Disciplina de Reproduc ție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară [624398]

UNIVERSITATEA DE ȘTIIN ȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ
CLUJ -NAPOCA

FACULTATEA DE MEDICIN Ᾰ VETERINAR Ᾰ
Departamentul CLINIC
Disciplina de Reproduc ție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară

Noémi – Blank a BENEDEK

LUCRARE DE LICEN ȚĂ

Insemi narea artifici ală prin metoda chirurgicală cu material seminal congelat la cățea

Îndrumă tor științific:
Conf . Dr. Raul Alexandru POP

Cluj -Napoca
2018

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

2

CUPRINS

REZUMAT ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 3
ABSTRACT ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 4
INTRODUCERE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………….. 5
PARTEA I – STADIUL ACTUAL AL CUNOA ȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI
ABORDATE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. … 6
Capitolul 1 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 7
FIZIOLOGIA CICLULUI SEXUAL ………………………….. ………………………….. …………………….. 7
1.1 Momentul ovula ției și hormonii implica ți ………………………….. ………………………….. …………. 7
Capitolul 2 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 9
METODE FOLOSITE PENTRU DEPISTAREA OVULA ȚIEI ………………………….. …………. 9
2.1 Frotiu citovaginal ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………. 9
2.2 Determinarea nivelului de progesteron plasmatic ………………………….. …………………………. 13
Capitolul 3 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 15
MATERIALUL SEMINAL ………………………….. ………………………….. ………………………….. …….. 15
3.1 Caracteristicile materialului seminal ………………………….. ………………………….. ………………. 15
3.2 Conservarea materialului seminal prin congelare ………………………….. …………………………. 17
Capitolul 4 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 20
MATERIALE ȘI METODE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……. 20
4.1. Examinarea materialului seminal după decongelare ………………………….. …………………….. 22
4.2 Considera ții practice privind conservarea materialului seminal ………………………….. ………. 25
4.3 Tehnica insemi nării artificiale prin metoda chirurgicală ………………………….. ………………… 27
Capitolul 5 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 35
REZULTATE ȘI DISCU ȚII ………………………….. ………………………….. ………………………….. …… 35
Capito lul 6 ………………………….. ………………………….. ………………………….. ………………………….. …. 41
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI ………………………….. ………………………….. ……………………… 41
BIBLIOGRAFIE ………………………….. ………………………….. ………………………….. ……………………… 42

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

3
INSEMI NARE ARTIFICIALĂ PRIN METODA CHIRURGICALĂ CU MATERIAL
SEMINAL CONGELAT LA CĂ ȚEA

Autor: Noémi – Blanka Benedek
Îndrumător Științific: Conf . Dr. Raul Alexandru POP
Universitatea de Științe Agricole și Medicină Veterinară, Facultatea de Medicină Veterinară,
Calea Mănă ștur nr. 3 -5, 400372, Cluj -Napoca, România
noemibenedek89@yahoo.ro

REZUMAT

Insemi narea artificială prin metoda chirurgicală cu material seminal congelat este o
tehnică de reproduc ție modernă , practicată prima dată în România cu succes. Această metodă se
folose ște în situa țiile în care monta naturală sau insemi narea artificială cu material seminal
proaspăt nu pot fi efectuate. Principalele motive utilizării acestei metode sunt : distan ța foarte
mare între femel ă și masculul donator , femela este la finalul perioadei reproductive sau proba de
material seminal este de o calitate mai scăzută din diferite motive (vȃrsta înaintată, fertilitate
scăzută , recoltări multiple ) însă masculul are o valoare genetică ridicată.
Scopul studiului , desfă șurat în perioada noiembrie 2016 – iunie 2018, în cadrul Clinicii
de Reproduc ție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultă ții de Medicină Veterinară Cluj,
constă în îmbunătă țirea procesului reproductiv prin tehnica chirurgicală de insemi nare artificială
cu material seminal congelat și urmărirea evolu ția gesta ției, fătării și a numărului de produ și
viabili rezulta ți în urma acesteia. Cercetările s -au efectuat pe un număr de 5 că țele cu vârsta
cuprinsă între 2.5 a ni și 5 ani, apar ținând raselor diferite: Ogar Englez, Saint Bernard (două
female), Golden Retriever și Dobermann.
Conform rezultatelor 60% din numărul de femele insemi nate prin această tehnică au
rămas gestante și numai 40% au dus gesta ția la un bun sfâr șit.
În concluzie , această metodă poate fi folosită cu succes atunci când femela este clinic
sănătoasă și are nivelul de progesteron corespunzător , iar materialul seminal are o mobilitate
totală de minim 50%, din care mobilitatea progresivă să fie de minim 35 %.

Cuvinte cheie : insemi nare artificială, metoda chirurgicală, material seminal
congelat

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

4
ARTIFICIAL INSEMINATION USING THE SURGICAL METHOD WITH FROZEN
SEMEN IN BITCHES

Author: Noémi – Blanka Benedek
Scientific Coordinator: Conf.Dr. Raul Alexandru POP
University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine,
Calea Mănă ștur nr. 3 -5, 400372, Cluj -Napoca, Romania
noemibenedek89@yahoo.ro

ABSTRACT

Artificial insemination by the surgical method with frozen semen is a modern breeding
technique, first practiced successfully in Romania. This method is used in situations when the
natural breeding or the artificial insemination with fresh semen can not be performed. The main
reasons for using this method are: the very long distance between the female and the donor male,
the female is at the end of the reproductive period or the sample of the semen has an inferior
quality for different reasons ( old age , low fertility, multiple ha rvesting) but the male still has a
high genetic value.
The purp ose of the study w hich was done between November 2016 – June 2018 at the
Reproduction, Obstetrics and Gynecology Clinic of the Faculty of Veterinary Medicine, Cluj,
consists in improving the re product ive process by artificial insemination technique with frozen
semen and following the evolution of gestation, the number of viable products resulting from it.
Research has been done on five bitches aged between 2.5 years and 5 years of different breeds:
Greyhound, Saint Bernard (two women), Golden Retriever and Dobermann.
According to the results, 60% of the bitches inseminated by this techniqu e have remai ned
pregnant and only 40% gave birth to a li tter.
In conclusion, this method can be used successfully when the female is clinically healthy
and has the approp riate progesterone level to carry a gestation , and t he semen has a total mobility
at least 50%, of which the progressive mobility is minimum 3 5%.

Key words : artificial insemination, surgical method, frozen semen

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

5

INTRODUCERE

Cățeaua este un animal cu ciclu diestric, cu o durată a ciclului sexual de 3 -6 luni și
sezonieră (căldurile apar în general toamna și primăvara). Pubertatea la că țea se instalează la
vârsta de 6 -12 luni, iar perioada de reproduc ție durează până la 8 -10 ani. Ciclul sexual prezintă
numeroase particularită ți, durata sa variind cu rasa și în cadrul rasei, variază în func ție de
individ, vârstă (Groza I., 2006). Lucrarea de fa ță are scopul de a îmbunătă ți procesul reproductiv
prin tehnica chirurgicală de insemi nare artificială cu material seminal congelat și urmărirea
evolu ția gesta ției, fătării și a numărului de produ și viabili rezulta ți în urma acesteia.
Insemi narea artificia lă realizată cu material seminal congelat necesită inocularea acestuia
să se facă intrauterin și se aplică prin metoda chirurgicală. Metoda chirurgicală de insemi nare
artificială este utilizat atunci când donatorul se află la o distan ță foarte mare și feme la este pe la
finalul perioadei reproductive. În acest studiu am urmărit rezultatele în urma insemi nării
artificiale prin metoda chirurgicală la 5 că țele, pentru care din diverse motive s -a optat pentru
această tehnică.
Studiul s -a derulat în perioada noiembrie 2016 – iunie 2018 în cadrul clinicii de
Reproduc ție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultă ții de Medicină Veterinară,
Universita ții de Științe Agricole și Medicină Veterinară Cluj -Napoca, sub îndrumarea cadrului
didactic, Conf. Dr. Alexandru Raul Pop.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

6

PARTEA I – STADIUL ACTUAL AL CUNOA ȘTERII ÎN DOMENIUL TEMEI
ABORDATE

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

7
Capitolul 1
FIZIOLOGIA CICLULUI SEXUAL

Cățeaua este un animal cu c iclu diestric, cu o durată a ciclului sexual de 3-6 luni. În
general căldurile apar toamna și primăvara . Pubertatea la că țea se instalează la vârsta de 6 -12
luni, iar perioada de reproduc ție durează până la 8 -10 ani. Ciclul sexual prezintă numeroase
particularită ți, durata sa variind cu rasa și în cadrul rasei, variază în func ție de individ, vârstă, etc.
Cățelele au 2 -4 periode de călduri pe an și fiecare fază a ciclului sexual este mai lungă (Groza I.,
2006 ).
Ciclul sexual (fig. 1.1 .) se împarte în mai multe faze după cum urmează:
Proestru s: durează timp de 7-10 zile, în această perioadă apar scurgeri sangvinolente și
vulva se tumefiază progresiv ; în proestrul târziu avem peak -ul de estrogen;
Estru s: are o durată de 5 -10 zile, ovula ția are loc începȃnd cu ziua a doua; începe in ziua
când se produce prima descărcare de LH, și este marcată de cre șterea progesteronului și scăderea
17β-estradiolului plasmatic;
Metestrus : avȃnd o durată de 20 -90 zile; nivelul de progesteron este în cre ștere și la
examenul citologic cornificarea /cheratinizarea celulelor este în scădere. Met estrul durează fie
până că țeaua fată, fie până nivelul de progesteron revine la normal.
Anestru s: are o durată variabilă ȋntre 15 -150 de zile, concentra ția progesteronului se
reduce la nivelul bazal, abrupt îna inte de fătare sau gradual la femele negestante.
Ovula ția are loc la sfăr șitul căldurilor (estrului), foliculii maturându -se succesiv, fiind în număr
de 4-6 la femelele de talie mică și până la 15 -20 la cele de talie mare. Prima faza estrală apare în
mod obișnuit la vârsta de 6 luni, după ce că țeaua se apropie de g reutatea corporală a adultului
(Groza I., 2006).

1.1 Momentul ovulației și hormonii implica ți

Ovula ția se urmăre ște prin diferite metode, majoritatea fiind legate de nivelul unor
hormoni direct responsabili de fazele ciclului sexual, cum ar fi dozarea progesteronului,
estrogeni lor, urmărirea nivelelor de LH și FSH; sau întocmirea unui frotiu vaginal și prin tehnici
de citologie, estimarea perioadei în care se află că țeaua.
Estradiolul este primul hormon de referin ță al ciclului estral, o cre ștere a nivelului de
estrogen este vizualizat clinic prin primele semne de călduri. Vaginul și vulva prezintă tumefiere,

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

8
se observă scurgeri sero-sangvinolente. Sub efectul estr adiolului , peretele vagin al se îngroa șă și
se exfoliază (la nivelul epiteliului mucoasei vaginale) , de aici provenind și primele modificări pe
care le putem vedea la examenul citologic. Nivelul său cre ște în proestrul timpuriu, ajunge la un
peak și apoi scade, producând modificări tipice și în comportamentul femelei (Scarlette Gotwals,
2001).
LH-ul (hormonul luteinizant ) este hormonul central al ci clului estral. Cre șterea sa este
stimulată de nivelul crescut de e strogen, care persistă o perioada v ariabilă, și are drept rezultat,
peste aproximativ 2 zile, ovula ția. Ov ocitele însă nu sunt mature și nici capabile de a fi
fecundate, ele devin fecundabile dup ă încă 2 zile de la cre șterea nivelului de LH, iar apoi ele își
mențin capacitatea fecundant ă pentru încă 1 până la 3 zile. A șadar, notând ziua « peak »-ului de
LH ca fiind ziua 0, femela este în perioada fertilă în zilele 4, 5 și 6. Pentru a depista acest peak al
LH-ului sunt necesare teste sangvine zilnice (Scarlette Gotwals, 2001).
Creșterea progesteronului provoacă schimbarea secre ției celulelor foliculare de la
estrogen la progesteron (Scarlette Gotwals, 2001).
Progesteronul este hormonul necesar susținerii gesta ției. La câini nivelul de progesteron
își atinge limita inferioară (<1,0 ng/ml ) înaintea peak -ului de LH. Urmărind cre șterea de LH și
nivelul de progesteron din sânge va cre ște, până la o valoare de aproximativ 1,5 -2 ng/ml. După
peak -ul de LH, progesteronul î și continuă cre șterea până la un nivel > 5 ng/ml în zilele 2 până la
4 și în continuare la o valoare > 10 -15 ng/ml la sfâr șitul perioadei fertile (Scarlette Gotwals ,
2001 ).
Creșterea ini țială a progesteron ului se leagă strâns de peak -ul de LH și astfel o putem
folosi, în practică, pentru a plani fica perioada fertilă a femelei (fig. 1.1 .).

Fig. 1.1 . – Evolu ția hormonilor pe parcursul unui ciclu sexual până la fătare
(Sursa : https://www.petcoach.co/article/hormone -levels -determining -breeding -times -and-
whelping -date/ )

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

9
Capitolul 2
METODE FOLOSITE PENTRU DEPISTAREA OVULA ȚIEI

2.1 Frotiu citovaginal

În general prima variantă folosită pentru a depista perioada ciclului estral în care se află
cățeaua este efectuarea unui frotiu vaginal și chiar pentru stabilirea momentului optim pentru
montă. Modific ările citologice reflectă în totalitate schimbările endocrin ologice care au loc în
organismul femelei, în principal concentra ția de es tradiol din sânge (fig. 2.1 .). Nivelul crescut de
estrogen determină o cornificare a celulelor caracteristice estrului (Robert Bowen, 1998).

Fig. 2.1 . -Zilele optime pentru realizarea testări i hormonale și a frotiu lui cito-vaginal
(Sursa: https://www.petcoach.co/article/hormone -levels -determining -breeding -times -and-
whelping -date/ )

Pentru a identifica diferitele stadii este de cele mai multe ori suficientă examinarea unei
singure lame, însă există unele situa ții, de exemplu pentru a diferen ția faza de proestru de
metestru, unde sunt necesare mai multe amprente.
Tamponul trebuie introdus adânc în vagin pentru a evita colectarea de celule din
vestibulul vaginal, formând un unghi ascu țit față de peretele dorsal al cavită ții. La rasele de talie
mare (ex.: Saint Bernard, Dobermann , Ogar englez etc ) se introduce pâna la 15 cm iar la cele de
talie mică (ex.: Yorkshire Terrier, Chihuahua) unde va în jur de 5 cm (Robert Bowen, 1998).
După ce tamponul este introdus complet este necesară rotirea sa de 2 -3 ori pentru a
colec ta cantitatea dorită de celule (fig. 2.2 .).

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

10

Fig. 2.2. – Recoltarea celulelor si p oziționarea corectă a tamponului steril în vagin
(Sursa :https://books.google.ro/books?id=PMY0AwAAQBAJ&q=fluid&hl=hu&source=g
bs_word_cloud_r& cad=5#v=snippet&q=colection%20vaginal%20fluid&f=false )

După prelevare celulele sunt întinse pe o lamă de sticlă (fig .2.3.), uscate și colorate prin
metoda rapidă Diff -Quick (fig. 2.4.), timpul necesar pentru fixare este de aproximativ 10 -15
secunde pentru fiecare din cele trei solu ții, după car e frotiul ( fig. 2.5.) poate fi examinat la
microscop cu obiectivul 40x (Kustritz M. ,2003; Bunagura J.D , Twedt D.C, 2009; Merck, 2014 ).

Fig. 2.3 . – Rularea tamponului pentru realizarea amprentei citologice pe lamă
(Sursa : http://www.slideshare.net/EmmanuelFontaine2/2014 -timing -of-ovulation -in-the-
canine -species -whats -new-in-2014 )

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

11

Fig. 2.4 . – Imersare în coloran ții Diff -Quick
(Sursa : https://i.ytimg.com/vi/DyLB6AeAc_g/maxresdefault.jpg )

Fig. 2.5. – Lamă cu amprentă colorată pregă tită pentru examinare
(Sursa : http://hjcam.hcavs.gr/en/v2 -i1-time-for-diagnostics )

Majoritatea celulelor depistate printr -un frotiu sunt celule epiteliale vaginale. Mai găsim
pe lângă acestea un număr variabil de leucoc ite, eritrocite, bacterii, și un număr mic compus din
alte celule și microorganisme contaminante. Citirea unui frotiu inseamnă clasificarea celulelor
epiteliale în unul dintre cele 3 tipuri fundamentale: celule parabazale, intermediare s i
superficiale.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

12
Celulele parabazale (fig. 2.6 .) sunt cele mai mici ca și dimensiune de pe frotiu, rotunde
sau aproape rotunde și au un raport citoplasmă/nucleu (1 :1) mare. Ele predomină în diestrus,
anestrus și la începutul proestrului, dar lipsesc în estrus (Robert Bowen , 1998).

Fig. 2.6 . – Celule parabazale
(Surs a: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/pbasals.jpg )

Celulele intermediare (fig. 2.7 .) pot varia ca și formă și mărime, dar în mod normal sunt
de 2-3 ori mai mari decât celulele parabazale și apar în toate stadiile ciclului, exceptând estrul.
Raportul citoplasmă/nucleu este în favoarea ci toplasmei (Robert Bowen, 1998).
Fig. 2.7 . – Celule intermediare
(Surs a: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/intermed.jpg )

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

13
Celulele superficiale (fig. 2.8 .) sunt mari, au formă poligonală cu nucleul absent sau
picnotic. Celulele fără nucleu sunt considerate complet cornificate și nu se întâlnesc în proestrs și
anestrus, ele fiind o caracteristică citologică a estrului (Robert Bowen, 1998).
Fig. 2.8 . – Celul e superficiale
(Sursa : http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/vc/superx2.jpg )

Depistarea ovula ției cu ajutorul frotiului se bazează pe corectitudinea cu care se execută
recoltarea și colorarea frotiului și mai apoi pe citirea imaginii care apare în timpul examinării la
microscop.

2.2 Determinarea nivelului de progesteron plasmatic

Determinarea ni velului de progesteron din ser este tehnica cea mai sigură pentru
stabilirea perioadei fertile, și stabilirea exactă a momentului oportun pentru montă. Determinările
se pot face în cadrul unui laborator specializat sau cu diferite kit -uri de dozare: Ovuche ck
Premate (Biovet Canada), Stat-Pro (ICG/Synbiotics), Target (Biometallics), PreMate (Camelot
Farms)etc. Aceste kit -uri sunt folosite pentru a determina rapid perioada în care se află femela și
funcționează bine pentru montele care decurg normal. Pentru montele în care se folose ște spermă
refrigerată sau congelată, femele cu probleme anterioare de infertilitate sau monte cu masculi cu
număr redus de s permatozoizi, determinarea cantitativă a progesteronului este recomandată
(Scarlette Gotwals, 2001).
Nivelul progesteronului înainte de peak -ul de LH este în limitele normale, cre ște apoi la
1,5-2 ng/ml la începutul peak -ului, apoi până >5 ng/ml în timpul acestuia și ajunge până la valori
de >10 -15 ng/ml la sfâr șitul perioadei fertile. Momentul peak -ului de LH poate fi estimat în

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

14
funcție de cre șterea nivelului de progesteron, acestea fiind strâns corelate (Sca rlette Gotwals,
2001) (fig. 2.9. ).

Fig. 2 .9. – Modificările estr adiolului , progesteronului si LH -ului pe parcursul unui ciclu
sexual până la fătare
(Sursa : http://www.peteducation.com/images/articles/ill_breeding1.gif )

Detectarea momentului optim pentru montă este crucial mai ales din punctul de vedere al
crescătorilor, deoarece că țelele au un ciclu mono -estru, intervalul dintre călduri fiind de 6 -7 luni.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

15
Capitolul 3
MATERIALUL SEMINAL

3.1 Caracteristicile materialului seminal

Insemi narea artificială se clasifică după locul de depunere al materialului seminal astfel:
insemi nare intra-vaginală profundă (AI ), insemi nare transcervicală (TCI) sau implant intrauterin
(metoda chirurgica lă) (William C. Truesdale, 2011).
Materialul seminal este format din trei frac țiuni: prima este un lichid clar denumit
fracțiune pre -spermatică (care de obicei este înlăturată, cu un volum între 0 .5-2 ml); a doua parte
este frac țiunea spermatică, cu densitate crescută, lăptoasă ( aceasta este partea de intere s și care
dorim să o colectăm), iar spre final ob ținem ultima frac țiune, cea prostatică, un lichid clar , dar de
care nu avem nevoie în cazul în care dorim conservarea materialului seminal (Valeria Rickard,
2011).
Evaluarea este o etapă foarte importantă și se realizează prin etalarea unei picături de
material seminal pe o lamă curată, uscată și preîncălzită care va fi examinată la microscop. Se
urmare ște motilitatea, morfologia spermatozoizilor, concentra ția materialului seminal recoltat și
alte caracteri stici după cum urmează în tabelul (3.1 .) de mai jos (Rober t Bowen, 2003) :

Tabel 3.1 .
Valori pentru principalele caracteristici ale materialului seminal
Parametru Valori normale
Volum de ejaculat (frac țiunea spermatică) 1-6 ml
Concentra ția 100-500 milioane/ml
Număr total de spermatozoizi pe ejaculat 300-2000 milioane
Motilitate progresivă >70%
Morfologie >80%
(Sursa : http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/dog.html )

 Culoarea normală este opacă, alb -lăptoasă; dacă ejaculatul este ro șu sau maro aceasta
indică prezen ța de sânge, culoarea galbenă se datorează urinei și cea verde unei infec ții;
 Volumul (în ml/ejaculat) poate varia considerabil în func ție de vârstă, rasă și libidoul
masculului de la 1 ml la 20 ml;

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

16
 pH-ul se măsoară numai la frac țiunea prost atică și trebuie să fie între 6.5 și 7.0, devieri
de la aceste valori pot indica inflama ții sau infec ții;
 Mobilitatea măsoară procentajul total de spermatozoizi care sunt vii și se mi șcă; ea
trebuie să fie > 70% (fig. 3.1 .);
 Morfologia celulelor spermatice este dificil de observant fără un microscop performant, o
colora ție adecvată și puțină expe riență. Colora ția Diff -Quick poate fi folosită și în acest
caz cu succes. Se consideră normal când > 80% din spermatozoizi sunt corec ți din punt
de vedere structural;
 Numărul spermatozoizilor poate fi determinat cu dificultate, însă se poate folosi un
hemocitometru (fig. 3.2 .) pentru u șurarea procedeului ( William C. Truesdale, 2011).

Fig. 3. 1. – Spermatozoid viu și normal și spermatozoid mort
(Sursa : http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/morph.html )

Fig. 3.2 . – Hemocitometrul
(Sursa : http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/semeneval/conc.html )

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

17
3.2 Conservarea materialului seminal prin congelare

În cele mai multe cazuri sperma este colectată manual și frac țiunea spermatică este
folosită pentru congelare. Pa șii cei mai importan ți din această tehnică sunt: centrifugarea, dilu ția,
echilibrarea termică, ambalarea, congelarea și decongelarea.
Centrifugarea are ca scop îndepărtarea frac țiunii prostatice care s -a dovedit că are un
efect negativ asupra motilită ții și viabilită ții spermatozoizilor tre cuți prin congelare -decongelare
și de a standardiza cu ajutorul dilu ției concentra ția finală a materialului seminal la spe rmatozoizi
(Linde -Forsberg, C. , 2005). Cel mai utilizat protocol de centrifugare este la 600 -700 rota ții/minut
timp de 5 -10 minute (Igna V, 2007).
Diluarea spermei are următoarele roluri: protejarea spermatozoizilor de efectele negative
ale temperaturilor scăzute și obținerea unei concentra ții finale standard. În majoritatea sistemelor
materialul seminal final a junge la o dilu ție de 50 -100 milioane de spermatizoizi pe 0,5 ml/paietă,
când folosim 2 -4 paiete pentru o insem ânțare (Igna V. , 2007).
Pregătirea spermei pentru congelare include ambalarea și divizarea care permit
depozitarea materialului în doze u șor identificabile: granule, paiete, palate sau tuburi. Curent, cea
mai comună formă de ambalare a materialului seminal congelat pentru câini sunt granulele (fig.
3.3.) sau paietele (fig.3.4 .), deoarece ele prezină câteva avantaje în plus fa ță de celălalte meto de:
volum redus (cre ște capacitatea de stocare), congelare uniformă, posibilitatea de identificare și
marcare u șoară (numele câinelui, d ata colectării, etc.) (Igna V., 2007).
Înaintea congelării, materialul este răcit până la 4°C și păstrat la această temperatură un anumit
interval de timp (1 -4 ore) în func ție de protocolul utilizat. Acest proces dă posibilitatea spermei
să dezvolte o rezisten ță la șocul termic care vine odată cu congelarea.
Congelarea în sine poate fi realizată cu ajutorul unor congel atoare programabile sau prin
punerea paietelor la distan țe diferite deasupra vaporilor de azot lichid. Ultimul stadiu al
congelării este introducerea direct în azot lichid la -196 °C (Igna V., 2007).
Extragerea paietei sau tubului cu granule din azotul li chid este recomandat să se facă cu
ajutorul unei pense special destinată. Dacă paieta este extrasă cu mâna, trebuie să fie prinsă de la
nivelul dopului uzinal. După extragere, se impune o singură mi șcare puternică în scopul
îndepărtării urmelor de azot răm ase și a condesului format.
Transferul paietelor în apa încălzită trebuie făcut cât mai repede posibil. Decongelarea în
interiorul unei paiete de 0. 5 ml sau unui tub de granule , la temperatura camerei, începe în
4 secunde de la extragerea din a zot, ceea ce duce la alterări ale materialului seminal con ținut
(Neagu V., 2011).

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

18
Rata de decongelare poate influen ța semnificativ rezultatele și este strâns corelată cu
protocolul de congelare folosit. O decongelare înceată poate duce la recristalizare, în timp ce o
procedură de decongelare prea rapidă poate cauza balonarea celulei, deoarece se creează un stres
osmotic brusc asupra celulei deshidratate (Neagu V., 2011).
Decongelarea granulelor sau paietelor în apă de 70°C, timp de 8 secunde, are ca și
rezultat o rată de supravie țuire a spermatozoizilor mult mai mare decât dezghe țarea făcută cu apă
la 37°C timp de 15 până la 60 de secunde (Olar, T.T. ,1984; Concannon, P.W., Battista, M.,
1989; Rota , 1998; Peña, A.I., Linde -Forsberg, C.,2000). Pentru baia de apă nu sunt necesare
materiale sofisticate putându -se utiliza chiar și un borcan suficient de înalt, fiind important ca
întreaga paietă sau tub de granule să fie introdusă în apă.

Fig. 3.3 . – Tub cu granule și Fig. 3.4 . – Paiete
(Sursa : http://animalhospitalofwoodstock.com/reproductive -services/frozen -semen/frozen –
semen -procedure.html )

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

19

PARTEA II – MATERIALE ȘI METODE

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

20
Capitolul 4
MATERIALE ȘI METODE

Cercetările s -au efectuat în perioada noiembrie 2016 – iunie 2018, în cadrul Clinicii de
Reproduc ție, Obstetrică și Ginecologie Veterinară a Facultă ții de Medicină Veterinară Cluj, pe
un număr de 5 c ățele cu vârsta cuprinsă între 2.5 ani și 5 ani, apar ținând raselor diferite: Ogar
Englez, Saint Bernard (două female), Golden Retriever și Dobermann .

Cazul numărul 1

Femelă din rasa Ogar E nglez , în vârstă de 5 ani și 44 kg masă corporală. Femela și-a
încheiat cariera sportivă la vârsta de 4. 5 ani, înregistrând performan țe remarcabi le în cursele de
500 de metri. Aceste performan țe au recomandat -o pentru reproduc ție, proprietarul optând pentru
un mascul rezident in Australia, de ținător al recordului “All Time” al curselor pe distan ța de 500
de metri . Din cauza condi țiilor sanitare extrem de severe (carantină de 6 luni, Australia fiind țară
indemnă de rabie) precum și a costurilor ridicate de transport proprietrul femelei a optat pentru
importul de material seminal conservat prin metoda congelării.
Frotiu l vaginal hormonal a fost efectuat în vedere a monitoriz ării ciclului estral sub
aspectul diagnosticului pr ecoce al unor eventuale stă ri septice subclinice ale aparatului genital
precum și a stabilirii (cu aproxima ție) a momentului optim p entru IA. Examenul frotiului rezultat
a relevat o multiplicare anormală a florei bacteriene precum și o crestere a num ărului de
neutrofile. Femela a fost supus ă unui tr atament cu Synulox pe o perioadă de 4 zile preoperator și
5 zile postoperator.
Examenul ecografic a relevat aspecte fiziologice ale aparatului genital.
Nivelul de progesteron , a fost măsurat prin metoda electrohemilumin escenței in zilele 9,
11, 13 si 15.
Insemi narea s -a realizat în a cincisprezecea zi a ciclului de c ălduri, când nivel ul
progesteronului plasmatic a atins valoare de 17,8 ng/ml (55 nmoli/l).

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

21
Cazul numărul 2

Femelă din rasa Golden Retriever , în vârst ă de 5 ani și masă corporală de 36 kg, având o
stare de între ținere foarte bună si clinic sănătoasă.
Frotiu l cito-vaginal a relevat aspectele fiziologie ale ciclul estral, observându -se celule
epiteliale din straturile superficial respectiv intermediar, procentul de cheratinizare fiind de 90%.
Flora bacteriana s -a prezentat în mod fiziologic, nefiind necesar tratamentul loca l sau sistemic.
Ecografia a relevat aspecte fiziologice ale apar atului genital și anume folicul i
predehiscenti la nivelul ovarului drept.
Nivelul de progesteron : 23 ng/ml (73.24 nmoli/l).
Insemi narea s -a realizat în a cincisprezecea zi a ciclului de călduri, c ând nivelul
progesteronului plasmatic a at ins valoare de 23 ng/ml (73. 24 nmoli/l).

Cazul numărul 3

Femelă din rasa Saint Bernard cu părul scurt , în vârstă de 2.5 ani cu o masă corporală de
55 kg, având o stare de între ținere foarte bună și clinic sănătoasă.
Anterior acestui ciclu sexual, femela a fost diagnosticată cu ascită și hipopericard din cauză
idiopatică. Tratamentul recomandat și administrat a fost de 5mg/kgc Furosemid și 0.5 mg/kgc de
Vetmedin ( în două doze) timp de 2 săptămâni, pr imind până a cincea zi de călduri. Proprietarul
a optat pentru această variantă datorită distan ței, timpului necesar și a stresului de transport.
La frotiu cito-vaginal s-au observat celule epiteliale vaginale din straturile superficial și
intermediar, fiind complet cornificate și fără nucleu vizibil.
Examenul ecografic a relevat aspect fiziologice normale ale aparatului genital.
Nivelul de progesteron: 10 ng/ml(31 .84 nmoli/l) .
Insemi narea s-a realizat în a noua zi a ciclului de călduri, când nivelul progesteronului
plasmatic a atins valoarea de 10ng /ml(31.84nmoli/l).

Cazul numărul 4

Femelă din rasa Saint Bernard cu părul lung, în v ârstă de 4 ani și o masă corporală de 70
kg, având o stare de între ținere foarte bună si clinic sănătoasă . Proprietarul a optat pentru această
opțiune, deoarece femela a avut antecedente de resorb ție fetală la montele anterioare , din cauza
unei insuficien țe luteale .

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

22
La examinarea f rotiu lui vaginal s-au obervat celule complet cornificate , cu nucleu sau
fără nucleu picnotic, rezultând că femela este în estrus.
Examenul ecografic a relevat aspecte fiziologice normale ale aparatului genital.
Nivelul de progesteron: 7 ng/ml(22.29nmoli/l).
Insemi narea s-a realizat în a opta zi a ciclului de călduri, când nivelul p rogesteronului
plasmatic a atins valoarea de 7ng/ml (22.29nmoli/l).

Cazul numărul 5

Femelă din rasa Dobermann de culoare neagră cu pete de foc , în vârstă de 5 ani și o masă
corporală de 37 kg , având o stare de între ținere foarte bună si clinic sănătoasă. Proprietarul a
optat pentru această variantă datorită distan ței, timpului necesar și a stresului de transport.
După relizarea f rotiu lui vaginal s-au observat aspectele fiziologie ale ciclul estral, celule
epiteliale din straturile superficial respectiv intermediar, procentul de cheratinizare fiind de
>90%. Tratamentul local sau sistemic nu a fost necesar, încărcătura microbiană fiind fiziologică.
Ecografie a relevat aspecte fiziologice ale aparatului genital (foliculi).
Nivelul de progesterone: 27 ng/ml (85. 98 nmoli/l).
Insemi narea s-a realizat în a cincispreze cea zi a ciclului de călduri, câ nd nivelul
progesteronului plasmatic a atins valoare de 27 ng/ml (85.98 nmoli/l).

4.1. Examinarea materialului seminal după decongelare

Cel mai frecvent test realizat după decongelare este reprezentat de evaluarea mobilită ții
spermatozoizilor. Din păcate, mobilitatea, pe lângă faptul că reprezintă o caracteristică destul de
subiectivă a calită ții, nu reprezintă o garan ție a fertilită ții.
La 8 secunde după imersia în apă cu temperatură de 70°C , materialul seminal decongelat
este gata pentru inocularea în coarnele uterine ale femelei. Înainte de începerea interven ției, o
parte din cantitatea rămasă, se examinează la microscop între lamă (curată, uscată și preîncălzită
pentru a nu produce un șoc termic spermatozoizilor) și lamelă. În urma examinării cu obiectivul
de 40x se observă o densitate mare a spermatozoizilor, mobilitate crescută și lipsa anomaliilor
(fig 4. 1.).
Se poate concluziona că materialul seminal a fost colectat, congelat și adus din nou la
tempetura de utilizare în condi țiile cele mai bune și fără a afecta calitatea sa.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

23
După 30 de mi nute din cauza căldurii produse de becul microscopului spermatozoizii de
pe lamă se epuizează mai repede decât în mod normal (fig 4. 2.).

Fig. 4. 1. – Material s eminal examinat cu obiectiv de 40x înainte de insemi nare

Fig. 4 .2. – Material seminal examinat cu obiectiv de 40x la microscopul electronic
la 30 de minute după examinarea ini țială prezintă spermatozoizi aglutina ți

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

24
Cazul num ărul 1
Mascul este rezident in Australia, în vârstă de 3 ani și este de ținător al recordului “All
Time” al curselor pe distan ța de 500 de metri.
Materialul seminal utilizat a fost supus conservării prin congelare cu metoda Clone și s-a
folosit granule cu o concentra ție de 150 spermatozoizi/doza și mobilitate totală de 85 % din care
mobilitatea progresivă a fost de 54%.

Cazul numărul 2

Materialul seminal provine de la un mascul rasa Golden Retriever în vârstă de 4 ani,
rezident in Spania.
Materialul seminal utilizat a fost supus conservării prin congelare cu metoda Clone și s-a
folosit granule cu o concentra ție de 150 milioane de spermatoz oizi/doza și o mobilitate totală de
98% din care mobilitatea progresivă a fost de 49 .84 %. Evaluarea mater ialului seminal a fost
realizată prin sistemul CASA la disciplină de Reproduc ție, FMV Cluj -Napoca.

Cazul numărul 3

Materialul seminal provine de la un mascul rasa Saint Bernard în vârstă de 3 ani ,
rezident î n Norvegia .
Materialul seminal utilizat a fost supus conservării prin congelare cu metoda Clone și s-a
folosit granule cu o concentra ție de 150 milioane de spermatozoizi/doză și o mobilitate totală de
66% din care mobilitatea progresivă a fost de 48%.

Cazul numărul 4

Materialul seminal provine de la un mascul rasa Saint Bernard în vârstă de 8 ani ,
rezident î n Norvegia .
Materialul seminal utilizat a fost supus conservării prin congelare cu metoda Clone și s-a
folosit granule cu o concentra ție de 150 milioane de spermatozoizi/doză și o mobilitate totală
de 56% din care mobilitatea progresivă a fost de 38%.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

25
Cazul numărul 5

Materialul seminal provine de la un mascul rasa Dobermann în vârstă de 3.5 ani, rezident
în Olanda .
Materialul seminal utilizat a fost supus conservării prin congelare cu metoda Clone și s-a
folosit paiete cu o concentra ție de 150 milioane spermatozoizi/doză și mobilitate totală de 66 %
din care mobilitatea progresivă a fost de 43% .

4.2 Considera ții practice privind conservarea materialului seminal

Congelarea spermei este o metodă de conservare a spermatozoizilor, teoretic pentru un
timp nelimitat. Metoda congelării joacă un rol important în conservarea diversită ții genetice a
speciilor a diferitelor rase canine și a reproduc ției asistate. Principiul crioconservării a
materialului seminal este reducerea temperaturii spermatozoizilor produc ând astfel o reducere a
activită ții metabolice a spermatozoizilor care permite stocarea acestora.
Nenumerate metode de congelare au fost descrise în literatură în ultimii 30 de ani. Unele
metode sunt mărci înregistrate (patentate), care necesită cumpărarea francizei pentru a putea fi
utilizat. Agen țiile de proprietate de țin următoarele metode: Canine Cryobank, CLONE,
International Canine Semen Bank (ICSB) și Synbiotics. Celelalte sisteme cu protocoale publicate
sunt: extenderul Norvegian Tris, sistemul1 și 2 Uppsala -Equex și modificările acestora,
extenderul CERREC și extenderul CERCA; extenderul a fost dezvoltat de către England C.G.W.
și Lofstedt R. (Concannon and Battista 1989; England 1993; Farstad 1996; LindeForsberg et al.
1995; Peña and Linde -Forsber g 2000 a, b) și alte extendere și metode de crioprezervare.
Materialul seminal congelat primit este transportat într -un rezervor Dry Shipper (fig. 4.3.)
care de obicei nu con ține azot lichid măsurabil. Rezervorul a fost încărcat cu azot lichid și ar
trebui să țină temperatura azotului lichid ( -196 ° C) timp de câteva zile. Acest transportator (fig.
4.3.) are un canistru, în care au fost plasate atât mediul de decongelare, cât și materialul seminal
congelat. De obicei, un mediu de dezghe ț va înso ți fiecare flacon de material seminal congelat.
Mediul de decongelare a fost a șezat pe o trestie de aluminiu, iar materialul seminal congelat a
fost plasat pe o trestie de aluminiu.
Când sose ște pachetul, rezervorul trebuie verificat pentru vapori prin scoaterea capa cului/
dopului de gât trăgându -l direct din rezervor. Când se procedează astfel, vaporii trebuie văzu ți în
gâtul rezervorului. Aceasta indică faptul că con ținutul este încă înghe țat. În acest moment,

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

26
rezervorul de transport trebuie fie umplut cu azot lichi d, fie materialul seminal și de dezghe ț să
fie îndepărtat și plasat într -un rezervor de stocare a materialului seminal.
Atunci când transfera ți materialul seminal din rezervorul de transport către rezervorul de
stocare, proceda ți astfel foarte repede, deoa rece flacoanele de material seminal pot con ține un
azot lichid care ar putea provoca ruperea acestuia dacă este lăsat afară din azotul lichid.
Când se pregăte ște să se dezghe țe sperma pentru insemi nare, scoate ți un flacon de mediu
de decongelare de pe band a de aluminiu și lasă să se dezghe țe la temperatura camerei. Șterge ți
flaconul uscat și turna ți con ținutul într -unul dintre pungile de dezghe țare Whirl -Pak care îl
însoțesc. Pune ți punga într -o baie de apă 70 -80 ˚C timp de cel pu țin 2 minute înainte de a prelua
materialul seminal congelat.
Materialul seminal congelat se află într -un flacon cu capac cu șurub. Dacă în fiolă există
azot lichid, trebuie să păstra ți flaconul în azot lichid până când acesta este deschis. Flaconul
poate exploda dacă este scos din azot lichid înainte de deschidere.
Desface ți flaconul din trestie. Dacă observa ți lichid în flacon sau dacă auzi ți un sunet
puternic, în flacon există încă azot lichid. Țineți flaconul deschis în aer până când tot lichidul se
evaporă, apoi răsturna ți rapid flaconul în punga de decongelare, astfel încât materialul seminal
granulat să cadă în mediul încălzit. Se pune rapid în baia de apă și se masează punga de dezghe ț
până când toate paietel e se dizolvă.
Fig. 4.3. – Dry Shipper și canistrul de transpo rtul
(Sursa : http://www.majesticgaits.com/mve.htm )

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

27

4.3 Tehnica insemi nării artificiale prin metoda chirurgicală

Femela este pregătită pentru interven ției se pune cateter venos la membrul anterior drept;
se tunde și se rade abdominal pe linia alba (fig.4. 4.) unde va avea loc incizia și se administrează
Diazepam i.v. (doza pentru Diazepam este de 0 .4 mg/kg de masă corporală); la 1 minut după
Diazepam se administrează Ketamină i.v. (doza pentru Ketamină este de 10 mg/kg masă
corporală). După ce femela a adormit se trece la a sepsia și antisepsia locului de incizie ( fig. 4. 5.).
După instalarea anesteziei femela este conten țonată pe masa de opera ție, imobilizată în
poziție ventro -dorsală, cu expunerea regiunii mezo – și hipogastrice. Se administrează 10
ml/kgc/oră solu ție perfuzabilă de NaCl 0,9% pentru a hidrata pe tot parcursul interven ției
chirurgicale.
În func ție de greutatea și diferen țele de metab olizare s -a suplimentat doza ini țială de
Ketamină corespunzător la toate cazurile.
Se efectuează o incizie pe linia albă de aproximativ 6 -10 centimetri între pubis și ombilic,
în func ție de talia animalului . Chirurgul folose ște o seringă sterilă pentru a aspira materialul
seminal din paietă sau din tubul cu granule. Coarnele uterine sunt aduse în plaga operatorie (fig.
4.5.) și în fiecare corn uterin, cu ajutorul unei branule de 24 G înclinată la 45° introducem
materialul seminal ales (fig. 4 .6.). În tot a cest timp un ajutor, prin taxis digital, obstruc ționează
partea distală a cornului for țând progresia materialului spre oviduct (fig.4.7.) . Cantitatea de
material seminal administrat diferă în func ție de talia femelei, astfel la cele de talie mare se
introduce până la 3 ml, la cele de talie medie între 1.2 – 1.5 ml, iar la cele de talie mică între 0.75
– 1.2 ml. După introducerea materialului seminal, se efectuează un u șor masaj dinspre locul
inoculării spre oviduct, pentru a f avoriza înaintarea mat erialului (fig. 4 .8.). Locul de punc ție se
tampone ază până la oprirea sângerării și uterul este repus în pozi ția ini țială (fig. 4. 9.). Procedura
se încheie prin sutura planurilor incizate (fig.4. 10.).
Managementul algic s -a realizat prin administrarea de Novasul (doza in mg/kgc), iar antibio –
terapia necesară preventiei complicatiilor septice post -operatorii cu Synulox (doza in mg/kgc).

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

28

Cazul numărul 5

Fig. 4. 4. – Plagă operatorie pregătită prin tundere și antisepsie pentru interven ție

Fig. 4. 5. – Coarnele uterine aduse în plaga operatorie

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

29

Fig. 4. 6. – Histero -centeză într -un unghi de 45°

Fig. 4 .7. – Introducerea materialului seminal în timp ce un ajutor face taxis digital ,
prin obstruc ționearea lumenul cornului uterin în partea ce duce spre uter

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

30

Fig. 4. 8. – Masaj u șor dinspre locul inoculării spre oviduct pentru favorizarea
înaintării a materialului seminal

Fig 4.9. – Repunerea uterului în pozi ția ini țială

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

31

Fig. 4.10. – Sutura planurilor incizate

Cazul numărul 3

Fig. 4.4. – Plagă operatorie pregătită prin tundere și antisepsie pentru interven ție

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

32

Fig. 4.5. – Coarnele uterine aduse în plaga operatorie

Fig. 4.6. – Histero -centeză într -un unghi de 45°

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

33

Fig. 4.7. – Introducerea materialului seminal în timp ce un ajutor face taxis digital ,
prin obstruc ționearea lumenul cornului uterin în partea ce duce spre uter

Fig. 4.8. – Masaj u șor dinspre locul inoculării spre oviduct pentru favorizarea
înaintării a materialului seminal

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

34

Fig 4.9. – Repunerea uterului în pozi ția ini țială

Fig. 4.10. – Sutura planurilor incizate

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

35
Capitolul 5
REZULTATE ȘI DISCU ȚII

Cazul numărul 1

Femela, din rasa Ogar Englez , s-a prezentat la 24 de zile după data insemi nării la examen
ecografic. În urma examenului ecografic s -a confirmat diagnosticul de gesta ție, observându -se un
număr aproximativ de 10 -11 pui (fig.5 .1. ).
La 62 zile de la insemi nare, femela a născut natural un număr de 11 pui viabili (fig.5 .2.)
.

Fig. 5.1. – Confirmarea gesta ției

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

36

Fig. 5.2. – Femela cu puii

Cazul numărul 2

Femela , din rasa Golden Retriever , s-a prezentat la 7 zile după insemi nare cu scurgeri
sero-vaginale de la nivel ul vaginal (fig.5.3.) și având nivelul de progesteron seric de 14.07 ng/ml
(44.83 nmoli/l). Din cauza nivelului de progesteron scăzut, care indică o insuficien ță luteinică, s –
a administrat o terapie de substitu ție cu Utrogestan în doză de 200 mg/12 h, intravaginal, până în
ziua 24.
La controlul ecografic de 24 de zile după insemi nare s -a observat mortalitate fetală
parțială (fig.5.4.) , diagnosticul fiind de Single Puppy Syndrom. Proprietarul s -a decis pentru
inducerea avortului cu PGF ₂α.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

37

Fig. 5.3. – Scur gere sero -vaginală Fig. 5.4. – Mortalitate fetală par țială

Cazul numărul 3

Femela, din rasa Saint Bernard cu părul scurt, a avut după 17 zile de la insemi nare nivelul
de progesteron de 55.5 ng/ml(176.75nmoli/l), fiind o valoare normal pentru sus ținerea gesta ției.
La controlul ecografic de 24 zile după insemi nare s -a observat un început de resorb ție
fetală, datorat probabil diureticului (Furosemid) administrat până aproape de ziua insemi nării. S-
a constatat că administrarea de Furosemid este contraindicat animalelor gestante și conform
testărilor făcute în acest sens duce la anomalii fetale și resorb ție fetală .

Cazul numărul 4

Femela, din rasa Saint Bernard cu părul lung, a avut după 17 zile de la insemi nare nivelul
de progesteron de 23.5 ng/ml(74.84nmoli/l). Această valoare se află în limita inferioară,
provocată probabil de o insuficien ță luteală, și se recomandă terapie prin administrare de
progesteron.
La controlul ecografic de 24 zile după insemi nare s -a observat că uterul este gol.
Proprietarul ne -a comunicat prezen ța căldurilor prelungite, care sus ține în c ontinuare ipoteza
nivelului scăzut de progesteron fapt pentru care gesta ția a fost întreruptă.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

38

Cazul numărul 5

Femela, din rasa Dobermann, s-a prezentat la 24 de zile după d ata insemi nării la examen
ecografic. În urma controlului ecografic s -a constatat că femela este gestantă, avâ nd un număr
aproximativ de 3 pui .
La 62 zile de la insemi nare, femela a născut natural un număr de 3 pui, to ți sănăto și.
Fiecare caz este prezentat succinct în Tabelul 5.1. Putem concluziona că dintr -un lot de 5
femele 60% au rămas ge stante și numai 40% au dus gesta ția la un bun sfâr șit.

Tabel 5.1.
Rezultatele în urma procedurii și caracteristicile fiecărui caz
Nr.
caz Rasa Vârsta
(ani) Mascul
(ani/loca ție) Tipul
materialului
seminal Mobilitate
spermatozoizilor
(%) Control
ecografic Nr. de produ și
fătați/viabili
1 Ogar
englez 5 3 / Australia Congelat
(granule) 85 Gesta ție
confirmată
(pui) 11 11
2 Golden
Retriever 5 4 / Spania Congelat
(granule) 98 Mortalitate
fetală
parțială 1 0
3 Saint
Bernard
(păr scurt) 2.5 3 / Norvegia Congelat
(granule) 38 Resorb ție
fetală – –
4 Saint
Bernard
(păr lung) 4 8 / Norvegia Congelat
(granule) 56 Lipsa
gesta ției – –
5 Dobermann 5 3.5 /
Olanda Congelat
(paiete) 66 Gesta ție
confirmată
(pui) 3 3

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

39

Procesul de înghe țare-dezghe țare reduce în mod semnificativ durata de via ță a
spermatozoizilor la nivel uterin în compara ție cu materialul seminal proaspăt sau refrige rat.
Numărul de spermatozoizi este mai scăzut, 100 de milioane de spermatozoizi mo bili după
procesul de înghe țare-dezghe țare, co mparativ cu 400 -2000 de milioane de spermatozoizi într -o
împerechere naturală. Di n aceste motive este recomandat depunerea materialului seminal
decongelat direct în uter pentru a maximaliza șansele de gesta ție și pentru a cre ște numărul
produ șilor.
Volumul ui spermatic care p ătrunde în uter nu este cunoscut cu exactitate deoarece
cantitate a de ejaculare nu este constant ă. O parte din el refuleaz ă iar cealalt ă poate ajunge în
peritoneu prin ostium abdominale tubae.
Este recomandat ă depunerea materialului semi nal în uter în func ție de talia femelei astfel
încât: la talia mic ă între 0.75 – 1.2 ml, la talia medie între 1.2 – 1.5 ml și la talia mare până la 3 ml.
În cazul în care materialul seminal utilizat prezint ă o concentra ție scăzut ă sau o motilitate slabă
după dezghe țare sunt necesare mai multe paie te de 0.5 ml pentru a insemina 100 -200×10⁶
spermatozoizi normali . Se poate centrifuga proba pentru a cre ște concentra ția prin scăderea
volumului. Dacă volumul uterului este dep ășit de materialul seminal , acesta se revarsă în vagin
și este irosit.
Bazându -ne pe studii experimentale p utem afirma c ă rata sarcinii , care a fost raportat ă
după inseminarea artificială chirurgicală , este de aproximativ 60%. Aceast ă metod ă este
susținută de unii cercet ători, însă alții o consider ă neetic ă și stresant ă pentru că țea. Dezavantajele
întâlnite în aceast ă procedur ă sunt: num ărul limitat de insem inări artificiale care pot fi efectuate,
infec țiile asociate acesteia și costul ridicat .
Ori de câte ori este posibil, materialul seminal congelat este preferat datorită unei rate
mai bune de concep ție și a unui cost total mai mic. Rata s uccesul ui material ului seminal congelat
depinde de trei lucruri : de calitatea acestuia , de momentul insemi nării și de fertilita tea femelei .
Din 1994 până în 2003, un număr total de 526 de femele din 99 de rase diferite au fost
insemi nate artificial în 685 de cicluri de estrus cu spermă congelată și decongelată intern (n =
353) sau importată (n = 332) de la 368 masculi. Rata totală de fătare a fost de 73 .1%, cea după
insemi narea intrauterin ă fiind 75.0% (n = 665) , iar cea după insemi narea intravaginală de 10 .0%.
Insemi narea la momentul optim a avut o rată mai mare de f ătare (78%) și o dimensiune mai mare
a fătului. La insemi nările efectuate tardiv acesta a fost de 55.7% (n = 61). Două insemi nări
consecutive au condus la o rată cresc ută de parturi ție și un num ăr mai ridicat de fetu și (78.1%)
față de o insemi nare (70.5%) . În cazul insemi nărilor efectuate la momentul optim rata de fătare

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

40
nu a fost semnificativ diferită față de femele le care au fost insemi nate de două ori (79 .3%).
Materialul seminal clasificat ca fiind de slabă calitate (motilitate progresivă <50% sau
spermatozoizi anormali > 20%) a condus la o rată d e concep ție mai mi că de 61% fa ță de
materialul seminal clasificat ca fiind de bună calitate (motilitate progresivă >50% sau
spermatozoizi anormali < 20%) care a vând o rată de concep ție de 77%. Ra sele mici (n = 50) au
avut un num ăr mai sc ăzut de fetu și (3.9 +/ – 0.3), decât rasele medii (n=94 , 5.7 +/ – 0.3) și decât
rasele mari (n=62) care au avut (6.1 +/- 0.5). Câinii de peste 6 ani a u avut o rată mai mică de
concepție (68.2%) decât cei mai tineri (77 .0%). Durata sarcinii a fost mai lungă pentru femele cu
mai pu țin de 3 pui (61.7 +/ – 0.4 zile, n = 30) decât pentru cele cu mai mult de 3 pui (60.5 +/- 0.1
zile, n = 177).
Aceste rezultate arată un potențial ridicat de insemi nare intrauterină la cățele. Rezultatele
obținute prin metoda insemi nării artificiale chirurgicale s-au bazat pe insemi narea că țelelor cu
vârsta sub 6 ani în a doua și a treia zi după ovula ție cu material seminal congelat de bună calitate
provenit de la masculi cu vârsta sub 8 ani.

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

41

Capitolul 6
CONCLUZII ȘI RECOMANDĂRI

 Metoda chirurgicală are ca și principal avantaj dep unerea strict intra uterină a materialului
seminal, fapt obligatoriu deoarece după decon gelare spermatozoizii î și pierd capacitatea
de a depă și colul uterin ( sperm -selector -ul cervical );

 La aceast ă metodă este necesară monitorizarea atentă a fenomenului de ovula ție, prin
dozarea a progesteronului din ser și/sau LH -ului, deoarece tehnica implică o singură
inoculare de material seminal. În cazul materialului seminal conservat prin congelare
spermatozo izii î și men țin capacitatea fecundantă aproximativ 9 ore după depunerea în
căile genitale ale femelei;

 Dezavantajele despre care putem discuta la acestă metodă ar fi : riscul anestezic, timpul
de recuperare al animalului in urma interven ției, metodă strict invazivă si costul ridicat al
acestei interven ții;

 Această metodă de insemi nare artificială nu influen țează parturi ția, aceasta put ând fi una
fiziologică naturală ;

 În urma studiului efectuat pe cele 5 femele din rase diferite , care au fost insemi nate prin
metoda chirurgicală, 3 au rămas gestante , reprezentând un procent de 6 0%; iar dintre
acestea doar 2 femele au fătat că ței viabili, adică 66%, respectiv 40% din numărul total
de cazuri luate în studiu .

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

42
BIBLIOGRAFIE

1. Bunagura J.D, Twedt D.C, 2009 , Kirk’s Current Veterinary Therapy XIV by Saunders, an
imprint of Else vier Inc.ISBN 978 -0-7216 -9497 -9, pa g 977 -979
2. Concannon, P.W., Battista, M. , 1989 , Canine semen freezing and artificial inseminations. In:
Kirk RW (ed). Current Veterina ry Therapy X: Small Animal Practic e. Philadelphia, WB
Saunders, pag 1247 -1259
3. England, G.C.W., Allen, W.E. , 1992 , Factors affecting the viability of canine spermatozoa. II.
Effects of seminal plasma and blo od. Theriogenology 37, pag 373 -381
4. Groza Ioan (co ordonator), 2006 , Ginecologie, Andrologie și Obstetrică Veterinară –
Compendiu, Ed. Academiei Române Bucure ști
5. Igna, V., 2007 , Sperm preservation, pag 265-278. In: Canine reproduction, obstetrics and
gynecology (in Romanian). Ed. Brumar, Timi șoara; Roman ia
6. Kustritz Margaret V.R. , 2003 , Small Animal Theriogenology ISBN 0 -7506 -7408 -3, pag 35-35
7. Linde -Forsberg, C., 2005 , Artificial insemination. Proc. ESAVS -EVSSA R-ENVN Congress,
Nantes, France
8. Merck’s Veterinary Manual, 10th Edition , 2014 , Ed. Callisto (t ranslated in Romanian) , pag
1485,1959 -1960
9. Neagu Vasile Radu, 2011 , Cercetări privind prelevarea, prelucrarea și crioconservarea
materialului seminal canin, pag 53
10. Olar, T.T., 1984 , Cryopreservation of dog spermatozoa. PhD thesis. Fort Collins, Colorado
State University, USA
11. Peña, A.I., Linde -Forsberg, C., 2000b , Effects of Equex, one – or two – steps dilution, and two
freezing and thawing rates on post -thaw survival of d og spermatozoa. Theriogenology, 53, pag
859- 875
12. Richard W.Nelson, Guillermo C. Couto, Small Animal Internal Medicine, 5th Edition
Elsevier Health Sciences, 15 feb. 2014 , Part VIII, Reproductive System Disorders , pag 900-902
13. Robert Bowen, 1998 , Vaginal Cytology: Introduction and Index
14. Robert Bowen, 2003 , Collection and Evaluation o f Semen: Introduction and Index
15. Rota, A., Ström, B., Linde -Forsberg, C., 1995 , Effects of seminal plasma and three different
extenders on canine semen stored at 4˚ C. Theriogenology, 44, pag 885 -900
16. Rota, A., Linde -Forsberg, C., Vannozzi, I., Romagno li, S., Rodriguez -Martinez, H., 1998 ,
Cryosurvival of dog spermatozoa at different glycerol concentrations and freezing/thawing rates.
Reproduction in Domestic Animals , 33, pag 355 -361
17. Scarlette Gotwals, 2001 , Timing the fertile period of the bitch: Brief revie w. Canine
Reproduction Seminar
18. Seager S.W.J., 1969 , Successful pregnancies utilizin g frozen dog semen. A.I. Digest, 17, pag 6 –
7
19. Sirivaidyapong, S., Ursem, P., Bevers, M.M., Colenbrander, B., 2001 , Effect of prostatic
fluid on motility, viability and acroso me integrity of chilled and frozen -thawed dog spermatozoa.
Journal of Reproduction and Fertility, Suppl 57, pag 383-386

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

43
20. Thomassen R., Farstad W., Krogenaes A., Fougner J.A., Berg K.A., 2001 , Artificial
insemination with frozen semen in dogs: a retrospecti ve study. J. Reprod. Fertil. (Suppl) , 57, pag
341-6
21. Valeria Rickard, 2011 , The Informed Breeder: Semen Collection and Packaging for Chilled
Semen Shipment
22. Verstegen, J.P., K. Onclin, L.D.M. Silva and P.W. Concannon, 1999 , Effect of stage of
anoestrus on th e induction of estrus by the dopamine agonist cabergol ine in dogs,
Theriogenology, 51, pag 597-611
23. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift, 2011 , Preservation and shipment of chilled and
cryopreserved dog semen, pag 250
24. William C. Truesdale, July 2011 , Artific ial Insemination Handout, ICSB -MA

Noémi – Blanka Benedek Inseminarea artificială prin metoda chirurgicală
cu material seminal congelat la cățea

44

Declarație olografă pe proprie răspundere, privind originalitatea lucrării
și respectarea drepturilor de autor

Subsemnatul/Subsemnata…………….…………………………, student(ă) la
Universitatea de Stiințe Agricole si Medicină Veterinară Cluj -Napoca,
Facultatea………………………………………, Specializarea….………………………………………
declar pe propria răspundere, cunoscând prevederile art. 292 Cod Penal, privind falsul în
declarații, că lucrarea de licență cu
titlul………………………… ……………………………………………………………………………………………..
………………………………………………………………………………………………………
………………………………………………………………………………………………………………………. ……
…………….……………………………………………………………………………nu este un
plagiat, fiind rezultatul cercetărilor p roprii efectuate în acest sens.
Lucrarea este elaborată de mine si nu a mai fost prezentată niciodată la o altă facultate
sau instituție de învățământ sup erior din țară sau străinătate.
De asemenea, declar că toate sursele bibliografice utilizate, inclusiv cele consultate pe
Internet sau din jurnale elctronice, sunt menționate detaliat în lista bibliografică, cu respectarea
regulilor de evitare a plagiatulu i, respectiv:
− toate fragmentele de text reproduse exact, chiar si în traducere proprie din altă limbă,
sunt scrise între ghilimele si dețin referința precisă a sursei;
− reformularea în cuvinte proprii a textelor scrise de către alți autori este menționa tă cu
referința precisă în textul lucrării;
− rezumarea ideilor altor autori este specificată cu referința precisă la textul original al
articolului sau manualului consultat.
Prin prezenta Declarație confirm că am luat la cunostință faptul că, în cazul în care se va
dovedi cu probe concrete că lucrarea a fost plagiată, voi fi exmatriculat(ă) din examenul de
diplomă/licență.

Cluj -Napoca Absolvent ,
Data……………………