Draft Teza Doctorat 2 [608035]

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ
VETERINARĂ DIN BUCUREȘT I
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Bioch imist Alina Ioana NICU

TEZĂ DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC
Prof. Univ. Dr. Adrian VAMANU

București
2017

UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI MEDICINĂ
VETERINARĂ DIN BUCUREȘT I
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Bioch imist Alina Ioana NICU

TEZĂ DE DOCTORAT

STUDII BIOTEHNOLOGICE PRIVIND
OBȚINEREA UNOR COMPUȘI NATURALI
BIOLOGIC ACTIVI DIN PLANTE CU
ACȚIUNE ANTIMICROBIANĂ ÎMPOTRIVA
UNOR TULPINI BACTERIENE PATOGENE

CONDUC ĂTOR ȘTIINȚIFIC
Prof. Univ. Dr. Adrian VAMANU

București
2017

UNIVERSITY OF AGRONOMIC SCIENCES AND VETERINARY
MEDICINE OF BUCHAREST
FACULT Y OF BIOTECHNOLOGIES

Biochemist Alina Ioana NICU

PHD THESIS

BIOTECHNOLOGICA L STUDIES FOR
OBTAINING NATURAL BIOLOGICALLY
ACTIVE PLANT COMPOUNDS WITH
ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST
SOME PATHOGENIC BACTERIAL STRAINS

SCIENTIFIC ADVISOR
Prof. Univ. Dr. Adrian VAMANU

Bucharest
2017

UNIVERSITE DE SCIENCES AGRONOMIQUES ET
MEDECINE VETERINAIRE BUCAREST
FACULT É DES BIOTECHNOLOGIES

Bioch imiste Alina Ioana NICU

THÈSE DE DOCTORAT

DES ÉTUDES BIOTECHNOLOGIQUES POUR
À L'OBTENTION DE CONSTITUANTS
NATURELS BIOLOGIQUEMENT ACTIFS
DE PLANTES AVEC ACTION
ANTIMICROBIENNE CONTRE CERTAINES
DES SOUCHES BACTÉRIENNES
PATHOGÈNE

CONSEILLER SCIENTIFIQUE
Prof. Univ. Dr. Adrian VAMANU

Bucarest
2017

CUPRINS

Rezumat al tezei de doctorat ………………………………………………………… ……. 1
Capitolul I Introducere ……………… ………… ….…………………………………… ….13
1.1 Scopul și obiectivele temei de cercetare …………………………………………… …………………………. 13
Capitolul II Necesitatea efectuării studiului ……………………………………………………….. 17
2.1 Noțiuni despre fiziologia și biochimia bacteriilor ………………………………. ………………………… 17
2.2 Patogenitatea și rezist ența la antibiotice a bacteriilor ………………………………… ………………….. 19
2.3 Compuși naturali biologic activi din plante și mecanismul de acțiune antibacterian ………….. 24
2.4 Descrierea plantelor utilizate în acest studiu ……… …………………………………………… …………… 30
Capitolul III Materiale și metode ……………………………………………. ……………………………. 34
3.1 Obținerea extractelor polifenolice și caracterizarea lor ………………………………………………….. 34
3.1.1 Materialul vegetal ……………………………………………………………………………………….. 34
3.1.2 Obținerea extractelor vegetale utilizând diferiți solvenți …………………………………… 35
3.1.3 Dozarea polifenolilor și identificarea lo r………………………………………………………… 36
3.2 Acțiunea antibacteriană a extractelor vegetale ……………………………………. ……………………….. 38
3.2.1 Întreținerea culturilor bacteriene și prepararea inoculului …………………………………. 38
3.2.2 Evaluarea activității antimicrobiene prin metoda difuzimetrică …………………… …….38
3.2.3 Determinarea concentrației minime inhibito rii prin metoda microdiluțiilor ………… 39
3.2.4 Formularea a două preparate cu acțiune terapeutică/cosmetică ……….. …………………39
3.2.5 Determinarea activității sinergice dintre extracte vegetale și antibiotice ……………..40
Capitolul IV Rezultate …………………………………………………………………………………………… .42
4.1 Caracterizarea extractelor vegetale …………………………………………… ………………………………… 42
4.2 Activitatea antibacteriană a extractelor din plante ……………………………………………………….. ..54
4.2.1 Caracteriz area activității antibacteriene. ………………………………. …………………………54
4.2.2 Determinarea concentrației minime inhibitorii………………………… ………………………61

4.2.3 Formule active – acțiune antibacteriană și biologică ……………… …………………………63
4.2.4 Activitate combinații dintre polifenoli vegetali și anti biotice …………………………….66
4.2.4.1 Teste cu antibiotice disponibile comercial ………………. …………………………67
4.2.4.2 Teste cu un antibiotic nou sintetiza t………………………. …………………………86
Capitolul V Valorificarea rezultatelor și elemente de noutate ………………………..106
5.1 Publicații………………………………………………………………………….. ……………… ……………………1 08
Capitolul V I Concluzii ……………………………………………………………….. ………………. ………..111
Bibliografie …………………………………………………………………………………………………………….. .117

TABLE OF CONTENTS

Abstract of the PhD thesis ………………………………………………………… ………. 1
Chapter I Introduction ……………… …………… .…………………………………… ….13
1.2 The purpose and objectives of this research ……………………………………… …………………………. 13
Chapter II The utility of the study ……………………………………………………….. ……………… 17
2.1 Short description of bacterial physiology and biochemistry ………………………………………….. .17
2.2 Bacterial pathology and resistance to antibiotics ………………………………… ……………………….. 19
2.3 Natural compounds from plants that are biological active and the mechanism of their
antibacterial activity ………………………………………………………………………………………………….. 24
2.4 The plants used for this study ……………………………………………………. …………………. …………… 30
Chapter III Materials and methods ……………………………………………………………………… 34
3.1 Obtaining of polyphenolic extracts and their characterization ………………………….. ……………. 34
3.1.1 Plant Material ……………………………………………………………………………………….. …….34
3.1.2 Ob taining the vegetal extract s using di fferent solvents ………………………………….. …35
3.1.3 Polyphenols assay and identification ……………………………………………………….. …….36
3.2 Antibacteria l activity of the vegetal extract s …………………… ………………………………………… ..38
3.2.1 Mainte nance of bacteria l cultures and inoculum preparation …………………………….. 38
3.2.2 Evaluation of antibacterial activity using the diffusimetric method ……… ……………. 38
3.2.3 Determin ing the minimum inhibitor y concentration using the microdilu tion
method…… …………………………………………………………………………………………………………….. …….. 39
3.2.4 Formula tion of two p roducts with therapeut ic/cosmetic action ……….. …………………39
3.2.5 Testing for sy nergic activity between vegetal extract s and antibiotics ………………. .40
Chapter IV Re sults ……………………………………………………… ……………………………………. …….42
4.1 Characterization of the vegetal extracts …………………………………………………………………… …..42
4.2 The antibacterial activity of the plant extracts …………………………………………………………… ….54
4.2.1 Characterization of antibacterial activity ……………………………… …………………………54

4.2.2 Minimum inhibitory concentration…. ………………. …………………. …………………………61
4.2.3 Active formulas –antibacteri al and biological activity …………… …………………………63
4.2.4 Tests on the combina tions between polyphenols and antibiotics…… …………………..66
4.2.4.1 Tests with commercially available antibiotics…. …………………………………67
4.2.4.2 Tests with a new synthesised antibiotic.. ………………… …………………………86
Chapter V Results exploitation and novelties …………………………. …………………………106
5.1 Publica tions …………………………………………………………………………………………. …………………108
Chapter VI Conclusion s…………………………………………………………….. …………………………111
Bibliography …………………………………………………………………………………… ……………….. …….117

TABLE DE MATIÈRES

Résumé de thèse de doctorat ………………………………………………………… ……. 1
Chapitre I Introduction …………………………… .…………………………………… …13
1.2 Le but et les objectifs de la thèse …………………………………………………………….. …………………. 13
Chapitre II La nécessité d’effectuer cet étude ……………………… …………………………….. 17
2.1 Description de la psysiologie et la biochemie des bactéries ………………………………… ………… 17
2.2 Bactéries pathogènes et les mécanismes de leur résistance aux
antibiotiques ……………………. ………………………………………………………………………………………. 19
2.3 Des constituantis naturels biologiquement actifs de s plantes et l eur mechanism es d'action
antibactérienne …………………………………………………………………………………………………………. 24
2.4 Les plantes utilisée dans cet étude ……………………………………………………. …………… …………… 30
Chapitre III Matériels et méthodes ………………………………………………………………………. 34
3.1 L'obtention des extraits polyph énolique et leur caractérisation ……………………………….. ……… 34
3.1.1 Le mat ériel végé tal………………………………………………………………………… ……………. 34
3.1.2 L'obtention des extraits végétaux en utilisant des différents solvants ………………… .35
3.1.3 Le dosage des polyph énols et leur identification …………………………………………….. .36
3.2 L'action antibactérienne des extract s végétaux …………………………… …………………………….. ….38
3.2.1 La maintenance des cultures bactérienne s et la préparation d 'inoculum bactérien …38
3.2.2 L’évaluation de l'activité antibactérienne par la méthode difusimétrique ……………. 38
3.2.3 La détermination de la moindre concentration inhibiteur par la méthode des
microdilutions ……………………………………………………………………………………………………………….. 39
3.2.4 La formulation des deux produits avec action thérapeutique/cosmétique ……….. …..39
3.2.5 La détermination de l’ activité synergique des combinaisons de polyphénols et des
antibiotiques ……………………………………………………………………………………… 40
Chapitre IV Rés ultat s…………………………………………….. …………………………………………….. ..42
4.1 La caractérisation des extraits végétaux …………………………………………………….. ……………….. 42

4.2 L'activité antibactérienne d es extraits végétaux ……………………………………………………… ……..54
4.2.1 La caractérisation de l'activité antibactérienne ……………………… …………………………54
4.2.2 La détermination de la moindre concentration inhibiteur …………………………………..61
4.2.3 Produits actifs – action antibactérienne et biologi ques…………… …………………………63
4.2.4 L'activité des combina isons entre les polyphénols végétaux et les antibiotiques… .66
4.2.4.1 Des tests avec des antibioti ques disponibles en vente ………………………….67
4.2.4.2 Des tests avec un nouveau antibiotiques synthétisé ……………………………..86
Chapitre V La récupération des résultats et des éléments de nouveauté …….. .106
5.1 Publications…………………………… …………………………………………………….. ………………………..108
Chapitre VI Conclusions …………………………………………………………… …………… …………….111
Bibliographie ……………………………………………………………………………….. …………………………117

1
REZUMAT
al tezei de doctorat

Cuvinte cheie : polifenoli, activitate antibacteriană, HPTLC, produs cu acțiune
terapeutică/cosmetică, activitate sinergică între polifen oli și antibiotic e

Teza de doctorat intitulată ” STUDII BIOTEHNOLOGICE PRIVIND OBȚIN EREA
UNOR COMPUȘI NATURALI BIOLOG IC ACTIVI DIN PLANTE CU ACȚIUNE
ANTIMICROBIANĂ ÎMPOTRIVA UNOR TULPINI BACTERIENE PATOGENE ”
compusă de doctorand Nicu Alina Ioana sub îndrumarea Prof. Univ. Dr. Vamanu Adrian,
înscrisă la Școala doctorală a Universității de Științe Agronomice și Medicină Veterinară
București, a avut în vedere obținerea de extracte polifenolice din o serie de plante din flora
indigenă și testarea activității antibacteriene ale acestora.
Scopul tezei a fost acela de a utili za o serie de biotehnogii extractive vegetale pentru a
optimizarea procesului de obținere a extractelor polifenolice din plante și evaluarea posibilității
formulării de produse cu acțiune terapeutică bazate pe compuși naturali, biologic activi pentru
tratarea infecțiilor.
În acest sens, studiile au urmărit o serie de obiective:
 Eficientizarea proceselor de extracție a polifenolilor folosind diferiți solvenți;
 Caracterizarea calitativă a extractelor polifenolice din plante indigene utilizate în
medicina tra dițională;
 Evaluarea activității antibacteriene ale extractelor asupra unor tulpini bacteriene patogene
(ATCC);
 Formularea unor produse cu acțiune terapeutică/cosmetică bazate pe compuși naturali de
origine vegetală;
 Testarea unor combinații de polifenoli și antibiotice pentru urmărirea potențării efectelor
antibioticelor.
Lucrarea este structurată în 6 capitole care prezintă date de literatură, dar în cea mai mare
parte sunt prezentate cercetările personale. Teza conține 7 tabele ce redau rezultate ale stu diilor,
precum și 50 de figuri dintre care una singură este o reprezentare grafică a unor procese, toate

2
celelalte conțin ând rezultate ale cercetărilor aferente prezentei lucrări. De asemenea, bibliografia
conține de 174 referințe.
Cadrul instituțional în care s -au desfășurat cercetările aferente acestei lucrări a fost în
principal Institutul de Cercetări Chimico -Farmaceutice București (ICCF). Au fost implicate
persoane din cadrul Departamentului Farmacologie, Laboratorul de Microbiologie;
Departamentul Bio tehnologii Farmaceutice, Laboratorul Plante; precum și din cadrul
Departamentului Sinteze substanțe bioactive și Tehnologii farmaceutice. De asemenea, o parte
din testele de microbiologie au fost desfășurate în cadrul Universității din București, Facultate a
de Biologie, Departamentul Biochimie și Biologie Moleculară.
Prima parte a lucrării descrie scopul și obiectivele temei de cercetare ( Capitolul I
Introducere ), iar în continuare, Capitolul II , cu titlul Necesitatea efectuării studiului redă o
serie de date din literatura de specialitate referitoare la morfologia bacteriilor patogene și a
mecanismelor de rezistență la antibiotice ale acestora, precum și o scurta trecere în revistă a
polifenolilor cunoscuți pentru activitățile lor biologice. Nu în ultimul rând, în acest capitol sunt
descrise succint cele paisprezece plante din flora indigenă utilizate în cadrul studiilor din lucrarea
de față : încadrare taxonomică, conținut fitochimic așa cum reiese din datele de literatură, precum
și utilizările acestora î n medicina tradițională .
Capitolul III descrie întreaga gamă de Materiale și metode utilizate pentru atingerea
obiectivelor temei de cercetare, pornind de la obținerea extractelor vegetale și solvenții folosiți,
metodele cromatografice ce au condus la cara cterizarea extractelor (HPLC și HPTLC) și
încheind cu metodele folosite pentru testarea activității antibacteriene ale extractelor, precum și a
combinațiilor dintre polifenoli și antibiotice: metoda difuzimetrică bazată pe migrarea în agar a
substanțelor c u potențială activitate antimicrobiană și determinarea concentrației minime
inhibitorii (CMI).
Partea cea mai amplă a lucrării este constituită din Capitolul IV Rezultate și prezintă, în
ordine logică și cronologică, totalitatea rezultatelor obținute. În p rimul rând sunt redate
cromatogramele ce caracterizează cele 14 extracte vegetale obținute (apoase sau etanolice),
precum și o serie de fracții separate din 3 dintre aceste extracte: fracții în cloroform, fracții
apoase și fracții în etil acetat. Am demons trat astfel că majoritatea extractelor conțin un amestec
de acizi fenolici și flavonoide , excepția fiind extractul din fructe de gutui ( Cydonia oblonga ) în
care s -au identificat doar acizi fenolici.
În ceea ce privește activitatea antibacteriană a extract elor vegetale totale, acestea au dus
la rezultate variate, de la lipsa de activitate până la activitate certă (încadrare conform

3
Farmacopeei Romane Ed. a X -a), cele mai eficiente extracte s -au dovedit a fi cel din Epilobium
hirsutum (pufulița cu flori mici ) și Arctium lappa (scai), în special împotri va speciilor bacteriene
Gram poz itive. În ceea ce privește corelarea dintre compoziția fitochimică și activitatea
antibacteriană, s -ar părea că o mai mare varietate de compuși în amestec duc la rezultate mai
bune, probabil datorită unor mecanisme sinergice între acizii polifenolici și flavonoide.
În continuare, am desfășurat o serie de experimente care au condus la formularea a două
produse pentru igiena mâinilor, produse cu acțiune antibacteriană și antioxidantă . Fiecare produs
conține un amestec din două extracte vegetale ( Epilobium hirsutum/Lythrum salicaria și Arctium
lappa/Aronia melanocarpa ) caracterizate din punct de vedere al compoziției în polifenoli și al
acțiunii biologice, soluțiile finale putând fi ut ilizate pentru curățarea mâinilor și pot fi încadrate
în sfera produselor cu acțiune terapeutică/cosmetică.
În ultima parte a acestui capitol sunt prezentate rezultatele testării unor combinații dintre
antibiotice (două din ele disponibile comercial și unu l nou sintetizat de către o echip ă de
cercetători ai Institutului de Cercetări Chimico Farmaceutice –ICCF București) și diferite
concentrații de polifenoli extrași din plante indigene. Pentru evaluarea acestor activități a fost
utilizată metoda difuzimetri că, iar în funcție de relația dintre diametrele zonelor de inhibiție ale
componentelor individuale față de cele ale combinațiilor acestea au fost împărțite în trei
categorii: cu activitate sinergică, indiferentă sau antagonică. Dintre cele 4 extracte luate în calcul
pentru aceste experimente, cea mai importantă activitate s -a dovedit a fi cea a extractului din
turița mare ( Agrimonia eupatoria ) care a înregistrat cele mai multe combinații cu acțiune
sinergică, în special împotriva Escherichia coli , o bacteri e condiționat patogenă ce cauzează
frecvent infecții intestinale și urinare și care este tot mai dificil de combătut prin tratamente cu
antibiotice deoarece dezvoltă rapid rezistența la acestea.
S-au evidențiat activități sinergice în mod aproape egal pentru toate cele 3 concentrații de
polifenoli testate, ceea ce arată importanța optimizării efectelor dintre compuși vegetali și
antibiotice, în funcție de tipul de acizi fenolici și flavonoide conținuți de extractul vegetal,
concentrația acestora, dar și de natura și mecanismul de acțiune al antibioticului. Cu toate
acestea, rezultatele acestei lucrări pot constitui bazele unor cercetări ulterioare care să conducă la
formularea de preparate cu acțiune terapeutică care să combată rezistența la antibiotice a
microroganismelor patogene și să diminueze consumul de antibiotice, eliminând totodată și
efectele secundare nedorite ale acestora.
În continuare, Capitolul V Valorificarea rezultatelor și elemente de noutate , punctează
pe scurt ceea ce este original în lucrarea de față și cum pot fi aceste noutăți explorate pe viitor,

4
precum și modalitățile prin care aceste rezultate au fost diseminate prin publicarea de articole și
participări la conferințe științifice.
Ultimul capitol, Concluzii (Capitolul VI) prezintă pe scurt cele mai importante realizări
ale studiului de față așa cum reies din datele prezentate în părțile anterioare ale tezei de doctorat
și sunt subliniate corelațiile dintre compoziția fitochimică a extractelor vegetale și acțiunile
antibacteriene al e acestora . De asemenea, se menționează datele privind combinațiile dintre
polifenoli și antibiotice cu accent pe activitățile sinergice dovedite în cadrul experimentelor din
lucrarea de față.
Bibliografia aferentă acestei teze conține 175 de titluri bibli ografice, din tre care 21 sunt
redactate de autori români și 154 de autori străini. Din numărul total de referințe, 152 au fost
publicate după 2000, iar dintre acestea 91 după anul 2010 ( 11 sunt publicații din 2016 -2017).

5
ABSTRACT
of the PhD thesis

Key words : polyphenols, antibacterial activity, HPTLC, product with
therapeutic/cosmetic activity, synergic activity between polyphenols and antibiotics

The PhD thesis with the title ”BIOTECHNOLOGICAL STUDIES FOR
OBTAINING NATURAL, BIOLOGICALLY ACTIVE PLANT COMPOUNDS WITH
ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST SOME PATHOGENIC BACTERIAL
STRAINS” written by the PhD student Nicu Alina Ioana under the supervision of Prof. Univ.
Dr. Vamanu Adrian, enrolled at the Doctoral school of the University of Agronomic Sciences
and Veterinary Medicine Bucharest, aimed to obtaine some polyphenolic extracts from
indigenous plants and to test their antibacterial activity.
The purpose of this thesis was to use a series of extractive biotechnologies in order to
optimize the process of obtaining polyphenolic extracts from plants and evaluating the
possibility of formulating some products with therapeutic action based on natural compounds
with biological activity fo r the treatment of infections.
The present study followed the objectives:
 Finding the most efficient process for extracting polyphenols using different solvents;
 Quality characterization of the polyphenolic extracts from indigenous plants used in
traditio nal medicine;
 Evaluation of the antibacterial activity of the extracts against some pathogenic bacterial
strains (ATCC);
 Formulation of some products with therapeutic/cosmetic activitybased on natural
compounds from vegetal sources;
 Testing of some combina tions between polyphenols and antibiotics in order to improve
the activity of antibiotics.
The present paper is structured in 6 chapters which present data from scientific literature
and mostly personal research. The thesis contain 7 tables that reveal the results of different
studies and 50 figures, from which only one is a graphical representation of some processes, all
the others show result of the research associated with this paper. Also, the bibliography contains
175 references.

6
Almost all of the rese arch affilia ted with this thesis took place at the National Institute for
Chemical Pharmaceutical Research and Development. There were involved personnel from the
Pharmacology Department, Microbiology Laboratory; Department of Pharmaceutical
Biotechnologie s, Plant Laboratory and the Department for Synthesis of Bioactive Substances and
Fine Chemicals. Also, some of the microbiology experiments took place at the University og
Bucharest, Faculty of Biology, Department of Biochemistry and Molecular Biology .
The first part of the thesis describes the purpose and objectives of the research
(Chapter I Introduction ) and the next part, Chapter II , entitled The utility of the study reveals
data from the literature about the morphology of pathogenic bacteria and the r esistance
mechanism that help bacteria to be immune to antibiotics, plus a short review of the best known
polyphenols and their biological activities. Moreover, this chapter briefly describe s the fourteen
plants from the indigenous flora that were used in this study: their taxonomic group, their
phytochemical composition as shown in the scientific literature and how they are used in
traditional medicine.
Chapter III mentions in detail all the Materials and methods used for achieving the
objectives of the thesis , starting with obtaining the vegetal extracts and the mention of the
solvents that were used, the chromatographic methods used to characterize those extracts (HPLC
and HPTLC) and ending with the methods used for testing the antibacterial act ivities of the
vegetal extracts and the combinations between polyphenols and antibiotics: the diffusimetric
method was chosen because it is based on the migration in agar of the substances with potential
antibacterial activity and it is used for antibiotic s studies , and lastly the determination of the
minimum inhibitory concentration (MIC).
The biggest part of the paper is represented by Chapter IV Results in which are
presented, both logically and chronologically, all the results obtained. The first part s hows the
chromatograms tha t characterize al 14 vegetal extracts ( aqueous or ethanolic) and the fractions
separated from 3 of these extracts: chloroform fraction, aqueous fraction and ethil acetate
fraction. Thus, we proved that almost all of the extracts c ontain a combination of phenolic acids
and flavonoids with one exception: quince fruit ( Cydonia oblonga ) that revealed only phenolic
acids as its components.
Regarding the antibacterial activity of the vegetal extracts, these varied from no activity
to cer tain activity (classification according to the Romanian Pharmacopoeia Xth Ed.), the most
efficient being the extract from Epilobium hirsutum (great willowherb) and Arctium lappa
(greater burdock) especially against Gram positive bacteria. Regarding the cor relation between
the chemical composition of the plant extracts and their antibacterial activity, it appears that the

7
best results were obtained when the extracts contained a combination of compounds, suggesting
that there are some synergic mechanism betwe en flavonoids and phenolic acids.
In the next part, we lead a series of experiments that lead to the formulation of two
products for hand hygiene, products with antibacterial and antioxidant antivities. Each one
contains a combination of two vegetal extrac ts (Epilobium hirsutum/Lythrum salicaria and
Arctium lappa/Aronia melanocarpa ) with the polyphenolic composition determined and with
proven biological activity; the final products being safe to use for hand cleaning and considered
products with therapeutic /cosmetic activity.
The last part of this chapter presents the results of testing some combinations between
antibiotics (two of them commercially available and one new synthetised by a team of
researchers from the National Institute of Chemical and pharmac ological Research – ICCF
Bucharest) and different concentrations of polyphenols extracted from indigenous plants. For
this evaluation, we used the diffusimetric method and, based on the relation between the zone
inhibition diameter of the individual compon ents and the combination, the latter were classified
in three tipes: with synergic activity, indifferent and with antagonic activity. From the 4 extracts
taken into consideration for this part of the study, the most important activity was found to that
of the agrimony extract ( Agrimonia eupatoria ) which lead to the most synergic activities,
especially against Escherichia coli , a bacteria that is a conditionally pathogenic that causes
urinary and intestinal infections that are more and more difficult to trea t with antibiotic because
tha bacteria rapidly develops resistance to their action.
Synergic activities were revealed almost equally for all three concentration of
polyphenols tested which shows once again the importance of optimizing the effects of
polyph enols compounds on antibiotic action considering the structure of the polyphenols and
flavonoids from the vegetal extract, their concentration and the nature and action mechanism of
the antibiotic. Taken all this into consideration, the results showed in t his thesis can be the basis
for further research that can lead to the formulation of products with therapeutic action that can
lower the antibiotic resistance of pathogenic microorganisms and decrease the consumption of
antibiotics and their unwanted side effects.
Next, Chapter V Results exploitation and novelties briefly accentuates the original
results of this study and how they can by further used in other researches. Also, this chapter
reveales how the results were disseminated by publishing original re search articles or through
participation to scientific conferences.
The last chapter, Conclusions (Chapter VI ) present the most important findings of this
thesis as they are shown through the paper and emphasizes the correlation between the

8
phytochemical composition of vegetal extracts and their antibacterial activities. Also, there are
mentions of the data regarding the combinations between polyphenols and antibiotics, with a
highlight on the synergic activities that were revealed through the experiments from the present
study.
The bibliography of this PhD thesis contains 175 titles, from which 21 were published
by romanian authors and 154 by foreign authors. Out of the total number of references, 1 52 were
written after the year 2000, from which 91 after 2 010 ( 11 publications are from 2016 -2017).

9
RÉSUMÉ
de la thèse de doctorat

Mots clés : polyph énols, activité antibactérienne, HPTLC, produit avec d'action
thérapeutiq ue/cosmétique, activité synergique entre polyph énols et antibiotiques

La thèse de doctorat intitulat é "DES ÉTUDES BIOTECHNOLOGIQUES POUR
L'OBTENTION DE CONSTITUANTS NA TURELS BIOLOGIQUEMENT ACTIFS DES
PLANTES AVEC ACTION ANTIMICROBIENNE CONTRE CERTAINES SOUCHES
DES BACTÉRIES PATHOGÈNE S", rédigé e par le doctorant Nicu Alina Ioana , sous la
direction du Prof. Univ. Dr. Vamanu Adrian, dans le cadre de l'École doctorale de l'Université de
Sciences Agronomiques et la Médecine Vétérinaire Bucarest, porte sur l'obtention des extraits
polyph énolique d'une sélection de plantes de la flore indigène et sur les tests effectués sur leur
activité antibactérienne.
La thèse a pour but l’utilisation d’une série de biotechnologies extractives végétaux afin
d’optimiser le processus pour l’obtention des extraits polyphénolique de pla ntes et l'évaluation
de la possibilité de formuler des produits avec action thérapeutique basée sur des constituants
naturels, biologiquement actifs pour le traitement d'infections.
À cet égard, les études ont observé u n certain nombre d'objectifs :
 l`accroissement de l`efficacit é des processus d’extraction des polyph énols en
utilisant des différents solvants;
 caractérisation qualitative des extraits polyph énolique s des plantes indigènes
utilisées dans la médecine traditionnelle;
 évaluation de l'activ ité antibactérienne des extraits contre des souches
bactériennes pat hogènes (ATCC );
 formulation de s produits avec actio n thérapeutique/cosmétique basés sur les
constituants naturels d’origine végétale ;
 le test des combinaisons de polyphénols et des antibiotiques pour suivre la trace
les effets sur l'activité des antibiotiques.
Ce travail est structuré dans 6 chapitres qui présentent d’une côté les données de la
littérature et d’autre côté (la plus consis tante) les recherche personnelle. La thèse contient

10
7 tables qui relèvent les résultats des études , mai aussi les 50 figures dont une seule est une
représentation graphique des processus, les autre s contie nnent les résultats de la recherche liée à
ce trav ail. La bibliographie contient 175 sources de références .
Le cadre institutionnel ou les recherche s liée à ce travail ont été déroulées à l'Institut
National de Recherches et Dev éloppment en Chimi e Pharmaceutique Bucarest (ICCF). Ont été
impliqués des personnes dans le Département de Pharmacologie, Laboratoire de Microbiologie;
le Département de Biotechnologies Pharmaceutique, Laboratoire des Plantes et le Département
de Synthèse de Substances Bioactifs et Technologies Pharmaceutiques. Aussi, des tests de
microbiologie ont été effectu és à l'Universit é de Bucarest, Facult é de Biologie, le D épartement
de Biochemie et Biologie Mol éculaire.
La première partie du thèse décrit le but et les objectifs du thème de recherche ( Chapitre
I Introduction ) et le Chapitre II , avec le titre La nécessité d’effectuer cet étude met en
évidence une série de données de la littérature spécialisée sur la morphologie des bactéries
pathogènes et les mécanismes de leur résistance aux antibiotiques et une brève vue d'ensemble
des polyphénols connus pour leurs activités biologiques . Pour conclure, dans ce chapitre sont
décrites en brève les quatorze plantes de la flore indigène utilisée dans l a présente étude :
l'encadrement taxonomique, le contenu phytochimi que qui résulte des données de littérature,
aussi bien que leurs utilisations dans la médecine traditionnelle.
Le chapitre III décrit la gamme complète des Matériels et méthodes utilisé s pour
l'accomplissement des objectifs du théme de recherche, commençant par l 'obte ntion des extraits
végétaux et les solvants utilisés, les méthodes chromatographiques qui ont mené à la
carac térisation des extraits (HPLC et HPTLC) et finissant avec les méthodes utilisé es pour tester
l'activité antibactérienne des extrait s, mais aussi l es combinaisons entre les polyphénols et
les antibiotiques : la méthode difusimé trique est basée s ur la migration en agar de s substances
avec activité antimicrobienne potentielle e t la détermination de la moindre concentration
inhibiteur (MCI).
Le Chapitre IV Résultats occupe la plus grande partie de la thèse et met en évidence la
totalité des résultats obtenus , dans ordre logique et chronologique . Premièrement s ont présentées
les chromatogram mes qui caractérise nt les 14 e xtraits végétaux obtenus (aqueuse ou éthanoïque )
et puis, une série des fraction s séparées de 3 de ces extraits : fraction dans chloroforme, fractions
aqueuses et fractions dans solution d'acétate d'éthyle. De cette façon, n ous avons prouvé que la
majorité des échantillons contienne un mélange d'acides phénoliques et des flavonoïdes,
l'exception étant l'extrait du fruit de coing ( Cydonia oblonga ) dans lequel on identifie seulement
des acides phénoliques .

11
En ce qui concerne l'activité antibactérienne des extraits végétaux totales, ils ont mené à
de résultats divers , du manque ment de l'activité jusqu’à l'activité certifiée (l'emploi
conformément au Pharmacopée Roumain Xeme Ed.). Les extraits les plus efficaces se sont avérés
à être ceux de L’Epilobium hirsutum et de L’Arctium lappa , en particulier contre les espèces
bactérienne Gram positive. En ce qui concerne la corrélation entre la composition phytochimi que
et l'activité antibactérienne, il semblerait que le mélange d’une variété plus grande de compo sés
mène à de meilleurs résultats, probablement en raison des mécanismes synergiste entre des
acides polyphénoliques et flavonoïdes
Nous avons effectué un certain nombre d'expérimentes qui ont mené à la formulation de
deux produits pour l 'hygiène des mains , produits avec action antibactérienne et antioxydant e.
Chaque produit contient un mélange de deux extraits végétaux
(Epilobium hirsutum/Lythrum salicaria et Arctium lappa/Aronia melanocarpa ) caractérisé du
point de vue de la composition dans polyphénols et de l'action biologiques , des liqueurs finales
biologiques pouvant être utilisé es pour nettoy er les mains . Elles peuvent être encadrées dans la
sphère des produits avec action thérapeutique/cosmétique.
La dernière partie de ce chapitre décrit les résulta ts de s tests des combinaison s
d'antibiotiques (deux d'entre eux sont disponible s en vente et un nouveau synthétisé par un e
équipe d’ experts de l'Institut National de Recherches et Dev éloppment en Chimi e
Pharmaceutique Bucarest ) et des concentrations diverses de polyphénols extraits des plantes
indigènes. Pour l'évaluation de ces activités a été utilisée la méthode difusimétrique et selon la
relation entre les diamètres des zones d'inhibition des composants individuels par rapport à ceu x
des combinaisons, ils ont été divisés dans trois catégories: avec activité synergique , indifférent e
ou antagonique. Parmi les 4 extraits pris en compte pour ces expérimentes , l'activité la plus
importante est celle de l'extrait du Agrimonia eupatoria qui a enregistré plusieurs combinaisons
avec action synergique, en particulier contre Escherichia coli , une bactérie pathogène qui mène
souvent à d es infections intestinales et urinaire et qui est de plus en plus difficile à combattre par
traitements antibio tiques parce qu’elle devient vite résistante à ceux -ci.
Les activités synergistes se sont manifesté presque identiquement pour toutes les
3 concentrations de polyphénols testés, ce qui montre l'importance de l'optimisation des effets
entre les compos ants végétaux et les antibiotiques, selon le type d'acides phénoliques et les
flavonoïdes contenu s par l’ extrait végétal , leur concentration, mais aussi de la nature et du
mécanisme d'action de l'antibiotique. Cependant, les résultats de ce travail peuvent con stituer les
base po ur la recherche ultérieure qui mène rait à la formulation de s préparatifs avec action
thérapeutique qui puissent combattre la résistance aux antibiotiques des microorganismes

12
pathogène s et réduire la consommation d'antibiotiques et élimin er en même temps leurs effets
secondaire indésirables.
Le Chapitre V L a récupération des résultats et des éléments de nouveauté , présente en
brève ce qui est original dans la thèse et comment ces nouveautés pourront être explorées à
l'avenir, aussi bien q ue les modalités qui ont permis que ces résultats soient disséminés par la
publication des articles et la participation aux conférences scientifiques.
Le dernier chapitre, des Conclusions (le Chapitre VI ) décrit brièvement les plus
importants accomplissements de la présente étude en tenant compte de leur présentation dans les
chapitres précédents et sou ligne les corrélation entre la composition phytochimi que des extraits
des plantes et leurs actions bactériennes. On présente aussi les données sur les combinaisons de
polyphénols et des antibiotiques en insistant sur les activités synergiques relevées dans les
expérimentes présentées dans le présent travail.
La bibliographie contiennent 175 titres bibliographiques, dont 21 sont rédigés par les
auteurs roumains et 1 54 par les auteurs étrangers. Du nombre total des références, 152 ont été
publié es après l’an 2000 et 91 d'entre eux après l’an 2010 ( 11 sont des publications de
2016 -2017).

13
CAPITOLUL I
INTRODUCERE
CHAPTER I
INTRODUCTION

Încă d in timpuri le cele mai vechi , oamenii au utilizat numeroase plante pentru a trata
afecțiuni diferite, de la simpl e răceli până la boli sistemice sau metabolice . Cunoștințe le obținute
în mod empiric de -a lungul timpului , așa cum sunt evidențiate în numeroase documente, au
pornit a fi analizate în detaliu în ultimele decenii, mai ales datorită dezvoltării exponențiale a
industri ilor medicală și farmaceutică. De asemenea, s -a demonstrat că utilizarea pe perioade
lungi de timp a medicamentelor de sinteză conduc la apariția de efecte secundare nedorite . În
acest context, studiul compuși lor sintetizați de plante, cum ar fi polifenoli, taninuri , vitamine,
etc., a demonstrat cum anume aceștia își exercită efecte le pozitive asupra sănătății umane, iar
astfel a apărut o tendință generală de întoarcere la tratamente naturiste , așa numitul fenomen
„back to nature ” care presupune utilizarea de produse pe bază de plante pentru tratarea
diverselor boli.
Polifenolii sunt compuși naturali sintetizați de pl ante pentru a se proteja de radiațiile UV
sau de patogeni și s-a demonstrat că au efecte antibacteriene, anti-inflamatorii, antioxidante sau
anti-virale, dar pot fi utilizați și pentru tratarea bolilor cardiovasculare , a diabetului sau pentru
scăderea nive lului trigliceridelor . Totuși , cel mai adesea plantel e medicinale sunt folosite pentru
a combate infecțiile bacteriene, l ocale sau generalizate , și este bine studiat efectul antimicrobian
al unor compuși precum acidul galic, quercitina, rutina sau acidul cafeic .
1.1 SCOPUL ȘI OBIECTIVELE TEMEI DE CERCETARE
Scopul prezentei teme de cercetare este dezvoltarea biotehnologiilor extractive vegetale
care să conducă la obținerea unor compuși naturali biologic activi din plante și studierea
efectelor antibacteri ene ale acestora asupra tulpinilor microbiene patogene în vederea obținerii de
noi preparate cu acțiune terapeutică care să permită tratarea rapidă a infecțiilor și înlăturarea
efectelor secundare ale antibioticelor sau a altor medicamente .
Având în vedere rezultatul experimentelor efectuate in vitro – efectul antibacterian al
polifenolilor prin generare de leziuni la nivelul membranei plasmatice sau ale enzimelor

14
bacteriene , pentru a putea elabora strategii terapeutice adecvate se impune necesitatea unor studii
experimentale care să urmărească atingerea următoarelor obiectiv e:
evaluarea eficienței a diferite biotehnologii extractive asupra obținerii unor cantități optime de
polifenoli, precum și stabilitatea acestora prin utilizarea de solvenți distincți ;
rezolvarea ipotezei potrivit căreia acțiunea antibacteriană a acestor polifenoli se concretizează
prin afectarea funcțiilor celulare ;
evaluarea compoziției în polifenoli a unor extracte din o gamă de plante utilizate în medicina
tradițională sau gastronom ie, precum Mentha piperita, Melissa officinalis, Juglans regia ,
Epilobium hirsutum , ș.a.;
evaluarea activității antibacteriene a extractelor obținute asupra unor tulpini bacteriene precum
Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis , Salmonella enteritidis ,
Salmonella typhimurium , Pseudomonas aeruginosa , prin determinarea activității antibacteriene
cu ajutorul metodei difuzimetrică sau determinarea concentrațiilor minime inhibitorii ;
formularea unor preparate pe bază de extracte vege tale cu efecte antibacteriene și demonstrarea
că acestea posedă acțiune terapeutică/cosmetică;
evaluarea acțiunii sinergice dintre polifenolii nou obținuți și produși ai celulelor bacteriene –
antibioticele – precum oxacilină, ciprofloxacină sau norfloxaci nă.

15
Ever since Ancient times, people have been using numerous plants to treat different
afections, from tho common cold to systemic or metabolic illnesses. The knowledge empirically
accumulated over the centuries, as shown in written documents, have started to be analised in
detail in the last decades, especially because of the exponential development of the medical and
pharmaceutical industries. Also, it was proven that long time consuming of synthetic drugs lead
to the apparition of unwanted side ef fects. In this context, the study of compounds synthetised by
plants such as polyphenols, tanins, vitamins, etc., showed that they also have positive effects on
human health thus leading to the so called “back to nature” movement based on using products
made from plants for disease treatment.
Polyphenols are natural compounds, synthetised by plants to protect themselves from UV
radioations or pathogens and it was proven that they have antibacterial effects, anti –
inflammatory, antioxidant and anti -viral; but they can also be used for treating cardiovascular
diseases, diabetes or for lowering triglycerides levels. However, most often medicinal plants are
used to treat bacterial infections, local or systemic, and it is well studied the antibacterial effect
of some compounds such as gallic acid, quercitin, rutin or caffeic acid.
1.1 THE PURPOSE AND OBJECTIVES OF THIS RESEARCH
The purpose of the present research is the development of vegetal extractive biotechnologies
that can lead to the obtaining of some natural biologically active plants compounds and the
studying of their antibacterial effects against some pathogenic microbial strains in order to obtain
new products with therapeutic action that will help treating infections and minimize the adverse
effect of ant ibiotics or other drugs.
Considering the in vitro results of several studies – the antibacterial effect of polyphenols by
generating lesions at the plasmatic membrane or inhibiting some enzymes, in order to elaborate
on some therapeutic strategies, experim ental studies are required in order to accomplish the
following objectives :
the evaluation of the efficiency of different extractive biotechnologies on obtaining optimal
quantities of polyphenols and their stability by using several solvents;
proving the h ypothese that the antibacterial effect of the po lyphenols is due to the disruption
of some cellular processes;
the evaluation of the polyphenolic composition of some extracts from several plants used in
traditional medicine or gastronomy, like Menthe piper ita, Melissa officinalis ¸ Juglans regia ¸
Epilobium hirsutum , etc.

16

the evaluation of the antibacterial activity of the new extracts against some pathogenic
bacterial strains such as Escherichia coli , Staphylococcus aureus , Staphylococcus
epidermidis , Salmon ella typhimurium , Salmonella enteritidis or Pseudomonas aeruginosa ,
by determining the antibacterial activity using the diffusimetric method and determining the
minimum inhibitory concentration.
the formulation of some new products based on vegetal extract s with antibacterial activity
and proving that they have therapeutic/cosmetic activity;
the evaluation of the synergic action between the new obtained polyphenols and other
products of the bacterial cells – antibiotics such as oxacillin, ciprofloxacin or n orfloxacin.

17
CAPITOLUL II
NECESITATEA EFECTUĂRII STUDIULUI
CHAPTER II
THE UTILITY OF THE STUDY

2.1 NOȚIUNI DESPRE FIZIOLOGIA ȘI BIOCHIMIA BACTERIILOR
Bacteriile sunt organisme unicelulare procariote, saprofite sau parazite, au dimensiuni
cuprinse între 0.5 și 8 nm, prezintă un singur cromozom și se înmulțesc prin diviziune binară,
izomorfă . Ele sunt întâlnite oriunde în natură datorită capabilității lor de a se adapta la orice tip
de mediu: soluri (straturi profund e sau superficiale ), ape de izvor, mări , oceane; pot supraviețui
și în atmosferă unde sunt transportate de curenții de aer . De asemenea , aceste organisme se fac
parte din microbiota normală a plantelor și animalelor, având un rol esențial în intestin ul celor
din urmă deoarece participă la fenome ne ca absorbția nutrienților, transformarea bolului
alimentar sau producția de vitamine (K, B -uri) (Jelea, 2007) .
Metabolismul bacterian presupune mineralizarea materiei organice nevii pentru a
transforma compuși i macrom oleculari în compuși simpli, astfel asigurând u-se circuitul
elementelor în natură . Gama largă de substrate ce pot fi metabolizate de către bacterii a dus la
utilizarea acestora în industrie pentru obținerea produselor de panificație, a vinului și oțetului
(bacterii lactice), a brânzeturilor , precum și în biotehnologie pentru producerea de hormoni (ex .:
insulina produsă de Escherichia coli ), îngrășământ biologic ( Azotobacter sp .), enzime, proteine,
acid lactic, aminoacizi, vitamine ( Proteus vulgaris pentru biotină, E. coli și Bacillus subtilis
pentru tiamină, Lactobacillus sp . pentru piridoxină), antibiotice ( Streptomyces sp ., Penicillinum
sp.) etc. Din aspectele nedorite ale dezvoltării bacteriene, menționăm producerea de toxine c e pot
cauza toxiinfecții alimentare sau apariția unor in fecții precum tuberculoza, sifilisul, botulismul,
și alterarea alimentelor (putrefacția cărnii, acrirea berii și a vinului, etc.) (Lazăr, 2003) .
Metabolismul bacterian este un proces biochimic complex, intracelular , care se
finalizează cu transformarea sub stanțelor nutritive în constituenți celulari și energie . Procesul
ciclic, necompartimentat, autoreglat , unicelular și flexibil datorită capacității crescute a
bacteriilor de a se adapta la diferite condiții de mediu . Desigur, și la bacterii există două tip uri de
metabolism: catabolism (reacții energetice precum respirația ) și anabolism (reacții de sinteză a
compușilor bacterieni ). Se observă însă o serie de particularități ale acestor procese la bacterii ,

18
precum faptul că natura și diversitatea nutrienților este foarte variată, de la substanțe anorganice
simple de tip azot sau carbon și până la substanțe organice complexe de tip lignină, acid formic,
celuloză , asfalt, fenoli, materiale plas tice, etc ., microorganismele fiind cunoscute ca speciile cele
mai tip ic omnivore întâlnite (Stelling et al ., 2002) .
Celulele bacteriene sunt formate din: structuri extraparietale, perete celular, membrană
plasmatică, c itosol, nucleoid și structuri din citosol . Peretele celular este cel care care asigură
forma celulară și protejează celula bacteriană de liza osmotică sau de substanțe potențial toxice
din mediu extern , cum ar fi antibioticele . Bacteriile se clasifică în două mari categorii în funcție
de natura peretelui celular: Gram negative și Gram pozitive .
Bacteriile Gr am pozitive prezintă un perete celular alcătuit din mureină (8 5-90%),
proteine și polizaharide . Mureina este un pept idoglican format din N -acetilglucozamină legat ă β
1-4 de acidul N-acetilmuramic și o structură repetitivă de tipul: L -Ala-D-Glu-L-R3-D-Ala, unde
radicalul R3 este specie specific. S tructură rigidă a peretelui este asigurată de o multitudine de
legături între grupările COOH de la nivelul acidului N -acetilmuramic și grupările NH2 ale
aminoacidului R3, dar și între aminoacizi i dextrogiri și levog iri. Polizaharidele cele mai des
întîlnite în compo nența peretelui celular sunt acizii teichoici 1,3-poliglicol -fosfat și 1,5-
poliribitol -fosfat, implicați în diviziune a celulară transportul ionilor, dar care pot acțion a și ca
factori de virulență sau re ceptori de fagi (Vollmer et al ., 2008) .
Bacteriile Gram negative prezintă un perete celular alcătuit din mureină doar în proporție
de 8-10%, nu au în componență acizi teichoici, dar diferența cea mai importantă este aceea că
aceste bacterii au o membrană externă formată din proteine, ipopolizaharide și lipide, practic este
vorba de o copie a membranei plasmatice care este rigidă și nu permite pătrunderea compușilor
din mediu extern. Între cele două membrane ale celulei bacteriene este un spațiu periplasmic în
care se găsește un complex alcătuit peptidoglican și lipoproteine care împreună cu membrana
externă formează un adevărat ”zid de apărare” față de mediul extern, de aceea bacteriile Gram
negative sunt mai rezistente la acțiunea compușilor antibacterieni și supraviețuiesc cu ușurință în
medii precum flora intestinală umană (Pink et al., 2000).
Spre deosebire de organismele multicelulare, c reșterea bacteriilor se referă la n umărul de
celule di n masa bacteriană la un moment dat, nu la dimensiunile celulelo r. În acest proces este
important timpul de dublare populațională care în condiții propice este destul de redus ( pentru
Escherichia coli timpul de dublare populațională este de aproximativ 20-25 minute) . În condiții
optime, prima dată are loc creșterea rap idă a volumului celular prin mărirea c oordonată a
compușilor celulari și mai apoi diviziunea celulei pentru a se restabili raportul optim suprafață
celulară/volum . Creșterea bacteriilor în cultură este de 3 tipuri: discontinuă ( atunci când mediu l

19
de cultur ă este limitat – cum este cazul experimentelor de laborator), continuă (mediul de cultură
este împrospătat permanent – bioreactoare sau turbidistate) sau sincrone (bacterii aparținând unor
specii diferite se divid concomitent , cum este cazul celor din flora intestinală) ( Hartwell, 1997 ).
2.2 PATOGENITATEA ȘI REZISTENȚA LA ANTIBIOTICE A
BACTERIILOR
Infecția reprezintă procesul prin care un a gent patogen ajunge la nivelul țesuturilor
organismului -gazdă și se înmulțește , iar boala infecțioasă constitu ie apariția unor modificări ale
compartamentului gazdei ca răspuns la agresiune a agentului străin , cu sau fără manifestări
clinice . Aria de studiu care studiază microor ganismele implicate în patologia umană și
interacțiunile care apar î ntre om și aceste a este microbiologia medicală (Georgescu, 1983) .
Infecțiile, în funcție de modalitatea de pătrundere a agentului infecțios în organismul –
gazdă , pot fi de două tipuri: exogene, când acesta ajunge în organism pe căi externe : piele,
uretral, oral, vaginal , muco ase sau anal; și endogene, când infecția este datorată
microorganisme lor care se găsesc în mod uzual în organism dacă sistemul imunitar al gazdei este
deficitar sau sistemele de apărare locală sunt deficitare (Ghețeu, 2011 ). În formele lor extreme,
infecți ile pot devia în septicem ie, un răspuns inflamator sistemic care este a zecea cauză de deces
în țările dezvoltate și a doua cauză de deces ca incidență în terapia intensivă la pacienții fără boli
coronarie ne. Cel mai frecvent, bacterii le care duc la septic emii sunt Klebsiella sp. ,
Escherichia coli , Streptococcus pyrogenes , Staphylococcus aureus , Pseudomonas aeruginosa
(Cornelis și Dingemans, 2013; Ramachandran, 2014) .
Dintre bacteriile patogene, menționăm bacilul Gram negativ Escherichia coli , care este
condiționat pat ogen, devenind periculos atunci când apar mutații sau este mutat în alt mediu
decât cel în care bacilul se dezvoltă în mod normal . În aceste cazuri , E. coli poate produc e
antigenul K, toxine, factorul atotoxic necrotizant , precum și/sau hem olizina . Cel mai adesea,
această bacterie determină infecții genito -urinare (85% din cazuri) sau intestinale, cum ar fi cele
6 tipuri de infecții diareigene: enteroagregativ (EaggEC), enterotoxigen (ETEC), enteroinvaziv
(EIEC), enterohemoragic (EHEC), enteroaderent difuz (DAEC) sau enteropatogen (EPEC).
Netratate, aceste infecții pot degenera în endocardite, meningite sau chiar septicemii
(Woodford et al., 2007; Ditu et al ., 2011) .
În plus , Escherichia coli este cauza apariției de infecții la copii care au fost supuși
tratamentelor de tipul chimioterapie i pentru cancer, tratamente care îi fac să devină
imunocompromiși (Daneshmand et al., 2013), iar unele tulpini sunt cauzează apariția acneei la
unele persoane (Iinuma și Tsuboi, 2012). Totuși , infecțiile urinare sunt mai frecvente decât cele

20
intestinale , ele fiind determinate de forme uropatogene de E. coli (UPEC), derivate din flora
intestinală fecală, care aderă mai întâi la introitusul vaginal și apoi la celulele tractului urinar cu
ajutorul fimbriilor P (Ehrlich et al., 2005). Diversitatea genelor de virulență asociate cu tulpinilor
uropatogene de Escherichia coli sugerează că acestea au dezvoltat numeroase mecanisme
redundante care să îi permită să supraviețuiascî în organismu l gazdă și să reziste la acțiunea
antibioticelor, motiv pentru care au început să se caute complexe sau amestecuri farmacologice
pentru tratarea infecțiilor cauzate de astfel de tulpini virulente (Wileset al., 2008).
Pseudomonas aeuginosa este o altă bacte rie foarte răspândită în toată lumea și este
considerată a fi în top 5 cauzatoare de infecții pulmonare, urinare, ale țesuturilor moi și care apar
în urma intervențiilor chirurgicale, unele dintre acestea putând chiar evolua în infecții cronice
sau chiar s epticemii (Trautmann et al., 2005; Sadikot et al., 2005). Celulele bacteriene prezintă
flageli și pili, secretă toxine și pot forma biofilme, factori importanți care contribuie la virulența
acestei tulpini bacteriene și care îngreunează tratamentele unor a stfel de infecții
(Kipnis et al., 2006). În plus, ca și în cazul celorlalți patogeni, se observă tot mai des apariția
fenomenului de rezistență la antibiotice care duce la o creștere a ratei de mortalitate asociată
infecțiilor cu P. aeruginosa (Schultz et al., 2002). De aceea, este important ca interesul
cercetătorilor să se focuseze pe descoperirea sau dezvoltarea de noi agenți terapeutici care să
combată mecanismele de virulență utilizate de această bacterie (Veesenmeyer et al., 2009).
Tot în categoria bacteriilor Gram negative patogene intră și genul Salmonella compus
dintr -o serie de specii aparținând genului Enterobacteriaceae ; există peste 2500 de serotipuri
patogene . Toate speciile acestui gen secretă endotoxine care circulă sistemic și pot cauza
pneumonie, meningită, osteomielită sau chiar febra tifoidă, precum și febrele paratifoide A, B
sau C; dar pot cauza și infecții localizate, precum toxiinfecții alimentare sau enterite , boli care au
ca simptome febra, durerile abdominale, diareea, greața și v oma (Ghețeu, 2011 ;
Takem et al., 2014 ).
Genul Salmonella este cel mai des întâlnit în ape, precum cea din canalizare, coaste
marine sau apa din soluri contaminate ( Baudart et al., 2000 ), astfel de medii le permit celulelor
bacteriene să reziste pe perioade lungi de timp, fiind un risc pentru oameni și animale
(Martinez -Urtaza et al., 2004 ). Pentru a putea supraviețui, aceste bacterii suferă o serie de
modificări genetice și fenotipice precum modularea expresiei unor gene în condiții de stres
osmotic, căldură, frig, mediu acid, stres oxidativ, dar și modificări ale m orfologiei sau
metabolismului. A daptări asemănătoare permit tulpinilor din genul Salmonella să
supraviețuiască în tractul i ntestinal în condiții de pH scăzut, nivel de oxigen scăzut sau stres
osmotic ( Chowdhury et al., 1996; Foster, 2005; Dhiaf et al., 2010 ).

21
Se cunoaște că bacteriile din genul Salmonella pot rămâne viabile în sol la 20 -30 șC până
la peste 900 zile, iar în co ndiții propice se dezvoltă cu ușurință (Eamens et al., 2006). Mai
periculos este însă faptul că aceste bacterii pot trece din sol în legume și pot determina infecții
după consum (Brandl, 2006), dintre motivele care au dus la o astfel de situație amintim
schimbarea climatică, temperaturile ridicate și seceta ; acestea fiind principalele cauze ale
internalizării celulelor bacteriene de către frunzele verzi (Lui et al., 2013).
Alte bacterii patogene de interes clinic îl reprezintă cele din genul Staphylococcus , coci
Gram pozitivi, din care amintim S. aureus , o bacterie patogenă producătoare de coagulază – o
endotoxină puternică, și S. epidermidis , o bacterie coagulaz -negativă care se găsește în mod
natural la nivelul tegumentelor și mucoaselor umane, dar care p oate deveni patogenă în anumite
condiți i, generând conjunctivite, dermatite sau infecții ale dispozitivelor medicale în spitale
(Ghețeu, 2011 ; Sarathbabu et al., 2013 ).
Staphylococcus aureus este una din cele mai cunoscute bacterii patogene la ora actuală,
ea fiind întâlnită în cazuri pornind de la infecții minore ale pielii și până la infecții grave ale
rănilor sau infecții port -operatorii. Ceea ce face această bacterie să fie foarte periculoasă este
faptul că dezvoltă foarte rapid rezistență la antibiotic e, primul caz de acest tip fiind înregistrat la
numai doi ani dup ă introducerea penicilinei în p ractica medicală (Lowy et al., 2003). Mai mult,
în ultimii 45 de ani, au fost semnalate tulpini meticilin -rezistente în spitale din întreaga lume, iar
incidența acestor cazuri este în continuă creștere. În plus, începând din anii ”90 s -au raportat
astfel de tulpini de S. aureus care produc toxina Panton -Valentine leukocidin (PVL) și sunt
foarte virulente, răspândi ndu-se rapid în comunitate, în centrele de îngriji re precum spitale, azile,
etc. ( Kim și Park, 1998; Deurenberg și Stobberingh, 2008).
O altă problemă generată de prezența tulpinilor de Staphylococcus aureus meticilin
rezistente în mediile spitalicești o reprezintă pneumonia declanșată de acest ea, în prop orție de
30-50% din toate pneumoniile asociate spitalelor, în special dobândite în urma utilizării
ventilatoarelor medicale (Kollef et al., 2005). Persoanele cele mai susceptibile la astfel de infecții
sunt copiii cu fibroză chistică, cei care sunt în recu perare după o infecție cu virusul influenza, cei
care au suferit arsuri severe, precum și cei spitalizați pe perioade lungi de timp, în special dacă
sunt intubați și ventilați mecanic (Gonzalez et al., 2003). Astfel, pneumonia cauzată de această
bacterie G ram pozitivă este relativ frecvent întâlnită în mediile spitalicești și are o rată de
mortalitate ridicată, de aceea este necesară ținerea sub strictă supraveghere a focarelor de astfel
de infecții și căutarea continuă de noi tratamente (De la Calle et al. , 2016). Un studiu referitor la
sinergia dintre extracte vegetale și antibiotice rezistente la antibiotice a demonstrat că extractul

22
etanolic din Colocasia esculenta potențează acțiunea gentamicinei împotriva unei tulpini
rezistente de S. aureus (Jency et al., 2015).
Staphylococcus epidermidis este bacteria oportunist patogenă cea mai întâlnită în
infecțiile spitalicești deoarece formează biofilme cu ușurință pe suprafața imp lanturilor sau a
dispozitivelor medicale precum catetere le (Otto, 2014). Biofilmul este o structură ce conferă o
mai mare toleranță la antibiotice, dar și la acțiunea răspunsului imun al gazdei (Yao et al., 2005).
Formarea de biofilme, precum și răspândirea la scară tot mai amplă a infecțiilor cu
S. epidermidis a condus la apariția tulpinilor rezistente la antibiotice precum meticilină (75 -90%
din cele izolate în spitale), aminoglicozide, tetracicline, cloranfenicol sau clindamicină
(Diekema et al., 2001; Rogers et al., 2009). Mai mult, s -a descoperit că S. epi dermidis poate să
transfere gene către S. aureus , astfel de fenomene pot duce la creșterea rezistenței acestor
bacterii, ducînd la apariția de tulpini bacteriene tot mai dificil de îndepărtat, fiind o reală
amenințare (Otto, 2009). Un studiu recent a demon strat că vancomicina și teicoplanina sunt
ineficiente în a combate biofilmele formate de S. epidermidis , distrugerea lor fiind posibilă doar
prin combinarea celor două antibiotice cu rifampicină (Claessens et al., 2015).
Rezistența la antibio tice este o si tuație neplăcută, tot mai răspândită în lume , care prezintă
variații populaționale și geografice majore . Cel mai adesea, sunt întâlnite rezistenț a la peniciline,
fluorochinolone , trimetoprim și β -lactamaze, dar și la nitrofurantoin sau cefalo sporine
(Wise, 2002) . Un exemplu în acest sens îl constituie China, unde se întâlnesc frecvent tulpini de
Escherichia coli producătoare de β-lactamaze căpătând astfel rezistență la amoxicilină ( 25%),
ciprofloxacină (75%) sau acid clavulanic (70%). A nual, peste 150 milioane de oameni
contractează infecții ale tractului urinar și aproape 50% di n femei suferă cel puțin odată în viață
de o astfel de complic ație (Qiao et al ., 2014) .
Pentru a combate această rezistență s -au încercat diverse metode de modificare a
structu rii moleculare pentru a prelungi acțiunea agenților antibacterieni precum inhibitori ai non –
nucleozid revers transcriptazei, sinteza de noi compuși din clasa β -lactamazelor și a
quinolonelor . Cu toate acestea, este tot mai crescută nevoia de a dezvolta noi clase de compuși
care să aibă o altă țintă la nivel bacterian, de aceea atenția se îndreaptă spre alți compuși naturali
în afară de antibiotice, precum flavonoidele care posedă o gamă largă de proprietăți
farmacologice (Cushnie și Lamb, 2005) .
Tulpini le patogene capătă rezistență la antibiotice pe două căi: genetică sau fenotipică . Pe
cale genetică , rezistența se poate dobândi prin apariția unor mutații la nivel cromozomial care
determină sinteza de proteine cu structur ă diferită ce nu mai constituie țintă pentru antibiotice,

23
sau poate fi transferat ă, gena de rezistență fiind dobandită prin transfer orizontal prin conjugare,
transformare sau transducție . În acest caz, informația genetică este integr ată în plasmide,
integroni sau transpozomi . Rezistența dobândită pe cale fenotipic a presupune formarea de
persisterii bacteriene . Practic, o parte din bacterii își opresc creșterea atunci când se află în faza
de log atunci când sunt exp use la antibiotice, iar antibioticele nu își mai pot exercita efectul e. În
plus, biofilmele bacteriene protejează celulele prin creșterea rezistenței la fagocitoză și a
modificării expresiei unor factori de virulență (Marcusson, 2007; Strahilevitz et al ., 2009) .
S-a observat că unul dintre cele mai comune mecanisme de rezistență este activarea
pompelor de eflux din membrana plasmatică (Mallea et al ., 1998), iar combaterea acestui
fenomen se realizează prin utilizarea unor inhibitori ai pompelor de eflux . Dezavantajul acestora
îl reprezintă slaba lor activitate asupra b acteriilor Gram negative, protejate de o membrană
externă (Blot et al ., 2007) . De aceea, interesul cercetătorilor s -a mutat către compuși naturali, din
plante, care să crească sensibilitatea microorganismelor la antibiotice . O astfel de plantă este
Helichr ysum italicum , originară din insula Corsica, al cărei extract a fost testat în combinație cu
cloramfenicol asupra Enterobacter aerogenes ATCC 13048 și Pseudomonas aeruginosa PAO1,
determinând o scădere a concentrației minime inhibitorii de 8, respectiv 5 o ri; ducând la
concluzia că în extract se găsește un inhibitor natural al pompelor de eflux bacteriene
(Lorenzi et al ., 2009) . Există chiar termenul de ”non -antibiotice” – substanțe naturale utilizate în
controlul unor boli și infecții care s -a demonstrat că au capacitatea de a modifica permeabilitatea
celulară și care au o activitate antimicrobiană largă in vitro asupra numeroase microorganisme .
Unele dintre acestea pot să potențeze acțiunea unor antibiotice sau de a crește susceptibilitatea
unor microorganisme rezistente la unele medicamente ineficiente anterior
(Kristiansen și Amaral, 1997) .
Un alt exemplu de activitate sinergică între antibio tice și extracte vegetale îl constituie
combinațiile de ciprofloxacină, septrină și ampicilină cu extract alcoolic din
Ocimum gratissimum , o plantă asiatică utilizată atât în gastronomie, cât și în medicina
tradițională pentru tratarea bronș itei, a infecț iilor cutanate sau a conjunctivitelor (Iwu, 1993) . S-a
demonstrat că extractul din O. gratissimum potențează efectul antibioticelor cu până la 66 .67%
(Nweze și Eze, 2009) .
În ultimii ani, unii cercetători consideră că în ultimii ani s -au dezvoltat o serie de produse
bazate pe substanțe denumite generic ”nutraceutice”, compuși non -farmaceutici care au efecte
benefice asupra sănătății umane și se referă în general la cei care sunt extrași din surse naturale
precum plantele și care prezintă unele avantaje faț ă de medicamentele de sinteză – acționează
într-o manieră mai blândă și pot ținti simultan mai multe mecanisme fiziologice, efectele lor

24
asupra sănătății fiind sustenabile și de durată (Schmitt și Ferro, 2012). Cu toate acestea, utilizarea
concomitentă a m edicamentelor de sinteză și a preparatelor pe bază de plante trebuie
monitorizată cu atenție și studiată amănunțit deoarece unele studii semnalizează efecte adverse
potențial periculoase (toxicitate renală sau hepatică, brahicardie, reacții inflamatorii cu fibroză a
organelor interne), în special atunci când se urmează tratamente cu anticoagulante sau
medicamente antiagregante plachetare. Plantele cu acțiune antibacteriană nu fac nici ele excepție,
unele din ele având acțiune antagonică cu unele antibiotice , situații care trebuie descoperite și
evitate (Posadzki et al., 2012 ; Teschke et al., 2012 ).
2.3 COMPUȘI NATUR ALI BIOLOGIC ACTIVI DIN PLANTE
Datorită interesului crescut din ultimele decenii în ceea ce privește compușii biologic
activi d in plante, s -au stabilit bazele științifice privind efectele a numeroase plante medicinale,
dar și utilizate în gastronomie de sute de ani; s -a descoperit ce substanțe conțin acestea și modul
lor de acțiune . Astfel, la ora actuală, există o serie de studii care confirmă c eea ce omenirea a
cunoscut în mod empiric de secole, ba mai mult, se pare că unii compuși naturali potențează
efectele medicamentelor de sinteză, reducând astfel dozele necesare pentru tratament și, implicit,
și efectele secundare ce pot apărea .
Dintre su bstanțele naturale eficiente în medicină amintim polifenolii, care sunt metaboliți
secundari din plante , având rol de apăra re față de diverși factori de stres , printre care și patogenii .
Denumirea acestei clase de compuși provine din limba greacă: „polus”= mulți, de unde sufixul
„poli”, iar „fenol” este structura chimică formată prin atașarea la un inel benzenic (fenil) a unei
grupări hidroxil ( -OH) (Pandey și Rizvi, 2009) . În sens mai larg, polifenolii aparțin compușilor
denumiți generic fitochimicale, substanțe ne -nutritive produse de către plante pentru a se proteja
de diferite aversiuni , dar care se pare că sunt efici enți în tratarea unor diferite boli ale oamenilor .
Dintre fitochimicalele de interes pentru uz terapeutic amintim triterpenoizii, flavonoid ele,
alcaloizii, polifenolii, , taninuri, etc . Ca mecanisme de acțiune, t aninurile și polifenolii se leagă
de proteinele bogate în prolină interferând astfel cu sinteza proteică la nivelul celulei bacteriene,
proces ce duce la moartea celulară . Pe de altă parte, f lavonoidele pot forma complexe cu proteine
extracelulare și din peretele celular, complexe care precipită și împiedică proteinele respective să
își exercite acțiunea fiziologică (Biswas et al ., 2013) .
S-a observat că persoanele care consumă cantități mari de fitochimicale dezvoltă mai
puține boli cronice și complicații ale acestora , cum ar fi francezii care consumă vin roșu în mod
regulat, popoarele din Orient care beau zilnic ceai verde sau cei din regiuni le mediteran eene care
folosesc ulei de măsline pentru prepararea hranei (Khurana et al ., 2013 ). Organizația Sănătății

25
Mondiale arată că peste 80% din populația globului utilizează plante medicinale pentru tratarea
unei game largi de afecțiuni deoarece au la bază compu și naturali ce sunt biodegradabili,
non-narcotici, au efecte secundare puține, sunt ușor de procurat și accesibili din punct de vedere
financiar (Shrestha et al ., 2013) .
Dintre polifenolii cel mai larg răspândiți menționăm acizii clorogenic, cafeic și ga lic; dar
și epigallocatechin -galatul, quercitina sau rutina, compuși ce au efecte bene fice pentru sănătate,
fiind recomandat consumul lor zilnic . Alimente bogate în polifenoli sunt : murele, ceapa,
pătrunjelul, mărul, strugurii, ceaiul verde , cireșele, vinul roșu, merișoarele , căpșunile, zmeura ,
sucul de portocale, prunele , făina de soia , etc. (Cassidy et al ., 2000; Hollman și Arts, 2000) . S-a
demonstrat că astfel de polifenoli prezintă proprietăți antimicrobiene, iar consumul lor este
preferabil pentru tratamentul infecțiilor și a altor maladii deoarece scade substanțial riscul
apariției de efecte secundare așa cum se întâmplă în cazul antibioticelor (reacții de
hipersensibilitate sau imunosupresia ). În țările în care medicamentele de sinteză sunt difici l de
procurat , infecțiile cauzate de bacterii, fungi sau virusuri reprezintă o amenințare puternică, iar
tratamente le pe bază pe plante sunt o alternativă importantă , acestea fiind ieftine și ușor de
procurat ( Daneshmand et al., 2013) .
O multitudine de plante cunoscute în medicina tradițională își exercită efectele prin
intermediul acțiunii polifenolilor, dar studiul mecanismelor de acțiune ale acestora s -a adâncit în
ultimele decenii, ca dovadă fiind faptul că între 1981 -2007 peste jumă tate din medicamentele
scoase pe piață conțin produși naturali, cum ar fi fenoli, flavonoide, saponine, lactone, etc .
(Farias et al ., 2013) . În plus, unii autori consideră că unele flavonoide din plante sunt active la
nivel nanomolecular, fiind chiar mai p uternice decât vancomicina sau tetraciclina ( Fabricant și
Farnsworth, 2001 ). Studiul Zhang et al ., 2013 a demonstrat că, din 58 de plante tradiționale
chinezești studiate, 30 au avut activitate antimicrobiană semnificativă, unele dintre ele chiar și
împotr iva Candida albicans . 8 plante au prezentat atât acțiune antibacteriană cât și fungică; iar
dintre cele 30 cu acțiune semnificativă antibacteriană, 15 inhibă și dezvoltarea fungilor
C. albicans și Aspergillus baumannii .
Extract ul din rădăcină de valeriană ( Valeriana jatamansi ) este utilizat în medicina
naturistă ca antispasmodic, afrodisiac, expectorant , tranchilizant, antiseptic, sedativ, pentru
tratarea înțepăturii de scorpion sau a mușcăturii de șarpe ; dar și ca laxativ, pentru tratarea unor
boli de piele, a arsurilor, a roșului în gât sau ulcere lor. Studiile recente au demonstrat că acest
extract conține monoterpenoizi de tip iridoid cu grupări epoxi, precum și acid isovaleric , iar
extractul metanolic din riz om posedă cantități considerabile de polifenoli și flavonoide
(257 mg/g QE, 187 mg/g GAE) (Thusoo et al ., 2014) .

26
Numeroase plante de interes datorită conținutului de polifenoli sunt chiar cele care se
întâlnesc în gospodării, precum: Zea mays (porumbul) c e conține acid ferulic, acid clorogenic,
acid cafeic, morină, rutină, naringenină, quercitină, kaempferol (Ramos -Escudero et al ., 2012),
Lactuca sativa (salata verde) care posedă efecte pozitive asupra sănătății datorită conținutului de
quercitin -3-glicozid , acid clorogenic, carotenoizi , vitamine, și fibre (Cheng et al ., 2014) sau
Amelanchier alnifolia Nutt. (pom de stafide), arbust din familia Rosaceae înrudit cu murele , care
are fructe comestibile , dulci, care conțin cantități important e de polifenoli ( avicularină,
quercitină , acid clorogenic, rutină, acid 5 – feruloilquinic, acid 3 – feruloilquinic), calciu, mangan,
potasiu, fier, cupru , magneziu și caroten (Jurikova et al ., 2013) .
Rezistența tot mai crescută a patogenilor la acțiunea antibiotice lor reprezintă o problemă
stringentă, necesitatea identificării de noi compuși cu activitate antimicrobiană fiind acum mai
mare ca oricând (Afsharzadeh et al ., 2013) . În acest sens , se pune accent ul pe studi erea
proprietăților antibacteriene ale polifenolilor, demonstrate pe un număr mare de plante, cum ar fi
trifoiul ( Eugenia caryophyllata ) care prezintă uleiuri esențiale ce au activitate antimicrobiană
ridicată și care sunt utilizate ca antiseptice împotriva infecțiilor orale, precum și compuși fenolici
ce denaturează proteine le, blochează fosfolipidele de membrană sau modifică permeabilitatea
membranei, fenomen ce duce moartea celulelor bac teriene (Nunez și Aquino, 2012) sau henna
(Lawsonia inermis ) care conține fenoli, terpenoide, carbohidrați , taninuri și quinone și care s -a
demonstrat că exercită acțiuni inhibitorii asupra dezvoltării unor bacterii precum E. coli ,
S. aureus , S. epidermidis sau P. aeruginosa (Gull et al., 2013) .
Extracte din frunze sau fructe de guava (Psidium guajava ) au ef ecte antibacteriene
împotriva E. coli (Biswas et al ., 2013); fructe le de Caryocar brasiliense (pequi), folosit în
medicina tradițională pentru bronșită, a tusei sau tratarea rănilor, a durerilor musculare și
reumatice conțin vitamina A, acizi grași: acidul palmitic, miristic, oleic, stearic, palmitoleic,
linoleic, linolenic; precum și terpenoizi: carotenoizi și polifenolii: acid galic, acid quinic și
quercitină (Amaral et al ., 2014) . Tot un extract din fructe, de data aceasta aparținând speciei
Passi flora ligularis s-a dovedit că posedă activitate antibacteriană și antifungică importantă,
comparativă cu cea a medicamentelor de sinteză (Saravanan și Parimelazhagan, 2014).
De asemenea, studii recente au demonstrat că extractele metanolic și etanolic di n
Hypericum husifusum (pojarniță prostrată), o plantă larg răspândită în Europa și utilizată în
medicina tradițională pentru a trata inflamațiile sunt bogate în polifenoli și flavonoide și au
activitate antibacteriană împotriva unor tulpini patogene precum S. aureus, E. coli sau S.
typhimurium (Toiu et al., 2016).

27
Un studiu din 2013 privind cantitatea de polifenoli conținută de către unele plante
aromatice a arătat că extractele în etanol obținut e din Thymus vulgaris , Salvia officinalis sau
Origanum mojar ana posedă între 4 .65 și 7 .30 mg GAE/g (Roby et al ., 2013) . Desigur, aceste
cantități pot varia semnificativ, în funcție de specia studiată, de perioada de recoltare sau de
metoda folosită la extracție . De exemplu, Matricaria pubescens , o plantă deșertică, conține
71.8 mg GAE/g în extractul etanolic și 78 .5 mg GAE/g în cel acetonic; precum și o serie de
alcanoizi, taninuri, saponine sau steroizi . Această plantă a dovedit o activitate antimicrobiană
semnificativă împotriva Escherichia c oli KB 349, Staphylococcus aureus ATCC 25932 și
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, extractele obținute în etanol și metanol fiind cele mai
eficiente pe toate cele trei tulpini (Metrouh -Amir et al ., 2015) .
Există și alte plante folosite în gastronomie car e au o activitate antimicrobiană
demonstrată, cum ar fi scorțișoara, ros marinul sau oregano, acesta din urmă s -a demonstrat chiar
că ar putea constitui o bază pentru un produs cu activitate neuroprotectoare (Kordali et al ., 2008 ;
Gird et al., 2016 ), iar pr ocedeul de extracție influențează activitatea antimicrobiană . De exemplu,
coaja de scorțișoară și uleiul esențial hidrodistilat au activități antibacteriene și antifungice
diferite (Singh et al, 2007) . În plus, extractul în hexan poate fi eficient deoarece hexanul este un
compus nepolar care poate interacționa cu alți compuși nepolari, obținându -se astfel o cantitate
mai mare de uleiuri esențiale decât în extractele apoase sau etanolice (Thangson et al ., 2004) . De
asemenea, Thymus vulgaris (cimbru) , o plant ă utilizată în gastronomie și medicina tradițională,
s-a demonstrat că prezintă thimol și carvacrol – compuși fenolici cu activitate antiseptică ,
antispasmodică și antimicrobiană, sau Piper nigrum (piperul negru) care are proprietăți
antimicrobiene datorat e compușilo r de tipul terpinene lor, α- și β-pinene lor, linaleol ului,
terpineol ului sau capsaicinei (Weerakkody et al., 2010; Zarringhalam et al ., 2013) .
Unii autori consideră că activitatea antimicrobiană a polifenolilor se datorează inactivării
enzimelor hidrolitice de către aceștia, enzime precum proteaze, carbohidrolaze, adezine
microbiene sau proteine transportoare, precum și că există o corelație între activitatea
antioxidantă, cea antibacteriană și cantitatea de polifenoli dintr -un extract (Shan et a l., 2007) . În
ceea ce privește determinarea activității antibacteriene a unui extract din plante, este o dezbatere
continuă între utilizarea metodei difuzimetrice și determinarea concentrației minime inhibitorii,
deoarece acestea pot da rezultate ușor dife rite datorită diferențelor de creștere a
microorganismelor pe mediu lichid sau solid, a timpului de expunere la extract, solubilitatea
extractului, tipul de emulsificator utilizat și cantitatea acestuia (Janssen et al ., 1987) .
Rezistența tot mai crescută a microorganismelor la antibiotice nu este singura problemă
cu care ne confruntăm, ci și rezistența acestora la conservanții utilizați în industria alimentară .

28
Acest lucru, combinat cu cererea tot mai mare de mâncare naturală, organică duce la nevoia
imper ioasă de a găsi noi surse naturale de substanțe antimicrobiene, iar unii autori și -au îndreptat
atenția către uleiurile esențiale din plante . Astfel, uleiul din fructele de Feronia limonia conține
peste 50 de compuși, precum timol, acid dodecanoic, α -piren , carvacrol sau acid camforic,
substanțe care fac acesta să fie active atât împotriva bacteriilor Gram negative, în special E. coli
și P. aeruginosa , a celor Gram pozitive, în special S. aureus și Bacillus pumillus , dar și asupra
fungului Aspergillus fumig atus (Senthilkumar și Venkatesalu, 2013) . În literatura de specialitate
există numeroase cazuri în care s -a dovedit că bacteriile Gram pozitive sunt mai susceptibile la
acțiunea diferitelor substanțe, probabil datorită faptului că prin membrana plasmatică a acestora
compușii antibacterieni pătrund mai ușor în interiorul celulei, chiar degradând această membrană
ceea ce determină scurgerea citoplasmei și/sau coagularea ei (Kalemba și Kunicka, 2013) .
Tot pentru combaterea rezistenței tot mai crescute la anti biotice a unui număr crescut de
microorganisme, s -au căutat compuși naturali care să potențeze acțiunea antibioticelor și s -a
demonstrat astfel că există polifenoli care au această capacitate, sau pot chiar să combată
rezistența naturală a bacteriilor la a ntibiotice (Gunics et al ., 2002) . O sinteză a studiilor de acest
tip sugerează că una din cea mai puțin explorată sursă de plante cu acțiune biologică importantă
sunt cele din Africa, un continent unde în continuare medicina tradițională este la mare căuta re,
iar studiile care s -au concentrat pe specii specifice zonelor respective au arătat că acestea au un
potențial ridicat de potențare a acțiunii antibioticelor (Aiyegoro și Okoh, 2009).
Sunt demonstrate și o serie de activități individuale ale unor po lifenoli cum ar fi
resveratrolul întâlnit în alune, struguri, fistic, mure sau merișoare (Baur și Sinclair, 2006) și care
reduce tensiunea arterială și viteza de agregare plachetară (Borriello et al., 2010) sau q uerticina ,
un flavonoid care s -a demonstrat că prezintă acțiune anti-virală împotriva virusul ui herpes
simplu (HSV), a poliovirus ului sau a virusul ui Sindbis (Selway, 1986); precum și o activitate
antibacteriană semnificativă împotriva Salmonella typhimurium (Dastidar et al ., 2004) sau
Escherichia coli (Hilliard et al ., 1995) .
Din flavonoi zii importan ți din punct de vedere al activității biologice amintim
kaempferol ul, care inhibă producția de oxid nitric prin scăderea expresiei mARN care cod ifică
iNOS (Rho et al ., 2011), scade riscul instalării unor ti puri de cancere, are efecte antivirale ,
antibacteriene, și antiinflamatorii ( Calderon -Montano et al ., 2011 ) și epigallocatechin 3-gallatul
care are acțiune antibacteriană, antioxidantă, interacționează cu proteine din membranele celulare
și cu fosfolipidele de la acest nivel, determinând activarea unor căi de semnalizare intracelulare
care pot duce la o intensificare a metabolismului lipidic, dar și la prevenirea unor boli cronice
precum cancer, diabet sau boli cardiovasculare . Acest flavonoid e ste important și datorită

29
faptului că este rapid absorbit la nivel intestinal de unde ajunge în plasmă nemodificat și poate fi
transportat către situsuri unde își poate exercita acțiunea biologică, un maxim de concentrație a
epigallocatechin 3-gallatului s e înregistrează după 0.5 ore de la ingestie și scade considerabil
după două ore (Tiwari et al., 2005; Rein et al., 2012; Kim et al., 2014) .
Acidul cafeic, întâlnit în aproape toate plantele, fiind intermediar în biosinteza ligninei,
este un antioxidant puternic in vitro și in vivo (Olthof et al ., 2001), are acțiune anti-tumorală (Li
et al., 2012) și antifungică (Harrison et al ., 2003). Acidul clorogenic, întâlnit în cireșe, kiw i,
cafea și mere (Manach et al ., 2004) este un agent antimicrobian cunoscut (Karaca, 2011),
antioxidant și anticarcinogenic (Kasai et al ., 2003), având în special efecte hipoglicemice și
hipolipidemice (Meng et al ., 2013) .
Mai mult, s -a demonstrat că polifenolii precum acizii cafeic, ferulic, cumaric sau
clorogenic au activitate antioxidantă, legând ionii din mediu datorită dublelor legături pe care le
posedă, dar au în structura lor și un inel benzenic care le permite să străbată membrana
plasmatică a celulelor bacteriene, unde își exercită activitatea antibacteriană prin interme diul
grupărilor carboxil și a inelelor fenil pe care le au în structură (Tonari et al ., 2002) . S-a observat
că acizii polifenolici sunt mai eficienți ca agenți antibacterieni decât precursorii lor monomerici
(catechine), probabil datorită lanțurilor latera le ale moleculelor acizilor polifenolici care le
facilitează pătrunderea în interiorul celulelor bacteriene (Cueva et al ., 2010) . În plus, dacă acizii
organici se află în stare ne -ionizată aceștia pătrund cu ușurință în interiorul celulei bacteriene,
unde disociază (pH neutru din interior este un mediu propice pentru acest fenomen), astfel scade
pH-ul din citoplasmă ceea ce creează dificultăți celulei . Pe de altă parte, compușii anionici
rezultați nu mai pot părăsi mediul intracelular, se acumulează și duc la o creștere a presiunii
osmotice care poate duce la moartea celulară (Karaca, 2001) . Mai jos, în figura 2 .1, este
prezentată o schemă a diferitelor moduri de acțiuni antibacteriene ale compușilor polifenolici .

30

Figura 2 .1: Mecanisme de acțiune ale compu șilor polifenolici
(după Raybaudi -Massilia et al ., 2009)
2.4 DESCRIEREA PLANTELOR UTILIZATE ÎN ACEST STUDIU
Mentha piperita (mentă) face parte din familia Lamiaceae , este o plantă larg raspândită în
toată lumea, cunoscută ca plantă aromatică și utilizată atât în preparate culinare, cât și în
medicina tradițională . Principiile active din frunze au acțiune bacteriostatic ă, antiseptic ă,
antidiareic ă, antireumatic ă, antispastic ă, sudorific ă, diuretic ă, sedativ ă, calmează colicil e
hepatobiliare, dar acționează și ca fortifiant al sistemului nervos și analgezic ușor. Mentolul
acționează antiemetic și antiseptic, iar compușii flavonici coleteric și colagog; taninurile
acționează antidiareic; iar acizii polifenolici acționează colagog și spasmolitic
(Meenatchisundaram et al, 2009; McKay și Blumberg , 2006 ).
Hyssopus officinalis (isop) este încadrat în aceeași familie ca și menta, Lamiaceae , este o
plantă de origine mediteraneană, dar a ajuns în culturile din România datorită proprietăților sale
medicin ale, culinare, dar și ornamentale . Planta este folosită în medicina umană în tratarea unor
afecțiuni hepatice, bronșite, astm bronșic, laringite, traheite, anorexie, hidropizie, tensiune
arterială, meteorism, ca sudorifică și cicatrizantă . O substanță poli fenolică din compoziția
frunzelor s -a dovedit activă față de virusul Herpex simplex (Ciulei și Istudor, 1995; Pârvu, 1997) .

31
Melissa officinalis (roiniță) este de asemenea din familia Lamiaceae , o plantă erbacee des
întâlnită în culturile din zo na de sud a României . Principala acțiune farmacodinamică este
spasmolitică și sedativă – elimină spasmele gastrointenstinale de origine nervoasă și constituie un
bun remediu în nevrozele cardiace . Este indicată în tratamentul gastropatiei funcționale (nevroză
gastrică ) și a distoniei vegetative . Determină și alte efecte: curăță organismul de toxine, elimină
balon ările abdominale prin expulzarea gazelor, stimulează eliminarea bilei în intestin,
favorizează digestia, stimulează secreția glandelor mamare la lehuze, favori zează p rocesul de
epitelizare și vindecare a rănilor (Pârvu, 1997; Moradkhani et al., 2010 ).
Fagus sylvatica (fag european) a parține familiei Fagaceae care cuprinde specii de arbori
de talie mare, originari din regiunile temperate și călduroase ale emisferei nordice . S-a raportat
utilizarea frunzelor de fag ca remediu pentru tratamentul febrei și diareei, precum și al unor boli
de piele, de ficat sau re spiratorii (Crăciun et al ., 1976) . Ca efecte biologice demonst rate științific,
se cunoaș te acțiunea antibacteriană a acestuia împotriva unor tulpini de Helicobacter pylori ,
precum și activități anticancerigene (Frederich et al ., 2009) , precum și acțiunea p uternic
antioxidantă a frunzelor de fag (Pirvu et al., 2010) .
Epilobium hirsutum (pufuliță cu flori mici) aparține familiei Onagraceae , este o plantă
des utilizată în medicina tradițională datorită conținuturilor sale ridicate de antociani, vitamina C,
aminoacizi esențiali precum fenilalanină, cisteină, valină, serină, leucină, dar și minerale și
microelemente ca magneziu, zinc, sulf, fosfor, cobalt, cupru (Pa rvu, 1997) . Mai multe specii
aparținând genului Epilobium au fost studiate și s -a demonstrat că ace stea au activități
antimicrobiene, anti -inflamatoare, analgezice, antioxidante (Pourmorad et al., 2007;
Kiss et al., 2009; Kosalec et al., 2013), nu sunt toxice și pot constitui chiar baze pentru preparate
cu proprietăți antiproliferative (Kiss et al., 20 04; Granica et al., 2014).
Arctium lappa (scai) face parte din familia Asteraceae și este o plantă răspândită în mai
multe continente, iar în unele regiuni asiatice rădăcinile sale sunt utilizate în alimentație ca
legume . Este o specie bogată în ca rbohidrați, proteine, vitamine și minerale (Chan et al ., 2011) .
Se cunosc proprietățile anti -inflamatoare ale fructelor de scai, precum și efectele hipoglicemice
și antioxidante ale rădăcinilor sale, iar mai recent s -a demonstrat că extractul din aceste ră dăcini
are efecte hepatoprotectoare, antiproliferative, hipolipidemice și antidiabetice, iar fructele sale ar
putea fi utilizate pentru prevenirea și tratarea obezității (Han et al., 2016; Ghafari et al., 2017;
Ahangarpour et al., 2017)
Juglans regia (nuc) face parte din familia Juglandaceae , este un arbore comun întâlnit în
zone din Balcani până în China . Frunzele sale sunt bogate taninuri, flavone, vitamina C, diverse
minerale și au fost utilizate în tratarea diabetului, dar și pentru tratarea inflamațiil or, ca

32
antiseptice, hipotensive, antisudorifice și cicatrizante . În plus, unele studii recente sugerează că
ar avea și acțiune antiproliferativă, extractul polifenolic putând fi utilizat ca agent de
chemoprevenție (Negi et al ., 2011; Pitschmann et al ., 201 4).
Agrimonia eupatoria (turița mare) aparține familiei Rosaceae și a fost utilizată în
medicina tradițională românească pentru tratarea unor infecții sau inflamații ale sistemului
digestiv, respirator și oculare, dar și al unor afecțiuni ale aparatelor ge nital și digestiv . Este o
plantă bogată în proantocianidine, catechine și agrimoniină, care s -a demonstrat că posedă
activitate antitumorală (Ad ’hiah et al ., 2013 ). De asemenea, această plantă este folosită în
medicina tradițională pentru prepararea de cea iuri recomandate pentru dureri în gât, iar un studiu
recent a demonstrat că o cură cu acest ceai poate îmbunătăți statusul oxidativ, starea de
inflamație și poate intensifica metabolismul lipidelor la adulții tineri (Ivanova et al., 2013).
Aronia melanoca rpa (scoruș negru) aparține familiei Rosaceae , este originar din America
de Nord, dar se cultivă și în zone precum Danemarca, Rusia sau Europa de Est și se folosește în
industria alimentară pentru obținerea de sucuri naturale, producerea vinului sau a unor coloranți
(Wu et al., 2004) . S-a raportat utilizarea acesteia în medicina tradițională pentru tratarea răcelilor
(Rousseau, 1947), iar mai recent s -a demonstrat activitatea semnificativ antioxidantă a fructelor
de Aronia (Kahkonen et al., 1999), precum și acțiunea protectoare acestei plante în unele boli
inflamatorii sau cardiovasculare (Lala et al., 2006; Bermudez -Soto et al., 2007). Scorușul negru
este o plantă care s -a demonstrat că posedă efecte antiproliferative și anticarcinogene împotriva
cancerului de colon (Olsson et al., 2004; Bagchi et al., 2004).
Artemisia dracunculus (tarhon) aparține familiei Asteraceae și este cunoscut pentru
compoziția bogată în uleiuri volatile, acesta fiind unul din motivele pentru care tarhonul a fost
folosit de secole at ât pentru prepararea mâncărurilor, dar și în medicina tradițională pentru
tratarea disfuncțiilor gastrointestinale în Asia și Rusia, iar recent s -a dovedit că are efecte
antidiabetice și hipoglicemice (Pischel et al., 2011). De asemenea, tarhonul a fost fo losit pentru
tratamentul palpitațiilor, al rănilor și vânătăilor, al reumatismului și artritei, precum și a unor boli
de piele sau ale cavității bucale, a gastritei sau dizenteriei. În plus, s -a demonstrat că poate crește
apetitul și are efecte anticonvuls ive (Khodzhimatov, 1989; Moerman, 2003; Sayyah et al., 2004).
Hippophae rhamnoides (cătină ) aparține familiei familiei Elaeagnaceae , este o plantă cu
o bogată istorie de utilizare î n medicina tradițională fiind cunoscută acțiunea antimicrobiană a
fructelor, semințelor și a frunzelor (Puuppopen -Pimia et al., 2001; Chauhan et al., 2007;
Upadhyay et al., 2011), extractele din semințe și rădăcini fiind mai active atât asupra bacteriilor
Gram negative, cât și Gram positive decât extractele din frunze sau stem. În plus, s -a demonstrat
că fructele și semințele de H. rhamnoides conțin compuși hidrofilici și lipofilici precum

33
flavonoide, acid ascorbic sau carotenoizi care le conferă proprietăți antioxidante
(Rosch et al., 2003). Pe lângă efectele antibacteriene, extractele din cătină prezintă proprietăți
neuroprotectoare în stresul oxidative indus asupra unor linii celulare ne urale, precum și acțiune
anticancerigenă împotriva unor linii de cancer hepatic, de sân sau de colon (Olsson et al., 2004;
Grey et al., 2010; Shivapriya et al., 2015).
Cydonia oblonga (gutui) este un arbore din familia Rosaceae , originar din regiunea
Cauca zului, cunoscut din Antichitate și folosit atât în gastronomie cât și în medicina populară
pentru proprietățile sedative, antipiretice, antidiaretice și antitusive, dar și pentru tratarea unor
boli de piele (Oliveira et al., 2007). Oliveira et al., 2008 au demonstrat că frunzele sunt mai
bogate în compuși fenolici decât fructele , iar perioada iunie -august este cea mai indicată pentru
recoltarea acestora pentru că atunci frunzele de gutui posedă cea mai mare concentrație de acizi
organici. Studii ceva mai re cente au demonstrat că fructele de gutui au potențial antioxidant,
antimicrobian și anti -ulcerativ; iar un studiu pe șoareci a arătat că extractul de gutui contribuie și
la scăderea nivelului de colesterol, trigliceride și LDL (Hanauzu et al., 2006;
Fatto uch et al., 2007; Silva et al., 2008; Umar et al., 2015).
Lythrum salicaria (răchitan) este o plantă din familia Lythraceae , răspândită în special în
Europa, dar și Asia, Africa, America de Nord și Australia și utilizată îndelung în medicina
tradițională, având efecte antitusive, bronhodilatatoare , anticoagulante, antimicrobiane,
antiinflamatoare, antioxidante sau hipoglicemice (Kahkonen et al., 1999; Tunalier et al., 2007;
Sutovska et al., 2012). Răchitanul are proprietăți astringente dovedite pentru mai m ulte părți ale
plantei: rădăcini, frunze și flori, iar compoziția bogată a acestora în polifenoli și flavonoide le -a
conferit acțiuni terapeutice împotriva hemoragiilor, a ulcerelor, a eczemelor, varicelor,
hemoroizilor sau a insuficienței venoase (Mantle et al., 2000; Rauha et al., 2000).
Helianthemum nummularium (trandafir de piatră) aparține familiei Cistaceae și este cel
mai adesea întâlnit în zonele din nordul Europei, dar există și unele specii ale acestei familii
indigene zonelor din jurul mării Mediteraneene (Bouzergoune et al., 2013). Trandafirul de piatră
a fost utilizat în special în industria parfumurilor, fiind bogat în uleiuri esen țiale precum cineol,
viridiflorol, a -pinene sau acetat de bornil (Viuda -Martos et al., 2011). În ceea ce privește
conținutul în polifenoli al acestuia, s -a demonstrat că acest trandafir conține în special derivați de
kaempferol și că extractele nepolare (î n eter, chloroform sau butanol) obț inute din diferite specii
ale genului Cistaceae posedă activitate antimicrobiană (Bouzergoune et al., 2013).

34
CAPITOLUL III
MATERIALE ȘI METODE
CHAPTER III
MATERIALS AND METHODS

3.1 OBȚINEREA EXTRACTELOR POLIFENOLICE ȘI
CARACTERIZAREA LOR
3.1.1 Materialul vegetal
Materialul vegetal utilizat în acest studiu a constat într -o serie de plante recoltate de pe
teritoriul României, județele Prahova și Ilfov, după cum urmează:
 frunze de Mentha piperita (mentă) ,
 partea aeriană (herba) de la Hyssopus officinalis (isop) ,
 partea aeriană (herba) de la Melissa officinalis (roiniță) ,
 frunze de Fagus sylvatica (fag european) ,
 partea aeriană (herba) de la Epilobium hirsutum (pufulița cu flori mici),
 frunze de Arctium lappa (scai) ,
 frunze de Juglans regia (nuc) ,
 partea aeriană (herba) de la Agrimonia eupatoria (turița mare),
 frunze de Aronia melanocarpa (scoruș negru ),
 tulpini de Artemisia dracunculus (tarhon) ,
 frunze de Hippophae rhamnoides (cătină) ,
 fructe de Cydonia oblonga (gutui) ,
 tulpini de Lythrum salicaria (răchitan)
 partea aeriană (herba) de la Helianthemum nummularium .
Încadrarea taxonomică a speciilor a fost realizată d e către echipa de biologi a Institutul ui
de Cercetări Chimico -Farmaceutice București .

35
Acest institut (ICCF) reprezintă cadrul instituțional în care au fost desfășurate majoritatea
experimentelor aferente acestei lucrări. Au fost implicate persoane din cadrul Departamentului
Farmacologie, Laboratorul de Microbiologie; Departamentul Biotehnologii Farmaceuti ce,
Laboratorul Plante; precum și din cadrul Departamentului Sinteze substanțe bioactive și
Tehnologii farmaceutice. De asemenea, o parte din testele de microbiologie au fost desfășurate în
cadrul Universității din București, Facultatea de Biologie, Depart amentul Biochimie și Biologie
Moleculară.
3.1.2 Obținerea extractelor vegetale utilizând diferiți solvenți
Studiile a diferite extracte vegetale s -a realizat în diferite serii: una în care s -au obținut
două extracte diferite: apos și etanolic din aceeași sursă vegetală , a doua serie în care s-a obținut
doar extractul etanolic pentru studiul preliminar și o a treia etapă în care din extractul etanolic
total au fost derivate trei fracții folosind solvenți diferiți .
În prima serie s -au utilizat trei surse vegetale ( Mentha piperita , Hyssopus officinalis ,
Mellisa officinalis ), iar extractele au fost obținute după cum urmează:
i) extractul apos: pregătirea extractelor s -a efectuat prin mojararea a 50 grame de
material vegetal uscat în prealabil peste care s -au adăugat 1000 ml apă distilată timp
de 2 ore la reflux cu agitare continuă . După răcire, la aproximativ 40șC, amestecul a
fost filtrat pr in pânză de filtru, iar extracte le astfel obținut e notate cu Ea .
ii) extract alcoolic: pregătirea extractelor s -a efectuat prin mojararea a 50 grame de
material vegetal uscat în prealabil peste care s -au adăugat 500 ml alcool etilic 70% și
care a fost ținut în două ture la temperatură ridicată timp de 30 minute, cu agitare
continuă . După răcire, la aproximativ 40 șC, a mestecul a fost filtrat prin pânză de
filtru, iar extractele astfel obținute notate cu Et .
În ceea ce privește a doua serie de extracte studiate, acestea au avut ca surse vegetale
speciile de Fagus sylvatica , Epilobium hirsutum și Arctium lappa și s-au rea lizat în modul
următor:
i) extract alcoolic: p regătirea extractelor s-a efectuat prin mojararea a 50 grame de
material vegetal uscat în prealabil peste care s -au adăugat 500 ml alcool etilic 70% și
care a fost ținut în două ture la temperatură ridicată timp de 30 minute, cu agitare
continuă . După răcire, la aproximativ 40 șC, amestecul a fost filtrat pri n pânză de
filtru, iar extractele astfel obținut e notate cu Etot .

36
ii) extract apos: 250 ml din extractul alcoolic inițial a fost concentrat la reziduu și apo i
dizolvat în 100 ml apă distilată, acestea fiind fracții apoase notate F ap.
iii) extract în cloroform : extractele apoase obținute anterior au fost apoi supuse unui
tratament cu cloroform (3 x 100 ml), timp de 24 ore, iar fracțiile finale notate F cl.
iv) extract î n acetat: ultima etapă de separare a compușilor, câte 100 ml Fcl au fost supuse
extracției cu etil acetat (3 x 100 ml), timp de 24 ore, obținând fracțiile finale, F ac.
În plus, pentru celelalte specii introduse în faza preliminară a testărilor : Juglans regia,
Agrinomia eupatoria, Aronia melanocarpa , Artemisia dracunculus , Hippophae rhamnoides ,
Cydonia oblonga , Lythrum salicaria și Helianthemum nummularium s-au obținut doar extracte
etanolic totale (Etot) .
Extractele astfel obținute au fost folosite pentru analiza cantitativă și calitativă, iar pentru
testar ea în ceea ce privește activitatea antimicrobiană și evita rea rezultate lor fals pozitive ,
solvenții din fiecare extract și fracție au fost îndepărtați prin distilare la presiune scăzută până la
sec. Reziduul obținut s -a reluat într -o soluție de polietilenglicol 20% astfel încât preparatul astfel
obținut să ajungă la o concentrație finală de 5 mg/ ml polifenoli exprim ați în echivalenți acid
galic (GAE) . De asemenea, polietilenglicolul a fost testat pe ntru a se demonstra că are activitate
antibacteriană și deci nu interferă cu rezultatele obținute.
3.1.3 Dozarea polifenolilor și identificarea lor
Această dozare s -a efectuat folosind metoda descrisă de Gonzalez et al . (2003) care
utilizează ca metodă reacția dintre compușii fenolici și reactivul Folin -Ciocâlteu, reacție care
determină formarea unui compus albastru între acidul fosfowolframic și polifenoli în mediu
alcalin, compus care este apoi densitometrat . Astfel, p este câte 3 alicoturi cu 50 -500 μL extract
s-au adăugat 100 μL reactiv Folin -Ciocâlteu și apoi amestecul a fost adus la un volum final de
2.5 ml cu o soluție de carbonat de sodiu 5% . Densitatea optică a amestecului de reacție s -a citit la
750 nm după 5 mi nute incubare la temperatura camerei . Concentrația totală de polifenoli s -a
determinat utilizând ca standard acidul galic, iar rezultatele au fost exprimate în mg echivalenți
acid ga lic (mg GAE) .
Pentru a determina tipurile de polifenoli prezenți în extrac tele studiate s-au utilizat două
metode:
 metoda HPLC folosind o coloană cromatografică din oțel inoxidabil având ca fază
staționară octadecilsilan, iar ca faze mobile s -au utilizat un amestec de acid fosforic/apă
pH=2 .5 și metanol, debitul fiind de 1ml/min , determinarea în UV la lungimea de undă

37
330 nm, temper atura cuptorului coloanei de 40 șC și un volum de injectare de 20 µl.
Probele vegetale au fost preparate astfel: peste 0 .5 grame pulbere s -au adăugat 40 ml
solvent (etanol/apă 50:50 V/V ), ultrasonificar e 30 min la 40 șC, apoi aduse la volum final
50 ml în același solvent și filtrate . După echilibrarea sistemului cromatografic, se
injectează soluțiile de referință (acid cafeic, acid clorogenic, acid rozmarinic,
luteolin a 7 glucozida, rutină, diosmină), iar ulterior soluțiile de interes . Conținutul în
componenții de interes se calculează după formula:
Component “i”, % = (Ap x Ce)/ Ae * G/50 * 100,
unde:
Ap : aria picului componentului “i” din solu ția probă ;
Ae : aria picului componentului “i” din soluția de referin ță;
Ce : concentra ția component ului “i” în soluț ia de referință (mg/ml);
G : cantitatea de component “i” luată în lucru , (mg);
50 : factor de corecție .
Această metodă a fost utilizată pentru caracterizarea extractelor apoase de Mentha
piperita , Hyssopus officinalis , Melissa officinalis .
 cea descrisă de Wagner și Bladt (1996) și Reich și Schibli (2008), prin cromatografie de
înaltă performanță în strat subțire (HPTLC) pe plăcuțe de Silica gel 60F254
(Camag, Elveția) . Pentru developare s -a folosit sistemul
etil acetat:acid acetic:acid formic:apă 100:12:12:26 (volume în ml), iar pentru
vizualizare s -a folosit Natural Product Reagent, constituit din două solu ții:
acid difenilboric 1%, urmat de aplicarea pe suprafața pl ăcuței a unei soluții de
polietilen -glicol 5% în etil acetat . Plăcile uscate au fost analizate și fotografiate la
366 nm în UV într -o cameră de foto -documentare CAMAG REPROSTAR 3 . Pe lângă
vizualizarea în UV a compușilor separați, s -a calculat și raportu l Rf = distanța parcursă
de un anumit compus/ distanța parcursă de solvent; raport care este specific și constant
pentru fiecare compus individual într -o anumită combinație de faze mobile și staționară .
Ca standarde s -au folosit o serie de substanțe de ref erință achiziționate de Sigma/Aldrich
precum: rutină, kaempferol , apigenină, cosmosiină, vitexină, apiină, acid clorogenic,
acid cafeic, acid galic și catechine sub formă de soluții 10-3 M. În linia de start s -au
încărcat câte 2 -5 μL probă .

38
Această metodă a fost utilizată pentru caracterizarea extractelor și fracțiilor obținute din
Fagus sylvatica , Epilobium hirsutum , Arctium lappa , Juglans regia , Agrimonia eupatoria ,
Aronia melanocarpa , Artemisia dracunculus , Hippophae rhamnoides , Cydonia oblonga,
Lythrum salicaria , Helianthemum nummularium .
3.2 ACȚIUNEA ANTIBACTERIANĂ A EXTRACTELOR VEGETALE
3.2.1 Întreținerea culturilor bacteriene și prepararea inoculului
Pentru creșterea și întreținerea tulpinilor bacteriene ( Escherichia coli ATCC 8739 ,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228,
Staphylococcus aureus ATCC 6538 , Salmonella tiphymurium ATCC 14028,
Salmonella enteritidis ATCC 13076 ) s-au folosit două tipuri de medii de cultură:
 mediu lichid, preparat după urmă toarea rețetă: peptonă 10 g, NaCl 5 g, extract de drojdie
3 g adus la volum final 1000 ml apă distilată;
 mediu agarizat , preparat după următoarea rețetă: peptonă 10 g, NaCl 5 g, extract de
drojdie 10 g și agar 20 g adus la volum final 1000 ml apă distilată
(Sanders, 2011) .
Sterilizarea acestora s -a realizat prin sterilizare umedă, în au toclav, la o temperatură de
121șC timp de 15 minute . Cu 24 de ore înainte de fiecare experiment s -a făcut un pasaj pe mediu
agarizat pentru împrospătarea culturii .
Inoculul bacterian se prepară proaspăt înainte de fiecare experiment în parte. Din cultura
bacteriană crescută pe mediu agariza t se prelevează cu ajutorul ansei sterile o cantitate suficientă
cât să se obțină o suspensie bacteriană de 108 unități formatoare de colonii (ufc)/ml în apă
distilată sterilă. Evaluarea concentrației de colonii din suspensie se face prin citirea densități i
optice a acesteia și se ajustează astfel încât să fie egală cu 0.5 conform standardului McFarland.
3.2.2 Evaluarea activității antimicrobiene prin metoda difuzimetrică
Această metodă presupune difuzarea substanțelor cu proprietăți antimicrobiene în mediu
de cultură agarizat care a fost inoculat anterior cu microroganismul -test. Inocularea se face cu
1 ml suspensie microbiană de concentrație 107 ufc/ml în 100 ml mediu de cultură agarizat pentru
a asigura o concentrație finală de 105 ucf/ml . După inoculare, mediul este turnat în plăci Petri
sterile, cu diametrul de 90 mm și se lasă câteva minute să se solidifice . Ulterior, peste mediu se
adaugă 4 cilindri de oțel în care se vor pipeta câte
200 μL extract polifenolic . Plăcile se incubează 24 h la 35 șC și apoi se măsoară diametrele

39
zonelor de inhibiție apărute (milimetri ), conform metodei descrise în Farmacopeea Română,
ediția X (capitolul IX .F.5). Rezultatele se exprimă după cum urmează:
 diametru < 8 mm – fără activitate;
 diam etru cuprins între 8 și 15 mm – activitate slabă;
 diametru cuprins între 15 și 20 mm – activitate moderată;
 diametru > 20 mm – activitate certă .
3.2.3 Determinarea concentrației minime inhibito rii prin metoda microdiluțiilor
CMI, sau concentrația minimă inhibitorie, este concentrația dintr -o substanță sau un
amestec de substanțe (cum este în cazul unui extract vegetal) care împiedică dezvoltarea unui
anumit patogen, iar pentru determinarea ei s -a utilizat o micrometodă, după cum urmează: în
plăci tip ELISA cu 96 godeuri s -au realizat di luții seriale ale extractelor pornind de la
2500 µg/ ml până la 156 .25 µg/ ml în mediu de cultură lichid peste care s -a adăugat suspensie din
cultura bacteriană (cultura fi ind pasată pe mediu solid cu 24 h înainte de efectuarea
experimentului) astfel încât să ajungă la o concentrație finală de 104-105 ufc/ml, iar a poi plăcile
au fost incubate 24 h la 35șC, după care densitatea opti că a fost determinată la 600 nm .
Această metodă a fost utilizată doar pentru 4 extracte etanolice totale: Fagus sylvatica ,
Epilobium hirsutum , Juglans regia și Agrimonia eupatoria ; au fost alese deoarece au prezentat
rezultatele cele mai bune în prima fază a testărilor, cea a metodei difuzimetrice .
3.2.4 Formularea a două preparate cu acțiune terapeutică/cosmetică
Din extractele obținute anterior și caracterizate din punct de vedere al conținutului în
polifenoli și al activității antibacteriene, patru au fost selectate pentru prepararea a două formule
active, fiecare combinând câte două extracte, după cum urmează:
 Formula 1 preparată din extractul cu efect antibacterian din partea aeriană sau herba de
pufuliță cu flori mici ( Epilobium hirsutum ) și extractul antioxidant din herba de răchitan
(Lythrum salicaria ). Pentru prepararea acestei formule se obțin în prima etapă extracte
din cele două specii vegetale aduse la o concentrație finală de 50 mg GAE/ml . Ulterior,
4 ml extract standardizat din Epilobium hirsutum se amestecă cu 1 ml extract standardizat
din Lythr um salicaria , obținând 5 ml preparat final ce conține polifenolii speciilor
vegetale în raport de 4:1 (g/g – v/v). Acest preparat , numit FORMULA 1, se adăug ă în
50 ml produs final de igi enă sau cosmetic ce va avea o concentraț ie de 5 mg GAE/ ml
produs fina l.
 Formula 2 combină două extracte: cel antimicrobian din frunze de brusture
(Arctium lappa ) cu cel antioxidant obținut din scoruș negru ( Aronia melanocarpa ).

40
Pentru obținerea acestei formule se prepară în prima etapă extracte din cele două specii
vegetal e aduse la o concentrație finală de 50 mg GAE/ml . Ulterior, 4 ml extract
standardizat din Arctium lappa se vor combina cu 1 ml extract din Aronia melanocarpa ,
obținând astfel 5 ml preparat final ce conține polifenolii speciilor vegetale în raport de
4:1 (g/g – v/v). Ace st preparat , numit FORMULA 2, se adăug ă în 50 ml produs final de
igienă sau cosmetic ce va avea o concentrație de 5 mg GAE/ ml produs final.
3.2.5 Determinarea acțiunii sinergice dintre extracte vegetale și antibiotice
În această etapă a st udiului, am ales două antibiotice disponibile comercial
(Sigma -Aldrich): oxacilină pentru testarea pe tulpinile Gram pozitive de Staphylococcus sp. și
ciprofloxacină pentru tulpinile Gram negative de Escherichia coli și Pseudomonas aeruginosa ;
dar și un a ntibiotic nou sintetizat de către o echipă de cercetători din cadrul Departamentului
„Sinteze substanțe bioactive și Tehnologii farmaceutice” din cadrul Institutul ui de Cercetări
Chimico -Farmaceutice București – un compus quinolonic (acid 8 -cloro -chinolin -carboxilic) cu o
plajă largă de activitate, care a fost testat atât pe tulpini bacterieme Gram pozitive, cât și
negative .
Pe scurt, un amestec de acid 1 -etil-6-fluoro -7-cloro -1,4-dihidro -4-oxochinolin -3-carboxilic,
piperazin și dimetil -sulfoxid au fost ți nute la 120 -130șC timp de 2.5h , iar apoi amestecul a fost
concentrat pentru a fi adus la sec. Produsul rezultat a fost dizolvat în hidroxid de sodiu 2N și apoi
precipitat la pH 7.2 folosind acid acetic 10% și apoi filtrat. Mai departe, produsul obținut a f ost
dizolvat în acid acetic 10% și adus din nou la pH 7.3 utilizând hidroxid de sodiu 2N, filtrat din
nou și apoi lăsat să cristalizeze în forma finală: norfloxacină (acid
1-etil-6-fluoro -7-(piperazin -1-il)-1,4-dihidro -4-oxochinolin -3-carboxilic) (Pintilie et al., 2016).
Pentru toate cele trei antibiotice a fost determinată concentrația minimă inhibitorie după
metoda descrisă anterior, iar apoi activitatea sinergică a fost testată cu ajutorul metodei
difuzimetrice descrisă în subpunctul 3 .2.2. Datorită diferențelor de exercitare a acțiunii între
testarea pe mediu lichid respectiv pe mediu agarizat, s -a realizat o evaluare inițială a mai multor
concentrații de antibiotic pe mediu agarizat pentru a se alege concentrațiile optime de lucru
pentru fi ecare antibiotic care să ducă la rezultate corespunzătoare prin utilizarea metodei
difuzimetrică.
Extractele vegetale alese pentru această etapă au fost Fagus sylvatica , Epilobium hirsutum ,
Juglans regia și Agrimonia eupatoria , iar pentru fiecare din ele s-au realizat trei di luții care
conțineau CMI a anti bioticului și concentrații diferite de polifenoli: 4.5 mg GAE/ml,
1 mg GAE/ml, respectiv 0.5 mg GAE/ml.

41
Deoarece pentru determinarea acțiunii antibacteriene a antibioticelor Farmacopeea Română
prevede o serie de modificări ale metodei difuzimetrice, am adaptat aceste cerințe la
antibioticele, respectiv culturile bacteriene, după cum urmează:
– pentru tulpinile Gram negative am utilizat tampon fosfat cu pH 6 pentru obținerea
soluțiilor stoc și a diluțiilor d e lucru, tampon preparat după rețeta: fosfat bipotasic 2 g și
fosfat monopotasic 8 g – volum final 1 litru;
– pentru tulpinile Gram pozitive am utilizat tampon fosfat cu pH 7 pentru obținerea
soluțiilor stoc și a diluțiilor de lucru, tampon preparat după reț eta: fosfat disodic 3.639 g
și fosfat monopotasic 7.139 g – volum final 1 litru;
– diferența majoră însă o constituie faptul că s -au utilizat două medii de cultură agarizate
pentru această testare, un strat inferior constituit din mediul de cultură utilizat pentru
testările anterioare, turnat în strat subțire în plăci fără a fi inoculat, și un strat superior
constituit din 5 ml de mediu inoculat – mediu VII (FR X) preparat după rețeta:
peptonă 15 g, acid glutamic 0.1 g, fosfat bipotasic 0.5 g, fosfat monopot asic 1 g,
clorură de sodiu 5 g, glucoză 5 g, agar 15 g la un volum final de 1 litru.

42
CAPITOLUL IV
REZULTATE
CHAPTER IV
RESULTS

4.1 CARACTERIZAREA EXTRACTELOR VEGETALE
Pentru primele trei specii luate în studiu, determinarea comp ușilor polifenolici s -a realizat
prin tehnica HPLC, iar cromatograma cu substanțele de referință utilizate este prezentată în
figura 4 .1.

Figura 4 .1: Croma togramă cu substanțele de referință în raport cu extractele vegetale din
speciile Mentha piperita , Hyssopus officinalis și Melissa officinalis
Figure 4 .1: Chromatogram with the references in relation to the vegetal extracts from
Mentha piperita , Hyssopus officinalis and Melissa officinalis
În studiul de față s -au utilizat frunze de Mentha piperita pentru obținerea extractelor
vegetale, iar rezultatele determinărilor calitative ale extractului obținut din acest ea este redat în
figura 4 .2.

43

Figura 4 .2: Cromatogramă cu extractul apos din Mentha piperita (mentă)
Figure 4 .2: Chromatogram of the aqueous extract from Mentha piperita (mint )
După cum se poate observa din figură, studiile noastre au demonstrat că extractul apos
prezintă polifenoli precum acidul clorogenic, acidul cafeic, acidul rozmarinic și diosmină.
Următoarea plantă luată în studie este isopul, de la care s -a recoltat partea aeriană , iar
compușii identificați în extractul apos sunt prezentați în figura 4 .3.

Figura 4 .3: Cromatogramă cu extractul apos din Hyssopus officinalis (isop)
Figure 4 .3: Chromatogram of the aqueous extract from Hyssopus officinalis (hyssop )
Figura aceasta confirmă faptul că extractul apos din isop conține acidul clorogenic, acidul
cafeic, aci dul rozmarinic și diosmină.
Rezultatele anaizei e xtractul apos din părțile aeriene ale roiniței sunt redate figura 4 .4.

44

Figura 4 .4: Cromatogramă cu extractul apos din Melissa officinalis (roiniță)
Figure 4 .4: Chromatogram of the aqueous extract from Melissa officinalis (lemon balm )
Dacă primele două surse vegetale studiate prezintă aceeași compuși fenolici, se pare că și
roinița respectă acest trend, în extract fiind identificați acid clorogenic, acid cafeic, acid
rozmarinic, diosmină și quercetină , cea din urmă reprezentând singura diferență majoră în ceea
ce privesște cele trei plante sudiate inițial.
Fagul european este prima sursă vegetală pentru care s -au obținut fracții apoasă, în
cloroform și în etil acetat, iar analiza calitativă a acestora, precum și a extractului etanolic total,
s-a realizat prin te hnica HPTLC descrisă anterior, rezultatele sunt prezentate în figur a 4.5.

Figura 4.5: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Fagus sylvatica (fag european ) (A1) precum și a fracțiilor (A2) (după Pirvu et al ., 2014)
Figure 4 .5: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Fagus sylvatica (European beech ) (A1) and its fractions (A2) ( after Pirvu et al ., 2014)

45
Benzile T1 și T3 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – rutină, acid clorogenic, apigenin -7-O-apiosilglucozid/apiin,
quercitin -3-O-galactozid/hiperozid, aci d rozmarinic și apigenină;
 T3 – rutină, vitexin -2”-O-ramnozid, luteolin -7-O-glucozid,
quercitin -3-O-ramnozid/quercitrină și quercitină .
 T2 – Etot frunze fag ; T2aq – fracția Eap, T2chl – fracția Ecl, T2ea – fracția Eac .
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al ., 1996), spoturile
albastru -fluorescent au fost atribuite derivați lor acizilor fenil -carboxilici precum acid ul
clorogenic (S1), acid ul neoclorogenic (S3), acizi isoclorogenici (S5, S6, S8, S9, S11) și acid ul
cafeic (S1 2), iar cele verzi sau albastre -verzi (S 5, S7, S10 ) evidențiază derivați ai apigeninei și ai
kaempferol ului. Spoturile fluorescente galben -portocalii (S2, S5 ) s-au atribuit derivaților
catechinici și quercitinici , iar S13 este quercitina .
În ce privește f racțiile separate, cea apoasă conține izomeri ai acidului cafeoquinic, iar în
fracția acetat sunt evidențiați derivați flavonoidici, însă fracția cloroform nu prezintă polifenoli .
Rezultatele determinărilor calitative referitoare la polifenolii prezenți î n extractele de
pufuliță și fracțiile obținute din extractul polifenolic din această plantă sunt redate în figura 4 .6.

Figura 4.6: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Epilobium hirsutum (pufuliță ) (A1), precum și a fracțiilor (A2) (după Pirvu et al ., 2014)
Figure 4 .6: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Epilobium hirsutum (great willowherb ) (A1) and its fractions (A2) ( after Pirvu et al ., 2014)

46
Banda T1 prezintă pol ifenolii utilizați ca standarde: rutină, acid clorogenic, acid cafeic;
iar T2 – Etot pufuliță ; T2aq – fracția Eap, T2chl – fracția Ecl, T2ea – fracția Eac .
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al ., 1996), celor cinci
spoturi roșu -portocaliu intens (S2”, S3, S5, S6, S7) le -au fost atribuiți derivați de miricetină ,
precum miricetin -3-O-ramnozid și miricetin -3-O-glucuronid; spotul verde albastru S2”’ relevă
kaempferol , iar cele trei spoturi indigo fluorescente (S1, S4, S8) și cel alb astru (S2’) au fost
atribuite acidului cafeic și unor derivați ai acidului galic .
În ceea ce privește fracțiile separate, se observă că partea apoasă prezintă kaempferol , iar
în fracția acetat sunt evidențiați derivați ai miricetinei, însă fracția clorofo rm nu prezintă
polifenoli .
Analiza profilului polifenolic al extractelor din frunze de scai sunt redate în figura 4 .7.

Figura 4.7: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Arctium lappa (scai) (A1) precum și a fracțiilor (A2) (după Pirvu et al ., 2014)
Figure 4 .7: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Arctium lappa (greater burdock ) (A1) and its fractions (A2) ( after Pirvu et al ., 2014)
Benzile T1 și T3 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – rutină, acid clorogenic, apigenin -7-O-apiosilglucozid/apiin,
quercitin -3-O-galactozid/hiperozid, acid rozmarinic și apigenină;
 T3 – rutină, vitexin -2”-O-ramnozid, luteolin -7-O-glucozid,
quercitin -3-O-ramnozid/quercitrină și quercitină ;

47
 T2 – Etot frunze scai ; T2aq – fracția Eap, T2chl – fracția Ecl, T2ea – fracția Eac .
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al ., 1996), spoturile
S2 –albastru fluorescent și S4 – maro -portocaliu au fo st atribuite acidului clorogeni c și
isoquercitinei, respectiv . Acestea sunt spoturile majore observate în cazul extractului etanolic
total.
Dacă urmărim fracțiile separate, se observă că acestea conțin derivați ai quercitinei (S1,
S3, S5), acoperite anterior de acizii polifenolici, derivați care au fost distribuiți între fracția
apoasă și cea acetat, iar fracția cloroform nu prezintă polifenoli .
În continuare, prezentăm rezutatele obținute prin analiza celorlalte extracte vegetale
obținute, extracte etanolice totale. În prima figură (4.8) este prezentată c ompoziția în polifenoli a
extractelor etanolice din frunzele de J. regia și din A. eupatoria .

Figura 4 .8: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Juglans regia (nuc) (T4-T9) și Agrimonia eupatoria (turiță ) (T10 -T15) (după Pirvu et al ., 2011)
Figure 4 .8: HPTLC chromatogram of the ethanolic extracts from Juglans regia (walnut ) (T4-T9)
and Agrimonia eupatoria (agrimony ) (T10 -T15) ( after Pirvu et al ., 2011)
După cum se observă , benzile T1 -T3 prezintă polifenolii utilizați ca standarde, după cum
urmează:
 T1-rutină, hiperozid și un amestec de acizi protocatechinici ;
 T2-rutină, acid clorogenic, hiperozid, luteolin -7-glucozid, vitexină și acid cafeic ;
 T3-rutină, acid cloro genic, cosmosiină și kaempferol.
În ceea ce privește frunzele de nuc, p ornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf
(Wanger et al ., 1996), s-au identificat după cum urmează: spoturile portocalii fluorescente
(S3, S5, S6, S7) sunt derivați ai quercitinei, cele verzi flu orescente (S4, S8) sunt derivați ai

48
apigeninei, iar cele două spoturi principale, albastre fluorescente (S1, S2) sunt atribuite
derivaților de acid ca feic. De asemenea, spotul S9 (al bastru închis fluorescent) este
corespunzător unui acid protocatechic .
Analiza compoziției turiței mari , pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf
(Wanger et al ., 1996), a dus la identificarea compușilor după cum urmează: spoturile portocalii
fluorescente (S1, S2, S3, S6, S9) sunt derivați ai quercitinei, cele galbene fluorescente (S5, S7)
sunt derivați ai luteolinei, spoturile albastre fluorescente (S4, S10, S12) sunt atribuite derivaților
de acid cafeic . De asemenea, spoturile S8 și S11 (albastru -verde fluorescent) sunt
corespunzătoa re unor derivați ai apigeninei .
Compoziția în polifenoli a extractului etanolic total (Etot) din frunzele de scoruș negru
este prezentată în figura 4.9.

Figura 4 .9: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Aronia melanocarpa (scoruș negru ) (după Pirvu et al., 2014)
Figure 4 .9: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Aronia melanocarpa (chokeberries ) (after Pirvu et al., 2014)
Benzile T2 și T3 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – Etot frunze scoruș negru ;
 T2 – rutină, acid clorogenic, vitexin -2”-O-ramnozid,
quercitin -3-O-galactozid/hiperozid, quercitină;
 T3 – hiperozid , quercitin -3-O-ramnozid/quercitrină .

49
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al ., 1996) , s-au identificat
în acest extract derivați ai quercitinei p recum rutină, hiperozid sau iso quercitină, dar și acizi
clorogenic și n eo-clorogenic, acid cafeic și kaempferol .
Compoziția în polifenoli a extractului etanolic total (Etot) din frunzele de tarhon este
prezentată în figura 4.10.

Figura 4 .10: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Artemisia dracunculus (tarhon)
Figure 4 .10: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Artemisia dracunculus (tarragon )
Benzile T1, T2 și T5 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – acid clorogenic;
 T2 – rutină, acid clorog enic, vitexină, quercitină;
 T3, T4 – Etot tulpini tarhon;
 T5 – rutină, apiin, acid clorogenic, acid rosmarinic și apigenină .
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al ., 1996) , am demonstrat
că extractul din herba de tarhon prezintă rutină (S1), acid clorogenic și isoclorogenic (spoturile
S2 și S 3), precu m și un derivat de kaempferol (S 4).
În continuare, prezentăm crom atograma obținută în urma analizei extractului de cătină
(figura 4.11).

50

Figura 4 .11: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Hippophae rhamnoides (cătină)
Figure 4 .11: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Hippophae rhamnoides (sea-buckthorn )
Benzile T1, T2 și T5 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – acid clorogenic;
 T2 – rutină, acid clorog enic, vitexină, quercitină;
 T3, T4 – Etot frunze cătină;
 T5 – rutină, apiin, acid clorogenic, luteolin 7 -O-glucozid și luteolin .
Studiile noastre au demonstrat că extractul de cătină posedă diverși compuși polifenolici,
care cei mai abundenți fiind derivați ai quercetinului (spoturile S1, S2, S4, S7 și S 11), dintre care
S7 este cu siguranță turină și S11 is oquercitrin; cel puțin 4 derivați ai apigenin ei (S8, S12, S13 și
S14), precum și derivați ai galo – și/sau el agi-taninurilor (spoturile S5, S 9, S10 și S 15).
Următoare figură, 4.12, prezintă compoziția în polifenoli a extractului din fructe de gutui .

51

Figura 4 .12: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Cydonia oblonga (gutui)
Figure 4 .12: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from Cydonia oblonga (quince )
Benzile T1 și T4 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – rutină, acid clorogenic, hiperozid, vitexină și quercetină;
 T2, T3 – Etot fructe gutui ;
 T4 – rutină, apiin, acid clorogenic, hiperozid, acid rosmarinic și apigenină.
În urma analizei HPTLC, în fructele de gutui s -au identificat 3 compuși principali –
derivați mono – și di -cafeoilquinic: acid clorogenic (S1), acid neoclorogenic (S 2) și
acid 3,5 -dicafeoilquinic (acid is oclorogenic) (S3).
Compoziția în polifenoli extractului de răchitan este redată în figura 4 .13.

52

Figura 4 .13: Evide nțiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Lythrum salicaria (răchitan )
Figure 4 .13: HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Lythrum salicaria (purple losestrife )
Benzile T1 și T2 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – rutină, vitexin -2”-O-ramnozid, quercitin -3-O-ramnozid/quercitrină și
quercitină ;
 T2 – rutină, acid clorogenic, apigenin -7-O-apiosilglucozid/apiin,
quercitin -3-O-galactozid/hiperozid, acid cafeic, acid rozmarinic și apigenină;
 T3 – Etot f runze răchitan .
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al ., 1996) , s-au identificat
în acest extract derivați ai luteolinei precum orientină, iso -orientină, dar și rutină, vitexină și
acid galic .
Compoziția în polifenoli extractul ui din trandafir de piatră este redată în figura 4.14.

53

Figura 4.14: Evidențiere prin HPTLC a compușilor din extractul etanolic de
Helianthemum nummularium (trandafir de piatră) (după Pirvu și Nicu, 2017)
Figure 4.14 : HPTLC chromatogram of the ethanolic extract from
Helianthemum nummularium (rock rose ) (after Pirvu și Nicu, 2017)
Benzile T1, T2 și T4 prezintă polifenolii utilizați c a standarde, după cum urmează:
 T1 – rutină, apigenin -8-C-glucozid/vitexină, acid protocatecuic și apigenină;
 T2 – quercitin -3-O-galactozid/hiperozid, apigenin -7-O-glucozid/cosmosiin,
acid rozmarinic și kaempferol;
 T3 – Etot herba trandafir de piatră;
 T4 – rutină, acid clorogenic, acid galic și acid cafeic.
Pornind de la relația dintre culoarea spotului și Rf (Wanger et al., 1996) , s-au identificat
în acest extract o serie de glicozide ale quercetinei – spoturile galben -portocalii fluorescente
(S1, S5, S6, S8, S9, S10, S 11), dintre care cei mai cunoscuți co mpuși sunt rutina și isoquercit ina.
De asemenea, spoturile ve rzi fluorescente (S2, S3 și S 4) au fost atribuite a trei derivați de
kaempferol, cel mai probabil kaempferol 3 -O-coumaroil glicozide, după cum e menționat și
datele de literatură (Bouzergoune et al., 2013). Nu în cele din urmă, spoturile S7 și S 12 au fost
atribuite acidului clorogenic și acidului galic, respectiv.

54
4.2 ACTIVITATEA ANTIBACTERIANĂ A EXTRACTELOR DIN PLANTE
4.2.1 Caracterizarea activității antibact eriene
După cum am menționat anterior, studiul de față a constat în mai multe serii de extracte,
iar în prima serie am analizat atât extracte etanolic e, cât și apoase din aceleași surse vegetale .
Extracte le au fost aduse la o concentrație finală de 5 mg GAE/ ml extract (echivalenți ai acidului
galic) și li s -a testat activitatea ant ibacteriană asupra două tulpini , una Gram negativă și una
Gram pozitivă, prin metoda difuzimetrică – metoda din Farmacopeea Română X – adaptată
pentru extracte vegetale . Rezultatele sunt redate în tabelul următor .
Tabel 4 .1: Rezultate activitate antibacter iană a extractelor din mentă, isop și roiniță
Table 4 .1: Antibacterial activity the extracts from mint, hyssop and lemon balm
Material vegetal Microorganism test Diametru zonă de
inhibiție (mm) Interpretare r ezultat
(conform FR X)
Mentha piperita –
extract etanolic (Et) Staphyococcus aureus 11.33±0 .577 Activitate slabă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Mentha piperita –
extract apos (Ea) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
Hyssopus officinalis –
extract etanolic (Et) Staphyococcus aureus 15 Activitate moderată
Escherichia coli <8 Fără activitate
Hyssopus officinalis –
extract apos (Ea) Staphyococcus aureus 11.33±0 .577 Activitate slabă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Melissa officinalis –
extract etanolic (Et) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
Melissa officinalis –
extract apos (Ea) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
După cum se poate observa din tabel, toate cele șase extracte sunt inactive pe
Escherichia coli , bacteria luată în studiu ca reprezentant al tulpinilor Gram negative însă
împotriva Staphylococcus aureus , reprezentant al celor Gram pozitive , două extracte prezintă
activitate slabă (mentă Et și isop Ea), iar isop Et are activitate moderată . Este interesant acest
rezultat deoarece, conform cromatogramelor obținute pentru extractele apoase, toate cele trei

55
extracte prezintă practice aceiași compuși (exce pția e ste roinița care conține în plus quercitină) ,
ceea ce sugerează că în extractul apos de isop există cel puțin un compus de altă natură care
contribuie la activ itatea antibacteriană a acestuia . Dintre extractele etanolice, tot cel de isop este
cel mai poten t împotriva S. aureus .
Deși testele noastre au arătat că extractul din Melissa officinalis nu este activ împotriva
celor două bacterii luate în studiu, Stefanovic și Comic, 2012 sugerează că adăugarea de extract
apos sau etanolic din roiniță în soluții de antibiotice (amoxicilină, streptomicină, tetraciclină sau
cloramfenicol) potențează acțiunea acestora, deși mecanismul prin care realizează acest lucru nu
sunt complet elucidate, se bănuiește că ar fi vorba de creșterea permeabilității membranei
celulare care facilitează influxul de antibiotic în interiorul celulelor bacteriene
(Sibanda și Okoh, 2007).
Pe baza acestor rezultate, am decis să continuăm cu extractele în etanol, acesta fiind
recomandat pentru capacitatea sa de a extrage polifenolii din surse vegetale.
Partea a doua a studiului a presupus obți nerea de extracte etanolice deoarece s -a ajuns la
concluzia că acestea sunt mai eficien te în a extrage polifenoli , fapt menționat și de alți autori
(Pop et al., 2008) . Extractele au fost analizat e calitativ de data aceasta prin HPTLC, iar
rezultatele testării activității antibacteriene ale acestora prin metoda difuzimetrică sunt prezentate
în tabelul 4 .2. În plus de aceste extracte etanolice totale, pent ru trei dintre ele s -au separat câte
trei fra cții: apoasă, în cloroform și în etil acetat .
Tabel 4 .2: Activitatea antibacteriană a extractelor vegetale studiate și a fracțiilor obținute
Table 4 .2: The antibacterial activity of the new vegetal extracts and some of their fractions
Material vegetal Micr oorganism test Diametru zonă de
inhibiție (mm) Interpretare r ezultat
(conform FR X)
Fagus sylvatica –
fracția apoasă (Fap) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
Fagus sylvatica –
fracția cloroform (Fcl) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
Fagus sylvatica –
fracția acetat (Fac) Staphyococcus aureus 12.66±0.577 Activitate slabă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Fagus sylvatica – Staphyococcus aureus 17±0 .10 Activitate moderată

56
extract etanolic total
(Etot) Escherichia coli 12±0 .10 Activitate slabă
Epilobium hirsutum –
fracția apoasă (Fap) Staphyococcus aureus 13.33±0 .577 Activitate slabă
Escherichia coli 15.66±0.577 Activitate moderată
Epilobium hirsutum –
fracția cloroform (Fcl) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
Epilobium hirsutum –
fracția acetat (Fac) Staphyococcus aureus 14.33±0 .577 Activitate moderată
Escherichia coli 15±0.15 Activitate moderată
Epilobium hirsutum –
extract etanolic total
(Etot) Staphyococcus aureus 17±0 .06 Activitate moderată
Escherichia coli 17±0 .15 Activitate moderată
Arctium lappa –
fracția apoasă (Fap) Staphyococcus aureus 11.66±0.577 Activitate slabă
Escherichia coli 12±0.15 Activitate slabă
Arctium lappa –
fracția chloroform
(Fcl) Staphyococcus aureus 16.33±0 .577 Activitate moderată
Escherichia coli <8 Fără activitate
Arctium lappa –
fracția acetat (Fac) Staphyococcus aureus 16.33±0 .577 Activitate moderată
Escherichia coli 15.66±0.577 Activitate moderată
Arctium lappa –
extract etanolic total
(Etot) Staphyococcus aureus 21±0 .29 Activitate certă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Juglans regia (Etot) Staphyococcus aureus 10.33±0 .577 Activitate slabă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Agrimonia eupatoria
(Etot) Staphyococcus aureus 10.33±0 .577 Activitate slabă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Aronia melanocarpa
(Etot) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate

57
Artemisia
dracunculus (Etot) Staphyococcus aureus 8±0.06 Activitate slabă
Escherichia coli 8±0.13 Activitate slabă
Hippophae
rhamnoides (Etot) Staphyococcus aureus 12±0 .15 Activitate slabă
Escherichia coli <8 Fără activitate
Cydonia oblonga
(Etot) Staphyococcus aureus <8 Fără activitate
Escherichia coli <8 Fără activitate
Lythrum salicaria
(Etot) Staphyococcus aureus 12±0 .05 Activitate slabă
Escherichia coli 8±0.16 Activitate slabă
Helianthemum
nummularium (Etot) Staphyococcus aureus 18.33±0 .577 Activitate moderată
Escherichia coli 15.33±0 .577 Activitate moderată
În această etapă a studiului , plante le din care s -au obținut extracte etanolice au
demonstrat activități variate, variind de la slabă la certă (scaiul împotriva S. aureus ). În ceea ce
privește activitățile extractelor etanolice totale (Etot), se pare că cel e mai potent e sunt cele
obținut e din Epilobium hirsutum și Helianthemum nummularium, ce prezintă activitate m oderată
împotriva ambelor tulpini testate .
În ceea ce privește conținutul polifenolic al extractelor totale, se observă că cel e mai
potent e extract e împotriva S. aureus , scaiul și trandafirul de piatră , sunt singure le care conțin
isoquercitină, iar fagul , pufulița și trandafirul de piatră prezintă diferiți derivați ai flavonoidelor
(derivați de quercitină, kaempferol sau miricetină) care aparent conferă extractelor activitate
moder ată împotriva bacteriei Gram poz itive.
Împotriva bacteriei Gram negative se observă că doar 3 extracte prezintă activitate slabă
(Fagus sylvatica ) sau moderată ( Epilobium hirsutum și Helianthemum nummularium ), un număr
considerabil mai mic decât împotriva bacteriei Gram pozitive. Dintre acestea, e xtractul etanolic
total din pufulița cu flori mici (Etot) este cel mai eficient asupra Escherichia coli , probabil
datorită conținutului mai mare de acizi polifenolici și derivați ai acestora, compuși care au
capacitatea de a pătrunde prin difuzie în interiorul celulelor bacteriene unde afectează activitatea
unor enzime implicate în metabolism ul bacterian , precum proteaz e sau carbohidrolaze .
Deși aci zi polifenolici sunt menționați în literatura de specialitate ca fiind posibil
responsabili pentru acțiunea antimicrobiană în special asupra ba cteriilor Gram poz itive, este
interesant de menționat că în cazul studiului de față, cele trei extracte care prezintă preponderant

58
acizi polifenolici ( Aronia melanocarpa, Artemisia dracunculus și Cydonia oblonga ) nu au
activitate împotriva niciunei tulpini testate, ceea ce ar putea duce la concluzia că sunt necesare și
flavonoide care conlucrează cu acești acizi pentru a duce la inhibarea creșterii bacteriene.
Celelalte specii vegetale studiate, Juglans regia , Agrimonia eupatoria , Hippophea
rhamnoides și Lythrum salicaria sunt active doar împotriva speciei ba cteriene Gram positive
Staphylococcus aureus , ceea ce sugerează că polifenolii conținuți de aceste extracte nu pot să
ajungă în interiorul celulelor bacteriene Gram negative, care sunt protejate de o membrană
externă absentă la cele Gram pozitive. În cazul celor patru specii amintite, se observă că toate
conțin în special flavonoide de tipul quercitinei, apigeninei, orientinei și derivați ale acestora și
în număr redus acizi fenolici, cei din urmă fiind cei care pot să interacționeze cu fosfolipidele
membra nare și să determine dezintegrarea membranei pentru a permite pătrunderea compușilor
cu acțiune antibacteriană în citoplasmă.
Fracțiile obținute prin prelucrarea ulterioară a extractelor etanoli ce duc la concluzii
interesante; unele dintre ele nu posedă d eloc activitate antibacteriană, deși extractele totale aveau
activitate împotriva unei anumite tulpini . Aceste cazuri sunt utile pentru identificare a
polifenolilor care acționează de fapt asupra bacteriilor, căci prin extracții succesive cu solvenți
diferi ți, se separă compușii polifenolici, în funcție de polaritate . De exemplu, în cazul fagului,
două dintre fracții – apoasă și cloroform – nu au activitate împotriva celor două tulpini luate în
calcul, colaborând aceste rezultate cu cele de HPTLC se poate de duce că izomerii acidului
cafeoquinic din fracția apoasă nu prezintă activitate antibacteriană în cazul de față . Dar cea de -a
treia fracție – în acetat, care conține derivați flavonoidici – a dus la formarea unei zone de
inhibiție mai mică decât extractul inițial total . Acest lucru este foarte important deoarece
sugerează existența unor mecanisme de acțiune sinergice între polifenolii dintr -un anumit
extract .
Al doilea set de fracții separate din extractul inițial, cazul pufuliței cu flori mici, arată clar
că fracția în cloroform nu are activitate antibacteriană asu pra celor două tulpini bacteriene luate
în studiu, dar celelalte două își păstrează activități asemănătoare cu cele ale extractului etanolic
total, de 13 până la 15 mm, față de aproximativ 17 mm în cazul extractului total. Acest lucru
confirmă faptul că atât componentele fracției apoase, cât și ale fracției în etil acetat au activitate
antibacteriană, dar cele mai bune rezultate se obțin totuși în momentul în care compușii din cele
două fracții lu crează împreună.
Mai interesant însă este cazul scaiului ( Arctium lappa ) deoarece extractul total nu posedă
activitate împotriva bacteriei Escherichia coli , dar atât fracția apoasă, cât și cea acetat – ambele
conținând derivați de quercitină au dus la formarea unor zone de inhibiție de 12, respectiv

59
15.5 mm, ceea ce ar putea sugera o acțiune antagonică între acești derivați de quercitină și acidul
clorogeni c prezent în extractul total inițial .
O parte din rezultatele prezentate în acest tabel au fost publicate în articole științifice,
precum cele legate de activitatea extractului din frunze de fag (Nicu et al., 2016), a extractului
din herba de turiță mare (Pirvu et al., 2016) și, nu în ultimul rând, rezultatele obținute în urma
testării extractului din trandafirul de piatră (Pirvu și Nicu, 2017). Testele pe extractul polifenolic
din Fagus sylvatica au sugerat că acest amestec, bogat în acizi fenolici, își e xercită acțiunea
antibacteriană prin inducerea stresului oxidativ la nivelul celulelor bacteriene, fapt demonstrat
prin creșterea activității unor enzime precum catalaza, superoxid dismutaza sau glucozo -6-fosfat
dehidrogenaza (Nicu et al., 2016). Polifenol ii au în componența sa diferite structuri chimice care
pot reacționa complet opus în funcție de mediul în care se găsesc, de concentrația or și mai ales
de grupările pe care le posedă, uneori având chiar activități asemănătoare unor enzime (amin
oxidaza sa u lizil oxidaza) ceea ce îi face să devină prooxidanți (Akagawa și Suyama, 2001).
Referitor la cele nouă fracții diferite testate în acest studiu, se observă că fracțiile
cloroform – cele care nu conțin polifenoli – nu sunt în general active asupra bacter iilor, dar se
păstrează tendința observată anterior, bacteriile Gram pozitive fiind mai susceptibile la acțiunea
antibacteriană a fracțiilor testate .
În plus, fracțiile acetat care conțin diferiți deriva ți flavonoidici precum miricetina sau
quercitina sunt cele mai active împotriva celor două tulpini bacteriene, ceea ce sugerează faptul
că acești compuși au activitate antibacteriană semnificativă, dar singuri au o activitate ușor
redusă față de extractele totale inițiale, probabil datorită unor acțiuni sinergice între aceste
substanțe și acizii polifenolici prezenți în amestecul inițial .
Ulterior, după stabilirea și reconfirmarea faptului că etanolul este solventul cel mai potent
în a extrage polifenoli, am retestat patru dintre extracte ( Fagus sylvatic a și Epilobium hirsutum ,
Juglans regia și Agrimonia eupatoria ) asupra a șase tulpini bacteriene standard (ATCC) : două
Gram pozitive aparținând genului Staphyococcus și patru tulpini Gram negative aparținând
genurilor Escherichia , Pseudomonas și Salmonella , iar rezultatele sunt prezentate în tabelul
următor .

60
Tabel 4 .3: Activitate a antibacteriană a 4 extracte polifenolice împotriva a 6 tulpini bacteriene
Table 4 .3: The antibacterial activity of 4 polyphenolic extracts against 6 bacterial strains
Material vegetal Microorganism test Diametru zonă de
inhibiție (mm) Interpretare r ezultat
(conform FR X)
Fagus sylvatica –
extract etanolic
total (Etot) Staphyococcus aureus 17±0 .10 Activitate moderată
Staphylococcus epidermidis 29.33±0.577 Activitate certă
Escherichia coli 12±0.10 Activitate slabă
Pseudomonas aeruginosa 12.33±1.15 Activitate slabă
Salmonella tiphymurium 13.33±0.577 Activitate slabă
Salmonella enteritidis 13.33±0.577 Activitate slabă
Epilobium
hirsutum – extract
etanolic total (Etot) Staphyococcus aureus 17±0 .06 Activitate moderată
Staphylococcus epidermidis 17.66±0.577 Activitate moderată
Escherichia coli 17±0 .15 Activitate moderată
Pseudomonas aeruginosa 18.33±0.577 Activitate moderată
Salmonella tiphymurium 14.66±0.577 Activitate slabă
Salmonella enteritidis 17.33±0.577 Activitate moderată
Juglans regia –
extract etanolic
(Etot) Staphyococcus aureus 10.33±0 .577 Activitate slabă
Staphylococcus epidermidis 16±0.16 Activitate moderată
Escherichia coli <8 Fără activitate
Pseudomonas aeruginosa 11±0.1 Activitate slabă
Salmonella tiphymurium <8 Fără activitate
Salmonella enteritidis 11±0.1 Activitate slabă
Agrimonia
eupatoria – extract
etanolic (Etot) Staphyococcus aureus 10.33±0 .577 Activitate slabă
Staphylococcus epidermidis 15±0.16 Activitate moderată
Escherichia coli <8 Fără activitate
Pseudomonas aeruginosa <8 Fără activitate

61
Salmonella tiphymurium <8 Fără activitate
Salmonella enteritidis <8 Fără activitate
Rezultatele noastre confirmă încă odată faptul că extractele etanolice polifenolice din
plante sunt mai eficiente împotriva tulpinilor bacteriene Gram pozitive (în medie zone de
inhibiție de 15 -17 mm), față de cele împotriva tulpinilor Gram negative (11 -13 mm), excepție
făcând Epilobium hirsutum care a determinat zone de inhibiție de aproximativ 17 mm asupra
tuturor celor 6 tulpini testate . Ca maxime, se remarcă extractul total din scai care a format o zonă
de 21 mm împotriva S. epidermidis și extractul de fag cu o zonă de 29 mm asupra aceleiași
tulpini bacteriene .
Ca studiu comparativ, merită menționat că deși mai devreme am arătat că derivații
flavonoidici posedă activitate antibacteriană, se pare că ei nu sunt suficient de potenți, cele două
extracte care conțin predominant astfel de compuși, frunzele de nuc și herba de turiță , având în
general activități antibacteriene scăzute față de frunzele de fag și herba de pufuliță, care pe lâ ngă
flavonoide , conțin și o serie de acizi și derivați ai acizilor fenolici precum acid clorogenic,
neoclorogenic sau cafeic . Aceste rezultate confirmă încă odată posibilitatea unei acțiuni sinergice
între diferitele grupe de polifenoli .
Merită menționat faptul că trei dintre e xtracte posedă activitate slabă sau moderată
împotriva a cel puțin una din cele două tulpini de Salmonella luate în studiu, acest lucru fiind
important pentru că aceste specii bacteriene prezintă un real pericol pentru societate deoarece
dezvoltă rapid rez istență la antibiotice, pot supraviețui în medii aspre și nedescoperite la timp pot
evolua repede către septicemii. Ceea ce este de asemenea important este că cele două extracte cu
acțiune împotriva celor două specii de Salmonella (fag și pufuliță) conțin proporții aproximativ
egale de acizi fenolici și flavonoide (precum acizi cafeic, clorogenic, galic sau neoclorogenic;
derivați de kaempferol, miricetină, apigenină sau quercitină), în timp ce turița și nucul conțin
majoritar flavonoide, iar acizii cloroge nic și derivații săi sunt absenți. Aceste obse rvații
sugerează faptul că aceș ti acizi au un rol esențial în inhibarea dezvoltării bacteriilor din genul
amintit.
În ceea ce privește susceptibilitatea tulpinilor bacteriene la acțiunea extractelor
polifenolice, se remarcă faptul că bacteria cea mai sensibilă este Staphylococcus epidermidis , pe
testele asupra acestuia s -a obținut cel mai bun rezultat din toat ă lucrare a, o zonă de inhibiție
determinată de extra ctul din frunze de fag de 29 mm, dar și celelalte trei extracte prezintă
activitate moderată împotriva acestei tulpini. S. epidermidis este o bacterie care este condiționat
patogenă, dar care este des întâlnită în cazurile infecțiilor dobândite în urma unor transplanturi

62
sau a implanturilor (Otto et al. 2009), iar conceperea de noi preparate cu acțiune terapeutică de
combatare a acestor infecții ar putea avea un impact major asupra tratamentelor acestor tipuri de
infecții.
Toate aceste rezultate sugerează încă odată că plantele din flora indigenă pot fi utilizate
ca surse de noi compuși cu acțiune antibacteriană, iar pe viitor ar putea continua studiile pe
tulpini diferite de bacterii, dar și pentru a încerca să se determine mecanismul de acțiune al
acestor extracte .
4.2.2 Determinarea concentrației minime inhibitorii
În continuare, pentru aceleași patru extracte testate în cea de -a treia etapă a l ucrării de
față, am determinat concentrația minimă inhibitorie împotri va a două tulpini Gram negative și
două tulpini Gram pozitive, pentru o mai bună înțelegere a efectelor acestor extracte, precum și
evidențierea unor posibile concentrații de lucru pentru posibile formule cu acțiune terapeutică .
Rezultatele determinărilor CMI sunt redate în tabelul de mai jos .
Tabel 4.4: Concentrația minimă inhibitorie a extractelor vegetale studiate
Table 4 .4: The minimum inhibitory concentrations of some of the vegetal extracts studied
Material vegetal Microorganism test Concentrație minimă inhibitorie
(µg polifenoli /ml extract )
Fagus sylvatica – extract
etanolic total Staphyococcus aureus 156.25
Staphylococcus epidermidis 156.25
Escherichia coli 625
Pseudomonas aeruginosa 2500
Epilobium hirsutum –
extract etanolic total Staphyococcus aureus 156.25
Staphylococcus epidermidis 625
Escherichia coli 625
Pseudomonas aeruginosa 312.5
Juglans regia – extract
etanolic total Staphyococcus aureus 312.5
Staphylococcus epidermidis 156.25
Escherichia coli 1250
Pseudomonas aeruginosa 312.5

63
Agrimonia eupatoria –
extract etanolic total Staphyococcus aureus 625
Staphylococcus epidermidis 625
Escherichia coli 1250
Pseudomonas aeruginosa 312.5
Ca observație generală, determinările CMI continuă tendința menționată anterior, și
anume aceea că bacteriile Gram pozitive sunt mai susceptibile la acțiunea polifenolilor, asupra
celor două obținându -se cele mai mici valori ale concentrațiilor minime inhibitorii . Cu toate
acestea, meri tă menționate câteva observații, pe care le vom detalia în continuare.
Extractul din frunze de fag are aceeași CMI pentru cele două tulpini Gram pozitive,
156.25 µg/ml , deși diametrele zonelor de inhibiție determinate inițial diferă substanțial (17 mm
asupra S. aureus , respectiv 29 mm împotriva S. epidermidis ). Trebuie menționat însă că această
concentrație este cea mai mică testată, astfel că CMI reală împotriva S. epidermidis ar putea fi
sub această valoare . În ceea ce privește bacteriile Gram negative, valorile mai ridicate ale CMI se
corelează cu diametrele reduse ale zonelor de inhibiție formate pe mediu agarizat .
Extractul din pufuliță este și aici cel cu valorile cele mai scăzute ale CMI, demonstrând
încă odată că este cel mai eficient agent antibacterian, aceste valori corelându -se liniar cu
valorile diametrelor zonelor de inhibiție , iar extractul din turiță este cel care prezintă valorile
CMI cele mai ridicate, deși merită menționată valoarea de 312.5 µg/ml împotriva
Pseudomonas aeruginosa , deși metoda difuzime trică nu a arătat activitate a acestui extract
asupra acestei bacterii.
În ceea ce privește ultimele două extracte, este interesant faptul că deși la unele
determinări difuzimetrice, acestea nu au avut activitate, în cazul celei de -a doua determinări s -au
obținut valori ale CMI reduse, de 312 µg/ml (frunze de nuc împotriva S. aureus sau turița
împotriva Pseudomonas aeruginosa ). Acest fapt s -ar putea datora imposibilității unor compuși
din cele două amestecuri de a migra în mediul agarizat, ei exercitându -și activitatea
antibacteriană doar în mediul lichid, unde interacțiunea polifenoli -celule bact eriene facilitată .
4.2.3 Formule active – acțiune antibacteriană și biologică
După cum am menționat anterior, cele două formule active sunt constituite din câte două
extracte vegetale, unul cu acțiune antibacteriană și unul cu efect antioxidant . Pentru a asigura
produse de calitate, cu a cțiune terapeutică/cosmetică, cele patru extracte vegetale luate în calcul
au fost testate din punct de vedere al activității antioxidante pe care o posedă și s -a ajuns la
concluzia că cele mai potente sunt extractele din răchitan și scoruș negru. De aceea , fiecare din

64
aceste extracte a fost utilizat ca ingredient pentru câte o formulă, alături de un extract cu acțiune
antibacteriană moderată sau certă dovedită (Bubueanu et al., 2016). În final, cele două produse
au fost condiționate astfel încât să fie uti lizate ca produse pentru igiena mâinilor, după cum se
poate observa în imaginea 4.1 5.

Figura 4.15 : Produse pentru igiena mâinilor
Figura 4.15 : Products for hand hygiene
Cele două formule au fost retestate prin metoda difuzimetrică pentru a confirma prez ența
activității antibacteriene, iar rezultatele acestor teste sunt prezentate în tabelul 4.5. În plus, pentru
întărirea rezultatelor, fiecare din cele două formule a fost pulverizată într-un spot pe suprafața
mediului de cultură inoculat anterior și în figurile 4.1 6 și 4.17 se pot observa cu ușurință zone
clare în mediu, zone unde a fost inhibată dezvoltarea bacteriană.
Tabel 4 .5 Activitatea antibacteriană a celor două formule active
Table 4 .5 The antibacterial activity of the two active formulas
Materi al vegetal Microorganism test Diametru zonă de
inhibiție (mm) Interpretare r ezultat
(conform FR X)
Formula 1 Staphylococcus aureus 13.66±0.577 Activitate slabă
Escherichia coli 12.33±0.577 Activitate slabă
Formula 2 Staphylococcus aureus 13.66±0.577 Activitate slabă
Escherichia coli 12.33±0.577 Activitate slabă

65
Se observă din acest tabel două evenimente interesante: în cazul primei formule, deși
activitatea antibacteriană este dovedită în continuare (fapt confirmat și de imaginile 4.1 6 și 4.17 ),
diametrele zonelor de inhibiție obținute sunt mai scăzute decât în cazul extractului din
Epilobium hirsutum de aproximativ 17 mm, ceea ce ar sugera o acțiune antagonică între
compușii constitutivi ai pufuliței (derivați de miricetină și acid galic, kae mpferol și acid cafeic) și
cei din extractul de Lythrum salicaria (orientină și iso -orientină, rutină, vitexină și acid galic) .
În cazul formulei active 2, cele două extracte luate individual nu prezintă activitate
împotriva bacteriei Gram negative Escher ichia coli , dar împreună duc la formarea unei zone de
inhibiție de aproximativ 12 mm, ceea ce sugerează o posibilă acțiune sinergică între cele două
componente ale produsului final : isoquercitina și acidul galic conținute de Arctium lappa
împreună cu kaemp ferol, rutină, acizi cafeic, clorogenic și neoclorogenic din alcătuirea
extractului din Aronia melanocarpa . Desigur, s-ar putea argumenta că ambele formule sunt
condiționate în alcool etilic 70%, dar acesta nu explică scăderea diametrelor zonelor de inhibi ție
împotriva Staphylococcus aureus .
Mai departe prezentăm rezultatele obținute în urma pulverizării celor două produse pe
suprafața mediului de cultură inoculat cu bacterii de interes: figura 4.16 – S. aureus și figura 4.17
– E. coli .

Figura 4.16 : Zone de inhibiție formate prin pulverizarea celor două produse pentru igiena
mâinilor asupra Staphylococcus aureus
Figura 4.16 : The inhibitions zones made by the pulverisation of the two products for hand
hygiene on Staphylococcus aureus

66
După cum se poa te observa din imaginea 4.16, cele două zone formate pe suprafața
mediului de cultură după pulverizarea produselor pentru igiena mâinilor se suprapun (în dreapta
imaginii a fost aplicată formula 1, iar în partea stângă formula 2), dar în orice caz, este ev identă
acțiunea antibacteriană a ambelor produse evidențiată în imagine printr -o zonă clară, acolo unde
a fost inhibată dezvoltarea bacteriană .

Figura 4.17 : Zone de inhibiție formate prin pulverizarea celor două produse pentru igiena
mâinilor asupra Esch erichia coli
Figura 4.17: The inhibitions zones made by the pulverisation of the two products for hand
hygiene on Escherichia coli
După cum se poate observa din imaginea 4.17, ambele produse formulate pentru igiena
mâinilor au activitate împotriva E. coli , fiind evidente zone de inhibiție (în dreapta imaginii a
fost aplicată formula 1, iar în partea stângă formula 2). Ca și în cazul S. aureus , se remarcă
zonele unde mediul este transparent, zone unde nu a crescut cultura bacteriană.
Deși prin metoda difuzimetrică, zonele de inhibiție rezultate în urma testării celor două
formule au fost relativ scăzute, aceste două imagini demonstrează fără dubiu acțiunea
antibacteriană a celor două produse; diametrele reduse se pot datora pot fi puse pe seama unor
compuși din extractele polifenolice care nu pot migra în agar, dar atunci când sunt în contact
direct cu mediul de cultură inoculat inhibă dezvoltarea bacteriană pe toata suprafața de contact.
4.3.4 Ac tivitatea combinațiilor di ntre polifenoli vegetali și antibiotice
Pentru această etapă a lucrărilor, am utilizat cele 4 extracte pentru care am determinat
concentrațiile minime inhibitorii în etapa anterioară. După cum am menționat, s -au utilizat

67
3 antibiotice, două disponibile comercial și unul sinteti zat în cadrul unui proiect de cercetare din
cadrul ICCF București.
Pentru fiecare antibiotic s -au realizat câte trei combinații cu fiecare extract vegetal, toate
combinațiile conțin o concentrație egală cu CMI a antibioticului împotriva bacteriei respecti ve și
o concentrație diferită de polifenoli vegetali: 4.5, 1 sau 0.5 mg GAE/ml. Am ales să testăm
diferite concentrații pentru a putea discerne cum anume aceasta influențează activitatea
antibacteriană a combinațiilor, mai exact cum anume concentrația de p olifenoli modifică
acțiunea antibioticelor.
4.3.4.1 Teste cu antibiotice disponibile comercial
Primul antibiotic testat a fost ciprofloxacina, un antibiotic cu o cunoscută acțiune
împotriva tulpinilor Gram negative , precum Escherichia coli și Pseudomonas a eruginosa .
Ciprofloxacina aparține grupului fluorochinolonelor și își exercită acțiunea antibacteriană prin
inhibarea ADN -topoizomerazelor, fenomen ce duce la moartea celulei bacteriene prin blocarea
procesului de supraspiralare a A DN. În studiul de față, CMI asupra E. coli și P. aeruginosa care
poate fi utilizată cu succes în testarea pe mediu agarizat a fost determinată ca fiind de 4 µg/ml,
iar această concentrație a fost utilizată ulterior în combinație cu diferite concentrații de
polifenoli.
Al doilea antibiotic utilizat a fost oxacilina, un antiobiotic larg utilizat pentru tratarea
infecțiilor determinate de bacteriile Gram pozitive deoarece are o a cțiune bactericid ă
degenerativă, blocând sinteza peretelui bacterian. În cadrul studiului nostru, CMI de terminat ca
fiin petrivit pentru utilizarea metodei difuzimetrice asupra Staphylococcus aureus și
Staphylococcus epidermidis a fost de 2 µg/ml, iar această concentrație a fost utilizată ulterior în
combinație cu diferite concentrații de polifenoli.
În figu ra 4.1 8 prezentăm rezultatele testării activității amestecurilor dintre ciprofloxacină
și extract din frunze de Fagus sylvatica asupra E. coli .

68

Figura 4 .18: Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din frunze de
fag asupra Escherichia coli
Figure 4 .18: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Escherichia coli
Legendă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Fag -D2 – 1 mg GAE/ml
+ 4 µg/ml CF; Fag -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
După cum se poate observa din figura 4.18, combinația dintre ciprofloxacină și extractul
polifenolic din frunze de fag prezintă o acțiune antagonistă, diametrul zonei de inhibiție obținut
în caz ul antibioticului fiind mai mare decât cele obținute în cazul combinațiilor de compuși
naturali și sintetic. De asemenea, această acțiune este evident una progresivă – cu cât
concentrația de polifenoli este mai mare, cu atât este mai evidentă blocarea acți unii
ciprofloxacinei.
În continuare, prezentăm rezultatele obținute în cazul combinațiilor dintre ciprofloxacină
și extractul polifenolic din frunze de fag împotriva Pseudomonas aeruginosa (figura 4.19).
0510152025
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și
ciprofloxacină pe E. coli

69

Figura 4 .19: Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din frunze de
fag asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .19: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Fag -D2 – 1 mg GAE/ml
+ 4 µg/ml CF; Fag -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
În cazul Pseudomonas aeruginosa se observă o diferență mai redusă între diametrul
obținut prin testarea extractulu i polifenolic și a antibioticului (12 mm, 18 mm respectiv), dar
tendința generală este tot către o scădere a acțiunii ciprofloxacinei în prezența polifenolilor din
frunza de fag, deși diferențele nu sunt la fel de accentuate precum în cazul testelor efectu ate pe
Escherichia coli. Se remarcă însă faptul că o concentrație mai ridicată de polifenoli conferă o
acțiune antibcateriană mai puternică decât cele reduse, exact opusul rezultatelor primului
experiment, ceea ce sugerează că există mecanisme de acțiune d iferite asupra bacteriilor diferite.
Următoarea tulpină bacteriană luată în studiu a fost Staphylococcus aureus , iar
antibioticul utilizat a fost oxacilina, un antibiotic de referință pentru bacteriile Gram pozitive.
Rezultatele sunt prezentate în figura 4.20.
02468101214161820
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și ciprofloxacină pe
P. aeruginosa

70

Figura 4.20 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din frunze de fag
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4. 20: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Fag -D2 – 1 mg GAE/ml
+ 2 µg/ml OX; Fag -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
Acesta este primu l caz în care acțiunea combinațiilor dintre antibiotic și polifenolii de
origine vegetală este una pozitivă, din grafic reieșind clar faptul că diametrele zonelor de
inhibiție obținute la testarea combinației de compuși sunt mai mari decât ale compușilor testați
separat. În plus, cu cât concentrația de polifenoli este mai mare, cu atât soluția testată este mai
potentă împotriva S. aureus .
Cea de -a doua tulpină bacteriană Gram pozitivă împotriva căreia s -au testat astfel de
combinații este S. epidermidis , iar rezultatele sunt prezentate în figura 4.21.
051015202530
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și oxacilină pe
S. aureus

71

Figura 4.21: Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din frunze de fag
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4. 21: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Fag -D2 – 1 mg GAE/ml
+ 2 µg/ml OX; Fag -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
În acest caz, asistăm la un fenomen foarte interesant: extractul din frunze de fag a dus la
formarea unei zone de inhibiție cu di ametru aproape dublu față de concentrația minimă
inhibitorie de oxacilină, iar în cazul combinațiilor dintre polifenoli și antibiotic, diametrele
zonelor cont inuă să scadă, această tendință este cea care a fost remarcată și în cazul celelilalte
specii de Staphylococcus studiată. Acest fapt sugerează faptul că extractul polifenolic din extract
de frunze de fag , la concentrații de peste 4.5 mg GAE/ml, este un adj uvant în terapia cu oxacilină
și ar putea fi chiar mai indicat pentru combaterea unei infecții incipiente cu Staphylococcus sp.
Următoarea sursă vegetală luată în studiu este pufulița, o plantă foarte răspândită în
România, iar rezultatele combinațiilor d intre extractul de Epilobium hirsutum și ciprofloxacină
împotriva E. coli sunt prezentate în figura 4.22.
051015202530
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și oxacilină pe
S. epidermidis

72

Figura 4.22 : Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din herba de
pufuliță asupra Escherichia coli
Figure 4. 22: Activ ity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
great willowherb extract against Escherichia coli
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 4 µg/ml CF; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
Ca și în cazul extractului de fag, din figura 4.22 reiese că și polifenolii obținuți din
prelucrarea pufuliței inhibă activitatea ciprofloxacinei, deși într -un grad mai scăzut. Probabil
acest lucru se datorea ză și faptului că diferența dintre acțiunea antibacteriană a extractului este
mai apropiată de cea a antibioticului în cazul pufuliței față de frunzele de fag. Este interesant de
menționat că la concentrația cea mai mare de polifenoli luată în studiu, acti vitatea este aproape
aceeași ca atunci când extractul este testat singur, ceea ce indică o inhibare majoră a acțiunii
antibioticului.
În continuare, prezentăm rezultatele obținu te în urma testării acelor ași combinații
împotriva Pseudomonas aeruginosa (figura 4.23).

0510152025
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și ciprofloxacină pe E. coli

73

Figura 4.23 : Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din herba de
pufuliță asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .23: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
great willowherb extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 4 µg/ml CF; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
După cum reiese din figura 4.23, activitatea ciprofloxacinei este asemănătoare cu cea a
extractului de pufuliță; ce este interesant însă e faptul că indiferent de concentrația de polifenoli,
combinațiile dintre cele două duc la scăderea semnificativă a acțiunii antibacteriene, până la
aproape jumătat e, ceea ce demonstrează fără dubiu că există mecanisme antagonice între
cirprofloxacină și compușii din extractul de pufuliță, precum miricetină, kaempferol sau acidul
galic .
Mai departe am testat combinații de polifenoli și oxacilină împotriva a două tu lpini Gram
pozitive: S. aureus (figura 4.24) și S. epidermidis (figura 4.25).

02468101214161820
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și ciprofloxacină pe
P. aeruginosa

74

Figura 4.24 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din herba de pufuliță
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .24: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the great
willowherb extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 2 µg/ml OX; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
Testele împotriva Staphylococcus aureus demonstrează că, deși zonele de inhibiție
obținute după testarea combinațiilor de polifenoli și antibiotic sunt ușor scăzute față de acțiunea
antibioticului singur, ele rămân în plaja de interpretare ”acti vitate certă” și am putea deci, afirma
că polifenolii extrași din E. hirsutum nu inhibă semnificativ acțiunea oxacilinei împotriva
S. aureus . Mai departe, prezentăm rezultatele obținute împotriva unei alte tulpini bacteriene
Gram pozitive, și anume Staphy lococcus epidermidis (figura 4.25).

0510152025
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și oxacilină pe S. aureus

75

Figura 4.25 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din herba de pufuliță
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4.2 5: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the great
willowherb extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 2 µg/ml OX; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
În cazul testării împotriva Staphylococcus epidermidis se observă din nou că extractul
vegetal este mai potent decât antibioticul, iar prin combinarea celor două este inhibată activitatea
antibacteriană doar atunci când se utilizează concentrații reduse de polifenoli
(1 mg, respecti v 0.5 mg GAE/ml). Aceste rezultate pot sugera aplicarea unui tratament unic în
cazul unei infecții, extractul vegetal putând fi utilizat fără restricții, riscul de reacții adverse fiind
minim.
Mai departe, trecem în revistă rezultatele obținute în urma te stării ciprofloxacinei în
combinație cu extract polifenolic din frunze de nuc, prima tulpină bacteriană luată în studi u fiind
Escherichia coli (figura 4.26).
024681012141618
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și oxacilină pe
S. epidermidis

76

Figura 4.26 : Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din frunze de
nuc asupra Escherichia coli
Figure 4 .26: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Escherichia coli
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Jugl-D2 – 1 mg
GAE/ml + 4 µg/ml CF; Jugl-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
În acest caz, extractul vegetal nu posedă acțiune antibacteriană împotriva
Escherichia coli , dar este evident că odată cu creșter ea concentrației de polifenoli vegetali scade
activitatea antibioticului. Acest fapt s -ar putea datora faptului că, odată pătrunși în celula
bacteriană, polifenolii se leagă de proteine intracelulare, posibil chiar și de ADN -topoizomeraze,
ținta ciprofloxa cinei. Astfel, antibioticul nu își mai poate exercita acțiunea bactericidă.
Deși în cazul de față, extractul etanolic din frunze de nuc nu potențează activitatea
ciprofloxacinei împotriva E. coli ATCC 8739, un alt studiu, care însă utilizează un extract apos
de scoarță de nuc, demonstrează că acesta duce la obținerea de diametre ale zonelor de inhibiție
mai mari a amestecurilor dintre extract și aztre onam, cefixim sau ampicilină împotriva unei
tulpini de Escherichia coli enteropatogenică, rezistentă la ma i acțiunea mai multor antibiotice
(Iqbal et al., 2013).
În figura următoare, 4.27 prezentăm datele obținute prin testarea combinațiilor între
extractul din frunze de nuc și ciprofloxacină împotriva Pseudomonas aeruginosa .

0510152025
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și ciprofloxacină pe
E. coli

77

Figura 4.27 : Testare activitat e combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din frunze de
nuc asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .27: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Jugl-D2 – 1 mg
GAE/ml + 4 µg/ml CF; Jugl-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
Și în acest caz, precum în unele întâlnite anterior, polifenolii și antibioticul se anulează
reciproc, deși prin corelarea acțiunii celor două se observă zone de inhibiție cu diametru mai
mare decât în cazul singular al polifenolilor din frunzele de nuc. Ca și oxacilina, ciprofloxacina
blochează activitatea unor proteine intracelulare bacteriene, iar legarea uno r polifenoli sau a
compușilor rezultatați în urma metabolismului acestora poate duce la dispariția situsurilor de
acțiune ale antibioticului.
În continuare, în figura 4.28 se poate observa modul de acțiune al frunzelor de nuc,
oxacilinei, respectiv a comb inațiilor dintre cele două împotriva S. aureus.
05101520
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și ciprofloxacină pe
P. aeruginosa

78

Figura 4.28 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din frunze de nuc
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .28: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Jugl-D2 – 1 mg
GAE/ml + 2 µg/ml OX; Jugl-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
Acesta este un caz cu rezultate pozitive, în sensul că prezența polifenolilor nu pare să
afecteze semnificativ acțiunea antibioticului, oxacilina exercitându -și activitatea prin blocarea
proteinelor implicate în formarea peretelui bacterian. Se observă în cazul frunzelor de nuc faptul
că indiferent de concentrația de compuși vegetali, zonele de inhibiție formate au diametre
aproximativ egale.
Figura următoare, 4.29, prezintă activitatea polifenolilor extrase din frunze de nuc și
oxacilină asupra S. epidermidis .
0510152025
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și oxacilină pe
S. aureus

79

Figura 4.29 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din frunze de nuc
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4 .29: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Staphylococcus epid ermidis
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Jugl-D2 – 1 mg
GAE/ml + 2 µg/ml OX; Jugl-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
Acesta este un caz evident de acțiune sinergică semnificativă , cele trei combinații de
polifenoli și oxacilină având activități mai puternice decât luate separat. Este interesant faptul că
cea mai mare zonă de inhibiție s -a înregistrat în cazul amestecului cu concentrația cea mai
scăzută de polifenoli, mai exact fla vonoide. S -ar putea deci deduce faptul că, cel puțin în acest
caz, ”less is more”, o cantitate mică de flavonoide fiind potrivită pentru a duce la potențarea
acțiunii oxacilinei împotriva tulpinii bacteriene S. epidermidis , o bacterie recent intrată în ari a de
interes a medicinei, dar care cel mai adesea cauzează infecții spitalicești post -implanturi.
Anterior, s -a demonstrat că extractul apos din scoarță de Juglans regia are activitate certă
împotriva Staphylococcus epidermidis și chiar potențează acțiune a unor antibiotice împotriva
acestei tulpini, în special a eritromicinei și a cloramfenicolului (Abidi et al., 2015), ceea ce
confirmă rezultatele noastre și subliniază importanța continuării studiiilor referitoare la acțiunea
antibacteriană a scoarței și a frunzelor de nuc.
Trecem acum la următoarea sursă vegetală studiată, și anume Agrimonia eupatoria ,
rezultatele obținute prin combinarea extractului din această plantă cu ciprofloxacina împotriva
Escherichia coli fiind redate în figura 4.30.
14,51515,51616,51717,5
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și oxacilină pe
S. epidermidis

80

Figura 4.30: Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din herba de
turiță asupra Escherichia coli
Figure 4 .30: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
agrimony extract against Escherichia coli
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Agr-D2 – 1 mg GAE/ml
+ 4 µg/ml CF; Agr-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
Aceste teste au relevat faptul că atât extractul de Agrimonia eupatoria cât și o cantitate
ridicată de polifenoli din aceasta împreună cu ciprofloxacină, nu prezintă acitivitate împotriva
bacteriei E. coli . Și în cazul în care s -au utilizat concentrații mai reduse de polifenoli, activitatea
antibacteriană este aproape înjumătă țită față de acțiunea antibioticului. Un astfel de rezultat este
foarte interesant, mai ales dacă avem în vedere conținutul extractului de turiță, acesta fiind
compus în principal de flavonoide și lipsind acizii fenolici precum clorogenic, neoclorogenic sa u
galic; se pare că această concentrație crescută de flavonoide competiționează pentru situsurile de
legare a ciprofloxacinei la nivelul proteinelor bacteriene.
Mai departe, continuăm studiul pe turiță împotriva Pseudomonas aeruginosa , rezultatele
fiind r edate în figura 4.31.
0510152025
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și ciprofloxacină pe E. coli

81

Figura 4.31 : Testare activitate combinație ciprofloxacină – polifenoli din extract din herba de
turiță asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .31: Activity testing of the combinations between ciprofloxacin – polyphenols from the
agrimony extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; Agr-D2 – 1 mg GAE/ml
+ 4 µg/ml CF; Agr-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 4 µg/ml CF; CF – 4 µg/ml
În acest caz, se observă continuarea trendului întâlnit anterior, și anume combinarea
extractului polifenolic cu antibiotic duce la scăderea diametrelor zonelor de inhibiție obținute ,
acestea ajungând până aproape la jumatatea valorii înregistrate în cazul antibioticului testat
singur . Cu toate acestea, diferen ța majoră față de E. coli este aceea că, deși sunt bacterii Gram
negative amândouă, P. aeruginosa este sensibilă la acțiunea turiței și mai rezistentă la antibiotic.
În continuare, am testat aceste combinații împotriva a două tulpini bacteriene Gram
pozit ive: Staphylococcus aureus (figura 4.32) și Staphylococcus epidermidis (figura 4.33).

02468101214161820
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 CFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și ciprofloxacină pe
P. aeruginosa

82

Figura 4.32 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din herba de turiță
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .32: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the
agrimony extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Agr-D2 – 1 mg
GAE/ml + 2 µg/ml OX; Agr-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
După cum am observat și în alte cazuri, bacteriile Gram pozitive sunt mai susceptibile la
acțiunea compușilor antibacterieni, iar acest lucru este ușor de observat și în cazul de față,
diametrele zonelor de inhibiție depășind în aproape toate cazurile 20 m m, deci având activitate
certă. Deși diferențele sunt minore, putem afirma cu certitudine că în urma combinării oxacilinei
cu extractul de turiță rezultă o acțiune sinergică, fiind potențată inhibarea dezvoltării bacteriei
S. aureus . Tocmai de aceea, considerăm că Agrimonia eupatoria ar putea fi o sursă importantă
pentru obținerea unor adjuvante în tratamentul infecțiilor stafilococice pe viitor.

0510152025
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și oxacilină pe S. aureus

83

Figura 4.33 : Testare activitate combinație oxacilină – polifenoli din extract din her ba de turiță
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4 .33: Activity testing of the combinations between oxacillin – polyphenols from the
agrimony extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr-D1 – 4.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; Agr-D2 – 1 mg
GAE/ml + 2 µg/ml OX; Agr-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 2 µg/ml OX; OX – 2 µg/ml
Ca și testele asupra S. aureus , cele împotriva S. epidermidis dezvăluie o acțiune sinergică
între oxacilină și extractul de turiță, singura diferență o constituie concent rația de polifenoli care
este activă. În timp ce în primul caz toate cele trei c oncentrații testate aveau acelaș i efect, în al
doilea caz, doar concentrația maximă (4.5 mg GAE/ml) are efect de potențare a activității
antibioticului , celelalte couă nefiind suficiente pentru a potența acțiunea antibioticului .
La finalul acestui subpunct , reluăm rezultate obținute în tabelul 4. 6 pentru a evidenția
comparativ tipul de activități observate.
Tabel 4.6: Tipul de activități combinate observate între ex tracte veget ale și antibiotice
Tabel 4.6: Type of combinations revealed between vegetal extracts and antibiotics
Material vegetal Combinație Tulpină bacteriană Tip activitate
Fagus sylvatica Fagus D1 – CF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Fagus D2 – CF Antagonică
Fagus D3 – CF Antagonică
Fagus D1 – CF Pseudomonas aeruginosa Antagonică
02468101214161820
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 OXDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și oxacilină pe S. epidermidis

84
Fagus D2 – CF ATCC 9027 Antagonică
Fagus D3 – CF Antagonică
Fagus D1 – OX
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Sinergică
Fagus D2 – OX Indiferentă
Fagus D3 – OX Indiferentă
Fagus D1 – OX
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Antagonică
Fagus D2 – OX Antagonică
Fagus D3 – OX Antagonică
Epilobium
hirsutum Epil D1 – CF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Epil D2 – CF Antagonică
Epil D3 – CF Antagonică
Epil D1 – CF
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 Antagonică
Epil D2 – CF Antagonică
Epil D3 – CF Antagonică
Epil D1 – OX
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Antagonică
Epil D2 – OX Antagonică
Epil D3 – OX Indiferentă
Epil D1 – OX
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Indiferentă
Epil D2 – OX Antagonică
Epil D3 – OX Antagonică
Juglans regia Juglans D1 – CF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Juglans D2 – CF Antagonică
Juglans D3 – CF Antagonică
Juglans D1 – CF
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 Antagonică
Juglans D2 – CF Antagonică
Juglans D3 – CF Antagonică

85
Juglans D1 – OX
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Indiferentă
Juglans D2 – OX Indiferentă
Juglans D3 – OX Indiferentă
Juglans D1 – OX
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Sinergică
Juglans D2 – OX Sinergică
Juglans D3 – OX Sinergică
Agrimonia
eupatoria Agrimonia D1 –
CF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Agrimonia D2 –
CF Antagonică
Agrimonia D3 –
CF Antagonică
Agrimonia D1 –
CF Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 Antagonică
Agrimonia D2 –
CF Antagonică
Agrimonia D3 –
CF Antagonică
Agrimonia D1 –
OX Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Sinergică
Agrimonia D2 –
OX Sinergică
Agrimonia D3 –
OX Sinergică
Agrimonia D1 –
OX Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Sinergică
Agrimonia D2 –
OX Indiferentă
Agrimonia D3 –
OX Indiferentă
Legendă: D1 – combinație ce conține 4.5 mg GAE/ml ; D2 – combinație ce conține
1 mg GAE/ml, D3 – combinație ce conține 0.5 mg GAE/ml ,
CF – CMI ciprofloxacină, OX – CMI oxacilină
După cum se poate observa cu ușurință din tabelul anterior, bacteriile Gram negative sunt
cele mai rezistente la combinațiile dintre polifenoli de natură vegetală și ciprofloxacină , în toate
cazurile studiate activitatea combinațiilor fiind antagonică , fapt care ar putea sugera evitarea
consumului de produse provenind din astfel de plante (ex. ceai de turiță) atunci când se urmează
un tratament cu ciprof loxacină pentru combaterea unor infecții cauzate de Escherichia coli sau
Pseudomonas aeruginosa .

86
Nu același lucru poate fi spus și pentru tulpinile Gram pozitive, în acest caz
înregistrându -se activități sinergice pen tru 3 dintre plantele studiate atât împotriva S. aureus (fag
și turiță), cât și S. epid ermidis (nuc și turiță) , fie pentru toate cele trei concentrații de polifenoli
luate în studiu (turița împotriva S. aureus și nuc împotriva S. epidermidis ), fie numai pentru
concentrația maximă testată – 4.5 mg GAE/ml (fag împotriva S. aureus și turița împotriva
S. epidermidis ). Singurul extract care în această etapă a studiului nu a dus la înegistrarea niciunei
activități sinergice este pufulița cu flori mici, plantă care în mod interesant a avut activitatea
antibacteriană cea mai puternică.
Există numeroase combinații care au dus la o activitate indiferentă însă tot asupra
bacteriilor Gram pozitive, de data aceasta pentru toate cele 3 din cele 4 surse vegetale din care
am obținut extracte polifenolice (excepția sunt frunzele de fag) . Există d e asemenea o ușoară
variație în ceea ce privește concentrația de polifenoli care este activă – Epilobium hirsutum este
exemplul cel mai elocvent: împotriva S. aureus acționează doar concentrația minimă în
combinație cu oxacilina, iar asupra S. epidermidis doar concentrația maximă combinată cu
antibioticul (efecte indiferente) .
Se remarcă diferențe interesante în ceea ce privește concentrațiile polifenolice care
asigură potențarea efectelor oxacilinei. Astfel, rezultatele noastre arată că sunt mai active
amestecurile ce conțin 4.5 mg GAE/ml (4 cazuri de efecte sinergice înregistrate față de doar câte
2 pentru fiecare dintre celelalte două concentrații testate , precum și câte 2 cazuri de activitate
indiferentă pentru fiecare concentra ție testată ), ceea ce a r putea duce la concluzia că este
necesară o cantitate ridicată de compuși polifenolici în cazul formulării unor produse cu efecte
terapeutice bazate pe potențarea acțiunii oxacilinei sau pentru combaterea rezistenței tulpinilor
de Staphylococcus sp. la acest antibiotic.
4.3.4.2 Teste cu un antibiotic nou sintetizat
Norfloxacina utilizată în aceste studii aparține familiei de quinolone și a fost sintetizată în
cadrul unui Proiect Nucleu din cadrul Institututului de Cercetare -Dezvoltare Chimico –
Farmaceutică ICCF București, metoda și etapele folosite fiind descrise într -un articol din 2016
publicat de Pintilie et al. Este vorba în fapt despre un acid
1-etil-6-fluoro -7-(piperazin -1-il)-1,4-dihidro -4-oxochinolin -3-carboxilic, un antibiotic cu acțiune
bacterici dă, fiind implicat în inhibarea sinteza ADN -ului cromozomial bacterian prin inhibarea
reacției de superspiralare ADN, a relaxă rii ADN sau ruperea lanțurilor ADN dublu cat enar.
Concentrația minimă inhibitorie a acestui compus a fost determinată împotriva celor
patru tulpini bacteriene folosite ca microorganisme -test în cadrul studiului de față, rezultatele

87
fiind urm ătoarele: împotriva Escherichia coli CMI considerată optimă pentru testarea prin
metoda difuzimetrică este de 8 µg/ml, împotriva Pseudomonas aeruginosa de 16 µg/ml, iar
asupra tulpinilor Gram negative de 32 µg/ml ce corespunde atât pentru Staphylococcus aureus ,
cât și pentru S. epidermidis .
În figurile următoare prezen tăm rezultatele obținute prin determinarea acțiunii sinergice
dintre norfloxacină și extractele polifenolice din patru surse vegetale: frunze de fag, frunze de
nuc și părți aeriene de pufuliță, respectiv turiță mare. Rezultatele obținute pentru prima
combi nație, norfloxacină și extract din frunze de fag asupra Escherichia coli sunt redate în figura
4.34.

Figura 4.34 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de fag
asupra Escherichia coli
Figure 4 .34: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Escherichia coli
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; Fag-D2 – 1 mg GAE/ml
+ 8 µg/ml NF; Fag-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; NF – 8 µg/ml
După cum se poate observa din figură, concentrația de polifenoli din amestecurile testate
este invers proporțională cum acțiunea antibacteriană, rezultatele cele mai bune fiind evidente în
cazul în care pe lângă antibiotic s -au adăugat doar 0. 5 mg polifenoli/ml, înregistrându -se o
activitate sinergică certă între compușii vegetali și norfloxacină. Acest fapt ar putea sugera că o
concentrație prea mare de polifenoli creează o competiție pentru situsurile de acțiune ale
antibioticului.
Mai depar te, aceleași combinații de polifenoli și norfloxacină au fost testate împotriva
Pseudomonas aeruginosa , iar rezultatele sunt redate în figura 4.35.
0510152025
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și norfloxacină pe
E. coli

88

Figura 4.35 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de fag
asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .35: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; Fag-D2 – 1 mg
GAE/ml + 16 µg/ml NF; Fag-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; NF – 16 µg/ml
Deși P. aeruginosa este tot o bacterie Gram negativă ca și E. coli , rezultatele sunt la polul
opus în acest caz înregistrându -se numai efecte antagonice între polifenoli și norfloxacină,
indiferent de concentrația compușilor de natură vegetală. Până acum, niciuna dintre combinațiile
testate, indiferent de natura compuș ilor vegetali sau a antibioticelor nu a dus la observare unor
efecte sinergice împotriva aceste tulpini bacte riene, sau măcar a unor efecte indiferente.
În continuare, redăm rezultatele obținute împotriva tulpinilor Gram pozitive luate în
calcul, S. aureus (figura 4.36) și S. epidermidis (figura 4.37).
02468101214161820
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și norfloxacină pe
P. aeruginosa

89

Figura 4.36 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de fag
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .36: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Fag-D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Fag-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
În cazul testării combinațiilor de antibiotic și extract din frunze de fag împotriva
S. aureus , se observă aceleași r ezultate în cazul norfloxacinei ca și la oxacilină: efect sinergic
pentru concentrația cea mai ridicată de polifenoli și efecte indiferente în celelalte două cazuri,
ceea ce sugerează o posibilă acțiune adjuvantă a acestora doar la utilizarea unor concentr ații mari
de compuși vegetali. Desigur, acest lucru nu constituie o problemă, sursele vegetale fiind ușor de
obținut și ieftine, consumul de astfel de produse necauzând efecte adverse sau alte neplăceri la
oameni.
Următoarea figură, 4.37, prezintă rezulta tele testării combinațiilor dintre extractul din
frunze de fag și norfloxacină împotriva S. epidermidis .
0510152025
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și norfloxacină pe
S. aureus

90

Figura 4.37 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de fag
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4 .37: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
European beech leaves extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Fag – 5 mg GAE/ml; Fag -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Fag-D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Fag-D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
Din figura de mai sus reiese că există un antagonism clar între polifenolii din frunza de
fag și norfloxacină, deși extractul vegetal testat individual este mai potent decât antibioticul. Deși
în cazul oxacilinei s-au înregistrat o serie de combinații cu efecte indiferent sau sinergic, s -ar
părea că norfloxacina are o activitate mai redusă împotriva S. epidermidis și duce la scăderea
acțiunii polifenolilor asupra acestei tulpini bacteriene.
În continuare, trecem la studiul efectelor dintre norfloxacină și extractul din
Epilobium hirsutum . Prima tulpină bacteriană asupra căreia am testat aceste combinații este
Escherichia coli , iar rezultatele sunt redate în figura 4.38.
051015202530
Fag Fag-D1 Fag-D2 Fag-D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de fag și norfloxacină pe
S. epidermidis

91

Figura 4.38 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de
pufuliță asupra Escherichia coli
Figure 4 .38: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
great willowherb extract against Escherichia coli
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 8 µg/ml NF; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; NF – 8 µg/ml
Total opus rezultatelor obținute în prima parte a studiului, testarea cu ciprofloxacină, se
pare că extractul de pufuliță duce la efecte sinergice atunci când este asociat cu norfloxacină, cu
condiția ca polifenolii din extractul vegetal să nu depășească c oncentrația de 1 mg/ml, caz în care
cele două grupe de compuși se anulează reciproc, ducând la o lipsă totală a activității
antibacteriene; acesta fiind cel mai probabil cazul cel mai puternic de efect antagonic înregistrat
în studiul de față.
Mai depart e, trecem în revistă rezultatele obținute împotriva P. aeruginosa în figura 4.39.
0510152025
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și norfloxacină pe E. coli

92

Figura 4.39 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de
pufuliță asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .39: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
great willowherb extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 16 µg/ml NF; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; NF – 16 µg/ml
După cum am menționat și anterior, se pare că rezistența P. aeruginosa se remarcă și în
acest caz, diametrele zonelor de inhibiție în cazul combinațiilor fiind aproape la jumătate față de
cele obținute prin testarea individuală a extract ului vegetal și respectiv a norfloxacinei. Se
remarcă însă faptul că această inhibare a efectului antibacterian are loc indiferent de concentrația
de polifenoli din amestecurile testate.
Trecem mai departe la testarea acestor combinații împotriva S. aureu s, rezultatele fiind
expuse în figura 4.40.
02468101214161820
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și norfloxacină pe
P. aeruginosa

93

Figura 4.40 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de
pufuliță asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .40: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
great willowherb extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
Ca și în cazul fru nzelor de fag, se remarcă și acum faptul că doar prima combinație
testată, cea care este și cea mai bogată în compuși vegetali duce la apariția unui efect indiferent
față de activitatea antibioticului, celelalte două ducând la efecte antagonice. Cu toate a cestea, în
cazul frunzelor de fag s -a înregistrat un efect sinergic, față de cel indiferent din situația de acum,
ceea ce ar duce la concluzi că pufulița este mai puțin recomandată pentru administrarea
concomitent cu norfloxacina decât fagul.
Nu în ultimu l rând, prezentăm rezultatele obținute prin testarea extractului de pufuliță
combinat cu norfloxacina împotriva S. epidermidis în figura 4.41.
02468101214161820
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și norfloxacină pe S. aureus

94

Figura 4.41 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de
pufuliță asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4 .41: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
great willowherb extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Epil – 5 mg GAE/ml; Epil -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Epil -D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Epil -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
Din păcate, și în acest caz asistăm la o acțiune antagonică, cu atât mai accentuată cu cât
scade concentrația de polifenoli din amestecul testat. Se pare că această tulpină bacteriană
posedă o rezistență crescută la astfel combinații, probabil deoarece are loc rapid saturarea
situsurilor de acțiune ale antibioticului de către compușii vegetali.
În continuare, trecem la redarea rezultatelor obținute în cazul combinați ilor dintre
extractul din frunze de nuc și tulpinile bacteriene testate, prima fiind Escherichia coli , figura
4.42.
0510152025
Epil Epil -D1 Epil -D2 Epil -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din pufuliță și norfloxacină pe
S. epidermidis

95

Figura 4.42 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de nuc
asupra Escherichia coli
Figure 4 .42: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Escherichia coli
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; Jugl -D2 – 1 mg
GAE/ml + 8 µg/ml NF; Jugl -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; NF – 8 µg/ml
Cazul extractului este unul deosebit în sensul că, deși extractul nu posedă activitate
împotriva Escherichia coli , se pare că o cantitate de 1 mg GAE/ml din acest extract potențează
acțiunea norfloxacinei ducând la creșterea diametrului zonei de inhibiție cu peste 3 mm. Nu
aceleași rezultate se observă în cazul celorlaltor două concentrații de polifenoli, ceea ce
subliniază încă odată dependența dintre concentrația de polifenoli și acțiunea biologică a
acestora. Desigur, această activitate depinde și de celelalte componente din amestecul testat, căci
testarea ciprofloxacinei împotriva E. coli a dus la rezultate diferi te, în acel caz polifenolii din
frunzele de nuc având efecte antagonice față de antibiotic.
Mai departe, prezentăm rezultatele obținute prin testarea acelorași combinații asupra
Pseudomonas aeruginosa în figura 4.43.
0510152025
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și norfloxacină pe
E. coli

96

Figura 4.43 : Testare activitate comb inație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de nuc
asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .43: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; Jugl -D2 – 1 mg
GAE/ml + 16 µg/ml NF; Jugl -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; NF – 16 µg/ml
După cum se poate observa din figura de mai sus, în toate cele trei cazuri testate efectul
cumulat este unul an tagonic, dar diametrul cel mai mare s -a obținut tot în cazul concentrației
medii, cea de 1 mg GAE/ml, așa cum s -a întâmplat și în cazul testării împotriva E. coli. Acest
fapt ar putea sugera că, pentru amestecul polifenolic din frunzele de nuc (în special derivați de
apigenină și quercitină, dar și ai acidului cafeic), concentrația este foarte importantă, fiind o
variabilă sensibilă și care poate modifica în mod categoric rezultate finale ale unui experiment.
În continuare, prezentăm rezultate obținute pri n testarea combinațiilor dintre polifenolii
extrași din frunzele de nuc și norfloxacină împotriva tulpinilor Gram pozitive Staphylococcus
aureus (figura 4.44) și Staphylococcus epidermidis (figura 4.45).
02468101214161820
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și norfloxacină pe
P. aeruginosa

97

Figura 4.44 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de nuc
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .44: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ ml; Jugl -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Jugl -D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Jugl -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
În cazul testării asupra S. aureus nu se înregistrează efecte sinergice între cele două
componente ale amestecurilor testate, dar se observă faptul că, pentru concentrația maximă
testată – 4.5 mg GAE.ml – s-a obținut un efect indiferent, iar pe măsura ce a scăzut concentrația
de polifenoli, a scăzut și diametrul zonelor de inhibiție formate. Aceste rezultate ar putea fi
datorate faptului că bacteriile Gram pozitive nu prezintă perete celular și astfel compușii
polifenolici pot pătrunde cu ușurință în interiorul celulei bacteriene, unde își e xercită acțiunea
direct proporțional cu concentrația de polifenoli ajunsă la acest nivel.
Este interesant de menționat că aceste rezultate sunt opuse celor înregistrate în cazul
oxacilinei, unde indiferent de concentrația de polifenoli, s -au observat efe cte sinergice ale celor
trei combinații dintre compușii polifenolici și antibiotic. Acest fapt se poate explica prin modul
de acțiune antibacterian diferit al celor două antibiotice; este posibil să existe o competiție pentru
legarea la anumite proteine ba cteriene între polifenolii de tipul celor întâlniți în frunza de nuc și
norfloxacină.
02468101214161820
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și norfloxacină pe
S. aureus

98

Figura 4.45 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din frunze de nuc
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4 .45: Activity testing of th e combinations between norfloxacin – polyphenols from the
walnut leaves extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Jugl – 5 mg GAE/ml; Jugl -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Jugl -D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Jugl -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
Rezultatele prezentate în figura 4.45 împotriva S. epidermidis sunt similare cu cele
împotriva S. aureus în sensul că odată cu scăderea concentrației de polifenoli din amestecul testat
scade și activitatea antibacteriană a acestuia . Diferența majoră este aceea că în acest caz s -au
observat trei efecte antagonice, față de doar două în cazul testelor pe S. aureus .
O altă asemănare este aceea că testările combinațiilor cu oxacilină au dus la efecte
sinergice între cele două clase de c ompuși, rezultate ce nu au fost regăsite în cazul norfloxacinei,
posibil din aceleași considerente ca și în cazul S. aureus .
Mai departe, trecem în revistă rezultatele obținute prin testarea unor combinații între
norfloxacină și compuși polifenolici extraș i din partea aeriană a turiței mari. Prima figură, 4.46,
prezintă efectele înregistrate în cazul testării asupra Escherichia coli .
0510152025
Jugl Jugl -D1 Jugl -D2 Jugl -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din frunze de nuc și norfloxacină pe
S. epidermidis

99

Figura 4.46 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de turiță
asupra Escherichia coli
Figure 4 .46: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
agrimony extract against Escherichia coli
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; Agr -D2 – 1 mg
GAE/ml + 8 µg/ml NF; Agr -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 8 µg/ml NF; NF – 8 µg/ml
După cum se poate observa din figura de mai sus, rezultatele sunt încurajatoare, în sensul
că, deși testată individual A. eupatoria nu prezintă activitate împotriva E. coli , în combinație cu
norfloxacina se înregistrează efecte sinergice, de potențare a activității antibioticului pentru toate
cele trei concentrații de polifenoli luate în studiu. Merită menționat faptul că diametrul zonei de
inhibiție cel mai mare s -a înregistrat pentru concentrația polifenoli că cea mai redusă, ceea ce ar
putea avea însemnătate practică importantă deoarece în cazul obținerii unei posbile formule
terapeutice se poate folosi o cantitate minimă de materie primă pentru obținerea unor rezultate
maximale.
În continuare prezentăm rez ultatele obținute împotriva Pseudomonas aeruginosa în
figura 4.47.
0510152025
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și norfloxacină pe E. coli

100

Figura 4.47 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de turiță
asupra Pseudomonas aeruginosa
Figure 4 .47: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
agrimony extract against Pseudomonas aeruginosa
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; Agr -D2 – 1 mg
GAE/ml + 16 µg/ml NF; Agr -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 16 µg/ml NF; NF – 16 µg/ml
După cum reiese din grafic, și de această dată s -au obținut efecte antagonice împotriva
acestei tulpini bacteriene, P. aeruginosa fiind singura din cele patru testate care nu a dus la
înregistrarea niciunui efect sinergic între compușii polifenolici vegeta li și antibiotice. Cu toate
acestea, în cazul de față se observă diferențe între acțiunea diferitelor amestecuri, cel care
prezintă activitatea cea mai crescută fiind cel care co nține 1 mg GAE/ml, situație întâ lnită în alte
câteva cazuri anterioare.
Nu în ultimul rând, prezentăm rezultatele înregistrate în urma testării combinațiilor dintre
extractul din turiță și norfloxacină asupra bacteriilor Gram po zitive, prima fiind S. aureus , în
figura 4.48.
02468101214161820
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și norfloxacină pe
P. aeruginosa

101

Figura 4.48 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de turiță
asupra Staphylococcus aureus
Figure 4 .48: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
agrimony extract against Staphylococcus aureus
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Agr -D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Agr -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
Ca și în cazul testărilor împotriva E. coli se observă că activitatea antibacteriană crește
odată cu scaderea concentrației de polifenoli di n amestec, diametrul zonei de inhibiție maxim
fiind înregistrat în cazul concentrației de 0.5 mg GAE/ml – valoare pentru care se înregistrează
un efect indiferent însă ce nu poate fi considerat ca având efecte terapeutice importante din punct
de vedere al influențării acțiunii antibioticului.
În continuare, în figura 4.49, se prezintă efectele obținute prin testarea împotriva
S. epidermidis .
02468101214161820
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și norfloxacină pe S. aureus

102

Figura 4.49 : Testare activitate combinație norfloxacină – polifenoli din extract din herba de turiță
asupra Staphylococcus epidermidis
Figure 4 .49: Activity testing of the combinations between norfloxacin – polyphenols from the
agrimony extract against Staphylococcus epidermidis
Legend ă: Agr – 5 mg GAE/ml; Agr -D1 – 4.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; Agr -D2 – 1 mg
GAE/ml + 32 µg/ml NF; Agr -D3 – 0.5 mg GAE/ml + 32 µg/ml NF; NF – 32 µg/ml
În acest caz, se înregistrează singurul moment când asocierea norfloxacinei cu compuși
polifenolici duce la anularea completă a acțiunii antibioticului. Este foarte interesant faptul că
acest efect se înregistrează în cazul concentrației minime de polifenolii, ceea ce sugerează faptul
că, cel puțin în cazul acestei tulpini bacteriene, interacțiunea dintre compușii preponderent
flavonoidici din turiță și norfloxacină este una ineficien tă.
La finalul acestui subpunct , reluăm rezultate obținute în tabelul 4.7 pentru a evidenția
comparativ tipul de activități observate.
Tabel 4.7: Tipul de activități combinate observate între extracte vegetale și norfloxacină
Tabel 4.7: Type of combinatio ns revealed between vegetal extracts and norfloxacin
Material vegetal Combinație Tulpină bacteriană Tip activitate
Fagus sylvatica Fagus D1 – NF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Fagus D2 – NF Indiferentă
Fagus D3 – NF Sinergică
Fagus D1 – NF Pseudomonas aeruginosa Antagonică
0510152025
Agr Agr -D1 Agr -D2 Agr -D3 NFDiametrul zonelor de inhibiție (mm)
Testare combinații extract din turiță și norfloxacină pe
S. epidermidis

103
Fagus D2 – NF ATCC 9027 Antagonică
Fagus D3 – NF Antagonică
Fagus D1 – NF
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Sinergică
Fagus D2 – NF Indiferentă
Fagus D3 – NF Indiferentă
Fagus D1 – NF
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Antagonică
Fagus D2 – NF Antagonică
Fagus D3 – NF Antagonică
Epilobium
hirsutum Epil D1 – NF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Epil D2 – NF Sinergică
Epil D3 – NF Sinergică
Epil D1 – NF
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 Antagonică
Epil D2 – NF Antagonică
Epil D3 – NF Antagonică
Epil D1 – NF
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Indiferentă
Epil D2 – NF Antagonică
Epil D3 – NF Antagonică
Epil D1 – NF
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Antagonică
Epil D2 – NF Antagonică
Epil D3 – NF Antagonică
Juglans regia Juglans D1 – NF
Escherichia coli ATCC 8739 Antagonică
Juglans D2 – NF Sinergică
Juglans D3 – NF Antagonică
Juglans D1 – NF
Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 Antagonică
Juglans D2 – NF Antagonică
Juglans D3 – NF Antagonică

104
Juglans D1 – NF
Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Indiferentă
Juglans D2 – NF Antagonică
Juglans D3 – NF Antagonică
Juglans D1 – NF
Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Antagonică
Juglans D2 – NF Antagonică
Juglans D3 – NF Antagonică
Agrimonia
eupatoria Agrimonia D1 –
NF
Escherichia coli ATCC 8739 Sinergică
Agrimonia D2 –
NF Sinergică
Agrimonia D3 –
NF Sinergică
Agrimonia D1 –
NF Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027 Antagonică
Agrimonia D2 –
NF Antagonică
Agrimonia D3 –
NF Antagonică
Agrimonia D1 –
NF Staphylococcus aureus
ATCC 6538 Antagonică
Agrimonia D2 –
NF Antagonică
Agrimonia D3 –
NF Indiferentă
Agrimonia D1 –
NF Staphylococcus epidermidis
ATCC 12228 Antagonică
Agrimonia D2 –
NF Antagonică
Agrimonia D3 –
NF Antagonică
Legendă: D1 – combinație ce conține 4.5 mg GAE/ml ; D2 – combinație ce conține
1 mg GAE/ml, D3 – combinație ce conține 0.5 mg GAE/ml , NF – CMI norfloxacină
În această a doua parte a testelor pe combinații dintre compuși vegetali și antibiotic se
remarcă trendul general de activitate sinergică în special asupra Escherichia coli , exact opus
rezultatelor obținute pentru ciprofloxacină – niciun efec t sinergic și doar o singură combinație cu
activitate sinergică asupra Staphylococcus aureus , față de patru combinații în cazul oxacilinei.
În ceea ce privește activitățile cu efect indiferent între cele două tipuri de compuși, acesta
a fost observat prep onderent asupra S. aureus pentru toate cele patru surse vegetale studiate, ceea
ce nu s -a întâmplat și în cazul oxacilinei.

105
De asemenea, merită menționată o altă diferență semnificativă, respectiv aceea că, față de
testele cu oxacilină, niciuna din combin ațiile dintre polifenoli și norfloxacină nu produce efect e
indiferent e sau sinergic e asupra Staphylococcus epidermidis , existând chiar un caz extrem în
cazul Agrimonia eupatoria când acțiunea antibioticului este complet anulată.
În plus , se observă faptul că s-au înregistrat efecte sinergice pentru toate cele trei
concentrații de polifenoli testate în proporții aproape egale (2 cazuri pentru 4.5. mg GAE/ml,
3 cazuri pentru 1 mg GAE/ml și 3 cazuri pentru 0.5 mg GAE/ml), precum și câte două efecte
indiferen te pentru fiecare concentrație testată, ceea ce subliniază încă odată importanța tipului de
polifenoli dintr -un amestec și raportul acestora față de antibioticul testat. Se pare că o
concentrație mai scăzută duce la o potențare mai puternică a efectelor ba ctericide ale
norfloxacinei.
De remarcat este și cazul extractului din Agrimonia eupatoria , care singur nu are
activitate împotriva E. coli , dar care, indiferent de concentrația în polifenoli, potențează acțiunea
norfloxacinei. Acest fapt, precum și rezultatele similare obținute pentru combinațiile cu oxacilină
recomandă turița mare ca o sursă naturală importantă ce poate fi utilizată ca adjuvant în terapia
cu antibiotice.

106
CAPITOLUL V
VALORIFICAREA REZULTATELOR ȘI ELEMENTE DE
NOUTATE
CHAPTER V
RESUL TS EXPLOITATION AND NOVELTIES

Este bine stabilit faptul că plantele sunt o sursă majoră și în că neexplorată complet de
compuș i biologic activi, iar izolarea și caracterizarea unor noi astfel de compuși sau a unor
amestecuri noi este de interes major la or a actuală . Cu toate acestea, mecanismul biochimic și
molecular care stă la baza acestor efect e asupra celulelor bacteriene nu este complet elucidat .
Având în vedere rolul major pe care îl au produsele bazate pe compuși naturali în ziua de astăzi
în populație, se justifică interesul pentru identificarea de noi surse vegetale bogate în polifenoli,
precum și încercarea de a utiliza astfel de substanțe naturale pentru a potența efectele
medicam entelor de sinteză și de a micșora dozele utilizate.
Lucrarea de față prezintă o serie de elemente de noutate și abordări originale , după cum
urmează:
1. S-au obținut 3 extracte apoase și 14 extracte etanolice din plante din flora indigenă, unele
din ele util izate în medicina tradițională românească, precum Mentha piperita , Hyssopus
officinalis , Malissa officinalis , Fagus sylvatica , Epilobium hirsutum , Arctium lappa ,
Juglans regia , Agrimonia eupatoria , Aronia melanocarpsa , Artemisia dracunculus ,
Hippophae rham noides , Cydonia oblonga , Lythrum salicaria , Helianthemum
nummularium . Toate plantele au fost culese din jurul localității Sinaia sau din județul
Ilfov;
2. O serie de extracte etanolice totale (Fagus sylvatica , Epilobium hirsutum , Arctium lappa )
au fost prelucrate în plus, obținându -se fracții apoase, în cloroform și în etil acetat, a
căror studiu din punct de vedere al compoziției în polifenoli și al activității
antibacteriene, a ajutat la o mai bună înțelegere a mecanismelor de acțiune ale comp ușilor
conținuți de extractele respective;
3. Toate extractele, precum și fracțiile corespunzătoare unora din ele, au fost aduse la o
concentrație finală de 5 mg GAE/ml pentru a putea compara în mod obiectiv activitățile
antibacteriene ale acestora;

107
4. Pentru ev aluarea activității antibacteriene a extractelor , alcoolul etilic utilizat pentru
extracția compușilor polifenolici a fost eliminat prin aducere la reziduu sec, care apoi a
fost reluat în polietilen glicol 20%, substanță care s -a dovedit că nu posedă activ itate
antibacteriană care să poată duce la rezultate fals pozitive;
5. Metoda HPTLC utilizată pentru caracterizarea calitativă a extractelor vegetale este o
metodă modernă care a fost folosită în premieră pentru unele specii din flora indigenă a
României, pre cum Epilobium hirsutum , Lythrum salicaria , Arctium lappa , etc.;
6. Toate extractele obținute au fost supuse unui screening inițial prin testarea activității
antibacteriene împotriva a două tulpini bacteriene cu potențial patogen : Escherichia coli
și Staphylococcus aureus ;
7. Cele patru extracte care au demonstrat cele mai promițătoare activități antibacteriene
(Fagus sylvatica , Epilobium hirstutum , Juglans regia și Agrimonia eupatoria ) au fost
testate împotriva a șase tulpini bacteriene patogene aparținând genurilor Escherichia ,
Pseudomonas , Staphylococcus și Salmonella prin metoda difuzimetrică, dar și prin
determinarea CMI, experimente care au demonstrat că primele două prezintă acți une
antibacteriană cu un spectru mai larg, atât asupra speciilor Gram pozitive, cât și Gram
negative;
8. Poate cel mai important element de noutate în reprezintă formularea a două produse pe
bază de extracte vegetale cu acțiune antibacteriană și antioxidantă demonstrate, produse
ca pot fi încadrate în sfera celor cu acțiune terapeutică/cosmetică, ele fiind aduse la o
formă stabilă, standardizată și care se pot utiliza pentru igiena mâinilor. Aceste produse
conțin un amestec de câte două extracte polifenolice, după cum urmează: formula 1 –
Epilobium hirsutum și Lythrum salicaria , formula 2 – Arctium lappa și
Aronia melanocarpa , originalitatea acestor formule este atestată de către un brevet de
invenție;
9. Patru dintre extractele rezultate în prima etapă a studiil or experimentale, cele din frunze
de fag european, pufuliță cu flori mici, frunze de nuc și turița mare au fost testate în
combinație cu 3 antibiotice, 2 disponibile comercial (ciprofloxacină și oxacilină) și unul
nou sintetizat (norfloxacină) , prin metoda difuzimetrică, iar rezultatele au condus la
concluzii diverse, unele combinații având acțiune sinergică, altele indiferentă și o parte
antagonică.
10. În urma testării combinațiilor dintre antibiotice și extracte vegetale, s -a ajuns la concluzia
că norfloxaci na este antibioticul a cărui acțiune a fost potențată în cele mai multe cazuri
în special împotriva bacteriei Gram negative Escherichia coli . De asemenea, se pare că
pentru o activitate biologică importantă, este important ca extractul vegetal să conțină a tât

108
componente flavonoidice, cât și acizi fenolici, acești compuși de natura vegetală par să
conlucreze pentru a asigura diferite acțiuni ale amestecurilor care îi conțin.
5.1 PUBLICAȚII
Rezultatele obținute în cadrul acestei teze au fost diseminate prin publicare de articole,
participare la diferite manifestări științifice și brevete de invenție, toate acestea fiind listate în
continuare:
I. Publicații ISI în reviste cu scor relativ de influență la domeniu ≥0.2
 Pirvu L., Hlevca C., Nicu I. , Bubueanu C., 2014 . Comparative analytical,
antioxidant and antimicrobial activity studies on a series of vegetal extracts
prepared from eight plant species growing in Romania . Journal of Planar
Chromatography, vol. 27, nr. 5, p. 346 -356.
 Pirvu L., Nicu I. , 2017. Polyphenol s content, antioxidant and antimicrobial
activity of ethanol extracts from the aerial part of rock rose (Helianthemum
nummularium) species . Journal of Agricultural Science and Technology A,
vol. 7, p. 61 -67.
II. Publicații ISI fără scor de influență calculat a l revistei sau SRI<0.2
 Pintilie L., Stefaniu A., Nicu A.I. , Caproiu M.T., Maganu M., 2016.
Synthesis, antimicrobial activity and docking studies of novel 8 -chloro –
quinolones . Revista de Chimie, vol. 67, nr. 3, p. 438 -445.
 Nicu A.I. , Pirvu L., Vamanu A., Stoian G., 2016. The European beech leaves
extract has an antibacterial effect by inducing oxidative stress . Romanian
Biotechnological Letters, vol. 22, nr. 6, p. 12071 -12080.
III. Publicații în reviste indexate în baze de date internațio nale relevante pentru domeniul
analizat sau reviste indexate ISI Thomson
 Pirvu L., Nicu I. , Schiopu S., Coprean D., 2016. Gastroprotective potential of
Fagus sylvatica leaves extracts on stress -induced ulcer model on rats .
Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, vol. XX, p. 293 -299.
 Nicu A.I. , Pirvu L., Vamanu A., 2017. Antibacterial activity of ethanolic
extracts from Agrimonia eupatoria L. and Epilobium hirsutum L. herba .
Acceptat spre publicare în Scientific Bulletin. Series F. Biotechnologies, vol.
XXI.

109
IV. Publicații în volumele unor conferințe internaționale relevante pentru domeniul
analizat , cu comitet științific internațional și publicate in extenso în volum cu
ISBN/ISSN
 Nicu A.I. , Pirvu L., Stoian G., 2014. The antioxidant effect of the Europ ean
beech leaves extract, basis for its anti -aging and antibacterial properties .
Simpozionul internaț ional ”Prioritățile chimiei pentru o dezvoltare durabilă
Priochem", ed. a X -a, volum de rezumate ISSN 2285 -8334, p. 14, București,
România .
 Pintilie L. , Stefaniu A. ,
Nicu A.I. , Caproiu M .T., Maganu M., Tanase C .,
Deaconu M ., Cojocaru A. , 2014. Quinolone Antibacterial Agents; Synthesis,
Characterization And QSAR Properties , Simpozionul internaț ional
”Prioritățile chimiei pentru o dezvoltare durabilă Prioche m", ed. a X -a, volum
de rezumate ISSN 2285 -8334, p. 149, București, România .
 Bubueanu C., Pirvu L., Nicu I. , 2014. Bioactivity and chemical composition
of various Origanum vulgare extracts , Simpozionul internaț ional ”Prioritățile
chimiei pentru o dezvoltare durabilă Prio chem", ed. a X -a, volum de rezumate
ISSN 2285 -8334, p. 38, București, România .
 Pintilie L., Stefaniu A., Deaconu M., Nicu A.I. , Caproiu M.T., Ionita A.C.,
Morosan E., Mititelu A., Pop A.L., Udeanu D.I., 2016. Synthesis and
computati onal studies of new quinolone compounds with antibacterial
activity , ”International congress of the medical sciences, behavioral sciences,
education and psysical rehabilitation from the perspective of quality of life”,
volum de rezumate ISSN 2457 -2772, p. 58-59, Craiova, România.
 Pintilie L., Stefaniu A., Nicu A.I. , Caproiu M.T., Maganu M., Udeanu S.I.,
Mititelu M., Ionita A.C., Morosan E., 2016. Design, synthesis, molecular
docking and antibacterial activity of some novel compounds , ”Congresul
național de Farmacie”, ed. a XVI -a, volum de rezumate ISSN 2537 -2823, p.
66, București, România.
V. Alte p ublicații
 Pirvu L. C., Hlevca C., Bubueanu E. C., Nicu I. , Panteli M., Rasit I. , 2014.
Studii privind activitatea antimicrobiană și activitatea de modificare a
rezistenței la antibiotice a unor extracte vegetale din flora indigenă , Medalia
de Aur la Salonul de Invenții și Inovații INVENTIKA, București ;

110
 Pirvu L., Coprean D., Nicu I. , Neagu G., 2016. Studies on Agrimoniae herba
selective extracts; polyphenols conte nt, antioxidant and antimicrobial
potency, MTS test , Academy of Romanian Scientists Annals Series on
Biological Sciences, vol. 5, nr. 1, p. 96 -107.
 Bubueanu E., Hlevca C., Iuksel R., Nicu I. , Panteli M., Pirvu L.C., 2016.
Plant extracts with antimicrobial -antioxidant effect and process for
preparation of two active formulas . Patent number RO130827 -A2, Derwent
primary accession number 2016 -12077H.
 Caproiu M.T., Deaconu M., Nicu A.I. , Pintilie L., Stefaniu A., 2016.
8-chloro -quinolin -carboxylic acid with ant imicrobial activity and process for
preparing the same . Patent number RO131025 -A2, Derwent primary
accession number 2016 -275456.
 Bubueanu C., Nicu I. , Pirvu L., 2016. Chromatographic fingerprint, analysis
and bioactivity of Origanum vulgare extracts , Malaysian Journal of Medical
and Biological Research, vol. 2, nr. 2, p. 159 -162.

111
CAPITOLUL V I
CONCLUZII
CHAPTER VI
CONCLUSIONS

Scopul lucrării de faț ă l-a reprezentat obținerea uno r extract e polifenolic e din o serie de
plante din flora indigenă , precum și testarea efectelor antibacteriene ale acestora, polifenolii fiind
compuși sintetizați de plante în diferite organe care s -a demonstrat că au efecte biologice
importante asupra sănătății umane .
Astfel, am obținut 14 extract e alcoolic e și 3 extract e apoase din diferite părți ale
plantelor , precum și izolarea unor fracții (apoase, în cloroform și în acetat) ale extractelor
etanolice din 3 plante, din care am dozat polifenolii și flavonoidele și am realizat o analiz ă
calitativă a acestora . Astfel, am demonstrat că acest e extract e conțin quercitin ă, diosmină,
acid clorogenic, acid neoclorogenic, apigenină, acid galic, derivați ai acizilor galic,
acid rozmarinic, acid cafeic , kaempferol , precum și o serie de derivați catechinici , quercitinici
sau ai ap igeninei . Această combinație de polifenoli, con centrațiile lor, precum și sursele vegetale
utilizate în acest studiu reprezintă un element de noutate .
În ceea ce privește activita tea antibacteriană a extractelor , aceasta a fost testată inițial
asupra a dou ă tulpini: Escherichia coli ATCC 8739 – o bacterie Gram negativă, și asupra
Staphylococcus aureus ATCC 6538 – o bacterie Gram pozitivă , iar apoi s -a mers mai departe ci
testarea pe tulpini de Staphylococcus epidermidis ATCC 12228,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Salmonella typhimurium ATCC 14028 și
Salmonella enteritidis ATCC 13076 .
Studiile microbiologice inițiale au arătat o activitate antibacteriană mai puternică a
extractelor etanolice, iar dintre acestea menționăm activitatea moderată a extract ului de
Epilobium hirsutum împotriva celor șase bacterii testate, dar și activitățile certe ale extractului
din frunze de Fagus sylvatica asupra S. epidermidis și cea asupra S. aureus a extractului de
Arctium lappa , activități demonstrate prin testarea activ ității microbiol ogice prin metoda
difuzimetrică . Dintre cele 14 plante luate în studiu, una singură s-a dovedit a nu avea activitate
antibacteriană: Melissa officinalis . Dintre celelalte, toate au avut minim o activitate slabă
împotriva a cel puțin o tulpină bacteriană .

112
Pentru trei dintre extractele etanolice, s -au obținut câte trei fracții care au fost apoi testate
individual, iar rezultatele acestor teste au arătat că fracțiile în etil acetat ce conțin derivați
flavonoidici sunt cele mai eficiente at ât pe Gram pozi tive, cât și Gram negative, dar nu atât de
eficiente ca extractele etanolice totale, efect datorat probabil unor acțiuni sinergice între acești
derivați și acizii fenolici prezenți inițial .
Determinarea concentrațiilor minime inhibitorii, ur mătoarea etapă a studiului, a relevat
faptul că în unele extracte există compuși ce nu pot migra în mediul agarizat și își exercită
acțiunea doar în mediu de cultură lichid, cum ar fi cei din extractele de frunze de nuc sau herba
de turiță mare . Pentru cel elalte două extracte, frunze de fag și herba de pufuliță cu flori mici,
rezultatele obținute prin metoda difuzimetrică sunt corelate liniar cu valorile CMI .
Se păstrează observația că toate extractele sunt mai eficiente împotriva tulpinilor
Gram pozitive , fenomen datorat probabil lipsei membranei externe la această bacterie, prezentă
la bacteriile Gram negative, membrană care limitează pătrunderea polifenolilor în interiorul
celulei unde să își poată exercita activitatea antibacteriană, cel mai probabil pr in generarea
stresului oxidativ în urma proceselor de oxidare și auto -oxidare pe care le suferă .
După evaluarea atentă a activităților antibacteriene ale extractelor obținute, precum și
efectuarea unor teste privind activitatea antioxidantă a unor extracte (rezultatele acestor teste au
fost doar amintite în această lucrare), au fost formulate două preparate cu acțiune terapeutică,
ambele conținând un amestec de două extracte vegetale după cum urmează: formula 1:
pufuliță și răchitan, formula 2: scai și sco ruș negru. Ambele produse am demonstrat că au
activitate antibacteriană împotriva tulpinilor Gram negative, dar și Gram pozitive, putând fi
utilizate cu succes ca spray -uri pentru igiena mâinilor.
În următoarea parte a studiului, s -au calculat CMI pentru 3 antibiotice împotriva a
4 tulpini bacteriene, precum și testarea activității a combinațiilor dintre extracte polifenolice
conținând concentrații diferite de polifenoli și antibiotice. Pentru aceste teste, s -a măsurat
diametrul zonelor de inhibiție format e pe mediu agarizat de fiecare ameste în parte, iar pe baza
rezultatelor au fost clasificate ca având efecte antagonice, indiferente sau sinergice. Din cele
peste 90 de combinații testate, 16 au avut efecte sinergice, în special împotriva Escherichia coli
(7 astfel de combinații, toate cu norfloxacină) și 16 au avut efecte indiferente, în special
împotriva Staphylococcus aureus (11 astfel de combinații – 6 cu oxacilină și 5 cu norfloxacină).
Ce este interesant însă este faptul că, din cele trei concentrați i de polifenoli testate pentru
fiecare pereche de antibiotic/bacterie din studiu, nu întotdeauna aceeași concentrație de
polifenoli a dus la apariția efectelor sinergice. Astfel, par să fie mai numeroase efectele benefice

113
atunci când se utilizează cantităț i mici de polifenoli (1 mg sau 0.5 mg GAE/ml) față de
4.5 mg GAE/ml, probabil deoarece o cantitate mai ridicată de compuși polifenolici
competiționează cu antibioticele pentru situsurile de legare la nivelul proteinelor bacteriene. Mai
mult, este importan tă și compoziția extractului polifenolic, rezultatele obținute sugerează faptul
că cele mai multe efecte sinergice au fost generate de extractul din turița mare
(Agrimonia eupatoria ) pentru toate antibioticele testate, acest extract fiind bogat în derivaț i
flavonoidici, singurul acid fenolic identificat conținut este acidul cafeic. La polul opus se află
extractul din pufulița cu flori mici ( Epilobium hirsutum ), doar două efecte sinergice înregistrate
prin combinație cu norfloxacina, acest extract fiind com pus predominant din acizi fenolici
precum acidul cafeic, acidul galic și derivați ai acestuia.
La final, se poate concluziona că, din cele patru extracte vegetale testate în combinație cu
antibiotice, cel mai eficient pare a fi cel din turița mare, extrac t care individual nu prezintă
activitate împotriva acelorași tulpini bacteriene ( Escherichia coli, S taphylococcus aureus,
Staphylococcus epidermidis ) și care este compus în principal din flavonoide, iar cel mai puțin
eficient în potențarea acțiunii antibioticelor este extractul din pufuliță, extract care prezenta
inițial activitate antibacteriană ridicată împotriva tuturor tulpinilor bacteriene testate.
În concluzie, plante din flora indigenă precum frunzele de fag , scai sau de nuc , turița
mare sau p ufulița cu flori mici ar putea fi noi surse de compuși biologic activi, care să poată fi
utilizați , ca atare sau în combinații cu antibiotice, pentru tratarea infec țiilor determinate de
bacterii .

114
The purpose of this research was to obtain polyphenolic ex tracts from a series of
indige nous plants and testing their an tibacterial effects, polyphenols being important compounds
sythetised by different plants organs which were proven to posess important biological effects on
human health.
We obtained 14 alcoholi c extracts and 3 aqueous extracts from different plant parts and 3
fractions (aqueous, in chloroform and in acetate) from the alcoholic extract of three plants; from
all extracts and fractions polyphenols were assayed and qualitative analysed. As such, we
demonstrated that this extracts mainly contain quercitin, diosmiin, chlorogenic acid,
neochlorogenic acid, apigenin, gallic acid, gallic acid derivatives, rosmarinic acid, caffeic acid,
kaempferol, catechinic derivatives, quercetin or apigenin derivatives. This combination of
polyphenols and the vegetal sources used in this study represent novelty elements.
The antibacterial activity of the extracts were initially tested against two bacterial strains:
Escherichia coli ATCC 8739 – a Gram negatibe bacteria an d Staphylococcus aureus ATCC
6538 – a Gram positive bacteria, afterwards the tests were extented against strains such as
Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,
Salmonella typhimurium ATCC 14028 and Salmonella enteritidis ATCC 13076.
The initial microbiological studies revealed a stronger antibacterial activity of the
ethanolic extracts, from which we mention the moderate activity of the extract from
Epilobium hirsutum against all six bacterial strains and the certain acti vities of the extract from
Fagus sylvatica leaves against S. epidermidis and the Arctium lappa extract against S. aureus ,
activities determined by the siffusimetric method. From the 14 plants studied, only one had no
activity: Melissa officinalis . From all the others, each had at least weak activity against one
bacterial strain.
For three of the ethanolic extracts, we obtained 3 fractions that were individually tested
and the results showed that the fraction in ethil acetate containing flavonoidic derivativ es are the
most active against Gram negative and Gram positive bacteria, although not as effective as the
whole ethanolic extracts which suggests that there are some synergic actions between these
derivatives and the phenolic acids found in the initial ext ract.
The next step of the study, determination of the minimum inhibitory concentration
(MIC), suggested that in some of the extracts there may be some compounds that cannot migrate
in the agar media and therefore are only active in broth media, like the extract from the walnut
leaves or from agrimony. The other two extracts, from European beech leaves and great

115
willowherb, showed results for MIC that are liniary correlated with the results obtained by the
diffusimetric method.
All results prove that all extract s are more efficient against Gram positive strains,
probably due to the fact that they do not have an external cellular membrane as the Gram
negative ones do, membrane that can limit the amount of polyphenols that can get inside the
bacterial cells where t hey can exercise theit antibacterial activity, most probably by generating
oxidative stress due to oxidation and auto -oxidation processes.
After the careful evaluation of the antibacterial activities of the vegetal extracts we
obtained and testing the anti oxidant activity of some of the extracts (the results of these tests
were only reminded in this research), two active formulas were obtained with therapeutic
activity, both of them containing two plant extracts as follows: formula 1: great willowherb and
purple losestrife, formula 2: greater burdock and chokeberries. Both products were proven to
posses antibacterial activity against Gram negative and Gram positive bacteria and they can be
used as sprays for hand hygiene.
In the next stage of the study, were determined MICs for 3 antibiotics against 4 bacterial
strains and combination between these antibiotics and polyphenolic extracts were tested. For
each combination taken into consideration the diameter of the inhibition was measured and based
on these res ults, the combinations were classified in 3 types: antagonic, indifferent and synergic.
From over 90 combinations tested, 16 had synergic activity, mostly against Escherichia coli (7
combinations, all with norfloxacin) and 16 had indifferent activity, most ly against
Staphylococcus aureus (11 combinations – 6 with oxacillin and 5 with norfloxacin).
It is worth mentioning the fact that from the three polyphenolic concentrations tested for
each antibiotic/bacteria pair studied, not always the same concentratio n of polyphenols lead to
synergic activity. Our results showed that the most benefic effects were registered when small
quantities of polyphenols were used (1 mg or 0.5 mg GAE/ml) rather that 4.5 mg GAE/ml,
probably due to the fact that a higher concentrat ion of polyphenols competes with antibiotics for
the interaction sites of bacterial proteins. Moreover, our results suggest that the composition of
the extract is also very important, the plant extract with the most synergic effects was
Agrimonia eupatori a for all three antibiotics, this extract is rich in flavonoidic derivatives with
only one identified phenolic compound: caffeic acid. On the other hand, the extract from
Epilobium hirsutum only lead to two synergic activities in combination with norfloxac in, this
extract containing mainly phenolic compounds such as caffeic acid, gallic acid and its
derivatives.

116
In the end, it is safe to say that from the four vegetal extracts tested in combinations with
antibiotics, the most efficient seems to be the one f rom agrimony, an extract that on its own
showed no antibacterial activity against the same strains ( Escherichia coli ,
Staphylococcus aureus , Staphylococcus epidermidis ) and that has a high concentration of
flavonoids. The least efficient in increasing the activity of antibiotics is the extract from the great
willowherb, that paradoxally had the most potent activity when tested initially against all sic
bacterial strains.
In conclusion, indigenous plants like European beech leaves, greater burdock, walnut
leaves, great willowherb or agrimony coul be new sources of biologically active compounds that
can be used, as such or in combinations with antibiotics, to treat bacterial infections.

117
BIBLIOGRAFIE
BIBLIOGRAPHY

1) Abidi S.H., Ahmed K., Sherwani S.K., Kazmi S.U. , 2015 . Synergy between antibiotics and
naturl agents results in increased antimicrobial activity against Staphylococcus epidermidis ,
J. Infect . Dev. Ctries ., vol. 9, nr. 9, p. 925-929.
2) Ad’hiah A.H., Al -Bederi O.N.H., Al -Samm arrae K.W., 2013. Cytotoxic effects of Agrimonia
eupatoria L. against cancer cell lines in vitro , J of the Association of Arab Universities for
Basi and Applied Sciences, vol. 14, nr. 1, p. 87 -92.
3) Afsharzadeh M., Naderinasab M., Najaran Y.T., Barzin M., Emami S.A., 2013. In-vitro
antimicrobial activities of some iranian conifers , Iranian Journal of Pharmaceutical
Research, vol. 12, p. 63 -74.
4) Ahangarpour A., Heidari H., Oroojan A.A., Mirzavandi F., Nasr Esfehani K., Dehghan
Mohammadi Z., 2017. Antidiabetic, hypolipidemic and hepatoprotective effects of Arctium
lappa root ′s hydro -alcoholic extract on nicotinamide -streptozotocin induced type 2 mo del of
diabetes in male mice , Avicenna J. Phytomed., vol. 7, nr. 2, p. 169 -179.
5) Aiyegoro O.A., Okoh A.I., 2009. Use of bioactive plant products in combination with
standard antibiotics: Implications in antimicrobial chemotherapy , J. Med. Plants Res ., vol. 3,
nr. 13, p. 1147 -1152.
6) Akagawa M., Suyama K., 2001. Amine oxidase -like activity of polyphenols. Mechanism and
properties . Eur. J. Biochem., vol. 268, p. 1953 -1963 .
7) Amaral L.F.B., Moriel P., Foglio M.A., Mazzola P.G., 2014. Caryocar brasiliense
supercriti cal CO2 extract possesses antimicrobial and antioxidant properties useful for
personal care products , Complementary and Alternative Medicine, vol. 14, p. 73-79.
8) Bagchi D., Sen C.K., Bagchi M., Atalay M., 2004. Anti-angiogenic, antioxidant, and
anticarcinogenic properties of a novel anthocyanin -rich berry extract formula ,
Biochemistry, vol. 69, nr. 1, p. 75 -80.
9) Baudart J., Lemarchand K., Brisabois A., Lebaron P., 2000. Diversity of Salmonella strains
isolated from the aquatic environment as deter mined by serotyping and amplification of the
ribosomal DNA spacer regions , Appl. Environ. Microbiol., vol. 66, nr. 4, p. 1544 -1552.

118
10) Baur J.A., Sinclair D.A., 2006. Therapeutic potential of resveratrol: The in vivo evidence ,
Nat. Rev. Drug Dis., vol. 5, p. 493-506.
11) Bermudez -Soto M.J., Larrosa M., Garcia -Cantalejo J., Espin J.C., Tomas -Barberan F.A.,
Garcia -Conesa M.T., 2007. Up-regulation of tumor suppressor carcinoembryonic antigen –
related cell adhesion molecule 1 in human colon cancer Caco -2 cells followin g repetitive
exposure to dietary levels of a polyphenol -rich chokeberry juice , The Journal of Nutritional
Biochemistry, vol. 18, nr. 4, p. 259 -271.
12) Biswas B., Rogers K., McLaughlin F., Daniels D., Yadav A., 2013. Antimicrobial activities
of leaf extracts of guava (Psidium guavajava L.) on two Gram -negative and Gram -positive
bacteria , International J. of Microbiology, ID 746165.
13) Blot S., Depuydt P., Vandewoude K., De Bacquer D., 2007. Measuring the impact of
multidrug resistance in nosocomial infection , Curr. Opin. Infect. Dis., vol. 20, p. 391–396.
14) Borriello A., Cucciolla V., Della Ragione F., Galletti P., 2010. Dietary polyphenols: focus
on resveratrol, a promising agent in the prevention of cardiovascular diseases and control
of glucose homestasis . Nutr. Metab. Cardiovasc. Dis., vol. 20, nr. 8, p. 618 -625.
15) Bouzergoune F., Bitam F., Aberkane M.C., Mosset P., Fetha M.N., Boudjar H., Aberkane
A., 2013. Preliminary Phytochemical and Antimicrobial Activity Investigations on the Aerial
Parts of Helianthemum kahiricum . Chemistry of Natural Compounds, vol. 49, nr. 4,
p. 751 -752.
16) Brandl M.T., 2006. Fitness of human enteric pathogens on plants and implications for food
safety , Annu. Rev. Physiol., vol. 44, p. 367 -392.
17) Bubueanu E., Hlevca C., Iuksel R., Nicu I., Panteli M., Pirvu L.C., 2016. Plant extracts with
antimicrobial -antioxidant effect and process for preparation of two active formulas . Patent
number RO130827 -A2, Derwent primary accession number 2016 -12077H.
18) Calderon -Montano J.M., Burgos.Moron E., Perez -Guerrero C., Lopez -Lazaro M., 2011. A
review on the dietary flavonoid kaempferol , Mini -Reviews in Medicinal Chemistry, vol. 11,
p. 298 -344.
19) Cassidy A., Hansley B., Lamuela -Raventos R.M., 2000. Isoflavones, lignans and stilbenes –
origins, metabolism and potential importance to human health , J. Sci. Food Agric., vol. 80,
p. 1044 -1062.

119
20) Chan Y.S., Cheng L.N., Wu J.H., Chan E., Kwan Y.W., Lee S.M., Leung G.P., Yu P.H.,
Chan S.W., 2011. A review of the pharmacological effects of Arctium lappa (burdock) ,
Infla mmopharmacology, vol. 19, nr. 5, p. 245 -254.
21) Chauhan A.S., Negi P.S., Ramteke R.S., 2007. Antioxidant and antibacterial activities of
aqueous extract of seabuckthorn (Hippophae rhamnoides) seeds , Fitoterapia, vol. 78,
nr. 7-8, p. 590 -592.
22) Cheng D.M., Pogr ebnyak N., Kuhn P., Krueger C.G., Johnson W.D., Raskin I., 2014.
Development and phytochemical characterization of high polyphenol red lettuce with
anti-diabetic properties , PLoS ONE, vol. 17, p. 91571.
23) Chowdhury R., Sahu G.K., Das J., 1996. Stress respon se in pathogenic bacteria , J. Biosci.,
vol. 21, nr. 2, p. 149 -160.
24) Ciulei I., Istudor V., 1995 – Analiza farmacognostica și fitochimică a produselor vegetale ,
vol.II, Editura Tehnoplast Company SRL, București.
25) Claessens J., Roriz M., Merckx R., Baatsen P., Van Mallaert L., Van Eldere J., 2015.
Inefficacy of vancomycin and teicoplanin in eradicating and killing Staphylococcus
epidermidis biofilms in vitro , Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 45, nr. 4, p. 368 -375.
26) Cornelis P., Dingemans J., 2013. Pseudomonas ae ruginosa adapts its iron uptake strategies
in function of the type of infection . Frontiers in Cellular and Infection Microbiology , vol. 3,
article 75.
27) Cueva C., Moreno -Arribas M.V., Martin -Alvarez P.J., Bills G., Vicente M.F., Basilio A.,
Rivas C.L., Reque na T., Rodriguez J.M., Bartolome B., 2010. Antimicrobial activity of
phenolic acids against commensal, probiotic and pathogenic bacteria . Res Microbiol,
vol. 161, nr. 5, p. 372 -382.
28) Cushnie T.P., Lamb A.J., 2006. Assessment of the antibacterial activity o f galangin against
4-quinolone resistant strains of Staphylococcus aureus . Phytomedicine, vol. 13, nr. 3,
p. 187 -191.
29) Daneshmand F., Zare -Zardini H., Tolueinia B., Hasani Z., Ghanbari T., 2013. Crude extract
from Ziziphus jujuba fruits, a weapon against p ediatric infectious disease , Iranian Journal of
Pediatric Hematology Oncology, vol. 3, p. 216 -221.
30) Dastidar S.G., Manna A., Kumar K.A., 2004. Studies on the antibacterial potentiality of
isoflavones , Int. J. Antimicrob. Agents, vol. 23, p. 99 -102.

120
31) De la C alle C., Morata L., Cobor -Trigueros N., Martinez J.A., Cardozo C., Mensa J.,
Soriano A., 2016. Staphylococcus aureus bacteremic pneumonia . Eur. J. Clin. Microbiol.
Infect. Dis., vol. 35, nr. 3, p. 497 -502.
32) Deurenberg R.H., Stobberingh E.E., 2008. The evolu tion of Staphylococcus aureus .
Infection, genetics and evolution, vol. 8, nr. 6, p. 747 -763.
33) Dhiaf A., Abdallah F.B., Bakhrouf A., 2010. Resuscitation of 20 -year starved Salmonella in
seawater and soil , Ann. Microbiol., vol. 60, nr. 1, p. 157 -160.
34) Diekema D.J., Pfaller M.A., Schmitz F.J., Smayevsky J., Bell J., Jones R.N., Beach M.,
2001. Survey of infections due to Staphylococcus species: frequency of occurence and
antimicrobial susceptibility of isolates collected in the United states, Canada, Latin
America, Europe, and the Western Pacific region for the SENTRY Antimicrobial
Surveillance Program, 1997 -1999 . Clin. Infect. Dis., vol. 32, nr. 2, p. 114 -132.
35) Dițu L.M., Chifiriuc M.C., Bezirtzoglou E., Voltsi C., Bleotu C., Pelinescu D., Mihăescu G.,
Lazăr V., 2011. Modulation of virulence and antibiotic susceptibility of enteropathogenic
Escherichia coli strains by Enterococcus faecium probiotic strain culture fractions ,
Anaerobe, vol. 17, p. 448 -451.
36) Eamens G.J., Waldron A.M., Nicholls P.J., 2006. Survival of pathogenic and indicator
bacteria in biosolids applied to agricultural land , Aust. J. Soil Res., vol. 44, nr. 7,
p. 647 -659.
37) Ehrlich G., Hu F., Shen K., Stoodley P., Post J., 2005. Bacterial plurality as a general
mechanism driving persistence in chronic infections , Clin. Orthop. Relat. Res., vol. 437,
p. 20 -24.
38) Fabricant D.S., Farnsworth N.R., 2001. The value of plants used in traditional medicine for
drug discovery , Environ Health Perspect, vol. 109, p. 69.
39) Farias D.F., Souza T.M., Viana M. P., Soares B.M., Cunha A.P., Vasconcelos I.M., Pontes
Silva Ricardo N.M., Pinheiro Ferreira P.M., Maciel Melo V.M., Urano Carvalho A.F., 2013.
Antibacterial, antioxidant, and anticholinesterase activities of plant seed extracts from
brazilian semiarid regi on, BioMed Research International, ID 510736.
40) Fattouch S., Caboni P., Coroneo V., Tuberoso C.i.G., Angioni A., Dessi S., Marzouki N.,
Cabras P., 2007. Antimicrobial activity of Tunisian quince (Cydonia oblonga Miller) pulp
amd peel polyphenolic extracts , J. Afric. Food Chem., vol 55, nr. 3, p. 963 -969.

121
41) Foster P.I., 2005. Stress response and genetic variation in bacteria , Mutat. Res. Fundam.
Mol. Mech. Mutagen, vol. 569, p. 3 -11.
42) Georgescu M., 1983 – Microbiologie medicală și imunologie fundamentală , Editura I.M.F.,
București.
43) Ghafari F., Rajabi M.R., Mazoochi T., Taghizadeh M., Nikzad H., Atlasi M.A., Taherian A.,
2017. Comparing apoptosis and necrosis effects of Arctium lappa root extract and
doxorubicin on MCF7 and MDS -MB-231 cell lines , Asian Pac. J. Canc er Prev., vol. 18,
nr. 3, p. 795 -802.
44) Ghețeu D., 2011 – Virusologie, microbiologie, parazitologie . Suport de curs pentru
specializarea Medicină dentară, Iași.
45) Gird C.E., Costea T., Nencu I., Popescu M.L., Dutu L.E. , 2016 . Phytochemical and
phytobiological research upon aerial parts and seeds from Peucedanum officinale L.,
Farmacia , vol. 63, nr. 2, p. 247-253.
46) Gonzalez C., Rubio M., Romero -Vivas J., Gonzalez M., Picazo J.J., 2003. Staphylococcus
aureus bacteremic penumonia: differences between community and nocosomial acquisition .
Int. J. Infect. Dis., vol. 7, nr. 2, p. 102 -108.
47) Gonzalez M., Guzman B., Rudyk R., Romano E., Molina M.A.A., 2003. Spectrophotometric
determination of phenolic compounds in propolis , Lat. Am. J. Pha rm., vol. 22, p. 243 -248.
48) Granica S., Piwowarski J.P., Czerwińska M.E., Kiss A.K., 2014. Phytochemistry,
pharmacology and traditional uses of different Epilobium species (Onagraceae): A review ,
Journal of ethnopharmacology, DOI: 10.1016/j.jep.2014.08.036.
49) Grey C., Widen C., Adlercreutz P., Rumpunen K., Duan R. -D., 2010. Antiproliferative
effects of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) extracts on human colon and liver
cancer cell lines , Food Chem., vol. 120, nr. 4, p. 1004 -1010.
50) Gull I., Soha il M., Aslam M.S., Athar M.A., 2013 . Phytochemical, toxicological and
antimicrobial evaluation of lawsonia inermis extracts against clinical isolates of pathogenic
bacteria , Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials , vol. 12, nr. 1, p. 36-41.
51) Gunics G., Forkas N., Motohashi N., 2002. Interaction between 3,5 -diacetyl -1,4-
dihydropyridines and ampicilin, and erythromycin on different E. coli strains , International
Journal of Antimicrobial Agents, vol. 20, p. 227 -229.
52) Hamauzu Y., Yasui H., Inno T., Kume C., Omanyuda M., 2005. Phenolic profile,
antioxidant property, and anti -influenza viral activity of Chinese quince (Pseudocydonia

122
sinensis Schneid.), quince (Cydonia oblonga Mill.) and apple (Mallus domestica Mill.)
fruits , J. Agric. Food Chem., vol. 53, nr. 4, p. 928 -934.
53) Han Y.H., Kee J.Y., Kim D.S., Park J., Jeong M.Y., Mun J.G., Park S.J., Lee J.H., Um J.Y.,
Hong S.H., 2016. Anti-obesity effects of Arctii fructus (Arctium lappa) in white/brown
adipocytes and high -fat diet -induced obese mice , Food Funct., vol. 7, nr. 12, p. 5025 -5033.
54) Harrison H.F., Peterson J.K., Snook M.E., Bohac J.R., Jackson D.M., 2003. Quantity and
potential biological activity of caffeic acid in sweer potato (Ipomoea batatas L.) storage root
periderm , J. Agric. Food Chem., vol . 51, p. 2943 -2948.
55) Hartwell L., 1997. Theoretical biology. A robust view of biochemical pathways , Nature, vol.
387, p. 855 -857.
56) Hilliard J.J., Krause H.M., Bernstein J.I., 1995. A comparison of active site binding of 4 –
quinolones and novel flavones gyrase inhibitors to DNA gyrase , Adv. Exp. Med. Biol.,
vol. 390, p. 59 -69.
57) Hollman P.C.H., Arts I.C.W., 2000. Flavonols, flavones and flavanols – nature, occurrence
and dietary burden , J. Food Sci. Agric., vol. 80, p. 1081 -1093.
58) Iinuma K., Tsuboi I., 2012. Zinc ascorbate has superoxide simutase -like activity and in vitro
antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Escherichia coli . Clinical,
Cosmetic and Investigational Dermatology, vol. 5, p. 135 -140.
59) Iqbal J., Siddiqui R., Kazmi S.U., Ahmed N., 20 13. A simple assay to screen antimicrobial
compounds potentiating the activity of current antibiotics , BioMed Research International ,
vol. 2013, article ID 927323.
60) Ivanova D., Vankova D., Nashar M., 2013. Agrimonia eupatoria tea consumption in relation
to markers of inflammation, oxidative status and lipid metabolism in healthy subjects , Arch.
Physiol. Biochem., vol. 119, nr. 1, p. 32 -37.
61) Iwu M.M., 1993 – Handbook of African medicinal plant, CRC Press Inc., Boca Raton,
Florida.
62) Janssen A. M., Scheffer J. J. C., Svendsen A. B., 1987. Antimicrobial activity of essential
oils-A1976 -1986 literature review – Aspects of the test methods , Planta Medica, vol. 5,
p. 395 –398.
63) Jelea M., 2007 – Microbiologia bacteriilor chemolitotrofe fier – și sulfoxidante , Editura
Universității de Nord, Baia Mare.

123
64) Jency B., Chinthu V.S., Nivya R.M., Kumar R. , 2015 . Synergistic antibacterial activity of
natural plant extracts and antibiotics against methicillin resistant Staphylococcus aureus
(MRSA) , World Journal of Pharmacy and Pha rmaceutical Sciences, vol. 4, nr. 3, p. 741–763.
65) Jurikova T., Balla S., Sochor J., Pohanka M., Mlcek J., Baron M., 2013. Flavonoid profile of
Saskatoon berries (Amelanchier alnifolia Nutt.) and their health promoting effects ,
Molecules, vol. 18, p. 12571 -12586.
66) Kahkonen M.P., Hopia A.I., Vuorela H.J., Rauha J.P., Pihlaja K., Kujala T.S., Heinonen M.,
1999. Antioxidant activity of plant extracts containing phenolic compounds , J. Agric. Food
Chem., vol. 47, nr. 10, p. 3954 -3962.
67) Kalemba D., Kunicka A., 2003. Antibacterial and antifungal properties of essential oils ,
Current Medicinal Chemistry, vol. 10, p. 813 –829.
68) Karaca H.C., 2011. Evaluation of natural antimicrobial phenolic compounds against
foodbourne pathogens , University of Kentucky Master’s Theses, Paper 652.
69) Kasai H., Fukada S., Yamaizumi Z., Sugie S., Mori H., 2000. Action of chlorogenic acid in
vegetables and fruits as an inhibitor of 8 -hydroxideoxyguanosine formation in vitro and in a
rat carcinogenesis model , Food and Chemical Toxicology, vol. 38, p. 467 -471.
70) Khodzhimatov M., 1989. Wild-growing medicinal plants of Tadjikistan , Glavnaya
nauchnaya redaktsiya Tadzhikskoi Sovetckoi entsiklopedii, Dushanbe.
71) Khurana S., Venkataraman K., Hollingsworth A., Piche M., Tai T.C., 2013. Polyphenols:
benefits to the cardiovascular system in health and in aging , Nutrients, vol. 5, p. 3779 -3827.
72) Kim H.S., Quon M.J., Kim J. , 2014 . New insights into the mechanisms of poly phenols
beyond antioxidant properties; lessons from the green tea polyphenol, epigallocatechin 3 –
gallate . Redox Biology , vol. 2, p. 187–195.
73) Kim W.J., Park S.C. , 1998 . Bacterial resistance to antimicrobial agents: an overview from
Korea . Yonsei Medical Journal , vol. 39, nr. 6, p. 488-494.
74) Kipnis E ., Sawa T ., Wiener -Kronish J. , 2006. Targeting mechanisms of Pseudomonas
aeruginosa pathogenesis . Med . Mal. Infect ., vol. 36, p. 78–91.
75) Kiss A., Kowalski J., Melzig M.F., 2004. Compounds from Epilobium angustifolium inhibit
the specific metallopeptidases ACE, NEP and APN , Planta medica, vol. 70, nr. 10,
p. 919 -923.
76) Kiss A.K., Bazylko A., Filipek A., Granica S., Jaszewska E., Kiarszys U., Kośmider A.,
Piwowarski J., 2011. Oenothein B’s contribution to th e anti -inflammatory and antioxidant

124
activity of Epilobium sp., Phytomedicine: international journal of phytotherapy and
phytopharmacology, vol. 18, nr. 7, p. 557 -560.
77) Kollef M.H., Shorr A., Tabak Y.P., Gupta V., Liu L.Z., Johannesc R.S., 2005. Epidemiology
and outcomes of health -care-associated pneumonia: results from a large US detabase of
culture -positive pneumonia . Chest, vol. 128, nr. 6, p. 3854 -3862.
78) Kordali S., Cakir A., Ozer H., Cakmakci R., Kesdek M., Mete E., 2008. Antifungal,
phytotoxic and insect icidal properties of essential oil isolated from Turkish Origanum
acutidens and its three components, carvacrol, thymol and p -cymene , Bioresource
Technology, vol. 99, p. 8788 -8795.
79) Kosalec I., Kopjar I., Kremer D., 2013. Antimicrobial activity of willowher b (Epilobium
angustifolium L.) leaves and flowers , Current Drug Targets, vol. 14, nr. 9, p. 986 -991.
80) Kristiansen J.E., Amaral L., 1997. The potential management of resistant infections with
non-antibiotics . J Antimicrob chemother, vol. 40, nr. 3, p. 319 -327.
81) Lala G., Malik M., Zhao C., He J., Kwon Y., Giusti M.M., Magnuson B.A., 2006.
Anthocyanin -rich extracts inhibit multiple biomarkers of colon cancer in rats , Nutrition and
Cancer, vol. 54, nr. 1, p. 84 -93.
82) Lazăr V., 2003 – Microbial adherence , Romanian A cademy Press, Bucharest.
83) Li W., Li N., Tang Y., Li B., Liu L., Zhang X., Fu H., Duan J., 2012. Biological activity
evaluation and structure -activity relationships analysis of ferulic acid and caffeic acid
derivatives for anticancer , Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, vol. 22, p. 6085 –
6088.
84) Liu C., Hofstra N., Franz E., 2013. Impacts of climate change on the microbial safety of pre –
harvest leafy green vegetables as indicated by Escherichia coli O157 and salmonella spp. ,
Int. J. Food Microbiol., vol. 163, nr. 2 -3, p. 119 -128.
85) Lorenzi V., Muselli A., Bernardini A.F., Berti L., Page J. -M., Amaral L., Bolla J. -M., 2009.
Geraniol restores antibiotic activities against multidrug -resistant isolates from Gram –
negative species , Antimicrobial Agents and Chemoth erapy, vol. 53, p. 2209 -2211.
86) Lowy F.D., 2003. Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus .
J. Clin. Invest., vol. 111, nr. 9, p. 1265 -1273.
87) Mallea M., Chevalier J., Bornet C., Eyraud A., Davin -Regli A., Bollet C., Pages J. M., 1998.
Porin alteration and active effl ux: two in vivo drug resistance strategies used by
Enterobacter aerogenes , Microbiology, vol. 144, p. 3003 –3009.

125
88) Manach C., Scalbert A., Morand C., Remesy C., Jimenez L., 2004. Polyphenols: food
sources and bioavailability , Am. J. Clin. Nutr., vol. 79, p. 727 -747.
89) Mantle D., Eddeb F., Pickering A.T., 2000. Comparison of relative antioxidant activities of
British medicinal plant species in vitro , J. Ethnopharmacol., vol. 72, nr. 1 -2, p. 47 -51.
90) Marcusson L.L., 2007. Resistance to Fluoroquinolones in Escherichia coli : Prevention,
Genetics and Fitness Costs , Acta Universitatis Upsaliensis Uppsala.
91) Martinez -Urtaza J., Saco M., de Novoa J., Perez -Pineiro P., Peiteado J., Lozano -Leon A.,
Garcia -Martin O., 2004. Influence of environmental factors and human activity on the
presence of Salmonella serovars in a marine environment , Appl. Environ. Microbiol.,
vol. 70, nr. 4, p. 2089 -2097.
92) McKay D.L., Blumberg J.B., 2006. – A Review of the Bioactivity and Potential Health
Benefit s of Peppermint Tea ( Mentha piperita L.), Phytother. Res., vol. 20, p. 619 –633.
93) Meenatchisundaram S., Parameswari G., Sunny D., Brinda M., Subbraj T., Suganya T.,
Michael A., 2009. Pharmacological Activities of Mentha piperita – Mini Review -,
Ethnobotanical Leaflets, vol. 13, p. 213 -14.
94) Meng S., Cao J., Feng Q., Peng J., Hu Y., 2013. Roles of ghlorogenic acid on regulating
glucose and lipids metabolism: a review , Evidence -Based Complementary and Alternativa
Medicine, ID 801457.
95) Metrouh -Amir H. , Duarte C.M.M. , Maiza F., 2015. Solvent effect on total phenolic contents,
antioxidant, and antibacterial activities of Matricaria pubescens , Industrial Crops and
Products , vol. 67, p. 249 –256.
96) Moerman D.E., 2003. Native American ethnobotany. A database of foods, drugs, dyes and
fibers of Native american peoples, derived from plants , http://naeb.brit.org/ .
97) Moradkhani H., Sargsyan E., Bibak H., Naseri B., Sadat -Hosseini M., Fayazi -Barjin A.,
Meftahizade H., 2010. – Melissa officinalis L ., a valuable medicine plant: A review , Journal
of Medicinal Plants Research, vol. 4, nr. 25, p. 2753 -2759.
98) Negi A.S., Luqman S., Srivastava S., Krishna V., Gupta N., Darokar M.P., 2011.
Antiproliferative and antioxidant activities of Juglans regia fruit extracts , Pharm Biol,
vol. 49, nr. 6, p. 669 -673.
99) Nicu A.I., Pirvu L., Vamanu A., Stoian G., 2016. The Europen beech leaves extract has an
antibacterial effect by inducing oxidative stress . Romanian Biotechnological Letters, vol. 22,
nr. 6, p. 12071 -1208 0.

126
100) Nunez L., D’Aquino M., 2012. Microbicide activity od clove essential oil (Eugenia
caryophyllata) , Brazilian Journal of Microbiology, p. 1255 -1260.
101) Nweze E.I., Eze E.E., 2009. Justification for the use of Ocimum gratissimum L in herba
medicine and its interaction with disc antibiotics , BMC Complementary and Alternative
Medicine, vol. 9, p. 37 -42.
102) Oliveira A.P., Costa R.M., Magalhaes A.S., Pereira J.A., Carvalho M., Valentao P.,
Andrade P.B., Silva B.M., 2012. Targeted metabolites and biological activit ies of Cydonia
oblonga Miller leaves , Food Res. Int., vol. 46, nr. 2, p. 496 -504.
103) Oliveira A.P., Pereira J.A., Andrade P.B., Valentao P., Seabra R.M., Silva B.M., 2007.
Phenolic profile of Cydonia oblonga Miller leaves , J. Agric. Food Chem., vol. 55, nr. 1 9,
p. 7926 -7930.
104) Olsson M.E., Gustavsson K -E., Andersson S., Nilsson A., Duan R -D., 2004. Inhibition of
cancer cell proliferation in vitro by fruit and berry extracts and correlations with
antioxidant levels , Journal of Agriculture and Food Chemistry, vol. 52, nr. 24, p. 7264 -7271.
105) Olthof M., Hollman P., Katan M., 2001. Chlorogenic acid and caffeic acid are absorbed
in humans . J. Nutr., vol. 131, p. 66 -71.
106) Otto M., 2009. Staphylococcus epidermidis – the “accidental” pathogen , Nat. Rev.
Microbiol. , vol. 7, nr. 8, p. 555–567.
107) Otto M., 2014. Staphylococcus epidermidis pathogenesis , Methods Mol. Biol., vol. 1106,
p. 17 -31.
108) Pandey K.B., Rizvi S.I., 2009. Plant polyphenols as dietary antioxidants in human health
and disease , Oxid. Med. Cell. Longev. , vol. 2, p. 270 –278.
109) Parvu C., 1997. Universul plantelor. Mica enciclopedie , Ed. Enciclopedica, București.
110) Pintilie L., Stefaniu A., Nicu A.I., Caproiu M.T., Maganu M., 2016. Synthesis,
antimicrobial activity and docking studies of novel 8 -chloro -quinolones . Revist a de Chimie,
vol. 67, nr. 3, p. 438 -445.
111) Pink D., Moeller J., Quinn B., Jericho M., Beveridge T. , 2000 . On the architecture of the
Gram -negative bacterial murein sacculus . J. Bacteriol., vol. 182, nr. 20, p. 5925 -5930.
112) Pirvu L., Barbulescu D., Nichita C., Nita S., Colceru Mihul S., 2011. Obtaining and
chemical characterization of some vegetal extracts with corrosion -scaling inhibition
properties. Part II. Juglans folium and Agrimoniae herba extracts. Romanian
Biotechnological Letters, vol. 16, nr.1, p. 5937 -5944.

127
113) Pirvu L., Coprean D., Nicu I., Neagu G., 2016. Studies on Agrimoniae herba selective
extracts; polyphenols content, antioxidant and antimicrobial potency, MTS test . Annals of
the Academy of Romanian Scientists Series on Biological Sciences, vol. 5, nr. 1, p. 96 -107.
114) Pirvu L., Hlevca C., Nicu I., Bubueanu C., 2014. Comparative analytical, antioxidant
and antimicrobial activity studies on a series of vegetal extracts prepared from eight plant
species growing in Romania . Journal of Planar Chromatography , vol. 27, nr. 5, p. 346 -356.
115) Pirvu L., Nicu I., 2017. Polyphenols content, antioxidant and antimicrobial activity of
ethanol extracts from the aerial part of rock rose (Helianthemum nummularium) species .
Journal of Agricultural Science and Technology A, vol. 7, p. 61 -67.
116) Pirvu , L., Armatu, A., Bubueanu, C., Pintilie, G., Nita, S. , 2010 . Obtaining and chemical
characterization of some vefetal extracts with corrosion -scaling inhibition properties. Part I.
Fagus sylvatica L. and Alii cepae bulbus extracts , Romanian Biotechnological Letters ,
vol. 15, nr. 6, p. 5683 -5689;
117) Pischel I., Burkard N., Kauschka M., Butterweck V., Bloomer R.J., 2011. Potential
application of Russian Tarragon (Artemisia dracunculus L.) in health and sports , Journal of
the International Society of Sports Nutrition, vol. 8, p. 16.
118) Pitschmann A., Zehl M., Atanasov A.G., Dirsch V.M., Heiss E., Glasl S., 2014. Walnut
leaf extract inhibits PTP1B and enhances glucose -uptake in vitro , Ethnopharmacol, vol. 152,
nr. 3, p. 599 -602.
119) Pop M., Lupea A.X., Turcu V., 2008. Studies on the Pholyphenolics Compounds
Extraction from Vaccinium Fruits . Revista de Chimie , vol. 59, nr. 5, p. 491 -494.
120) Posadzki P., Watson L., Ernst E. , 2012 . Herb -drug interactions: a overview of systematic
reviews , British Journal of Clinical Pharmacology , vol. 75, nr. 3, p. 603-6018.
121) Pourmorad F., Ebrahimzadeh M.A., Mahmoudi M., Yasini S., 2007. Antinociceptive
activity of methanolic extract of Epilobium hirsutum , Pak. J. Biol. Sci., vol. 10, nr. 16,
p. 2764 -2767.
122) Puupponen -Pimia R., Nohynek L., Meier C., Kahkonen M., Heinonen M., Hopia A.,
Oksman -Caldentey K.M., 2001. Antimicrobial properties of phenolic compounds from
berries , J. Agric. App. Microbiol., vol. 90, nr. 4, p. 494 -507.
123) Qiao L.D., Chen S., Yang Y., Zhan g K., Zheng B., Guo H.F., Yang B., Niu Y.J., Wang
Y., Shi B.K., Yang W.M., Zhao X.K., Gao X.F., Chen M., Tian Y., 2014. Characteristics of

128
urinary tract infection pathogens and their in vitro susceptibility to antimicrobial agents in
China: data from a mul ticenter study , BMJ Open, vol. 3, e004152.
124) Ramachandran G., 2014. Gram -positive and Gram -negative vacterial toxins in sepsis: a
brief review , vol. 1, nr. 5, p. 213 -218.
125) Ramos -Escudero F., Munoz A.M., Alvarado -Ortiz C., Alvarado A., Yanez J.A., 2012.
Purple corn (Zea mays L.) phenolic compounds profile and its assessment as an agent
against oxidative stress in isolated mouse organs , J. Med. Food, vol. 15, p. 206 -215.
126) Rauha J.P., Remes S., Heinonen M., Hopia A.I., Kahkonen M., Kujala T.S., Pihlaja K.,
Vuorela H., Vuorela P., 2000. Antimicrobial effects of Finnish plant extracts containing
flavonoids and other phenolic compounds , Int. J. Food Microbiol., vol. 56, p. 3 -12.
127) Reich E., Schibli A., 2008. HPTLC for the Analysis of Medicinal Plants , Thieme, N.Y. –
Stutt gart.
128) Rein M. , 2012 . Bioavailability of bioactive food compounds: a challenging journey to
bioefficacy . British Journal of Clinical Pharmacology , vol. 75, nr. 3, p. 588-602.
129) Rho H.S., Ghimeray A.K., Yoo D.S., Ahn S.M., Kwon S.S., Lee K.H., Cho D.H., Cho
J.Y., 2011. Kaempferol and kaempferol rhamnosides with depigmentation and anti –
inflammatory properties , Molecules, vol. 16, p. 3338 -3344.
130) Roby M.H.H., Sarhan M.A., Selim K.A. -H., Khalel K.I., 2013. Evaluation of antioxidant
activity, total phenols and pheno lic compounds in thyme (Thymus vulgaris L.), sage (Salvia
officinalis L.), and marjoram (Origanum mojarana L.) extracts , Industrial Crops and
Products, vol. 43, p.827 – 831.
131) Rogers K.L., Fey P.D., Rupp M.E., 2009. Coagulase -negative staphylococcal infections .
Infect. Dis. Clin. North Am., vol. 23, nr. 1, p. 73 -98.
132) Rosch D., Bergmann M., Knorr D., Kroh L.W., 2003. Structure -antioxidant efficiency
relationships of phenolic compounds and their contribution to the antioxidant activity af sea
buckthorn j uice, J. Agric. Food Chem., vol. 51, nr. 15, p. 4233 -4239.
133) Rousseau J., 1947. Ethnobotanique Abenakise Montreal , Archives de Folklore, vol. 11, p.
145-182.
134) Sadikot R .T., Blackwell T .S., Christman J .W., Prince A .S., 2005 . Pathogen -host
Interactions in Pseudomonas aeruginosa pneumonia , Am. J. Respir. Crit. Care Med. ,
vol. 171, p. 1209 –1223.

129
135) Sanders C.S., 2011. Sanders Lab Protocols.
136) Sarathbabu R., Rajumari N., Ramanim T.V., 2013. Characterization of coagulase
negative staphyloccoci isolated frum urine, pus, sputum and blood samples , Int. J. Pharm.
Sci. Invent., vol. 2, nr. 1, p. 37 -46.
137) Saravanan S., Parimelazhagan T., 2014 . In vitro antioxidant, antimicrobial and anti –
diabetic properties of polyphenols of Passiflora ligularis Juss. fruit pulp . Food Scie nce and
Human Wellness , vol. 3, p. 56–64.
138) Sayyah M., Nadjafnia L., Kamalinejad M., 2004. Anticonvulsant activity and chemical
composition of Artemisia dracunculus L. essential oil , Journal of Ethnopharmacology, vol.
94, nr. 2 -3, p. 283 -287.
139) Schmitt J., Ferro A. , 2013 . Nutraceuticals: is there good science behind the hype? ,
British Journal of Clinical Pharmacology , vol. 75, p. 3, p. 585-587.
140) Schultz M .J., Rijneveld W ., Flor quin S ., Edwards C.K., Dinarello C.A., van der Poll T.,
2002. Role of interleukin -1 in the pulmonary immune response during Pseudomonas
aeruginosa pneumonia . Am . J. Physiol . Lung Cell . Mol. Physiol ., vol. 282, nr. 2, p. 285–290.
141) Selway J.W.T., 1986 – Antiviral activity of flavones and flavans. Plant flavonoids in
biology and medicine: biochemical, pharmacological, and structure -activity relationships ,
Alan R. Liss Inc., New York.
142) Senthilkumar A., Venkatesalu V., 2013. Chemical constituents, in vitro antioxidant and
antimicrobial activities of essential oil from the fruit pulp of wood ap ple, Industrial Crops
and Products, vol. 46, p. 66 -72.
143) Shan B., Cai Y. Z., Sun M., Corke H., 2005. Antioxidant capacity of 26 spice extracts
and characterization of their phenolic constituents , J. Agric. Food Chem., vol. 53,
p. 7749 –7759.
144) Shivapriya S., I lango K., Dubey G.P., 2015. Evaluation of antioxidant and
neuroprotective effect of Hippophae rhamnoides (L.) on oxidative stress induced cytotoxicity
in human neural cell line IMR32 , Saudi J. Biol. Sci., vol. 22, nr. 5, p. 645 -650.
145) Shrestha S., Subaramaih ha S.R., Pasura Subbaiah S.G., Birur Eshwarappa R.S.,
Lakkappa D.B., 2013. Evaluating the antimicrobial activity of methanolic extract of Rhus
succedanea leaf gall , BioImpacts, vol. 4, p. 195 -198.

130
146) Sibanda T., Okoh A.I. , 2007. The challenges of overcoming a ntibiotic resistance: Plant
extracts as potential sources of antimicrobial and resistance modifying agents , Afr. J.
Biotech. , vol. 6, p. 2886 -2896.
147) Silva B.M., Valentao P., Seabra R.M., Andrade P.B., 2008. Quince (Cydonia oblonga
Miller): an interesting dietary source of bioactive compounds , Food Chem. Res. Dev.,
p. 243 -266.
148) Singh G., Maurya S., de Lampasona M. P., Catalan C. A. N., 2007. A comparison of
chemical, antioxidant and antimicrobial studies of cinnamon leaf and bark volatile oils,
oleoresins a nd their constituents , Food and Chemical Toxicology, vol. 45, p. 1650 –1661.
149) Stefanovic O., Comic L. , 2012 . Synergistic antibacterial interaction between Melissa
officinalis extracts and antibiotics . Journal of Applied Pharmaceutical Science , vol. 2, nr. 1,
p. 01-05.
150) Stelling J., Klamt S., Bettenbrock K., Schuster S., Gilles E.D., 2002. Metabolic network
structure determines key aspects of functionality and regulation , Nature, vol. 420,
p. 190 -193.
151) Strahilevitz J., Jacoby G.A., David C., Hooper D., Robicsek A., 2009. Plasmid -Mediated
Quinolone Resistance: a Multifaceted Threat , Clin. Microbiol. Rev. , vol. 22, p. 664 -670.
152) Sutovska M., Capek P., Franova S., Pawlaczyk I., Gancarz R., 2012. Antitussive and
bronchodilatory effects of Lythrum salicaria polysaccharide -polyphenolic conjugate , Int. J.
Biol. Macromol., vol. 51, nr. 5, p. 794 -799.
153) Takem E.N., Roca A., Cunnington A., 2014. The association between malaria and non –
typhoid Salmonella bacteraemia in children in sub -Saharan Africa: a literature review ,
Malar. J., vol. 13, nr. 1, p. 400 -412.
154) Teschke R., Frenzel C., Glass X., Schulze J., Eickhoff A. , 2012 . Herbal hepatotoxicity: a
critical review , British Journal of clinical Pharmacology , vol. 75, nr. 3, p. 630-636.
155) Thongson C., Davidson P. M., Mahakarnchanakul W., Weiss J., 2004. Antimicrobial
activity of ultrasound -assisted solvent -extracted spices , Letters in Applied Microbiology,
vol. 39, p. 401 –406.
156) Thusoo S., Gupta S., Sudan R., Kour J., Bhagat S., Hussain R., Bhagat M., 2014.
Antioxidant activity of essential oil and extracts of Valeriana jatamansi roots , BioMed
Research International, ID 614187.

131
157) Tiwari R.P., Bharti S.K., Kaur H.D., Di kshit R.P., Hoondal G.S., 2005. Synergistic
antimicrobial activity of tea & antibiotics , Indian J . Med. Res., vol. 122, p. 80-84.
158) Toiu A., Vlase L., Dragoi C.M., Vodnar D., Oniga I. , 2016. Phytochemical analysis,
antioxidant and antibacterial activities of Hypericum hifusum L. (Hypericaceae) , Farmacia ,
vol. 65 nr. 5, p. 663-667
159) Tonari K., Mitsui M., Yonemoto K., 2002. Structure and antibacterial activity of
cinnamic acid related compounds , J. Oleo. Sci., vol. 51, p. 271 -273.
160) Trautmann M ., Lepper P .M., Haller M ., 2005. Ecology of Pseudomonas aeruginosa in
the in tensive care unit and the evolving role of water outlets as a reservoir of the organism .
Am. J Infect. Control , vol. 33, p. 41–49.
161) Tunalier Z., Kosar M., Kupeli E., Calis I., Baser K.H.C., 2007. Antioxidant, anti –
inflammatory, anti -nociceptive activities a nd composition of Lythrum salicaria L. extracts , J.
Ethnopharmacol., vol. 110, nr. 3, p. 539 -547.
162) Umar A., Iskandar G., Aikemu A., Yiming W., Zhou W., Berke B., Begaud B.,
Moore N., 2015. Effects of Cydonia oblonga Miller leaf and fruit flavonoids on bloo d lipids
and anti -oxidant potential in hyperlipidemia rats , J. Ethnopharmacol., vol. 169, p. 239 -243.
163) Upadhyay N.K., Yogendra Kumar M.S., Gupta A., 2011. Antioxidant, cytoprotective and
antibacterial effects of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) leave s, Food Chem. Tox.,
vol. 48, nr. 12, p. 3443 -3448.
164) Veesenmeyer J.L., Hauser A.R., Lisboa T., Rello J., 2009 . Pseudomonas aeruginosa
Virulence and Therapy: Evolving Translational Strategies . Crit. Care Med ., vol. 37, nr. 5,
p. 1777 –1786.
165) Viuda -Martos M., Sendra E., Perez -Alvarez J.A., Abrini J., 2011. Identification of
Flavonoid Content and Chemical Composition of the Essential Oils of Moroccan Herbs:
Myrtle (Myrtus communis L.), Rockrose (Cistus ladanifer L.) and Montpellier cistus (Cistu s
monspeliensis L.) . Journal of Essential Oil Research, vol. 2, nr. 2, p. 1 -9.
166) Vollmer W., Blanot D., de Pedro M.A., 2008. Peptidoglycan structure and architecture ,
FEMS Microbiol. Rev., vol. 32, p. 149 -167.
167) Wagner, H., Bladt, S., 1996 – Plant Drug Analysis . Second Ed., Springer.
168) Weerakkody N.S., Caff in N., Turner M.S., Dykes G.A., 2010 . In vitro antimicrobial
activity of less -utilized spice and herb extracts against selected food -borne bacteria. Food
Control , vol. 21, p. 1408 –1414.

132
169) Wiles, T.J., Kulesus, R.R., Mulvey, M.A. , 2008 . Origins and Virulence Mechanisms of
Uropathogenic Escherichia coli , Exp. Mol. Pathol. , vol. 85, nr. 1, p. 11-19.
170) Wise R., 2002. Antimicrobial resistance: priorities for action , J. Antimicrob.
Chemother., vol. 49, p. 585 -586.
171) Woodford, N., 2007 . Molecular epidemiology of multi resistant Escherichia coli isolates
from community onset urinary tract infections in Cornwall, England , J. Antimicrob.
Chemother. , vol. 59, nr. 1, p. 106-109.
172) Wu X., Gu L., Prior R.L., McKay S., 2004. Characterization of anthocyanins and
proanthocyanidins in some cultivars of Ribes, Aronia and Sambucus and their antioxidant
capacity , J. Agric. Food Chem., vol. 52, nr. 26, p. 7846 -7856.
173) Yao Y., Sturdevan t D.E., Otto M., 2005. Genomewide analysis of gene expression in
Staphylococcus epidermidis biofilms: insights into the pathopsisyology of S. epidermidis
biofilms and the role of phenol -soluble modulins in formation of biofilms. J. Infect. Dis.,
vol. 191, nr. 2, p. 289 -298.
174) Zarringhalam M., Zarringhalam J., Shadnoush M., Safaeyan F., Tekieh E., 2012.
Inhibitory effect of black and red pepper and thyme extracts and essential oils on
Enterohemorrhagic Escherichia coli and DNase activity of Staplylococcus aur eus, Iranian
Journal of Pharmaceutical research, vol. 12, nr. 3, p. 363 -369.
175) Zhang L., Ravipati A.S., Koyyalamudi S.R., Jeong S.C., Reddy N., Bartlett J., Smith
P.T., de la Cruz M., Monteiro M.C., Melguizo Á., Jiménez E., Vicent F., 2013. Anti-fungal
and a nti-bacterial activities of ethanol extracts of selected traditional Chinese medicinal
herbs , Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, vol. 6, nr. 9, p. 673 -681.