Draft 1 Disertaţie Corectat Prof. Popa 1 [608986]

1
CUPRINS Pag.
CAPITOLUL 1 . Introducere. Stadiul actual al cunoașterii.
1.1. Boala inflamatorie a intestinului. Epidemiologie și tratament.
1.2. Curcumina
1.2.1. Generalități.
1.2.2. Compoziția curcuminei
1.2.3. Structura și solubilitatea curcuminei
1.2.4. Reactivitatea curcuminei
1.2.4.1. Reacții cu specii reactive de oxigen
1.2.4.2. Degradarea chimică și metabolism
1.2.4.3. Reacții de adiție nucleofilă
1.2.4.4. Interacțiune cu ioni metalici
1.2.5. Studii farmacologice e fectuate pe curcumină
1.2.6. Efecte adverse ale curcuminei
1.3. Sisteme de eliberare controlată pe bază de polizaharide
1.3.1. Importanța sistemelor de eliberare controlată a medicamentelor pe
bază de polizaharide
1.3.2. Obiectivele eliberării controlate a m edicamentelor din sisteme de
administrare pe bază de polizaharide
1.3.3. Mecanismele de eliberare a medicamentelor
1.3.4. Tipuri de polizaharide utilizate în obținerea sistemelor de eliberare
controlată
1.3.4.1.Gelanul
1.3.4.2 Chitosanul
1.3.4.3. Caragenanul
1.4. Metode de obținere a sistemelor de eliberare
1.4.1. Forțe intra și intermoleculare implicate în obținerea sistemelor de
eliberare controlată
1.4.1.1. Legăturile covalente
1.4.1.2. Reacții coordinative metal -polimer
1.4.1.3. Interacții elect rostatice
1.4.1.4. Interacții hidrofobe
1.4.2. Metode și tehnici de obținere a sistemelor de eliberare
1.4.2.1. Metoda extruderii
1.4.2.2. Metoda emulsiei
1.4.2.3. Coacervarea soluțiilor polimerice
1.4.2.4. Uscarea prin pulverizare
REZULTATE ORIGINALE
OBIECTIVELE STUDIULUI DE CERCETARE
CAPITOLUL 2: Materiale. Tehnici experimentale. Metode de
caracterizare.
2.1 Materiale
2.2. Tehnici experimentale
2.2.1. Prepararea microparticulelor de hidrogel conținând curcumină
imobilizată în matrici de polizaharide
2.3. Tehnici de caracterizare

2
2.3.1. Spectroscopia FT -IR
2.3.2. Analiza dimensiunii particulelor prin difractometrie laser
2.3.3. Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
2.3.4. Gradul de umflare
2.3.5. Eficiența de încapsulare
2.3.6. Determinarea activității antioxidante
2.3.7. Adsorbția de proteine
2.3.8. Cinetica de eliberare a curcuminei din particulele complexe
CAPITOLUL 3. Particule complexe pe bază de polizaharide cu
curcumină imobilizată
3.1. Prepararea particulelor complexe pe bază de polizaharide
3.2. Spectrele FT -IR ale particulelor complexe obținute
3.3. Determinarea diametrului mediu al particulelor prin difractometrie laser
3.4. Morfologia particulelor complexe
3.5. Comportamentul la umflare în medii apoase
3.6. Eficie nța de încapsulare
3.7. Determinarea activității antioxidante a curcuminei
3.8. Determinarea adsorbției de proteine
3.9. Cinetica de eliberare a curcumin
CONCLUZII

3

CAPITOLUL 1
Introducere. Stadiul actual al cunoașterii.
1.1. Boala inflamatorie a intes tinului. Epidemiologie și tratament.
Boala inflamatorie a intestinului se caracterizează prin inflamație cronică neinfecțioasă a
tractului gastrointestinal și include în principal boala Crohn (care poate afecta orice segment al
tractului gastrointestinal d e la gură până la anus), colită ulceroasă (care poate afecta mucoasa
colonică) și colită de cauză nedeterminată. În boala Crohn și colita ulcerativă sunt frecvent
întâlnite dureri abdominale și diaree. Sângerarea rectală apare mai frecvent în colita ulcero asă
decât cu boala Crohn, dar pacienții cu boala Crohn se confruntă adesea cu pierderi în greutate și
boli perianale. Bolile inflamatorii ale intestinului apar de obicei la adulți cu vârsta cuprinsă între
20 și 40 de ani. Bolile inflamatorii ale intestinul ui pot afecta negativ toate aspectele vieții unei
persoane. Deși cauza bolii nu este încă cunoscută în totalitate, se sugerează că boala inflamatorie
a intestinului este un rezultat al răspunsului imun necontrolat la un factor declanșator la
persoanele pre dispuse genetic. Rolul factorilor de mediu, fie ca declanșatori sau ca și cauze ale
răspunsului imun necontrolat, continuă să fie dezbătut.
Boala inflamatorie a intestinului a fost considerată o boală a țărilor dezvoltate, dar s -a
observat o schimbare a mo delului epidemiologic, indicând stabilizarea incidenței în țările
dezvoltate, prevalența bolii fiind ridicată, dar și o creștere rapidă de cazuri în țările nou
industrializate în America de Sud, Europa de Est, Asia și Africa. Boala Crohn și colita ulceroas ă,
cunoscute sub denumirea de boală inflamatorie a intestinului, se caracterizează prin inflamații
cronice ale tractului gastrointestinal. Cea mai mare prevalență a bolii raportată în 2017 în Europa
a fost în Norvegia (505 cazuri de colită ulcerativă la 10 0 000 de persoane), în Germania (322
cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane), în America de Nord în SUA (286 cazuri de
ulcerative colită la 100000 persoane), precum și în Canada (319 cazuri de boală Crohn la 100
000 de persoane) [ 1,2]
Scopul tratamen tului bolilor inflamatorii intestinale cronice este de a reduce inflamația care
declanșează semnele și simptomele. În cele mai bune cazuri, acest lucru poate duce nu numai la
ameliorarea simptomelor, ci și la inducerea și menținerea remisiei pe termen lung , ceea ce determină
riscuri reduse de complicații. Tratamentul IBD implică, de obicei, fie terapie medicamentoasă, fie
chirurgie. Medicatia utilizata implica aminosalicilații , corticosteroizii (sunt ineficienți în menținerea
remisiei), imunomodulatorii (in general nu sunt recomandati datorită incetării acțiunii și a toxicității).
În unele cazuri de boală Crohn perianala se pot utiliza antibiotice cum ar fi ciprofloxacin si
metronidazol împreuna cu alte medicamente.
Tratarea bolii cronice inflamatorii a inte stinului presupune reducerea inflamației care
declanșează semnele și simptomele. În cele mai bune cazuri, acest lucru poate conduce nu numai
la ameliorarea simptomelor, ci și la inducerea și menținerea remisiei pe termen lung, ceea ce
determină riscuri și complicații reduse. Tratamentul pentru IBD implică, de obicei, fie terapie
medicamentoasă, fie chirurgie. Aminosalicilații, corticosteroizii (sunt ineficienți în menținerea
remisiei), imunomodulatoarele (în general, nu sunt recomandate din cauza încetării acțiunii și a
toxicității) sunt utilizate ca medicamente. În unele cazuri de boală Crohn perianală, antibioticele
precum ciprofloxacina și metronidazol pot fi utilizate în combinație cu alte medicamente [3].
În prezent nu exista strategii terapeutice capa bile să modifice semnificativ prognosticul
bolii inflamatorii de colon. Terapia nutriționala deține posibilități interesante pentru tratament iar
curcumina a câștigat interes datorită acțiunilor sale farmacologice și proprietaților sale.

4
Cercetările anteri oare au remarcat potențialele beneficii ale utilizării curcuminei în tratarea
bolilor intestinale. Principalul mecanism, prin care curcumina mediază aceste efecte este legată
de suprimarea factorului nuclear Kappa -light-chain -enhancer (NF -KB). În plus, act ivitatea
curcuminei include suprimarea interleukinei 1 (IL -1) și a factorului necrozei tumorale alfa (TNF –
α) două cytokine importante în reglarea răspunsurilor inflamatorii. Pentru aceste activități
importante, curcumina este considerată un tratament poten țial în boala inflamatorie intestinală [4,
5].

1.2. Curcumina.
1.2.1. Generalități.
Turmeric ( Curcuma longa ), este o plantă perenă aparținând familiei de ghimbir. Este
cultivată intens în sudul și sud -estul Asiei tropicale. Rizomii acestei plante sunt cel mai des
utilizați în scopuri culinare și medicinale. Componenta biologică activă din turmeric este
curcumina, și se găsește în condiment într -un procent care variază între 2% și 5%. Culoarea
galbenă caracteristică a turmericului se datorează curcuminoizilor, izola ți pentru prima dată de
Vogel în 1842.
Curcumina este o pulbere cristalină de culoare galben -portocalie, insolubilă în apă.
Structura curcuminei (C21H20O6) a fost descrisă pentru prima dată în 1910 de către Lampe și
Milobedeska și s -a arătat a fi diferuloi lmetan. Turmericul este utilizat ca și condiment dietetic
sau colorant în alimente și textile. Este utilizat pe scară largă în medicina tradițională indiană
pentru a vindeca afecțiunile biliare, anorexia, tuse, răni diabetice, tulburări hepatice, reumatism
și sinuzită.
Pasta de turmeric în var stins este un remediu popular utilizat în casă pentru tratamentul
inflamațiilor și rănilor. Timp de secole, curcumina a fost consumată sub formă de condiment
dietetic, în doze de până la 100 mg /zi. Cercetările amp le efectuate în ultimele cinci decenii au
indicat reduce rea colesterolul din sânge atunci când curcumina a fost ut ilizată [6].
Turmericul sălbatic este denumit Curcuma aromatica , iar speciile domestice sunt
denumite Curcuma longa . În ultimele decenii, au fo st efectuate cer cetări amp le pentru a stabili
activitățile biologice și acțiunile farmacologice ale turmericului și ale extractelor sale. Curcumina
(diferuloilmetan), principalul component bioactiv al turmericului de culoare galbenă s -a dovedit
a avea un s pectru larg de acțiuni bio logice. Acestea includ activități antiinflamatoare,
antioxidante, anticarcinogene, antimutagenice, anticoagulante, antifertilitate, antidiabetice,
antibacteriene, antifungice, antiprotozoice, antivirale, antifibrotice, antivenin, antiulcer,
hipotensive și hipocolesterolemice. Efectul său anticancer este mediat în principal prin inducerea
apoptozei.

1.2.2. Compoziția curcuminei
Turmericul conține proteine (6.3%), grăsimi (5.1%), minerale (3.5%), carbohidrați
(69.4%) și apă (13.1%). Uleiul esențial (5.8%) ob ținut prin distilarea cu aburi a rizomilor conține
α-feandandren (1%), sabinen (0.6%), cineol (1%), borneol (0.5%), zingiberen (25%) și
sesquiterpine (53%).
Curcuminoizii (diferuloilmetan) (3 –4%) sunt responsabili pentru culoarea galbenă și
cuprind curcumi na I (94%), curcumina II sau demetoxicurcumina (6%) și curcumina III sau
bisdemetoxicurcumina (0.3%) și curcumina ciclică dar procentul poate varia și depinde de
originea plantei și de condițiile unde a crescut. Derivații demetoxi și bisdemetoxi ai curcumi nei
au fost de asemenea izolați. Curcumina a fost izolată pentru prima dată în 1815 și structura

5
chimică a fost determinată de Roughley și Whiting în 1973. Are un punct de topire la 176 -177 °
C; formează o sare brun -roșiatică cu a lcali și este solubila în etanol, alcali, cetone, acid acetic și
cloroform [7-9].
Curcumina comercială conține curcumina I (77%), curcumina II (17%) și curcumina III
(3%) ca și componente principale ale acesteia.

1.2.3. Structura și solubilitatea curcum inei
În timp ce majoritate a cercetărilor au urmărit aspectele biologice, doar câțiva cercetători
au fost interesați de înțelegerea importanței structurii chimice a curcuminei pentru activitatea
biologică. În chimia organică extragerea și sinteza curcuminei și a noilor deri vați sintetici a fost
principalul scop al cercetărilor. Chimia anorganică a utilizat abilitatea sa de chelator metalic prin
gruparea α, β -diceto pentru a forma noi entități structurale cu modificarea activității biochimice.
Fizico -chimia s -a concentrat pe proprietățile spectroscopice foarte sensibile ale curcuminei,
pentru a studia interacțiunile sale cu structurile microeterogene și biomolecule. Chimia analitică
a fost implicată în proprietățile sale unice spectroscopice pentru a identific a și estima urmele de
elemente [10]. Alte studii chimice folositoare în întelegerea activității biologice a curcuminei
sunt reactivitatea sa chimică cu specii reactive de oxigen, reacții de adiție, reacții de degradare și
formarea nanoconjugatelor și a for mulă rii lor. Structura principalilor curcuminoizi este
prezentata in Figura. 1.

Figura 1. Structura chimică a principalilor curcuminoizi.

6
Curcuminoizii exista în două forme tautomere, dintre care cea bis -cetonica este
predominantă în mediu acid sau neut ru cât și în stare solidă, pe când cea enolică este
predominantă în soluție alcalină . Marele dezavantaj al curcuminei îl constituie insolubilitatea în
apă și biodisponibilitatea scăzută în celule [11].
Este aproape insolubilă în apă și ușor solubilă în s olvenți polari cum ar fi DMSO,
metanol, etanol, acetonitril, cloroform, acetat de etil, etc. Este greu solubilă în solvenți
hidrocarbonați cum ar fi ciclohexan și hexan. Este un acid Bronsted slab cu 3 protoni labili și în
consecință 3 pKa -uri corespunzând la trei echilibre prototropice. Reactivitatea chimică și
solubilitatea cresc la pH bazic. Soluțiile apoase de curcumină pot fi preparate prin adăugarea
surfactanților, lipidelor, albuminei, ciclodextrinelor, biopolimerilor, etc. Soluțiile micelare care
utilizează surfactanți sunt mai potrivite în prepararea soluțiilor apoase de curcumină la o
concentrație ridicată. Când se utilizează soluții apoase cu surfactanți în sisteme biologice, este
necesară o grijă suplimentară la efectuarea experimentelor, deoarec e surfactanții pot interfera cu
proprietatile biologice [9, 12].

1.2.4. Reactivitatea curcuminei
Curcumina are 3 grupe funcționale reactive: o grupare ceton ica și două grupări fenolice în
pH>8, respectiv 2 grupari cetonice și doua grupari feno lice în pH acid. Reacții chimice importante
asociate cu activitatea biologică a curcuminei sunt cele de cedare a hidrogenului care conduc la
oxidarea curcuminei, adiție reversibilă sau ireversibilă (reacții Michael), hidroliza, degradarea și
reacții enzima tice.

1.2.4.1. Reacții cu specii reactive de oxigen
Curcumina s -a dovedit a fi un compus exce lent de consumare al speciilor reactive de oxigen,
proprietate care îi conferă activitate antioxidantă în celulele normale. Speciile reactive de oxig en sunt
formate din am bii radicali liberi oxidanți și oxidanți moleculari [12-19] Toate cele trei locuri active
ale curcuminei pot fi supuse oxidării prin transferul de electroni și captarea oxigenului. Investigații
detaliate au confirmat că în timpul reac țiilor cu radicali lib eri cel mai ușor se de tașează hidrogenul de
la gruparea fenol cu formarea radicalilor fenoxil, care sunt stabilizați prin rezonanță de -a lungul
structurii ceto -enolice. Ca exemplu, reacția radicalilor peroxil cu curcumina produce radi cali fenoxil
care sunt mai puțin reactivi decât radicalii peroxil și prin aceasta comportare determină o protecție
față de speciile reactive de oxigen [13, 16, 20] Reacțiile sunt reversibile iar compusul poate reveni la
structura chimică inițială prin inte rmediul antioxidanțilo r solubili în apă cum ar fi acidul ascorbic
[20] Literatura menționează reacțiile de eliminare ale altor radicali liberi din speciile reactive de
oxigen: radicalii hidroxil, radicalii superoxid, radicalii alcoxi [14-17]. Dintre oxidan ții moleculari,
reacți ile cu peroxinitril si peroxid de hidrogen sunt cele mai comune. În multe modele biologice,
curcumina poate proteja celulele în condiții în care există o producere excesivă a acestor oxidanți
moleculari. Există puține rapoarte în lite ratura de specialitate privind reacția directă a curcuminei cu
peroxinitril [18] Constantele de viteză și concentrațiile de inhibare a curcuminei pentru a preveni
formarea de nitrotirozină indică faptul că aceasta este un antioxidant puternic împotriva str esului
oxidativ [9]. Figura 2 prezintă posibilele locuri de formare a radicalilor liberi în structura
curcuminei și regenerarea radicalului fenoxil prin intermediul acidului ascorbic.

7

Figura 2. Posibile locuri de formare a radicalilor liberi în structura curcuminei si stabili zarea,
respectiv regenerarea radicalului fenoxil prin intermediul acidului ascorbic [9].
1.2.4.2. Degradarea chimică și metabolism
Curcumina suferă o degradare chimică în soluții apoase -organice, ce se intensifică cu
creșterea pH -ului, ceea ce reprezintă o problemă serioasă în aplicațiile sale [13, 21 -25]. Degradarea
curcuminei a re loc prin gruparea nesaturată α, β -diceto, fiind mai puțin intensă în soluții concentrate,
când produșii rezultați sunt 6 -trans -(4‘hidroxi -3‘-metoxifenil) – 2,4-dioxo -5 hexanal, a ldehida
felurică, feruloil metan și vanilină. Deși nu este pe deplin înțeleasă se crede că degradarea se
efectuează prin intermediul fragmentului diceto. Cu toate acestea, degradarea este redusă în mod
semnificativ atunci când curcumin a este atașată la lip ide: lipozomi, albumi nă, ciclodextrină,
curcubituril, surfactanți, polimeri și alte substante macromoleculare și microeterogene [13, 26].
Astfel s -a dovedit a fi de mare folos faptul că soluții stabile de curcumină ar putea fi preparat e într -un
mediu de cu ltură ce conține 10 % ser fetal bovin, precum și sânge uman. Curcumina suferă o
degradare mult mai rapidă atunci când este expusă la lumina soarelui [9, 12, 27]. Produsele
identificate în timpul fotodegradării sunt: vanilina, acidul fe luric și alți fenoli cu molecule mai mici
indicând o distribuție a produșilor de degradare fotochimică similară cu degradarea chimică în
soluție. Unele rapoarte indică faptul că curcumina generează oxigen singlet și alte specii reactive de
oxigen în moment ul fotodegradării, reponsabile pentru activitatea sa fotobiologică și fotodinamică
[28]. Fotodegradarea este accelerată în prezența nanoparticulelor de TiO2, iar această metodă poate fi
utilizată pentru a îndepărta petele de turmeric din țesuturile de bumba c [29]. Metabolizarea
curcuminei la șobolani și oameni produce diferite produse. Două căi biologice majore au fost
identificate pentru metabolizarea curcuminei cum ar fi cea de conjugare cu oxigen și de reducere.
Produșii de conjugare cu oxigen sunt glucur onid curcumina și sul fat de curcumină iar cei de reducere
sunt tetrahidrocurcumin a, hexahidrocurcumin a și octahidrocurcumin a. Alți produși pot fi:
dihidrocurcumin glucuronid, tetrahidrocurcumin glucuronid, acid ferulic și acid dihidroferulic. [9].
Deși s -a raportat că procesel e au loc pe cale e nzimatică, enzimele implicate în toate aceste produse de
reacție specifice sunt încă un subiect de dezbatere. Reacțiile enzimatice specifice sunt, probabil, mult
mai rapide și nu permit degradarea hidrolitică lentă, prin urmare, procesul hidrolitic nu poate concura
cu reacțiile enzimatice [30]. În figura 3 sunt prezentați produșii de degradare ai curcuminei.

8

Figura 3. Produșii de degradarea ai curcuminei
1.2.4.3. Reacții de adiție nucleofilă
Gruparea nesaturată α, β -diceto din curcumin ă participă la reacția de adiție nucleofilă (adiția
Michael), cu anioni de –OH, -SH, -SeH ca donori. Această reacție a fost raportată ca fiind utilă
pentru a explica chimia și activitatea biologică a curcuminei în celulele vii [21, 31 -36].
Un interes deos ebit a primit reacția tiolilor biologici, cum ar fi glutation ce conține grupări –
SH [33, 34]. Conjugatele curcumină -glutation au fost izolate din diferite sisteme biologice. Formarea
acestui produs de adiție ar conduce la epuizarea nivel urilor de glutatio n în celule, conducând astfel la
reducerea apărării antioxidante. Cu toate că unele studii sugerează că acestă reacție este reversibilă,
teoria nu este confirmată încă în celulele vii. O reacție similară a fost observată în timpul in hibării
tioredoxin redu ctazei, de către curcum ină [35]. Centrul activ al acestei enzime este selenocisteina.
Selenol din selenocisteină fiind puternic nucleofil la pH fiziologic este supus ușor reacției de adiție
1,4 cu curcumina, formând diferite specii l egate covalent. Se spec ulează că această reacție este
responsabilă pentru inhibarea enzimei tioredoxin reductaza de către curcumină. Hidrogenul metilenic
al fragmentului diceto/enol a curcuminei poate acționa ca și un nucleofil și particip a astfel la reacții
de adiție Michael cu electrofilie puternică, d ar acestea nu pot avea o semnificație în sisteme biologice
[37]. Derivații de curcumină obținuți prin modificare chimică au fost preparați prin reacții de
condensare și adiție, cum ar fi, de exemplu, deri vații de semicarbazonă și derivații oximă ai
curcumi nei. Aceste produse stabile, preparate independent au fost examinate pentru activitatea
anticancer. În cele mai multe dintre studii s -a raportat că acești derivați sunt mai citotoxici pentru
celulele canc eroase decât curcumina lib eră [38, 39].

1.2.4.4. Interacțiune cu ioni metalici
Curcumina formează complecși puternici cu majoritatea ionilor metalici cunoscuți. Gruparea
nesaturată α, β -diceto a curcuminei este un agent de chelare excelent. Curcumina es te considerat un
ligand mo nobazic bidentat și formează complecși stabili cu aproape toate metalele și nemetalele,
obținându -se structuri stabile la un raport stoechiometric curcumină: ion metalic de 2:1. Există foarte
puține studii pentru raportul 3:1 (a f ost raportat un complex cu Fe3+) [40]. Coordinarea curcuminei cu
metalul are loc prin gruparea enolică. Există mai multe lucrări privind complecșii de curcumină cu
metale tranziționale cum ar fi Fe3+, Mn2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+, Pb2+, Cd2+, Ru3+, Re3+ și multe altele.
Există complecși cu metale netranziționale și ioni rari cum ar fi: Al3+, Ga3+, Sm3+, Eu3+, Dy3+, Y3+,

9
Se2+ , precum și oxizi metalici cum ar fi VO2+. Structura și proprietățile fizice ale acestor complecși
depind de natura ionului metalic precum ș i de stoechiometria condiț iilor de reacție care la r ândul lor
decid stabilitatea și reactivitatea lor. Complecșii metalici nu modifică numai proprietățile fizice ale
curcuminei dar afectează și reactivitatea biologică a metalelor. În general s -a observat c ă
toxicitatea metalelor în complexele de curcumină e ste redusă și unele complexe de curcumină cu
metale cum ar fi Cu2+, Mn2+ acționează ca antioxidanți [41-48]. Datorită reacției reversibile de
transfer de electroni cu ionul superoxid, complecșii de Cu2+, Mn2+ ai curcuminei acțione ază ca și
o enzimă ce mimează superoxid dismutaza. Complecșii metalici ai curcuminei au o mare
semnificație în ceea ce privește patologia bolii Alzheimer, în cazul căreia s -a constatat că datorită
naturii lipofile, curcumina poate trece de bariera hemato -encefalică iar ionii metalici chelați sunt
toxici pentru neuroni. S -a observat, de asemenea, că incidența bolii Alzheimer este redusă în
mod semnificativ în rândul persoanelor care sunt cunoscute a consuma în mod frecvent
curcumină . Curcumina formează compl ecși stabili cu toate meta lele implicate în boala
Alzheimer [48-50]. Interacțiunea Al3+ cu curcumina, anterior considerată a fi responsabilă pentru
apariția bolii a fost studiată extensiv. Curcumina formează trei tipuri diferite d e complecși cu
Al3+, în fu ncție de stoechiometria reacției. Raportul stoechiometric curcumină: Al3+ de 1:1 a
prezentat o afinitate mai mică la legarea ADN -ului decât Al3+ liber, care a fost atribuită abilității
sale de reducere a incidenței bolii Alzheimer [49, 50]. Au fost raporta te numeroase alte aplicații ale
complecșilor de curcumină cu ioni metalici. Complexele de Ga3+ cu curcumină au fost concepute
pentru obținerea materialelor bioceramice inovative [51]. Complexul de curcumină cu zinc a
prezentat efe cte anticancer, gastroprot ective și antidepresive la șobolani [52,53]. Complecșii de
curcumină cu aur au dovedit o activitate antiartritică la testele in vivo [54]. Complecșii vanadil –
curcumină au prezentat activitate antioxidantă și antireumatică [55]. Prin formarea complecșilor
metalici cu curcumină se re duce toxicitatea metalelor grele cum ar fi Hg2+, Cd2+, Pb2+ unde stresul
oxidativ indus de metalele grele este redus semnificativ prin formarea complexului [56-60]. Datorită
sarcinii pozitive compl ecșii metalici ai curcuminei se pot leaga de ADN [61]. Unele rapoarte afirmă
faptul că aceștia induc deteriorarea ADN -ului și prin urmare prezintă un efect pro -oxidant. Ca
urmare, ei sunt explorați ca agenți antitumorali mai buni decât curcumina standard [62,
63].Evaluarea biologică a ac estor complecși este mai dificil de efectuat in vivo , deoarece
biodisponibilitatea lor este foarte scăzută iar experimentele sunt dificil de efectuat datorită
solubilității scăzute în solvenți organici cum sunt DMSO sau în f luidele biologice. Cu toate aces tea,
fără nici o îndoială această complexare in vivo a curcuminei cu metalele joacă un rol semnificativ în
reducerea toxicității induse de metale. Curcumina poate complexa cu diferiți liganzi. Complecșii cu
punți de porfirin ă cu Cu2+, Ni2+ și Zn2+ prezintă o îmbun ătățire a activității fotodinamice în modele
de ADN plasmidic [64]. Complecșii cu 4,4 bipiridină și Zn2+ sunt mai eficienți decât curcumina
pentru a distruge celulele de neuroblastom. Cei cu terpiridin lantanida (La3+) au arătat o creștere în
fotot oxicitate în celulele HeLa [65]. Complecșii de bipirdin -curcumină cu Pd2+ inhibă formarea
celulelor canceroase de prostată [62]. Complexului metalic format este prezentat schematizat în
figura 4 .

10

Figura 4. Schematizarea c omplexului metalic format

1.2.5. Studii farmacologice efectuate pe curcumină
Insolubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută a curcuminei în celule au determinat
dezvoltarea de noi formulări pe bază de substanțe org anice biocompatibile: lipozomi,
biopolimeri, hidrogeluri [66-68]. Pentru a crește biodisponibilitatea și a obține o circulație mai
eficientă, o permeabilitate mai bună și rezistență la procesele metabolice au fost preparate mai
multe formulări ce includ na noparticule, lipozomi, micele și complexe fosfolipidice. Studiile
farmacologice relevă faptul că curcumina este sigură și eficient ă, ceea ce a determinat să fie
utilizată în tratamentul și prevenirea unei game largi de boli umane. Cu toate acestea, datele
acumulate au arătat că curcumina are o biodisponibilitate relativ scăzută și o slabă solubilitate în
soluții apoase. Pentru prima dată Wahlstrom și Blennow (1978) au raportat faptul că după
administrarea orală a 1 g curcumină/kg la șobolani, concentrațiile de curcumină care s -au găsit în
plasmă au fost neglijabile, fapt care se poate datora unei slabe absorbții din intestin [69]. Într-un
studiu în care curcumina a fost administrată oral cu o doză de 2 g/kg la șobolani, o concentrație
serică maximă de 1.35 μ g/ml a fost observată la un interval de timp de 83 h, în timp ce la
oameni, la aceeași doză, cantitatea de curcumină este nedectab ilă sau foarte redusă în
concentrațiile serice (0.006 µg/ml) [70]. Un alt studiu efectuat pe șobolani a arătat că
administrare a per os a curcuminei 500 mg/kg a condus la o biodisponibilitate de 1% în plasmă; s –
a observat faptul că administrarea orală a curcuminei (1000 mg/kg) la șobolani a prezentat o
concentrație plasmatică de 15 ng/ml după 50 min [71]. Spre deosebire de adminis trarea la
rozătoare, administrarea a 4 -8 g de curcumină la om a arătat nivele plasmatice maxime de 0.41 –
1.75 μM după o oră de la administrare [72]. Într-un alt studiu efectuat pe voluntari umani
sănătoși, 3.6 g curcumină administrată oral a fost regăsită l a nivel plasmatic într -o concentrație
de 11,1 μmol/l, după o oră de la administrare [73]. S-a constatat că 10 mg/kg curcumină
administrată intravenos la șobolani a atins nivelul seric maxim în curcumină de 0.36 μg/ml, în
timp ce o doză de 50 de ori mai mar e administrată pe cale orală a dat o concentrație doar de 0.06
0.01 μg/ml în nivelele serice ale șobolanilor [74]. Sun și colab. au arătat că administrarea
intravenoasă a curcuminei libere la șobolani prezintă o mai bună biodisponibilate in plasma
sangvină . Concentrația a fost de 6.6 μg/ml în sânge cand s -au administrat 2 mg/kg curcumină

11
intravenos [75]. Aceste studii sugerează rolul căii de administrare pentru atingerea nivelelor
serice ale curcuminei și, de asemenea, comparația între nivelele serice la ro zătoare și oameni.

1.2.6. Efecte adverse ale curcuminei
Dezavant ajul major al curcuminei este insolubilitatea sa în apă și, prin urmare,
biodisponibilitatea scăzută în celule [68]. Studiile clinice au arătat că, curcumina este bine
tolerată de organism în doze de până la 8 g/zi. Reacțiile adverse dependente de doză rap ortate au
fost: (a) tulburări gastrointe stinale (b) infertilitate (c) inhibarea sintezei de Hepcidin (d) chelat or
pentru fier -determină scăderea nivelului de fier din organism, poate conduce la apariția anemiei,
(e) creșterea tranzitorie a enzimelor hepati ce (f) suprimarea agregării plachetare, (g) dermatită de
contact și urticarie atunci când este administrat în f ormulări topice.
Cea mai bună complianță a pacienților a fost atunci când s -au administrat 2 -4 g /zi
deoarece numărul mare de capsule sau creșt erea în dimensiune a capsulelor devine clinic
nepractică, în special la populația în vârstă. Dat ele epidemiologice sugerează o incidență scăzută
a cancerului gastric în India datorită consumului ridicat de curcumină. Doza de curcumină
estimată în dieta cel or care consumă zilnic cantități mari de turmeric este de 0.15 g/zi. În lipsa
studiilor clinice pe termen lung, această doză poate fi considerată potrivită atunci când
curcumina este utilizată pentru perioade lungi de timp. Această doză de curcumină este s imilară
cu cea recomandată de World Health Organization dar este de 10 ori mai mica decât cea
recomandată în general în suplimente [76, 77]. Curcumina standard se utilizează în general
împreună cu piperina (un extract din piperul negru) pentru a crește bio disponibilitatea acesteia.
Studiile anterioare de cercetare privind efectele secundare ale piper inei au arătat că aceasta poate
conduce la tulburări gastrice, conduce la efecte negative dovedite asupra fertilității și poate
inhiba efectul terapeutic al uno r medicamente daca se administrează simultan [76, 78, 79].
Atenuarea sau eliminarea acestor dez avantaje a fost încercată prin pregătirea formulărilor
pe bază de micelele, lipozomi, nanoparticule polimerice, complexe, emulsii [80, 81].
Matricele polimeri ce pot proteja curcumina de condițiile adverse de mediu; îmbunătățe sc
timpul de înjumătățire al compusului bioactiv, crescând astfel biodisponibilitatea acestuia atât in
vitro cât și in vivo [82].
Un număr crescut de studii raportează încapsularea/încorpor area curcuminei în
nanoparticule pe baza de polimeri natura li, cum ar fi chitosanul, guma ghatti sau polimerii
sintetici: poli(etilenglicol), poli(acid lactic), poli( N-vinil pirolidon), poli(acid glicolic lactic -co-
acid) pentru a obține diverse formulări f armaceutice [83-87].

1.3. Sisteme de eliberare controlată pe bază de polizaharide
Un polimer ideal utilizabil pentru imobilizare și transport de compuși biologic activi
trebuie să prezinte trei caracteristici esentiale :
-să fie biocompatibil și biodegradabil .
-produșii de degradare ai polimerului trebuie să fie netoxici și să nu creeze răspuns inflamat oriu
din partea organismului [88]
-degradarea polimerului trebuie să se producă într -o perioadă rezonabilă de timp [89].
Alegerea suportului polimeric ține sea ma de următoarele criterii:
• masa moleculară și distribuția maselor moleculare [90, 91]
• structur a : liniară sau ciclică, ramificată, reticulată, etc.
• relația polimer – principiu biologic activ:
➢ tipul de legătură: covalentă, ionică sau complex

12
➢ încapsularea în matricea polimeră;
➢ localizarea unității farmacologic -activă în polimer: în lanț sau ca ramifi cație
➢ fenomene stereochimice [92]
➢ natura chimică a polimerului [93].
➢ compoziția chimică;
➢ solubilitatea în sisteme apoase;
➢ încărcarea ionică;
➢ solubilitatea în fluidele corpului.
Polizaharidele îndeplinesc condițiile cerute pentru imobilizarea unui princip iu biologic
activ. Ele sunt lipsite de toxicitate, inerte farmacologic, nu conțin impurități sau aditivi și
compuși reziduali ai proceselor de polimerizare, pre zintă structură chimică bine precizată. În
plus, pot fi cu succes utilizate ca su porturi pentru imobilizare deoarece reacționează cu
substanțele biologic active formând compuși stabili. Atunci când moleculele principiului
biologic activ nu conțin grupe com plementare cu cele ale polimerului, acesta din urmă poate fi
funcționalizat.
Abilitatea multor polizaharide de a forma hidrogeluri chiar și la concentrații foarte mici
reprezintă una dintre cele mai importante propriet ăți funcționale ale acestora. Formarea
structurilor tridimensionale oferă o cale de creștere a stabilit ații chimice și mecanice a sistemului.
Amestecurile de polizaharide obținute natural și gelurile binare pot fi utilizate ca modele pentru
structuri celulare complexe.
Datorită proprietăților pe care le posedă, unele hidrogeluri polizaharidice au fost
intro duse în domeniul materialelor inteligente cu posibile aplicații în realizarea de țesuturi
artificiale, sisteme de eliberare controlată a principiilor biologic active. Principiile biologic act ive
sunt fixate de către macromolecule fie prin procese analoage absorbției, fie prin procese chimice
care duc la formarea de complecși. În cazul polizaharidelor grupele hidroxil și carbonil pot lega
direct principiul activ.
Polizaharidele sau moleculele p olimerice de carbohidrați sunt lanțuri lungi de
monozaharide lega te prin legături glicozidice. Materialele care au la bază polimeri naturali sunt
utilizați pe scară largă în aplicații biomedicale.

1.3.1. Importanța sistemelor de eliberare controlată a medicament elor pe bază de polizaharide

Eficacitatea clinică a chimioterapic elor cu masa moleculară mic ă și a macromoleculelor
biologice funcționale (adică proteine și oligonucleotide) este adesea limitată de o serie de
obstacole cum ar fi: solubilitatea scăzută, pi erderea structurii bioactive înainte de a ajunge la
locul țintă, a bsorbția celulară inadecvată, timpul mic de injumătățire în plasma determinat de
clearance -ului renal sau de degradarea enzimatică, rezistența organismului la medicamente
determinat de supra exprimarea transportatorului de eflux și a efectelor adverse nedor ite ale
medicamentelor citotoxice determinate de efectul “off target” în timpul chimioterapiei [94-98].
Dezvoltarea unui sistem inteligent de eliberare a medicamentelor de dimensiuni
nanome trice a atras atenția cercetătorilor pentru a rezolva nu numai ace ste probleme menționate
mai sus ci și pentru a ajuta la dezvoltarea nanomedicinei în bolile neinfecțioase, în special
cancerul [99-103].
Nanosisteme de administrare a medicamentelor cu dimen siune și structură controlată pot
fi realizate în mod corespunzăto r pentru a traversa cel mai mic perete capilar și au capacitatea de
a evita în același timp clearance -ul prin intermediul sistemului fagocitar mononuclear, ceea ce

13
determină o durată prelun gită de staționarea a lor în fluxul sangvin. Datorită efectului de
permeabilitate și retenție crescut (EPR), macromoleculele și nanoparticulele de dimensiuni mai
mari pot fi mai bine prinse în țesuturile tumorale decât moleculele cu masă moleculară mică și
nanoparticulele de mici dimensiuni [104-106].
Pe de altă parte, m oleculele bioactive cu masă moleculară mare (de exemplu citokine,
factori de creștere) au utilizări limitate determinate de instabilitatea lor la eliberarea in vitro și in
vivo, precum și da torită imunoge nității reduse și a timpului scurt de înjumătățire [107].
Pentru a depăși aceste limitări, tehnologiile moderne de obținere a medicamentelor sunt
facilitate de abilitățile cercetătorilor pentru a crea așa numita „a doua generație de medicame nte”
proteice. Pe baza proprietăților fizico -chimice ale macromoleculelor cum ar fi: masa moleculară,
structrura secundară și disponibilitatea grupelor funcționale de suprafață, au fost utilizate în
obținerea conjugatelor polimer -proteină sau proteină -proteină. Cu toate acestea structura
proteinei poate fi alterată prin procesul de modificare [108]. Prin urmare, există o mare necesitate
de a dezvolta sisteme de eliberare a medicamentelor, ceea ce poate determina îmbunătățirea
timpului de înjumătățire și imu nogenitate scăzută. Această strategie poate fi apoi utilizată în zone
farmaceutice care utilizează proteinele ca și agenți terapeutici.
Cercetările efectuate pe parcursul ultimelor decenii au condus la dezvoltarea unor
nanosisteme standard utilizate pentru eliberarea agenților terapeutici cum ar fi: lipozom i, micele,
conjugate polimerice, nanoparticule anorganice ș.a. Printre acestea polizaharidele sunt cele mai
cunoscute biomateriale, fiind derivate din polimeri naturali carbohidrați. În general sunt
consi derate sigure și sunt utilizate pe scară largă în in dustria alimentară [109]. De asemenea, au
fost utilizate ca excipienți în diferite formulări de medicamente. Practic polizaharidele sunt
carbohidrați care conțin un numar mai mare de molecule de monozaha ride legate covalent prin
legături glicozidice. Pe lângă polizaharide, în definiția carbohidraților există și monozaharidele și
dizaharidele.
Polizaharidele oferă o gamă largă de funcționalități versarsatile și diversitate structurală
datorită masei molec ulare variabile și a grupăr ilor funcționale abundente (grupări amino,
carboxil, carbonil și hidroxil) pe catena principală [110]. Polizaharidele provin de la diferite
specii de plante (celuloza), animale (chitosan, de origine naturală obținut prin deacetil area
chitinei provenite din crustacee și insecte exoscheletice), alge (alginat) și microorganisme
(dextran). În comparație cu alți polimeri sintetici hidrofobi, polizaharidele dețin un număr mare
de grupări hidroxilice sau alte grupări hidrofile, cum ar fi grupările carboxilice din alginat și
gelan, grupările amino din chitosan, ceea ce determină o solubilitate crescută în apă și
consolidează caracteristicile lor de bioaderare și biorecunoaștere ( interacțiunile electrostatice
între țesuturile biologice și polizaharide) [111]. De exe mplu, chitosanul, singura polizaharidă cu
caracter de polication, este capabil să se atașeze de straturile mucoaselor încărcate negativ prin
interacțiuni electrostatice [112]. În mod similar acidul hialuronic poate recunoaște și lega
antig enul glicoproteinei CD44 de pe suprafața membranelor celulare [113].
Mai mult de atât, fragmentele lor funcționale intrinseci pot servi ca punți de atașare a
chimioterapicelor, a sondelor imagistice și a agenților de țintire prin modificări chim ice facile
[114-116], cum ar fi PEG -ilarea și conjugarea anticorpilor, pentru a se asigura o circulație
sistemică prelungită și posibilitatea de acumulare a chimioterapicelor la locul țintă din organism.
Datorită proprietăților lor biochimice asemănătoare cu matrice le extracelulare umane,
polizaharidele sunt ușor de recunoscut și metabolizat de către organism [117]. Cercetările
efectuate anterior eu evidențiat implicarea lor în multe procese biologice, inclusiv în
recunoașterea sistemului imunitar și semnal izarea cel ulară [118], responsabile de activarea

14
răspunsurilor antimicrobiene și antiinflamatorii [119]. În plus acești biopolimeri suferă o
degradare enzimatică și hidrolitică in vivo conducând la produse secundare de degradare
inofensive care pot fi reut ilizate în sistemele biologice sau pot fi eliminate de sistemul imunitar
[120]. Pe baza caracteristicile menționate anterior, polizaharidele ar putea fi utilizate pentru
dezvoltarea sistemelor terapeutice de administrare a medicamentelor.

1.3.2. Obiectivele eli berării co ntrolate a medicamentelor din sisteme de administrare pe bază
de polizaharide
Biomaterialele obținute din polizaharide au fost exploatate de către cercetători datorită
capacității lor de eliberare controlată a agenților bioactivi (chimioterapice, antibioti ce, proteine,
peptide, acizi nucleici) utilizând diferite căi de administrare [121]. Progresele recente în
dezvoltarea nanomaterialelor pe bază de polizaharide au determinat apariția unor tendințe pentru
obținerea unor sisteme multifuncționale co mplexe pen tru transportul și eliberarea controlată a
substanțelor active terapeutice, care vor marca un pas important în medicina teranostică și
regenerativă, sistemele de administrare având profiluri terapeutice îmbunătățite cum ar fi
eficacitatea terapeu tică, prop rietățile mecanice și siguranța.
În general obiectivele eliberării controlate sunt următoarele:
• Protejarea medicamentul ui împotriva degradării.
Această proprietate este extinsă și pentru protecția biomoleculelor pe bază de proteine,
cum ar fi c itokinele și factorii de creștere, care conțin o structură secundară sofisticată care poate
fi degradată în timpul eliberării [122].
• Creșterea timpul ui de înjumătățire și biodisponibilitatea unor medicamente.
Un exemplu obișnuit es te administrarea pe cale parenterală de insulină după fiecare masă.
Au fost obținute nanoparticule de dextran cu insulină imobilizată pentru a crește timpul de
înjumătățire al insulinei iar administrarea să se efectueze mai rar [123].
• Îmbun ătățirea efectelor terapeutice și reduc erea efectel or secundare ale
medicamentelor
Acest obiectiv este des întâlnit în dezvoltarea sistemelor de administrare al
medicamentelor utilizate în terapia cancerului, unde chimioterapia ș i radioterapia afectează
condiția organismului pacienților.
• Scăder ea co stului cercetărilor privind identificarea unei noi ținte moleculare
terapeutice.
Costurile pentru cercetările efectuate în scopul de a identifica o nouă moleculă de
medicament sa u pentru a descoperi o nouă cale de semnalizare intracelulară eficientă î n terapie
sunt enorme. Prin urmare cercetătorii identifică unele molecule de medicament deja existente,
care sunt deja utilizate în terapie (profilul lor farmacologic fiind cu noscut) și utilizează tehnici
noi de administrare pentru a direcționa medicamentu l la locul țintă din organism unde va fi
eliberat controlat. În acest mod farmaco cinetica medicamentului este îmbunătățită iar costurile
pentru cercetarea fundamentală și pent ru cercetarea clinică vor fi mai mici [124].
Există numeroase principii de bază utilizate pentru dezvoltarea sistem ele de administrare
a medicamentelor care nu se limitează doar la sisteme obținute din polizaharide.

1.3.3. Mecanismele de eliberare a medicamente lor
Mecanismele de eliberare a medicamentelor conduc la elaborarea de sisteme de
administrare versatile pe bază de polizaharide utilizând diferite modificări chimice și cele mai

15
importante principii care trebuie respectate atunci când se proiectează un ast fel de sistem pentru
o eliberare eficientă componentelor bioactive încorporate su nt următoarele:
a) Dimensiunea ochiurilor rețelei polimerice poate controla difuzia moleculelor de
medicament [125].

Hidrogelurile sunt con stituite dintr -o rețea de polimeri reti culati și spații deschise (adică
ochiuri) între lanțurile polimerice. Ochiurile rețelei polimere permit difuzia lichidului și
substanței active de masa molecu lară mica. Dimensiunea ochiurilor rețelei variază între 5 și 100
nm pentru hidrogeluri și există d iferite metode pentru determinarea diametrului lor. Din cauza
eterogenității re țelei și a polidispersității, majoritatea hidrogelurilor au o distribuție largă a
dimensiunilor ochiurilor de rețea [126, 127].
Când diametrul ochiului rețelei polimerice este de trei ori mai mare decât diametrul
moleculei de medicament, difuzia este fac torul dominant pentru eliberarea medicamentului.
Ecuația Strokes -Einstein este utilizată de obicei pentru a determina difuzabilitatea (D), care
depinde de dimensiunea (raza) mol eculei de medicament (y drug) și vâscozitatea soluției (η) [128].
(1)
Unde R este constanta ideală a gazului iar T este temperatura absolută (K).
Când ochiurile rețelei au raza similară cu a moleculei de medicament, difuzia
medicamentului va fi o prită de împiedicările sterice [125]. Prin urmare, controlul domensiunii
ochiurilor și a porilor rețelei polimerice devine important în elaborarea sistemelor de eliberare.
Dimensiunea porilor poate fi ajustată în matricea polimerică prin ajustarea concent rației de
polimer, a concentrației de agent de reticulare și a stimulilor e xterni cum ar fi temperatura și pH –
ul.

b) Eliberarea controlată a medicamentelor prin degradarea rețelei
O strategie de a controla eliberarea de molecule de medicament inițial imobil izate într -un
hidrogel este de a controla degradarea rețelei. Dimensiunea o chiurilor rețelei cre ște pe măsură ce
rețeaua se degradează, permițând medicamentelor să difuzeze din hidrogel. Degradarea poate să
apară în catena principală a polimerului sau la l egăturile formate prin reticulare și este de obicei
mediată de hidroliză [129-131] sau activată enzimatic [132-134].
Legăturile esterice suferă o hidroliză lentă și au fost folosite pentru a forma o clasă de
hidrogeluri obținute din poli(etilenglicol) (PEG ) biodegradabile, iar eliberarea de proteine
imobilizate din acest tip de h idrogel este extrem de lentă având timpul de înjumătățire până la 17
zile [131] . Legăturile oligo -peptidice sunt scindabile cu metaloproteinaze matriceale [133]. Un
exemplu de utili zare a acestor legături este încorporarea unei peptide scindabilă cu
metalo proteinaze matriceale (GGRMSMPV) într -un hidrogel de acid hialuronic care a fost
utilizat pentru a elibera un inhibitor tisular recombinant al metaloproteinazei matriceale într -un
model porcin de infarct miocardic [135]. Acest studiu prezintă un hidrogel s ensibil la
biomolecule care se poat e degrada ca răspuns la metaloproteinaza matricială și eliberează
medicamente pentru tratamentul infarctului miocardic.
În plus față de hidrogelur ile cu răspuns la metaloproteinaze matriceale, există și alte
sisteme de sc indare care răspund la biomoleculele prezente în organism, cum ar fi hidrog elurile
cu răspuns la glucoză pentru eliberarea insulinei [136, 137] și hidrogelurile cu răspuns la
trombi nă pentru a controla coagularea sângelui [138, 139]. Degradarea poate fi, d e asemenea,
declanșată în timp real, cu stimuli externi. De exemplu, condițiile acide accelerează de obicei
hidroliza [140]

16
Lumina ultravioletă (UV) poate declanșa degradarea micro gelurilor care conțin
fragmente de o -nitrobenzil eter (NBE) datorită datori tă scindării legăturii, însoțită de eliberarea
factorului de creștere de tr ansformare β1 încapsulat (TGF -β1) [141].
Pierderea masei polimerului prin degradarea hidrogelului, cunosc ută și sub denumirea de
eroziune, poate avea loc simultan în tot hidrogelul sau în mod preferențial pe suprafața
hidrogelului. Eroziunea în tot hidrog elul și de suprafață poate fi utilizată pentru a controla
diferențial eliberarea de medicamente. Multe hid rogeluri suferă o eroziune în masă, deoarece
rețeaua este permeabilă la apă sau la enzime care mediază degradarea. Dacă viteza de difuzie a
acestor ag enți este rapidă în comparație cu viteza de degradare a legăturii, degradarea va avea loc
simultan în toat ă masa de gel [142]. Hidrogelurile constituite din polizaharide oxidate (de
exemplu, alginat și chitosan oxidate cu periodat de sodiu) suferă de obicei o eroziune în toată
masa, iar viteza de degradare poate fi mediată de gradul de oxidare [143, 144]. Poliesterii
hidrofobi, cum ar fi poli(caprolactona) (PCL) și poli(lactida) (PLA ) care se degradează prin
hidroliză sunt adesea utilizați prin copolimeriza re cu polietilenglicol hidrofil (PEG), ceea ce
determină o degradare în masă a hidrogelurilor [145]. Aceșt i copolimeri sunt adesea utilizați cu o
concentrație ridicată de polimer (2 0-30% în greutate), ceea ce permite eliberarea substanțelor
bioactive contr olată de degradare; de exemplu, un copolimer triblock de PCL -PEG -PCL a
determinat eliberarea albuminei ser ice bovine (BSA) timp de două săptămâni. În schimb,
eroziunea de suprafață rezultă când viteza de scindare a legăturilor este mai mare decât viteza de
difuzie a enzimei sau a soluției apoase din exterior în cea mai mare parte a hidrogelului [146].
Hidroge lurile reticulate care utilizează grupări hidrofobe asociate(de exemplu, în tre β –
ciclodextrină și colesterol) pot inhiba intrarea apei, conducând la o erodare mai mare a
suprafeței hidrogelului. Pierderea de masă poate fi liniară în timp pentru gelurile e rodate la
suprafață, ceea ce poate determina o eliberare de ordinul zero a medicamentelor încapsulate
[147]. Pentru o varietate de hidrogeluri, se poate controla reacția de degradare și mecanismul de
eroziune pentru a obține cinetica de eliberare dorită cu prinsă între săptămâni și luni, permițând
astfel o eliberarea prelungită. Cu toate acestea, trebuie să avem în vedere că produsul de
degradare trebuie să fie netoxic și suficient de mic pentru eliminarea sa naturală.

c) Comportamentul la umflare a materialul ui ar putea determina eliberarea controlată a
moleculelor de medicament.

Particulele de hidrogel pe bază de polizaharide se umflă pentru a absorbi apa ,
dimensiunea structurii poroase va crește iar medicamentul încapsulat va fi eliberat. Gradul de
umflar e al unui hidrogel reprezintă echilibrul între forțele care comprimă deformar ea rețelei și
osmoza care determină absorbția apei [148, 149]. Diverși factori au fost intens studiați cum ar fi
pH-ul, temperatura, puterea ionică, câmpurile electrice, lumina și glucoza și s -a stabilit că pot
influența gradul de umflare [125] .
Umflarea h idrogelurilor dependentă de pH este deosebit de importantă pentru sistemele
de administrare a medicamentelor pe cale orală și în terapia cancerului. În această aplicație,
umflarea hidrogelurilor pe bază de polizaharide în mediul acid din stomac este de obi cei minimă
și astfel medicamentul este protejat prin încapsulare fizică. Pe măsură ce particulele de hidrogel
traverseză tractul intestinal unde pH -ul este neutru, rețeaua polimeră poate fi elaborată să se
umfle dramatic, permițând difuzia rapidă a medicam entului. Astfel au fost elaborate hidrogeluri
utilizând diferi ți polimeri cu grupări funcționale acide sau bazice. Dintre polizaharide alginatul
este cel mai des utilizat. În cond iții acide, hidrogelul pe bază de alginat este atât de compactat

17
încât medica mentele nu pot fi eliberate. Atunci când pH -ul devine neutru, grupările de ac id
carboxilic din alginat sunt deprotonate și generează o osmoză considerabilă, ceea ce determină
umfl area rețelei polimere și eliberarea substanței bioactive imobilizate [150]. Declanșarea
eliberării în funcțe de pH poate determina direcționarea și eliberarea medicamentelor în tumorile
solide în care mediile extra – și intracelulare sunt mai acide decât î n țesuturile normale [151].
Alte mecanisme care determină um flarea hidrogelu lui au fost, de asemenea, exploatate
pentru direcționarea eliberării medicamentelor încapsulate. De exemplu, un nanogel sensibil la
temperatură a fost utilizat pentru a elibera un medicament chimioterapic (cisplatin ) celulelor de
cancer mamar , unde tempera tura a fost puțin mai ridicată decât temperatura normală a corpului
[152]. O limitare a sistemelor în care eliberarea medicamentului este controlată de umflare este
că răspunsul la stimuli este relativ lent pentru hidrogelurile macroscopice datorită difuz iei lente
a apei. Pentru particulele de hidrogel de 1 mm, modificările în urma procesului de umflare și
eliberarea controlată a medicamentelor ar trebui să necesite zeci de min ute. Pentru a obține un
răspuns rapid la stimul, se poate reduce distanța de di fuzie prin reducerea dimensiunii
particulelor de hidrogel sau modificarea structurii prin construirea de macropori interconectați în
interiorul hidrogelului. Ca alternativă la m odificarea structurii hidrogelului, au fost studiate
utilizarea diferitelor str aturi superficiale care se pot umfla rapid pentru a controla difuzia
medicamentelor încapsulate [153].

d) Eliberarea controlată prin deformare mecanică

O ultimă abordare pentru el iberarea moleculelor de medicament încapsulate în matricea
polimeră este de a deforma mecanic rețeaua, deoarece dimensiunile ochiurilor rețelei polimere
pot crește prin schimbarea structurii rețelei polimere și determin ă astfel declanșarea fluxului
convecti v în rețea . Această strategie poate genera tipare de eliberare pulsatilă cu u n control fin
asupra vitezei de eliberare instantanee [154]. Eliberarea pulsatilă poate imita unele modele
biologice de semnalizare, de exemplu, în administrarea insulinei în urma consumului de alimente
[155]. Deformarea rețelei polimere poate fi realizată abordând diferite metode, inclusiv
deformarea pur mecanică sau utilizarea deformațiilor induse de ultrasunete și de câmpul
magnetic. S-a demonstrat că deformarea mecanică directă determină eliberarea controlată a unui
factor de creștere utilizat pentru a intensifica vascularizarea tisulară [156]. Un câmp magnetic
poate deforma rețeaua polimeră a unui hidrogel care conține nanoparticule magnetice [157, 158],
iar includerea unor mac ropori are ca rezultat o deformare extinsă și rapidă a structurii, ceea ce
determină îmbunătățirea eliberarii de moleculelor medicament [159].
Ultrasunetele pot perturba temporar structura hidrogelului iar aceasta deformare este
avantajoasă datorită rezol uției spațiotemporale ridicate și a difuziei profunde în țesuturi [160].
Eficacitatea ultrasunetelor pentru a asigura o eliberare de medicamente pulsatilă a fost
demonstrată cu o serie de medicamente, inclusiv insulină și ɣ-interferon [161]. O potențială
problemă care are legătură cu deformarea mecanică este deteriorarea cumulativă a hidrogelurilor,
ceea ce determină defecte mecanice în structura hidrogelul ui. Această problemă poate fi
rezolvată prin utilizarea de hidrogeluri care au capacitatea de autovind ecare. De exemplu,
hidrogelurile pe bază de alginat reticulate reversibil cu cationii divalenți se pot vindeca în
condiții fiziologice în urma încetării a cțiunii ultrasunetelor, permițând eliberarea repetată
(pulsatilă) de molecule mici, proteine și oligon ucleotide condensate (compactate) [154]

18
1.3.4. Tipuri de polizaharide utilizate î n obținerea sistemelor de eliberare controlată

Există multe posibile abordări de clasificare a polizaharidelor: în funcție de compoziția
chimică, de structură, solubilitate și de s ursel e de unde provin. În funcție de compoziția chimică
polizaharidele pot fi clasificate în două categorii: homopolizaharide sau homoglicani (conțin un
singur tip de monozaharide; ex chitina sau chitosanul, amidonul, celuloza) și heteropolizaharide
sau h eteroglicani (sunt constituite din mai multe tipuri de monozaharide; ex. Alg inații,
glucozaminoglicanii, acidul hialuronic și pectina). O altă clasificare a polizaharidelor este în
funcție de sarcina electrică și acestea pot fi polizaharide cationice (chit osanul care conține
gruparea aminică cu sarcină pozitivă) și polizaharide a nionice (alginații, gelanul conțin gruparea
carboxilică cu sarcină negativă). Moleculele cu aceleași grupări funcționale pot fi modificate
chimic în mod similar. În plus, metodele utilizate în prepararea biomaterialelor sunt comparabile
și pot fi abordate pentru obținerea unor sisteme utilizate pentru eliberarea controlată a
medicam entelor [162].

1.3.4.1.Gelanul
Gelanul, exopolizaharid polianionic de cultura microbiana, a devenit u n polimer extrem
de important pentru bioaplicații odată cu aprobarea sa, in anul 1992, de catre FDA ca aditiv
alimentar. Gama aplica țiilor sale s -a extins rapid în domeniul farmaceutic, cosmetic, alimentar,
medical, inginerie tisulară, biotehnologii etc. Este un polimer anionic, liniar cu secvențe de
tetrazaharide care se repetă și sunt constituite din două reziduuri de de β -D-glucoză, unul de acid
β-D-glucuronat și unul de α -L-ramnoză (figura 5 ) într -un raport 2:1:1 . [163, 164]

Figura 5. Unitățile de te trazaharide care se repetă ale gelanului deacetilat (sunt indicate locurile
unde substituenții gliceril si acetil sunt atașati în gelanul bogat in grupe a cil) [163, 164]
Polizaharida nativă de biosinteza are un substituent L -gliceri l pe O(2) de la al 3 -lea
reziduu de glucoză legat de secvența de tetrazaharid e și, în cel puțin cât eva unități care se re petă,
o grupă acetil la O(6) al a celuiasi reziduu .[165]
În producția comercială obișnuită ambele tipuri de substituenți sunt îndepărta ți prin
tratarea masei de fermentație cu alcali fierbinți. Polimerul deacetil at rezultat este cunos cut ca și
“gumă gelan” sau prin numele comercial Kelcog el (pentru aplicații alimentare) sau Gelrite
(pentru aplicații nealimentare). Gruparile acil pot fi pă strate prin utilizarea procedurilor de
extracție mai blânde. Catenele ramifi cate au fost vizualiza te direct prin microscopie de fortă
atomică pentru o re țea formată prin uscarea soluțiilor diluate de gelan pe mică prospăt măcinată.
Lungimea segmentelor li niare între punctele de formare a microgrefelor variază considerabil, dar
în general este de 150 nm . Macromoleculele de gelan se asociază câte două, într -o structură de
dublu helix (fig. 2). Cele două lanțuri polimerice sunt paralele unul față de celălalt și sunt
îmbinate exact la jumătate (cu o rotație a lanțului de 180ș), în așa fel încât distanța car e se repetă

19
a helixulu i este jumătate din catena indivi duală, un aranjament similar cu cel observat pentru
caragenan. [166].
Gelanul este o exopolizaharidă m icrobiană anionică, solubilă în apă, cu masa moleculară
cuprinsă între 1 -2 x 106 Da pentru gelanul bogat în grupe acil și 2 -3 x105 Da pentru gelanul
deacetilat [167]. Gelanul acetilat este solubil în apă caldă în timp ce gelanul deacetilat sau cel
care co nține puține grupe acil este solubil atât în apă caldă cât și în apă rece. Pr oprietățile
gelanului depind de numărul de g rupe acil/mol [168, 169] .
Încălzirea la 85 -95șC a gelanului bogat în grupe acil este suficientă pentru solubilizarea
sa în apă. Când d ispersia de gelan bogat în grupe acil este încălzită la 40 -50șC, se umflă și
formează o suspensie s ub formă de pastă. Con tinuând încălzirea, această suspe nsie dispare brusc
și solubilizarea este completă. Prin răcire, macromoleculele suferă o schimbare con formațională
de la o formă neregulată la una regulată, elicoidală. Agregarea structurii elicoidale este limitată
în prezența grupelor acetil, când se form eaza geluri moi, elastice. Gelurile acetilate nu manifestă
sinereză sau histerezis termic. Gelurile de gelan bogat în grupe acil au o vâscozitate joasă;
comportamentul la gelifier e al gelanului bogat î n grupe acil este similar cu cel al xantanului și al
gumei locust bean . [170].
În cazul gelanului deacetilat hidratarea depinde de tipul și concentrația ion ilor, el fiind
solubil în apă deionizată la temperatura camerei, la fel ca și sarea sa de sodiu. Ad ăugarea unei
concentrații foarte mici de ioni metalici în soluția de gelan conduce la obținerea unui hidrogel
atunci când temperatura se modifică. În compara ție cu alte hidrogeluri pe bază de polizaharide,
cel de gelan este mai rezist ent la temperatură și mai puțin sensibil la pH [171].
Gelifierea gelanului a fost investigată de mulți cercetători, constatându -se ca este un
proces în două etape. În prima etapă are loc o schimbare conformațională de la o conformație
dezordonată la o con formație ordonată de d ublu helix și în a dou a etapă are loc agregarea
dublulu i helix și formare punctelor de joncțiune [172].
Gelifierea gelanului depinde de concentrația solutie i de polimer, temperatură și de
prezența în soluție a cationilor monovalenți sau bivalenți. Gelanul formeaza un helix ord onat din
catene duble la temperat uri scăzute, în timp ce la temperaturi înalte apare o singură catenă de
polizaharidă, ceea ce reduce s emnificativ vâscozitatea soluției. Temperatura de tranziție pentru
transforma re de fază sol -gel est e de 35șC dar poate va ria între 30 -50 șC. Sub această t emperatură
se formează gelul de gelan. Mecanismul de gelifiere constă în formarea unor zone de joncțiu ne
dublu elicoidale, urmată de agregarea segmentelor dublu elicodale pentru a forma o rețea
tridime nsională prin complexa re cu cationi și prin legături de hidrogen cu apa [173].
S-a sugerat că mecanismul de gelifiere a gelanului deacetilat în prezența ion ilor bivalenți
este diferit de mecanismul de gelifiere care are loc în prezen ța ionilor monovalenți [172]. În
prezența cationilor monovalenți, gelifierea apare cu agregarea ulterioară a dublu helixului și la o
temperatură mai scăzută decât cea la care apar e tranziția de la o structură neregulată la structura
ordonată de dublu helix . În schimb, se presup une ca în cazul cationilor bivalenți aceștia ar
interac ționa imediat cu segmentele de lanț din gelan atunci cand are loc răcirea, formând o
structură ordonat ă specifică la o temperatură mai ridicată decât temperatura de tranziție . Rețelele
de gel astfel fo rmate devin foarte stabile la temperatură după adăugarea progresivă de cationi
[174].
Cationii monovalenți scad repulsia electrostatică prin legarea lor la structura elicoidală în
locurile specifice din jurul grupelor carboxilice ale polimerului. Puterea legăturii crește cu
creșterea razei ionice (Li+< Na+< K+< Rb+< Cs+). Sunt necesare concentrații mai mari de cationi
monovalenți pentru obținerea unor geluri de gelan cu o tărie optimă în timp ce concentrații de

20
cationi bivalenți mult mai mici sunt necesare pentru obținerea unui gel cu aceeasi tărie [172,
175]. Agregare și gelifierea cu cationii bivalenți apare direct în zonele de legare din helixul dublu
al io nilor bivalenți. Concentrații mari de sare sau de acid cauzează agregarea exc esivă și în
consecință scade tăria gelului. Aceste structuri ordonate devin e xtrem de stabile la temperatură
prin adăugarea progresivă de cationi bivalenți, mai eficienți decât ce i monovalenți. Cationii
bivalenți ai metalelor tranziționale (Zn2+, Cu2+ și Pb2+) conduc la formare a de geluri mai
puternice decât metalele din grupa II [176]. Utilizând pentru reticularea gelanului săruri ce conțin
cationii Ca2+ și Mg2+ s-a observat, prin comparare, că gelurile care conțin cationii Ca2+ sunt de
1.1-1.4 ori mai put ernice dec ât cele care conțin cationi de Mg2+ la aceeași concentrație de sare.
[172]. Potențialul de gelifiere a gelanului este îmbunătățit prin adăugarea de cationi monovalenți
sau bivalenți în timpul procesului de răcire ceea ce determină creșterea număr ului de punți de
sare din zona de joncțiune. S-au facut cercetări asupra meca nismului de agregare a lanțurilor de
gelan în timpul gelifierii și asupra proprietăților reologice ale soluțiilor de polimer și ale gelurilor
pentru a elucida relația dintre struc tura macromoleculelor și cationi. Pentru a observa schimbările
conformațional e ale lanțurilor de gelan în timpul gelifierii de la o structură dezordonată la o
structură ordonată d ublu elicoidală s -a utilizat spectrometria de dicroism circular. O valoare
maximă a elipticității m olare a apărut la 201 nm și temperatura la care tranziț ia conformațională
a avut loc devine mai mare cu creșterea concentrației de cationi. Au fost inregistr ate si spectre
RMN pentru a monitoriza schimbările în mobilitatea lanțurilor de gelan în timpul tra nsformării
de fază (tranziției sol -gel) în prezența cat ionilor monovalenți sau bivalenți, observandu -se
legăturile de hidrogen care se formează [177]. Metode le reologice reprezintă o cale de
monitorizare a procesului de gelifiere a fl uidului vâscoelastic, deoarece vâscoelasticitatea soluției
de polimer se schi mbă mult la punctul de gel. Temperatura de gelifiere creste cu cresterea
concentrației de cationi [178-180].
Studiile reologice și de microscopie confocală laser de baleiaj demon strează că soluțiile
cu concentrații de gela n între 0.005 -0.05 %, în prezența a 10 mM CaCl 2 duc la formarea unei
rețele de gel. La concentrații mai mici de gelan, spectrul mecanic arată un comportament de gel
iar observațiile microscopice indică formarea u nei rețele tridimensio nale chiar dacă vâscoz itatea
soluției este redusă semni ficativ. Creșterea progresivă a concentrației de gelan determină un
caracter elastic al sistemelor de gel obținute dar imbunătățirea proprietăților gelului depinde de
concentrația de cationi. [181, 182 ].

• Aplicații farmaceutice
Polimerul a fost utilizat inițial ca ingredient alimentar dar datorită proprietăților sale
funcționale este tot mai mult utilizat și pentru obținerea de noi sisteme de administrare a
substanțelor medicament oase. Gelurile de gela n sunt termoreversibile și au o temperatură de
topire d e 50șC, depinzând de concentrație și de prezența cationilor care il stabilizeaza,
determinand astfel c resterea acestei proprietati [183].
Pacien ții au arătat o complianță ridicat ă pentru sistemele de eliberare pe bază de gelan
datorită formării in situ a gelului și de aceea el a fost investigat pentru obținerea de sisteme
polimerice de administrare a med icamentelor oftalmice eliberate controlat în sacul conjunctival.
Gelul de gel an prezintă o vâscozit ate scăzută în absența cationilor iar în momentul administrării
picăturilor de soluții oftalmice ce conțin gelan și substanța activă medicamentoasă (fără a c onține
cationi), în prezența lichidului lacrimal are loc tranziția sol -gel. B iodisponibilitatea
medicamentului depinde de tăria gelului. Timpul de contact al gelului în sacul conjunctival crește
cu creșterea concentrației de gelan. Procesul de autoclavare care se utilizează pentru sterilizarea

21
soluțiilor de gelan poate duce la o sc ădere semnificativă a tăriei gelului în prod usul final ca
urmare a scindării lanțului polimeric, fiind proporțională cu timpul de autoclavare [184, 185].
Gelurile formate cu soluț ie hipotonică (ser fiziologic) își mențin integritatea căteva ore. Gelurile
de gelan pot fi formate în lichidul lacrimal când concentrația polimerului est e foarte mică, iar
sodiul s -a dovedit a fi un ion adecvat pentru formarea in situ a gelului [186].
Gelanul a fost de asemenea testat in vivo pentru administrare nazală cu formare a gelului
in situ . Shi -lei Cao și colab. 2009 [187] , au creat un nou gel de gelan cu formare in situ pentru
eliberarea controlată a furoatului de mometazonă administrat pe cale na zală. Acest medicament
(din clasa corticosteroizilor) este eficient în inhiba rea simptomelor asocia te rinitei alergice.
Testele in vivo au arătat că 20 μg/zi de furoat de mometozonă sunt suficiente pentru a reduce
numărul de strănuturi la șobolani [188, 18 9]. Pentru comparație, medicamentul a fost administrat
la șobolani atat ca su spensie simplă cât și încoporat în soluția d e gelan. S -a dovedit ca efici ența
medicamentului din gelul ce se formează in situ este superioară medicamentului liber, efectele
sale t erapeutice fiind mult îmbunătățite. Vâscozitatea sistemului are o importanță majoră; la
început sol uția de gelan are vâsc ozitatea unui fluid ce poate fi p ulverizat și apoi, în prezența
cationilor se formează gelul care trebuie să -și mențină integritatea st ructurală pentru a facilita
eliberarea susținută a medicamentului pe o perioa dă prelungită fără a s e eroda sau dizolva
repede. Gelanul necesită cantități mici de ioni pentru a se transforma în gel; vâscozitatea acestuia
crește cu creșterea concentrației de polizaharid. Pentru formularea sistemului de administrare a
medicamentului s -a utilizat xantan (ag ent de suspendare), gelan 0.5% și furoatul de mometazonă.
Prin testele in vivo efectuate s -a demonstrat că biodisponibilitatea și efectele terapeutice ale
medicamentului pot fi îmbunătățite dacă acesta este încorporat în sistemul poli meric de
administrare special formulat pentru gelifierea in situ și eliberarea controlată a substanței
medicamentoase . Gelul format are un caracter pseudoplastic și a prezentat si guranță pe tot
parcursul studiului [187].
Au fost elaborate microparticule d e gelan care conțin cl orhidrat de metoclorpr amid
obținute prin metoda pulverizare -uscare, fiind utilizate pentru administrarea intranazală. Metoda
de obținere nu este dependentă d e caracteristicile de solubilitate a medicamentului și a
polimerului. Micropa rticulele de gelan și clorhidrat de metoclop ramid nu sunt toxice pentru
mucoa sa nazală. Dimensiunea particulelor a variat între 9.38 -10.67 μm, fiind potrivită pentru
administrarea nazală. După pulverizarea microsferelor se formează un gel pe mucoasa nazală
datorita proprietățil or lor mucoadezive, pr in retragerea apei de pe mucoasa nazală și prin
interacțiunea cu cationii prezenți. Eliberarea medicamentului din microparticule a fost controlată
moderat, fiind atribuită formării hidrogelului. Rezultatele stud iilor in vitro sunt pr omițătoare și
arată ca metoda pulverizare -uscare utilizată pentru formarea microparticulelor de gelan cu
clorhidrat de metoclopramid ar putea fi utilizată pe ntru elaborarea de sisteme cu administrare
intranazală. Sunt necesare însă st udii farmacocinetice ș i de farmacodinamie în ainte de
administrarea nazală la oameni [190].
Gelanul a fost de asemenea testat pentru administrarea orală a medicamentelor.
Au fost efectuate cercetări pentru obținerea unui sistem de gelifiere in situ pentru
eliberarea controlată a naproxenului. Naprox enul este un medicament antiinflamator
nesteroidian, cu efect antipiretic și antiinflamator. Formează legături cu albumina din plasmă,
prezintă toxicitate gastrică și ar fi mai eficient dacă doza de medicament ar fi eliberată controla t
pe o perioadă prelun gită. Au fost utilizați trei tipuri de polimeri care au proprietăți de gelifiere:
alginat de sodiu, pectină și gelan și doi agenți de r eticulare, clorură de calciu și citrat de sodiu de

22
o anumită concentratie, pe ntru fiecare polimer î n soluție.Concentrația de medicament utilizată a
fost d e 2.5% fată de soluția de polimer [191].
Gelifierea in situ a fost testată prin adăugarea soluțiilor de polimer sub formă de picături
în fluidul gastric simulat la un pH=1.2 [192]. S-a urmărit efectu l diferitelor conc entrații de
CaCl 2 și citrat de sodiu asupra proprietăților de gelifiere. Concentrațiile minime care mențin
fluiditatea soluțiilor înainte d e administrare și cele care determină gelifierea soluțiilor în fluidul
gastri c sunt de 0.25% (m/v) citrat de sodiu, respectiv de 0.075% (m/v) CaCl 2. Cresterea
concentrației de CaCl 2 cu 0.1% (m/v) cauzează gelifierea formulării înainte de contactul cu
fluid ul gastrointestinal simulat. De asemenea, eliberarea naproxenului din geluri este afectată de
tipul și concentrația agenț ilor de reticulare [191].
Metoda gelifierii ionice este cunoscută și s -a studiat efectul diferiților cationi și a
concentrației de pol imer asupra eficienței de încapsulare a substanței medicamentoase precum și
asupra vitezei de elibe rare a acesteia la locul țintă din tractul gastrointest inal. Particulele pe bază
de gelan au fost testate in vitro și in rezultatele obținute au fost promiță toare în eliberarea
controlată pe o perioadă mai mare de timp, în reducerea e fectelor secundare, în creșterea
biodisponibilității și complianța paciențil or poate crește datorită reducerii frecvenței
administrării [193, 194].
Anurag Verma și Jazant K Pand it, 2011 [ 195] au studiat efectul calciului și a l
concentrației de polimer as upra eficienței de înc orpora re și eliberare a substanței
medicamentoase. Au fost obținute particule flotabile de gelan în care a fost încorporat rifabutin
(medicament utilizat în tratamentul infecțiilor rezistente ale stomacului cum este și infecția cu
bacteria Helicobacter Pyl oris). Particulele au fost preparate prin gelifiere ionică cu ioni de calciu
în mediu acid. Particulele sunt sferice, au o suprafață rugoasă, iar fotografii le de microscopie
electronică de baleiaj în secțiunea transversală evidentiaz ă un interior foarte p oros. Eficiența de
incapsulare a medicamentului în particule variază între 40.3% și 60.7%. Creșterea concentrației
de ioni de calciu determină creșterea efic ienței de încapsulare a medicamentului. Proprietățile de
flotabilitate depind mult de concentrația de NaHCO 3. Viteza de eliberare a substanței
medicamentoase scade cu creșterea concentrației de ioni de calciu. În prima oră eliberarea a fost
rapidă, ulterio r aceasta devenind lentă. Chiar daca concentrația de gelan a variat, nu au fo st
observate diferențe semnificative în elib erarea medicamentului, eficiența de eliberare fiind de 48 –
69%. Eficiența scăzută în imobilizare a medicamentului este determinată de ut ilizarea NaHCO 3
ca agent generator de gaz care în reacție cu acidul acetic (d in baia de extrudere a particulelor)
eliberează CO 2. Dioxidul de carbon rămâne blocat în rețeaua de gel, avînd ca efect creșterea
porozității particulelor și dar scade rezistența particulelor de hidrogel. Ca rezultat substanța
medicamentoasă difuzează ușor în lichidul de gelifi ere. Studiul demonstreaza faptul că eficiența
încorporă rii substanței medicamentose poate fi controlată prin reglarea factorilor procesului.
Particulele de h idrogel obținute pot fi utilizate ca sisteme particulate polimerice destinate
eliberării controlate a rifabutinului, fiin d administrate oral pentru tratar ea diverselor infecții
rezistente ale stomacului [195]. Amit Kumar Nayak și colab. au elaborat noi par ticule de
hidrogel obținut din semințe de tamarind și gelan pentru eliberarea controlată a clorhidr atului de
metformin de stinate administrării orale. Semi nțele de tamarind sunt necancerigene,
biocompatibile și au o stabilitate excelentă la pH acid [196]. Ele au proprietăți mucoadezive
gasindu -și utilizare în aplicații de eliberare controlată a medicamen telor [197] . Ca metodă de
preparare a particulelor a fost aleasă gelifierea ionică iar agentul de reticulare utilizat a fost
CaCl 2. Clorhidratul de metformin este un medicament hipoglicemiant utilizat în diabetul de tip II

23
neinsulino -dependent. Are timpul de injumătățire de 1.5 -1.6 h și absorbție în intestinul superior
[198, 199]. Biodisponibilitatea sa orală a fost de 50 -60% [197].
Particulele sferice mucoad ezive au fost optimizate printr -un model factorial 32 și
analizate prin RSM ( response surface metho dology). A fost observată o creștere a eficienței de
încapsulare a medicamentului odată cu scăderea raportului de gelan -semințe de tamarind cat și
cu reducer ea concentrației de CaCl 2. O scădere în eficiența de eliberare a medicamentul ui a fost
observată cu scăderea concentrație i de gel an/semințe de tamarind și cu creșterea concentrației de
CaCl 2. Eficiența de încapsulare este de 95.73
4.02 % iar el iberarea medicamentului în primele
10 ore este de 61.22
3.44%. Pa rticulele de hidrogel au fost caracterizate prin spectroscopie
SEM și FTIR. Particulele de hidrogel astfel formulate prezinta un grad de umflare dependent de
pH, au o bună mucoade zivitate la mucoasele membranei biologice iar testele in vivo pe șobolani
au arătat o bună a ctivita te hipoglicemiantă. Particulele sferice astfel formulate ar putea fi utilizate
pentru eliberarea controlată, prelungită a clorhidratului de metformin pentru menținerea nivelului
optim de glucoză din sânge și pentru o bună complianță a pacienților. Aceste p articule de
hidrogel p ot fi utilizate și pentru încorpo rarea altor medicamente care necesită îmbunătățirea
biodisponibilității și a eficienței lor terapeutic e [200]. Amit Kumar Nayak și colab.,2014 [201] au
elaborat și particule de hi drogel mucoadezive pe bază de gelan cu mucilagii de ispaghula (tărâte
de psyllium ) în care a fost încorporat clorhidratul de metformin. Ca și în studiul anterior, metoda
de obține re a fost gelifierea ionica iar ca agent de reticulare s -a utilizat CaCl 2. Eficiența în
încapsulare a fost de 94.24
4.18 % iar eliberarea medicamentului în primele 10 ore este de
59.13
2.27 %. Particulele mucoadezive care conțin clorhidratul de metformin sunt indicate
pentru eliberarea controlată și susți nută a medicamentului. Au fost efectuate tes te in vivo iar
particulele de hidrogel cu clorhidratul de metformin încorporat au fost administrate la șobolani
cărora li s -a indus di abetul cu aloxan și s -a observat ca nivelul optim de glucoză din sânge este
menținut [201].
Partic ule sferice de gelan preparate prin metoda de gelifiere ionica au fost utilizate
pentru eliberarea controlată a cefalexinului. S -a urmărit efectul parametril or de formulare asupra
eficienței de încapsulare și eliberare controlată a me dicamentului. Cefalexi nul a fost dispersat în
soluția de gelan care a fost ex trusă într -o baie ce conține o soluție cu ioni de calciu și zinc. Pentru
optimizarea procesului a fost studiată influența unor parametri cum ar fi pH -ul soluției în care are
loc e xtruderea și cantitate a de cefalexin inclusă în particulele de hidrogel. Aceș ti parametri au
fost modificați pentru a obține o imobilizare eficientă a medicamentului, o eliberare controlată și
susținută în timp, o dimensiune și o morfologie optimă a partic ulelor sferice. Partic ulele
preparate în mediul acid au avut o structură por oasă, în timp ce particulele preparate în mediu
bazic au o suprafață netedă. Caracterizarea particulel or s-a efectuat prin spectroscopie FTIR,
DSC și difractie laser. Particulele au avut formă sferică iar diametrul mediu va riază între 925 și
1183 μm. A fos t obținută o eficiență în încapsulare de 69.24% iar eficiența de eliberare a
medicamentului crește oda tă cu creșterea cantității de medicament din particule. A fost obținută
o eficiență de eliberare im bunătățită a substanțe i medicamentoase inclusă în parti culele preparate
în mediu acid. Cinetica de eliberare a fost studiată in vitro în două medii de pH di ferite care
simulează fluidele fiziologice, în 0.1 N HCl pH = 1.2 sau în med iu de soluție tampon f osfat la
pH = 7.4, dar nu a fost observată o diferență semnificativă. În baia de reticulare au fost adăugați
în amestec ioni de Ca2+ și ioni de Zn2+ iar aces t studiu a demonstrat ca particulele de hidrogel
astfel obținute au dimensiun i uniforme și propriet ăți de eliberare contr olată a medicamentelor
[202].

24
Shiv Sankar Bhattacharya și colaboratorii [203] au preparat microparticule de gelan,
prin tehnica de ret iculare ionică utilizând ca agent de reticulare AlCl 3 și au imobilizat în
interiorul microparticule lor acidul tranexamic. Acidul tranexamic este un medicament
antifibrinolitic, are un timp de înjumătățire de 1.9 -2.7 h și biodisponibilitatea de 39% ceea ce
determină administrări repetate pentru menținerea concentrației terapeutice o ptime.
Caracterizarea particulelor de hidrogel a fost efectuată prin microsco pie electronică de baleiaj,
spectroscopie FTIR, difracție cu raze X, DSC și HPLC. Eficiența în încapsu lare scade de la
89.12 % la 71.15 % odată cu creșterea concentrației soluție i de gelan de la 0.75% la 1.25%.
Particulele sunt sferice și dimensiunea lor variază între 8.11×102 μm și 9.11×102 μm iar
diametrul lor crește odată cu creșterea concentrației de polimer. Spectroscopia FT -IR evidențiază
faptul că între polimer și medicame nt nu există interacți uni. Valoarea gradului de umflare este
scăzută în mediu acid dar crește considerabil în mediul bazic datorită formării grupelor
carboxilat și relaxării rețel ei polimere efect care conduce la o absorbție mai mare de soluție
apoasă. Cu cât valoarea gradului de umflare a polimerului crește cu atât eficiența de el iberare a
medicamentului din microparticule este intensificată. Eliberarea în timp completă a
medicame ntului a fost realizată în mediu alcalin și depinde de mai mulți factori cum ar fi
concentrația de polimer și concentrați a de agent de reticulare. Rezulta tele acestui studiu au
evidențiat faptul ca microparticulele de hidrogel încărcate cu medicament pot f i utilizate pentru a
minimiza eliberarea acidului tranexamic în mediu acid și pot fi utilizate pent ru a modela
eliberarea medicamentului în mediul bazic, ceea ce ar ajuta la scăderea pierderii de medicament
și la creșterea biodisponibilității. Testele in vivo au arătat o eliberare lentă și prelungită dar sunt
necesare mai multe stu dii clinice [203].
Clorura de aluminiu a fost utilizată ca și agent de reticulare ionic pentru studiul
încapsulării glipizidei în particule de hidrogel pe bază de gelan acetilat pentru eliberarea
controlată și prelungită a medicamentului. Metoda utilizată pentru prepararea par ticulelor a fost
gelifierea ionotropică urmată o reticu lare covalentă cu aldehidă glutarică. Glipizida este un
medicament care scade glicemia, utilizat în tr atamentul diabetului de tip II [204]. Absorbția orală
este rapidă, uniformă ș i completă cu o biodis ponibilitate de a proape 100 % [205]. Imobilizarea
subtanței medicamentoase în particule de hidrogel pe bază de gelan determină creșterea eficienței
sale ter apeutice. Timpul de înjumătățire al glipizidei este mic, de aproximativ 3.4 h și necesită
administr ări repetate pentru me nținerea concentrației terapeutic e optime [206]. A fost obținută o
eficiență de încapsulare de 97.67%. Prin reticulare covalentă cu ald ehida glutarică eficiența de
încapsulare a fost redusă cu 11.89 %. Eficiența de eliberare a medicam entului a fost de 10% în
mediu acid în 2h, în mediu alc alin variază între 38% și 47% pentru particulele de gelan reticulate
ionic cu ioni de Al3+ și de 15% p entru particulele reticulate cu aldehidă glutarică. Eliberarea
medicamentului a fost corelată și în acest caz cu gradul d e umflare, la fel ca în studiul efectuat
de Shiv Sankar Bhattacharza și colab. Utilizarea aldehidei glutarice ca reticulant covalent a
determinat diminuarea eficienței de eliberare a substanței medicamentoase. A ceste particule au
potențial pentru a fi utilizate în aplicații de eliberare controlată și ar putea determina scăderea
frecvenței de administrare a dozei dar și diminuarea efectel or adverse asociate cu medicamentul
[207].
Metoda coacervării complexe este bazată pe interacțiuni le electrostatic e dintre polimeri
anionici și cationici rezultând capsule insolubile sferice.
Chitosanul poate forma complecși polielectrolitici prin interac țiuni electrostatice cu
polizaharidele care au în structura lor grupe carboxi lice sau sulfat [208, 209]. Gelanul a fost
testat pentru încapsularea componenților biologic activi în complexul de poliioni format cu

25
chitosanul de masă moleculară joasă în soluț ie apoasă, cercetările conducand la concluzia că în
acest complex polielectro litic nu poate fi incl usă o cantitate mare de medicament datorită naturii
acide a mediului de gelifiere, iar eliberarea medicamentului este rapidă datorită mediului acid din
stoma c [210]. Anurag Verma și colab.,2012 [211] , au obținut un sistem de administr are prin
complexare po lielectroli tică utilizând două polizaharide, un polication chitosanul și un polianion
gelanul pentru administrarea piroxicamului. S -a urmărit eliberarea cont rolată a medicamentului
în stomac, eficientizarea încapsulării, creșterea sta bilității medicamentul ui, reducerea frecvenț ei
administrării și evitarea deza vantajelor asociate cu particulele formate în emulsie. Particulele
sunt formate dintr -un complex de po lielectroliți pe bază de gelan și chitosan, prin tehnica
coacervării complexe , fără a utiliza nici un reticulant chimic. Gelucire (39/01 și 50/13) este
utilizat ca fază de lipide datorită biocompatibilității, biodegradabilității, conține cantități foarte
mici de acid și previne iritarea gastrică, formând un înveliș în jurul medicam entului. Diametrul
particulelor obținute variază între 1.09 -1.3 mm; ele prezi ntă o bună flotabilitate, o eficiență a
încapsulării crescută (medicamentul este încorporat în particu le într -o proporție de 93 -98%).
Elaborarea particulelor flotabile utilizând c omplexarea polielectro litică poate avea rezultate
eficiente în eliberarea co ntrolată a antiinflamatoarelor nesteroidiene (AINS) administrate oral
pentru un efect terapeutic optim , reducerea efectelor secundare (reduc iritația gastrică) și pentru o
bună co mplianță a pacienților [211].
Alte studii au fost efectuate pentru prepararea microsferelor obținute prin metoda
reticulării în emulsie utilizând ca polimeri gelan ul și polia(lcool ul vinilic) iar ca agent de
reticulare aldehida glutarică, pentru încapsulare a unui medicament an tihipertensiv [212].
Rezistența mecanică a fost îmbunătățită atunci când s -a utilizat o retea interpenetrată de polimeri
(IPN) față de microsferele obținute p rin reticulare ionică. Particulele obținute au formă sferică și
prin creștere a densității de reti culare se obțin dimensiu ni mai mici datorită formării une i rețele
polimerice mai dense. În schimb creșterea concentrației de gelan determină creșterea dimensiu nii
microsferelor. Microsferele IPN rezultate au arătat o rezistență la trac țiune mai mare față de
microsferele obținute doar dintr -un singur polimer. S -au efectuat studii in vitro pentru a se stabili
eficiența de eliberare a substanței medicamentoase din microsfere și s -a observat creșterea
cantității de medicament eliberat din m icrosferele care con țin cantități mai mici d e gelan.
Eficiența de eliberare a medicamentului din microsfere depinde și de mediul de difuzie și de
solubilitatea medicamentului în d iferite medii [213].
O rețea interpenetrată de polimer a fost utilizată pent ru obținerea microca psulelor de
gelan și alb umină din o u în care a fost înglobat un complex răsină -diltiazem pentru eliberarea
controlată a medicamentului. Diltiazem clorhidrat, u n medicament solubil în apă, a fost legat de
Indion 254 – o rășină schimbătoa re de ioni. Metoda u tilizată pentru obținerea microcapsulelor de
gelan cu alb umină a fost gelifierea ionică combinata cu reticularea chimică covalentă. Agentul de
gelifiere ionic utilizat este clorura de calciu iar cel de reticulare chimică este aldehida g lutarică.
Caracteriz area microcapsulelor obț inute s -a realizat prin analize S EM, DSC, TGA, XRD și
FTIR. Microcapsulele au formă sferică, cu o suprafață rugoasă iar diametrul varia ză între 841 și
1118 µm. Dimensiunea particulelor reticulate ionic descrește odată cu a doua reti culare (cu
aldehida glut arică) și ar putea fi atribuită c ontractarii rapide a matricei IPN datorită reticulării
covalente între lanțurile polimerului. Cu creș terea concentrației de aldehidă glutarică scade
dimensiunea microcapsulelor datorită creșterii d ensității de reticulare. Cu creșterea cantității de
rezin at, particulele își măresc diametrul datorită ocupării spațiului interstițial între segmentele
polimer ului. Eficiența de încapsulare a fost de 68.02 -89.06 %. Cu creșterea concentr ației de
CaCl 2 descr ește efici ența în încapsulare. Eficiența de încapsulare a microcapsulelor obținute doar

26
prin reticulare ionică a fost mai mare decat cea în care microcapsulele au fost dublu reticulate. Pe
de altă parte, eficiența de încapsulare a medic amentului în microca psulele preparate cu cantități
mici de aldehidă glutarică a fost mai mică decât atunci când s -au utilizat cantități mai mari de
aldehidă glutarică. Eliberarea medicamentului a fost studiată in vitro într-o soluție care simulează
fluidul gastric pH=1.2 și î ntr-o soluție care simulează pH -ul sângelui în pH=7.4. Medicamentul
simplu (clorhidratul de diltiazem) prezintă o dizolvare rapidă și completă în 60 min. Elibe rarea
medicamentului din complexul cu rășină a durat 3h iar din microcapsulel e IPN a eficiența de
eliberare a fost mai le ntă [214].
S-au efectuat cercetări pentru obținerea de sisteme de administrare sub formă de filme
pe bază de gelan cu substanțe medica mentoase incluse, pentru eliberarea lor controlată și
susținută având aplicaț ii dermatologice.
Ming-Wei și colab., 2010 [215] au studiat prepararea, caracterizarea și proprietățile
biologice ale gelanului reticulat utilizând 1 -etil-3-(3-dimetilpropil) carb odiimida ca activator al
reactiei de reticulare. S -au utilizat filme cu grosi mea de 26 μm de gela n care reacționează cu
agentul de reticulare în etanol (40%), cu aplicații medicale în vindecarea rănilor postoperatorii.
Au fost efectuate teste de biocompati bilitate in vivo și in vitro și s-a constatat că filmul de gelan
este compati bil cu celulele fibr oblaste L929 și cu sângele. P rin implatare subcutanată filmul
cauzează o ușoară inflamație în primele zile după operație , dar nu apare nici o fibroză sau reac ție
stromală. Un astfel de film are potențial de a fi utilizat în aplicații c utanate [215].
C. C encetti și colab. [216] au preparat și caracterizat film de polimeri utilizat ca și
pansament antimicrobian pe bază de argint, gelan, poli(alcool vinilic) și b orax. Obținerea unui
pansament în care argintul este încorporat trebuie să as igure activitate ant imicrobiană locală, cu
avantajul unei eliberări controlat e a argintului și o frecvență mai redusă pentru schimbarea
pansamentului. Acest tip de pansament trebu ie să asigure un mediu umed, nu trebuie să se
destrame, să se deshidrateze și trebuie să adere la locul afectat. În acest studiu este descrisa
prepararea unui nou pansament (nețesut) pe bază de gelan tratat cu un amestec de poli(alcool
vinilic) și borax ca pabil sa crească capacitatea de încapsulare și eliberare a argintului.
Pansam entul obținut are ca pacitatea de de absorbți e a apei (o proprietate fundament ală pentru
absorbția exudatelor plăgii) și o viteza scăzută de deshidratare. Argintul este eliberat c ontrolat în
timp, activitatea sa antibacteriană fiind testată pe Staphylococc us aureus si Pseudom onas
aeruginosa [216] .
C.Cencetti și colab.au preparat și un film de hidrogel pe bază de gelan și acid hialuronic
sulfat [217] având rol în obținerea unei ba riere pentru reducerea cicatricilor epidurale apărute
după operații chirurgic ale. Filmul de hidro gel are în compoziția sa gelan 2% (m/v) și acid
hialuroni c sulfat 1% (m/v). Prezența polimerului sulfat induce proprietăți hidrofile și, prin
intersectarea c u zonele de joncțiune ale gelanului, se obține un hidrogel cu proprietăți mec anice
și reologice î mbunătățite [217].
S-au efectuat cercetări pentru obținerea unui sistem polimeric utilizat în eliberarea
controlată a ciprofloxacinei cu potențiale aplicații d ermice, format dintr -un derivat de gelan ce
conține grupe de amoniu cuaternar . Acesta a fost obți nut prin substituție nuc leofilă la grupele
hidroxil prima re din gelan a clorurii de N -(3-cloro -2-hidroxipropil) – trimetil amoniu în prezența
alcalilor, în anum ite condiții de reacție specifice, utilizând diverse rapoarte molare gelan/ N -(3-
cloro -2-hidroxip ropil)-clorură de trimetil amoniu. Caracterizarea s -a efe ctuat prin spectroscopie
1H RMN, FT -IR și titrare conductometrică cu AgNO 3 pentru determinarea gradul ui de
cuaternizare. Analiza termogravimetrică a fost utilizată pentru investi garea comportamentul ui
termic. Au fost formulate particule de hidrogel pe baz ă de gelan cuaternizat și chitosan cu

27
reținerea activității antibacteriene a fragmentelor de amoniu c uaternar. Studiile in vitro s-au
efectuat pe piele de șobolan în soluție tamp on fosfat (pH=7.43). Ciprofloxacina a fost elibera tă în
24 h, confirmând faptul că particulele astfel obținute pot fi utilizate ca sisteme pentru eliberarea
controlată a medicamen telor cu aplicații dermice locale [218].

• Aplicații medicale
În ultimii ani, transplantarea celu lelor terapeutice a jucat un rol tot mai important în
medicina regenerativă. Un rol determinant pentru un tratament adecvat și care să funcționeze îl
reprezint ă cantitatea și calitatea celulelor. Suporturile polimerice sunt utilizate pe ntru
administrarea, transportul, direcționarea și eliberarea controlată a cel ulelor terapeutice la un loc
țintă din corp. Ele au, de asemenea, rolul de a menține viabilitatea celu lară și fenotipul celular
trebuie să rămână intact în timpul transportului [219, 220].
Au fost e fectuate studii pentru obținerea de noi sisteme polimerice capabile sa poată
transporta și elibera celule pentru tratarea diverselor afecțiuni cu utilizare în medicina
regenerativă tisulară. Chunming Wang și colab.,2008 [221] au obținu t un supo rt polimeri c de
hidrogel pe bază de gelan, utilizat ca vehicul pentru transportul și eliberarea controlată a
celulelor care ajută la regenerarea diverselor țesuturi. Obți nerea microsferelor de gelan se
realizează prin metoda emulsiei apă în ulei, urmată de o serie de tratamente de reticular e redox.
Pentru a îmbunătăți adez iunea celulară, un strat de gelatină va acoperi suprafața microsferelor,
rezultând un suport gelatină -grefat -gelan pentru transportul celulelor. Celulele care au fost
imobilizate pe acest suport au f ost fibroblaste dermice umane și osteoblaste fetale umane. Prin
microscopie optică și microscopie electronică de baleiaj s -a putut observa că celulele fibrobla ste
sunt uniform răspândite și populează rapid suprafața microsuportului de gelatină și gelan. Î n
cazul celulelor osteob laste ce sunt imobilizate pe acel asi tip de suport, viabilitatea celulară și
potențialul lor pentru osteogeneză sunt demonstrate prin t este de fluorescență și prin indicații
histologice și biochimice specifice. A ceste microsfere de gelan și gelatină ar putea fi utilizate
pentru transportu l celulelor pentru aplicații în medicina regenerativă tisulară [221].
În aplicațiile ingineriei tisul are, cartilajul articular, datorită funcției sale în mobilitate și
locomoție este considerat cel mai important cartilaj. Traumatismele și bolile degenerat ive
(osteoartrita, artrita reumatoidă) pot crea stări de invaliditate, conduc la apariția durerii și s cad
calitatea vieții. Au fost încercate multe tratatmente dar rezultatele nu sunt satisfăcătoare și din
această cauză s -au efectuat cercetări în domeniu p entru elaborarea altor tehnici pentru tratarea
acestor afecțiuni [222].
Au fost studiate suporturi b iopolimerice pentru încorporarea celulelor și pentru formarea
unui țesut cart ilaginos funcțional [223].
Sistemele injectabile de hidrogel pot fi aplicate printr -o tehnică foarte puțin invazivă și
datorită capacității acestora de a forma geluri in situ în condiții fiziologice au fost utilizate în
cercetările pentru aplicații în re generarea cartilajul ui [224].
Gelanul a fost unul dintre biopolimerii propuși pentru aplicații în ingineria tisulară.
În studiul efectuat de J. T. Oliveira și colab., 2010 [225] a fost testat un hidrogel
injectabil de gelan care conține celule autologe pe ntru regenerarea car tilajului articular afectat la
iepure. Celulele încapsula te în hidrogelul de gelan au fost condrocite articulare umane.
Hidrogelul împreuna cu celulele au fost introduse prin injectare în locul afectat din cartilajul
articular, iar geli fierea a avut loc in situ, in condiții fiziologice. Dupa 8 saptămâni de acțiune au
fost efectuate teste histologice, biochimice, moleculare și imunologice. Rezultatele au prezenta t o
distribuție celulară uniformă și condriocitele în matrice au o formă rotu ndă [225].

28
Un alt studiu efectuat de Jiabing Fan și colab. [226] utilizează, de asemenea,
hidrogeluri injectabile de gelan în care sunt încorporate celule stem mezenchimale -sinov iale
(CSMS) prelevate de la iepure. Sistemul astfel format a fost testat in vitro pentru aplicații în
ingineria tisulară a cartilajului utilizând culturi cu celule condrogenice. Rezultatele au arătat
formarea unui țesut cartilaginos prin tratarea culturilo r de celule cu factorii de creștere TGF -β1,
TGF -β2 sau BMP -2, ceea ce conduce la concluzia că CSMS înc orporate în hidrogelul in jectabil
de gelan prezintă potențial de formare a structurilor cartilaginoase. Aceste studii reprezintă o
bază pentru studii viit oare in vivo [226].
Datorită temperaturii înalte de gelifiere și lipsei de r ezistență mecanică, utili zarea
gelanului în ingine ria ti sulară este limitată. Au fost efectuate cercetări și pentru îmbunătățirea
acestor proprietăți și a fost obținut un nou biom aterial pe bază de gelan și chitosan cu posibile
aplicații în ingineria tisu lară. Gelanul a fost mai intai parțial oxidat și a fost adăugat apoi într -o
soluție de carboximetil chitosan ceea ce a determinat obținerea unui hidrogel complex format
dintr -o rețea dublă. S -a observat o îmbunătățire a temperaturii de gelifiere care este mai mică de
42 șC, s -a ob servat o creștere a modul ului de comprimare de 278 k Pa și s -a demonstrat că
hidrogelul are o bună elasticitate. În acest nou hidrogel format au fost încap sulate celule
condriocite iar testele in vitro au arătat ca acestea prolifere ază și au o viabilitate c rescut ă. Acest
hidrogel pe bază de gelan parțial oxidat și carboximetil chitosan este un material care ar putea fi
utilizat în aplicații ale ingineriei t isulare a cartilajului [227].
Gelanul poate fi modificat prin metacrilare; în acest mod se poate utili za o metodă
alternativă pentru obținerea hidrogelului, fotopolimerizarea. Utilizarea fotopolimerizării conduce
la obținerea de hidrogeluri cu caracteristi ci structurale și mecanice imbunătățite [228].
Obținerea de hidrogeluri cu r ezistență mecanică îmbună tățită este un obiectiv major în
aplicații ale ingineriei tisulare. Pentru atingerea acestui obiectiv, o strategie ar fi crearea unei
rețele duble de hidr ogel în care celulele să poată fi încapsulate. S -au efectuat studii în acest sens
și s-a obținut un hi drogel format din rețele interpenetrate prin fotoreticulare în două etape
utilizând ca polimer gelan metacrilat pentru prima rețea rigidă și fragilă, resp ectiv gelatina
modificată cu metacrilamidă pentru a doua rețea moale, și elas tică. Proprietățile mecan ice ale
fiecărei rețele a u fost obținute prin contro lul gradului de metacrilare a fiecărui polimer. Rețeaua
dublă este formată prin fotoreticularea gelanu lui metacrilat, difuzia gelatinei modificată cu
metacrilamidă în prima rețea, și fotoreticularea gelat inei modificată cu metacr ilamidă pentru a
forma a II -a rețea. Rezistența la compresiune a hidrogelurilor obținute prin această metodă a fost
de până la 6. 9 Mpa, o valoare ce este apropiată de rezistența rezistența la compresiune a
cartilajului. Raportul ma sic al polimerilor influentează rezistența mecanica a hidrogelurilor
obținute. În aceste rețele au fost încapsulate celule fibroblaste iar testele au arăt at compatibilitate
celulară și viabilitatea celulară nu a fost afectată de co ndițiile de prelucrare a hidrogelului [229].
Hidrogelul de gelan a fost testat din punct de vedere angiogenic pentru a determina
potențialul său în aplicații de regenerare a nucleului pulpos. Hidrogelurile utilizate pentru
regenerarea nucleului pulpos tre buie să dețină proprietăț i neangiogenice sau chiar antigiogenice.
Datorită capacității hidrogelurilor de gelan de a realiza suporturi pentru încapsularea de celule cu
proprietăți mecanice optime și datorită lipsei de toxicitate, acestea pot fi utilizate ca și înlocuitori
(substitu enți) pentru nucleul pulp os în diferite strategii ac elulare sau celulare. Testul pe
membrană corioalantoică s -a efectuat pentru a stabili dacă hidrogeluri le de gelan au răspuns
angiogenic. Au fost utilizate discuri de hidrogel pe b ază de metacrilat de gela n reticulat ionic și
discuri de hidrogel pe bază de metacrilat de gelan fotoreticulat. Acest test Testul a demonstr at că
hidrogelurile de gelan nu au nic i nici un răspuns angiogenic, nu inhibă și nici nu induc formarea

29
de noi vase de sânge. Testele histol ogice și imunohistochimice efectuate au arătat ca
hidrogelurile sunt nepermisive în refacerea celulelor endoteliale. Hidrogelul pe baza de
metacrilat de gelan reticulat ionic sau fotoreticulate nu provoacă nici un răspuns inflama tor acut.
Angiogeneza est e un proces asociat puternic cu deteriorarea progres ivă a nucleului pulpos și
aceasta ar putea fi prevenită prin utilizarea hidrogelului de metacrilat de gelan reticulat ionic sau
fotoreticulat deoarece hidrogelul ar putea contribu i la regenerarea țesutulu i deteriorat al discului
intervertebral. Datorită proprietăților sale funcționale și foarte adaptabile, precum și datorită
abilității sale de a controla i nfiltrarea celulelor și a vaselor de sânge, hidrogelurile pe bază de
gelan au potențial de a fi utiliz ate ca înlocuitori pentru nucleul pulpos [230].
S-au efectuat cercetări și pentru regenerarea și repararea defectelor osteocondrale. Ele
apar după o trau mă, cancer sau disfuncții metabolice. Defectele osteocondrale necesită
regene rarea cartilajului și a o sului subcondral în acela și timp, ceea ce implică ut ilizarea unor
structuri bistratificate [231]. Construcțiile bistratificate, reprezentate printr -o stru ctură
cartilaginoasă și una osoasă au fost propuse de către J.M. Oliveira . Sistemele combină
construcț iile cu structuri bifazic e, biomimetice și sunt compuse din hidroxiapatită și chitosan
[232].
Hidrogelurile au atras atenția în tratarea defectelor osteo condrale. Gelanul formează
hidrogeluri ce pot gelifia in situ . Datorită struc turii lor caract eristice își găsesc aplicații in
regenerarea țesutului cartilaginos. În cercetările efectuatede Diana R. Pereira și colab., gelanul
slab acilat a fost utilizat pen tru obținerea structurilor bistratificate din hidrogel în ingineria
tisulară osteocondrală. Structuril e bistratificate au fost obținute din soluție apoasă de 2 % gelan
slab acilat (pentru structura cartilaginoasă) și dintr -o soluție de 2 % gelan slab acila t în care se
adaugă diferite cantități de hidroxiapatită (5 -20%), în acest mo d obținându -se o structur ă osoasă.
Bioactivitatea a fost analizată in vitro prin imersarea construcțiilor de hidrogel într -o soluție ce
simulează fluidul din corp timp de 14 zile. Caracterizarea structurilor de hidrogel obținute, prin
microscopie electroni că de baleiaj, spectrosco pie FT -IR, difracție cu r aze X au demonstrat că
form area apatitei este limitată de stratul cu structură de os. Testele de bioactivitate prezintă un
compor tament diferit în ambele structuri. Structura de os este bioactivă (un strat de apatită a fost
format în contact cu fluidul sim ulat al corpului) pe cand s tructura cartilaginoasă nu a arătat o
natură bioactivă. Prezența hidroxiapatitei induce nucleația apat itei și ionii de calciu accelerează
nucleația apatitei în stratul cu structur ă de os. Construcțiile de hidrogel de gelan bistra tificat au
un potențial maj or de a fi utilizate în ingineria tisulară [233].
Regenerarea limitată a cartilajului articular a co ndus la diverse cercetări pentru
conceperea de noi tratamente și investigare a de noi tehnici medicale pentru atingerea acestui
obiectiv. Încorporarea cel ulelor stem, a celulelor precursoare împreună cu factorii de creștere în
diverse suporturi pe bază de polizaharide reprezintă o abordare în regenerarea cartilajului
articular [234].
Rigiditatea substratu lui poate influența comportamentul de aderare a celulelor și poate susține
diferențierea celulară in diferite fenotipuri de celule [235-237]. Substraturil e mai moi au tendința
să promoveze diferențierea neurogenă, adipogenă și cond riogenă, în timp ce subst raturile mai
rigide au do vedit că promovează miogene za și osteogeneza în funcție de compoziția specifică a
mediilor de cultură [236, 238, 239].
Mark Ahe arne și Daniel J Kelly [ 240] au comparat hidrogelurile de fibrină, agaroză și
gelan ca vehicule sub fo rmă de microsfere pentru transportul și încorporarea celulelor stem și a
factorilor de creștere având aplicații în regenerare a cartilajului. Gelatina MS s a fost utilizată
pentru a controla factorul de creștere TGF -β3 și celulele precursoare ( progenitoare ) extrase din

30
lipidele infrapatelare ale genunchiului. S -au utilizat pentru a determina capacitatea celor trei
hidrogeluri de a susține formarea țesutului cartilaginos hialin. Studiile au fost efectuate in vitro .
Cel mai înalt nive l al ADN -ului a fost obse rvat în hidrogelurile de gelan care conțin factorul de
creștere TGF -β3 și eliberează celulele . Este necesară optimizarea raportului dintre concentrația
de gelan și concentrația de CaCl 2 pentru a obține un hidrogel cu o temperatură de gelifiere
potrivită, dat fiind faptul că utilizarea gelanului este limitată de gelifierea rapidă a hidrogelului la
temperaturi scăzute [240].
Capacitatea de regenerare a țesu tului adult deteriorat din siste mul nervos central este
foarte limitată. Leziunile traumatice ale mădu vei spinării pot conduce la pierderea permanentă a
funcțiilor motorii și senzoriale precum și la alte complicații. Abordările medicamentoase sunt
limitate și se bazează pe utililizarea m edicamentelor antiinflamatoare cum ar fi metilprednisolon
[241]. Trans plantul de celule stem ar putea constitui o strategie de regenerare a acestor țesuturi,
dar celulele au o rată mică de supraviețuire, (sub 1 %). Pentru a crește viabilitatea acestor celu le,
ele pot fi imobilizate într -o matrice biopolimeră care poate să le asigure un mediu favorabil de
supraviețuire după transplant. Gelanul a fost ales ca biomaterial pentru imobilizarea și
transportul celulelor, dar pentru creșterea adeziunii celulare gelanul a fost funcționalizat cu o
peptidă sistemică derivată din fibrone ctină. Gelanul funcționalizat a avut un efect asupra
morfologiei și proliferării celulelor stem neuronale precursoare, diferit de efectul gelanului
standa rd cu aceleași celule. Acest stu diu demonstrează că gelanul funcționalizat cu peptida
utilizat ca biom aterial pentru imobilizarea de celule stem ar putea avea beneficii în tratarea
leziunilor din măduva spinării [242].
Caracterul biocompatibil al gelanulu i determina utilizarea sa în num eroase aplicații în
care acest polizaharid lucrează în contact sau chi ar în interiorul organismului. Fiind formulat
formulat sub formă de pa rticule, filme, hidrogeluri mai mult sau mai putin fluide, gelanul
constituie un sis tem ideal pentru transportul și direcționarea principiilor active, poate fi
administrat oral, transder mal, pe caile respiratorii, instilat in sacul conjunctival al ochiului etc, și
are capacitatea de eliberare sustinută și controlată a principiilor active pe care le conține. De aici
aplicațiile numeroase în medicina, in diferite formulări farmaceutice, în cosmetică sau în
ingineria tisulara. Acestea se adauga la aplicatiile numeroase din domeniul alimentar – fie in
biotehnologii (imobilizarea de enzime, cel ule de drojdie de bere etc.) fie in realizarea de alimente
functionale -, ca mediu de cultura pentru t esuturi de plante, s.a.

1.3.4.2 Chitosanul
Chitosanul este un material promițător pentru o gamă largă de aplicații biomedicale.
Chitosanul este produsul principa lul obținut prin procedeul de de acetilare alcalină a chitinei, (β –
(1-4)-2-amino -2-deoxi -D-glucoză); es te un polimer liniar natural semi -cristalin, semi -sintetic,
polication ic din familia polizaharidelor cu structură liniară, compus din unități (1→4) -2-
acetamido -2-deoxi -β-D-glucan(N -acety l-D-glucozamină) și (1→4) -2-amino -2-deoxi -β-D-glucan
(D-glucozamină) [243] (figura 6). În literatura de specialitate sunt raportate cercetări intense cu
privire la morfologia sa, [244] datorită faptului că acesta deține prop rietăți excelente cum ar fi:
biodegradabilitate, biocompatibilitate, netoxicitate, mucoadezivitate, gr upări amino și hidroxilice
reactive ideale pentru modificarea chimică [245, 246].
Sursa de proveniență a chitosanului este determinantă pentru proprietăț ile sale fizice,
astfel că polim erul obținut din ciuperci este preferat în locul celui obținut din cru stacee din punct
de vedere al alergogenității, al distribuției grupelo r deacetilate și a masei moleculare, fiind mult
mai indicat pentru utilizările în ap licațiile biomedicale. Denumirea de chitosan este atribuită

31
chitinei care are peste 60% resturi D -glucozaminice, ceea ce corespunde unui grad de deacetilare
de 60%. [247]
Proprietățile reactive, datorate grupărilor hidroxil și grupărilor aminice primare î n
concentrație mare permit chito sanului să reacționeze cu multe substanțe obținându -se
micro/nanosfere , micro/nanocapsule, derivați cu un spectru larg de utilizări. Încorpo rarea
principiilor active conduce la obținerea de produse farmacologice noi cu diver se aplicații. Pe
lângă faptul că este o resursă regenerabilă și există din abundență, chitosanul iese în evidență
datorită proprietăților sale chimice, fizice și biologice unice ca biocompatibilitatea,
biodegradabilitatea, mucoadezivitatea, caracteristicil e anti -bacteriene, antitumorale, hemostatice,
toxicitate și imunogenitate scăzută [248] caracterul fun gic, analgezic, precum și caracteristici
peliculogene. Toate aceste proprietăți au atras cercetări cu privire la numeroase bioaplicații cum
ar fi: agent a ntibacterian pentru bandajele (p ansamentele) utilizate la oprirea sângerarilor,
ingineria tisulară ca înlocuitor temporar de piele, suturi resorbabile, transport de medicam ente.
Având la bază chitosanul găsim raportate și elaborate în literatură matrici cu rol de vehicule
transportoare d e principii active, sub formă particulată, lipozomală, membrane osmoti ce,
structuri spongioase, hidrogeluri, filme etc. În aplicațiile oftalmologice chitosanul înlocuiește cu
succes polimerii sintetici datorită proprietățilo r sale caracteristice, cum ar fi claritatea optică,
stabilitatea mecanică adecvată, corecția optică su ficientă, higroscopicitate și compatibilitate. Un
alt avantaj îl reprezintă faptul că poate modificat chimic ușor, iar matricile pe bază de chitosan se
pretează la furnizarea eficientă a medicamentelor polare prin diferite bariere biologice ale
corpului [249, 250].

Figura 6. Structura chimică (a) chitină, (b) chitosan distribuția eterogenă a grupelor acetil pe lanț
[250].

1.3.4.4. Caragenanul
Caragena nul aparține familiei de galacta ni hidrofili liniari sulfatați cu o masă moleculară
mare, fiind format din unități alternante de D -galactopyranoză și 3,6 -anhidro -galactoză (3,6 -AG)
unite prin legături alternative alternante de α -1,3 și β -1,4- glicozidice. Tipurile de caragenan cum
ar fi λ, κ, ι, ε, μ, θ au un conținut de 22 -35 % grupe sulfat, clasificare r ealizată în funcție de
solubilitatea acestora în clorură de potasiu [251].
În procesul de obținere a caragenanilor, pe lîngă galactoză și sulfat, pot exis ta și alte
reziduuri de carbohid rați: xiloza, glucoza, acizi uronici și substituienți cum ar fi grupe de metil
eteri și piruvat [252]. Proprietățile caragenanilor sunt influențate în principal de numărul și
poziția grupelor de ester sulfat și de asemenea d e conținutul de 3.6 -anhidro -galactoză (3.6 -AG)
Conținutul de grupe ester -sulfat pentru kappa -caragenan este în jur de 25 -30% și 28 -35 % grupe
3,6-anhidro -galactoză, iotta -caragenan conține grupe sulfat în jur de 28 -30% și 25 -30 % grupe
3,6-anhidro -galactoz ă, iar lambda -caragenan conține grupe ester -sulfat în jur de 32 -39 % și nu
conține nici o grupă 3,6 -anhidro -galactoză.

32
Masa moleculară medie a caragenanilor diferă în funcție de natura sa; spre exemplu
caragenanul nativ are o valoare a masei moleculare med ii cuprinsă între 1.5 × 106 și 2 × 107
g/mol, iar cel de calitate alimentară o valoare de 100.000 –800.000 g/mol sau 200.000 – 400.000
g/mol, pe când caragenanul degradat (poligeenan) are o masă moleculară medie de 20.000 –
30.000 g/mol.
Domeniul de toleranță a pH-ului pentru caragenani este cuprins în intervalul 4 -10, în
mediu acid acestia având o stabilitate slabă. Caragenanii sunt sensibili la depolimerizarea
realizată prin hidroliză acidă, pentru că o temperatură ridicată și un pH scăzut conduc la
pierderea completă a funcționalității lor . Studiile au relevat că acesta este netoxic și neiritant, este
sigur de utilizat în industria alimentară nefiind stocat în organele animalelor testate (șoareci,
maimuțe, iepuri, porcușori), și nu este nici cancerigen; de as emenea toxicitatea depinde de ma sa
moleculară și nu de grupele sulfat. [251]
Stabilitatea caragenanilo r
Soluțiile de caragenan sunt destul de stabile la pH neutru sau alcalin. La pH mic
stabilitatea soluțiilor scade, în special la temperaturi ridicate, dat orită hidrolizei care conduce la
pierderea vâscozității și a capacității de gelifiere; în cazul în car e gelul este deja format nu mai
intervine procesul de hidroliză acesta fiind stabil chiar și la pH 3.5 – 4. Datorită limitărilor
caragenanului în condiții acide pentru aplicațiile practi ce este de dorit evitarea prelucrării
soluțiilor lor la pH mic și teme raturi ridicate pe o perioadă mai îndelungată de timp. [253]

Figura 7. Structura principalelor tipuri de caragenan utilizate pentru aplicații în indust ria
alimentară: (a) kappa (k), ( b) iota (i) și (c) lambda (λ)

1.4. Metode de obținere a sistemelor de elib erare
Înțelegerea avansată a chimiei materialelor și a tehnicilor de inginerie facilitează multiple
strategii de fabricare a sistemelor de eliberare a me dicamentelor pe bază de polizaha ride. În
această secțiune, discutăm elementele de bază ale chimiei aso ciate cu legătura de reticulare în
cadrul sistemelor de polizaharide și tehnicile de inginerie utilizate pentru obținerea sistemelor de
administrare a med icamentelor.

33
1.4.1. For țe intra și intermoleculare implicate în obținerea sistemelor de elibe rare controlată pe
bază de polizaharide (figura 8)

Figura 8 Ilustrarea schematică a diferitelor forțe intra și intermoleculare care intervin în
sistemele de pol izaharide A) Reticularea covalen tă B) Legătura coordinativă metal -polimer C)
Interacții electr ostatice D) Interacții hidrofobe

1.4.1.1. Legăturile covalente

34
Pentru creșterea stabilității nanoparticulelor pe bază de polizaharide și pentru a evita
dizolvare a lanțurilor/segmentelor de poli meri hidrofili în faza apoasă, se realizează, de obicei, o
reticulare chimică, menținând în același timp biodegradabilitatea materialelor (figura 2).
Reticularea chimică este procesul de legare a lanțurilor polimerice prin l egături covalente,
obțin ându -se rețele tridimensionale care reduc mobilitatea structurii și îm bunătățește de obicei
proprietățile mecanice, de barieră și cele de rezistență la apă. Cei mai comuni agenți de reticulare
sunt compuși bifuncționali simetrici cu grupe reactive cu speci ficitate pentru grupele funcționale
prezente pe macromolecule.Legături le chimice din structura matricei polimere sunt de obicei
concepute fie pentru a fi biodegradabile, fie pentru a răspunde stimulilor în condiții specifice
endogen e și exogene [254-256].
Deși le găturile de reticulare covalente reprezintă principala interac țiune între
macromolecule, există și alte interacțiuni necovalente (de exemplu, legăturile de hidrogen și
interacțiunile hidrofobe) care ar putea fi de asemenea i mplicate în formarea mat ricei po limere, în
funcție de tipul de polizaharid utilizat și de modi ficările chimice efectuate. În general, legăturile
labile, incluzând legăturile peptidice (reacții mediate de carbodiimidă), legăturile esterice
(esterificarea me diată de anhidridă) și l egăturil e disulfidice (oxidarea grupărilor tiol) facilitează
în mod ob ișnuit reticularea intramoleculară a polizaharidelor [255,257].

1.4.1.2. Reacții ion metalic -polimer
Spre deosebire de reticularea covalentă, reacția de coordin area metal -polimer forme ază
legături mai puternice între lanțurile de polizaharide prin legătu ri coordinativ -covalente
chelatizare între cationii metalici (de exemplu cupru, fier, zinc) și fragmentele de ligand cu
sarcină negativă ale polizaharidelor [258-260].
Aceste legături i ntramole culare permit formarea reversibilă și facilă a nanocompozitelo r
metal -polizaharid , [261] cum ar fi hidrogelurile cu proprietăți fizico -chimice variabile, care
depind de dimensiunea și valența metalelor, precum și de gradul d e modificare chimică sau de
conc entrația polimerului [261, 262]. În plus, legăturile coordinat ive metal -polimer sunt în
general sensibile la pH, proprietate care favorizează utilizarea lor în aplicații biomedicale ca
sisteme pentru eliberarea controlată a medicamentelor, deși ace astă pro prietate poate provoca
instabilitatea rețelei polimere reticul ate [263].
Gelanul și alginatul sunt exemple binecunoscute de polizaharide care pot fi reticulate prin
interacțiuni cu diferiți ioni metalici divalenți [264]. Ionii de Zn2+ formează leg ături co ordintive
cu grupările carboxilice din unitățile de β -D-glucur onat ale gelanului [265]. Drept urmare, se
formează rețeaua polimerică de hidrogel . Particulele de hidrogel pe bază de gelan reticulate cu
ioni de zinc pot fi pre parate la temperatura ca merei și la pH fiziologic prin metoda extruderii.
Astfel, particulele de gelan reticulate cu acetat de zinc au fost utilizate pentru imobilizarea
celulelor de drojdie si au fost testate în procere fermentative dar au un potențial ri dicat de
utilizare și în aplicaț ii farmaceutice pentru imobilizarea substanțelor terapeutice f iind potrivite
pentru obținerea formulărilor gastrorezistente și eliberarea medicamentelor în colon [266].

1.4.1.3. Interacții electrostatice

Pe lângă sistemele de eliberare obținute pe baza polizaharidelor anionice reticulate prin
coord inare cu ioni m etalici, pot fi elaborate sisteme de eliberare obținute prin complexare
polielectrolitică (PEC) formate p rin interacțiuni electrostatice între polizaharidele de sarcini
opuse [267, 261]. Comple cșii polielectrolitic i asigură o legătură fizică reversibilă și necovalentă,

35
fără a utiliza alți agenți reactivi sau catalizatori pentru imobilizarea substanțelor activ e
terapeutice.
Complexele polielectrolitice sunt obținute din macromolecule cu sa rcină electrică opusă
polianioni și policationi cum ar fi acizii nucle ici (de exemplu, pADN, siARN), proteine (de
exemplu, albumină, colagen, g elatină), polizaharide (de exemp lu, chitosan, acid hialuronic,
alginat) și polimeri sintetici cu sarcină pozitivă și negativă (de ex. , polietilenimină, acid
poliacrilic ) [262, 268]. Complexitatea, stabilitatea și proprietățile fizice (de exemplu,
permeabi litatea, umflarea) ale complexel or polielectrolitice sunt determinate de mai mulți
factori, inclusiv de proprietă țile lor intrinseci (de exemplu, rezistența ionică, densitatea sarcini i,
masa moleculară, flexibilitatea) și mediul fizico -chimic în care are l oc reacția (de exemplu,
temperat ura și pH -ul soluției, tipul solventului, gradul de interacțiune dintre polimeri) , precum și
ordinea și durata de interacțiune a polimerilor în amestec pentru obținerea complexelor
polielectrolitice [121, 255, 256, 268, 269] .
Printre polizaharidele existen te, chitosanul este polizaharida cationică cel mai frecvent
utilizată în aplicați i pentru formarea complexelor polielectrolitice datorită caracteristic ilor sale
biocompatibile și datorită solubilității în apă [256], în timp ce acidul hialuronic [270], sulfatul de
dextran [271], alginatul [272], acizii nucleici [273] și câteva peptide/p roteine bogate în acid
aspartic și glutamic sunt utilizate ca polielec troliți anionici [274, 275]. În plus, polizaharidele
anionice pot forma c omplexe polielectrolitice cu pep tide/proteine încărcate pozitiv, cum ar fi
polilizina, care este o peptidă cu sar cină pozitivă care poate interacționa electrostatic cu alginatul
pentr u a forma nanoparticule obținute prin complexare polielectrolitică [274].

1.4.1.4. Interacții hidrofobe
Hidrogelurile, prin definiție, absorb o cantitate mare de apă, iar natura lor hi drofilă face
problematică încapsularea și eliberarea medicamentelor hi drofobe. Separarea de faze între
medicamentele hidrofobe încapsulate și h idrogel poate deteriora, de asem enea, stabilitatea și
rezistența hidrogelului. Aceste probleme au motivat elabora rea de hidrogeluri care conțin
polimeri hidrofobi sau componente hidro fobe pentru a servi drept locuri de legare pentru
medicamente hidrofobe [276]. Abordările tipice pentru a include domenii hidrofobe în
hidrogeluri includ copolimerizarea monomerilor hidr ofobi și încorporarea moleculelor hidrofobe
(de exemplu, ciclodextrina și colesterolul). Lanțurile alifatice hidrofobe au fost încorporate în
peptide care s -au autoasamblat în nanoparticule pentru a forma un sistem pentru eliberarea
medicamentelor hidrofob e anticancer [277, 278]. Tiocolesterolul a fost încorporat într -un
hidrogel pe bază de alcool polivinilic pentru administrarea de medicamente h idrofobe [279].
Cu toate aceste a, încorporarea domeniilor hidrofobe poate reduce semnificativ absorbția
de apă î n hidrogeluri și poate modifica proprietățile fizice și biochimice ale acestora. În acest
scop, includerea ciclodextrinelor în hidrogeluri este avantajoasă deoarece nu schimbă
hidrofilicitatea generală a hidrogelurilor. Aceste oligozaharide macrociclice co nțin atât un
caracter hidrofil extern cât și o cavitate hidrofobă inte rnă la care se pot asocia medicamentele
hidrofobe. În astfel de sisteme, eliberarea medicamentului este c ontrolată în principal de
compartimentarea relativă a medicamentelor solubilizate între hidrogel, de mediul de eliberare și
este independentă de dimens iunea ochiurilor rețelei de hidrogel [280].
Este esențial să recunoaștem că hidrogelurile oferă adesea nu meroase posibilități pentru
crearea interacțiunilor cu medicamentele, ceea ce poa te permite, hibridizarea mai multor
interacțiuni într -un singur hidrog el [281]. Controlul eliberării medicamentelor prin interacțiuni
chimice o feră adesea un grad în plus de l ibertate în elaborarea sistemelor polimerice. Totuși,

36
trebuie studiat impactul mo dificărilor chimice asupra biocompatibilității medicamentului sau
hidrogelului. Modificările chimice ale medicamentului pot determina o schimba re
conformațională iar efectul t erapeutic al acestuia poate fi diminuat [282, 283]. De exemplu,
unele enzime își pierd bioactivitatea atunci când sunt PEGilate prin intermediul grupăr ii ε-amino
din reziduurile de lizină [284].

1.4.2. Metode și tehnici d e obținere a particulelor
Sistemele de eliberae care sunt utilizate în eliberarea controlată a medicamentelor inc lud
lipozomi, coacervate, micro/nanoparticule, geluri și complecși d e incluziune moleculară [285-
287]. În locul polimerilor sintetici, polizaharidele și unele proteine alimentare pot fi utilizate
pentru obținerea hidrogelurilor utilizate ca sisteme pentru administrarea și eliberarea controlată a
medicamentelor. Există un număr de tehnici pentru obținere a particulelor de hidrogel. Multe se
bazează fie pe ruperea matricei continue de gel pentru a forma particule de hidrogel sau formarea
picăturilor dispersat e care apoi sunt gelifiate printr -un mecanism specific cum ar fi sch imbarea
temperaturii (gelifierea prin încălzire sau la rece ), prin adăugarea unei enzime sau prin
adăugarea de ioni [288, 289].
În acord cu McClements principalele metode pentru a crea p articule de hidrogel sunt
următoarele: ruperea gelului macroscopic, coacervarea simplă sau complexă, extruderea și
emulsionarea. În scopul de a elabora sisteme de eliberare potrivite, nutraceuticele și suplimentele
nutritive pot fi clasificate în component e hidrofile, lipofile și amfifile și componente care nu sunt
solubil e nici în ulei nici în apă (ex. probiotice). Cele hidrofile pot fi transportate într -o matrice
formată din biopolimeri, în timp ce componentele lipofile sunt în general transportate într -un
sistem pe bază de emulsie. [289].

1.4.2.1. Metoda extruderii este cea mai utilizată pentru imobil izarea celulelor și a principiilor
active [290-292]. Extruderea are loc în condiții blânde care permit ca încorporarea
componenților bioactivi în hidrogel s ă se efectueze fără modificarea structurii sau a bioactivității
lor [293].
Metoda implică un dispoz itiv simplu având unul sau mai multe capilare prin care
suspensia cu principii active încorporate în soluția de polimer este extrudată în picături mici.
Producția la scară industrială utizând această metodă este dificil de r ealizat și nepractică chiar
dacă s-a încercat îmbunătățirea ei prin introducerea unor dispozitive cu jet de aer și dispozitive
vibraționale, deoarece apar probleme operaționale prin blocar ea capilarei, apar dificultăți la
curățare și probleme sanitare [294, 295].
Particulele obținute pr in această metodă sunt de dimensiuni mari, de aproximativ 1 mm în
diametru [296-298].
Dispozitive de extrudere cu capilare mai fine pot produce particule m ici, dar înfundarea
orificiilor este des întâlnită mai ales atunci c ând se produc particule mai mici de 100 μm [299,
300].

1.4.2.2. Metoda emulsiei
O altă tehnică de încapsulare alternativă este procesul de emulsifiere care a fost dezvoltat
pentru a pre întâmpina această problemă problema anterioara [301]. Multe studii a u pornit de la
imobilizarea medi camentelor prin emulsifierea unei soluții apoase ce formează un gel într -o fază
nemiscibilă compusă dintr -un solvent organic sau ulei [302]. Prin metoda emu lsifierii se obțin
microsfere de dimensiuni mici, cu un diametru ce variază de la câțiva microni la aproape 1 mm.

37
Polidispersitatea dimensională este mare în comparație cu a particulelor obținute prin metoda
extruderii [303].
Emulsionarea se realizează, d e regulă, într -un vas unde soluția cu principiul activ de
încapsulat și polimerul sunt dispersate în tr-o fază organică nemiscibilă, prin utilizarea unui rotor
agitator de viteză mare. [302] . Picăturile dispersate sunt stabilizate prin adăugarea unui ameste c
de surfactanți [304]. Microsferele sunt formate prin gelifierea pi căturilor folosind diferite meto de
care depind de natura polimerului. Microîncapsularea prin emulsionare necesită un control strict
al unor parametri cum ar fi concentrația de polimer, tip ul și cantitatea de surfactanți [305].
Dimensiunea picăturilor dispe rsate prin emulsionare va determ ina diametrul microsferelor
produse. Pe lângă surfactanți, dimensiunea particulelor este influențată de viteza de agitare și de
vâscozitatea soluției de pol imer [302]. Caracteristicile microsferelor sunt influențate de struc tura
chimică și de masa molecula ră a polimerului utilizat pentru imobilizarea substanțelor terapeutice.

1.4.2.3. Coacervarea soluțiilor polimerice
Coacervarea este o metodă fizico -chimic ă de microîncapsulare. Termenul de coacervare
provine de la cuvântul latin cuacervus care înseamnă gramadă sau teanc . Coacervarea reprezintă
procesul de formare a unor agregate macromoleculare ca urmare a separării de fază ce are loc
într-o soluție omogenă de polimer, la adăugarea unui nesolvent.
Coacervarea este de două tipuri:
► coacervarea simplă
► coacervarea complexă
1. Coacervarea simplă are loc ca rezultat al interacțiunii dintre soluția unui polimer și a
substanței micmoleculare (medicamentoase) .
Coacervarea prin interacțiunea dintre doi polimeri se numește compusă sau complexă.
În prezent p rocedeul coacervării compușilor macromoleculari este considerat ca formarea
unui sistem bifazic în urma stratificării.
În coacervarea simplă , coacervatele se obțin prin adăugarea unui agent de coacervare
peste o dispersie a poasă a unui biopolimer. Agentul de coacervare acționează ca un nesolvent
pentru biopolimer. Coacervatele formate se absorb la suprafața picăturilor de ulei în care se află
componentul act iv. Pentru formarea peretelui microcapsulei se adaugă un agent de re ticulare
(aldehida glutarica, ta ninuri, etc). Prin coacervare simplă se pot încapsula substanțe
medicamentoase solide, insolubile în apa (sulfanilamide, antibiotice etc).
2. Coacervarea c omplexă se referă la separarea fazelor de un precipitat lichid, sau faza
în care soluțiile a doi col oizi hidrofili sunt amestecate în condiții adecvate. Ea se poate aplica la o
arie foarte largă de componente: compuși de aromă,vitamine, fitosteroli, colora nți, substanțe
medicamentoase, etc. Prin coacervarea complexă se obț in microcapsule simple, mononucl eare,
cu diametrul de 30 – 800 μm și un conținut de substanță încapsulată de 80 – 90 %. Păstrate în
condiții de umiditate de peste 70% capsulele se umflă și permit eliberarea substanței încapsulate.
Coacervarea complexă est e însoțită de interacțiunea dint re incărcăturile pozitive și
negative a doi polimeri și este inițiată de obicei de schimbarea pH -ului.
Coacervatul reprezintă un ansamblu de molecule mari, cum ar fi proteinele, lipidele,
acizii nucleici care formează o uni tate coloidală stabilă cu propri etați asemănătoare materiei vii.
Coacervatele au mărimi cuprinse între 1 și peste 100 micrometri, au proprietăți osmotice
și se formează în mod spontan în a numite soluții organice diluate [305, 306].
Complexul de coacervare implică separarea unei soluții c ompusă din cel puțin două
tipuri de macromolecule în două faze nemiscibile: o fază bogată în ambele macromolecule și o

38
altă fază constând într -o fază de ech ilibru. Cele două tipuri de macromolecule implicate în
formarea comp lexului de coacervare sunt în ge neral de sarcini opuse (spre exemplu o proteină și
o polizaharidă). În funcție de puterea de interacțiune dintre cele două macromolecule poate apare
coacerv area sau precipitarea. Precipitarea apare atunci când polielectroliț i puternici
interacționează. Pre cipitatele sunt complecși destul de denși, care tind să se separe din soluție sub
formă solidă [307, 308].
Structura coacervatelor în comparație cu precipit atele este mai ordonată și sunt mai
puțin predispuse la agregare și sedimentare. Datorită acestor mo tive, coacervarea este de obicei
preferată în locul precipitării pentru încapsularea ingredientelor bioactive. Pentru încapsularea
substanțelor active uleio ase în interiorul coacervatelor și pentru a forma particule de biopo limeri
care conțin componenti bi oactivi lipidici, în primul rând uleiul este dispersat într -o soluție de doi
polielectroliți care au abilitatea de a forma coacervate. Condițiile (temperatu ră, pH, viteză de
agitare etc) sunt ajustate astfel încât coacervare a să fie favorizată și uleiul di spersat să fie
încapsulat în interiorul noilor complexe formate. Pentru a obține o încapsulare maximă pH -ul
trebuie ajustat la o valoare optimă.
Coacervatel e disociază și se rup în momentul ajustării pH -ului sau atunci când tăria
ionică este reglată; coace rvatele sunt, de asemenea, susceptbile la fuziune. Pentru a îmbunătăți
stabilitatea coacervatelor unul sau ambii polielectroliți prezenți trebuie să fie ret iculați chimic,
enzimatic sau printr -un tratament termic [289, 308].
1.4.2.4. Uscarea prin Pulveriz area – uscarea este cea mai utilizată metodă în industrie
pentru formarea particulelor. Este un proces rapid într -un singur pas utilizând un pulverizator
pentru uscare. Este o metodă potrivită pentru o gamă largă de aplicați i în diferite industrii cum ar
fi cele biomedicale, alimentare și farmaceutice.
Studiile au arătat că metoda de uscare prin pulverizare poate fi aplicată pentru a încapsula
medicamente [309], proteine [310], celule de drojdie și alte microorganisme [311].
Uscarea prin pulverizare a fost , de asemenea, utilizată pentru acoperirea materialelor
magnetice utilizate în aplicații terapeutice [312] și obținerea de microparticule încărcate cu
medic ament pentru eliberare controlată.
Procesul de uscare prin pulveriza re începe cu atomizarea soluției de polimer cu
componenți bioactivi pentru a forma picături fine în camera de uscare. Picăturile pot fi produse
prin utilizarea diferitelor tipuri de atomiz oare rotative sau tip duză. Picăturile sunt uscate prin
evaporarea u midității, prin adăugarea de aer fierbinte în camera de uscare cu controlul
temperaturii și a debitului de aer. Picăturile fine au o suprafață specifică mare care facilitează
uscarea rapid ă.
Particulele fine produse sunt evacuate continuu din camera de us care și colectate prin
intermedi ul unui ciclon sau a unui sac de filtrare.

.

39

REZULTATE ORIGINALE

40

Obiective

Obiect ivul princi pal al tezei îl constituie obținerea unor sisteme micro/n anoparticulat e
cu caracter de hi drogel, pe bază de polizaharide reticulate ionic și complexate polielectrolitic,
destinate imobilizării de polifenoli cu potențiale aplicații biomedicale.

Realizarea obiectivului principal a presupus îndeplinirea mai multor obiective sp ecifice,
precizate în cele ce urmează.
• Elaborarea unei metode de includere a curcuminei in micro/nanoparticule de chitosan
reticulate ionic cu Na 2SO 4 pentru a îmbunătăți stabi litatea și biodisponibilitatea
principiului activ.
• Elaborarea unei m etode de obți nere a microparticu lelor complexe pe bază de gelan sau
gelan în amestec cu caragenan cu micronanoparticulele de chitosan cu curcumină
imobilizată prin metoda gelifierii ionice și a compl exării polielectrolitice destinate
administrării pe cale orală și elib erării curcuminei î n colon pentru a trata boala
inflamatorie intestinală.
• Caracterizarea fizico -chimică a sistemelor de eliberare obținute prin spectroscopie FT -IR,
difractom etrie laser , microscopie electronica de baleiaj, cinetica gradului d e umflare.
• Testarea activității antioxidante a curcuminei libere și a curcuminei imobilizate în
particulele de polizaharide.
• Testarea capacității particulelor de polizaharide de a adsorbi proteinele.
• Studiul procesului de eliberare in vitro a curcuminei di n particulele de polizaharide.

41

CAPITOLUL 2:
MATERIALE, TEHNICI EXPERIMENTALE, METODE DE CARACTERIZARE
În acest capitol vor fi prezentate materialele care au stat la baza microparti culelor de
hidrogel pe bază de polizaharide cu curcumină im obilizată cu ap licații biomedica le, al tehnicilor
experimentale precum și al metodelor de caracterizare utilizate.
2.1. Materiale
2.1.1. Biopolimeri utilizați în obținerea microparticulelor de hidrogel pe bază de
polizaharide cu curcumină imobilizată

Pentru obți nerea micropart iculelor de hidro gel cu curcumină imobilizată au fost utilizate trei
polizaharide; gelanul, i -caragenanul și chitosanul. Aceste polizaharide au fost selectate datorită lipsei
de toxi citate, sunt biocompatibile, pot forma ușor geluri în preze nța ionilor mul tivalenți și comp lexe
polielectrolitice. În plus, utilizarea gelanului are ca scop obținerea particulelor gastrorezistente
deoarece acesta este rezistent la pH și la diferite enzime prezente în mediul gastric și intestinal dar se
degradează în prezența une i enzime prezente în colon -galactomanans.

• Gelanul este un biopolimer anionic liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repeat
formate din două reziduuri de β -D-glucoză, un reziduu de acid β -D-glucuronic și unul de
α- L-ramnoză într -un rap ort 2:1:1 . Structura chimică a g elanului este prezentată în figura
5. Gelanul deacetilat utilizat pentru obținerea particulelor de hidrogel a fost procurat de la
Kelkogel și are masa moleculară cup rinsă între 2 -3 × 105 Da.
• I-Caragenanul aparține familiei d e galactani hid rofili liniari su lfatați cu o masa
moleculară mare, fiind format din unități alternante de D -galactopiranoză și 3,6 anhidro –
galactoză (3,6 -AG) unite prin legături alternante de α -1,3 și β-1,4- glicozidice. Structura
i-caragenanului este prez entată în figur a 7(b). I-caragen an, conține 2 grupari –HSO3 –
/mol (464 Da). A fost procurat de la Sigma Aldrich.
• Chitosanul reprezintă produsul principalul obținut prin procedeul de deacetilare alc alină
a chitinei și este un polimer cationic liniar natural semi -cristalin , policationic, c u structură
liniară, compus din unități (1→4) -2-acetamido -2-deoxi -β-D-glucan (N -acetil -D-
glucozamină) și (1→4) -2-amino -2-deoxi -β-D-glucan (D -glucozamină) [354]. Stru ctura
chitosanului este prezentată în figura 8(b). Chitosan ul utilizat est e procurat de la Sigma
Aldrich, are o masă moleculară medie și un grad de deacetilare de 75% fiind procurat de
la Sigma Aldrich.

2.1.2. Agenț ide reticulare :
• Acetat de magneziu tetrahidrat : M=214.45 g/mol, Procurat de la Sigma Aldrich Fi gura

42

Figura 9. Struct ura ace tatului de magneziu

• Sulfatul de sodiu : Na 2SO 4, M=142,04 g/mol, procurat de la Sigma Aldrich Figura 10:

Figura 10. Structura chimică a sulfatului de sodiu

2.1.3. Principiul acti v ales pentru imobilizare
Curcumina (figura 1) este un compus activ extras din pl anta Curcuma longa și se
găsește într -un amestec de curcuminoizi, curcumina. demetoxicurcumina, bisdemetoxicurcumina
și curcumina cicclică. Curcumina este componentul majorita r și poate fi intâlnită în două forme
tautomere. Are formula chimică C21H2 0O6 și masa moleculară, M=368,38 g/mol. Structura sa
chimică este prezentată în figura 1. Curcumina a fost procurată de le Sigma Aldrich.

2.1.4. Alte materiale :
Albumina serică bovină are masa moleculară de aproximativ 66 kDa. A fost
achiziționată sub formă de pudră de la Sigma Aldrich. Este utilizată pentru determinarea
adsorbției de proteine prin metoda Lowry.
Tween 20 (figura 11) este un tensioactiv non -ionic cu masa moleculară 1228g/mo l și
balanța hidrofil -lipofil de 16.7. A fost utilizat pentru stabilizar ea emulsiilor și pentru a crește
solubilitatea curcuminei în medii apoase. A fost procurat de la Sigma Aldrich.

Figura 11. Structura chimică pentru polietilen glicol sorbitan monola urat
• Fosfat disodic, Na2HPO4·12H2O, M = 358.14 g/mol, Chemical Company.
• Fosfat monosodic, NaH2PO4·2H2O, M = 156.02 g/mol, Chemical Company.
• Acetat de sodiu, M= 82.0343g/mol, Chemical Company
• Reactiv Folin Ciocâlteu
NaOH, M=40 g/mol
• CuSO4

43
• Tartrat du blu de sodiu și potasiu
• DPPH utilizat pe ntru determinarea activității an tioxidante
• Na2CO3
• Solvenți
• Apă bidistilată produsă în laboratoarele proprii;
• Alcool etilic C2H5 -OH, M= 46.07g/mol, achiziționat de la Chemical Company
• Acid acetic glacial, M=60.05 g/mo l, Chemical Company.

2.2. Tehnici exper imentale
In acest subcapitol su nt prezentate toate tehnicile de ob ținere și de caracterizare pentru
particulele de hidrogel conținând curcumină.

2.2.1. Prepararea microparticulelor de hidrogel conținând curcumină imobili zată
în matrici de polizahar ide

Metoda se bazează, pe forma rea unui compl ex polielectrolitic fiind prezentată schematic
în figura 12, si presupune parcurgerea a două etape pentru obținerea microparticulelor.

Figura 12. Prezentarea metodei de preparare a microparticulelor de gelan ce conțin
micro/nanoparticule d e chitosan cu curcumină imobilizată

În prima etapă, au fost preparate particulele de chitosan cu curcumină imobilizată astfel:
se prepară o soluție obținută din 40 ml chitosan de concentrație 0.0 5% în acid acetic 0.06 M și 16
ml soluție de Na 2SO 4 de conce ntrație 0.1 %. Soluția de agent de reticulare ionic (Na 2SO 4 de
concentrație 0.1%) a fost adăugată peste soluția de chitosan. Apoi, 200 mg de curcumină au fost
dizolvate în 20 ml de etanol absolut sub agitare și soluția de cu rcumină obținută a fost adăugată
în picături î n soluția de chitosan preparată anterior, în timpul ultrasonicării (utilizînd o sondă cu

44
ultrasunete Sonics and Materials sonicator, Vibra Cell). Au fost utilizate diferite durate de
ultrasonicare: 4 minute, 8 minute și 12 minute pentru a obț ine diferite d imensiuni ale particulelor
de chitosan cu curcumină imobilizată.
Suspensia obținută conținând microparticule de chitosan de diferite dimensiuni încărcate
cu curcumină a fost menținut ă la temperatura de 40 °C pe o baie de ultrasunete timp de 1 oră
pentru ev aporarea alcoolului și pentru a dispersa micro/nanoparticulele formate iar apoi a fost
menținută la aceeași temperatură pe o plită magnetică (250 rpm) până când etanolul a fost
compl et evaporat. Particulele de chitosan cu curcumină imobilizat ă au fost sepa rate prin
centrifugare, au fost spălate de trei ori cu apă bidistilată iar apoi au fost resuspendate în 100 ml
apă bidistilată. Dacă suspensia cu nanoparticule nu este utilizată imed iat, aceasta se poate păstra
la 4⁰C, la întuneric în recipie nte închise.
În a doua etapă, gelanul sau gelan în amestec cu 10%, 20% sau 30% i -caragenan a fost
dizolvat în 20 ml apă bi -distilată la 80°C pentru a obține o soluție de polimer de concentrație de
2%. Soluția a fost răcită la 40°C iar apoi au fost adăuga t un volum de 20 ml din suspensia de
particule de chitosan încărcate cu curcumină (preparate în etapa anterioară) în picături, sub
agitare puternică (6000 rpm) folosind un omogenizator Ultraturrax . Această suspensie a fost
apoi extrusă cu ajutorul unei se ringi și a unu i ac cu dimensiunea de 23 Gauge în 100 ml soluție
de acetat de magneziu de diferite concentrații. În aceste condiții, are loc atât formarea instantanee
a complexului polielectrolitic la suprafața particulelor d e chitosan care conțin curcumină , cât și
reticularea ionică a gelanului (sau a amestecului gelan/i -caragenan). Particulele complexe
obținute au fost păstrate timp de 3 ore în soluția de reticulare pentru stabilizare și apoi au f ost
separate prin filtrare, uscate la 25°C (temperatura came rei) pe hârtie de filtru, în vase Petri iar
apoi au fost depozitate în recipiente bine închise, la temperatura de 4°C, la întuneric până când
vor fi efectuate alte caracterizări. Codificarea probe lor, programul experimental utilizat și
eficiența de încapsu lare a curcumi nei în particulele complexe obținute sunt prezentate în tabelul
1.

Tabel 1. Programul exeperimental și eficiența de încapsulare

Proba Gelan
(%) I-Caragenan
(%) Concentrația
soluție i de
acetat de
magneziu (%) Eficiența de
încapsulare
(%)
P1*
100 0 1 97.25
P2* 2 91.5
P3* 3 87.23
P4** 70 30 2 85.71
P5*** 80 20 2 90.4
P6**** 90 10 2 94.2
* Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 89% gelan și 11% chitosan; vol umul soluției de acetat de
magneziu a fost de 100 ml.
** Com poziția partic ulelor complexe de polizaharide a fost: 26.7% i -caragenan, 62.3% gelan și 11% chitosan;
volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.
*** Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 17.8 % i-caragenan, 71.2% gelan și 11 % chitosan;
volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.
**** Compoziția particulelor complexe de polizaharide a fost: 8.9% i -caragenan, 80.1% gelan și 11% chitosan;
volumul soluției de acetat de magneziu a fost de 100 ml.

45

2.3. Tehnici de caracter izare
2.3.1. Spectros copia FT -IR

Spectrele FT -IR au fost înregistrate pentru curcumina liberă, chitosan, gelan, particulele
de chitosan cu curcumină imobilizată, precum și pentru particulele complexe ob tinute de gelan
sau gelan în amestec cu diferite concentrați i de i -caragen an în care curcumina a fost imobilizată.
Spectrele au fost înregistrate pe un spectrofotometru FT -IR Bruker Vertex (figura 13) pe un
interval de frecvență de 4.000 -400 cm-1 la o rezo luție de 2 cm-1.

Figura 13.. Spectrofotometru FT -IR VERT EX 70v

2.3.2. Analiz a dimensiunii particulelor prin difractometrie laser
Diametrul mediu al particulelor de chitosan cu curcumina imobilizată și distribuția lor
dimensională a fost analizată prin difrac tome trie laser utilizând dif ractometrul SHIMADZU –
SALD 7001. Măsurătorile a u fost efectuate pentru suspensiile de micro / nanoparticule de
chitosan în apă bi -distilată după 24 de ore de la preparare. Suspensiile au fost sonicate înainte de
măsurători pe o b aie de sonicare Bandeli Sono rex timp de 10 minute la tempera tura camerei.
Precizia rezultatelor a fost asigurată, de asemenea, prin sistemul propriu de agitare din celula de
măsurare a dispozitivului, care menține particulele în suspensie, precum și prin e fectuarea mai
multor determi nări consecutive. Au fost efectu ate trei deter minări pentru fiecare probă.

2.3.3. Microscopie electronică de baleiaj (SEM)
Particulele complexe încărcate cu curcumină au fost caracterizate prin microscopie
electronică de baleiaj (SE M) p entru a determina morfol ogia lor și pentru a demonstra c ă
particulele de chitosan încărcate cu curcumină au fost imobilizate în matricea gelan sau gelan / i –
caragenan. Particulele complexe au fost uscate, tăiate în secțiune transversală, metalizate cu aur
folosind un dispozitiv d e pulverizare catodică și au fos t analizate ut ilizînd un instrument Vega
Tescan (Figura 14 ).

46

Figure 14. Microscop electronic de baleiaj tip Vega Tescann

2.3.4. Gradul de umflare
Particulele complexe obținute au un caracter hidrog el, de aceea s -a considerat u til să se
determine capacitatea lor de reține re a apei – de obicei cuantificată prin gradul de umflare (Q,%).
Această caracteristică este esențială, deoarece apa determină creșterea dimensiunii ochiurilor
rețelei formate pe de o parte prin gelifierea ionic ă a chitosanului cu sulfat de so diu și pe de altă
parte a matricei de gelan sau gelan/i -caragenan cu ioni de magneziu. Acestă caracteristică este
foarte importantă, deoarece ea determină difuzia mai mult sau mai puțin intensă a curcuminei din
matricea de h idrogel. Pentru particulele comp lexe obținute valorile Q (%) au fost determinate
gravimetric.
Au fost utilizate trei soluții care simulează fluidele fiziologice: soluție tampon fosfat
(PBS) la pH=6.8 (simularea lichidului intes tinal) și la pH=7.4 (simulare a pH -ului sângelui sau
pH-ului f luidului din colon) și o soluție care simulează lichidul gastric la pH=2, care a fost
obținut din acid clorhidric 0.1 N, NaCl 10 mM și apă bi -distilată.
O cantitate precis cântărită (0.05 g) de p articule complexe uscate (M dry) a fost imersată în
5 ml de ag ent de umflar e, la 37°C. Periodic, agentul de umflare a fost îndepărtat prin filtrare și
suprafața particulelor a fost tamponată cu hârtie de filtru pentru a îndepărta excesul de soluție.
Greutat ea particulelor complexe umfl ate (M swollen ) a fost determinat ă. Cantitatea de agent de
umflare reținut de particulele complexe de hidrogel (M swelling agent ) a fost diferența dintre greutatea
particulelor complexe umflate (M swollen ) și cea a particulelor co mple xe uscate (M dry). După
cântărire, probele au fost reintro duse în agent ul de umflare utilizat (întotdeauna 5 ml) și operația
a fost repetată până la atingerea echilibrului. Gradul de umflare a fost exprimat ca raportul dintre
cantitatea de agent de umfl are prezent în particulele co mplexe la fiecare interval de ti mp și
cantita tea de particule complexe complet uscate (ecuația 2).

(2) 100 M M Q(%)
dry agent sweeling  =

47

Determinarea gradului de umflare s -a efectuat în triplicat. Datele sunt prezentate ca
valoarea medie ± intervalul de confiden ță de 95%.

2.3.5. Eficiența de înca psulare
Curba de calibrare a cur cuminei în et anol a fost trasată utilizând soluții cu concentrații
cuprinse între 1 și 5 μg/ml. Absorbanța acestor soluții a fost înregistrată cu un spectrofotometru
BOECO -S22, UV -Vis la lungimea de undă de 425 nm (Figura 15 ).

Figura 15. Curba de calibr are a curcumi nei în etanol

Curcumina a fost extrasă în etanol (V = 10 ml) dintr -o cantitate cunoscută de particule
complexe. Pe baza curbei de calibrare, a fost determinată cantitatea de curcumi nă din probe. În
acest caz, e ficiența de încapsulării a fost:
Ei (%) = mcf / mi x 100 (3)
Unde mcf este cantitatea de curcumină din particulele complexe determinată
spectrofotometric și mi este cantitatea inițială de curcumină. Au fost efectuate trei deter mină ri
pentru fiecare probă, iar erorile au fost de ± 3%.

2.3.6. Determinarea ac tivității antioxidante
Metoda cu unele modificări a fost descrisă anterior de L. L. Mensor și colab., 2001 [313]
și de C. W. Choi și colab., 2002 [314]
Soluția stoc de curcumină a fost preparată prin dizolvar ea a 25 mg de curcumină în 50 ml
de etanol . Pentru testarea activității antioxidante au efectuate mai multe diluții iar concentrațiile
finale ale soluților de curcumină au fost: 10, 40, 60, 80, 100, 150 μg/ml. În eprubete a fos t
adăugat câte 2 ml din fiecare concentrație d e probă. Peste soluția de cu rcumină din eprubete au
fost adăugați 2 ml soluție DPPH de concentrație 0. 2 mM. Probele astfel preparate au fost
vortexate timp de 20 -30 de secunde. Absorbanța probelor a fost citită după 40 de mi nute cu
ajutorul unui spectrofot ometru UV la o lungime de un dă de 51 7 nm. Acidul ascorbic a fost
utilizat ca standard. Valorile absorbanței au fost transformate în procent de activitate
antioxidantă (procentul de inhibare a radicalilor liberi din DPPH) fol osind următoarea formulă:
(4)

48
IC 50 a fost calculat din graficul I% vs. Concentratie si reprezintă concentrația de
curcumină care poate capta 50% din radicalii liberi din DPPH.
Pentru calibrarea spectrofotometrului s -a utilizat etanol. As reprezintă valoarea
absorbanței sol uțiilor de anali zat de difer ite concentrații care conțin 2 ml soluție DPPH. Ca și
blank (Ab) s -a utilizat o soluție preparată din 2 ml metanol și 2 ml din soluțiile de curcumină de
diferite concentrații (absorb anța blankului a fost măsu rată pentru fiecare concentrație ). Soluția
pentr u control (Ac) a fost preparată utilizând 2 ml soluție DPPH și 2 ml metanol. Determinările
au fost efectuate la temperatura camerei.
Pentru determinarea activității antioxidante a cu rcum inei încorporate in particu lele
complexe au fost utilizate probe iradi ate cu UVA la 365 nm pentru 30 minute și neiradiate UV.
Curcumina din particule a fost extrasă în etanol . Practic o cantitate cunoscută de particule a fost
imersată în 25 ml etanol și au fost menținute sub agita re, în pahare Erlenmeyer, pe o b aie de apă
la temperatura de 37⁰C pentru 24 h in recipiente inchise, la întuneric. Cantitatea de curcumină
extrasă din probe a fost determinată spectrofotometric pe baza curbei de calibrare. Dupa
determinarea cantității de c urcumină din fiecare probă, au f ost efectuate diferite diluții,
concentrațiile finale ale soluțiilor de analizat fiind 10, 40, 60, 80, 100, 130, 150 μg / ml (ca și la
curcumina liberă). A fost determinat procentul de inhibare a radicalilor liberi di n DPPH și pe
baza rezultatelor o bținute, a fost calc ulat IC50 atât pentru curcumina extrasă din particule
iradiate UV, cât și pentru curcumina extrasă din particule neiradiate. Toate determinările au fost
efectuate în triplicat.

2.3.7. Adsorbția de proteine
A fost studiată în trei medii de pH diferit : pH=2 (sol uția a fost preparată utili zând 10mM
NaCl și 0.1N HCl , pH similar cu cel din mediul gastric ), pH=6.8 (soluție tam pon fo sfat-PBS- pH
similar cu cel din fluidul intestinal ) și pH=7.4 ( PBS-acest pH fiind similar cu cel al sângelui și al
fluidelor din colon) . A fost utili zată ca protei nă model albumina serică bo vină (BSA) . Au fost
preparat e trei soluți i de BSA de concentrație 4 mg/ml cu pH diferi t prin di zolvarea a 1 00 mg
BSA in 25 ml soluție de pH diferit , la temperatura camerei, sub a gitare usoară .
Pentru a d etermina adsorbția d e protein e în condi ții care s imulea ză pe ce le din tractul
gastrointestinal, 50 mg de particule complexe cu c urcumină imobili zată au fost plasate succesiv
pentru 2 h (repre zentând timpul de staționare al particulelor în mediul gastric) î ntr-un ml soluție
de BSA la pH=2, apoi pentru 3 ore (repre zentând timpul de staționare al particulelor în mediul
intes tinal) într-un ml soluție BSA la pH = 6.8 și în final pentru 4 o re ( repre zentând timpul de
staționare a l particulelor în mediul din colon ) într -un ml soluție BSA la pH=7.4.
După menținerea particulelor timp de 2 ore în soluți a de BSA la pH=2 , acestea au fost
separate prin filtrare, au fost spălate cu apă bidistilată i ar apoi au fost imersate în soluție de BSA
la pH=6.8 pentru 3 ore. Apoi , particulele complexe au fost din nou separate prin filtrare, au fost
spălate cu apă bidistilată și au fost imersate în soluție de PBS la pH=7.4 pentru 4 ore. Apele de
spălare , la fiec are determinare, au fost amestecate c u soluți ile de BSA de diferite pH -uri în care
au fost imersate particulele complexe și a fost determin at volumul soluției de BSA . Utilizând
metoda Lowry, cantitatea de BSA din fiecare soluție a f ost determinată spectrop hotometric , la o
lungime de un dă de 660 nm, și pe ba za curbei de calibrare pentru BSA trasate anterior . Cantitatea
de BSA adsorbită de particulele complexe cu curcumi nă imobili zată a fost determinată prin
diferenț ă dintre cantitatea i nițială de B SA și cant itatea de BSA măsurată în soluții de pH diferit.
Recipiente le care conțin particulele complexe suspendate în soluția de albumi nă au fost închise și

49
menținute la temperatura de 37 ⁰C, la întuneric într -o etuvă. Re zultatele au fost exprimate ca
eficiența de a dsorbție (AE%) în fiecare soluție de pH diferit .

AE% = (Cant itatea totală de BSA adsorbită) / (Cantitatea inițială de BSA dintr -un ml soluție) × 100 (5)

Curba de calibrare a avu t ecuația : y=0.0008x, R2 = 0.99 89 Toate determinările au fost
efectuate în tri plicat iar re zultatele au fost pre zentate ca valoarea medie ± STDEV

Figura . Curba de cal ibrarea pentru BSA

2.3.8. Cinetica de eliberare a curcuminei din particulele complexe
A fost studiată în trei medii de pH diferite, cum ar fi PBS (pH = 7. 4 specific sângelui și
fluidelor din colon, pH = 6.8 specific mediulu i intestinal) și pH = 2 (soluție preparată din NaCl
10 mM și HCl 0.1 N, simulând pH -ul din mediul gastric). În acest studiu, o cantitate cunoscută
de particule complexe uscate a fost imer sată în 20 ml de soluție la pH=7.4, p H=6.8 sau pH=2 sub
agitare ușoar ă (15 0 rot/min) la 37°C, la întuneric, în recipiente închise și cantitatea de curcumină
eliberată a fost determinată la o lungime de undă de 425 nm (BOECO -S22, spectrofotometru
UV-Vis).De oarece curcumina este o substanță hid rofobă și este foarte puțin solu bilă în medii
apoase, a fost adăugat 1% Tween 20 în soluția în care se realizează cinetica de eliberare [315]. Pe
baza curbelor de calibrare a curcuminei libere în soluții la pH = 7.4, pH = 6.8 și pH = 2 care
conțin 1% Tween 20, a fost determinată periodic cantitatea de curcumină din mediul de eliberare.
Ecuațiile curbelor de calibrare (figura 16) au fost următoarele:
-pentru curba de calibrare a curcuminei la pH = 7.4: y = 0.1201x (R2 = 0.9987)
-pentru curba de calibrare a c urcuminei la pH = 2: y = 0.0856x (R2 = 0.999).
-pentru curba de calibrare a curcuminei la pH = 6.8: y = 0,1089x (R2 = 0.9977)
Pentru a determina dacă cea mai mare cantitate de curcumină din particulele complexe ar
putea fi eliberată în mediul din colon la pH = 7.4, s -a studiat și cinetic a de eliberare cu aceleași

50
probe în medii de pH diferit: timp de 2 ore la pH = 2, apoi timp de 3 ore la pH = 6.8 și după 4 ore
la pH = 7.4. Pentru această analiză, o anumită cantitate de particule complexe uscate a fost
cântărită și apoi imersată în mediul de eliberare la pH = 2 timp de 2 ore. După 2 ore, probele au
fost filtrate, spălate de trei ori cu apă bi -distilată și apoi imersate în mediul de eliberare la pH =
6.8 timp de 3 ore și î n final la pH = 7.4 timp de 4 ore. P eriodic a fost determinată canti tatea de
curcumină eliberată la fiecare valoare a pH -ului. Determinarea eficiența de eliberare a
curcuminei din particule a fost efectuată în triplicat. Datele sunt date ca valoare medie ± interval
de confidență de 95%.

(a) (b)

(c)
Figura 16. Curbele de calibrare a curcuminei î n soluții de pH diferit la (a) pH=2, (b) pH=6.8 și (c) pH=7.

51
CAPIT OLUL 3
PARTICULE COMPLEXE PE BAZ Ă DE POLIZAHARIDE CU CURCUMINĂ IMOBILIZATĂ

Curcumina, (1E,6E) -1,7-bis(4 -hydroxy -3-methoxyphenyl) -1,6-heptadiene -3,5-dione, cu
formula chimică C21H20O6 și masa moleculară de 368.38 g/mol, este un compus extras din
Curcuma Lo nga (turmeric) cu beneficii foar te importante pentru organismul uman. Depinzând de
originea sa și de condițiile solului unde a crescut, turmeric conține între 2 -9 % curcuminoizi – un
grup de compuși ce includ curcumina (component major), demetoxicurcumina, bis-
demetoxicurcumina și curcum ina ciclică (component minor) [9, 316]. Efectele sale
farmacologice au fost evidențiate de numeroase cercetări, care au subliniat acțiunea sa în
prevenți a și tratarea unor boli cronice cum ar fi artrita, cancerul, depresia și bolile
neurovegetative [30, 3 1, 317 -323]. Au fost raportate mai mult de 100 de ținte terapeutice iar
numărul și diversitatea efectelor biologice ale curcuminei este foarte mare variin d de la
antiinflamator, antioxidant, antiviral la efectele antitumoral e [324]
Boala Crohn și colita u lcerativă, cunoscută colectiv ca boală inflamatorie a intestinului,
sunt caracterizate de inflamația cronică a tractului gastrointestinal. Cea mai mare pr evalență a
bolii raportată în 2017 în Europa a fost în Norvegia (505 c azuri de colită ulcerativă la 10 0 000 de
persoane), în Germania (322 cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane) și în America de
Nord în SUA (286 cazuri de ulcerative colită la 100000 persoane), precum și în Canada (319
cazuri de boală Crohn la 100 000 de persoane) [325]. Scopul trata mentului bolilor inflamatorii
intestinale cronice este de a reduce inflamația care declanșează semnele și simptomele. În cele
mai bune cazuri, acest lucru poate duce nu numai la ameliorarea simptomelor, ci și inducerea și
menținerea remisiei pe termen lung ceea ce determină riscuri reduse de complicații. Tratamentul
IBD implică, de obicei, fie terapie medicamentoasă, fie chirurgie.
În prezent nu exista stra tegii terapeutice capabile să modifice semnificativ prognosticul bolii
inflamatorii de colon. Terapia nutriționala deține posibilități interesante pentru tratament iar
curcumina a câștigat interes datorită acțiunii sale farmacologice și proprietaților sale . Principalul
mecanism, prin care curcumina mediază aceste efecte este legată de suprimarea factorului nuclear
Kappa -light-chain -enhancer (NF -KB). În plus, activitatea curcuminei include suprimarea
interleukinei 1 (IL -1) și a factorului necrozei tumorale a lfa (TNF -α) doua citokine importante în
reglarea răspunsurilor inflama torii. Pentru aceste activități importante, curcumina este considerată un
tratament potențial în boala inflamatorie intestinală [4, 5] . Marele dezavantaj al curcuminei îl
constituie inso lubilitatea în apă și biodisponibilitatea scăzută în celule [11]. Aten uarea sau
eliminarea acestor dez avantaje a fost încercată prin realizarea de formulări pe bază de micele,
lipozomi, nanoparticule, complexe, emulsii [80, 81] Matricile polimere pot prote ja curcumina de
condițiile de mediu adverse, imbunatatesc timpul de în jumă tățire al compusului bioacti v
crescand astfel biodisponibilitatea sa atât in vitro cât și in vivo [82]. Printre polizaharidele
utilizate în scopul obținerii de imobilizate ale curcum inei, având un rol protector dar si de
transport si eliberare control ata a principiului activ se numă ra chitosanul, gelanul și i –
caragenanul.
Chitosanul este un polimer cationic liniar natural semi -cristalin, obținut prin procedeul de
deacetilare alcalină a chitinei, fiind compus din unități (1→4) -2-acetamido -2-deoxi -β-D-glucan
(N-acetil -D-glucozamină) și (1→4) -2-amino -2-deoxi -β-D-glucan (D -glucozamină ) [326, 327].
Studiile anterioare au arătat că prin imobilizarea curcuminei în microparticule de chitosan
reticulate cu TPP, stabilitatea, concentrația plasmatică, si biodispon ibilitatea curcuminei au
crescut [328-330]. Un alt studiu prezintă încapsularea curcuminei în nanoparticule de chitosan

52
care au fost complexate polielectrolitic prin adăugarea lor într -o matrice formată dintr -un
amestec de alginat și caragenan, ce a determ inat creșterea biodisponibilităț ii compusului bioactiv
[331]. Nanoparticulele au eliberat 95% curcumină în 7 ore iar eficiența procesului a depinde de
raportul dintre polimeri (de cantit atea de caragenan din particule). Au fost formulate cu succes și
alte nano particule de chitosan conțin ând curcumină, cu proprietăți mucoadezive, care au avut ca
țintă pentru eliberare colonul. Grupările aminice din chitosan sunt deprotonate in pH alcalin ș i,
prin urmare, este puțin probabil să exercite pe deplin funcționalit atea mucoadezivă pe baza
interac țiunilor electrostatice. Cu toate acestea, nanoparticulele încărcate cu curcumină au
demonstrat mucoadezivitate semnificativă, ceea ce indică faptul că cu rcum ina contribuie
probabil la acest efect, studiul demonstrând că nan oparticulele de chitosan cu curc umină
imobilizată au potențial de eliberare în colon [332].
Gelanul este un biopolimer anionic liniar cu secvențe de tetrazaharide care se repetă
formate din două reziduuri de β -D-glucoză, un reziduu de acid β -D-glucuronic și unul de α -L-
ramnoză într -un raport 2:1:1 [164]. Administrarea ingredientelor pe bază de proteine se face pe
cale orală. Acestea au o capacitate redusă de a trece peste bariera intesti nală epitelială deoarece
sunt sensibile la enzimele din tractul gastro intestinal [333, 334] Sistemele polimerice pot proteja
proteinele de aceste enzime. Astfel, absorbția proteinelor și a peptidelor va avea loc în colon și
nu în segmentele anterioare ale tractului digestiv [335]. Gelanul este rezistent la enzime cum sunt
pectinaza, amilaza, celulaza, papa ina și lipaza [336]. O degradare semnificativă se produce în
prezența galactomanazei (galactomannanas), ceea ce facilitează eliberarea componenților
bioac tivi din sistemul polimeric în fluidele din colon [337, 338]. Fei Yang și colab. (2013) au
preparat și evaluat particulele sferice obținute din chitosan și gelan prin gelifiere ionotropă și
complexare polielectrolitică pentru încapsularea și eliberarea con trolată a proteinelor, utilizând
clorura de calciu ca agent de reticul are. Albumina a fost încorporată în particulele obținute cu o
eficiență ce variază între 65 -85%. Eficiența în încapsulare și viteza de eliberare a proteinei
depinde de concentrațiile de chitosan, calciu și gelan. Concentrații mai mari de gelan combinate
cu uscarea la vid încetinesc elibe rarea rapidă a proteinei la pH=1.2, dar se obține o eliberare
susținută la pH= 6.8; o eliberare eficientă este observată la pH=7 [339]. Particule de gelan și
pectină reticulate cu AlCl 3 au fost preparate pentru imobilizarea și eliberarea în colon a
resvera trolului. Eficiența în imobilizare a fost de 76% iar cinetica de eliberare a arătat că cea mai
mare cantitate de component bioactiv a fost eliberat la pH 6.8 [315].
I-Caragenanul aparține familiei de galactani hidrofili li niari sulfatați cu o masă
molecu lară mare, fiind format din unități alternante de D -galactopiranoză și 3,6 -anhidro –
galactoză (3,6 -AG) unite prin legături alternante de α -1.3 și β -1.4-glicozidice [251]. Proprietățile
caragenanilor sunt influențate în princi pal de numărul și poziția grupel or de ester sulfat și, de
asemenea, de conținutul de 3,6 -anhidro -galactoză (3,6 -AG). Conținutul de grupe ester -sulfat
pentru kappa -caragenan este în jur d e 25 -30% și 28 -35% grupe 3,6 -anhidro -galactoză, iotta –
caragenan conțin e grupe sulfat în jur de 28 -30% și 25-30 % grupe 3,6 -anhidro -galactoză, iar
lambda -caragenan conține grupe ester -sulfat în jur de 32 -39 % și nu conține nici o grupă 3.6 –
anhidro -galactoză [252]. Stabilitatea caragenanului in solutii acide este mai scăzută, astfel încat
pentru aplicațiile practice este de dorit evitarea prelucrării soluțiilor lor la pH mai puternic acid și
temperaturi ridicate pe o perioadă mai îndelungată de timp [253]. Au fost obținute particule care
răspund la pH preparate prin complexare polielectrolitică cu caragenan ș i chitosan pentru
eliberarea albuminei și administrarea acestora pe cale orală. O eficiență crescută în eliberare a
avut loc la pH 7.5 [340]

53
Scopul studiu lui de cercetare efectuat il constiue prepararea unor noi formulări pr in
imobilizarea curcuminei în pa rticule de polizaharide pentru a -i crește stabilitatea și
biodisponibilitatea. Polizaharidele au fost reticulate ionic cu acetat de magneziu (în cazul
gelanului și a i -caragenanului) și cu sulfat de sodiu (în cazul chitosanu lui). Originalitatea
studiului e ste oferită de natura agenților de reticulare utilizați, de realizarea unor noi particule
complexe pe bază de polizaharide prin utilizarea gelanului în am estec cu i -caragenan pentru a
obține complexe polielectrolitice cu ch itosanul și de asemenea prin imo bilizarea curcuminei în
microparticulele obținute.
Particulele obținute au fost caracterizate din punct de vedere morfologic prin microscopie
electronica de baleiaj și comportamentul lor la umflare a fost studiat în trei me dii apoase de pH
diferit (la pH = 2, pH = 6.8 și pH = 7.4). A fost evaluată activitatea antioxidantă a curcuminei
libere și a curcuminei incluse în particulele obținute utilizând testul cu D PPH și de asemenea a
fost analizată capacitatea matricei polimere de a adsorbi proteinelor. Cineti ca de eliberare a
curcuminei a fost studiată in vitro în trei medii fiziologice: în soluție tampon fosfat (PBS) la pH
= 6.8, pH = 7.4 și într -o soluție ca re simulează fluidul gastric la pH = 2.
Particulele complexe obținute au fost special concepute pentru eliberarea controlată și
susținută a curcuminei în colon. Gelanul este rezistent la degradarea enzimatică care apare în
stomac și intestin dar este degra dat semnificativ în fluidul din colon, în prezența unei enzime
galacto mann ans. I -caragenan a fost util izat deoarece fiecare unitate structurală conține două
grupe ester sulfat și în amestec cu gelan conduce la structuri stabile cu porozitate adecvată.
Poro zitatea matricei polimere poate fi controlată și prin variația concent rației de agent de
reticulare. P rin imobilizarea curcuminei în micro/nanoparticulele de chitosan, biodisponibilitatea
sa crește iar chitosanul poate forma complexe polielectrolitice cu a mest ecul de gelan și i –
caragenan, determinând obținerea particule stab ile, gastro -rezistente. Pe de al tă parte matricea de
gelan/caragenan, în care au fost incluse micro/nanoparticulele de chitosan cu curcumină
imobilizată, constitue o barieră suplimentară în eliberarea curcuminei, conducând astfel la o
eliberare susținută ș i controlată îmbunătățită.

Rezu ltate și discuții

3.1.Prepararea particulelor complexe pe bază de polizaharide
Doi polianioni (gelan, i -caragenan) și un polication (chitosan) au fost ut ilizați pentru
obținerea matricei polimere, iar selecția lor a fost de terminată de faptul că sunt poli meri naturali,
netoxici, capabili să formeze complexe polielectrolitice. De asemenea, pot forma geluri ușor prin
reticulare ionică în prezența ionilor pol ivalenți (cationi sau anioni), evitându -se astfel utilizarea
agenților de reticulare covalenți, cel ma i adesea toxici.
Particulele obținute prin gelifiere ionică cu Na 2SO 4 sunt compuse din chitosan, în care
curcumina a fost încapsulată prin co -precipitare. S-a demonstrat deja că încapsularea curcuminei
în particule de chitos an e ste benefică și are ca rezul tat o stabilitate și biodisponibilitate
îmbunătățită atunci când sunt administrate pe cale orală [326, 341]. Culoarea galben închis a
particulelor de chit osan cu curcumină imobilizată este o confirmare vizuală a încapsulării
principiului activ. Particulele de chitosan conținând curcumina imobilizată au fost apoi
încorporate în matricea de gelan sau gelan/i -caragenan. S -a obținut o soluție vâscoasă din cele
două amestecuri de polizaharide care a fost extrusă într -o baie care c onține soluție de acetat de
magn eziu cu diferite concentrații. Complexul polielectrolitic a fost format prin interacțiuni
electrostatice între grupele aminice libere de la suprafața micr o/nanoparticulelor de chitosan și

54
grupele carboxilice sau sulfat ale c elor două polizaharide anionice. Acetatul de magneziu
participă la reticularea ionică a grupelor carboxilat din gelan și, respectiv, sulfat din caragenan.
Aceste grupări, reticulate cu a cetat de magneziu, nu fost implicate în complexarea
polielectrolitică a particulelor de chitosan, dar contribuie la îmbunătățirea stabilității mecanice a
particulelor complexe obținute. Trebuie menționat că încercarea de a lucra cu amestecuri de
gelan/i -caragenan în care procentul de i -caragenan depășește 30% a condus la fo rmar ea de
particule instabile. C ercetările anterioare raportate în literatură au demonstrat că ionii de potasiu
sunt eficienți pentru reticularea i -caragenanului. Cu toate acestea, nivel urile ridicate de potasiu
nu sunt de dorit în aplicațiile medicale, de oarece pot provoca aritmii sever e și slăbiciune
musculară din cauza hiperkalemiei [342].
Particulele complexe formate sunt sferice, stabile și au un diametru mediu de 3 mm în
stare umfl ată și de 0.5 -1.0 mm în stare uscată. Reprezentarea schematică a parti culelor de
chitosan încărcate cu curcumină încorporate într -o matrice gelan este ilustrată în figura 17.

Figura 17. Reprezentarea schematică a particulelor complexe constituite din mi cro/nanoparticule
de chitosan cu curcumină imobilizată incluse într -o matrice de gelan

3.2. Spectrele FT-IR ale particulelor complexe obținute
Figura 18 (a) prezintă spectrele FT -IR pentru chitosan, curcumină și particulele de
chitosan încărcate cu curcum ină, iar Figura 18 (b) arată spectrele FT -IR pentru particulele
comple xe, gelan și caragenan.

55

(a)

(b)
Figura 18. Spectrele FT -IR pentru (a) chitosan, curcumină și particulele de chitosan încărcate
cu curcumină, și (b) pentru particulele complexe (pr oba P5C), gelan și caragenan.

Fig. 18 (a și b) indică faptul că în sp ectrul FT -IR al particulelor de chitosan încărcate cu
curcumină se regăsesc benzile de absorbție caracteristice ale componentelor. Astfel, banda largă
de la 3420 cm-1 ar putea fi atribui tă absorbției grupelor -OH din chitosan (Fig. 18a), a grupărilor
fenol din curcumină, dar poate fi atri buită și absorbției grupei -NH 2 de chitosan.
Peak -urile de absorbție care corespund grupelor funcționale din curcumină au fost
observate la intensități mult mai mici, cum ar fi la 1627 cm-1 (fragment aromatic C = C, vibrați e
de întindere) și 1513 cm-1 (-C-O- și –C = C – banda de vibrație) care indică faptul că principalele
peak -uri de curcumină au fost păstrate atunci când a fost încorporată în micro/nanop articule de
chitosan, iar aceste schimbări ale intensității peak -urilor sugerează că curcumina a fost
încorporată în micro/nanoparticulele de chitosan.
S-a observat, de asemenea, că peak -ul de la 1541 cm-1 al chitosanului a fost deplasat în
spectrul micro/ nano particulelor de chitosan încărcate cu curcumină la 1587 cm-1 și poa te fi
atribuit interacțiunilor i ntermoleculare care pot apare între componente. Alte peak -uri de
absorbție caracteristice curcuminei sunt ușor deplasate în spectru particulelor de chito san cu
curcumină imobilizată, ceea ce sugerează faptul că unele interac țiuni, cum ar fi legăturile de

56
hidrogen, pot exista între grupările fenolice ale curcuminei și grupele amino ale chitosanului și
dovedesc că curcumina a fost imobilizată în matricea pol imeră.
În spectrele prezentate în Fig. 18b , incluzând și spectrul probe i P5C, s -a observat o bandă
de absorbție largă, între 3500 cm-1 și 3600 cm-1, specifică pentru benzile de absorbție pentru
grupele -OH (alcool -din polizaharid) și grupele fenolice (din curcumină) ). Vârful la 1436 cm-1 în
spectrul probei P5C este ușor depl asat în comparație cu banda de a bsorbție specifică curcuminei
(1428 cm-1) și dovedește că polifenolul este prezent în compoziția particulelor complexe. Banda
intensă la aproximativ 1024 cm-1 în spectrul gelanului, a fost atribuită vibrațiilor de întindere C-
O-C (din ciclul glicozidic). S -a constatat că această bandă este ușor deplasată în spectrul
caragenanului (1069 cm-1) și în spectrul particulelor complexe P5C la 1042 cm-1, dovedind f aptul
că compoziția probei P5C conține toate polizaharidele utilizate ( această bandă de absorbție nu a
fost observată în spectrul curcuminei). În cele din urmă, în spectrul probei P5C, o bandă
specifică grupei sulfat din caragenan este ușor deplasată de la 846.1 cm-1 la 875 cm-1.

3.3. Diametrul mediu al particulelo r
Diam etrul medi u și polidispersitatea dimensională pentru micro/nanoparticulele de
chitosan încărcate cu curcumină au fost determinate prin difractometrie laser. Au fost analizate
trei tipuri de pa rticule obținute în condiții de ultrasonicare la durate diferite , pentru a evalua
influența duratei tratamentului cu ultrasunete asupra acestei caracteristici. S -a constatat un efect
care era de așteptat, și anume scăderea diametrului mediu al particulelor de chitosan odată cu
creșterea timpului de tratament ul cu ultra sunete, în timp ce proba păstrează însă un caracter
destul de polidispers. Prin urmare, pentru probele obținute după 4 minute de ultrasonicare,
diametrul mediu al particulei a fost în jur de 1 .45 µm; după 8 minute de ultraso nicare, diametrul
a fost 0.38 µm și după 1 2 minute a fost 0.15 µm. Tabelul 2 prezintă diametrul mediu al
particulelor pentru trei durate de ultrasonicare, precum și deviația standard (analiza a fost
realizată în triplicat pe ntru toate probele). În figura 1 9, sunt ilustrate curbele de pol idispersit ate
dimensională ale probelor obținute după 4 minute, 8 minute și 12 minute de tratament cu
ultrasunete. S -a observat că pe măsură ce timpul de ultrasonicare crește, dimensiunea
nano particulelor și polidispersitate a dimensională scade, așa cum er a de aștep tat.

Tabel 2. Diametrul mediu al particulelor de chitosan încărcate cu curcumină obținut după diferite
durate de ultrasonicare.

Nr. crt . Timpul de
ultrasonicare
(min) Diametrul med iu
(µM) Deviația standard
1 4 1.445 0.138
2 8 0.376 0.174
3 12 0.154 0.190

57

Figura 19. Curbe de polidispersitate dimensională ale particulelor de chitosan cu curcumină
imobilizată determinate prin difractometrie laser, utilizând diferite durate de u ltrasonicare.

3.4. Morfologia partic ulelor complexe
Figura 20 prezin tă fotogra fiile realizate utilizând microscopia electronică de baleiaj
pentru proba P1C în secțiune transversală.

58
P1

Figura 20. Fotografii de microscopie electronică de baleiaj în secțiune transversală pentru proba
P1C care conț ine micro/na noparticule de chitosan cu curcumină imobilizată (tratamentul cu
ultrasunete a fost de 4 minute).

Morfologia particulelor complexe de gelan conținând micro/nanoparticule le de chitosan
cu curcumină imobilizată a fost evidenți ată prin microscopi e electronică de baleiaj. Matricea de
gelan prezintă o structură fibrilară, specifică acestei polizaharide. Spațiile dintre formațiunile
fibrilare sunt ocupate de un număr mare de mi croparticule de chitosan conținând curcumina
imobilizat ă. Microparticulele de chitosan încărcate cu curcumină incluse în matricea gelan își
păstrează forma sferică, sunt dispersate în număr mare în matricea gelan în care sunt puternic

59
ancorate, iar dimensi unea lor a fost de aproximativ 2 -3 µm. Diametrul lor es te însă mai mare
decât diametrul determinat prin difractometrie laser (1.445 µm). Explicația constă în faptul că în
jurul lor, a fost depus un strat suplimentar de gelan prin complexare polielectroliti că c u
microparticulele de chitosan dublându -le practic diametrul.

3.5. Compor tamentul la u mflare în medii apoase
Comportamentul de umflare a particulelor complexe în diferite medii apoase a fost
evaluat prin determinarea evoluției în timp a gradului de umflar e (Q ,%). Evaluarea acestei
caracteristici a fost necesa ră deoarece gradul de umflare de termină difuzia principiului activ din
particule și astfel influențează cinetica de eliberarea a curcuminei. O valoare a gradului de
umflare mai mare, indusă de o densit ate de reticulare mai mică și o porozitate mai mare, va
conduce la o difuz ie mai accent uată a principiului activ din matricea polimerică [343]. Studiul
evoluției în timp a gradului de umflare (Q%) determinat gravimetric, a fost efectuat pentru
probele P1C, P2C, P3C, P4C, P5C și P6C în PBS pH = 7.4 (simulează p H-ul sângelui și a
mediului din colon), pH = 6.8 (simulează mediul intestinal) și pH = 2 (simulează mediul
gastric). Aceste rezultate sunt ilustrate în figura 21 .

(a) (b)

(c) (d)

60

(e) (f)
Figura 21. Evoluția în timp a gradul ui de umflare pentru probele P1C, P2C, P3C în (a) PBS, pH
= 7.4, (b) PBS, pH = 6.8 (c) și în soluție care simulează fluidul gastric la pH = 2 și pentru probele
P2C, P4C, P5C, P6C în (a) PBS, pH = 7.4, (b) PBS, pH = 6.8 (c) și în soluție care simulează
fluidul gastric la pH = 2. Rezultatele sunt date ca valoarea medie
intervalul de confidența de
95%.
Așa cum era de așteptat, gradul maxim de umflare scade în ordinea: P1C > P2C > P3C,
efect datorat unui grad de reticulare mai mare obținut prin cre șterea concentrației soluției de
acetat de ma gneziu, deci a ionului reticulan t. Din figura 21 , se observă că valorile Q % au fost
mai mari la pH = 7.4 decât la pH = 6.8 sau pH = 2, d eoarece particulele complexe conțin gelan
într-o cantitate predominantă (v ezi Tabelul 1). Prin urmare, pH -ul bazic indu ce formarea
anionilor carboxilat din grupele acide care nu au participat la reticularea cu ionii de Mg2+, ceea
ce determină apariția de r epulsii electrostatice între lanțurile macromoleculei și are ca efect
relaxarea rețelei care facilitează difuzia unei c antități mai mari de apă. El-Sherbiny și Smyth
[344] au raportat concluzii similare pentru nanoparticule de PLGA încărcate cu curcumină, cu
PEG grefat cu chitosan sau chitosan [344].
Valoarea pKa a grupelor carb oxilice din gelan este de aproximativ 3.5 iar a grupelor
sulfat din caragenan este apropiată de 2.6. La un pH mai mare decât valoarea pKa grupele
carboxilice sunt deprotonate, legătu rile de hidrogen nu se mai formează, apare repulsia
electrostatică și creș te hidrofilicitatea ceea ce conduce la un gra d mare de umflare a hidrogelului
și la eliberarea medicamentului [345]. Gradul de reticulare a probei P1C este mai scăzut ceea ce
înseamn ă că multe grupe carboxilice din gelan sunt libere. La pH=2 există posibil itatea formării
unui număr mai mare de legătu ri de hidrogen în proba P1C ceea ce determină o adsorbție mai
scăzută a soluției în primele 2 -3 ore. Aceste forte de atracție intermolecu lare conduc predominant
la interacțiuni polimer -polimer și nu la interacți uni mediu -polimer rezultând o cantitate mai m ică
de mediu absorbit de aceste particule de hidrogel [346]. Temperatura de 37⁰C poate conduce la o
absorbție mai mare de soluție la pH=2 iar unele legăturile de hidrogen formate pot fi scindate ca
urmare a mișc ărilor moleculare [347]. Soluția se abosarbe la suprafața particulelor de chi tosan și
protonează grupările amino iar absorbția de soluției la pH = 2 crește. Din figura 21c se observă
că valorile gradului de umflare pentru probele P2C și P3C (cu un grad mai mare de reticulare)
sunt apropiate dar super ioare probei P1C în primele ore ale studiului cinetic efect determinat de
numărul mai mic de legături de hidrogen formate. Gradul de reti culare mai mare și grupele
carboxilice protonate determină o difuzie lentă a soluției în interiorul particulelor de hid rogel în

61
cazul probelor P2C și P 3C. Din figura 21c se poate observa că la pH=2 pentru proba P3C gradul
de umflare tinde spre echilibru d upă aproximativ 2 h, pentru proba P2C gradul de umflare tinde
spre echilib ru după 5 h iar pentru proba P1C gradul de um flare tinde spre echilibru după
aproximativ 5 -6 h. Literatura precizează că scindarea legăturilor de hidrogen are loc în timp după
o cine tică liniară de ordinul 1 fapt ce poate explica cinetica nespecifică a gra dului de umflare la
pH=2 pentru proba P1C [347].
Curcumina inclusă în partic ulele complexe este mai solubilă în soluții alcaline și ar putea
permite adsorbția unei cantități mai mar i de soluție PBS la pH=7.4. Chiar dacă la pH=7.4
particulele pot absorbi o cantitate considerabilă de soluție, acestea nu au început să se
dezintegreze și nu au apărut pierderi de masă, efect determinat probabil de interacțiunile dintre
polimeri (gelan sau gelan în amestec cu i -carragenan și chitosan), responsabile pentru obține rea
particulelor complexe cu o rezistență mec anică suficient de ridicată [348]. Se poate observa că
valorile Q% scad la pH=6.8, comparativ cu cele de la pH=7.4, deoarece repulsiile e lectrostatice
sunt mai mici, dar rămân relativ ridicate, cu valori cuprins e între 831.25% și 1646%.
În pH acid, ar fi d e așteptat obținerea de valori r idicate ale gradului de umflare datorită
prezenței chitosanului ale cărui macromolecule trec in forma pro tonata, provocând, de asemenea,
respingeri electrostatice cu distanțarea m acromoleculelor, ceea ce ar trebui să permită
pătrunderea unor cantități mai mari de apă. Dar particulele de chitosan de dimensiuni reduse și
puternic ancorate în matricea de gelan, respectiv gelan/caragenan, nu pot aduce un aport ridicat
la valoarea gradu lui maxim de umflare. În plus, gradul de umfl are mai mic poate fi explicat si ca
fiind o consecință a formării legăturilor de hidrogen între grupele carboxilice (sau/si sulfonice) și
grupările –OH din polizaharidele dominante, efect raportat anterior și de către alți cercetători
[349]. Valoarea gradu lui de umflare pentru probele P4 C, P5C, P6C a fost mai mare decât pentru
proba P2C datorită prezenței i -carragenanului în matricea polime ră, ceea ce conferă o porozitate
mai mare și, prin urmare, difuzia unor ca ntități mai importante de apă în particulele complexe
obținute [344]. Chiar d acă diferențele dintre valorile gradului de umflare ale particulelor
complexe care conțin caragenan nu su nt substanțiale, a existat o ușoară tendință a acestora să
scadă odată cu reducerea cantității acestui polizaharid în c ompoziția lor (P6C <P5C <P4C),
indiferent de valoarea pH –ului din mediul apos în care a fost determinat.
3.6. Eficiența de încapsulare
Din ta belul 1, se observă că eficiența de încapsulare a curcuminei (EE%) a fost cuprinsă
între 87.23% și 97.25%, pentru parti culele complexe cu matricea poli merică formată doar din
gelan. În plus, se poate observa faptul că EE% crește odată cu scăderea concentra ției de acetat de
magneziu, utilizat ca agent de reticulare ionic (P1C -P3C). Astfel, se poate afirma că eficiența de
încapsulare a micro/nanoparticulel or de chitosan încărcate cu curcumină în matricea de gelan
crește atunci când matricea polimeră are un gr ad de reticulare mai scăzut, iar ochiurile rețelei
sunt mai flexibile, dim ensiunile lor sunt mai mari și o cantitate ma i mare de micro/nanoparticule
de chitosan încărcate cu curcumină pot fi incluse. Odată cu creșterea gradului de reticulare,
rețeaua de po limeri devine mai densă, iar cantitatea de micro/nanoparticule de chitosan încărcate
cu curcumină încorporate în matric ea polimerică pe bază de gelan a fost mai mică. Pentru
probele P2C, P4C, P5C și P6C cu același grad de reticulare, dar cu concentrații di ferite de i –
carragenan, se poate observa că eficiența de imobilizare în ap roape toate cazurile scade atunci
când cantit atea de i -caragenan crește.
Comp arativ cu gelanul, i -caragenanul are două grupe sulfat capabile de gelifiere ionică, la
fiecare unitate s tructurală, iar gelanul doar una. Drept urmare, rețeaua formată în prezenț a i-
caragenanului poate fi mai densă, mai ale s ca urmare a reducerii cantităț ii de gelan. Prin urmare,

62
este de așteptat ca eficiența de încapsulare a curcuminei (în micro/nanoparticu le de chitosan) să
crească odată cu scăderea cantității de i-caragenan. Ef iciența de imobilizare a curcuminei pentru
probele P4C, P5C cu 30% și 20% i -carragenan în compoziție a fost mai mică. Conform metodei
de preparare a particulelor complexe, după reticul area ionică a matricei de gelan/caragenan care
conține micro/nanoparticu le de chitosan încărcate cu curcumină, acestea au fost menținute timp
de trei o re în mediul de gelifiere (soluție de acetat de magneziu) pentru stabilizare. În această
perioadă, o part e din curcumina imobilizată poate difuza în soluția apoasă de acetat de magneziu,
iar difuzia a fost mai intensă cu cât porozitatea pariculelor complex e a fost mai mare, această
caracteristică morfologică a particulelor complexe fiind corelată cu cantitate a de caragenan din
compoziția lor. Porozitatea crește odată cu creșterea cantitatății acestui polizaharid în matrice.
Chiar dacă matricea gelan/caragen an a fost mai densă, difuzia curcuminei a fost mai intensă
datorită porozității mai mari. În studiile noa stre de cercetare anterioare, s -a demonstrat că i –
caragenanul induce mat ricei polimere o porozitate mai mare, iar difuz ia compusului bioactiv
imobiliza t depinde de aceasta [350].

3.7. Determinarea activității antioxidante a curcuminei
Polifenolii sunt sensibi li în diverse medii, în timpul procesării alimentelor și în timpul
depoz itării. Degradarea antioxidanților naturali poa te împiedica eficacitatea efecte lor lor
terapeutice și împiedică utilizarea acestor antioxidanți în aplicațiile alimentare / nutraceutice și
farmaceutice [351]. Radiațiile ultraviolete (UV) reprezintă o nouă a bordare pentru sterilizarea
matricelor polimere biodegradabile [352]. Un sistem de sterilizare cu UVA a fost conceput si
pentru apa potabilă și s -a demonstrat că iradierea cu UVA pentr u aproximativ 30 de minute poate
să distrugă aproape complet bacteriile nepatogene și patogene [353].
Mecanismele care explică efectul stresului produ s de diferite radiații UV asupra
acumulării fenolilor în plante sunt multiple și complexe. Radiațiile UV pot fi împărțite în: UVA
(320-400 nm), UVB (280 -320 nm) și UVC (200 -280 nm). UVA reprezintă aproximativ 6% din
radiația solară totală și reprezintă cea mai puțin periculoasă parte a radiației UV. UVB poate
provoca efecte dăunătoare în plante și reprezintă aproximativ 1.5% din spectrul total. UVC sunt
foarte periculoase pentru organisme, dar stratul de ozon filtrează cea mai mare parte din aceste
radiații UV [354, 355].
Degradarea curcuminei în prezența radiației UVB (254 nm) a fost studiată și s -a stabilit
că după 8 ore d e expunere 50 % din curcumina pu dră a fost degradată [356].
Activitatea antioxidantă pentru curcumina liberă și pentru curcumina extrasă din probele
P2C, P4C , P5C a fost evaluată utilizând testul cu DPPH. Particulele au fost expuse la lumină
UVA pentru 30 de m inute iar curcumina din particul e a fost ex trasă în etanol . S-au uti lizat pentru
determinarea procentului de inhibare soluții de curcumină de diferite concentrații (cuprinse între
10 și 1 50 µg/ml) iar pe baza rezultatelor obținute IC 50 a fost determinat atât pentru curcumina
din partic ulele iradia te UV cât și pentru curcu mina din particulele care nu au fost iradiate.
În figura 22 sunt prezentate valorile IC50 (µM) obținute în urma evaluării activității
antioxidante utilizând testul cu DPPH pentru acidul a scorbic, curcumina liberă si pen tru
curcumin a extr asă din probele P2C , P4C, P5C (au fost utilizat e probe neiradiate și iradiate cu
lumină UVA pentru 30 minute, λ=365 nm). Cu cât valorile IC50 sunt mai mici cu atat caracterul
antioxidat al curcuminei este mai pute rnic.

63

Figura 22. Valorile IC 50 obținute în urma testării activității antioxidante cu DPPH pentru
curcumina liberă (FC) și curcumina extrasă din probele P2C , P4C și P5C înainte și după
expunerea la UVA la 365 nm.

Din figura 22 se poate observa că valorile IC50 pentru acidul ascorbic, c urcumin a liberă
și curcumina extrasă din probele P2C, P4 C și P5C sunt apropiate, ceea ce înseamnă că ,
curcumina imob ilizată reține proprietățile antioxidante iar matricea polimeră are rol de protecție.
Pentru curcumina liberă expus ă la l umină UVA se obse rvă că valoarea IC50 crește cu 50%
comparativ cu curcumina li beră care nu a fost expusă la UVA. Literatura menționea ză că
bioactivitatea curcuminei (pudră) a fost schimbată atunci când a fost expusă la lumină UVB și
50% din curcumină a fost degradată după 24 de ore de expunere. Activitatea antioxidantă a
curcuminei li bere după expunea la UV poate fi determinată de produșii de degradare care conțin
grupa h idroxil metoxifenil , aceasta g rupă fiind esențială pentru activitatea antioxid antă a
curcuminei [357].
Se obser vă că între r ezultatele obținute pentru probele P2C, P4C și P5C înainte și după
expunere la UVA există câteva diferențe. Astfel pentru probele P4C și P5C expuse la lumină
UVA activi tatea antioxidantă a curcuminei a fost ușor dimin uată datorită creșterii poro zității
particulelor de hidrogel. Valoare IC 50 pentr u probele P4C și P5C a fost mai mare cu 23% ,
respectiv 33% în comparație cu valoarea IC50 pentr u curcumina liberă neiradiată UV.
Rezultatele arată că bioactivitatea curcuminei și proprietățile sale antioxidante pot f i
alterate prin expunerea sa la UV, iar aceste efecte trebuie luate în considerare în timpul
sterili zării particulelor complexe care conțin curcumina imobili zată. Cu toate acestea, valoarea
IC50 pentru curcumina extr asă din particulele complexe iradiate UV au valori mai mici
comparativ c u curcumina liberă expusă la UV. Rezultatele arată o scădere a valorii IC50 pentru
probele P2C, P4C și P5C expuse la lumină UVA cu 70%, 30% și 25% în comparație cu valorile
IC50 ale curcuminei libere expuse la UV.

64

3.8. Determinarea adsorbției de proteine

Studiul adsorbț iei de proteine pe suprafața particulelor de biopolimeri este esențială în
aplicații biomedicale , atât in vivo cât și in vitro [358] .
Dezvoltarea de biomateriale cu hemoc ompatilitate înaltă și trombo genitate scă zută
repre zintă un obie ctiv fundamental în aplicații biomedicale. Chitosanul este utili zat la scară larg ă
în apli cații biomedicalecare impli că contactul cu sângele , dar studiile de cercetare anterioare
arată că acea stă poli zaharidă poate conduc e la apariția trombo zei și a emboli zării [359] . Proce sul
trombogenic î ncepe atunci când proteinele d in plasm ă sunt adsorb ate pe suprafața sistemelor de
eliberare, urmate de ade ziunea și activarea trombocitelor [360]. O strategi e de reducere a
sarcinilor pozitive ale grupărilor amino protonate prezente pe suprafața chitosanului constă în
introducerea grupărilor sulfonat (RSO3 –) pe l anțul macromolecular. Această reacție induce o
suprafa ță încărcată negativ, similară cu cea a hepar inei, care poate reduce adsorbția proteinelor
plasmatice [361] responsabile pent ru stadiile incipiente ale procesului trombogen. Unele proteine
din sânge au proprietăți anti -trombogene [362] , adsor bția lor fiind mediată de diferite interacțiuni
(hidrofobe, electrostatice, legături de hidrogen). Cu toate acestea, cunoașterea adsorbției de
proteine este necesară pentru a înțelege prop rietățile fizice și comportamentul de adsorbție al
proteinei. Cele m ai abundente proteine din plasma umană, cu excepția hemoglo binei, sunt
albumina serică umană (HSA 45 mg /ml), imunoglobulina G totală (IgG 10 mg / ml),
fibrinogenul (Fib 3 mg /ml), transfe rina (Tr 3 mg ml) ) și imunoglobulina A totală (IgA 1 mg /ml)
[363, 364]. În ace st studiu, albumina serică bovină (BSA) a fost selectată drept proteină model,
deoarece este similară chimic cu HSA, care are cea mai mare concentrație în plasma sanguină. În
tractul gastro -intestinal, unele proteine și enzim e diferite trebuie adsorbite pe suprafața
particulelor cu medicamente imobilizate .
Interacțiunile dintre molecu lele de protein e și particulele de polimer pot fi clasificate în
interacțiuni hidrofobe, legături ionice (sau electrostatice), legături de hidroge n și interacțiuni van
der Waal s [365] . Rezultatele obținute pentru eficiența ads orbției de BSA pe probele P1C, P2C,
P3C, P4C, P5C și P6C sunt prezentate în Figura 23.

65

Figura 23. Eficiența de adsorbție a BSA pentru toate probele anali zate după plasarea simultană a
particulelor complexe la pH = 2 (albastru), pH = 6 .8 (roșu) și pH = 7 .4 (verde). Rezultatele sunt
exprima te ca valori medii ± STDEV.

Din rezultatele obținute, s -a constatat că adsorbția de BSA depinde de interacțiunile
electrostatice, de gradul de umflare și de compoziția particule lor complexe. La pH = 2, adsorbția
de BSA crește pe măsură ce gradul de reticu lare scade, iar cantitatea de i -carragenan în
compoziția particule lor complexe crește. La pH = 2, adsorbția de BSA crește pe măsură ce
gradul de reticulare scade, iar cantitatea de i -carragenan în particule crește. La acest pH, grupele
amin ice din BSA sunt protonate și pot interacționa cu grupări le carboxilice ale gel anului sau cu
grupările sulfat din i-caragenan de pe suprafața particulelor complexe care nu au participat la
reacția de reticulare . Odată cu creșterea cantității de i -carragenan în particule c rește atât
porozitatea lor, cât și numărul grupe lor funcționale din matricea polimerică care nu au participat
la reacția de reticulare (gradul de reticulare poate scade).
La pH = 6,8, s -a obser vat că valorile eficienței adsorbției BSA în ComPs au valori m ai
mici decât la pH 2. La acest pH, grupele am inice din BSA nu au fost protonate și nu au avut loc
interacțiuni electrostatice, ceea ce a determinat o adsorbție mai mică de BSA pe suprafața
particulelor complexe. Se poate observa pentru proba P3C, cu un gr ad de reticulare mai mare, că
valoarea eficienței de adso rbție a BSA a fost puțin mai m are decât pentru probele P1C sau P2C,
care au un grad de reticulare mai mic. De asemenea, valorile eficienț ei adsorbției de BSA la pH
= 6.8 tind să scadă odată cu crește rea cantității de i -caragenan în compoziția particule lor
comp lexe. Așa cum am menționat anteror la pH = 2, legăturile de hidrogen ar putea fi formate,
deoarece valoarea pKa pentru ge lan este de aproximativ 3 .5, iar valoarea pKa pentru i -caragenan
este de a proximativ 2 .6 [366] . Numărul de legături de hidrogen în particule poate crește atunci
când g radul de reticulare scade iar aceste legături pot fi scindate în timp . Există posibilitatea ca la

66
pH = 6.8, adsorbția de protei ne să depindă și de legăturile de hidrogen formate anterior la pH = 2
și nu numai de gradul de reticulare. O explicație pentru rezultat ele obținute ar fi că legăturile de
hidrogen formate anterior la pH = 2 în particulele compl exe nu au fost scindat e imediat după
imersiunea eșantioanelor în soluție de BSA la pH = 6 .8. Aceste legături de hidrogen pot fi
scindate în timp după o perioadă în care particulele complexe pot adsorb i o cantitate suficientă
de soluție de BSA în PBS la pH = 6.8. Astfel, pentru eșantionul P3C, adsorbția BSA a fost
îmbunătățită în comparație cu celel alte particule complexe , deoarece numărul de legături de
hidrogen formate a fost mai mic.
Pe măsură ce concentrația de i -caragenen în probele P4C, P5C și P6C creș te, numărul
grupelor funcțional e care nu a participat la reacția de reticulare crește, de asem enea (și gradul de
reticulare scade), ceea ce conduce la un număr mai mare de legături de hidrogen format e anterior
la pH = 2 în matricea polimeră .
În consecință, eficiența de adsorbție a BSA la pH = 6 .8 crește atunci când cantitatea de i –
caragenan din probă scade. Gradul de umflare are o valoare maximă la pH = 7 .4 și crește atunci
când gradul de reticulare scade . În comparație cu adsorbția de protei ne la pH = 6 .8, o cantitate
mai mare de soluție de BSA poate difuza în interiorul particule lor complexe la pH = 7.4, fiind și
o consecință a faptului că legăturile de hidrogen, formate inițial la pH = 2, au fost scindate. La
pH = 7 .4, nu există interacțiuni electro static e între grupările amin ice din BSA cu cele carboxilat
din gelan sau sulfat d in i-carragenan de oarece punctul izoelectric pentru BSA este la pH = 4 .5 și
grupele amin ice nu au fost protonate .
În consecință, eficiența adsorbției de BSA a fos t mai mică decât l a pH = 2. În plus ,
curcumina la pH = 7 .4 devine mai solubilă. La acest pH, se pot forma legătu ri de hidrogen între
grupările hidroxil ale curcuminei și grupările amin ice ale albuminei care pot conduce la o
eficiență de ad sorbția de BSA mai mare în comparaț ie cu cea obținută la pH = 6 .8.
Din această anali ză putem extra ge conclu zia că adsorbția de pr oteine pe suprafața
particulelor complexe în tractul gastrointestinal depinde de valoarea pH -ului, de gradul de
reticulare, precum și de interacțiunile inter /intramolecula re care au loc între grupările funcționale
din BSA și grupările funcționale din poliz aharidele constitutive .

3.9. Cinetica de eliberare a curcuminei
Cinetica de eliberare a curcuminei a fost studiată la temperatură fiziologică (T = 37 ° C),
în trei m edii de pH diferit: PBS (pH = 7.4 și pH = 6.8) și în soluție care s imulează lichidul gastric
la pH = 2. Curbele de eliberare a curcuminei din probele analizate și influența diferiților factori
asupra eficiențe i eliberării sunt prezentate în Figura 24, Figu ra 25 și Figura 26.
Figura 24 arată influența pH -ului și a gradului de reticulare asupra cinet icii cu eliberare a
curcuminei din probele analizate. Figura 25 arată influența pH -ului și a porozității asupra
cineticii de eliberare a curcuminei din probele an alizate. Figura 26 arată influența dimensiunii
micro / nanoparticul elor încărcate cu curcumină și a pH -ului asupra cineticii de eliberare a
curcuminei din probele analizate.

67

(a) (b)

(c)
Figura 24. Cinetica de eliberare a cu rcuminei în timp din partic ule complexe pe bază de
gelan pentru probele P1C, P2C, P3C: în PBS la pH = 7.4 (a), în PBS la pH = 6.8 (b) și la
pH = 2 ( c). Datele sunt date ca valoare medie ± intervalul de confidență de 95%.

68

(a) (b)

(c)
Figura 25 . Cinetica de eliberare a curcuminei în t imp din particule com plexe pe bază de
polizaharide pe ntru probele P 2C, P4C, P5C, P6C: în PBS l a pH = 7.4 (a), în PBS la pH =
6.8 (b) și la pH = 2 (c). Datele sunt date ca valoare medie ± intervalul de confidență de
95%.

69

(a) (b)

(c)
Figura 26. Cinetica de eliberare a curcuminei în timp din particulele complexe P4C care conțin
micro/nanoparticule de chitosan c are conțin curcumină obținute la diferite durate de
ultrasonicare: în PBS la pH = 7.4 (a) în P BS la pH = 6.8 (b) și pH = 2 (c). Datele sunt date ca
valoare medie ± interval de confidență de 95%.
Din figura 24, figura 25 și figura 26, se observă că, indepen dent de tipul de particule,
cantitatea maximă de curcumină eliberat ă, (adică eficiența de elib erare, a șa cum este dat în
tabelul 3), a fost mai mare în mediu ușor alcalin (pH = 7.4) decât în pH acid (pH = 2) și valorile
eficienței de eliberare la pH = 6.8 au fost intermediare.
Acest efect se corelează foarte bine cu valor ile gradului de umflare a p articule lor
complexe analizate, pentru cele trei medii de pH -ului diferit. Evident, la valori ale pH -ului într –
un domeniu ușor alcalin, unde umflarea a fost maxim ă (efect explicat mai sus), cantitatea
maximă de curcumină eliberat ă a fost mai mare comparati v cu cea eliberată în medii mai acide,
facilitând difuzia curcuminei din particulele complexe.
În cazul probelor P1C, P2C, P3C, prezentate în figura 24, eliberare a curcuminei a avut
loc cu o viteză mai mare până la 1440 minute du pă care cantitatea eliberat ă începe să scadă până
la un punct de echilibru la aproximativ 9360 min, rămânând constantă după aceea la pH = 7.4,
pH = 6.8 și pH = 2. Mai mult, pentru toate val orile de pH, eficiența de eliberare pentru probele
de particule com plexe conținând micropartic ule de c hitosan încărcate cu curcumină (P1C, P2C și

70
P3C) crește odată cu scăderea gradului de reticulare. Același comportament este observat și în
figura 8 pentru probele P4C, P5C și P6C la pH = 6.8 și pH = 7.4. Eficiența de elib erare mai mare
în mediul al calin a fost o consecință a unei umflări mai intense a matricei polimere, ceea ce
permite ochiurilor de rețea să -și mărească dimensiunea și, prin urmare, difuzia principiului
bioactiv a fost intensificată.
Difuzia curcuminei din particulele P2C, P4C, P5C ș i P6C ( figura 25) depinde de
cantitatea de i -carragenan din particule, deci de porozitatea lor. La pH = 2 după 5040 minute,
cinetica de eliberare a curcuminei are un comportament diferit în comparație cu cinetica de
eliberare a c urcuminei la pH = 6.8 sau l a pH = 7 .4. La pH = 2, după 6420 de minute pentru toate
probele analizate, eficiența de eliberare a curcuminei din particulele complexe a fost aproape
similară pe ntru toate probele. După 9360 minute, s -a observat că eficiența de eliberare a
curcuminei a fo st maxim ă pentru proba P2C și scade odată cu creșterea concentrației de
caragenan în particulele complexe, astfel încât valoarea minima a eficienței de eliberare a fost
observată pentru probele P4C.
Creșterea procentului de i -caragenan în compoziția partic ulelor c omplexe are ca efect
creșterea gradului de reticulare (vezi explicația anterioară); prin urmare, intensificarea eliberării
curcuminei din matricile mai re ticulate ar trebui să se desfășoare mai lent. I -Caragenanul, însă,
induce o porozitate mai mar e matric ii polimere în care au fost imobilizate micro/nanoparticulele
de chitosan care conțin curcumină, ceea ce are ca efect intensificarea difuziei principiului activ
prin pori. Între cele două efecte opuse induse de caragenan, se dovedește că cel datora t crește rii
porozității a fost dominant, ceea ce explică rezultatele obținute.
Pe de altă parte, caragenanii sunt susceptibili la depolimerizare prin hidroliză ac idă. La
temperaturi ridicate și pH scăzut, caragenanii își pierd ra pid funcționalitatea [348]. Studiil e
anterioare de degradare a caragenanului au arătat că doar 0.1% din legăturile glicozidice sunt
deteriorate după ce probele de kappa -carragenan au fost m enținute timp de 3 ore la pH = 1,2 și
37 ° C [251, 367].
Din figura 26, se observă că eficienț a de eli berare a curcuminei depinde de dimensiunea
micro/nanoparticulelor de chitosan care conțin curcumină încorporată în matricea gelan sau
gelan / c aragenan; dime nsiunea acestora scade odată cu creșterea duratei de ultrasonica re. Pentru
această analiză, a fost utilizată proba P4C în care micro/nanoparticulele de chitosan, obținute cu
diferite durate de ultrasonicare – 4 minute, 8 minute și 12 minute a u fost încorpo rate Eficiența de
eliberare a curcuminei crește odată cu creșter ea pH-ului și cu scăderea d imensiun ii particulelor.
Astfel, pentru particulele complexe P4C care conțin micro/nanoparticulelor de chitosan cu
curcumină imobilizată cu o dimensiun e de aproximat iv 150 nm (ultrasonicate timp de 12
minute), s -a obținut o efici ență maximă de eliberare a curcumin ei independent de pH -ul mediului
utilizat. Efectul s -a datorat creșterii suprafeței specifice a micro/nanoparticulelor de chitosan care
conțin curcumină, cu creșterea duratei de ultrasonicare. Suprafața lor de contact cu mediul de
eliberare crește odată cu scăderea diametrului, facilitând eliberarea unei cantități din ce în ce mai
mari de principiu activ. Mai multe detalii referitoare la transpor tul și elibera rea curcuminei din
matricea polimeră pot fi obținute folosind mo delul cinetic Ritger -Peppas [368] .
(6)
Valorile factorului exponențial n sunt enumerate în tabelul 3.

Tabel 3. Eficiența de eliberare și valorile factorului exponențial n

71
Prob a Eficiența de eliberare
(%) Timpul
de
eliberare
(min) Valoarea factorului
exponțial, n R2
pH=7.4 pH=6.8 pH=2 pH=7.4 pH=6.8 pH=2 pH=7.4 pH=6.8 pH =
2
P1 83.87 76.73 63.99
9360 0.49 0.43 0.52 0.93 0.99 0.96
P2 69.18 66.69 61.41 0.51 0.4 0.49 0.95 0.98 0.92
P3 65.1 60.22 57.73 0.54 0.53 0.52 0.89 0.94 0.94
P4 97.94 82.15 56.08 0.5 0.41 0.53 0.94 0.97 0.81
P5 87.67 74.2 56.91 0.51 0.51 0.5 0.96 0.98 0.85
P6 84.19 70.64 57.87 0.51 0.49 0.52 0.91 0.93 0.92

Din tabelul 3, se ob servă că pentru apro ape toate probele, din care a fost eliberată
curcumina, factorul de difuzie exponențial n p rezintă valori egale sau foarte apropiate de 0.5,
ceea ce indică o difuzie de tip Fickian. Mai mult, cantitatea de principiu activ eliberat este direct
proporțională cu timpul până când s -a ajuns la o eficiență de eliberare de ap roximativ 60% din
totalul d e curcum inei eliberate, procent găsit ideal în modelele matematice utilizate pentru a
descrie sistemele de eliberare controlată a medicamentelor [369, 370] . Succesul unui sistem de
administrare a medicamentului specific pentru co lon depinde de proprietățil e fizico -chimice ale
medicamentului, de tipul sistemului de administrare, de toți ceilalți factori care pot influența
timpul de tranzi t gastrointestinal și de gradul de interacțiune dintre medicament și tractul digestiv
[371, 372] . De asemenea, sistemul de adminis trare orală trebuie să protejeze medicamentul
împotriva eliberării în stomac și în intestinul subțire [371] . Colonul poate fi o țintă potențială
pentru absor bția sistemică a mai multor medicamente utilizate pentru tratame ntul altor afecțiuni
decât cele ale colonului [371].
Datele preclinice și clinice privind administrarea orală a curcuminei au evidențiat
biodisponibilitatea sistemică scăzută și susceptibilit atea crescută la activitatea metabolică, iar
cercetările anterio are au arătat că doar 2.30 ± 0.26 μ g / ml curcumină au fost găsite în plasmă
după administrarea orală a 10 g de curcumină. Curcumina sufer ă modificări metabolice extinse
în intestin și ficat, ceea ce împiedică preluarea sistemică a curcuminei pentru a trat a diferite boli.
O varietat e de mat eriale, pe bază de polimeri naturali, sintetici și lipide, au fost utilizate pentru
obținerea sistemelo r de eliberare care pot depăși eficient epiteliul gast rointestinal și, astfel,
curcumina poate ajunge în colon și în c irculația sistemică în doze terapeu tice [373] .
Scopul imobilizării curcuminei în particule complexe pe bază de polizaharide a fost acela
de a facilita administrarea orală a curcuminei, asigur ându -se depășirea barierei gastrointestinale
și, în consecință, eliberarea unei cantități t erapeuti ce de curcumină în colon. Gelanul a fost ales
ca polimer predominant cantitativ pentru prepararea acestor particule complexe datorită
stabilității sale în me diul puternic acid al stomacului și a rezistenței sale la enzime le din tractul
gastro -intes tinal. D atorită timpului în general scurt de staționare a alimentelor în stomac (golirea
stomacului durea ză 2 -6 ore) și în intestinul subțire (3 -5 ore), se asigură d epășirea barierei
gastroitestinale a particulelor complexe și el iberea unei cantități terap eutice d e curcumină în
colon.
La trecerea particulelor prin stomac și intestinul subțire, este posibilă eliberarea unei
cantități relativ reduse de curcumină, așa cum au demonstrat studiile descrise mai sus. A fost
interesant s ă studiem eliberarea curcum inei din trei tipuri de particule complexe plasându -le
secvențial mai întâi într -o soluție la pH=2 care s imulează mediul stomacal, apoi în soluția PBS la

72
pH = 6,8 ca re simulează lichidul intestinal și apoi în PBS la pH = 7.4 care simulează mediul
colonului . Pentru eliberare într -un mediu acid, durata a fost stabilită la 2 ore (comparabilă cu cea
de staționare a alimentelor în stomac). Apoi, particulele complexe au fos t plasate imediat într -un
mediu de eliberare cu pH = 6.8 timp de 3 ore, deoarece aceasta es te durat a în care 50% din toate
alimentele trec din intestinul subțire în colon și apoi particulele compl exe au fost plasate într -o
soluție la pH = 7.4 pentru 4 ore (timpul de staționare a alimentelor în colon variază între 4 -72
ore).
Curbele cinetice obți nute sun t prezentate în figura 27 , care ilustrează un comportament
diferit pentru particulele P2C, P3C și P4C. De fapt, după îndepărtarea particulelor complexe din
mediul acid și intestinal și plasarea lor într -un mediu ușor alca lin, eliberarea curcuminei a fost
practic intensificată.
Cantitatea totală de curcumină eliberată după aproximativ 10 ore, în cele t rei medii
succesive, depășește cantitatea maximă de curcumin ă eliberată din aceleași trei tipuri de
particule, după 10 ore, fie în mediu acid, fie în m ediu int estinal sau doar în mediu ușor alcalin
(vezi Figurile 24, 25, 26).

Figura 27. Curbe cinetice p entru eliberarea curcuminei în timp din particulele P2C, P3C și P4C
în mediu acid la pH = 2 (2 h), în PBS la pH = 6.8 (3 h) și apoi în mediu ușor alcal in în PB S la pH
= 7.4 (4 h). Datele sunt date ca valoarea medie ± intervalul de confidență de 95%.

De as emenea, trebuie remarcat faptul că după aproximativ 10 ore î n care particulele
complexe rămân în tractul digestiv, eliberare a curcuminei din particulel e P4C a fost practic
completă (peste 60% din curcumina ar putea fi eliberată în colon). Acest rezultat co nfirmă
ipoteza noastră de pornire și demonstrează rolul prot ector al matricei polimere pentru curcumină
în depășirea bariere i stomacale; prin urmare, a ceste fo rmulări încărcate cu curcumină pot fi
potrivite pentru eliberarea acestui polifenol în colon.
CON CLUZII

73
Particulele sferice încărcate cu curcumină pe bază de polizaharide au fost obținute
utilizând o metodă care are la ba ză complexarea polielectrol itică a polizaharidelor constituente și
gelifierea ionică în prezența ionilor metalici divalenți.
Eficien ța de încapsulare a curcuminei a fost mai mare de 85.7% și a crește atunci când
densitatea de reticulare sau cantitatea de i -caragenan din compoziția p articule lor complexe scade.
Mai mult decât atât, gradul de umflare și cantitatea de curcumină eliberate d in particulele
complexe cresc atunci când gradul de reticula re scade sau crește concentrația de i -carragenan din
particule. Prezența i -caragenanului în compozi ția matricei polimerice are ca rezultat o morfologie
diferită, caracterizată prin porozitate ridi cată, ceea ce determină o intensificare a procesului de
difuzie. Curcumina imobilizată își păstrează activitatea antioxidant ă chiar și după expunerea l a
UVA ma tricea polimeră având rol protector pentru curcumină iar particulele au capacitatea de
adsorbție a proteinelor și pot fi utilizate ca biomateriale. Independe nt de tipul de particule,
curcumina a fost eliberată conform uno r profile cinetice specific e, în di ferite medii la pH = 2, pH
= 6.8 și pH = 7.4, cu o eficiență mai mare la în mediul slab alcalin.
În cele din urmă, se poate admite că polizaharidele, utiliza te pentru obținerea acestor
particule complexe cu curcumină imob ilizată, au rol de protecți e pentru curcumină, permițându -i
să depășească bariera gastrică și să fie absorbită mai eficient în colon .