Draft Aprilie 2018 [302439]

Universitatea din București

Facultatea de Biologie

LUCRARE DE LICENȚĂ

Coordonator știintific:

Lect. Dr. Dana CUCU

Absolvent: [anonimizat]-Adrian VLĂICULESCU

2018

Universitatea din București

Facultatea de Biologie

SI CANALULUI IONIC TRPA1 ÎN CELULELE TUMORALE

Coordonator științific:

. Dr. Dana CUCU

Absolvent: [anonimizat]-Adrian VLĂICULESCU

2018

[anonimizat]-[anonimizat]1-human TRPA1

HClO-[anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]-[anonimizat]-Transient Receptor Potential Vanilloid

CUPRINS

ABREVIERI…………………………………..……………………..i

INTRODUCERE………………….…………………….……………5

CAPITOLUL 1. ASPECTE TEORETICE PRIVIND CANALUL TRPA1

Familia canalelor ionice TRP……………….

Caracteristici structurale ale TRPA1…………………..

Funcționalitatea canalului TRPA1……………………….

Rolul canalului TRPA1………………..……..

1.4.1. [anonimizat] a canalului TRPA1

1.4.1.1. TRPA1 la insecte……………….

1.4.1.2. TRPA1 la nematode……………….

1.4.1.3 TRPA1 la vertebratele ectoterme…………….

1.4.1.4 TRPA1 la mamifere………………….

Relația dintre canalele TRPA1 și TRPV1…………………….

Rolul canalelor TRP în cancer………….

1.6.1. Canalele TRPM în cancer………………

1.6.2. Canalele TRPV în cancer……………..

1.6.3. Canalele TRPC în cancer………………….

CAPITOLUL 2. MATERIALE SI METODE………………………….

Studiu experimental…………………………………………….

CAPITOLUL 3. REZULTATE SI DISCUTII…………………………..

CAPITOLUL 4. CONCLUZII…………………………………………..

Bibliografie………………………………………………………

INTRODUCERE

Transportul regulat al ionilor canale ionice mediază o [anonimizat]. [anonimizat] (canale de K, Na, Ca, Cl), [anonimizat], [anonimizat] (GABA), acetil colină (Ach), si canale specializate (conexine, canale operate mecanic). Astfel, disfuncția acestor canale afectează procesele fiziologice (Bagal, Brown et al. 2013). Canalele TRP sunt un grup de canale ionice ce funcționează ca senzori celulari pentru o [anonimizat]2+, temperatură, [anonimizat] (Zheng 2013).

Canalele Transient Receptor Potential (TRP) au fost inițial descoperite la Drosophila melanogaster(Minke 2010) [anonimizat]-se implicatiile acestora în diverse tipuri de maladii. Expunerea prelungită la lumina puternică arată un flux tranzient de calciu în celulele fotoreceptoare de la musculița de oțet. [anonimizat] a fost denumită “trp”. Această descoperire a [anonimizat] „canonice”, datorită asemănării cu cele de la Drosophila (Wes, Chevesich et al. 1995).

Canalele TRP sunt mediatori importanți ai semnalelor senzoriale cu efecte marcante asupra funcțiilor celulare și căilor de semnalizare. Mutațiile în genele ce codifică aceste canale sunt cauza a numeroase boli ereditare la om (Canalopatiile TRP), ce afectează sistemele cardiovascular, renal, osos și nervos. Canalele TRP sunt de asemenea ținte promițătoare pentrucompuși naturali cu potențial terapeutic. Spre exemplu, TRPV1 este supraexprimat într-o populație de neuroni senzoriali unde mediază excitația și ulterior desensibilizarea pentru capsaicină și analogul său mult mai potent, resiniferatoxină. Resiniferatoxina a fost studiată de Iadarola și Mannes ca și agonist al TRPV1 ce ar putea contracara durerea provocată de cancer(Kaneko and Szallasi 2014).

Activarea canalelor TRP permite trecerea cationilor prin membrană si depolarizează celulele, ducând la un număr mare de răspunsuri celulare. Aceste canale îndeplinesc diverse roluri fiziologice și sunt cel mai probabil prezente la nivelul tuturor celulelor din corpul uman (Nilius 2013).

La mamifere, au fost descoperite în total 28 de canale TRP. Acestea sunt grupate după similaritatea de secvență în subfamiliile TRPC (Canonical), TRPM (Melastatin), TRPV (Vanilloid), TRPA (Ankyrin), TRPML (Mucolipin) și TRPP (Polycystin) (Zheng 2013).

Anumite canale TRP, precum TRPV1, TRPM8, TRPA1 sunt exprimate în neuroni senzoriali nociceptivi. Cercetările folosind animale modificate genetic și agenți farmacologici au confirmat că aceste canale TRP sunt implicate în generarea și transmiterea senzației dureroaseși astfel reprezintă ținte pentru dezvoltarea de agenți analgezici noi (Brederson, Kym et al. 2013).

Din superfamilia canalelor TRP, TRPA1 este singurul membru al grupului TRPA și este exprimat predominant în neuroni senzoriali, precum și în celule ale părului și pielii (Wu et al., 2010). TRPA1 este considerat a fi un chemosenzor și este implicat în canalopatia TRP asociată cu durere. TRPA1 este de asemenea exprimat în sistemul vascular și digestiv. Deși nu s-a demonstrat că TRPA1 ar fi direct implicat în cancer, este implicat în inflamatia intestinală ce este corelată cu cancerul de colon(Wu et al., 2010). Canalele TRP, în special TRPA1 și TRPV1 sunt

activate de compuși iritanți, majoritatea prezenți în condimente. Agoniști ai TRPA1 sunt alilizotiocianatul (AITC) si cinamaldehida (CAN), prezente în uleiul de muștar și în scorțisoară (Paulsen, Armache et al. 2015).

Alilizotiocianatul (AITC) este un compus natural ce posedă atât activitate bactericidă, cât și proprietați anti cancer. Cele mai multe vegetale crucifere sunt surse de AITC în cantitați considerabile, și printre acestea se numără muștarul, wasabi și varza. Proprietățile bactericide și fungicide ale AITC au fost demonstrate împotriva multor patogeni, și abilitățile sale împotriva cancerului au fost dovedite atât în celule cultivate in vitro, cât și pe modele animale. Bioactivitatea AITC este foarte mare, aproape 90% din cantitatea administrată este absorbită (Geng, Tang et al. 2011).

Alți activatori ai canalului Transient Receptor Potential Ankirin 1 (TRPA1) sunt produșii virali si bacterieni. Rolul TRPA1 in acest caz este de detectare si răspuns. Dovezile cele mai convingătoare provin din descoperirea că TRPA1 este activat de lipopolizaharide, sau endotoxine, ce reprezinta principalul imunostimulant prezent la bacteriile Gram-negative, cauzând activarea rapidă a nociceptorilor (Meseguer, Alpizar et al. 2014). De asemenea, activarea TRPA1 de către lipopolizaharide în nociceptorii vagali și somatici a dus la eliberarea locală de neuropeptide, provocînd durere, inflamație neurogenică și vasodilatație. Spre deosebire de răspunsurile imune tradiționale, care sunt lente, aceste efecte ale produșilor bacterieni toxici sunt foarte rapide, de ordinul secundelor de la aplicare (Poltorak, He et al. 1998).

În ceea ce privește inflamația, în timpul acesteia sistemul imunitar eliberează factori solubili care susțin refacerea țesutului, suprimă inflamația si reduc durerea. Printre acești factori endogeni se află clase de mediatori lipidici, printre care si resolvinele, ce acționează ca și inhibitori ai TRPV1 si TRPA1, reducând durerea inflamatorie (Park, Xu et al. 2011).

Activitatea TRPA1 a fost corelată cu patofiziologia unor afecțiuni precum migrenele și neuropatiile periferice asociate cu diabetul sau chimioterapia (Eberhardt, Filipovic et al. 2012). Mecanismul activității TRPA1 în migrene presupune activarea sa de către agenți iritanți și provocatori de durere, și astfel are loc eliberarea peptidei pro migrene, CGRP pe această cale neurală. Unii activatori ai TRPA1 sunt cunoscuți ca declanșatori ai migrenelor (nitroglicerină,partenolid) (Benemei, Fusi et al. 2014).

TRPA1 este de asemenea fundamental pentru manifestarea unor forme de iritație, o senzație ce induce scărpinatul, cu rol de apărare împotriva paraziților externi și airitanților. TRPA1 participă și în alte afecțiuni cutanate, precum dermatita alergică de contact(Oh, Oh et al. 2013).

Un rol deosebit al TRPA1 a fost descoperit prin caracterizarea Caenorhabiditis elegans, cu privire la gena Trpa1. Acești viermi, precum multiple animale, trăiesc mai mult în climate reci. Studiile sugerează că durata de viață a C. elegans este reglată de o cascadă de semnalizare ce presupune activarea dependentă de temperaturi scăzute a TRPA1, influx de Ca2+ și activarea factorului de transcripție DAF-16/FOXO. Activarea acestei căi a dus la creșterea duratei de viață în viermii adulți, dar a avut efect opus la larve (Xiao, Zhang et al. 2013).

Cancerul pancreatic este o problemă de sănătate majoră, mai ales deoarece tratamentele convenționale pentru cancer nu sunt foarte eficiente. Aproape toți pacienții ce suferă de cancer pancreatic dezvoltă metastaze urmate de deces. Mulți pacienti prezintă mutații ale oncogenei K-ras, dar de asemenea numeroase gene supresor tumorale sunt inactivate. Prognosticul acestei boli este sumbru, 15-20% dintre pacienti sunt eligibili pentru rezecție, dar doar 20% din aceștia supraviețuiesc 5 ani de la realizarea procedurii. Pentru tumorile in stadiu avansat, cu metastaze, tratamentul actual cu gemcitabină și chemoiradiere este relativ ineficient. Cu toate acestea, cele mai promițătoare par a fi strategiile bazate pe biologia moleculară a cancerului pancreatic (Li, Xie et al. 2004).

Un rol important în progresia adenocarcinomului pancreatic ductal (PDAC) îl au celulele pancreatice stelate (PSC). Odată activate, PSC susțin proliferarea și metastaza celulelor tumorale. Studiul realizat de Storck, Hild și colab. este printre primele ce studiază expresia și funcția canalelor ionice în celulele pancreatice stelate. Aceștia au descoperit că celulele pancreatice stelate exprimă canale KCa3.1, a căror activitate este necesară pentru migrare, și că acestea cooperează cu TRPC3 pentru a-și exercita funcția (Storck, Hild et al. 2017).

Implicarea TRPA1 în cancer în mod direct nu a fost demonstrată încă, insă acesta este implicat în inflamația intestinală, ce este asociată cu cancerul de colon, și Schaefer și colab. au demonstrat că activatori ai TRPA1, precum izotiocianatul de alil, prin inhalare, promovează viabilitatea și proliferarea celulelor carcinomului pulmonar cu celule mici (Schaefer, Stohr et al. 2013) (Engel, Leffler et al. 2011).

Hayashi, Nakamura și colab. au folosit AITC, agonist al TRPA1 într-un experiment de wound healing circular al epiteliului gastric. AITC a prevenit repararea zgârieturii în celulele de epiteliu gastric de șoarece

Scopul acestui studiu este determinarea funcției canalului Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) în celulele adenocarcinomului pancreatic ductal din multiple linii celulare, utilizînd AITC ca și activator specific. Obiectivele principale sunt determinarea rolului acestui canal în migrare și proliferare celulară, și utilizarea sa ca biomarker pentru identificarea bolii și gradului de malignitate.

CAPITOLUL 1. ASPECTE TEORETICE PRIVIND CANALUL TRPA1

Familia canalelor ionice TRP

Membrii superfamiliei TRP de canale ionice prezintă caracteristici comune, precum cele 6 segmente transmembranare, grade variate de omologie de secvență si permeabilitatea pentru cationi. În ciuda acestor similaritați, canalele TRP sunt neobișnuite din punct de vedere al selectivității cationilor si mecanismelor specifice de activare raportat la alte familii de canale ionice. În multe cazuri, canalele TRP pot fi considerate ca fiind integratoare de semnale multiple, astfel raspunsul la un input este modificat de către altul. O caracteristică funcțională este aceea că aceste canale joacă roluri majore in raspunsul la toate clasele majore de stimuli externi, precum lumina, sunetul, substanțe chimice, temperatură și stimuli tactili. Canalele TRP oferă de asemenea celulelor abilitatea de a simți modificări în mediul inconjurător, precum modificări de osmolaritate (Venkatachalam and Montell 2007).

Canalele TRP sunt exprimate si funcționează într-o mare varietate de organisme pluricelulare, precum Drosophila melanogaster, Danio rerio, Mus musculus și Homo sapiens. Superfamilia de canale TRP este împarțită în doua grupuri, ce sunt la rândul lor împărțite în șapte subfamilii (Fig. 1). A 8-a subfamilie, TRPY, este reprezentată de canale TRP de la drojdii. Prezența canalelor TRP la drojdii indică faptul că originea acestor canale precedă apariția metazoarelor (Montell 2005).

Separarea canalelor TRP în cele 2 grupuri este bazată pe modificări topologice si de secvență. Canalele TRP ce aparțin grupului 1 constituie 5 subfamilii, acestea prezintă cea mai mare omologie de secvență cu canalul TRP de la Drosophila. Cele mai înrudite canale cu cel de la Drosophila sunt numite canale TRP clasice, sau TRPC. Subfamiliile TRPV, TRPM, TRPA și TRPN sunt numite după numele original al membrului descoperit inițial al fiecărei subfamilii. Proteinele TRPN nu se întâlnesc la mamifere, dar sunt exprimate la unele vertebrate, precum Danio rerio. Canalele TRP aparținând grupului 1 prezintă elemente si domenii specifice. Cea mai mare omologie de secvență se observă la nivelul celor 6 segmente transmembranare. Subfamiliile TRPC, TRPM si TRPN prezintă de asemenea un domeniu TRP, situat în imediata vecinătate a celui de al 6-lea segment transmembranar. Cele mai conservate porțiuni ale domeniului TRP sunt TRP box 1 și 2. Cu excepția subfamiliei TRPM, canalele din grupul 1 prezintă repetiții ankirinice N-terminale. Cele două subfamilii TRPP și TRPML alcătuiesc grupul 2. Subfamilia TRPP pare a fi cea mai veche, deoarece membri ai acesteia se intâlnesc și la drojdii și la mamifere (Venkatachalam and Montell 2007).

Caracteristici structurale ale TRPA1

Toate canalele TRP au o structură general conservată, fiind alcătuite din 4 subunități ce formează un por, fiecare conținând 6 segmente transmembranare (S1-S6) formate dintr-un segment senzor S1-S4 și o regiune por conducător de ioni S5-S6. Domeniile amino-terminal și carboxi-terminal sunt localizate la nivel citoplasmatic. Printre canalele TRP mamaliene, Transient Receptor Potential Ankirin 1 (TRPA1) este singurul ce conține un linker alcătuit dintr-o buclă în ac de păr beta urmată de 2 regiuni alfa-helix și helixul situat înaintea segmentului S1 care leagă domeniul repetițiilor ankirinice cu primul segment transmembranar(Fig. 2) (Cvetkov, Huynh et al. 2011; Brewster and Gaudet 2015); (Paulsen, Armache et al. 2015).

, TRPA1 conține cea mai mare structură ARD, estimată la aproximativ 14-18 segmente de ankyrină. Capătul N-terminal al TRPA1 este distribuit în două zone distincte constituite din două ”tulpini” urmate de flexibil (Zheng 2013)

e

.

De asemenea, structura determinată a canalului TRPA1 de către Paulsen, Armache și colab evidențiază distribuția spațială a cisteinelor cheie. Cisteina din poziția 621 (C621) este situată în prima structură de tip helix-turn-helix, C641 este situată în prima porțiune a structurii beta-pliate, iar C665 se află într-o buclă flexibilă ce conectează structurile beta-pliate cu al doilea helix-turn-helix. Dintre acestea, cea mai importantă este cisteina din poziția 621, care prezintă reactivitate ridicată, crescută de restul de lizină adiacent (Paulsen, Armache et al. 2015).

La anumite specii non-mamaliene, TRPA1 prezintă o sensibiliate relativ scazută la compuși electrofili și este mai degrabă activat de căldură. Studii de mutagenezăau evidențiat regiuni din interiorul ARD care codifică pentru răspuns chimic sau termic. Acest lucru sugerează că domeniul repetărilor ankirinice comunică cu porul. Secvența de repetiții ankyrinice este legată steric de zonele helix-turn-helix suprapuse ale regiunii linker prin intermediul legăturilor polare si hidrofobe. Structura este propagată superior și terminată la nivelul domeniului TRP-like, astfel formând o rețea de interacțiuni strânse capabile de a duce informație de la domeniul repetițiilor ankirinice la por (Paulsen, Armache et al. 2015).

Funcționalitatea canalului TRPA1

Rol în hipoxie

Dacă cisteinel din pozițiile 633 si 856, celulelor ce exprimă TRPA1 in caz de hiperoxie este redus drastic. Un alt studiu realizat de Mori, Takahashi și colab. a demonstrat că în condiții de hipoxie are loc activarea canalului TRPA1. În condiții normale de oxigenare, TRPA1 este hidroxilat la nivelul prolinei din poziția 394, în cadrul domeniului repetițiilor ankirinice, de către prolin hidroxilaze (PHD), inactivând canalul. În condiții de hipoxie, concentrațiile scăzute de O2 scad activitatea prolin hidroxilazelor, astfel ducând la nivele crescute de TRPA1 activ ce nu prezintă modificări la nivelul prolinei 394 (Pro394) .

De asemenea, Wang, Cvetkov și colab. au identificat 4 legături disulfurice, ce se formează între 5 resturi diferite de cisteină in vivo. Aceste modalități de organizare a legăturilor disulfurice ar putea conduce la mai multe forme conformaționale ale canalului TRPA1, astfel prezentând diferite situsuri de legare pentru molecule efectoare, precum și accesibilitate modificată pentru resturile de cisteină ce sunt implicate în modificări covalente (Wang, Cvetkov et al. 2012).

În afară de activatorii menționați anterior (izotiocianatul de alil, cinnamaldehida și alicina), ce sunt compuși iritanți naturali, TRPA1 este activat și de compuși iritanți de sinteză, prezenți în gazul lacrimogen, gazele de eșapament, fumul de țigară și agenții de curățare puternici. Exemplele includ acroleină, formalină și aldehide α- sau β-nesaturate (Kaneko and Szallasi 2014).

Rol în inflamație (detecție de ROS)

Două studii diferite au identificat iritanți care activează canalul TRPA1 în neuronii senzoriali ai căilor aeriene, rezultând în inflamație neurogenică și hipersenzitivitate respiratorie. Astfel, s-a dovedit activarea TRPA1 de către compuși toxici din fumul de țigară și aerul poluat, precum crotonaldehidă, acroleină și agenți oxidanți precum peroxidul de hidrogen (Simon and Liedtke 2008).

De asemenea, se menționează și rolul acestui canal în tuse. O rețea densă de nervi senzoriali localizați în zona inferioară a căilor aeriene inferioare servește această funcție. O varietate de receptori și canale prezente în terminații sesizează stimulii iritanți și activează sistemele de răspuns reflex, incluzând tusea. Bessac și Jordt arată rolul predominant al canalelor TRPV1 și TRPA1 ca senzori ai iritării căilor aeriene și inițiatori ai reflexului de tuse (Bessac and Jordt 2008).

Au fost oferite dovezi ce arată cum substanțe precum superoxidul și peroxinitritul pot activa TRPA1. Inhalarea de peroxid de hidrogen (H2O2) provoacă depresia frecvenței respiratorii la șoareci. Hipocloritul este o altă specie oxidantă ce a fost recent descrisă ca activator al canalului TRPA1. La fel ca alți iritanți, acesta poate fi format prin inhalarea de clor sub formă gazoasă sau poate fi generat endogen de către macrofage și neutrofile, ca și consecință a inhalării de substanțe toxice (Fig. 3) (Volpi, Facchinetti et al. 2011).

Speciile reactive de oxigen (ROS) și speciile reactive de azot (RNS) ce sunt eliberate de neutrofile și macrofage activate induc peroxidarea sau nitrarea lipidelor, și astfel generează compuși foarte reactivi, precum acroleină, 4-hidroxinonenal și acid nitrooleic, toți aceștia capabili să activeze TRPA1, și prin acest mecanism să inducă durere și inflamație în căile aeriene (Facchinetti and Patacchini 2010).

La mamifere, sistemele respirator si cardiovascular trebuie să se adapteze rapid pentru a menține livrarea O2 la organele ce il necesită cel mai mult, precum creierul si inima. Neuronii cu aferențe vagale au fost propuși ca având funcția de a detecta hipoxia in diferite organe, precum plămânii si inima, in ischemii și alte afecțiuni ce scad aprovizionarea cu O2(Gruss, Ettorre et al. 2006). Astfel, s-a ajuns la demonstrarea că TRPA1 este capabil de a detecta schimbări in disponibilitatea oxigenului in vivo(Takahashi, Kuwaki et al. 2011). Canalul TRPA1 este capabil să „simtă”O2 prin intermediul mai multor procese, precum hidroxilarea prolinei de către prolin hidroxilaze, si oxidare directă a resturilor de cisteină(Takahashi, Kuwaki et al. 2011).

În caz de hipoxie, concentratia scăzută de O2 scade activitatea prolin hidroxilazelor, anulând activitatea inhibitorie a prolin hidroxilării asupra TRPA1, ceea ce duce la activarea canalului. În caz de hiperoxie, O2 activează TRPA1 oxidând resturile de cisteină 633, 856 sau ambele. Aceste resturi sunt localizate la nivelul domeniului repetărilor ankirinice si la regiunea linker situată între S4 si S5. TRPA1 poate apărea sub cel puțin două forme oxidate în condiții de hiperoxie: o stare oxidată relativ instabilă, reversată de către glutation, si o stare oxidată relativ stabilă. Grupările sulfhidril situate pe cisteinele 633 si 856 pot fi modificate la acid sulfenic în prima stare sau pot forma legături disulfurice în cea de a doua stare. Acest sistem de oxidare poate înlătura inhibiția prolin hidroxilării spre a activa TRPA1 (Mori, Takahashi et al. 2016).

Senzor termic

Precum am arătat în introducere, TRPA1 se exprimă în regnul animal începând cu insectele. Canalul TRPA1 al insectelor este sensibil la compuși electrofilici. Acesta este activat de căldură, raportat pentru speciile de Anopheles gambiae și Bombyx mori (Sato, Sokabe et al. 2014). În urma experimentelor in vivo s-a demonstrat că pragul de activare al canalului TRPA1 de la Drosophila melanogaster este puțin mai ridicat decât temperatura preferată de musculiță, cea de 25℃, astfel sugerând faptul că TRPA1 are rol în detectarea temperaturii ridicate nocive și evitarea ei (Kang, Panzano et al. 2011).

În cazul nematodelor, precum Caenorhabditis elegans, TRPA1 este exprimat într-o mare varietate de țesuturi, precum neuroni, mușchi, intestin și celule epiteliale. TRPA1 de la Caenorhabditis (ceTRPA1) este implicat și in mecanosenzație, dovedit de mutanții pentru această proteină cu deficit în comportamentul mecanosenzorial. Spre deosebire de canalul TRPA1 de la artropode, studiile au demonstrat activarea ceTRPA1 de către temperaturile scăzute (Xiao, Zhang et al. 2013). Această diferență ar putea proveni din faptul că ceTRPA1 nu provine din canalul TRPA1 ancestral, ci este mai înrudit cu proteina TRPA1 întâlnită la anemone. Astfel, prezintă diferențe majore față de canalul TRPA1 de la alte nevertebrate, inclusiv insensibilitatea la compuși electrofili (Kang, Pulver et al. 2010).

La fel ca la nematode, pierderea genei TRPA1 ancestrale a avut loc și la himenoptere. Himenopterele au ca reprezentanți albine, viespi și furnici. Acestea prezintă o proteină specifică pentru himenoptere (hsTRPA) ce are o serie de similarități cu TRPA1 de la Drosophila, precum activarea la temperaturi ridicate și sensibilitatea de compuși chimici nocivi. La albine, întâlnim un posibil rol social, deoarece temperatura de întreținere a descendenților în stup este de 32-36, iar punctul de activare al hsTRPA1 se află la temperatura de 34℃, deci putând fi posibilă detectarea creșterilor de temperatură pentru a activa comportamentul de răcire al stupului (Laursen, Anderson et al. 2015).

În ceea ce privește vertebratele ectoterme, funcția canalului TRPA1 de senzor de căldură și chimic este înalt conservată. Canalele ortoloage ale broaștelor, șopârlelor și șerpilor sunt sensibile la căldură și prezintă activare termică la temperaturi de 40℃, 34℃ și respectiv 37℃, însă excepția este Danio rerio (peștele zebră), la care TRPA1 deși este sensibil la compuși electrofili, nu prezintă activare la căldură (Laursen, Anderson et al. 2015).

TRPA1 a fost inițial descris ca și termosenzor folosind ortologul de la șoarece, ce a confirmat activarea la temperaturi sub cele ale canalului TRPM8 (sub 17℃). Această temperatură provoacă durere la oameni, dar cu toate acestea, sensibilitatea la frig este disputată, unele studii au obținut un răspuns evident la frig, în timp ce altele nu au înregistrat modificări, sugerând astfel că acest canal este controlat stringent de către celulă. Spre deosebire de alte canale TRP precum TRPM8, manipularea genetică și farmacologică a funcției canalului TRPA1 nu produce modificări în temperatura corpului (Laursen, Anderson et al. 2015).

Relația dintre canalele TRPA1 și TRPV1

TRPA1 și TRPV1 sunt membri ai superfamiliei TRP înrudiți structural. Funcțiile TRPA1 și TRPV1 se interconectează foarte mult. Acest lucru este clar în special în relație cu durerea și inflamația unde TRPV1 este coexprimat pe majoritatea nervilor senzoriali ce exprimă TRPA1 și împreună integrează o varietate mare de stimuli dureroși. Descoperirea mai recentă a faptului că aceste două canale sunt exprimate pe zone non-neuronale a dus la cercetări amănunțite. Celulele în care sunt exprimate variază de la țesut muscular neted la keratinocite și celule endoteliale (Fernandes, Fernandes et al. 2012). Astfel, 97% din neuronii ce exprimă TRPA1 exprimă TRPV1, în timp ce 30% din neuronii ce exprimă TRPV1 exprimă TRPA1 (Story, Peier et al. 2003).Ambele canale sunt canale permeabile pentru Ca2+. Acest lucru permite TRPV1 să influențeze caracteristici intrinseci ale canalului TRPA1, incluzând relații de voltaj (Staruschenko, Jeske et al. 2010).

Și TRPV1 și TRPA1 sunt canale permeabile pentru calciu si ar putea forma un complex la nivelul membranei plasmatice a neuronilor senzoriali. Acest lucru permite ca TRPV1 să influențeze caracteristici intrinseci ale canalului TRPA1, incluzând relația voltaj-curent. În mod similar, Salas et al au arătat că trăsăturile canalului TRPA1 situat la nivelul neuronilor nu sunt replicate in celule ce exprimă doar TRPA1, ci aceste trăsături sunt prezente doar atunci când TRPA1 si TRPV1 sunt coexprimate. Mai mult decât atât, Si TRPV1 si TRPA1 sunt integratori ai unei game de stimuli dureroși, si agoniștii TRPV1 și TRPA1 sunt capabili sa desensibilizeze caile TRPV1 si TRPA1 (Ruparel et al 2008).

Canalele TRP Vanilloid sunt împarțite în 6 membri, numerotați de la 1 la 6. Cu toate acestea, doar TRPV1 din subfamilia TRPV este cu adevărat activat de vaniloizi, incluzând capsaicina, compusul pungent din ardeii iuți. Este important de menționat că receptorul TRPV1 suferă desensibilizare după administrare repetată de capsaicină sau după expunere prelungită la aceasta. Receptorul nu doar că suferă desensibilizare pentru alți activatori ai aceluiași receptor, dar calea TRPV1 scade raspunsul la agoniști ai TRPA1 și invers. Mecanismele desensibilizării sunt diferite, cel indus de capsaicină este independent de prezența ionilor de Ca2+, în timp ce mecanismul heterolog (desensibilizarea TRPA1 ca urmare a acțiunii capsaicinei asupra TRPV1) este dependent de ionii de Ca2+ (Ruparel et al 2008).

Au fost identificați multipli activatori ai canalelor TRPV1 și TRPA1 (Tabel 1).

Canalele TRPA1 și TRPV1 au un rol sinergic în durerea și inflamația pancreatică. Metodele histologice au confirmat că inflamația pancreatică este asociată cu excitabilitate crescută și expresia ARN-ului mesager al canalelor TRP în celulele pancreatice. Astfel, inflamația pancreatică a crescut semnificativ expresia și proprietățile funcționale ale TRPA1 și TRPV1, precum și excitabilitatea neuronilor senzoriali pancreatici în căile spinale și vagale.Antagoniștii acestor canale TRP au acționat sinergic spre a stopa inflamația pancreatică și durerea asociată (Schwartz, Christianson et al. 2011).

Rolul canalelor TRP în cancer

Multe proteine din structura celulelor tumorale prezintă expresie crescută sau scăzută comparativ cu nivelele din celulele normale. Unele dintre aceste proteine, spre exemplu cele codificate de oncogene si gene supresor tumorale au un rol major în tumorigeneză și apariția metastazelor, în timp ce altele, precum cele implicate in homeostazia calciului , sunt asociate cu progresia cancerului. Majoritatea tipurilor de cancer sunt heterogene în ceea ce privește rata de creștere și gradul de agresivitate. Unele din cele mai importante căi de semnalizare alterate în tumorigeneză cresc rata de proliferare și inhibă apoptoza. Homeostazia calciului controlează aceste procese celulare, inclusiv proliferarea, apoptoza, transcripția si angiogeneza (Roderick and Cook 2008).

Homeostazia calciului joacă un rol foarte important în supraviețuirea și funcționarea normală a celulelor. Astfel, homeostazia calciului este atinsă prin diferite canale de Ca2+sau pompe asociate cu membrana plasmatică (Stewart, Yapa et al. 2015).

Spre deosebire de celulele normale, ce folosesc metabolismul mitocondrial ca sursă primară de energie, celulele canceroase folosesc ATP glicolitic ca sursă primară (Gatenby and Gillies 2007; Hanahan and Weinberg 2011). ATP glicolitic accentuează activitatea pompelor de calciu cunoscute ca ATP-aze de calciu ale membranei plasmatice(PMCA) pentru a furniza energia necesară menținerii nivelului scăzut de calciu în celulele canceroase pancreatice. Calciul intracelular în exces conduce la citotoxicitate în aceste celule și s-a dovedit că PMCA joacă un rol major în menținerea nivelului normal al calciului intracelular (Carafoli 1991).

Semnalizarea calciului este necesară pentru proliferarea celulară în toate celulele eucariote, dar unele celule transformate malign prezintă dependență redusă de calciu pentru a pastra rata de proliferare. Cu toate acestea, disfuncții ale canalelor de calciu sunt implicate în tumorigeneză deoarece expresia crescută a canalelor de calciu prezente în membrana plasmatică amplifică influxul de calciu, astfel promovând caile de proliferare dependente de calciu (Roderick and Cook 2008).

Mulți dintre membrii familiei TRP de canale ionice permeabile pentru Ca2+ și Na+ prezintă expersie alterată în celulele tumorale, majoritatea modificărilor la nivelul acestora nu presupun mutații ale genei TRP, ci nivele crescute sau scăzute ale expresiei proteinei TRP salbatică (wild type), în funcție de stadiul cancerului (Duncan, Deeds et al. 1998).

Canalele TRP contribuie la schimbări în concentrația intracelulară a calciului, fie acționând ca și căi de intrare a calciului prin membrana plasmatică fie prin schimbări în polarizarea membranei, modulând forța de intrare prin căi alternative, precum și activitatea canalelor de Ca2+dependente de voltaj. De asemenea, canalele TRP sunt exprimate pe membranele rezervoarelor interne de calciu (reticulul endoplasmic) unde pot acționa ca și declanșatori pentru proliferare crescută, diferențiere aberantă și pierderea abilității de a intra în apoptoză ducând la proliferarea necontrolată caracteristică celulelor canceroase. Expresia crescută sau scăzută a anumitor proteine TRP în cancer și progresia cancerului au fost folosite spre a dezvolta noi strategii de a distruge celulele tumorale. Unul din aspecte presupune intrarea prin canale TRP exprimate în celule tumorale a Ca2+și Na+ ceea ce conduce la o concentrație crescută de Ca2+ și Na+ intracitoplasmatic, ce distruge celulele prin apoptoză și necroză. Această strategie necesită expresia și activarea selectivă a unui anumit canal TRP în celulele țintă. Noile strategii de a distruge aceste celule prin activarea căii apoptozei sunt valide, deoarece pentru multe tipuri de cancer, căile normale de intrare in procesul de apoptoză sunt inhibate și celulele sunt rezistente la apoptoză (Wertz and Dixit 2000).

O altă abordare posibilă este introducerea de molecule antiproliferative în celule prin canale TRP. Această strategie permite introducerea selectivă a unor molecule incărcate electric ce sunt citotoxice atunci când se află în interiorul celulei, dar relativ non-toxice când se află la exteriorul celulei. Prin cuplarea unei astfel de molecule cu un agonist al unui canal TRP, ar fi în special afectate celulele tumorale pe membrana cărora este supraexprimat canalul TRP respectiv, dar ar avea efect scăzut asupra celulelor normale în care exprimarea canalului TRP este mult mai scăzută. Doxorubicina, un antibiotic obținut din Streptomyces peucetius var. Caesius, este un agent chemoterapeutic cu o greutate moleculară mică (543 Daltoni) și incărcătură electrică, astfel este un candidat viabil pentru a fi transportat prin canalele TRP sau alte canale ce prezintă dimensiune mare a porului. Deși doxorubicina este foarte eficientă împotriva tumorilor umane (cancer mamar, carcinom pulmonar cu celule mici și leucemii), aceasta generează radicali liberi, deci doza adimistrată este limitată de potențialul cardiotoxic.Astfel, facilitarea transportului în celule tumorale ar putea crește funcția terapeutică a doxorubicinei (Santoni and Farfariello 2011).

S-au realizat experimente pe celule de neuroblastom ce au fost transfectate cu TRPV1, și apoi expuse la o concentrație scăzută de doxorubicină, administrată împreună cu capsaicină. Aceste experimente au arătat că doxorubicina a patruns doar în celulele ce au fost transfectate cu TRPV1, și intrarea a necesitat expunerea celulelor la capsaicină, agonist al TRPV1, astfel sugerând că antibioticul a pătruns prin canalele TRPV1 activate. Experimente similare au fost realizate și pentru canalul TRPM8, folosind agoniști ai acestuia împreună cu doxorubicină (Santoni and Farfariello 2011).

Canalele TRPM în cancer

TRPM8

TRPM8 face parte din superfamilia canalelor TRP și subfamilia Melastatin (TRPM). Este un canal cationic ce în condiții fiziologice facilitează trecerea ionilor de Ca si Na prin membrana plasmatică, ducând la depolarizarea celulei. Deși expresia acestui canal este normală în celule prostatice normale, în cancerul de prostată aceasta crește foarte mult (Tsavaler, Shapero et al. 2001). În prostata normală, expresia genei trpm8 este controlată de receptori pentru androgeni. Experimentele de imunohistochimie și reacție de polimerizare în lanț(PCR) realizate pe celule de cancer de prostată umană au arătat că TRPM8 este în principal exprimat în celule epiteliale apicale dependente de androgeni, și expresia acestuia scade în celulele ce își pierd activitatea de receptor androgenic. Și alte tumori, precum cele formate la nivelul sânului, colonului, plămânilor și pielii prezintă expresie crescută a TRPM8, deși expresia sa în celulele normale corespondente acestor tipuri de cancer este aproape nedetectabilă (Bidaux, Roudbaraki et al. 2005).

TRPM8 este de asemenea un biomarker pentru adenocarcinomul pancreatic ductal. Acesta inhibă migrarea celulelor tumorale, astfel sugerează posibilitatea folosirii în terapie (Cucu, Chiritoiu et al. 2014).

TRPM1

Studiile privind expresia canalului TRPM1 au dus la descoperirea de nivele crescute în țesuturile benigne și nivele scăzute în melanoame primare. În cazul melanoamelor metastatice, nu a fost detectat ARN mesager (ARNm) (Duncan, Deeds et al. 2001). Expresia ARNm pentru TRPM1 pare sa fie corelată cu progresia tumorală a melanocitelor, precum și grosimea tumorii și potențialul de a metastaza (Fang and Setaluri 2000).

Canalele TRPV în cancer

TRPV1

TRPV1 este cel mai bine cunoscut pentru funcția pe care o îndeplinește în neuronii nociceptivi, aceea de a detecta temperaturi foarte ridicate și durere. Este activat de căldură și capsaicină, compusul pungent din ardeiul iute (Moiseenkova-Bell, Stanciu et al. 2008).

Modificări în expresia TRPV1 sunt întalnite în cancerul urotelial uman. Astfel, TRPV1 prezintă expresie crescută în celulele carcinomului urotelial papilar. De asemenea, expresie crescută întâlnim și în carcinomul hepatic. Examinarea clinico-patologică a indicat o corelație semnificativă între expresia canalului TRPV1 și diferențierea celulară (Lazzeri, Vannucchi et al. 2005).

TRPV2

Analiza genei și proteinei TRPV2 în tumori superificiale și invazive a evidențiat creșterea cantității de ARNm al TRPV2 odată cu avansarea stadiului tumoral (Wang, Hu et al. 2004). În tumori de tip gliom, ARNm corespunzător proteinei TRPV2 este exprimat în astrocite, dar expresia sa scade pe măsură ce stadiul histologic al tumorii crește (Nabissi, Morelli et al. 2010).

TRPV6

Canalul TRPV6 este implicat în controlul progresiei tumorilor hormon-dependente, precum cele de prostată și sân. Expresia ARNm al TRPV6 este foarte scăzută sau nedetectabilă în țesuturi prostatice normale sau benigne, dar și în cazul neoplaziilor prostatice intraepiteliale și adenocarcinoamelor și al tuturor tumorilor cu o suprafață mai mică de 2.3 cm3. Analiza țesutului prostatic afectat arată creșterea direct proporțională a expresiei ARNm al TRPV6 cu agresivitatea cancerului (Fixemer, Wissenbach et al. 2003).

Canalele TRPC în cancer

În urma experimentelor imunohistochimice și reacției de polimerizare în lanț în timp real (RT-PCR), a fost analizată expresia proteinei TRPC6. Expresia proteinei suferă o creștere semnificativă în cancerul de prostată comparativ cu hiperplazia prostatică benignă, însă nu se observă o diferență în expresia proteinei între tumorile androgen-dependente și cele androgen-independente (Yue, Wang et al. 2009).

CAPITOLUL 2. MATERIALE ȘI METODE

REACTIVI ȘI SOLUȚII

Liniile celulare din adenocarcinomul pancreatic au fost cultivate pe mediu DMEM (Dullbeco’s Modified Eagle Medium). La acest mediu au fost adăugate 10% ser fetal bovin si 1% soluție de antibiotic Streptomicină.

Liniile celulare au fost cultivate pe flask-uri de 25 cm2 și au fost incubate la temperatura de 37℃ si 5% CO2.

Pentru pasajul celulelor s-a folosit solutie 0.25% tripsină-EDTA (Gibco 25200-056).

CULTURI DE CELULE

Linia celulară Panc-1

Linia celulară BxPc-3

Linia celulară PK-9

Linia celulară MiaPaca-2

MENȚINEREA CELULELOR

Dezghețarea

Într-un tub Corning de 15 mL se introduc 4 mL de mediu de cultură pentru centrifugarea celulelor și neutralizarea DMSO-ului in care au fost inghețate. Criotubul cu celule se dezgheață 1-2 minute in baia de apă, apoi se extrage conținutul criotubului și se pune in tubul Corning de 15 mL. Se centrifughează la 1500 rpm 5 minute. După centrifugare, se scoate supernatantul, se pune 1 mL de mediu de cultură steril peste sediment, se resuspendă si se adaugă conținutul într-un flask de 25 cm2. Se incubează la 37℃ si 5% CO2 pentru 48h.

Hrănirea

Mediul de cultură se schimbă din două în două zile. Se indepărtează mediul din flask cu o pipetă serologică si se adaugă 5 mL de mediu de cultură steril si se incubează pentru 48 de ore.

Pasajul

Pentru a realiza un pasaj, confluența celulelor trebuie sa fie de cel puțin 70%. Înainte de efectuarea unui experiment, celulele trebuie pasate de cel puțin 3 ori. Se extrage mediul din flask și se adaugă 1 mL de tripsină. Se incubează 5-10 minute pentru a se desprinde celulele de substrat. Se vizualizează la microscop pentru a confirma desprinderea celulelor. Tripsina se inactivează cu 3 mL de mediu de cultură. Cei 3 mL de mediu de cultură impreuna cu tripsina se adaugă într-un tub Corning de 15 mL și se centrifughează la 2000 rpm, 5 minute. După centrifugare se aruncă supernatantul, se adaugă 1 mL de mediu de cultură steril, se resuspendă și se pune într-un flask de 25 cm2. Se completează cu mediu până la 5 mL volum final și se incubează pentru 48 de ore.

Pentru realizarea experimentelor, celulele trebuie pasate astfel încât să fie numărate și calculate la densitatea necesară. În urma centrifugării, se ia o cantitatea de mediu în care au fost resuspendate celulele și se pune în camera de numărare. În urma numărării, se stabilesc diluțiile necesare pentru a se ajunge la o densitate de celule/mL.

Înghețarea

Mediul din flask este extras și se adaugă 1 mL de tripsină. Se incubează timp de 5-10 minute, apoi se vizualizează la microscop pentru a observa dacă s-a realizat desprinderea celulelor. Se adaugă 2 mL de mediu de cultură steril pentru inactivarea tripsinei, se resuspendă și se pune totul într-un tub Corning. Se centrifughează la 2000 rpm pentru 5 minute. Supernatantul este îndepărtat, iar sedimentul se resuspendă în ser fetal bovin (FBS), adăugându-se 10% DMSO. Suspensia celulară este împărțită in criotuburi și ținută la -70℃.

Tratarea cu Izotiocianat de alil (AITC)

Izotiocianatul de alil ( AITC, 2-propenil izotiocianat) aparține unei familli de compuși intâlniți în natură, numiți izotiocianați (ITC). Izotiocianatul de alil este present în majoritatea legumelor crucifere și este întâlnit în mod special în muștar, hrean și wasabi. Acesta este un lichid ce variază de la incolor la galben pal, este relativ solubil in apă, dar foarte solubil în solvenți organici. Punctul de fierbere este situat la 149 ℃ și are o densitate mai mare decât a apei (Zhang 2010).

Soluția de izotiocianat de alil 100 µM/mL a fost adăugată în mediul de cultură al celulelor cu 24 de ore înainte de experimente. Flask-urile tratate cu izotiocianat de alil au fost menținute la incubator la 37℃ si 5% CO2.

METODE UTILIZATE

Tehnica „wound-healing”

Date generale

Metoda „wound-healing” este simplă, necostisitoare, și este printre primele metode dezvoltate pentru a studia migrarea direcționată in vitro. Această metodă mimează migrarea celulară ce are loc pentru vindecarea rănilor in vivo. Pașii de bază presupun realizarea unei „răni” la nivelul celulelor dispuse în monostrat, fotografierea la inceput si apoi la intervale regulate în timpul migrării pentru inchiderea rănii, și apoi compararea imaginilor pentru a cuantifica rata de migrare a celulelor (Rodriguez, Wu et al. 2005).

Mod de lucru

Celulele din liniile celulare Panc-1, BxPc-3, MiaPaca-2 și PK-9 ajunse la al treilea pasaj după dezghețare, au fost numărate folosind camera de numărat Burker-Turk. În urma calculelor și a diluțiilor necesare, acestea au fost cultivate în vase Petri cu diametru de 35 mm la o densitate de 3×105 celule/mL. Densitatea aceasta a fost aleasă deoarece celulele trebuie să ajungă în cel mai scurt timp la o confluență de 100 %.

În momentul atingerii confluenței de 100%, s-au împărțit vasele cu celule în grupuri de control și de tratate cu izotiocianat de alil (AITC) 100μM monitorizate la 24h și 30h. La momentul 0 a fost trasată o „zgărietură” în mijlocul spațiului cu celule, cu ajutorul unei micropipete de 200µL. Celulelor din grupul de control le-a fost adăugat în continuare mediul de cultură specific, iar celor din grupul de tratate mediu de cultură în care s-a adăugat izotiocianat de alil. S-au folosit vase Petri diferite pentru tratamentul și controlul de la momentul 0 și după 24h, apoi 30h.

Imediat după acest procedeu, s-au realizat poze folosind un microscop VivaTome și utilizând programul QuickPhoto. S-a monitorizat rata de migrație a celulelor la intervale de 24h și 30h.

Pentru datele statistice, s-a măsurat suprafața „zgârieturii” cu ajutorul software-ului ImageJ (Fig.). S-a determinat schimbarea acestei arii procentual față de momentul „zero” (când s-a trasat zgârietura). Analiza statistică s-a realizat cu programul OriginPro8. Prezentarea datelor s-a realizat ca media ± eroarea standard a mediei (SEM). Analiza statistică s-a realizat folosind testul Two-Sample Student’s T-Test.

Western-blot

Date generale

Western blot este o tehnică foarte importantă în biologia celulară și moleculară. Aceasta este o metodă sensibilă și rapidă cu ajutorul căreia se separă și identifică proteinele pe baza unei reacții antigen-anticorp. Mixul de proteine este separat în funcție de greutatea moleculară în gelul de electroforeză. Rezultatele sunt transferate pe o membrană de nitroceluloză producându-se benzile specifice fiecărei proteine. Ulterior, membrana este incubată cu anticorpii specifici proteinei de interes. Anticorpii nelegați sunt spălați, iar cei legați sunt detectați prin developarea filmului (Mahmood și Yang, 2012).

Mod de lucru

Fracțiile proteice au fost obținute prin lizarea celulelor în tampon HEPES-CHAPS (2 % CHAPS în 50 mM/L HEPES, 200 mM/L NaCl, pH 7,34; Sigma-Aldrich, Inc) și un mix de inhibitori de proteaze (Roche) și au fost lăsate timp de 30 de minute pe gheață pentru lizare. Ulterior, probele (cate 50 μg și cate 100 μg) au fost supuse electroforezei în gel de poliacrilamidă 8%, după care au fost transferate pe o membrană de nitroceluloză (Santa Cruz Biotechnology). Membrana de nitroceluloză a fost tratată peste noapte cu o soluție de lapte degresat 10% la temperatura camerei. A doua zi, membrana a fost scufundată într-o soluție conținând anticorpul TRPM8 la o diluție de 1:300 în lapte degresat și PBS și a fost lăsată timp de o oră la incubat pe agitator la temperatura camerei. Ulterior s-a spălat membrana de 4 ori cate 5 minute cu o soluție de PBS-Tween 20, după care s-a adăugat anticorpul secundar „goat-anti-rabbit” la o diluție de 1:1000 în PBS-Tween 20 și laptele degresat. S-a mai lăsat membrana o oră la incubat pe agitator la temperatura camerei, după care s-a spălat de 3 ori câte 10 minute cu soluția de PBS-Tween 20. În ultima etapă, membrana impregnată cu proteina de interes a fost supusă detecției chemiluminescente pentru a se obține benzile proteice (Cucu și colab., 2014).

Capitolul 3. Rezultate și discuții

Rezultate

Migrația liniei celulare Panc-1

Migrația celulelor a fost studiată prin tehnica „wound healing”. Celulele au fost împărțite în 6 vase Petri, 3 care au reprezentat grupul de control și 3 care au fost tratate cu AITC 100 µM si au reprezentat grupul celulelor tratate. S-au realizat poze pentru monitorizarea migrației celulare la 0H, imediat după ce s-a facut scratch-ul, după 24 H de tratament si dupa 30 H de tratament când canalul s-a închis în proporție destul de mare în grupul de control. Celulele au fost crescute în vase Petri de 24 mm la o confluență de 3×105 celule/ml până au ajuns la densitatea de 100%, dupa care s-a realizat scratch-ul utilizand vârful unei micropipete de 200 uL, ulterior adăugându-se mediu DMEM simplu pentru control, sau mediu cu AITC pentru celulele tratate. Am utilizat programul ImageJ pentru a măsura suprafața „rănii”. Pentru analiza statistică a datelor am folosit programul OriginPro, testul Two-Sample Student T-Test.

După 24 ore se observă că zgârietura (scratch-ul) a fost acoperită în proporție de 95% în grupul de control, spre deosebire de cel tratat unde AITC-ul a influențat migrația celulară, diminuand-o.

După 30 ore de la tratament, celulele din grupul de control au acoperit canalul format în urma scartch-ului, iar cele din grupul tratat au migrat si ele, însă nu îndeajuns cât să acopere canalul. Comparând figurile, după 30 de ore se observă diferențe evidente între grupul de control și grupul celulelor tratate cu AITC 100 µM.

Dupa cum am spus și mai devreme, prin tratamentul cu AITC am stimulat canalul și am putut observa implicația TRPA1 in migrația celulelor tumorale pancreatice. Astfel, atunci când TRPA1 este stimulat, se observă o scadere semnificativă a migrației celulare. Din literatuăa știm că AITC-ul poate avea el insuși acest efect de diminuare a migrației celulare, de aceea urmează studii de western blot cu silențiere de canal pentru a demonstra activitatea TRPA1, nu a AITC.

Migrația liniei celulare MiaPaca-2

Am realizat studii de migratie celulara pe linia pancreatica tumorala MiaPaCa-2. Celulele au fost divizate in 6 vase Petri de 24mm. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de control si celelalte 3 urmau a fi tratate cu AITC 100uM. Celulele au fost crescute la o densitate celulara de 3×105 cel/ml pana au ajuns la confluenta de 100%, in cele 6 vase.Cu varful unei micropipete de 200uL am realizat un scratch pe intregul diametru al vasului. S-a folosit mediu DMEM simplu pentru vasele din grupul de control si DMEM cu AITC 100uM pentru vasele din grupul tratat. Am realizat poze pentru monitorizarea migratiei celulare imediat dupa realizarea scratch-ului (0H), apoi la 24H si in final la 30H.

După 24 de ore se observă că scratch-ul a fost acoperit in proporție mai mare în vasele de control, deci AITC a scăzut rata migrației și în cazul acestei linii celulare.

În cazul liniei celulare MiaPaca-2, rata migrației nu a crescut semnificativ de la 24 la 30 de ore de la realizarea zgârieturii, insă se poate observa diferența clară între grupurile de control și cele tratate cu AITC în ceea ce privește acoperirea zgârieturii.

Asemenea rezultatelor obținute în experimentul de migrație al liniei celulare Panc-1, pentru linia MiaPaCa-2 am observat o diminuare a migrației în urma tratamentului cu AITC. Spre deosebire de Panc-1, la MiaPaCa-2 diferența între grupul de control și tratate nu a fost statistic semnificativă.

Migrația liniei celulare BxPC-3

Am realizat studii de migrație celulară pe linia celulară tumorală pancreatică BxPC-3. Celulele au fost imparțite în 6 vase Petri de 24mm. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de control, iar celelalte 3 urmau a fi tratate cu AITC 100uM. Celulele au fost crescute la o densitate celulară de 3×105 cel/ml pana au ajuns la confluenta de 100%, in toate cele 6 vase. Cu varful unei micropipete de 200uL am realizat un canal pe intregul diametru al vasului. S-a folosit mediu DMEM simplu pentru vasele din grupul de control si DMEM cu AITC 100uM pentru vasele din grupul tratat.

Am realizat poze pentru monitorizarea migratiei celulare imediat dupa realizarea scratch-ului (0H), apoi la 24H si in final la 30H.

După 24 de ore de la realizarea zgârieturii, se observă o diferență clară între rata migrației grupurilor de control și cele tratate. Canalul aferent grupurilor control a fost acoperit într-o proporție mult mai mare.

După 30 de ore de la realizarea rănii, diferența între grupurilor de control și cele tratate este în continuare prezentă, chiar accentuată. Se poate observa acoperirea suplimentară a canalului în cazul grupurilor de control, în timp ce acoperirea în cazul grupurilor tratate cu AITC nu a crescut considerabil.

După 24 de ore se observă că scratch-ul a fost acoperit în proporție de 45% în vasele control și 35% în vasele tratate. După 30 de ore, în vasele de control, scratch-ul a fost acoperit în proporție de 70%, iar în cele tratate, acoperirea canalului a ajuns la 40%. Asemenea rezultatelor obținute în migrația celulară a liniei MiaPaCa-2 și în contrast cu cele obținute la Panc-1, s-a observat o scădere a migrației nesemnificativă statistic în experimentul realizat cu celule BxPC-3.

Migrația liniei celulare PK-9

Am realizat studii de migrație celulară pe linia PK9. Celulele au fost imparțite în 6 vase Petri de 24mm. Trei dintre acestea au reprezentat grupul de control, iar celelalte 3 urmau a fi tratate cu AITC 100uM. Celulele au fost crescute la o densitate celulară de 3×105 celule/ml pană au ajuns la confluența de 100%, în toate cele 6 vase. Cu varful unei micropipete de 200uL am realizat un canal pe intregul diametru al vasului. S-a folosit mediu DMEM simplu pentru vasele din grupul de control si DMEM cu AITC 100 µM pentru vasele din grupul tratat.

Am realizat poze pentru monitorizarea migrației celulare imediat după realizarea scratch-ului la 0 h, apoi la 24 h și în final la 30 h.

Spre deosebire de rezultatele obținute la celelalte 3 linii, pentru PK-9 s-a observat o creștere a migrației în urma tratamentului cu AITC.

Se poate observa că după 24 de ore, rata migrației este aproximativ egală între cele două grupuri, control și tratate. Cu toate acestea, în urma realizării analizei statistice, am determinat faptul că de fapt în grupul de celule tratate rata migrației a fost mai mare (Fig. etc).

După 24 de ore, în grupul de control s-a observat o acoperire a canalului de 40%, în timp ce în grupul celulelor tratate cu AITC 100 µM rata migrației a fost mai mare, acoperirea atingând 42%. După 30h, diferența dintre cele 2 grupuri crește. Astfel, acoperirea scratch-ului a fost de 45% la grupul de control si de 60% la grupul celulelor tratate cu AITC.

Western-blot

Western blot-ul s-a realizat în urma experimentelor de migrație celulară prezentate mai devreme în care am avut o condiție de control și o condiție de celule tratate cu AITC pentru stimularea canalului. În figura de mai sus este prezentat rezultatul testării prin western blot pentru cele 4 linii celulare pancreatice tumorale PK-9, BxPC-3, MiaPaCa-2 și Panc-1 și am observat astfel prezența TRPA1 la o greutate moleculară de aproximativ 120-130 kDa în toate liniile testate. Markerul de încărcare utilizat a fost Calnexina. Dupa cum se observă, în Panc-1 ar fi expresia cea mai ridicată, de aceea experimentele de imagistică de calciu s-au realizat doar în această linie celulară.

BIBLIOGRAFIE

Bagal, S. K., A. D. Brown, et al. (2013). "Ion channels as therapeutic targets: a drug discovery perspective." J Med Chem 56(3): 593-624.

Benemei, S., C. Fusi, et al. (2014). "The TRPA1 channel in migraine mechanism and treatment." Br J Pharmacol 171(10): 2552-2567.

Bessac, B. F. and S. E. Jordt (2008). "Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation and reflex control." Physiology (Bethesda) 23: 360-370.

Bidaux, G., M. Roudbaraki, et al. (2005). "Evidence for specific TRPM8 expression in human prostate secretory epithelial cells: functional androgen receptor requirement." Endocr Relat Cancer 12(2): 367-382.

Brederson, J. D., P. R. Kym, et al. (2013). "Targeting TRP channels for pain relief." Eur J Pharmacol 716(1-3): 61-76.

Brewster, M. S. and R. Gaudet (2015). "How the TRPA1 receptor transmits painful stimuli: Inner workings revealed by electron cryomicroscopy." Bioessays 37(11): 1184-1192.

Carafoli, E. (1991). "The calcium pumping ATPase of the plasma membrane." Annu Rev Physiol 53: 531-547.

Clapham, D. E. (2015). "Structural biology: Pain-sensing TRPA1 channel resolved." Nature 520(7548): 439-441.

Cucu, D., G. Chiritoiu, et al. (2014). "Characterization of functional transient receptor potential melastatin 8 channels in human pancreatic ductal adenocarcinoma cells." Pancreas 43(5): 795-800.

Cvetkov, T. L., K. W. Huynh, et al. (2011). "Molecular architecture and subunit organization of TRPA1 ion channel revealed by electron microscopy." J Biol Chem 286(44): 38168-38176.

Duncan, L. M., J. Deeds, et al. (2001). "Melastatin expression and prognosis in cutaneous malignant melanoma." J Clin Oncol 19(2): 568-576.

Duncan, L. M., J. Deeds, et al. (1998). "Down-regulation of the novel gene melastatin correlates with potential for melanoma metastasis." Cancer Res 58(7): 1515-1520.

Eberhardt, M. J., M. R. Filipovic, et al. (2012). "Methylglyoxal activates nociceptors through transient receptor potential channel A1 (TRPA1): a possible mechanism of metabolic neuropathies." J Biol Chem 287(34): 28291-28306.

Engel, M. A., A. Leffler, et al. (2011). "TRPA1 and substance P mediate colitis in mice." Gastroenterology 141(4): 1346-1358.

Facchinetti, F. and R. Patacchini (2010). The rising role of TRPA1 in asthma.

Fang, D. and V. Setaluri (2000). "Expression and Up-regulation of alternatively spliced transcripts of melastatin, a melanoma metastasis-related gene, in human melanoma cells." Biochem Biophys Res Commun 279(1): 53-61.

Fernandes, E. S., M. A. Fernandes, et al. (2012). "The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away from sensory nerves." Br J Pharmacol 166(2): 510-521.

Fixemer, T., U. Wissenbach, et al. (2003). "Expression of the Ca2+-selective cation channel TRPV6 in human prostate cancer: a novel prognostic marker for tumor progression." Oncogene 22(49): 7858-7861.

Gatenby, R. A. and R. J. Gillies (2007). "Glycolysis in cancer: a potential target for therapy." Int J Biochem Cell Biol 39(7-8): 1358-1366.

Geng, F., L. Tang, et al. (2011). "Allyl isothiocyanate arrests cancer cells in mitosis, and mitotic arrest in turn leads to apoptosis via Bcl-2 protein phosphorylation." J Biol Chem 286(37): 32259-32267.

Gruss, M., G. Ettorre, et al. (2006). "Moderate hypoxia influences excitability and blocks dendrotoxin sensitive K+ currents in rat primary sensory neurones." Mol Pain 2: 12.

Hanahan, D. and R. A. Weinberg (2011). "Hallmarks of cancer: the next generation." Cell 144(5): 646-674.

Hinman, A., H. H. Chuang, et al. (2006). "TRP channel activation by reversible covalent modification." Proc Natl Acad Sci U S A 103(51): 19564-19568.

Kaneko, Y. and A. Szallasi (2014). "Transient receptor potential (TRP) channels: a clinical perspective." Br J Pharmacol 171(10): 2474-2507.

Kang, K., V. C. Panzano, et al. (2011). "Modulation of TRPA1 thermal sensitivity enables sensory discrimination in Drosophila." Nature 481(7379): 76-80.

Kang, K., S. R. Pulver, et al. (2010). "Analysis of Drosophila TRPA1 reveals an ancient origin for human chemical nociception." Nature 464(7288): 597-600.

Laursen, W. J., E. O. Anderson, et al. (2015). "Species-specific temperature sensitivity of TRPA1." Temperature (Austin) 2(2): 214-226.

Lazzeri, M., M. G. Vannucchi, et al. (2005). "Transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1) expression changes from normal urothelium to transitional cell carcinoma of human bladder." Eur Urol 48(4): 691-698.

Li, D., K. Xie, et al. (2004). "Pancreatic cancer." The Lancet 363(9414): 1049-1057.

Meseguer, V., Y. A. Alpizar, et al. (2014). "TRPA1 channels mediate acute neurogenic inflammation and pain produced by bacterial endotoxins." Nat Commun 5: 3125.

Minke, B. (2010). "The history of the Drosophila TRP channel: the birth of a new channel superfamily." J Neurogenet 24(4): 216-233.

Moiseenkova-Bell, V. Y., L. A. Stanciu, et al. (2008). "Structure of TRPV1 channel revealed by electron cryomicroscopy." Proc Natl Acad Sci U S A 105(21): 7451-7455.

Montell, C. (2005). "The TRP superfamily of cation channels." Sci STKE 2005(272): re3.

Mori, Y., N. Takahashi, et al. (2016). "Redox-sensitive transient receptor potential channels in oxygen sensing and adaptation." Pflugers Arch 468(1): 85-97.

Nabissi, M., M. B. Morelli, et al. (2010). "TRPV2 channel negatively controls glioma cell proliferation and resistance to Fas-induced apoptosis in ERK-dependent manner." Carcinogenesis 31(5): 794-803.

Nilius, B. (2013). "Transient receptor potential TRP channels as therapeutic drug targets: next round!" Curr Top Med Chem 13(3): 244-246.

Oh, M. H., S. Y. Oh, et al. (2013). "TRPA1-dependent pruritus in IL-13-induced chronic atopic dermatitis." J Immunol 191(11): 5371-5382.

Park, C. K., Z. Z. Xu, et al. (2011). "Resolvin D2 is a potent endogenous inhibitor for transient receptor potential subtype V1/A1, inflammatory pain, and spinal cord synaptic plasticity in mice: distinct roles of resolvin D1, D2, and E1." J Neurosci 31(50): 18433-18438.

Paulsen, C. E., J. P. Armache, et al. (2015). "Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulatory mechanisms." Nature 520(7548): 511-517.

Paulsen, C. E., J. P. Armache, et al. (2015). "Structure of the TRPA1 ion channel suggests regulatory mechanisms." Nature 525(7570): 552.

Poltorak, A., X. He, et al. (1998). "Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene." Science 282(5396): 2085-2088.

Roderick, H. L. and S. J. Cook (2008). "Ca2+ signalling checkpoints in cancer: remodelling Ca2+ for cancer cell proliferation and survival." Nat Rev Cancer 8(5): 361-375.

Rodriguez, L. G., X. Wu, et al. (2005). "Wound-healing assay." Methods Mol Biol 294: 23-29.

Santoni, G. and V. Farfariello (2011). "TRP channels and cancer: new targets for diagnosis and chemotherapy." Endocr Metab Immune Disord Drug Targets 11(1): 54-67.

Sato, A., T. Sokabe, et al. (2014). "Embryonic thermosensitive TRPA1 determines transgenerational diapause phenotype of the silkworm, Bombyx mori." Proc Natl Acad Sci U S A 111(13): E1249-1255.

Schaefer, E. A., S. Stohr, et al. (2013). "Stimulation of the chemosensory TRPA1 cation channel by volatile toxic substances promotes cell survival of small cell lung cancer cells." Biochem Pharmacol 85(3): 426-438.

Schwartz, E. S., J. A. Christianson, et al. (2011). "Synergistic role of TRPV1 and TRPA1 in pancreatic pain and inflammation." Gastroenterology 140(4): 1283-1291 e1281-1282.

Simon, S. A. and W. Liedtke (2008). "How irritating: the role of TRPA1 in sensing cigarette smoke and aerogenic oxidants in the airways." J Clin Invest 118(7): 2383-2386.

Staruschenko, A., N. A. Jeske, et al. (2010). "Contribution of TRPV1-TRPA1 interaction to the single channel properties of the TRPA1 channel." J Biol Chem 285(20): 15167-15177.

Stewart, T. A., K. T. Yapa, et al. (2015). "Altered calcium signaling in cancer cells." Biochim Biophys Acta 1848(10 Pt B): 2502-2511.

Storck, H., B. Hild, et al. (2017). "Ion channels in control of pancreatic stellate cell migration." Oncotarget 8(1): 769-784.

Story, G. M., A. M. Peier, et al. (2003). "ANKTM1, a TRP-like channel expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures." Cell 112(6): 819-829.

Takahashi, N., T. Kuwaki, et al. (2011). "TRPA1 underlies a sensing mechanism for O2." Nat Chem Biol 7(10): 701-711.

Tsavaler, L., M. H. Shapero, et al. (2001). "Trp-p8, a novel prostate-specific gene, is up-regulated in prostate cancer and other malignancies and shares high homology with transient receptor potential calcium channel proteins." Cancer Res 61(9): 3760-3769.

Venkatachalam, K. and C. Montell (2007). "TRP channels." Annu Rev Biochem 76: 387-417.

Volpi, G., F. Facchinetti, et al. (2011). "Cigarette smoke and alpha,beta-unsaturated aldehydes elicit VEGF release through the p38 MAPK pathway in human airway smooth muscle cells and lung fibroblasts." Br J Pharmacol 163(3): 649-661.

Wang, C., H. Z. Hu, et al. (2004). "An alternative splicing product of the murine trpv1 gene dominant negatively modulates the activity of TRPV1 channels." J Biol Chem 279(36): 37423-37430.

Wang, L., T. L. Cvetkov, et al. (2012). "Identification of in vivo disulfide conformation of TRPA1 ion channel." J Biol Chem 287(9): 6169-6176.

Wertz, I. E. and V. M. Dixit (2000). "Characterization of calcium release-activated apoptosis of LNCaP prostate cancer cells." J Biol Chem 275(15): 11470-11477.

Wes, P. D., J. Chevesich, et al. (1995). "TRPC1, a human homolog of a Drosophila store-operated channel." Proc Natl Acad Sci U S A 92(21): 9652-9656.

Xiao, R., B. Zhang, et al. (2013). "A genetic program promotes C. elegans longevity at cold temperatures via a thermosensitive TRP channel." Cell 152(4): 806-817.

Yue, D., Y. Wang, et al. (2009). "Expression of TRPC6 in benign and malignant human prostate tissues." Asian J Androl 11(5): 541-547.

Zhang, Y. (2010). "Allyl isothiocyanate as a cancer chemopreventive phytochemical." Mol Nutr Food Res 54(1): 127-135.

Zheng, J. (2013). "Molecular mechanism of TRP channels." Compr Physiol 3(1): 221-242.