Efectele Daunatoare ale Bauturilor Alcoolice Asupra Sanatatii Consumatorilor

EFECTELE DĂUNĂTOARE ALE BĂUTURILOR ALCOOLICE ASUPRA SĂNĂTĂȚII CONSUMATORILOR

CUPRINS

REZUMAT

I.INTRODUCERE

I.1. DATE CU PRIVIRE LA ALCOOLI

I.2. STRUCTURA ȘI NOMENCLATURA

I.3 PROPRIETĂȚILE FIZICE

I.4. UTILIZĂRILE ALCOOLILOR

I.5. CLASIFICAREA BĂUTURILOR ALCOOLICE

I.5.1. BĂUTURILE ALCOOLICE FERMENTATE

I.5.2. BĂUTURILE ALCOOLICE DISTILATE

I.6. EVAZIUNEA FISCALĂ ȘI FALSURILE DIN INDUSTRIA ALCOOLULUI

II. ANALIZA IMPACTULUI DE REGLEMENTARE

II.1. MOTIVAREA REGLEMENTĂRILOR

II.2. DEFINIREA PROBLEMEI

II.3. ESTIMAREA PROBLEMEI ȘI DIMENSIONAREA ACESTEIA

III.STUDIU DE CAZ SI ANALIZE

III.1. OBIECTIVELE STUDIULUI DE CAZ

III.2. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

III.2.1. DEZVOLTAREA METODEI

III.2.2. VALIDAREA METODEI

III.2.2.1. LINIARITATEA

III.2.2.2. LIMITĂ DE DETECȚIE (LD)

III.2.2.3. LIMITĂ DE CUANTIFICARE (LQ)

III.2.2.4. INTERVALUL (DOMENIUL DE LUCRU)

III.3. PRECIZIA METODEI

III.3.1. REPETABILITATEA ANALIZEI. PRECIZIA SISTEMULUI

III.3.2. PRECIZIA INTERMEDIARĂ

III.3.3. REPRODUCTIBILITATEA

III.3.4. ACURATEȚEA (EXACTITATEA)

III.4. CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA METANOLULUI PRIN GC-MS

IV. APLICABILITATEA METODEI DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

IV.1. PROTOCOL DE LUCRU

IV.2. REZULTATE ȘI DISCUȚII

IV.2.1. DETERMINAREA METANOLULUI DIN DISTILATELE ALCOOLICE NATURALE

IV.2.2. DETERMINAREA CONCENTRAȚIEI METANOLULUI FAȚĂ DE CONCENTRAȚIA DE ETANOL

IV.2.3 DETERMINAREA PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ A ALTOR VOLATILI TOXICI PREZENȚI ÎN DISTILATELE ALCOOLICE

IV.3. CONCLUZII

V. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINARE CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

V.1. DEZVOLTAREA METODEI

V.2. VALIDAREA METODEI

V.2.1. LINIARITATEA

V.2.2. LIMITĂ DE DETECȚIE

V.2.3. LIMITĂ DE CUANTIFICARE (LQ)

V.2.3. INTERVALUL (DOMENIUL DE LUCRU)

V.2.4. PRECIZIA

V.2.5. ACURATEȚEA (EXACTITATEA)

V.3. CONCLUZII REFERITOARE LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN GC-MS

V.4. APLICABILITATEA METODEI GC-MS LA DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PROVENITE DE LA ANIMALE DE EXPERIENȚĂ

VI. MATERIAL ȘI METODĂ

VI.1. DETERMINAREA VARIAȚIEI CONCENTRAȚIILOR DE METANOL ÎN SÂNGE ÎN CAZUL INJECTĂRII DE METANOL CU DOZA DE DL50 LA IEPURI DIN RASA „OLANDEZ CENUȘIU” ȘI OBSERVAREA SIMPTOMATOLOGIEI INTOXICAȚIEI

VI.2. STABILIREA DOZELOR ȘI MODUL DE ADMINISTRARE A METANOLULUI LA ANIMALELE DE EXPERIENȚĂ

VI.3. RECOLTAREA PROBELOR ÎN URMA ADMINISTRĂRII METANOLULUI ÎN DOZĂ DL50 LA IEPURII DIN RASA „OLANDEZ CENUȘIU”

VI.4.REZULTATE ȘI DISCUȚII

VI.5.SIMPTOMATOLOGIA INTOXICAȚIEI METANOLICE ÎN URMA ADMINISTRĂRII DE METANOL ÎN DOZĂ DL50 LA IEPURII DIN RASA “OLANDEZ CENUȘIU”

VI.6. DOZAREA METANOLULUI PRIN GC-MS DIN SÂNGE ȘI PROBE BIOLOGICE LA RASA DE IEPURI “OLANDEZ CENUȘIU” (DL100)

VI.7. DOZAREA METANOLULUI PRIN GC-MS

VI.8. STABILIREA ȘI ADMINISTRAREA DOZEI DE METANOL DL 100 LA IEPURII DIN RASA “OLANDEZ CENUȘIU”

VI.9. RECOLTAREA PROBELOR BIOLOGICE

VI. 10. REZULTATE ȘI DISCUȚII

VI.11. SIMPTOMATOLOGIA INTOXICAȚIEI METANOLICE ACUTE CU DOZĂ DE METANOL DL100 LA IEPURII DIN RASA “OLANDEZ CENUȘIU”

VI.12. DETERMINAREA CONCENTRAȚIILOR DE METANOL PRIN GC-MS DIN ORGANE ȘI ȚESUTURI LA IEPURI DIN RASA „OLANDEZ CENUȘIU”

VI.13. PROTOCOL DE LUCRU

V.14. REZULTATE ȘI DISCUȚII

VII. DETERMINAREA CONCENTRAȚIEI DE METANOL ÎN CAZUL INTOXICAȚIILOR LETALE

VII.1 PREZENTAREA CAZULUI NR. 1

VII.2. PREZENTAREA CAZULUI NR. 2

VII.3. CONCLUZII FAȚĂ DE CAZUISTICĂ

VIII. INCIDENȚA INTOXICAȚIILOR LETALE CU ALCOOL METILIC ÎN UNELE JUDEȚE DIN ROMÂNIA ÎN PERIOADA 2005 – 2010

VIII.1. STUDIUL STATISTIC AL INTOXICAȚIILOR LETALE PENTRU TOATE JUDEȚELE

VIII.2. CONCLUZII

IX. CONCLUZII GENERALE

IX.1. CONTRIBUȚII ORIGINALE

IX.2. PERSPECTIVE DE CERCETARE

BIBLIOGRAFIE

REZUMAT

Această lucrare urmărește prezentarea efectelor nefaste ale consumului de produse alcoolice pentru sănătatea persoanelor consumatoare. S-a realizat o scurtă prezentare a alcoolilor pentru a se cunoaște fundamentul acestor efecte, apoi s-au discutat utilizările cele mai frecvente ale acestor băuturi alcoolice.

Ulterior s-au menționat o serie de falsuri privind conținutul de produse toxice incluse în băuturile alcoolice, și respectiv ce efect au acestea asupra sănătății consumatorilor cât și asupra evaziunii implicite. Mai apoi s-a evidențiat legislația în vigoare pentru aceste cazuri de fabricare a produselor alcoolice folosindu-se diverși produși toxici, cât și diverse legi aferente industriei comercializării cât și fabricării produselor alcoolice.

S-au realizat diverse studii cu privire la sănătatea publică în funcție de consumul alcoolui natural cât și de cel cu adaosuri toxice.

După acestea s-a urmărit concentrația de metanol prin cercetări toxico-chimice de gaz-cromatografie cuplată cu spectrometrie de masă într-o serie de cazuri atât pe animale cât și pe ființe umane.

Cuvinte cheie: efecte negative, produși toxici ilegali, spectrometrie de masă.

INTRODUCERE

În momentul de față sunt descrise nenumărate aspecte ale băuturilor alcoolice printre care și efectele acestora asupra sănătății consumatorilor. Acest fenomen este într-o oarecare măsură și firesc pe lângă faptul că este cercetat în amănunt. Există o istorie de mii de ani ce stă drept fundament pentru băuturile alcoolice acestea integrându-se vieții de fiecare zi a omului, alături de pasiunile, obiceiurile ori alături de petrecerile acestuia.

Conform specialiștilor băuturile alcoolice datează încă din mileniul al VII-lea înainte de era noastră, fiind introduse mai întâi băuturile vinoase (începând cu mileniul 3), apoi făcându-și apariția berea (în Egipt și Mesopotamia) și mai apoi restul acestora.

De-a lungul acestor perioade s-a strâns o literatură bogată în legătură cu băuturile alcoolice cât și a vinului, variind de la cânturile literaților, la critica moraliștilor și până la analiza oamenilor de știință. Băuturile alcoolice sunt aproape imposibil de eliminat din rutina și din viața oamenilor.

Actualmente este profund îngrijorătoare creșterea progresivă a consumului de alcool pe întregul glob. Unele dintre cauze pot fi cele economice, sociale ori fenomenele de insecuritate asupra existenței cotidiene, alteori șomajul poate fi un criteriu valoric de ordin arbitrar pentru promovarea cadrelor, acestea putând fi explicate și prin imposibilitatea economică de calificare prin uzul studiilor superioare. Alteori acest consum exagerat poate fi o cauză a alimentației neraționale și uneori ineficiente, ori alteori poate culmina cu consumul de droguri, toate acestea accentuând într-o societate cu un sistem inechitabil, acest consum de alcool poate deveni o evadare, ori un refugiu, și la un moment dat un soi de speranță pentru unele persoane.

Această întreagă evoluție a consumului de alcool a dus treptat la prioritizarea diagnosticală cât și terapeutică în cadrul practicii medicale.

I.1. Date cu privire la alcooli

Originea cuvântului alcool provine din limba arabă și este împărțit astfel:” al” este articolul și “cohol” este tradus,” lucru subtil”, o traducere oarecum destul de metaforică asupra noțiunii în sine.

În acest caz când este vorba de alcool, se face referire la alcoolul etilic, iar acesta prezintă următoarea formula structurală:

Privit strict din punct de vedere fizic, alcoolul etilic prezent în stare pură apare sub forma unui lichid incolor și inflamabil, având punctul de fierbere la aproximativ 780C, prezentând un gust amar, ce arde preponderent cu flacără albastră.Se poate amesteca alături de alte substanțe precum: apă, alcoolul metilic cât și cu eterul dar și cu alte substanțe de tip organic.

Acest produs este obținut pe cale naturală folosindu-se fermentarea zaharului cât și a amidonului din diverse fructe, uneori cereale sau cartofi fiind prezentă enzima (fermentul) ce poartă numele de cozimază, acesta fiind un produs al metabolismului ciupercii din drojdia de bere.

În perioada de fermentație se desfășoară un proces chimic de descompunere sau catabolizare a zahărului. Băuturile ce prezintă o concentrație mai ridicată sunt obținute prin distilarea unor produși de fermentație.

Pe lângă calea naturală binecunoscută, alcoolul se poate obține și pe cale artificială. Așadar pe cale sintetică se hidrogenează catalitic aldehida acetică ori se hidratează etilena, acestea având o largă utilizare în cadrul industriei chimice, farmaceutice dar și alimentare.

Cu toate că aceste două metode au nevoie de intervenția omului, în natură alcoolul poate lua naștere fără o anumită intervenție antropică. S-a realizat un film documentar în Africa în care este ilustrat în acest sens exemplul de mai sus. Astfel că anumite fructe din teritoriile exotice căzute pe sol au intrat într-un proces de fermentație și apoi au fost consumate de diverse animale ce au prezentat mai apoi diferite semne și stări de ebrietate.

Există presupuneri că și omul la rândul său a cunoscut în acest fel alcoolul.Cu toate acestea pornind din acest punct până în momentul când omul a produs și a consumat în mod deliberat băuturi alcoolice, a trecut o perioadă destul de lungă

Începând de la omul de Cro-Magnon (încă din anul 40.000 înainte de Hristos) se presupune că se cunoștea modul de preparare al băuturilor fermentate. Fără îndoială asemenea tipuri de băuturi au fost produse în mod intenționat încă din perioada de început a agriculturii, chiar din mezolitic, mai exact între anii 10.000 și 5.000 de ani înainte de Hristos și s-a folosit alături de apă cu miere de albine (din hidromel), cât și orz, ori uneori lapte de iapă. Aceste băuturi erau consumate adesea sub forma unui aliment ori sub forma unor ofrande.

Cu toate acestea alcoolul a fost pe deasupra și un puternic drog, fiind folosit frecvent chiar și în ritualurile magice. Conform datărilor celor mai vechi documente istorice, băuturile alcoolice sunt menționate încă de acum 6.000 de ani. În Mesopotamia, ori Egipt până în China și Grecia, chiar și în Biblie, toate aceste scrieri străvechi menționează mărturiile celor ce au folosit băuturile alcoolice, fiind menționate și cazurile în care s-a abuzat de aceste băuturi.

Ca substanță separată și distinctă, alcoolul este produs pentru prima dată la o distanță de peste 5.000 de ani față de primele atestări documentare, fiind folosite în acest caz tehnici inovatoare și performante în procesul de distilare. Acesta este motivul pentru care băuturile alcoolice sunt prezente de-abia din Evul Mediu. Din acea perioadă alcoolul a fost folosit și sub formă de solvent pentru a se putea extrage principiile active din plante.

Așadar se poate concluziona că alcoolul a avut un prim scop de reducere a temerilor în fața manifestărilor de forță ale naturii dar și în fața incertitudinilor vieții ,astfel că pentru a putea trece mai ușor peste anumite bariere în contactele inter-umane s-a simțit nevoia consumului de alcool. Din câte se pare, alcoolismul la scară largă nu a fost un manifest puternic în perioada antichității, ci mai degrabă în ultimele secole și mai mereu în prezent.

I.2. Structura și nomenclatura

Folosind formula alcoolilor monohidroxilici, de tip R-OH, se poate observa faptul că aceștia pot fi considerați atât derivați din hidrocarburi, prin simpla înlocuire a unui atom de Hidrogen folosind un radical de tip organic. În majoritatea alcoolilor există o grupă de tip –OH ce este legată printr-o singură valență de către un atom de carbon folosit dintr-un radical de hidrocarbură.

Pentru o înțelegere mai bună și implicit pentru evidențierea pragmatică, se poate trata un alcool cu un acid de clorhidric de tip gazos și rezultă apă alături de aceasta fiind și un derivat halogenat, precum urmează:

– R-OH (alcoolul)+acid clorhidric-> Hrea zaharului cât și a amidonului din diverse fructe, uneori cereale sau cartofi fiind prezentă enzima (fermentul) ce poartă numele de cozimază, acesta fiind un produs al metabolismului ciupercii din drojdia de bere.

În perioada de fermentație se desfășoară un proces chimic de descompunere sau catabolizare a zahărului. Băuturile ce prezintă o concentrație mai ridicată sunt obținute prin distilarea unor produși de fermentație.

Pe lângă calea naturală binecunoscută, alcoolul se poate obține și pe cale artificială. Așadar pe cale sintetică se hidrogenează catalitic aldehida acetică ori se hidratează etilena, acestea având o largă utilizare în cadrul industriei chimice, farmaceutice dar și alimentare.

Cu toate că aceste două metode au nevoie de intervenția omului, în natură alcoolul poate lua naștere fără o anumită intervenție antropică. S-a realizat un film documentar în Africa în care este ilustrat în acest sens exemplul de mai sus. Astfel că anumite fructe din teritoriile exotice căzute pe sol au intrat într-un proces de fermentație și apoi au fost consumate de diverse animale ce au prezentat mai apoi diferite semne și stări de ebrietate.

Există presupuneri că și omul la rândul său a cunoscut în acest fel alcoolul.Cu toate acestea pornind din acest punct până în momentul când omul a produs și a consumat în mod deliberat băuturi alcoolice, a trecut o perioadă destul de lungă

Începând de la omul de Cro-Magnon (încă din anul 40.000 înainte de Hristos) se presupune că se cunoștea modul de preparare al băuturilor fermentate. Fără îndoială asemenea tipuri de băuturi au fost produse în mod intenționat încă din perioada de început a agriculturii, chiar din mezolitic, mai exact între anii 10.000 și 5.000 de ani înainte de Hristos și s-a folosit alături de apă cu miere de albine (din hidromel), cât și orz, ori uneori lapte de iapă. Aceste băuturi erau consumate adesea sub forma unui aliment ori sub forma unor ofrande.

Cu toate acestea alcoolul a fost pe deasupra și un puternic drog, fiind folosit frecvent chiar și în ritualurile magice. Conform datărilor celor mai vechi documente istorice, băuturile alcoolice sunt menționate încă de acum 6.000 de ani. În Mesopotamia, ori Egipt până în China și Grecia, chiar și în Biblie, toate aceste scrieri străvechi menționează mărturiile celor ce au folosit băuturile alcoolice, fiind menționate și cazurile în care s-a abuzat de aceste băuturi.

Ca substanță separată și distinctă, alcoolul este produs pentru prima dată la o distanță de peste 5.000 de ani față de primele atestări documentare, fiind folosite în acest caz tehnici inovatoare și performante în procesul de distilare. Acesta este motivul pentru care băuturile alcoolice sunt prezente de-abia din Evul Mediu. Din acea perioadă alcoolul a fost folosit și sub formă de solvent pentru a se putea extrage principiile active din plante.

Așadar se poate concluziona că alcoolul a avut un prim scop de reducere a temerilor în fața manifestărilor de forță ale naturii dar și în fața incertitudinilor vieții ,astfel că pentru a putea trece mai ușor peste anumite bariere în contactele inter-umane s-a simțit nevoia consumului de alcool. Din câte se pare, alcoolismul la scară largă nu a fost un manifest puternic în perioada antichității, ci mai degrabă în ultimele secole și mai mereu în prezent.

I.2. Structura și nomenclatura

Folosind formula alcoolilor monohidroxilici, de tip R-OH, se poate observa faptul că aceștia pot fi considerați atât derivați din hidrocarburi, prin simpla înlocuire a unui atom de Hidrogen folosind un radical de tip organic. În majoritatea alcoolilor există o grupă de tip –OH ce este legată printr-o singură valență de către un atom de carbon folosit dintr-un radical de hidrocarbură.

Pentru o înțelegere mai bună și implicit pentru evidențierea pragmatică, se poate trata un alcool cu un acid de clorhidric de tip gazos și rezultă apă alături de aceasta fiind și un derivat halogenat, precum urmează:

– R-OH (alcoolul)+acid clorhidric-> H2O+R-Cl (un derivat halogenat)

Cu toate că denumirea de ordin rațional a alcoolilor este formată după regulă de mai sus, adăugând sufixul „ol” ori prefixul „hidroxi” la numele hidrocarburii de tip baza, mai este folosită și nomenclatura veche, după care este indicat numele alcoolilor folosindu-se asocierea termenului „alcool” alături de numele respectivului radical. Uneori se uzitează frecvent numirea de etanol pentru alcoolul etilic, cât și propanol pentru alcoolul propilic.

Când se realizează o denumire pentru un alcool este necesar a se ține seama de poziția ocupată de atomul de carbon față de care este legat respectivul hidroxil la fel și legat de existența izomerilor.

I.3 Proprietățile fizice

La temperatură obișnuită, alcoolii în general, apar sub forma unor substanțe incolore, lichide dar uneori pot fi și solide. Ele prezintă anumite puncte de fierbere ce sunt cu mult mai ridicate față de cele ale hidrocarburilor sursă, și uneori pot fi chiar mai ridicate decât cele ale unor combinații organice de ordin asemănător. Acest comportament distinct este datorat faptului că fiind în stare lichidă, unii alcooli tind să formeze asociații de tip molecular, și astfel aceștia nu se mai găsesc sub forma R-OH, ci mai mereu sub forma unor molecule de alcool legate între ele prin intermediul unor legături de H, in acest mod ajungând să formeze asociații de forma (R-OH) x.

Legăturile acestea ale Hidrogenului apar între atomul de H al unei simple molecule și atomul de O al unei alte molecule; acestea au la bază o cauză a polarității grupei OH.Din starea de vapori, legăturile existente între vapori se pot desface, după care alcoolul va rămâne într-o formă neasociată. Este știut că alcoolii de ordin primar dețin un punct de fierbere mult mai ridicat decât alcoolii terțiari.

Cu toate acestea, densitatea lor este mai mică decât a apei. Acest fapt se datorează acțiunii de tip ecranat realizate de către radicalii alchil asupra grupării hidroxil, ce îngreunează asocierea. Acțiunea aceasta este cel mai frecvent întâlnită în cadrul alcoolilor terțiari. Odată cu creșterea numărului de atomi de carbon din cadrul moleculei se va observa o scădere a solubilității alcoolilor în apă.

Pe de altă parte, metanolul, etanolul și propanolul se pot amesteca în orice proporții cu apa. Aceștia sunt foarte buni dizolvanți pentru anumiți compuși organici. Însă, alcoolii superiori sunt insolubili față de apă având și proprietatea de a reuși să protejeze de umiditate substanțele pe care le acoperă.

I.4. Utilizările alcoolilor

Una dintre utilizări este regăsită printre metanol care este folosit pentru a se obține formaldehidele, masele plastice, benzinele sintetice cât și unii coloranți. Acesta este un combustibil foarte bun, dar este toxic și poate provoca orbirea.

Un alt produs este etanolul și este folosit la băuturile alcoolice sub formă de solvent în cadrul industriei lacurilor și vopselelor, precum și în industria farmaceutică.Pe lângă acesta, glicerina este un alt alcool folosit la obținerea dinamitei dar și a unor materiale izolante, ea fiind folosită și sub formă de medicament.

I.5. Clasificarea băuturilor alcoolice

Băuturile alcoolice au conținutul bogat în alcool etilic datorită fermentării fructelor și cerealelor constituente ori a altor componente din diverse plante având un conținut bogat în carbohidrați, precum zaharurile. Este de la sine cunoscut că băuturile alcoolice sunt reprezentate și de preparatele în care alcoolul propriu-zis este doar adăugat, precum este cazul cocktailurilor.

O simplă clasificare a acestor băuturi alcoolice este întreprinsă prin două mari categorii: una este reprezentată de băuturile fermentate iar cealaltă de băuturile distilate.Pe lângă această clasificare, acestea două sunt împărțite la rândul lor în alte două categorii. Astfel ca băuturile fermentate cuprind berea și vinul, iar cealaltă categorie a băuturilor distilate cuprinde lichiorul și băuturile spirtoase. Sursele alcoolice din aceste produse pot fi următoarele, indiferent de ordine sau de amestecurile posibile, precum urmează: orzul, porumbul, apoi orezul, uneori grâul, apoi secara, cartofii, sfecla și trestia de zahăr sau molasa și implicit mierea.

I.5.1. Băuturile fermentate

Una dintre băuturile obținute prin fermentație este berea. Astfel că acest produs se fabrică din malț, hamei și frecvent drojdie. Malțul este un derivat din cereale ce sunt încolțite, de obicei orz, ce este folosit sub formă de hrană pentru drojdie îndeosebi în cazul hameiului (numit humulus Lupulus) de la care se folosește doar floarea, și distruge alte bacterii ce ar putea competiționa cu drojdia pentru obținerea hranei (mai exact cerealele). Același procedeu este folosit și în cazul berii fără alcool, după care urmează extragerea chimică a alcoolului conținut.În mod uzual conținutul în alcool al berii este între 5-8%, apropiat de 0% în cazul berii fără substanțe alcoolice.

Următoarea băutură fermentată este sake (se numește și vin de orez) și este o băutură japoneză tradițională fiind asimilată din punct de vedere al produsului finit cu vinul binecunoscut în Europa. Cu toate acestea este mai apropiată din punctul de vedere al procesului de producere, cu berea, sake-ul fiind produs prin fermentarea orezului. În mod normal conținutul de alcool deținut de sake în stare nediluată este între 18 și 20%.

O altă băutură de fermentație este Cidrul. Aceasta este o băutură obținută prin fermentația merelor, iar conținutul de alcool variază între 2 și 8%.

Urmează vinul și în acest caz există o serie de sortimente de vin ce au în comun obținerea prin fermentarea diverselor fructe, dar cel mai desstrugurii.Pe lângă struguri, pentru fabricarea vinului se mai folosesc fructele de pădure, prunele dar și merele. În mod obișnuit conținutul de alcool variază de la 8 la 14%.

Mai apoi apar vinurile fortificate ce sunt sortimente ale vinului obținute printr-un adaos de alcool, având un conținut de alcool etilic de la 18 până la 20%, ca în cazurile: sherry, ce este un vin alb fortificat cu brandy, apoi porto, ce este un vin dulce fortificat, apoi muscățelul, ce este un vin de struguri din varietatea de tip Mușcat, și în final este vermutul ce reprezintă un vin fortificat având adaosuri aromate.

După acestea urmează ultima categorie de băuturi fermentate, aceasta fiind șampania. Acesta este un sortiment al vinului spumos aparținând regiunii Champagne din zona de nord-est a Franței.

I.5.2. Băuturile distilate

Prima dintre băuturile distilate este reprezentată de Whiskey. Aceasta este o băutură distilată iar când este produsă din porumb se numește Tennessee, Bourbon sau Blended Scoth, apoi poate fi produsă din secară sau orz și atunci se numește Irish, Scoth. Conținutul în alcool pentru majoritatea sortimentelor de whiskey variază în jurul valorii de 40%.

Următoarea băutura distilată este votca, și aceasta este produsă dintr-o serie de cereale, precum secara, orzul și cartoful, chiar și grâul, având un conținut în alcool ce variază între 38% și 40%.

Romul este o altă băutură distilată produsă din melasă, mai exact din trestie de zahăr, având un conținut de aproximativ 35%, in acest caz avem exemplul Bacardi.

Ginul este o altă băutură distilată obținută din cereale și aromatizată cu esență de ienupăr, avando concentrație de alcool ce variază între 40 și 45 %.

Apoi o altă băutură distilată este Tequila, aceasta fiind distilată din agave albastre cu un conținut ce variază de la 30 la 40% în alcool.

Brandy este o altă băutură distilată obținută din vin ars cu un conținut în alcool variind destul de mult, mai exact între 35 și 60%. Un alt tip de brandy este coniacul originar din regiunea franceză de vest dar și in partea centrală, numită și le region delimitee Cognac.

Un alt sortiment de băutură distilată este reprezentat de Martini și conține gin cu vermut, acesta fiind un sortiment de vin fortificat

Următoarea băutură distilată este țuica, aceasta fiind produsă din fructe, de obicei prune. Încadrată la categoria Brandy, țuica reușește să reunească și alte tipuri de brandy, de obicei distilate de două ori, precum: palinca și horinca.

După țuică, următoarea băutura distilată este rachiul, acesta fiind provenit din fructe fermentate, în alte țări balcanice fiind numit “rakia”.

Un alt sortiment de brandy este vinul ars, iar acesta seamănă mult cu varietatea numită coniac.

Ultima băutura distilată este reprezentată de lichior, aceasta fiind o categorie distinctă diferită de băuturile spirtoase prezentate mai sus, prin folosirea zaharului sub formă de component adăugat. Exemplele de lichior sunt următoarele: Ouzo, Pastis, apoi Chartreuse și Unicum, dar și Jagermeister cât și Campari.

I.6. Evaziunea fiscală și falsurile din industria alcoolului

În primul rând, evaziunea fiscală a fost inclusă pe lista vulnerabilităților la adresa întregii siguranțe naționale a României, încă din anul 2010.Cu toate că au trecut mai bine de 5 ani de atunci, perioada în care s-au schimbat diverse declarații acide între guvernanți, nu s-au făcut schimbări majore în această industrie catalogată ca fiind una dintre domeniile cele mai vulnerabile pentru situațiile de evaziune.Printre cauzele importante sunt reprezentate maimulte, după cum urmează: taxarea foarte ridicată, consumul mare, dar și lipsa anumitor controale severe. Guvernul este necesar a dubla impozitarea prin acțiuni dure de control ce să descurajeze evaziunea și falsurile prin adăugarea diverșilor componenți toxici în produsele alcoolice.Cu toate acestea, printr-o taxare excesivă începând cu anul 2013, Guvernul a mărit acciza de la 750euro/hl la aproximativ 1000euro/hl. În momentul de față chiar dacă există un set de taxe, colectarea acestora este destul de slabă, astfel că doar câteva companii plătesc accizele la stat, iar acest fapt este scos în evidență de banderolele emise în primele șase luni din 2014 ce sunt cu 50% mai puține față de anul 2013. Un alt exemplu este denotat de faptul că în anul 2001, în România erau utilizate 600 de milioane de banderole, dar în anul 2014 doar 80 de milioane.

Pe lângă acestea există și premise pentru falsificarea produselor alcoolice. Astfel ca băuturile alcoolice prezintă o calitate îndoielnică, dar mai mult de-atât ea este și riscantă prin utilizarea diverșilor componenți toxici în produsul final. O soluție pentru aceasta ar putea fi comercializarea băuturilor alcoolice doar în magazinele autorizate. Această modalitate ar putea fi la îndemână pentru verficările ulterioare ale autorităților asupra plății taxelor dar și asupra calității produselor.Un alt exemplu este oferit de Ungaria, unde transportul alcoolului este urmărit prin intermediul GPS, în România însă au loc diverse transporturi fictive către statele învecinate precum Bulgaria, în aceste produse folosindu-se și o doză de apă. În momentul de față evaziunea fiscală în industria alcoolului este estimată la 50%, conform Consiliului Fiscal din România și la aproximativ 90% după cum afirmă reprezentanții din domeniu. După evaziune, o altă problemă este și calitatea băuturilor alcoolice.Mitul de țuică ori de rachiu de casă este intens validat de către patroni. Astfel că aceștia afirmă că pentru a se putea produce 200 milioane de litri de alcool din fructe, cât este în momentul actual consumul în România, ar fi necesar a se cultiva o suprafață de aproximativ 233.000 Ha de pomi fructiferi. După cum afirmă CEO-ul Alexandrion, liderul actual al pieței de alcool din România, o mare parte a acestui alcool comercializat este produs cu ajutorul diverșilor componenți toxici.În momentul de față există peste 100.000 de cazane în România. Problema apare nu la cei care produc pentru consumul personal, ci la persoanele care în fiecare săptămână scot pe piața zeci de tone de alcool, ce este produs în condiții improprii, având și pe deasupra și efecte tulburătoare asupra sănătății consumatorilor. Anul trecut în județul Bihor a existat un caz care s-a soldat cu moartea a 30 de persoane după ce au consumat afinată produsă prin adaos de alcool metilic.Circuitul economic de tip evazionist a luat o mare amploare în România și are ca scop în unele situații denaturarea de ordin ilicit a alcoolului ce este produs de Marex Brăila, iar livrarea acestuia este realizată sub forma altor produse, precum alcool sanitar, loțiuni de ordin cosmetic, și soluții de spălat parbrizele folosindu-se o rețea de societăți comerciale evitând în acest mod plata accizelor.De îndată ce erau livrate aceste produse, comercianții respectivi le renaturau folosindu-se de filtrări repetate, vânzându-le mai apoi sub formă de băuturi alcoolice.

II.ANALIZA IMPACTULUI DE REGLEMENTARE

Se expun următoarele idei ce stau la baza creării ulterioarelor reglementări legislative, după cum urmează:

->Având la bază politica statului de control în cazul consumului nociv al produselor alcoolice cât și ineficiența anumitor mijloace de control cu scopul reducerii consumului în mod abuziv de alcool;

->Luând în calcul numărul crescut al persoanelor dependente de produse alcoolice și luând în considerare creșterea consecințelor negative rezultate în urma consumului de alcool;

->observând acestea s-a dezbătut asupra protejării consumatorilor în fața efectelor negative ale campaniilor publicitare din prezent desfășurate în cadrul Cumunitații Europene cât și in cadrul Directivei Comisiei din Europa;

->în scopul realizării unui program de ordin național cu privire la controlul alcoolului în perioada 2012-2020, ce este aprobat prin hotărârea de guvern Nr.360 din data de 06.06.2012;

->în scopul respectării recomandării 2001.458/EC din data de 05.06.2001, legată de consumul de alcool de către tineri, mai ales copii cât și adolescenți, dar și în scopul urmăririi strategiei europene înființată pentru reducerea eventualelor daune cauzate de consumul excesiv de alcool.

II.1. Motivarea reglementărilor

Pentru a se motiva analiza impactului de reglementare a fost dezvoltată în baza articolului 13 Legea cu numărul 23 5-XVI- din data de 20 iulie, anul 2006, asupra principiilor de bază ale reglementării pentru activitatea de întreprinzător, ele fiind în conformitate cu prevederile din Metodologia analizei impactului de reglementare ce a fost aprobată prin hotărârea de guvern nr.1230 din data de 24 octombrie anul 2006.

Mai apoi elaborarea proiectului de lege:” Cu privire la o anumită modificare dar și completare a unor acte de ordin legislativ” se prezintă cu scopul fundamental de a ameliora sănătatea publică din România, în urma existenței unor cazuri în care consumul produselor alcoolice contrafăcute a avut efect nociv asupra sănătății consumatorilor și respectiv la încercarea de a se minimaliza efectele preponderent negative.

Aceste efecte apar frecvent la tineri și la persoanele din generația post-decembristă și în același timp încercarea reducerii gradului de impunerii unei păreri false asupra beneficiilor în cazul consumului de alcool, și pe deasupra încercarea promovării unui mediu sănătos de viață.

Această adoptare de proiect de lege are rolul de a contribui la asigurarea securității naționale prin stabilirea unui genofond sănătos.Se menționează de altfel că adoptarea cât și implementarea acestui proiect legislativ va avea un impact vizibil într-o perioadă variind de la 10 la 15 ani.

II.2. Definirea problemei

Deoarece sănătatea publică și consumul produselor alcoolice reprezintă două entități inseparabile în momentul de față, acest fapt prezintă o problemă de ordin prioritar care poate favoriza apariția unor maladii de tip cardio-vascular și neoplasmatic, alteori gastro-intestinal și genetic, putând fi adesea și psihologic.

Procentul de 10% reprezintă mortalitatea generală a populației și cuprinde segmentul de vârstă între 16 și 74 de ani în condiții de consum abuziv de alcool. Alcoolul majorează riscul ruinării familiilor, al agresivității sociale și adesea al criminalității. Consumul de alcool crește riscul dezvoltării cirozelor de tip hepatic, apoi a neoplasmelor, HA chiar și ictus, iar alteori apar malformații de tip congenital și provoacă cel mai frecvent dependența alcoolică și comportamentul deviant. În procent de până la 60% au loc suiciduri datorită consumului de alcool și unul din 3 accidente rutiere este o cauză a consumului de alcool, pe lângă acestea 40% din totalul intoxicațiilor și al otrăvirilor sunt o cauză directă pentru consumul abuziv de băuturi alcoolice în care s-au adăugat componenți toxici.

Pe de altă parte se poate observa că aproximativ 60% din totalul estimărilor prezintă tineri influențați de publicitatea făcută acestor băuturi alcoolice, în special asupra berii, ce este prezentată ca și când alcoolul conținut reprezintă o valoare socială.Pe lângă acest fapt se observă că una dintre băuturile alcoolice preferate ale adulților dar și ale tinerilor este reprezentată de bere. Astfel că berea cât și vinul la fel ca și băuturile spirtoase prezintă anumite caracteristici distincte de la un produs la altul.

Cu toate că tehnologiile de realizare a băuturilor alcoolice variază de la o țară la alta, se poate observa că în majoritatea cazurilor, se folosește o cantitate identică-spre exemplu există un STAS pentru bere, un STAS pentru vin și un STAS pentru băuturile spirtoase, astfel ca acestea conțin cam aceeași cantitate de alcool.

Cu toate acestea există totuși o diferență redusă între diferitele tipuri de produse alcoolice în ceea ce privește un anumit impact în cazul sănătății. În cazul în care sunt consumate în exces ori în mod iresponsabil aceste băuturi alcoolice duc la diverse probleme persoanelor consumatoare ce se pot propaga asupra întregii comunități.

Tocmai din acest motiv este nevoie de intervenția statului folosindu-se diverse metode reglementative dar și de susținere deplină a unei politici de anticipare a consumului excesiv și adesea dăunător pentru consumatorii în cauză.

II.3. Estimarea problemei și dimensionarea acesteia

Diversele efecte pe care publicitatea le manifestă asupra întregii societăți contemporane se pot observa deja și se împânzesc direct sau uneori indirect și indiferent dacă sunt sau nu foarte vizibile ele trebuiesc sesizate din timp pentru a se evita situațiile grave.

Diversele reclame realizate pentru anumite produse alcoolice reprezintă un caz des întâlnit pentru a se ilustra impactul psihologic de ordin negativ ce are loc în general în cadrul mesajului transmis.

De altfel chiar și îndemnul în sine la consumul de alcool este unul fără tăgadă periculos pentru România, unde proporția de persoane consumatoare de produse alcoolice contrafăcute tinde către o creștere îngrijorătoare.

Cu toate acestea nu se fac sesizări cu atât mai puțin de către persoanele ce au în grijă acest departament și monitorizează această activitate. Luând în considerare faptul că fabricarea dar și circulația băuturilor alcoolice precum berea sunt anumite genuri de activitate ce se supun licențierii, de aici apare și lipsa unor reglementări ce ar putea să fie menționate într-o lege specială fără să creeze confuzii pentru diverșii agenți economici ce dezvoltă acest gen de activitate.

Producția,exportul și importul de bere între 2012 și 2014

Sursă: Conform indicatorilor privind circulația producției industriale în România din formularul BNS anul 2014.

După datele furnizate de Organizația Mondială de Sănătate, berea este consumată în mod preferențial de către tinerii având vârsta sub 30 de ani.

Datorită accesului destul de ușor la procurarea produselor alcoolice, mai exact berea, a ajuns să fie consumată încă de la vârste fragede, mai ales datorită lipsei legislației care să reglementeze producerea fără adaosuri chimice, va duce în mod implicit la răsfrângerea unor efecte negative asupra populației.La nivel mondial 83% dintre femei obișnuiesc să consume bere conform datelor statistice oferite de OMS.

În România conform unor estimări consumul de bere pentru segmentul de vârsta între 15 și 17 ani variază de la 3 la 4 ori pe săptămână. Această situație se răsfrânge în mod negativ asupra încălcărilor comise de către majoritatea conducătorilor auto ce au fost depistați în stare de ebrietate.

III.STUDIU DE CAZ SI ANALIZE

III.1. Obiectivele studiului de caz

În contextul actual generat de importanța elucidării mecanismului de acțiune a metanolului asupra organismului uman, cât și de importanța testelor toxicologice în cazul intoxicațiilor metanolice, prezentul studiu de caz își propune următoarele obiective:

Validarea unei metode GC-MS de determinare și cuantificare a metanolului din distilatele alcoolice;

Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice;

Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentrației metanolice din probe biologice, respective sânge și țesuturi.

Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu pe animale de laborator, respectiv pe iepuri, care cuprinde:

-Evaluarea dinamicii intoxicației metanolice analizând prin GC-MS probele de sânge recoltate de la iepuri la intervale prestabilite, în cazul administrării unei doze DL50 de metanol.

– Evaluarea stării de sănătate și dinamica intoxicației metanolice prin analiza GC-MS a probelor de sânge în cazul administrării metanol DL100 animalelor.

-Studierea variației concentrației metanolice din țesuturile animalelor de experiență, concentrație determinată prin GC-MS.

Aplicarea metodei de determinare a concentrației de metanol din probe biologice GC-MS, pe subiecți umani (prezentări de caz).

Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicații letale din unele județe din România.

III.2. Dezvoltarea și validarea unei metode de determinare a metanolului prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă

Obiective:

->Validarea unei metode GC-MS de determinare și cuantificare a metanolului din distilatele alcoolice.

Progresele realizate în stabilirea compoziției unor amestecuri complexe au fost posibile datorită perfecționării în ultimele decenii a tehnicilor cromatografice și în special a cromatografiei de gaze.

Datorită variabilității mari a substanțelor care compun un distilat din produse naturale apare evidentă necesitatea utilizării unor detectori universali care să ofere un semnal analitic pentru oricare din compușii separați. Sensibilitatea, precizia și adaptabilitatea la coloanele capilare, au făcut că spectrometrul de masă să devină cel mai utilizat tip de detector în analiza probelor necunoscute multicomponențiale separate prin cromatografie de gaze iar spectrele de masă obținute să constituie un punct de plecare foarte important în elucidarea structurilor chimice deci și a proprietăților fizico – chimice și farmacologice.

III.2.1. Dezvoltarea metodei

Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat la un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecție. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un debit de 1 mL/minut.

Astfel, au fost efectuate determinări inițial pe o coloană nepolară (DB 5 MS, cu următoarele dimensiuni: 30 m lungime x 0,25 mm diametru intern și 0,25 µm grosimea filmului depus pe pereții interni ai coloanei).

În urma analizei unei probe etalon ce conține metanol și etanol se observă faptul că timpii de retenție corespunzători celor doi compuși sunt relativ apropiați 1,539 minute pentru metanol și 1,615 minute pentru etanol.

Acest fapt nu este foarte important în situația în care cei doi alcooli se află în cantitate mică în proba analizată, în schimb, dacă etanolul se află în concentrație mare, există riscul ca picul corespunzător etanolului să mascheze picul metanolului.

Din acest motiv, în urma consultării literaturii de specialitate (U.S. Pharmacopeia – Cromatographic Columns 2009-2010) și a datelor tehnice privind coloanele utilizate în cromatografia de gaze ne-am oprit în cele din urmă la o coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (cu următoarele dimensiuni: 60 m lungime x 0,25 mm diametru intern și 0,25 µm grosimea filmului depus pe pereții interni ai coloanei).

Analizând cromatograma obținută se observă că timpul de retenție pentru metanol este de 6,650 iar pentru etanol este de 7,712. Dacă se ia în considerare și lățimea la bază a celor două picuri (0,049 pentru metanol și 0,117 pentru etanol) s-a calculat rezoluția între aceste două picuri, de 12,795, deci metodă este selectivă.

Am efectuat analize pentru mai multe rapoarte de splitare, anume 1/10, 1/50, 1/100 și 1/1000. Analizând datele experimentale obținute am considerat că raportul optim de splitare este de 1/50.

În continuare, pentru picul cu valoarea timpului de retenție 6,697 se înregistrează spectrul de masă și acesta se compară cu spectrele din biblioteca de spectre. Așa cum se observă din figura 9.7, pentru picul cu timpul de retenție 6,697, după compararea spectrală se obține identitatea compusului corespunzător, în cazul de față metanolul.

Un alt aspect avut în vedere îl constituie verificarea purității picului. Acest lucru este opțional în analiza cromatografică. Puritatea picului poate fi definită ca fiind un factor de prag, sub care se pot pune întrebări cu privire la precizia rezultatelor. În urma tuturor acestor experimente am stabilit condițiile experimentale optime de lucru:

cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; injector automat tip Agilent:

-> Technologies 7683 B Series; detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm și o grosime a filmului de 0,25 µm);faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 mL/minut;volum injecție de 0,1 µl; raport splitare 1/50; temperatura injectorului: 2500C;gradient temperatură în compartimentul coloanei: 500C, 20 minute, apoi temperatura crește cu 100C/min până la 2500C unde este menținută constantă încă 5 minute;temperatura sursei MSD: 2300C; temperatura cvadrupolului MSD: 1500C;modul de achiziție a spectrelor: SCAN (urmărirea tuturor liniilor din spectrul de masă);domeniul de masă urmărit: 15 – 500 unități atomice de masă;interpretarea rezultatelor obținute: Agilent Technologies ChemStation software.

III.2.2. Validarea metodei

III.2.2.1. Liniaritatea

Reactivi utilizați în studiul liniarității:

-> etanol de puritate cromatografică (Merck);metanol de puritate cromatografică (Merck);apă bidistilată;soluțiile standard: la un volum de 0,5 mL metanol se adaugă 5 mL etanol și 4,5 ml apă. Concentrația în metanol s-a calculat ținând cont de densitatea acestuia, conform relației în care:

D – densitatea metanolului (0,791 g/mL);

V – volumul de metanol luat în lucru (0,5 mL);

V – volumul final (10 ml).

Metanolîn g/mL == =0,03955
Solvent – amestec de etanol și apă în raport volumic de 1/1.

Din soluția standard (39550 g/mL) s-au preparat soluții de lucru prin diluare cu solvent.

Pornind din aceeași soluție stoc, s-au preparat un număr de 3 seturi de soluții de lucru pentru studiul linearității pe intervalul de concentrație 4,94375 – 19775 μg/mL. Fiecare din aceste probe au fost analizate în condițiile menționate, iar din cromatogramele obținute, s-a determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului.

În figura 9.9 se prezintă dreapta de calibrare obținută în studiul liniarității metodei de determinare a metanolului.

Tabelul 9.3 Calculul statistic al dreptei de regresie

S-a studiat liniaritatea funcției de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în funcție de concentrația injectată). Funcția de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 – 19775 μg/mL). Ecuația dreptei de regresie obținute s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate:

Arie = 4877,4 x Concentrația (μg/mL) + 1569486,174

Analizând datele experimentale obținute se observă că există două domenii de liniaritate diferite, pe domeniul 4,9 – 2768,5 μg/mL și respectiv 2768,5 – 19775 μg/mL.

Tabelul 9.5. Calculul statistic al regresiei

Pe domeniul 4,9 – 2768,5 μg/mL ecuația curbei de calibrare este:

Arie pic = 6500,4 x Concentrația – 11679,5

Pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL ecuația curbei de calibrare este:

Arie pic = 4685,8 x Concentrația + 3601973,7.

III.2.2.2. Limită de detecție (ld)

->LD = 146,4μg/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 μg/mL, respectiv LD = 875,8 μg/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 μg/mL.

III.2.2.3. Limită de cuantificare (lq)

-> LQ = 443,5 μg/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 μg/mL, respectiv LQ = 2653,9 μg/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 μg/mL

III.2.2.4. Intervalul (domeniul de lucru)

Având în vedere aceasta, faptul că distilatele prezintă valori ale concentrației în etanol foarte diverse, am considerat oportun să alegem ca interval de lucru: 3559,5 – 9887,5 μg/mL;

III.3. Precizia metodei

III.3.1. Repetabilitatea analizei. Precizia sistemului

Tabelul 9. 8. Repetabilitatea injecției (Precizia sistemului)

Având în vedere valoarea deviației standard relative obținute (RSD = 1,0621%), se poate afirma că la determinarea prin cromatografie de gaze a metanolului, sistemul este precis.

Repetabilitatea analizei (precizia metodei)

Tabelul 9.9. Precizia metodei de determinare a metanolului prin GC-MS

Deviația standard relativă are o valoare mai mică de 5%, respectiv, (RSD) este de 2,6601 % pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL;

III.3.2. Precizia intermediară

Tabelul 9.10. Precizia intermediară de determinare a metanolului prin GC-MS

Deviația standard relativă obținută are o valoare mai mică de 5%, (RSD) este de 2,3336 % pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL.

III.3.3. Reproductibilitatea

Normele elaborate de ICH (Internațional Conference of Harmonization) definesc reproductibilitatea ca o precizie interlaboratoare în studii de colaborare. Deoarece nu am avut posibilitatea de a aplica metoda și în alte laboratoare, reproductibilitatea nu a fost studiată.

III.3.4. Acuratețea (exactitatea)

Tabelul 9.11. Exactitatea metodei de determinare a metanolului prin GC-MS

Regăsirea medie în studiul exactității metodei de determinare a metanolului prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă are valoarea de 95,9% pe intervalul 92,4 – 97,9%. Având în vedere faptul că pentru metodele cromatografice se acceptă un interval de± 10%, rezultă că metodă este exactă.

III.4. Concluzii referitoare la determinarea metanolului prin GC-MS

Cromatograf de gaze tip Agilent Tehnologes 7890 A, detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm și o grosime a filmului de 0,25 µm), fază mobilă heliu cu un debit de 1 mL/min.

->gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 500C timp de 20 minute, apoi temperatura crește cu 100C/min până la 2500C unde este menținută constantă încă 5 minute;

->volumul de soluție injectată este de 0,1 μL și un raport de splitare de 1/50 în portul de intrare al injectorului ce are temperatura de 2500C; temperatura sursei MSD este de 2300C și cea a cvadrupolului MSD este de 1500C;

->identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală față de biblioteca de spectre Wiley.

->s-a studiat liniaritatea funcției de răspuns (s-a urmărit modificarea ariei picului în funcție de concentrația injectată). Funcția de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 – 19775 μg/mL).

Pe domeniul 4,9 – 2768,5 μg/mL ecuația curbei de calibrare este:

Arie pic = 6500,4 x Concentrația – 11679,5

Pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL ecuația curbei de calibrare este:

Arie pic = 4685,8 x Concentrația + 3601973,7.

->au fost calculate limitele de detecție (LD = 146,4 μg/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 μg/mL, respectiv LD = 875,8 μg/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 μg/mL) și limita de cuantificare (LQ = 443,5 μg/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 μg/mL, respectiv LQ = 2653,9

Mg/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 μg/mL).

-> A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 – 9887,5 μg/mL;

->Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

– Repetabilitatea injecției (precizia sistemului) – RSD – 1,0621 %;

– Repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD – 2,6601 %

– Precizia intermediară – RSD – 2,3336 %

– Exactitate – regăsire medie de 95,9% pe intervalul 92,4 – 97,9% pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL.

IV. APLICABILITATEA METODEI DE DETERMINARE A METANOLULUI PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

Obiective:

Determinarea concentrației de metanol din distilatele alcoolice naturale prin metoda GC-MS.Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice naturale.

IV.1. Protocol de lucru

S-a analizat un număr de 98 de probe de distilate alcoolice naturale, care constitue produse rezultate în urma distilării amestecurilor de macerate de fructe (mere, pere, prune, struguri), macerate simple de prune sau struguri (tescovină).

Aceste produse de distilare denumite țuică sau rachiu se regăsesc în toată țara. Rețetele după care se prepară nu au o specificitate aparte, acestea ținând de “rețeta personală” a celor care prepară aceste produse, având astfel un caracter artizanal.

Probele au fost analizate conform metodei de determinare a metanolului din distilatele alcoolice prin GC-MS utilizând același aparat și aceiași parametri de lucru.

IV.2. Rezultate și discuții

IV.2.1. Determinarea metanolului din distilatele alcoolice naturale

Probele au fost prelevate din zona Moldovei în perioada 2007 – 2009. Majoritatea probelor provin din județul Bacău respectiv 82 de probe celelalte 16 probe provin din alte șapte județe.

Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidență două probe ca fiind sub limita de determinare și una sub limita de cuantificare.

Cele 95 de probe prezintă concentrații ale metanolului (μg/mL distilat) cuprinse între 499,5 – 8316,0 μg/mL distilat.

Valoarea medie cea mai mare regăsește în distilatele din prune, respectiv 3320,46 μg/mL distilat. Media cea mai scăzută a concentrației metanolului în μg/mL distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină.

Regulamentul CEE 1014/90 și STP 57 – 92 prevede că valoarea concentrației de metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru. Pentru raportarea concentrației metanolului față de 100 mL etanol anhidru s-a determinat conținutul în etanol pentru fiecare probă de distilat în parte, cu o metodă, conform legislației în vigoare.

IV.2.2. Determinarea concentrației metanolului față de concentrația de etanol

Raportând concentrația de metanol μg/mL distilat la concentrția de etanol din probele analizate, s-au obținut valori între 0,12 – 2,3 g/100 mL etanol anhidru, dintre care:

19 probe au valori ale concentrției metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100mL alcool etilic anhidru), din care:

6 probe cu valori ale concentrației în metanol peste limită, distilate din tescovină, reprezentând 6,12% din totalul probelor analizate.

7 probe cu valori ale concentrației alcoolului metilic peste limita admisă, provenite din amestec de fructe, însemnând 7, 14% din totalul probelor de distilat analizate.

6 probe cu valori ale concentrației metanolului peste limitele admise reprezintă 6,12% din totalul probelor de distilate.

Din calculul concentrației medii a metanolului din probele de distilat analizate în funcție de materialul din care au fost prelucrate se observă:

În funcție de proveniența probelor cu valori ale concentrației metanolice peste limita admisă se constată că distilatele din Localitatea Străoani Jud. Bacău (figura 10.9.) prezintă cea mai mare medie a concentrației de metanol la 100 mL etanol anhidru, respectiv 1,92 g/100 mL etanol anhidru. Valoarea aceasta este urmată de valoarea concentrației medii a metanolului din distilatele provenite din Localitatea Blăgești Jud. Bacău cu 1,85 g/100 mL etanol anhidru.

IV.2.3 Determinarea prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă a altor volatili toxici prezenți în distilatele alcoolice

În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de distilate naturale s-au identificat o serie de compuși volatili denumiți congeneri (Jung A., 2010). Aceștia au fost identificați prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenție cu datele din bibliotecile spectrale. Concentrația acestora se calculează raportând aria picului ce corespunde fiecărui compus detectat și identificat, față de aria totală a picurilor detectate. Concentrația în mL/total congeneri a compușilor volatili detectați și identificați s-a calculat raportându-se procentul de arie al fiecăruia la concentrația în volume a etanolului, concentrație ce a fost obținută anterior.

În urma centralizării acestor date, s-a constatat că o parte din compușii identificați se regăsesc mult mai des în probele de distilate față de alții. Astfel s-a efectuat un calcul statistic privind frecvența detectării acestor compuși, calcul care este prezentat în tabelul 10.13. Acest tabel prezintă compușii care au fost detectați în mai mult de 50 de determinări, valoarea maximă, medie și minimă a ariei procentuale din totalul compușilor volatili, a volumului (mL/mL distilat) cât și a numărului de probe în care s-au detectat.

Tabelul 10.13. Compuși detectați care au mai mult de 50 determinări

Din totalul compușilor volatili detectați 96% reprezintă etanol, 3% alți compuși volatili și 1 % alcoolul metilic. Față de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul reprezintă 1,04%

IV.3. Concluzii

În vederea determinării concentrației de alcool metilic și a prezenței compușilor volatili în distilatele alcoolice naturale, s-au analizat un număr de 98 de probe de distilate alcoolice naturale care provin din zona Moldovei. Determinarea concentrației metanolului și a compușilor volatili din distilatele alcoolice naturale s-a efectuat prin GC – MS, conform metodei. Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS s-au pus în evidență două probe ca fiind sub limita de determinare și una sub limita de cuantificare.

Cele 95 de probe prezintă concentrații ale metanolului (μg/mL distilat) cuprinse între 499,5 μg/mL distilat și 8316,0 μg/mL distilat.

Regulamentul CEE 1014/90 și STP 57 – 92 prevede că valoarea concentrației de metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru. Pentru raportarea concentrației metanolului față de 100 mL etanol anhidru s-a determinat conținutul în etanol.

Raportând concentrația de metanol μg/mL distilat la concentrația de etanol din probele analizate, s-au obținut valori între 0,12 – 2,3 g/100 mL etanol anhidru, dintre care:

->19 probe au valori ale concentrației metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100 mL alcool etilic anhidru), din care în funcție de materialul din care s-au distilat ,sunt:

Tescovină – 6 probe,amestec de fructe – 7 probe,prune – 6 probe.

Din calculul concentrației medii a metanolului din probele de distilat analizate care au concentrația metanolică peste limita admisă în funcție de materialul din care au fost prelucrate ,se observă:

valoarea medie cea mai mare a concentrației metanolice se regăsește în probele de distilate provenite din macerarea și distilarea prunelor, respectiv 1,67 g/100 mL etanol anhidru;valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea amestecurilor de fructe de 1,38 g/100 mL etanol anhidru;valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentrații metanolice peste limita admisă este de 1,51 g/100 mL etanol anhidru.

În funcție de proveniența probelor cu valori ale concentrației metanolice peste limita admisă se constată că cele mai multe provin din Comănești, Jud. Bacău, respectiv 7 probe, reprezentând 36% din totalul probelor, cele mai puține probe provenind din Panciu ,Jud. Vrancea și Străoani, Jud. Bacău cu câte 2 probe și un procent de 11%. În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogrameleprobelor de distilate naturale s-au identificat o serie de compuși volatili denumiți congeneri.Din totalul compușilor volatili detectați 96% reprezintă etanol, 3% alți compuși volatili și 1 % alcool metilic. Față de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul reprezintă 1,04%.

V. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA UNEI METODE DE DETERMINARE CANTITATIVĂ A METANOLULUI DIN PROBE BIOLOGICE PRIN CROMATOGRAFIE DE GAZE CUPLATĂ CU SPECTROMETRIE DE MASĂ

Obiective:

Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentrației metanolice din probe biologice, respectiv sânge și țesuturi.

Intoxicațiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică, constituie cauza multor urgențe medicale, dar și a multor decese (Șorodoc L., 2009).Important în acest sens este ca diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus pacientul să fie pus cât mai prompt pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate. În acest sens s-a încercat elaborarea și validarea unei metode de determinare a metanolului din produsele biologice într-un timp scurt și eficient. Prin această metodă s-a avut în vedere analizarea din punct de vedere calitativ și cantitativ a metanolului din sânge, dar și din organe, în cazul examenului toxicologic pe cadavru.

V.1. Dezvoltarea metodei

Pentru a realiza separarea, identificarea și determinarea cantitativă a metanolului din probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, au fost efectuate inițial o serie de teste, obligatorii de altfel, pentru a stabili condițiile experimentale optime de analiză (Dorneanu V., 2003, Lazăr D., 2000).

Toate determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecție. Faza mobilă utilizată este constituită din heliu, cu un debit de 1 mL/minut.

În ceea ce privește alegerea coloanei staționare folosite s-a avut în vedere determinarea metanolului din distilate alcoolice astfel, că fază la staționară a fost utilizată o coloană polară Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm).

Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 2500C. Cantitatea de probă injectată este de 1 μL cu un raport de splitare de 1/50. Faza mobilă – heliu (debit 1 mL/min).Programul de temperatură pornește de la 500C (temperatură menținută constantă timp de 16 minute) și crește la 2500C cu o viteză de 250C.În ceea ce privește sistemul de detecție, parametrii de lucru sunt următorii:

temperatura sursei MS: 2300C;temperatura cuadrupolului: 1500C;mod de achiziție (SIM – Single Ion Monitoring) – mod de lucru: SIM, ionii înregistrați fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 și 32;detecție oprită între minutul 12 și 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei din probă).

În ceea ce privește modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic, acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard.

V.2. Validarea metodei

V.2.1. Liniaritatea

Pentru evaluarea liniarității s-a avut în vedere un necesar de minim 5 valori ale concentrației pentru cel puțin trei serii de soluții de substanțe standard, de diferite concentrații (de regulă concentrația de interes ± 20 până la 50% pentru valorile extreme de concentrație (Yowomo M., 2005, Roman L., 1998).

Reactivi necesari:

metanol de puritate cromatografică (Merck); apă bidistilată; soluțiile standard.

În ceea ce privește pregătirea standardelor de lucru s-a procedat astfel:

Pentru calculul concentrației în metanol se are în vedere densitatea metanolului (d) în mg/mL (0,791), volumul de metanol și volumul final al probei.

Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru s-a lucrat în modul următor: un volum (v) de 0,5 mL metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 mL sânge obținându-se un volum total (V) de 10 mL soluție stoc (ST 1) a cărei concentrație se calculează folosind formula următoare:

În g/mL == = mL=0,039550g/mL=39550 μg/mL

Din soluția astfel obținută au fost preparate prin diluare cu sânge soluții de diferite concentrații. Aceste soluții au fost supuse distilării conform modului descris.Pornind din aceeași soluție stoc, s-a preparat un număr de 3 seturi de soluții de lucru pentru studiul linearității pe intervalul de concentrație 4,94 – 19775,00 μg/mL.

Fiecare din aceste probe au fost analizate în condițiile menționate și, din cromatogramele obținute, s-a determinat aria picurilor corespunzătoare metanolului.

Se reprezintă grafic variația ariei medii în funcție de concentrație și se determină intervalul de concentrație pentru care această variație este liniară. Se trasează dreapta de regresie pentru acest interval și se determină coeficientul de corelație (r), deviația standard a pantei dreptei de regresie (s) și ecuația dreptei ce redă modificarea ariei picului în funcție de concentrație:

Arie pic = a x Concentrația + b

A = panta, b = intercept

În figura 11.5 se prezintă dreapta de calibrare obținută în studiul liniarității metodei de determinare a metanolului.

Tabelul 11.3. Calculul statistic al dreptei de regresie

Funcția de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 – 19775 μg/mL sânge sau 1,65 – 6591,67 μg/mL distilat).

V.2.2. Limită de detecție

Utilizând datele obținute la studiul liniarității se obține:

LD = 139,3 μg/mL

V.2.3. Limită de cuantificare (lq)

Estimarea LQ s-a realizat pe baza erorii standard a dreptei de regresie și a pantei dreptei de regresie.

LQ = 422,1 μg/mL

V.2.3. Intervalul (domeniul de lucru)

A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 – 6591,67 μg/mL distilat respectiv 417,9 – 19775,01 μg/mL sânge.

V.2.4. Precizia

Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

->repetabilitatea injecției (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări, valoarea deviației standard relative (RSD) fiind de 0,8748 %;

->repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluții independente la trei nivele de concentrație diferite pentru care valoarea deviației standard relative (RSD) este de 4,6811 % pe domeniul 263,67 – 527,33 μg/mL distilat;

->precizia intermediară pentru trei soluții independente la trei nivele de concentrație diferite pentru care valoarea deviației standard relative (RSD) este de de 4,1078 % pe domeniul 263,67 – 527,33 μg/mL distilat;

V.2.5. Acuratețea (exactitatea)

Pentru estimarea exactității s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe la trei nivele de concentrație diferite obținându-se o regăsire medie de 98,0% pe intervalul 93,2 – 102,8%.

V.3. Concluzii referitoare la determinarea cantitativă a metanolului din probe biologice prin GC-MS

» cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A; detector spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD; coloană cromatografică Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm și o grosime a filmului de 0,25 µm); injector automat tip Agilent Technologies 7683 B Series;

» faza mobilă: heliu, cu un debit de 1 mL/minut;volum injecție de 1 µl; raport de splitare 1/50;temperatura injectorului:2500C;gradient temperatură în compartimentul coloanei: 500C (temperatură menținută constantă timp de 16 minute) și crește la 2500C cu o viteză de 250 C;temperatura sursei MSD: 2300C; temperatura cvadrupolului MSD: 1500C;modul de achiziție a spectrelor: SIM (urmărirea liniilor din spectrul de masă cu raportul M/Z = 15, 29, 31 și 32); interpretarea rezultatelor obținute: Agilent Technologies ChemStation software.

S-a studiat liniaritatea funcției de răspuns. Funcția de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9 – 19775 µg/mL sânge sau 1,65–6591,67 µg/mL distilat). Ecuația dreptei de regresie obținută (în cazul exprimării concentrației pe mL distilat) s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate. Au fost calculate limitele de detecție (LD = 139,3 µg/mL) și limita de cuantificare (LQ = 422,1 µg/mL). A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3–6591,67 µg/mL distilat respectiv 417,9 – 19775,01 µg/mL sânge;

Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

->repetabilitatea injecției (precizia sistemului) – RSD – 0,8748 %;repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD – 4,6811 %;precizia intermediară – RSD – 4,1078 %.

Pentru estimarea exactității – regăsire medie 98,0 % pe intervalul 93,2 – 102,8 %.

V.4. Aplicabilitatea metodei gc-ms la determinarea cantitativă a metanolului din probe biologice provenite de la animale de experiență

Obiective

1. Determinarea variației concentrațiilor de metanol în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa “Olandez cenușiu” și observarea simptomatologiei intoxicației.

2. Determinarea variației concentrațiilor de metanol în sânge și organe în cazul injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa „Olandez cenușiu” și observarea simptomatologiei intoxicației.

Pentru studierea absorbției, acumulării toxicului, s-a optat pentru testarea toxicității metanolului pe organismul animal, în conformitate cu legislația în vigoare. Acest studiu s-a efectuat în cadrul Laboratorului de Biologie Animală din cadrul Universității “V. Alecsandri” Bacău, Facultatea de Biologie, pe un lot de iepuri. Rasă utilizată în vederea cercetării a fost „Iepurele cenușiu olandez”. Studiile pe animale sunt supuse legislației în vigoare respectiv OG. 37/2002 cu privire la protecția animalelor folosite în scopuri științifice sau în scopuri experimentale aprobată cu L 471/2002.

VI. MATERIAL ȘI METODĂ

Metoda a fost testată pe mai multe tipuri de probe biologice (sânge, țesut), efectuate pe același aparat și aceiași parametri utilizați la validarea metodei.

Pentru că probele de sânge și țesuturi să poată fi analizate prin GC-MS, au fost prelucrate prin distilare (metoda Cordebard).

VI.1. Determinarea variației concentrațiilor de metanol în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa „olandez cenușiu” și observarea simptomatologiei intoxicației

VI.2. Stabilirea dozelor și modul de administrare a metanolului la animalele de experiență

Lotul experimental a fost compus din cinci femele de iepuri aparținând rasei „Olandez cenușiu”. Acestea prezintă o masă corporală cuprinsă între 2000 și 2400 g. Din punct de vedere anatomo–fiziologic, sunt mature având vârsta de șase luni. Dozele de alcool metilic care s-au administrat în vederea inducerii intoxicației metanolice au fost stabilite față de literatura de specialitate (Roe O., 1982, Silverman J., 2002, Ciudin E., 2004).

Administrarea dozei s-a efectuat intraperitoneal. S-a optat pentru acest gen de administrare deoarece doza de administrat este mai mică, iar posibilitatea de administrare orală a toxicului era destul de scăzută ținând cont de comportamentul sensibil al iepurelui. Administrarea intravenoasă a metanolului ar fi indus necroza endovenoasă, ceea ce ar fi periclitat atât sănătatea animalului pe durata experimentului cât și deprecierea locurilor de elecție în vederea recoltării sângelui pentru analiză. Pentru fiecare exemplar s-a calculat doza de administrare în funcție de masă corporală.

Tabelul 12. 4. Doza de metanol DL50 calculată pentru lotul experimental de iepuri, conform masei corporale

VI.3. Recoltarea probelor în urma administrării metanolului în doză dl50 la iepurii din rasa „olandez cenușiu”

Probele de sânge s-au recoltat din venă femurală, la următoarele intervale: I – 75 minute,II – 195 minute,III – 375 minute.

VI.4.Rezultate și discuții

Din rezultatele obținute în urma analizei sângelui recoltat la intervale prestabilite, se constată că cea mai scăzută concentrație la prima serie de recoltări, respectiv la 75 de minute s-a înregistrat la iepurele numărul 1, cu o valoare de 0,69 mg/mL și cea mai crescută la iepurele cu numărul 3 cu 0,95 mg/mL. La a doua serie de recoltări, la 195 de minute, valoarea cea mai mică s-a înregistrat la iepurele cu nr. 5 (0,75 mg/mL), valoarea cea mai mare înregistrându-se la iepurele cu nr. 3 cu 1,02 mg/mL. Seria a treia de recoltări se evidențiazăcu 0,68 mg/mL reprezentând valoarea cea mai mică și 0,89 mg/mL.Conform acestor valori este evident că în minutul 75 metanolul nu era complet în circuitul metabolic, vârful concentrației regăsindu-se în minutul 195, ținând cont că în minutul 375 concentrațiile erau deja în descreștere. În prima parte a metabolismului crește concentrația cu 0,012 mg/mL pe minut, de la minutul 75 până la minutul 195 se înregistrează o creștere extreme de lentă de 0,0002 mg/mL pe minut ca panta descendentă să se exprime cu o descreștere de 0,0004 mg/mL. Se poate spune că dacă absorbția este foarte rapidă metabolismul este extrem de lent.

VI.5. Simptomatologia intoxicației metanolice în urma administrării de metanol în doză DL50 la iepurii din rasa “olandez cenușiu”

Pe parcursul derulării experimentului s-au urmărit o serie de parametri fiziologici și s-au făcut observații referitoare la simptomatologia intoxicației metanolice.

La primul interval de recoltare la 75 de minute sensibilitatea la metanol a fost minimă. Simptomatologia intoxicației metanolice s-a concretizat la toți subiecții practic la cel de-al doilea interval de recoltare, respectiv la 195 de minute de la injectare. La a treia recoltare la intervalul de 375 de minute toți subiecții prezentau aceiași simptomatologie, respectiv somnolență, dezechilibru motor, dificultăți de deplasare, manifestată cu precădere la membrele inferioare posterioare prin imposibilitatea de coordonare șievoluția valorilor pulsului este diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea mai crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului, având o evoluție descendentă în raport cu evoluția concentrației metanolice regăsită în probele de sânge recoltate pe intervalele prestabilite.Această evoluție atât a concentrației metanolice determinată din sânge cât și a simptomatologiei denotă faptul că toxicitatea metanolului are un caracter individualizat în funcție de fiecare subiect.

VI.6. Dozarea metanolului prin GC-MS din sânge și probe biologice la rasa de iepuri “olandez cenușiu” (dl100)

Observarea simptomatologiei intoxicației

VI.7. Dozarea metanolului prin GC-MS

A doua etapă a experimentului s-a desfășurat la un interval de 72 de ore de la încheierea primei etape pe aceiași subiecți.

S-a optat pentru un astfel de interval între cele două serii de experimente pentru ca organismul subiecților să elimine complet metanolul și produșii de metabolism ai acestuia și starea de sănătate să revină la normal pentru a nu denatura simptomatologia intoxicației metanolice.

În acest interval iepurii au fost hrăniți și hidratați corespunzător normelor de hrană și îngrijire, urmărindu-se îndeaproape comportamentul pentru a depista eventualele deficiențe sau afecțiuni. După 72 de ore iepurii prezentau o stare de sănătate bună și un comportament normal.

VI.8. Stabilirea și administrarea dozei de metanol DL 100 la iepurii din rasa “olandez cenușiu”

A doua doză administrată a constituit o doză letală DL100, doză calculată în funcție de masa corporală a fiecărui subiect.

Tabelul 12.9. Cantitatea de metanol DL100 administrat la iepuriidin rasa „Olandez cenușiu” în funcție de masă corporală

VI.9. Recoltarea probelor biologice

Recoltarea probelor de sânge în vederea determinării metanolului s-a efectuat în două serii, a câte 5 mL, prima serie la 75 de minute, a doua serie în momentul decesului subiectului testat.Seria 1 – la 75 minute de la expunere,seria 2 – în momentul decesului subiectului testat.

VI. 10. Rezultate și discuții

Rezultatele privind concentrația de metanol din sângele recoltat în cea de-a doua etapă a experimentului sunt exprimate în tabelul 12.11, intervalul de timp la care s-a făcut recoltarearespectiva, prima probă la 75 de minute și a a doua probă la momentul decesului, cât și valorile concentrației metanolice obținute prin analiza GC-MS.

Tabelul 12.11. Valorile concentrației metanolului determinat în sânge la iepuriîn cazul intoxicației acute cu DL100 (4,8 mL/kg corp)

Din datele etalate în tabelul 12.11. se observă că la 75 de minute de la administrarea dozei de metanol DL100, valorile concentrației metanolului în sânge sunt variabile, cea mai mică valoare fiind înregistrată la subiectul nr. 1, cu 1,08 mg/mL față de cea mai mare valoare înregistrată la subiectul 3 cu o valoare de 1,77 mg/mL.

În cazul valorilor concentrațiilor metanolice determinate din sânge în momentul decesului subiecților, se constată de asemeni o mare fluctuație de valori, care ține de factorii individuali și de intervalul de timp la care s-a produs decesul.

Față de perioada de supraviețuire de la administrarea metanolului până la deces, cel mai mult a supraviețuit subiectul nr. 2 cu 200 de minute, cel mai puțin supraviețuind subiectul nr. 3 cu 105 minute.

Variația cea mai mare dintre valoarea concentrației metanolice în viu și valoarea concentrației metanolice la deces a fost înregistrată la subiectul nr. 1 care la 75 de minute de la injectarea cu metanol avea o concentrație metanolică de 1,08 mg/mL și în momentul decesului de 1,55 mg/mL, diferența dintre cele două valori acumulându-se în 85 de minute. Calculându-se o rată de acumulare pentru cei cinci iepuri, din momentul injectării până la minutul 75, metanolul a avut o rată de acumulare cuprinsă între 0,014 – 0,023 mg/mL/minut.

VI.11. Simptomatologia intoxicației metanolice acute cu doză de metanol DL100 la iepurii din rasa “olandez cenușiu”

Concomitent cu recoltarea probelor de sânge s-au făcut observații privind simptomatologia intoxicației acute provocate de metanolul injectat intraperitoneal la iepurii de experiență pentru DL100 (4,8 mL/Kg corp).

După 75 de minute de la injectarea metanolului DL100 se observă apariția somnolenței, dezechilibrului motor, a stării de relaxare, a urechilor lăsate, ochiI exoftalmici, puls filiform, la toți subiecții testați.

Dacă la doza de metanol DL50 simptomatologia intoxicației la 75 de minute de la administrarea metanolului era prezentă cu simptome ușoare la 60 % dintre subiecți, la o administrare a unei doze de DL100, simptomatologia intoxicației este prezentă la 100% din subiecți.

În funcție de rezistența fiecărui organism și mai ales în funcție de particularitățile metabolice ale fiecărui subiect, aceștia au supraviețuit mai mult sau mai puțin. Insuficiența cardio respiratorie, a determinat decesul subiecților după 105-200 minute de la administrarea DL100.

VI.12. Determinarea concentrațiilor de metanol prin GC-MS din organe și țesuturi la iepuri din rasa „olandez cenușiu”

VI.13. Protocol de lucru

După exitus toți subiecții testați prin administrare intraperitoneală a unei doze DL100 cu metanol, au fost autopsiați.

Conform protocolului de prelevare de probe biologice s-au prelevat de la fiecare subiect fragmente de organe în vederea examenului toxicologic.

Astfel s-au recoltat fragmente de creier, ochi, fragmente de cord, plămân, ficat și rinichi. Probele s-au condiționat separat pentru fiecare tip de țesut, în flacoane sterile, prevăzute cu capac etanș și etichetate.

Fiecare etichetă a fost inscripționată cu: numărul iepurelui, conținut, data și ora prelevării.

Pentru examenul toxicologic al țesuturilor în vederea determinării concentrației de metanol s-au prelevat câte 5 g țesut din fiecare organ. Pentru acuratețea rezultatelor, probele au fost cântărite cu o balanță analitică ANH.

V.14. Rezultate și discuții

Tabelul 12.13. Valorile medii ale metanolului (în mg/g probă) în diferite țesuturi în cazul intoxicației cu DL100 la iepure (4,8 mL metanol/kg corp)

Față de rezultatele obținute cea mai mare concentrație s-a obținut în proba de ficat recoltată de la subiectul nr. 3 cu o valoare de 3,81 mg/mL. Cea mai scăzută valoare s-a regăsit în fragmentul de cord recoltat de la subiectul nr. 1, respectiv 1,16 mg/mL. Media valorilor concentrațiilor metanolice pe tipurile de organe prelucrate a fost de 1,70 mg/mL, din care media concentrațiilor metanolice obținute din creier reprezintă 1,62 mg/mL, cord 1,63 mg/mL, plămân 1,76 mg/mL, rinichi 1,66 mg/mL și cea mai mare valoare în ficat cu 2,16 mg/mL.

În figură 12.13. este prezentată fluctuația concentrației de metanol în organele analizate. Astfel, sunt prezentate valorile medii ale concentrației metanolice obținute din analiza GC-MS a probelor prelevate de la cei cinci iepuri, probe din creier, ochi, cord, plămân, ficat și rinichi. Acestea sunt prezentate comparativ cu valoarea mediei generale. Din sinteza datelor rezultă că valoarea medie cea mai mare s-a determinat în ficat, respectiv 2,16 mg/mL, iar valoarea cea mai scăzută s-a înregistrat în ochi, de 1,40 mg/mL. Concentrația din pămâni, de 1,76 mg/mL este mai mare datorită afinității crescute a metanolului pentru celula alveolară pulmonară cât și funcției respiratorii care stimulează circulația la nivel pulmonar. Concentrația metanolică scăzută de la nivelul ochilor se explică prin faptul că globii oculari prezintă o mare cantitate de lichid provenit din lichid lacrimal și umoare apoasă. Valoarea medie generală a concentrației metanolice s-a calculat la 1,70 mg/mL, valoare reprezentativă față de valorile obținute pe organele analizate.

Figura 12.19. exprimă reprezentarea grafică a mediilor concentrațiilor de metanol determinate la cei cinci subiecți prin GC-MS din sânge, creier, ochi, cord, plămân, ficat și rinichi, după administrarea de metanol în doză DL100 (4,8 mL/Kg) față de timpul de supraviețuire. Din reprezentarea grafică reiese că subiectul nr. 3 a acumulat cea mai marecantitate de metanol respectiv 2,2 mg/mL, acesta de altfel a avut perioada cea mai scurtă de supraviețuire (105 min). Următoarea valoare a concentrației metanolice este cea a subiectului nr. 2 cu 1,63 mg/mL, acest a decedat ultimul la 200 de minute. Subiectul nr. 5 cu o concentrație metanolică de 1,60 mg/mL decedează la 180 de minute de la injectare la fel ca subiectul nr. 4 cu 1,53 mg/mL. Subiectul cu valoarea concentrației metanolice cea mai scăzută este iepurele nr. 1 cu 1,42 mg/mL, care a supraviețuit 155 de minute.

Conform timpului de supraviețuire față de valoarea mediei concentrației pentru fiecare din cei cinci iepuri analizați, se constată că valoarea medie a concentrației metanolice nu este relevantă în procesul de supraviețuire, metabolismul individual având un rol hotărâtor, fapt expus în figura 12.19.

Datele obținute privind concentrația metanolică ce se regăsește în sângele și organele iepurilor testați la metanol în doză DL100 (4,8 mL/Kg), corelate cu masa corporală față de intervalul de supraviețuire evidențiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol se face conform masei corporale, aceasta nu prezintă importanță majoră în procesul de supraviețuire.

VII. DETERMINAREA CONCENTRAȚIEI DE METANOL ÎN CAZUL INTOXICAȚIILOR LETALE

Prezentare de caz

Marea majoritate a intoxicațiilor metanolice se produc pe fondul consumului de băuturi alcoolice în exces și care prezintă o concentrație metanolică peste limita admisă.

Acest gen de intoxicații conduc de cele mai multe ori la un final nefast, deoarece intoxicația cu alcool etilic maschează simptomatologia intoxicației metanolice întârziind astfel aplicarea medicației antidot specifice. Tarele de sănătate, cât și starea de confuzie, obnubilare sau chiar comă a pacienților sunt factori importanți în diagnosticarea precoce a intoxicațiilor metanolice.

De o importanță majoră în aplicarea diagnosticului sunt examenele complementare și în mod special examenele biochimice și nu în ultimul rând examenul toxicologic al sângelui. În cele ce urmează se prezintă două cazuri de intoxicații metanolice care s-au prezentat la Spitalul Județean Bacău ce au decedat la câteva ore de la internare.

VII.1 Prezentarea cazului nr. 1

O pacientă de 32 de ani este internată în secția Urgențe a Spitalului Județean Bacău în data de 21.02.2010 cu diagnosticul “Comă gradul III, șoc toxic în observație”.

La examenul clinic general, pacienta prezenta tegumente reci marmorate, secreții albicioase abundente la nivelul căilor respiratorii, TA nu se poate măsura, AV-68/minut, pupile midriatice bilateral, ROT absente, raluri bronșice bilateral. Examenele complementare respectiv, examenul biochimic al sângelui relevă: amilază -117 U/L, GGT–113 U/L, TGO–331 U/L și TGP–147 U/L. Din datele de anchetă rezultă că femeia era o consumatoare cronică de băuturi alcoolice.Starea gravă a pacientei cât și a lipsei de informații privind toxicul care a fost ingerat pe fondul consumului de băuturi alcoolice, a condus la o Tabelul 12.14. Valorile concentrației metanolice din sânge și organe determinate prin GC/MSdiagnosticare dificilă. Evoluția a fost gravă cu deprimare respiratorie, pacienta moare prin stop cardio-respirator după 9 ore de la internare.În urma examenului toxicologic s-a constatat că în momentul decesului pacienta prezenta o alcoolemie de 1,90g%. Analiza concentrației metanolice din sânge și organe s-a efectuat prin GC-MS, conform metodei, valorile fiind prezentate în tabelul 12.14.

Datele obținute pun în evidență valorile crescute ale concentrațiilor metanolice atât în sânge cât și în organele cercetate. Astfel, în sânge concentrația metanolului este de 1,720 g‰, în ficat de 0,795 g ‰, în bilă de 2,661 g ‰, în stomac 2,287 g ‰, în intestin de 1,639 g ‰ iar în rinichi de 1,590 g ‰.

Datorită coeficientului bun de lipo–hidrosolubilitatate, metanolul se distribuie în majoritatea organelor, cu precădere în organele cu concentrații mari de apă. În cazul de față, în bilă concentrația metanolică este de trei ori mai mare față de concentrația metanolică din ficat, unde s-a înregistrat cea mai scăzută valoare.Variația mare a valorilor concentrațiilor metanolice este explicată în primul rând de examenul anatomo-patologic. În cazul de față steatoza hepatică cu degenerescență grasă, explică pe de o parte distribuția neuniformă a toxicului, cât și accentuarea scăderii ratei metabolice a metanolului, cu potențarea efectului de acumulare. Valorile mari ale concentrației metanolice din stomac și intestin pun în evidență faptul că expunerea la metanol s-a făcut prin ingestie.

Astfel, consumul excesiv de băuturi alcoolice coroborat cu tarele de sănătate (leziuni bacilare vechi, steatoză hepatică, alcoolism cronic) și nu în ultimul rând concentrația mult peste limită a metanolului din băuturile alcoolice consumat a dus în cazul de față la deces. Valoarea concentrației metanolice determinată în sânge și organe fiind fatală chiar și în cazul unui organism sănătos.

VII.2. Prezentarea cazului nr. 2

În luna februarie 2011, un bărbat de 65 de ani este internat în secția Urgențe a S.J.U. Bacău, la ora 14:50 cu diagnosticul de Comă profundă, șoc toxic. În momentul internării prezenta tegumente reci, marmorate, hipotermie 34°C, pupile midriatice bilateral, areactive la lumină, ROT absente, RCA abolite, TA – 80/50, AV – 60/minut, GCS-6, examenul Computer

Tomograf nu s-a putut efectua. Examenele complementare, respectiv analizele biochimice pun în evidență următoarele valori: Creatinină – 1,35, TGP- 45, GOT- 65, GGT- 171, CO2 – 8, K- 6,39, Na – 156,4, Gluc. – 143, pH – 6,8. Cu toate eforturile de susținere a vieții, la ora 06:50 decedează în urma stopului cardio-respirator. Din analiza toxicologică reiese că acesta a consumat băuturi alcoolice cu o concentrație metanolică mult peste limită (1 g/100 mL etanol anhidru), constatându-se o concentrație etanolică de 0,90 g ‰ la 16 ore de la internare.Tabelul 12.15. Valorile concentrației metanolice din sânge și organe determinate prin GC-MS

În urma analizei GC-MS a probelor biologice, s-au obținut următoarele rezultate, prezentate în tabelul 12.15.

Datele prezentate în tabelul 12.15, pun în evidență valorile mari ale concentrației metanolice obținute în Șstomac, intestin, rinichi, valori de 1,23 g‰, 1,34 g‰, 1,48 g‰.

Valori apropiate s-au obținut în pulmon cu 0,94 g‰ și pancreas cu 0,92 g‰. În bilă s-a determinat 1,05 g‰. Valori mai mici s-au determinat în sânge și anume 0,52 g‰, în creier 0,67 g‰ și în ficat 0,77 g‰, date exprimate și în figura 12.23

Din analiza toxicologică prin GC-MS a sângelui și a organelor în cazul de față se constată o fluctuație a valorilor cu pondere mare pe rinichi, intestin și stomac și mai scăzută pe creier, cord și ficat. Valoarea concentrației metanolice din sânge a fost cea mai scăzută valoare determinată la caz, ceea ce denotă că metabolismul metanolului era în dinamică.

VII.3. Concluzii față de cazuistică

Cele două cazuri prezentate constituie practic două exemple de intoxicație metanolică letală. În ambele cazuri pacienții au fost internați în stare comatoasă, astfel încât epicriza foilor de observație nu a putut fi completată cu date care ar fi putut avea o reală importanță în stabilirea diagnosticului. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii pacienți au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident simptomatologia intoxicației etanolice.

Față de datele din literatură, valorile concentrației metanolice obținute în urma analizei probelor biologice prin GC-MS, se încadrează în intervalele valorice obținute și în alte cazuri de intoxicații letale cu metanol, respectiv intervalul 0,52– 2,66 g‰ metanol (Ashley L., 1992, Vaida H., 1997, Watson WA., 2003). Comparația valorile privind ponderea concentrației de metanol obținute la cazul nr.1 față de ponderea concentrației metanolice la cazul nr. 2, pe aceleași organe conform valorilor expuse în tabelele nr. 12.14. și 12.15. se prezintă în figură nr. 12.25.

Având în vedere valorile expuse în figură 12.25, față de dinamica intoxicației metanolice, putem afirma că distribuția și absorbția toxicului în organe la cele două cazuri cercetate, este diferită. În baza acestor cercetări, se poate preciza că în momentul decesului la cazul nr. 2, față de cazul nr. 1, metanolul era în faza de eliminare. Acest fapt este relevat în primul rând de valoarea mare a concentrației metanolice din rinichi (1,48 g ‰) față de valoarea obținută în sânge (0,52 g‰), cât și de valoarea mare din plămâni (1,05 g‰).

Analizând datele obținute la cazul nr. 1, se observă o distribuție diferită față de cazul nr. 2. Deoarece concentrația metanolică din sânge este mai mare față de concentrația metanolică din rinichi (tabelul 12.14.), se poate preciza că momentul decesului s-a produs în plin proces metabolic, în faza de acumulare. Momentul decesului la scurt timp de la internare (9 ore), a fost precipitat de mai mulți factori și anume în primul rând de tarele de sănătate a pacientei (leziunile bacilare specifice infecției cu bacil Koch, ficat steatozic) și nu în ultimul rând concentrația etanolică de 1,90 g‰.

În urma analizei celor două cazuri, s-a constatat că decesul a survenit ca urmare a consumului excesiv de băuturi alcoolice contrafăcute, care în mod evident prezentau concentrații ale metanolului peste limita admisă.

VIII. INCIDENȚA INTOXICAȚIILOR LETALE CU ALCOOL METILIC ÎN UNELE JUDEȚE DIN ROMÂNIA ÎN PERIOADA 2005 – 2010

VIII.1. Studiul statistic al intoxicațiilor letale pentru toate județele

Studiul statistic privind intoxicațiile letale cu metanol s-a efectuat în urma consultării datelor preluate de la Serviciile de Medicină Legală a cincisprezece județe din România.

Datele cuprind:Numărul de cazuri de morți violente în urma intoxicației metanolice, vârsta, sexul, proveniența persoanei decedate cât și prezența alcoolului etilic sau a altor toxici determinați în sânge.În tabelul 13.1. sunt prezentate datele privind numărul de cazuri de intoxicații metanolice pentru fiecare județ pe fiecare an, din 2005 până în 2010.

Situația numărului total de cazuri înregistrate pe acest interval din cele cinsprezece județe este prezentată în figura 13.1., unde se observă că județul cu cele mai multe cazuri de intoxicații letale este județul Bacău cu 25 de cazuri. Este urmat de județul Brașov cu 12 cazuri și județul Vrancea cu 10 cazuri.

Sintetizând datele obținute din cele zece județe în care în perioada 2005 – 2010 au existat cazuri de intoxicații metanolice letale, s-au obținut o serie de rezultate privind totalul cazurilor de intoxicații letale în funcție de sex și în funcție de proveniență.

În funcție de sex, s-au înregistrat un număr de 53 de cazuri de bărbați și 13 cazuri de femei. Față de proveniența celor decedați în urma intoxicației metanolice cele mai multe cazuri au fost înregistrate în mediul rural, respectiv 48 de cazuri față de 18 cazuri din mediul urban. Aceste aspecte au fost sintetizate în figurile 13.2. și 13.3.

Din ambele figuri se observă că județul Bacău prezintă cele mai multe cazuri de decese atât la bărbați cât și la femei, totodată, comparative cu datele sintetizate de la celelalte județe, prezintă și cele mai multe cazuri din mediul rural și mediul urban. Din acest punct de vedere, este urmat de județul Brașov cu 11 cazuri bărbați și un caz de sex feminin, iar în funcție de origine 8 cazuri din mediul rural cu patru cazuri din mediul urban.

În funcție de grupele de vârstă ale intoxicaților cu metanol s-a efectuat o statistică pe șase grupe de vârstă, se observă că grupa de vârstă 41- 50 ani prezintă cele mai multe cazuri de decedați în urma intoxicației metanolice, respectiv 19 cazuri. Aceste aspecte au fost sintetizate și prezentate în figura 13.4.

Datele din figura 13.5oferă o imagine de ansamblu a numărului de cazuri de morți violente prin intoxicație cu alcool metilic. Este evidentă diferența de la un an la altul, cea mai evidentă fluctuație fiind între anul 2005 cu 5 cazuri și 2006 cu 22 de cazuri. De asemeni în anul 2007 se înregistrează 13 cazuri ca în 2008 numărul de cazuri să se reducă la 5, urmând o evoluție în creștere, astfel în 2009 se ajunge la 9 cazuri, iar în 2010 la 12 cazuri.

VIII.2. Concluzii

Analizând datele preluate de la Serviciile de Medicină Legală din 15 județe privind cazurile de morți violente care s-au produs în urma intoxicațiilor metanolice, s-a constatat:

Județele Galați, Botoșani, Vaslui, Mehedinți și Bistrița Năsăud, pe intervalul studiat nu a prezentat nici un caz de intoxicație metanolică letală;

Din cele 10 județe în care s-au înregistrat cazuri de intoxicații letale, s-a înregistrat un total de 66 de cazuri, Județul Bacău prezentând cele mai multe cazuri, respectiv 21 de cazuri, cele mai puține cazuri înregistrându-se în județul Suceava și anume, un caz;

În funcție de sex, cele mai multe cazuri s-au înregistrat la bărbați, respectiv 53 de cazuri și 13 femei;

În funcție de origine, din mediul rural au provenit 48 de cazuri față de 18 din mediul urban;

Față de grupele de vârstă în care s-au încadrat subiecții, grupa 41–50 care prezintă 19 cazuri, urmată la un scurt interval de grupa 51–60 cu 16 cazuri, numărul cel mai scăzut s-a înregistrat în grupa 61–70 cu 3 cazuri;

Numărul total de cazuri pentru fiecare an analizat, pune în evidență anul 2006 cu 22 de cazuri, evoluția fiind fluctuantă.

IX. CONCLUZII GENERALE

Metanolul este prezent în numeroase produse de larg consum, dar majoritatea cazurilor de intoxicații metanolice se produc în urma consumului de băuturi alcoolice care prezintă o concentrație metanolică peste limita admisă de 1g/100 mL etanol anhidru. Metanolul din aceste produse de distilare rezultă din degradarea părții lemnoase a semințelor fructelor cât și din degradarea substanțelor pectice din dermul fructelor și al semințelor acestora. De asemeni, prezența metanolului în produsul finit de distilare este strâns legată de tehnica de prelucrare a fructelor și a mixurilor de fructe.

În contextul actual generat de importanța elucidării mecanismului de acțiune a metanolului asupra organismului uman, cât și de importanța testelor toxicologice în cazul intoxicațiilor metanolice, prezenta teză de doctorat și-a propus următoarele obiective:

Validarea unei metode GC-MS de determinare și cuantificare a metanolului din distilatele alcoolice.

Determinarea concentrației de metanol din distilatele alcoolice natural prin metoda propusă. Determinarea altor congeneri volatili cu caracter toxic din distilatele alcoolice natural.

Validarea unei metode GC-MS de determinare a concentrației metanolice din probe biologice, respective sânge și țesuturi.

Aplicarea metodei de determinare a metanolului din probe biologice într-un studiu pe animale de laborator.

Aplicarea metodei de determinare a concentrației de metanol din probe biologice GC-MS, pe subiecți umani (prezentări de caz).

Evaluarea statistică a numărului de cazuri de intoxicații letale din județe din România.

În lucrarea de față, prin analiza gaz cromatografică a probelor alcoolice am urmărit separarea a cât mai multor componente din matricea complexă în vederea identificării acestora precum și determinarea cantitativă a metanolului prezent în acestea. În acest sens am pus la punct o metodă de analiză a metanolului prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometrie de masă. Determinările gaz cromatografice au fost efectuate pe un cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecție. În urma consultării literaturii de specialitate cât și în urma testelor în vitro am stabilit următoarele condiții de lucru:

separarea cromatografică se realizează pe o coloană Zebron – Phenomenex, tip ZB-WAXplus (lungime de 60 m, diametru intern de 0,25 mm și o grosime a filmului de 0,25 µm);

faza mobilă este constituită din heliu cu un debit de 1 mL/min,gradient de temperatură în compartimentul coloanei: 500C timp de 20 minute, apoi temperatura crește cu 100C/min până la 2500C unde este menținută constantă încă 5 minute;volumul de soluție injectată este de 0,1 μL și un raport de splitare de 1/50 în portul de intrare al injectorului ce are temperatura de 2500C;

detecția se realizează prin spectrometrie de masă cu temperatura sursei MSD de 2300C și cea a cvadrupolului MSD de 1500C;

identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală față de biblioteca de spectre Wiley.

Pentru ca metoda să fie validată am studiat liniaritatea funcției de răspuns. Funcția de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9–19775 g/mL). Ecuația dreptei de regresie obținute s-a calculat prin metoda celor mai mici pătrate:

Arie = 4877,4 x Concentrația (μg/mL) + 1569486,174;Pe domeniul 4,9 – 2768,5 μg/mL ecuația curbei de calibrare este: Arie pic = 6500,4 x Concentrația – 11679,5;Pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL ecuația curbei de calibrare este: Arie pic = 4685,8 x Concentrația + 3601973,7.

Au fost calculate limitele de detecție (LD = 146,4 μg/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5

G/mL, respectiv LD = 875,8μg/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 μg/mL) și limita de cuantificare (LQ = 443,5 μg/mL pe intervalul 4,9 – 2768,5 μg/mL, respectiv LQ=2653,9

G/mL pe intervalul 2768,5 – 19775 μg/mL) folosind estimarea acestor limite pe baza deviației standard și a pantei dreptei de regresie.A fost stabilit intervalul de lucru: 3559,5 – 9887,5 μg/mL; Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

repetabilitatea injecției (precizia sistemului) pentru un număr de 5 determinări, valoarea deviației standard relative (RSD) fiind de 1,0621 %;

repetabilitatea analizei (precizia metodei) pentru trei soluții independente la trei nivele de concentrație diferite pentru care valoarea deviației standard relative (RSD) este de 2,6601 % pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL;

precizia intermediară pentru trei soluții independente la trei nivele de concentrație diferite pentru care valoarea deviației standard relative (RSD) este de 2,3336 % pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL.

Pentru estimarea exactității s-a determinat regăsirea pentru un număr de trei probe la trei nivele de concentrație diferite obținându-se o regăsire medie de 95,9% pe intervalul 92,4 – 97,9% pe domeniul 2768,5 – 19775 μg/mL.

Metoda astfel validată am aplicat-o în vederea determinării concentrației de alcool metilic și a prezenței compușilor volatili în distilatele alcoolice natural. Astfel am analizat un număr de 98 de probe de distilate alcoolice natural, provenite din zona Moldovei.Din cele 98 de probe de distilat analizate prin GC-MS conform metodei, două probe au avut valori ale concentrației metanolului sub limita de detecție și una sub limita de cuantificare.

Cele 95 de probe prezintă concentrații ale metanolului (μg/mL distilat) cuprinse între 499,5μg/mL – 8316,0 μg/mL. Valoarea medie cea mai mare se regăsește în distilatele din prune, respectiv 3320,46 μg/mL distilat. Media cea mai scăzută a concentrației metanolului în μg/mL distilat se observă în probele de distilat alcoolic prelucrate din tescovină.

Regulamentul CEE 1014/90 și STP 57–92 prevede că valoarea concentrației de metanol în băuturile alcoolice naturale se raportează la 100 mL alcool etilic anhidru. Pentru raportarea concentrației metanolului față de 100 mL etanol anhidru am determinat conținutul în etanol conform unei metode de determinare a concentrației etanolice din distilatele alcoolice conformă cu legislația.

Raportând concentrația de metanol μg/mL distilat la concentrția de etanol din probele analizate, am constatat:

19 probe au avut valori ale concentrației metanolice peste limita admisă (peste 1,00 g/100 mL alcool etilic anhidru), din care:

valoarea maximă determinată este de 2,30 g/mL etanol anhidru ,6 probe cu valori ale concentrației metanolice peste limită au ca materie primă tescovină,7 probe cu valori ale concentrației alcoolului metilic peste limita admisă, provenite din amestec de fructe,6 probe cu valori ale concentrației metanolului peste limitele admise provenite din prune.

Din calculul statistic privind concentrația medie a metanolului din probele de distilat analizate care au concentrația metanolică peste limita admisă în funcție de materialul din care au fost prelucrate se observă:

valoarea medie cea mai mare a concentrației metanolice se regăsește în probele de distilate provenite din macerarea și distilarea prunelor, respectiv 1,67 g/100 mL etanol anhidru;

valoarea medie cea mai scăzută o întâlnim la probele provenite din distilarea amestecurilor de fructe de 1.38 g/100 mL etanol anhidru.

valoarea medie generală pe cele 19 probe de distilat cu concentrații metanolice peste limita admisă este de 1,51 g/100 mL etanol anhidru.

În concluzie, din cele 98 de probe de distilate alcoolice naturale 19 probe prezentau valori ale concentrației alcoolului metilic peste limita admisă, reprezentând 19,38%.

În urma analizei GC-MS, conform metodei prezentate, în cromatogramele probelor de distilate naturale am identificat o serie de compuși volatili denumiți congeneri. Aceștia au fost identificați prin metoda SCAN comparându-se timpii de retenție cu datele din bibliotecile spectrale. Am calculat concentrația acestora raportând aria picului ce corespunde fiecărui compus detectat și identificat, față de aria totală a picurilor detectate, respectiv ariile picurilor compușilor volatili ce au putut fi detectați prin această metodă.

Concentrația în mL/total congeneri a compușilor volatili detectați și identificați am calculat-o raportând procentul de arie al fiecărui pic la concentrația în volume a etanolului, concentrație ce a fost obținută anterior.

Față de totalul compușilor volatili detectați prin GC-MS, 96% reprezintă etanol, 3% alți compuși volatili și 1 % alcool metilic. Față de ponderea etanolului din distilatele analizate, metanolul reprezintă 1,04%.Intoxicațiile metanolice de diferite etiologii, dar cu precădere cu etiologie alcoolică, constituie cauza multor urgențe medicale, dar și a multor decese. Important este că diagnosticul cu privire la natura toxicului la care a fost expus pacientul să fie pus cât mai rapid pentru administrarea unei scheme de tratament adecvate. În acest sens am încercat elaborarea și validarea unei metode de determinare a metanolului din produsele biologice într-un timp scurt și eficient. Prin această metodă am analizat metanolul din probe de sânge, cât și din organe, în cazul examenului toxicologic pe cadavru.

Pentru a realiza separarea, identificarea și determinarea cantitativă a metanolului din probe biologice prin cromatografie de gaze, cuplată cu spectrometrie de masă, am efectuat inițial o serie de teste în vitro, obligatorii de altfel, pentru a stabili condițiile experimentale optime de analiză, având în vedere metoda GC-MS de determinare a metanolului din distilate alcoolice.

În ceea ce privește modul de preparare a probelor pentru izolarea alcoolului metilic, acestea au fost prelucrate prin distilare conform metodei Cordebard. S-au pregătit o serie de standarde de lucru pentru validarea metodei. Pentru calculul concentrației în metanol se are în vedere densitatea metanolului (d) în mg/mL (0,791), volumul de metanol și volumul final al probei. Astfel, pentru prepararea standardelor de lucru am lucrat în modul următor: un volum (v) de 0,5 mL metanol a fost amestecat cu un volum de 9,5 mL sânge obținându-se un volum total (V) de 10 mL soluție stoc (ST 1) a cărei concentrație se calculează folosind formula următoare:

= =0,03955g/mL=3955 μg/mL

Din soluția astfel obținută am preparat prin diluare cu sânge soluții de diferite concentrații. Aceste soluții au fost supuse distilării conform modului descris anterior. Distilatele astfel prelucrate le-am analizat pe un cromatograf de gaze tip Agilent Technologies 7890 A cuplat cu un spectrometru de masă tip Agilent Technologies 5975C inert MSD ca sistem de detecție. Faza staționară – coloană polară Zebron – Phenomenex, de tip YB-WAXplus (60 m x 0,25 mm; 0,25 µm).Portul de intrare al injectorului se află la o temperatură de 2500C. Cantitatea de probă injectată este de 1 μL cu un raport de splitare de 1/50. Faza mobilă este constituită din heliu (debit 1 mL/min).Programul de temperatură pornește de la 500C – temperatură menținută constantă timp de 16 minute și crește la 2500C cu o viteză de 250C/min.

În ceea ce privește sistemul de detecție, parametrii de lucru sunt următorii:

temperatura sursei MS: 2300C;temperatura quadrupolului: 1500C;mod de achiziție (SIM – Single Ion Monitoring);mod de lucru: SIM, ionii înregistrați fiind cei cu raportul M/Z = 15, 29, 31 și 32;detecție oprită între minutul 12 și 15 (interval de timp necesar pentru eliminarea apei din probă).

Identificarea metanolului se realizează prin compararea spectrală față de biblioteca de spectre Wiley.

S-a studiat liniaritatea funcției de răspuns. Funcția de răspuns este liniară pe domeniul studiat (4,9–19775 g/mL sânge sau 1,65–6591,67 μg/mL distilat). Au fost calculate limitele de detecție (LD = 139,3 μg/mL) și limita de cuantificare (LQ = 422,1 μg/mL) folosind estimarea acestor limite pe baza deviației standard și a pantei dreptei de regresie. A fost stabilit intervalul de lucru: 139,3 – 6591,67 μg/mL distilat respectiv 417,9 – 19775,01 μg/mL sânge;Pentru estimarea preciziei s-au determinat:

repetabilitatea – RSD 0,8748 %;repetabilitatea analizei (precizia metodei) – RSD 4,6811 % pe domeniul 263,67 – 527,33 μg/mL distilat;precizia intermediară – RSD 4,1078 % pe domeniul 263,67 – 527,33 μg/mL distilat;Pentru estimarea exactității s-a determinat – regăsirea medie de 98,0% pe intervalul 93,2 – 102,8%.

Aplicabilitatea metodei de determinare a metanolului din probe biologice s-a testat într-un studiu experimental ce se bazează pe testarea toxicității alcoolului metilic pe animale de laborator. În cazul de față s-a folosit un lot format din cinci iepuri din rasa “Iepurele olandez cenușiu”, experimentele desfășurându-se în cadrul Laboratorului de Biologie Animală a Universității “V Alecsandri” Bacău.

Studiul pe animale de experiență a avut următoarele obiective:

1. Determinarea variației concentrațiilor de metanol în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL50 la iepuri din rasa “Olandez cenușiu” și observarea simptomatologiei intoxicației.

2. Determinarea variației concentrațiilor de metanol în sânge și organe în cazul injectării de metanol cu doza de DL100 la iepuri din rasa „Olandez cenușiu” și observarea simptomatologiei intoxicației.

S-a urmărit evoluția intoxicației metanolice din punct de vedere simptomatic cât și din punct de vedere toxicologic prin analiza probelor de sânge recoltate la intervale determinate respectiv la 75, 195 și 375 de minute.

Determinarea metanolului prin GC-MS s-a efectuat prin analiza distilatelor obținute din probele de sânge și organe, conform metodei prezentate, pe același aparat și aceiași parametri pe care i-am utilizat la validarea metodei. Din punct de vedere toxicologic în prima fază a experimentului, am obținut valori ale concentrației de metanol în sânge pe următoarele intervale de recoltare:75 minute: 0,68 mg/mL – 1,02 mg/mL,195 minute: 0,75 mg/mL – 1,02 mg/mL,375 minute: 0,68 mg/mL – 0,89 mg/mL.Față de evoluția simptomatologiei, la 75 de minute de la administrarea toxicului 60 % dintre subiecți prezentau modificări minore a simptomatologiei, ca la minutul 375, 100 % din subiecți prezentau o simptomatologie ce relevă deteriorării majore a stării de sănătate. Evoluția valorilor pulsului a fost diferită de la individ la individ, în medie valoarea cea mai crescută raportându-se la minutul 75 de la administrarea metanolului.

În cea de-a doua etapă a experimentului am testat variația concentrațiilor de metanol în sânge în cazul injectării de metanol cu doza de DL100 (4,8 mL/Kg corp) la iepuri din rasa “Olandez cenușiu”. Am efectuat două recoltări, prima la un interval de 75 de minute, cea de-a doua recoltare efectuându-se în momentul decesului subiecților.La primul interval de recoltare am obținut valori ale concentrației metanolice cuprinse între 1,08 mg/mL și 1,77 mg/mL. A doua recoltare a fost efectuată la intervale diferite în funcție de momentul decesului fiecărui subiect. Am obținut valori ale concentrației metanolice cuprinse între 1,23 mg/mL, și 1,82 mg/mL.

Față de valorile obținute din analiza organelor recoltate în urmă decesului subiecților testați cu metanol DL100, am constatat că cea mai mare concentrație metanolică medie s-a determinat în urma analizării ficatului cu o valoare de 2,16 mg/mL, iar cea mai scăzută valoare s-a determinat în ochi cu o valoare medie de 1,40 mg/mL. Din punct de vedere al fiecărui subiect în parte, am obținut valori fluctuante și diferite pe organe la fiecare subiect analizat. Valoarea medie cea mai mare s-a obținut la subiectul nr. 3 de 2,20 mg/mL și cea mai mică valoare la subiectul nr. 1 cu o valoare medie de 1,42 mg/mL. Datele obținute privind concentrația metanolică ce se regăsește în sângele și organele iepurilor testați la metanol în doză DL100 (4,8 mL/Kg), corelate cu masa corporală față de intervalul de supraviețuire, evidențiază faptul că în cazul în care expunerea la metanol se face conform masei corporale, aceasta nu prezintă importanță majoră în procesul de supraviețuire.Marea majoritate a intoxicațiilor metanolice se produc pe fondul consumului de băuturi alcoolice în exces și care prezintă o concentrație metanolică peste limita admisă.

În perioada 2010 – 2011 la SJU Bacău s-au prezentat două astfel de cazuri, care constituie practic două exemple de intoxicație metanolică letală. În ambele cazuri pacienții au fost internați în stare comatoasă și șoc toxic. Ancheta cazurilor stabilea cu certitudine că ambii pacienți au consumat băuturi alcoolice în exces, prezentând în mod evident și simptomatologia intoxicației etanolice.

Comparând valorile privind ponderea concentrației de metanol obținute la cazul nr. 1 față de ponderea concentrației metanolice la cazul nr. 2, pe aceleași organe se constată că în cazul numărul 1 decesul a survenit în plin proces metabolic și acumulare a metanolului. În cazul numărului 2 decesul a survenit în faza de eliminare a metanolului. În ambele cazuri se poate spune că a fost vorba de o dublă intoxicație atât metanolică cât și etanolică. Simptomatologia acută a intoxicației etanolice cât și lipsa datelor de anchetă au mascat intoxicația metanolică, conducând spre exitus.

Analizând datele preluate de la Serviciile de Medicină Legală din 15 județe privind cazurile de morți violente care s-au produs în urma intoxicațiilor metanolice, s-a constatat:

Județele Galați, Botoșani, Vaslui, Mehedinți și Bistrița Năsăud, pe intervalul studiat nu a prezentat nici un caz de intoxicație metanolică letală;

Din cele 10 județe în care s-au înregistrat cazuri de intoxicații letale, s-a înregistrat un total de 66 de cazuri, Județul Bacău prezentând cele mai multe cazuri, respectiv 21 de cazuri.În funcție de sex, cele mai multe cazuri s-au înregistrat la bărbați, respectiv 53 de cazuri și 13 la femei;În funcție de proveniență, din mediul rural au provenit 48 de cazuri față de 18 din mediul urban;

Față de grupele de vârstă în care s-au încadrat subiecții, cele mai multe cazuri înregistrându-se pe grupa 41–50 care prezintă 19 cazuri.Numărul total de cazuri pentru fiecare an analizat, pune în evidență anul 2006 cu 22 de cazuri, evoluția fiind fluctuantă. În urma acestui studiu, consider că metanolul este un toxic activ plasat în numeroase produse de largă circulație, la care are acces un segment important din populație.

Deși se cunosc în mare parte efectele toxice ale acestuia, prezența sa în băuturile alcoolice prezintă cel mai mare risc.

Datorită faptului că în majoritatea cazurilor decesul subiecților a survenit ca urmare a consumului de băuturi alcoolice contrafăcute care în mod evident prezentau concentrații ale metanolului peste limita admisă se impun măsuri de control asupra băuturilor alcoolice preparate artizanal. Se impune de asemeni avertizarea a populației privind potențialul toxic al alcoolului metilic, acordându-i-se importanța cuvenită în categoria toxicelor.

IX.1. Contribuții originale

1. Am elaborat și validat o metodă modernă de determinare a metanolului prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometria de masă, din distilate alcoolice.

2. Am evaluat concentrația metanolului din distilatele alcoolice naturale produse artizanal în funcție de materialul din care au fost distilate și în funcție de localitățile din care provin.

3. Am elaborat și validat o metodă în vederea determinării a metanolului din probe biologice, respectiv sânge și țesuturi, prin cromatografie de gaze cuplată cu spectrometria de masă.

4. Am evaluat dinamica intoxicației metanolice pe baza concentrațiilor metanolului determinate în sânge la intervale prestabilite într-un studiu pe un organism animal, respectiv pe iepuri.

5. Am evaluat distribuția metanolului în organe în cazul intoxicației letale, într-un studiu pe animale de laborator (iepuri), cât și pe subiecți umani, decedați în urma consumului de băuturi alcoolice care aveau concentrații metanolice peste limita admisă.

6. Am efectuat o situație statistică a intoxicațiilor metanolice letale din județele din România.

IX.2. Perspective de cercetare

Tema studiului de caz oferă premizele către noi direcții de cercetare:

->Analiza concentrației de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcție de specia de fruct din care s-a prelucrat distilatul, respective specia de strugure din care provine tescovina, sau specia de prune din care s-a prelucrat distilatul.

Analiza concentrației de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcție de vechimea distilatului.

Analiza concentrației metanolului din distilatele alcoolice natural în funcție de perioada de fermentare și păstrare a materialului fructifer în vederea distilării.

Analiza concentrației de metanol din distilatele alcoolice naturale în funcție de gradul de infestare a materialului fructifer cu diferite specii de fungi.Analiza concentrației de metanol din sânge în urma consumului de sucuri naturale.

Analiza concentrației de metanol din sânge în urma consumului de băuturi răcoritoare acidulate îndulcite cu aspartam.

Analiza concentrației metanolului metabolic în funcție de diferite afecțiuni ale organismului.Analiza concentrației metanolului din apele reziduale din stațiile de epurare a apelor.Analiza concentrației de metanol din diferite produse de curățare.

BIBLIOGRAFIE

1.2008 World Methanol Analysis. www.cmaiglobal.com;

2. https://www.cmaiglobal.com/Marketing/News/WMA2008.pdf. Accesat la 9 ianuarie 2010;

3. Hayes AW, et al. FATS, Principles and Methods of Toxicology, Third edition Raven Press, N.Y. 1994; (4): 129-142; 364-377;

4. Ioniță P I. Curs de chimia compușilor organici cu funcțiuni simple. Universitatea din București, 2008;

5. Sun Y, Ong K Y. Detection Technologies for Chemical Warfare Agents and Toxic Industrial Chemical. CRC Press, United Kindom, 2004;

6. Luminița Agoroaiei, Elena Butnaru. Toxici gazoși și volatili, Editura „Gr. T. Popa”, U.M.F., Iași 2005; 103 –109;

7. Klaassen C, ed Cassaret and Doull’s Toxicology: The basic science of poisons, 6th ed. New York, McGraw-Hill, 2001;

8. Dorneanu Maria, Ștefănescu Eugenia, Rogut Odette. Chimie organică. Sinteze și reacții de recunoaștere, Ed. Gr.T.Popa UMF Iași, 2002;

9. * * * EPA (U.S. Environmental Protection Agency). Acute Exposure Guideline Levels (AEGLs). Methanol Results (Proposed). AEGL Program, Office of Pollution, Prevention and Toxics, U.S. Environmental Protection Agency, 2004;

10. Some distilled fruit spirits contain, normally, high quantities of .62. Hui YN, Wai – Kit Nip, Nollet LML. Food Biochemistry and Food Procesing. Blackwell Publissing, United States, 2006;

11. Levy P, Hexdall A, Gordon P, Boeriu C, Heller M, Nelson L. Methanol Contamination of Romanian Home –Distilled Alcohol. Journal of Toxicoloy, Clinical Toxicology, 2003; 41(1): 23-28;

12. Stănciulescu G, Rusnac D, Bortos G. Tehnologia distilatelor alcoolice din fructe și vin. Editura Ceres, București, 1975;

13. Standard Profesional: STP 57-92/1992 elaborat de Întreprinderea Viei și Vinului cu acordul Ministerului Agriculturii și Alimentației, 1992;

14. Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European și al Comisiei din 2008 privind definirea, desemnarea, etichetarea și protecția indicațiilor geografice ale băuturilor spirtoase, 2008;

15. Beliș V. Tratat de Medicină Legală, Ed. Medicală, București, 1995; 2 (7): 138-155;

16. Dermengiu D, Gorun G. Toxicologie Medico-Legală, Ed. Viața Medicală Românească, București, 2006;

17. Leikin & Paloucek’s. Poisoning & Toxicology Handbook 3rd Edition. Lexi Comp INC Hudson, Ohio, 2002; 600-602; 810-812;

18. Richard C.Dart, MD, Ph. D (ed) Medical Toxicology Third Edition Lippincott Williams & Wilking, 2004; 1216;

19. Graw M, Haffner HT, Althaus L, et al. Invasion and distribution of methanol. Arch Toxicol 2000; 74(6): 313-321;

20. Wexier P, Anderson B D, Ann de Peyster, Gad SC, Hakinnen P J, Kamrin M A, Betty J Locey, Mehendale H M, Pope C N, Shugart LR. Enciclopedia of Toxicology, Second Edition, Hardcover, 2005; 3: 56;

21. Stegink LD, Filer LJ, Bell EF, et al. Effect of Repeated Ingestion of Aspartame-Sweetened Beverage on Plasma Amino Acid, Blood Methanol, and Blood Formate Concentrations în Normal Adults. Metabolism, 1989; 38: 357-363;

22. Charles JC, Heilman RL. Metabolic acidosis, Hospital Physician march, 2005; 37-42;

23. Casaletto JJ. Differential diagnosis of metabolic acidosis, Emerg. Med. Clin. N. Am, 2005; 23: 771-787;

24. Leakso O, Haapala M, Jaakkolo P, et al., FT-IR Breath Test în the Diagnosis and Control of Methanol Intoxications, J Anal Toxicol, 2001; 25(1): 26-30;

25. Watson WA, Litovitz TL, Rodgers GC, Klein-Schwartz W, Youniss J, Roșe SR, Borys D, May ME. 2002 Annual Report of the American Association of Poison Control Centers Toxic Exposure SurveillanceSystem. American Journal of Emergency Medicine 2003; 21(5): 353-421;

26. Bologa Cristina. Aspecte practice în abordarea acidozei metabolice de cauză toxică, Revista Medicală Română, 2010; Vol. LVII, Nr. 2: 83-87;

27. Vieriu Socaciu R. Teorie și practică medico-legală în contextul legislației actuale, Ed. Medicală Universitară Iuliu Hațeganu Cluj Napoca, 2002;

28. Vaida H, Rusu A I, Zaharia Daniela, Moșoigo P, Florian Ș. Intoxicație colectivă cu alcool metilic în penitenciarul Gherla în perioada iunie – august 1997. Rom. J. Med. Leg. 1997; 5(3): 229-233;

29. 276. Roe O. Species Differences în Methanol Poisoing, CRC Critical Reviews în Toxicology, 1982; 10(40): 275-286;

30. Vincent J, Marcovilivk, MD, Focep Peter T. Pous, MD, Focep. Emergency Medicine. Secret Questions and Answers. Reveal the Secrets to Safe and Effective Emergency Medicine 3rd Edition Philadelphia UȘA, 2003; 363-607;

31. G4350-90020 7820 Gas Chromatograph Advanced Ușer Guide, Agilent Technologies, UȘA, 2009;

32. Regulamentul CEE Nr. 2870/2000 Al Comisiei Europene din 19.12.2000 de stabilire a metodelor comunitare de referință pentru analiza băuturilor alcoolice;

33. Dorneanu V, Maria Stan. Metode Chimice și intstrumentale de analiză, Ed. Gr. T. Popa UMF Iași, 2003; 23-33; 438-445;

34. Lazăr Doina, Lazăr M.I., Gaby Nutturez, Metode cromatografice și spectrale aplicate în controlul medicamentului, Ed. „Terra Nostra” Iași 2000;

35. Jung Adriana, Jung H, Auwarter V, Pollak S, Farr A M, Hecser L, Șchiopu A. Volatile congeners în alcoholic beverages: analysis and forensic significance. Romanian Journal of Legal Medicine, 2010; Vol. XVIII (4): 265 – 271;

36. Ashley L. et ed., Determining volatile organic compounds în human blood from a large sample population by using purge and trop gas chromatography/mass spectrometry, Anal. Chem., 1992; 64: 1201-1209;

37. Streete J, et al. Gas Chromatographic separation of volatile substances by head-space capillary gas chromatography to aid the diagnosis of acute poisoning Analyst, 1992; 117: 1111-1127;

38. Șorodoc L, Lionte C, Rusalim Petriș O, Victorița Șorodoc. Toxicologie clinică de urgență. Intoxicații acute nemedicamentoase, Ed. Junimea, Iași, 2009; 1: 19 – 35;

39. Silverman J. Animal breeding and research protocols- the missing link Lab. Anim.N.Y. 2002; 19: 31;

40. Stemek N.H. Role of the instituțional animal care and use committee în te morning research, Ethics Behav., 1997; 173;

41. Ciudin Elena. Biologia animalelor de laborator, Editura ALFA, Iași, 2004; 109 – 158;

42. OG. 37/2002 Protecția animalelor folosite în scopuri științifice sau în scopuri experimentale aprobată cu L 471/2002;

43. Scott P.W.R. – Gas chromatography detectors, Library For Science, LLC, 2003

44.Agilent 5973N MSD Hardware Manual, Agilent Technologies, UȘA, 1999;

45. Yuwono, M.; Indryanto, G. – Validation of Chromatographic method of analysis, Profiles of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, Edited by Harry G. Brittain, Academic Press, Elsevier, 2005; 32: 243 – 262;

46. Mei-Ling Wang, Jih-Terng Wang, Youk-Meng Choong. Simultaneous quantification of methanol and ethanol alcoholic beverage using a rapid gas cromatographie method coupling with dual internal standard. Food Chemistry, Aug. 2004; 86: 609-615;

47. U.S. Pharmacopeia Forum – Cromatographic Columns – Edition 2009-2010;

48. Robert L, Grob PhD, Eugen F, Barry PhD. Modern Practice of Gas Cromatography 4 th Edition ISBN 978-0-471-22983-4 June 2004;

49. Roman L, Bojiță M, Săndulescu R. Validarea metodelor de analiză și control, Ed. Medicală, 1998;

50. Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European și al Comisiei din 2008 privind definirea, desemnarea, etichetarea și protecția indicațiilor geografice ale băuturilor spirtoase;

51.AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION – Diagnostic and statistical manual of mental disorders;

52.CHELCEA S. – Valsul ONU sau despre psihologia spatiului personal;

53.Dryden, W. (1996) – "Developments in Psychotherapy. Historical Perspectives", London, Sage Publications ;

54.DAN ENACHESCU, MIHAI GR. MARCU – Sanatate publica si managementul medical;

55.DUMITRASCU T. – Stresul si copilul ;

56.GILLES FERREOL – Adolescentii si toxicomania.;

57.Freeman, E.(1993) – "Substance Abuse Tratment. A Family System Perspective",London, Sage Publications;

58.IUSTIN LUPU, IOAN ZANC – Sociologie medicala.;

59.LAURENCE D.A, BENNETT P.H – Clinical Pharmacology;

60.MOLTO J., C. RADEL – Drogues ;

61.RASCANU R. – Psihologie medicala si asistenta sociala;

62.WEED A. C., BURCHER J.N., Mc kenna – New measures for assessign alcoohol and drug abuse with mmpi;

63.WWW.MEDFAM.RO;

64.WWW.MS.RO;

65.WWW.MEDLINE.COM;

66.www.intermediart.ro/psyhoo/biblioteca/rubstiint.html;

67.www.vlg.sisnet.ro/arhiva ;

68.www.bmj.ro/numar ;

69.www.biologie.lucaciu.go.ro ;

70.www.euroconsulting.ro/program_detalii.php?program_id=116 ;

71.www.ispt.ro/igienacop.

BIBLIOGRAFIE

1.2008 World Methanol Analysis. www.cmaiglobal.com;

2. https://www.cmaiglobal.com/Marketing/News/WMA2008.pdf. Accesat la 9 ianuarie 2010;

3. Hayes AW, et al. FATS, Principles and Methods of Toxicology, Third edition Raven Press, N.Y. 1994; (4): 129-142; 364-377;

4. Ioniță P I. Curs de chimia compușilor organici cu funcțiuni simple. Universitatea din București, 2008;

5. Sun Y, Ong K Y. Detection Technologies for Chemical Warfare Agents and Toxic Industrial Chemical. CRC Press, United Kindom, 2004;

6. Luminița Agoroaiei, Elena Butnaru. Toxici gazoși și volatili, Editura „Gr. T. Popa”, U.M.F., Iași 2005; 103 –109;

7. Klaassen C, ed Cassaret and Doull’s Toxicology: The basic science of poisons, 6th ed. New York, McGraw-Hill, 2001;

8. Dorneanu Maria, Ștefănescu Eugenia, Rogut Odette. Chimie organică. Sinteze și reacții de recunoaștere, Ed. Gr.T.Popa UMF Iași, 2002;

9. * * * EPA (U.S. Environmental Protection Agency). Acute Exposure Guideline Levels (AEGLs). Methanol Results (Proposed). AEGL Program, Office of Pollution, Prevention and Toxics, U.S. Environmental Protection Agency, 2004;

10. Some distilled fruit spirits contain, normally, high quantities of .62. Hui YN, Wai – Kit Nip, Nollet LML. Food Biochemistry and Food Procesing. Blackwell Publissing, United States, 2006;

11. Levy P, Hexdall A, Gordon P, Boeriu C, Heller M, Nelson L. Methanol Contamination of Romanian Home –Distilled Alcohol. Journal of Toxicoloy, Clinical Toxicology, 2003; 41(1): 23-28;

12. Stănciulescu G, Rusnac D, Bortos G. Tehnologia distilatelor alcoolice din fructe și vin. Editura Ceres, București, 1975;

13. Standard Profesional: STP 57-92/1992 elaborat de Întreprinderea Viei și Vinului cu acordul Ministerului Agriculturii și Alimentației, 1992;

14. Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European și al Comisiei din 2008 privind definirea, desemnarea, etichetarea și protecția indicațiilor geografice ale băuturilor spirtoase, 2008;

15. Beliș V. Tratat de Medicină Legală, Ed. Medicală, București, 1995; 2 (7): 138-155;

16. Dermengiu D, Gorun G. Toxicologie Medico-Legală, Ed. Viața Medicală Românească, București, 2006;

17. Leikin & Paloucek’s. Poisoning & Toxicology Handbook 3rd Edition. Lexi Comp INC Hudson, Ohio, 2002; 600-602; 810-812;

18. Richard C.Dart, MD, Ph. D (ed) Medical Toxicology Third Edition Lippincott Williams & Wilking, 2004; 1216;

19. Graw M, Haffner HT, Althaus L, et al. Invasion and distribution of methanol. Arch Toxicol 2000; 74(6): 313-321;

20. Wexier P, Anderson B D, Ann de Peyster, Gad SC, Hakinnen P J, Kamrin M A, Betty J Locey, Mehendale H M, Pope C N, Shugart LR. Enciclopedia of Toxicology, Second Edition, Hardcover, 2005; 3: 56;

21. Stegink LD, Filer LJ, Bell EF, et al. Effect of Repeated Ingestion of Aspartame-Sweetened Beverage on Plasma Amino Acid, Blood Methanol, and Blood Formate Concentrations în Normal Adults. Metabolism, 1989; 38: 357-363;

22. Charles JC, Heilman RL. Metabolic acidosis, Hospital Physician march, 2005; 37-42;

23. Casaletto JJ. Differential diagnosis of metabolic acidosis, Emerg. Med. Clin. N. Am, 2005; 23: 771-787;

24. Leakso O, Haapala M, Jaakkolo P, et al., FT-IR Breath Test în the Diagnosis and Control of Methanol Intoxications, J Anal Toxicol, 2001; 25(1): 26-30;

25. Watson WA, Litovitz TL, Rodgers GC, Klein-Schwartz W, Youniss J, Roșe SR, Borys D, May ME. 2002 Annual Report of the American Association of Poison Control Centers Toxic Exposure SurveillanceSystem. American Journal of Emergency Medicine 2003; 21(5): 353-421;

26. Bologa Cristina. Aspecte practice în abordarea acidozei metabolice de cauză toxică, Revista Medicală Română, 2010; Vol. LVII, Nr. 2: 83-87;

27. Vieriu Socaciu R. Teorie și practică medico-legală în contextul legislației actuale, Ed. Medicală Universitară Iuliu Hațeganu Cluj Napoca, 2002;

28. Vaida H, Rusu A I, Zaharia Daniela, Moșoigo P, Florian Ș. Intoxicație colectivă cu alcool metilic în penitenciarul Gherla în perioada iunie – august 1997. Rom. J. Med. Leg. 1997; 5(3): 229-233;

29. 276. Roe O. Species Differences în Methanol Poisoing, CRC Critical Reviews în Toxicology, 1982; 10(40): 275-286;

30. Vincent J, Marcovilivk, MD, Focep Peter T. Pous, MD, Focep. Emergency Medicine. Secret Questions and Answers. Reveal the Secrets to Safe and Effective Emergency Medicine 3rd Edition Philadelphia UȘA, 2003; 363-607;

31. G4350-90020 7820 Gas Chromatograph Advanced Ușer Guide, Agilent Technologies, UȘA, 2009;

32. Regulamentul CEE Nr. 2870/2000 Al Comisiei Europene din 19.12.2000 de stabilire a metodelor comunitare de referință pentru analiza băuturilor alcoolice;

33. Dorneanu V, Maria Stan. Metode Chimice și intstrumentale de analiză, Ed. Gr. T. Popa UMF Iași, 2003; 23-33; 438-445;

34. Lazăr Doina, Lazăr M.I., Gaby Nutturez, Metode cromatografice și spectrale aplicate în controlul medicamentului, Ed. „Terra Nostra” Iași 2000;

35. Jung Adriana, Jung H, Auwarter V, Pollak S, Farr A M, Hecser L, Șchiopu A. Volatile congeners în alcoholic beverages: analysis and forensic significance. Romanian Journal of Legal Medicine, 2010; Vol. XVIII (4): 265 – 271;

36. Ashley L. et ed., Determining volatile organic compounds în human blood from a large sample population by using purge and trop gas chromatography/mass spectrometry, Anal. Chem., 1992; 64: 1201-1209;

37. Streete J, et al. Gas Chromatographic separation of volatile substances by head-space capillary gas chromatography to aid the diagnosis of acute poisoning Analyst, 1992; 117: 1111-1127;

38. Șorodoc L, Lionte C, Rusalim Petriș O, Victorița Șorodoc. Toxicologie clinică de urgență. Intoxicații acute nemedicamentoase, Ed. Junimea, Iași, 2009; 1: 19 – 35;

39. Silverman J. Animal breeding and research protocols- the missing link Lab. Anim.N.Y. 2002; 19: 31;

40. Stemek N.H. Role of the instituțional animal care and use committee în te morning research, Ethics Behav., 1997; 173;

41. Ciudin Elena. Biologia animalelor de laborator, Editura ALFA, Iași, 2004; 109 – 158;

42. OG. 37/2002 Protecția animalelor folosite în scopuri științifice sau în scopuri experimentale aprobată cu L 471/2002;

43. Scott P.W.R. – Gas chromatography detectors, Library For Science, LLC, 2003

44.Agilent 5973N MSD Hardware Manual, Agilent Technologies, UȘA, 1999;

45. Yuwono, M.; Indryanto, G. – Validation of Chromatographic method of analysis, Profiles of Drug Substances, Excipients, and Related Methodology, Edited by Harry G. Brittain, Academic Press, Elsevier, 2005; 32: 243 – 262;

46. Mei-Ling Wang, Jih-Terng Wang, Youk-Meng Choong. Simultaneous quantification of methanol and ethanol alcoholic beverage using a rapid gas cromatographie method coupling with dual internal standard. Food Chemistry, Aug. 2004; 86: 609-615;

47. U.S. Pharmacopeia Forum – Cromatographic Columns – Edition 2009-2010;

48. Robert L, Grob PhD, Eugen F, Barry PhD. Modern Practice of Gas Cromatography 4 th Edition ISBN 978-0-471-22983-4 June 2004;

49. Roman L, Bojiță M, Săndulescu R. Validarea metodelor de analiză și control, Ed. Medicală, 1998;

50. Regulamentul Nr. 110/2008 al Parlamentului European și al Comisiei din 2008 privind definirea, desemnarea, etichetarea și protecția indicațiilor geografice ale băuturilor spirtoase;

51.AMERICAN PSYCHIATRIC ASSOCIATION – Diagnostic and statistical manual of mental disorders;

52.CHELCEA S. – Valsul ONU sau despre psihologia spatiului personal;

53.Dryden, W. (1996) – "Developments in Psychotherapy. Historical Perspectives", London, Sage Publications ;

54.DAN ENACHESCU, MIHAI GR. MARCU – Sanatate publica si managementul medical;

55.DUMITRASCU T. – Stresul si copilul ;

56.GILLES FERREOL – Adolescentii si toxicomania.;

57.Freeman, E.(1993) – "Substance Abuse Tratment. A Family System Perspective",London, Sage Publications;

58.IUSTIN LUPU, IOAN ZANC – Sociologie medicala.;

59.LAURENCE D.A, BENNETT P.H – Clinical Pharmacology;

60.MOLTO J., C. RADEL – Drogues ;

61.RASCANU R. – Psihologie medicala si asistenta sociala;

62.WEED A. C., BURCHER J.N., Mc kenna – New measures for assessign alcoohol and drug abuse with mmpi;

63.WWW.MEDFAM.RO;

64.WWW.MS.RO;

65.WWW.MEDLINE.COM;

66.www.intermediart.ro/psyhoo/biblioteca/rubstiint.html;

67.www.vlg.sisnet.ro/arhiva ;

68.www.bmj.ro/numar ;

69.www.biologie.lucaciu.go.ro ;

70.www.euroconsulting.ro/program_detalii.php?program_id=116 ;

71.www.ispt.ro/igienacop.