Enzime Implicate In Procese Industriale

LUCRARE DE DIZERTAȚIE

Enzime

implicate în procese industriale

Cuprins

Scurt istoric

1. Caracterizarea generală a enzimelor.

2. Clasificarea enzimelor.

3. Mecanismul de acțiune enzimatică

3.1 Specificitatea enzimelor

3.1.1 Specificitatea de reacție

3.1.2 Specificitatea de substrat

4. Cinetica enzimatică

4.1 Influența temperaturii asupra activității enzimatice

4.2 Influența pH-ului

4.3 Influența presiunii și a radiatiilor

4.4 Influența efectorilor asupra activitatii enzimelor

5. Utilizarea enzimelor în diferite domenii de activitate

5.1 Indicatorii de calitate în industria alimentara.

5.2 Hidroliza amidonului și producerea fructozei

5.3 Obținerea băuturilor

5.4 Obținerea monozaharidelor non-naturale,

5.5 Industria laptelui

5.6 Utilizarea enzimelor în panificație

5.7. Industria textilă

5.8 Detergenti

5.9 Utilizarea enzimelor în industria chimică

5.10 Utilizarea enzimelor în ingineria genetică

5.11 Epurarea biologică a apelor

5.12 Fiziologia și patologia plantelor

5.13 Prelucrarea biomasei vegetale

5.14 Utilizarea enzimelor din microorganisme în sinteza chimica

5.15 Hrana animalelor

5.16 Utilizarea unor enzime în medicină

6. Imobilizarea enzimelor

6.1 Imobilizarea enzimelor pe suporturi insolubile

6.1.1 Adsorbtia si legarea ionica

6.1.2 Legarea covalenta

6.2 Imobilizarea prin reticulare

6.3 Imobilizarea prin încapsulare

6.3.1 Incapsularea tip rețea

6.3.2. Microîncapsularea

Concluzii

Bibliografie

Enzime implicate în procese industriale

Scurt istoric

Reacțiile enzimatice au fost folosite din timpurile cele mai vechi pentru fabricarea vinului, a oțetului, a berii și a brânzei. O cercetare sistematică a lor a fost întreprinsă abia în epoca modernă. În 1713, Réaumur a observat dizolvarea cărnii în sucul stomacal al ciorii. De asemenea, fiziologul Spallanzani (1783) a hrănit animalele cu bucăți de carne învelite în rețele de sârmă și a observat dizolvarea cărnii în stomac. Lavoisier (1789) a făcut un bilanț de materiale al fermentației, arătând că oxigenul, hidrogenul și carbonul din zahăr se regăsesc în alcoolul și bioxidul de carbon ce iau naștere. O contribuție importantă în studiul fermentației alcoolice au avut-o Cagnard-Latour (1838), Kützing (1838) și Liebig (1839).

Buchner (1897) a izolat din drojdia de bere un suc independent de celulă capabil să provoace fermentație, pe care el a numit-o zimază și care mai târziu s-a dovedit a fi un amestec de mai multe enzime. În cursul secolului al XIX-lea, au fost preparate mai multe extracte de enzime.

Kirchoff și Dubrunfaut au descoperit că extractul apos de malț din orez transformă amidonul într-un zahăr solubil numit maltoză. Din acest extract, Payen și Persoz (1833) au izolat prin precipitare cu etanol, prima enzimă, amilaza, sub forma unui material solid alb, amorf, capabil să solubilizeze o cantitate de amidon de 2000 de ori mai mare decât propria sa greutate. Mai târziu s-a făcut hidroliza amigdalinei cu extract de migdale amare, iar Wohler și Leibig au izolat emulsina.

Un moment istoric deosebit de important este recunoașterea clară, de către Berzelius, în 1835, a caracterului catalitic al reacțiilor enzimatice, precum și a rolului vital al acestora în organismele vii.

Caracterizarea generală a enzimelor.

Descoperirea enzimelor datează din secolul al XIX-lea, grație lui Louis Pasteur, care a concluzionat, studiind fermentarea zahărului la alcool sub influența drojdiilor, că „fermentația este un proces corelat cu viața și organizarea celulelor de drojdie, nu cu moartea sau putrezirea lor”, denumind catalizorul dedus „ferment”; de altfel, descompunerea cărnii de către secrețiile stomacale și conversia amidonului la zaharuri de către extracte din plante sau salivă erau cunoscute de la sfârșitul secolului al XVIII-lea, dar mecanismul nu fusese identificat.

Termenul de enzimă a fost enunțat pentru prima oară în 1878 de Wilhelm Kühne, provenind din grecescul „enzimos”, tradus prin expresia „în interiorul aluatului”, iar prima enzimă izolată datează din 1897, când Eduard Buchner a observat că fermentarea zahărului continuă chiar dacă nu mai există drojdie în amestec, denumind „zimază” substanța responsabilă de acest proces.

Enzimele sunt componente de natura proteică produse de celulele vii , care catalizează reactiile de sinteză și/sau degradare din organismele vegetale, animale și microorganisme. Studiile cinetice asupra sistemelor biologice au pus în evidență existența unui număr impresionant de mare de procese care decurg în organismele vii sau în sisteme derivate din organismele vii.

Enzimele joacă un rol vital în metabolismul bacterian, care este condiționat de prezența în mediu a materialelor necesare speciei pentru sinteza constituenților celulari și producerea de energie. Pătrunderea acestor substanțe în celulă se realizează în două faze: descompunerea și traversarea membranei citoplasmatice (Zarnea, 1970, p. 169).

Implicarea enzimelor este obligatorie în prima fază, cea a descompunerii (degradarea se produce sub influența enzimelor microbiene localizate la suprafața celulei), și facultativă în cea de-a doua, unde depinde de tipul de substanță care traversează membrana citoplasmatică: în cazul transportului activ al substanțelor în celulă, sunt implicate enzime specifice – permeazele – ce asigură pătrunderea în celulă a unor substanțe (de exemplu β-galactozid-permeaza E.coli asigură transportul activ al β-galactozidazelor).

Enzimele sunt implicate și în degradarea substratului nutritiv, desfășurată prin intermediul reacțiilor catabolice de degradare, proces în trei faze distincte: descompunerea macromoleculelor la unitățile lor de construcție – proteine la aminoacizi, grăsimi la glicerol și acizi grași, glucide la hexoze –, descompunerea parțială a produșilor rezultați cu formare de CO2, H2O și un număr variabil de alte substanțe, și o a treia etapă, realizată fie pe calea ciclului acizilor tricarboxilici, la microorganismele care pot descompune integral substanțele nutritive, fie prin reacții de fermentare, în care produșii căilor catabolice servesc ca acceptori sau donatori de hidrogen în reacții cuplate de oxido-reducere. Procesul respectiv (succesiunea de reacții) nu este spontan, el având nevoie de participarea mai multor enzime specifice – dehidrazele.

Enzimele au rol important și în metabolismul energetic al bacteriilor, în fiecare din cele două faze: eliberarea fracționată a energiei și stocarea excesului pentru reutilizare . Eliberarea fracționată a energiei, spre exemplu, cuprinde o serie de oxido-reduceri succesive, catalizate de enzimele respiratorii (dehidrazele) care alcătuiesc sistemul transportor de electroni sau catena de respirație celulară, enzime active în prezența unor coenzime care servesc ca acceptori tranzitori de H de la un substrat la altul. În ceea ce privește stocarea energiei suplimentare, rolul enzimelor nu este pe deplin lămurit, presupunându-se existența unui catalizator care va fi fosforilat în cadrul procesului de fosforilare oxidativă, catalizator care asigură transportul de electroni și transferă gruparea fosfat pe ADP, cu formare de ATP.

Practic, fiecare parte a metabolismului bacterian este influențată de enzime, cu o specificitate extrem de mare, fapt reliefat și în fig.1.1. Activitatea bacteriană nu ar fi posibilă dacă acest tip de substanțe nu ar fi prezent sau ar fi generat în cantități insuficiente.

Figura 1.1 Transformarea glucozei în acid piruvic, intermediată de 10 enzime diferite

(sursa: Zarnea, 1970)

Dat fiind acest fapt, celula bacteriană va avea nevoie de un echipament enzimatic complex, capabil să ducă la bun sfârșit funcția respectivă.

Există milioane de enzime în corpul uman, și sunt sute de tipuri diferite de enzime găsite în sânge, care pot descompune 5 milioane de molecule de peroxid în apă și oxigen în 60 secunde. Enzimele intestinale pot descompune moleculele de zahăr și grăsimi care sunt de 1 milion de ori mai mari decât greutatea lor.

Cele mai importante enzime care au fost izolate în hrana sănătoasă sunt: citocrom oxidaza, un anti-oxidant necesar pentru respirația celulelor; lipaza, enzima care descompune moleculele de grăsime; proteaza, enzima care ajută la digestia proteinelor; amilaza, enzima care facilitează digestia amidonului; catalaza, enzima ce catalizează descompunerea apei oxigenate în apă și oxigen în țesuturi; peroxidaza, enzima ce acționează în același mod, dar la nivel celular; transhidrogenaza, enzima care ajută în păstrarea tonusului muscular al inimii; pepsina, care ajută la digestia proteinelor și transformarea lor în aminoacizi și SOD (Super Oxid Dismutaza), o enzimă care previne îmbătrânirea.

Enzimele, fiind proteine, se denaturează foarte ușor în timp, și de aceea activitatea lor biocatalitică scade foarte repede până la dispariția lor totală, spre deosebire de activitatea catalizatorilor anorganici care se menține indefinit. O enzimă denaturată își recapătă activitatea biocatalitică prin renaturare. Procesul renaturării se datoreaza mai ales formării unor legături adecvate sub aspect termodinamic.

Proprietatea unei enzime de a cataliza o anumită reacție se datoreaza structurii sale primare, adică secvenței resturilor de aminoacizi în catena sa polipeptidică.

Din cele peste 1000 de enzime cunoscute astăzi mai mult de un sfert din ele conțin ioni metalici în structura lor, sau reclamă participarea ionilor metalici în cataliză. Dacă vorbim despre metalo-enzime (prima categorie) și enzime activate de metale (a doua categorie) trebuie să admitem că diferențele sunt mai mult de ordin cantitativ, în metalo-enzime legătura dintre componenta proteică și ionul metalic fiind mai puternică. Totuși în multe cazuri diferențierea celor două categorii prin mijloace uzuale este greu de făcut. Chiar factorii tehnici cum ar fi condițiile de purificare a enzimelor, pot interveni în încadrarea artificială a unei enzime într-unul din cele două tipuri menționate. Astfel, dacă în etapele de purificare a unei enzime dependente de un ion metalic se reține și acesta din urmă, enzima se caracterizează printr-o activitate “reziduală “mare. Când purificarea se face în prezența agenților de chelare, această activitate reziduală se poate reduce la minim, permițând demonstrarea clară a dependenței activității enzimatice de un anumit ion metalic.

De cele mai multe ori între enzimă, metal și substrat există un raport stoechiometric simplu 1:1:1, care admite ca posibile patru scheme de coordinare: E-S-M, E-M-S, M-E-S și complecși ciclici. (cu E, S, M s-au notat enzima, substratul și ionul metalic).

În cazul complecșilor E-S-M metalul se leagă slab sau nespecific la enzimă în absența substratului.

În complecșii E-M-S, legarea substratului la enzimă se face slab în absența ionului metalic.

În cazul complecșilor ciclici legarea substratului are loc și în absența ionului metalic, deși este mult favorizată de prezența acestuia. Complecșii M-E-S se caracterizează prin faptul că legarea fie a metalului, fie a substratului este independentă de faptul că se găsesc izolate cu enzima sau în amestec.

Mult mai precise în stabilirea schemei de coordinare a complexului ternar enzima-metal-substrat sunt metodele RMN și RES.

Din punct de vedere termodinamic enzimele posedă proprietatea de a coborî energia de activare a reacției pe care o catalizează, ducând astfel, la instalarea unei stări de echilibru.

Clasificarea enzimelor.

Enzimele cunoscute de mai multă vreme posedă denumiri curente (tripsina, pepsina, emulsina). Ulterior denumirile au fost construite sistematic, cu ajutorul sufixului -aza. Utilizarea sufixului -aza asociat denumirii substratului, definește fermenții hidrolitici. De exemplu “proteazele” sunt enzime care scindează proteinele, “fosfatazele” cele care hidrolizează esterii acidului fosforic.

În funcție de raportul lor cu celula, enzimele bacteriene se împart în două categorii:

– extracelulare sau exoenzime, în general hidrolaze, care sunt eliu notat enzima, substratul și ionul metalic).

În cazul complecșilor E-S-M metalul se leagă slab sau nespecific la enzimă în absența substratului.

În complecșii E-M-S, legarea substratului la enzimă se face slab în absența ionului metalic.

În cazul complecșilor ciclici legarea substratului are loc și în absența ionului metalic, deși este mult favorizată de prezența acestuia. Complecșii M-E-S se caracterizează prin faptul că legarea fie a metalului, fie a substratului este independentă de faptul că se găsesc izolate cu enzima sau în amestec.

Mult mai precise în stabilirea schemei de coordinare a complexului ternar enzima-metal-substrat sunt metodele RMN și RES.

Din punct de vedere termodinamic enzimele posedă proprietatea de a coborî energia de activare a reacției pe care o catalizează, ducând astfel, la instalarea unei stări de echilibru.

Clasificarea enzimelor.

Enzimele cunoscute de mai multă vreme posedă denumiri curente (tripsina, pepsina, emulsina). Ulterior denumirile au fost construite sistematic, cu ajutorul sufixului -aza. Utilizarea sufixului -aza asociat denumirii substratului, definește fermenții hidrolitici. De exemplu “proteazele” sunt enzime care scindează proteinele, “fosfatazele” cele care hidrolizează esterii acidului fosforic.

În funcție de raportul lor cu celula, enzimele bacteriene se împart în două categorii:

– extracelulare sau exoenzime, în general hidrolaze, care sunt eliberate în mediu;

– intracelulare sau endoenzime, care rămân în celulă, subdivizate în enzime solubile (situate la nivelul structurilor de suprafață ale celulei, de unde sunt eliberate cu ușurință în urma distrugerii acesteia sub acțiunea ultrasunetelor sau abrazivilor, putând fi obținute în stare pură) și enzime „particulate”, legate de membrana citoplasmatică, mezozomi, cromatofori etc. (aceste enzime, din care fac parte cele ale metabolismului energetic sau ale aparatului fotosintetizant rămân legate de resturile celulare după dezintegrarea celulei).

Coenzimele, tipic disociabile, ar trebui numite mai degrabă “cosubstraturi”. La acțiunea enzimei participă în mod hotărâtor coenzima. Se cunosc numeroase cazuri, în care aceleași coenzime, catalizează reacții chimice complet diferite, în funcție de proteina de care sunt legate, dar nu se cunoaște nici un exemplu, în care aceeași proteină enzimatică, să desfășoare, prin asocierea cu diverse coenzime, activități diferite.

Numeroase coenzime prezintă relații strânse cu vitaminele, care sunt substanțe active, aduse obligatoriu prin alimentație.

Vitaminele sunt esențiale pentru desfășurarea proceselor vitale și nu pot fi înlocuite prin alți compuși. Numărul vitaminelor care constituie rația zilnică este foarte redus. Prin urmare acestea nu sunt “substanțe alimentare”, în sensul uzual al cuvântului, ci posedă funcții catalitice, care intră în compoziția unor coenzime.

Câteva exemple de coenzime și vitaminele corespunzătoare se dau în tabelul următor:

Tabelul 2.1

Clasificarea și nomenclatura enzimelor se bazează pe principiile și regulile stabilite de IUPAC.

Astfel , enzimele au fost clasificate în 6 clase principale (cu subclase și subsubclase), astfel:

OXIDOREDUCTAZE – catalizează reacțiile de oxidoreducere prin tansfer de H sau electroni, sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular (glucozidaza, catalaza, peroxidaza)

TRANSFERAZE – catalizează transferul diferitelor grupari chimice de la un substrat donor la un alt substrat acceptor (aminotransferazele, metiltransferazele)

HIDROLAZE – catalizează scindarea hidrolitică a diferitelor substrate prin adiția apei la nivelul diferitelor grupări chimice (alfa-amilaza, celulaza, glucoamilaza).

LIAZE – catalizează adiția sau îndepărtarea unor grupări chimice din substraturi prin alte mecanisme decât în cazul hidrolizei (C-C liaze, C-O liaze, C-N liaze).

IZOMERAZE – catalizează rearanjări intramoleculare. Sunt cis-trans izomeraze, racemaze, epimeraze (glucozizomeraza).

LIGAZE (SINTETAZE) – catalizează sinteza unor noi legături prin unirea a doi compuși într-unul singur, folosind ca sursă energetică nucleozidfosfatul. Formează legături C-O, C-S, C-N, C-C, esterice cu H3PO4

Tabelul 1.2

Mecanismul de acțiune enzimatică

Procesul enzimatic nu se desfășoară oriunde în molecula enzimei, ci numai în anumite zone care au o dispoziție spațială corespunzătoare, alcătuite din 2-4 aminoacizi. Aceste zone se numesc "centri activi" și reprezintă aranjamentul spațial adecvat "prinderii" substratului.

Un centru activ este constituit dintr-un număr redus de aminoacizi. Pentru enzimele cu structură binară există frecvent doi centri activi . Unul dintre ei este situat pe fragmentul proteic, iar celălalt pe fragmentul de coenzimă.

Structura binară a enzimelor este indispensabilă acțiunii catalitice. Luate separat, atât cofactorul cât și apoenzima nu au activitate catalitică.

Din numărul foarte mare de resturi de aminoacizi numai un număr limitat (un segment limitat de enzimă) participă la interacțiunea cu substratul. Pe această porțiune există grupări funcționale capabile să atragă și să fixeze molecula substratului într-o poziție privilegiată și într-un loc (situs) strict determinat. Legarea substratului la centrul activ al enzimei îi imprimă o stare de tensiune moleculară care facilitează reacția biochimică. În centrul activ se găsesc numai anumiți aminoacizi care prezintă grupe -OH, – SH, – COOH, -NH2, radical imidazol (de exemplu, serina, histidina, acid aspartic, lisina).

Ansamblul acestor grupări chimice funcționale alcătuiesc centrul catalitic al enzimei. În segmentul polipeptidic al centrului catalitic se deosebesc trei grupe de aminoacizi:

– aminoacizi implicați în prima etapă a catalizei enzimatice deci cei care constituie locul sau situsul de specificitate și asigură recunoasterea substratului pentru ca reacția ES ES să poată avea loc;

– aminoacizi care participă la transformarea chimică a substratului în produs de reacție conform ecuației ES EP; acești aminoacizi alcătuiesc partea catalitică a centrului activ;

– aminoacizi necesari menținerii conformației adecvate a centrului catalitic, a situsului alosteric (care reglează funcționarea centrului activ) și poziționarea adecvată a enzimei în interiorul celulei (de exemplu, asocierea enzimei cu altă enzimă pentru formarea unui complex multienzimatic sau legarea de membrană).

În cazul enzimelor cu structura binară, în centrul activ se poate distinge un situs de fixare care se combină cu substratul prin legături labile (la formarea căruia participă aminoacizi auxiliari) și un situs catalitic (format din aminoacizii colaboratori care acționează asupra substratului), importanța pentru această interacțiune fiind prezența cofactorilor. Aminoacizii care nu sunt implicați în reacția enzimatică sunt aminoacizi necolaboratori. Funcționalitatea centrului catalitic este consecința structurii spațiale a proteinenzimei care prin dispoziția sa în spațiu aduce anumiți aminoacizi distanțați în structura primară într-o poziție optimă pentru legarea substratului (Fig.3.1).

Fig.3.1 Organizarea centrului activ (dupa Louisot P, 1982)

De exemplu, pentru acțiunea chimotripsinei, enzima care hidrolizează legăturile peptidice, este esențială legarea substratului la Ser195 care constituie cu Asp102 și His57 centrul activ al enzimei, interacțiunea acestora fiind posibilă datorită modificării conformației spațiale a proteinei în timpul reacției enzimatice.

Enzimele allosterice prezintă două situsuri: situsul catalitic la care se leagă substratul și situsul allosteric la care se leagă efectorul allosteric, activator sau inhibitor (Fig.3.2).

Fig.3.2 Organizarea centrului activ la enzimele alosterice

Enzima formează cu substratul un produs intermediar reactiv, cu o viață scurtă. Sub această formă intermediară, substratul intrat în reacție suferă modificări electronice sub acțiunea centrilor activi ai enzimei, rezultând produsul de reacție.

Enzima și substratul produc o reacție intermediară. Producerea acesteia are o energie de activare mai mică decât reacția dintre reactanți fără catalizator.

Schema simplificată

Calea A: reactant 1 + reactant 2 -> produs

Calea B: reactant 1 + enzimă -> intermediar

intermediar + reactant 2 -> enzima + produs

Deci, enzima este utilizată pentru a forma un produs intermediar, dar atunci când aceasta reacționează cu un alt reactant se formează din nou enzima.

Mecanismul enzimelor poate fi explicat cu urmatoarele două modele:

Modelul lacăt – cheie

Acesta este cel mai simplu model de a reprezenta modul în care functioneaza o enzimă. A fost propus pentru prima oara de Emil Fischer în 1894. Substratul se încadrează pur și simplu în situs-ul activ al enzimei pentru a forma un produs intermediar. Se spune că atât substratul cât și enzima au forme geometrice complementare, pentru ca acestea să se lege ferm ca o cheie într-un lacăt. Lacătul este enzima și cheia este substratul. Prin urmare, acest model este cunoscut sub denumirea de lacăt – cheie (lock and key).

Fig.3.3 Modelul „lock and key”

Modelul indus

Modelul indus, propus de Daniel Koshland în 1958, este un model mai sofisticat, care se bazează pe faptul că moleculele sunt flexibile, datorită legăturilor simple, covalente, care se pot roti. Enzimele sunt flexibile în structura lor, ele putând să își modifice forma în timp ce moleculele substratului se apropie. Schimbarea formei este indusă de apropierea moleculei substratului. Lanțurile de amino-acizi sunt responsabile pentru această flexibilitate a situs-ului activ al enzimei. Avantajul schimbării structurii situs-ului activ este de a se modela în poziția precisă, aceasta făcând funcționarea catalitică corectă.

Fig.3.4 Modelul indus

3.1 Specificitatea enzimelor

Specificitatea de acțiune a enzimelor este o caracteristică esențială a acestora conferită de componente. Aceasta este unul dintre cele mai remarcabile atribute biologice care stau la baza coordonării proceselor biochimice.

Diversele forme de manifestare a specificității enzimelor pot fi încadrate în două categorii:

1. specificitatea de reacție;

2. specificitatea de substrat.

3.1.1 Specificitatea de reacție

Enzimele catalizează un anumit tip de reacție, în funcție de modul de acțiune asupra substratului. Acest tip de specificitate stă la baza clasificării enzimelor și este datorat cofactorului care guvernează tipul de reacție în care se va angaja substratul. De exemplu, un anumit α-aminoacid poate fi substrat pentru mai multe enzime care au cofactori diferiți.

3.1.2 Specificitatea de substrat

Enzimele diferă în ceea ce privește specificitatea de substrat în funcție de mecanismul de reacție și de natura substratului. Enzimele acționează asupra anumitor substraturi, grupe funcționale, legături chimice.

Există trei tipuri de specificitate determinată de substrat:

a. specificitatea stereochimică;

b. specificitatea relativă;

c. specificitatea absolută.

Specificitatea stereochimică. Existența unor compuși biologici sub formă de izomeri determină posibilitatea acțiunii selective a unor enzime asupra unuia dintre ei. Enzima leagă substratul pe baza complementarității între centrul activ și un fragment din molecula, respectată numai în cazul unuia dintre izomeri (fig.4.3). Celălalt izomer având o dispoziție spațială diferită nu se poate lega de enzima. Enzimele pot să determine:

a. transformarea unui anumit izomer geometric (cis sau trans);

b. formarea unui anumit izomer geometric sau optic;

c. transformarea unui substrat aparținând unei anumite serii sterice D sau L.

Fig.3.5 Reprezentare schematica a stereospecificitatii:

a – situs catalitic; b, c – situsuri de fixare specifice

Exemple:

Lactat dehidrogenaza (LDH) este o enzimă care determină transformarea acidului L-lactic dar nu și pe cea a acidului D-lactic. De asemenea, determină transformarea unui compus optic inactiv, acidul piruvic, într-un compus optic activ, acidul L-lactic, realizând o sinteză asimetrică.

L-aminoacid oxidaza care catalizează reacțiile de dezaminare a L-aminoacizilor si D-aminoacid oxidaza care transformă D-aminoacizii;

Succinat dehidrogenaza (SDH) catalizează preferențial dehidrogenarea acidului succinic cu formarea acidului fumaric (izomerul trans).

Maltaza hidrolizează legaturile glicozidice ale α-glucozei nu și pe cele ale β-glucozei, având astfel specificitate anomerică.

Specificitatea relativă de grup. Enzimele din această categorie manifestă un spectru mai larg de activitate, acționând asupra unui grup de substraturi ce prezintă structură asemănătoare.

Exemple:

Alcool dehidrogenaza (ADH) transformă toți alcoolii cu număr mic de atomi de carbon:

Glicozidazele actionează numai asupra legăturii glicozidice;

Hexokinaza catalizează fosforilarea mai multor hexoze (glucoza, fructoza, manoza, galactoza) în prezența ATP:

Fosfatazele catalizează numai hidroliza esterilor fosforici;

Peptidazele actionează numai asupra legaturilor din peptide si proteine;

Lipazele hidrolizează legatura esterică dintre glicerol și acizii grasi;

Tirozinaza oxidează fenolii la compusi chinonici .

Un caz aparte îl reprezintă fosfolipazele care acționează asupra aceluiași substrat (fosfolipidele) dar cu un punct de scindare diferit, fiind un amestec de specificitate de substrat și de acțiune.

Specificitatea absolută. Enzimele din această categorie acționează strict asupra unui anumit tip de substrat nerecunoscând nici o modificare a substratului respectiv. Ele nu sunt specifice pentru o anumita legatură sau grupare din structura substratului și recunosc doar substratul în totalitate.

Exemple:

Arginaza acționează numai asupra argininei:

Ureaza catalizează numai hidroliza ureei:

Anhidraza carbonică catalizează sinteza acidului carbonic:

Cinetica enzimatică

Studiul cineticii enzimatice permite cunoașterea mecanismelor, înțelegerea și clasificarea proceselor metabolice și importanța lor fiziologică pentru organism. Măsurarea activitații enzimatice se reduce la studiul cineticii sau vitezei reacției catalizate care reprezintă, în general, cantitatea de substrat transformată în unitatea de timp sau de produs (produși) format în reacție

Ca orice catalizator, enzimele acționează prin micșorarea energiei de activare, fapt ce crește puternic rata de repetare a reacției (majoritatea reacțiilor enzimatice se petrec cu viteze de câteva milioane de ori mai mari decât echivalentele necatalizate), și, similar din nou tuturor catalizatorilor, ele nu sunt consumate în timpul reacției și nici nu influențează echilibrul reacțiilor. Diferența fundamentală față de alți catalizatori este specificitatea foarte mare a acestor substanțe.

Clasificarea cinetică a reacțiilor enzimatice

După mecanismul lor reacțiile enzimatice pot fi descrise în termeni cinetici în reacții reversibile și ireversibile, reacții de ordinul I, II, III, reacții cu faze intermediare , reacții cu unul sau mai mulți produși finali etc.

În funcție de numărul de substrate implicate în reacție , recțiile enzimatice sunt împărțite în :

A + B C + D Tip I

A + B C Tip II

A B Tip III

Reacții enzimatice cu un singur substrat.

La ciocnirea (cu anumită viteză și sub un anumit unghi) unei molecule de enzimă cu o moleculă de substrat se formează o moleculă de compus intermediar enzimă-substrat notat ES (enzima se „atașează” substratului); moleculele ES pot, în unitatea de timp, fie să se descompună în molecule de E și S, fie să dea naștere unui produs P, cu eliberarea enzimei, fie să rămână în forma de compus intermediar ES. Enzima joacă astfel rolul de catalizator pentru transformarea substratului S în produsul P.

Schema de reacție pentru acest caz este următoarea :

E + S E + P 1

Prima tratare teoretică sistematică a acestui caz se datorește lui Michaelis și Menten și ulterior dezvoltată pentru starea staționară de Briggs și Haldane. Aplicînd principiul staționarității pentru intermediarul enzimă – substrat rezultă :

2

Cum = 0 – și = 0 – expresia 2 se poate scrie funcție de concentrațiile inițiale.:

= k1 (0 – )(0 – ) – k2 –k3 =0 3

nu poate fi mai mare ca 0 iar 0 0 , astfel că în expresia 3 0 – 0 În aceste condiții se obține :

= k1 0(0 – ) – k2 –k3 =0 4

De unde rezultă concentrația staționară

= 5

Împărțind și numărătorul și numitorul fracției cu k1 obținem :

= 6

Viteza pentru formarea produsului de reacție este funcție numai de concentrațiile inițiale respective după cum urmează:

= k3 = = v0 7

relație din care se vede că „viteza inițială ”este proporțională cu concentrația enzimei 0 atunci cînd concentrația inițială a substratului se păstrează constantă. Dacă însă se menține constantă concentrația enzimei și se variază aceea a substratului , viteza inițială este proporțională cu concentrația inițială a substratului cu condiția ca aceasta să fie suficient de mică; pentru concentrații mai mari viteza crește tinzând către o valoare maximă care rezultă din expresia 7.

Vmax = k3 0 8

unde k3 poate fi evaluat din valoarea vmax și concentrația inițială a enzimei . Viteza inițială se mai poate scrie :

v = = = 9

unde Km = are dimensiuni de concentrație , fiind numeric egală cu valoarea concentrației inițiale a substratului pentru care viteza inițială este jumătate din viteza maximă, vmax. Această comportare este arătată în figura 1.

Fig 4.1. Variația vitezei de reacție cu concentrația substratului obținută la hidroliza de ATP catalizată de miozină.

Se observă că la concentrații mici ale substratului viteza urmează o lege cinetică de ordinul I, în timp ce la concentrații mari ale acestuia , o lege de ordinul 0.

Tabelul 4.1 Km pentru diferite enzime și substraturi

În cataliza enzimatică se disting doua etape: formarea complexului ES care implică recunoașterea substratului de către centrul activ al enzimei, etapă caracterizată prin Km egal cu și o a doua etapă este descompunerea complexului ES în E și P și care este caracterizată de vmax. Deoarece este dificil de reprezentat viteza reacției pentru concentrații mici de substrat, unde precizia este destul de mică, s-a încercat o linearizare a ecuației Michaelis care a fost realizată de Lineweaver si Burk.

. 10

Prin reprezentarea grafică în funcție de din ordonata la origine rezultă 1/vmax și din pantă Km/ vmax ; deci se poate evalua Km așa cum se vede în fig.4.2

Fig 4.2. Reprezentarea Lineweaver si Burk

Aceasta reprezentare grafică este mai comodă pentru determinarea constantei Michaelis (Km) și a vitezei maxime (vmax) a reacției pentru o concentrație dată de enzimă

4.1 Influența temperaturii asupra activității enzimatice

Viteza de reacție crește cu creșterea temperaturii, dar în anumite limite. Studiul vitezei inițiale a unei reacții enzimatice în funcție de temperatură determină apariția a două faze distincte care corespund la două fenomene diferite:

În zona de temperaturi mai mici (0 si 40oC) viteza reacției crește când temperatura crește. Această creștere a vitezei cu temperatura se explică printr-o creștere a concentrației complexului activat (intermediar) atunci când se furnizează mai multă energie sub formă termică sistemului de reactie.

La o temperatura ce depășește 45oC se asistă la o denaturare a proteinei.

Fig.4.3Influența temperaturii asupra activității enzimatice

Curba care corespunde temperaturii optime este rezultanta a doua curbe punctate: curba de activare si curba de denaturare. Temperatura optima este cea la care cele două fenomene se gasesc în echilibru. Ele depind de pH, de forta ionică a mediului și de timpul de reacție, de puritatea enzimei, prezenta activatorilor și inhibitorilor.

Se observă deci că până la o anumită temperatură viteza reacției crește atingând o valoare maximă după care scade cu creșterea temperaturii. Temperatura corespunzatoare vitezei maxime de acțiune a enzimei reprezintă temperatura optimă de actiune. Efectul temperaturii asupra reacțiilor enzimatice este exprimat prin coeficientul de temperatură Q10, care reprezintă factorul de creștere a vitezei de reacție enzimatică prin ridicarea temperaturii cu 10oC.

Fig. 4.4. Influența temperaturii asupra vitezei de reacție

Temperatura optimă pentru cele mai multe enzime este de 30oC – 40oC. Temperaturile scăzute conservă activitatea enzimatică. Unele enzime cu greutate moleculară mică și a căror stabilitate structurală este realizată prin punți disulfidice, cum sunt ribonucleaza, miokinaza, sunt rezistente la încălzire.

Există microorganisme termofile care trăiesc în apă la 70oC – 80oC și a căror enzime sunt active la aceasta temperatură. La 0oC unele enzime își încetează reversibil activitatea, această temperatură constituind temperatura de conservare pentru unele enzime.

Unele enzime imobilizate pe gel de poliacrilamidă, rășini schimbătoare de ioni etc., sunt mai rezistente la căldură. Aceste enzime imobilizate pot fi utilizate în medicină în tratamentul unor boli (galactozemie, arteroscleroză).

4.2 Influența pH-ului

Variațiile de pH pot avea efecte atât la nivelul enzimei, cât și la nivelul substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unor grupări funcționale de pe enzimă a căror sarcină pozitivă sau negativă este necesară fie formării complexului enzimă-substrat, fie menținerii conformației tridimensionale native a protein-enzimei. De asemenea, la nivelul substratului poate fi modificat gradul de ionizare împiedicând sau favorizând formarea complexului enzima-substrat. Valoarea pH-ului la care reacția enzimatică se desfasoară cu viteză maximă se numeste pH optim.

Fig.4.5. Influența pH-ului asupra vitezei de reacție

Se observă, din grafic, că de o parte și de alta a valorii optime a pH-ului viteza de reacție descrește rapid atingând valori neglijabile. În cazul ribonucleazei, de exemplu, viteza este foarte mică, cu 0, 5 unităti de pH de o parte și de alta a pH-ului optim, ceea ce arată importanța unui mediu de reacție bine tamponat pentru studiul reacției enzimatice in vitro.

In vivo, variațiile de pH pot influenta acțiunea enzimelor. La animalele superioare, de exemplu, pH-ul sanguin este mentinut în limite foarte înguste datorită sistemelor tampon și eliminării acizilor sau bazelor în exces.

pH-ul optim pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse între 6 – 8. Excepție fac enzimele digestive, pepsina (pH1,5 – 2), arginaza (pH9,5 – 10).

Variațiile de pH modifică geometria centrului activ și deci activitatea catalitică a enzimei, modificând încărcarea electrică a unor grupări depărtate de acest centru, dar care intervin în menținerea conformației adecvate a lanțului polipeptidic.

Potențialul redox al mediului influențează starea grupărilor care intră în constitutia enzimelor, ele putând fi oxidate sau reduse. Astfel gruparile –SH din dehidrogenaze pot fi modificate prin reacții de tipul:

determinând schimbări conformaționale ale enzimei și antrenând modificari ale activitații enzimatice.

4.3 Influența presiunii și a radiatiilor

Enzimele supuse la presiuni foarte mari (18.000 atm.) îsi pierd ireversibil acțiunea catalitică.

Același efect îl au radiațiile energice : U.V., radiațiile , razele X. Efectul radiațiilor se datorește în parte oxidării unor grupări funcționale (-SH) din structura enzimelor de către peroxizii și radicalii liberi de tipul HO—formați din apă sub actiunea radiațiilor cu energie mare.

4.4 Influența efectorilor asupra activitatii enzimelor

Efectorii sunt substante care măresc sau scad acțiunea catalitică a enzimelor. Aceștia pot fi activatori sau inhibitori.

Activatorii sunt compuși de natură organică sau anorganică care în concentrații mici măresc viteza unei reacții enzimatice atunci când se găsesc în mediul de reacție.

O serie de ioni metalici cum ar fi: K, Cu, Fe, Mg, Mn, Co, Mo au efecte pozitive asupra unor reacții enzimatice.

Fe, Mo, Cu participă în reacțiile de oxido-reducere, Mg este necesar în reacțiile de transfer ale grupării fosfat, Ca este necesar în reacțiile enzimatice ce intervin în coagularea sângelui.

Metalele influențează reacțiile catalizate enzimatic prin unele mecanisme cum ar fi:

participarea directă a ionului metal în cataliză prin schimbări ale valenței și transportul de electroni în procesele de oxido-reducere (de exemplu Fe în citocromi);

formarea de complexe între substrat și metal (de exemplu ATP și Mg2 în reacțiile de transfer de fosfat);

formarea unor metalo-enzime care leagă apoi substratul într-un complex enzima-metal-substrat;

inducerea unor modificări conformaționale a enzimei sub influența ionului metalic.

Un numar mare de enzime conțin un ion metalic, în calitate de cofactor, absolut necesar activitatii catalitice. Alcool dehidrogenaza, anhidraza carbonică, fosfataza alcalină, carboxipeptidaza, contin Zn2+, arginaza, aminopeptidaza, contin Mn2+, fosfokinaza – Mg2+, tirozinaza – Cu2+, succindehidrogenaza – Fe, xantin oxidaza – Mo2+ etc.

În calitate de activatori funcționează și unele kinaze care permit transformarea unor proenzime în enzime. De exemplu, enterokinaza activează transformarea tripsinogenului în enzimă activă numită tripsină, plasmokinaza transformă plasminogenul în plasmină, trombokinaza transformă protrombina în trombină.

În calitate de activatori lucrează și unele substanțe reducatoare care au grupări –SH (cisteina, glutationul, marcaptoetanolul) și care blochează ionii metalelor grele evitând inhibarea grupărilor –SH din aminoacizii protein-enzimei.

Inhibitorii enzimatici sunt compuși care diminuează sau anihilează activitatea enzimelor. Ei au compoziție chimică și mod de acțiune diferit. Utilizarea unor inhibitori a permis determinarea naturii aminoacizilor din centrul activ și cei care participă la formarea complexului ES. Printre substanțele capabile să se fixeze pe diferite grupări din proteine (hidroxil, sulfhidril, carboxil) și să determine proprietățile catalitice, fie prin modificarea conformației, fie prin blocarea centrului activ al enzimei, se găsesc ionii metalelor grele, sau compuși cum sunt acidul monoiod-acetic sau acidul paraclor mercuri-benzoic care reacționează cu grupările tiol:

(reacție reversibilă), sau:

Enz-SH Cl-Hg-C6H4-COOH HCl Enz.-S-Hg-C6H4-COOH

(reacție reversibilă prin adăugarea în exces a unei substanțe reducătoare cum este cisteina).

Astfel, di-izopropilfluorfosfatul care permite fosforilarea restului de serină din centrul activ al diverselor enzime (esteraze și unele enzime proteolitice cum este tripsina) provoacă inactivarea ireversibilă a enzimei:

Inhibitorii competitivi sunt compuși care prezintă o analogie structurală cu substratul enzimei și pot intra în competiție cu acesta pentru a se fixa pe situsul activ al enzimei. Enzima se poate combina fie cu substratul, fie cu inhibitorul stabilindu-se echilibrele urmatoare:

Este clar ca enzima angajată în complexul EI nu poate funcționa ca un catalizator, numai complexul ES va permite formarea produsilor de reactie.

Inhibiția depinde de concentrația substratului, inhibitorului, de afinitatea enzimei pentru substrat și pentru inhibitor.

Adăugarea unui inhibitor competitiv favorizează disocierea complexului ES și creșterea constantei Michaelis. La adăugarea de cantităti mari de substrat inhibitorul este deplasat din centrul catalitic al enzimei, care va fi ocupat de substrat, iar viteza de reacție va avea aceeași valoare maximă ca și în absența inhibitorului.

Fig.4.6. Influența inhibitorilor asupra vitezei de reacție

Se observă, din graficul alăturat, că dreapta corespunzatoare inhibției competitive taie axa absciselor într-un punct 1/K’m care permite calculare valorii K/m.

Inhibiția competitivă există la toate enzimele. Un analog structural al substratului, nemetabolizabil, este în general un inhibitor competitiv.

De exemplu, succindehidrogenaza, inhibată de diferiți analogi structurali ai acidului succinic:

Acțiunea enzimatică este inhibată de acizii:

datorită asemanării lor structurale cu acidul succinic.

Inhibiția competitivă are numeroase aplicații practice, în special în terapeutică. Exemplu clasic este cel al sulfamidelor, analogi structurali ai acidului para-aminobenzoic:

Sulfamidele intră în competiție cu acidul p-aminobenzoic și inhibă producerea de acid folic necesar creșterii bacteriilor.

Chimioterapia anticanceroasă face apel la numeroși antimetaboliti, în general analogi structurali ai bazelor purinice sau pirimidinice, permițând inhibiția biosintezei acizilor nucleici si blocarea diviziunii celulare.

Alt exemplu de inhibitor competitiv utilizat ca medicament este alopurinolul ce inhibă acțiunea xantin-oxidazei care oxidează xantina la acid uric. Acesta este utilizat în tratamentul gutei, prevenind încarcarea organismului cu acid uric.

Inhibitorii necompetitivi se fixează fie pe enzima (dar într-un situs diferit de situsul activ), fie pe complexul ES pentru a forma un complex ESI, fie pe amândouă.

Situsurile active ale enzimei își pierd capacitatea de a reacționa cu substratul datorită unui fenomen de împiedicare sterică. Gradul de inhibiție depinde de concentrația inhibitorului și de afinitatea enzimei pentru inhibitor. Exemple de inhibitori necompetitivi sunt cianurile, care se combină cu unele metale necesare activității enzimei (Fe2, Fe3) cu care formează complexe inactive asemănătoare cu fero- sau fericianurile.

Unele metale grele (Hg, Pb, Cu, Ag) sunt inhibitori deoarece se combină cu grupările –SH ale enzimei formând mercaptide:

Agentii chelatanți de tipul acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA) leaga Mg2 sau Ca2.

Un tip rar de inhibiție este cea dată de inhibitori care nu se leagă la enzima liberă ci numai la complexul enzima-substrat. Aceasta este o inhibitie necompetitiva. Un astfel de inhibitor micșorează în egală măsură viteza maximă cât și valoarea Km, dar raportul dintre Km și v ramâne același. Un exemplu de inhibiție necompetitivă este cel al inhibiției citocromoxidazei de catre azida de sodiu.

Când în mediul de reacție există un exces de substrat are loc formarea unui complex ESS care este mai putin activ sau chiar inactiv. Are loc în acest caz o inhibiție prin exces de substrat.

Un exemplu de inhibiție prin exces de substrat este hexokinaza care este inhibată de glucoza-6-fosfat, produsul propriei reacții.

În general procesele chimice catalizate de enzyme sunt de 108 până la 1020 de ori mai rapide decât cele necatalizate. Cea mai mare parte a creșterii vitezei de reacție este determinată de poziționarea exactă a substratului, în ceea ce privește apropierea și orientarea față de gruparea catalitică. Unele enzime sunt adapate biologic atât pentru

Utilizarea enzimelor în diferite domenii de activitate

5.1 Indicatorii de calitate în industria alimentara.

Aprecierea calitatii alimentelor se face prin :

Dozarea activitatii enzimelor proprii produsului;

Dozarea activitatii enzimelor straine de produs aduse de impuritati sau apărute prin alterarea microbiologică.

Spre exemplu, aprecierea calitatii laptelui se face prin determinarea mai întâi a enzimelor proprii sau a celor apărute prin fenomenul de contaminare bacteriană. Cu ajutorul enzimelor existente în lapte, se poate deosebi laptele crud de cel pasteurizat.

peroxidaza este o enzima care se gaseste numai în lapte nefiind de origine mamară. Aceasta este distrusă la temperaturi de peste 70 °C și absența ei servește pentru controlul pasteurizării laptelui ;

reductaza, este o enzimă de origine microbiană și se folosește pe cale indirectă la determinarea numarului de microorganisme din lapte. Prospețimea laptelui se determină prin prezenta reductazei prin proba cu albastru de metil sau resazurina ;

catalaza, este enzima secretata de microorganisme și leucocite. Proprietatea catalazei este de a descompune apa oxigenată în apă și oxigen molecular și prezența ei servește la aprecierea stării de sănatate a ugerului în funcție de cantitatea de oxigen degajată în lapte ;

fosfatazele alcaline și acide au origine mamară și acestea sunt distruse prin încălzirea laptelui la 83 °C timp de 13 minute. Lipsa fosfatazelor ajută la efectuarea controlului pasteurizarii joase și mijlocii a laptelui ;

lipoza este tot o enzima de origine mamară însă aceasta poate fi produsă și de către microorganisme. Diferenta între acestea este data de faptul că lipoza de origine mamară este distrusă la temperatura de 70 °C, iar cea de origine microbiană se distruge numai la temperatura de 80 °C ;

proteaza si lactoza sunt enzime tot de origine mamara cu deosebirea ca proteaza poate fi de origine microbiana si aceasta contribuie la hidroliza proteinelor din branzeturilor tari in peptane, polipeptide si aminoacizi ;

Tratarea laptelui cu tripsină imobilizată a determinat o crestere a stabilității în timp a laptelui cu 2-3 săptămâni fară a se constata oxidări sau schimbarea gustului [Ullmann's Enciclopedia of Industrial Chemistry, 1987; Peppler, 1987].

Laptele crud și ouă lichide pot fi conservate cu H2O2 înainte de pasteurizare. Cu toate acestea, H2O2 trebuie sa fie hidrolizată prin adăugarea catalazei, înainte de prelucrare termică a produselor.

5.2 Hidroliza amidonului și producerea fructozei

Utilizarea enzimelor la degradarea amidonului a fost prima cerere la scară largă a enzimelor microbiene în industria alimentară. În principal, două enzime efectuează conversia din amidon la glucoză: alfa-amilaza scindează legăturile 1 , 4-ale alfa glucozei în oligomeri la temperaturi ridicate. Această fază se numește lichefiere și se realizează de către enzimele bacteriene. În următoarea fază numită zaharificare, glucoamilaza hidrolizează oligomeri în glucoză. Aceasta se face de către enzimele fungice, care funcționează la pH și temperatură mai mici decât alfa-amilază. Beta-amilaza este comercial produsă din boabe de orz și utilizate pentru producția dizaharidului maltoză

O metodă alternativă pentru a produce fructoză utilizează zaharoză ca materie primă. Zaharoza este scindată de invertază în glucoză și fructoză, Fructoza este separată și cristalizată și apoi glucoza este circulată înapoi la proces

5.3 Obținerea băuturilor

Enzimele sunt folosite, de asemenea, în fabricarea sucurilor de fructe. Enzimele pectinolitice, singure sau în amestec cu alți biocatalizatori, sunt utilizate pe scară largă în diferite procese biotehnologice.

Tabelul 5.1. Clasificarea și nomenclatura enzimelor pectinolitice

Enzimele pectinolitice sunt absolut necesare în extracția, clarificarea și depectinizarea sucurilor de fructe (Alkorta și alții 1995, Chang și alții 1995, Meyer și alții 2001). Clarificarea acestora decurge și sub acțiunea enzimelor pectinolitice din fructe, dar procesul de autoclarificare este prea lent pentru a fi utilizat la scară industrială. În procesele industriale sunt utilizate preparate concentrate de enzime pectinolitice produse de microorganisme, preparate care realizează o degradare rapidă a polimerilor pectici. Clarificarea diferitelor sucuri necesită acțiunea sinergică a mai multor tipuri de enzime pectinolitice. Astfel, sucurile de mere au fost clarificate rapid prin combinarea activităților endopoligalacturonazice (din Aspergillus niger) și pectinesterazice (din Aspergillus oryzae). Exopoligalacturonazele nu au avut efecte în astfel de procese, aceste enzime fiind adsorbite în proporție destul de mare pe protopectina din mere (Hara și alții 1986). Sucurile de grapefruit, sucuri mai rezistente în procesele care implică degradarea polimerilor pectici, au fost clarificate cu ajutorul unei pectin liaze izolate din Aspergillus sojae (Ishii și alții 1973). Clarificarea sucurilor de citrice, sucuri cu pH foarte acid a putut fi realizată prin acțiunea combinată a pectinesterazei ce se găsește în aceste sucuri și a poligalacturonazei din Corticium rolfesii. Poligalacturonaza biosintetizată de Corticium rolfesii are o utilitate deosebită, deoarece ea acționează la un pH foarte scăzut – 2, 5 -, pH la care reacția enzimatică se desfășoară în condiții apropiate de cele aseptice (Tagawa și alții 1988).

Acțiunea combinată a enzimelor pectinolitice, celulazelor și hemicelulazelor poate conduce la lichefierea fructelor (Grassin și alții 1996)

Enzimele pectinolitice sunt utilizate în procesele de vinificație, mai ales pentru obținerea vinurilor din soiuri de struguri bogate în substanțe pectice (Colagrande și alții 1994). Extracția aromelor și a pigmenților vegetali se poate face cu ajutorul acestor enzime (Solehah și alții 1994)

În procesele tehnologice care urmăresc prelucrarea boabelor de cafea în vederea obținerii cafelei instant, utilizarea enzimelor pectinolitice s-a dovedit a fi eficientă (Vükari și alții 1993).

Enzimele pectinolitice au fost utilizate pentru macerarea fructelor și vegetalelor, pentru obținerea alimentelor pentru sugari și a piureurilor (Recourt și alții 1996, Dijkvan și alții 1996).

Fabricarea berii este un proces enzimatic. În procesul de zdrobire enzimele sunt eliberate, hidrolizează amidonul în zaharuri solubile fermentabile ca maltoză, care este un dizaharid al glucozei.Se pot folosi enzime suplimentare pentru a ajuta hidroliza amidonului (de obicei, alfa-amilaze), pentru a rezolva problemele cauzate de filtrarea beta-glucanului prezent în malț (beta-glucanaze), hidroliza proteinelor (proteinaza neutra), pentru controlul în timpul maturării, filtrarii si stocării (papaină, alfa-amilază și beta-glucanază).

Zerul contine cantitati mari de lactoză. Lactoză scoasa din zer și tratată cu lactază produce glucoza si galactoza. Ea poate fi apoi folosită pentru a produce alcool.

Invertaza poate fi utilizata pentru hidroliza zaharozei, pentru a inversa zaharuri (amestec de glucoza si fructoza) si dulceata crește. Aceasta este folosita în prelucrarea ciocolății.

5.4 Obținerea monozaharidelor non-naturale,

Monozaharidele non naturale sunt necesare ca materii prime pentru produse chimice și farmaceutice noi. Exemple sunt L-riboză, D-psicosa, xiloza-L, D-tagatosa și altele. Unele dintre zaharuri sunt în prezent produse de izomerizări chimice sau epimerizări. Recent metode enzimatice au fost dezvoltate pentru a fabrica practic toate formele D-si L- de zaharuri simple.

Glucoizomeraza este una dintre enzimele industriale importante folosite în fabricarea de fructoză. Recent s-a demonstrat că se pot cataliza conversii necunoscute anterior. De exemplu L-arabinoza este izomerizată la -L ribulosă și încet, de asemenea, la L -riboză. D-xiloza este izomerizată de la D-xilulosă și încet la D-lixoză.. Metodele enzimatice sunt un instrument important în producția de zaharuri rare.

5.5 Industria laptelui

În lapte sunt prezente următoarele tipuri de enzime:

Tabelul 5.2

În industria laptelui s-au propus spre utilizare următoarele preparate enzimatice:

Lizozimul (muramidază) este o enzimă bacteriolitică cu greutate moleculară de 14, 4 kiloDaltoni(kDa). Are capacitatea de a distruge peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive (în special), prin hidrolizarea legăturii glicozidice β-1,4 dintre acidul N-acetilmuramic (NAM) și N-acetilglucozamină (NAG) (carbohidrați prezenți în peretele bacterian). Se găsește în cantitate mare în secreții, cum ar fi: lacrimi, salivă și mucus, în citoplasma neutrofilelor polimorfonucleare (PMN), dar cea mai mare cantitate de lizozim se întâlnește în albușul de ou.

Fig.5.1 Structura secundară a lizozimului

Lizozimul se utilizează în industria brânzeturilor, pentru împiedicarea dezvoltării bacteriilor sporulate aparținând genului Clostridium și în special Clostridium tirobutiricum care pot metaboliza acidul lactic pe care-l transformă în acid butiric și cantități importante de CO2 și H2. În afară de gustul neplăcut produce și o balonare a acestora, cu formare de găuri mari neregulate, care pot conduce chiar la “ruperea” brânzei.

Prin adaos de lizozim se realizează liza celulei vegetative și deci se împiedică dezvoltarea bacteriilor butirice în lapte. Dacă în lapte ajung spori de Cl. tirobutiricum aceștia rezistă la pasteurizare și vor rămâne în coagul, deci vor produce balonarea târzie a brânzeturilor.

Lizozimul împiedică însă dezvoltarea lactobacililor și în special dezvoltarea lui Lb. helveticus folosit la fabricarea brânzei Șvaițer, deci se împiedică acidifierea normală a laptelui (maturarea). Bacteriile propionice nu sunt inhibate de lizozim.

β-Galactozidaza (lactaza) este enzima capabilă să hidrolizeze lactoza cu formare de glucoză și galactoză. Industrial se utilizează pentru:

Delactozarea produselor lactate destinate persoanelor cu insuficiență( intoleranță) la lactoză;

Delactozarea laptelui concentrat sau a laptelui praf;

Obținerea de siropului de glucoză și galactoză din lactoză din zer

Glucozoxidaza care catalizează transformarea glucozei în acid gluconic s-a propus a fi utilizată ca antioxidant enzimatic în produsele bogate în grăsimi (unt, lapte parf cu grăsime). Practic însă la aceste produse se utilizează antioxidanți chimici sau ambalare sub atmosferă de gaz inert (azot).

Acțiunea glucozoxidazei s-ar manifesta prin aceea că activează lactatperoxidaza (LPS) care utilizează oxigenul în vederea producerii de H2O2.

Catalaza se utilizează în combinație cu glucozoxidaza pentru a elimina excesul de H2O2 care rezultă la acțiunea glucozoxidazei sau singură pentru a elimina excesul de H2O2 adăugată direct în lapte în scop de conservare. Apa oxigenată reziduală (rămasă neconsumată) în condițiile în care nu s-ar folosi și catalaza ar modifica caracteristicile senzoriale ale laptelui precum și valoarea nutrițională a proteinelor prin oxidarea metioninei.

Tratamentul laptelui cu H2O2 și catalază se impune față de tratamentul termic (în unele țări) în două cazuri:

când fermele nu dispun de echipament de răcire iar tratamentul termic (pasteurizarea) nu este fezabil din punct de vedere tehnic (se folosește ~ 2 ml H2O2 33% la 1 l lapte). Laptele ajuns în fabrică trebuie încălzit la 50C/30 min apoi răcit la 35C și se adaugă catalaza( 20 mg/l).

când laptele este destinat fabricării brânzeturilor și se dorește să se păstreze enzimele proprii laptelui precum și bacteriile lactice de contaminare, dar se dorește să se distrugă cele de alterare, în special coliformi care sunt puțin rezistente la acțiunea H2O2. De remarcat că H2O2 nu contribuie la distrugerea totală a bacteriilor patogene (Microbacteriunm tuberculosis, Brucella abortus și unele specii de Staphylococcus, precum și bacteriile sporogene).

Superoxid dismutaza (SOD), împreună cu catalaza a fost propusă pentru inhibarea oxidării lipidelor prin faptul că realizează catalizarea dismutării anionului superoxidic (O2-) cu formare de apă oxigenată și oxigen:

Apa oxigenată formată poate fi degradată de catalază în O2 și H2O cu reducerea simultană a unei a doua molecule de H2O2 sau poate fi degradată de peroxidază la H2O în prezența unui donator de H2.

Preparate enzimatice folosite la coagularea laptelui. Coagularea enzimatică a laptelui s-a realizat la început exclusiv cu cheag, însă creșterea producției de brânzeturi pe plan mondial a pus problema unui înlocuitor pentru cheag. Întrucât coagularea laptelui este inițiată prin scindarea legăturii peptidice dintre fenilalanina 105 și metionina 106 din k-cazeină, oricare endo-peptidază care este capabilă să producă această hidroliză este un înlocuitor potențial pentru cheag (chimozina). Această proprietate hidrolitică-coagulantă nu este suficientă, fiind necesar ca preparatul enzimatic respectiv să aibă și o activitate proteolitică nespecifică corespunzătoare, în sensul că trebuie evitată degradarea intensă a proteinelor la pH-ul natural al laptelui pentru a nu se distruge zonele de interacțiune pentru agregarea miceliilor.

Principalele preparate enzimatice de origine animală sunt cheagul și pepsina.

Cheagul – preparat enzimatic din stomacul glandular de vițel, miel, ied sacrificați în perioada de alăptare. Se mai numește pressure, rennet. Preparatul cheag are ca principiu activ chimozina, însă conține și ceva pepsină, raportul masă chimozină activă/masă pepsină activă > 1, 38.

Cheagul industrial se obține sub formă lichidă sau pulbere.

La folosirea cheagului în soluție apoasă trebuie să avem în vedere că acesta își pierde din activitate dacă :

concentrația enzimei în soluție este mică ;

este prezentă lumina solară sau chiar lumina din încăperi;

soluția este puternic agitată cu formare de spumă ;

temperatura depășește 60 C ;

soluția are pH 6, 6 ÷ 7, 4.

Stabilitatea enzimei este bună între pH 5, 0 și 6, 0.

Pepsina este un preparat enzimatic care se obține din mucoasa roșie a stomacelor de vită și mai ales porc, unde se găsește sub formă inactivă de pepsinogen. Trecerea sub formă activă are loc sub influența HCl folosit la extracția enzimei din mucoasa stomacală roșie. Preparatul mai conține și chimozină, raportul masă chimozină activă/masă pepsină activă > 0, 154.

Pepsina coagulează bine numai laptele acidifiat la pH 6, 6. În comparație cu cheagul are o activitate proteolitică mai mare putând conduce la defecte de gust (gust amar). Se obține sub formă de pepsină praf tip L (putere de coagulare 1:50000 sau 1: 120.000). Pepsina praf are 3% apă, maximum 40% (pt. 1:120000) – 58%(1:50000) NaCl și maximum 3, 5% lipide.

Preparatele enzimatice fungice se prezintă sub formă de pulberi fine, omogene, alb-gălbui, solubile în apă, însă ca acțiune sunt inferioare enzimelor coagulante de origine animală, în principal cheag.

La folosirea preparatelor enzimatice fungice trebuie să avem în vedere următoarele:

creșterea temperaturii de coagulare peste 30 C influențează pozitiv coagularea (deci trebuie să se țină seama de sortimentele de brânză cu temperatura de coagulare a laptelui 30 C);

aciditatea laptelui 20 T influențează negativ acțiunea enzimelor;

coagulul obținut are o durată mai lungă de întărire, consistența mai moale, ceea ce favorizează pierderi de substanță uscată în zer. Se impune prelungirea duratei de coagulare și prelucrare a coagulului cu 10 – 15 min, respectiv creșterea acidității laptelui supus închegării și creșterea temperaturii acestuia;

activitatea proteolitică a enzimelor fungice este mai mare decât a cheagului, în special asupra proteinelor serice, ceea ce înseamnă pierderi de proteine în zer.

Preparatele enzimatice de origine bacteriană au o utilizare mai limitată din următoarele motive:

au activitate proteolitică mai mare și din această cauză produc defecte la brânzeturi

5.6 Utilizarea enzimelor în panificație

In cereale sunt prezente diferite enzime hidrolitice endogene, în scopul degradării constituienților de rezervă, cum ar fi amidonul, proteinele și lipidele. Componenții de rezervă ai grânelor, cum sunt amidonul și proteinele, la fel ca și β-glucanul din pereții celulelor, sunt degradați prin acțiunea combinata a exo- și endo-enzimelor.

Exo-enzimele atacă polimerii de la un capat al moleculei, îndepărtând secvențial, una câte una, unitățile monomerice. Pe de alta parte, endo-enzimele atacă porțiuni interioare ale polimerilor, eliberând fragmente de molecula mai mici, dar încă relativ mari. In linii mari, endo-enzimele duc la solubilizarea macromoleculelor prin reducerea mărimii lor, în timp ce exo-enzimele produc specii cu mase moleculare mai mici din produșii de hidroliză ai endo-enzimelor (Bamforth, 1986).

Hidroliza a amidonului – amidonul este degradat de o combinatie de enzime, care include α- si β-amilaze si dextrinaza limita (Figura 5.2), rezultatul final fiind producerea de glucide.

Figura 5.2. Hidroliza amilozei (A) si a amilopectinei (B) din amidon prin actiunea combinata a α- si β-amilazei si a dextrinazei limita

[o- rest de glucoza; ● – rest de glucoza redusa; – legatura α-(1, 4) si …. legatura α-(1, 6)].

Proteaze – Exista multa confuzie in literatura de specialitate în ceea ce privește nomenclatura enzimelor cerealiere care hidrolizează proteinele. În general, “proteaze” sau “enzime proteolitice” sunt folosite, în mod obișnuit, ca nume generice pentru enzimele care hidrolizează legăturile peptidice (Storey si Wagner, 1986). Endopeptidazele hidrolizeaza legaturile interne din proteine, în timp ce aminopeptidazele și carboxipeptidazele sunt exopeptidaze, care elibereaza aminoacizi de la capatul amino, respectiv capatul carboxil al lantului peptidic (Figura 5.2). Utilizarea enzimelor in panificatie 31

Figura 5.3. Proteoliza legaturilor peptidice în proteina cerealelor.

Lipazele adevarate sunt enzimele care atacă triglicerolii, așa cum se poate vedea în exemplul următor, și actionează numai la interfața ulei-apa (Galliard, 1980):

Figura 5. 4. Actiunea lipazelor asupra triglicerolilor. R, R’ si R” reprezinta lanturi

ale acizilor grasi.

Oxidaze

Lipoxigenaza (linoleat: oxigen oxido-reductaza) se refera la un grup de enzime care catalizează oxigenarea (oxidarea), de catre oxigenul molecular, a acizilor grasi care conțin un sistem cis, cis – (1, 4) – pentadien pentru a produce derivați hidroperoxidien conjugați (Galliard si Chan, 1980), asa cum se poate vedea:

Figura 5.5. Actiunea lipoxigenazei asupra acizilor grasi in prezenta oxigenului molecular.

Fenoloxidaza

Există un spectru larg de enzime în cereale care catalizează oxidarea mono- si difenolilor la chinone. Acestea sunt prezentate, adeseori, ca polifenol oxidaza, fenolaza, tirozinaza, catecolaza și crezolaza. Sunt catalizate doua reacții distincte, așa cum se poate vedea mai jos:

Figura 5. 6. Reactii catalizate de fenol oxidaze.

Aceste enzime sunt implicate in formarea materialelor polimerice colorate. Această reacție poate fi denumită “brunificare enzimatică” sau “melanoidizare”.

Peroxidaza

Peroxidaza este membru al unei familii largi de enzime denumite oxido-reductaze (Burnette, 1977) și este o hemproteină care catalizează oxidarea unui numar de amine aromatice și fenoli de către peroxidul de hidrogen (Kruger si Reed, 1988).

Enzima catalizează reacția generală (Scott, 1975):

ROOH + AH2 → H2O + ROH + A

ROOH poate fi HOOH sau un alt peroxid organic, cum ar fi peroxidul de eter, etil peroxidul de hidrogen sau peroxidul de butil (Sumner si Somers, 1947). Reactia enzimatica are loc via un numar de complecși intermediari, asa cum se poate vedea în ecuatiile urmatoare, unde AH2 inlocuieste donorul de hidrogen si A donorul oxidat (Burnette, 1977):

Peroxidaza + H2O2 → Complex I

Complex I + AH2 → Complex II + AH

Complex II + AH2 → Peroxidaza + A

Ascorbat oxidaza

Ascorbat oxidaza sau acid ascorbic oxidaza catalizează oxidarea, cu ajutorul oxigenului molecular, a acidului ascorbic, care se adaugă curent în panificație. Acidul ascorbic este transformat în acid L-dehidroascorbic, care la rândul său oxidează glutationul, în prezență de glutation reductază. (Launay, B.Bure, J., 1973). Glutationul oxidat devine în acest caz indisponibil pentru a participa la reacții de tipul: 2 G-SH ® 2 G-S-S-G cu proteinele, consecința fiind o “întărire” a aluatului (glutenului).

Hexozoxidaza

Hexozoxidaza (HOX; EC 1.1.3.5) catalizează conversia unui număr de mono- și oligoglucide la lactonele corespunzătoare, cu hidroliza în continuare, la acizii aldobionici respectivi, concomitent cu formarea H2O2. Reacția catalizată de HOX poate fi reprezentată astfel:

D-glucoză + O2 → d-D-gluconolactonă + H2O2

D-galactoză + O2 → g-D-galactogalactonă + H2O2

Hexozoxidaza a fost izolată din doua specii de alge roșii Iridophycus flaccidum (Bean și Hassid, 1956) și Chondrus crispus (Sullivan și Ikawa, 1973; Kerchensteiner, 1978). Hexozoxidaza a fost purificată din alga roșie Chondrus crispus. Prin utilizarea acestei enzime în sistemul aluat, s-a obținut o scădere a concentrației de grupări tiol libere, probabil din cauza formării punților disulfurice dintre proteine, în fracția glutenică. S-a găsit o bună corelație între reducerea conținutului de grupări tiol și creșterea tăriei aluatului, așa cum reiese din măsurători la extensograf. Rezultatele au fost confirmate de probe de coacere. Sunt necesare studii viitoare pentru a se vedea dacă formarea legăturilor disulfurice este singura explicație pentru funcționalitatea enzimei. Efectele sale benefice se pot datora, de asemenea, gelatinizării pentozanilor sau cuplării proteine-pentozani. Hexozoxidaza a fost comparată cu glucozoxidaza, care este preferată în mod obișnuit, ca alternativă enzimatică la agenții de oxidare chimici, utilizați pentru îmbunătățirea calității pâinii. Se presupune că mecanismul de acțiune al hexozoxidazei în aluat este identic cu cel al glucozoxidazei, dar hexozoxidaza este mai eficientă, la aceeași doză, din cauza spectrului mai larg al substratului utilizat și a afinității mai mari pentru glucoză (valoare Km mai mică).O analiză a mono- și diglucidelor din făină și din aluat arată că afinitatea HOX de a utiliza maltoza, o face utila în mod special, ca un ameliorator oxidativ pentru îmbunătățirea calității pâinii (Poulsen și Hostrup, 1998).

Sulfhidriloxidaza

Obținută din Aspergillus niger și adăugată la aluat fie singură, fie împreună cu glucozoxidaza, a fost p rezentată ca un întăritor al aluaturilor moi.

Sulfhidriloxidaza catalizează formarea legăturilor –S–S– din grupările tiol ale proteinei. Este posibil ca sulfhidriloxidaza să aibă afinitatea limitată pentru grupele –SH din gluten.

Testarea sulfhidriloxidazei a demonstrat faptul că singură nu are influență asupra bucății de aluat, tăriei aluatului sau asupra toleranței la frământare (Maarten van Oort, 1996).

Enzimele afectează, de asemenea, procesul de coacere. Alfa-amilazele au fost cel mai intens studiate în legătură cu o calitate mai bună a pâinii și creșterea termenul de valabilitate. Sunt folosite atât amilaze fungice cât și bacteriene. Supradozajul poate duce la aluat lipicios, astfel încât valoarea adăugată trebuie să fie atent controlată. Una dintre motivațiile pentru a studia efectul enzimelor asupra calităților aluatului și pâinii vine din dorința de a reduce alți aditivi. În plus față de amidon, făina de obicei conține cantități mici de celuloză, glucani și hemiceluloză ca arabinoxilan și arabinogalactan. Există dovezi că utilizarea xilanazelor scade absorbția de apă și reduce astfel cantitatea de apă adăugată . Aceasta duce la aluat mai stabile Xilanazele sunt utilizate mai ales pentru copt secară și făină de gris uscat

Proteinaze pot fi adăugate pentru a îmbunătăți proprietățile tehnologice ale aluatului; glucoză oxidaza a fost utilizată pentru a înlocui oxidanți chimice și de a consolida lipaze gluten, ceea ce duce la aluat mai stabil și o pâine de calitate mai bună .

5.7. Industria textilă

Enzimele pot înlocui adesea produse chimice sau procese chimice care nu prezintă siguranță sau afectează mediul înconjurător.

Enzimele și-au găsit o largă aplicabilitate în industria textilă. Înainte de a fi țesute firele de urzeală se acoperă cu un agent de încleiere pentru a fi lubrifiate și protejate la abraziune în timpul țeserii. Ca agent de încleiere se utilizează în special amidonul . Înainte ca materialul să fie vopsit trebuie să se îndepărteze agentul de încleiere. Înainte de descoperirea enzimelor îndepărtarea agentului de încleiere se realiza cu hidroxid de sodiu la temperatură ridicată, ceea ce determina o deteriorare a firelor de bumbac. Utilizarea amilazei pentru îndepărtarea agentului de încleiere a determinat o îmbunătățire a calității materialelor, a dus la evacuarea în mediu a unei cantități mai mici de subsatnțe poluante, a îmbunătățit condițiile de muncă pentru lucrătorii din textile. Pentru a înlocui în totalitate substanțele chimice din industria textilă se fac cercetări pentru utilizarea altor enzime ( celulaza, hemicelulaza, pectinaza și lipaza). Înmuierea mai rapidă a fibrelor vegetale s-a realizat cu ajutorul enzimelor pectinolitice (Brumaro și alții 1993, Baracat-Pereira și alții 1993). O serie de studii au evidențiat îmbunătățirea calității țesăturilor atunci când fibrele de bumbac au fost tratate cu un amestec de hemicelulaze și pectinaze (Csizer și alții 2002, Sawado și alții 2001).

Firele de bumbac se supun unei operații de înălbire cu peroxid de hidrogen. Pentru a neutraliza peroxidul de hidrogen se poate face tratarea cu un agent reducător și spălare cu apă. Pentru descompunerea peroxidului de hidrogen la la apă și oxigen se poate utiliza catalaza.

Enzimele proteolitice din anumite bacterii si ciuperci sunt utilizate la fabricarea pielii. Aceste enzime digera colagen sau țesut conjunctiv

5.8 Detergenti

Proteinaze bacteriene sunt în continuare cele mai importante enzime pentru detergenti. Unele produse au fost modificate genetic pentru a fi mai stabile fata de unele substante chimice (detergenți anionici, agenți de oxidare pH-ul ridicat. Enzime lipidice degradante au fost introduse în praf și detergenți lichizi.

Amilaze sunt utilizate în detergenți pentru a elimina petele pe bază de amidon. Amilaza hidrolizează amidonul gelatinizat , care tinde să stea pe fibre textile. Amilazele sunt utilizate pentru îndepărtarea resturilor de mâncare pe bază de amidon (cartofi, spaghetti, cremei de ou, lichidelor rezultate la fierberea cărnii sau ciocolatei). Amilazele sunt utilizate atât în detergenții pentru vase cât și cei pentru rufe.

Lipazele pot cliva cu usurință petele de proteină, ulei sau grasime. Problema este delicată în cazul îndepărtării petelor de grasime, în special pentru țesăturile care au în compoziție un amestec de bumbac și poliester, la temperaturi joase (pentru un consum energetic redus). Lipazele descompun grăsimile în compuși mai solubili în apă prin hidroliza legăturilor eterice dintre glicerol și acizi grași. Lipaza cea mai importantă de pe piată a fost inițial obținută din Humicola lanuginose. Aceasta este produsă pe scară largă de către gazda Aspergillus oryzae după clonarea genei Humicola în acest organism. Lipidele pot fi îndepartate și cu ajutorul detergentilor ionici la pH alcalin.

Celulazele au fost componente ale detergenților de la începutul anilor 90. Celulaza este de fapt un complex de enzime capabile să degradeze celuloza cristalină la glucoză. Celulazele alcaline produse de tulpini de Bacillus și celulazele neutre și acide de fungii Trichoderma și Humicola au scopul de a îndepărta proteinele colorate (din iarba, sânge, ou sau transpirație).

Celulazele au proprietatea de a modifica structura fibrei celulozice din bumbac sau amestecuri în care apare bumbacul. În cazul în care articolele cu această compoziție sunt spălate de câteva ori, acestea au tendința de a se scămoșa iar culoarea devine palidă.

Efectul este datorat formării microfibrelor care sunt parțial desprinse de pe fibra principală. Lumina incidentă de pe aceste articole este reflectată într-o proporție ridicată înapoi creând impresia schimbării culorii. Aceste microfibre pot fi degradate de enzima celulaza, determinând o netezire a fibrei si implicit o menținere a culorii articolelor supuse spălării. Mai mult, celulazele mențin țesătura pufoasă și pot îndeparta petele de pamânt care de regulă sunt fixate pe microfibe.

Principalele enzime utilizate în detergentii “biologici” sunt amestecuri de amilază și proteaze (alcalină sau neutră) care sunt active la pH = 6, 5 -10 și la temperaturi de 30 – 60 0C.

5.9 Utilizarea enzimelor în industria chimică

Manifestând o mare inertie chimicã, alcanii participã mai ales la reactii radicalice care au loc în conditii bogate energetic. Semnificative în acest sens sunt oxidãrile exoterme, neselective, la temperaturi înalte (frecvent arderi). Se cunosc însã si oxidãri blânde, realizate printr-o asa numitã activare enzimaticã.

În acest caz procesul are loc sub influenta enzimelor din organismele vii.

Aplicatii analitice

Aplicatiile analitice ale enzimelor pot fi împartite în doua arii: electrozii enzimatici si analizatorii automatici.

Electrozii enzimatici sunt electrozi capabili sa genereze un potential electric ca rezultat al reactiei catalizate de enzima imobilizata pe sau în jurul electrodului. Primul electrod enzimatic preparat este un electrod sensibil la glucoza. Acesta s-a realizat prin imobilizarea glocozoxidazei într-un gel de poliacrilamida, fixat apoi în jurul unui electrod de oxigen cu acetat de celuloza. Principiul de functionare este simplu: enzima catalizeaza eliminarea oxigenului din solutie cu o viteza dependenta de concentratia de glucoza.

Aplicatiile enzimelor în autoanaliza implică înlocuirea enzimelor solubile existente într-un sistem de autoanaliză cu acestea. Folosirea enzimelor solubile prezintă inconveniente prin faptul că în fiecare probă de analizat se adaugă câte un solubilizat din enzima liberă, acesta pierzându-se. Alternativa este imobilizarea enzimei respective pe peretele unui tub de naylon prin care se trece proba de analizat. Este necesar totuși în acest caz calcularea dimensiunilor tubului în raport cu rata de curgere a probei. Un avantaj al acestui sistem este faptul ca pe aceeasi proba se pot face mai multe determinari [Karube, 1987].

În aplicațiile industriale, pentru a transforma o substanță organică în produși de reacție utili exista trei posibilități:

a). transformări chimice

b). fermentații cu celule microbiene întregi

c). reacții catalizate enzimatic

Transformarile chimice, desi nelimitate virtual, în practica unele sunt fie prea costisitoare, fie tehnic dificile. De exemplu sinteza chimică a antibioticelor este impracticabilă, la fel și extracția chimică a lactozei din lapte.

Fermentațiile celulare au avantajul de a asigura o oarecare specificitate a reacției, condiții de mediu normale și asigură un randament bun. În schimb apar și unele inconveniente: apariția produsilor de reactie nedoriti datorita cailor metabolice alternative prezente in celula, este necesara utilizarea unor conditii aseptice riguroase.

Folosirea enzimelor prezintă numeroase beneficii: reacția enzimatică este specifică atât față de substrat cât si fată de produsul de reacție, contaminarea microbiană are o importanța mai scăzută, nu este necesară folosirea unui mediu nutritiv pentru dezvoltarea microorganismului, nu există membrană celulară care să împiedice interacțiunea dintre enzimă și substrat. Totuși folosirea enzimelor solubile în procese industriale poate ridica anumite probleme: enzima poate fi instabilă, nu se poate reutiliza, este greu de automatizat. Unele sau chiar toate aceste inconveniente se pot elimina prin imobilizarea enzimelor [Chibata, 1987]

Enzimele au largi aplicații în industria de biosinteză enzimatică. Astfel se pot obtine substante optic active (aminoacizi, hidroxiacizi), antibiotice și alte medicamente, biopolimeri folosiți în industria extractivă. De asemenea se pot realiza diferite reacții de oxidare a unor substanțe organice sau reacții de transformare biochimică a unor compusi naturali (hormoni steroizi).

În industria chimică enzimele sunt utilizate atât ca reactivi chimici de analiză, cât și ca reactivi chimici de sinteză. În domeniul chimiei, proteinelor nu li se poate concepe studiul secvenței de aminoacizi a unei proteine fără utilizarea metodelor de hidroliză enzimatică cu ajutorul unor proteinaze ( chimiotripsină, papaină, pepsină, tripsină)

Separarea DL-aminoacizilor

Aminoacizii pot fi produși industrial fie prin sinteza chimică fie prin fermentație. Deși sinteza chimică prezintă avantajul eficienței economice, rezultatul este forma racemică DL-aminoacid, optic inactiv. Pentru a avea valoare acesta trebuie redus la forma activa L.

Dintr-o varietate de metode chimice și biochimice cea mai buna variantă o reprezintă folosirea aminoacilazei imobilizate [Preda, 2003].

DL-aminoacidul obținut prin sinteza chimică este hidrolizat selectiv de către aminoacilaza L-specifică din Aspergillus oryzae (E.C. 3.5.1.4.) la formele, L-aminoacidșsi D-acilaminoacid. Acestea se pot separa usor pe baza solubilitatii lor diferite. D-aciaminoacidul este apoi racemizat la forma DL-aminoacid si reutilizat.

Metoda este utilizata pentru fabricarea unor L-aminoacizi ca L-Met si L-Val.

Procesul Tanabe utilizeaza o coloana împachetata cu aminoacilaza imobilizata DEAE-Shepadex în proces de operare continuu.

Degusa, pe de alta parte, utilizeaza acilaza libera într-un bioreactor membrana. Metoda este atractiva numai pentru L-aminoacizi (nu pentru D-aminoacizi ) si, de aceea se utilizeaza numai pentru producerea acestora. Procesul este eficientizat atât prin utilizarea eficace a enzimei cât si prin racemizarea izomerului nedorit [Chibata, 1987].

Sinteza acetonei , a acidului n-butiric, și a n- butanolului

Pentru obținerea pe cale enzimatică a acetonei , a acidului n-butiric, și a n- butanolului au loc următoarele reacții redate schematic.

CH3-CO-COOH +E1-TPPE1-TPP-CHOH-CH3 +CO2

Acetaldehida activată, E1-TPP-CHOH-CH3 reacționând cu CoASHîn prezența NAD+, se formează CH3-COSCoA + E1- TPP + NADH + H+

Acetil SCoA reacționează cu acidul oxalilacetic în prezența citrat sintetazei (E.C.4.1.3.7) activată cu ionii Mg2+, formându-se în prima etapă citrilcoenzimăA, citrilSCoA, care se transformă în a doua etapă în acid citric și coenzima AcoSH:

CH3-COSCoA + HOOC-CO-CH2 – COOH

Hidroliza citrilcoenzimei A are un caracter puternic exoterm ( H = – 32, 186 KJ/mol)datorită legăturii macroergice din citrilSCoA

Liaza numită aconitat hidratază, cunoscută sub numele de aconitază ( E.C.4.2.1.3), catalizează trecerea reversibilă.

Acid citric Acid cis-acotinic Acid izocitric

Acidul izocitric , la rândul său , prin dehidrogenare sub acțiunea NAD-izocitrat dehidrogenazei E.C.1.1.1.42 formează inițial acid oxalilsuccinic care, prin decaborxilare , trece apoi în acid α- cetoglutaric:

Din acetilcoenzimă A rezultă în alte condiții acid acetilacetic ( β- cetobutiric), din care derivă pe de o parte acetonă și alcool izopropilic:

CH3 – CO- CH2-COOH CH3-CO-CH3 CH3 – CHOH-CH3

iar pe de altă parte se formează acid n- butiric și alcool n-butilic:

CH3 – CO- CH2-COOH CH3 – CH2- CH2-COOH CH3 – CH2- CH2-CH2-OH

Din acetaldehidă activată și acid piruvic rezultă E1- TPP și acid acetilacetic, din care prin decarboxilare se formează acetoină, care, prin hidrogenare, trece în 2, 3-butandiol:

Peniciline semisintetice Penicilina este produsă de tulpini modificate genetic, de tulpini Penicillium. Cele mai multe dintre penicilini sunt convertite de enzima acilasă imobilizată la acid 6-aminopenicillanic, care servește ca o coloană vertebrală pentru multe peniciline semisintetice. Acestea pot fi sintetizate prin metode chimice sau enzimatice

5.10 Utilizarea enzimelor în ingineria genetică

Extragerea ADN-ului se produce utilizându-se o serie de enzime specifice, în primul rând, cele de restricție, capabile să rupă molecula de ADN în anumite locuri. Enzima de restricție extrasă din Escherichia coli Eco RI recunoaște următoarea secvență de nucleotide:

G↓ AATTC

CTTAA↑G.

Restrictazele reprezintă instrumentul de bază al ingineriei genice, deoarece au capacitatea unică de a tăia molecula de ADN în anumite sectoare (loci). Prima restrictază a fost obținută din bacteriile Haemophillus influenzae serotipul α și se folosea pentru fragmentarea ADN-ului virusului SV-40 și cartarea lui (Kelly, Smith, 1970).

Nu toate restrictazele se utilizează în ingineria genică, ci doar acele care au următoarele proprietăți:

pot tăia molecula de ADN în fragmente discrete;

posedă o specificitate de acțiune înaltă (taie molecula de ADN într-o anumită succesiune – “site”-ul de recunoastere);

pot forma, în rezultatul restricției, “margini lipicioase” la capetele fragmentului de ADN (această proprietate nu este caracteristică tuturor restrictazelor);

pot fi izolate relativ ușor în stare pură din mediul incubațional.

Principiile enzimologiei sunt aplicate in laborator la masurarea activitatii enzimatice in scop diagnostic si a concentratiei de substrat.

5.11 Epurarea biologică a apelor

Importanță enzimelor bacteriene în procesul de epurare este evident mare, enzimele fiind implicate în degradarea și descompunerea materiei organice în timpul procesului. Se cunosc informații încă din anii ’50 și ’60 despre proteaze, urează, catalază, peroxidază și coenzima Q, dehidrogenaze etc., izolate sau descrise ca activitate în interiorul nămolului activ.

Enzime din grupul hidrolazelor sunt responsabile cu degradarea majorității substanțelor organice prezente în apele uzate: polimeri biologici reduși la monoglucide, glicerină, acizi grași, aminoacizi, care sunt apoi transformați în interiorul celulei în substanțe care, prin reacții biochimice ulterioare produc energia necesară creșterii și dezvoltării celulelor.

Monoglucidele sunt descompuse prin căi oxidative comune: sunt descompuse la glucoză/fructoză și fosfații respectivi, degradate prin glicoliză la acid piruvic, apoi oxidate la dioxid de carbon și apă pe calea acizilor tricarboxilici; specii de Pseudomonas, Acetobacter sau Acetomonas, frecvente în nămolul activ, folosesc alte căi, cum ar fi ciclul pentozofosfaților sau calea Entner-Doudroff; în toate situațiile, enzimele implicate în glicoliză au sediul în citoplasmă, iar cele implicate în oxidarea piruvatului, în mitocondrii (Vaicum, 1981, p. 53).

Proteinele din apele uzate sunt hidrolizate la aminoacizi de enzime proteolitice. Aceștia sunt catabolizați în bacterii în funcție de enzimele existente și de condițiile de mediu (prezența sau absența oxigenului), prin dezaminări (oxidative, reducătoare sau hidrolitice), cu îndepărtarea grupării amino- sub forma amoniacului, și prin decarboxilări, cu îndepărtarea CO2.

Lipidele sunt hidrolizate la o serie largă de substanțe, toate cu un caracter comun: solubilitate în solvenți organici apolari. Ele au capacitatea de a hidroliza în glicerină și acizi grași sub acțiunea lipazelor, enzime din clasa hidrolazelor găsite în microorganisme atât aerobe cât și anaerobe (Clostridium, Aspergillum, Penicillium, Fusarium). Glicerina este transformată în acid glicerofosforic și urmează, în general, calea de degradarea a glucidelor, iar acizii grași sunt degradați prin β-oxidare, proces cu implicarea a cinci enzime (tiokinază, acil-dehidrogenază, hidratază, dehidrogenază, tiolază), comun oxidării hidrocarburilor (cu participarea adițională a oxigentransferazelor), alcoolilor, cetonelor, aldehidelor și altor substanțe.

Degradarea principalelor clase de substanțe organice naturale duce la formarea unor intermediari comuni, care constituie fondul metabolic comun, cum este cazul acidului acetic activat (Acetil-CoA), care asigură includerea produșilor metabolismului intermediar în calea finală de degradare sau în alte sinteze de substanță, pentru ca, în anaerobioză, calea finală de degradare (comună metabolismului glucidelor, proteinelor și lipidelor) să aibă loc în ciclul acidului citric sau al acizilor tricarboxilici. În acest mod, acidul acetic activ este descompus la CO2 și H2O, prin reacții consecutive, în ciclu, de dehidrogenare și decarboxilare, efectuate sub influența unor enzime specifice, prezente în mitocondrii (Vaicum, 1981, p.55).

O serie de enzime sunt implicate în metabolismul energetic ale microorganismelor din nămolul activ: enzimele fosforilării oxidative (cele care asigură refosforilarea ADP la ATP, dar și scindarea acestuia cu generarea de energie, cum este cazul ATP-azei) și sistemele de enzime ale lanțului respirator. Transferul de hidrogen (electroni) la ultimul acceptor e catalizat de trei tipuri de enzime din clasa oxidoreductazelor (idem, p. 59):

– pirin-dehidrogenaze (cu conezimă NAD sau NADP) catalizând în principal reacții de sinteză (mai ales cele cu coenzima NADP);

– flavin-dehidrogenaze (cu coenzime FAD sau FMN);

– citocromi (care conțin un sistem nucleu porfirinic – Fe).

Tot din acest sistem pare să facă parte și coenzima Q (chinonă), funcționând ca o moleculă solubilă în lipidele membranei mitocondriale, între flavienzime și citocromi. În cazul în care sistemul respirator apare necuplat cu fosforilarea, se pare că flavienzimele sunt oxidate direct de către citocromi, ocolindu-se sistemul chinonic (ibidem, p. 60).

Enzime sunt implicate și în oxidarea biologică, care oferă ca produși finali CO2 și H2O în procesul denumit stabilizare aerobă în epurarea apelor. În afară de calitatea lui de acceptor final de hidrogen sau electroni, oxigenul mai poate pătrunde direct în molecule organice, în scopul degradării lor, reacții catalizate de enzime din grupurile dehidrogenazelor (transportatoare de electroni), oxigenazelor (oxigentransferaze) sau hidroxilazelor.

Întregul proces al epurării cu nămol activ poate fi analizat din punctul de vedere al cineticii enzimatice. Au fost stabilite valori ale Km pentru apele uzate menajere (între 30 și 100 mg/l) și pentru unele substanțe organice degradate (acetat: 6, 3 mg/l, săpun: 67 mg/l etc.). Respirația nămolului activ în prezența apei uzate (respirația de substrat) privită ca funcție de concentrația acesteia (exprimată în CCOCr) urmează cinetica Michaelis-Menten (cu abateri în cazul alimentării discountinue, ibidem, p. 49).

Preparate enzimatice fixate pe substrat sunt folosite ca adjuvanți ai procesului de epurare, iar cinetica lor se încadrează în cinetica normală a enzimelor.

5.12 Fiziologia și patologia plantelor

Botanica si chimia agricolă aplică analiza enzimatică în cercetarea fiziologiei plantelor, în controlul calitatii unor produse vegetale. Studiile privind comportamentul la ger și la secetă a unor plante de cultura folosesc analiza enzimatică. Calitatea semintelor este testată prin activitatea enzimatica a proteinelor, a alfa – amilazei.

Conversia protopectinei, substanță parentală, insolubilă în apă, la pectină solubilă și pectat și, ulterior, la produșii lor de degradare, este un proces cu rol important în maturarea și infectarea plantelor.

La plante, protopectina are rol de adeziv intracelular, transformarea sa în forme solubile determinând o scădere a rigidității țesuturilor reflectată prin înmuierea și, ulterior, prin lichefierea materialului plantei. Chiar dacă mecanismul acestei conversii nu este pe deplin elucidat, este evident faptul că în aceste procese un rol major îl au enzimele pectinolitice ale plantelor și ale patogenilor, primele fiind implicate în schimbările fiziologice, iar celelalte în alterările patologice.

Paralelismul între creșterea activităților pectinesterazice și endopoli-galacturonazice, pe de o parte, și formarea pectinelor solubile în apă, pe de altă parte, paralelism observat în cursul maturării fructelor, indică o strânsă corelație între aceste două procese. În fructele necoapte prezența endopoligalacturonazei nu a fost depistată, iar activitatea pectinesterazică este foarte mică. Cele două activități încep să crească, existând o corelație între creșterea acestora și gradul de coacere. În fructele roșiilor transgenice, la care este expresat un RNA antisens pentru poligalacturonază, activitatea poligalacturonazică este foarte mică, ajungând până la 1% din cea depistată în fructele normale (Langley și alții 1994, Grierson și alții 1994).

Expresia unei gene antisens pentru pectinesterază, a determinat o scădere de 10 ori a activității pectinesterazice în roșii (Treman și alții 1994). Roșiile transgenice au unele proprietăți modificate, proprietăți care sunt exploatate în procesele de stocare și prelucrare a acestora.

Enzimele pectinolitice joacă un rol important în interacția microorganismelor cu plantele superioare, interacție cu efecte multiple asupra țesuturilor plantelor. Câteva dintre aceste efecte sunt:

macerarea și distrugerea celulelor (Salinas și alții 1995, Federici și alții 2001)

apariția reacțiilor de apărare ale plantei contra patogenului;

pereții celulari devin mai succeptibili la atacul altor polizaharidaze microbiene;

creșterea concentrației de etilenă, hormon care produce căderea fructelor (Agravante și alții 1991).

Bolile plantelor cauzate de patogeni sunt procese complexe la care participă mai mulți factori. Mecanismul inducerii patogenicității este asociat cu o interacție între patogen și peretele celular polizaharidic al gazdei, interacție care influențează producția de enzime care degradează peretele celular (Alghisi și alții 1995, Yang și alții 1994). Rolul direct al enzimelor pectinolitice produse de patogen în procesul de infecție este indicat prin:

capacitatea tuturor patogenilor cunoscuți de a produce enzime pectinolitice (Rodriguezpalenzuela și alții 1991);

corelația directă între producția acestor enzime și virulența observată (Erampalli și alții 1995);

prezența enzimelor pectinolitice produse de patogen în țesuturile plantelor infestate (Chilosi și alții 1997).

Producția de enzime pectinolitice, în particular a celor cu mecanism “random“, de către patogen este una din condițiile esențiale pentru succesul infecției. Aceste enzime determină o alterare a peretelui celular, făcând posibilă penetrarea patogenului în plantele gazdă. O mutantă de Colletotrichum magna deficitară în secreția extracelulară a pectat liazei s-a dovedit a fi nepatogenă, deși acest microorganism este cunoscut ca fiind un patogen major al fructelor de avocado (Wattad și alții 1995).

Capacitatea microorganismelor de a produce enzime pectinolitice “in vitro“ nu este o dovadă a patogenicității lor, unele dintre ele fiind capabile să producă aceste enzime pe medii sintetice, neavând capacitatea de a le produce “in vivo“. În procesele de infecție un rol important îl are susceptibilitatea sau rezistența plantei la efectele patogenului (Baayen și alții 1997)

Recent, un grup de cercetători canadieni (Laurent și alții 2000) au reușit să obțină anticorpi policlonali față de o pectinesterază produsă de o genă de la Erwinia chrysanthemi expresată la de E. coli. Acești anticorpi nu au interacționat cu pectinesterazele fungice sau cu cele produse de plante, cea ce face posibilă utilizarea lor în identificarea timpurie a interacției plantă-patogen.

La plante au fost puse în evidență mai multe mecanisme de protecție contra infecțiior microbiene. Câteva dintre acestea sunt:

conversia acidului pectic la pectatul de calciu rezistent la acțiunea enzimelor pectinolitice;

efectul inhibitor asupra enzimelor pectinolitice exercitat de unele substanțe din plante: acidul cafeic, antocianidinele, epichatechina, compuși fenolici acidul salicilic, zaharoză (Tardy și alții 1997 );

inhibiția enzimelor pectinolitice de către hormonii plantelor sau de analogi ai acestora (Chilosi și alții 1997);

biosinteza unor inhibitori proteici naturali ai enzimelor pectinolitice, inhibitori care formează complexe cu enzimele pectinolitice și care contraatacă acțiunea nocivă a acestora.

Proteinele cu efect inhibitor asupra poligalacturonazelor microbiene au fost purificate și caracterizate din fructe și vegetale.

Din zmeură necoaptă a fost izolată o proteină cu masă moleculară de 38 500 Da, care inhibă necompetitiv două endopoligalacturonaze produse de Botrytis cinerea și o endopoligalacturonază din Aspergillus niger (Johnston și alții 1993).

Perele au o glicoproteină cu masă moleculară de 43 000 Da care inhibă diferențiat formele moleculare ale endopoligalacturonazei din Botrytis cinerea (Stotz și alții 1993)

Din semințe germinate de soia a fost izolată o proteină care interacționează diferit endopoligalacturonazele din Sclerotinia sclerotiorum și Aspergillus niger (Flavaron și alții 1994).

În fructele de măr a fost pusă în evidență o proteină heterogenă, având grade diferite de glicozilare, care inhibă diferit cele cinci forme ale poligalacturonazelor din Botrytis cinerea (Yao și alții 1995).

Cu ajutorul unui biosensor, Mattei (1997) a arătat existența unei afinități diferite între inhibitorul proteic izolat din Phaseolus vulgaris și diferite endopoligalacturonaze obținute prin mutageneză dirijată din Fusarium moniliforme. Resturile de arginină, lizină și histidină din structura acestui inhibitor joacă un rol esențial în interacții cu poligalacturonaza (Federici și alții 2001).

Un inhibitor proteic natural al pectinesterazelor a fost izolat și din fructele de kiwi. Inhibitorul s-a dovedit a fi o glicoproteină care este biosintetizată sub forma unui precursor inactiv în fructele necoapte (Giovane și alții 1995, Camardella și alții 2000).

Mecanismul prin care aceste proteine inhibă activitatea enzimelor pectinolitice nu este cunoscut.

5.13 Prelucrarea biomasei vegetale

Amestecuri de enzime pectinolitice din surse microbiene au fost utilizate în prelucrarea biomasei vegetale (Kravtchenko și alții 1993). Prin intermediul acestor enzime se realizează astfel curățirea mediului și reciclarea resurselor naturale. Deșeurile rezultate în urma prelucrării citricelor sunt bogate în glucide, fapt care permite utilizare lor pentru producerea furajelor. Tratarea acestor deșeuri cu pectinesteraze microbiene are ca rezultat formarea pectatului de calciu concomitent cu apariția așa numitului “fenomen de coagulare“. Acest fenomen ușurează îndepărtarea apei, realizându-se și o economie de combustibil în procesele de uscare.

Pectinesteraza din Penicillium felutatum a fost utilizată de către Aizenberg (1996) pentru producerea pectinelor slab metilate, substanțe cu aplicații în medicină și în producerea hranei pentru diabetici.

Viteza cu care amidonul din plante este hidrolizat sub acțiunea glucoamilazei produse de Aspergillus niger a fost crescută în prezența unui amestec de endopoligalacturonază și pectinesterază obținut din specii de Rhizopus (Chitradon și alții 1996).

Multe procese biotehnologice folosite în industria alimentară utilizează, alături de alte tipuri de enzime pectinolitice, pectinesteraza. Acțiunea pectinesterazei conduce la eliberarea de metanol, substanță toxică pentru organismele animale. În acest sens au fost efectuate teste toxicologice pe diferite animale. Administrarea orală, timp de 13 zile, a unei cantități de 10 g preparat proteic cu activitate pectinesterazică /kg corp, nu a afectat greutatea, semnele vitale, comportamentul sau parametrii biochimici ai șobolanilor (Lissau și alții 1998). Cu toate acestea, efectele fiziologice și nutriționale produse sub acțiunea metanolului trebuie avute în vedere.

Izolarea protoplaștilor din plante necesită prezența enzimelor pectinolitice, a celulazelor și hemicelulazelor (Ruesink și alții 1988).

Lacours (1994) a arătat că enzimele pectinolitice pot fi utilizate în caracterizarea taxonomică a speciilor de Gremmenniela.

Castaldo (1996) a pus la punct o metodă enzimatică pentru dozarea concentrațiilor de pectină cu ajutorul enzimelor pectinolitice. În această tehnică, acidul D-galacturonic, rezultat din degradarea pectinelor sub acțiunea pectinesterazei și a endopoligalacturonazei, este transformat în lactonă sub acțiunea unei glucuronolacton oxidaze. Acest proces este însoțit de o scădere a absorbanței la 340 nm, scădere datorată oxidării NADPH, cofactor al oxidazei. O metodă asemănătoare de determinare a concentrației pectinelor din fructe și vegetale a fost pusă la punct de Yoskioka (1992).

Enzimele pectinolitice au fost întrebuințate și în sinteza acidului ascorbic (Kulbe și alții 1987). În acest sens, pectina din mere a fost convertită, sub acțiunea pectinesterazei și endopoligalacturonazei, la acid D-galacturonic. Acidul galacturonic recuperat din hidrolizat prin electrodializă, a fost convertit la acid 2-ceto-L-galacturonic. Ciclizarea catalitică, acidă sau bazică, a cetoacidului a condus la obținerea acidului ascorbic.

Studii recente (Ruiz-Teran și alții 2001) au arătat o extracție de 3 ori mai eficientă a glucovanilinei (substanță din care se obține vanilina) din păstăile de mazăre în prezența enzimelor pectinolitice.

Industria alimentară generează volume mari de deșeuri, solide si lichide. Posibilitatea de a folosi enzime pentru a reduce deseurile si conversia deseurilor la produse cu valoare adaugata este în curs dedezvoltate. Disponibilitatea utilizării de enzime specifice, la costuri reduse a fost un important stimulent în utilizarea lor pentru eliminarea deseurilor.

Unele dintre enzimele folosite în tratamentele deseurilor alimentare sunt polizaharide (celulaza, pectinasa, hemicelulasa, chitinasa, și amilaza), lactaze, si proteinaze.

Tratamentul fructelor cu celulază si pectinasă a crescut randamentul sucului și separarea mai bună a solidelor din suc. Solidele pot fi folosite ca hrană pentru animale. Chitinasele sunt folosite pentru a depolimeriza cochilii de scoici, și produsul utilizat pentru a produce SCPs. Amilazele sunt utilizate pentru tratarea apelor uzate care conțin amidon pentru a produce sirop de glucoză utilizat în productia de alcool de către drojdii. Lactoza în zer a fost tratată cu lactază (b-galactozidaza) pentru a produce glucoza și galactoză, care sunt apoi utilizate în productia de alcool de drojdie sau de a produce drojdii de panificație.

Proteazele sunt utilizata pentru tratarea apelor uzate din prelucrarea pestelui si a operatiunilor de prelucrare a cărnii. Unele dintre aceste produse sunt utilizate ca alimente pentru pește.

În Suedia, pe reziduurile de la prelucrarea cartofului, au fost cultivate drojdiile Candida utilis si Endomycopsis fubuliger (proiectul „Simba”). E.fubuliger elimină în mediu o enzimă glucoamilaza), care hidrolizează amidonul până la glucoză, datorită căreia C. utilis acumulează o biomasă de circa 2 kg pe oră.

5.14 Utilizarea enzimelor din microorganisme în sinteza chimica

1. Obținerea catecolului: Microorganismele modificate genetic au fost utilizate de Draths și Frost (1998) pentru a sintetiza unul dintre cei mai importanți compuși chimici, catecolul, din glucoză. Această metodă este aplicată astăzi la scară industrială și s-a dovedit a fi foarte avantajoasă. Cel mai important aspect al acestei metode este acela că s-au utilizat ca materii prime materiale regenerabile. Metoda clasică implică utilizarea benzenului, obținut din petrol o sursă neregenerabilă, în 4 etape

Fig.5.7 Obținerea catecolului

2. Obținerea acidului adipic: Acidul adipic este un produs foarte important în industrie fiind utilizat pentru a obține nailon-6. Toate fabricile producătoare de acid adipic au adoptat măsuri cu privire la reducerea emisiilor de protoxid de azot care rezultă din metoda clasică ce implică utilizarea acidului azotic. O soluție „verde” și durabilă a acestei sinteze a fost identificată de Frost. Procesul introdus de acesta implică sinteza acidului adipic din glucoză prin catecol utilizând biocatalizatorul Escherichia coli modificat genetic:

3 Hidroxilarea ciclurilor aromatice și oxidarea catenelor laterale: Kirner (1995) a realizat hidroxilarea microbiană a ciclurilor aromatice și oxidarea lanțurilor legate de acestea pentru compușii heteroaromatici. O astfel de selectivitate este dificil de realizat într-o singură etapă prin metodele de sinteză tradiționale. Exemplul arată faptul că pe lângă atingerea selectivității, biocataliza poate fi implicată și în etape cum ar fi protejarea, deprotejarea sau activarea anumitor grupări și ca urmare crește eficiența utilizării atomilor, reduce deșeurile și conduce la scăderea necesarului de energie.

Fig.5.8 Hidroxilarea ciclurilor aromatice

4. Sinteza acidului 6-aminopenicilanic (Penicilina G): Metoda clasică se realizează cu protejarea grupării carboxilice și reprezintă un proces în patru etape. Prin metoda enzimatică se realizează transformarea într-o singur etapă:

5. Reacții Baye -Villager: Ingineria genetică reprezintă o alternativă utilizată în industrie. Astfel, Stewart a utilizat drojdia lui Baker modificată genetic în reacții Bayer-Villiger: Reacția implică transformarea cetonei într-o lactonă, iar în mod obișnuit se utilizează acidul m-cloroperoxibenzoic (m-CPB). Cum această substanță este sensibilă la șocuri și explozibilă este mult mai avantajoasă și mai sigură metoda biocatalitică. Acesta este un exemplu clasic în care biocataliza transformă o reacție obișnuită într-o reacție compatibilă cu mediul. Drojdia, un organism sigur și nepatogen, realizează oxidarea cetonei utilizând oxigenul atmosferic într-o reacție în care apa reprezintă singurul produs secundar obținut.

Enzimele prezintă însă și dezavantaje. Incompatibilitatea și instabilitatea acestora limitează utilizarea lor industrială. S-au făcut însă numeroase cercetări pentru a se găsi noi metode care să elimine aceste dezavantaje.

Altus Biologics (1997) a descoperit cristale de enzime reticulate (CER), utilizate pentru creșterea elasticității enzimelor utilizate în reacții ale compușilor organici. Cristalele de enzime reticulate sunt foarte stabile în condiții extreme de temperatură și pH și la expunerea la solvenți apoși și solvenți organic

6 Sinteza antibioticului cefalexin. Această reacție a fost posibilă prin utilizarea cristalelor de enzime reticulate.

7 Fermentația alcoolică. Un alt exemplu al unei reacții biocatalitice îl constituie fermentația glucozei la etanol în prezența drojdiei. Saccharomyces obținută prin recombinare genetică;

8. Biocataliza aplicată materialelor celulozice.

Fig.5.8 Biocataliza materialelor celulozice

Cercetările efectuate la scară de laborator au arătat faptul că acidul levulinic poate fi transformat în metil-tetrahidrofuran ± un diluant pentru combustibilii auto. De asemenea poate fi transformat în acidul ș-aminolevulinic

Fig.5.9. Transformarile acidului levulinic

(DALA) care este un erbicid cu spectru larg important deoarece este 100% biodegradabil. Recent s-a stabilit că DALA este util și ca insecticid și ca un component în terapia foto dinamică utilizată în tratarea cancerului. Astfel, din acidul levulinic se obține DALA (sub formă de sare) cu puritate mai mare de 90%. Acidul difenolic este un material cu aplicare pe scară largă în producția de polimeri. Se obține ușor prin reacția dintre acidul levulinic și doi moli de fenol. Acidul difenolic poate fi folosit ca înlocuitor de bisfenol A deoarece este mai puțin toxic decât acesta. Acidul succinic este recunoscut ca fiind materie primă într-un număr mare de procese bio-tehnologice pentru obținerea de substanțe cu masă moleculară mare cum ar fi 1, 4-butandiolul (BDO), tetrahidrofuranul, α-butirlactona și N-metil pirolidona. S-au făcut numeroase încercări pentru a aplica procesul de fermentație în scopul obținerii acidului succinic din resurse regenerabile, dar nici una dintre acestea încercări nu au putut fi aplicate la scară industrială. Pentru a obține acid succinic la nivel industrial se aplică un proces care decurge în prezența bacteriei Escherichia coli.

În acest proces glucoza este supusă unui proces de fermentație în urma căruia se obține intermediarul succinat de sodiu. Sarea este transformată în acidul succinic și o bază printr-un proces de electrodializă în scopul disocierii sub acțiunea apei urmat de reciclarea bazei și reintroducerea acesteia în etapa de fermentație. Producția de BDO pe baza bioderivaților acidului succinic s-a realizat cu costuri reduse în comparație cu metodele clasice de obținere a acestui compus.

În ultimii ani, industria a pus un accent mai mare de tehnologiile curate care în același timp să fie și profitabile. Impactul tehnologiilor verzi va fi resimțit ca urmare a îmbunătățirii treptate a unui număr din ce în ce mai mare de procese. Cataliza este o componentă cheie a proceselor de obținere a substanțelor chimice cu economie de atomi și cu cantități reduse de deșeuri. Materiile prime regenerabile vor juca un rol important în procesele tehnologice de viitor. Bioprocesarea reprezintă un prim exemplu al uniunii dintre cataliză și materii prime regenerabile și ar putea da un impuls pentru dezvoltarea unei game mult mai largi de procese nebiologice pentru transformarea biomasei.

5.15 Hrana animalelor

Studiul intensiv pentru utilizarea enzimelor în hrana pentru animale a debutat la începutul anilor 80. Primul succes comercial a fost adăugarea de beta-glucanază în dietele bazate pe orz furajer. Orzul conține beta-glucan, care cauzează vâscozitate mare în intestinal de pui. Efectul net al utilizării enzimei în hrana pentru animale a fost creșterea în greutate , cu aceeași cantitate de orz, ceea ce înseamnă că a crescut raportul de conversie al hranei. Finnfeeds International a fost pionier în enzimele din hrana animalelor. Enzimele au fost testate mai târziu, de asemenea, în dietele bazate pe grâu. Enzima xilanază s-a dovedit a fi cea mai eficientă în acest caz. Xilanazele sunt utilizate frecvent în zilele noastre în prepararea hranei pentru animale. Figura 5.10 prezinta structura tridimensionala a unei Trichoderma xilanaze

Fig.5.10 Structura tridimensionala Trichoderma xilanaza

De obicei, un preparat enzimatic este un cocktail multienzimatic ce conține glucanaze, xilanaze, proteinaze și amilaze. Enzimele reduc vâscozitatea, determinând creșterea absorbției de substante nutritive, eliberează nutrienti fie prin hidroliză de fibre non-degradabile sau eliberare de nutrienți blocati de aceste fibre, fie prin reducerea cantității de fecale. Un alt tip de enzimă important pentru hrană este fitaza comercializate de exemplu, prin DSM în Țările de Jos.

5.16 Utilizarea unor enzime în medicină

Existenta proceselor vitale fiind strans legata de activitatea enzimelor, Warburg, imaginand un test optic, a descoperit prin intermediul acestuia prezenta in serul sanguin a multor enzime care apartin de fapt echipamentului enzimatic de baza al tuturor celulelor.

Avandu-se in vedere faptul ca cele mai multe dintre enzimele descoperite prin metoda Warburg in plasma sanguina exista in toate celulele organismului de cercetat modificarea activitatii unei enzime plasmatice nu oglindeste totdeauna imbolnavirea unui anumit tesut, organ, respectiv sisteme de organe.

Pentru ca diagnosticarea enzimatica a bolilor interne sa capete un caracter sigur, stiintific, se recomanda examinarea paralela a activitatii mai multor enzime plasmatice. In acest scop este determinata activitatea enzimelor LDH, GOT si GTP. Leziunile hepatice influenteaza de asemenea activitatea unor enzime.

Alfachimotripsina, inclusă în categoria enzimelor proteolitice, având un caracter antiinflamator, este folosită în diferite afecțiuni si intervenții chirurgicale: tromboflebite, abcese, hemoragii oculare, ulcere varicoase și vărsate sanguine și limfatice.

Alfachimotripsina este folosită și pentru diagnosticarea citologica a cancerului gastric.

Tripsina cristalizată este o enzimă proteolitică care, aplicandu-se local, lichefiază și înlătură țesutul necrozat. Soluția de tripsină se aplică sub formă de comprese sterile.

Aprotinina numită și trasylol se prezinta sub formă de fiole a 10ml soluție izotonă injectabilă. Este o polipeptida din plămânul de bovine care, inhibând tripsina, chimotripsina și kalidinogenază are caracter antiproteazic.

Aprotinina este folosita in tratamentul unor boli ca pancreatita acuta si peritonita septica, in sangerarile fibrinolitice si in unele stari de soc.

Enzimele plasmatice sunt: enzime plasmatice funcționale, active asupra unor substraturi plasmatice (de exemplu, lipoprotein lipaza) și enzime plasmatice nefuncționale ce ajung în plasmă în cantitate foarte mică în condiții normale, activitatea lor crescând în cazul unor afecțiuni ale organelor ce le conțin. Dintre acestea cele mai importante sunt enzimele celulare. Modificarea permeabilitătii membranelor sau distrugerea celulelor sunt insotite de eliminarea enzimelor in spatiul extracelular. Enzimele citoplasmatice apar înaintea enzimelor mitocondriale. De exemplu, transaminazele, LDH, CK, aldolaza.

Pentru diagnosticarea unor afectiuni specifice unui anumit organ este ideala cunoasterea unor enzime specifice organului respectiv, numite enzime marker. Gasirea unor markeri exclusivi este extrem de dificila totusi se poate considera ca unele dintre enzimele a caror activitate se determina in laborator au aceasta calitate.

De exemplu, amilaza este marker pentru pancreas, fosfataza acida pentru prostata, OCT pentru ficat, izoenzimele LDH1 si CK-MB sunt markeri in afectiunile miocardului, izoenzimele LDH4 si LDH5 sunt markeri pentru ficat si muschi.

In laborator, enzimele se folosesc si ca "reactivi" pentru dozarea unor componente plasmatice prin metode enzimatice, cum ar fi glucoza, colesterolul, ureea, creatinina, etc

Tehnicile moderne de imunologie (EIA, ELISA) folosesc enzimele ca indicatori. Anticorpii specifici pentru un antigen sunt cuplati cu enzime indicatoare (peroxidaza din hrean, fosfataza alcalina). Acestea, dupa transformarea unui substrat specific, genereaza produsi colorati a caror concentratie este proportionala cu cea de antigen.

Se utilizeaza cu prudentă, deoarece datorita naturii proteice pot fi hidrolizate de enzimele digestive sau pot provoca reactii imunologice în cazul unei prelucrari si purificări ineficiente.

Enzimele în medicația vasculară.

Streptokinaza, amestec enzimatic obtinut din streptococ, are actiune fibrinolitică (trombolitică), fiind utilă pentru activarea hidrolizei trombilor formați in conditii patologice, de exemplu în infarct miocardic.

Urokinaza obtinuta din urina are acelasi rol.

Diferitele produse farmaceutice ce reprezinta activatorul tisular al plasminogenului (tPA) sunt folosite pentru dizolvarea cheagului de fibrina. Heparinaza microbiana imobilizata poate fi folosita pentru îndepărtarea heparinei folosite în tratament ca anticoagulant.

Hemocoagulaza (reptilaza) activeaza transformarea fibrinogenului în fibrină și este folosită pentru tratarea hemoragiilor nedeterminate de deficitul unor factori ai coagularii.

Enzimele în terapia antitumorală. Ex. asparaginaza este folosita de pacienții cu leucemie deoarece celulele tumorale au afinitate mare pentru asparagina și scăzând nivelul acesteia nu mai este posibila dezvoltarea lor. Fenilalanin amonioliaza este o alta enzima ce se poate utiliza imobilizata pentru a reduce cantitatea de fenilalanină la pacienții cu cancer sau fenilcetonurie.

Enzimele folosite in tulburarile digestive. Enzimele digestive se folosesc ca terapie de substitutie pentru a realiza digestia proteinelor (pepsina, chimotripsina, tripsina, carboxipeptidaza), glucidelor (amilaza) si lipidelor (lipaza). Se utilizeaza asocieri de mai multe enzime, dar si cu substante utile digestiei (bila, hemicelulaze). Exista si preparate ce contin enzime proteolitice de natura vegetala (ficina, bromelina, papaina).

Enzimele folosite ca antiinflamatoare si cicatrizante. Sunt diferite endopeptidaze si enzime ce actioneaza asupra proteoglicanilor care degradeaza tesuturile alterate de la suprafata unor leziuni facilitand penetrarea medicamentelor, vindecarea ranilor, reducerea edemelor (se asociaza in medicatia dermatologica, ORL, oftalmica): hialuronidaza, tripsina, chimotripsina, papaina, lizozim.

Imobilizarea enzimelor

Enzimele sunt biocatalizatori și pot fi reciclate. O enzimă este utilizată doar o singură data atunci când este adaugată la un substrat în produsele alimentare lichide sau solide. În schimb, în cazul în care moleculele unei enzime sunt atașate la o suprafață solida (imobilizată), enzima poate fi expusă în mod repetat la un anumit substrat. Putem defini enzimele imobilizate ca fiind enzime localizate într-o anumita regiune din spatiu, bine delimitata, care isi mentin activitatea catalitica si care se pot folosi in mod repetat sau continuu

Enzimele imobilizate sunt enzimele legate chimic de un suport diferit ca structura: gel de silice, alumina, carbune activ, rasini schimbatoare de ioni, polizaharide modificate (DEAE -sephadex, carboximetil celuloza). Suportul trebuie sa indeplineasca anumite caracteristici: sa permita atacul enzimei fara pierdere de activitate enzimatica, nu trebuie sa fie inactivat de sange, nu trebuie sa provoace hemoliza sau sa reactioneze cu plachetele sanguine, nu trebuie sa prezinte toxicitate sau sa genereze raspuns imun, sa elibereze produsi toxici (in cazul in care enzimele imobilizate pe acesta vin in contact cu organismul uman).

Avantaje ale utilizarii enzimelor imobilizate

Obtinerea enzimelor imobilizate reprezintă una din realizarile remarcabile ale biotehnologiei moderne, cu aplicatii multiple si deosebit de importante atât pentru cercetarea fundamentala cât si mai ales în domeniul industrial,

Prin imobilizare, enzimele dobândesc o serie de proprietati noi, avantajoase în comparatie cu cele ale enzimelor native, neimobilizate:

enzimele devin mai stabile în solutii apoase si mai putin sensibile la temperaturi crescute si la variatii de pH ale mediului de reactie.

ele dobândesc, de regula, o rezistenta sporita la actiunea inhibitoare a metalelor grele si a inhibitorilor lor naturali si de sinteza.

principalul avantaj al enzimelor imobilizate consta în posibilitatea utilizării lor repetate.

Se cunosc trei metode generale de imobilizare a enzimelor

legarea de suport

reticularea

incapsularea

Fig.6.1. Imobilizarea prin legare de suport si prin incapsulare

a, b: legare de suport; c, d incapsulare.

Fig.6.2. Imobilizarea prin reticulare

6.1 Imobilizarea enzimelor pe suporturi insolubile

6.1.1 Adsorbtia si legarea ionica

Este cea mai simpla metoda de imobilizare. Enzima se ataseaza de suport prin legaturi necovalente, fara nici o etapa de preactivare. Legatura sau legaturile formate în cazul adsorbtiei, implică în mod obisnuit interactiuni ionice, hidrofobe sau legaturi de hidrogen care se formează între suprafața proteinei enzimatice și suprafața de contact a materialului adsorbant.

Suportul adsorbant sau schimbator de ioni trebuie să prezinte o serie de proprietăți adecvate pentru încărcarea suprafeței de contact cu macromolecule proteice:

densitatea situsurilor de legare accesibile enzimei din punct de vedere steric;

distribuția sarcinilor electrostatice ;

polaritatea suprafeței (echilibrul hidrofob-hidrofil);

densitatea,

porozitatea,

distribuția porilor,

stabilitatea și distribuția macromoleculeor pe suport sunt importante și pentru că influențează configurația reactoarelor folosite pentru procesele enzimatice.

Suporturi utilizate pentru imobilizarea enzimelor prin adsorbtie sau legare ionica

Suportul ideal este:

– ieftin,

– inert din punct de vedere chimic,

– rezistent mecanic

Printre suporturile utilizate pentru adsorbția sau legarea ionică a enzimelor se numără: alumina, carbunele activ, kaolinul, bentonita, sticla poroasa, rasini sintetice, adsorbante, schimbatori de ioni naturali sau sintetici anioniți (DEAE- Sephadex) sau cationiți (CM-Celuloza).

Tehnica de imobilizare prin adsorbtie sau legare ionica

Procedeul implica un control strict al pH-ului si tariei ionice, acestia fiind parametrii care pot modifica incarcarea suportului cu enzimă si astfel pot afecta nivelul adsorbtiei.

O simpla modificare de pH poate anula interactiunile ionice ducand la eliberarea enzimei de pe suport.

Prin urmare, se alege un pH de lucru si o tarie ionica adecvate particularitatilor fizico-chimice si biochimice ale enzimei si ale suportului

Fazele de realizare a imobilizarii sunt:

amestecare soluție de enzimă in tampon de pH si molaritate adecvbate cu materialul adsorbant,

incubare

îndepărtarea prin spălare, a enzimei nelegate sau slab legate.

Principalele avantaje ale acestei metode de imobilizare sunt următoarele :

1. este un procedeu simplu din punct de vedere tehnologic, accesibil din punct de vedere al costurilor

2. permite regenerarea activitatii catalitice datorita eventualei inactivari a enzimei pe parcurs, prin adaugarea de enzima libera.

Principalul dezavantaj al acestei metode se datorează faptului că, legaturile create intre enzima si suport fiind slabe, exista riscul desprinderii permanente a unei cantitati de enzima din preparatul imobilizat.

Legarea covalenta

Aceasta metoda de imobilizare implica formarea unei legaturi covalente între enzima si matricea suportului. În mod normal, legatura este formata între o grupare funcțională aflată pe suprafata matricei și o grupă functională terminală sau apartinand catenei laterale a unui aminoacid din lanțul polipeptidic de la suprafata macromoleculei de enzimă.

Legătura covalentă fiind puternică, este puțin probabilă desprinderea enzimei de suport. În realizarea legaturii covalente enzimă-suport sunt implicate grupele amino (-NH2) ale lizinei sau argininei, grupele carboxil (-COOH ) ale acidului aspartic sau glutamic, grupele hidroxil (-OH) ale serinei sau treoninei, grupa fenol a tirozinei, grupa imidazol a histidinei și grupa tiol (-SH) a cisteinei. Utilitatea acestor grupe active ale enzimei pentru formarea legăturilor covalente depinde de accesibilitatea și reactivitatea lor, care influențează stabilitatea legăturii covalente odată formată . Reactivitatea proteinei conținând catene laterale nucleofile este determinată de gradul lor de protonare: -S->-SH->-O->-NH2>-COO->-OH>>-NH3+ și poate fi estimată prin cunoașterea pKa, a grupelor ionizabile și a pH-ului soluției.

Resturile de lizină sunt cele mai utile pentru legarea covalentă a enzimei de suporturi insolubile, datorită suprafeței mari și a reactivității lor crescute, în special în soluții slab bazice. De asemenea, se pare că acestea sunt foarte rar implicate în situsurile active ale enzimei.

Tipuri de suporturi utilizate pentru legarea covalenta a enzimelor

Organice sintetice

Polistiren

Acrilati

Nylon

Poliacrilamida

Organice naturale

Celuloza + derivati

Dextran + derivati

Agaroza + derivati

Amidon + derivati

Alginat

6.1.2.1 Imobilizarea prin legare covalenta de sefaroza

• Cea mai utilizată metodă de imobilizare a enzimelor prin legare covalentă implică folosirea sefarozei, activată cu bromcian

• Sefaroza este un polimer accesibil din punct de vedere comercial, puternic hidrofil și în general rezistent la atacul microorganismelor.

• Din punct de vedere chimic este un gel de agaroză (poli-{β-1, 3-D-galactoză-α-1, 4-(3, 6-anhidro)-L-galactoză}).

• Grupările hidroxil ale polizaharidului se combină cu bromcianul pentru a forma un imidocarbonat ciclic activat.

• Imidocarbonatul ciclic activat reacționează în condiții bazice (pH 9-11, 5) cu grupele amino primare ale enzimei (în principal din resturile de lizină;

• La activarea sefarozei cu bromcian trebuie evitate condițiile de formare a carbamatului inert.

Fig.6.3 Activarea prin legare de sefaroză

6.1.2.2 Alte tipuri de activari ale suporturilor polizaharidice

Toxicitatea mare a bromcianului a condus la comercializarea sefarozei activate și la cercetarea unor metode alternative pentru obținerea unor intermediari similari

Un astfel de exemplu consta in folosirea cloroformiaților pentru obținerea unor intermediari similari celor obținuți cu bromcian, dar lipsiți de toxicitate

Fig.6.4 Folosirea cloroformiaților

Activarea cu carbodiimide a suporturilor carboxilice

Carbodiimidele sunt reactivi bifuncționali foarte utili, ce permit legarea aminelor de acizi carboxilici. Controlul atent al condițiilor de reacție și alegerea carbodiimidei conferă un grad înalt de selectivitate acestei reacții.

Condițiile de reacție trebuie alese astfel încât să se evite formarea compușilor nedoriți (ureea).

Fig.6.5 Activarea cu carboimide.

Imobilizarea prin legare covalenta de suporturi anorganice activate

Folosirea trialcoxisilanilor permite chiar și materialelor inerte, ca sticla, să lege covalent enzime.

Fig.6.6. Imobilizarea enzimelor pe sticla activata

Protejarea enzimei in timpul imobilizarii prin legare covalenta de suport

Obiectivul cel mai important al acestor tehnici de imobilizare este ca enzimele imobilizate să-și mențină o cât mai mare parte din activitate catalitică și după terminarea reacției de cuplare cu suportul.

Acest obiectiv poate fi realizat în cazul în care cantitatea de enzimă legată în conformații inactive este cât mai mică.

Această condiție se poate realiza prin imobilizarea enzimelor în condiții de saturare cu substrat, produs sau inhibitor competitiv, în care caz situsul activ nu este implicat în legarea covalentă de suport.

Activitatea enzimelor imobilizate poate fi apoi ușor restabilită prin spălare, pentru îndepărtarea acestor molecule.

Obținerea formelor inactive poate fi prevenită și prin folosirea unor cantități mari de molecule legate reversibil la situsul activ sau în imediata vecinătate a acestuia.

Protejarea situsului activ se poate realiza și prin legarea unor molecule care rămân atașate de acesta în timpul procesului de imobilizare sau prin folosirea unei metode de cuplare ușor reversibilă, prin care este favorizată legarea celor mai stabile forme din punct de vedere energetic ale enzimei.

Situațiile (c) și (d) din figura 6.7 pot fi împiedicate folosind grupări ce distanțează enzima de suport (“spacer”), protejând-o astfel de influențele sterice ale suprafeței suportului.

6.1.2.1.6. Imobilizarea enzimelor prin legare covalentă de glutaraldehida

Glutaraldehida este utilizată pentru legarea enzimelor prin reticulare sau pentru legarea acestora de suporturi.

De obicei glutaraldehida se folosește sub forma unui amestec echilibrat de monomeri și oligomeri.

Disocierea produsului de condensare dintre enzimă și glutaraldehidă poate fi împiedicată prin reducere cu borohidrură de sodiu.

Această metodă este utilizată în special pentru obținerea membranelor cu enzime imobilizate folosite la fabricarea biosenzorilor și implică legarea unor molecule de enzime reticulate în prealabil cu moleculele unor proteine inactive diluante, de anumite tipuri de memebrane celulozice sau din nylon.

Fig.6.8. Chimismul procesului de imobilizare a enzimelor prin reticulare cu glutaraldehida

Imobilizarea prin reticulare

Metoda reticularii se bazeaza pe formarea de legaturi chimice, dar fara a se folosi suporturi insolubile in apa.

Imobilizarea enzimelor se realizeaza prin formarea de legaturi incrucisate intermoleculare intre moleculele de enzima prin intermediul unor reactivi bi sau multifunctionali (agenți de reticulare).

Ca agenti de reticulare literatura citeaza:

glutaraldehida, prin intermediul careia se realizeaza compusi de tipul bazelor Schiff;

derivatii de izocianat, prin intermediul cărora se realizeaza legaturi peptidice;

bisdiazobenzidina, prin care se realizeaza cuplari diazo;

N, N’ – polimetilen bisiodoacetamida, care favorizeaza formarea de compusi alchilati.

Reticularea cu agenti bifunctionali se realizeaza prin implicarea urmatoarelor grupe ale proteinei enzimatice:

– amino si amino terminala,

– amino (din lizina),

hidroxil (din tirozina).

Reactia de reticulare are loc in conditii relativ severe, asemanatoare cu cele necesare formarii legaturi covalente, putand afecta conformatia centrului activ al enzimei si nivelului activitatii enzimatice. Cel mai utilizat agent de reticulare este glutaraldehida.

6.3 Imobilizarea prin încapsulare

Imobilizarea prin incapsulare de tip rețea sau microcapsule difera de celelalte metode de imobilizare prin faptul ca moleculele de enzima sunt libere in solutie, dar miscarea acestora este limitată într-un spațiu bine definit, reprezentat de ochiurile unei rețele sau de picătura de apă din interiorul unei microcapsule care este separată de mediul exterior printr-o membrană semipermeabilă.

Incapsularea tip rețea

Incapsularea enzimelor în geluri formate din polimeri reticulați transversal se practică în cadrul proceselor ce implică folosirea de substraturi sau produși cu mase moleculare mici. Se poate imobiliza prin această metodă 1 g enzimă/g gel.

Datorită dificultății cu care moleculele mari pot ajunge la situsul catalitic al enzimei imobilizate, se recomandă ca incapsularea să se aplice numai în cazul enzimelor ce au substraturi cu mase moleculare mici. Acest tip de incapsulare este utilizat și în cazul imobilizării celulelor microbiene, animale și vegetale.

Incapsularea tip rețea se poate realiza prin amestecarea enzimei cu un polimer pentru a forma o structura tip retea care “prinde” enzima in interior.O alta modalitate este aceea de a amesteca enzima cu monomeri care polimerizeaza in situ pentru a forma un polimer reticulat care cuprinde enzima in spatiile interstitiale ale retelei .Între polimerii naturali utilizati, cele mai bune rezultate s-au obtinut in ultimii ani cu K-carrageenan și cu alginatul de calciu, polizaharide extrase din algele rosii. Polimerii sintetici utilizati in mod curent pentru incapsularea enzimelor sunt poliacrilamida, polivinilalcoolul, acidul poliacrilic, polietilenglicol dimetacrilatul. Intre acestia insa, gelul de poliacrilamida are cele mai multe aplicatii.

6.3.1.1 Incapsularea în gel de poliacrilamida

Incapsularea în gel de poliacrilamidă se realizeaza prin copolimerizarea monomerului aflat în soluție apoasă cu N, N’–metilenbisacrilamida ca agent de reticulare, în prezenta enzimei.

Reactia de polimerizare este initiata de persulfatul de potasiu (K2S2O8) si accelerata de N, N, N’ – tetrametilendiamina (TEMED) sau de – dimetilaminopropionitril (DMAPN).

Dimensiunile porilor gelului si proprietatile sale mecanice sunt determinate de cantitatile relative ale monomerului si agentului de reticulare. Astfel este posibila influențarea structurii retelei prin modificarea acestor concentratii

Microîncapsularea

Înglobarea enzimelor în microcapsule delimitate de membrane se poate realiza printr-o serie de tehnici care depind de natura polimerului care formează membrana. Membrana polimerică trebuie să fie semipermeabilă, în sensul că trebuie să mențină enzima închisă în interior, dar să permită în același timp trecerea substratului și a produsului de reacție.

Exemple de imobilizari prin microincapsulare

Un exemplu practic de imobilizare prin microîncapsulare este următorul:

Enzima se dizolvă într-o soluție apoasă de 1, 6-diaminohexan. Această soluție este apoi dispersată într-o soluție cloroformică de acid hexandioic, nemiscibilă cu apa. Pe parcursul emusionării, la interfața celor două faze, se produce copolimerizarea 1, 6-diaminohexanului cu acidul hexandioic, cu formarea unui strat polimeric subțire (nylon-6, 6) care înglobează picăturile apoase ce conțin enzima. Lipozomii sunt exemple de microcapsule constând în sfere concentrice alcatuite din membrane lipidice ce pot înconjura enzima. Aceștia se pot obține prin adăugarea de fosfolipide în soluția apoasă de enzimă.

Microcapsulele și lipozomii sunt separate prin filtrare din mediul în care au fost obținute, apoi sunt spălate pentru îndepărtarea enzimelor neînglobate și sunt păstrate în mediu apos, până la utilizare

În general, preparatele enzimatice obtinute prin microîncapsulare au activitate mare deoarece enzima nu este denaturată, nefiind legată de support, iar membrana microcapsulei este semipermeabilă atât pentru substrat, cât și pentru produsul de reacție, dacă acestea au molecule de dimensiuni mici.

Tabelul 6.1 Caracterizarea comparativă a diferitelor metode de imobilizare a enzimelor

1. Enzimele imobilizate se folosesc ca reactivi în analizoarele de chimie uscată. Ele sunt imobilizate într-un suport de dimensiuni reduse cu tamponul adecvat, cofactorii, cosubstratul și indicatorul de culoare. Plasma furnizează substratul și apa necesara activării sistemului. Enzimele sunt stabile prin legarea de o matrice și pastrarea într-un loc uscat.

2. Enzimele imobilizate pe o matrice insolubilă se folosesc și în reactoarele chimice din industria farmaceutică, ca reactivi specifici

Concluzii

Enzimele sunt, precum s-a mai spus, catalizatori organici produși de celula vie acționând asupra anumitor substanțe numite substraturi. În marea lor majoritate, enzimele catalizează reacția unei substanțe organice cu un compus anorganic liber sau cedat de alt compus organic (apă, acid fosforic, hidrogen, oxigen, etc.). Legile catalizei se aplică firește și la enzime. Enzimele, ca toți catalizatorii, nu catalizează decât reacții termodinamic posibile, decurgând în sensul stabilirii unui echilibru..

Folosirea enzimelor ca biocatalizatori în sinteza chimică, a constituit un succes al ultimelor decenii.

Avantajele sintezei chimice în cataliză enzimatică sunt:

gradul ridicat de conversie al substratului,

randamentele mari

În unele cercetări de fiziologie vegetală normală și patologică, în studierea efectelor pesticidelor și a stimulatorilor de creștere asupra diferitelor plante, precum și în determinarea rezistenței la ger și secetă a plantelor de cultură se foloseste activitatea unor enzime. Pentru a ne da seama dacă anumite produse vegetale sunt păstrate în condiții corespunzătoare, trebuie cercetată desfășurarea reacțiilor enzimatice proprii metabolismului. Cunoscându-se faptul că germinarea determină în semințele cerealelor creșterea activității α-amilazei și a proteinazelor, prin determinarea activității acestor enzime poate fi testată hidroliza amidonului și a proteinelor de rezervă.

Enzimele sunt folosite ca reactivi și în industria chimică organică. Cercetarea structurii primare a proteinelor poate fi realizată numai prin hidroliza enzimatică cu ajutorul unor proteinaze. Enzimele sunt folosite și în industria textilă, înaintea înălbirii fibrelor textile, amidonul de pe suprafața acestora era înlăturat în trecut prin intermediul maltajului. Parafinele și alcoolii inferiori sunt metabolizați de numeroase microorganisme aerobe (bacterii, alge). Datorită creșterii la scară mondială a consumului de săpun în raport cu cantitatea de grăsimi relativ staționară, au fost sintetizate noi produse numite detergenți. Astfel de compuși manifestă însușiri tensioactive ca și săpunurile. Detergenții, micșorând tensiunea superficială la interfață, au proprietatea de a emulsiona grăsimile și de a spăla. Am amintit despre detergenți deoarece la fabricarea lor se folosesc proteaze rezistente în mediu bazic.

Existența proceselor vitale fiind strâns legată de activitatea enzimelor, Warburg, imaginând un test optic, a descoperit prin intermediul acestuia prezența în serul sangvin a multor enzime care aparțin de fapt echipamentului enzimatic de bază al tuturor celulelor. Enzimele serice catalizează prea puține reacții metabolice, datorită concentrațiilor foarte mici ale cofactorilor și substraturilor corespunzătoari. Din grupul enzimelor utilizate în medicină menționăm tripsina cristalizată, hialuronidaza și celzulazele.

Acrirea laptelui, fermentația alcoolică a glucozei din mustul de struguri și din sucurile altor fructe, oțețirea vinului, dospirea aluatului pentru pregătirea pâinii, topitul plantelor textile reprezintă cele dintâi reacții chimice catalizate de enzime, pe care producătorii de bunuri le foloseau.

Realizarea în industria alimentară a unor procese fermentative cu ajutorul enzimelor este mult mai ușoară decât cea în care sunt folosite microorganisme ca atare, deoarece enzimele se caracterizează prin următoarele însușiri:

Prezintă specificitate mare;

Sunt netoxice;

Sunt active în concentrații mici și acționează cu viteză mare în condiții obișnuite de presiune, temperatură, pH;

Pot fi conservate în condiții bune;

Activitatea lor poate fi ușor standardizată.

Utilizarea enzimelor depinde exclusiv de modul în care se află în mediul de cultură. Astfel, când enzimele sunt extracelulare, pot fi izolate cu ușurință prin centrifugarea și filtrarea acestuia. Când însă enzimele sunt intracelulare trebuie anihilate mai întâi membranele celulelor. În acest scop pot fi folosite unele metode fizice precum și metode chimice.

Enzimele polizaharolitice sunt folosite în :

Panificație;

Industria etanolului pentru intensificarea zaharificării plămezii de cereale înaintea fermentației alcoolice;

Industria berii și a sucurilor de fructe pentru înlăturarea amidonului și limpezirea lichidelor respective.

Enzimele proteolitice provenite din bacterii sau din fungi servesc în:

Panificație;

Industria produselor lactate pentru stabilizarea laptelui concentrat;

La prepararea unor medii microbiologice care să “digere” diverse surse proteice.

Ingineria enzimatica exploreaza orizonturi noi în diverse direcții și, ca urmare, a obtinut realizări remarcabile în domeniile menționate deja: farmaceutică, alimentație, chimie. Utilizarea enzimelor este încurajătoare în activitatea de reducere a rezidurilor și poluantilor chimici din mediu (apa) și din produsele alimentare. Un rol major îl vor avea însă enzimele în energetică: prin tratarea biomasei cu celulaze, amilaze, amiloglucozidaze se realizeaza hidroliza celulozei, polizaharidelor, amidonului si dextrinei în glucoza->alcool etilic->energie, dupa cum prin asocierea fotosistemelor vegetale cu hidrogenaza bacteriana se poate obtine hidrogen->energie.

Bibliografie

Bibliografie