Elena-Daniela Fărcaș [308988]

[anonimizat]-Daniela Fărcaș

PROIECT DE DIPLOMĂ

Cooronator:

Conf. Dr. [anonimizat]

2020

[anonimizat]-DANIELA FĂRCAȘ

PROIECT DE DIPLOMĂ

ȊMBUNĂTĂȚIREA METODELOR DE IZOLARE ȘI STUDIUL SPORULĂRII LA PAENIBACILLUS LARVAE

Coordonator:

Conf. Dr. [anonimizat]

2020

ȊMBUNĂTĂȚIREA METODELOR DE IZOLARE ȘI STUDIUL SPORULĂRII LA PAENIBACILLUS LARVAE

Autorul: Elena-Daniela FĂRCAȘ

Îndrumător științific: Conf. Dr. [anonimizat]. Mănăștur, Nr. 3-5, 400372, Cluj-Napoca, România

E-mail: [anonimizat]

REZUMAT

Loca americană este una din cele mai păgubitoare boli ale puietului de albine. [anonimizat]-am propus să contribui la ȋmbunătățirea metodele actuale de cultivare și izolare a [anonimizat].

Ca medii lichide s-[anonimizat] (BHI) [anonimizat]: [anonimizat], agarul BHI și mediul MYPGP. S-a [anonimizat] (BHI) [anonimizat] 1/3 – ¼ reprezintă formula ideală pe care P. larvae se dezvoltă după 24 [anonimizat] 48 de ore. Pe mediile solide dezvoltarea coloniilor de P. [anonimizat] 72 ore de incubație.

[anonimizat], ne-a determinat să găsim o variantă optimă de sporulare a tulpinilor de P.larvae în condiții de laborator. Ȋn acest scop s-au utilizat mediile lichide și solide menționate mai sus.

[anonimizat] a 5-a și atinge procentajul maxim după aproximativ 2-3 săptămâni. Mediul MYPGP solid s-a dovedit a fi mediul ideal pentru sporulare.

Inducerea sporulării in vitro la tulpinile bacteriilor sporulate din genurile Bacillus și Paenibacillus reprezintă o metodă ideală de conservare a tulpinilor bacteriene pe o [anonimizat].

Cuvinte cheie: [anonimizat], cultivare, izolare, sporulare in vitro.

IMPROVING INSULATION METHODS AND STUDYING SPORULATION IN PAENIBACILLUS LARVAE

Author: Elena-Daniela FĂRCAȘ

Scientific supervisor: Assoc. Prof. Dr. [anonimizat]. Mănăștur, Nr. 3-5, 400372, Cluj-Napoca, Romania

E-mail: [anonimizat]

ABSTRACT

The American loca is one of the most damaging diseases of the bee brood. [anonimizat], I [anonimizat].

Cord-brain infusion broth (BHI) [anonimizat]quid media, both supplemented with horse serum and as solid media: milk agar, blood agar, BHI agar and MYPGP medium. It was found that the brain heart infusion broth (BHI) or Mueller-Hinton broth supplemented with horse serum in the proportion of 1/3 – ¼ is the ideal formula in which P. larvae develops after 24 hours of incubation, which allows the diagnosis to be accelerated with 48 hours. On solid media, the development of P. larvae colonies takes place slowly, after 72 hours of incubation.

The fact that this sporulated bacterial species lives relatively little in the culture media in vegetative form, determined us to find an optimal method of sporulation of P.larvae strains in laboratory conditions. The liquid and solid media mentioned above were used for this purpose.

Based on the information provided by the literature, it was possible to desing and opthimise special incubation conditions in anaerobiosis, (where) in vitro-induced sporulation starts from day 5 and reaches its maximum percentage after about 2-3 weeks. The solid MYPGP medium has proven to be the ideal medium for sporulation.

Induction of in vitro sporulation in strains of sporulated bacteria of the genera Bacillus and Paenibacillus is an ideal method of preserving bacterial strains for a long time in laboratory conditions, much easier than lyophilization and more accessible to laboratories with limited equipment.

Keywords: American loca, Paenibacilus larvae, cultivation, isolation, sporulation in vitro.

CUPRINS

Capitolul 1

STUDIU BIBLIOGRAFIC

1.1. Introducere

Paenibacillus larvae este un bacil Gram pozitiv, sporulat ce reprezintă agentul etiologic al unei boli deosebit de păgubitoare pentru familiile de albine. Sporii sunt sursa de infecție pentru larvele tinere de 24-48 de ore, care sunt cele mai sensibile și ȋn care, ȋn faza finală a bolii formele vegetative rezultate după germinare și multiplicare sporulează din nou dând naștere la un număr foarte mare de spori (ȋntre 1-2 miliarde/larva infectată).

Puietul se contaminează ȋn timpul hrănirii larvelor cu miere infectată cu spori, care germinează ȋn intestinul mediu dând naștere la forma vegetativă. Aceasta este foarte mobilă și este capabilă de-a traversa peretele intestinal pătrunzând în cavitatea abdominală unde se multiplică apoi diseminează în toate țesuturile larvei, producând o bacteriemie (septicemie) ce conduce la moartea acesteia.

Răspândirea sporilor între colonii se face în diferite feluri, în principal prin apicultorul însăși, activitățile din stupină produsele apicole contaminate, utilajul apicol și prin furtișag. Transferul ramelor cu puiet sau a celor cu miere deja contaminate și utilizarea stupilor sau echipamentelor contaminate sunt factori foarte importanți în răspândirea bolii.

Diagnosticul de locă americană se bazează pe o inspecție vizuală periodică a familiilor de albine din stupină. Această procedură are anumite limite deoarece ea se bazează pe observarea simptomele clinice ale bolii care nu sunt întotdeauna ușor de recunoscut. Confirmarea diagnosticului clinic de locă americană se face prin examene de laborator: cultural, caracterizarea morfologică, biochimică și fiziologică a tulpinilor bacteriene izolate.

Loca americană reprezintă pentru toate țările lumii ȋn care se practică apicultura una dintre cele mai periculoase boli, care decimează populațiile de albine.

În principiu loca americană se poate trata cu antibiotice, ȋnsă folosirea acestora are o multitudine de inconveniente. Antibioticele nu sunt acceptate ȋn Uniunea Europeană, iar prin tratament acestea trec ȋn miere, polen, ceară, pastură și produsele devin impropii exportului. Sporiii sunt rezistenți la acțiunea antibioticelor, în timp ce formele vegetative sunt, în funcție de tulpina bacteriană, sensibile la: sulfatiazol, streptomicină, oxitetraciclină, penicilină și tilozină.

1.2. Genul Paenibacillus

Acest gen cuprinde 164 specii (Ash et al. 1994), dintre care pentru zootehnie și medicina veterinară cea mai importantă specie este Paenibacillus larvae.

Paenibacillus larvae se prezintă sub formă de bacili fini, drepți sau ușor încurbați, cu capetele rotunjite, aero-anaerobi, cu dimensiunile de 1,5-6/0,5 μm, de regulă izolați sau grupați sub formă de lanțuri lungi mai ales în mediile lichide, mobili datorită unor cili lungi situați peritrich, Gram pozitivi sau Gram labili, sporulați (White, 1906, Badea Mihaela, 2013; Răpuntean Gh. și col., 2005; Mărghitaș L. Al., 2008).

Produce la albine o boală infecțioasă gravă, declarabilă, foarte contagioasă, forma sporulată conferă acestei bacterii o rezistență deosebită în mediul extern precum și în cadavrele puietului și celelalte obiecte și produse ale stupului. Boala apare de obicei către sfârșitul primăverii, după culesul de salcâm sau pe tot parcursul verii și atacă puietul albinelor lucrătoare, mai rar larvele de trântor, moartea acestuia producându-se după căpăcire.

În etiologia locii americane sunt implicate tulpinile speciei Paenibacillus larvae cu cele două subspecii Paenibacillus larvae subsp. larvae (Ash și col., 1993) și Paenibacillus larvae subsp. pulvifaciens (Heyndrickx și col., 1996).

Acestea se diferențiază între ele pe baza criteriilor prezentate în tabelul 1. (Shimanuki H. și Knox A. D., 2000).

Tabelul 1. Diferențierea bacteriilor formatoare de spori din miere

1.3. Medii de cultură și condiții de incubație

Paenibacillus larvae este o specie aero-anaerobă, pretențioasă care nu se dezvoltă decât pe medii obișnuite suplimentate cu lapte, gălbenuș de ou, sânge de cal sau de berbec sau pe medii speciale (temperatura optimă de creștere 37ș C), după o perioadă de 3-5 zile de incubație (Stamatin N., 1957; Chirilă și Fiț, 2018).

Se dezvoltă cu ușurință în bulion cord-creier (BHI) suplimentat cu tiamină HCl 0,1 mg/litru și de asemenea în agar în care bulionul este înlocuit cu un extract de larve de albine.

Dintre mediile speciale folosite pentru izolarea lui Paenibacillus larvae putem menționa mediul PLA (Paenibacillus larvae agar) și mediul MYPGP: care se compune din 10 g de bulion Mueller-Hinton, 15g extract de drojdie, 3g de fosfat de potasiu (K2PO4), 2g de glucoză, 1g de piruvat de sodiu (C3H3NO3) și 20 g de agar.

1.4. Caractere culturale

1.4.1. Medii lichide

În bulion cord-creier (BHI) suplimentat cu tiamină cultura se aseamănă cu cea de Bacillus anthracis în bulion, respectiv supernatant limpede și depozit floconos abundent.

1.4.2. Medii solide

Agar cu gălbenuș de ou: colonii de culoare gri, mai mult sau mai puțin lucioase, rotunde cu conturul ușor neregulat, putând conflua și cu consistență vîscoasă.

Pe agar cu lapte + tiamină: colonii mici, regulate, în general ruguoase, înconjurate de o zonă de cazeinoliză.

Pe geloza cu sânge Colombia: coloniile sunt mici (< 1 mm diametru), regulate, strălucitoare, gri sau gălbui (Heyndrickx et coll. 1996).

Pe geloza PLA: coloniile de P. larvae sunt mici, de culoare verde pal sau galbene (aceiași culoare ca a mediului), cu o suprafață rugoasă ușor opacă; centrul coloniei este uneori ridicat.

Geloza BHI suplimentată cu tiamină (BHIT) coloniile sunt de mărime variabilă, regulate, în general rugoase, plate sau înalte, semi-transparente.

Pe mediul MYPGP: coloniile de Paenibacillus larvae sunt mici, regulate, în general rugoase, plate sau înalte, albicioase sau bej.

1.5. Proprietățile biochimice

– acidifiază glucoza și levuloza;

– testul catalazei este aproape întotdeauna negativ sau ușor pozitiv (dar cu întârziere);

– esculinaza și triptofanaza pozitive;

– hidroliza cazeinei pozitivă;

– tulpinile de P. larvae nu hidrolizează amidonul;

– P. larvae nu utilizează citratul;

– este indol negativ, și produce cantități mici de H2S.

1.6. Răspândire geografică

Loca americană este o boală cosmopolită, răspândită pe scară largă, în Europa de Vest și de Est, fosta Uniune Sovietică, America de Nord și Centrală și o parte din America de Sud, Africa și Asia.

Acesta a fost, semnalată de asemenea, într-un număr de țări și teritorii din jurul oceanului Pacific, inclusiv Noua Zeelandă. (www.spc.int/lrd/ext/Disease_Manual_Final/b452.; Bertrand F., 2003).

Este boala cea mai devastatoare din sectorul apicol care poate afecta puietul albinelor melifere și datorită acestui fapt poate antrena pierderi economice substanțiale atât la apicultori cât și sectorului agricol și horticol care depind de polenizare.

1.7. Rezistența la factorii de mediu

Formele vegetative prezintă o rezistență scăzută în mediul extern fiind în general sensibile la căldură. În schimb formele sporulate prezintă o rezistență ridicată la acest factor fizic și anume: 8 ore la 100șC pentru sporii conținuți în larvele bolnave, 30 de minute la 100șC pentru sporii suspensionați în apă, 30 de minute la 121șC pentru sporii conținuți în ceară, 160 de minute la 100șC pentru sporii prezenți în miere, 41 de minute la 110șC pentru sporii prezenți în miere și 8,6 minute la 121șC pentru sporii prezenți în miere (J.P. Euzeby, 1999).

De asemenea formele vegetative de Paenibacillus larvae mor după 10 minute în apă încălzită la 60°C, iar sub acțiunea unor dezinfectanți ca: soda caustică 5% și formolul 10% sunt distruse după un interval de contact de 5 minute.

Sporii de Paenibacillus larvae rezistă la acțiunea fenolului 5% timp de luni de zile, a alcoolului etilic 96° timp de 40 de zile, a cloraminei 10% și a sublimatului coroziv 0,5-1% timp de câteva zile. Sporii sunt foarte rezistenți, au o formă ovoidă, sunt strălucitori, și se colorează greu chiar și prin tehnicile speciale doar învelișurile periferice, pot supraviețui până la 35-40 ani în condiții normale, chiar dacă vitalitatea lor tinde să scadă în timp (Haseman L., 1961).

Sporii bacterieni sunt găsiți în concentrații mari în sol, până la 105 – 106 spori/g sol pentru Bacillus cereus și Clostridium spp. (Lund BM, 1986). Formele vegetative ale bacteriilor sporulate se pot dezvolta într-o gamă largă de factori de mediu (aciditate, temperatură, concentrații mari de săruri sau zaharuri, disponibilitate ȋn oxigen) și sunt capabile de a forma biofilm iar sporiii care sunt rezistenți la tratamente fizice sau chimice precum și la acțiunile de curățare și dezinfecție aplicate în industria agro-alimentară.

Forma vegetativă a bacteriei Paenibacillus larvae subsp. larvae este sensibilă la sulfamide și la numeroase antibiotice: sulfatiazol, streptomicină, penicilină, teramicină, oxitetraciclină, tilozină, eritromicină și lincomycin (Kokansky J. și col. 2001; Cougoule N. și col.,2008, Reynaldi F. și col., 2008).

Tot mai numeroși cercetători semnalează prezența unei sensibilități a formelor vegetative de Paenibacillus larvae față de unele uleiuri esențiale extrase din plante (Albo Graciela și col., 2003; Gende Liesel Brenda și col.,2008).

1.8. Generalități asupra bacteriilor din genul Bacillus:

Bacteriile din genul Bacillus se prezintă ȋn frotiuri sub formă de bacilli mari Gram pozitivi, grupate sub formă de lanțuri de lungimi variate, sporulate, și în general mobile datorită prezenței unor cili dispuși peritrich. Reprezentantii acestui gen sunt aerobi, sau uneori facultativ și catalază pozitivi (Klein et al.,1998). Tulpinile de Paenibacillus larvae se pot dezvolta atât ȋn mediu aerob cât și ȋn atmosferă ȋmbogățită cu CO2.

1.9. Sporularea bacililor

Sporularea este un fenomen natural în ciclul de creștere a unor grupe de bacterii cum ar fi anumite specii din genul Bacillus (Ponce et al.,2008). Acest proces reprezintă un mecanism de supraviețuire, care se produce , în general atunci când microorganismele se află ȋntr-o situație de stress (Barill et al.,2012).

Acest proces complex este compus din mai multe etape care sunt foarte asemănătoare între ele la bacteriile sporulate aerobe, facultative anaerobe și anaerobe (Gibbons și Murrey, 1978). Înțelegerea acestui proces este importantă ȋn industria alimentară pentru asigurarea unor produse sterile (Augustin, 2003; Postollec et al.,2010), ȋn activitatea biotehnologică de producere a culturilor vaccinale pentru sporovaccinuri și pentru transformarea formelor vegetative ȋn forme sporulate ȋn vederea conservării ȋndelungate ȋn condiții de laborator a speciilor de interes științific.

Procesul de sporulare la bacteriile mezofile poate fi declanșat de o serie de factori precum: nevoile nutritive, o mare densitatea celulelor sau leziunile ADN-ului apărute ȋn cursul replicării (Nicholson et al., 2000; Gosh, 2009). Prima etapă a sporulării poate fi inversată dacă cultura bacteriană este transferată într-un mediu bogat în substanțe nutritive. Pentru bacterii termofile, prezența sărurilor minerale (magneziu, calciu și potasiu) poate juca un rol important (Nicholson et al.,2000).

Aceste minerale sunt importante pentru dezvoltarea unui spor matur și pot fi implicate în activarea procesului de formarea a sporilor. Pentru Paenibacillus larvae un rol important ȋn stimularea acestui proces ȋl are piruvatul de sodiu. Datorită faptului că aceste săruri minerale sunt de asemenea prezente în lapte, ele pot stimula formarea sporilor ȋn cazul bacteriilor termofile în cursul procesului de fabricație al produseor lactate (Burgess et al., 2010).

1.10. Structura sporului

Ȋn cea ce privește componentele de bază ale sporului acestea sunt asemănătoare între speciile genului Bacillus, diferențe minore se observă doar la speciile și tulpinile capsulate care au în plus un strat suplimentar numit exosporium (fig. 1).

Figura 1: Observarea și descrierea structurii sporilor de Bacillus (A)

Reprezentarea schematică a sporului. Multiplele straturi ale sporilor servesc pentru a proteja genomul lor (roșu) într-un spațiu central deshidratat, inima (verde). Membrana internă (negru) poate fi vizibilă pe secțiuni ale sporilor dar membrana externă (negru) este mai rară. Inima sporului este protejată de cortex (portocaliu) și tunicile care se separă în două straturi tunica internă (albastru) și tunica externă (roz). În funcție de specii exosporiumul sau scoarța (gri) învelește tunicile. Observarea la microscopul electronic cu transmisie (MET) a secțiunilor de spori de B. subtilis marcate cu roșu de rutheniu pentru a vizualiza cortexul (B) și B. anthracis marcat cu tetraoxid de osmiu (C). Exosporiumul constituit dintr-o structură de bază și prelungirile aeriene este separate de tunici printr-un spațiu (C). (B) După McKenney et al (2010), scara: 0,125 nm et (C) după McKenney et al (2013), scara ne precizată.

Structura sporului este în general, mai densă decât în celula vegetativă, constituenții celulari fiind prezenți într-o formă mai concentrată. La sporul matur de Paenibacillus larvae ea a putut fi descifrată cu certitudine prin examen electronomicroscopic (fig. 2).

Fig. 2. Electron micrograph of a mature endospore of Paenibacillus larvae. MW:mother cell wall; MC: mother cell cytoplasm; OC: outer spore coat; IC: inner coat;CT: cortex; GW: germ cell wall; IM: inner membrane; GC: germ cell cytoplasm (după Zenaida M. De Guzman et al. 2011)

Plecând de la interior spre exterior, ȋn structura sporului se disting următoarele componente:

1. Inima sporului de asemenea numită nucleu sau core sau protoplast este compus din:

– nucleoplasmă este o zonă, situată adesea central, citoplasma unde sporul de procariote plutește, cu alte cuvinte, este lichidul în care se găsesc elementele nucleare. Acesta conține printre altele ADN, proteine de duplicare, de transcripție și de reglare a genelor;

– sporoplasma corespunde la citoplasma formei vegetative, dar aceasta este mai densă, conține în plus un cromozom și multe granule de aproximativ 10 nm, probabil ribosomii.

2. Membrana internă corespunde viitoarei membrane a celulei vegetativă rezultate după germinarea sporului. Compozitia sa ȋn lipide apare foarte asemănătoare cu cea a celulei vegetative (Griffiths K. și Setlow P., 2009) conținând totuși, o proporție mai mare de cardiolipide ȋn cazul sporilor.

3. Cortex este constituit dintr- o formă de peptidoglycan (heteropolimer derivat din două glucide, N-acetil-glucozamina (NAG), și acidul N-acetil-muramique (NAM) și din diferiți aminoacizi) care este similar, dar nu identic cu peptidoglicanul din pereții celulelor vegetative. Acesta se distinge prin prezența reziduurilor δ-lactam muramice (MAL). Acestă particularitate este la originea unui număr mai mic de lanțuri laterale peptidice și astfel la o reducere a reticulației la ramurile glycanice (Popham, D. L., 2002).

4. Membrana externă, amplasată între cortex și mantauă, este puțin cunoscută și puțin descrisă în literatura de specialitate. Este vorba de o membrană funcțională în timpul dezvoltării presporului dar care nu mai poate fi evidențiată ȋn faza de spor dormant (Setlow, P., și Johnson E.A., 2007). Astfel, această membrană nu mai pare să fie integrată în spori și nu ar putea fi o barieră importantă de permeabilitate (Setlow P., 2006).

5. Mantaua este compusă din aproximativ 30 la 80 de proteine specifice diferite și este organizată în două părți: ȋnvelișul intern și ȋnvelișul extern (Setlow, P., et Johnson E.A., 2007; Leggett, M. J. et coll., 2012). În faza de spori dormanți (latență), mantaua reprezintă o parte importantă din volumul sporului. Mantaua conține de asemenea carbohidrați (6%). Învelișul intern are un aspect lamelar și este puțin dens în microscopia electronică, comparativ cu ȋnvelișul extern care este mai gros și mai dens la acțiunea electronilor. Desi majoritatea proteinelor nu au un rol cunoscut, mantaua în sine asigură un rol de protecție a cortexului ȋmpotriva enzimelor necesare pentru degradarea peptidoglicanului. Prin urmare, fără ȋnveliș, aceste enzime, cum ar fi lizozimul, au acces la cortex și pot cauza degradarea sa. Această structură are de asemenea un rol de protecție față de anumiți agenți chimici (glutaraldehidă, iod, agenți oxidanți,…).

6. Exosporium, structură ȋn principal de natură proteică este prezentă numai la sporii unor specii de Bacillus ca: B. cereus, B. anthracis sau Bacillus thurengiensis dar este absent la B. subtilis. Este vorba de stratul cel mai periferic al sporului similar capsulei de la forma vegetativă. Aceasta este reprezentată printr-o structură membranoasă compusă din lipoproteine și 20% glucide și nu este esențial pentru supraviețuirea sporului.

1.11. Germinare sporilor

Procesul de revenire a sporului la forma inițială, respectiv celula vegetativă trece prin trei etape: activarea, germinarea propriu zisă și l’excroissance (Ponce et al.,2008; Setlow, 2014).(figura. 3).

Fig. 3: Schema simplificată a etapelor ciclului de sporulare și de germinare la Bacillus subtilis (după McKenney et al. 2013)

Sporii trebuie activați înainte de-a apărea tentativa de germinare (Giffel et al., 2002). Prezența căldurii, expunerea la anumite produse chimice și o scădere a pH la 2-3 pot activa sporii (Nicholson et al.,2000; Setlow., 2014). În industria produselor lactate, căldura este mecanismul cel mai probabil de activare a sporilor termofili, datorită faptului că procedura de tratarea termică a laptelui este larg utilizată ca o tehnologie de conservare (Seale et al., 2008).

După activarea sporilor la bacteriile mezofile, facultatea germinativă este declanșată de substanțele nutritive prezente ȋn mediu (de exemplu: L-alanina) care se leagă de receptorii de germinare sau prin alte mijloace cum ar fi: o presiune ridicată, prezența sărurilor minerale sau a lizozimului (Setlow, 2003).

Capitolul 2.

CERCETĂRI PROPRII

2.1. Introducere

Pentru a respecta normele de calitate impuse de Uniunea Europeană, mierea nu trebuie să conțină antibiotice, medicamente pe care unii apicultori le folosesc pentru tratarea albinelor. Romania exporta anual ȋntre 8000 și 10.000 tone de miere, principalii beneficiari fiind țările din Uniunea Europeana, Germania, Marea Britanie, dar și alte țări cu economie dezvoltata ca America, Japonia și Canada. Pe aceste piețe mierea poate fi comercializată cu aproximativ 2350 de euro tona.

Totuși, ȋn stupinele ȋn care evoluează boli grave ca loca americană și europeană ȋn care diagnosticul a fost confirmat prin analize de laborator, se admit tratamentele cu antibiotice aplicate ȋn familie, după ce fagurii cu puietul afectat de boală au fost topiți și ȋnlocuiți cu faguri din rezervă.

În acest scop, autoritățile sanitare veterinare din Romania recomandă a se folosi preparatele pe bază de oxitetraciclină. Antibioticul alternativ acceptat și autorizat, ȋn cazul tulpinilor care au căpătat rezistență la oxitetraciclină este eritromicina, ȋnsă utilizarea sa se face numai la indicația specialistului care a diagnosticat boala.

Mierea depozitată de albine ȋn faguri după aplicarea tratamentului cu antibiotice nu poate fi comercializată la export.

Sunt interzise ȋn UE și România folosirea de: streptomicină, nitrofuran, sulfatiazol, acid nalidixic și cloramfenicol.

Aceste neajunsuri ale antibioticelor ne-au obligat să ne ȋndreptăm atenția către alte terapii alternative care se bazează pe unele extracte din plante cum sunt uleiurile esențiale. Acestea sunt produse complexe, care conțin, în cea mai mare parte mai mult de o sută de constituenți (fenoli, alcooli, aldehidele, esteri, triterpene, cetone). Ele sunt derivate din plante numite aromatice și medicinale (Bruneton, J., 2009).

De peste două decenii, numeroase studii au fost concentrate pe exploatarea proprietăților naturale ale uleiurilor esențiale. Aplicații noi ale acestora au fost dezvoltate în domeniul conservării alimentelor, industriei de parfumuri, producerii de cosmetice, farmaceutic și industria agro-alimentară.

Aromaterapia poate permite prin urmare controlul locii americane la albine fără a se recurge la sulfamide sau la antibiotice, în scopul de-a păstra caracterul natural al mierii.

2.2. Scopul lucrării

În prezenta lucrare ne-am propus 3 obiective.

1. Să ȋmbunătățim metodele actuale de cultivare și izolare a tulpinilor de Paenibacillus larvae din cazurile de locă americană.

2. Un studiu comparativ ȋntre 2 tulpini de P. larvae una de referință internațională și a doua din colecția laboratorului de microbiologie al Facultății de Medicină Veterinară din cadrul USAMV Cluj-Napoca.

3. Studiul sporulării in vitro a tulpinilor de P. larvae ȋn vederea identificării formulei de mediu pe care se realizează cea mai bună rată de sporulare.

Scopul obținerii sporilor in vitro a pornit de la observațiile anterioare ale cordonatorului lucrării care ȋn cursul activității de diagnostic curent din laboratorul de microbiologie al FMV a observat că sporii prezenți ȋn conținutul larvelor moarte de locă nu supraviețuiesc mai mult de 1 an ȋn condiții de laborator sub formă lichidă. Rezultatul studiului sporulării a vizat punerea la punct a unei metode de conservare ȋn condiții de laborator a tulpinilor de P. larvae izolate din diferite focare de boală ȋn vederea unor cercetări suplimentare.

Toate investigațiile prezentei lucrări s-au efectuat ȋn cadrul laboratorului de microbiologie al FMV sub directa coordonare a d-lui conf. dr. Chirilă Flore.

2.3. Materiale și aparatură

– o tulpina locală de Paenibacillus larvae;

– tulpina de P.larvae de referință internațională ATCC 9545;

– mediile de cultură;

– plăci Petri;

– bec de gaz;

– ansă de ȋnsămânțare;

– hotă cu flux laminar;

– jar;

– termostat reglat la 37° C;

– sânge de berbec sau de cal;

– ser normal de cal

– tuburi cu ser fiziologic.

2.4. Izolarea și păstrarea tulpinilor de Paenibacilus larvae în condiții de laborator

Pentru izolarea tulpinilor de P. larvae din puiet căpăcit mort sau din alte produse ale stupului s-au folosit mai multe formule de medii de cultură (care vor fi prezentate în continuare), în funcție de formula pe care am avut-o la dispoziție în momentul primirii probelor de material patologic. Cel mai des am folosit pentru izolare agarul cu sânge de oaie sau de cal, agarul cu lapte, și mai rar mediul BHI și mediul MYPGP suplimentate cu vitamina B1.

După însămânțare, plăcile Petri cu mediile de cultură s-au incubat la 37° C în condiții de aerobioză timp de 72 ore asigurându-se o umiditate corespunzătoare, pentru a se împiedica uscarea mediilor.

Identificarea tulpinilor de P. larvae s-a făcut pe baza caracterelor morfologice în frotiuri efectuate din coloniile suspecte colorate prin metoda Gram și a caracterelor culturale.

Culturile tulpinilor identificate ca aparținând speciei P. larvae s-au păstrat în condiții de laborator sub formă sporulată (metodă originală Dr. Chirilă) și sub formă liofilizată tulpina de referință.

2.5. Mediile de cultură

Principalele formule de medii de cultură folosite la izolarea tulpinilor de P. larvae mai frecvent ȋn studiile noaste au fost următoarele:

Bulionul nutritiv:

Extract de carne de vită 1000 ml

Peptonă 10 g

Clorură de sodiu 5 g

Fosfat disodic 1-2 g

Agarul cu sânge de oaie sau cal

Se prepară din bulion la care se adaugă 15-20 grame agar pulvis sau granulat în funcție de capacitatea acestuia de legare. Se încălzește la fierbere până la completa topire a agarului când mediul capătă un aspect siropos. Se răcește la 48-50° C, moment în care se introduce sângele recoltat pe anticoagulant sau pe perle de sticlă, în proporție de 5-10%. Se omogenizează, apoi se toarnă în plăci Petri așezate pe o suprafață orizontală. Se lasă să se solidifice la temperatura laboratorului cu capacul întredeschis în apropirea unui bec de gaz. Plăcile Petri cu medii se pot păstra la frigider timp de o săptămână.

Agarul cu lapte

Se prepară din bulion prin adăugare de agar 15-20 grame ca la agarul cu sânge, iar după topirea agarului se adaugă laptele degresat, fiert în proporție de 2-5%. Se omogenizează, apoi se toarnă în plăci Petri așezate pe o suprafață orizontală. Se lasă să se solidifice la temperatura laboratorului cu capacul întredeschis în apropirea unui bec de gaz. Se păstrează la frigider timp de o săptămână.

Agarul BHI suplimentat cu vitamina B1 (tiamină)

Se prepară din Brain Heart Infusion la care se adaugă agar iar după topire prin fierbere, răcire și solidificare în plăci Petri se suplimentează cu vitamina B1.

Formulă aproximativă* pentru un litru de apă purificată:

Infuzie creier-cord din (preparate solide)………………6,0 g

Extract peptic de țesut de origine animală……………..6,0 g

Clorură de sodiu……………………………………………….5,0 g

Dextroză…………………………………………………………3,0 g

Extract pancreatic de gelatină…………………………….14,5 g

Fosfat disodic……………………………………………………2,5 g

*Ajustată și/sau suplimentată după cum este necesar pentru a îndeplini criteriile de performanță.

pH 7.4 ± 0.2 la 25°C

Mediu MYPGP după Dingman D.W și Stahly D.P.:

Extract de drojdie……………………………………………………1,5%

Bulion Mueller-Hinton…………………………………………….1,0%

Glucoză…………………………………………………………………..0,2%

KH2PO4…………………………………………………………………..0,3%

Piruvat de sodiu………………………………………………………0,1%

Agar………………………………………………………………………..2,0 g

Se suplimentează cu vitamina B1 în momentul folosirii.

2.6. Activarea sporilor

Pentru inducerea sporulării, sporiii de Paenibacillus larvae din colecția laboratorului de microbiologie al Facultății de Medicină Veterinară conservați printr-o metodă originală au fost introduși fie ȋntr-un tub cu ser fiziologic steril sau un tub cu bulion steril. Tuburile astfel pregătite s-au introdus ȋntr-o baie de apă la 80ș C unde s-au menținut 10 minute omogenizându-se periodic. Apoi, 1 ml din suspensia de spori activați s-au ȋnsămânțat prin inundarea suprafeței mediilor de cultură repartizate ȋn plăci Petri. Cel mai frecvent s-au folosit agarul cu sânge de oaie și mediul MYPGP iar dintre mediile lichide bulionul suplimentat ȋn proporție de 1/10 cu ser de cal steril. După acoperirea completă a suprafeței mediilor din plăci excesul de suspensie de spori a fost ȋndepărtată cu pipeta. Placile Petri s-au menținut cu capacul ȋntredeschis 10 minute ȋn apropierea becului de gaz pentru uscarea suprafeței mediului. Apoi au fost introduse cu capacele ȋnchise ȋntr-un jar unde li-sa asigurat umiditatea necesară timp de 10 zile cât a durat perioada de incubație. Culturile au fost examinate zilnic.

Rezultate

În urma experimentelor noastre am observant că ȋn medii lichide bulion, infuzie cord-creier (BHI), bulion Mueller-Hinton suplimentate ȋn proporție de 1/10 cu ser de cal steril tulpinile de Paenibacillus larvae se dezvoltă cu ușurintă după 24 ore de incubație la 37o C după cum se observă ȋn figura 1.

Fig. 1. Cultură de 24 ore de Paenibacillus larvae ȋn bulion suplimentat cu ser de cal

Pe acest mediu cultura prezintă următoarele caractere culturale, supernatant limpede (clar) și un depozit moderat cantitativ cu aspect floconos.

Tulpinile de P. larvae se dezvoltă deasemenea rapid după un interval de 24 ore de incubație la 37o C după ȋnsămânțarea lor pe orice tip de geloză suplimentată cu ser de cal ȋn proporția menționată anterior. Pe aceste medii tulpinile de P.larvae se dezvoltă sub formă de colonii de dimensiuni variabile mici și medii semiopace de culoare alb-gri. De multe ori acestea confluează ȋntre ele mai ales când proba este bogată ȋn germeni (forme vegetative sau spori) după cum se poate observa ȋn figura 2.

Fig. 2. Cultură de 24 ore de Paenibacillus larvae ȋn agar suplimentat cu ser de cal

Un al doilea mediu de cultură deosebit de eficient pentru izolarea și cultivarea tulpinilor de P. larvae este geloza cu sânge de cal sau de oaie pe care ȋnsă culturile se dezvolă ceva mai ȋncet, respectiv după 3-4 zile de incubație la 37o C. Cultura se prezintă sub formă de colonii de talie mică și medie de culoare alb-gri (figura 3).

Fig. 3. Cultură de 24 ore de Paenibacillus larvae pe geloză cu sânge de cal

Examinate la stereolupă coloniile au un aspect al suprafeței neregulat, rugos sau pufos, figura 4.

Fig. 4. Aspectul coloniilor de Paenibacillus larvae pe geloza cu sânge de cal examinate la sterolupă

La examenul caracterelor morfologice pe frotiuri colorate prin metoda Gram se obsevă câteva deosebiri ȋntre cele 2 tulpini de P. larvae studiate. Astfel, tulpina de referință internațională ATCC 9545 se dezvoltă abundent formele vegetative prezentându-se sub formă de perechi sau lanțuri scurte, figura 5.

Fig. 5. Cultură de 3 zile pe agar cu sânge din tulpina de P. larvae ATCC 9545

Cultivată pe aceleași medii și ȋn aceleași condiții de incubație ca tulpina de referință internațională, tulpina de P. larvae locală din colecția laboratorului de microbiologie al FMV Cluj-Napoca s-a prezentat ȋn frotiurile colorate prin metoda Gram sub formă de lanțuri lungi și de filamente după cum se poate observa ȋn figura 6.

Fig. 6. Aspectul morfologic al unei culturii de 3 zile pe geloză cu sânge de cal

dintr-o tulpină de P. larvae

Examenul microscopic direct al culturilor după ziua a 4 sau a 5-a de incubație pe frotiuri colorate prin metoda cu albastru de metilen au evidențiat ȋnceperea sporulării vizibilă sub forma unor condensării de formă rotundă sau ovală ȋn interiorul lanțurilor de bacili sau ȋn interiorul filamentelor atât pe agarul cu sânge de cal cât și pe mediul MYPGP, figurile 7 și 8.

Fig. 7. Începutul sporularii pe agar cu sânge de cal (culturăde 5 zile la 37o C)

colorație cu albastru de metilen

Fig. 8. Începutul sporularii pe mediu MYPGP (cultură de 5 zile la 37o C)

colorație cu albastru de metilen

Examenul microscopic direct al culturilor după ziua a 9-a de incubație pe frotiuri colorate prin metoda cu albastru de metilen au evidențiat prezența de celule vegetative ȋn curs de sporulare și un număr redus de spori maturi lipițti ȋntre ei câte 2 sau 3 pe ambele medii de cultură, figurile 9 și 10. O parte dintre formele vegetative mor, ȋn frotiuri ȋși pierd afinitatea pentru coloranți și se observă sub forma unor umbre de lanțuri sau filament.

La Penibacillus larvae ȋn condiții naturale sporularea are loc ȋntr-un interval lung de timp ȋntre 1-2 luni, numărul de spori este foarte mare, ȋn timp ce in vitro sporularea pe mediul MYPGP este din observațile noastre de asemenea lentă, numărul de spori maturi rezultați fiind mai redus decât ȋn condiții naturale după cum se observă și din figurile 9 și 10.

Fig. 9. Sporulare după 9 zile de incubație pe agar cu sânge de cal la P. larvae

Fig. 10. Sporulare după 9 zile de incubație pe mediul MYPGP la P. larvae

Sporii maturi se găsesc de obicei liberi sau alipiți ȋntre ei câte 2-3 ca monedele ȋn fișicuri. În condiții naturale după ce formele vegetative invadează corpul larvelor și produc starea de septicemie se produce moartea larvelor, iar ȋn corpul acestora unde cantitatea de oxigen scade se crează condiții nefavorabile pentru formele vegetative care vor ȋncepe să sporuleze.

Fig. 11. Sporulare la P. larvae pe MYPGP după 15 zile de incubare la 37o C (colorație cu albastru de metilen)

Fig. 12. Sporulare la P. larvae pe MYPGP după 15 zile de incubare la 37o C (colorație Gram)

Informațiile din literature de specialitate evidențiază faptul că ȋn condiții de laborator mediile care asigură cea mai bună sporulare sunt agarul cu sânge și mediul MYPGP incubate ȋn condiții de anaerobioză. Culturile au fost incubate la 37° C într-o atmosferă cu 30% dioxid de carbon sau cu ajutorul metodei ȋn jar. Sporularea a fost evaluată ȋn ziua a 2-a, a 5-a, a 7-a, și a 9-a de incubare prin examen microscopic pe frotiuri colorare prin metoda, cu albastru de metilen sau cu verde de malahit Schaeffer & Fulton (Borracci, S.E. et al 2003).

Experimentele noastre efectuate cu alte specii bacteriene din genul Bacillus la care sporulare se produce ȋn condiții de aerobioză (Bacillus licheniformis și Bacillus laterosporus) au evidențiat o bună rată de sporulare a acestora ȋncă după prima zi de incubare la 37o C (figurile 11 și 12).

Fig.11. Rata de sporulare după 24 ore de incubare la B. licheniformis pe mediul MYPGP

(colorație cu albastru de metilen)

Fig.12. Rata de sporulare după 24 ore de incubare la B. laterosporus pe mediul MYPGP

(colorație cu albastru de metilen)

Discuții

Însămânțarea suspensiilor de spori activați termic timp de 10 minute la 80o C atât ȋn medii lichide bulion, infuzie cord-creier (BHI), bulion Mueller-Hinton cât și solide (agar) suplimentate ȋn proporție de 1/10 cu ser de cal steril au permis obținerea de culturi bogate din tulpinile de Paenibacillus larvae după 24 ore de incubație la 37o C. Sângele, plasma și serul sanguin sunt produse bogate ȋn factori esențiali, lipoproteine vitamine, săruri minerale vitamine, enzime care favorizează dezvoltarea majorității microorganismelor inclusiv cele izolate de la insecte.

ȋn bulionul infuzie cord creier (BHI) suplimentat cu tiamina dezvoltarea culturilor de P. larvae are loc mai încet, de obicei după 48-72 ore de incubație la 37ș C.

Cultivarea probelor prelevate de la familiile de albine suspecte de ȋmbolnăvire cu Paenibacillus larvae pe mediile lichide menționate mai sus suplimentate cu ser de cal steril permite grăbirea stabilirii diagnosticului cu 48 de ore mai devreme, cea ce este deosebit de important pentru instituirea măsurilor de profilaxie.

În bulionul nutritiv suplimentat cu ser de cal, cultura de P. larvae are un aspect caracteristic fiind foarte asemănătoare cu cultura de Bacillus anthracis ȋn sensul că supernatantul rămâne limpede iar depozitul abundent are un aspect floconos după cum s-a prezentat în fig.1.

În ciuda faptului că, sporularea in vivo se produce spontan în larvele de albine moarte, sporularea in vitro este adesea dificil de realizat, cu toate că pe unele medii de cultură se realizează o bună creșterea a formelor vegetative, acest proces eșuează adesea în cea ce privește procentajele de sporulare. Testele de sporulare in vitro în mediu lichid, bulion infuzie cord creier (BHI) suplimentat cu piruvat de sodiu n-au reușit nici ele să inducă procesul de sporulare.

Ȋn decursul timpului au fost experimentate mai multe proceduri de sporulare in vitro a tulpinilor de Paenibacillus larvae (Dingman, 1983; Dingman, Stahly 1983 Genersch, et al. 2005) iar mai recent de către (de Graaf, Alippi et al. 2013), însă nici una din aceste procedee nu a condus la obținerea unei cantități convenabile de spori de puritatea dorită necesari pentru diferite studii. Totuși rezultate convenabile privind sporularea in vitro au fost obținute de (De Graaf, Alippi et al. 2013), după însămânțarea tulpinilor de P. larvae pe agarul MYPGP.

De asemenea a fost evaluat procesul de sporulare in vitro pe 3 formule diferite de geloză Columbia: cu adaos de sânge bovin (ABC), acelasi mediu cu sânge hemolizat de cal și geloza de bază Columbia plus sânge bovin (BBA). Deși creșterea nu a fost așa de luxuriantă cele mai mari procente de sporulare au fost obținute în a 9 zi de incubare pe formula de mediu BBA (Borracci, S.E. et al. 2003). În culturile de laborator, sporularea debutează la începutul fazei staționare atunci când elementele nutritive sunt epuizate (Nicholson and Setlow, 1990; McKenney and Eichenberger, 2012). Din punctul de vedere al unui spor individual, sporularea durează aproximativ 8 – 10 h (De Hoon et al., 2010).

Deși sporularea individuală a unui bacil are loc într-un interval de timp redus după cum s-a arătat anterior, în condiții naturale și in vitro acest proces este îndelungat de ordinul câtorva săpămâni sau luni. Experimentul nostru asupra sporularii in vitro a unei culturi de Paenibacillus larvae ne-a demonstrat faptul că pe geloza cu sânge de cal și pe mediul MYPGP sporularea are loc cu condiția incubării probelor în anaerobioză. Procesul de sporulare este sesizabil prin tehnicile de microscopie optică încă din ziua a 5-a și se intensifică treptat pe măsură ce perioada timpului de incubare crește. Procenul de sporulare cel mai intens a fost obținut pe mediul MYPGP.

S-a observat de asemenea faptul că, metoda de colorare Schaeffer–Fulton (colorația cu verde de malachit) considerată cea mai bună pentru evidențierea sporilor este net inferioară metodelor de colorare cu albastru de metilen și Gram în cazul sporilor de P. larvae. Rezultate similare, am obținut cu aceste tehnici de colorare și în cazul sporilor de B. licheniformis și de B. laterosporus. La B. laterosporus, morfologia sporului este foarte bine evidențiată prin colorația cu albastru de metilen în etapa în care sporul se mai găsește situat încă în interiorul formei vegetative, iar când sporii devin liberi prezența lor se distinge mai greu, sub forma unor umbre, probabil datorită refringenței acestora (fig. 12).

Procesul de sporulare in vitro are loc relativ încet 2-3 săptămâni, durata acestuia apropiindu-se foarte mult de durata necesară în cazul sporulării naturale din cursul bolii. Inducerea sporulării in vitro la tulpinile bacteriilor sporulate din genurile Bacillus și Paenibacillus reprezintă o metodă ideală de conservare a tulpinilor bacteriene pe o durată îndelungată de timp în condiții de laborator, mult mai ușoară decât liofilizarea și mai accesibilă laboratoarelor cu dotare limitată cu aparatură. Acestă metodă deschide noi perspective referitoare la conservarea sub formă sporulată, pentru alte specii bacteriene pretențioase cum sunt cele din genul Clostridium.

Concluzii

1. Paenibacillus larvae este o specie bacteriană pretențioasă care nu se dezvoltă pe medii obișnuite, ea necesită medii îmbogățite sau speciale și o durată de incubare de 3-4 zile la 35-37ș C.

2. ȋn mediile lichide, infuzie cord creier (BHI) suplimentat cu tiamină se dezvoltă după 3 zile de incubație și supraviețuiește o perioadă scurtă de timp.

3. Bulionul infuzie cord creier (BHI) sau bulionul Mueller-Hinton suplimentat cu ser de cal în proporție de 1/3 – ¼ reprezintă formula ideală pe care P. larvae se dezvolta după 24 ore de incubație.

4. Această formulă contribuie la grăbirea stabilirii diagnosticului bacteriologic cu 48 de ore și la instituirea măsurilor de carantină în stupină.

5. Mediile lichide utilizate de noi nu ne-au permis inducerea sporulării, probabil și datorită faptului că în aceste medii formele vegetative supraviețuiesc un interval scurt de timp.

6. Pe agarul cu lapte cultura de P. larvae se dezvoltă după o incubație de 3 zile, însă acest mediu nu favorizează sporularea.

7. Pe agarul cu sânge de cal și de oaie tulpinile de P. larvae se dezvoltă după 3 zile de incubare iar începând din ziua a 5-a în frotiurile colorate prin metoda cu albastru de metilen se observă începerea procesului de sporulare.

8. Mediul MYPGP solid s-a dovedit a fi mediul ideal pentru sporulare.

9. Incubarea mediilor de cultură în condiții de anaerobioză favorizează sporularea.

10. ȋn condițiile de incubare în anaerobioză, sporularea indusă in vitro începe din ziua a 5-a și atinge procentajul maxim după aproximativ 2-3 saptămâni.

Bibliografie

1. ALBO GRACIELA N., HENING CYNTHIA; RINGUELET JORGE; REYNALDI F.J.; DE GIUSTE MARISA R.; ALIPPI ADRIANA M., .2003 Evaluation of some essential oils for the control and prevention of American Foulbrood disease in honney bees, Apidologie, vol.34, no. 5, 417-427.

2. ASH C., PRIEST F.G. et COLLINS M.D.: Molecular identification of rRNA group 3 bacilli Ash, Farrow, Wallbanks and Collins using a PCR probe test. Proposal for the creation of a new genus Paenibacillus. AntonievanLeeuwenhoek, 1993, 64, 253-260.

3. Ash, C., Priest, F. G. & Collins, M. D. (1994). Paenibacillus gen. nov.and Paenibacillus polymyxa comb. nov. In Validation of the Publication of New Names and New Combinations Previously Effectively Published Outside the IJSB, List no. 51. Int J Syst Bacteriol 44, 852.

4. Augustin, M. A., P. T. Clarke, and H. M. Craven, 2003."Powdered milk: characteristics of milk powders." Encyclopedia of Food Science and Nutrition: 4703 4711.

5. Badea Mihaela 2013 – Albinele și Apicultura – Afacere cu profit din primul an, Editura Gold, p.67.

6. Baril, E., Coroller, L., Couvert, O., El Jabri, M., Leguerinel, I., Postollec, F., & Mafart, P., 2012. Sporulation boundaries and sporeformation kinetics of Bacillus spp. as a function of temperature, pH and a w. Food microbiology, 32(1), 79-86.

7. BERTRAND F., 2003 Les maladies de l’abeille domestique (Apis mellifica) et leurs consequences sanitaires en France, Teză de Doctorat, Ecole Nationale Veterinaire de Lyon.

8. Borracci, S.E., Chacana, P.A., Palacio, A., Terzolo, H.R. In vitro generation of Paenibacillus larvae spores, XXXVIII Congreso Internacional de Apicultura de Apimondia, Ljubljana, Slovenia, 24 – 29 de agosto de 2003.

9. Bruneton J., 2009. Pharmacognosie – Phytochimie, plantes médicinales, 4ème éd., revue et augmentée, Tec et Doc. éditions médicales internationales, Paris: 1288.

10. Burgess S., Lindsay D., Flint S,H., 2010. Thermophilic bacilli and their importance in dairy processing. International Journal of Food Microbiology 144:215-225.

11. Chirilă Flore, Nicodim Iosif Fiț (2018) Cahier de microbiologie spéciale, Editura AcademicPres Cluj-Napoca, 55-60.

12. COUGOULE N.; ABADIE G.; VAUTOR E.; CHAUZAT M-P.; AUBERT M.; FAUCON J.-P., 2008 Étude de la sensibilité à la tétracycline d’isolates européens de Paenibacillus larvae, agent de la Loque Américaine de l’abeille domestique (Apis mellifera), Rev. De Med. Vet., vol. 159, no. 6, 323-326.

13. De Graaf D.C., Alippi A.M., Antúnez K., Aronstein K.A., Budge G., De Koker D., De Smet L., Dingman D.W., Evans J.D., Foster L.J., Fünfhaus A., Garcia-Gonzalez E., Gregorc A., Human H., Murray K.D., Nguyen B.K., Poppinga L., Spivak M., Van Engelsdorp D., Wilkins S. & Genersch E. (2013). Review Article: Standard methods for American foulbrood research. J. Apicult. Res., 52, DOI 10.3896/IBRA.1.52.1.11.

14. de Hoon MJL, Eichenberger P, Vitkup D. 2010. Hierarchical Evolution of the Bacterial Sporulation Network. Current Biology 20: R735-R745.

15. DINGMAN, D.W., 1983. Bacillus larvae: Parameters involved with sporulation and characteristics of two bacteriophages. University of Iowa.

16. DINGMANN D.W.&STAHLY D.P.(1983). Medium promoting sporulation of Bacillus larvae and metabolism of medium components. Appl. Environ. Microbiol., 46, 860–869.

17. J.P. Euzeby: Dictionaire de Bacteriologie Veterinaire, 18 juin 1999.

18. GENERSCH, E., ASHIRALIEVA, A. and FRIES, I., 2005. Strain-and genotype-specific differences in virulence of Paenibacillus larvaesubsplarvae, a bacterial pathogen causing American Foulbrood disease in honeybees. Applied and Environmental Microbiology, 71(11), pp. 7551-7555.

19. Ghosh, Sonali, and Peter Setlow, 2009. "Isolation and characterization of superdormant spores of Bacillus species." Journal of bacteriology 191(6): 1787-1797.

20. Gibbons, N. E., and R. G. E. Murray. 1978. Proposals concerning the higher taxa of bacteria. Int J Syst Bacteriol 28:1-6.

21. Griffiths, K.K. and Setlow, P. ( 2009) Effects of modification of membrane lipid composition on Bacillus subtilis sporulation and spore properties. J Appl Microbiol 106, 2064– 2078.

22. HASEMAN L., 1961. How long can spores of American Foulbrood live? American Bee Journal, 101; 298-299.

23. Heyndrickx M., Vandemeulebroecke K., Hoste B., Janssen P., Kersters K., De Vos P., LoganN., Ali N., Berkeley R. (1996) Reclassification of Paenibacillus (formerly Bacillus) pulvifaciens (Nakamura 1984) Ash et al. 1994, a later subjective synonym of Paenibacillus (formerly Bacillus) larvae (White 1906) Ash et al. 1994, as a subspecies of P. larvae, with emended descriptions of P. larvae as P. larvae subsp. Larvae and P. larvae subsp. pulvifaciens, Int. J. Syst. Bacteriol. 46, 270–279.

24. Klein G., Pack A., Bonapart C., Reuter G., 1998. Taxonomy and physiologyof probiotic lactic acid bacteria international. Journal of Food Microbiology.41:103-125.

25. KOCHANSKY JAN; KNOX DAVID A.; FELDLAUFER MARK; PETTIS JEFFERY S., 2001 Screening alternative antibiotics against oxytetracycline-susceptible and-resistant Paenibacillus larvae, Apidologie vol 32, no. 3, 215-222.

26. Leggett MJ, McDonnell G, Denyer SP, Setlow P, Maillard JY (2012) Bacterial spore structures and their protective role in biocide resistance. J Appl Microbiol 113: 485–498. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05336.x

27. LIESEL BRENDA GENDE; IGNAZIO FLORIS; ROSALIA FRITZ; MARTIN JAVIER EGUARAS., 2008 Antimicrobial activity of cinnamon (Cinnamonum zeylanicum) essential oil and its main components against Paenibacillus larvae from Argentine, Bull. Of Insectology 61(1), 1-4.

28. Lund BM. Anaerobes in relation to foods of plant origin. Soc Appl Bacteriol Symp Ser 1986; 13:351–72.

29. MĂRGHITAȘ L. AL., 2008 Albinele și produsele lor Ed. a II – a, Ed. Ceres București

30. McKenney PT, Driks A, Eichenberger P. 2013. The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nat Rev Microbiol 11: 33-44.

31. McKenney PT, Eichenberger P., Dynamics of spore coat morphogenesis in Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 2012 Jan; 83(2): 245-60. doi: 10.1111/j.1365-2958.2011.07936.x. Epub 2011 Dec 15.

32. Nicholson W. L., Munakata N., Horneck G., Melosh H. J., & SetlowP., 2000. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(3), 548-572.

33. Nicholson WL, Setlow P. 1990. Sporulation, germination and outgrowth, p 391–450 In Harwood CR, Cutting SM. (ed), Molecular biological methods for Bacillus. John Wiley and Sons, Chichester, United Kingdom [Google Scholar]

34. Ponce, Adrian, Stephanie A. Connon, and Pun To Yung, 2008."Detection and viability assessment of endospore-forming pathogens." Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems. Springer New York. 481-523.

35. Popham, D.L. (2002). Specialized peptidoglycan of the bacterial endospore: the inner wall of the lockbox. Cell. Mol. Life Sci. 59, 426-433.

36. Postollec, F., Bonilla, S., Baron, F., Jan, S., Gautier, M., Mathot, A. G., & Sohier, D., 2010. A multiparametric PCR-based tool for fast detection and identification of spore-forming bacteria in food. International journal of food microbiology, 142(1), 78-88.

37. RĂPUNTEAN GH.; RĂPUNTEAN S., 2005 Bacteriologie Veterinară Specială, Ed. Academic Pres 73.

38. REYNALDI F.J.; ALBO GRACIELA N.; ALIPPI ADRIANA M., 2008 Effectiveness of tilmicosin against Paenibacillus larvae, the causal agent of American Foulbrood disease of honeybees, Veterinary microbiology, vol. 132, no. 1-2 ; 119-128.

39. Seale, R.B., Flint, S.H., Mcquillan, A.J. & Bremer, P.J. (2008) Recovery of spores from thermophilic dairy bacilli and effects of their surface characteristics on attachement to different surfaces. Applied and Environmental Microbiology, 74, 731-737.

40. Setlow, P. (2003). Spore germination. Curr. Opinion Microbiol. 6, 550-556.

41. Setlow, P. (2006). Spore of Bacillus subtilis: their resistance to and killing by radiation, heat and chemicals. J. Appl.Microbiol. 101, 514-525.

42. Setlow, P. (2014). Germination of spores of Bacillus species: what we know and do not know. J. Bacteriol. 196, 1297-1305.

43. Setlow, P., and Johnson E.A. (2007). Spores and their significance. In Food Microbiology, Fundamentals and Frontiers, 3rd edition, Doyle,M.P., and Beuchat, L.R. eds.(ASM Press, Washington, DC), pp 35-67.

44. SHIMANUKI H AND KNOX A. D, 2000 Diagnosis of Honey Bee Diseases, United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Agriculture Handbook, Number 690.

45. STAMATIN N., 1957 Microbiologie veterinară, Ed. Agro-Silvică de Stat, vol. II, 656-661.

46. Te Giffel, M.C., Wagendorp, A., Herrewegh, A. & Driehuis, F. (2002) Bacterial spores in silage and raw milk.Antonie van Leeuwenhoek, 81, 625-630.

47. WHITE G.F.,1906: The bacteria of the apiary with special reference to bee disease. US Department of Agriculture, Bureau of Entomology, Technical Series no. 14; 50p.

48. Zenaida M. De Guzman, Cleofas R . Cervancia, Kris Genelyn B. Dimasuay, Mitos M. Tolentino,Gina B. Abrera, Ma. Lucia C. Cobar, Alejandro C. Fajardo Jr., Noel G. Sabino, Analinda C. Manila-Fajardo, Chitho P. Feliciano (2011) Radiation inactivation of Paenibacillus larvae and sterilization of AmericanFoul Brood (AFB) infected hives using Co-60 gamma rays, Applied Radiation and Isotopes 69 (2011) 1374–1379.

www.spc.int/lrd/ext/Disease_Manual_Final/b452.;

DECLARAȚIE PE PROPRIA RĂSPUNDERE

Subsemnata Farcaș Elena-Daniela , studentă la Facultatea de Zootehnie și Biotehnologii, programul de studii/specializarea Biotehnologii Medical Veterinare , forma de învățământ frecvență, în calitate de autor al lucrării de licență : ȊMBUNĂTĂȚIREA METODELOR DE IZOLARE ȘI STUDIUL SPORULĂRII LA PAENIBACILLUS LARVAE, elaborat și depus pentru susținere publică în sesiunea de licență- iulie, 2020;

Declar pe propria răspundere că Proiectul de licență /diplomă/ disertație respectă dreptul de autor și drepturile proprietății intelectuale, conform Legii nr. 8 din 14 martie 1996 privind drepturile de autor și drepturile conexe, publicată în Monitorul Oficial, nr. 60/26 martie 1996 și a Cartei USAMV Cluj-Napoca, știind că sub incidența plagiatului intră realizarea lucrării de către o altă persoană; copierea sau preluarea, parțială sau totală, a unui text, a unei lucrări sau proiect de cercetare, proiect de diplomă, lucrare de licență, de doctorat etc.; preluarea de texte de pe internet, fără ghilimele și trimitere la pagina de web; preluarea unor surse bibliografice fără citarea acestora sau menționarea în referințele bibliografice; însușirea rezultatelor muncii științifice a altor autori, texte/fragmente/idei din opera acestora, fără consemnarea surselor bibliografice.

Înțeleg că orice omisiune sau incorectitudine în prezentarea informațiilor este pedepsită conform legii (art. 292 privind falsul în declarații din Codul Penal).

Declar pe propria răspundere că datele și informațiile din prezenta declarație corespund realității.

Data: 03.07.2020

Semnătura: