore la 370C și se lasă apoi peste noapte la 40C. A doua zi se urmărește depunerea de precipitat la fundul tubului, și, în funcție de cantitatea acestuia, se notează rezultatele pozitive semicantitativ (de la ++++ la +).

Se recomandă pentru identificarea streptococilor β-hemolitici de grup A, B, C, F, G, dar și a celor non- β-hemolitici, de grup B și D.

Teste de aglutinare pe lamă

Sunt reacții antigen-anticorp, care folosesc drept suport pentru anticorpii specifici de grup fie stafilococi cu proteină A (reacție de coaglutinare), fie particule de latex (reacție de latex-aglutinare). Astfel:

– Metoda coaglutinarii: reacția se efectuează pe lama folosindu-se tulpină de identificat (antigenul) sub forma unei suspensii obținută prin cultivarea tulpinii de identificat în bulion glucozat și o trusă de antiseruri: A, B, C, F, G.

Principiul metodei: cuplarea stafilococului Cowan cu proteină A cu anticorpii specifici antistreptococici de grup. Fragmentul Fc al anticorpilor se fixează de proteină stafilococică, iar fragmentul Fab rămas liber reacționează cu polizaharidul specific de grup, dând o reacție vizibilă macroscopic, sub forma unor grunji, cu clarificarea fazei lichide.

– Metoda latex-aglutinarii: particularitatea reacției este dată de faptul ca anticorpii specifici antigrup sunt fixați pe un suport reprezentat de particule de latex. Reacția se desfășoară pe lama, rezultatul pozitiv (corespondența imună) însemnând apariția grunjilor în fază lichidă clarificată.

Comparativ cu testul clasic al reacției de precipitare, testele de aglutinare pe lamă sunt mai rapide, mai economice, cu o sensibilitate și specificitate cel puțin egale.

– Identificarea tipului M streptococic

Streptococcus pyogenes se clasifică, după proteină M, în 80 de serovaruri M, care pot fi identificate prin:

Reacția de precipitare în tuburi capilare intre seruri anti-M specifice de tip si proteina M a tulpinii de identificat, obtinuta prin metoda de extractie Lancefield (Tomida si colab., 2011). Principiul reacției este ca cel de mai sus, dar în locul tuburilor de precipitare se folosesc tuburi capilare cu diametrul de 0,7-l mm și lungimea de 75-90 mm. Se înmoaie extremitatea capilarului în antiserul de referință și se aspiră o coloană de 25-30 mm de ser. Se aspiră în mod similar, peste antiserul de referință, o coloană de extract antigenic cu înălțime egală cu a celei de ser, fără a interpune vreo bulă de aer la interfața dintre cei doi reactivi. Se obturează orificiul inferior prin întărea verticală a tubului în blocul de plastilină. Reacția se citește după 5 min., urmărindu-se apariția unui precipitat alburiu la limita de separare a celor doi reactivi, pe fond întunecat.

– Identificarea tipului T streptococic: pe baza proteinei T, Streptococcus pyogenes este împărțit în 28 serovaruri T, care se identifică prin :

Reacția de aglutinare pe lamă se efectuează între serurile anti-T adsorbite și suspensia tulpinii de identificat cultivată în bulion ( tehnicile de aglutinare de mai sus).

Ultimele date de literatură fac diferențiere între streptococii de grup D și enterococi, considerându-se ca enterococii fac parte dintr-un gen separat de genul Streptococcus, și anume genul Enterococcus.

Alte metode de detectare rapidă a antigenului streptococic:

– detectarea directă din exudatul faringian a streptococilor de grup A: există truse comerciale cu reactivi care pot realiza extracția enzimatică sau chimică a polizaharidului specific de grup A și detectarea antigenului extras prin reacții de aglutinare sau reacții ELISA;

– detectarea directă a streptococilor de grup A din exudatul faringian sau a streptococilor de grup B din hemoculturi prin utilizarea de sonde nucleotidice (sonde ADN comercializate pentru acești germeni).

Antibiograma nu se efectuează pentru ca, deși infecțiile streptococice s-au tratat cu penicilină, până acum nu s-au semnalat cazuri de rezestenta ale acestuia la penicilină. Antibiograma se efectuează doar la persoanele alergice la penicilină.

Diagnosticul imunobiologic are la bază investigarea răspunsului imun umoral și celular.

Răspunsul imun umoral

În vitro

Determinarea anticorpilor antistreptolizina O (ASLO) prin reacția ASLO

Elementele reacției: ser de cercetat (anticorpi antistreptolizina O ?); antigen standard – streptolizină S- (SLO); suspensie de hematii de iepure.

Principiul reacției: prezența anticorpilor antistreptolizina O în serul de testat neutralizează antigenul standard (SLO), care nu-și mai manifestă efectul hemolitic asupra hematiilor (reacție de seroneutralizare).

Titrul reacției: cea mai mare diluție de ser cu hemoliza absentă.

Titrul ASLO normal: 250 unități ASLO/ml. Titrul peste 250 unități ASLO/ml semnifică infecție cu streptococ beta-hemolitic grup A, fie o infecție recentă (în urmă cu 2-3 săptămâni), fie repetate infecții streptococice în antecedente, netratate sau incorect tratate (Debeleac si colab., 2003)

Determinarea anticorpilor anti-MAP se realizează prin reacția de latex-aglutinare. Se fac diluții binare ale serului de bolnav care se pun în contact cu antigenul latex-MAP. Se agită, se incubează acoperit la 370C 2 ore, apoi se lasă la temperatura camerei până a doua zi. Reacție pozitivă înseamnă aglutinare vizibilă cu ochiul liber. Se consideră titrul pozitiv peste 40 U. Anticorpii anti-MAP au o importanță deosebită, fiind singurii anticorpi capabili să protejeze organismul de o nouă infecție streptococică, dar numai față de același tip, imunitatea anti-M fiind specifică de tip. Anticorpii anti-MAP apar la 3-4 săptămâni de la debutul infecției acute și se mențin luni și chiar ani de zile.

Anticorpii anti-MAP se găsesc la titruri foarte ridicate la cei cu RAA și cardită reumatismală, cât și în perioadele de acalmie, servind la diagnosticul acestor complicații, în special în aceste perioade dintre pusee.

Determinarea anticorpilor anticarbohidrat (anti-CHO) se efectuează prin reacția de hemaglutinare pasivă (HAP). În această reacție se pun în contact serul de bolnav diluat binar, cu antigenul standard reprezentat de antigen streptococic grup A extras prin metoda Fuller, antigen cu care se sensibilizează hematii de berbec. Reacția se icubeaza 1 ora la 370C.

Reacție pozitivă înseamnă apariția unei hemaglutinări pe fundul godeului, hamaglutinare care apare sub forma de stea, față de martor unde hematiile sunt dispuse omogen pe fundul godeului. Titrul pozitiv se consudera peste valoarea de 20 U.Anticorpii anticarbohidrat au aceeati semnificație și evoluție ca a anticorpilor anti-MAP.

În vivo

IDR Dick prin care se testează susceptibilitatea la scarlatină (prezența sau absența anticorpilor antitoxină eritrogena). Se injectează 0,1 ml de toxină eritrogena pe față anterioară a antebrațului. La 24-48 de ore se citește reacția. Reacție pozitivă (prezența unui eritem cu diametru mai mare de 10 mm) semnifică lipsa de anticorpi protectori anti-toxina eritrogena, deci susceptibilitatea de a face scarlatină. Reacție negativă (absența eritemului la locul administrării toxinei eritrogene) semnifică prezența anticorpilor protectori anti-toxina eritrogena, deci un organism protejat fasa de o astfel de infecție.

Fenomenul de stingere Schultz-Charlton: diferențiază erupția scarlatinoasă de alte erupții, pe baza neutralizării în vivo a toxinei eritrogene de către serul de convalescent injectat intradermic în zona eruptivă a bolnavului suspect de scarlatină. Dispariția erupției de la locul administrării serului semnifică erupție scarlatiniformă; menținerea erupției semnifică o altă etiologie a erupției decât cea scarlatiniformă.

CAPITOLUL II

ETIOLOGIA INFECȚIILOR DE TRACT RESPIRATOR SUPERIOR EVIDENȚIATĂ PRIN EXUDATUL FARINGIAN – NAZAL

Streptococcus pyogenes, care este responsabil de majoritatea faringitelor bacteriene un rol important în etiologia faringitelor Infecțiile datorate S. pyogenes prezintă importanță medicală prin complicații infecțioase (sinuzite, otite medii, mastoidite, adenite cervicale supurate, flegmon amigdalian, celulită difuză a planșeului bucal-angina Ludwig) sau post-infecțioase (reumatismul cardioarticular acut, glomerulonefrita acută).

Datorită multiplicării și capacității de invazivitate streptococii piogeni sunt patogeni. Asupra tabloului clinic proprietățile biologice ale microorganismelor infectante, poarta de intrare și natura răspunsului imun al gazdei, au o mare influență.

La copilul mic infecția evoluează ca o nazo-faringită subacută cu exudat discret și febră moderată iar la copilul mare și la adult infecția se manifestă acut, fiind prezentă febra mare, cefalee, disfagie, greață, vărsături. Pacienții prezintă faringele puternic congestiv, angină cu variate aspecte ale exudatului (pultaceu, ulcerație cu falsă membrană), uneori peteșii pe palatul moale, frecvent adenită cervicală.

Anual aproape întreaga populație este expus riscului acestor faringite datorită multitudinii serovarurilor M de S.pyogenes, totuși infecțiile sunt mai frecvente la copii până la 12-14 ani.

Faringitele cu tulpini eritrotoxigene de S. pyogenes sunt însoțite cu scarlatină în cazul în care pacienții nu sunt imuni la această toxină. Ocazional și alți streptococi β-hemolitici (grup B, C și G) sunt cauza unor faringite a căror evoluție poate fi gravă.

În cazul rinitelor, în majoritate virale sau nemicrobiene (alergice, mecanice, medicamentoase sau sinuzitelor pentru diagnosticare se recoltează exudatul nazal Rinita microbiană constă în inflamația mucoaselor nazale cu edeme și secreții, produsă de bacterii ( stafilococi, streptococi, pneumococi). Sinuzita reprezintă inflamația mucoasei sinusale, cel mai adesea de natură bacteriană ( S. pneumoniae, S. aureus, S. pyogenes).

Recoltarea exudatului nazo-faringian poate servii, de asemenea, pentru detectarea purtătorilor de S. aureus.

2.1. Materiale și metode de cercetare

Cercetările prezentate în lucrare au fost efectuate în perioada 15 octombrie 2013- 15 aprilie 2014, în laboratorul Spitalului ……………………………….. din București

Contextul teoretic și ipoteza de lucru

Obiectul de studiu: persoane cu ICRS, tulpini bacteriene izolate din exudatul faringian ți nazal

Cercetările au fost organizate și desfășurate în conformitate cu modelul liniar, incluzând următoarele etape: studierea surselor bibliografice de specialitate, definirea problemelor și stabilirea obiectivelor, organizarea și desfășurarea cercetării, colectarea datelor, prelucrarea statistica a datelor.

În realizarea cercetărilor au fost respectate anumite etape:

În prima etapă s-a studiat literatura de specialitate, definirea scopului și obiectivelor, a planului de cercetare, premizele inițierii studiului

Selectarea metodologiei s- făcut în etapa a II-a,

În etapa III s-a trecut la identificarea agenților cauzali a ICRS și determinarea factorilor de virulență și fenotipurilor de rezistență la microorganismele izolate

Etapa-IV afost alocat Analizei și interpretării rezultatelor

Scopul lucrării este prezentarea etapelor diagnosticului infecțiilor de tract respirator superior pe baza analizei microbiologice a exudatului nazo-faringian, la pacienții din ambulatoriu, în vederea stabilirii corecte a terapiei antibacteriene.

Obiectivele lucrării

stabilirea etiologiei infecților de trac respirator superior din ambulator pe baza probelor analizate în laboratorul ……………………………

Prelevarea de exudat faringian și a exudatului nazal la pacienții din ambulatoriu

Izolarea și determinarea serologică de grup a tulpinilor de streptococi beta-hemolitici izolați din probe de exudat faringian

Izolarea pneumococilor din probe de exudat nazal

Izolarea S. aureus, tulpini MRSA, din probe de exudat nazal

Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor de streptoci beta-hemolitici izolați din probe de exudat faringian, a pneumococilor și a S.aureus, tulpini MRSA, izolați din exudat nazal

2.1.1. Metode și materiale folosite

Materiale folosite:

• apăsător de limbă steril

• mască

• tampon steril cu mediu de transport pentru recoltarea exudatului faringian

• medii de cultură cu geloză și suplimentate cu 5% sânge de berbec, COS (Gelose Columbia-sânge)

• MSA=Gelose -Chapman (manitol,salt,agar) mediu selectiv pentru creșterea stafilococilor

• medii Mueller-Hinton Agar suplimentate cu 5% sânge de berbec pentru realizarea antibiogramei

• ser fiziologic steril

• anse sterile

• eprubete sterile

• discuri cu antibiotice

• trusă pentru identificarea grupului antigenic (Streptococcal Grouping Kit)

• trusă pentru testul coagulazei

• termostat

Metodele de lucru folosite:

Metodologia de prelevare a probelor clinice

Recoltarea exudatului faringian

Pacientul a fost așezat pe un scaun, cu fața spre lumină și gâtul în ușoară extensie. S-a realizat deprimarea limbii cu apăsătorul steril și, în timp ce pacientul pronunță vocala A, s-a șters cu tamponul ferm, amigdalele și peretele posterior al faringelui, vizând în special orice zonă inflamată, ulcerată, depozite purulente.

Recoltarea exudatului nazal

Pacientul a fost așezat pe scaun, cu fața spre lumină și ceafa sprijinită de perete pentru imobilizarea capului. S-a introdus blând tamponul într-o nară, în lungul planșeului nazal, până a atins peretele posterior al nazo-faringelui. Tamponul a fost lăsat pe loc câteva secunde, apoi s-a rotit ușor pentru a-l încărca cu exudat și a fost apoi retras.

Izolarea tulpinilor de streptococ β-hemolitic, a tulpinilor de pneumococ și a tulpinilor de S. aureus din probele de exudat faringian și nazal

Probele de exudat faringian si nazal au fost însămânțate pe medii cu geloză ce conține 5% sânge de berbec (mediul Gelose-Columbia-sânge ) și pe mediul MSA, mediul Chapman. S-a descărcat tamponul de exudat pe un cadran al plăcii cu mediul de cultură, apoi s-a realizat însămânțarea prin tehnica striurilor în poligon.

Incubarea: După însămânțare, plăcile cu mediul Gelose-Columbia-sânge (COS) au fost incubate în exicator cu 5% CO2 la 37ºC timp de 24 ore. Plăcile cu mediul MSA ( mediul Chapman ) au fost incubate în termostat la 37º C, timp de 24 ore.

Interpretarea rezultatelor

După o perioadă de 24 ore de incubare plăcile însămânțate au fost scoase din termostat și analizate. s-a notat creșterea coloniilor de microorganisme pe mediul cos (geloză-sânge), caracterele de cultură, colonii ce prezintă hemoliză β și α. Coloniile cu aspect morfologic caracteristic streptococilor și cele cu aspect morfologic caracteristic stafilococilor, au fost prelevate și repicate pe medii COS ( geloză-sânge) apoi incubate cu 5% CO2, la 37ºC, timp de 24 ore.

Determinarea apartenenței de grup a tulpinilor de streptococ izolate: Pentru determinarea grupului antigenic a tulpinilor de streptococ izolate s-a folosit o trusă specială, Streptococcal Grouping Kit.

Tehnica de lucru: inițial s-a pregătit o suspensie ce conține 2-3 colonii β-hemolitice și 3 ml enzimă care provoacă liza peretelui celular al bacteriei. Timp de 10 minute s-a incubat la termostat.

Pe o plăcuță standard cu 6 spații delimitate din suspensia pregătită s-a distribuit câte 3 picături în fiecare spațiu. În fiecare spațiu de asemenea s-a adăugat antiserul corespunzător grupului A, B, C, D, F și G, în această ordine, considerând tulpina pentru care s-a realizat testul, aparține grupului ce corespunde spațiului în care s-a observat în timp de 1 minut o reacție de aglutinare.

Fig.9. Streptococ β-hemolitic de grup C.

Identificarea pneumococilor prin testul sensibilității la optochin

Din probele de exudat nazal însămânțate pe mediul geloză-Columbia-sânge și incubate în exicator, în prezența de 5% CO2 la 37º C timp de 24 ore, s-a observat creșterea coloniilor ce prezintă α-hemoliză ( hemoliză viridans). Din aceste colonii s-au realizat repicări pe mediul geloză-Columbia-sânge și în mijlocul zonei de repicare s-a atașat un disc de optochin. Aceste plăci au fost incubate în exicator, în prezența de 5% CO2 la 37ºC, timp de 24 ore. La probele care au prezentat sensibilitate la optochin ( S.pneumoniae-prezent), s-a realizat antibiograma.

Identificarea S. aureus: Din probele de exudat nazal însămânțate pe mediul geloză-Columbia-sânge sau mediul Chapman, s-a observat creșterea coloniilor cu aspect caracteristic stafilococilor. După repicare pe mediul geloză-Columbia-sânge și obținerea de cultură pură, s-au identificat tulpinile de S. aureus prin testul coagulazei. S-a folosit o trusă specială. La probele cu stafilococi coagulază-pozitivi s-a realizat antibiograma.

Fig.10.Testul coagulazei.

Determinarea spectrului de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor de streptococ β-hemolitic, a tulpinilor de pneumococ și de S. aureus

Pentru tulpinile de streptococ β-hemolitic de grup A (S. pyogenes), de grup C și de grup G, antibioticul de elecție este penicilina. În aceste cazuri s-a realizat testarea sensibilității la eritromicină, ca alternativă pentru tratarea pacienților care pot fi alergici la penicilină.

Pentru tulpinile de pneumococ identificate, s-a realizat antibiograma în vederea stabilirii terapiei antibacteriene.

În cazul S. aureus s-a efectuat testarea sensibilității la cefoxitin pentru identificarea tulpinilor MRSA ( meticilino-rezistente ). Antibiograma s-a realizat prin metoda difuzimetrică.

Tehnica de lucru:

• S-a realizat un inocul standardizat (0,5-07 McFarland) din cultura pura în 3 ml de AFS.

• Prin tehnica însămânțării în pânză, inoculul standardizat din cultura de pneumococ a fost însămânțat pe mediul Mueller-Hinton-sânge, și pe mediul Mueller-Hinton II din cultura de S. aureus, utilizând un tampon steril.

• Plăcile însămânțate au fost lăsate 5 minute la temperatura camerei pentru absorbția inoculului.

• Au fost plasate discuri cu antibiotice pe plăcile însămânțate (maxim 8 discuri cu antibiotic pe o placă) și apoi lăsate 5-15 minute la temperatura camerei pentru depunerea discurilor.

• Plăcile cu mediul Mueller-Hinton-sânge au fost incubate în exicator cu 5%CO2 si la termostat, la 37ºC timp de 24 ore, iar cele Mueller-Hinton II, în termostat, la 37ºC timp de 24 ore.

• Dupa incubare plăcile au fost scoase din termostat și analizate. S-a măsurat cu rigla gradată în mm diametrul zonelor de inhibiție completă din jurul fiecărui disc cu antibiotic. S-a verificat dacă diametrul zonelor de inhibiție a fiecărui disc de antibiotic se cuprinde în limitele variației admise conform tabelelor universale, standardul CLSI (Clinical Laboratory Standards Institute- 2013).

• Pentru realizarea antibiogramei au fost folosite următoarele antibiotice:

Pentru S. pneumoniae s-au folosit următoarele antibiotice: Penicilină 10 unitati; Ofloxacin 5 μg ; Chloramfenicol 30 μg; Clindamicină 2 μg; Tetraciclină 30 μg; Eritromicină 15 μg; Ceftriaxon 30 μg; Vancomicină 30 μg;

• Pentru S. aureus s-au folosit urmatoarele antibiotice:

Cefoxitin 30 μg ; Oxacilină 1 μg ; Ciprofloxacin 5μg ; Eritromicină 15μg; Rifampicina 30 μg; Clindamicină 2 μg ; Cefazolin 30 μg; Sulfametoxazol/Thrimetoprim 1,25/23,75 μg

S.aureus a fost raportat doar în cazul în care s-a găsit rezistență la Cefoxitin ( tulpină MRSA).

2.1.2. Rezultate

În perioada 15.10.2013-15.04.2014 s-au recoltat probe de exudat faringian și nazal la 510 pacienți din ambulatoriu, în laboratorul …………………………………. Din 510 de probe, 382 au fost negative pentru agenții etiologici ai infecțiilor de tract respirator superior, aceste cazuri reprezentând infecții de natură virală (cca 74,9 % ).

Etiologia infecțiilor de tract respirator superior este în general infecțioasă, cu 60-80% cazuri de origine virală și circa 30-40% cazuri de origine bacteriană.

Dintre infecțiile tractului respirator superior cele mai frecvente sunt faringitele, 70% din cazurile de faringită acută fiind de natură virală. Streptococcus pyogenes ( streptococul β-hemlotic de grup A) este principalul agent etiologic al anginei bacteriene acute, alături de streptococii de grup B, C și G ( Chifiriuc, 2011).

Fig.11. Streptococ β-hemolitic și S.aureus pe geloză-sânge

Etiologia nazofaringitelor , rinitelor și sinuzitelor este dominată de S. pneumoniae și într-o mai mică măsură de S. aureus.

Fig.12. Testul sensibilității la optochin (stânga) si cultură de S. aureus (dreapta), pe mediul geloză-sânge

De asemenea principalii agenți etiologici ai otitelor medii sunt S. pneumoniae și S. pyogenes, mai rar pot fi în cauză S. aureus sau/și bacterii anaerobe.

Ocazional, la adult cauză a epiglotitei acute pot fi streptococii, stafilococii sau pneumococii ( Buiuc, 2008).

Incidența infecțiilor de tract respirator superior este considerabil mai mare în rândul populației pedriatice .

Fig. 13. Incidența ICRS în funcție de vârstă

În anumite populații peste 30% din indivizi pot prezenta colonizare faringiană asimptomatică cu streptococi de grup A. Nu există un ghid de tratament definitiv pentru acești purtători asimptomatici sau pentru indivizii asimptomatici care prezintă o cultură faringiană pozitivă după un tratament complet pentru faringită simptomatică. Studii asupra istoricului natural al stării de purtător streptococic și asupra infecției au arătat că atât riscul de a dezvolta reumatism articular acut, cât și cel de a transmite infecția la alte persoane este substanțial mai mic la purtătorii asimptomatici decât la persoanele cu faringită simptomatică.

De asemenea în colectivitatea generală circa 30% din indivizi pot prezenta portaj de S. aureus, iar la personalul de spital rata portajului poate ajunge până la 70%. Determinarea portajului cu tulpini de S.aureus rezistente la meticilină prezintă importanță deoarece o mare parte dintre pacienții colonizați vor dezvolta infecții: bacteriemii, infecții pulmonare ( Buiuc,2003).

Din 510 probe de exudat nazo-faringian, 25,1% au fost pozitive pentru agenții etiologici ai infecțiilor de tract respirator superior.

Tabel nr. 2 Agenți etiologici ai infecțiilor de tract respirator superior, identificați în probele de exudat nazo-faringian recoltate

Fig. 14 Microrganisme identificate în probele relevate

În exudatele faringiene au fost identificați streptococi β-hemolitici de grup A la 42 de pacienți iar de grup C și G la 26 pacienti. În aceste cazuri s-a realizat testarea sensibilității la eritromicină, ca alternativă pentru tratamentul pacienților care pot fi alergici la penicilină. Prezența streptococului β-hemolitic de grup B și a stafilococului auriu nu a fost identificată în probele de exudat faringian.

Fig.15.Testarea sensibilității la eritromicină la o tulpină de streptococ de grup A pe mediul Mueller-Hinton-sânge .

În exudatele nazale predominant au fost identificate tulpini de S. aureus la 31 de pacienți, dintre care 12 tulpini au prezentat rezistență la cefoxitin (tulpini MRSA), alături de S. pneumoniae identificat la 17 pacienți. S. aureus prezintă un spectru larg de interacțiuni cu gazda umană. Acesta poate face parte din microbiota normală sau pot determina o varietate de afecțiuni de la infecții cutanate și țesuturilor moi, boli grave ce pot pune în pericol viața, cum ar fi pneumonia necrozantă, bacteriemie, osteomielită, sindromul de șoc toxic, și meningita (Sibbald și colab., 2006).

S. aureus posedă numeroși factori de virulență, adezine de suprafață exo-proteine ​​și toxine (Dinges și colab., 2000; Fedtke și colab., 2004 ; McCormick și colab., 2001 ; Palmqvist și colab., 2004).

O altă caracteristică importantă a tulpinilor de S. aureus este capacitatea de a dobândi rezistență la agenții antimicrobieni. Prima tulpină de S. aureus meticilino-rezistentă (MRSA) a fost raportată în 1960 și de atunci prevalența MRSA a crescut în toate regiunile analizate, cu cifre diferite, chiar în cadrul aceleiași țări (Jevons, 1961; Voss și colab., 1994).

Rezistența la meticilină este conferită de gena mecA ce codifică pentru o proteină ce leagă penicilina, și anume, proteina 2a (PBP 2a), cu afinitate redusă pentru agenți β-lactamici. Această genă este situată pe un element genetic mobil de dimensiuni variabile numit caseta mecA localizată cromozomal (SCCmec). Până în prezent, șapte tipuri și mai multe subtipuri de SCCmec au fost caracterizate (Deurenberg și Stobberingh, 2008; Herold și colab., 1998; Oliveira și de Lencastre, 2002; Ito și colab., 2001).

Începând cu anul 1990 au fost raportate un număr tot mai mare de infecții în care au fost implicate tulpini de MRSA în comunitate, mai ales la copii și adulți tineri, fără factori de risc clasici implicați în infecțiile cu S. aureus meticilino-rezistent asociate asistenței medicale (CDCP, 1999; Eady și Cove, 2003; Lowy, 1998; Naimi și colab., 2003).

Aceste tulpini au fost numite CA-MRSA (comunitate-asociate S. aureus meticilino-rezistent). În general, tulpinile HA-MRSA (health-associated-MRSA) sunt rezistente și la alte antibiotice, CA-MRSA sunt în majoritate rezistente numai.la meticilină. HA-MRSA izolate frecvent poartă tipurile I, II și III SSCmec, în timp ce tulpini de CA-MRSA poartă tipurile IV, V, VI și VII. Spre deosebire de HA-MRSA, majoritatea tulpinilor CA-MRSA poartă genele luks-F ce codifică pentru leucocidina Panton-Valentine (PVL) (Groom și colab., 2001)

Fig.16.Antibiograma la S.aureus: tulpină MSSA.

Fig. 17. Antibiograma la S.aureus: tulpină MRSA.

S.aureus a fost raportat doar în cazul în care s-a găsit rezistență la cefoxitin ( tulpină MRSA).

În tabelul nr. 4 s-a reprezentat grafic spectrul de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor de S. aureus identificate.

Dintre tulpinile de S. aureus testate 10 au prezentat rezistență la sulfametoxazol/trimetoprim și doar una la ciprofloxacin.

Fig. 18. Spectrul de sensibilitate la antibiotice a tulpinilor de S. aureus identificate.

Tulpini MRSA au fost în număr de 12. Acestea au prezentat rezistență la cefoxitin și oxacilină,și implicit la cefazolin.

Concluzii

Analiza microbiologică a exudatului nazo-faringian în laboratorul CMIML Dr. Stoica Florisanda, la 510 pacienți din ambulatoriu a relevat faptul că 25,1% (128) din infecțiile tractului respirator superior au fost de origine bacteriană. S. pyogenes a fost cel mai frecvent izolat în exudatul faringian, fiind identificat în 32,8% din infecțiile bacteriene de tract respirator; testele serologice au identificat streptococi β-hemolitici aparținând grupelor serologice C și G în 20,3% din infecții.

Testele microbiologice au pus în evidență în exudatul nazal tulpini de S. pneumoniae la 13,28% din pacienți și tulpini de S. aureus la 43 pacienți (33,59%).

Testările de antibiosensibilitate prin metoda difuzimetrică pentru tulpinile de S. aureus izolate au indicat o rată înaltă a rezistenței acestor tulpini la trimetoprim sulfametoxazol (41,66%), tulpinile au fost de asemenea rezistente la cefoxitin și oxacilină (33,33%), eritromicină (20,83%), clindamicin (16,66%), rifampicin (12,5%), cefazolin (33,33%) și ciprofloxacin (4,16%). Tulpinile si-au păstrat sensibilitatea la vancomicină, teicoplanină, linezolid și rifampicină. 27,9% dintre tulpinile de S. aureus au fost interpretate ca MRSA.

Prevalența tulpinilor de MRSA în comunitate poate să fie subestimată, acest lucru datorându-se în parte faptului că exudatul nazal nu constituie o analiză de rutină. Emergența tulpinilor de MRSA în comunitate are implicații importante în managementul infecțiilor cauzate de tulpinile de S. aureus, putând constitui un rezervor de tulpini MRSA pentru unitățile spitalicești.

Bibliografie

=== cuprinѕ ===

Cuprins

Introducere

CAPITOLUL I. STADIUL CUNOAȘTERII ÎN DOMENIUL INFECȚIILOR

TRACTULUI RESPIRATOR SUPERIOR

Infectii streptococice

Etiologie

Epidemiologie

1.1.3. Patogenie

Tablou clinic

1.1.5. Streptococii de grup B – Streptococcus agalactiae

Streptococii negrupabili

1.2. Diagnosticul de laborator al infecțiilor produse de streptococi

1.3. Exudatul faringian

CAPITOLUL II. ETIOLOGIA INFECȚIILOR DE TRACT RESPIRATOR SUPERIOR EVIDENȚIATĂ PRIN EXUDATUL FARINGIAN – NAZAL

2.1. Materiale și metode de cercetare

2.1.1. Metode și materiale folosite

2.2. Rezultate

Concluzii

Bibliografie