Efectele Inhibitorilor de Adn Metiltransferaze Asupra Citodiferentierii Liniei Germinale Mascule Implicatii Asupra Proceselor de Imprinting Genomic

Cuprins

INTRODUCERE

PARTEA I – ASPECTE TEORETICE

Capitolul I – PARTICULARITĂȚI ALE SPERMATOGENEZEI MURINE LA ȘOARECE

1.1. Etapele spermatogenezei

1.2. Organizarea cromatinei în nucleii spermatozoizilor

1.3. Proteinele nucleare sperm-specifice și rolul lor în asigurarea structurii și funcției materialului genetic

Capitolul II-MECANISME EPIGENETICE IMPLICATE ÎN CITODIFERENȚIEREA LINIEI GERMINALE MASCULE

2.1. Modificările chimice ale histonelor și mecanismele de reglare a transcrierii

2.2. Rolul „long-range RNA” și al microRNA în procesele de diferențiere a spermatozoidului

2.3. Rolul proceselor de metilare/demetilare ADN în setarea informației genetice specifice liniei germinale mascule

2.4. Imprinting genomic și maladii asociate

2.5. ADN-metiltransferazele mamaliene

PARTEA a II-a – CERCETĂRI PROPRII

1. Scopul și obiectivele studiului

2. Materiale și metode

3. REZULTATE EXPERIMENTALE ȘI DISCUȚII

4. PERSPECTIVE ȘI APLICAȚII PRACTICE/CLINICE ALE CERCETĂRILOR

5. CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

ABREVIERI

ADN – acid deoxiribonucleic

ARN – acid ribonucleic

snARN – small nuclear ARN

Apr – spermatogonii A perechi

Ai – spermatogonii intermediare

Aal – spermatogonii aliniate

PL – protamine like

SNBP – aperm nuclear basic proteins

Arg – arginină

Lys – lizină

H1, H2A, H2B, H3, H4 – tipuri de histone

ncRNA – ARN necodificator

HAT – histon-acetilaza

HDAC – histon-deacetilaza

ATP – adenozin-trifosfat

ARNm – ARN mesager

miARN – micro-ARN

siARN – ARN de silențiere

piARN – PIWI ARN

CpG – dinucleotide citozină-fosfat-guanină

DNMT – ADN metil-tranferază

SAM – S-adenozilmetionină

DDSA – 2 dodecenyl succinic acid anhydride

MNA – methylnadic anhydride

EDTA – ethylenedinitrilotetraacetic acid

SDS – sodium dodecyl sulfate

BSA – serumalbumină bovină

ABDS – apă bidistilată

UV – ultraviolete

PT – proteine de tranziție

5-aza2DC – 5-aza-2ˈ-deoxicitidină

ICSI – injecția intracitoplasmatică a spermatozoidului

INTRODUCERE

Epigenetica se ocupă cu studiul modificărilor ereditare ale expresiei genice datorate în special modificării cromatinei nucleare, fără alterări în secvența de ADN. Mecanismele epigenetice sunt de o importanță crucială pentru determinarea expresiei genice la un anumit moment sau într-o anumită celulă.

Controlul diferențierii celulare și reglarea expresiei genice au la bază mecanisme moleculare complexe ce reprezintă una dintre direcțiile de studiu pentru biologia modernă a dezvoltării și o mare provocare.

Informația genetică a fiecărui genom este stabilită în momentul fecundației și nu mai suferă modificări pe parcursul vieții, cu excepția mutațiilor și a editării ADN, procese ce apar la celulele ce participă la răspunsul imun.

Expresia genică poate prezenta o dinamică spațio-temporală corelată cu procesele epigenetice care conduc la remodelarea cromatinei în timpul etapelor de dezvoltare și diferențiere, fără afectarea secvenței nucleotidice. Codificarea informației epigenetice are la bază metilarea ADN, modificările histonelor, variantele histonice, proteinele nonhistonice ale cromatinei, și ARNs necodificator mic (snARNs). Profilul epigenetic reglează expresia genelor și poate fi transmis de la o generație la alta. Prin ștergerea sau reglarea markerilor epigenetici se stabilesc noi paternuri de expresie genică și modul în care va răspunde fiecare celulă pe parcursul dezvoltării.

Majoritatea informațiilor obținute provin din studii realizate pe modelul murin, datorită considerațiilor etice privind obținerea materialul experimental uman. La mamifere, reprogramarea epigenetică are loc la embrioni în două etape de dezvoltare: prima în timpul gametogenezei, și a doua preimplantațional, imediat după fecundație.

Celulele germinale mascule conțin pe lângă histonele somatice și variante histonice sperm-specifice. Acestea sunt înlocuite de protamine cu o masă moleculară mică ce permit condensarea ADN-ului încărcat negativ.

Scopul lucrării a fost studiul modificărilor epigenetice care se petrec pe parcursul spermatogenezei datorită importanței lor în diferențierea normală a celulelor germinale masculine, în reproducerea pe cale naturală, care este crucială pentru menținerea speciilor, și în tehnicile de reproducere asistată, în special modificările apărute în timpul procedurilor de fertilizare in vitro. Am ales modelul murin datorită asemănărilor în ceea ce privește spermatogeneza la om și șoarece, inclusiv organizarea tubului seminifer, dar și datorită omologiei de 98% între om și șoarece de la nivelul celor două gene pentru protamine. Pentru realizarea obiectivelor noastre am utilizat un inhibitor de ADN-metiltransferaze, respectiv 5-aza-2-deoxicitidina, pentru efectele asupra citodiferențierii liniei germinale mascule și asupra proceselor de imprinting genomic. Am studiat arhitectura materialului genetic în gametogeneză, respectiv dinamica arhitecturii cromatinei în spermatogeneza murinelor la nivel citologic.

PARTEA I

ASPECTE TEORETICE

CAPITOLUL I

PARTICULARITĂȚI ALE SPERMATOGENEZEI MURINE LA ȘOARECE

Etapele spermatogenezei

Spermatogeneza este un tip special de diferențiere celulară, esențială pentru supraviețuirea speciilor. Aceasta cuprinde totalitatea proceselor citologice pe care le suferă celulele germinale pentru a se transforma în spermatozoizi. Odată ce începe meioza, celula intră pe o anumită cale de diferențiere celulară. Stadiile citologice identificabile prin care trece fiecare celulă ce suferă meioza sunt: leptoten, zigoten, pachiten, diploten, diakineza, metafaza I și metafaza II. În pachiten cromozomii omologi se împerechează și are loc recombinarea lor (Hoyer-Fender, 2003). În schimb, cromozomii X și Y se unesc doar la nivelul regiunilor lor pseudoautozomale, formând corpusculul sexual, și devin, în cea mai mare parte, inactivi transcripțional (Baarends și Grootegoed, 1999; Hoyer-Fender, 2003). La finalul meiozei, celulele germinale devin spermatide rotunde, iar genele de pe cromozomii X și Y devin active din punct de vedere transcripțional.

Cele trei etape ale spermatogenezei sunt: faza proliferativă, faza meiotică sau reducțională, faza de diferențiere sau spermatogeneza.

Faza proliferativă (spermatogoniogeneza)

Celulele germinale primordiale ajunse în gonadă se divid mitotic pentru a menține constant numărul de celule ce vor suferi meioza și formează spermatogoniile. Aceste celule inițiază spermatogeneza, cresc populația de celule germinale prin mitoză și reglează numărul de celule germinale astfel încât să se păstreze un raport corespunzător între celulele germinale și celulele Sertoli. O spermatogonie poate suferi 8-9 diviziuni înaintea transformării în spermatocit, iar fiecare spermatocit suferă două diviziuni meiotice (De Rooij și Russell, 2000).

S-au descris mai multe tipuri de spermatogonii: spermatogoniile tip A care nu prezinta heterocromatină în nucleu, spermatogoniile tip B care conțin puțină heterocromatină in nucleu, și, la șoarece și șobolan, spermatogoniile intermediare (In) care conțin o cantitate intermediară de heterocromatină în nucleu.

Spermatogoniile tip A individuale (Ai) sunt singurele care nu conțin punți intercelulare și sunt considerate celule stem pentru linia germinală la mamifere (cu excepția primatelor). După mitoză, în general jumătate dintre celulele fiice ale spermatogoniilor de tip Ai migrează la distanță una de alta și devin două noi celule stem, și jumătate dintre ele suferă citokineză incompletă și generează spermatogonii A perechi (Apr) care produc celule fiice și rămân conectate prin punți intercelulare. Prin diviziune, spermatogoniile A perechi (Apr) formează lanțuri de patru spermatogonii A aliniate (Aal), care prin diviziuni succesive formează lanțuri de 8, 16, și rar 32 de celule. La șoarece și șobolan, spermatogoniile Aal produc următoarele șase generații de spermatogonii: A1, A2, A3, A4, ln și B. Trecerea de la spermatogoniile Aal la A1 este o transformare ce are loc în momentul în care celulele sunt în faza G0/G1 a ciclului celular și nu implică diviziuni.

Durata ciclului celular de la spermatogoniile A2 la B este de aproximativ 28 de ore jumătate la șoarece, 42 de ore la șobolan și 60 de ore la hamsterul chinezesc. Pentru spermatogoniile Ai, Apr și Aal ciclurile celulare durează 56 de ore la șobolan, și 90 de ore la hamsterul chinezesc.

Populația de celule stem din testicul, aproximată la ~10.000 de celule la șoarece, menține fertilitatea pe tot parcursul vieții la masculii mamiferelor.

Faza meiotică sau reducțională

Spermatogoniile de tip B se divid o singură dată și generează spermatocite primare, care prin diviziune meiotică formează o pereche de spermatocite primare. Meioza inițiată de finalizarea sintezei de ADN produce patru spermatocite primare tetraploide, care suferă două diviziuni fără replicare ADN și formează spermatocitele secundare, ce vor suferi a doua diviziune meiotică.

Spermiogeneza

Spermatidele se formează în urma celei de-a doua diviziuni meiotice. Spermatozoizii se formează din spermatide prin procesul de spermiogeneză, fără diviziune.

Pe parcursul spermiogenezei spermatidele se modifică astfel:

Cromatina se condensează și nucleul își schimbă forma, aceasta fiind specifică fiecărei specii.

Aparatul Golgi produce acrozomul, situat deasupra nucleului.

Se formează coada spermatozoidului (la speciile cu spermatozoizi flagelați) și se eliberează excesul de citoplasmă sub forma unui corp rezidual, fagocitat de celulele Sertoli.

Durata unui ciclu de spermatogeneză este diferită în funcție de specie. La șoarece mitoza durează ~11 zile, meioza ~11 zile și fazele postmeiotice ~14 zile. La om, spermatogeneza durează de două ori mai mult. Spermatogeneza poate avea loc continuu deoarece spermatogoniile A1 sunt celule stem. Zilnic sunt produși în fiecare testicul o sută de milioane de spermatozoizi. Spermatozoizii nefolosiți sunt resorbiți sau trec în urină (Zărnescu, 2002).

Organizarea cromatinei în nucleii spermatozoizilor

Cromatina nucleară reprezintă fibra de ADN înfășurată în jurul proteinelor histonice. Regiunile de ADN legate strâns de histone sunt silențiate transcripțional, în timp ce regiunile mai relaxate sunt active transcripțional. Datorită acestei condensări a cromatinei din nucleul spermatozoizilor, aceștia sunt inactivi transcripțional, deși conțin histone cu un grad înalt de acetilare, specifice celulelor active transcripțional (Schagdarsurengin și colab., 2012).

Spermatozoizii sunt celule foarte compacte și stabile, cu o cantitate minimă de citoplasmă ce protejează ADN-ul în momentul transferului în ovocit. Organizarea cromatinei nucleare a spermatozoizilor este unică, fiind caracterizată de prezența nucleohistonelor și a nucleoprotaminelor (Schagdarsurengin și colab., 2012).

Înalta compactare a cromatinei spermatozoizilor determină blocarea completă a expresiei genice. Schimbările importante din timpul spermatogenezei în compoziția cromatinei și alterarile semnificative din structura sa fac ca în stadiile finale ale spermatogenezei compoziția proteinelor cromozomale să fie total diferită de cea din stadiile inițiale.

Deși proteinele cromozomale specifice spermatozoizilor prezintă o imensă variabilitate structurală, ele pot fi clasificate după compoziția lor astfel:

Tipul H (histone-type) – proteine cu o compoziție în aminoacizi asemănătoare celei a histonelor din celulele somatice;

Tipul P (protamine-type) – proteine cu masă moleculară mică (4000-10000 Da), bogate în arginină (>60%). Pe parcursul spermatogenezei are loc o înlocuire aproape totală a histonelor din celulele stem cu acest tip de proteine;

Tipul PL (protamine-like) –compoziția în aminoacizi a acestor proteine este situată între tipurile descrise anterior (35-50% arginină și lizină).

1.2.2. Dinamica cromatinei în celulele germinale mascule

În nucleii spermatozoizilor, ADN este organizat într-o altă conformație tridimensională, histonele fiind înlocuite de către o clasă specială de proteine nucleare – SNBP (Sperm Nuclear Basicadiile finale ale spermatogenezei compoziția proteinelor cromozomale să fie total diferită de cea din stadiile inițiale.

Deși proteinele cromozomale specifice spermatozoizilor prezintă o imensă variabilitate structurală, ele pot fi clasificate după compoziția lor astfel:

Tipul H (histone-type) – proteine cu o compoziție în aminoacizi asemănătoare celei a histonelor din celulele somatice;

Tipul P (protamine-type) – proteine cu masă moleculară mică (4000-10000 Da), bogate în arginină (>60%). Pe parcursul spermatogenezei are loc o înlocuire aproape totală a histonelor din celulele stem cu acest tip de proteine;

Tipul PL (protamine-like) –compoziția în aminoacizi a acestor proteine este situată între tipurile descrise anterior (35-50% arginină și lizină).

1.2.2. Dinamica cromatinei în celulele germinale mascule

În nucleii spermatozoizilor, ADN este organizat într-o altă conformație tridimensională, histonele fiind înlocuite de către o clasă specială de proteine nucleare – SNBP (Sperm Nuclear Basic Proteins). Organizarea particulară conferită de aceste proteine determină inactivitatea ADN din spermatozoizi (nu există transcriere genică și nu există replicare) și conferă omogenitate structurală (toată cromatina din nucleii spermatozoizilor fiind inactivă). În fazele timpurii ale spermatogenezei, nucleii sunt activi din punct de vedere genetic. Inactivarea (silențierea) are loc în stadiul de spermatidă prin înlocuirea histonelor și hipermetilarea AND ce conduc la o compactare controlată, este reversibilă și are rolul de a pregăti materialul genetic pentru a funcționa ca genom patern în embriogeneza timpurie, după fecundație. Remodelarea cromatinei prin compactare este controlată de o cascadă de semnale moleculare impuse de un cod epigenetic.

1.2.3. Structura cromatinei ca rezultat al interacției protamine-like (PL) cu ADN în nucleii spermatozoizilor

În timpul spermatogenezei, proteinele PL condensează ADN (DNA-condensing proteins) și înlocuiesc histonele somatice, având o funcție intermediară între histone și protamine și un grad ridicat de heterogenitate atât numerică, cât și în dimensiune.

Proteinele PL sunt bogate în Arg și Lys (8-30 mol%, respectiv 22-30 mol%), ceea ce conduce la o creștere a încărcăturii electrice, facilitând compactarea ADN în nucleii spermatici. În timpul fecundării, decondensarea cromatinei necesită prezența proteinelor specifice din ou (ex. nucleoplasmina) (Rice și colab., 1995).

Asocierea ADN cu protamine, protamine-like înalt bazice, inclusiv histona H1, determină formarea toroidului, structură cu organizare complexă, ca rezultat al neutralizării sarcinii negative (Clark și Thomas, 1988; Garcia-Ramirez și Subirana, 1994).

Protaminele reprezintă un pas evolutiv de la histonele H1 sperm-specifice către protamine, tendință caracterizată de extinderea cozii N-terminale prin apariția repetițiilor peptidice bine conservate și a unui conținut mare de Arg. Se observă segregarea cozilor N- și/sau C-terminale de la domeniile globulare winged-helix ale H1 mai intâi la nivel post-transcripțional și apoi, la nivel genetic. Se constată apariția genelor independente pentru proteine PL sub un control distinct și autonom (Lewis și Ausio, 2002). Pentru ca aceste evenimente să aibă loc este necesară o rată înaltă de recombinare la nivel genomic. Citat după

1.2.4. Rolul fosforilării proteinelor PL în remodelarea cromatinei

În spermatozoizi numeroase situsuri bine conservate de la nivelul regiunilor N-terminale ale proteinelor spH1 și spH2 sunt fosforilate la începutul spermiogenezei, iar în stadiile finale sunt defosforilate, în același timp cu o condensare excesivă a cromatinei (Poccia și Green, 1992). Imediat după fecundație, aceste situsuri sunt rapid fosforilate din nou. Fosforilarea crește sarcina negativă și este un mecanism important prin care poate fi modulată precis și temporar afinitatea acestor proteine față de ADN, în timpul spermiogenezei.

Remodelarea cromatinei necesită acțiune topoizomerazei I pentru a menține o relaxare suficientă a ADN (Cobb și colab., 1997), deci aceasta ar putea fi implicată în reglarea proteinelor PL prin fosforilarea domeniilor lor SR (Arg-Ser).

1.2.5. Structura cromatinei ca rezultat al interacției protaminelor cu ADN în nucleii spermatozoizilor

Remodelarea cromatinei este un fenomen major care are loc în cursul spermatogenezei. Condensarea nucleară în cursul spermiogenezei este realizată prin înlocuirea unor histone cu proteine de tranziție și, în final, cu protamine. Prin această împachetare a materialului genetic informația genetică se transmite eficient, în special în cazul spermatozoizilor și al virusurilor.

Înlocuirea histonelor cu protamine are loc la mamifere în spermiogeneză, pentru o împachetare optimă a ADN-ului spermatozoidului care este mult mai condensat (de șase ori) decât cel din cromozomii metafazici.

Legarea protaminelor în șanțurile minore ale dublului helix de ADN lasă foarte puține zone libere. Histonele au un efect de poziționare la nivel nucleosomal pe care protaminele nu îl prezintă. În comparație cu nucleii somatici, în nucleii spermatozoizilor se dobândește o altă organizare specifică, pierzându-se structura nucleosomală și superhelicitatea negativă.

Nivele de organizare ADN în nucleii spermatozoizilor (după Ward, 1993):

1. Dublul helix ADN – la spermatozoid este aproape identic cu cel al ADN somatic, dar are lungime mai mare a secvențelor telomerice și prezintă o extindere a hipermetilării ADN.

2. Complexul ADN-protamine – de formă toroidală, omolog cu fibra nucleosomală din nucleii celulelor somatice.

Rolul complexului ADN-Protamine în împachetarea ADN, conformația și reactivitatea acestuia

Repulsia electrostatică dintre segmentele de ADN învecinate este eliminată după completa neutralizare a catenelor fosfodiesterice, permițând împachetarea strânsă a moleculelor. În vederea minimalizării volumului necesar pentru împachetare, regiunea din protamine care iese în afara adânciturii minore, împreună cu cozile C- și N-terminale ce interacționează cu segmentele poli-Arg, este poziționată în adâncitura majoră a moleculei adiacente de ADN.

Toroidul este unitatea fundamentală de împachetare a ADN legat cu protamine. El are un diametru de 90 nm (~60 Kb). În celulele somatice, ADN-ul este răsucit de două ori în jurul octamerului histonic, formând un solenoid. La spermatozoizi, protaminele înlocuiesc histonele și se formează toroidul prin răsucirea complexului ADN-protamine. Înlocuirea histonelor este favorizată de modificări posttranslaționale. Nucleul spermatidei conține în momentul maturării aproximativ 50000 de astfel de structuri toroidale.

3. Echivalentul solenoidic – o tură a solenoidului cuprinde 13 supraînfășurări ale ADN, câte două pentru fiecare din cei 6 nucleosomi și una pentru solenoidul însuși. Prin transformarea a 11 din cele 12 de încolăciri nucleosomale în încolăciri simple rezultă pentru fiecare tură a solenoidului câte 2 cercuri în spirală.

4. Domeniile buclate – reprezintă următorul nivel de organizare, având o dimensiune mai redusă la mamifere în nucleii spermatozoizilor decât în celulele somatice (aproape jumătate). Acestea sunt atașate de matricea nucleară prin secvențe specifice.

În matricea nucleară se regăsesc mai puțin de o zecime din totalul proteinelor nucleare și are proprietatea de a păstra dimensiunea și forma nucleului atunci când acesta este izolat. Ea este formată dintr-o rețea de fibre distribuite în interiorul nucleului. În timpul spermiogenezei, nucleul suferă modificări morfologice complexe: condensare și modificarea formei prin remodelări ale matrixului nuclear.

În timpul spermatogenezei la om, telomerele sunt grupate la periferia spermatocitelor, aranjament care este întâlnit și la spermatozoidul matur.

Cromatina spermatozoidului este cea mai condensată structură de ADN cunoscută.

Proteinele nucleare sperm-specifice și rolul lor în asigurarea structurii și funcției materialului genetic

Structura cromatinei este rezultatul interacției dintre ADN și proteinele cromozomale. Proteinele cromozomale au rolul de a menține integritatea structurală a cromozomului, de a proteja ADN de acțiunea dezoxiribonucleazelor și de a regla activitatea genică.

Pe parcursul spermatogenezei, la nivelul cromatinei din celulele stem au loc anumite tranziții dinamice asociate frecvent cu importante modificări ale compoziției sale și cu alterări semnificative în structura sa. De cele mai multe ori, compoziția proteinelor cromozomale din stadiile finale ale spermatogenezei este total diferită de cea din stadiile inițiale. Astfel, cromatina este înalt compactată expresia genică fiind consecutiv total blocată în spermatozoizi.

1.3.1. Proteine cromozomale specifice tesutului testicular

Deși proteinele cromozomale specifice spermatozoizilor prezintă o imensă variabilitate structurală, ele pot fi grupate în funcție de compoziția lor în trei categorii:

Tipul H (histone-type) – proteine cu o compoziție în aminoacizi similară cu histonele din celulele somatice;

Tipul P (protamine-type) – proteine cu masă moleculară mică (4000-10000 Da), bogate în arginină (>60%). Pe parcursul spermatogenezei, aceste proteine înlocuiesc aproape total histonele din celulele stem;

Tipul PL (protamine-like) – proteine cu o compoziție de aminoacizi intermediară între tipurile descrise anterior (35-50% arginină și lizină).

Histonele

Histonele sunt proteine cu un puternic caracter bazic datorat faprului că 25% din aminoacizii constituenți sunt încărcați pozitiv (arginină, lizină și histidină). Triptofanul, fenilalanina și tirozina lipsesc complet.

În funcție de conținutul în arginină și lizină, histonele cromozomale pot fi împărțite în cinci clase, fiecare cu câteva subtipuri ce diferă prin 1 sau 2 aminoacizi:

H1 – bogate în lizină,

H2A și H2B – moderat bogate în lizină,

H3 și H4 – relativ bogate în arginină.

Histonele pot suferi modificări chimice cum ar fi: metilarea, acetilarea și fosforilarea diferiților aminoacizi. Acestea conduc la schimbarea sarcinii moleculelor histonice, fiind corelate cu procese ca activarea sau inactivarea genelor, replicarea ADN și citodiferențierea.

Modificările histonelor sunt schimbări reversibile, cu excepția metilării, fiind asociate cu evenimente cromozomale distincte. Interacțiunea histonelor cu alte componente cromozomale sunt influențate direct de procesele de fosforilare și acetilare. Modificarea sterică a histonelor are loc deoarece grupările fosfat și acetil sunt voluminoase. Regiunile de prindere sunt cele mai afectate de modificările amintite fiind regiuni foarte voluminoase. În concluzie, cele trei modificări chimice (metilarea, fosforilarea și acetilarea) afectează structura fibrei nucleozomale prin faptul ca influențează interacțiunea dintre ADN și histone.

În etapele de diferențiere a spermatogoniei până ajunge spermatozoid matur au loc rearanjamente structurale la nivelul cromatinei celulelor spermatice, histonele fiind înlocuite treptat de proteinele de tranziție și apoi, de protamine. Histonele specifice țesutului testicular sunt asemănătoare cu izoformele histonice din țesuturile somatice.

Pe măsură ce spermatocitele se dezvoltă, pattern-urile subtipurilor histonice se modifică într-o manieră specifică (cu excepția histonei H4) sub controlul unor mecanisme care reglează expresia genelor în celulele specifice pentru subtipurile histonice, la nivel translațional sau posttranscripțional (Tabel 1).

Tabelul 1. Expresia genelor histonice în spermatogeneza mamiferelor. Prezența subtipurilor histonice în diferitele stadii de dezvoltare ale spermatocitelor, înainte de înlocuirea acestora de proteinele de tranziție și, în final, de protamine (după Burlibașa, 2008).

Subtipurile histonice testiculare

Celulele germinale mascule au un număr neobișnuit de mare de variante histonice comparativ cu celulele somatice

Histonele specifice țesutului testicular apar în spermatogonii, apoi în spermatide, majoritatea fiind sintetizate și încorporate la nivelul cromatinei în timpul meiozei.

Gena H1t – se exprimă numai în celulele din testicul (este o genă înalt conservată). Proteina H1t nu este o variantă generală meiotică, fiind limitată la celulele liniei germinale mascule. În spermatocitele aflate în pachiten și în cele din stadiile târzii, cantitatea de H1t este foarte mare.

H2A și H2B – pereche de gene cu exprimare testiculară ce codifică pentru proteinele cu localizare testiculară TH2A și TH2B. Genele H2A.Z. și H2A.X. sunt subtipuri ale H2A cu replicare independentă. În cromatina celulelor testiculare este abundentă H2A.Z., H2A.X. fiind specifică țesuturilor somatice.

H3 (TH3) – subtip testicular de histonă H3 în testiculul de șobolan. Este diferit structural de celelalte subtipuri H3 cunoscute, incluzând 3 resturi de cisteină. Gena pentru TH3 nu a fost deocamdată identificată în nici un genom de mamifer.

Subtipul H3.3 – se exprimă în timpul spermatogenezei, din stadiul de spermatidă până în stadiile timpurii ale spermatogenezei. H3.3 suferă numeroase modificări asociate cu silențierea și formarea heterocromatinei.

H3.3A este prezentă pe parcursul stadiilor de dezvoltare de la spermatogonie la spermatidă. În profaza I, histona H3 este înlocuită masiv cu H3.3A și H3.3B, asociate cu eucromatina, sugerând un posibil rol în cadrul transcripției masive care are loc în spermatocite (Bramlage și colab., 1997, Kimmins și Sassone-Corsi, 2005).

Histona H4 are o secvență de 102 aminoacizi ce este menținută la toate speciile de mamifere, atât la celulele germinale, cât și la cele somatice. Este cea mai conservată dintre toate clasele de histone.

Tranziția histonelor în protamine pe parcursul spermatogenezei la om constă într-o înlocuire parțială a histonelor. Aproximativ 15% din ADN spermatozoizilor rămâne atașat miezului histonic, în mod special cu H2A, H3.1, H3.3 și H4 (înalt acetilată). H1 nu a fost detectată în cromatina spermatozoidului matur (Burlibașa, 2008).

Prin schimbarea treptată în timpul dezvoltării celulelor germinale mascule a histonelor linker și a histonelor din miezul nucleozomal și prin modificarea morfologiei cromatinei și a activității genice, un rol funcțional important este atribuit subtipurilor histonice.

Histonele din stadiul de spermatide prezintă modificări posttranslaționale, cea mai impresionantă dintre acestea fiind hiperacetilarea histonelor în timpul spermatogenezei. Această modificare a structurii histonei H4 are loc la spermatidele în curs de elongare, când are loc înlocuirea histonelor de către proteinele de tranziție, fiind corelată cu mai multe procese celulare, inclusiv cu controlul transcripțional și asamblarea cromatinei (Burlibașa, 2008).

Protaminele

Histonele vor fi înlocuite pe parcursul maturării spermatozoidului cu protaminele. Acestea sunt un grup de proteine cu greutate moleculară mică (4.000-10.000 daltoni), înalt bazice, bogate în arginină. Spre deosebire de histone, care au o structură înalt conservată pe parcursul evoluției, protaminele specifice spermatozoidului variază enorm între specii. În general există un singur tip de protamină, însă la om au fost identificate până în acest moment 2-3 tipuri de protamine codificate de gene diferite.

Protaminele se sintetizează inițial în citoplasma spermatidelor în curs de formare, iar apoi se deplasează în nucleu pentru a înlocui treptat histonele. Histonele bogate în lizină sunt înlocuite inițial cu histone bogate în arginină (proteine de tranziție), iar apoi acestea sunt înlocuite cu protamine.

În nucleii spermatozoizilor, structura nucleozomală și superhelicitatea negativă din nucleii celulelor somatice se pierd, câștigându-se o altă organizare specifică, patternul de legare al protaminelor din șanțurile minore ale dublului helix de ADN, asigurând o căptușire a ADN aproape completă lăsând zone libere foarte puține.

Protamine-like

Sunt proteine ce au o compoziție intermediară de aminoacizi, între cele două tipuri prezentate anterior. Conținutul lor în arginină și lizină este de aproximativ 30-50% și, chiar mai mare ocazional. Frecvent prezintă o structură înrudită cu cea a histonei H1.

În ultimele stadii ale spermatogenezei, proteinele PL (protamine-like) au o heterogenitate structurală semnificativă, având mase moleculare de 5.000 – 30.000 daltoni. Acest tip de proteine sperm-specifice au fost împărțite în două categorii în funcție de masa lor moleculară, și anume: PL-I (> 15.000 Da) și PL-II sau PL (≤ 15.000 Da).

Domeniile terminale non-globulare N și C ale proteinelor PL prezintă o variabilitate mare.

1.3.2. Condensarea ADN în nucleii spermatozoizilor

La mamifere, substituția histonelor de către protamine are loc în spermiogeneză și astfel se realizează o împachetare strânsă a ADN-ului spermatozoidului care va fi de 6 ori mai condensat față de cel din cromozomii metafazici.

Cele două etape în care are loc înlocuirea histonelor cu protamine sunt:

1. Histonele bogate în arginină înlocuiesc histonele bogate lizină;

2. Protaminele înlocuiesc histonele bogate în arginină.

Lipsa de activitate a cromatinei este dovedită de absența superspiralizării ADN în nucleii spermatozoizilor. Superhelicitatea negativă conferită de histone nu este necesară deoarece la nivelul spermatozoizilor nu au loc procese de replicare sau transcriere.

Deoarece protaminele se atasează la nivelul dublului helix de ADN în șanțurile minore, ele reușesc să căptușească aproape complet ADN lasând foarte puține zone libere, spre deosebire de modelul de legare al histonelor în nucleosom. Astfel, protaminele nu au un efect de poziționare cum au histonele, iar structura nucleozomală și superhelicitatea negativă nu se mai regăsesc în nucleii spermatozoizilor, dar se câștigă o altă formă de organizare specifică.

După Ward (1993), ADN-ul din nucleii spermatozoizilor prezintă următoarele nivelele de organizare: dublul helix ADN, complexul ADN-protamine sub formă toroidală, echivalentul solenoidic și domeniile buclate.

Dublul helix ADN are o configurație este aproape identică cu cea a ADN-ului din celulele somatice, dar lungime secvențelor telomerice este mai mare și hipermetilarea ADN extinsă.

Complexul ADN-protamine este omologul fibrei nucleozomale din nucleii somatici. Unitatea fundamentală de împachetare a ADN legat cu protamine este toroidul, cu un diametru de 90 nm, conținând aproximativ 60 Kb, și nu nucleozomul. Această structură diferă complet de orice altă structură pe bază de cromatină din nucleii celulelor somatice (Hud și colab. 1993).

Spermatidele și spermatozoizii nu își replică ADN și nici nu și-l transcriu, deci nu este necesar ca ADN să fie suprarăsucit. Genomul spermatocitelor este condensat, modelul său de impachetare protejându-l în timpul transportului pentru fecundare, atât prin presiunea de stivuire a proteinelor, cât și prin forțele Van der Waals. ADN se dispune în cercuri concentrice suprapuse asemănător cu un colac de sârmă sau torus.

Modelul de împachetare este următorul: porțiunile centrale ale protaminelor care sunt bogate în Arg se află în adânciturile minore ale macromoleculei de ADN; prin neutralizarea sarcinilor electrice negative ale ADN de către gruparea Arg se elimină repulsia electrostatică dintre segmentele vecine. Cozile protaminelor se află localizate în adânciturile majore ale ADN adiacent și permit astfel legarea paralelă a moleculelor de ADN.

Echivalentul solenoidic nu este încă pe deplin elucidat. Modelul actualul admite că, o tură a solenoidului cuprinde 13 supraînfășurări ale ADN, una pentru solenoid și câte două pentru fiecare din cei șase nucleozomi. O tură a solenoidului este formată din 2 cercuri în spirală rezultate transformarea a 11 dintre cele 12 încolăciri ale nucleozomului în încolăciri simple.

Domeniile buclate sunt considerate nivelul următor de organizare al ADN din nucleii spermatozoizilor de la mamifere (om, hamster). Buclele acestor domenii au în cazul spermatozoizilor o dimensiune mai redusă decât în celulele somatice, și prezintă secvențe specifice cu ajutorul cărora se atașează de matricea nucleului.

Matricea nucleară conține mai puțin de o zecime din totalul proteinelor ce alcătuiesc nucleul, fiind un element de structură al nucleului care menține dimensiunea și forma originală a acestuia când este izolat.

Uneori, ADN din spermatozoizi poate prezenta același model de bandare G ca și cromozomii mitotici din celulele somatic, deoarece poate fi prematur condensat în cromozomii monocromatidici. Deci, pe parcursul spermiogenezei, cromozomii nu ocupă poziții precise, existând o anumită variabilitate a aranjării în spațiu a cromozomilor în nucleii spermatozoizilor. Pe de altă parte s-a demonstrat că secvențele repetate ale telomerelor sunt strâns legate de matricea nucleară.

După fuziunea gameților, nucleul spermatozoidului se condensează în citoplasma ovocitei, formând pronucleul mascul care rămâne inițial separat de pronucleul femel al ovocitei, și se reactivează genetic prin modificări structurale și biochimice.

Spermatozoizii se maturează în epididim fiind capabili să se deplaseze, dar dobândesc capacitatea de a fertiliza ovulul abia în aparatul reproducător femel suferind anumite modificări fiziologice denumite global cu termenul de capacitare.

Nucleii suferă anumite modificări pe parcursul capacitării, cum ar fi: pierd ionii de zinc, grupările -SH rămân libere și sunt oxidate, dând naștere punților disulfhidrice. De asemenea, au loc modificări la nivelul membranei plasmatice a spermatozoidului.

După contactul cu ovulul, cele două membrane fuzionează și spermatozoidul pătrunde în citoplasma ovulului astfel: . printr-un proces de tip fagocitic este înglobată porțiunea anterioară a capului spermatozoidului, iar prin fuziunea membranelor sunt înglobate pasiv regiunea posterioară a capului și coada spermatozoidului. După ce nucleul ajunge în citoplasma ovulului, anvelopa nucleară se dezorganizează. Spre deosebire de celulele somatice, anvelopa nucleară nu prezintă pori decât în regiunea posterioară. Procesul de decondensare a nucleului este determinat prin ruperea legăturilor disulfhidrice ale protaminelor și substituirea acestora cu histone. Reducerea se realizează de către glutation, tripeptid foarte abundent la nivelul citoplasmei oului. Înlocuirea de către histone a protaminelor se desfășoară în primele 5 minute după intrarea spermatozoidului în ovul, având la bază competiția pentru protamine dintre nucleoplasmină și ADN. Fuziunea nucleilor femel și mascul are loc în aproximativ 12 ore la mamifere. În momentul în care nucleul spermatozoidului se decondensează, are loc a doua diviziune meiotică la nivelul nucleului ovulului. Pronucleii migrează apoi unul către celălalt, replicându-și în același timp ADN-ul. Nucleozomii se reconstituie prin urmare înainte de faza S care precede prima diviziune de tip mitotic a nucleului.

În concluzie, pe parcursul spermiogenezei modificările biochimice ale cromatinei au în principal scopul de a realiza rearanjamente de ordin arhitectural ce vor conduce la represia totală a activității genice din nucleii spermatozoizilor maturi, aceștia fiind considerați numai ca niște “cărăuși” ai bagajului genetic către generațiile următoare (Burlibașa, 2008).

CAPITOLUL II

MECANISME EPIGENETICE IMPLICATE IN CITODIFERENȚIEREA LINIEI GERMINALE MASCULE

Epigenetica studiază mecanisme implicate în controlul expresiei genice care nu sunt legate de secvența nucleotidică a ADN. Mecanismele epigenetice includ modificarea resturilor aminoacizilor specifici ai miezului histonic, metilarea ADN, generarea de ARN necodificator (ncRNA) și remodelarea cromatinei (Schagdarsurengin și colab., 2012).

Gametogeneza se caracterizează prin reprogramarea totală a epigenomului, fiind unul dintre singurele evenimente din viața celulară pe parcursul căruia modelul epigenetic al celulelor germinale este complet șters și refăcut pentru a face posibilă creerea tuturor tipurilor celulare necesare pentru apariția unui întreg nou organism (Fig. 1).

Spermatogeneza este un proces complex ce implică multiplicarea celulelor stem germinale, diferențierea lor în spermatocite, diferențierea spermatidelor la finalul diviziunii meiotice și transformarea lor în spermatozoizi maturi. Spermatogeneza este un proces continuu începând de la pubertate și se caracterizează prin trei stadii: premeiotic (spermatogoniogeneza), meiotic și postmeiotic (spermiogeneza). Spermatogonia se divide prin mitoză și apoi suferă meioza formând spermoatocitele primare în preleptoten. ADN-ul lor se replică și intră apoi în profaza primei diviziuni meiotice. La spermatocitele în pachiten, cromozomii omologi se împerechează și are lor un schimb de segmente de ADN, proces numit recombinarea omologilor (crossing-over meiotic). Proteinele de la nivelul situsurilor de recombinare facilitează acest proces, iar structura care se formează se numește complex sinaptonemal. Cromozomii X și Y se unesc cap la cap, la nivelul regiunilor lor pseudoautozomale, formând prin heterocromatinizare corpusculul sexual. Inactivarea meiotică a cromozomilor sexuali implică și heterocromatinizarea variantelor histonice H2A (H2A.1) și HP1, dar și ubuquitinilarea lui H2A (H2Aub) (Kimmins and Sassone-Corsi, 2005).

La masculi, meioza se caracterizează prin înlocuirea histonelor specifice celulelor somatice cu variante specifice, unele dintre ele fiind specifice testiculului. Prin prima diviziune meiotică rezultă spermatocitele secundare, care suferă imediat a doua diviziune meiotică, dând naștere spermatidelor rotunde, haploide. Nucleul spermatidelor se maturează postmeiotic, suferind un proces de remodelare în care sunt implicați factori transcripționali și reglatori. Până în stadiul final al spermatogenezei, are loc o reorganizare totală a genomului haploid, urmată de compactarea ADN prin modificări locale legate de procesul de imprinting, reglarea expresiei genelor specifice și heterocromatinizarea unor regiuni cum ar fi corpusculul sexual în spermatocite, și prin modificări la nivel global legate de înlocuirea histonelor cu protamine (proteine bazice nucleare spermatice – SNBP) și condensare. În spermatozoizi expresia genică este blocată complet prin această compactare (Caron et al., 2005). Diferențierea celulară care are loc pe parcursul spermatogenezei se caracterizează printr-o restructurare totală a cromatinei ce conduce la formarea structurii nucleare unice a spermatozoizilor.

Diferențierea celulelor spermatice este esențială pentru succesul fecundației și pentru o dezvoltare normală a embrionului.

Figura 1. Dezvoltarea embrionară (după Burlibașa și Gavrilă, 2011).

Cele două stadii ale reprogramării epigenetice pe parcursul dezvoltării: gametogenică și reprogramare preimplantațională. Informația gameților în stadii finale ale diferențierii trebuie reprogramată astfel încât zigotul rezultat prin fecundație să fie totipotent (capabil să dea naștere tuturor tipurilor celulare). Totipotența este pierdută în primele etape ale dezvoltării, atunci când începe separarea trofectodermului de masa celulară internă. În acest moment celulele sunt pluripotente.

2.1. Modificările chimice ale histonelor și mecanismele de reglare a transcrierii

Spermatozoizii sunt transcripțional inactivi, dar conțin histone cu un grad mare de acetilare, specifice celulelor cu activitate transcripțională. Funcția acestora nu este cunoscută, dar se presupune că ele reprezintă un semnal epigenetic specific celulelor spermatice care va fi transmis ovocitului, fiind implicat ulterior în zigot în reglarea expresiei genice (Schagdarsurengin și colab., 2012).

Histonele pot suferi unele modificări chimice în strânsă legătură cu activitatea genică, replicarea ADN și citodiferențierea, cum ar fi: metilarea, acetilarea, fosforilarea, ubiquitinilarea, glicozilare și ADP-ribozilare. Ca rezultat, pot avea loc schimbări ale sarcinii moleculelor histonice. La nivel testicular, există un cod histonic specific implicat în procesele de compactarea cromatinei și de îndepărtare și degradare a histonelor din timpul spermiogenezei (Burlibașa și Gavrilă, 2011).

Histonele sunt adevărate căi de semnalizare deoarece poartă markeri epigenetici pentru activarea transcripției sau inactivarea unor domenii cromozomiale.

2.1.1. Metilarea histonelor

Metilarea histonelor este o modificare ce are loc la nivelul aminoacizilor bazici (arginina, lizina și histidina) prin încorporarea specifică a grupării metil sub acțiunea unor enzime de metilare de origine nucleară numite histon-metiltransferaze (metilaza III). Donorul de grupări metil este S-adenozinmetionina. Metilarea este corelată cu scăderea activității de transcriere.

Metilarea histonelor crește interacția dintre histone și ADN prin creșterea bazicității, amplifică interacțiunile hidrofobe ale histonelor cu alte proteine prin creșterea hidrofobicității lor și induce modificări sterice (Burlibașa și Gavrilă, 2011).

Suv39h2 este o metiltransferază supraexprimată la nivel testicular, prezentă în regiunile heterocromatice din spermatocitele în leptoten până în stadiul de spermatidă rotundă (Agalioti și colab., 2002).

Metilarea anormală este asociată cu infertilitate, defecte de imprinting și cancer (La Salle și Trasler, 2006).

2.1.2. Acetilarea histonelor

Acetilarea histonelor este o modificare dinamică, reversibilă, lposttranslațională a lizinei, și simultană cu translația la nivelul serinei, cu formarea de ɛ-N-acetillizină și respectiv, N-acetilserină. Acetilarea are loc în domeniul aminoterminal al miezului histonic și este asociată cu activarea transcripțională a genelor. Donorul de grupări metil este acetil-CoA, iar enzimele implicate sunt: histon-acetilaza (HAT) și histon-deacetilaza (HDAC).

În timpul spermatogenezei au fost evidențiate variante acetilate ale histonelor. Spermatogoniile și spermatocitele în preleptoten conțin miez histonic acetilat de H4, în timp ce la spermatocitele în meioză, în leptoten sau pachiten, nu s-au observat histone acetilate.

Spermatogeneza este un bun model de studiu pentru modificările chimice ale histonelor asociate cu diviziunea celulară și diferențierea. În spermiogeneză, au loc blocarea transcripției genice și înlocuirea histonelor cu protamine (Fig 2). Transcripția este activă în spermatogonii, în spermatocitele în pachiten și în spermatidele rotunde, și se oprește la spermatidele elongate. La mijlocul perioadei de dezvoltare a spermatidelor, are loc înlocuirea histonelor cu proteine de tranziție, mai bazice denumite protamine și condensarea ADN (Burlibașa și Gavrilă, 2011).

Acetilarea aberantă a histonelor este asociată cu afectarea spermatogenezei (Fenic și colab., 2004).

Fig 2. Mecanismele moleculare implicate în condensarea cromatinei și în înlocuirea histonelor în timpul spermatogenezei (după Burlibașa și Gavrilă, 2011).

Unii represori transcripționali postmeiotici se pare că rectutează histon-deacetilaze de clasă I (HDAC) în cromatină în stadiile timpurii ale spermatogenezei pentru a iniția deacetilarea generală a histonelor și represia transcripțională. În următorul stadiu al spermiogenezei, degradarea HDAC de clasă I ar induce o hiperacetilare globală a miezurilor histonice, conducând la încorporarea proteinelor cu bromodomenii (proteine Brd), care pot funcționa ca semnal pentru îndepărtarea și degradarea histonelor acetilate și înlocuirea lor cu proteine de tranziție, și în final cu protamine ADN (Burlibașa și Gavrilă, 2011).

2.1.3. Fosforilarea histonelor

Fosforilarea are loc la nivelul serinei și treoninei, crescând sarcina negativă a histonelor și facilitând desprinderea lor de ADN. Donorul de grupări fosfat este ATP, iar enzimele sunt proteinkinazele și fosfatazele.

H2A.X joacă un rol crucial în spermatogeneză, deoarece funcția sa este strâns legată de repararea rupturilor dublu catenare în ADN (Rogakou și colab., 1998).

2.1.4. Ubiquitinilarea histonelor

Ubiquitinilarea este o modificare marker pentru degradarea proteinelor pe calea proteasomului, dar este implicată și în repararea ADN, în codul histonic și în controlul ciclului celular (Baarends și colab., 1999).

Ubiquitinilarea histonelor a fost descrisă și în remodelarea cromatinei din timpul spermatogenezei la șobolan, șoarece, păstrăv și cocoș (Baarends și colab., 1999), pe parcursul căreia joacă un rol fundamental. De exemplu, la șoarece H2A este ubiquitinilat (uH2A) într-un procent mare în domenii specifice ale cromatinei, cum ar fi în corpusculul sexual din spermatocitele pachitenice. Apoi apare depleția uH2A în spermatidele rotunde, dar este din nou detectată în spermatidele elongate (Baarends și colab., 1999). HR6, enzimă cu rol în conjugarea ubiquitinei, ubiquitinizează H2B in vivo și este puternic exprimată în testicul (Sung și colab., 1988). În absența ei, spermatogeneza se oprește la stadiul de spermatide rotunde sau elongate (Roest și colab., 1996).

Prin studii imunochimice s-a arătat că la șoarece H2A este în cantitate maximă în stadiul de pachiten din profaza meiozei I în celulele gametice. La început, în pachitenul timpuriu, H2A este concentrată în cromatina corpusculului sexual care este condensată și inactivă transcripțional. Apoi, apare în tot nucleul în pachitenul mijlociu, sugerând că ar putea facilita înlocuirea histonelor cu variantele specifice țesutului testicular (Poccia și colab., 1987). Expresia H2A crește din nou (Hendriksen și colab., 1995) în timpul elongării nucleare postmeiotice și în fazele de condensare din spermatogeneză, când histonele sunt înlocuite treptat cu proteine de tranziție, și ulterior cu protamine.

2.2. Rolul „long-range RNA” și al microRNA în procesele de diferențiere a spermatozoidului

Deși spermatozoidul conține citoplasmă în cantitate foarte mică și este inactiv transcripțional și translațional, s-a demonstrat că el conține populații complexe de ARN (ARNm, miARN, piARN) pe care le transmite în timpul fecundației și care codifică informație epigenetică, dar a căror funcție este încă studiată (Ostermeier și colab., 2004). Reproducerea este controlată nu numai de gene codificatoare pentru proteine, ci și de regiuni necodificatoare, inclusiv loci care produc ARN-uri mici, care se leagă prin complementaritate de ARNm (ARN mesager) pentru a stimula degradarea acestora sau pentru a represa translația lor (Xuan și colab., 2015).

Reîmpachetarea selectivă a cromatinei și medierea unor etape specifice imprintingului în momentul fecundației ar putea fi două dintre rolurile ARN (Miller și colab., 2005). De asemenea, specii de microARN (miARN) și siARN (silencing ARN) sunt implicate în reglarea translației pe parcursul diferențierii celulare (Ostermeier și colab., 2005).

miARN (21-23 nucleotide) transmise de spermatozoid codifică informații epigenetice utilizate în timpul dezvoltării embrionare (Ostermeier și colab., 2005). miARN este un ARN necodificator care controleză translația ARNm legându-se specific de el. Cea mai mare cantitate de miARN se găsește în celulele meiotice, iar lipsa lui poate bloca maturarea acestora. Expresia miARN este afectată de modificări epigenetice ca modificarea histonelor și metilarea ADN.

piARN (PIWI interaction RNA) (29-30 nucleotide), specific țesutului testicular, este prezent în profaza I, dar dispare treptat în timpul procesului de elongare a spermatidelor. Unele tipuri de piARN pot rămâne în spermatozoid, transmițând informație epigenetică după fecundație. Este implicat în reglarea expresiei genice pe parcursul spermatogenezei. Dupa cine

Pe parcursul proceselor de diferențiere a spermatozoizilor intervin molecule de ARN mic necodificator, inclusiv miRNA, care intervin în reglarea posttranscripțională a expresiei genice.

2.3. Rolul proceselor de metilare/demetilare ADN în setarea informației genetice specifice liniei germinale mascule

Metilarea ADN a genomului la mamifere are loc la nivelul dinucleotidelor CpG și este implicată în mai multe procese ca inactivarea cromosomului X, carcinogeneză și reglarea expresiei genice. Pe parcursul gametogenezei, este stabilit un pattern de metilare ADN, care este apoi modificat în primele stadii ale embriogenezei (Kelly și colab., 2003).

Gametogeneza implică o uniformizare a amprentei parentale pentru ca toate celulele gametice să poarte aceeași amprentă unică, paternă la masculi și maternă la femele.

Metilarea ADN reprezintă o formă de adnotare a genomului care mediază represia genelor, fiind un marker care poate fi utilizat pentru resilențierea cromatinei după fiecare rundă de replicare. Pe parcursul dezvoltării, modelul de metilare ADN a liniei germinale este șters în stadiul de blastocist, și în momentul implantării, când întregul genom este metilat cu excepția insulelor CpG, se stabilește un nou model bimodal. Acestă represie totală permite genelor house-keeping să se exprime în toate celulele organismului. Postimplantațional, au loc modificări ale metilării stadiale și specifice fiecărui țesut care vor determina în final modelul epigenetic caracteristic fiecărui tip celular. Acest proces este controlat de informația conținută de secvența ADN și reprezintă un eveniment secundar care asigură stabilitatea expresiei pe termen lung(Cedar și Bergma, 2012).

Metilarea ADN are loc la nivelul dinucleotidelor citozină-fosfat-guanină (CpG) la carbonul 5 al resturilor de citozină (5-mC) și este implicată în stabilirea imprintingului parental, prin reglarea expresiei unor clustere de gene situate pe cele două alele. Astfel, anumite alele vor fi exprimate paternal, iar corespondentele lor maternale vor fi silențiate, și invers (Delaval și Feil, 2004 ; Morison și colab., 2005). În cazul celulelor germinale primordiale, paternul de metilare este șters după migrarea celulelor primordiale germinale la nivelul crestelor genitale (Lee și colab., 2002; Yamazaki și colab., 2003) ceea ce permite restabilirea ulterioară a unui nou model de imprint specific parental în stadiile târzii ale gametogenezei.

Demetilarea insulelor CpG metilate este un subiect controversat, deoarece nu se cunoaște nici o enzimă cu activitate de demetilare a ADN. Demetilarea are loc în mod pasiv, atunci când modelul de metilare nu este copiat la fiecare replicare a ADN. Astfel, reprogramarea epigenetică poate avea loc și fără prezența unei demetilaze. Totuși, se pare că in vivo există un complex cu activitate de demetilare, deoarece după fecundație întregul genom parental este demetilat înainte de prima diviziune celulară (Morgan și colab., 2005).

ADN-ul testicular este înalt hipometilat, fenomen caracteristic țesuturilor transcripțional active. Spre deosebire de celulele somatice, hipometilarea nu este localizată în secvențe din insule CpG, ci în afara promotorilor genici (Schagdarsurengin și colab., 2012). E tradus bine??

Metilarea corectă joacă un rol important în spermatogeneză. Metilarea aberantă (hipermetilarea) a ADN este asociată cu parametri spermatici anormali, infertilitate masculină idiopatică și sarcini eșuate (Benchaib și colab., 2005).

2.4. Imprinting genomic și maladii asociate

La mamifere, zigotul moștenește prin fecundație două seturi cromozomale complete, unul de la tată și unul de la mamă, majoritatea genelor autosomale fiind exprimate atât de alelele materne, cât și de cele paterne (Butler, 2009).

Imprintingul genomic stabilește expresia unui singur subset de gene prin blocarea exprimării uneia dintre alelele parentale. Marcarea epigenetică diferențiată are loc în cursul gametogenezei sau în primele diviziuni după fecundație când imprintingul genomic este șters în ambele linii germinale și resetat prin metilarea ADN, modificarea structurii cromatinei și modificări ale histonelor (La Salle și Tasler, 2006).

Gameții sunt în mod special sensibili la modificările epigenetice deoarece modelul de metilare se stabilește inițial la liniile germinale femele și mascule și este esențial pentru dezvoltarea normală a embionului. Modificările epigenetice nu afectează secvența ADN și sunt ereditare, fiind menținute prin diviziuni mitotice în celulele somatice ale organismului. Silențierea expresiei genice poate avea loc prin trei mecanisme care interacționează între ele: silențierea asociată ARN, modificări ale histonelor și metilarea ADN.

Setarea corectă a imprintingului genomic este foarte importantă pentru o dezvoltare normală a organismului.

Maladiile epigenetice ca cele asociate imprintingului, sarcinile molare și cancerele la copii, pot avea ca substrat tocmai o expresie genică modificată sau chiar silențiată datorită interacțiunii deficitare a acestor trei mecanisme (La Salle și Trasler, 2006).

Modificările posttranslaționale ale cozilor histonice ca metilarea, acetilarea și fosforilarea unor resturi ale aminoacizilor sunt asociate cu alterări ale competenței transcripționale (Geiman și Robertson, 2002). De asemenea, silențierea heterocromatică este mediată de transcripți antisens, ARN necodificator și ARN de interferență (Lippman și Martienssen, 2004).

2.4.1. Defecte de imprinting datorate lipsei localizate a metilării

Pierderea funcției unui număr de gene imprintate este corelată cu maladii genetice, cu avansarea unor tipuri de cancer și cu afecțiuni neurologice. Cele mai studiate maladii datorate defectelor de imprinting sunt sindromul Prader-Willi, sindromul Angelman, sindromul Beckwith-Wiedemann și sindromul Russel-Silver. Disomia uniparentală se manifestă prin supraexprimarea sau subexprimarea genelor imprintate implicate în controlul creșterii fetale și a dezvoltării postnatale. Un alt mecanism ar putea fi deleția uneia sau mai multor gene, sau mutații punctiforme care afectează un anumit locus.

Un alt aspect ce trebuie luat în considerare sunt modificările apărute în cazul culturii in vitro a celulelor germinale mascule utilizate în tehnologiile de reproducere asistată. Modelul de metilare ADN și alți markeri epigenetici sunt instabili și sensibili la modificările mediului de cultură și la tehnicile de manipulare. În acest caz poat să apară modificări în metilare și în expresia genelor imprintate la embrionii ce au fost cultivati in vitro înainte de implantare (Doherty și colab., 2000). Totuși, este puțin probabil ca tehnologiile de reproducere asistată să afecteze ștergerea sau setarea imprintingului genomic deoarece utilizează gameți haploizi, iar aceste procese sunt deja finalizate în stadiul de spermatidă al spermatogenezei. Acest aspect poate fi luat în considerare numai în cazul în care se utilizează celule gametice anormale sau imature.

2.4.2. Pierderea totală a metilării

Sarcinile molare au la origine celule cu două genomuri parentale identice. Majoritatea au o etiologie uniparentală, însă există și femei cu o afecțiune autozomal recesivă care duce la sarcină molară cu origine biparentală, în care este implicată fie o pierdere totală a imprintingului, fie metilarea ADN maternal pe genele imprintate (Judson și colab., 2002).

Sarcina molară reprezintă o complicație a sarcinii care se datorează unuei tulburări în timpul procesului de fecundație și poate fi totală sau parțială în funcție de patternul cromozomal. În sarcina molară completă nu se detectează țesut embrionar sau fetal, caracteristic fiind un cariotip 46 XX, cu toți cromozomii de origine paternă, deoarece un ovul anucleat este fecundat de un spermatozoid haploid care își replică propriul material genetic. Molele parțiale sunt caracterizate printr-un cariotip triploid rezultat prin fecundarea unui ovul normal de doi spermatozoizi și prezintă țesut fetal sau embrionar (Berkowitz și Goldstein, 2009).

Pierderea totală a imprintingului pe linia germinală masculină conduce la apariția teratoamelor datorită prezenței a două genomuri maternale.

2.5. ADN-metiltransferaze mamaliene

ADN-metiltransferazele (DNMT) sunt o familie de enzime ce catalizează transferul unei grupări metil donate de cofactorul S-adenozilmetionină (SAM) la carbonul 5 al resturilor de citozină de pe catena ADN, formând 5-metilcitozina (Fig. 3).

Familia proteinelor DNMT realizează metilarea de novo și asigură menținerea modelului de metilare.

Au fost identificate trei clase de metiltransferaze implicate în programarea epigenetică: DNMT1, DNMT2 și DNMT3.

DNMT1 și replicarea ADN –DNMT1 interacționează cu mecanismele implicate în replicarea ADN și copiază modelul de metilare de pe catena matriță pe catena nou sintetizată, făcând posibilă astfel păstrarea aceluiași model de metilare în celulele fiice (Rountree și colab., 2000). DNMT1 este metiltransferaza principală din toate țesuturile somatice, dar nivelul de ARNm al Dnmt1 este cel mai mare în testicul și ovar. DNMT1 se atașeaza la situsurile CpG și formează un complex tranzitoriu cu resturile de citozina de care se legă covalent. După ce gruparea metil este transferată, enzima DNMT 1 este eliberată și devine disponibilă pentru o altaă rundă de replicare.

Fig. 3. Metilarea ADN. (A) Carbonul 5 al citozinei primește o grupare metil cu ajutorul DNMT-urilor, în prezența SAM. (B) Enzimele DNMT3A și DNMT3B sunt responsabile de metilarea de novo a ADN. (C) Menținerea metilării în ADN-ul hemimetilat se realizează sub acțiunea DNMT1 (după Turek-Plewa și Jagodzinski, 2005).

DNMT3 și metilarea de novo – DNMT3A și 3B sunt enzime implicate în metilarea de novo a insulelor CpG, mai ales pe parcursul dezvoltării celulelor germinale și în embriogeneza timpurie (Goll și Bestor, 2005). Activitatea catalitică a lui DNMT3A și 3B este modulată prin interacțiunea cu enzima DNMT-like DNMT3L care nu prezintă activitate intrinsecă (Suetake și colab., 2004). Importanța ei rezidă în faptul că în lipsa activității DNMT3L are loc blocarea meiozei la masculi și o reactivare a retrotranspozomilor (Bourc'his și Bestor, 2004).

DNMT2 – este cea mai bine conservată DNMT (Goll și Bestor, 2005).

Toate DNMT-urile mamaliene sunt caracterizate prin prezența a 10 motive conservate de aminoacizi aflate la nivelul domeniului C-terminal, implicate în funcția lor catalitică.

PARTEA II

CERCETĂRI PROPRII

1. SCOPUL ȘI OBIECTIVELE STUDIULUI

Scopul lucrării a fost studiul modificărilor epigenetice care se petrec pe parcursul spermatogenezei datorită importanței lor în diferențierea normală a celulelor germinale masculine, în reproducerea pe cale naturală, care este crucială pentru perpetuarea speciilor, și în tehnicile de reproducere asistată, cu referire la modificările apărute în timpul procedurilor de fertilizare in vitro.

Am ales modelul murin datorită asemănărilor în ceea ce privește spermatogeneza la om și șoarece, inclusiv organizarea tubului seminifer, dar și datorită omologiei de 98% între om și șoarece de la nivelul celor două gene pentru protamine.

Obiectivele studiului:

1. Analizarea comparativă în microscopie electronică a celulelor germinale aflate în diferite stadii de dezvoltare obținute de la cele două grupuri de indivizi prin recoltarea țesutului testicular și prelucrarea probelor pentru evidențierea modificărilor produse de 5-aza-2-deocitidină.

2. Evaluarea gradului de metilare a ADN prin restricția cu endonucleazele izoschizomere MspI/HpaII a ADN-ului izolat din țesutul testicular de la indivizii din grupul martor și de la cei tratați și purificat.

3. Izolarea proteinelor SNBP din țesutul testicular și migrarea lor în gel de electroforeză SDS-PAGE pentru evidențierea procesului de înlocuire a histonelor cu protamine în grupul martor comparativ cu grupul tratat.

Pentru realizarea obiectivelor noastre am utilizat un inhibitor de ADN-metiltransferaze, respectiv 5-aza-2-deoxicitidina, pentru efectele sale asupra citodiferențierii liniei germinale mascule și asupra proceselor de imprinting genomic. Am studiat arhitectura materialului genetic în gametogeneză, respectiv dinamica arhitecturii cromatinei în spermatogeneza murinelor, la nivel citologic.

2. MATERIALE ȘI METODE

2.1. Materiale

2.1.1. Animale

În experiment au fost utilizați 12 masculi (Mus musculus) Balb C la vârsta maturității sexuale (6-8 săptămâni). Animalele au fost ținute în condiții de temperatură și umiditate standard, cu ciclu lumină-întuneric și acces liber la apă și hrană. Masculii au fost împărțiți în două grupuri, 3 în grupul 1 și 9 în grupul 2. Grupul 1 a servit ca martor și șoarecii au fost injectați intraperitoneal cu apă distilată sterilă. Șoarecii din grupul 2 au fost tratați prin injectare în cavitatea intraperitoneală cu 5-aza-2-deoxicitidină în doză de 0,8 ml de concentrație 2,44 mg/ml. După 3-4 zile șoarecii au fost eutanasiați prin dislocare cervicală și s-a recoltat țesutul testicular.

Eutanasierea animalelor a fost realizată conform legislației Consiliului European (86/609/CEE/24.11.2004) privind protecția animalelor utilizate în scopuri experimentale și științifice.

2.2. Metode

2.2.1. TEHNICA DE PRELUCRARE A MATERIALULUI BIOLOGIC PENTRU MICROSCOPIA ELECTRONICĂ DE TRANSMISIE (TEM)

Material biologic: țesut testicular a fost prelevat de la exemplare adulte de Mus musculus.

1) Prelevarea probelor biologice. Pentru a preveni modificările ce pot apărea la nivel tisular sau celular, este necesar să se ia în considerare particularătățile de organ și ale tipului tisular supus studiului, începând cu momentul prelevării probelor.

Pentru a obține rezultate bune, concomitent cu prelevarea pieselor de țesut trebuie realizată și o prefixare a materialului biologic. Țesutul s-a secționat cu ajutorul unei lame de ras în piese mici de aproximativ 1 mm, în condițiile menținerii lui într-o soluție fixatoare (glutaraldehidă 4% în tampon cacodilat 0,1 M pH 7.4).

2) Fixarea materialului biologic asigură stabilizarea structurii biologice cât mai aproape de starea nativă cu ajutorul unor agenți reticulanți capabili de a realiza legături încrucișate între moleculele constitutive ale materialului prelucrat, realizând astfel un cadru care nu permite deteriorarea arhitectonicii ultrastructurale. Fixatorul utilizat a fost glutaraldehida 3% în tampon cacodilat 0,1 M pH 7, timp de 4 ore la rece.

3) Spălarea s-a realizeazat în tampon cacodilat de două ori câte 10 minute la rece, după care s-a lasat peste noapte la frigider, în tampon cacodilat. A doua zi s-a spalat în același tampon de opt ori, câte 15 minute, la rece.

4) Postfixarea . Materialul biologic a fost imersat în OsO4 1%, timp de 1 și ½ ore. Înainte de postfixarea cu OsO4 este foarte important a se înlătura orice urmă de glutaraldehidă ale cărei reziduuri împiedică legarea osmiului. Glutaraldehida se aplică prima deoarece pătrunde mai ușor și acționează mai rapid asupra structurii preparaturlui. În prezent, fixarea dublă cu glutaraldehidă și OsO4 este considerată ca fiind cea mai bună.

5) Spălarea s-a realizeazat în tampon cacodilat 0,1M de două ori câte 10 minute, și ulterior în apă distilată de două ori câte 10 minute, la rece.

6) Deshidratarea s-a realizat în alcool etilic 30%, 50%, 70% x2 timp de 30 minute, la rece. S-a lasat peste noapte în alcool 70% la rece. A doua zi s-a adus la temperatura camerei 30 minute înainte de a continua deshidratarea. Apoi s-au realizeazat băile în alcool etilic 90%, 96% de câte două ori timp de 30 minute, la temparatura camerei. În ultima baie de alcool etilic 100% se lasă 3 x 20 minute la temparatura camerei.

7) Substituția. S-a substituit alcoolul cu oxid de propilen astfel:

– alcool etilic absolut/ oxid de propilen – 2/1, 1/1, 1/2 – 30 minute;

– oxid de propilen – 2x 30 minute, la temperatura camerei.

8) Impregnarea

– baia I – oxid de propilen /rășină – 2/1 – 2 ore la temperatura camerei;

– baia II – oxid de propilen/rășină – 1/1 – 2 ore;

– baia III – oxid de propilen/rășină – ½ – 2 ore cu dopuri;

– s-a lasat peste noapte fără dopuri, la temperatura camerei;

– a doua zi probele s-au trecut în rășină pură pentru 4 ore.

9) Includerea s-a realizat în Epon 812.

Prepararea rășinii: s-a realizat o mixtură din Epon 821, DDSA (2 dodecenyl succinic acid anhydride) și MNA (methylnadic anhydride) la care s-a adăugat un accelerator al polimerizării DMP 30.

10) Polimerizarea

– prepolimerizarea la 400C pentru 24 ore;

– polimerizarea la 600C pentru 48 de ore.

11) Ultrasecționarea s-a realizat la ultramicrotom LKB.

12) Montarea pe grilă – s-au utilizat grile de Cu cu 200 mesh (număr de ochiuri). Grila s-a acoperit cu o peliculă de formvar (polivinil formaldehida).

13) Contrastarea s-a realizat conform metodei Reynolds cu citrat de plumb și acetat de uranil soluție apoasă 4%.

14) Analiza electronomicroscopică a preparatelor s-a realizat la microscopul electronic de transmisie Philips “EM 201”.

Principiul de funcționare al microscopului electronic este bombardarea cu electroni pentru a ilumina specimenul și a crea o imagine marită a acestuia cu o rezoluție de până la 2 milioane de ori.

2.2.2. IZOLAREA ADN DIN ȚESUT ANIMAL

Soluții necesare

Tampon de digestie NaCl – 100 mM, Tris HCl – 50 mM, EDTA (ethylenedinitrilotetraacetic acid) – 50 mM, SDS 10%, pH=8,0;

Tampon de extracție: Tris HCl – 10 mM, EDTA – 1 mM, pH=7,5;

Proteinaza K (10 mg/ml);

Soluție LiCl 5M;

Cloroform;

Etanol absolut;

Etanol 70%.

Etape:

1) Prelevarea țesutului testicular în etanol 70%. Probele au fost conservate la -20˚C.

2) S-a îndepărtat etanolul, iar probele biologice s-au preluat în 300 µl tampon de digestie și s-au mojarat pe gheață pentru labilizarea membranei și pregătirea proteinelor pentru fragmentarea ulterioară cu proteinază.

3) S-a adăugat proteinaza K 3 µl (10 mg/ml). S-a incubat 2h la 50˚C, și apoi peste noapte la 37˚C.

4) După ce digestia a fost completă, un volum egal de LiCl 5M (agent de precipitare a proteinelor) s-a adăugat în fiecare tub. Probele s-au amestecat prin inversarea timp de 1 min.

5) S-au adăugat 600 µl de cloroform și probele s-au amestecat cu grijă timp de 1 minut.

6) S-au centrifughat tuburile cu probele timp de 30 min, 12000 rpm.

7) S-a preluat supernatantul în alte tuburi Eppendorf. Aceste ultime 2 etape s-au repetat de 3 ori.

8) S-au adăugat 2 volume de alcool absolut la temperatura camerei și s-au inversat tuburile de câteva ori cu grijă, până la precipitarea ADN-ului.

9) Tuburile s-au centrifugat la 8000 rpm timp de 10 minute și ADN-ul sedimentat s-a spalat în etanol 70%.

10) Excesul de alcool s-a aruncat și probele s-au lăsat să se usuce în aer liber timp de 10 min.

11) ADN-ul s-a resuspendat în 100-200 µl de apă distilată sterilă și s-a păstrat la 4˚C.

2.2.3. PURIFICARE ADN IZOLAT

Soluții necesare:

RN-ază concentrație stoc 10 mg/ml, adusă la concentrație finală de 100 µg/ml.

Fenol/Cloroform – 50/50.

Etanol 95%.

Etanol 70%.

SDS (sodium dodecyl sulfate) 10%.

Etape de lucru:

1) S-a adaugă SDS 10%, astfel încât concentrația finală să fie 0,5%. S-a incubat pentru 10 minute la 50˚C.

2) S-a adăugat RN-ază A la o concentrație de 100 µg/ml și probele s-au incubat la 37˚C timp de 30 minute.

3) S-au adăugat 10 mM EDTA și probele s-au incubat 10 minute la 50˚C.

4) S-a realizeazat extracția cu fenol:cloroform 50:50, de 3 ori.

5) S-a preluat faza apoasă, s-au adăugat 2 volume EtOH 95% și s-au inversat tuburile de câteva ori până când ADN a precipitat.

6) ADN s-a resuspendat prin centrifugare.

7) Supernatantul s-a îndepărtat, iar ADN s-a spălat cu 70% etanol.

8) S-a îndepărtat etanolul, iar probele s-au resuspendat în apă distilată sterilă și s-au păstrat la 4˚C.

2.2.4. RESTRICȚIA ADN CU ENDONUCLEAZE DE RESTRICȚIE IZOSCHIZOMERE Msp I / Hpa II

Principiul metodei: este o metodă clasică de analiză a metilării. Se bazează pe proprietatea unor enzime de restricție de a nu realiza tăierea ADN metilat. Deoarece în cazul ADN-ului de la mamifere metilarea poate avea loc doar la nivelul citozinei din CG, enzimele utilizate vor fi Msp I / Hpa II (CCGG) care recunosc secvența CCGG. Hpa II nu poate tăia ADN atunci când citozina metilată se află în interiorul secvenței, proprietate ce face ca perechea Msp I / Hpa II să fie un instrument valoros pentru analiza metilării.

Protocolul de lucru

La 10 g ADN purificat în 10 l apă distilată sterilă s-a adăugat endonuclează de restrictie Msp I, respectiv Hpa II, Buffer, BSA (concentrație stoc 5 mg/ml) și apă distilată sterilă, până la un volum final de 40 l. S-a lasă peste noapte la termostat la 37˚C.

Amestecul s-a realizat conform tabelului:

2.2.5. FRACȚIONAREA ELECTROFORETICĂ A FRAGMENTELOR DE RESTRICȚIE: ELECTROFOREZA ÎN GEL DE AGAROZĂ

Etapele de preparare a gelului de agaroză 2% de dimensiunea 15 x 20 cm.

S-au amestecat 2 g agaroză în 100 ml tampon TBE într-un vas Erlenmeyer de 500 ml.

S-a acoperit vasul cu o folie de aluminiu și s-a topit agaroza pe o plită, agitând ocazional.

S-a pregătit cuva pentru gel și s-a turnat agaroza răcită înainte la 50-600C, căreia i s-au agăugat în prealabil 1-2 l bromură de etidium.

S-a inserat pieptenele și s-a lasat gelul să se răcească timp de 30-60 minute.

S-a îndepărtat pieptenele și banda adezivă de pe cuvă și s-a plasat cuva cu gel în tancul de electroforeză cu 1x TBE, astfel încât tamponul să acopere complet gelul.

Soluția 10x TBE conține: 1M Tris Borate pH 8.3, 20 mM EDTA

S-au amestecat 7 l probă cu 3 l bromfenol și s-au introdus probele (10 l) în godeuri.

S-a conectat la 40 V și s-a lăsat peste noapte.

S-a scos gelul cu grijă din tancul de electroforeză, s-a vizualizat în UV și s-a fotografiat.

2.2.6. IZOLAREA PROTEINELOR SNBP (sperm nuclear basic proteins) DIN ȚESUT TESTICULAR

Material biologic: testicule înghețate la -80˚C sau proaspăt prelevate.

Soluții necesare:

Tampon de omogenizare 1: 0,15 NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM PMSF, pH 7,5

Tampon de omogenizare 2: 0,15 NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,2 mM PMSF, 0,5% Trixon X-100, pH 7,5

HCl – 0,4 N

Acetonă

Apă bidistilată (ABS)

Etape de lucru:

Testiculele și țesutul epididimar s-au omogenizat în aproximativ 0,5 ml tampon de omogenizare 1.

Omogenatul s-a centrifughat la 16.000 g la 4˚C timp de 10 minute.

Sedimentul s-a resuspendat în același tampon și s-a repetat pasul 2.

Sedimentul s-a resuspendat în tamponul de omogenizare 2 (care conține în plus 0,5% Trixon X-100), s-a omogenizat și s-a centrifugat la 16.000 g la 4˚C.

Sedimentul final s-a resuspendat în aproximativ 0,8 ml 0,4 N HCl.

Extractul acid s-a centrifugat la 16.000 g timp de 10 minute.

Supernatantul astfel obținut s-a precipitat cu 5 volume de acetonă timp de 1-2 ore la -20˚C.

Tuburile s-au centrifugat ca mai înainte, iar sedimentul s-a lăsat să se usuce.

După uscare sedimentul s-a resuspendat în apă bidistilată sterilă.

2.2.6. ELECTROFOREZA SDS-PAGE (Laemmli system)

Principiul metodei: separarea și migrarea proteinelor are loc în funcție de greutatea moleculară a fiecăreia, și nu de sarcina electrică. SDS (sodium dodecylsulfate) este un detergent anionic ce denaturează proteinele, învelindu-le. În același timp le conferă o sarcină netă negativă, proporțională cu lungimea peptidei. Prin tratarea cu SDS și un agent reducător, polipeptidele devin particule încărcate negativ, cu aceeași densitate a sarcinii (sarcină/unitate de lungime).

Principala aplicație a acestui sistem este determinarea masei moleculare a polipeptidelor. Acest lucru se realizează prin supunerea la electroforeză a unor proteine standard, cu masă moleculară cunoscută, în paralel cu polipeptidele de caracterizat (cu masă moleculară necunoscută). Există o relație liniară între log10M (M = masa moleculară) a unei polipeptide și Rr (mobilitatea relativă). Prin determinarea Rr (distanța de la start la polipeptidă/distanța până la frontul de migrare), utilizând o curbă etalon (construită pe baza valorilor Rr și log10M ale proteinelor cunoscute – markerii moleculari), se poate determina valoarea log10M a polipeptidei necunoscute și, de aici, masa ei moleculară.

Soluții STOC

Soluția monomer (30,8%C, 2,7% Cbis)

60g acrilamidă

1,6 g bisacrilamidă

H2O bidistilată (ABD) până la 200 ml

4 x running gel buffer

1,5 ml Tris-Cl, pH 8,8

4 x stacking gel buffer

0,5 M Tris-Cl, pH 6,8

10% SDS

10% ammonium persulfat (inițiator)

(se utilizează întotdeauna proaspăt, nu se stochează)

2 x treatment buffer (0,125 M Tris-Cl, 4%SDS, 20% v/v glycerol, 0,2 M DTT, 0,02% Bromphenol Blue, pH 6,8)

Tank buffer (0,025 M Tris, 0,192 M Glycine, 0,1% SDS, pH 8,3)

Running gel (30 ml, grosime 0,75 mm), 12,5%

Soluție monomer – 12,5 ml

4 x running gel buffer – 7,5 ml

10% SDS – 0,3 ml

ABD – 9,6 ml

10% ammonium persulfat (APS) – 150 µl

TEMED – 10 µl

Stacking gel (4% acrilamidă, grosime 0,75 mm – pentru 2 geluri)

Soluție monomer – 1,33 ml

4 x stacking gel buffer – 2,5 ml

10% SDS – 0,1 ml

ABD – 6 ml

10% APS – 50 µl

TEMED – 5 µl

Colorarea și decolorarea gelului

Soluția de colorare

0,025% Coomassie Brilliant blue R250

40% metanol

7% acid acetic

Soluția de decolorare

40% metanol

7% acid acetic

3. REZULTATE EXPERIMENTALE ȘI DISCUȚII

Spermatogeneza se caracterizează prin modificări importante ale epigenomului celulelor germinale, în special pe parcursul maturării postmeiotice a spermatidelor în spermatozoizi. În timpul elongării și condensării nucleului spermatidelor, majoritatea histonelor sunt înlocuite cu alte proteine bazice specifice testiculului, respectiv cu proteinele de tranziție (PT), și apoi cu protaminele. Protaminele sunt responsabile de compactarea extremă a genomului într-o structură specifică nucleului spermatic. În cazul murinelor, această înlocuire a histonelor cu protamine este completă (Rousseaux și colab., 2005).

În paralel cu această condensare a cromatinei se produce o blocare a procesului de transcripție celulară, la începutul elongării spermatidelor, nucleul spermatozoidului fiind un nucleu în repaus, transcripțional inactiv (Ward, 1994). După fecundația ovocitului, pronucleul mascul suferă imediat o deconsensare a cromatinei și, concomitent, își reia activitatea transcripțională și de replicare.

Mecanismele implicate în această reorganizare majoră și globală a cromatinei sunt în continuare puțin cunoscute la ora actuală. Printre factorii care ar putea interveni în acest proces, două elemente ar putea juca un rol fundamental: încorporarea masivă de variante histonice, inclusiv variantele specifice testiculului (Govin și colab., 2004), și hiperacetilarea histonelor în spermatidele în curs de elongare (Rousseaux și colab., 2005). Aceste două modificări majore ale epigenomului celulelor germinale pe parcursul spermiogenezei ar putea permite selectarea consecutivă de factori și/sau de complexe responsabile cu înlocuirea histonelor.

Deoarece spermatogeneza la mamifere are loc pe o perioadă îndelungată și are etape distincte care pot fi identificate citologic, aceasta oferă un model potrivit pentru studierea semnificației funcționale a modificărilor anumitor histone și a rolului lor în organizarea cromatinei.

Un aspect interesant al spermatogenezei este faptul că în timpul dezvoltării celulelor germinale, pe parcursul mitozei și meiozei, nu are loc o diviziune completă a citoplasmei (citokineză). Celulele fiice rezultate dintr-o spermatogonie rămân conectate prin punți citoplasmatice, formând un sincițiu (Fig. 4). Punțile citoplasmatice se păstrează pâna la finalul spermatogenezei, când spermatozoizii sunt eliberați în lumenul tubulilor seminiferi. Pe parcursul diferențierii, cea mai mare parte a citoplasmei spermatidelor este eliminat sub formă de corpusculi reziduali. Prezența acestor punți citoplasmatice are rolul de a menține în citoplasma comună a celulelor spermatice haploide toți produșii proteici ai unui genom diploid, astfel încât atât celulele care conțin cromozomul X, cât și cele care conțin cromozomul Y să beneficieze de ei pentru a se diferenția (Alberts și colab., 2002).

Fig. 4. Aranjamentul sincițial al celulelor germinale mascule în spermatogeneză

(după Alberts și colab., 2002) DE TRECUT LA BIBLIOGRAFIE

STUDIUL HISTOLOGIC ÎN MICROSCOPIE ELECTRONICĂ

Examinarea comparativă în microscopie electronică a probelor tisulare recoltate de la indivizii din grupul martor și de la cei tratați a vizat evidențierea modificărilor ultrastructurale ale celulelor germinale mascule ca posibili biomarkeri morfologici pentru realizarea defectuoasă a proceselor epigenetice specifice spermatogenezei.

În figurile 5-14 sunt prezentate imaginile electronomicroscopice ale unor celule germinale normale din probele prelevate de la indivizii din grupul martor.

Situate în imediata vecinătate a laminei bazale, spermatogoniile sunt celule stem ale liniei germinale, fiind cel mai puțin diferențiate. Acestea se divid continuu prin mitoză, rezultînd celule fiice diploide A, care rămân celule stem, sau B, care care urmează calea de dezvoltare. Figura 5 reprezintă o spermatogonie cu nucleul înconjurat de o membrană nucleară continuă și intactă, ce conține o cantitate mare de eucromatină, dar și câteva porțiuni cu heterocromatină, și un nucleol în care se evidențiază componenta granulară și fibrilară. Celor trei regiuni distincte morfologic ale nucleolului sunt: centrul fibrilar, cu genele pentru ARNr, ARN pol I și factori de transcriere, componenta fibrilară densă, cu fibre pentru ribonucleoproteine de 5 nm, și componenta granulară, care este sediul asamblării componentelor pre-ribozomale cu particule ce au diametru de 15-20 nm.

Fig. 5. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatogonii din grupul martor (Microscop electronic, 7345x). Se constată relativa uniformitate în ceea ce privește structura cromatinei, cu particule (granule) ribonucleoproteice electronodense și central se află nucleolul cu un aspect normal, caracteristic.

Celulele care continuă pe calea diviziunii meiotice se numesc spermatocite. Fiecare spermatocită primară (2n) dă naștere la două spermatocite secundare haploide, iar din fiecare spermatocită secundară vor rezulta prin meioza II două spermatide. Deci, din fiecare spermatogonie se formează câte partum spermatide. Spermiogeneza este procesul prin care spermatidele se diferențiază în spermatozoizi, aceștia fiind celulele cel mai înalt diferențiate.

În mai multe secțiuni ultrafine s-au evidențiat (Fig. 6, 7, 8) detalii de structură ale unor spermatocite primare în nucleul cărora se remarcă atât prezența eucromatinei, cât și a heterocromatinei, cu evidențierea complexelor sinaptonemale proteice ce se formează în timpul meiozei între cromosomii omologi (două perechi de cromatide surori), cu cele 2 elemente laterale și un element central, caracteristice.

Fig. 6. Imaginea electronomicroscopică a unor spermatocite primare (Microscop electronic, 4760x).

Fig.7. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatocite primare (Microscop electronic, 7345x). Se constată prezența complexelor sinaptonemale și zone electronodense care alternează cu zone electronoclare reprezentate de cromatina decompactată, activă.

Fig. 8. Imaginea electronomicroscopică a unui complex sinaptonemal din spermatocită primară din grupul martor (Microscop electronic, 21760x).

În figura 9 sunt prezentate două spermatocite secundare la care se constată dimensiunea relativ mare a nucleului în acest stadiu, înconjurat de o membrană nucleară perfectă, cantitate relativ mare de citoplasmă, prezența a numeroase mitocondrii și a nucleolului. Se remarcă și aranjamentul sincițial al celulelor germinale mascule în spermatogeneză.

Fig. 9. Imaginea electronomicroscopică a unor spermatocite secundare (Microscop electronic, 4760x). La un pol al nucleului se constată inițierea procesului de formare a acrozomului.

La nivelul spermatidelor și spermatozoizilor cromatina atinge cel mai înal grad de condensare cunoscut în lumea vie, caracteristică ce reprezintă un proces de adaptare la funcția pe care o au spermatozoizii de a transporta materialul genetic (Fig. 10, 11, 13, 14).

Schimbările importante pe care le suferă cromatina în structura și compoziția sa pe parcursul spermatogenezei prin înlocuirea treptată a histonelor cu SNBP au ca rezultat înalta compactare a cromatinei și blocarea completă a expresiei genice în spermatozoizi.

Fig. 10. Spermatidă rotundă care începe să compacteze (Microscop electronic, 4760x).

Fig. 11. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide în curs de elongare (Microscop electronic, 17280x). La polul anterior se află structuri caracteristice care vor iniția acrozomul, iar la polul posterior se regăsesc resturi de citoplasmă în care se observă granule fine reprezentate de microtubuli (structurile aparatului flagelar) ce vor forma viitorul aparat flagelar, respectiv axonema spermatozoidului.

Aparatul flagelar conferă motilitate cozii spermatozoidului și este constituit din trei componente principale: un schelet central format din 11 microtubuli (9 periferici și 2 centrali), denumit axonemă, o membrană celulară subțire și mitocondrii aranjate în spirală în jurul axonemei (Fig. 12).

Fig. 12. Imaginea elctronomicroscopică a aparatului flagelar (Microscop electronic, 17760x). Secțiune transversală prin flagelul spermatozoidului. Se constată prezența axonemei (aparatului flagelar) cu structură caracteristică 9+2.

Fig. 13. Imaginea electronomicroscopică a unui spermatozoid din grupul martor (Microscop electronic, 10540x). Se constată cromatina foarte condensată evidențiată prin electrodensitatea structurii.

Fig. 14. Imaginea electronomicroscopică a unui spermatozoid din grupul martor – detaliu (Microscop electronic, 16320x).

Modelul genomic de metilare este stabilit pe parcursul gametogenezei și este implicat în timpul dezvoltării în procese importante, ca reglarea genelor, embriogeneza și imprintingul genomic. Acest studiu a fost realizat pentru pentru a studia mecanismele epigenetice care intervin în timpul spermatogenezei analizând efectele 5-aza-2-deoxicitinei asupra funcției spermatozoizilor și modificările celulelor germinale mascule în diferite etape de dezvoltare prin examinarea efectului de demetilare genomică a celulelor germinale, respectiv spermatogonii, spermatocite primare și secundare, spermatide și spermatozoizi.

5-aza-2-deoxicitidina (5-aza2DC) este un chimioterapic utilizat ca agent anticanceros în sindroamele mielodisplazice și are efecte citotoxice severe, putând fi chiar letală. Mecanismul de acțiune al acestui analog al citidinei este complex, determinând o reducere a metilării totale a ADN și a metilării de novo în celulele germinale masculine prin inhibarea ADN-metiltransferazei, afectând astfel gene care în mod normal se metilează în timpul spermatogenezei.

Studiul a avut ca obiectiv evaluarea efectelor 5-aza2DC asupra celulelor germinale mascule de șoarece aflate în diferite stadii. Rezultatele au arătat că acest medicament, în doza administrată, produce alterări semnificative ale structurii acestor celule, și consecutiv afectează spermatogeneza.

Tratamentul cu 5-aza-2-deoxicitidină a avut ca rezultat degenerarea și chiar pierderea celulelor germinale, cu prezența unui număr mare de celule apoptotice. Analiza efectelor demetilării în fiecare etapă de dezvoltare a celulelor germinale a indicat faptul că spermatogoniile au fost mai susceptibile decât spermatocitele la blocarea metilării de către 5-aza-2-deoxicitidină.

În figurile următoare sunt prezentate efectele administrării de 5-aza2DC asupra celulelor liniei germinale masculine.

În figura 15 este prezentată imaginea electronomicroscopică a nucleului unei spermatogonii cu membrană nucleară intactă, dar cu particule de cromatină condensată, ce ar putea indica un fenomen de apoptoză. Se observă și organizarea sincițială a celulelor.

Fig. 15. Imaginea electronomicroscopică a unor spermatogonii din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (sinciții) (Microscop electronic, 4800x).

Figura 16 reprezintă imaginea unei secțiuni prin tubul seminifer cu evidențierea unei spermatogonii și a unei spermatocite primare din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină. Nu există modificări majore în primele stadii de dezvoltare.

Fig. 16. Imaginea electronomicroscopică a unei secțiuni prin tubul seminifer (Microscop electronic, 5250x). Se constată prezența unei spermatogonii spre periferia tubului și pe măsură ce se înaintează spre lumen se constată prezența celulelor aflate în următoarele stadii de dezvoltare.

Celulele germinale expuse la 5-aza2DC pot fi recunoscute datorită degradării datorate hipometilării ADN care determină modificări ale structurii cromatinei și ale expresiei genice.

Alterarea nucleolară în stadiul de spermatocită primară, demonstrată în microscopie electronică prin segregarea componentelor nucleolare în cele 2 componente, granulară și fibrilară, a fost evidentă în celulele examinate, fiind un marker precoce al alterării ADN (Fig. 17, 18, 19).

Fig. 17. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatocite primare cu detalii de nucleol (Microscop electronic, 11160). Se constată segregare nucleolară caracteristică tratamentelor cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină.

Fig. 18. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatocite primare din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 2160x).

Fig. 19. Imaginea electronomicroscopică a nucleolului din spermatocita primară, detaliu (Microscop electronic, 4800x).

Analiza secțiunilor ultrafine evidențiază fenomenul de segregare nucleolară datorată alterării profilului de metilare al genelor ribozomale, ce duce la alterarea profilului de transcriere (Fig. 20, 21, 22, 23, 24). Alterarea exprimarii genelor ribozomale este datorată modificării profilului epigenetic.

Fig. 20. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatocite secundare din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 3100x).

Fig. 21. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatocite secundare din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 2160x).

Fig. 22. Imaginea electronomicroscopică a unui nucleol de spermatocită secundară cu segregare nucleolară din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină, detaliu (Microscop electronic, 6400x).

Fig. 23. Imaginea electronomicroscopică a unui nucleol de spermatocită secundară cu segregare nucleolară din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 4800x).

Fig. 24. Imaginea electronomicroscopică a nucleolului, detaliu de structură (Microscop electronic, 5250x). Se constată și în acest caz segregarea nucleolară.

Spermatidele suferă și ele modificări (Fig. 25, 26, 27, 28, 29). Se constată prezența unui rest de citoplasmă care înconjoară nucleul, structura cromatinei fiind caracteristică acestui stadiu în care zone electronoclare alternează cu zone electronodense. Spre periferia nucleului se constată o condensare pregnantă a cromatinei. Structurile acrozomale sunt normale ca densitate electronomicroscopică, caracteristice acestui stadiu.

Fig. 25. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide rotunde din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 16320). Nu se constată modificări majore ale structurii cromatinei, respectiv ale structurii acrozomale.

Fig. 26. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide cu structură apoptotică din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 1400x).

Fig. 27. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide cu structură apoptotică din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină, detaliu de structură (Microscop electronic,2160x).

Fig. 28. Imaginea electronomicroscopică a unei spermatide cu structură apoptotică din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 14500x).

Fig. 29. Imaginea electronomicroscopică a unor spermatide elongate din grupul tratat cu 5-aza-2ˈ-deoxicitidină (Microscop electronic, 3800x).

Fără îndoială modificările epigenetice apărute în timpul spermatogenezei afectează morfologia, viabilitatea, motilitatea și numărul spermatozoizilor, scad capacitatea lor de fecundare și supraviețuire a embrionilor, sau pot conduce chiar la infertilitate.

Merită menționat faptul că există și alte studii care au evaluat efectele 5-aza2DC asupra liniei germinale masculine și că rezultatele autorilor au corespuns cu ceea ce am obținut în aceste experimente (Kelly și colab., 2003; Oakes și colab., 2007).

Mai multe studii au utilizat alte medicamente anticanceroase ca 5-azacitidină, bleomicină, busulfan, deoxicitidină și vinblastină și rezultatele lor au corespuns cu cele ale noastre. Autorii au constatat că la șobolan, 5-azacitidina în doze mari poate determina scăderea mobilității, morfologie anormală și număr redus de spermatozoizi după 6-11 săptămâni de tratament. Rezultatele au evidențiat importanța unui pattern de metilare corect pentru dezvoltarea și capacitatea de fecundare a celulelor germinale mascule. Hipometilarea afectează maturarea celulelor germinale și primele stadii ale embriogenezei la descendenții animalelor tratate (Doerksen și Trasler, 1996; Doerksen și colab., 2000).

S-a demonstrat că efectele 5-aza2DC, care este un analog al citidinei cu selectivitate pentru ADN și mai relevant din punct de vedere clinic, sunt similare celor produse de 5-azacitidină, care este mai puțin selectivă (Kelly și colab., 2003).

Este evident faptul că 5-aza2DC a afectat nucleii celulelor germinale de murine și a determinat condensarea cromatinei și deteriorarea membranei nucleare, acestea fiind semne ale apoptozei celulare.

Alegerea de către noi a murinelor ca animal model pentru a studia impactul hipometilării ADN asupra celulelor germinale mascule s-a bazat pe numeroasele avantaje pe care le oferă această specie: existența animalelor transgenice și a liniilor consangvinizate, elementele reglatorii bine cunoscute pentru mai multe gene și tehnicile de cultură in vitro pentru embrionii preimplantaționali.

Studiul nostru demonstrează că există modificări epigenetice produse de 5-aza2DC prin hipometilarea masivă a ADN. Acestea au fost demonstrate prin modificările ultrastructurale apărute în celulele liniei germinale masculine observate la microscopul electronic.

Putem trage concluzia că mecanismele epigenetice petrecute în timpul spermatogenezei sunt de o importanță covârșitoare pentru dezvoltarea normală a celulelor germinale masculine. Fără o metilare corectă înlocuirea histonelor cu protamine nu se poate realiza, blocând maturarea liniei germinale.

Fracționarea electroforetică a proteinelor SNBP la Mus Musculus

Proteinele cromozomale din spermatozoizi SNBP (sperm nuclear basic proteins) au fost intens studiate în ultima decadă și s-a reușit clasificarea lor în trei mari categorii: tipul H (histone-type), protamine (P) și tipul PL (protamine-like). Grupul cel mai heterogen din punct de vedere structural de SNBP este cel al tipului PL. Acesta include proteine bogate în aminoacizii lizină și arginină. Majoritatea histonelor sunt înlocuite pe parcursul spermatogenezei cu proteine PL, dar într-o proporție mai mare cu protamine. În majoritatea cazurilor, proteinele PL se regăsesc în spermatozoidul matur alături de complementul histonic complet. Înlocuirea histonelor cu protamine în spermatozoidul matur este o caracteristică a taxonilor superiori din punct de vedere evolutiv ai protostomienilor și deuterostomienilor, în timp ce SNBP-urile sunt întâlnite în mod special la spermatozoizii speciilor aparținând taxonilor apăruți timpuriu în evoluția metazoarelor. Se poate presupune deci, că protaminele ar fi putut evolua din histone trecând prin tipul intermediar PL. PL și proteinele H1 au fost prima dată descrise la moluștele bivalve la care s-au studiat mecanismele care ar putea sta la baza evoluției SNBP. Cu toate acestea, evoluția PL din histonele familiei H1 încă nu a putut fi dovedită (Eirin-Lopez și colab., 2006).

În această lucrare am izolat și analizat SNBP-urile din țesutul testicular de la Mus musculus, comparând probele obținute de la șoarecii din grupul martor cu cele de la șoarecii tratați cu 5-aza2DC.

Ca markeri de greutate moleculară am utilizat:

marker histone bogate în Lys (?) tip VIII S calf timus (Sigma)

protein marker broad range (Biolabs)

chicken erythrocyte histone octamers protein (Abcam)

Din analiza electroforegramei se constată absența protaminelor în proba de țesut testicular tratat cu 5-aza2DC.

Fig. 30. Fracționarea electroforetică a proteinelor SNBP la Mus Musculus. MHL=marker histone bogate în Lys, T5=țesut testicular tratat cu 5-aza2DC, TM=țesut testicular martor, MP=marker greutate moleculară proteine, CEP=marker octameri histonici din eritrocite de pui de găină.

Efectele tratamentului asupra metilării ADN-ului genomic

Restricția ADN cu endonucleaze de restricție izoschizomere msp I / hpa II și fracționarea electroforetică a fragmentelor de restricție: electroforeza în gel de agaroză

Metilarea ADN la nivelul insulelor CpG a fost analizată utilizând restricția cu enzimele izoschizomere MspI/HpaII.

Mk Ma Ha Mb Hb

Fig. 31. Electroforegrama ADN restrictat cu perechea de enzime izoschizomere MspI/HpaII.

Mk- marker de greutate moleculară SMART, a- ADN extras din țesut testicular martor; b – ADN extras din țesut testicular de la șoarece injectat cu5-aza-2-deoxicitinina; M- Msp I; H- Hpa II.

Nu stiu sa interpretez electroforegrama

Analogii chimici ai citozinei, 5-azacitidina și derivatul său 5-aza-2’-deoxicitidina, au proprietatea de a se încorpora în ADN în timpul replicării și în ARN în timpul transcrierii, inhibând metiltransferazele în celulele aflate în diviziune. Astfel, cauzează o demetilare a secvenței respective, o activare relativă a genelor și influențează modul de legare al proteinelor reglatoare la ADN sau la ARN.

5-aza2DC este încorporată în faza S a diviziunii celulare, formând un complex stabil cu DNMT1. Astfel DNMT 1 nu mai este disponibilă pentru o noua runda de replicare (Schermelleh, 2005).

Acest inhibitor acționează și prin intermediul interacțiilor fizice dintre ADN-metiltransferaza de întreținere DNMT1 și HDAC-uri. Domeniul catalitic al DNMT1 nu este necesar pentru această interacție, sugerând că această ADN-metiltransferaza este un corepresor transcripțional independent de abilitatea sa de a metila ADN. Această interacție ar putea acționa pentru a stabiliza ereditatea (imprint-ul) cromatinei silențiate prin facilitarea deacetilării histonelor la nivelul bifurcației de replicare, unde DNMT1 acționează pentru a menține markerul epigenetic 5mC (Richards și Elgin, 2002).

Rezultatele au arătat că expunerea in vivo a celulelor germinale la 5-aza2DC reduce nivelul de metilare genomică în situsurile CCGG.

Administrarea de 5-aza2DC la șoareci nou-născuți la care erau prezente doar spermatogonii a afectat diferențierea spermatogoniilor în spermatocite datorită hipometilării ADN (Raman și Narayan, 1995). Într-un alt studiu care a utilizat 5-azacitidina s-a arătat că gradul de hipometilare ADN nu s-a corelat întotdeauna cu fiziologia și funcționarea celulelor germinale după 6 săptămâni de administrare, fiind necesară administrarea pe parcursul mai multor cicluri mitotice ale celulelor stem (12 săptămâni) (Doerksen și colab., 2000).

Rezultate preliminare

În situația în care 5-aza2DC interferă cu mecansimele de reparare ADN este posibil să apară situsuri mici sau unice de demetilare, care să afecteze funcția unei singure gene, fără modificarea nivelului general de metilare ADN. Aceste efecte pot fi studiate în detaliu cu ajutorul tehnicilor care detectează modificări situs-specifice ale metilării, ca de exemplu secvențierea cu bisulfit (Frommer și colab., 1992).

S-a realizat mutageneză cu bisulfit (QIAGEN) a unei regiuni bogată în dinucleotide CpG (exon1) de la capătul 5’ al genelor prm1 și prm2 pentru analiza profilului de metilare ADN la nivelul acestor gene. S-a utilizat programul ImageJ pentru cuantificare și s-a constatat că nivelul de metilare al celor două gene a fost cel mai scăzut în cazul spermatidelor rotunde.

Fig. 32. Cuantificarea rezultatelor obținute prin mutageneza cu bisulfit a unei regiuni bogată în dinucleotide CpG (exon1) de la capătul 5’ al genelor prm1 și prm2.

Interpretare?

4. PERSPECTIVE ȘI APLICAȚII PRACTICE/CLINICE ALE CERCETĂRILOR

Reprogramarea epigenetică a genomului în timpul gametogenezei și a perioadei preimplantaționale este esențială pentru o embriogeneză normală. Imprintingul genomic stabilit în timpul gametogenezei pentru stabilirea echivalenței între genomurile parentale confirmă importanța reprogramării epigenetice și necesitatea ambelor genomuri parentale pentru o dezvoltare normală. Aspectele cheie implică modificări dinamice în metilarea ADN, modificări ale histonelor și remodelarea cromatinei, procese ce au loc rapid în cursul dezvoltării celulelor germinale mascule și femele. Recent au fost identificați mai multi factori de remodelare a cromatinei și enzime ce modifică ADN-ul sau histonele, aceștia contribuind la înțelegerea mecanismelor care guvernează reprogramarea epigenetică.

Este evident că mai sunt necesare studii ulterioare pe gameți și embrioni timpurii pentru o înțelegere mai bună a desfășurării în timp și a mecanismelor ce stau la baza reprogramării epigenetice. Este necesar să se stabilească dacă există o corelație între modificările epigenetice și unele cazuri de infertilitate masculină sau feminină. Studii recente au sugerat o legătură între tehnologiile de reproducere asistată și defecte epigenetice ale produșilor de concepție obținuți astfel, indicând monitorizarea acestora pentru modificări epigenetice. Murinele sunt un model excelent pentru cercetările ce vizează gameți sau embrioni animali pentru a studia efectele unor proceduri ca ICSI, superovulația sau cultura de gameți și embrioni, însă ar trebui luate în considerare și alte specii, ca bovinele sau primatele, la care dezvoltarea embrionară este mai apropiată de cea de la om.

5. CONCLUZII

Această teză a avut ca scop aprofundarea studiului modificărilor epigenetice asupra citodiferențierii liniei germinale mascule la indivizi tratați cu inhibitori de ADN-metiltransferaze (5-aza-deoxicitidină). Rezultatele noastre oferă perspective interesante pentru stabilirea etiologiei la unii dintre pacienții infertili.

Analiza nivelului de metilare al ADN în celulele germinale izolate de la masculii tratați indică faptul că spermatogoniile mitotice sunt mult mai susceptibile efectului de hipometilare a 5-aza2DC comparativ cu spermatocitele meiotice, punând în evidență corelația dintre demetilarea ADN-ului celulelor germinale și blocarea diferențierii lor datorită alterării.

Există stadii primare, dar nu se diferențiază

Lipsa protaminelor

Modificările care încep în pachiten sunt cele specifice cromatinei inactive transcripțional.

În contextul dezvoltării spectaculoase a tehnicilor de reproducere asistată, elucidarea mecanismelor de remodelare a cromatinei și, implicit, a celor de reprogramare a expresiei genice este de o importanță majoră.

Studiile ulterioare ar trebui îndreptate către căile de semnalizare responsabile de reprogramarea epigenetică, pentru a înțelege modul în care epigenomul nostru inițiază adaptarea rapidă a fenotipului în funcție de factorii de mediu la care este expus.

Odată ce vor fi elucidate mecanismele complexe ce stau la baza reprogramării epigenetice a celulelor germinale și a embrionilor timpurii, atenția ar trebui îndreptată către markerii epigenetici care controlează dezvoltarea. Cercetarea reglării epigenetice a unei/unor gene suspecte în timpul dezvoltării ar putea face posibilă aflarea cauzei unor boli umane corelate cu alterări ale metilării ADN sau ale structurii cromatinei și tratarea acestora utilizând medicamente inovative care să acționeze numai asupra reglatorilor epigenetici, fără a afecta sistemul reproducător.

Rezultatele studiilor precedente au demonstrat importanța unui patern de metilare corect în dezvoltarea celulelor germinale masculine și în capacitatea lor de fecundare.

Tratamentele de lungă durată la șobolani cu 5-azacitidină au avut ca rezultat o reducere a metilării ADN și au afectat atât maturarea celulelor germinale masculine, cât și primele stadii embrionare.

Deoarece expunerea la un alt medicament, care nu produce hipometilarea, 6-azacitidină, nu a afectat spermatogeneza sau produșii de concepție, putem trage concluzia că efectele 5-azacitidinei s-au datorat cel puțin parțial alterării în metilarea ADN.

Pentru a putea studia mai ușor mecanismele prin care metilarea la nivelul genomului scade funcția celulelor germinale masculine, am ales să realizăm acest studiu pe șoarece, care este un animal model mult mai potrivit pentru studiile genetice decât șobolanul.

Avantaje: disponibilitatea animalelor transgenice și a liniiilor consangvinizate, elemente reglatorii bine definite pentru multe gene și tehnici de cultură pentru embrioni bine puse la punct.

Vom studia efectele deletorii ale analogilor citidinei, 5-aza2D, care sunt mult mai selectivi pentru ADN și determină semne clinice evidente, asupra dezvoltării celulelor germinale mascule de șoarece, metilării ADN și pierderilor preimplantaționale.

Presupun ca ar trebui niste concluzii succinte, dar mi s-au parut interesante ideile. Poate mutam parte din ele la discutii sau la perspective…

Care ar trebui sa fie concluziile principale?

BIBLIOGRAFIE

Agalioti T., Chen G., Thanos D., 2002. Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene. Cell., 111(3):381-92.

Baarends W.M., Hoogerbrugge J.W., Roest H.P., Ooms M., Vreeburg J., Hoeijmakers J.H., Grootegoed J.A., 1999. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis. Dev. Biol., 207: 322–333.

Benchaib M., Braun V., Ressnikof D., Lornage J., Durand P., Niveleau A., Guérin J.F., 2005. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results. Hum. Reprod., 20(3):768-73.

Berkowitz, R.S., Goldstein, D.P., 2009. Molar pregnancy. N. Engl. Med., 360:16.

Bourc'his D., Bestor T.H., 2004. Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature, 431(7004): 96-9.

Bramlage B., Kosciessa U., Doenecke D., 1997. Differential expression of the murine histone gene H3.3A and H3.3B. Differentiation, 62:13-20.

Burlibașa L., 2008. Cromatina – structură și funcții. Ed. Ars Docendi, 63-159.

Burlibașa L., Gavrilă L., 2011. Developmental Epigenetics: Roles in Embryonic Development. În Nutrition in Epigenetics (eds. M. D. Niculescu and P. Haggarty), Wiley-Blackwell, Oxford, UK.

Butler M.G., 2009. Genomic imprinting disorders in humans: a mini-review. J. Assist. Reprod. Genet., 26:477–486.

Caron C., Govin J., Rousseaux S., Khochbin S., 2005. How to pack the Genome for a safe trip Progress in Mollecular and subcellular Biology. Epigenetics and Chromatin, Springer-Verlag Cerlin Heidelberg, 38:65-89.

Cedar H., Bergma Y., 2012. Programming of DNA methylation patterns. Annu. Rev. Biochem., 81:97–117.

Clark D.J., Thomas J.O., 1988. Differences in the binding of H1 variants to DNA. Cooperativity and linker-length related distribution. Eur. J. Biochem., 178:225–233.

Cobb J., Reddy R.K., Park C., Handel M.A., 1997. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Mol. Reprod. Dev., 46:489–498

Delaval K., Feil R., 2004. Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting. Curr. Opin. Genet. Dev., 14(2): 188-95.

De Rooij D.G., Russell L.D., 2000. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask. J. Androl., 776-798.

Doerksen, T., Benoit, G., Trasler, J.M., 2000. Deoxyribonucleic acid hypomethylation of male germ cells by mitotic and meiotic exposure to 5-azacytidine is associated with altered testicular. Histology Endocrinology, 141(9):3235-44.

Doerksen T., Trasler J.M., 1996. Developmental exposure of male germ cells to 5-azacytidine results in abnormal preimplantation development in rats. Biol Reprod. 1996; 55:1155–1162.

Doherty A.S., Mann M.R., Tremblay K.D., Bartolomei M.S., Schultz R.M., 2000. Differential effects of culture on imprinted H19 expression in the preimplantation mouse embryo. Biol. Reprod., 62:1526–1535.

Eirίn-Lόpez J.M., Lewis J.D., Howe L.A., Ausio J., 2006. common phylogenetic origin of protamine-like (PL) proteins and histone H1: Evidence from bivalve PL genes. Mol. Biol. Evol., 23(6):1304–1317.

Fenic I., Sonnack V., Failing K., Bergmann M., Steger K., 2004. In vivo effects of histone-deacetylase inhibitor trichostatin A on murine spermatogenesis. J. Androl., 25:811-818.

Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis C.M., Watt F., Grigg G.W., Molloy P.L., Paul C.L., 1992. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1827–1831.

Garcia-Ramirez M., Subirana J.A., 1994. Condensation of DNA bz basic proteins does not depend on protein composition. Biopolymers, 34:285-92.

Geiman T.M., Robertson K.D., 2002. Chromatin remodeling, histone modifications, and DNA methylation – How does it all fit together? J. Cell. Biochem., 87:117–125.

Goll M.G., Bestor T.H., 2005. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu. Rev. Biochem., 74: 481-514.

Govin J., Caron C., Lestrat C., Rousseaux S., Khochbin S., 2004. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem., 271:3459-69.

Hendriksen P.J., Hoogerbrugge J.W., Themmen A.P., Koken M.H., Hoeijmakers J.H., Oostra B.A., van der Lende T., Grootegoed J.A., 1995. Postmeiotic transcription of X and Y chromosomal genes during spermatogenesis in the mouse. Dev. Biol., 170:730-733.

Hoyer-Fender S., Costanzi C., Pehrson, J.R., 2000. Histone macroH2A1.2 is concentrated in the XY-body by the early pachytene stage of spermatogenesis. Exp. Cell. Res., 258:254–260.

Judson H., Hayward B.E., Sheridan E., Bonthron D.T., 2002. A global disorder of imprinting in the human female germ line. Nature, 416:539–542.

Kelly T.L.J., Li E., Trasler J.M., 2003. 5-aza-2′-deoxycytidine induces alterations in murine spermatogenesis and pregnancy outcome. J. Androl, 24(6):822-30.

Kimmins S., Sassone-Corsi P., 2005. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature, 434:583-589.

La Salle S., Trasler J.M., 2006. Epigenetic patterning in male germ cells: importance of DNA methzlation to progenz outcome. În: The sperm cell – production, maturation, fertilization, regeneration. Cambridge University Press, 279-322.

Lee J., Inoue K., Ono R., Ogonuki N., Kohda T., Kaneko-Ishino T., Ogura A., Ishino F., 2002. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5 primordial germ cells. Development, 129(8):1807-17.

Lewis J.D., Ausió J., 2002. Protamine-like proteins: evidence for a novel chromatin structure. Biochem. Cell Biol., 80:353–361.

Lippman Z., Martienssen R., 2004. The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature, 431(7006):364-70.

Miller D, Ostermeier GC and Krawetz SA (2005) The controversy potential and roles of spermatozoal RNA. Trend Mol Med 11, 156–163.

Morgan H.D., Santos F., Green K., Dean W., Reik W., 2005. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum. Mol. Genet., 14 Spec. No. 1:R47-58.

Morison I.M., Ramsay J.P., Spencer H.G., 2005. A census of mammalian imprinting. Trends Genet., 21(8): 457-65.

Oakes C.C., Kelly T.L.J., Robaire B., Trasler J.M., 2007. Adverse effects of 5-aza-2-deoxycytidine on spermatogenesis include reduced sperm function and selective inhibition of de novo DNA methylation. J. Pharmacol. Exp. Ther., 322(3):1171-80.

Ostermeier G.C., Goodrich R.J., Moldenhauer J.S., Diamond M.P., Krawetz S.A., 2005. A suite of novel human spermatozoal RNAs. J. Androl., 26(1):70-74.

Ostermeier G.C., Miller D., Huntriss J.D., Diamond M.P., Krawetz S.A., 2004. Reproductive biology: delivering spermatozoan RNA to the oocyte. Nature, 429:154.

Poccia D.L., Green G.R., 1992. Packaging and unpackaging the sea urchin sperm genome. Trends Biochem. Sci., 17: 223–227.

Poccia D.L., Simpson M.V., Green G.R., 1987. Transitions in histone variants during sea urchin spermatogenesis. Dev. Biol., 121:445-453.

Raman R., Narayan G., 1995. 5-Aza-deoxycytidine-induced inhibition of differentiation of spermatogonia into spermatocytes in the mouse. Mol. Reprod. Dev., 42:284–290.

Rice P., Garduno R., Itoh T., Katagiri C., Ausio J., 1995. Nucleoplasmin-mediated decondensation of Mytilus sperm chromatin. Identification and partial characterization of a nucleoplasmin-like protein with sperm-nuclei decondensing activity in Mytilus californianus. Biochemistry, 34:7563–7568.

Richards E.J., Elgin S.C., 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell., 108(4):489-500.

Roest H.P., van Klaveren J., de Wit J., van Grup C.G., Koken M.H., Vermey M., van Roijen J.H. et al., 1996. Inactivation of the HR6B ubiquitin-conjugating DNA repair enzyme in mice causes male sterility associated with chromatin modification. Cell, 86:799-810.

Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M., 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem., 273:5858–5868.

Rountree M.R., Bachman K.E., Baylin S.B, 2000. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat. Genet., 25(3):269-77.

Rousseaux S., Caron C., Govin J., Lestrat C., Faure A.K., Khochbin S., 2005. Establishment of male-specific epigenetic information. Gene, 345:139-153.

Schagdarsurengin U., Paradowska A., Steger K., 2012. Analysing the sperm epigenome: roles in early embryogenesis and assisted reproduction. Nature Reviews Urology, 9:609-619.

Schermelleh L., Spada F., Easwaran H.P., Zolghadr K., Margot J.B., Cardoso M.C., Leonhardt H., 2005. Trapped in action: direct visualization of DNA methyltransferase activity in living cells. Nat. Methods., 2(10):751-6.

Suetake I., Shinozaki F., Miyagawa J., Takeshima H., Tajima S., 2004. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J. Biol. Chem., 279(26):27816-23.

Sung P., Prakash S., Prakash L., 1988. The RAD6 protein of Saccharomzces cerevisiae polyubiquitinates histones, and its acidic domain mediates this activity. Genes. Dev., 2:1476-1485.

Turek-Plewa J., Jagodzinski P.P. The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression, 2005. Cell. Mol. Biol. Lett., vol. 10, 631-47.

Ward W.S., 1993. Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa. Biol. Reprod., 48:1193-1201.

Ward W.S., 1994. The structure of the sleeping genome : implications of sperm DNA organization for somatic cells. J. Cell. Biol., 55:77-82.

Xuan Z., Zhiming L., Huinuan L., Long G., Qing L., Zhongxian L., Chi-Meng T., 2015. Integrated miRNA and mRNA expression profiling to identify mRNA targets of dysregulated miRNAs in non-obstructive azoospermia. Sci. Rep., 5:7922.

Yamazaki Y., Mann M.R., Lee S.S., Marh J., McCarrey J.R., Yanagimachi R., Bartolomei M.S., 2003. Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(21):12207-12.

Zărnescu O., 2002. Gametogeneza. În: Biologia moleculară a dezvoltării, Partea a II-a. Ed. Universității din București, 9-66.

Alberts B., Johnson A., Lewis J., 2002. Molecular Biology of the Cell 4th edition. New York: Garland Science; Sperm. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26914/

Sau

Alberts, B., Bray, D., Lewis, J. et al. (1994) Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, New York, USA, 1294 pp.

Nu stiu cum sa o trec in bibliografie

BIBLIOGRAFIE

Agalioti T., Chen G., Thanos D., 2002. Deciphering the transcriptional histone acetylation code for a human gene. Cell., 111(3):381-92.

Baarends W.M., Hoogerbrugge J.W., Roest H.P., Ooms M., Vreeburg J., Hoeijmakers J.H., Grootegoed J.A., 1999. Histone ubiquitination and chromatin remodeling in mouse spermatogenesis. Dev. Biol., 207: 322–333.

Benchaib M., Braun V., Ressnikof D., Lornage J., Durand P., Niveleau A., Guérin J.F., 2005. Influence of global sperm DNA methylation on IVF results. Hum. Reprod., 20(3):768-73.

Berkowitz, R.S., Goldstein, D.P., 2009. Molar pregnancy. N. Engl. Med., 360:16.

Bourc'his D., Bestor T.H., 2004. Meiotic catastrophe and retrotransposon reactivation in male germ cells lacking Dnmt3L. Nature, 431(7004): 96-9.

Bramlage B., Kosciessa U., Doenecke D., 1997. Differential expression of the murine histone gene H3.3A and H3.3B. Differentiation, 62:13-20.

Burlibașa L., 2008. Cromatina – structură și funcții. Ed. Ars Docendi, 63-159.

Burlibașa L., Gavrilă L., 2011. Developmental Epigenetics: Roles in Embryonic Development. În Nutrition in Epigenetics (eds. M. D. Niculescu and P. Haggarty), Wiley-Blackwell, Oxford, UK.

Butler M.G., 2009. Genomic imprinting disorders in humans: a mini-review. J. Assist. Reprod. Genet., 26:477–486.

Caron C., Govin J., Rousseaux S., Khochbin S., 2005. How to pack the Genome for a safe trip Progress in Mollecular and subcellular Biology. Epigenetics and Chromatin, Springer-Verlag Cerlin Heidelberg, 38:65-89.

Cedar H., Bergma Y., 2012. Programming of DNA methylation patterns. Annu. Rev. Biochem., 81:97–117.

Clark D.J., Thomas J.O., 1988. Differences in the binding of H1 variants to DNA. Cooperativity and linker-length related distribution. Eur. J. Biochem., 178:225–233.

Cobb J., Reddy R.K., Park C., Handel M.A., 1997. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Mol. Reprod. Dev., 46:489–498

Delaval K., Feil R., 2004. Epigenetic regulation of mammalian genomic imprinting. Curr. Opin. Genet. Dev., 14(2): 188-95.

De Rooij D.G., Russell L.D., 2000. All you wanted to know about spermatogonia but were afraid to ask. J. Androl., 776-798.

Doerksen, T., Benoit, G., Trasler, J.M., 2000. Deoxyribonucleic acid hypomethylation of male germ cells by mitotic and meiotic exposure to 5-azacytidine is associated with altered testicular. Histology Endocrinology, 141(9):3235-44.

Doerksen T., Trasler J.M., 1996. Developmental exposure of male germ cells to 5-azacytidine results in abnormal preimplantation development in rats. Biol Reprod. 1996; 55:1155–1162.

Doherty A.S., Mann M.R., Tremblay K.D., Bartolomei M.S., Schultz R.M., 2000. Differential effects of culture on imprinted H19 expression in the preimplantation mouse embryo. Biol. Reprod., 62:1526–1535.

Eirίn-Lόpez J.M., Lewis J.D., Howe L.A., Ausio J., 2006. common phylogenetic origin of protamine-like (PL) proteins and histone H1: Evidence from bivalve PL genes. Mol. Biol. Evol., 23(6):1304–1317.

Fenic I., Sonnack V., Failing K., Bergmann M., Steger K., 2004. In vivo effects of histone-deacetylase inhibitor trichostatin A on murine spermatogenesis. J. Androl., 25:811-818.

Frommer M., McDonald L.E., Millar D.S., Collis C.M., Watt F., Grigg G.W., Molloy P.L., Paul C.L., 1992. A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1827–1831.

Garcia-Ramirez M., Subirana J.A., 1994. Condensation of DNA bz basic proteins does not depend on protein composition. Biopolymers, 34:285-92.

Geiman T.M., Robertson K.D., 2002. Chromatin remodeling, histone modifications, and DNA methylation – How does it all fit together? J. Cell. Biochem., 87:117–125.

Goll M.G., Bestor T.H., 2005. Eukaryotic cytosine methyltransferases. Annu. Rev. Biochem., 74: 481-514.

Govin J., Caron C., Lestrat C., Rousseaux S., Khochbin S., 2004. The role of histones in chromatin remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur. J. Biochem., 271:3459-69.

Hendriksen P.J., Hoogerbrugge J.W., Themmen A.P., Koken M.H., Hoeijmakers J.H., Oostra B.A., van der Lende T., Grootegoed J.A., 1995. Postmeiotic transcription of X and Y chromosomal genes during spermatogenesis in the mouse. Dev. Biol., 170:730-733.

Hoyer-Fender S., Costanzi C., Pehrson, J.R., 2000. Histone macroH2A1.2 is concentrated in the XY-body by the early pachytene stage of spermatogenesis. Exp. Cell. Res., 258:254–260.

Judson H., Hayward B.E., Sheridan E., Bonthron D.T., 2002. A global disorder of imprinting in the human female germ line. Nature, 416:539–542.

Kelly T.L.J., Li E., Trasler J.M., 2003. 5-aza-2′-deoxycytidine induces alterations in murine spermatogenesis and pregnancy outcome. J. Androl, 24(6):822-30.

Kimmins S., Sassone-Corsi P., 2005. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. Nature, 434:583-589.

La Salle S., Trasler J.M., 2006. Epigenetic patterning in male germ cells: importance of DNA methzlation to progenz outcome. În: The sperm cell – production, maturation, fertilization, regeneration. Cambridge University Press, 279-322.

Lee J., Inoue K., Ono R., Ogonuki N., Kohda T., Kaneko-Ishino T., Ogura A., Ishino F., 2002. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5 primordial germ cells. Development, 129(8):1807-17.

Lewis J.D., Ausió J., 2002. Protamine-like proteins: evidence for a novel chromatin structure. Biochem. Cell Biol., 80:353–361.

Lippman Z., Martienssen R., 2004. The role of RNA interference in heterochromatic silencing. Nature, 431(7006):364-70.

Miller D, Ostermeier GC and Krawetz SA (2005) The controversy potential and roles of spermatozoal RNA. Trend Mol Med 11, 156–163.

Morgan H.D., Santos F., Green K., Dean W., Reik W., 2005. Epigenetic reprogramming in mammals. Hum. Mol. Genet., 14 Spec. No. 1:R47-58.

Morison I.M., Ramsay J.P., Spencer H.G., 2005. A census of mammalian imprinting. Trends Genet., 21(8): 457-65.

Oakes C.C., Kelly T.L.J., Robaire B., Trasler J.M., 2007. Adverse effects of 5-aza-2-deoxycytidine on spermatogenesis include reduced sperm function and selective inhibition of de novo DNA methylation. J. Pharmacol. Exp. Ther., 322(3):1171-80.

Ostermeier G.C., Goodrich R.J., Moldenhauer J.S., Diamond M.P., Krawetz S.A., 2005. A suite of novel human spermatozoal RNAs. J. Androl., 26(1):70-74.

Ostermeier G.C., Miller D., Huntriss J.D., Diamond M.P., Krawetz S.A., 2004. Reproductive biology: delivering spermatozoan RNA to the oocyte. Nature, 429:154.

Poccia D.L., Green G.R., 1992. Packaging and unpackaging the sea urchin sperm genome. Trends Biochem. Sci., 17: 223–227.

Poccia D.L., Simpson M.V., Green G.R., 1987. Transitions in histone variants during sea urchin spermatogenesis. Dev. Biol., 121:445-453.

Raman R., Narayan G., 1995. 5-Aza-deoxycytidine-induced inhibition of differentiation of spermatogonia into spermatocytes in the mouse. Mol. Reprod. Dev., 42:284–290.

Rice P., Garduno R., Itoh T., Katagiri C., Ausio J., 1995. Nucleoplasmin-mediated decondensation of Mytilus sperm chromatin. Identification and partial characterization of a nucleoplasmin-like protein with sperm-nuclei decondensing activity in Mytilus californianus. Biochemistry, 34:7563–7568.

Richards E.J., Elgin S.C., 2002. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing: rounding up the usual suspects. Cell., 108(4):489-500.

Roest H.P., van Klaveren J., de Wit J., van Grup C.G., Koken M.H., Vermey M., van Roijen J.H. et al., 1996. Inactivation of the HR6B ubiquitin-conjugating DNA repair enzyme in mice causes male sterility associated with chromatin modification. Cell, 86:799-810.

Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M., 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem., 273:5858–5868.

Rountree M.R., Bachman K.E., Baylin S.B, 2000. DNMT1 binds HDAC2 and a new co-repressor, DMAP1, to form a complex at replication foci. Nat. Genet., 25(3):269-77.

Rousseaux S., Caron C., Govin J., Lestrat C., Faure A.K., Khochbin S., 2005. Establishment of male-specific epigenetic information. Gene, 345:139-153.

Schagdarsurengin U., Paradowska A., Steger K., 2012. Analysing the sperm epigenome: roles in early embryogenesis and assisted reproduction. Nature Reviews Urology, 9:609-619.

Schermelleh L., Spada F., Easwaran H.P., Zolghadr K., Margot J.B., Cardoso M.C., Leonhardt H., 2005. Trapped in action: direct visualization of DNA methyltransferase activity in living cells. Nat. Methods., 2(10):751-6.

Suetake I., Shinozaki F., Miyagawa J., Takeshima H., Tajima S., 2004. DNMT3L stimulates the DNA methylation activity of Dnmt3a and Dnmt3b through a direct interaction. J. Biol. Chem., 279(26):27816-23.

Sung P., Prakash S., Prakash L., 1988. The RAD6 protein of Saccharomzces cerevisiae polyubiquitinates histones, and its acidic domain mediates this activity. Genes. Dev., 2:1476-1485.

Turek-Plewa J., Jagodzinski P.P. The role of mammalian DNA methyltransferases in the regulation of gene expression, 2005. Cell. Mol. Biol. Lett., vol. 10, 631-47.

Ward W.S., 1993. Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa. Biol. Reprod., 48:1193-1201.

Ward W.S., 1994. The structure of the sleeping genome : implications of sperm DNA organization for somatic cells. J. Cell. Biol., 55:77-82.

Xuan Z., Zhiming L., Huinuan L., Long G., Qing L., Zhongxian L., Chi-Meng T., 2015. Integrated miRNA and mRNA expression profiling to identify mRNA targets of dysregulated miRNAs in non-obstructive azoospermia. Sci. Rep., 5:7922.

Yamazaki Y., Mann M.R., Lee S.S., Marh J., McCarrey J.R., Yanagimachi R., Bartolomei M.S., 2003. Reprogramming of primordial germ cells begins before migration into the genital ridge, making these cells inadequate donors for reproductive cloning. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(21):12207-12.

Zărnescu O., 2002. Gametogeneza. În: Biologia moleculară a dezvoltării, Partea a II-a. Ed. Universității din București, 9-66.

Alberts B., Johnson A., Lewis J., 2002. Molecular Biology of the Cell 4th edition. New York: Garland Science; Sperm. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26914/

Sau

Alberts, B., Bray, D., Lewis, J. et al. (1994) Molecular Biology of The Cell. Garland Publishing, New York, USA, 1294 pp.