EFECTUL TRATAMENTULUI CU CITOSTATICE ASUPRA MATERIALULUI GENETIC UMAN: INVESTIGAȚII CITOGENETICE ȘI MOLECULARE [310955]

UNIVERSITATEA DIN BUCUREșTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

EFECTUL TRATAMENTULUI CU CITOSTATICE ASUPRA MATERIALULUI GENETIC UMAN: INVESTIGAȚII CITOGENETICE ȘI MOLECULARE

Coordonator științific: Absolvent: [anonimizat]. Dr. [anonimizat]

2017

CUPRINS

INTRODUCERE

Citostaticele reprezintă o categorie de factori mutageni de natură chimică care la ora actuală sunt utilizați pe scară largă în tratarea diferitelor tipuri de cancere. Astfel a [anonimizat], precum și identificarea mecanismelor celulare și moleculare prin care organismele răspund la acțiunea acestor factori chimici.

[anonimizat]. Aberațiile cromozomiale sunt utilizate la ora actuală ca biomarkeri pentru evaluarea efectelor biologice dăunătoare ale agenților chimioterapici.

[anonimizat], [anonimizat]. Este absolut necesar de determinat influența administrării de citostatice asupra repetiției telomerice având în vedere faptul că telomerele sunt structuri cu funcții esențiale în stabilitatea și replicarea cromozomilor. Telomerele au o [anonimizat], pierderea până la un anumit nivel, a unora dintre repetiții nu le alterează iremediabil funcția. [anonimizat], [anonimizat], integritatea structurală și funcțională a cromozomului eucariot. [anonimizat], telomerele mai scurte acționând ca un ceas mitotic. Menținerea integrității cromozomilor și a funcției normale a telomerelor, sunt vitale pentru evoluția normală a celulei.

[anonimizat]. [anonimizat]. [anonimizat] a telomerelor.

[anonimizat], existând la ora actuală o multitudine de metode de studiu ce permit acumularea de noi date experimentale privind aceste aspecte de interes ([anonimizat]-FISH, [anonimizat], PRINS etc.).

Alegerea temei acestei lucrări de licență a [anonimizat], dar și de la cantitatea redusă de informații referitoare la acest subiect în literatura de specialitate. Primul pas în elaborarea studiului a fost reprezentat de stabilirea cu precizie a [anonimizat] s-a organizat, ulterior, programul de cercetare.

Scopul tezei de licență este determinarea efectului tratamentului cu citostatice asupra materialului genetic uman prin investigații citogenetice și moleculare.

Obiective generale:

Evidențierea efectelor determinate de administrarea de diferite doze de doxorubicinăla nivel cromozomial utilizând tehnici de citogenetică clasică.

determinarea cu ajutorul tehnicii Real Time PCR a numărului de repetiții ale secvenței (TTAGGG)n pentru identificarea modificărilor moleculare induse de doxorubicinăla nivel telomeric.

Lucrarea a fost redactată în 6 capitole. În partea teoretică (primele 3 capitole) sunt prezentate informații cu privire la tipurile de citostatice ca agenți chimioterapici anticanceroși, cu accent pe doxorubicinăca citostic ce a fost utilizat în realizarea etapelor experimentele; sunt evidențiate rolul și structura telomerelor și telomerazei la nivel organismic și sunt enunțate și caracterizate pe scurt principalele tehnici ce pot fi utilizate pentru studiul efectelor citostaticelor la nivel citogenetic dar și molecular la nivel telomeric.

Partea de rezultate personale prezintă materialele și metodele utilizate în studiu precum și rezultatele și discuțiile generate de tehnicile de citogenetică clasică cât si de reacția de Real Time PCR.

Lucrarea a fost realizată în cadrul Departamentului de Genetică al Facultății de Biologie.

CAPITOLUL 1

Chimioterapicele anticanceroase

Chimioterapicele anticanceroase se mai întalnesc și sub denumirile de antitumorale, antineoplazice, oncostatice, citostatice, citotoxice, etc. și au rolul principal să distruga cu selectivitate celulele canceroase, selectivitatea de actiune justificand termenul de chimioterapic (“glont fermecat” – Paul Erlich). Citostaticelor actioneaza prin perturbarea proceselor care stau la baza multiplicarii celulare, ele functionand preferential asupra celulelor cu o rata mare de multiplicare. Deci selectivitatea de actiune este datorata tocmai faptului ca celulele canceroase se multi plica cu o viteza mai mare decât celulele normale ale organismului. Există însă și o serie de celula normale ce au rata crescuta de diviziune: celulele hematopoietice, celulele tubului digestiv, foliculul pilos, spermatogeneza, sau dezvoltarea embrio-fetala astfel ca este de asteptat ca în tratamentului cu citostatice să fie afectate și aceste tipuri celulare.

În afara de viteza de multiplicare mai conteaza în chimioteratia anticanseroasa și gradul de sincronizare al diviziunii celulare. Cu cât celulele se multiplica mai sincron cu atat

sunt afectate mai mult de medicamentele anticancerose. celulele imunocompetente stimulate antigenic reprezinta una dintre categoriile de celule cu multiplcare sincriona, aceasta facand ca medicamentele anticanceroase să deprime preferential imunitatea, în special pe cea de tip celular.

Din punct de vedere molecular, majoritatea medicamentelor anticanceroase actioneaza asupra aparatului genetic celular.

Unele citostatice impiedica, direct sau indirect, formarea acizilor nucleici.

Există citostatice dependente de faza de diviziune:

Analogi ai bazelor azotate și acest caz determina aparitia de acizi nucleici nefunctionali ibntercalandu-se în timpul replicarii în locul bazelor azotate normale, fie inhiba prin diverse necanisme sinteza de baze azotate. Aceste medicamente omoara celulele canceroase în faza S a ciclului celular de diviziune, cand are loc sinteza de ADN.

Există și citostatice care altereaza tubulina și implicit formarea fusului de diviziune ceea ce duce la blozarea diviziunii celulare în metafaza.

Citostatice independente de faza: sunt medicamente anticanceroase care actioneaza asupra ADN-ului preformat. O astfel de categorie este reprezentata de agentii alcilanti care se fixeaza de acidul nucleic caruia ii modifica practic structura chimica, spre exemplu prin alchilare. Aceste medicamente actioneaza practic nespecific, alterand ADN-ul tuturor celulelor. Ele actioneza însă strict asupra celulelor aflata în diviziune, celulele aflate în G0 avand capacitatea să isi repare leziunile induse de administrarea de citoastatice

La ora actuala se realizeaza o serie de asocierii de tipuri diferite de citostatice din punst de vedere al actiunii astfel incat să se determina sincronizarea ciclului celular astfel incat efectul asocierii să fie superior actiunii lor independente. Aceste combinatii aduc un plus de eficacitate dar și un plus de siguranta deoarece nu se asociaza de regula medicamente care se potenteaza din punct de vedere al reactiilor adverse.

În urma actiunii diferitelor tipuri de citostatice, toate studiile din domeniu au evidentiat aparitia unor procese mutagene, cancerigene sau teratogene. Cancerogenitatea se poate manifesta prin dezvoltarea, ca urmare a unui tratament anticanceros, a unui alt tip de cancer decât cel tratat.

Ca și în cazul administrarii oricarui agent chimioterapic și medicamentele anticancerose pot determina aparitia fenomenului de rezistenta. Rezistenta se dezvolta prin aparitia unor

mutatii genetice care fac celulele canceroase să fie mai putin inf1uentate de citostatice.

În functie de tipul de citostatic și de capacitatea acestuia de a fi metabolizat administrarea se realizeaza diferentiat. Majoritatea medicamentelor citostatice se absorb suficient de bine astfel incat pot fi administrate pe cale orala. Unele citostatice însă impun administrare parenterala, strict intravenoasă. Există însă și cazuri în care administrarea se realizeaza local direct pe leziune în cazul unor cancere ale pielii sau intracavitar în cancerul de vezica urinara.

Eficacitatea citostaticelor este foarte diferita în functie de tipul de cancer, fiind mai eficace în cancerele sistemice decât în cancerele de organ.

Reactiile adverse sunt numeroase și grave, unele dintre acestea sunt comune depinzând de mecanismul de actiune al agentului chimioterapic. Afectarea maduvei hematopoietice poate genera frecvent leucopenie, trombocitopenie, mai putin frecvent anemie. Un alt efect general intalnit este scaderea imunitatii caracteristica responsabila de alterarea apararii organismului impotriva infectiilor.

1.1.Tipuri de agenti chimioterapici anticancerigeni

Agentii alchilanti

Sunt citostatice cu grupari alchil reactive capabile să interacționeze cu gruparile chimice bogate în electroni și determinand alchilarea acestora. Acesti agenti actioneaza prferential cu acizii nucleici pe care ii alchileaza fie la nivelul bazelor azotate, fie la nivelul gruparilor fosfat, fie 1a nivelul proteinelor asociate (Lind M.J., M.J., (2008). Cel mai frecvent este intalnita alchilarea guaninei.

Principalele grupe chimice ale agentilor alchilanti sunt: azotiperite (ciclofosfamida, clormetina, melfalanul, clorambucilul etc), etilenamine, sulfonoxizi (busulfan), nitrozouree (carmustina și lomustina) și triazene (dacarbazina).

Citostatice care afecteaza ADN-ul preformat

Aceste citostatice afecteaza moleculele de ADN preformate avand proprietati asemanatoare agentilor alchilanti.

Exemple: cisplatina, procarbazina, dactinomicina, doxorubicina, daunorubicina sau bleomicina, etopozida, tenipozida etc.

Antimetaboliții

Antimetaboliții reprezinta un grup de medicamente anticanceroase care au structura chimicii asemanatoare unor metaboliți precursori ai acizilor nucleici.

Analogii purinici: ex. mecaptopurina, azatiopurina, tioguanina

Analogii pirimidinici: fluorouracilul, citarabina/citozinarabinozida,

Substantele care interfera metabolismul acidului folic: metotrexatul

Tot ca antimetaboliților sunt incluse și hidroxicarbamida sau hidroxiureea.

Toxinele fusului de diviziune

Aceste citostatice altereaza structura proteinelor componente ale fusului de diviziune alteran astfel diviziunea celulare.

Exemple: vincristina, vinblastina, paclitaxe

Anticanceroase eu mare specificitate de actiune

Actioneaza preferential asupra unor elemente biochimice și fiziologice care diferentiaza celula canceroasă de celulele normale ale organismului. Exemple: asparaginaza, acidul retinoic, imatinibul (glivec), trastuzumab (Fulga, 2015).

1.2 Doxorubicina

Cunoscuta și ca: adrimedac, adriamicina, hidroxdaunorubicină, hidroxidunomicină este un medicament chimioterapic anticanceros (din categoria citostaticelor care afecteaza ADN-ul preformat) utilizat pentru tratamentul cancerului.

Doxorubicina este folosită pentru a trata multe tipuri de cancer, inclusiv leucemia, cancerul de oase, sân, ovare, testicular, tiroid, cap și gât, splină, stomac, țesuturilor ușoare, boala Hodgkin’s, tumori Wilms și neuroblastome. Este adesea utilizata împreună cu alțiagenți chimioterapeutici.

Doxorubicina se administrează prin injectare în vena. Reacțiile adverse frecvente includ pierderea părului, supresia măduvei osoase, vărsăturile, erupția cutanată și inflamația gurii. Alte efecte secundare grave pot include reacții alergice cum ar fi anafilaxie, leziuni cardiace, leziuni tisulare la locul injectării, rechemări la radiații și leucemie asociată tratamentului.

Doxorubicina se află în familia de medicamente antracicline și antibiotice antitumorale.

Istoric doxorubicina

În anii 1950, o companie de cercetare italiană, Farmitalia Research Laboratories, a început să caute compuși anticanceri din microbii solului. O probă de sol a fost izolată din zona din jurul Castelului Monte, un castel din secolul al XIII-lea. O nouă tulpină de Streptomyces peucetius, care a produs un pigment roșu, a fost izolată și un antibiotic din această bacterie a fost eficient împotriva tumorilor la șoareci.
Deoarece un grup de cercetători francezi au descoperit același compus în aproximativ același timp, cele două echipe au numit compusul ,,daunorubicin’’, combinând numele ,,Dauni’’, un trib preroman care a ocupat zona Italiei de unde compusul a fost izolat, cu cuvântul francez ,,rubin’’, rubis, descriind culoarea.

Studiile clinice au început în anii 1960, iar medicamentul a avut succes în tratarea leucemiei acute și a limfomului. Cu toate acestea, până în 1967, s-a recunoscut că daunorubicina poate produce toxicitate cardiacă fatală (Tan C și colab. 1967).

Cercetatorii de la Farmitalia au descoperit curand ca schimbarile în activitatea biologică ar putea fi făcute prin schimbari minore în structura compusului. O tulpină de Streptomyces a fost mutagenizata folosind N-nitroso-N-metil uretan, iar această nouă tulpină a produs un antibiotic diferit. Ei au numit acest nou compus ,,Adriamicină’’, după Marea Adriatică, iar numele a fost ulterior schimbat în ,,doxorubicină’’ pentru a se conforma convenției de numire stabilite (Arcamone F. și colab., 1969). Doxorubicina a prezentat o activitate mai bună decât daunorubicina împotriva tumorilor la șoarece și, în special, a tumorilor solide. De asemenea, a prezentat un indice terapeutic superior, dar cardiotoxicitatea a rămas.

Doxorubicina și daunorubicina împreună pot fi considerate a fi compuși prototip pentru antracicline. Studiile ulterioare au condus la numeroase alte antibiotice antraciclinice sau analogice, iar acum există peste 2.000 de analogi cunoscuți ai doxorubicinei.

Până în 1991, 553 dintre aceștia au fost evaluați în cadrul programului de screening al Institutului Național al Cancerului (NCI).

Mecanism de actiune la nivel de ADN gemonic total

Doxorubicina se intercaleaza și interfera cu sinteza ADN și ARN (Tacar și colab., 2013).

Doxorubicina interacționează cu ADN-ul prin intercalare și inhibarea biosintezei macromoleculare. Aceasta inhibă progresia topoizomerazei II, o enzimă care relaxează ADN, pregătindu-l pentru transcriere (Pommier și colab., 2010). Doxorubicina stabilizează complexul topoizomerazei II după ce a rupt lanțul ADN pentru replicare, împiedicând dublul helix să fie restabilit și, prin urmare, oprind procesul de replicare. Partea cromoforă plană aromatică a moleculei se intercaleaza între două perechi de baze ale ADN-ului, în timp ce cele sase pentoze sunt dispuse în curbura minoră a ADN și interacționează cu perechile de baze dispuse în vecinatatea imediata a locului de intercalare (fig. 1)

Prin intercalare, doxorubicină poate induce evacuarea histonelor din cromatina activă transcripțional.

Ca rezultat general al actiunii Doxorubicinei prpcesele reparatorii ADN, epigenomul și transcriptomul sunt dereglate (Pang și colab., 2013).

De asemenea, administrarea de doxorubicina poate crește producția de radicali liberi de tip chinonă, contribuind astfel la citotoxicitatea să.

Așa cum am mentionat anterior, în urma administrarii de doxorubicină s-a constatat ca aceasta poate produce toxicitate cardiacă fatală. Ca urmare s-au realizat o serie de studii pentru a se evidentia modul în care actioneaza aceasta la nivel mitocondrial pe ADN-ul deteriorat. Cardiotoxicitatea indusă de antracicline (doxorubicina fiind unul dintre ele) limitează potențialul terapeutic al acestor agenți, dar mecanismele care conduc la cardiotoxicitate rămân controversate. Șoarecii transgenici lipsiți de topoizomeraza mitocondrială I (Top1mt) au fost mult mai sensibili la cardiotoxicitatea doxorubicinei, decât au fost cei care au exprimat această enzima (Zhang S și colab. 2012). O concluzie foarte importantă este că deteriorarea ADN-ului mitocondrial joacă probabil un rol major în cardiotoxicitatea mediată de doxorubicină. Această concluzie oferă un cadru pentru reconcilierea multor modele contradictorii cu privire la modul în care apare acest efect secundar critic al antraciclinelor și oferă noi abordări pentru predicția potențială a cardiotoxicității antraciclinei. Cele două ipoteze importante care au condus spre citotoxicitatea antraciclinei sunt (I) antraciclinele acționează prin vizarea topoizomerazelor și (II) determina producerea mediată de fier a speciilor reactive de oxigen (ROS). Metabolismul doxorubicinei a fost studiat intens, iar doxorubicina și metaboliții săi generează o varietate de efecte celulare care conduc la generarea de ROS, modificări ale metabolizării fierului și modificări ale semnalizării Ca 2+ (Sobek S și colab. 2013). Cardiotoxicitatea pe termen scurt, cât și cea cronică a doxorubicinei este cel mai clar observată în efectele asupra mitocondriilor, mai concret asupra ADN-ului mitocondrial (Zhang S și colab. 2012).

1.3 Efectele mutagene ale administrării de citostatice

Citostaticele, incadrate în categoria agentilor mutageni chimici actionează în mod direct sau indirect asupra materialului genetic determinad diferite tipuri de mutatii. Ca urmare în acest capitol am realizat o trecere în revista a principalelor mutatii care pot să apara sub actiunea agentilor mutageni.

Mutațiile reprezinta sursă principala a variabilității. Ele apar în urma rezultatului acțiunii diferitilor factori mutageni chimici, biologici, fizici sau erorilor de replicare.

Mutabilitatea asigură proprietatea materialului genetic de a se modifca şi de a transmite modificările descendenţilor.

Capacitatea mutagenă reprezintă capacitatea agentului de a determina apariția mutațiilor.

Clasificare mutații

După cantitatea materialului genetic afectat, mutațiile pot fi:

genice – cea mai mică unitate de mutație numită muton este perechea de nucleotide. Mutația genică se mai numește și mutație punctiformă;

cromozomale (structural cromozomale);

genomice (numeric cromozomale –poliploidii/aneuploidii)

După tipul de celulă în care se produc mutațiile, acestea pot fi:

somatice, afectând celulele corpului și generând o clonă de celule mutante derivate prin diviziuni succesive, pornind de la o celulă somatică care a suferit o mutație, aceste mutații dispar o data cu dispariția organismului și nu se transmit generațiilor următoare.

gametice (germinale), afectând materialul genetic din celulele liniei germinale. Acestă mutație se transmite prin gameții generațiilor următoare.

După tipul de genom afectat, mutațiile pot fi:

nucleare, când afectează genomul nuclear,

extranuclear sau citoplasmatice, atunci când afectează genomurile extranucleare (din mitocondrii și din cloroplaste);

După mărimea efectului fenotipic, mutațiile pot fi:

micromutații (efecte fenotipice mici, greu sesizabile);

macromutații (efecte fenotipice extinse, ușor observabile).

Mutațiile care afectează viabilitatea sunt:

letale (se mai numesc și mutații interzise, ele conducând la moartea individului, chiar din momentul apariției – moarte genetică)

subletale (semiletale) compatibilă cu viața în stare hemizigotă

viabile;

Din punct de vedere al necesităților nutriționale, se întâlnesc mutante auxotrofe care au cerințe diferite față de tipul normal numit prototrof. Tipul normal (sălbatic) sau prototrof, poate crește pe medii minimale. Mutantele auxotrofe pot crește pe mediu minimal, numai dacă la acesta se adaugă anumiți produși (aminoacizi, nucleotide, vitamine, etc) pe care mutanta respectivă nu îi poate sintetiza singură. Bacteriile de tip sălbatic sunt sensibile la fagi și la antibiotice, pe când cele de tip mutant sunt rezistente la fagi și la antibiotice.

După manifestare în fenotip, mutațiile sunt:

dominante – se manifestă ori de câte ori există, indiferent de prezența (starea heterozigotă Aa) sau absența (starea homozigotă AA ) a alelei recesive;

semidominante – alelele ce constituie perechea de factori ereditari se exprimă deopotrivă într-o proporție mai mult sau mai puțin egală;

recesive, se manifestă numai în condiție homozigotă, adică atunci când alela recesivă este în dublu exemplar – aa, respectiv în absența alelei dominante A (a+).

După sensul modificării genelor, mutațiile pot fi:

înainte ( forward m. ) când alela de tip sălbatic (A sau a+) devine alelă nouă (a)

(A a a+a-)

înapoi ( back m. ), când sensul mutației este de la alela nouă (a) la alela de tip sălbatic (A sau a+)

Mutațiile genice, numite și mutații punctiforme apar în urma unor microleziuni în structura ADN (fig. 2), reprezentate de:

Uneori, în cazul unor mutații silențioase, mutațiile genice nu alterează lanțul polipeptidic, dar alteori, cum este cazul mutațiilor nonsens, acestea duc la o modificare radicală a structurii  polipeptidului (tabel nr. 1).

Mutațiile missense – mutația unei singure baze în matrița ADN duce la schimbarea unui aminoacid din structura polipeptidului final, exemplu: glicina este înlocuită cu arginina. Avand în vedere ca structura noului aminoacid inclus nu este asemanatoare cu a celui inlocuit, aceasta poate provoca probleme în funcționarea polipeptidului mutant.

Mutațiile neutre sunt reprezentate de acel tip de mutații missense în care noul aminoacid inclus este similar chimic cu cel înlocuit. Polipeptidul rezultat nu va fi atat de diferit ca structură și funcție de cel original (atat glicina, cât și alanina sunt aminoacizi nepolari).

Mutațiile silențioase sunt acele mutații în care înlocuirea unei baze azotate din structura ADN nu conduce la modificări în lanțul polipeptidic, acest lucru fiind posibil datorită faptului ca în urma substituției se ajunge la un codon  nou, dar care codifică același aminoacid. Deci, aceste mutații nu pot fi identificate prin analiza secvenței proteinei.

Mutațiile nonsens sunt mutații care duc la înlocuirea unui codon codificator al unui aminoacid cu unul din cei trei codoni stop, aceasta determinând o terminare timpurie a translației, generând de regulă, peptide mai scurte și nefuncționale (Gavrila, 2003).

Tabel nr. 1 – Clasificarea mutatților genice în funcție de effect

(modificat dup :https://www.google.ro/search?q=mutatii+punctiforme)

NORMAL

MISSENSE MUTATION

MUTATII NEUTRE

MUTATII SILENTIOASE

MUTATII NONSENS

Macroleziunile sunt modificări mai extinse în materialul genetic și sunt reprezentate prin:

pierderi ale unor segmente cromozomale;

duplicații ale unor segmente cromozomale;

inversii;

translocații sau relocări de segmente cromozomale

În afară de modificările strict structurale, pot apărea și modificări ale numarului de cromozomi. Acestea însă nu sunt în mod obligatoriu, semn al efectului mutagenilor fizici, chimici sau biologici.

Aneuploidiile

În cazul aneuploidiilor, indivizii au pe lânga numarul diploid de cromozomi un numar de cromozomi în plus sau în minus. Această modificare apare în momentul în care cromozomii  eșuează în segregare în timpul meiozei (non disjunctie).

Tipuri de aneuploidii:

Monosomie: absența unui cromozom dintr-o pereche.

Trisomie: prezența a trei copii ale unui anumit cromozom.

Poliploidiile

Constau în multiplicarea numarului n de cromozoni ai complementului. Poate să apară ca urmare a eșuării activității fusului de diviziune de a segrega cromozomii în grupuri separate. Starea de poliploidie este întâlnită la mai multe organisme care, deși sunt considerate diploide, au stșri poliploide numai în anumite tesuturi.

Există doua tipuri de poliploidie :

Autopoliploidie– multiplicarea numarului propriu de cromozomi,

Alopoliploidie- cromozomii provin de la specii diferite

Dacă modificarea survenită nu periclitează viața celulei, atunci ea se reproduce și se transmite, inducând mutații cromozomiale.

Restructurările cromozomiale pot fi clasificate în:

Micronuclei – nuclei mici, adiționali, formați prin excluderea unor fragmente acentrice de cromozomi sau chiar a unor cromozomi întregi în timpul diviziunii, ca urmare a alterării structural-funcționale a centromerilor.

Deleții interstițiale sau terminale – pierderea unui fragment din interiorul cromozomului sau de la capătul acestuia, cu formarea de fragmente acentrice.

Inversii para și pericentrice – desprinderea unui fragment para sau pericentric și realipirea lui la cromozomul inițial, dar nu în poziția inițială ci inversat.

Translocații – constau în translocarea unui fragment dintr-un cromozom pe altul omolog sau neomolog.

Apariția de cromozomi dicentrici – rezultă prin fuziunea telomerelor cu distrucții aparținând cromozomilor omologi sau neomologi.

Apariția de cromozomi inelari – fuziunea telomerelor cu distrucții, aparținând aceluiași cromozom.

Duplicații – dublarea unor segmente de cromozomi prin atașarea fragmentelor desprinse de la cromozomul pereche.

Interschimburi – translocații telomeră-la-telomeră și sinapse somatice ale cromatidelor cromozomilor omologi sau neomologi.

Double minutes – rezultă în urma amplificării genice în condiții anormale (fig. 3) (Gavrilă și colab., 2003).

CAPITOLUL II

Telomere, telomerază

Avand în vedere faptul ca telomerele joaca un rol fundamental în mentinerea stabilitatii cromozomiale și genomice și în contextul în care citostatice s-a dovedit a actiona ca agenti mutageni la nivel cromozomial, ne-am propus să trecem în revista pe scurt elementele de baza ce tin de structura și functiile telomerelor și telomerazei.

2.1 Telomere

În anii 1930, J.H. Muller a introdus termenul de telomeră, doar pe baze genetice și înainte de a se cunoaste semnificația ADN-ului.

Denumirea de telomeră derivă de la cuvintele grecești telos = capăt și meros =parte, desemnând astfel capetele cromozomului eucariot.

J.H.Muller a afirmat că telomera reprezintă un segment cromozomal care conține telogene, adică gene responsabile de determinare a caracterului monopolar la brațul cromozomal. Ipoteza a fost confirmată pe baza cercetărilor de mutageneză efectuate la Drosophila melanogaster. Contrastul dintre instabilitatea evidentă a cromozomilor cu capete rupte și stabilitatea remarcabilă a cromozomilor integrii, a generat ipoteza existenței la capătul natural al cromozomului a unei structuri specializate. O alterare în acest loc este insoțită de instabilitatea cromozomului. Dacă în urma iradierii are loc ruperea capetelor cromozomilor, ei vor deveni instabili, urmand fuzionarea capetelor rupte. Astfel, se vor genera cromozomi inelari și dicentrici. Pentru evoluția normală a celulei este vitală menținerea integrității cromomilor și a funcției normale.

Prin tehnici speciale de tratare a cromozomilor: metoda Vossa, colorare Giemsa se realizează evidențierea telomerelor. Se va evidenția heterocromatina asociată telomerelor cromozomilor, rezultănd benzi T. Dispariția pattern-ului de benzi a permis evidențierea structurii particulare a telomerelor.

În prezent cu ajutorul tehnicii FISH utilizînd, probe de ADN telomeric marcate cu fluorocromi se pot evidenția telomerele.

În interiorul nucleului există o orientare clară a telomerelor cromozomilor față de centriolii citoplasmatici. Prin polarizarea telomerelor, în Profaza I a meiozei la animale și la plante, cromozomii se vor deplasa spre o regiune a nucleului formând, o stuctură cu aspect de buchet. În descrierea cromozomului organizator genomic (GOC), telomerele au fost evidențiate a deține un rol important: reorganizează structura supracromozomală a fiecăreia dintre cele doua genomuri haploide din nucleul fiu și orientează cromozomii spre poli. Mai târziu, în Pachiten, în puncte adiacente, telomerele cromozomilor omologi și complexul sinaptonemal format între cei doi cromozomi omologi ai bivalentului meiotic, sunt atașate la memebrana internă a anvelopei nucleare.

Organizarea unei telomere a cromozomului eucariot este constituită din regiuni diferite. Astfel, va există o parte usor colorată, numită eutelomeră, cât și un capăt extrem al cromozomului, ce se poate colora puternic cu tehnici speciale precum bandare T. Această parte terminală s-a numit protelomeră. Partea cea mai subțire a cromozomului o reprezintă eutelomera, în timp ce protelomera este formată din trei perechi de cromomere, de mărime variabilă la diferiți cromozomi.

Telomerele constau în secvențe repetitive hexanucleotidice conservate, bogate în G și T (T sau A)m(G)n, asociate cu proteine non-histonice (Cech, 1993).

La marea majoritate a speciilor de eucariote analizate de cercetători, secvența de ADN telomeric este simplă, similară și repetată în tandem (tabel nr. 2)

Tabel nr. 2 Secvența repetiției telomerice la diferite grupe de organisme

(Telomerase Database-http://telomerase.asu.edu/sequences_telomere.html)

Repetitiile telomerice simple au o catena bogată în G, cu o mare specificitate de orientare în raport cu capătul cromozomului. Spre capătul dublexului ADN, de la 5’ la 3’ este orientată catena ADN telomeric bogată în G, iar capătul său 3’ depăsește cu 12 – 16 nucleotide catena complementară.

Posibilitatea separarii sale ca ADN satelit telomeric prin ultracentrifugare izopicnică este data de asimetria moleculară a ADN telomeric, ce reiese din prezența multitudinilor de resturi de G care determină pe baza de complementaritate, o multitudine de resturi de C în cea de a doua catenă.

Funcția unei telomere poate fi iremediabil alterată dacă din structura acesteia se pierd mai multe repetiții, depașindu-de un nivel. La vertebrate, stabilitatea unei telomere este asigurată de mii de perechi de nucleotide (O’Sullivan și colab., 2010).

Secvențele asociate telomerelor sunt, după cum se precizează în denumire, un tip particular de secvențe telomerice. Acestea prezintă, la speciile studiate, o diversitate de lungimi, succesiuni de nucleotide și complexități. Au fost numite Tas (telomere associated sequence), iar semnificația funcțională și evolutivă a acestora nu se cunoaște. Repetițiile tipic telomerice se găsesc spre terminalul cromozomal, iar repetițiile telomerice degenerate se află spre domeniile telomerice ce se apropie de centromer. Determinarea dispunerii într-un gradient orientat spre terminalul cromozomului a fost posibilă prin analiza secvențelor telomerice clonate în YAC (Murnane și colab., 2012). Existența repetițiilor telomerice reprezintă substratul molecular al heterocromatinei telomerice care a putut fi evidențiată prin tehnica bandării T. Repetițiile subtelomerice sunt blocuri de 100 pâna la 1000 de repetiții scurte aranjate în tandem.

Repetițiile telomerice interstițiale se pot găsi și la distanțe mari fată de capetele cromozomilor, de exemplu în apropierea centromerului. Aici sunt formate din repetiții degenerate, cu un domeniu de aproximativ 500 perechi de baze, dispuse în tantem și separate de secvențele repetate, nefiind înrudite cu repetițiile telomerice (Draskovic și colab., 2014 ).

La nivelul nucleului, ADN-ul telomeric este complexat cu proteine structurale, care formează complexul shelterin. Acest complex asigură protecția capetelor cromozomilor față de repararea necorespunzătoare a ADN-ului atunci când telomerele nu sunt alungite și facilitează la nevoie alungirea telomerelor sub acțiunea telomerazei (Bolzán, 2012). La mamifere complexul este alcătuit din 6 proteine: TRF1 și TRF2 (TRF=Telomeric Repeat binding Factor) (Sfeir și colab., 2012), TIN2 (TIN2=TRF1 Interacting Nuclear factor 2) (Nandakumar și Cech, 2013), POT1 (POT1=Protector of Telomeres 1), RAP1 (RAP1=Repressor/Activator Protein 1) (Martínez și Blasco, 2010), TPP1 (O'Connor și colab., 2006; Kibe și colab., 2010) (fig. 5).

Lungimea telomerelor este menținută de un proces dinamic de scurtare și prelungire a telomerelor.  Telomerele sunt pierdute progresiv cu fiecare rundă de diviziune celulară, pierzând aproximativ 20-300 bp de secvențe datorită "problemei terminalizării replicării reprezentată de incapacitatea ADN polimerazei de a replica ADN de la capetele cromozomilor liniari. Eroziunea sau scurtarea replicativă este mecanismul principal pentru pierderea repetitiilor telomerice, ceea ce duce la senescența replicativă a celulelor.

2.2 Telomeraza

Pentru a evita scurtarea telomerelor, unele celule activează telomeraza, o transcriptază inversă (o polimerază ADN dependentă de ARN) care alungește cromozomii prin adăugarea de secvențe TTAGGG la capătul cromozomilor. Telomeraza este o proteină alcatuita din 2 subunitati: din subunitatea polipeptidica (TERT) și subunitatea ARN (TERC) (fig. 6)

Deși este inactivă în majoritatea celulelor somatice, telomeraza este activă în liniile de celule imortalizate, în celulele germinale, în celulele stem, în limfocite activate și în majoritatea celulelor tumorale analizate până în prezent.

Pierderea funcției enzimatice a telomerazei duce la scurtarea progresivă a telomerelor în timp, la dispariția ADN telomeric detectabil, la formarea fuziunilor cromozomilor telomeră la telomeră, urmată în final de oprirea creșterii sau chiar moartea celulelor.

Pe lângă menținerea lungimii telomerelor, telomeraza este, de asemenea, implicată în alte procese celulare care nu sunt direct legate de funcția telomerelor, acestea incluzând reglarea expresiei genelor, proliferarea celulara, apoptoza și semnalizarea celulară, adeziunea și migrarea.

Toate aceste activități ale telomerazei sunt considerate a contribui semnificativ în procesul de carcinogeneză. De fapt, reglarea în sens ascendent sau reactivarea telomerazei este o caracteristică critică în peste 90% din cazurile de cancer. Din această cauză, telomeraza a fost o țintă primordială pentru dezvoltarea terapiilor eficiente împotriva cancerului.

CAPITOLUL III

Tehnici citogenetice și moleculare de analiză a efectelor administrării de citostatice asupra genomului uman

Evaluarea efectului citostaticelor asupra telomerelor umane a necesitat aplicarea unor tehnici specifice. Selectarea celor mai fezabile tehnici, care să permită stabilirea unor corelații între doza de citostatic și lungimea telomerelor a presupus, într-o etapă inițială, realizarea unui screening al metodelor descrise în literatura de specialitate.

3.1 Tehnici de citogenetică clasică aplicate pentru evidentierea telomerelor

Caracterizarea initiala a complementului cromozomial cât și pricipalele tipuri de restrcturari cromozomale produse de diferite tipuri de agenti mutageni se realizeaza la ora actuala utilizand coloratia clasica cu Giemsa. Ulterior pot fi aplicate diferite tipuri de bandari cromozomiale (Bandare G, Bandare Q, Bandare R, andarea NOR, Bandarea T). Dintre acestea cea care este utilizata cu precadere pentru evidentierea structurii telomerice este bandarea T.

Bandarea T (telomerică) este o variantă a bandării R. Bandarea terminala sau telomerică a fost descoperita și raportată de Dutrillaux (Dutrillaux,1973), care a folosit două tipuri de denaturare termică controlată urmată de colorarea cu Giemsa sau acridil orange. În bandare T este utilizat un tratament termic dar și chimic mai restrictiv al cromozomilor, prin acesta se diminuează colorarea cromozomilor aceștia rămând colorați doar la telomere, care sunt rezistente la căldură (Gersen și colab., 2005).

3.4 Tehnici de citogenetica moleculara aplicate pentru evidentierea și cuantificarea lungimii telomerelor

Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH)

Prin intermediul tehnicii FISH sunt detectate și localizate secvențe specifice de ADN din structura cromozomilor (Lansdorp și colab., 1996). Metoda FISH permite cuplarea directă (în situ) a unei sonde oligonuclotidice cu secvența telomerică. Tehnica standard implică: obținerea de metafaze, denaturarea ADN-ului cromozomial, hibridizarea cu sondă oligonucleotidică sintetică marcată fluorescent și vizualizarea la microscopul cu fluorescență și/sau prin intermediul unui sistem de captare imagini..

Cuantificarea efectivă a lungimii telomerelor se realizează prin tehnica denumită Q-FISH (quantitative FISH). Tehnica a fost implementată de Lansdorp și colab., în 1996, care au utilizat o sondă PNA (peptide nucleic acid) în locul sondei oligonucleotidice din FIS-ul clasic. Imaginile înregistrate sunt analizate cantitativ (Lansdorp și colab., 1996).

3.3 Tehnici moleculare utilizate pentru analiza lungimii telomerelor

Real Time PCR

Reactia de Real Time PCR, cunoscută și ca reacție de PCR cantitativă (qPCR), este una dintre tehnicile actuale aplicate în laboratoarele de biologie moleculară din intreaga lune. Tehnica este bazata pe reactia PCR cuplata cu monitorizarea în timp real a amplificarii moleculei de ADN vizate, și nu la sfârșitul acesteia, ca în PCR convențional.

Metode pentru detectarea produsilor de PCR în timp real sunt: ​​(1) marcarea cu coloranți fluorescenți nespecifici care se pot intercala cu orice ADN dublu catenar și (2) utilizarea de sonde de ADN specifice secvenței constând din oligonucleotide care sunt marcate cu fluorocrom reporter care permite detectarea numai după hibridizarea probei cu secvența să complementară.

Informațiile minime pentru publicarea metodelor experimentale cantitative ce utilizeaza PCR în timp real (MIQE) sugerează ca abrevierea qPCR să fie utilizată pentru PCR cantitativ în timp real și că RT-qPCR să fie utilizata pentru Revers Transcrierea-qPCR (Bustin și colab., 2009). Acronimul RT-PCR desemnand, în mod obișnuit, reacția de reverstranscriere cu plata cu cuantificarea în timp real, dar nu toți autorii aderă la această convenție (Kirstin și Saunders, 2009).

Real Time PCR se desfașoară în echipamente specializate cu capacitatea de a ilumina fiecare probă cu un fascicul de lumină cu cel puțin o lungime de undă specificată și de a detecta fluorescența emisă de fluorocromul excitat.

Procesul PCR constă, în general, dintr-o serie de schimbări de temperatură care se repetă de 25 – 50 de ori. Aceste cicluri sunt formate din trei etape: prima, la aproximativ 95 ° C, permite separarea lanțului dublu al acidului nucleic. A doua, la o temperatură de aproximativ 50-60 ° C, permite legarea primerilor cu matrita ADN. În timp ce a treia, la o temperatură cuprinsă între 68 și 72 ° C, facilitează polimerizarea efectuată de ADN polimeraza (Sambrook și Russel 2001).

Datorită dimensiunii mici a fragmentelor ce sunt amplificate prin Real Time PCR, ultima etapă este omisă deoarece enzima este capabilă să realizeze elongarea inclusiv în timpul trecerii dintre etapa de aliniere și etapa de denaturare.

Temperaturile și timpii utilizați pentru fiecare ciclu depind de o gamă largă de parametri, cum ar fi: enzima folosită pentru sinteza ADN-ului, concentrația de ioni bivalenți și de deoxiribonucleotide (dNTPs) prezente în reacție și de temperatura de legare a primerilor.

Cuantificarea în cadrul reactiei de Real Time se poate realiza relativ sau absolut.

Cuantificarea absolută furnizează numărul exact de molecule de ADN țintă prin comparație cu ADN standard, folosind o curbă de calibrare. Prin urmare, este esențial ca eficiență de amplificare a reactiei PCR să fie aceeasi pentru eșantion și pentru standard (Dhanasekaran și colab., 2010).

Cuantificarea relativă se bazează pe utilizare de gene interne de referință pentru a determina diferențele de expresie ale genei țintă respective variatiile numarului de repetitii ale unei secvente.

Motivul utilizării uneia sau mai multor gene housekeeping este corectarea variațiilor nespecifice, cum ar fi diferențele în cantitatea și calitatea AND-ului/ARN-ului utilizat, care pot afecta eficiența întregului proces PCR. Aspectul cel mai important al procesului este acela că gena de referință trebuie să fie stabilă. Selectarea acestor gene de referință a fost efectuată în mod tradițional în biologia moleculară, utilizând studii calitative sau semi-cantitative cum ar fi examinarea vizuală a gelurilor ARN, densitometria Northern blot sau PCR semi-cantitativă. La ora actuala este posibil să se efectueze o estimare mai detaliată pentru multe organisme folosind micro matriceleADN. Cu toate acestea, cercetările au arătat că amplificarea majorității genelor de referință utilizate variază în funcție de condițiile experimentale. Prin urmare, este necesar să se efectueze un studio metodologic statistic inițial solid pentru a selecta cea mai potrivită gena de referință. Au fost elaborați un număr de algoritmi statistici care pot detecta ce genă sau gene sunt cele mai potrivite pentru utilizare în condițiile date.

Utilizări diagnostice:

Diagnosticul prin PCR calitativ este aplicat pentru a detecta rapid prezența aciziilor nucleici care sunt asociati cu boli infecțioase, cancer și anomalii genetice.

Tehnica Real Time PCR poate fi utlizată totodată, și pentru a determina raportul dintre numărul de copii telomerice (T) și copia unei singure gene (S), raport care este proporțional cu lungimea secvenței telomerice individuale, studii cu aplicabilitate în contextul în care variabilitatea de lungime telomerică este corelata la ora actuala cu diferite boli infecțioase, cancere și efect al diverșilor agenți mutageni (Cawthon, 2002; Gavrilă, 2004).

Analiza fragmentelor de restricție terminale (TRF) prin Southern blot (SB)

Tehnica se bazează pe restrictarea ADN genomic cu endonucleaze de restricție HinfI sau RsaI la fragmente, care apoi sunt separate prin electroforeză în gel de agaroză și transferate pe membrane de nitroceluloză sau nylon. Măsurarea lungimii telomerelor se bazează pe analiza lungimii fragmentelor de restricție terminale (TRF). TRF sunt fragmentele mari de ADN ce rămân nerestrictate în urma digestiei ADN-ului cu endonucleaze de restricție care sunt hibridizate cu sonde marcate radioactiv sau neradioactiv. Dimensiunea și abundența TRF-urilor rezultate este măsurată cantitativ cu densitometrul (Oexie, 1998; Norwood și Dimitov, 1998).

Flow-citometrie cuplată cu hibridizarea fluorescentă în situ (Flow-FISH)

Echipa lui Lansdorp și Rufer (1998) a combinat tehnica FISH cu citometria în flux pentru a măsura lungimea telomerelor în cadrul unor populații celulare caracterizate imunologic (Rufer și colab, 1998). Protocolul integral a fost descris prima dată de către Bacrlocher și colab. (2002). Tehnica a fost utilizată pentru numeroase tipuri celulare: măduvă osoasă, sânge, nodulii limfatici etc., iar valorile lungimii telomerelor obținute s-au corelat foarte bine cu cele detectate prin TRF.

Test protectiv de hibridizare (HPA)

Tehnica HPA pentru detecția repetițiilor telomerice a fost prima dată dezvoltată de Nakamura și colab. (1999). Tehnica HPA este utilă pentru examinările clinice ale telomerelor dintr-un număr redus de celule obținute din fluide sau prin diferite tipuri de biopsii (Nakamura și colab., 1999).

Protocol de amplicare a repetițiilor telomerice (TRAP)

Metoda a fost ințial creată de Kim și colab. în 1994 și a revoluționat cercetările asupra activității telomerazei în senescență și cancer (Kim și colab.,1994). Reacția se bazează pe funcționarea telomerazei izolată din extract celular total la nivelul repetiției telomerice într-o reacție PCR “în vitro”. Cuantificarea se realizează prin raportarea la un control intern a reacției de către un sistem automatizat de captare și analiză a imaginii (Wright W.E. și colab., 1995).

Analiza lungimii unei singure telomere (STELA)

Baird și colab. (2003) au dezvoltat o tehnică ce măsoară lungimea telomerei unui cromozom individual prin PCR. Primul pas constă în alinierea unui linker care conține 7 repetiții TTAGGG, urmate de 20 nucleotide necomplementare cu catena telomerică bogată în G. În a două etapă linkerul este legat la capătul 5’ al catenei bogate în C. Reacția PCR este realizată utilizând linkerul, un primer care este complementar cu cele 20 nucleotide ale linkerului și un primer în amonte specific regiunii subtelomerice (Baird și colab., 2003).

CAPITOLUL IV

4. 1 Materiale și metode

Material biologic: s-a recoltat sânge periferic de la o persoană sanătoasă, nefumătoare, nu a consumat alcool și care nu a urmat nici un tratament care să producă modificări la nivelul cromozomilor.

Subiectul a fost informat despre scopul și etapele studiului, dându-și consimțământul în scris pentru a participa la acesta.

Sângele periferic recoltat s-a pus în cultură, iar unele dintre probe s-a realizat tratarea culturii cu doxorubicina (concentrație inițială 2mg/ml; resp. 3,68M) (tabel nr. 3)

Tabel nr. 3 Dozele de doxirubicină administrate culturii de limfocite

Metode

Citogenetică clasică

S-au cultivat în vitro limfocitele din sângele periferic și s-au realizat preparatele citogenetice.

Pentru evidențierea complementului cromozomial, s-a realizat cultivarea în vitro a limfocitelor din sânge periferic.

Pentru realizarea culturii din sânge total s-a folosit mediu: PB-MAX suplimentat (ser fetal bovin; L-glutamină, soluție N16, antibiotice, fitohemaglutamină). Fitohemaglutina s-a adaugat pentru stimularea transformării blastice a limfocitelor, în special a limfocitelor T.

Mediul de cultură astfel pregătit, s-a repartizat în flacoane sterile de 15 ml, câte 9 ml/flacon. Ulterior, s-a adaugat în fiecare flacon câte 1 ml sânge total. După agitarea ușoară a flacoanelor (pentru ca celulele sanguine să se disperseze în mediul de cultură), acestea s-au introdus în termostat, la temperatura de 37°C. După 72 de ore de la cultivare (când s-a considerat că în cultură se află numărul maxim de limfocite în diviziune) cultura s-a “sacrificat”, procedându-se la prelucrarea materialului obținut.

La 48 ore de la cultivare, s-a realizat administrarea sterilă în fiecare tub de cultură a Doxorubicinei în dozele 0,1472 mg/ml; 0,2944 mg/ml; 0,4416 mg/ml; 0,5888 mg/ml; 0,736 mg/ml.

Cu două ore înainte de sacrificarea culturii de sânge, s-a adaugat în fiecare flacon de cultură, soluție de colchicină 0,02%, pentru blocarea limfocitelor în metafază (etapă a mitozei în care cromozomii sunt bine individualizați, cu gradul maxim de contractare a fibrei de cromatină, prezentând morfologie, dimensiuni caracteristice și constante).

După două ore de colchicinizare, cultura de sânge din fiecare flacon s-a trecut în tuburi de centrifugă: se centrifughează 15 min. la 1500 rpm pentru separarea celulelor de mediul de cultură.

S-s îndepărtat supernatantul (mediul de cultură), reținându-se sedimentul celular și s-a resuspendat într-o soluție salină hipotonă de clorură de potasiu 0,075M. Hipotonizarea s-a realizat pentru mărirea volumului celular și dispersia mai bună a cromozomilor în acest volum. Temperatura de hipotonizare este de 37°C, iar durata de 35 min. După scurgerea interval de timp, s-a centrifugat 15 min. la 1500 rpm, reținându-se sedimentul celular.

Urmează o serie de 3-4 fixări ale materialului celular, folosind un amestec alcool metilic absolut: acid acetic glacial în proporție de 3:1, realizată extemporaneu și s-a utilizat la temperatura de 4°C. Trecerea celulelor din soluția fixatoare veche în cea proaspătă s-a făcut printr-o centrifugare la 1500 rpm, timp de 15 min., îndepărtarea fixatorului vechi și adăugarea celui nou.

După ultima fixare, s-a făcut o nouă centrifugare în aceleași condiții ca mai sus, iar sedimentul celular se resuspendă într-un volum mic de soluție fixatoare. Din această suspensie s-au realicat preparate microscopice, prin picurare pe o lamă cu o pipetă Pasteur, de la o înălțime de câțiva centrimetri. Lamele cu preparatele microscopice s-au lăsat să se usuce la aer.

După uscare sau la 24 ore de la realizarea preparatelor, s-au colorat lamele, utilizând tehnica clasică (convențională) cu soluție Giemsa 5%.

Vizualizarea preparatelor microscopice s-a realizat la microscop Micros (Mic100), utilizând obiectivele 20x-100x. Fotografierea metafazelor s-a realizat utilizand camera foto Dyno Eye.

SOLUȚII NECESARE: mediu: PB-MAX, colchicină 0,02%; KCl 0,075M; metanol: acid acetic glacial (3:1). soluție Giemsa 5%.

Tehnici moleculare

Izolarea ADN-ului genomic total din sânge periferic

cu Wizard Genomic DNA Purification kit (Promega)

S-a centrifugat cultura de sânge (1ml sânge cultivat) pentru îndepărtarea mediului de cultură la 1000 rpm x 10 min., la 25 oC, s-a îndepărtat total supernatantul,

Peste 300 ml sânge din cultură s-a adăugat 900 ml soluție de liză celulară, s-a inversat tubul de 5-6 ori pentru mixare,

S-a incubat amestecul 30 min la temperatura camerei și s-a inversat tubul la fiecare 10 min. pentru a permite liza completă a hematiilor, s-a centrifugat la 14.000 rpm x 2 min.,

S-a preluat supernatantul și s-a repetat tratamentul cu soluția de liză celulară în aceleași condiții pentru a permite o liză totală a hematiilor de 3 x,

S-a resuspendat sedimentul rezultat în urma ultimei centrifugări, prin vortexare puternică,

S-a adaugat 300 ml soluție de liză nucleară, s-a pipetat repetat pentru omogenizare,

S-a adaugat 100 ml soluție de precipitare a proteinelor, s-a vortexat, s-a centrifugat la 14000 rpm x 5 min.,

S-a preluat supernatantul și s-a adăugat 300 ml izopropanol aflat la temperatura camerei, s-a amestecat prin inversare și s-a centrifugat 14000 rpm x 3 min.,

S-a aruncat supernatantul,

S-a uscat sedimentul 30 min la temperatura camerei,

ADN s-a resuspendat în 100 ml soluție de rehidratare și s-a păstrat la 4 oC.

SOLUȚII NECESARE: kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega): soluție de liză celulară, soluție de liză nucleară, soluție de precipitare a proteinelor, soluție de rehidratare; izopropanol.

Electroforeza în gel de agaroză a ADN-ului genomic izolat

S-a preparat un gel de agaroză 1 % în tampon TBE 1 X;

S-a migrat câte 10 ml ADN izolat, în amestec cu 2 ml BFE pentru 1 oră la 75 V;

Vizualizarea moleculelor de ADN se face la transiluminator UV (λ=302 nm), utilizând bromură de etidiu (conc. finală 1 μg/ml).

SOLUȚII NECESARE: Soluție stoc de tampon TBE 10X (pH=8,0-8,5): 0,089 M Tris, 0,089 M acid boric, 0,02 M EDTA; albastru de bromfenol 6X (BFE); soluție stoc de bromură de etidiu (conc. 10 mg/ml).

Determinarea spectrofotometrică a concentrației și purității ADN-ului izolat

După calibrarea aparatului (Nanodrop Nanovue 4282 v2.0.3) față de soluția blank (soluție de rehidratare),

S-a determinat concentrația fiecărei probe de ADN (2 μl probă/citire).

SOLUȚII NECESARE: soluție de rehidratare

Tehnica Real-Time PCR

Pentru analiza expresiei genei de referință (36B4) a fost utilizată următoarea pereche de primeri (Integrated DNA Technologies):

36B4 F: 5’- CCCATTCTATCATCAACGGGTACAA-3’

36B4 R: 5’- CAGCAAGTGGGAAGGTGTAATCC-3’

Pentru evidențierea repetiției telomerice au fost utilizați primerii (Integrated DNA Technologies)

TELG: 5’-ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTAGTGT-3’

TELC:5’-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTATCCCTAACA-3’

Tabelul nr. 4 Configurația plăcuței qPCR pentru telomere și gena de referință 36B4

M, M.m, 1, 1.1, 2, 2.2, 3, 3.3, 4, 4.4, 5, 5.5 probele lucrate în duplicat

Gena housekeeping -36B4, Telomere

Analiza și interpretarea rezultatelor obținute prin Real Time PCR

❖ Se utilizează metoda de cuantificare conform Cawton, 2002:

t/s = [2Ct(telomere)/2Ct(genă în copie unică)]–1 = 2–ΔCt (lungimea totală a telomerelor/individ analizat)

CAPITOLUL V

Rezultate și discuții

5.1 Citogenetică clasică

Prin evaluarea numărului de metafaze anormale și a restructurărilor cromozomiale apărute, am putut demonstra efectul clastogen al medicamentului doxorubicină.

Pentru fiecare doză de doxorubicină administrată au fost analizate cate 50 metafaze, similar și pentru cultura martor.

În figurile 7- 18, sunt prezentate o parte din cele mai reprezentative aberații cromozomiale apărute în urma tratării culturilor limfocitare cu doze crescătoare de doxorubicină.

Cele mai frecvente aberații citogenetice identificate au fost interchimburile (29) corelat cu apariția de multiple fragmente acentrice (40) (tabel 5).

Rezultatele demonstrează că numărul de rearanjamente crește cu doza de doxorubicină administrată (de la 10, la doza 0,1472 mg/ml la 60, la doza de 0,736 mg/ml) (tabel 5).

La doza maxima adminsitrată de doxorubicină (0,736 mg/ml) numărul de metafaze ce au putu fi analizate a scăzut drastic, semn ca în urma tratamentul a avut loc un amplu proces de apoptoza celulară generată de gravitatea restructurărilor cromozomiale aparute ce nu au fost compatibile cu supraviețuirea celulelor.

Tabel nr. 5 Tipul și frecvența rearanjamentelor cromozomiale produse în urma tratamentului cu doze crescătoare de doxorubicină

Multiplele rupturi și deleții cromozomiale au generat locații pentru schimburile cromozomiale neomoloage, ceea ce a dus la aberații cromozomiale foarte complexe, uneori imposibil de definit. Interschimburile cromozomiale complexe sunt generate atât prin translocarea telomeră la telomeră, cât și prin sinapse cromatidice somatice. Presupunem că asemenea sinapse somatice reprezintă consecința deteriorării unor gene responsabile de prevenirea asociației dintre cromozomii omologi în celulele somatice. De asemenea, este posibil ca numărul de rupturi mono cromatidice induse de medicament este mult mai mare, dar unele dintre ele sunt transformate în rupturi bicromatidice în evoluția ulterioară a celulei afectate.

Fragmentele acentrice sunt atașate la capetele telomerelor cromozomilor aparent intacți. Aceast fapt poate fi interpretat ca fiind rezultatul modificărilor structurale și funcționale induse de aceste medicamente în telomere, în ciuda faptului că aceste structuri cromozomiale rămân în cromozomii aparent intacți, definind capetele acestora.

Apariția cromozomilor dicentrici este consecința directă a instabilității telomerelor modificate datorită fuziunii telomerelor afectate cu cromozomi neomologi.

Multe dintre rearanjamentele cromozomiale induse de doxorubicină s-au întâlnit, de asemenea și în experimentele de iradiere de tip beta asupra celulelor umane în cultură (Gavrila et al., 2005) și dau informatii despre un efect real radiomimetic al acestor medicamente utilizate în terapia cancerului uman .

Având în vedere faptul că analizele citogenetice realizate în prezentul studiu au evidențiat cu o frecvență ridicată apariția unor modificări ce implică terminațiile cromozomiale, următoarea direcție experimentală asupra căreia ne-am îndreptat atenția a fost determinarea variabilității lungimii telomerice indusă de administrarea de doxorubicină, utilizând tehnci moleculare moderne, și anume qPCR.

Determinarea prin tehnica Real Time PCR a variației de lungime a telomerelor umane

Estimarea gradului de puritate și integritate al ADN-ului izolat

Prima etapă a experimentelor a constat în izolarea ADN-ului din sângele periferic cultivat atat de la martor, cât și  de la cele 5 variante de tratament cu kit-ul comercial: Wizard Genomic DNA Purification Kit – Promega.

ADN-ul izolat a fost supus atât electroforezei în gel de agaroză 1% (fig. 19), cât și citirii la spectrofotometru (tabel nr. 6), în vederea estimării integrității și purității extractului.

Fig. 19 Electroforeză în gel de agaroză 1% pentru verificarea purității AND-ului genomic uman, obținut utilizând kit-ul Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)

Tabel nr. 6 Analiza spectrofotometrică a ADN-ului izolat

Din analiza datelor spetrofotometrice, cât și a imaginii electroforetice a ADN-ului izolat obținut, am concluzionat că acesta este atât calitativ, cât și cantitativ optim pentru a fi introdus în reactia de qPCR.

Aplicarea tehnicii Real Time PCR în determinarea lungimii telomerice în populațiile umane

În fiecare reacție qPCR a fost introdusă aceeași concentrație de ADN genomic (42 ng/µl). Probele au fost lucrate în duplicat/placă, fiecare probă fiind însoțită de un control negativ al amplificării.

În figurile 20, 21, 22 sunt prezentate curbele de amplificare (A) și respectiv de topire (B) ale ampliconilor rezultați din reacția de Real Time PCR pentru gena în copie unică 36B4 și pentru telomere. Din analiza curbelor de topire perntru cele 6 probe luate în studiu s-a constatat, atât în cazul genei control 36B4, cât și a telomerelor, prezența unui singur peak în jurul temperaturii de 780C (gena 36B4) și, respectiv, 760C (telomere), ceea ce confirmă specificitatea reacției PCR și faptul că nu au avut loc amplificări nespecifice (fig. 20, 21, 22).

Pentru interpretarea rezultatelor s-a folosit metoda de cuantificare conform Cawton, 2002, care se bazează pe raportarea lungimii telomerelor (t) la o genă aflată în copie unică în genom (s), considerându-se că acest raport t/s reprezintă lungimea telomerică individuală.

Pentru calcularea raportului t/s au fost utilizate valorile Ct/probă (Ct=threshold cycle =numărul de cicluri cu fluorescență peste prag).

Formula de calcul folosită arată că: t/s = [2Ct(telomere)/2Ct(genă în copie unică)]–1 = 2–ΔCt, valoarea raportului fiind un indicator direct al lungimii totale a telomerelor/individ analizat. (Cawthon, 2002).

Calcularea rapoartelor/probă conform formulelor anterior menționate, s-a realizat după importarea în programul Microsoft Excel a valorilor Ct înregistrate de aparatul de Real Time PCR (Tabel nr. 7)

Tabel nr. 7 Valorile utilizate pentru calcularea raportelor t/s pentru probele analizate

Din analiza datelor de qPCR se observă că pe măsură ce se crește doza de doxorubicină administrată, lungimea telomerelor crește (fig. 23). Această variație a lungimii telomerice nu este însă semnificativă statistic.

Datele obținute în prezentul experiment sunt susținute de faptul că și în literatura de specialitate rezultatele sunt contradictorii. Din analiza datelor din literatura de specialitate, rezultă faptul că în cazul doxorubicinei acțiunea la nivelul terminațiilor cromozomiale este strict dependentă de tipul de celulă asupra careia acționează.

Studiile realizate până în prezent arată faptul că doxorubicina inhibă activitatea telomerazei în cancerele testiculare (Burger și colab., 1997), cât și în cancerele hepatice determinâd scurtatea telomerelor în celulele respective (Zhang și colab., 2002). Totuși, în cazul celulelor canceroase ovariene umane, doxorubicina nu a determinat scăderea activitații telomerazice, și nici scurtarea telomerică (Kiyozuka și colab., 2000). Pe de altă parte, în cazul cancerelor de sân, cât și de stomac, scăderea activității telomerazice indusă de doxorubicină nu a determinat o scădere a lungimii telomerice  (Park și colb, 1998).

CAPITOLUL VI

Concluzii

Citogenetică clasică

Analizele de citogenetică au reliefat faptul că, numărul de rearanjamente crește cu doza de citostatic utilizată.

În ansamblu, cele mai reprezentative aberații cromozomiale produse de administrarea de doze crescute de doxorubicină au fost au fost interchimburile cromozomiale corelate cu apariția de multiple fragmente acentrice.

La doza maxima adminsitrată de doxorubicină a fost indusă apoptoza celulară într-un numar mare din celulele aflate în cultură, semn că restructurările cromozomiale aparute au fost atât de grave încât nu au fost compatibile cu supraviețuirea celulelor.

Determinarea prin tehnica Real Time PCR a variației de lungime a telomerelor umane

Raportul t/s evidențiază o creștere a numărului de repetiții telomerice în cazul culturilor la care a avut loc administrarea de dozorubicină, comparativ cu cultura netratată, în directă dependență cu creșterea dozei citostatic administrat.

Rezultatele generate de prezentul experiment coroborate cu datelor din literatura de specialitate, indică faptul că în cazul doxorubicinei acțiunea la nivelul terminațiilor cromozomiale este strict dependentă de tipul de celulă asupra careia acționează.

BIBLIOGRAFIE

Mariana Trebunova, Galina Laputkova, Eva Slaba, Kamila Lacjkova, Aneta Verebova, 2012, Effects of Docetaxel, Doxorubicin and Cyclophosphamide on Human Breast Cancer Cell Line MCF-7.

Iseri OD, Kars MD, Eroglu S and Gunduz U, 2009, Drug resistant MCF-7 cell lines also developed cross-resistance to structurally unrelates anticancer agents, Int J Hematol Oncol 19, 1-8.

Nabholtz J-Ma, 2003, Docetaxel-anthracycline combinations în metastatic breast cancer, Breast cancer Res Treat, 79, 3-9.

Karin C. Nitiss and John L. Nitiss, 2014, Twisting and Ironing: Doxorubicin Cardiotoxicity by Mitochondrial DNA Damage, Clin. Cancer Research, 20.

Khiati S, Dalla Rosa I, Sourbier C, Ma X, Rao VA, Neckers LM, 2014, Mitochondrial topoisomerase I (Top1mt) is a novel limiting factor of doxorubicin cardiotoxicity, Clin Cancer Res, 20.

Gammella E, Maccarinelli F, Buratti P, Recalcati S, Cairo G. 2014, The role of iron în anthracycline cardiotoxicity, Front Pharmacol, 5, 25.

Vejpongsa P, Yeh ET, 2014, Topoisomerase 2 beta: a promising molecular target for primary prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Clin Pharmacol Ther, 95, 45–52.

Sterba M, Popelova O, Vavrova A, Jirkovsky E, Kovarikova P, Gersl V, et al. 2013, Oxidative stress, redox signaling, and metal chelation în anthracycline cardiotoxicity and pharmacological cardioprotection, Antioxid Redox Signal, 18, 899–929.

Wallace KB. 2007, Adriamycin-induced interference with cardiac mitochondrial calcium homeostasis. Cardiovasc Toxicol, 7, 101–7.

Doroshow JH. 2012, Dexrazoxane for the prevention of cardiac toxicity and treatment of extravasation injury from the anthracycline antibiotics, Curr Pharm Biotechnol, 13, 1949–56.

Nitiss JL. 2009, Targeting DNA topoisomerase II în cancer chemotherapy, Nat Rev Cancer, 9, 338–50.

Zhang S, Liu X, Bawa-Khalfe T, Lu LS, Lyu YL, Liu LF, et al. 2012, Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med, 18, 1639–42.

Zhang H, Barcelo JM, Lee B, Kohlhagen G, Zimonjic DB, Popescu NC, et al. 2001, Human mitochondrial topoisomerase I. Proc Natl Acad Sci U S A, 98, 10608–13.

Sobek S, Dalla Rosa I, Pommier Y, Bornholz B, Kalfalah F, Zhang H, et al.Negative regulation of mitochondrial transcription by mitochondrial topoisomerase I. Nucleic Acids Res, 2013; 41: 9848–57

Douarre C, Sourbier C, Dalla Rosa I, Brata Das B, Redon CE, Zhang H, et al. 2012, Mitochondrial topoisomerase I is critical for mitochondrial integrity and cellular energy metabolism. PLoS ONE, 7.

Maccarinelli F, Gammella E, Asperti M, Regoni M, Biasiotto G, Turco E, et al. 2014, Mice lacking mitochondrial ferritin are more sensitive to doxorubicin-mediated cardiotoxicity, J Mol Med, 92, 859–69.

Malhotra V, Perry MC 2003, Classical chemotherapy: mechanisms, toxicities and the therapeutic window, Cancer Biology & Therapy. 2 , 2–4.

Giorgi-Renault S.; Renault J.; Baron M.; Gebel-Servolles P.; Delic J.; Cros S.; Paoletti C, 1988, Heterocyclic quinones XIII. Dimerization în the series of 5,8-quinazolinediones: Synthesis and anti tumor effects of bis(4-amino-5,8-quinazolinediones), Chem. Pharm. Bull. 36, 3933–3947.

Takimoto CH, Calvo E., 2008, Principles of Oncologic Pharmacotherapy, în Pazdur R, Wagman LD, Camphausen KA, Hoskins WJ (Eds).

Tacar, O; Sriamornsak, P; Dass, February 2013. "Doxorubicin: an update on anticancer molecular action, toxicity and novel drug delivery systems.". The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 65 (2): 157–70.

Fornari FA, Randolph JK, Yalowich JC, Ritke MK, Gewirtz DA, April 1994. "Interference by doxorubicin with DNA unwinding în MCF-7 breast tumor cells". Mol Pharmacol. 45, 649–56.

Momparler RL, Karon M, Siegel SE, Avila F, August 1976. "Effect of adriamycin on DNA, RNA, and protein synthesis în cell-free systems and intact cells". Cancer Res. 36, 5.

Pommier, Y; Leo, E; Zhang, H; Marchand, C May 2010. "DNA topoisomerases and their poisoning by anticancer and antibacterial drugs.". Chemistry & Biology. 17, 421–433.

Frederick CA, Williams LD, Ughetto G, et al. March 1990, Structural comparison of anticancer drug-DNA complexes: adriamycin and daunomycin, Biochemistry. 29, 2538–49.

Pigram WJ, Fuller W, Hamilton LD, January 1972, Stereochemistry of intercalation: interaction of daunomycin with DNA, Nature New Biol. 235, 17–9.

Pang B, Qiao X, Janssen L, Velds A, Groothuis T, Kerkhoven R, Nieuwland M, Ovaa H, Rottenberg S, van Tellingen O, Janssen J, Huijgens P, Zwart W, Neefjes J, 2013, Drug-induced histone eviction from open chromatin contributes to the chemotherapeutic effects of doxorubicin, Nature Communications. 4.

Pang B, de Jong J, Qiao X, Wessels LF, Neefjes J, 2015, Chemical profiling of the genome with anti-cancer drugs defines target specificities, Nature Chemical Biology. 11, 472–480.

Doxorubicin HCL, 2016,International Drug Price Indicator Guide.

British Medical Association. 2015, British national formulary, 583.

Ravina, Enrique, John Wiley & Sons, 2011, The Evolution of Drug Discovery: From Traditional Medicines to Modern Drugs. 291.

Weiss RB, December 1992, The anthracyclines: will we ever find a better doxorubicin?. Seminars în Oncology. 19, 670–86.

Baruffa G, 1966, Clinical trials în Plasmodium falciparum malaria with a long-acting sulphonamide, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60, 222–4.

Camerino B, Palamidessi G, 1960, Derivati della parazina II. Sulfonamdopir (în Italian). Gazz Chim Ital, 90,1802–1815.

Tan C, Tasaka H, Yu KP, Murphy ML, Karnofsky DA, March 1967. Daunomycin, an antitumor antibiotic, în the treatment of neoplastic disease. Clinical evaluation with special reference to childhood leukemia. Cancer. 20, 333–53.

Arcamone F, Cassinelli G, Fantini G, et al. 1969, Adriamycin, 14-hydroxydaunomycin, a new antitumor antibiotic from S. peucetius var. caesius, Biotechnol Bioeng. 11, 1101–1110.

Di Marco A, Gaetani M, Scarpinato B, February 1969, Adriamycin: a new antibiotic with antitumor activity. Cancer Chemother Rep. 53, 33–7.

Drug Shortages, doxorubicin, 2014,US Food and Drug Administration.

Peter Loftus, 2011, J&J is Short of Cancer Drug Doxil, Wall Street Journal.

Harris, Gardiner, 2012, Shipments From Abroad to Help Ease Shortage of Two Cancer Drugs, New York Times.

FDA NEWS RELEASE, 2013,US Food and Drug Administration.

Parker WB, Jul 2009, Enzymology of purine and pyrimidine antimetabolites used în the treatment of cancer, Chemical Reviews. 109, 2880–93.

Adjei AA, Jun 2004, Pemetrexed, a novel multitargeted antineoplastic agent, Clinical Cancer Research. 10, 4276–4280.

Wagstaff AJ, Ibbotson T, Goa KL, 2003, Capecitabine: a review of its pharmacology and therapeutic efficacy în the management of advanced breast cancer, Drugs. 63, 217–36.

O’Sullivan RJ, Karlseder J,2010, Telomeres: protecting chromosomes against genome instability. Nat Rev Mol Cell Biol, 11,171-181.

Meyne J, Ratliff RL, Moyzis RK. 1989, Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. Proc Natl Acad Sci USA, 86, 7049-7053.

Meyne J, Baker RJ, Hobart HH, Hsu TC, Ryder OA, Ward OG, et al. 1990, Distribution of nontelomeric sites of (TTAGGG)n telomeric sequences în vertebrate chromosomes. Chromosoma; 99, 3-10.

Schmutz I, de Lange T. Shelterin. 2016, Current Biology; 26, 397-399.

Feuerhahn S, Iglesias N, Panza A, Porro A, Lingner J. 2010, TERRA biogenesis, turnover and implications for function. FEBS Lett; 584, 3812-3818.

Cusanelli E, Chartrand P. 2015, Telomeric repeat-containing RNA TERRA: a noncoding RNA connecting telomere biology to genome integrity. Front Genet, 6, 1-9.

Jafri MA, Ansari SĂ, Alqahtani MH, Shay JW. Roles of telomeres and telomerase în cancer, and advances în telomerase-targeted therapies. Genome Med, 2016; 8.

von Zglinicki T, Saretzki G, Docke W, Lotze C. 1995, Mild hyperoxia shortens telomeres and inhibits proliferation of fibroblasts: a model for senescence? Exp Cell Res; 220, 186-193.

Kawanishi S, Oikawa S. 2004, Mechanism of telomere shortening by oxidative stress. Ann N Y Acad Sci; 1019, 278-284.

Blasco MA, Lee HW, Hande MP, Samper E, Lansdorp PM, DePinho RA, et al. 1997, Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. Cell; 91, 25-34.

Ayouaz A, Raynaud C, Heride C, Revaud D, Sabatier L. 2008, Telomeres: Hallmarks of radiosensitivity. Biochimie; 90, 60-72.

Xu Y, Goldkorn A. 2016, Telomere and telomerase therapeutics în cancer. Genes; 7:22.

Zhao Z, Pan X, Liu L, Liu N. 2014, Telomere length maintenance, shortening, and lengthening. J Cell Physiol; 229, 1323-1329.

Draskovic I, Londono-Vallejo A. 2014, Telomere recombination and the ALT pathway: a therapeutic perspective for cancer. Curr Pharm Des; 20, 6466-6471.

Engelhardt M, Ozkaynak MF, Drullinsky P, Sandoval C, Tugal O, Jayabose S, et al. 1998, Telomerase activity and telomere length în pediatric patients with malignancies undergoing chemotherapy. Leukemia; 12, 13-24.

Franco S, Ozkaynak MF, Sandoval C, Tugal O, Jayabose S, Engelhardt M, et al. 2003, Telomere dynamics în childhood leukemia and solid tumors: a follow-up study, Leukemia; 17, 401-410.

Lee JJ, Nam CE, Cho SH, Park KS, Chung IJ, Kim HJ. 2003, Telomere length shortening în non-Hodgkin’s lymphoma patients undergoing chemotherapy. Ann Hematol; 82, 492-495.

Ricca I, Compagno M, Ladetto M, Rocci A, Dell’Aquila M, Omedè P, et al. 2005, Marked telomere shortening în mobilized peripheral blood progenitor cells (PBPC) following two tightly spaced high-dose chemotherapy courses with G-CSF, Leukemia; 19, 644-651.

Schröder CP, Wisman GB, de Jong S, van der Graaf WT, Ruiters MH, Mulder NH, et al. 2001, Telomere length în breast cancer patients before and after chemotherapy with or without stem cell transplantation, Br J Cancer; 84,1348-1353.

Unryn BM, Hao D, Gluck S, Riabowol KT. 2006, Acceleration of telomere loss by chemotherapy is greater în older patients with locally advanced head and neck cancer. Clin Cancer Res; 12, 6345-6350.

Li P, Hou M, Lou F, Björkholm M, Xu D. 2012, Telomere dysfunction induced by chemotherapeutic agents and radiation în normal human cells. Int J Biochem Cell Biol; 44, 1531-1540.

Bolzán AD. 2012, Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis; 27,1-15.

Burger AM, Double JA, Newell DR. 1997, Inhibition of telomerase activity by cisplatin în human testicular cancer cells. Eur J Cancer; 33, 638-644.

Multani AS, Chandra J, Mcconker J, Sen S, Cabral TF, Pathak S. 1999, Cell death în paclitaxel-dependent chinese hamster ovary cells is initiated by the loss of telomeric DNA repeats. Oncol Res; 11, 455-460.

Zhang RG, Guo LX, Wang XW, Xie H. 2002, Telomerase inhibition and telomere loss în BEL-7404 human hepatoma cells treated with doxorubicin. World J Gastroenterol; 8, 827-831.

Liu M, Hales BF, Robaire B. 2014, Effects of four chemotherapeutic agents, bleomycin, etoposide, cisplatin, and cyclophosphamide, on DNA damage and telomeres în a mouse spermatogonial cell line. Biol Reprod; 90,1-10.

Kunifuji Y, Gotoh S, Abe T, Miura M, Karasaki Y. 2002, Down-regulation of telomerase activity by anticancer drugs în human ovarian cancer cells. Anticancer Drugs; 13, 595-598.

Akiyama M, Horiguchi-Yamada J, Saito S, Hoshi Y, Yamada O, Mizoguchi H, et al. 1999, Cytostatic concentrations of anticancer drugs do not affect telomerase activity of leukaemic cells în vitro. Eur J Cancer, 35, 309-315.

Elmore LW, Rehder CW, Di X, McChesney PA, Jackson-Cook CK, Gewirtz DA, et al. 2002, Adriamycin-induced senescence în breast tumor cells involves functional p53 and telomere dysfunction. J Biol Chem; 277, 35509-35515.

Park KH, Rha SY, Kim CH, Kim TS, Yoo NC, Kim JH, et al 1998, Telomerase activity and telomere lengths în various cell lines: changes of telomerase activity can be another method for chemosensitivity evaluation. Int J Oncol; 13, 489-495.

Buttiglieri S, Ruella M, Risso A, Spatola T, Silengo L, Avvedimento EV, et al. 2011,The aging effect of chemotherapy on cultured human mesenchymal stem cells. Exp Hematol; 39,1171-1181.

Liu M, Maselli J, Hales BF, Robaire B. 2015,The effects of chemotherapy with bleomycin, etoposide, and cis-platinum on telomeres în rat male germ cells. Andrology; 3, 1104-1112.

Jeyapalan J, Leake A, Ahmed S, Saretzki G, Tilby M, von Zglinicki T. 2004,The role of telomeres în Etoposide induced tumor cell death. Cell Cycle; 3, 1169-1176.

Moriarty TJ, Dupuis S, Autexier C. 2002, Rapid upregulation of telomerase activity în human leukemia HL-60 cells treated with clinical doses of the DNA damaging drug etoposide. Leukemia; 16,1112-1120.

Klapper W, Qian W, Schukte C, Parwaresch R. 2003, DNA damage transiently increases TRF2 mRNA expression and telomerase activity. Leukemia; 17, 2007-2015.

Sato N, Mizumoto K, Nishio S, Maehara N, Urashima T, Ogawa T, et al. 2000, Up-regulation of telomerase activity în human pancreatic cancer cells after exposure to etoposide. Br J Cancer; 82, 1819-1826.

Li D, Zhang Y, Cao W, Sun L, Xu H, Lu W. 2002, Regulative function of telomerase and extra- cellular regulated protein kinases to leukemic cell apoptosis. J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci; 22, 292-301.

Ku WC, Cheng AJ, Wang TC. 1997, Inhibition of telomerase activity by PKC inhibitors în human nasoparyngeal cancer cells în culture. Biochem Biophys Res Comm; 241, 730-736.

Zhang RG, Guo LX, Wang XW, Xie H. 2002,Telomerase inhibition and telomere loss în human hepatoma cells treated with doxorubicin, World J Gastroenterol; 8, 827-831.

Burger AM, Double JA, Newell DR. 1997, Inhibition of telomerase activity by cisplatin în human testicular cancer cells. Eur J Cancer; 33, 638-644.

Kiyozuka Y, Yamamoto D, Yang J, Uemura Y, Senzaki H, Adachi S, et al. 2000, Correlation of chemosensitivity to anticancer drugs and telomere length, telomerase activity and telomerase RNA expression în human ovarian cancer cells. Anticancer Res; 20, 203-212.

Park KH, Rha SY, Kim CH, Kim TS, Yoo NC, Kim JH, 1998, Telomerase activity and telomere lengths în various cell lines: changes of telomerase activity can be another method for chemosensitivity evaluation. Int J Oncol; 13, 489-495.

Grant W.F., 1994, The present status of higher plant bioassays for the detection of environmental mutagens. Mutat Res., 310, 175-85.

Greider C., Blackburn E.H., 1987, The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. Cell, 51, 887-898.

Greider C.W., Blackburn E.H., 1985, Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. Cell, 43, 405–413.

Hacia J.G., Movotny E.A., Mayer R.A., Woski S.A., Ashlock M.A., Collins F.S., 1999, Design of modified oligodeoxyribonucleotide probes to detect telomere repeat sequences in FISH assays. Nucleic Acids Res. 27, 4043-9.

Hagen U., 1967, Determination of single and double breaks in irradiated ADN from the distribution of molecular weight. Biochim. Biophys. Acta, 134, 45-58.

Hall E.J., Hei T.K., 2003, Genomic instability and bystander effects induced by high-LET radiation. Oncogene, 22:7034–7042.

Hande M.P., Azizova T.V., Burak L.E., Khokhryakov V.F., Geard C.R., Brenner D.J., 2005, Complex chromosome aberrations persist in individuals many years after occupational exposure to densely ionizing radiation: an mFISH study. Genes Chromosomes Cancer, 44,1-9.

Hande M.P., Balajee A.S. and Natarajan A.T., 1997, Induction of telomerase activity by UV-irradiation in Chinese hamster cells. Oncogene, 15,1747–1752.

Hansen M.T., 1978, Multiplicity of genome equivalents in the radiation-resistant bacterium Micrococcus radiodurans. J. Bacteriol., 134, 71-75.

Hayflick L., Moorhead P.S., 1961, The serial cultivation of human diploid cell strains, Exp. Cell Res., 25, 585–621.

O'Callaghan N., Dhillon V., Thomas P., Fenech M., 2008, A quantitative real-time PCR method for absolute telomere length. Biotechniques, 44, 807-809.

Nieri D., Berardinelli F., Sgura A., Cherubini R., De Nadal V., Gerardi S., Tanzarella C., Antoccia A., 2013, Cyogenetics effects in human primary fibro- blasts exposed to low-doses of radiations with different quality. Int. J. Radiat. Biol., 89, 698–707.

Norwood D., Dimitrov D.S., 1998, Sensitive method for measuring telomere lengths by quantifying telomeric DNA content of whole cells. Biotechniques, 25,1040-1045.

Oexie K., 1998, Telomere lenght distribution and Southern blot analysis. J. Theor. Biol., 190.

Tchirkov A. și Lansdorp P.M., 2003, Role of oxidative stress in telomere shortening in cultured fibroblasts from normal individuals and patients with ataxia-telangi- ectasia. Hum. Mol. Genet., 12, 227–232.

Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M., 1998, Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol., 16, 743-7.

Hyeon J. O., Hande M.P., Lansdorp P.M., Natarajan A.T., 1998, Induction of telomerase activity and chromosome aberrations in human tumour cell lines following X-irradiation. Mutat. Res., 401, 121-31.

Zijlmans M.J., Martens U.M, Poon S., Raap A.K., Tanke H. J., Ward R.K., Lansdorp P.M., 1997, Telomeres in the mouse have large inter-chromosomal variations in the number of T2AG3 repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 94, 7423-7428.

Sabatier L., Lebeau J., Dutrillaux B., 1994, Chromosomal instability and alterations of telomeric repeats in irradiated human fibroblasts. Int. J. Radiat. Biol., 66,611-613.

O'Connor M., Safari A., Xin H., Liu D., Songyang Z., 2006, A critical role for TPP1 and TIN2 interaction in high-order telomeric complex assembly. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103, 11874–11879.

Alejandro D. Bolzán, 2016, Effect of chemotherapeutic drugs on telomere length and telomerase activity, Laboratory of Cytogenetics and Mutagenesis, Multidisciplinary Institute of Cell Biology ,3, 1488.

Karin C. Nitiss and John L. Nitiss, 2014, Twisting and Ironing: Doxorubicin Cardiotoxicity by Mitochondrial DNA Damage, Clin Cancer Res, 14, 821.

https://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction

Nandakumar J., Cech T.R., 2013, Finding the end: recruitment of telomerase to telomeres. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 14, 69-82.

Prof. Dr. Lucian Gavrila, anul 2003, Capitolul: Telomere, Capitolul XXIX Alterarea structurii genomului: Mutațiile ereditații, Factori mutageni fizici, Mutageneza chimică, Genomica I, Editura Enciclopedica Bucuresti, paginile 781 – 805.

Ion Fulga, 2015, Capitolul 71: Chimioterapicele anticanceroase și imunosupresivele, Farmacologie, Editura 1, Fulga I, Editura Medicala, ed. 2, 597 -612.

http://telomerase.asu.edu/sequences_telomere.html

http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/cs/c0cs00134a#!divAbstract

https://www.google.ro/search?q=telomeraza&client…..#imgrc=L6xlG1ZFAn0fjM

https://www.google.ro/search?q=telomeraza&client=firefox-b-ab&source=lnms&tbm=isch&să=X&ved=0ahUKEwji66epsfUAhVMXhQKHaoXDEwQ_AUICigB&biw=1366&bih=657#imgrc=L6xlG1ZFAn0fjM

http://ar.iiarjournals.org/search?author1=MARIANNA+TREBUNOVA&sortspec=date&submit=Submit"

http://www.smartscitech.com/index.php/TT/article/view/1488

https://www.slideshare.net/rajdangol303/mutation-35776184

https://www.google.ro/search?q=mutații+punctiforme&client=firefox-bab&source=lnms&tbm=isch&să=X&ved=0ahUKEwj3u6er18rUAhXJ1RoKHU3MAYMQ_AUICigB&biw=1366&bih=657#tbm=isch&q=genic+transversion+mutation+classification&imgrc=1KPP4X_Z8paXDM

http://web2.mendelu.cz/af_239_nanotech/J_Met_Nano/0214/estudy_of_the_influence_of_cytostatics.html)

https://www.google.ro/search?q=mutații+punctiforme

https://www.google.ro/search?q=chromosome+mutation&client=safari&rls=en&source=lnms&tbm=isch&să=X&ved=0ahUKEwjTgIegpMzUAhWiDpoKHTQ3AUoQ_AUICigB&biw=1042&bih=494#imgrc=Wu1bSGMENadWBM

https://www.google.ro/search?să=G&hl=ro&q=Telomer&tbm=isch&tbs=simg:CAQSlwEJXbomQ2jsM_18aiwELEKjU2AQaBAgACAoMCxCwjKcIGmIKYAgDEiiLCuUBxwOyBuYBnRSeFIoKnBS0Brc9nDW2Pao9uj38PdU9xj3TPdQ9GjAak8NBc-_1OJz9zfpYUP0n2RpFd8lvab4GZpy_1K38P9giVkxacdR6sIML6Pu4oIm-0gBAwLEI6u_1ggaCgoICAESBK3lEN8M&ved=0ahUKEwjs4Ja8qMzUAhXGQZoKHRENBGMQwg4IIigA&biw=1242&bih=558#imgrc=XbomQ2jsM_8h6M:

https://www.google.ro/search?q=telomeraza&client…..#imgrc=L6xlG1ZFAn0fjM