Enzime Pectinolitice de Origine Microbiana

Enzime pectinolitice de origine microbiană

D. Dinu

Universitatea din București, Facultatea de Biologie, Spl. Independenței nr. 91-95, București

Introducere

Reacțiile biochimice, reacții deosebit de complexe și variate, sunt mediate de biocatalizatori cu proprietăți remarcabile, cunoscuți sub denumirea de enzime. Capacitatea enzimelor de a crește de până la 1014ori viteza unei reacții, condițiile blânde de acțiune, specificitatea și posibilitatea de reglare a activității, constitue un avantaj major al acestora. Aplicațiile practice ale enzimelor în diferite sectoare de activitate au condus la necesitatea obținerii în cantități mari de preparate enzimatice cu diferite activități catalitice. În producția mondială de enzime un loc de frunte îl ocupă tehnologiile care vizează obținerea de preparate proteice cu activitate pectinolitică. Dezvoltarea biotehnologiilor care urmăresc găsirea de noi surse de izolare a enzimelor pectinolitice este o consecință firească a implicării și eficienței acestora în diferite procese. Numeroasele utilizări ale enzimelor pectinolitice în cele mai diverse domenii de activitate – industria alimentară, industria prelucrării fibrelor naturale, industria farmaceutică, industria chimică – au determinat demararea cercetărilor în vederea obținerii acestora din surse microbiene. Orientarea către microorganisme a avut în vedere avantajele oferite de astfel de surse și proprietățile enzimelor pectinolitice de origine microbiană.

Larga răspândire, variabilitatea, adaptabilitatea și potențialul de biosinteză al microorganismelor pot fi considerate puncte de plecare pentru noi cercetări consacrate descoperirii și manipulării unor agenți cu proprietăți superioare.

Pectinele, substraturi ale enzimelor pectinolitice

Substanțele pectice reprezintă un grup heterogen de polizaharide cu un conținut mare de sarcini negative datorate resturilor de acid galacturonic din structură. Celulele plantelor aflate în diferite stadii de dezvoltare sunt acoperite de un perete extensibil. În structura peretelui celular microfifrilele de celuloză sunt legate necovalent la o matrice alcătuită din hemiceluloze, pectine și proteine structurale.

Studiile intreprinse asupra pereților celulari de proveniență diferită au evidențiat un aranjament caracteristic al principalelor componente ale acestora (Albersheim 1975, Cosgrove 1997, Capita și alții 2001). În acest aranjament, moleculele adiacente de celuloză aderă puternic prin legături de hidrogen și formează agregate cristaline, numite microfibrile de celuloză. Microfibrilele de celuloză sunt principalii determinanți ai rezistenței peretelui celular. Seturile de microfibrile sunt aranjate în straturi sau lamele în structura cărora fiecare microfibrilă se leagă de vecina sa prin molecule de hemiceluloză. Hemicelulozele sunt heteropolizaharide care se leagă la suprafața microfibrilelor de celuloză, mai ales prin legături de hidrogen. Hemicelulozele ajută la legarea încrucișată a microfibrilelor într-o rețea complexă și previn contactul direct microfibrilă-microfibrilă. Alături de această rețea alcătuită din microfibrile celulozice și hemiceluloze, peretele celular conține și o altă rețea formată din molecule de pectină legate încrucișat. Pectinele formează un gel în jurul rețelei celuloză-hemiceluloză și acționează ca un material de umplutură care previne agregarea și ruperea acestei rețele. Prin intermediul substanțelor pectice peretele celular își modulează porozitatea pentru diferite macromolecule. Datorită sarcinii lor negative, pectinele sunt puternic hidratate și înconjurate de cationi, în special de Ca2+. Substanțele pectice se găsesc din abundență în lamela mijlocie, fiind agenți de cimentare intercelulară prin intermediul legăturilor încrucișate formate între ionii de calciu și catenele pectice din structura a doi pereți adiacenți.

Aranjamentul principalelor componente în cadrul unui perete celular primar este prezentat în Figura 1.

Substanțele pectice sunt macromolecule complexe în structura cărora acidul D-galacturonic este componentul principal. Catena polizaharidică centrală are unitățile de -D-galacturonat legate (14) și conține 2-4% unități de L-ramnoză (aproximativ câte una la 25 unități galacturonice) legate -(14) și -(12) la resturile de acid galacturonic. Catenele laterale sunt de două feluri: lungi, alcătuite din acid galacturonic (galacturonani) sau din resturi de L-arabinoză (arabinani) și scurte, alcătuite din resturi de D-galactoză, D-xiloză sau L-fucoză. În structura substanțelor pectice au fost evidențiate două tipuri de regiuni: o regiune “grea“, alcătuită din catene ramnogalacturonanice puternic substituite cu zaharuri neutre și o regiune “ușoară“ în structura căreia există, în special, catene homogalacturonanice.

Multe din grupările carboxil din structura resturilor de acid galacturonic sunt esterificate cu metanol. Gradul de esterificare variază cu sursa biologică și cu agentul utilizat pentru extracția substanțelor pectice. Au fost izolate și caracterizate și substanțe pectice care au câteva din resturile de acid galacturonic acetilate.

Figura 1. Aranjamentul principalilor constituenți ai peretelui celular primar.

Gradul de esterificare, proporția de zaharuri neutre și gradul de policondensare sunt principalele elemente ale heterogenității substanțelor pectice de diferite origini (Dick și alții 1989, MacKinnan și alții 2002). Deesterificarea, proces care se poate realiza chimic sau enzimatic, determină asamblarea macromoleculelor pectice prin intermediul ionilor de Ca2+. Acest proces afectează semificativ proprietățile fizico-chimice ale pectinelor, și, implicit, arhitectura pereților celulari (Braccini și alții 2001, Barnavon și alții 2001, Ralet și alții 2001, Camara și alții 2002)

Clasificarea substanțelor pectice se face după mai multe criterii. După solubilitatea lor în diferite medii, substanțele pectice au fost împărțite în trei categorii:

substanțe pectice solubile în apă (pectine înalt metilate sau acizi pectinici);

substanțe pectice solubile în soluții care complexează ionii de calciu ca de exemplu EDTA, oxalat de amoniu (pectine slab metilate sau acizi pectici);

substanțe pectice insolubile în apă (protopectinele), considerate o formă nativă a acestor biomolecule. Insolubilitatea protopectinei se datorează atât mărimii policondensatului, cât și legăturilor ce o caracterizează. În structura protopectinei există rețele complexe de catene poligalacturonice asociate între ele prin legături ionice stabilite între un ion bivalent (în special calciu) și două grupări carboxil. Protopectina se leagă, prin legături de hidrogen, de celelalte componente din pereții celulari. Protopectina poate fi solubilizată cu acizi diluați, la cald.

O altă clasificare a substanțelor pectice are în vedere gradul de esterificare a grupărilor carboxil din structură. După acest criteriu, substanțele pectice au fost împărțite în:

pectine înalt metilate (HMP) cu au un grad de metilare de peste 50%

pectine slab metilate (LMP) cu au un grad de metilare de sub 50%.

Izolarea și caracterizarea pectinelor din diferite țesuturi vegetale a evidențiat prezența în pereții celulari a mai multor tipuri de substanțe pectice. În funcție de structură, substanțele pectice au fost clasificate de ONeill (1990) în:

homogalacturonani – catene de resturi de acid galacturonic legate -(14) glicozidic, metilate sau nemetilate;

ramnogalacturonani de tipul I (RG-I) – o familie de polizaharide înrudite, la care catena de bază are o structură de forma: 4)–D-Galp A-(12)- -L-Rhap-(1. Aproximativ 50% din resturile de ramnoză din structură sunt substituite la C-4 cu oligozaharide neutre (galactoză, arabinoză și puțină fucoză);

ramnogalacturonani de tipul II (RG-II) – în structura cărora unele resturi de acid galacturonic au atașate la C-2 sau C-3 aldo și ceto oligozaharide;

arabinani, galactani și arabinogalactani, care alcătuiesc catenele laterale a polizaharidelor pectice.

Substanțele pectice se găsesc aproape în toate organele plantelor. Aceste polizaharide sunt componentele majore ale pereților primari ai dicotiledonatelor și monocotiledonatelor. Pereții celulari ai graminaceelor conțin cantități mai mici de substanțe pectice. Cantități mari de substanțe pectice se găsesc în pulpa fructelor cărnoase (mere, pere, ananas) precum și în sfecla de zahăr.

Cantități importante de substanțe pectice au fost determinate în diferite deșeuri rezultate în industria alimentară (coji de citrice, borhot de sfeclă, tărâțe de grău, resturi de pulpă de fructe). Prezența substanțelor pectice în aceste deșeuri justifică utilizarea acestora ca inductori ai enzimelor pectinolitice microbiene.

Clasificarea și nomenclatura enzimelor pectinolitice

În general, în categoria enzimelor pectinolitice sunt incluse enzimele care acționează asupra homogalacturonanilor și ramnogalacturonanilor.

Enzimele pectinolitice cuprind: o esterază, șapte poligalacturonaze (nume generic preluat după Whitaker, 1990) și patru liaze. Dintre acestea numai o parte sunt incluse în Enzyme Nomenclature și au număr de cod. Clasificarea și nomenclatura enzimelor pectinolitice este prezentată în Tabelul 1.

Unii cercetători au inclus -D-arabinofuranozidaza și endoarabinaza, enzime care acționează asupra arabinanilor din structura substanțelor pectice, în categoria enzimelor pectinolitice. Majoritatea enzimologilor și microbiologilor nu sunt familiarizați cu aceste două enzime, enzime care nu au fost incluse în nici un volum din seria Methods in Enzymology.

Modul de acțiune al principalelor enzime pectinolitice (endopoligalacturonaza, exopoligalacturonaza, endopectat liaza, exopectat liaza, pectin liaza și pectinesteraza) este prezentat în Figura 2.

Cercetări recente au evidențiat existența altor două enzime implicate în degradarea polimerilor pectici, ramnogalacturonaza și -1,4-D- galactanaza. Unele tulpini de Aspergillus aculeatus biosintetizează o ramnogalacturonază, enzimă care scindează legăturile dintre resturile de acid galacturonic și cele de ramnoză din structura ramnogalacturonanilor pectici (Beldman și alții 1996, Hennink și alții 1996). Yamaguchi (1995) a izolat din culturile de Aspergillus niger o endo–1,4-D- galactanaza, proteină cu masă moleculară de 32 000 Da, care hidrolizează polizaharidele pectice din soia cu eliminare de oligomeri galactozidici și galactoză. O tulpină de Echerichia coli s-a dovedit a fi capabilă să biosintetizeze o pectin acetil esterază (Shevchik și alții 1997).

3. Surse de izolare ale enzimelor pectinolitice

Enzimele pectinolitice sunt larg răspândite la microorganisme și la plantele superioare.

Ele joacă un rol important în procesele de creștere, în plantele superioare permițând elongația celulelor. Enzimele pectinolitice de origine vegetală sunt implicate în procesele de înmuiere a țesuturilor în timpul maturării și stocării. Endopoligalacturonazele, exopoligalacturonazele, pectinesterazele apar, separat sau împreună, în diferite organe ale plantelor. Din surse vegetale nu au fost izolate proteine cu activitate pectat, sau pectin liazică.

Enzimele pectinolitice au fost separate și caracterizate din: roșii, cireșe, piersici, portocale, grepfruit, papaia, mango, soia, in, măsline, polen.

Prezența enzimelor pectinolitice a fost semnalată și la insecte. În larvele de Conotrachelus nenuphar a fost semnalată prezența pectinesterazei, endopoligalacturonazei, pectat liazei și pectin liazei. Aceste enzime sunt eliberate atunci când larvele se hrănesc, fiind capabile să producă o macerare a țesuturilor fructelor și, împreună cu celulazele, sunt responsabile de căderea prematură a merelor și prunelor infectate de aceste larve. Activitatea poligalacturonazică a fost decelată în saliva ploșniței verde, Schizaphis graminum și în cea a gărgăriței orezului, Sitopilulus oryzae.

Un număr mare de agenți patogeni ai plantelor, în special fungi și bacterii, produc enzime pectinolitice. Acestea, împreEnzimele pectinolitice au fost separate și caracterizate din: roșii, cireșe, piersici, portocale, grepfruit, papaia, mango, soia, in, măsline, polen.

Prezența enzimelor pectinolitice a fost semnalată și la insecte. În larvele de Conotrachelus nenuphar a fost semnalată prezența pectinesterazei, endopoligalacturonazei, pectat liazei și pectin liazei. Aceste enzime sunt eliberate atunci când larvele se hrănesc, fiind capabile să producă o macerare a țesuturilor fructelor și, împreună cu celulazele, sunt responsabile de căderea prematură a merelor și prunelor infectate de aceste larve. Activitatea poligalacturonazică a fost decelată în saliva ploșniței verde, Schizaphis graminum și în cea a gărgăriței orezului, Sitopilulus oryzae.

Un număr mare de agenți patogeni ai plantelor, în special fungi și bacterii, produc enzime pectinolitice. Acestea, împreună cu alte proteine, trec în mediul interior al gazdei și joacă un rol important în procesele de colonizare și infectare a plantelor. Majoritatea microorganismelor investigate produc cel puțin două tipuri de enzime pectinolitice cu acțiune sinergică care formează un sistem activ de degradare a polimerilor pectici. Majoritatea enzimelor pectinolitice de origine microbiană sunt inductibile, fiecare tip de enzimă având inductori specifici.

Figura 2. Modelul unei molecule de pectină și de pectat. Punctele de atac ale enzimelor pectinolitice.

Din clasa fungilor, speciile de Aspergillus sunt cele mai bune producătoare de enzime pectinolitice. Acestea biosintetizează în cantități mari endo și exopoligalacturonaze. Poligalacturonazele de la Aspergillus sp. prezintă forme moleculare multiple cu un determinism genetic diferit (Statilova și alții 1993). Unele Aspergillus sp., ca de exemplu Aspergillus niger, cultivate pe medii corespunzătoare, produc și pectinesteraze, pectat sau pectin liaze (Dinu și alții 1997, Dinu și alții 1998).

Alte specii de fungi producătoare de enzime pectinolitice sunt: Botrytis cinerea (ten Have și alții 2001, Rho și alții 2001), Fusarium sp. (Garcia-Marceira și alții 2001, Niture și alții 2001), Penicillium sp. (Chelegatti și alții 2000), Verticillium sp. (James și alții 2001).

Diferite specii de bacterii, (Cellovibrio, Clostridium, Erwinia, Lactobacillus, Pseudomonas), produc una sau mai multe tipuri de enzime pectinolitice. Echipamentul pectinolitic al acestora este diferit de cel al fungiilor. Bacteriile și fungii secretă poligalacturonaze și pectinesteraze. Diferența între cele două clase constâ în tipul de enzime care acționează asupra polizaharidelor pectice prin mecanisme de transeliminare: pectin liazele sunt enzime caracteristice fungilor, iar pectat liazele apar cu precădere la bacterii.

Enterobacteria Erwinia chrysanthemi realizează degradarea substanțelor pectice din pereții celulari ai plantelor invadate prin intermediul mai multor tipuri de enzime: pectin metilesteraza, pectin acetilesteraza, pectat liaza și pectin liaza. Erwinia chrysanthemi se caracterizează prin abilitatea de a secreta mai multe izoenzime ale endopectat liazei, izoenzime care au un rol major în procesele de putrezire a plantelor infestate cu această bacterie. De la o tulpină de Erwinia chrysanthemi au fost caracterizate opt endopectat liaze, respectiv PelA, PelB, PelC, PelD, PelE, PelI, PelL și PelZ și o exopectat liază, PelX. Primele cinci forme aparțin familiei 1 de pectat liaze, familie care include pectat liaze bacteriene și pectin liaze fungice, enzime cu structură primară asemănătoare. PelI aparține familiei 2, familie în care sunt încadrate liaze de la Erwinia carotovora. PelL și PelX fac parte din familia 4, iar PelZ din familia 5.

Diversificarea biotehnologiilor care utilizează enzime pectinolitice și nevoia tot mai mare de preparate enzimatice cu activitate pectinolitică complexă, au determinat găsirea de noi surse microbiene care să producă astfel de enzime. Această necesitate a determinat extinderea cercetărilor și la drojdii. Cercetări recente au arătat că unele specii de drojdii, cultivate pe medii care conțin substanțe pectice, sunt producătoare de enzime pectinolitice. Drojdia metilotrofă Candida boidinii biosintetizează poligalacturonază, pectinesterază, pectin și pectat liază (Nakagawa și alții 2000), Kluyveromyces marxianus numai poligalacturonază (Jia și alții 2000), iar unele specii de Saccharomyces – poligalacturonază, pectinesterază și pectin liază (Gomes și alții 2001).

Majoritatea enzimelor pectinolitice produse de microorganisme sunt inductibile. Fiecare tip de enzimă are inductori specifici. Penicillium frequentans, crescut pe medii în care sursa de carbon a fost pectina, poligalacturonatul de sodiu sau acidul galacturonic, a biosintetizat 11 poligalacturonaze și 3 pectinesteraze. Același microorganism cultivat pe mediu de glucoză a produs 2 poligalacturonaze și o pectinesterază (Chellegatti și alții 2000).

Tehnica DNA recombinat a fost utilizată pentru a obține tulpini înalt producătoare de enzime pectinolitice. Khahn (1991) a clonat gena care codifică pectinesteraza, a expresat-o la o tulpină sălbatică de Aspergillus niger, ceea ce a condus la o creștere de douăzeci de ori a activității esterazice. Genele care codifică endopoligalacturonaze fungice au fost clonate, secvențializate și expresate la drojdii de tipul Saccharomzces cerevisiae și Kluyveromzces marxianus (Jia și alții 2000, Vilanova și alții 2000).

Enzimele pectinolitice de origine microbiană: specificitate, mecanism de acțiune, structură, proprietăți

Pectinesterazele

Pectinesterazele (EC 3.1.1.11) hidrolizează pectinele îndepărtând grupări metoxi de la grupările 6-carboxilice ale resturilor de acid galacturonic.

Aceste enzime prezintă specificitate de grup, recunoscând din structura substratului partea D-galacturonică și legătura esterică. Elucidarea specificităății manifestate de pectinesteraze s-a realizat prin studii pe pectine modificate chimic. Studiile întreprinse cu pectine în care o parte din grupările carboxil sunt reduse sau pe metilesterii acidului alginic au arătat imposibilitatea pectinesterazelor de a hidroliza astfel de substraturi. Aceste experimente au evidențiat înalta specificitate a acestor enzime față de structuri poli-D-galacturonanice. Specificitatea față de partea alcoolică este mai redusă, pectinesterazele fiind capabile să hidrolizeze cu viteze mai mici, etil, propil și alil esterii acidului pectinic. Viteza de hidroliză a substratului este influențată și de gradul de policondensare al acestuia, diminuându-se odată cu scăderea acestuia (Rexová-Benková și alții 1976).

Mecanismele prin care acționează pectinesterazele au fost elucidate pe baza experimentelor întreprinse de Miller și colaboratorii (1971). Studiile în acest sens au fost realizate pe pectină cu grad de policondensare 33 și grad de esterificare 96%. Substratul a fost supus inițial acțiunii unei exopectat liaze purificată din Clostridium multifermentans, enzimă care acționează secvențial de la capătul reducător. Acțiunea liazei asupra substratelor înalt esterificate a fost neglijabilă, dar a crescut rapid la adiția unei pectinesteraze purificate din Fusarim oxysporum. În urma acestor experimente, s-a tras concluzia că, majoritatea acțiunii esterazei decurge la capătul reducător al moleculei de pectină. Monitorizarea simultană și continuă a celor două tipuri de activități pectinolitice a indicat că 57% din activitatea pectinesterazei din Fusarim oxysporum decurge de la capătul reducător al substratului. Experimente similare întreprinse cu o proteină multienzimatică purificată din Clostridium multifermentans, care posedă activitate esterazică și exopectat liazică, au arătat că, în cazul acestui microorganism, deesterificarea pectinei înalt metilate decurge exclusiv de la capătul reducător.

Modul de acțiune și specificitatea pectinesterazei din Aspergillus niger au fost studiate de Kester și colaboratorii (2000) utilizând oligogalacturonați total metilați cu grade de condensare cuprinse între 2 și 6 (Kester și colaboratorii 2000). Natura produșulor de reacție a fost determinată prin cromatografie de înaltă performanță (HPLC) pe anioniți, iar localizarea grupărilor esterice, marcate în prealabil cu 18O , în structura produșilor de reacție a fost posibilă prin spectrometrie de masă. Aceste studii au arătat că pectinesteraza din Aspergillus niger este capabilă să hidrolizeze și digalacturonați total metilați. Enzima hidrolizează cu viteză mai mare legăturilre esterice localizate pe resturile de acid galacturonic din interiorul substratului. După hidroliza acestor legături sunt eliberate grupările metilice de la resturile de acid galacturonic de la capetele reducătoare ale oligogalacturonaților, în timp ce grupările de la capătul nereducător nu sunt hidrolizate.

Unele dintre pectinesterazele microbiene au structură glicoproteică. Rijssel (1993) a izolat un complex pectinolitic din Clostridium thermosaccharolyticum care posedă activitate poligalacturonazică și pectinesterazică. Proteina complexă s-a dovedit a fi o glicoproteină cu resturi de N-acetil galactozamină și galactoză.. Pectinesteraza purificată de Shevchik și colaboratorii (1996a) din Erwinia chrysanthemi s-a dovedit a fi o lipoproteină din membrana externă, cu o secvență palmitat la extremitatea N-terminală.

Experimentele de mutageneză dirijată realizate de Duwe (1996) pe pectinesteraza din Aspergillus niger au vizat două resturi de histidină din structura enzimei. Substituirea restului de histidină din poziția 137 cu un rest de alanină a avut ca efect pierderea totală a activității, în timp ce aceeași substituție la histidina din poziția 188 nu a avut nici un efect. Pe baza acestor rezultate s-a tras concluzia că restul de histidină din poziția 137 este esențială în activitatea catalitică, făcând probabil parte din centrul catalitic activ.

Markovic (1996) a evidențiat prezența a șase resturi de histidină în structura pectinesterazei din Aspergillus niger. Tratamentul cu dietilpirocarbonat a arătat o inactivare a enzimei proporțională cu cantitatea de inhibitor. Aceste rezultate au sugerat că histidina nu face parte din centrul catalitic al acestei enzime, dar este implicată în stabilizarea structurilor de ordin superior.

Proprietățile pectinesterazelor de origine microbiană sunt prezentate în Tabelul 2. Cu excepția enzimei din Clostridium multifermentans,, pectinesterazele de origine microbiană au mase moleculare cuprinse între 27 000 și 48 000 Da. Punctul izoelectric variază între 3,6 și 7,4, iar pH-urile optime între 4,2 și 9,0. Constantele Michaelis variază în limite largi, valorile acestora fiind influențate de modul de exprimare a concentrației substratului.

Acidul poligalacturonic este un inhibitor al pectinesterazelor. Datorită acestui fapt, cationii monovalenți (în special Na+ și K+) în concentrații cuprinse între 50 și 100mM, și cationii divalenți (în special Ca2+) în concentrații între 5 și 10mM, provoacă o creștere a activității specifice. Schejter (1988) a arătat că poligalacturonatul de sodiu este un inhibitor competitiv pentru cele două pectinesteraze din Botridis cinerea, constantele de inhibiție având valori de 2,8 și, respectiv, 0,11 mg/ml.

Manjou (1992) a determinat pentru o pectinesterază microbiană o constantă de inhibiție a acidului poligalacturonic de 0,44 mg/ml. Studiile sale au arătat că această inhibiție dispare atunci când esteraza a fost coimobilizată pe suporturi de sticlă poroasă cu o endopoligalacturonază. Un alt inhibitor competitiv al acestor enzime s-a dovedit a fi și metanolul (Maldonado și alții 1994).

Pectinesteraza II, izolată de Lim (1983) din culturi de Aspergillus oryzae a fost total inhibată de HgCl2. Alți inhibitori ai pectinesterazelor microbiene s-au dovedit a fi: CuCl2, AlCl3 (Lim și alții 1983, Sakelaris și alții 1989a), iodul (Markovic și alții 1989), reactivi pentru grupări SH de tipul N-etilmaleiimida, p-cloromercuribenzoatul de sodiu, iodacetamida (Lim și alții 1983, Cardello și alții 1995).

4.2. Protopectinazele

Degradarea protopectinei a fost atribuită inițial acțiunii sinergice a pectinesterazei și endopoligalacturonazei și/sau pectin liazei. Studiile întreprinse de Sakai și colaboratorii săi au pus în evidență capacitatea unor microorganisme de a produce o enzimă care solubilizează protopectina. Această nouă enzimă, denumită protopectinază, degradează protopectina cu eliberare de polimeri pectici solubili, fără a produce macerarea țesuturilor plantelor. Cercetările întreprinse de Sakai și grupul său asupra acestei enzime, au fost sumarizate și publicate în volumul 161 din seria Methods in Enzymology (Sakai și alții 1988).

Protopectinaza a fost purificată și cristalizată de Sakai (1988) din Kluyveromyces fragilis (protopectinaza F), Galactomyces reessii (proto-pectinaza L) și din Trichosporon penicillatum (protopectinaza S). Proprietățile fizice- chimice și cinetice ale acestor enzime sunt prezentate în Tabelul 3.

Masele moleculare ale celor trei protopectinaze, estimate prin aceeași tehnică, au avut valori foarte apropiate. Coeficienții de extincție la 280nm (E280) au valori apropiate, dar nu identice, datorită diferențelor existente între cele trei protopectinaze la nivelul compoziției în aminoacizi aromatici. Valorile pI indică că protopectinaza F este o proteină acidă, iar protopectinazele L și S sunt proteine bazice. Toate trei protopectinazele sunt glicoproteine, dar cantitatea de carbohidrați este diferită.

Compoziția în aminoacizi, diferită pentru cele trei protopectinaze, are o caracteristică comună: lipsa metioninei (protopectinaza L) sau prezența ei în cantitate foarte mică (protopectinazele F și S au un singur rest de metionină în structură). Protopectinazele S și L au la capătul N-terminal un rest de glicină și o secvență identică de 27 resturi de aminoacizi.

Datele prezentate în Tabelul 3 arată asemănări la nivelul unora dintre proprietăți, mai ales între protopectinazele L și S, enzime care s-au dovedit a fi identice din punct de vedere imunologic. Pentru toate cele trei protopectinaze poligalacturonatul de sodiu s-a dovedit a fi un substrat mai bun decât protopectina de diferite proveniențe.

Utilizând ca substrate tri-, tetra- și pentagalacturonați, Sakai (1988) a determinat modul de acțiune și constantele cinetice pentru cele trei protopectinaze (Figura 3). Rezultatele obținute au evidențiat o acțiune similară a protopectinazelor F, L și S asupra substratelor cu 3 și 4 resturi de acid galacturonic. Hidroliza trigalacturonatului decurge prin îndepărtarea unui rest de acid galacturonic de la capătul reducător, iar degradarea tetragalacturonatului decurge prin eliminarea unei molecule de acid galacturonic sau de digalacturonat de la capătul reducător (Figura 3).

Modul de acțiune asupra pentagalacturonatului a fost diferit. Astfel, protopectinazele F și S îndepărtează o moleculă de acid galacturonic sau una de digalacturonat de la capătul reducător al moleculei pentagalacturonice, în timp ce protopectinaza L îndepărtează doar un rest de acid galacturonic din structura acestui oligogalacturonat. Pe baza raportului Vmax / KM , numit coeficient specific, Sakai (1988) a demonstrat că specificitatea celor trei enzime pentru substrate crește în ordinea tri-, tetra- și penta-galacturonați. În ceea ce privește acțiunea asupra poligalacturonaților, modul de scindare depinde și de gradul de policondensare. Când cele trei protopectinaze au acționat asupra acidului poligalacturonic, produșii de reacție obținuți au avut 2-3 resturi de acid galacturonic în structură. Când substratul a fost o pectină cu grad de metilare de 30%, produșii au avut 4-5 resturi de acid galacturonic în structură; utilizarea unei pectine cu grad de metilare de 70% a condus la obținerea de produși având între 9 și 15 resturi de acid galacturonic în structură. Pe baza acestor rezultate, Sakai (1988) a sugerat posibilitatea ca aceste enzime să reacționeze cu protopectina la situsuri care conțin trei, sau mai multe resturi de acid galacturonic nemetilate și să scindeze hidrolitic substratul.

Tabelul 3. Proprietățile protopectinazelor F, L și S

a determinat ca manoză; b determinat ca ramnoză

* Poligalacturonatul utilizat a avut un grad de policondesare de 130.

Experimentele realizate de Iguchi (1996) au evidențiat că, sub acțiunea radiațiilor se obțin mutante de Trichosporon penicillatum capabile de a produce trei protopectinaze cu proprietăți asemănătoare, desemnate ca protopectinazele SE1, SE2 și SE3. Din filtratele culturilor de Bacillus subtilis au fost purificate protopectinaze (protopectinaze C) care nu acționează asupra acidului poligalacturonic. Una dintre acestea a avut o masă moleculară de 50 000 Da, pI 5.3 și a prezentat termostabilitate până la 70OC. Această enzimă a manifestat activitate protopectinazică pe fibre de bumbac și pe protopectina din lămâie, dar și activitate pectat liazică (Takao și alții 2000). Din culturile de Bacillus subtilis au fost izolate alte două protopectinaze, una cu activitate ramnogalacturonazică (Sakai și alții 1993), iar cealaltă cu activitate arabinazică (Sakamoto și alții 1995).

Protopectinazele descrise în literatură manifestă specificitate diferită față de protopectinele de diferite proveniențe. Astfel, protopectinaza din Trichosporon penicillatum acționează cu viteze diferite asupra protopectinelor din portocale, grapefruit, cartofi, morcovi, pere, piersici (Sakamoto, 1995), și o degradează cel mai bine pe cea din cartofi (Nakamura, 1995). Protopectinaza din Bacillus subtilis degradează cel mai rapid protopectinele din morcovi (Nakamura, 1995).

Existența unor enzime capabile să degradeze protopectina, forma insolubilă a polizaharidelor pectice, este contestată de multe cercetări din domeniu. Majoritatatea cercetărilor consideră că degradarea protopectinei se datorează acțiunii sinergice a poligalacturonazei, pectinesterazei și pectat sau pectin liazei. Această ipoteză se bazează pe faptul că toate enzimele capabile să acționeze asupra protopectinei izolate și caracterizate până în prezent posedă și o a doua funcție catalitică. Această a doua funcție poate fi, de la caz la caz, poligalacturonazică, pectat liazică, ramnogalacturonazică sau arabinazică.

4.3. Endopoligalacturonazele

Endopoligalacturonazele (EC 3.2.1.15) sunt enzime care hidrolizează legăturile glicozidice din structura poligalacturonaților într-o manieră mai mult sau mai puțin întâmplătoare, formând oligogalacturonați. Acțiunea acestor enzime determină scăderea pronunțată a vâscozității soluției substratului.

Endopoligalacturonazele acționează preferențial asupra acizilor pectici și a pectinelor slab esterificate. Studiile întreprinse asupra endopoligalacturonazei purificate din Corticium rolfsii au arătat că această enzimă scindează, în ordine, acidul poligalacturonic, pectina 67% esterificată și pectina 91% esterificată, cu viteze de 100%, 12% și, respectiv, 1,5%. Utilizarea acizilor pectinici în calitate de substrate a acestor enzime a condus la obținerea de rezultate neconcludente, în structura acestora existând porțiuni de resturi de acid galacturonic neesterificate, porțiuni suficient de mari ca să permită acțiunea endopoligalacturonazei. Studiile întreprinse de Chen și colab. (1996) asupra produșilor de reacție obținuți sub acțiunea endopoligalacturonazei din Erwinia carotovora au evidențiat capacitatea acestei enzime de a hidroliza pectinele cu grade de metilare de 16%, 32% și 52%, care au în structură patru resturi adiacente de acid galacturonic.

Mărimea moleculei substratului este un factor care influențează activitatea acestor enzime. Ele acționează cu viteză maximă asupra substratelor cu număr mare de resturi de acid galacturonic, cu viteze reduse asupra oligogalacturonaților și nu scindează digalacturonatul.

Determinarea produșilor de reacție formați în fazele incipiente ale reacției a permis diferențierea între endo și exo enzime: endopoligalacturonazele produc oligozaharide diferite și cantități mici de mono-și digalacturonați, în timp ce exopoligalacturonazele produc mono și digalacturonați în cantitate mare. Lim (1980) a arătat că endopoligalacturonaza din Rhizopus arrhizus nu produce oligomeri în primele 40 minute de reacție, iar molecule monomere de acid galacturonic apar abia dupădouăore.

Elucidarea mecanismului prin care acționează aceste enzime s-a realizat în urma analizei produșilor de reacție obținuți pe substrate polimere și oligomere. Rezultatele obținute au arătat că natura produșilor depinde de mărimea regiunii de contact dintre substrat și situsul activ, mărime care afectează constantele cinetice de reacție, KM și Vmax.. Astfel, sub acțiunea endopoligalacturonazelor, pentru care mărimea substratului este relativ neesențială în legare, se formează cantități mici de produși intermediari, iar mecanismul după care acționează aceste enzime a fost denumit impropriu “single chain attack“. În cazul endopoligalacturonazelor, care se leagă mai puternic de poligalacturonații cu mase mari decât de cei cu mase mici, concentrația produșilor intermediari este ridicată, mecanismul de acțiune fiind denumit “multi-chain attack“. Studiind cinetica reacției de hidroliză a substratelor sub acțiunea endo-poligalacturonazei purificate din Saccharomyces fragilis, Demain (1954) a observat trei etape de reacție. În prima etapă, etapă care decurge rapid, sunt scindate aproximativ 25% din legăturile glicozidice din structura substratului cu eliberarea tetra-, tri- și digalacturonați. În etapa a doua, etapă mult mai lentă, gradul de hidroliză crește la 50%, iar tetragalacturonații sunt hidrolizați la tri- și monogalacturonați. În ultima etapă, etapă foarte lentă, trigalacturonații sunt scindați la digalacturonați și acid galacturonic.

Pentru a explica diversitatea produșilor rezultați sub acțiunea poligalacturonazelor de proveniențe diferite, Rexová-Benková (1976) a propus trei modele care să explice modul de acțiune al poligalacturonazelor. Cele trei modele, numite A, B și C, sunt prezentate în Figura 4. Endopoligalacturonazele din Aspergillus niger și cele din Trichoderma reessi urmează modelul A, caracterizat prin scindarea tetramerilor la trimeri și acid galacturonic, și prin scindarea extrem de lentă a trimerilor. Modelul B, caracterizat printr-o scindare alternativă a tetramerilor (la trimeri și acid galacturonic sau la două molecule de digalacturonat) și prin degradarea rapidă a trimerilor, a fost evidențiat la endopoligalacturonazele din roșii. Modelul C, pus în evidență pentru endo-enzima de la Erwinia carotovora, se deosebește de celelalte mecanisme printr-o scindare specifică a pentamerilor și a hexamerilor.

Având în vedere faptul că modul de acțiune și specificitatea de substrat a enzimelor depinde de natura situsului activ, Rexová-Benková (1976) a considerat că endopoligalacturonazele care acționează după unul din cele trei modele au centre catalitice diferite, alcătuite dintr-un număr diferit de subsitusuri.

Studii recente (Bonnin și alții 2001) au evidențiat atacul multiplu asupra substratelor și în cazul endopoligalacturonazei din Fusarium moniliforme. Afinitatea și viteza maximă de reacție cresc cu creșterea lungimii catenei substratului. Situsul catalitic al enzimei este alcătuit din cinci subsitusuri, iar produșii finali de hidroliză ai homogalacturonanilor sunt monomeri și dimeri ai acidului galacturonic.

Stereochimia acțiunii hidrolitice a două endopoligalacturonaze din Aspergillus niger, a fost investigată de Biely (1996a și b) cu ajutorul spectroscopiei 1H-RMN. În mediu de D2O, toți produșii de reacție au avut noul capăt reducător în conformație , fapt care arată acțiunea invertivă a acestor enzime.

Figura 4. Posibilități de acțiune a endopoligalacturonazelor pe substraturi mici

(O reprezintă o moleculă de acid galacturonic).

Pe baza studiilor de variație a constantelor cinetice cu pH-ul, Rexová-Benková (1976) a sugerat implicarea în mecanismul de acțiune al endopoligalacturonazei din Aspergillus niger a unei grupări carboxil și a unei grupări imidazol protonate a histidinei.

Cercetările intreprinse de Statilova și colab. (1996b) au evidențiat prezența în structura situsului activ al endopoligalacturonazei de la Aspergillus niger a unui rest de tirozină, rest ionizat la pH 10,5. Studiile de modificare chimică a unor resturi de aminoacizi din structura endopoligalacturonazei din Aspergillus ustus au indicat participarea unui rest de triptofan în legarea substratului și a unui rest de histidină în actul catalitic (Rao și alții 1996 a și b, Niture și alții 2001). Pe baza acestor studii, Rao și colab. (1996b) au presupus că în mecanismul de acțiune al acestei enzime are loc transferul unui singur proton de la restul de histidină la O glicozidic din structura substratului, transfer urmat de hidroliză prin adiția unei molecule de apă.

Studiile structurale realizate de Statilová (1998b) au pus în evidență caracterul glicoproteic al formelor multiple ale poligalacturonazei din Aspergillus niger. În structura celor două forme majore ale poligalacturonazei sunt prezente resturi de N-acetilgalactozamină și manoză. Și endopoligalacturonaza din Aspergillus aculeatus s-a dovedit a fi o glicoproteină cu o structură secundară în care motivul predominant este -structura paralelă (Cho și alții 2001).

Endopoligalacturonazele au fost purificate și caracterizate din mai multe surse microbiene. Proprietățile câtorva endopoligalacturonaze sunt prezentate în Tabelul 4. Aceste enzime au mase moleculare cuprinse între 30 000 și 85 000 Da, pI variind în domeniul 3,7-8,3. Toate endopoligalacturonazele au pH optim acid, cuprins între 3,8 și 5,5. Comparativ cu alte enzime pectinolitice, valorile KM pentru poligalacturonat variază pe un domeniu destul de îngust, cuprins între 0,14 și 4,7 mg/ml.

Efecte inhibitoare asupra endopoligalacturonazelor au următoarele substanțe:

HgCl2, cu o valoare a constantei de inhibiție de 6,8×10-5M (Blanco și alții 1994);

acidul tanic (Liu 1978 , Elegado 1994);

pectina, în concentrații de ordinul 10-3 g/100ml, determină o inhibiție competitivă (Schejter 1988);

NaCl în concentrație de peste 1o/oo inhibă endopoligalacturonazele din bacteriile marine (Mountfort 1995);

epicatechina, în concentrații cuprinse între 20-80 g/ml, inhibă cu 6,5% și respectiv 43% cele două endopoligalacturonaze din Colletotrichum gloeosporioides (posibil ca epicatechina să regleze activitatea endopoli-galacturonazelor fungice în fructele infestate) (Pruski 1989);

CaCl2 și BaCl2, în concentrații de 5×10-3M, au efect inhibitor datorat precipitării parțiale a acidului poligalacturonic.

4.4. Exopoligalacturonazele

Exopoligalacturonazele (EC 3.2.1.67) hidrolizează poligalacturonații cu eliberarea acidului galacturonic, producând o scădere mai redusă a vâscozității soluției substratului comparativ cu endopoligalacturonazele. Acțiunea exopoligalacturonazelor de origine vegetală și microbiană începe de la capătul nereducător al moleculei. Modul de acțiune al acestor enzime a fost determinat pe baza observațiilor experimentale care au arătat că, aceste enzime nu atacă substratele care au la extremitatea nereducătoare un rest de acid galacturonic 4:5 nesaturat sau un deoxizahar.

În literatura de specialitate au fost descrise și exopoligalacturonaze care atacă substratul la capătul nereducător cu eliberarea digalacturonatului. Astfel de enzime au fost izolate de la Erwinia aroideae și de la unele specii de Pseudomonas și au denumirea corectăde poli-(1,4–D-galacturonid) digalacturonohidrolaza.

Exopoligalacturonazele nu degradeazăcomplet poligalacturonații, activitatea lor depinzând de gradul de policondensare al acestora și de proveniența lor. Astfel, exopoligalacturonaza din Aspergillus tubingensis (Kester și alții 1996 a și b) a fost capabilă să hidrolizeze și oligogalacturonați cu grade de condensare cuprinse între 2 și 7, dar activitatea cea mai mare s-a înregistrat pe poligalacturonați cu mase moleculare mari.

Studiile întreprinse de Biely (1996a) au arătat că exopoligalacturonaza din Aspergillus tubingensis, ca și endopoligalacturonazele din Aspergillus niger, determină modificarea configurației la nivelul grupării reducătoare a produsului de reacție.

Proprietățile fizico-chimice au fost stabilite pentru un număr mic de exopoligalacturonaze microbiene.

Hara (1984) a izolat două exopoligalacturonaze din culturile de Aspergillus niger. Exopoligalacturonaza I a avut masa molecularăde 66 000 Da, pH optim 3,8, temperatura optimă 600C, pI 5,6, KM pentru acid pectic de 20 mg/ml și de 6,5 mg/ml pentru acid digalacturonic. Exopoligalacturonaza II a avut masa molecularăde 63 000 Da, pH optim 4,5, temperatura optimă 600C, pI 5,8, KM pentru acid pectic 3,85 mg/ml și de 5,0 mg/ml pentru acid digalacturonic. Concentrații de HgCl2, cuprinse între 0,002M și 0,2M, au activat ambele enzime, dar mai ales forma moleculară I.

Prezența a două exopoligalacturonaze în culturile de Aspergillus niger a fost evidențiatăși de Behere (1993). Ambele forme ale exo-enzimelor au avut pH optim de 5,0, iar valorile KM raportate la poligalacturonatul de sodiu au fost de 0,24% și 0,12%. Exopoligalacturonaza purificatăde Heinrichova (1976) din culturi de Aspergillus niger a avut un pH optim de 5,2.

Mikhailova (1995) a caracterizat două exopoligalacturonaze din Aspergillus alliaceus. Exopoligalacturonaza I a avut pH optim 3,5 și temperatura optimă 45-500C, iar pentru forma moleculară II acești parametri au fost 6,8 și 350C.

Cele două exopoligalacturonaze izolate de Devi (1996) de la Aspergillus carbonarius au avut masele moleculare de 61 000 Da și, respectiv 47 000 Da, acționând optim la 430C, respectiv 540C.

O altă specie producătoare de exopoligalacturonază s-a dovedit a fi Aspergillus tubingensis (Kester 1996 a și b). Enzima din această sursă a avut masa de 70 000 Da, pI cuprins între 3,7-4,4, pH optim de 4,2 și KM față de acidul poligalacturonic de 3,2 mg/ml. Enzima a fost inhibată competitiv de acidul galacturonic (Ki= 0,3mM) și de acidul digalacturonic (Ki= 0,4mM) O tulpină de Fusarium oxysporum s-a dovedit a fi capabilă să producă patru exopoligalacturonaze cu valori pI de 9,3, 7,35, 6,85 și 6,55. Toate cele patru forme ale enzimei au fost inhibate de ionii de calciu (Guevara, 1997).

O exopoligalacturonază a fost purificată până la omogenitate din mediul de cultură al unei tulpini de Bacillus (Kobajashi și alții 2001). Enzima a avut o masă moleculară de 45 000 Da, pI 5,8 și o viteză maximă de acțiune asupra poligalacturonatului de sodiu la 600C și pH 7,0. Spre deosebire de alte exopoligalacturonaze bacteriene, această exopoligalacturonază eliberează doar acid monogalacturonic atunci când acționează asupra acidului poligalacturonic, di-, tri,-tetra- și penta –galacturonaților.

Cercetări recente (Antov și alții 2001) au studiat cultivarea microorganismului Polyporus squamosus într-un sistem apos bifazic, polietilen glicol/dextran, în prezența melasei de sfeclă de zahăr ca sursă de pectină. În supernatantul mediului de cultură activitatea exopoligalacturonazică s-a dovedit a fi mai mare decât cea decelată în urma cultivării în sistem monofazic.

Datele prezentate arată necesitatea unor studii mai detaliate asupra aceastei categorii de enzime pectinolitice. Singura proprietate care diferențiază clar exopoligalacturonazele de oligogalacturonat hidrolaze (enzime prezentate în paragraful 4.5) este preferința acestora pentru substrate cu mase moleculare mari.

4.5. Oligogalacturonat hidrolazele și oligogalacturonat liazele

Oligogalacturonat hidrolazele și oligogalacturonat liazele sunt enzime pectinolitice cu aplicații practice reduse și destul de puțin studiate.

Oligogalacturonat hidrolazele scindează legăturile glicozidice de la capătul nereducător al substratului. Aceste enzime diferă de exopoligalacturonaze prin faptul că manifestă activitate specifică mult mai mare față de oligogalacturonați comparativ cu cea față de poligalacturonați și pectați. Oligogalacturonat liazele (EC 4.2.2.6) acționează asupra oligogalacturonaților saturați și nesaturați prin trans eliminare, îndepărtând monomeri nesaturați de la capătul reducător al acestora. Pentru ambele tipuri de enzime, viteza de reacție descrește rapid cu creșterea gradului de policondensare, fiind de până la 400 ori mai mică pe substrate macromoleculare.

În Tabelul 5 sunt prezentate tipurile de oligogalacturonaze pectice și specificitatea manifestată de acestea față de diferite substraturi.

Cercetări recente (Heinrichowa, 1992) au evidențiat biosinteza unei D-galacturonan digalacturonohidrolaze de către Selenomonas ruminantium enzimă capabilă să degradeze oligogalacturonați cu grade de condensare cuprinse între 3 și 5.

Heinrichowa și colaboratorii (1994) au evidențiat că Clostridium lochheadii produce un complex de enzime pectinolitice în structura căruia intră o galacturonat digalacturono hidrolază (EC 3.2.1.82), o oligo-(D-galactoziduronat) liază (EC 4.2.2.6) și o endopectat liază (EC 4.2.2.2).

Tabelul 5. Proprietățile câtorva oligogalacturonaze microbiene după Whitaker (1990)

asubstratele sunt prezentate în ordinea vitezei cu care sunt scindate; bterminologia utilizată: dimer, trimer, tetramer, pentamer – substrate cu 2, 3, 4, respectiv 5 resturi de acid galacturonic; n-substrate nesaturate cu resturi de acid 4,5 dehidrogalacturonic la capătul nereducător; gradul de policondensare a acidului pectic solubil este de 15-20; c proteina posedă două tipuri de activități hidrolazice acționând asupra digalacturonaților saturați și nesaturați.

4.6. Endopolimetilgalacturonazele

Prezența endopolimetilgalacturonazelelor (endopectin hidrolaze) la unele microorganisme a fost raportată de o serie de cercetători; Friedurek (1983), Wick (1982), Reddy (1983), Silley (1985). Toate aceste cercetări nu au reușit să evidențieze acțiunea acestor enzime asupra poligalacturonatului 100% metilat în absența pectinesterazei și pectin liazei. Datorită acestui fapt, existența acestui tip de enzime este pusă sub semnul întrebării.

4.7. Endopectat liazele

Endopectat liazele (EC 4.2.2.2) hidrolizează poligalacturonați îndepărtând din structura acestora oligogalacturonați 4:5 nesaturați. Deși endopectat liazele și endopoligalacturo-nazele acționează asupra acelorași tipuri de substrate, endopectat liazele se diferențiază de endopoligalacturonaze prin patru trăsături caracteristice:

sunt biosintetizate numai de microorganisme, în special de bacterii și de fungii patogeni ai plantelor și alimentelor;

au pH-uri optime alcaline;

prezența ionilor de calciu este absolut necesară;

scindează legăturile glicozidice prin mecanism de trans eliminare, rezultând un produs de reacție cu o dublă legătură între atomii de carbon 4 și 5 ai galacturonatului.

În general poligalacturonații și pectinele slab metilate sunt substratele preferate ale endopectat liazelor. Există totuși diferențe de la o enzimă la alta. Astfel, endopectat liazele izolate din două tulpini de Arthrobacter și dintr-o tulpină de Bacillus polymyxa, acționează cu viteza cea mai mare asupra acizilor pectinici cu grade de esterificare de 21%, 44% și, respectiv, 26% (Whitaker și alții 1990).

Studiile întreprinse de Bruhlmann (1995) au arătat că endopectat liaza, biosintetizată de o specie nesporulantă de Amycolata, degradează poligalacturonații prin trans eliminare întâmplătoare, produșii intermediari fiind o gamă largă de oligogalacturonați 4,5 nesaturați. Acești produși intermediari sunt scindați în continuare sub acțiunea catalitică a enzimei, produșii finali ai reacției fiind de tipul dimerilor și trimerilor.

Activitatea endoliazică scade cu scăderea lungimii catenei substratelor, majoritatea endopectat liazelor degradând extrem de lent trigalacturonații și tetragalacturonații nesaturați. Pe baza acestor constatări experimentale, Rexová-Benková (1976) a propus două tipuri de mecanisme de acțiune diferite (modele A și B). Endopoligalacturonazele care acționează după modelul A au ca substrate limită trigalacturonații nesaturați, în timp ce enzimele aparținând modelului B nu pot scinda acești trimeri nesaturați.

Un mod de acțiune diferit a fost evidențiat de Preston (1992) în cazul formelor moleculare ale endopectat liazei din Erwinia chrysanthemi. Forma moleculară notată PLa acționează prin mecanism random, conducând la formarea mai multor tipuri de produși, de la dimeri la decameri. Formele PLb și PLc generează trimeri și tetrameri printr-o combinație de mecanisme endolitice și exolitice. Forma PLd produce prioritar dimeri și acționează printr-un mecanism endolitic non random.

Dintre toate enzimele pectinolitice, endopectat liazele au fost cel mai mult investigate din punct de vedere al structurii. Comparând secvențele de aminoacizi ale celor cinci pectat liaze produse de Erwinia chrysanthemi, Tardy (1997) a pus în evidență existența a două familii enzimatice cu proprietăți diferite. Prima familie include formele moleculare de tip B și C, forme care pot acționa numai asupra pectinelor slab metilate și au o afinitate de 10 ori mai mare pentru aceste substrate decât endopectat liazele aparținând familiei a doua. Cea de a doua familie include formele A, D și E, forme active și pe substrate al căror grad de metilare ajunge pânăla 45%.

Studiile de difracție cu raze X au evidențiat prezența în structurile de ordin superior ale pectat liazelor C și E din Erwinia chrysanthemi, a unui nou tip de domeniu structural care a fost numit -helix paralel (Yodler și alții 1993a și b). Structura tridimensională a endopectat liazei C cuprinde numai -structuri paralele, structuri care sunt pliate într-o spirală răsucită spre dreapta (“large right handed coil“). Divizarea structurii terțiare în elemente de structură secundară a arătat prezența a trei -structuri paralele. Două din aceste structuri sunt pliate una față de cealaltă antiparalel, rezultând o structură de tip -sandwich, iar cea de a treia este perpendiculară pe acest -sandwich. Pectat liaza E din Erwinia chrysanthemi a avut o structură tridimensională asemănătoare cu cea a formei C (Lietzki și alții 1994). Studiile de mutageneză dirijată realizate de Jurnak (1996) au evidențiat că pectat liazele C și E, proteine similare din punct de vedere al plierii globale, prezintă diferențe semnificative în cea ce privește mărimea și configurația regiunilor “loop“ din structură. În aceste regiuni de tip “loop“ sunt localizate situsurile active ale enzimelor. Studiul structurilor tridimensionale ale endopectat liazelor C și E a evidențiat existența a două centre catalitice diferite responsabile pentru activități diferite (Henrissat și alții 1995).

Analiza structurii tridimensionale a pectat liazei din Bacillus subtilis în complex cu calciul, a evidențiat existența unui domeniu -helix paralel și a unei regiuni de tip “loop“, între care existăo cavitate la nivelul căreia ar putea fi localizat situsul catalitic activ. Situsul catalitic activ al acestei enzime are în structură un rest de arginină (Pickersgill și alții 1994).

Endopectat liaza din Aspergillus niger are o structură asemănătoare cu cea a pectat liazelor C și E produse de Erwinia chrysanthemi și este o proteină cu două funcții catalitice (Heffron și alții 1995).

Studiile de modificare chimică a unor resturi de aminoacizi din structura endopectat liazei biosintetizată de Fusarium moniliforme, au evidențiat implicarea unui rest de tirozină în legarea substratului și a unui rest de lizină (situat în/sau lângă centrul catalitic activ) în mecanismul catalitic (Rao, 1996a).

Proprietățile câtorva endopectat liaze microbiene sunt centralizate în Tabelul 6. Aceste enzime se caracterizează prin pH-uri optime de acțiune situate în domeniul bazic și prin valori KM destul de mici. Studiile întreprinse de Tierny (1994) au evidențiat modificarea proprietăților pectat liazei de la Bacteroides thetarotaomicron atunci când gena acesteia a fost clonată la Echeria coli.

Aspergillus niger, în culturi în fază solidă (solid-state fermentation) în care sursa de carbon a fost un amestec de tărâțe de grâu și borhot de sfeclă, s-a dovedit a fi capabil să producă două endopectat liaze cu acțiune în domeniul acid de pH. Endopectat liaza I, enzimă cu masa de 41 700 Da și KM pentru pectatul de sodiu 6,25 mg/ml, a acționat cu viteza cea mai mare la pH 6,0. Endopectat liaza II, enzimă cu masa de 30 200 Da și KM pentru pectatul de sodiu 1,35 mg/ml, a acționat cu viteza cea mai mare la pH 4,8 (Dinu și alții 1998, Dinu 1997).

Endopectat liazele sunt activate de ioni de Ca2+. Studiile de spectrometrie de emisie atomică au arătat că acest ion este o parte a holoenzimei. Calciul se leagă de proteină la nivelul grupărilor carboxil din structura acesteia, dar prezența acestui ion nu afectează legarea substratului la enzimă (Rao și alții 1996a). Ionii de Ba2+, Co2+, Cu2+, Mg2+, Mn2+, Sr2+, Zn2+ nu afectează activitatea endopectat liazică (Tardy și alții 1997).

Inhibitori ai endopectat liazelor s-au dovedit a fi ionii bivalenți de mercur, EDTA și doi compuși din plante, epicatechina și acidul salicilic (Tardy și alții 1997).

4.8. Exopectat liazele

Exopectat liazele (EC 4.2.2.9) scindează penultima legătură glicozidică din structura poli-D-galacturonaților cu începere de la capătul reducător al acesteia și eliberează molecule de acid digalacturonic 4:5 nesaturate.

Prezența exopectat liazelor a fost semnalată doar la câteva microorganisme: Clostridium multifermentans, Erwinia aroideae, Erwinia dissolvens, Fusarium culmorum, Streptomyces nitrosporeus (citate dupâ Whitaker 1990). Guevara (1997) a pus în evidență existența a două exopectat liaze la Fusarium oxisporum sp. radicis lycopersici, proteine cu pI de 8,65 și, respectiv, 9,0.

pH-ul optim al acestor enzime este cuprins între 8,0 și 9,0. Cu excepția enzimelor izolate de la speciile de Erwinia, toate celelalte au necesitate absolutăpentru ionii de calciu. Exopectat liazele nu manifestăpreferințăfațăde mărimea moleculei substratului, poligalacturonații și oligogalacturonații, inclusiv trigalacturonații, fiind degradați cu aproximativ aceeași viteză.

Exopectat liaza din Clostridium multifermentans face parte, alături de o pectinesterază, dintr-o proteină complexă având masa de 400 000 Da. Cele două enzime din acest complex acționează sinergic în degradarea pectinelor (Miller și alții 1970).

4.9. Pectin liazele

Pectin liazele (EC 4.2.2.10) manifestă specificitate pentru substrate înalt esterificate, acțiunea lor aleatoare conducând la formarea de oligo-D-galacturonați nesaturați. Majoritatea pectin liazelor purificate și caracterizate sunt de origine fungică.

Activitatea acestui tip de liaze este afectată de distribuția grupărilor esterificate în catena poli-D-galacturonanică. Studiile realizate pe substrate cu diferite grade de esterificare și cu o distribuție diferită a grupărilor esterificate, au arătat o activitate mai mare asupra substratelor deesterificate enzimatic comparativ cu cea manifestată pe substrate deesterificate în mediu alcalin. Pectinele deesterificate enzimatic au o distribuție regulată a grupărilor esterice, în timp ce deesterificarea chimică conduce la o distribuție statistică a acestor grupări.

Pectinele înalt esterificate sunt cele mai bune substrate pentru pectin liaze. Pectații, amidele acidului pectic și glicilesterii pectinei nu sunt degradați de pectin liaze.

Modul de acțiune al pectin liazelor (Figura 5) a fost pus în evidență prin analiza produșilor rezultați în urma scindării tetra-, penta- și hexa-galacturonaților.

O – rest de acid galacturonic esterificat

rest de acid galacturonic esterificat, cu o dublă legătură între C4 și C5

Figura 5. Modul de acțiune al pectin liazelor.

Câteva din proprietățile pectin liazelor microbiene sunt prezentate în Tabelul 6. Analiza datelor prezentate în acest tabel arată că majoritatea pectin liazelor au pH-ul optim în domeniul acid și valori mici ale constantei Michaelis. Aproximativ 10% din pectin liazele izolate și caracterizate s-au dovedit a fi enzime care acționează la pH alcalin. O pectin liază cu afinitate mică este enzima izolată din Penicillium italicum, enzimă cu KM mare față de pectina 86% metilată (15 mg/ml), dar și cu activitate catalitică mare. Afinitatea scăzută a acestei enzime a fost explicată de Alana (1991) prin repulsiile electrostatice care apar între enzimă și substrat, ambele fiind încărcate negativ la pH 9,0. După depășirea dificultăților de formare a complexului enzimă-substrat, activitatea catalitică este mare. Proprietățile pectin liazei din Penicillium italicum s-au modificat în urma imobilizării covalente pe nylon (Alkorta și alții 1996). Creșterea stabilității enzimei imobilizate a permis utilizarea acesteia în 12 cicluri de degradare a pectinei.

Manifestarea activității catalitice a pectin liazelor nu necesită neapărat prezența ionilor de calciu în mediu (excepție enzima din Fusarium oxysporum), dar ionii divalenți de calciu, cupru, magneziu, mangan și mercur, în concentrație 2mM, s-au dovedit a fi activatori pentru unele pectin liaze (Lim și alții 1983). Activitatea pectin liazică s-a dovedit a fi inhibată de: acidul p-cloromercuri-fenil-sulfonic, anhidridă maleică, N-etilmaleimida (Manachini și alții1988) și de unii hormoni ai plantelor sau analogi ai acestora.

Mikhailova (1994) a arătat că unele specii de Penicillium produc forme moleculare ale pectin liazelor care diferă din punct de vedere al controlului biosintezei. Unele dintre acestea sunt represate de glucoză și depresate prin intermediul AMP ciclic. Fuziunea protoplaștilor de la fungii pectinolitici de tipul Aspergillus a condus la obținerea a patru hibrizi cu activități endopoligalacturonazice, exopoligalacturonazice și pectin liazice nemodificate (Solis și alții 1997).

O bacterie endofilică izolată de pe suprafața sâmburilor de cireșe s-a dovedit ca produce o pecin liază cu acțiune optimă la 400C și pH 7,9 și o valoare KM față de pectină de 4,5 mg/ml (Sakiyana și alții 2001).

Importanța și utilizările enzimelor pectinolitice

5.1. Implicațiile enzimelor pectinolitice în fiziologia și patologia plantelor

Conversia protopectinei, substanță parentală, insolubilă în apă, la pectină solubilă și pectat și, ulterior, la produșii lor de degradare, este un proces cu rol important în maturarea și infectarea plantelor.

La plante, protopectina are rol de adeziv intracelular, transformarea sa în forme solubile determinând o scădere a rigidității țesuturilor reflectată prin înmuierea și, ulterior, prin lichefierea materialului plantei. Chiar dacă mecanismul acestei conversii nu este pe deplin elucidat, este evident faptul că în aceste procese un rol major îl au enzimele pectinolitice ale plantelor și ale patogenilor, primele fiind implicate în schimbările fiziologice, iar celelalte în alterările patologice.

Paralelismul între creșterea activităților pectinesterazice și endopoli-galacturonazice, pe de o parte, și formarea pectinelor solubile în apă, pe de altă parte, paralelism observat în cursul maturării fructelor,indică o strânsă corelație între aceste două procese. În fructele necoapte prezența endopoligalacturonazei nu a fost depistată, iar activitatea pectinesterazică este foarte mică. Cele două activități încep să crească, existând o corelație între creșterea acestora și gradul de coacere. În fructele roșiilor transgenice, la care este expresat un RNA antisens pentru poligalacturonază, activitatea poligalacturonazică este foarte mică, ajungând până la 1% din cea depistată în fructele normale (Langley și alții 1994, Grierson și alții 1994).

Expresia unei gene antisens pentru pectinesterază, a determinat o scădere de 10 ori a activității pectinesterazice în roșii (Treman și alții 1994). Roșiile transgenice au unele proprietăți modificate, proprietăți care sunt exploatate în procesele de stocare și prelucrare a acestora.

Enzimele pectinolitice joacă un rol important în interacția micro-organismelor cu plantele superioare, interacție cu efecte multiple asupra țesuturilor plantelor. Câteva dintre aceste efecte sunt:

macerarea și distrugerea celulelor (Salinas și alții 1995, Federici și alții 2001)

apariția reacțiilor de apărare ale plantei contra patogenului;

pereții celulari devin mai succeptibili la atacul altor polizaharidaze microbiene;

creșterea concentrației de etilenă, hormon care produce căderea fructelor (Agravante și alții 1991).

Bolile plantelor cauzate de patogeni sunt procese complexe la care participă mai mulți factori. Mecanismul inducerii patogenicității este asociat cu o interacție între patogen și peretele celular polizaharidic al gazdei, interacție care influențează producția de enzime care degradează peretele celular (Alghisi și alții 1995, Yang și alții 1994). Rolul direct al enzimelor pectinolitice produse de patogen în procesul de infecție este indicat prin:

capacitatea tuturor patogenilor cunoscuți de a produce enzime pectinolitice (Rodriguezpalenzuela și alții 1991);

corelația directă între producția acestor enzime și virulența observată (Erampalli și alții 1995);

prezența enzimelor pectinolitice produse de patogen în țesuturile plantelor infestate (Chilosi și alții 1997).

Producția de enzime pectinolitice, în particular a celor cu mecanism “random“, de către patogen este una din condițiile esențiale pentru succesul infecției. Aceste enzime determină o alterare a peretelui celular, făcând posibilă penetrarea patogenului în plantele gazdă. O mutantă de Colletotrichum magna deficitară în secreția extracelulară a pectat liazei s-a dovedit a fi nepatogenă, deși acest microorganism este cunoscut ca fiind un patogen major al fructelor de avocado (Wattad și alții 1995).

Capacitatea microorganismelor de a produce enzime pectinolitice “in vitro“ nu este o dovadă a patogenicității lor, unele dintre ele fiind capabile să producă aceste enzime pe medii sintetice, neavând capacitatea de a le produce “in vivo“. În procesele de infecție un rol important îl are susceptibilitatea sau rezistența plantei la efectele patogenului (Baayen și alții 1997)

Recent, un grup de cercetători canadieni (Laurent și alții 2000) au reușit să obțină anticorpi policlonali față de o pectinesterază produsă de o genă de la Erwinia chrysanthemi expresată la de E. coli. Acești anticorpi nu au interacționat cu pectinesterazele fungice sau cu cele produse de plante, cea ce face posibilă utilizarea lor în identificarea timpurie a interacției plantă-patogen.

La plante au fost puse în evidență mai multe mecanisme de protecție contra infecțiior microbiene. Câteva dintre acestea sunt:

conversia acidului pectic la pectatul de calciu rezistent la acțiunea enzimelor pectinolitice;

efectul inhibitor asupra enzimelor pectinolitice exercitat de unele substanțe din plante: acidul cafeic, antocianidinele, epichatechina, compuși fenolici acidul salicilic, zaharoză (Tardy și alții 1997 );

inhibiția enzimelor pectinolitice de către hormonii plantelor sau de analogi ai acestora (Chilosi și alții 1997);

biosinteza unor inhibitori proteici naturali ai enzimelor pectinolitice, inhibitori care formează complexe cu enzimele pectinolitice și care contraatacă acțiunea nocivă a acestora.

Proteinele cu efect inhibitor asupra poligalacturonazelor microbiene au fost purificate și caracterizate din fructe și vegetale.

Din zmeură necoaptă a fost izolată o proteină cu masă moleculară de 38 500 Da, care inhibă necompetitiv două endopoligalacturonaze produse de Botrytis cinerea și o endopoligalacturonază din Aspergillus niger (Johnston și alții 1993).

Perele au o glicoproteină cu masă moleculară de 43 000 Da care inhibă diferențiat formele moleculare ale endopoligalacturonazei din Botrytis cinerea (Stotz și alții 1993)

Din semințe germinate de soia a fost izolată o proteină care interacționează diferit endopoligalacturonazele din Sclerotinia sclerotiorum și Aspergillus niger (Flavaron și alții 1994).

Fructele de măr a fost pusă în evidență o proteină heterogenă, având grade diferite de glicozilare, care inhibă diferit cele cinci forme ale poligalacturonazelor din Botrytis cinerea (Yao și alții 1995).

Cu ajutorul unui biosensor, Mattei (1997) a arătat existența unei afinități diferite între inhibitorul proteic izolat din Phaseolus vulgaris și diferite endopoligalacturonaze obținute prin mutageneză dirijată din Fusarium moniliforme. Resturile de arginină, lizină și histidină din structura acestui inhibitor joacă un rol esențial în interacții cu poligalacturonaza (Federici și alții 2001).

Un inhibitor proteic natural al pectinesterazelor a fost izolat și din fructele de kiwi. Inhibitorul s-a dovedit a fi o glicoproteină care este biosintetizată sub forma unui precursor inactiv în fructele necoapte (Giovane și alții 1995, Camardella și alții 2000).

Mecanismul prin care aceste proteine inhibă activitatea enzimelor pectinolitice nu este cunoscut.

5.2. Aplicații biotehnologice ale enzimelor pectinolitice

Enzimele pectinolitice, singure sau în amestec cu alți biocatalizatori, sunt utilizate pe scară largă în diferite procese biotehnologice.

Enzimele pectinolitice sunt absolut necesare în extracția, clarificarea și depectinizarea sucurilor de fructe (Alkorta și alții 1995, Chang și alții 1995, Meyer și alții 2001). Clarificarea acestora decurge și sub acțiunea enzimelor pectinolitice din fructe, dar procesul de autoclarificare este prea lent pentru a fi utilizat la scară industrială. În procesele industriale sunt utilizate preparate concentrate de enzime pectinolitice produse de microorganisme, preparate care realizează o degradare rapidă a polimerilor pectici. Clarificarea diferitelor sucuri necesită acțiunea sinergică a mai multor tipuri de enzime pectinolitice. Astfel, sucurile de mere au fost clarificate rapid prin combinarea activităților endopoligalacturonazice (din Aspergillus niger) și pectinesterazice (din Aspergillus oryzae). Exopoligalacturonazele nu au avut efecte în astfel de procese, aceste enzime fiind adsorbite în proporție destul de mare pe protopectina din mere (Hara și alții 1986). Sucurile de grapefruit, sucuri mai rezistente în procesele care implică degradarea polimerilor pectici, au fost clarificate cu ajutorul unei pectin liaze izolate din Aspergillus sojae (Ishii și alții 1973). Clarificarea sucurilor de citrice, sucuri cu pH foarte acid a putut fi realizată prin acțiunea combinată a pectinesterazei ce se găsește în aceste sucuri și a poligalacturonazei din Corticium rolfesii. Poligalacturonaza biosintetizată de Corticium rolfesii are o utilitate deosebită, deoarece ea acționează la un pH foarte scăzut – 2,5 -, pH la care reacția enzimatică se desfășoară în condiții apropiate de cele aseptice (Tagawa și alții 1988).

Acțiunea combinată a enzimelor pectinolitice, celulazelor și hemicelulazelor poate conduce la lichefierea fructelor (Grassin și alții 1996)

Enzimele pectinolitice sunt utilizate în procesele de vinificație, mai ales pentru obținerea vinurilor din soiuri de struguri bogate în substanțe pectice (Colagrande și alții 1994). Extracția aromelor și a pigmenților vegetali se poate face cu ajutorul acestor enzime (Solehah și alții 1994)

În procesele tehnologice care urmăresc prelucrarea boabelor de cafea în vederea obținerii cafelei instant, utilizarea enzimelor pectinolitice s-a dovedit a fi eficientă (Vükari și alții 1993).

Enzimele pectinolitice au fost utilizate pentru macerarea fructelor și vegetalelor, pentru obținerea alimentelor pentru sugari și a piureurilor (Recourt și alții 1996, Dijkvan și alții 1996).

Înmuierea mai rapidă a fibrelor vegetale s-a realizat cu ajutorul enzimelor pectinolitice (Brumaro și alții 1993, Baracat-Pereira și alții 1993). O serie de studii au evidențiat îmbunătățirea calității țesăturilor atunci când fibrele de bumbac au fost tratate cu un amestec de hemicelulaze și pectinaze (Csizer și alții 2002, Sawado și alții 2001).

Amestecuri de enzime pectinolitice din surse microbiene au fost utilizate în prelucrarea biomasei vegetale (Kravtchenko și alții 1993). Prin intermediul acestor enzime se realizează astfel curățirea mediului și reciclarea resurselor naturale. Deșeurile rezultate în urma prelucrării citricelor sunt bogate în glucide, fapt care permite utilizare lor pentru producerea furajelor. Tratarea acestor deșeuri cu pectinesteraze microbiene are ca rezultat formarea pectatului de calciu concomitent cu apariția așa numitului “fenomen de coagulare“. Acest fenomen ușurează îndepărtarea apei, realizându-se și o economie de combustibil în procesele de uscare.

Pectinesteraza din Penicillium felutatum a fost utilizată de către Aizenberg (1996) pentru producerea pectinelor slab metilate, substanțe cu aplicații în medicină și în producerea hranei pentru diabetici.

Viteza cu care amidonul din plante este hidrolizat sub acțiunea glucoamilazei produse de Aspergillus niger a fost crescută în prezența unui amestec de endopoligalacturonază și pectinesterază obținut din specii de Rhizopus (Chitradon și alții 1996).

Multe procese biotehnologice folosite în industria alimentară se utilizează, alături de alte tipuri de enzime pectinolitice, pectinesteraza. Acțiunea pectinesterazei conduce la eliberarea de metanol, substanță toxică pentru organismele animale. În acest sens au fost efectuate teste toxicologice pe diferite animale. Administrarea orală, timp de 13 zile, a unei cantități de 10 g preparat proteic cu activitate pectinesterazică /kg corp, nu a afectat greutatea, semnele vitale, comportamentul sau parametrii biochimici ai șobolanilor (Lissau și alții 1998). Cu toate acestea, efectele fiziologice și nutriționale produse sub acțiunea metanolului trebuie avute în vedere.

Izolarea protoplaștilor din plante necesită prezența enzimelor pectinolitice, a celulazelor și hemicelulazelor (Ruesink și alții 1988).

Lacours (1994) a arătat că enzimele pectinolitice pot fi utilizate în caracterizarea taxonomică a speciilor de Gremmenniela.

Castaldo (1996) a pus la punct o metodă enzimatică pentru dozarea concentrațiilor de pectină cu ajutorul enzimelor pectinolitice. În această tehnică, acidul D-galacturonic, rezultat din degradarea pectinelor sub acțiunea pectinesterazei și a endopoligalacturonazei, este transformat în lactonă sub acțiunea unei glucuronolacton oxidaze. Acest proces este însoțit de o scădere a absorbanței la 340 nm, scădere datorată oxidării NADPH, cofactor al oxidazei. O metodă asemănătoare de determinare a concentrației pectinelor din fructe și vegetale a fost pusă la punct de Yoskioka (1992).

Enzimele pectinolitice au fost întrebuințate și în sinteza acidului ascorbic (Kulbe și alții 1987). În acest sens, pectina din mere a fost convertită, sub acțiunea pectinesterazei și endopoligalacturonazei, la acid D-galacturonic. Acidul galacturonic recuperat din hidrolizat prin electrodializă, a fost convertit la acid 2-ceto-L-galacturonic. Ciclizarea catalitică, acidă sau bazică, a cetoacidului a condus la obținerea acidului ascorbic.

Studii recente (Ruiz-Teran și alții 2001) au arătat o extracție de 3 ori mai eficientă a glucovanilinei (substanță din care se obține vanilina) din păstăile de mazăre în prezența enzimelor pectinolitice.

Bibliografie

Agravante, J., Matsui, T., Kitagawa, H. (1991). Changes in pectin methylesterase, polygalacturonase and pectic substances of ethanol and ethylene trated bananas during ripening. Nippon Skokukim Kogyo Gakkaishi, 38 , 127-132.

Aizenberg, V.L., Syrchin, S.A., Sedina, S.A., Shinkarenko, L.N., Demchenko,P.I., Vitte, P.N. (1996). Properties of pectinesterase from Penicillium fellutanum Biourge and new development in pectin applications. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 947-954.

Alaña, A., Llama, M., Serra, J. (1991). Purification and some properties of the pectin lyase from Penicillium italicum. FEBS Lett., 280, 335-340.

Albersheim, P., Killias, U. (1962). Studies relating to the purification and properties of pectin transeliminase. Arch. Biochem.Biophys., 97, 107-115.

Albersheim, P. (1975). The wall of growing plants cells. Scientific American, 3, 81-95.

Alghisi, P., Favaron, F. (1995). Pectin degrading enzymes and plant parasite interactions. Eur. J. Plant Pathol., 101, 365-375.

Alkorta, I., Garbisu, C., Llema, M.J., Serra, J.L. (1996). Immobilization of pectin lyase from Penicillium italicum by covalent binding to nylon. Enzyme Microb. Technol., 18, 141-146.

Antov, M.G., Pericin, D.M., Dimic, G.R. (2001). Cultivation of Polyporus squamosus for pectinase production in aqueous two-phase system containing sugar beet extraction waste. J. Biotechnol., 91, 83-87.

Baayer, R.P., Schofffellmmeer, E.A.M., Toet, S., Elgersma, D.M. (1997). Fungal polygalacturonase activity reflects susceptibility of carnation cultivars to Fusarium wilt. Eur. J. Plant Pathol.,103, 15-23.

Barnavon, L., Doco, T., Terrier, N., Ageorges, A., Romieu, C., Pellerin, P. (2001). Involvement of pectin methyl-esterase during the ripening of grape berries: partial cDNA isolation, transcript expression and changes in the degree of methyl-esterification of cell wall pectins. Phytochemistry, 58, 693-701.

Baracat-Perreira, M.C., Santas, V.M.C., Fernandes de Aranjo,E., Olzany, S.D. (1993). Partial caracterization of Aspergillus fumigatus polygalacturonases for the degumming of natural fibers. J. Ind. Microbiol., 11, 139-140.

Barnby, F.M., Morpeth, F.F., Pyle, D.L. (1990). Polygalacturonases production by anaerobic fermentation of Klyveromyces maxianus. Enzyme Microb. Technol., 12, 891-897.

Beldman, G., Mutter, M., Searle-van Leeuwen, M.J.F., Van Den Broek, L,A.M., Schols, H.A., Voragen, A.G.J. (1996). New enzymes active towards pectic structures. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],231-245.

Behere, A., Satyanarayan, V., Padwal-Desai, S.R. (1993). Separation and limited characterization of three polygalacturonases of Aspergillus niger. Enzyme Microb.Technol., 15, 158-161.

Biely, P., Benen, J.A.E., Kester H.C.M., Heinrichova, K., Visser, J. (1996a). Srereochemistry of hydrolysis of glycosidic linkage by three Aspergillus polygalacturonases. Prog. Biotechnol., 19, 706-710.

Biely, P., Benen, J.A.E., Heinrichova, K., Kester H.C.M., Visser, J. (1996b). Inversion of configuration during hydrolysis of -1,4-galacturonidic linkage by three Aspergillus polygalacturonases. FEBS Lett., 323, 249-255.

Blanco,P., Sieira, C., Diaz, A., Villa, T.G. (1994). Production and partial characterization of an endopolygalacturonase from S. Cerevisiae. Can.J. Microbiol., 40, 974-977.

Bonnin, E., Le Goff, A., Korner, R., Van Alebrek, G.W., Christensen, T.M., Voragen, A.G., Thibault, J. (2001). Study of the mode of action of endopolygalacturonase from Fusarium moniliforme. Biochem. Biophys. Acta, 1526, 301-309.

Braccini, I., Perez, S. (2001). Molecular basis of Ca 2+-induced gelation in alginates and pectins: the egg box model revisited. Biomacromolecules, 2, 1089-1096.

Bruhlmann, F. (1995). Purification and characterization of an extracellular pectate lyase from Amycolata sp. Appl. Environ. Microbiol., 61, 3580-3585.

Brumaro, M.H.N., Coelho, J.L.C., De Aranjo, E.F., Silva, D.A. (1993). Pectin lyase of P. griseoroseum related of deguming of ramie. J. Rev.Microbiol., 24, 175-178.

Camara Hurtado, M., Greve, L.C., Labavitch, J.M. (2002). Changes in cell wall pectins accompanying tomato (Lycopersicon esculentum Mill) paste manufacture. J. Agric. Food Chem., 50, 273-278.

Camardella, L., Carratore, V., Servillo, L., Giovane, A., Balestieri, C. (2000). Kivi protein inhibitor pectin methylesterase amino acid sequence and structural importance of two disulfide bridges. Eur. J. Biochem., 267, 1561-1565.

Capita, N.C., Defernez, M., Findlay, K., Wells, B., Shoue, D.A., Catchpole, G., Wilson, R.H., McCann, M.C. (2001). Cell wall aehitecture of the elongating maize coleoptide. Plant Physiol., 127, 551-565.

Cardello, L., Lourenco, E.J. (1995). Inhibitors of pectinesterases. Aliment. Nutr., 6, 25-37.

Chellegatli, M.A., Kawano, C.Y., Said, S., Fonseca, M.J. (2000). Sequential synthesis and secretion of pectinases by penicillium frequentans. J.Basic Microbiol., 40, 319-326.

Chen, E.M.W., Mort, A.J, Andrews, J., (1996). Nature of sites hydrolyzable by endopolygalacturonase in partially esterified homogalacturonans. Carbohydr. Polym., 29, 129-136.

Chilosi, G., Magro, P. (1997). Pectin lyase and polygalacturonase isoenzymes production by Botrytis cinerea during the early stages of infection on different host plants. J. Plant Pathol., 78, 61-69.

Chitradon, L., Poonpairoj, P., Mahakahan, P., Kitpreechavanich, V., Lotong, N. (1996). Pectinases from Rhizopus sp. efficient in enhancing the hydrolyzation of raw cassaya starch: purification and characterization. Prog. Biotechnol., 14 [Pectins and pectinases], 715-722.

Cho, S.W., Lee, S., Shin, W. (2001). The X-ray structure of Aspergillus aculeatus polygalacturonase and a modeled structure of the polygalacturonase-octopolygalacturonate complex. J.Mol.Biol., 311, 863-878

Colagrande, o., Silva, A., Fumi, M.D. (1994). Recent applications of biotechnology in wine production. Biotechnol. Prog., 10, 2-18.

Cooke, R.D., Ferber, E.M., Kanagasabapathy, H. (1976). Purification and characterization of polygalacturonase from a commercial Aspergillus niger preparation. Biochim. Biophys. Acta, 452, 440-44.

Cosgrove D.J. (1997). Assembly and enlargement of the primary cell wall in plants. Annu.Rev.CellDev.Bio., 13, 171-201

Crotti, L.B., Jorge, J.A., Terezi, H.T., Polizeli, M.L.T. (1996). Purification and characterization of galactase induced pectinase from the exo 1-mutant strain of Neurospora crassa. Prog. Biotechnol., 14 [Pectins and pectinases], 787-792.

Csiszar, E., Losonczi, A., Szabacs, G., Ruszuals, I., Reicher, J. (2001). Enzymes and chelating agent in cotton pretreatment. J. Biotechnol., 89, 271-279.

Demain, A.L., Phaff, H.J. (1954). J. Biol. Chem., 210 , 381-393, citati dupã Rexová-Benková, L., Marcovic, O. (1976). Pectic enzymes. In Advancces in carbohydrate chemistry and bichemistry, editori Tripton, R.S. si Horton, D., vol. 33, pag. 347.

Devi, N.A., Rao, A.G. (1996). Fractionation, purification and preliminary characterization of polygalacturonase from Aspergillus carbonarius. Enzyme Microb. Technol., 18, 59-65.

Dick, A.J. (1989). Cell wall metabolism in ripening fruit. Part II. Characterization of pectic polysaccharides solubilized during softening of Bartlett pear fruit. Plant Physiol.,89, 1394-1400.

Dijkvan, C. (1996). Pectins and pectolytic enzymes in relation to development and processing of green beans (Phaaseolus vulgaris L ). Prog. Biotechnol., 19, 399-404.

Dinu, D., Dumitru, I.F. (1997). Isolation and partial characterization of a pectinesterase from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett., 2, 489-494.

Dinu, D., Dumitru, I.F. (1998). Studies concerning the purification and properties of pectate lyase isolated from Aspergillus niger. Roum. Biotechnol. Lett., 3, 23-29.

Dinu, D. (1999). Pectic enzymes produced by Aspergillus niger MIUG 16 in solid-state fermentation on wheat bran and beet draft.. Roum. Biotechnol. Lett., 4, 287-293.

Di Pietro, A., Roncero, M.J.G. (1996). Purification and characterization of a pectate lyase from Fusarium oxysporum f. sp. Lycopersici produced on tomato vascular tissue. Physiol. Mol. Plant Pathol., 49 , 177-185.

Duwe, B., Kha, N.G., Nguyen, Q. (1996). Site-directed mutagenesis of the active site of pectin methylesterase from Aspergillus niger RH 5344. Biotechnol. Lett., 18, 621-626.

Elegado, F.B., Fujio, Y. (1994). Purification and some properties of endopolygalacturonase from Rhizopus sp LKN. World J. Microbiol. Biotechnol., 10, 256-259.

Elumalai, R.P., Mahadevan, A. (1995). Characterization of pectate lyase produced by Pseudomonas marginalis and cloning of pectate lyase genes. Physiol. Molec. Plant Pathol., 46, 109-119.

Errampalli, D., Kohn, L.M. (1995). Comparison of pectic zymograms produced by produced by different clones of Sclerotinia sclerotiorum in culture. Phytopathology, 85, 292-296.

Federici, l., Caprari, C., Mattei, B., Sanno, C., Matteo, A., De Lorenzo, G., Cervone, F., Tsernoglou, D. (2001). Structural requirements of endopolygalacturonase for interaction with PGIP (polygalacturonase-inhibiting protein). Proc. Natl. Acad. Sci., 98, 13425-13430.

Fiedurek, J., Ilczuk, L. (1983). Acta Alimentaria Polonica, 9, 89-92, citat din Chemical Abstract, vol. 101, 166843f (1984).

Flavaran, f., Davidio, R., Porcedder, F., Alghidi, P. (1994). Purification and characterization of a soybeen polygalacturonase inhibiting protein. Planta, 195, 80-87.

Förster, H. (1988). Pectinesterases from Phytophthora infestans. In Methods in Enzymology, vol. 161, pag. 335-350.

Garcia-Maceira, F.I., Di Pietro, A., Huertes-Gonzalez, M.D., Ruiz-Roldau, M.I. (2001). Molecular characterization of an endopolygalacturonase from Fusarium oxysporum expressed during early stages of infection. Appl. Envirom. Microbiol. 67, 2191-2196.

Gardner, J.M., Kado, C.I. (1976). Polygalacturonic acid transeliminase in osmotic shock fluid of Erwinia rubrifaciens: characterization of the purified enzyme and its effect on plant cells. J. Bacteriol., 127, 451-460.

Giovane, A., Balestieri, C., Quagliuolo, L., Castaldo, C., Servillo, L. (1995). A glycoprotein inhibitor of pectin methylesterase in kiwi fruits. Purification by affinity chromatography and evidence of a ripening related precursor. Eur. J. Biochem., 233, 926-929.

Gomes, S., Simon, G., Belarbi, A. (2001). Regulation of the expression of endopolygalacturonase gene PGU 1 in Saccharomices. Yeast, 18, 423-432.

Grassin, C., Fauquembergue, P. (1996). Application of pectinases in beverages. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases],453-462.

Guevara, M.A., Gonzales J.M.T., Estevez, P. (1997). Multiple forms of pectic lyase and polygalacturonase from Fusarium oxysporum f. sp. Radicis lycopersici: regulation of their synthesis by galacturonic acid. Can. J. Microbiol., 43, 245-253.

Hang, Y.D., Woodams, E.E. (1994). Production of fungal polygalacturonase from apple pomace. Food Sci . Technol., 27, 194-197.

Hara, T., Lim, J.Y., Fujio, Y. (1984). Purification and some properties of exo-polygalacturonase from Aspergillus niger cultured in the medium containg Satsuma mandarin peel. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 31, 581-586.

Hara, T., Fujio, Y., Ueda, S. (1986). Clarification of apple with polygalacturonase of Aspergillus niger and pectinesterase of Aspergillus oryzae ang their protopectin adsorption and degradation behaviour. Nippon Shokuhin Kogyo Gakkaishi, 33, 336-341.

Heinrichová, K., Rexová-Benková, L. (1976). Purification and characterization of an exo-D-galacturonase of Aspergillus niger. Biochim. Biophys. Acta, 422, 349-356.

Heinrichová, K., Dzurova, M., Rexová-Benková, L. (1992). Mechanism of action of D-galacturonan digalacturonohydrolase of Selenomonas ruminatium on oligo-galactosiduronic acids. Carbohydr. Res., 235, 269-280.

Heinrichová, K., Stachova, M. (1994). Pectinolytic enzymes of Clostridium lochheadii. Biologia (Bratislava), 49, 813-818.

Hennink, A., Ham, H., van Oort, M.G. (1996). Production, characterization and application of rhamnogalacturonase. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 485-494.

Henrissat, B., Heffron, S.E., Yoder, M.D., Lietzke, S., Yurnak, F. (1995). Functional implications of structure-based sequence alignment of proteins in the extracellular pectate lyase superfamily. Plant Physiol., 107, 963-976.

Iguchi, K., Kishida, M., Sakai, T. (1996). Purification and characterization of three extracellular protopectinases with polygalacturonase activities from Trichosporon penicillatum. Biosci. Biotechnol. Biochem., 60, 603-607.

James, J.., Dubery, A. (2001). Inhibition of polygalacturonase from Verticillium dahliae by a polygalacturonase inhibiting protein from cotton. Phytochemistry, 52, 149-156.

Jia, J., Wheals, A. (2000). Endopolygalacturonase genes and enzymes from Saccharomices cerevisiae and Kluyveromyces maxianus. Curr. Genet., 38, 264-270.

Johnston, D.J., Rammanathan, V., Williamson, B. (1993). A protein from immature raspberry fruits which inhibits endopolygalacturonase from Botrytis cinerea and other microorganisms. J. Exp. Bot., 44, 971-976.

Jurnak, F., Kita, N., Garrett, M., Heffron, S.E., Scavetta, R., Boyd, C., Keen, N. (1996). Functional implications of the three-dimensional structures of pectate lyases. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 295-308.

Joyce, A.M., Fogarty, W.M. (1975). Proc.Soc. Gen. Microbiol., 3, 79-89, citați după Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. In Microbial enzymes and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 157.

Kester, H.C.M., Kustters-van-Someren, M.A., Margo, A., Mueller, Y., Visser, J. (1996a). Primary structure and characterization of an exopoligalacturonase from Aspergillus tubingensis. Eur. J. Biochem., 240, 738-746.

Kester, H.C.M., Kustters-van-Someren, M.A., Muller, Y., Visser, J. (1996b). The exo-polygalacturonase from Aspergillus tubingensis: characterization and cloning of the gene. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases], 817-823.

Kester. H.C.M., Benen, J.A., Visser, J., Orlando, R., Bermann, C., Magaud, D., Anker, D., Douthean, A. (2000). Tandem mass spectrometric analysis of Aspergillus niger pectin methylesterase: mode of action on fully methylesterified oligogalacturonates. Biochem. J., 349(part 2), 469-474.

Khahn, O.N., Ruthamski, E., Leidinger, K. (1991). Characterization and expression of a genomic pectin methylesterase-encoding gene in Aspergillus niger. Gene, 106, 717-720.

Kobajaschi, T., Higoki, N., Yajima, N., Suzumatsu, A., Hagilava, H., Kawai, S., Ito, S. (2001). Purification and properties of a galacturonic acid realising exopoligalacturonase from a strain of Bacillus. Biosci. Biotechnol. Biochem., 65, 842-847.

Koller, A., Neukom, H. (1969). Research on the degradation mecanism of a purified polygalacturonase from Aspergillus niger. Eur. J. Biochem., 7, 485-489.

Konno, H. (1988). Endopectate lyase from Erwinia aroideae. In Methods in Enzymology, editori Wood, W.A. si Kellogg S.T., vol. 161, pag. 381-385.

Kravtchenko, T.P., Penci, M., Voragen, A.G.J., Pilnik, W. (1993). Enzymic and chemical degradation of some industrial pectins. Carbohydr. Polym., 20, 195-205.

Kulbe, K.D. (1987). Enzymatic synthesis of L-ascorbic acid via D-uronic acids membrane-reactor integrated recovery of D-galacturonic acid from pectin hydrolysates. Ann. N.Y.Acad. Sci., 506, 543-551.

Lacours, N., Toti, L., Sieber, T.N., Petrini, O. (1994). Pectic enzyme patterns as a taxonomic tool for characterization of Gremmennielo sp. Isolates. Can. J. Bot., 74, 891-896.

Laangley, K.R., Martin,A., Stenning, R., Murray, A.J., Hobson, G.E., Schuch, W., Bird, C.R. (1994). Mecanical and optical assessment of the ripening of tomato fruit with reduced polygalacturonase activity. J. Sci. Food Agric., 66, 547-554.

Laurent, F., Kotoujansky A., Berteau, Y. (2000). Overproduction in E.Coli of pectin methylesterase from Erwinia chrysanthemi 3937: one-step purification, bichemical characterization, and production of polyclonal antibodies. Can. J. Microbiol., 46, 474-480.

Lietzki, S., Yader, K., Jurnak, F. (1994). The three-dimensional structure of pectate lyase E, a plant virulance factor from Erwinia chrysanthemi. Plant Physiol., 106, 849-862.

Lim, Y.K., Yamasaki, Y., Suzuki, Y., Ozawa, J. (1980). J. Agric.Biol., 44, 473-476, citati dupã Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectinolytic enzymes. In Microbial enzymes and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 151.

Lim, J.Y., Fujio, Y., Ueda, S. (1983). Purification and characterization of pectinesterase and pectin lyase from Aspergillus oryzae A-3. J. Appl. Biochem., 5, 91-98.

Lissau, B.G., Pedersen, P.B., Petersen, B.R., Budolfsen, G. (1998). Safety evaluation of a funga pectinesterase enzyme preparation and the use in food. Food Addit. Contam., 15, 627-636.

Liu, Y.K., Luh, B.S. (1978). Purification and characterization of endopolygalacturonase from Rhizopus arrhizus. J. Food Sci., 43, 721-726.

MacKinnen, J.M., Jardine, W.G., OKennedy, N., Renard, C.M., Jarvis, M.C. (2002). Pectin methyl and nonmethyl esters in potato cell walls. J. Agric. Food Chem., 50, 342-346.

MacMillan, J.D., Phaff, H.J. (1966). Exo-polygalacturonase lyase from Clostridium multifermentans. In Methods in enzymology, editori Neufeld, E.F. si Ginsburg, V., Academic Press, vol. VIII, pag 632- 645.

Maldonado, M.C., Shasser de Sad, A.M., Callieri, D.A.S. (1994). Purification and characterization of pectinesterase produced by a strain of Apergillus niger. Curr. Microbiol. 28, 193-196.

Maldonado, M.C., Shasser de Sad, A.M. (1998). Production of pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solide state systems. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 20, 34-38.

Manachini, P.L. (1988). Pectic enzymes from Aureobasidium pullulans LV 10. Enzyme Microbiol. Technol., 10, 682-685.

Manjou, A., Ibarro, J.L., Romaro, C., Canovas, M. (1992). Properties of pectinesterase and endo-D-polygalacturonase coimmobilized in a porous glass support. Appl. Biochem. Biotechnol., 32, 19-31.

Marcovic, O. (1989). Biologia (Bratislava), 44, 1185-1189, citat din Chemical abstracts, vol. 113, 147666g (1990).

Marcovic, O., Stovicková, J., Joernvall, H. (1996). Modification of tomato and Aspergillus niger pectinesterase with diethyl pyrocarbonate.. Protein Chem., 15, 127-130.

Martel, M.B., Letoublon, R., Fevre, M. (1998). Purification and characterization of two endopolygalacturonase secreted during the early stages of the saprophytic growth of Sclerotinia Sclerotiorum. FEMS Microbiol. Lett., 158, 133-138.

Mattei, B., Salvi, G., Caprari, C., Lorrenzo, G., Crescenzi, V., Cervone, F. (1996). Analysis of interaction between PGIP from Phaseoleus vulgaris L anf fungal endopolygalacturonase using biosensor technology. Prog. Biotechnol., 14 [ Pectins and pectinases],775-782.

Mayer, A.S., Koser, C., Adler-Nissen, J. (2001). Efficiency of enzymatic and other alternative clarification and fining treatments and haze in chery. J. Agric. Food Chem., 49, 3644-3650.

Mc Millan, G.P., Idnston, D.I., Perombelon, M.C. (1992). Purification to homoganity of extracellular polygalacturonase and isoenzymes of pectate lyase of Erwinia carotovora, subs. atroseptica by column chromatography. J. Appl. Bacteriol., 73, 83-86.

Mikhailová, R.V., Sapunová, L.I, Lobanok, A.G. (1994). Biosynthesis of pectin lyases in Penicillium adametzi, Penicillium citricum, Penicillium janthinellum. Word J. Microbiol. Biotechnol., 10, 457-461.

Mikhailová, R.V., Sapunová, L.I, Lobanok, A.G. (1995). The three polygalacturonases constitutively synthesized by Aspergillus alliaceus. World J. Microbiol. Biotechnol., 11, 330-332.

Miller, L., Macmillan, J.D. (1970). Mode of action of pectic enzymes. II. Further purification of exopolygalacturonate lyase and pectinesterase from Clostridium multifermentans. J. Bacteriology., 102, 72-78.

Miller, L., Macmillan, J.D. (1971). Purification and pattern action of pectinesterase from Fusarium oxysporum f.sp. vasinfectum. Biochemistry, 10, 570-576.

Mountfort, D.O., Atkinson,M. (1995). Evidence for the role of Na+ ang galacturonic acid in the regulation of polygalacturonase production by marine anaerobe Eubacterium sp. Strain P-1. Botanica Marina, 38, 195-201.

Nakagawa, T., Miyaji, T., Yurimoto, H., Sakai, H., Kato, N., Tomizuko, N. (2000). A methylotrophic pathway participates in pectin utilization by Candida boidimii. Appl. Envirom. Microbiol., 66, 4253-4257.

Nakamura, T., Hours, R.A., Sakai, T. (1995). Enzymatic maceration of vegetables with protopectinases. J.Food Sci., 60, 468-472.

Nikaidou, N., Naganuno, T., Kamio, Y., Izaki, K. (1995). Production, purification, and properties of a pectin lyase from Pseudomonas marginalis N 6301. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 320-324.

Niture S.K., Pant, A., Kuma, A.R. (2001). Active site characterization of the single endopolygalacturonase produced by F. moniliforme NCIM 1276. Eur. J. Biochem., 268, 832-840.

O’Neill, M., Albersheim, P., Darvill, A. (1990). The pectic polysaccharides of primary cell wall. În Methods in Enzymology, vol. 2, pag. 415-441.

Pickersgill, R., Jenkins, J., Nasser, H., Robert-Boudouy, J. (1994). The structure of Bacillus subtilis pectate lyase in complex with calcium. Nat. Struct. Biol., 1, 712-723.

Pitkanen, K., Heikinheimo, R., Pakkanen, R. (1992). Purification and characterization of Erwinia chtysanthemi B 374 pectin methylesterase produced by Bacillus subtilis. Enzyme Microb. Technol., 14, 832-836.

Preston, J.F., Rice, J.D., Jugan,O., Keen, N.T. (1992). Differential depolymerization mechanisms of pectate lyases secreted by Erwinia chrysanthemi EC 16. J. Bacteriol., 174, 2039-2042.

Prusky, D. (1989). Purification and characterization of an endopolygalacturonase produced by Colletotrichum gloeosporioides. Physiol. Mol. Plant Pathol., 35, 121-133.

Ralet, M-C, Dronnet, V., Buchholt, H.C. Thibault, J-F. (2001). Enzymatically and chemically de-esterfied lime pectins: characterization, polyelectrolyte behaviour and calcium binding properties.. Carbohydr. Res., 336, 117-125.

Rao, M., Narsimha, K., Asha, A., Pant, A. (1996a). Role of lysine, tryptophan and calcium in the -elimination activity of a low molecular-mass pectate lyase from Fusarium moniliforme. Biochem. J., 319, 159-164.

Rao, M., Narsimha, K., Asha, A., Pant, A. (1996b). Implication of tryptophan anh histidine in the active site of endo-polygalacturonase from Aspergillus ustus: elucidation of the reaction mechanism. Biochim. Biophys Acta, 1296, 167-176.

Recourt, K., Stolle-Smith, T., Laats J.M., Beekhuizan, J.G., Eddelaan, C.E.M., Voragen, A.G.J., Wichers, H.I. (1996). Pectins and pectolytic enzymes in relation to development and processing of green beans (Phaseolus vulgaris L). Prog. Biotechnol.,

19, 399-404.

Reddy, S.R., Reddy, S.M. (1983). Comp. Physiol. Ecol., 8, 69, citati după Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. În Microbial enzymes and biotechnology (ediția a 2 a), editori Fogarty, W.M. și Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 155.

Reignault, P., Mercier, M., Bompeix, G., Boccara, M. (1994). Pectin methylesterase from Botrytis cinerea: physiological, biochemical and immunochemical studies. Microbiology., 140, 3249-3255.

Rexová-Benková, L., Marcovic, O. (1976). Pectic enzymes. In Advancces in carbohydrate chemistry and bichemistry,editori Tripton, R.S. si Horton, D., vol. 33, pag. 323-381.

Rexová-Benková, L., Mracková, M. (1978). Active groups of extracellular endo-D-galacturonase of Aspergillus niger derived from pH effect on kinetic data. Biochim. Biophys. Acta, 523, 162-169.

Rho, E., Park, H.J., Kim, M.O., Chung, Y.R., Lee, C.W. (2001). Expression of exopolygalacturonase in Botrytis cinerea. FEMS Microbiol. Lett., 201, 105-109.

Rijssel, M., Geewig, J.G., Hansan,A.T.(1993). Isolation and characterization of an extracellular glycosylated protein complex from Clostridium thermossaccharolyticum with pectic methylesterase and polygalacturonate hydrolases activities. Appl. Environ. Microbiol., 59, 828-836.

Rodriguezpalenzuela, P., Burr, T.J., Collmer, A. (1991). Polygalacturonase is a vitulence factor in A. grobacterium tumefianas. J. Bacteriol., 173, 6547-6552.

Rombouts, F.M., Pilnik, W. (1980). Pectic enzymes.În Economic microbiology:enzymes and bioconversion, editor Ros, A.H., Academic Press, New York, vol. 5, pag. 227-282.

Ruiz-Teran, F., Perez-Amador, I., Lopez-Munguia, A. (2001). Enzymatic extraction and transformation of glucovanillin to vanillin from vanilla green pods. J. Agric. Chem., 49, 5207-5209.

Sakai, T. (1988). Protopectinase from yeasts and yeasts like fungus. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 366-373.

Sakai, T., Sakamoto, T., Hallaert, J., Vandamme, E.J. (1993). Pectin, pectinase and protopectinase: production, properties, and applications. Adv. Appl. Microbiol. 39, 213-290.

Sakellaris, G. (1989a). Production, purification and characterization of extracellular pectinesterase from Lactobacillus plantarum Biotechnol. Appl. Biotechnol., 11, 503-507.

Sakellaris, G. (1989b). Purification and characterization of an extracellular polygalacturonaase from Lactobacillus plantarum strain B A 11. J.Appl. Bacteriol., 67, 77-85.

Sakiyama, C.C., Paula, E.M., Pereira, P.C., Borges, A.C., Silva, D. (2001). Characterization of pectin lyase produced by an endophylic strain isolated from cofee cherries. Lett. Appl. Microbiol., 33, 117-121.

Salinas, J., Verhoeff, J. (1995). Microscopical studies of the infection on gerbera flowers by Botrytis cinerea. J. Plant Pathology, 101, 377-386.

Sawada, K., Ueda, M. (2001). Enzyme processing of textiles in reverse micellar solution. J. Biotechnol., 89, 263-269.

Schejter, A., Marcus, L. (1988). Isozymes of pectinase and polygalacturonase from Botrytis cinerea Pers. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 366-373.

Shanley, N.A., Van den Broek, L.A.M., Voragen, A.G.J., Coughlan, M.P. (1993a). Izolation and characterization of an endopolygalacturonase from phanerochaete chrysosporium. J. Biotechnol., 28, 179-197.

Shanley, N.A., Van den Broek, L.A.M., Voragen, A.G.J., Coughlan, M.P. (1993b). Physicochemical and catalytic properties of three endopolygalacturonase from Penicillium pinophilum. J. Biotechnol., 28, 199-218.

Shevchik, V.E., Condemine, G., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N., Robert-Boudouy, J. (1996a). Characterization of pectin methylesterase B, an outer membrane lipoprotein of Erwinia chrysanthemi 3937. Mol. Microbiol., 19, 455-466.

Shevchik, V.E., Condemine, G., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N., Robert-Baudouy, J. (1996b). Pectin methylesterase B of Erwinia chrysanthemi, the first pectinase characterized as a membrane lipoprotein. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 837-844.

Shevchik, V.E., Hugouvieux-Cotte-Pattat, N. (1997). Identification of a bacterial pectin acetyl esterase in Echerichia coli 3937. Mol. Microbiol. 24, 1285-1301.

Silley, P. (1985). A note on pectolytic enzymes of Lachnospira multiparus. J. Appl. Bacteriol., 58, 145-149.

Solehah, A., Balaumani, K.D., Amizo, M.A. (1994). Enzymes for improved extraction and stabilization of colour and flavour of orange juice. J. food Sci. Technol., 31, 508-510.

Solis, S., Flores, M.E., Huitron, C. (1997). Improvement of pectinase production by interspecific hybrids of Aspergillus strains. Lett. Microbiol., 24, 77-81.

Statilová, E., Markovic, O., Skrovinová, D., Jörnavall, H. (1993). Pectinase of Aspergillus sp. polygalacturonase: multiplicity, divergence, and structural patterns linking fungal, bacterial and plant polygalacturonases. J. Protein Chem., 12, 15-22.

Statilová, E., Breierová, E., Vadkertiová, R. (1996a). Candida boidinii-a new found producer of pectic enzymes complex. Prog. Biotechnol., 14, [Pectins and pectinases], 453-462.

Statilová, E., Dzurová, M., Markovic, O., Jörnavall, H. (1996a). An essential tyrosine rezidue of Aspergillus polygalacturonase. FEBS Lett., 382, 140-146.

Statilová, E., Mislovicová, D., Kacuraková, M., Machová, E., Kolarová, M., Markovic, O., Jörnavall, H. (1998b). The glycoprotein character of multiple forms of Aspergillus polygalacturonases. J. Protein Chem., 17, 173-179.

Stotz,H.V., Powell, A.L.T., Damon, S.E., Greve, L.C., Bennett, A.B., Labavitch, J.M. (1993). Molecular characterization of a polygalacturonase from Pyrus communis L. cv. Bartlett. Plant Physiol., 102, 130-138.

Stotz,H.V., Contos, J.A., Powell, A.L.T., Bennett, A.E., Labavitch, J.M. (1994). Structure and expression of an inhibitor of fungal polygalacturonases from tomato. Plant Mol. Biol., 25, 607-617.

Tagawa, K., Kaji, A. (1988). Polygalacturonase from Corticium rolfsii. In Methods in enzymology (Biomass, Part B ), editori Wood, W.A. si Kellogg, S.T., Academic Press, vol. 161,pag. 361-365.

Takao, M., Nakaniwa, T., Yoshikawa, K., Terashita, T., Sakai, T. (2001). Purification and characterization of thermostable pectate lyase with protopectinase activity from thermophillic Bacillus sp. TS 47. Biosci. Biotechnol. Biochem., 64, 2360-2367.

Tierny, Y., Bechat, M., Joncquiert, J-C., Dubourguier, H-C., Guillaume, J. (1994). Molecular cloning and expression in Escherichia coli og genes encoding lyase and pectin methylesterase activities from Bacteroides thetarotaomicron. J. Appl. Bacteriol., 76, 592-602.

ten-Have, A., Breuil, W.O., Wublen, J., Visser, J., van Kar, J. (2001). Botrytis cinerea endopolygalacturonase genes are differentially expressed in various plant tissues. Fungal Genet. Biol., 33, 97-105.

Treman, D,M., Handa, A.K. (1994). Reduction of pectin methylesterase activity modifies tissue integrity and cation levels in ripening tomato fruits. Plant Physiol., 106, 429-436.

Ueda, S., Fujio, Y., Liu, J.V. (1982). Pectic enzymes from Aspergillus oryzae. J. Appl. Biochem., 4, 524-535.

Vilanova, M., Blanco, P., Cortes, S., Villa, T.G., Siliro, C. (2000). Use a PGU 1 recombinat saccharomyces cerevisiae strain in oenological fermentations. J. Appl. Microbiol., 89, 876-883.

Vucari, L, Tenkanen, M, Buchert, J., Rathrö, M., Barley, M., Linko, M. (1993). In bioconversion of forest and agricultural plant residues, editor Saddler, J.N., International Oxford, pag. 131-182.

Wattad, C., Freeman, S., Dinoor, A., Pruski, D. (1995). Colletotrichum magna is deficient in extracellular secretion of pectate lyase. Mol. Plant-Microbe Interact., 8, 621-626.

Whitaker, J.R. (1990). Microbial pectolytic enzymes. In Microbial enzymes and biotechnology (editia a 2 a), editori Fogarty, W.M. si Kelly, C., Elsevier Applied Science, London, pag. 133-176.

Yamaguchi, F., Inoue, S., Hatanaka, C. (1995). Purification and properties of endo-1,4-D-galacturonase from Aspergillus niger. Biosci. Biotechnol. Biochem., 59, 1742-1744.

Yang, H.A., Zhou, J., Sivasithamparam, H., Tommerup, I.C., Barton, J.E., Obrien, P.A. (1994). Genetic variability in pectic enzymes of Rhizoctonia solarii isolates causing bare-patch disease of cereals. J. Phytopathology, 141, 259-266.

Yao, C., Conway, W.S., Sams, C.E. (1995). Purification and characterization of a polygalacturonase produced by Penicillium expansum in apple fruit. Phytopathology, 86, 1160-1166.

Yoder, M.D., Keen, N.T., Jurnak, F. (1993a). New domain motif of the structure of pectate lyase C, a novel secreted plant virulance factor. Science, 260, 1903-1907.

Yoder, M.D., Lietzke,S.E., Jurnak, F. (1993b). Unusual structural features in the parallel -helix in pectate lyases. Structure, 1, 241-251.

Yoskioka, S., Ukedo, H., Matsunuoto, K., Osajimo, Y. (1992). Enzymatic determination of pectin and related lower-molecular weight compounds in fruits and vegetables using polygalacturonase, pectinesterase, glucuronolactone reductase and ascorbat axidase. Nippon Skokukin Kogyo, 39, 821-826.