Electroforeza Proteinelor Serice

Cuprins

CAPITOLUL I

1.1  Structura proteinelor 3

1.1.1 Structura primara 4

1.1.2 Structura secundara 5

1.1.3 Structura tertiara 7

1.1.4 Structura cuaternara 7

1.1.5 Punctul izoelectric 8

1.2  Proteinele in organismul uman 9

1.2.1 Sursa de proteine in organism si biosinteza proteinelor 9

1.2.2  Digestia si absorbtia proteinelor 9

1.2.3 Necesitatile fiziologice de proteine in alimentatie 10

1.2.4 Aminoacizii esentiali. Valoarea biologica a proteinelor alimentare 11

1.3  Clasificarea proteinelor 12

1.4 Funcțiile proteinelor 13

1.5 Metode de separare a proteinelor 15

1.5.1 Centrifugarea in gradient, gelfiltrarea, cromatografia 16

1.5.2 ELECTROFOREZA PROTEINELOR 17

1.5.3 Teste de disproteinemie 20

1.5.4 Determinarea proteinelor totale 21

1.6 Aspecte actuale în analiza proteinelor 23

CAPITOLUL II

2.2 Partea experimentala 31

  2.2.1 Obiectivul 31

2.2.2 Prelevarea si prelucrarea probei 31

2.2.3 Principiul metodei 31

2.2.4 Instrumentatie 31

2.2.5 Reactivi 35

2.2.6 Conditii si mod de lucru pentru testul de separare a proteinelor din ser pe gel de agaroza 36

2.2.7. Interpretarea rezultatelor 38

Bibliografie 44

=== Electroforeza proteinelor serice ===

Cuprins

CAPITOLUL I

1.1  Structura proteinelor 3

1.1.1 Structura primara 4

1.1.2 Structura secundara 5

1.1.3 Structura tertiara 7

1.1.4 Structura cuaternara 7

1.1.5 Punctul izoelectric 8

1.2  Proteinele in organismul uman 9

1.2.1 Sursa de proteine in organism si biosinteza proteinelor 9

1.2.2  Digestia si absorbtia proteinelor 9

1.2.3 Necesitatile fiziologice de proteine in alimentatie 10

1.2.4 Aminoacizii esentiali. Valoarea biologica a proteinelor alimentare 11

1.3  Clasificarea proteinelor 12

1.4 Funcțiile proteinelor 13

1.5 Metode de separare a proteinelor 15

1.5.1 Centrifugarea in gradient, gelfiltrarea, cromatografia 16

1.5.2 ELECTROFOREZA PROTEINELOR 17

1.5.3 Teste de disproteinemie 20

1.5.4 Determinarea proteinelor totale 21

1.6 Aspecte actuale în analiza proteinelor 23

CAPITOLUL II

2.2 Partea experimentala 31

  2.2.1 Obiectivul 31

2.2.2 Prelevarea si prelucrarea probei 31

2.2.3 Principiul metodei 31

2.2.4 Instrumentatie 31

2.2.5 Reactivi 35

2.2.6 Conditii si mod de lucru pentru testul de separare a proteinelor din ser pe gel de agaroza 36

2.2.7. Interpretarea rezultatelor 38

Bibliografie 44

CAPITOLUL I

1.1 Structura proteinelor

Din punct de vedere chimic, proteinele sunt heteropolimeri constituiti din 20 de L-α aminoacizi (asa numitii aminoacizi standard), in care gruparile carboxil se pot combina cu gruparile amino formand legaturi peptidice in lanturile peptidice. Aminoacizii standard au proprietati variate, proprietati care sunt direct responsabile de structura tridimensionala a proteinei, dar si de proprietatile acesteia (Tabel 1).

Tabel 1. Aminoacizii standard si abundenta acestora în proteine

Complexitatea moleculara a proteinelor implica organizarea lor la nivele diferite: structura primara,secundara, tertiara si cuaternara. Caracterizarea nivelului de organizare, pe baza interactiunilor necesare realizarii si obtinerii acestora, desi s-au ridicat unele obiectiuni, este utila pentru intelegerea conformatiei, a proprietatilor fizico-chimice si biologice a proteinelor.

In principiu, structura primara se refera la legaturile covalente dintre aminoacizi, similare legaturilor uzuale ale compusilor organici, caracteristicile moleculelor relativ mici (peptide). Cu cresterea numarului de aminoacizi si respectiv a moleculei, apar noi tipuri de legaturi si cele existente primesc noi atributii; de exemplu, legaturile de H care determina structura secundara si impun anumite conformatii: „helix”, „foaie plianta”. In cadrul segmentelor helicale, apar noi tipuri de legaturi intre gruparile laterale: van der Waals, saline, etc., care determina structura tertiara. Interactiunile intre moleculele proteinelor, cu formare de agregate aranjate caracteristic in spatiu, datorita unor relatii complexe de suprafata a resturilor de aminoacizi si a unor portiuni din legatura peptidica a monomerilor peptidici sau a subunitatilor proteinelor, conduce la structura cuaternara.

1.1.1 Structura primară

Toate peptidele si proteinele au ca structura fundamentala o „ coloana vertebrala” alcatuita dintr-un numar oarecare de aminoaizi, uniti intre ei prin legatura peptidica : -CO-NH- formata intre gruparea α-NH2 a unui aminoacid si α-COOH a celui invecinat. Toti aminoacizii (cu exceptia Pro si HiPro), indiferent de structura lor, participa in formarea lantului peptidic prin acelasi fragment comun: -CO-CH-NH-

Partea din aminoacizi care nu apartine acestui fragment apare sub forma unui rest,care pastreaza, in general, individualitatea si proprietatile caracteristice lantului de hidrocarbura si a eventualelor fractiuni pe care le poseda, de exemplu, gruparea -COOH in cazul diacizilor, -NH2 in diaminoacizi, -OH alcoolic (Ser,Tre) sau fenoli (Tir), -SH in aminoacizii cu sulf, resturile alifatice, aromatice, imidazol, indol, etc.

Peptidele si proteinele au un numar oarecare de grupari titrabile reprezentate prin gruparile –COOH si –NH2 de la capetele lantului sau a celor neantampinate in legatura peptidica precum si a altor cauze care confera un caracter acid sau bazic resturilor de aminoacizi. Dupa neutralizarea acestora, prin hidroliza peptidei apar rapid un numar egal de grupari –COOH si –NH2 titrabile, care pledeaza pentru unirea lor in molecula nativa, sub forma legaturii peptidice: -CO-NH- +H2O = -COOH + H2N-.

Hidroliza partiala a peptidelor sau proteinelor duce la aparitia unor di-, tri- si oligopeptide.

Din datele experimentale si consideratiile teoretice se pot formula unele proprietati si particularitati ale structurii primare:

-aminoacizii din structura legaturii peptidice sunt de forma L ,fiecare contribuind cu aceeasi „ lungime” in lantul peptidic (exceptie Pro si Hipro).

-distantele si unghiurile atomilor din lantul peptidic sunt aceleasi pentru toti aminoacizii. Legatura peptidica este de tip covalent ; datorita transferului de electroni de la –CO- la –NH- apare o dubla legatura care oscileaza intre acestea, o stare de mezomerie, cu doua structuri limita, care se transforma una in alta, dand nastere unui echilibru (rezonanta).

Datorita deplasarii altrenative a unui electron de la gruparea -NH la C=O se produce oscilarea dublei legaturi de la atomul de carbon si oxigen la atomul de azot, fomrmandu-se astfel cele 2 forme mezomere (Bedeleanu, 1985).

1.1.2 Structura secundară

Structura secundară a proteinelor implica legaturile de H si este o consecinta a reactivitatii legaturii peptidice insasi. Din aceasta cauza ea este in mica masura, sau chiar deloc influentata de natura resturilor de aminoacizi neimplicati direct in legatura peptidica.

Structurile cele mai posibile, datorita legaturilor de H intramoleculare, sunt structurile α-helix si β-foi pliante; aceste denumiri apartin lui Pauling si Corey si indica descoperirea lor cronologica.

Structura α-helix

In cadrul structurii helicale a polipeptidelor, cea mai stabila este α-helixul, in forma de „bara”, in care lantul principal: -C-CO-NH-C-, puternic infasurat, formeaza partea interioara, iar resturile laterale se orienteaza spre exterior, intr-o arie helicala (Fig. 1).

α-Helixul este stabilizat prin legaturi de H intre gruparile NH si CO din legaturile peptidice principale, in asa fel incat gruparea –CO- a fiecarui aminoacid situat la o distanta de patru resturi, in secventa liniara.In consecinta toate gruparile –CO- si –NH- din „coloana vertebrala” a polipeptidei sunt legate prin legaturi de H.

Sensul de rotire al α-helixului poate fi spre stanga sau spre deapta.

Mai multeα-helixuri se pot infasura formand un „cordon”(ca o sfoara rasucita), ca de exemplu, in keratina din par, miozina si tropomiozina din muschi, epiderma din piele, fibrina din coagulul sanguin; aceste „fibre” sau „fire” joaca un rol important in rezistenta si alte proprietati fizico-mecanice ale proteinelor.

Structura β-foaie pliata difera de precedenta prin arhitectura sa spatiala, sub forma de foaie si nu de bastonase. Lantul polipeptidic este aproape complet extins,incat distanta axiala intre 2 aminoacizi adiacenti este de 3,5 Å (fata de 1,5 Å in α-helix).O alta diferentiere consta in stabilizarea lor prin legaturi de H intre lanturi polipeptidice diferite. Regiuni mai extinse β sau gasit numai in fibroina din matasea naturala , in alte proteine apar doar segmente reduse din structura lor in conformatia similara β – foilor pliante.

1.1.3 Structura terțiară

Structura tertiara se refera la relatiile sterice ale returilor de aminoacizi care nu sunt implicate in „coloana vertebrala” liniara. Structura cuaternara apare in proteinele alcatuite din mai multe lanturi polipeptidice si in care acest mod de organizare presupune existenta unor „subunitati”. Prin interactiunile intre aceste subunitati apar anumite structuri spatiale speciale care conditioneaza functiile lor biologice. Delimitarile intre structurile secundare si tertiare si intre acestea si cele cuaternare sunt adesea arbitrari, ceea ce duce uneori , la neintelegeri in definirea si caracterizarea lor.

Structura tertiara traduce o anumita aranjare spatiala, care determina unele proprietati fizico – chimice si biologice. De exemplu, viscozitatea intrinseca : η = V/m x A, in care V = volumul particulei, m = masa moleculara si A o functie a raportului axelor moleculei, are valoarea 2,5 pentru sferele rigide si creste concomitent cu cresterea raportului (diferentei) dintre axe. Pentru majoritatea proteinelor native, η este independent de gr. Mol., dar depinde de aceasta pentru moleculele nonsferice; cele mai mari modificari ale viscozitatii sunt cauzate de forma moleculei.

1.1.4 Structura cuaternară

Multe proteine sunt alcatuite dintr-un numar de lanturi polipeptidice independente, care nu sunt legate intre ele prin legaturi covalente; fiecare subunitate este caracterizata printr-o structura proprie primara, secundara si tertiara. Aranjarea lanturilor peptidice determina structura cuaternara (Fig. 2).

In prezent se considera ca majoritatea, daca un chiar toate proteinele cu gr.mol. peste 50000, sunt alcatuite din asemenea subunitati, ca de exemplu, hemoglobina, formata din patru lanturi polipeptidice, si enzimele, alcatuite din mai multe lanturi, disociabile in subunitati monometrice cu ajutorul agentilor care produc denaturarea partiala a proteinelor. Structura cuaternara a proteinelor este de interes special pentru izoenzime, adica a enzimelor care exista in mai multe forme structurale la aceeasi specie precum si in forma complecsilor multienzimatici, de exemplu in cazul dehidrogenazei piruvice din E. coli compusa din trei tipuri de enzime, cu gr.mol. globala de 4.000.000 si care contine 88 polipeptide distincte capabile de autogrupare si aranjare in spatiu, in coditiile amestecului partilor componente.

Mentionam ca si structurile tertiare si cuaternare sunt determinate de secventa aminoacizilor si sunt astfel supuse mecanismelor genetice.(Bedeleanu, 1985)

1.1.5 Punct izoelectric

Pentru o proteina exista o valoare de pH la care incarcarea (aparenta) este zero; acest pH, la fel ca pentru aminoacizi, se denumeste punct izoelectric sau pHi si se apreciaza experimental prin lipsa de migrare in campul electric. pHi al unei proteine poate fi evaluat cu aproximatie din datele cu privire la compozitia in aminoacizi. Valoarea pHi este o caracteristica a fiecarei proteine,fiind situat in majoritatea cazurilor in domeniul neutralitatii, ceea ce reflecta un numar aproximativ egal de aminoacizi cu caracter acid si bazic.

Cunoasterea pHi este importanta atat in scop analitic, pentru caracterizarea unei proteine, cat si preparativ, deoarece la acest pH proteinele au solubilitatea minima (favorizeaza precipitarea). (Bedeleanu,1985)

 1.2 Proteinele in organismul uman

1.2.1      Sursa de proteine in organism si biosinteza proteinelor

Intrucat proteinele celulare sufera un process de uzura, ele trebuie inlocuite in permanenta. Principala sursa de proteine necesare pentru refacere provine din alimente. De notat insa ca in organism are loc in permanenta un transfer proteic intertisular. In acest fel la fondul comun de acizi aminati contribuie atat acizii aminati de origine alimentara, cat si cei proveniti din degradarea proteinelor tisulare. Acest fond comun de acizi aminati va fi la randul lui folosit pentru sinteze proteice sau pentru formarea de produsi specializati (serotonina, adrenalina, tiroxina ), iar o parte din acizii aminati sunt degradati si utilizati in scopuri energetice.

  1.2.2      Digestia si absorbtia proteinelor

La pH-ul acid de aproximativ 1,0 al sucului gastric proteinele din alimente, in mare parte denaturate prin procesele culinare, sunt supuse actiunii pepsinei transformadu-se in proteoze si peptone. Trecand in duoden acesti produsi de degradare enzimatica ai proteinelor sunt supusi actiunii tripsinei si chimotripsinei pancreatice, care-i scindeaza pana la stadiul polipeptide. Proteinele neatacate de pepsina in stomac pot fi si ele hidrolizate de catre tripsina si chimotripsina pana la stadiul de polipeptide. La randul lor polipeptidele sunt atacate de peptidaze, respective de un amestec de carboxipeptidaze si aminopeptidaze, cunoscut mai demult sub numele de erepsina, care scindeaza substratul pana la stadiul de aminoacizi. Acesti acizi aminati se absorb apoi din lumenul intestinal pe calea venei porte. Este posibil ca hidroliza unor peptide sa aiba loc chiar in peretele intestinal. Exista astazi dovezi ca absorbtia acizilor aminati se face printr-un process biologic activ implicand consum de energie, iar vitamina B6 ( piridoxal-fosfat ) faciliteaza absorbtia aminoacizilor. S-a aratat de asemenea existenta unei competitii intre diversii acizi aminati in privinta absorbtiei lor, astfel incat administrarea in alimentatie a unui acid aminat in exces poate stanjeni absorbtia altui acid aminat.

Desi principala forma de absorbtie o constituie aminoacizii, mici fragmente peptidice pot strabate ca atare mucoasa intestinala. Se pare ca, intr-o masura mai redusa, se pot absorbi chiar si moleculele nehidrolizate de proteine, in special la sugari. Asa se explica trecerea anticorpilor din laptele mamei in sangele sugarilor. Alergiile cutanate produse de alergenii administrati pe cale digestive sugereaza ca si la adult este posibila o oarecare absorbtie de proteine nehidrolizate. Se stie ca antigenicitatea unei proteine, adica capacitatea de a produce o reactie imuna, este conditionata de existenta sub forma de macromolecula, iar digestia avansata distruge aceasta antigenicitate. S-a sugerat ca in unele sindroame de malabsorbtie principalul mecanism patogenetic ar fi reprezentat de un deficit enzimatic  la nivelui mucoasei intestinale, astfel incat unele peptide din gluten, principala proteina din grau, nu sunt complec scindate. Aceste fragmente exercita efecte nocive local asupra mucoasei intestinale, iar, absorbindu-se, duc la formarea de anticorpi circulanti fata de gluten.

Nutritia parenterala cu proteine prezinta un interes deosebit in cazul pacientilor care nu se pot alimenta pe cale orala. S-a aratat pe plan teoretic ca organismul poate asimila proteinele introduse parenteral, iar intestinal joaca in acest caz un rol insemnat in scindarea si asimilarea acestor proteine. In practica, administrarea parenterala de proteine este insa limitata, deoarece proteinele straine introduse pe aceasta cale produc o sensibilitate a organismului. Administrarea de plasma umana inlatura acest inconvenient, dar astazi nutritia parenterala se realizeaza de preferinta prin perfuzii cu solutii de aminoacizi (de exemplu Aminofuzin) obtinute prin hidroliza avansata a proteinelor.

1.2.3 Necesitatile fiziologice de proteine in alimentatie

Intrucat alimentele bogate in proteine sunt si cele mai scumpe, problema minimului si a optimului de proteine in alimentatie a facut obiectul a numeroase studii. S-a stabilit ca o cantitate minima de proteine in dieta este absolut indispensabila. Acest minim de proteine de aproximativ 40g/zi este compatibil cu viata dar nu constituie o alimentatie rationala, iar rezistenta organismului scade. Optimul de proteine in alimentatie este de cel putin 1g/kg corp/zi (cam 60-80 g/zi, pentru un adult), ceea ce ar reprezenta aproximativ 10-12 % din valoarea calorica a ratiei alimentare. Evident necesitatile de proteine cresc in cursul sarcinii si al alaptarii (cam 1,5 g/kg corp/zi) si in perioada de crestere la copii 2,5 g/kg corp/zi, la sugari).

Nu toate proteinele au aceeasi valoare biologica, adica nu toate proteinele alimentare  sunt capabile sa contribuie la refacerea proteinelor organismului. In stransa legatura cu aceste aspecte este problema aminoacizilor esentiali si a coeficientului de utilizare digestiva si biologica a unei proteine.

1.2.4 Aminoacizii esentiali. Valoarea biologica a proteinelor alimentare

La om balanta azotata nu poate fi mentinuta daca lipsesc din alimentatie urmatorii 8 aminoacizi: fenilalanina, valina, triptofan, treonina, lizina, leucina, izoleucina si metionina. Acesti acizi aminati absolut necesari in alimentatie se numesc aminoacizi esentiali. Histidina si arginina nu sunt aminoacizi esentiali, dar par a fi necesari pentru asigurarea unei cresteri normale. Spre deosebire de aminoacizii esentiali, toti ceilalti aminoacizi pot fi sintetizati “in vivo”prin aminarea produsilor de degradare a lipidelor si a hidratilor de carbon. Cand unul dintre acizii aminati necesari pentru sinteza unei proteine lipseste, sinteza proteinei respective nu mai are loc, iar aminoacizii neutilizati sunt deaminati, urea rezultata eliminandu-se prin urina. Din acest motiv, in astfel de conditii, balanta azotata devine negativa.

Unele cercetări au sugerat faptul că, în anumite conditii, chiar si deficitul de alti aminoacizi, in afara celor 8 esentiali amintiti, pot avea efecte negative. Pe de alta parte deficitul de metionina poate fi compensat prin administrarea α-ceto δ-metiolbutiratului care in organism devine un precursor al metioninei fara a se afla insa in hrana obisnuita. De aceea este important de reamintit aici definitia data de Rose unui acid aminat esential si care ar fi “ acela care nu poate fi sintetizat de animal din substante accesibile in mod obisnuit intr-o ratie corespunzatoarenecesitatilor de crestere” (Cucuianu, 1977).

Valoarea biologica a unei proteine alimentare depinde de compozitia sa in aminoacizi. Cu cat mai bogat si mai variat va fi continutul in acizi aminati si cu cat mai apropiat de compozitia proteinelor proprii organismului, cu atat valoarea biologica a unei proteine alimentare va fi mai mare. Masura acestei valori o constituie coeficientul de utilizare biologica a proteinelor = N ingerat – N urinar / N ingerat.

Acest coeficient indica in ce masura o proteina ingerata este incorporata in proteinele proprii. Atunci cand in urma administrarii unei proteine, eliminarea urinara de N este mult crescuta, inseamna ca incorporarea aminiacizilor din compozitia ei este redusa si ca acestia se degradeaza in organism. Proteinele de origine vegetala si in special zeina din porumb, care este lipsita de triptofan, tirozina si lizina, au o valoare biologica  redusa. In schimb proteinele din carne, peste, oua si lapte au o valoare biologica ridicata.

Valoarea biologica creste atunci cand se foloseste in alimentatie un amestec de proteine, chiar atunci cand fiecare din proteinele utilizate are o valoare biologica incompleta. Intr-o astfel de situatie, fiecare proteina poate aduce un aport de aminoacizi care lipsesc celorlalte, intregindu-se sortimentul de aminoacizi. Valoarea unei proteine alimentare depinde insa nu numai de continutul de aminoacizi, dar si de digerabilitatea ei. In general, proteinele din plante protejate de invelisul de celuloza sunt mai greu digerabile. O situatie particulara o prezinta albusul de ou crud si fasolea soia, care contin anumiti factori ce se opun digestiei.

Clasificarea proteinelor

Există mai multe criterii care pot fi luate în considerare la clasificarea proteinelor:

Masa moleculara

Numarul de catene ale proteinei functionale

Omogenitatea

Solubilitatea

Astfel, dupa masa moleculara proteinele se pot clasifica in:

Oligopeptide

Polipeptide

Proteine propriuzise

Distinctia  dintre cele trei categorii nu este netă. Se considera ca oligopeptidele contin pana la zece aminoacizi, polipeptidele intre zece si cincizeci de aminoacizi iar proteinele peste aceasta valoare.

Numarul de catene este important pentru proteine deoarece este direct corelat cu complexitatea edificiului proteic. O proteina functionala poate fi monomerica sau poate fi multimerica. Proteinele multimerice pot fi formate din catene de acelasi fel ca in cazul proteinelor homomultimerice sau din catene peptidice diferite ca in cazul proteinelor heteromultimerice.

 În cazul în care omogenitatea este considerată criteriu de clasificare, proteinele se subdivid in:

Proteinele omogene formate numai din aminoacizi. Acestea se subdivid dupa forma catenei in proteine globulare si in proteine fibrilare. Proteinele fibrilare pot fi solubile (fibrinogenul din sange, respectiv actina si miozina din tesutul muscular) sau insolubile: colagenul, elastina,fibroina,keratinele.

Proteinele neomogene, conjugate sau heteroproteide. Ele sunt formate dintr-o componenta polipeptidica numita apoproteina si dintr-o componenta neproteica numita cofactor. In functie de natura acestui cofactor distingem:

Glicoproteide

Nucleoproteide

Lipoproteide. Aceasta clasa este reprezentata de conjugate proteici cu lipidele simple ori complexe sau cu produsii lor de hidroliza. Se intalnesc atat in serul si plasma sanguina cat si in constitutia membranelor celulare. Jonctiunea lipida-proteina se face prin: 1) legaturi covalente (acilarea cu un rest de acid gras a gruparilor aminice sau hidroxil libere din componenta proteica), 2) prin legaturi ionice, (componenta lipidica participa cu resturi fosfat sau aminiu- din colina- iar componenta proteica cu resturi carboxilat ori amoniu, guanidiliu etc). Pe langa acestea, stabilizarea conjugatului lipoproteic se face si prin legaturi mai slabe precum 3) legaturile de hidrogen, respectiv 4) forte van der Waals. Lipoproteidele plasmatice se sistematizeaza dupa densitate, (corelata aici cu mobilitatea electroforetica) in cinci categorii: chilomicroni, lipoproteide de densitate foarte mica (VLDL), lipoproteide de densitate intermediara (IDL), lipoproteide de densitate mica (LDL) si lipoproteide de densitate mare (HDL).

Funcțiile proteinelor

   Dintre cele patru clase de substante fundamentale ale materiei vii, proteinele sunt pe departe cele mai importante (in comparatie cu glucidele, lipidele si chiar cu acizii nucleici). Natura macromoleculara, nemaintalnita multidudine a structurilor care se regaseste intr-o functionalitate extrem de diversa, le confera un loc prioritar in raport cu alte substante biologice. Termenul de proteine (derivate de la grecescul proteios – primul), introdus de catre Jons J. BERZELIUS in 1893, subliniaza primordialitatea clasei (Irimie, 1998).

Semnificatia celor afirmate este in acord cu functiile principale indeplinite:

1. Biocataliza enzimatica. Marea majoritate a reactiilor petrecute in organismul viu sunt catalizate de macromolecule de natura proteica, numite enzime. Domeniul de actiune al enzimelor se intinde de la cele mai simple reactii, precum hidratarea dioxidului de carbon, catalizata de anhidraza carbonica, si terminand cu cele mai complexe, cum sunt cele implicate in procesele de replicare cromosomiala.Valorile specificitatii si activitatii enzimelor sunt caracteristici care le departejeaza net de catalizatorii chimici conventionali, facandu-le competitive in procese de sinteza organica.

2. Biocataliza hormonala. In prezent se cunosc o serie de hormoni cu structura polipeptidica care, secretati de celule specializate, isi exercita functia biocatalitica la nivelul celulei tinta, dupa transportul pe cai umorale . Hormonii nu sunt catalizatori in sensul strict al cuvantului. Prin reglarea nivelului unor anume metaboliti, stari, procese, toate acestea realizate prin controlul unor cai metabolice, hormonii influenteaza reactiile chimice, de unde si atributul de biocatalizatori. Insulina, hormonul homeostazei glicemice, somatostatina hormonul de reglare a cresterii, vasopresina, angiotensina, bradikinina, oxitocina etc. sunt alte exemple de hormoni peptidici.

3. Transport si stocare. Proteinele indeplinesc functia de transportori specifici pentru diferite molecule sau ioni atat in spatiile intercelulare cat mai ales prin membrane, realizand astfel selectivitatea accesului  substantelor biologic active pana in interiorul celulei. Hemoglobina, transportorul de oxigen la nivelul eritrocitelor, mioglobina, substanta care stocheaza oxigenul la nivelul celulelor musculare, transferina, care transporta ionul feros, depozitandu-l in ficat sub forma de complex cu feritina, o alta proteina, ceruloplasmina, purtatorul de cupru, albumina serica care transporta lipidele, citocromii care asigura transportul electronilor sunt numai cateva dintre reprezentantii proteinelor de transport sau stocare.

4. Coordonare a miscarilor. Natura proteica a formatiunilor contractile ale tesutului muscular, a formatiunilor motile ale flagelilor (cililor) celulelor bacteriene, determina miscari, ca raspuns la actiunea unor stimuli de natura diferita.

5. Suport mecanic al diferitelor tesuturi. Elasticitatea si rezistenta pielii este datorata colagenului, cea a vaselor sanguine elastinei, iar a fanerelor keratinei.

6. Protectia imuna. La aparitia substantelor sau corpurilor straine (virusuri, bacterii) celula reactioneaza, in functie de pozitia ei pe scara evolutiva, prin sinteza si secretia unor substante proteice, anticorpii care neutralizeaza materialul exogen.

7. Generarea si transmiterea impulsurilor nervoase. Raspunsul celulelor nervoase la diferiti stimuli este mediat de o serie de receptori de natura proteica. Rodospina, o cromproteida, este responsabila de receptia luminii la nivelul celulelor bastonase din retina. Proteinele receptoare pot reactiona la prezenta unor substante cu masa moleculara redusa precum acetilcolina si genereaza semnale la nivelul sinapselor (terminatiilor celulei nervoase), realizand comunicarea intre celule.

8. Controlul cresterii si diferentierii celulare. Se realizeaza in stransa legatura cu determinismul genetic al proteinelor. Ttranscrierea si traducerea mesajului genetic este coordonata de proteine represoare. In organismele superioare factorii de crestere, de natura proteica, asigura cresterea si diferentierea celulara. De asemenea, in organismele superioare, activitatea diferitelor celule este coordonata de hormoni printre care se disting si cei polipeptidici.

1.5 Metode de separare a proteinelor

Izolarea in stare pura si analiza proteinelor din punct de vedere structural si functional nu ar fi fost posibila fara dezvoltarea unor tehnici de mare sensibilitate si acuratete, bazate pe proprietatile fizico-chimice ale proteinelor. Tehnicile care permit separarea si analiza proteinelor se bazeaza pe marimea moleculei, solubilitate, diferenta in adsorbtie, afinitate biologica pentru alte molecule sau incarcare electrica.

Proteinele globulare, in solutie pot fi cu usurinta separate de molecule cu greutate moleculara mica prin dializa, utilizand membrane semipermeabile, care retin macromoleculele, moleculele mici trecand prin membrana in mediul de dializa.

Ultrafiltrarea permite separarea proteinelor prin trecerea solutiei, sub influenta presiunii sau a fortei centrifuge, printr-un filtru cu proprietati semipermeabile care retine macromoleculele.

1.5.1 Centrifugarea in gradient, gelfiltrarea, cromatografia

Centrifugarea in gradient de densitate sau centrifugarea zonala este o metoda de separare nu numai a proteinelor ci si a organitelor celulare sau a altor structuri macromoleculare. Tehnica consta in crearea in tubul de centrifuga a unui gradient al concentratiei de sucoza de la 20% sus la 60% jos, la baza tubului, in care mixtura de proteine sub influenta fortei centrifuge, se repartizeaza in benzi, dupa greutatea, densitatea, forma macromoleculelor.

Gelfiltrarea este o metoda simpla si foarte utila in separarea proteinelor, constand in trecerea pe o coloana cu bile fine de dextrani a mixturii proteice; proteinele cu greutate moleculara mica trec prin porii bilelor, in timp ce proteinele cu greutate moleculara mare raman in volumul de excludere si inainteaza mai rapid pe coloana.

Cromatografia pe schimbatori de ioni utilizeaza bile de dextran sau celuloza, de care sunt atasate grupari cu sarcini pozitive de suprafata (dietilaminoetil; DEAE) sau grupari cu sarcini negative (carboximetil; CM) la aceste sarcini atasandu-se proteinele potrivit incarcarii lor electrice, la pH neutru, urmand ca desorbtia lor din coloana sa se faca gradat, la gradient de pH sau molaritate.

Cromatografia de afinitate se bazeaza pe capacitatea biologica a unei proteine de a se lega necovalent de alta molecula denumita ligand, care este legata la randul ei, covalent, la o matrice solida (aragoza, silicageli, dextrani, poliacrilamina). Dupa atasarea specifica a proteinei din mixtura la ligand (atasare de tip enzima-substrat sau imunoglobulina-proteina antigen), desorbtia proteinei fixate se obtine cu eluenti specifici (glicozizi, agenti chaotropici) sau metode de elutie nespecifice (pH scazut, concentratii scazute de saruri).

O serie de metode de purificare si analiza a proteinelor se bazeaza pe proprietatea acestora de a migra in camp electric (tehnici electroforetice). Prin obtinerea in stare cat mai pura a diverselor proteine se poate ajunge ca, prin injectarea lor la alte specii (iepure, porc, capra, etc.), sa fie obtinute antiseruri specifice utilizate in laboratoarele de imunochimie. Aceste antiseruri contin imunoglobuline specifice sintetizate in urma proliferarii policlonale a plasmocitelor animalului imunizat cu proteina specifica. In ultimul timp, se utilizeaza tot mai mult imunoglobuline cu inalta specificitate sintetizate in vitro – anticorpi monoclonali – rezultate ca urmare a proliferarii monoclonale a unui singur tip de celule. Hibridomul (celula producatoare) este obtinut in urma fuziunii, in vitro a unor limfocite splenice de soarece care au proprietatea de a sintetiza imunoglobulinele monoclonale.

1.5.2 ELECTROFOREZA PROTEINELOR

Electroforeza proteinelor initiata de Tiselius (1937) se utilizeaza, dupa scopul urmarit, in doua variante: electroforeza libera (in coloana de lichid) si de zona (pe diferite suporturi).

Electroforeza libera in coloana de lichid se poate efectua intr-un vas in forma de „U” si se inregistreaza frontul de migrare al fiecarei fractiuni.

Electroforeza de zona difera, ca principiu, de precedenta, prin faptul ca ionii nu se misca liber in solutie; prin utilizarea unui „suport”, de exemplu celuloza sau derivati ai ei, bloc de amidon, gel de poliacrilamida etc., farctiunile migrate se retin in locuri bine stabilite (Bedeleanu, 1985).

Electroforeza este miscarea particulelor incarcate electric intr-un solvent cand acesta este plasat intr-un camp electric. Este o metoda foarte eficienta in separerea macromoleculeor, pentru caracterizarea componentelor unei mixturi sau pentru a izola macromoleculele dintr-o mixtura, putand fi folosita ca o metoda analitica sau preparativa. In electroforeza zonala, o cantitate mica de solutie este plasata intr-in mediu suport (hartie de filtru, agar, agaroza, acetat de celuloza, etc.). Atunci cand se aplica un potential electric tamponului, macromoleculele din solutie migreaza. Rata de migrare este determinata de energia campului electric, de rezistenta mediului de suport si de incarcarea neta a unei macromolecule la un voltaj dat; cu cat incarcarea neta este mai mare, cu atat si viteza de migrare este mai mare. In laboratorul clinic, electroforeza zonala se utilizeaza curent pentru a separa componentele serului, ale lichidului cefalorahidian, ale urinii sau a altor fluide biologice. La electroforeza serului se obtin 5 benzi majore. Prima banda (fractiune), cea mai anodica, este albumina; urmatoarea, reprezentata de α 1-globuline, contine: α 1-antitripsina, α 1-liporoteina si α 1-acid glicoproteina; a treia banda, α 2-globulinele, cuprinde haptoglobina, cerutoplasmina, α2 macroglobulina si alte globuline; a patra banda, β-globulinele, cuprinde β-liproteinele, transferina plasminogenul, componentele de complement, hemopexina; gamaglobulinele constituie cea de-a cincea banda, fiind alcatuita din imunoglobulinele IgG, IgA, IgM, IgD si IgE. Totusi unele imunoglobuline au si migrare in regiunea beta-gama si beta iar IgG se poate extinde pana in regiunea α2. De aceea, IgG monoclonala poate fi identificata din regiunea α2 pana in γ. Valorile fractiunilor proteinelor serice separate prin electroforeza pe hartie de filtru sunt redate in tabelul de mai jos. Modificarea raportului dintre diferitele fractiuni proteice separate prin electroforeza poarta numele de disproteinemii. Determinarea prin electroforeza a proteinelor serice trebuie completata prin determinari cantitative ale proteinelor individuale.

Tabel 2. Principalele proteine plasmatice (Cucuianu, 1991)

Migrarea electroforetica Proteina Concentratia plasmatica (mg/dl)

Prealbumina Prealbumina 25

Albumina Albumina 4000

Alfa-1 Alfa-1-antitripsina 280

Apolopoproteina A 200

Alfa-1-glicoproteina acida 90

Componentul C9 al sistemului

complement 8

Protrombina 5

Alfa-1-microglobulina 5

Factorul IX al coagularii 1

Factorul X al coagularii 1

Transcobalamina I 0.3

Inter-alfa Proteina S/Vitronectina 50

Alfa-2 Haptoglobina 300

Alfa-2-macroglobulina 290

Alfa-2-glicoproteina acida 60

Ceruloplasmina 35

Antitrombina III 30

Cl inhibitorul 24

Kininogenul 10

Alfa-2-plasmin inhibitorul 6

Proteina de legare a retinolului 4

Proteina de legare a tiroxinei 2

Beta Transferina 260

Apolipoproteina B* 100

Componentul C3 al sistemului

complement 80

Hemopexina 75

Componentul C4 al sistemului

complement 40

Fibronectina 33

Plasminogenul 20

Factorul B al sistemului

complement 8

Factorul XIII al coagularii 3

Factorul V al coagularii 2

Factorul VIII al coagularii 1

Beta-2-microglobulina 0,1

Gama IgG 1200

IgA 200

IgM 150

IgD 10

IgE 1

Componentul Clq al sistemului

complement 15

Prekalikreina 1

Proteina C-reactiva 0,5

1.5.3 Teste de disproteinemie

Testele de disproteinemie, numite si teste de floculare, teste hepatice sau teste de labilitate serica, cuprind un grup de teste care, desi empirice, s-au dovedit a fi foarte utile in explorarea metabolismului proteic.

Principiul acestor teste se bazeaza pe faptul ca, la tratarea serului cu o serie de reactivi, in special cu saruri ale metalelor grele, apare o turbiditate, ca urmare a precipitarii proteinelor serice, in momentul in care echilibrul lor coloidal este tulburat.

In toate cazurile, adaugarea reactivului la un ser normal, nu este urmata de nici un efect, doar in cazul serurilor anormale, unde se produce precipitare, turbiditate sau floculare.

Testele de disproteinemie (sau de labilitate coloidala) se bazeaza pe faptul ca la pH-ul de 7,4 incarcarea electrica si stabilitatea coloidala a gama globulinelor este mai scazuta decat cea a albuminelor serice. Din acest motiv in urma diluarii cu apa distilata a serului si a adaugarii de mici cantitati de agenti de precipitanti ai proteinelor se va produce o floculare care va fi cu atat mai exprimata cu cat raportul albumine/globuline va fi mai scazut.(Cucuianu, 1976)

Nici unul din testele de disproteinemie nu este complet identic cu altul in ceea ce priveste rezultatele clinice.

De exemplu, în testul cu reactiv Takata-Ara (solutie coloidala de oxid mercuric), reactivul este stabil in prezenta albuminei serice, care actioneaza ca un coloid protector. Globulinele nu au aceasta proprietate si, in cazul schimbarii raportului in favoarea globulinelor, apare floculatia. Tehnica de lucru presupune adaosul de reactiv într-un numar de 9 eprubete în care serul a fost diluat succesiv su ser fiziologic, de fiecare data in raport 1:1. Dupa agitare, se observa aspectul solutiei. Interpretarea rezultatelor se face in modul urmator: :

Daca nu se introduce nici o floculare sau se observa o slaba floculare in una sau doua eprubete (intre eprubeta 2 si 4), serul este normal.

Daca se produce flocularea neta in cel putin 3 eprubete, prima fiind eprubea a 3-a sau a 4-a, reactia este pozitiva.

Reactia este invers pozitiva daca flocularea are loc in eprubeta 4 sau in 4 eprubete consecutive si slab pozitiva daca se produce numai in 2 eprubete consecutive. Reactia este pozitiva numai in leziuni hepatice, boli infectioase, neoplazii (Mihele,1996).

Testul Takata-Hobs. Oxidul mercuric, rezultat din clorura mercurica si carbonatul de sodiu, formeaza o solutie coloidala a carei stabilitate este mentinuta constanta de albumina serica,ce actioneaza ca un coloid de protectie. Cand gama globulinele sunt crescute,sau albuminele sunt mult scazute,in solutie se produce o floculare a carei intensitate este proportionala cu cantitatea de gama globuline prezente in ser (Cucuianu 1976).

1.5.4 Determinarea proteinelor totale

Determinarea proteinelor totale se poate face prin mai multe metode, dintre care mai utilizate sunt metoda spectrofotometrica la 280 nm si cea bazata pe reactia biuretului.

Tabelul 3. Tehnicile de dozare a proteinelor

a. Dozarea proteinelor prin spectrofotometrie la 280 nm.

Principiul determinarii se bazeaza pe faptul ca aminoacizii aromatici din proteine (tirosina, triptofan, fenilalanina) absorb in ultraviolet. Absorbtia depinde de pH, maximul la 280 nm inregistrindu-se la pH=7,5. Coeficientii de extinctie depind de tipul proteinei, de aceea rezultatele au caracter aproximativ. Pe baza compozitiei proteinelor serice s-a calculat un coeficient mediu de extinctie de 10,5 iar concentratia de proteine se estimeaza pe baza legii Lambert-Beer din spectrofotometria de absorbtie moleculara. Determinarea se preteaza pentru o orientare rapida privind continutul proteic (Cucuianu, 1976).

Tabelul 4. Coeficientii de extinctie in procente (a) ai unor aminoacizi si proteine

b. Dozarea proteinelor pe baza reactiei biuretului

Proteinele si peptidele, spre deosebire de compusii azotati neproteici (creatinina, urea, acidul uric) dau cu ionul Cu 2+ in solutie alcalina un complex de culoare violeta. In prealabil se realizeaza o etalonare pe baza unor solutii standard de proteina. Reactivul contine sulfat de cupru in solutie de tartrat dublu de sodiu si potasiu (sare Seignette). Absorbanta probei se masoara la 540 nm. (Cucuianu,1976).

c. Metoda Kjeldahl

Metoda consta in incalzirea probei cu acid sulfuric, care descompune materia organica si transforma azotul organic in sulfat de amoniu. Descompunerea chimica se considera completa cind solutia devine limpede si incolora, din inchisa la culoare, cum a fost initial. Apoi, solutia este distilata de pe NaOH adaugat in cantitati mici, cind are loc conversia ionului amoniu in amoniac. Cantitatea de amoniac eliberata (corespunzatoare N existent intial in proba) este determinate prin retitrare.

Proteina + H2SO4 → CO2 + (NH4)2SO4 + SO2

(NH4)2SO4 + 2NaOH → Na2SO4 + 2NH4OH

2NH4OH + H2SO4 → (NH4)2SO4 + 2H2O

In prezent, metoda Kjeldahl este automatizata si se utilizeaza catalizatori specifici (oxid de mercur, sulfat de cupru) pentru a grabi descompunerea materiei organice.

Pe baza faptului ca proteinele contin in medie 16 % N, prin metoda Kjeldahl se poate extima continutul de proteine plasmatice.

1.6 Aspecte actuale în analiza proteinelor

Electroforeza capilara (CE), cunoscuta deasemenea ca si electroforeza capilara de zona (CZE), poate fi utilizata pentru separarea speciilor ionice pe baza sarcinii si a fortelor de frictiune. In electroforeza traditionala, analitii incarcati electric se misca intr-un lichid conductor sub influenta unui cimp electric. Introdusa in 1960, tehnica CE a fost destinata separarii speciilor pe baza raportului masa/sarcina in interiorul unei capilare scurte umpluta cu un electrolit. CE ofera rezolutie si selectivitate deosebite permitand separarea de analiti putin diferiti intre ei din punct de vedere al proprietatilor fizice.

Instrumentatie

Instrumentatia necesara pentru realizarea CE este relativ simpla. O prezentare schematica este data in Fig. 3. Componentele principale sunt recipientul de proba, sursa si recipientul de colectare, capilara, electrozii, o sursa de inalta tensiune, detectorul, sistemul de masura si prelucrare a datelor. Recipientul de proba, recipientul de colectare si capilara sunt umpluti cu un electrolit, cum ar fi o solutie apoasa tampon. Pentru introducerea probei, capatul capilarei este introdus in recipientul care contine proba si apoi in recipientul sursei (proba este introdusa prin efect capilar sau sifonare). Migrarea analitului este apoi initiata prin aplicarea unui camp electric intre recipientul sursei si cel de colectare si alimentat la electrozi de catre sursa de inalta tensiune. Toti ionii, pozitivi sau negativi, sunt impinsi prin capilara in aceeasi directie prin curgere electroosmotica (miscare a ionilor intr-un solvent prin canale foarte inguste, atunci cind este aplicat un potential). Curgerea electroosmotica este o componenta esentiala in tehnicile chimice de separare, mai ales CE. Analitii se separa prin migrarea datorata mobilitatii electroforetice si sunt detectati in apropierea extremitatii de iesire a capilarei. Semnalul detectorului este trimis la unitatea de prelucrare a datelor si in final este realizata reprezentarea grafica a semnalului detectorului in functie de timp. Speciile separate apar ca picuri cu timpi de retentie diferiti.

Figura 3: Diagrama unui sistem de electroforeza capilara

Detectia

Separarea prin electroforeza capilara poate fi detectata in mai multe moduri. Majoritatea instrumentelor comerciale se bazeaza pe absorbtia in UV si VIS. In aceste sisteme, o sectiune a capilarei este utilizata ca si celula de detectie. In general, capilarele utilizate in electroforeza capilara sunt acoperite cu un polimer pentru cresterea stabilitatii. Portiunea capilarei folosita pentru detectia UV trebuie sa fie transparenta optic. Lungimea drumului prin celula de detectie in electroforeza capilara (~ 50 micrometri) este mult mai mica decit cea in celua traditionala in UV (~ 1 cm). Conform legii Lambert-Beer, sensibilitatea detectorului este proportionala cu lungimea celulei de detectie. Pentru marirea sensibilitatii, calea optica prin celula de detectie poate fi marita prin modificarea formei (vezi figura).

 In  prezent, electroforeza capilara este considerata o metoda de mare impact in toate domeniile stiintelor vietii, permitand separarea peptidelor si proteinelor, mai ales a macromoleculelor de interes biomedical. Astfel, separarea in mediu de tampon acid prezinta avantajul protonarii coloanei, minimizand interactiunile materialului proteic cu suprafata coloanei. Astfel de abordari au permis analiza privind anomalii de structura a proteinelor (Righetti, 2001).  

Analiza proteinelor in amestecuri complexe cum sunt celulele lizate este realizata in present prin electroforeza pe gel de sodiu dodecil sulfat (SDS)-poliacrilamida . Pentru analiza structurala, fiecare proteina in spot este digerata sub actiunea proteazei iar fragmentele de peptide sunt analizate din punct de vedere al secventei prin procedeu Edman sau spectrometria de masa. Studiile de genom sunt combinate in present cu aceste studii ale proteinelor. Exista aplicatii ale electroforezei capilare pentru analiza totala a sistemelor proteice complexe sau analiza structurala a fiecarei proteine separate (Manabe, 1999).

Mobilitatile determinate experimental prin CZE (electroforeza capilara zonala) sunt utilizate in studiul denaturarii proteinelor pe un model bazat pe date teoretice fizico-chimice. Modelul este capabil sa furnizeze informatii suplimentare privind structura proteinelor pe baza datelor de mobilitate. Studiile de caz au fost realizate pentru investigarea denaturarii termice pe fericitocromul c izolat din inima de cal si respectiv lizozomi din albus de ou de gaina. (Piaggio, 2007).

Utilizarea poliaminelor ca modificatori electroosmotici s-a dovedit eficienta in cresterea rezolutiei electroforezei capilare de zona a glicoproteinelor in tuburi capilare. Eficienta a fost evaluata prin utilizarea unui tub capilar acoperit cu poliacrilamida fata de un tub capilar clasic (Kubo, 2001).

Cele mai multe analize de electroforeza a proteinelor in laboratoare clinice sunt in prezent efectuate pe gel de acrilamina sau gel de agaroza. Aceasta metoda este acum contestata de electroforeza capilara (CE) din cauza potentialului acesteia din urma pentru automizare si de eficacitate ridicata alaturi de timpul scurt de analiza. Caracteristica de automizare a electroforezei capilare in sine, combinat cu capacitatea de interfatare cu alte functii robotizate, recomanda aceasta tehnica pentru analiza proteinelor in matrici psihologice precum serul, urina, lichidul cerebrospinal ( Oda, 1997).

In ultimii ani, electroforeza capilara (CE) a devenint o technica de analiza cu multe aplicatii in studiul proteinelor din mancare si a peptidelor. Acest articol descrie metodele CE existente in analiza unor produse precum: lapte, oua, carne si peste (proteine). Marile dezvoltari in aplicatia cu CE pentru a solutiona diferite probleme in technologiile de alimente, precum asistarea in procese de calitate, autenticitate si control al alimentelor provenite de la animale, sunt considerate.(Recio, Ramos, López-Fandiño, 2001).

Biotehnologia a inregistrat o crestere rapida in ultimii ani in special datorita dezvoltarii si succesului unor medicamente pe baza de proteine pentru o gama larga de disfunctii. Similar medicamentelor obisnuite, monitorizarea medicamentelor pe baza de proteine in privinta proprietatilor fizico-chimice si a caracteristicilor de lot este esentiala. Electroforeza pe placa de gel continua sa aiba o importanta aparte; recent, CE a inceput sa deschida noi cai pentru analiza proteinelor la scara industriala. Acest articol isi focalizeaza atentia asupra electroforezei proteinelor punand accent pe medicamentele bazate pe proteine (Little, 2006).

Proteinele din alimente joaca un rol important in procesul de nutritie si sanatatea umana. De aceea, noi metode de analiza sunt in continuare dezvoltare pentru separarea cit mai completa a proteinelor. Electroforeza capilara de inalta performanta (HPCE) este una din cele mai noi metode de analiza aplicata in separarea proteinelor din alimente. Accentul se pune pe metodologii de separare a celor 3 mari grupe de proteine din alimente: carne, lapte si cereale (Bean, 2001).

Cromatografia electrocinetica micelara

Incepind din anii `80, a fost prezentata o tehnica de analiza care sa permita instrumentatiei din electroforeza capilara (CE) separarea speciilor neutre precum si a celor ionice. In cromatografia electrocinetica micelara (MEKC), probele sunt separate pe baza distributiei diferite intre o faza micelara pseudo-stationara si o faza mobila apoasa (Tanabe, 1984). In cele mai multe aplicatii, MEKC este realizata in capilare deschise in mediu alcalin pentru generarea unei curgeri puternice electroosmotice. Instrumentatia si metodele de detectie sunt ca si cele din CE. Diferenta este ca solutia contine un surfactant la o concentratie mai mare decit concentratia critica micelara (CMC). Peste aceasta concentratie, surfactantii monomeri sunt in echilibru cu micelele. Dodecilsulfatul de sodiu (SDS) este cel mai comun surfactant utilizat in aplicatiile MEKC. Caracterul anionic al gruparilor sulfat determina ca surfactantul si micelele sa aiba mobilitate electroforetica in sens contrar directiei curgerii electroosmotice. Ca rezultat, surfactantul si micelele migreaza incet, desi miscarea neta este spre catod. In timpul separarii MEKC, analitii se distribuie intre interiorul hidrofob al micelei si solutia tampon hidrofila (vezi figua 4).

Figura 4: Distributia analitilor (A) pe baza hidrofobicitatii lor.

Analitii care sunt insolubili in interiorul micelei vor migra cu viteza curgerii electroosmotice uo, si pot fi detectati la timpii de retentie ai solutiei tampon, tM. Analitii care se solubilizeaza complet in micele (analiti hidrofobi) vor migra cu viteza micelara uc, si vor fi eluati la timpul final de elutie, tc.6

Figure 5: Tehnici de marire a drumului optic prin capilara: a.) celula sferica; b.) celula in Z (tub aditional).

Fluorescenta poate fi de asemenea utilizata pentru detectie pentru probe care au un semnal propriu de fluorescenta sau sunt modificate chimic pentru a contine grupe legate fluorescente. Acest mod de detectie ofera mare sensibilitate si selectivitate. Instrumentatia pentru detectia prin fluorescenta este mai complicata. Metoda necesita ca fascicolul optic sa fie focalizat pe capilara. Fluorescenta indusa cu laser (LIF) a fost folosita in CE oferind limite de detectie de 10-18 – 10-21 mol. Sensibilitatea este datorata intensitatii mari a radiatiei incidente si focalizarii exacte a acesteia pe capilara.

Pentru identificarea componentilor din proba, electroforeza capilara poate fi cuplata direct cu spectrometria de masa sau alte tehnici spectroscopice. In multe sisteme, iesirea capilarei este introdusa intr-o sursa de ioni care utilizeaza ionizarea. Ionii rezultati sunt analizati de spectrometrul de masa.

Separarile de tip Electroforeza capilara, bazate pe microcipuri cuplate cu LIF (fluorescenta indusa cu laser) sunt instrumente cu mare capabilitate de separare, detectare si determinare a biomuleculelor. Electroforeza capilara cu anumite configuratii are potentialul de a detecta un numar mic de molecule sau chiar si o singura molecula, datorata coerentei spatiale ridicate a laserului, sursa care permite excitarea unor volume foarte mici de proba cu o eficienta ridicata (García-Campaña, 2007).

Numeroase articole reprezinta un sprijin pentru dezvoltarea de metode selective, reproductive si validate de electroforeza capilara. Cu accent pe aplicatiile farmaceutice si biologice, utilizarea cu success a electroforezei capilare este sustinuta de numarul mare de referinte bibliografice. In prezent exista un volum mare de informatii privind natura suporturilor pentru solutiile tampon, surfactantii utilizati in cromatografia capilara electrocinetica micelara (MEKC), selectori de chiralitate, aditivi ai solutiilor tampon, medii polimerice de separare si alte astepecte care sa usureze analiza in matrici complexe (Watzing, Degenhardt, 1998).

Cele mai noi rezultate privind aplicatiile unor metode cromatografice variate (cromatografie gaz-lichid, lichi-lichid) pentru separarea si determinarea aminoacizilor si peptidelor cu numar mic de aminoacizi in stare pura sau matrici complexe sunt discutate si comparate (Cserhati, 2007).

O lucrare recenta ofera detalii ale interactiunii intre compusii farmaceutici si purtatori pe baza electroforezei capilare de afinitate si a cromatografiei electrocinetice. Au fost calculati coeficientii de partitie ai produselor farmaceutice intre micele si faza apoasa pe baza masurarii timpului de migratie, cand au fost cunoscute concentratia critica micelara si raportul de faze. Marimile termodinamice, precum modificarile de entalpie si entropie ale solubilizarii micelare au fost calculate pe baza dependentei de temperatura a coeficientilor de partitie. Volumele partiale specifice au fost masurate pe baza imprastierii fascicolului luminos incident. Logaritmul coeficientilor de partitie si factorul de capacitate in sistemul micelar au fost corelate cu logaritmul coeficientilor de partitie n-octanol/apa (Reinhard, 2001).

Recent au fost semnalate progrese in dezvoltarea de aplicatii ale metodelor de inalta performanta prin migrare capilara, incluzand electroforeza zonala, isotacoforeza, focalizarea isoelectrica, electroforeza de afinitate, cromatografia electrocinetica, pentru analiza, prepararea si caracterizarea fizicochimica a peptidelor. Metoda electromigrarii capilare poate fi aplicata la: analiza conventionala calitativa si cantitativa pentru determinarea puritatii, determinarea in biomatrice, monitorizarea schimbarilor fizice si chimice si conversiile enzimatice, aminoacizii si analiza secventiala (Kaika,

2001).

Au fost propuse doua modele fizico-chimice pentru estimarea razei hidrodinamice si a sarcinii nete a unei proteine atunci cand sunt disponibile mobilitatea electroforetica pentru un anumit protocol de lucru, setul de valori pK ale aminoacizilor si date din Baza de Date a Proteine. Aceste modele permit deasemenea interpretarea corecta a efectului solventilor asupra razei hidrodinamice a proteinelor si sarcina neta. Verificarea modelelor s-a facut pe cinci proteine: lizozom, nucleaza stafilococica, anhidraza carbonica umana, anhidraza carbonica de bovina, albumina serica umana si valorile de predictie au fost comparative cu cele date in literatura pentru sarcinile nete ( Piaggio, 2005).

CE este aplicata cu bune rezultate la analiza produselor farmaceutice si in aplicatii biologice. Imbunatatirile constante ale tehnicii vizeaza selectivitatea, precizia, reducerea timpului de analiza, limita de detectie, validarea pentru diferite analize. Deasemenea, solutii tampon, surfactantii din MEKC, selectorii chirali, aditivi, medii polimerice de separare, modificatori ai curgerii electroosmotice, sunt aspecte care trebuie optimizate pentru a face fata matricilor complexe ale probelor (Degenhardt, Kunkel, 1998).

Aceasta publicatie descrie in amanuntime o discutie despre interactiunea dintre compusii farmaceutici vehiculand folosirea capilarelor electroforeze de afinitate si cromatografia de emulsie cinetica. Coeficientii de partitionare ai medicamentelor au fost calculati între micele si o faza de masurare a timpului de migrare. Acesti coeficienti au furnizat concentrarea criticã de micele si raportul de faza. Cantitatile termodinamice, cum ar fi entalpia si entropia au fost calculate din dependenta coeficientilor de repartitie a temperaturii. Cateva volume specifice au fost masurate folosind logaritmul difuziei luminii. Logaritmul de calcul a partitiei coeficientilor si a factorilor de capacitate in sistemul micelar a fost corelat cu logaritmul n-octano si coeficientii de partietie a apei (Wätzig, 1998).

Electroforeza capilara are un puternic impact in toate domeniile stiintelor vietii, inclusiv domeniile de cercetare ale biomedicinei si biotehnologiei precum si in practica clinica prin realizarea separarilor eficiente de peptide si proteine. Separarea in medii tampon acide, izoelectrice are avantajul de a protona peretele coloanei de silice, minimizind interactiunea materialului proteic cu suprafata coloanei. In acest fel se pot aplica gradienti de tensiune mari, datorita conductivitatilor mici. Aplicatiile privesc analize de structura a proteinelor (Righetti, 2001).

.

CAPITOLUL II

2.2 Partea experimentala

  2.2.1 Obiectiv

Lucrarea practica a avut ca obiectiv determinarea proteinelor serice prin electroforeza si corelarea rezultatelor cu anumite afectiuni.

2.2.2 Prelevarea si prelucrarea probei

S-a recoltat sangele de la pacient, apoi s-a separat serul de cheag, prin centrifugare. In acest fel a fost indepartat fibrinogenul. Au fost utilizate probe de ser proaspat separat.

Inainte de lucru, serul s-a diluat in raport 1:6 cu solutia tampon de lucru.

2.2.3 Principiul metodei

Intr-o solutie tampon cu pH 8,6 -9 proteinele serice sunt in stare ionizata.

Daca intr-o asemenea solutie se creaza o diferenta de potential intre doi electrozi dispusi la o anumita distanta, moleculele proteinelor se indreapta spre polul pozitiv si viteza de migrare depinde mai ales de marimea particulelor si de sarcina lor electrica.

2.2.4 Instrumentatie

Determinarile s-au efectuat cu aparatul de electroforeza CORMAY.

Linia de electroforeza CORMAY este un echipament modern, foarte performant, utilizat pentru separarea si analiza electroforetica a proteinelor, lipoproteinelor, enzimelor, hemoglobinei din ser sau din alte medii (plasma, urina, lichid cefalorahidian, lichide sinoviale, etc.).

Toate caracteristicile acestui aparat, respectiv metoda de separare pe care o foloseste (pe gel de agaroza, care confera separarii o foarte buna rezolutie), timp scurt de migrare (20 de minute pentru proteine si lipoproteine), posibilitatea de a efectua migrarea simultan pe doua folii de gel si analiza fractiunilor migrate pe densitometru controlat de microprocesor si prevazut cu monitor (care face ca rezultatele sa se poate obtine simplu, cu mare precizie si repede) recomanda acest aparat pentru toate laboratoarele clinice, indiferent de marime, atat pentru activitati de rutina cat si pentru activitati de cercetare.

Acest aparat cuprinde:

Camera de migrare

Alimentator – Sursa de curent continuu stabilizat

Densitometru

Monitorul densitometrului

Imprimanta externa

Camera de migrare

Cuva de electroforeza universala S-20 este conceputa pentru orice tip de electroforeza la tensiune joasa.

Este construita prin injectare din policarbonat, de aceea este greu de spart. Este formata din 5 parti:

Compartimentul

Capacul

Suportul tip punte

Electrozi de platina

Conectori cu dispozitiv de siguranta

Suportul tip punte are doua randuri de elemente de sustinere corespunzator pentru dimensiunile suporturilor rigide ale membranelor sau gelurilor utilizate de obicei.

Cuva are un sistem de protectie care previne deschiderea accidentala a capacului atunci cand conectorii electrici sunt fixati. (Imaginea camerei de migrare)

Procedura de lucru

Se deschide cuva si se scoate suportul punte

Se toarna tamponul in fiecare din cele doua compartimente ale cuvei, conform tehnicii de lucru.

Se ia gelul, cu degetele plasate in zona de mijloc a partilor anodica si catodica si se apasa usor astfel incat sa se indoaie.

Se introduce folia in interiorul elementelor de sustinere ale suportului-punte, cu gelul in jos.

Se introduce suportul-punte in cuva. Tamponul trebuie sa depaseasca marginea foliei cu un centimetru pe fiecare parte.

Se pune capacul.

Se fixeaza conectorii la cuva. Acestia nu pot fi fixate daca capacul nu este pus corect. Acest lucru protejeaza operatorul de accidente.

Intretinere

Dupa fiecare utilizare, tamponul trebuie aruncat si toate componentele cuvei clatite cu apa distilata.

Se usuca apoi componentele pe o hartie de filtru.

Electrozii sunt usor de demontat pentru a fi clatiti pentru a elimina depunerile de tampon. Aceasta operatiune trebuie facuta cu multa grija pentru a nu degrada firele de platina.

Sursa de curent continuu stabilizat CORMAY ZE-3P

Sursa de curent stabilizat pentru electroforeza ZE-3P este conceputa pentru alimentarea cu curent continuu stabilizat a unei cuve de electroforeza.

Conditii de operare

Alimentare: 220V +/- 10%; 50Hz

Temperatura ambianta: +15- +35 ˚C.

Umiditate: <80%

Densitometrul

Densitometrul este un instrument semiautomatic controlat de un microprocesor care permite masurarea cantitativa a fractiunilor rezultate prin separarea electroforetica a proteinelor, lipoproteinelor si enzimelor.

Posibilitatile de lucru ale densitometrului sunt:

Masoara absorbanta luminii transmise sau a luminii reflectate de-a lungul caii de masurare care poate fi de lungime maxima de 180 mm.

Reda pe monitor graficul absorbantei

Calculeaza automat valoarea numerica a fractiunilor proteice si afiseaza pe monitor valorile numerice procentuale si absolute ale acestor fractiuni, apreciind aceste valori fata de valori fiziologice normale preprogramate de utilizator.

Daca este nevoie impartirea in fractiuni poate fi corectata manual si rezultatele recalculate.

Poate determina distanta intre fractiuni, intinderea fiecarei fractiuni si absorbanta maxima a fiecarei fractiuni.

Densitometrul este inzestrat cu un monitor si o imprimanta, ceea ce simplifica efectuarea analizelor de laborator clinic. Acest densitometru permite citirea fractiilor separate atat de substrat transparent (gel de agaroza) cat si pe substrat opac.

Este prevazut cu programe de lucru pentru analiza gelurilor de agaroza pe care s-a executat separarea proteinelor (cu identificarea de 5 sau 6 fractiuni) si a lipoproteinelor precum si cu spatiu de memorie pentru inca alte programe utilizator.

Conditii de mediu

Ca orice aparat de laborator, densitometrul trebuie utilizat in conditii de temperatura de 10-40˚C, umiditate relative de pana la 80% in atmosfera fara gaze agresive chimic.

Monitorul densitometrului

Densitometrul CORMAY DS-2 este prevazut de fabricant cu un monitor grafic monocrom de 10 inci, pe care sunt prezentate graficele obtinute de microprocesorul densitometrului prin prelucrarea datelor densitometrice a foliei cu agaroza.Acest monitor grafic este alimentat prin intermediul densitometrului, astfel incat la pornirea densitometrului se aprinde automat si monitorul.

Imprimanta externa

Este o imprimanta rapida compatibila Epson/IMB, conectata la densitometru. Ea permite tiparirea cu acuratete a graicului obtinut pe monitor si a tuturor valorilor calculate la electroforeza.

2.2.5 Reactivi

Reactivii necesari electroforezei

Acid acetic glacial

Etanol 96%

Prepararea reactivilor

Tamponul de lucru: se dilueaza continutul unei sticlute cu tampon concentrat cu apa bidistilata, aducandu-se la 1000 ml.

Colorantul: continutul unei fiole cu solutie concentrata de colorant se dilueaza la 300 ml apa distilata; cu cei 300 de ml solutie de colorant de lucru se pot colora 10 placi cu gel.

Solutia de fixare: se amesteca 135 ml etanol, 30 ml acid acetic glacial si 135 ml apa distilata; aceasta solutie trebuie preparata cu cel putin 15 minute inainte de folosire. Cu cei 300 de ml de solutie de fixare se pot prelucra 5 placi cu gel.

Solutie de decolorare: continutul unui flacon cu solutie de decolorare se dilueaza la 10 l cu apa distilata (sau 10 ml de solutie concentrata de decolorare se dilueaza la 1 l cu apa distilata). Se utilizează pentru toate solutiile de apa bidistilata de cat mai buna calitate.

Conditii de pastrare

Placile de agaroza se pastreaza la temperatura camerei in pozitie orizontala (cu gelul in sus), inchise ermetic. Placile de agaroza nu se pastreaza la frigider.

Solutia de fixare se pastreaza la temperatura camerei maxim 3 luni de la preparare, in flacoane inchise ermetic.

Tamponul concentrat si colorantul se pastreaza la temperatura camerei.

Tamponul diluat (de lucru) se pastreaza la temperatura camerei o perioada de timp corespunzatoare datei indicate pe flacon. A nu se utiliza daca este tulbure.

Solutia de colorare se pastreaza la temperatura camerei pana la data expirarii inscrisa pe flacon.

Solutia de decolorare se pastreaza o luna la temperatura camerei.

2.2.6 Conditii si mod de lucru pentru testul de separare a proteinelor din ser pe gel de agaroza

Setul este realizat pentru separarea electroforetica a proteinelor din ser pe gel de agaroza si permite obtinerea a 6 fractiuni proteice tipice:

Albumina

Alfa-1-globuline

Alfa-2-globuline

Beta-1-globuline

Beta-2-globuline

Gama globuline

Setul de electroforeza a proteinelor contine:

10 placi cu agaroza (pentru 100 separari)

Tampon concentrat veronal (3 sticlute x 75 ml)

Colorant negru amido concentrat (1 fiola x 75 ml)

Solutie decoloranta concentrata (1 fiola x 100 ml)

Benzi de plastic cu fante pentru aplicarea serului (10 bucati)

Benzi de hartie de filtru (20 bucati)

Modul de lucru

Se toarna cate 150 ml de tampon de lucru in fiecare parte a camerei de migrare (in cazul cuvelor de migrare Cormay CU-1 sau S-20) sau cate 45 ml (pentru sistemul Beckman).

Se scoate gelul din pachet fara a se atinge suprafata si se pune pe o foaie de hartie de filtru; pentru a se evita uscarea gelului si aparitia unor probleme analitice, ambalajul gelului va fi deschis numai imediat inaintea folosirii gelului, atunci cand toate solutiile au fost preparate si serurile au fost diluate.

Folosind benzile de hartie de filtru din kit, se usuca zona de gel unde se vor depune probele de ser; se indeparteaza banda de hartie de filtru de pe gel imediat ce s-a umezit.

Se aseaza banda de plastic cu fante pe zona uscata anterior, astfel incat cele doua fante de orientare ale benzii de plastic sa se aseze pe cele doua puncte albastre de pe placa cu gel. Se apasa usor cu degetul pe banda de plastic astfel incat aceasta sa adere la fel ferm, pe intreaga suprafata.

Se aplica 5µl de ser (diluat) pe fiecare fanta de pe banda si se lasa sa se absoarba timp de 5 minute de la aplicarea ultimei probe.

Se elimina excesul de ser ramas neabsorbit cu banda de hartie de filtru din kit.

Se indeparteaza banda de plastic cu fante de pe gel; aceasta se spala cu apa distilata si se usuca la temperatura camerei. Benzile de plastic pentru aplicare se pot refolosi.

Se aseaza placa de gel in camera de migrare cu gelul in jos si cu zona unde a fost aplicat serul in apropierea catodului (-).

Se acopera camera de migrare cu capacul si se conecteaza cablul de furnizare de curent de la sursa.

Se declanseaza electroforeza la 100 V, timp de 20 de minute (Cormay CU-1, Cormay S-20), sau timp de 15 minute la 100V (Beckman).

Dupa derularea electroforezei se scoate placa (sau placile) din camera de migrare si se imerseaza timp de 15 minute in solutie de fixare in pozitie verticala. Pentru aceasta se folosesc cuvele verticale din setul S-20 furnizat de firma Cormay, sau alt sistem similar (exemplu: Beckman).

Se pune in pozitie orizontala in etuva la temperatura maxima de 80˚C pana la uscare. Timpul de uscare depinde de temperatura de uscare. Se poate folosi pentru uscare rapida un uscator de par, orientand fluxul de aer catre folia cu gel, de la o distanta de circa 15 cm.

Se introduce placa in colorant timp de 10 minute, apoi se decoloreaza in 2-3 bai succesive de decolorant. Pentru aceste operatiuni se pot folosi cuvele verticale din setul S-20, sau aceste operatiuni se pot executa cu gelul in pozitie orizontala, folosind de exemplu placi Petri ca baze de colorare si respective de spalare.

Se spala placa decolorata in apa distilata si se lasa in pozitie verticala la temperatura camerei sau la 80˚C pana la completa uscare. Daca este necesar, se sterge partea din spate a placii (fara gel) cu o hartie umeda.

Cauze frecvente ale separarii necorespunzatoare

Aparitia de mici cristale in urma uscarii placii, poate fi cauzata de folosirea unei solutii de fixare expirata.

Decolorarea incomplete a placii (in afara zonei fractiunilor) poate fi cauzata de uscarea insuficienta a gelului dupa fixare.

Separarea scurta poate fi cauzata de o uscare a gelului in perioada de depozitare.

Aparitia de fractiuni neregulate poate fi cauzata de o aderare neuniforma a benzii de aplicare a serurilor pe gel in momentul aplicarii.

Interpretarea rezultatelor

Kit-ul Cormay Gel Protein 100 confera o separare foarte buna a fractiunilor proteice, mai ales a beta-1 si beta-2 globulinelor; aceasta separare buna se obtine mai ales cand serul este proaspat, deoarece fractiunea beta-2 dispare in cursul pastrarii serului. In unele cazuri pot apare fractiuni intermediare fractiunilor principale, de exemplu intre alfa-2 si beta-1 (beta lipoproteine).

Prezenta de proteine monoclonale (mai ales in zonele beta si gama) este o indicatie pentru folosirea kit-ului pentru imunofixare (Cormay Gel IFE).

Rezultatele obtinute la electroforeza celor 5 probe de ser au fost interpretate tinand cont de valorile medii de referinta ale laboratorului (stabilite cu instrumentul de lucru si kit-ul Cormay) precum si de valorile considerate normale.

Valori medii de referinta:

Albumina 52-65%

Alfa-1-globuline 2-4.5%

Alfa-2-globuline 11-15%

Beta globuline 6-13%

Gama globuline 10-19%

Se recomanda fiecarui laborator sa-si stabileasca propriile valori normale.

Valori normale: proteinele serice totale 6.6-8.6 g dL (Bibl. )

Albumine:52 – 62%

Globuline:38 – 48%

Alfa-1-globuline: 2-5%

Alfa-2-globuline: 6-9%

Beta globuline: 8-11%

Gama globuline: 14-21%

Implicatii clinice

HIPERPROTEINEMII (cresteri ale proteinelor totale):

Aparente deshidratari (“pseudohiperproteinemii”)

Reale:

inflamatii cornice

macroglobulinemie Waldenstrom

leucemii

miclom multiplu

colagenoze; sarcoidoza

boli hepatice autoimmune

HIPOPROTEINEMII(scaderi ale proteinelor totale)

Aparente: hiperhidratari

Reale:

deficit de aport (malnutritie)

deficit de absorbtie, malabsorbtie

deficit de sinteza: ciroza hepatica

pierderi: sindrom nefrotic, arsuri, hemoragii acute; peritonite

alcoholism amiloidoza

DISPROTEINEMII (modificari patologice a raportului diferitelor fractiuni proteice):

– valori scazute ale albuminelor

deficit de aport

deficit de absorbtie (malabsorbtie)

deficit de sinteza

pierderi proteice (albuminuri)

– α1 si α2 globulinelor (valori crescute)

inflamatii acute

colagenoze

neoplasme

sindrom nefrotic (cresteri ale alfa-2-globulinelor)

– valori crescute ale gama globulinelor:

proliferare reactiva sau tumorala a plasmocitelor producatoare de imunoglobuline (mielom multiplu)

inflamatie cronica

endocardita bacteriana

ciroza hepatica

– valori scazute ale gama globulinelor

malnutritie

sindrom nefrotic

Tabelul 5. Rezultate experimentale la electroforeza proteinelor pe gel de agaroza

Tabel 6. Interpretarea rezultatelor obtinute la electroforeza proteinelor

Concluzii

Analiza rezultatelor din Tab. 5 a permis identificarea aspectelor patologice privind nivelul diferitelor tipuri de proteine in plasma.

Electroforeza este un mijloc util de determinare a proteinelor serice, in completarea testelor de disproteinemie, care furnizeaza numai informatii calitative.

Instrumentatia utilizata furnizeaza rezultatele in forma accesibila pentru interpretare si permite stocarea lor pentru monitorizarea afectiunii, atunci cand aceasta exista.

Testul de electroforeza trebuie completat prin alte teste enzimatice ( exemplu: TGO, TGP) si de o imagistica medicala (exemplu: ecografii).

Bibliografie

Bean S. R., Lookhart G. L. (2001). High-performance capillary electrophoresis of meat, dairy, and cereal proteins. Electrophoresis, 22, 4207-4215.

Bedeleanu, D.D., Manta I., Biochimie medicală și farmaceutică, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1985.

Cserhati T. (2007).Chromatography of amino acids and short peptides.New advances Biomedical Chromatography. Electrophoresis, 21, 780-796.

Cucuianu, M., Biochimie Clinică, Ed. Dacia, Cluj-Napoca, 1977.

Cucuianu, M., Russ, H.G., Niculescu, D., Vonica, A.,  Biochimie. Aplicații Clinice, Editura Dacia, 1951, I:39

García-Campaña A. M., Taverna M., Fabre H. (2007). LIF detection of peptides and proteins in CE. Electrophoresis, 28, 208-232

Irimie, D.F. Elemente de biochimie I, Ed. Erdelzi Hirado, Cluj-Napoca, 1998.

Kaika V. (2001). Recent advances in capillary electrophoresis of peptides. Electrophoresis, 22, 4139-4162.

Kubo K., Hattori A. (2001). Assessment of the capillary zone electrophoretic behavior of proteins in the presence of electroosmotic modifiers: Protein-polyamine interaction studied using a polyacrylamide-coated capillary. Electrophoresis, 22, 3389-3394.

Law S. W., Zhao J. H., Li F. Y. S., (2005). On-line sample enrichment for the determination of proteins by capillary zone electrophoresis with poly(vinyl alcohol)-coated bubble cell capillaries. Electrophoresis, 26, 3486-3494.

Little J. M., Paquette D. M., Roos K. P. (2006). Electrophoresis of pharmaceutical proteins: Status quo. Electrophoresis, 27, 2477-2485.

Manabe T., (1999). Capillary elctrophoresis of proteins for proteomic studies. Electrophoresis, 20, 3116-3121.

Mihele D., Pavlovici M., Biochimie Clinica, Ed. Medicala, 1996.

Mihele D, Biochimie Clinica, Ed. Medicala, 1997.

Oda P. R., Clark R., Katzmann J. A., Landers J. P. (1997). Capillary electrophoresis as a clinical tool for the analysis of protein in serum and other body fluids. Electrophoresis, 18, 1715-1723.

Piaggio V.M., Peirotti B. M., Deiber J.A. (2005). Effect of background electrolyte on the estimation of protein hydrodynamic radius and net charge through capillary zone electrophoresis. Electrophoresis, 26, 3232-3246.

Piaggio V.M., Peirotti B. M., Deiber J.A. (2007). On the application of CZE to the study of protein denaturation. Electrophoresis, 28, 2223-2234

.

Recio I., Ramos M., López-Fandiño R., (2001). Capillary electrophoresis for the analysis of food proteins of animal origin. Electrophoresis. 22, 1489-1502.

Reinhard N., Mrestani Y. (2001). Use of affinity capillary electrophoresis for characterizing pharmaceutical colloidal vehicle systems thermodynamically. Biopharmaceutics & Drug Dispositio, 22, 265-271.

Righetti, P.G., (2001). Capillary electrophoretic analysis of proteins and peptides of biomedical and pharmacological interest. Biopharmaceutics & Drug Disposition, 22, 337-351.

Terabe , S. Otsuka, K. Ichikawa, K., Tsuchiya, A., Ando, T. (1984). Electrokinetic separations with micellar solutions and open-tubular capillaries. Anal. Chem. 56, 111-113.

Tsai S. W., Loughran M., Suzuki H., Karube I. (2004). Native and sodium dodecyl sulfate-capillary gel electrophoresis of proteins on a single microchip. Electrophoresis, 25, 494-501.

Watzig, H.,Degenhardt M., Kunkel A., (1998). Strategies for capillary electrophoresis: Method development and validation for pharmaceutical and biological applications. Electrophoresis, 19, 2695-2752.

Skoog, D.A. Holler, F.J. Nieman, T.A. Principles of Instrumental Analysis, 5th ed. Saunders college Publishing: Philadelphia, 1998.