Dintre toate maladiile cunoscute în prezent, cancerul este cel care îi înspăimântă cel mai mult pe oameni. În multe cazuri insă, diagnosticarea… [305446]

[anonimizat]. [anonimizat].

Cancerul nu este o boală noua. Au fost descoperite dovezi despre cancere osoase in remanturi preistorice. [anonimizat] (India, Babilonia, Grecia). Hipocrate , [anonimizat] a introdus termenul de Karkinos de unde derivă termenul actual de carcinom. Termenul de NEOPLAZIE (Neoplasm), [anonimizat] a [anonimizat] (nou) și plasma (formare). [anonimizat], cu toate acestea nu există la ora actuală o definiție complet satisfăcătoare a neoplaziei . Oncologul Britanic R.A. Willis , definește neoplazia drept o *masa anormală de țesut a [anonimizat] a generat modificarea*(1)

[anonimizat], ereditate, [anonimizat], [anonimizat], [anonimizat], haotice.

In 2012 au fost depistate peste 14 [anonimizat]. [anonimizat], colorectale, pulmonare și cervicale la femei. Rata de creștere a cancerului este legată de creșterea longevității și a [anonimizat]-sociale și financiare imense.

Tratamentul curativ al cancerului se bazează în primul rând pe diagnosticarea corectă a bolii. [anonimizat], cu examinarea microscopică a țesutului afectat. Acest tip de examinare se poate realiza in urma unei biopsii sau unei intervenții chirurgicale și depinde în mare măsură de calitatea procesării realizate de asistentul de anatomie patologică. [anonimizat].

PARTEA GENERALĂ

I Anatomie-Patologică – Definiție și scurt istoric

Anatomia Patologică este o [anonimizat], prin studiul modificărilor de formă cauzate de o anumită stare patologică. [anonimizat], la care se pot asocia și alte metode in funcție de disponibilitate ([anonimizat], [anonimizat],cito-genetică)

Primele date privitoare la anatomia patologică din literatura medicală românească se regăsesc în regulamentul Eforiei Spitalelor Civile din București (1832). Aici se prevăd condițiile ce trebuie îndeplinite pentru efectuarea necropsiilor ([anonimizat], autopsiile erau interzise).
 
[anonimizat] 1857 sub președinția doctorului Nicolae Kretzulescu, secretar fiind Carol Davila, se menționează numeroase prezentări de cazuri clinice cu piese chirurgicale sau necroptice, vădindu-se, prin aceasta, încă de pe atunci, orientarea anatomo-clinică a învățământului nostrum medical.
 
Cu toate acestea, în raport cu preocupările de medicină internă și chirurgie, anatomo-patologia (ca toate celelalte științe morfologice) s-a dezvoltat mai încet. Disecțiile pentru anatomia descriptivă, ca și necropsiile de spital, se făceau pe atunci în pavilionul mortuar de la Spitalul Colțea. Această activitate se continuă la școala Națională de Medicina și Farmacie, organizată de Carol Davila în 1857. In programa analitică a cursului de chimie (predat de C. Davila) se prevăd, în ceea ce privește aplicarea metodelor de chimie în medicina legală și în probleme de igienă, conferințele asupra diagnosticului anatomo-patologic. Specialiștii în anatomia patologică se întâlneau greu, după cum reiese din anunțul pe care îl găsim în Monitorul Medical nr. 36 din 21 noiembrie 1863:

“La școala de medicină se cere un doctor în medicină care posedă cunoștințe mai speciale asupra anatomiei patologice și aplicații microscopice. De aceea cu onoare sunt rugați aceia dintre d. doctori din Principatele Unite care posedă această specialitate să binevoiască a comunica subsemnatului.”
Semnează Inspectorul General, Directorul Școalei, C. Davila.(2)

Anatomia patologică contemporană, se transformă treptat dintr-o stiință pur descriptivă, intr-una dinamică, prin adoptatrea noilor metode de diagnostic, bazate pe tehnologiile de imunohistochimie si biologie moleculara (3)

Anatomia patologica modernă, prin integrarea tehnicilor de Morfologie Moleculară (IHC, FISH, CISH), acoperă trei domenii clasice – diagnostic, prognostic si selecție terapeutică, devenind o componentă relevantă a medicinei moleculare și mai ales a medicinei personalizate (3)

II Laboratorul de anatomie patologica

Structura si organizare

In Romania majoritatea laboratoarelor de anatomie patologică fac parte din structura spitalelor universitare, județene sau municipale, fiind de fapt servicii sau departamente, integrate in grupul specialitaților paraclinice, alături de laboratorul clinic si serviciile de imagistică.

Procedeele operaționale ale serviciului de anatomie patologică, au la bază un cadru legislativ complex, reprezentat de :

Reglementări internaționale:

SR EN ISO 9001:2008 – Sisteme de management al calității. Cerințe.

SR EN ISO 9000/ 2006 – Sisteme de management al calității. Principii fundamentale și vocabular.

Legislație primară:

Legea nr. 104/2003 privind manipularea cadavrelor umane și prelevarea organelor și țesuturilor de la cadavre în vederea transplantului

Legea nr. 46/2003 –legea drepturilor pacientului.

Legea nr. 459/2001 pentru aprobarea Ordonanței Guvernului nr. 1/2000 privind organizarea activității si funcționarea instituțiilor de medicină legală.

Legea nr. 271/2004 – privind aprobarea Ordonanței Guvernului nr. 57/2001 pentru modificarea și completarea Ordonanței Guvernului nr. 1/2000 privind organizarea activității și funcționarea instituțiilor de medicină legală.

Legislația secundară:

Ordinul nr. 261/2007 -pentru aprobarea normelor tehnice privind curățarea, dezinfecția si sterilizarea in unitățile sanitare.

Ordinul MSP 1226/2012 pentru aprobarea Normelor tehnice privind gestionarea deșeurilor rezultate din activitățile medicale și a Metodologiei de culegere a datelor pentru baza națională de date privind deșeurile rezultate din activitățile medicale

Ordinul MSP 916/2006 privind aprobarea normelor de supraveghere, prevenire si control al infecțiilor nosocomiale in unitățile sanitare.

Alte documente, inclusiv reglementări interne ale entității publice:

Regulamentul intern

Regulamentul de Organizare și Funcționare

PO-01 Elaborarea procedurilor

MC-01 Manualul Calității.

Din punct de vedere structural, serviciile de anatomie patologică sunt organizate compartimental, fiind deservite de personal specializat, reprezentat de medici anatomopatologi (primari, specialisti, rezidenți), biologi, asistenți/tehnicieni de histopatologie, asistenți de prosectură/autopsieri, băiesi, infirmieri, registratori.

Principalele compartimente ale serviciului de anatomie patologică sunt:

Compartimentul de prosectură

Aici se aplică procedeele de manipulare si predare a cadavrelor pacienților decedați in spital. Activitatea principală constă in primirea si inregistrarea decedaților, autopisiere cu recoltarea de probe pentru ex. histopatologic, imbălsamare, igienizare, cosmetizare, eliberare de certificate de deces, imbălsamare si transport, predarea decedaților către aparținători.

Fig. 1 Masa de autopsie

(https://ro.wikipedia.org)

Compartimentul de histopatologie

Este zona in care se desfășoară activitatea principală a serviciului de anatomie patologică, având drept obiectiv diagnosticul histopatologic. Protocolul de lucru, constă în prelucrarea pieselor de anatomo-patologie (biopsii, piese chirurgicale, fragmente tisulare recoltate în timpul autopsiei), cu scopul obținerii de preparate de înaltă calitate, stabile în timp, care urmează să fie examinate la microscop de către medicul anatomo-patolog. Tot aici se pot efectua exemene extemporanee, intraoperatorii, prin procedee de criosecționare si colorare rapidă a produselor recoltate in timpul intervențiilor chirurgicale.

Fig. 2 Microtom Fig. 3 Criotom

(https://ro.wikipedia.org/w/index.php?search=thyroid+tumors)

Compartimentul de citologie

Furnizează servicii de diagnostic pentru materiale citologice (materiale biologice în formă lichidă, cu conținut celular specific): prelevate cervico-vaginale, puncții aspirative cu ac fin din tiroida, sân, plămâni, brosaje bronșice, materiale de puncție din cavitățile naturale ale organismului (pleurale, peritoneale etc.). Prelucrarea în vederea examinării citologie se efectuează în cea mai mare parte prin tehnici de colorare, cea mai uzuală fiind colorația Papanicolau.

Fig. 5 Frotiu Babes Papanicolau (arhivă personală)

Compartimentul de biologie moleculara

Serviciile moderne de anatomie patologică, care au dotarea si personalul specializat in domeniul morfologiei moleculare , pot aplica tehnici de imunohistochimie si hibridizare in situ, cu scopul obținerii de informații diagnostice suplimentare, personalizate pentru fiecare caz in parte, fiind esențiale in diagnosticul diferențial al leziunilor, in obținerea de date prognostice si selecție terapeutică.

Fig. 6 Colorator automat de imunohistochimie

(https://www.ihcworld.com/products/Hestion-IHC-Slide-Stainer.htm)

Fig. 7 Coloratie IHC pentru CD20 (limfocite matureB). Ob. 20x (arhivă personală)

Fig. 8 Coloratie IHC. Expresie intensa nucleara pentru TTF1, intr-un carcinom pulmonar. Ob. 40x(arhivă personală)

Fig. 9. Coloratie IHC. Cancer mamar intens pozitiv la proteina HER-2. Ob. 20x.(arhivă personală)

Rolul asistentului in laboratorul de anatomie patologică

Asistentul sau ”tehnicianul” de anatomie patologică, este o persoană specializată, calificată să-și desfășoare activitatea in cadrul laboratorului de anatomie patologică, fiind responsabil de realizarea unor preparate tehnice de foarte bună calitate, pentru examenul microscopic și elaborarea diagnosticului histopatologic de către medicul anatomo-patolog.

Protocolul de lucru este complex, fiind reprezentat de o serie de etape secvențiale:

Recepționarea materialului biopsic, cu verificarea documentelor de insoțire (fișa de insoțire corect completată, cu toate datele necesare, cu identificarea secției și a datelor de recoltare)

Verificarea materialului biopsic (recipient adecvat, fixare corectă, calitatea produsului)

Înregistrarea piesei in registrul de recepție cu mențiunile necesare și semnătura de predare /primire.

Asigurarea unei fixări de bună calitate a piesei .Fixarea este esențială in prelucrarea histopatologică a piesei (3)

Participa alături de medicul anatomopatolog la prelevarea pieselor cu respectarea protocoalelor specialitații

Acordarea de număr sau numere la caz, in funcție de protocol și de dimensiunea preparatului.

Asigură procesarea, includerea la parafină, secționarea la microtom, deparafinarea, colorarea și montarea lamelor obținute.

Asigură tehnici de colorare specială (de ex. punerea in evidență a amiloidului)

Prezintă medicului anatomopatolog produsul finit in vederea examenului histopatologic.

Înregistrează rezultatul histopatologic elaborat de medic.

Asigură arhivarea fragmentelor incluse in blocuri de parafina și a lamelor histopatologice pentru o perioadă de 30, respectiv 10 ani (4).

Clasează și arhivează buletinele histopatologice.

Asigură secționarea la criotom si colorarea preparatelor in cadrul examenelor extemporanee, intraoperatorii.

Înregistrează și arhivează rezultatul examenelor extemporanee.

Participă la pregătirea și realizarea de tehnici fenotipale cu respectarea protocolului specific serviciului respectiv (IHC, FISH, CISH).

Conceptul de Anatomie Patologică s-a schimbat in ultimile doua decenii, datorită introducerii in practică a noilor tehnologii de biologie moleculara și adoptatrea unor metode noi de diagnostic. Treptat această specialtiate s-a transformat dintr-o stiință pur descriptivă, intr-o stiință dinamică, bazată pe dovezi.(3)

Decizia de implementare a noilor metode, depinde în mare masură de personalul care deservește această specialitate (medici, asistenți, biologi), fiind necesare o serie de etape:

Identificarea resurselor.

Stabilirea raportului cost/eficientă.

Prezenta surselor de informare.

Participarea la programele de pregatire continuă

Realizarea protocoalelor de implementare.

Prezența sistemelor informatizate cu baze de date accesibile.

Prezența de direcții inovatoare în sistemul de sănătate.

Programe de audit în vederea identificării problemelor din sistem.

Diversificarea ofertelor contractuale cu posibilități de negociere.

Inițiativa personanului care deservește laboratorul.

ETAPELE PROCESĂRII

Principalele etape ale procesarii

Procesarea țesuturilor reprezintă procesul prin care fragmentele biopsice și prelevatele suferă transformări de la starea nativă la stadiul în care pot fi prelucrate obținându-se produsul finit – blocul de parafină, din care se vor executa secțiunile fine ce vor fi etalate pe lame.

Etapele procesării

Tabelul 1- Etapele procesării

Etapele imunohistochimice sunt prezentate in tabelul nr.2

Tabelul 2- Etapele imunohistochimice practicate in Spitalul Județean de Urgență Brașov

III Glanda Tiroida

1.Aspect macroscopic si microscopic

Macroscopic, glanda tiroidă, organ nepereche, este localizată in regiunea cervicală anterioară , are forma literei ”H”, fiind alcatuită din doi lobi legați de un istm, care traversează traheea anterioară. Are culoare galben-roz, consistență moale și o greutate de 15-30 g. (mai mare la femei)

Are o capsulă proprie ce trimite prelungiri în interiorul glandei. Ea este învelită într-o dedublare a fasciei cervicale mijlocii, aderentă de trahee, teaca vasculonervoasă în care se află artera carotidă, vena jugulară și nervul vag. Anterior, glanda vine în raport cu mușchii subhioidieni. Între capsula proprie și capsula fibroasă, dependentă a fasciei cervicale mijlocii, se află posterior, glandele paratiroide. Irigația arterială este asigurată de arterele tiroidiene superioară și inferioară; venele se deschid în venele jugulare și trunchiul venos brahiocefalic stâng. Limfaticele merg în ganglionii cervicali profunzi și pretraheali. Inervația este dată de ramuri din nervii laringieni superior și inferior și din cei trei ganglioni simpatici cervicali.(7)

Fig. 10 Desen schematic al glandei tiroide.( http://www.sfatulbatranilor.ro/threads/15470-Despre-tiroid%C4%83)

Microscopic, Glanda tiroidă este formată din structuri foliculare rotunde sau ovoide, care variază în dimensiune, cu o medie de 200 microni.Tapetajul este unistratificat, asigurat de celule foliculare cuboidale sau aplatizate, cu citoplasma palid acidofilă, granulară. În interiorul foliculilor (intraluminal) apare coloid palid sau intens eozinofil, în funcție de vârstă și grad de activitate al glandei (7). Imunohistochimic, epiteliul folicular reacționează la numerosi anticorpi; Tiroglobulina, TTF1 (Factor de transcriptie tiroidian), Citokeratina cu greutate moleculară joasa (CK7, CK18)

Un alt component major al glandei este reprezentat de celulele de tip neuroendocrin, numite”celule C”, cu localizare parafoliculară. Numărul lor este corelat cu vârsta. Sunt mult mai numeroase la copii si bătrâni, decât la adulți. Imunohistochimic, reacționeaza la CromograninaA, NSE (Neuron Specific Enolase) si Calcitonina (7)

Fig. 11 Glanda tiroida, aspect microscopic. Color. H.E. Ob.20x.(arhivă personală)

Fig. 12 Glanda tiroida marcata cu Tiroglobulina. Color IHC Ob. 20x.(arhivă personală)

Fig. 13 Imunoreactivitate pentru celulele C tiroidiene. Coloratie IHC. Ob 20x.(arhivă personală)

2.Tumorile maligne ale glandei tiroide

Cancerul tiroidian este cea mai frecventă tumoră malignă care apare la nivelul sistemului endocrin. Cu toate acestea, reprezintă doar 1-2% din totalul tumorilor maligne la om. Din punctul de vedere al distribuției pe sexe, femeile sunt de 2-3 ori mai afectate decât bărbații de această boală.

Factorii de risc implicati in apariția cancerului tiroidian sunt radiatiile ionizante (accidente nucleare sau iatrogen/terapeutice) și în unele cazuri, susceptibilitate genetică (cancerul medular) (8).

La copii cancerul tiroidian este rar, cu o crestere abruptă a incidenței după vârsta de 20 ani (8).

Din punct de vedere histogenetic neoplasmele tiroidiene pot fi divizate in trei categorii de diferențiere. (7)

Tumori cu diferențiere foliculară.

Tumori cu diferențiere celulară ”C”.

Tumori cu diferențiere mixtă (foliculară și cu celule ”C” (foarte rare)(7)

Dintre acestea , cele mai frecvente (peste 95%) aparțin grupului cu diferențiere foliculară.

Din punct de vedere histopatologic, cancerele tiroidiene , pot fi subdivizate in tumori primare și tumori secundare/metastaze (acestea sunt foarte rare). Marea majoritate a tumorilor primare sunt de origine epitelială, respectiv cu punct de plecare de la nivelul epiteliului folicular (carcinomul papilar si folicular, carcinomul slab diferențiat si anaplazic). Carcinoamele medulare, mai rare au origine in celulele C ale glandei. Tumorile non-epiteliale sunt reprezentate de limfoame si sarcoame cu diferențiere variabilă ( vasculare, mușchi neted sau neurale). (8)

Clasificarea cancerelor tiroidiene (W.H.O.)

Epiteliale de origine foliculară

Carcinomul papilar.

Carcinomul folicular, convențional și oncocitic.

Carcinomul slab diferențiat.

Carcinomul anaplazic (nediferențiat).

Epiteliale de origine celulară ”C”

Carcinomul medular

Epiteliale de origine mixtă

Carcinom mixt medular și folicular.

Carcinom mixt medular și papilar.

Epiteliale de origine diferită sau incertă

Carcinom mucoepidermoid.

Carcinom scuamos.

Carcinom mucinos.

Carcinom cu diferențiere timoca (CASTLE).

Nonepiteliale

Limfoame/plasmocitoame.

Angiosarcom.

Teratom .

Sarcoame de nerv periferic (MPNST).

Metastaze

Prin extensie directă a cancerelor de la organele învecinate (Laringe, trahee esofag)

Pe cale sanguină (melanom, cancere renale, pulmonare sau de origine mamară)

3.Diagnosticul anatomopatologic

Diagnosticul tumorilor tiroidiene se stabilește in serviciile de anatomie patologică pe diferite preparate obținute prin : puncție biopsie, biopsie incizională sau piese operatorii (cel mai frecvent). Metodologia se bazează pe examen macroscopic și prelucrare histopatologică cu includerea preparatelor în blocuri de parafină stabile si obținerea de secțiuni cu colorații standard Hematoxilină – Eozină (H.E.) care sunt examinate microscopic.

Fig. 14. Carcinom papilar tiroidian. Color H.E. Ob. 20x (9)

In unele situații, se impun coloratii speciale- histochimice , necesare in disgnosticul diferențial al subtipului tumoral. (ex. colorație Roșu de Congo pentru amiloid)

Fig. 15. Depozite de amiloid in carcinomul medular tiroidian. Color. Roșu de Congo. Ob. 20x. (9)

Pentru obținerea unui disgnostic personalizat, cu informații prognostice și posibilitatea de selecție terapeutică, sau în cazul diagnosticelor histopatologice incerte, se utilizează tehnici de imunohistochimie, cu scopul fenotipării țesutului tumoral. In acest scop se utilizează anticorpi mono sau policlonali, care pun in evidență țesuturi epiteliale normale și tumorale, celule neoroendocrine sau prezența de țesut limfoid tumoral.

Panelul de anticorpi utilizat in diagnosticul cancerului tiroidian cuprinde un numar de 5-7 anticorpi. La nevoie, acest număr poate fi suplimentat, in funcție de particularitățile cazului (Tabel 3)

Tabel3. Panelul de anticorpi standard, utilizat în diagnosticul cancerului tiroidian

HBME-1 si CK19 identifică țesut tumoral în glanda tiroidă. Color. IHC (8)

PARTEA SPECIALA

SCOPUL SI OBIECTIVELE

Afecțiunile glandei tiroide sunt cele mai frecvente boli ale aparatului endocrin și de aceea trebuie acordată o deosebită atenție conduitei anatomo-patologice al anumitor particularități lezionale.

Factorii ce declanșează tireopatiile, sunt deosebit de variați, de la factori cu influențe de ordin endogen ( factori genetici ) , cât și factori exogeni ( aportul de iod ).

Tumorile glandei tiroide ( gușa , tiroiditele și nodulii tiroidieni) se impart in :

– benigne

– maligne (de ordin primar sau secundar )

Cele 2 clasificări expuse ( clasificarea OMS și clasificarea TNM-2002) sunt deosebit de clar prezentate , fiind utile atât morfopatologilor , cât și chirurgilor , endocrinologilor și oncologilor.

Deși tumorile maligne tiroidiene nu dețin o pondere atât de crescută , punerea unui diagnostic corect din punct de vedere morfopatologic implica efectuarea unor serii de tehnici histopatologice și imunohistochimice de mare finețe.

Am considerat utilă prezentarea unor date statistice referitoare la tumorile tiroidiene furnizate de departamentul de anatomie – patologică a Spitalului Județean de Urgență Brașov pe o perioadă de 5 ani.

Studiul dorește evaluarea completă a tumorilor maligne de tiroida , atât prin metode clasice histopatologice cât și tehnici moderne de Imunohistochimie și extinderea cunoștințelor legate de factorii histopatologici și imunohistochimici.

Obiectivele studiului

Evaluarea apariției bolii în raport cu sexul și vârsta pacienților;

Aplicarea tehnicilor histopatologice care vin in ajutorul elaborării unui diagnostic corect in afecțiunile tiroidiene.

Extinderea cunoștințelor legate de factorii clinici , histopatologici și imunoshistochimici în identificarea tumorilor maligne de tiroidă.

Aplicarea tehnicilor de imunohistochimie prin utilizarea unui panel de anticorpi pentru diagnosticarea tumorilor maligne de tiroidă și stabilirea fenotipală a tumorii.

II. MATERIAL ȘI METODA

TIPUL DE STUDIU

Am efectuat un studiu retrospectiv pe o perioadă de 5 ani, respectiv 01.01.2011 – 31.12.2015, bazându-se pe datele obținute ca urmare a consultării documentelor medicale din arhivele departamentului de anatomie-patologica din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgenta Brașov care se evidențiază în tabelul nr 1.

Tabelul 1.

Pentru efectuarea studiului s-a folosit metoda retrospectivă utilizându-se următoarele baze de date: foi de observație, documente imagistice, literatura de specialitate iar introducerea cazurilor în studiu s-a bazat pe diagnosticul de externare.

Lotul studiat a pus în evidență o diferențiere clară între sexe, majoritatea afecțiunilor tiroidiene fiind descoperite la sexul feminin, după cum este prezentat în tabelul numărul 2.

Tabelul 2.

Din punctul de vedere al grupelor de vârsta , studiul efectuat a pus în evidență următoarele date statistice după cum urmează în tabelul numărul 3.

Tabelul 3.

Pe baza datelor diagnostice furnizate de arhiva departamentului de anatomie patologică s-au înregistrat pe clase de afecțiuni benigne și maligne după cum urmeaza in tabelul numărul 4.

Tabelul 4

Din punctul de vedere al structurii și tipului tumorii , aspecte obținute în urma procedurilor histopatologice s-au obținut următoarele date statistice după cum sunt evidențiate în tabelul numărul 5

Tabelul 5 – Afecțiuni tiroidiene

Ultima coloana din tabelul numărul 5 aparține tipului de tumori maligne care și acestea pot fi clasificate în funcție de profilul tumorii, evidențiat prin analiza microscopică, pe baza tehnicilor histopatologice și fenotiparii prin examene imunohistochimice. Aceste diferențieri din cadrul studiului efectuat vor fi expuse mai departe în tabelul numărul 6.

Tabelul 6 – Tipuri de afecțiuni maligne

PARTICULARITĂȚILE STUDIULUI

Primul obiectiv al studiului a fost evaluarea apariției bolii în funcție de sex și vârsta a pacienților cu afecțiuni tiroidiene.

Studiul a fost efectuat pe lotul de pacienți înregistrați în baza de date a departamentului de anatomie patologică a Spitalului Județean de Urgență Brașov. Introducerea în studiu a fost făcută absolut aleatorie, fiind în ordinea apariției cazurilor în secțiile de chirurgie .

Inițial am analizat structură pe sexe a lotului studiat ce au constituit grupul de studiu prezentat în figură 1.

Figura 1

După cum se observă din reprezentarea grafică persoanele cele mai afectate au fost cele de sex feminin.

Reprezentarea grafică a structurii pe grupe de vârsta a fost realizată în figură 2.

Figura 2

Din reprezentarea grafică a structurii pe grupe de vârstă se evidențiază o creștere a afecțiunilor tiroidiene odată cu înaintarea în vârstă , vârful fiind cuprins în grupa de vârsta 51-60 de ani și o coborâre a diagramei în grupa de vârsta 71-80 de ani.

Din punctul de vedere al clasei tumorale reprezentarea grafică a lotului studiat în cei cinci ani se prezintă precum în figură 3.

Figura 3.

Se observă că din totalul cazurilor incluse în studiu pe parcursul celor 5 ani ponderea cea mai mare o au afecțiunile tumorale cu caracter benign.

Împărțirea pe tipuri de afecțiuni tiroidiene se reprezintă grafic precum în figura 4

Figura 4.

METODA DE LUCRU

Diagnosticul prezumtiv a fost elaborat de medicii specialiști endocrinologi pe baza anamnezei ,datelor clinice , imagistice si a analizelor de laborator , iar diagnosticul cert a fost stabilit in departamentul de anatomie patologică , in urma intervențiilor chirurgicale de tireodectomie totală sau subtotală.

Analizele de laborator furnizează date asupra secreției si concentrației hormonilor tiroidieni. Foliculii tiroidieni produc 2 hormoni : triiodotironina , cunoscută și notată cu T3 , și tetraiodotironina care la rindul ei este cunoscută și notată cu T4. Secreția hormonilor tiroidieni este controlată de un hormon hipofizar și anume TSH ( Thyroid Stimulating Hormon ) și un hormon hipotalamic , fiind vorba de TRH ( Tirotropin Stimulating Hormon). T3 , T4 si TSH-ul actioneaza prin intermediul unor unor receptori specifici .

Un alt hormon sintetizat de tiroidă este calcitonina , care este de fapt un antagonist al parathormonului. Acești doi hormoni secretați de glanda tiroidă funcționează amîndoi pentru a păstra valori normale ale concentrațiilor calciului in ser și in lichidele extracelulare.

Funcția glandei tiroide se poate stabili atât clinic prin evaluarea semnelor și simptomelor de hipotiroidism sau hipertiroidism dar și paraclinic prin testele de funcțtionalitate tiroidiana. Un set minim de analize pentru tiroida constă in dozarea TSH , T4 ( freeT4) si T3 ( freeT3). In sânge hormonii tiroidieni circulă legați de proteine transportoare (99%) si liberi (1%). Întrucât globulina de legare a tiroxinei ( TBG principala proteină de transport a T3 si T4 ) este supusă unor influențe endo- și exogene ( crește in sarcină și dupa administrarea de contracetive orale , scade in sidromul nefrotic antrenând aceleși variatii ale T3 și T4 plasmatic ) , forma libera a hormonilor ( fT3 și fT4) este mai fiabilă decât cea plasmatică. Dintre cei 2 hormoni T3 este sintetizat majoritar , aproximativ 80% in periferie , prin conversie din T4 ( ceea ce insemnă ca T4 reflectă mai mult activitatea secretorie a tiroidei , iar T3 efectul asupra țesuturilor periferice ) .T3 este mai activ decât T4 insă are un timp de injumătațire mai mic.

INTERPRETAREA ANALIZELOR PENTRU TIROIDĂ. VALORI NORMALE , SCĂZUTE ȘI CRESCUTE.

Există un algoritm care se alcătuiește pe baza testelor de funcționalitate tiroidiană, care este prezentat mai jos:

TSH normal , T3 si T4 normale = eutirodism

TSH normal , fT4 crescut = sindrom de rezistență la acțiunea hormonilor tiroidieni.

TSH scăzut , fT4 normal , T3 crescut = tireotoxicoza T3.

TSH scăzut , fT4 crescut = hipertiroidism clinic manifest.

TSH scăzut , fT4 normal = hipertiroidism subclinic.

TSH crecut/normal , fT4 crescut = hipertiroidism hipotalamo-hipofizar.

TSH crescut , fT4 scăzut = hipotiroidism clinic manifest.

TSH crescut , fT4 normal = hipotiroidism subclinic.

TSH scăzut/normal , fT4 scăzut = hipotiroidism hipotalamo-hipofizar.

Valorile normale ale probelor sunt :

TSH = 0,6 – 4,6 mU/L

T4 = 60 – 182 nmol/L

fT4 = 12 – 22 pmol/L

T3 = 1,2 – 3,2 nmol/L

fT3 = 4 – 6,7 pmol/L

In evaluarea afecțiunilor tiroidiene , dozarea TSH și a hormonilor tiroidieni trebuie completată și de testele de autoimunitate tiroidiană ( anticorpi anti-tireoperoxidază ATPO , anticorpi anti-tireoglobulina ATG , și anticorpi anti-receptor pentru TSH = Trab) ecografie tiroidiană , scintigrafie tiroidiană , radioiodocaptare sau puncție-biopsie.

MANAGEMENTUL ANATOMO-PATOLOGIC AL LEZIUNILOR TIROIDIENE

ETAPA PREOPERATORIE

Aceasta etapa cuprinde mai exact examenul citologic , care se execută in urma punției cu ac fin.

Examenul citologic are o deosebită importanța in conduita terapeutică a afecțiunilor tiroidiene prin prisma faptului că se poate realiza diagnosticul diferențial intre tumorile benigne si cele maligne.

Puncția cu ac fin

Este o manevra cu un grad invaziv mai scăzut decât puncția-biopsică și cu o importanță covârșitoare in managementul nodulilor tiroidieni , făcând trierea acestora din punctul de vedere al intervenției chirurgicale de extirpare totală sau parțială , respectiv tireodectomie totală sau subtotală.

O condiție majoră pentru elaborarea unui diagnostic citologic corect și cu un grad inalt de siguranță este colaborarea dintre : endocrinolog , citolog , radiolog. In această colaborare trebuie să existe un schimb de informații cât mai amănunțit privind aspectul morfologic al zonei examinate, statusului funcțional cât și a stării imunologice a bolnavului precum și discutarea aspectelor scintigrafice și ecografice ale țestului examinat , in speță glanda tiroidă.

Punția cu ac fin este recomandată cu prelicție in cazul nodulilor tiroidieni palpabili , care au ca dimensiuni cel puțin 1 cm si deci pot fi depistați in cazul unui consult clinic.

Indicațiile puncției cu ac fin

cresterea bruscă in volum a nodulului.

nodul foarte dur la palpare sau foarte solid la examinarea ecografică.

răgușelă sau paralizie a corzilor vocale.

iradiere prealabilă a zonei gâtului.

Contraindicațiile puncției cu ac fin sunt aproape inexistente ,doar cazuri de pacienți necooperanți sau in cazul unor afecțiuni hematologice cu deficiențe de coagulare. Mai exact există riscul major a unor hemoragii , in cazul pacienților cu deficiențe de coagulare și de aceea este foarte importanta realizarea unei ecografii in urma puncției cu ac fin.

Complicatiile legate de puncția cu ac fin sunt nesemnificative raportat la importanța datelor ce le furnizează această investigație. Printre cele mai frecvente complicatii ar fi :

hemoragii locale , hematoame ( mai rar intâlnite ).

durerea locala dupa puncție.

infecția post-puncțională , in cazul nerespectării măsurilor de asepsie.

Consimțământul informat al pacientului , face parte din actul de etică medicală și nu trebuie niciodată omisă discuția directă cu pacientul care trebuie informat despre importanța actului medical si complicațiile și pericolele la care este expus. Este de preferat ca acest consimțământ să fie semnat de către pacient pentru a avea și o valoare din punct de vedere juridic.

Exista o asociație medicala americana denumită pe scurt AMA , care recomandă ca formularele de consimțământ să fie cât mai complexe care să cuprindă cât mai multe date referitoare la : diagnosticul pacientului , beneficiile intervenției cât și riscurile la care este expus și totodată riscurile refuzului interventiei respective.

Informatii ce trebuie sa insoțească intotdeauna un eșantion , probă de laborator :

nume si prenume pacient , CNP , dată recoltare , unitatea unde s-a recoltat.

diagnosticul prezumtiv

localizarea nodulului impreuna cu date imagistice legate de marimea formatiunii nodulare.

antecedente de hipotiroidite , tiroidite autoimune , boală Basedow Graves.

antecedente de iradieri externe.

antecedente de cancer.

antecedente heredocolaterale de cancer tiroidian

rezultatele analizelor de laboarator efectuate , in special nivelul TSH-ului seric.

tratamente anterioare.

Tehnica puncției cu ac fin

Pentru a obține un preparat cu o importanță deosebită in stabilirea unui diagnostic citologic , manevra trebuie executată de personal calificat si cu destulă experienta atât in palparea nodulilor cât si a efectuării propriuzi-se a puncției tiroidiene.

Punctia cu ac fin se poate realiza prin metoda directă sau prin metoda echoghidată , cea din urmă având o acuratețe net superioară .

Imaginea 1 – Tehnica citopuncției

”Ghid de diagnostic in patologia endocrină” – Angela Borda , Nicole Berger – pag. 199

Metoda directă

Această metodă este specifică nodulilor tiroidieni cu posibiliatea de palpare crescută si se realizează in repaus de deglutiție. Poziția pacientului poate fi in decubit ventral sau decubit dorsal cu gâtul in superextensie , această poziție fiind propice pentru nodulii localizați retrosternal.

Se folosesc ace de seringa de 0,4 mm( 27G), 0,5 mm( 25G ) ,0,6 mm ( 23G ) , acestea fiind putin invazive și in general foarte bine tolerate de pacienți.

Materiale folosite la puncția cu ac fin sunt expuse in imaginile de mai jos.

Imaginea 2 – Ace si pistol pentru puncție

http://www.orvosok.hu/orvosiszotar/biopszia–biopsia-84

Imaginea 3 – Pistol Cameco cu seringă atașată

Aspirációs Citológia

Nodulul se puncționează inițial cu acul liber, după identificare și imobilizare intre doua degete ,ca in imaginea de mai sus , iar mai apoi se atașează pistolul Cameco.

Se aspiră ușor de câteva ori pâna la apariția primei picături de preparat ( sânge sau serozitate ). Folosirea portacului ușurează efectuarea manevrei , permițând si aspirarea unui conținut de consistența crescută ( coloid ). Puncționarea unui nodul se realizează de câteva ori , de la 2 până la 4 ori , iar după unii specialiști chiar pâna la 9 ori. Oricum cert este faptul că , cu cât se efectuează mai multe puncții cu atât se reduce riscul de rezultate fals negative sau de eșantioane neconforme insă și cu riscul mai ridicat de apariție a unor hemoragii.

După extragerea acului se comprimă locul puncției aproximativ 1 minut iar pentru evitarea complicațiilor hemoragice pacientul va ramâne in decubit dorsal timp de 15 minute.

Metoda echoghidată

Este o manevra mai precisă , asigură o acuratețe si un risc mult mai scăzut decât metoda directă.

Metoda echoghidată are indicație in cazul nodulilor profunzi , nepalpabili sau situați posterior , nodulilor mixști cu o componentă solidă si una lichidă iar puncția părții solide este imperios necesară.

Interveția poate fi executată de una sau două persoane, una care ține sonda echografică si cealaltă puncționează sau cea care execută puncția ghidează și sonda ecografică așa cum este prezentat in imaginea 4.

Imaginea 4 – Puncție echoghidată

Agobiopsia tiroidea ecoguidata

Prelucrarea materialului

Materialul obținut prin mișcarea de aspirație , se expulzează din acul seringii printr-o miscare ușoară pe suportul frotiului , mai exact lame de sticlă pentru microscop și va fi etalat imediat.

Imaginea 5 – Lame de sticlă pentru microscop ( arhivă personală )

Calitatea eșantionului se poate aprecia macroscopic din punctul de vedere al culorii , vîscozității , abundenței.

Fixarea frotiului se va alege in funcție de colorația ce urmează a fi efectuată . Fixare la aer pentru colorația May-Grunwald-Giemsa si alcool 95% pentru colorații Papanicolau sau Hematoxilină-Eozină.

Eșantioanele de consistență lichidiană se centrifughează mai intâi la o viteză de 1000-1500 rot/min timp de 10 min. iar mai apoi din sediment se execută frotiul.

Imaginea 6 – Centrifugă ( arhivă personală )

Protocolul execuției citologiilor este :

– Pentru frotiurile gata executate:

1.Uscarea frotiului in aer liber la temperatura camerei

2.Fixare in alcool etilic 960

3.Uscare in aer la temperatura camerei

4.Colorare Giemsa, HE sau Papanicolaou

– Pentru produsele patologice native:

1. Centrifugare – 10 min. la 750 – 1000 rot/min

2.Execuție frotiuri pe lame se sticlă

3.Uscare la temperatura camerei

4. Fixare in alcool etilic 960

5. Uscare la temperatura camerei

6. Colorare Giemsa sau HE

Coloranții

Se pot folosi reactivi preparați din pulberi sau kit-uri gata preparate. Timpii și concentrațiile menționate în rețete sunt orientative și se adaptează în funcție de condițiile locale (temperatură ambientală, duritatea și pH-ul apei de robinet etc). Colorația este considerată corectă dacă se obțin rezultatele preconizate.

După sedimentare și execuția frotiului lamele colorate au aspectul ca in imaginea 7

Imaginea 7 – Colorație Papanicolau

Din sedimentul obținut se pot executa si blocuri de parafină , adică sedimentul este prelucrat și inclus in bloc de parafină . Această operațiune se folosește atunci când se doresc și investigații suplimentare, cum ar fi investigații imunohistochimice.

Interpretarea unui frotiu citologic tiroidian necesită experiență din partea patologului care va trebui să aibă in vedere unele aspecte cum ar fi :

background-ul frotiului.

densitatea celulară

modul de grupare si specificitatea morfologică a celulelor epiteliale.

Pe lîngă pucția cu ac fin , din etapa preoperatorie mai fac parte și alte investigații, cum ar fi puncția biopsică. Puncția biopsică și pregătirea preparatului o voi prezenta in etapa postoperatorie intrucât tehnica este aceeași.

ETAPA INTRAOPERATORIE

Această etapă se referă strict la examenul intraoperator și anume examenul extemporaneu.

Examenul extemporaneu

Examenul extemporaneu este o investigație care in zilele noastre este folosită din ce in ce mai puțin tocmai datorită dezvoltării tot mai mult a tehnicii puncției cu ac fin și a citologiei.

Este o investigație mai laborioasa care necesită anestezie și se practică numai in cazuri de diagnostic incert sau in cazul unei citologii neconcludente.

Datele minime ce ar trebui să insoțească examenul extemporaneu sunt :

date clinice – vârstă, sex, date de laborator

rezultatul puncției cu ac fin.

preparatul ( piesa de analizat ) care trebuie să fie intreg, nesecționat.

Tehnica examenului extemporaneu

Examenul macroscopic si palparea piesei operatorii ajută anatomo-patologul la identificarea și localizarea leziunii iar prelevarea fragmentului pentru prelucrat se va face printr-o singură secționare in axul cel mai lung. O condiție esențială este ca fragmentul prelevat să conțină o parte din capsula leziunii ( nodulului ) și o parte din țesut sănatos.

Etapele protocolului examenului extemporaneu sunt:

se vor verifica datele de insoțire ale fragmentului trimis pentru investigare

se va aprecia macroscopic dacă materialul trimis se pretează examinării din punctual de vedere al dimensiunii.

se înregistrează cazul intr-o condică dedicată examenelor de prelucrare la gheață.

se orientează macroscopic piesa, se dimensionează și se descrie fragmentul tisular

se congelează fragmentului tisular – se montează fragmentul tisular pe suportul metalic și se îngheață în cryostat la temperatură sub minus 27C până devine perfect opac.

se secționează la criomicrotom – se niveleaza blocul tisular înghețat, efectuandu-se secțiuni la 2-10μ

secțiunile obținute se etalează pe lame de sticlă cu ajutorul unui port-ac sau direct pe lamă.

lamele cu material histopatologic secționat la gheață se coloreaza cu hematoxilină-eozină sau soluție de albastru de toluidina (colorații uzuale) sau Scharlach (colorație specială pentru lipide).

se montează în apă.

POZA CU LAMA EXTEMP.

Complementar acestui procedeu , de secționare la microtomul de gheață , se mai practică și amprentarea fragmentului inainte de congelare , datorită faptului că prin refigerare se alterează detaliile nucleare , in special la carcinoamele papilare. Amprentarea se face deci din fragmentul proaspăt , pe lame de microscop , după care materialul depus pe lamă urmează protocolul colorației citologice.

Microtomul de gheață ( cryostatul ) este prezentat in imaginea 8

Imaginea 8 – Cryostat al laboratorului de anatomie-patologică al Spitalului de Urgență Brașov

Elaborarea diagnosticului se va face de către anatomo-patolog după citirea la microscop a lamelor , acesta având trei posibilități : leziune benignă , leziune malignă sau se va aștepta rezultatul final după prelucrarea la parafină . In acest ultim caz se ajunge atunci cand imaginea de pe lamă nu este concludentă .

In patologia glandei tiroide examenul extemporaneu are o specificitate foarte ridicată cuprinsă intre 99-100 % și o sensibilitate mai redusă între 64-78 %.Există date statistice care reflectă o diferență între cazurile fals negative și diagnosticele elaborate la parafină, acestea fiind între 2,7 și 43 %.Deasemenea tot conform unor surse statistice se estimează ca aproximativ 25% din tumorile maligne ale glandei tiroide nu se pot detecta preoperator.

ETAPA POSTOPERATORIE

Este etapa cea mai reprezentativă din punct de vedere histopatologic , datorită faptului ca in această etapă au loc toate transformările suferite de preparatele prelevate in vederea obținerii unui produs final de cea mai bună calitate și conform calității produsului final va fi și precizia diagnosticului pentru că nu se poate elabora un răspuns anatomo-patologic fără o calitate inaltă a produsului final , in speță lama ce va fi vizualizată la microscop.

In această etapă piesa operatorie va parcurge intregul circuit al laboratorului de anatomie-patologică de la camera de primire probe pînă la eliberarea rezultatului.

Camera de primire probe este prezentată in imaginea 9

Imaginea 9 – Camera de primiri probe a Spitalului Județean de Urgențe Brașov

Tehnica histopatologică presupune totalitatea transformărilor care le suferă un prelevat dintr-un organ sau țesut pînă la stadiul unui preparat cu aspect translucid care permite observarea detaliilor structurale tisulare la microscop. Pentru a se putea obține acest lucru fragmentul prelevat va suferi o serie intreagă de modificări succesive.

Inainte de a fi trimisă spre laboratorul de anatomie patologică piesa operatorie va fi insoțită de următoarele documente , ce sunt obligatorii:

fișa de insoțire sau buletin de analize unde va fi trecut corect numele si prenumele pacientului,CNP, vârsta, numărul foii de observație, secția care solicită examenul histopatologic, diagnosticul, ce material biopsic s-a trimis, data recoltării, fixatorul utilizat(felul, concentația), semnătura si parafa medicului care solicita diagnosticul histopatologic.

se verifică existența materialului biopsic trimis in recipient și se compară cu datele de insoțire să corespundă intocmai.

se va verifica dacă piesa operatorie este fixată in formol sau altă substanță fixatoare sau este in stare proaspătă.

se va verifica dacă din punct de vedere calitativ piesa operatorie corespunde descrierii făcute in documentele ce o insoțesc(detalii macoscopice – dimensiuni, formă, presecționare de către medicul chirurg).

înregistrarea in condicile de evidență ale departamentului de anatomie patologică și acordarea de numere/caz; unui caz se poate acorda unul sau mai multe numere( de exemplu 1001,1002,1003 ); înregistrarea cazului se poate face înainte sau în cursul orientării macroscopice , insă deobicei se efectuează după prelevare pentru o evidențiere precisă a numărului de blocuri pentru fiecare caz in parte.

Exemplul de etichetare a fiecărei casete (bloc de parafină ) in parte este prezentat in imaginea 10 și imaginea11

Imaginea 10 – Casete pentru fragmente bioptice prelevate folosite de către Spitalul Județean de Urgență (arhivă personală)

Brașov

Imaginea 11 – Casete de includere a fragmentelor prelevate

Una din cele mai importante etape ale procesului histopatologic este fixarea , care trebuie sa se producă cat mai repede posibil după prelevarea țesutului, operațiune efectuată de către medicul ce recoltează țesutul ori de către anatomopatolog.

Fixarea materialului prelevat trebuie să indeplinească anumite condiții și anume :

să nu producă contracția materialului.

să nu producă modificări structurale ( tumefieri )

să nu producă intărirea țesuturilor

Fixarea are scop stabilizarea propietăților țesuturilor in vederea procesării și depinde de o serie de factori cum ar fi :

scopul examinării microscopice

volumul piesei

tipul colorațiilor ce vor urma a fi efectuate ( POSDRU)

Proprietățile fixatorilor

Pentru ca o substanță să poată fi folosită ca fixator terbuie să indeplinească o serie de proprietăți ce țin de structura chimică, concentrație, ph, temperatură, presiune osmotică și nu in ultimul rînd trebuie să aiba o durată de timp cât mai scurtă.

Soluțiile fixatoare trebuie să aibă o presiune osmotică mare, pentru a putea pătrunde in țesuturi. Soluțiile izotone nu fixează iar soluțiile hipertone și hipotone produc modificări structurale ( intărirea și tumefierea pieselor).

Concentrația electrolitică optimă trebuie să fie de 2 – 4 ori mai mare decât a sângelui.

Ph-ul soluțiilor fixatoare trebuie să fie acid , in jur de 4.

O altă calitate a soluției fixatoare este temperatura la care se realizează fixarea. Difuzibilitatea moleculelor crește odată cu creșterea temperaturii, de exemplu rata de penetrare a unui țesut de către formaldehidă este mai rapidă la temperatură ridicată.(posdru)

Durata fixării, este o altă proprietate a soluției fixatoare , deosebit de importantă și este dependentă de tipul fixatorului, de exemplu 24 de ore pentru formaldehidă și 3 ore pentru fixatorul Carnoy. Fixarea nu este un proces chimic rapid,de moment, ci progresiv, porțiunile profunde ale pieselor fixându-se mai târziu, mai lent, mai ales dacă piesa operatorie este mai voluminoasă. In cazul pieselor voluminoase, se practică etalarea porțiunilor importante ce urmează a fi prelucrate și astfel este asigurată fixarea corectă pe intreaga suprafață a fragmentului.

Puterea de penetrare a soluției fixatoare depinde decompoziția chimică a fixatorului si de structura maerialului ce va fi supus fixării. De regulă țesuturile conjunctive care au o structură mai densă sunt pătrunse mai greu de fixatori decât țesuturile parenchimatoase care au o penetrabiliate mai ridicată.

O fixare corectă intr-o soluție de formol in amestec cu bicromat pe timp de 24 de ore va rezulta o colorare foarte evidentă a nucleilor in timp ce o fixare prelungită, pînă la câteva zile va duce la modificări profunde ale structurii țesutului in ce privește bazofilia nucleară și va permite colorarea unor lipide și mitocondrii.

Orice soluție fixatoare are avantaje și dezavantaje , reprezentate de dispariția unor structuri moleculare, întăriri și tumefieri ale țesuturilor in cursul procesării, deficiențe de colorare histochimice și imunohistochimice.

Dezavantajul major al unui reactiv fixator constă in impactul extraordinar asupra organismului uman. De exemplu formaldehida este o substanță deosebit de toxică, riscurile folosirii de către personalul din laboratoarele de anatomie patologică fiind stabilite cert, atât din punctul de vedere al unei substanțe toxice cât și al efectului carcinogen.

TIPURI DE FIXATORI

Soluțiile fixatoare se impart in:

fixatori simpli

fixatori compuși

Fixatorii simpli sunt soluții in compoziția cărora nu mai intră in amestec și alt reactiv,de exemplu formaldehida, metanolul, acidul acetic glacial.

Fixatorii compuși sunt acele soluții in compoziția cărora intră și alți aditivi sau compuși complementari, cum ar fi fixatorul Carnoy – etanol+cloroform+acid acetic.

Cel mai uzual fixator simplu, care indeplinește o mare parte din cerințele histopatologice este formaldehida (formolul) care se gasește in concentrație de 38 – 40 % și se pastrează la temperaturi de peste 9*C datorită faptului că la temperaturi mai joase precipită iar calitătile fixatoare scad, și in concentrație de 10 % și un ph = 7 considerat cel mai util in histopatologie și chiar și in biologie moleculară.

In cazul unor guși voluminoase se pot executa incizii pentru a ajuta penetrarea fixatorului in structurile profunde.

PRELEVAREA/ORIENTAREA PIESELOR

Este o etapă din protocolul histopatologic ce implică o mare răspundere și necesită experiență din partea personalului ce execută această operațiune. Piesele primite in laboratorul de anatomie patologică pot avea diverse proveniențe, cum ar fi :

citologii

biopsii

piese operatorii

fragmente tisulare rezultate in urma necropsiilor.

Pentru fiecare intervenție operatorie există un protocol de orientare. In cazul tireodectomiilor pațiale sau totale o importanță majoră îl constituie examenul macroscopic, ce implică și determinarea greutății totale a piesei, un aspect deosebit de important in cazul chirurgiei de reducție a bolii Basedow.

Se notifică fiecare aspect particular al piesei operatorii, exterior boselat, hipervascularizat, marcaje cu fir al fiecărui lob, evetuala prezență a glandelor paratiroide și a prezenței limfonodulilor.

Imaginea 12 – Glandă tiroidă pregătită pentru orientare in departamentul de anatomie

patologică a Spitalului Județean de Urgență Brașov

Modul de secționare a pieselor de tireodectomie se realizează in totalitate pentru fiecare lob in parte, in secțiuni de 3-5 mm grosime. Feliile secționate trebuie detașate unele de altele pentru a se putea vizualiza și determina toate dimensiunile si structurile particulare ale tumorilor,cum ar fi depășirea capsulei și invadarea in profunzimea țesuturilor.

Imaginea 13 – Secțiuni de 3 – 5 mm ale unei glande tiroide

Numărul de secțiuni prelevate este dependent de aspectul macroscopic și datele colaterale ale cazului. In contextul unei hiperplazii sau al unei guși eterogene numărul secțiunilor va fi redus , 3-5 fragmente din fiecare lob – 1/3 superioară, 1/3 inferioară și partea centrală ( istmul ). Se va preciza localizarea fiecărui fragment in parte și se vor efectua secțiuni multiple , prelevându-se chiar tot fragmentul dacă leziunea o impune.

Limfonodulii ( ganglionii ) se vor preleva separat și se va nota numărul total de ganglioni gasiți pentru evaluarea stadiului de invazie tumorală.

PROCESAREA PIESELOR

Procesarea pieselor reprezintă totalitatea modificărilor suferite de fragmentele prelevate pînă să ajungă la stadiul de bloc. Adică fragmentul tisular va fi inglobat intr-o masă compactă de parafină.

Imaginea 14 – Blocuri de parafină ( arhivă personală )

Protocolul de procesare a piselor prelevate este urmatorul :

fixare

deshidratare

clarificare

impregnare cu parafină

includere

secționare

colorare

montare

Procesarea actuală se execută pe aparate speciale automate numite histoprocesoare.

Imaginea 15 – Histoprocesor al Spitalului de Urgență Brașov

Fixarea se realizează in cadrul protocolului de funcționare a histoprocesorului, cu formol de o concentrație mai scăzută, 5% pe o perioadă de timp stabilită in programul aparatului.

Deshidratarea este procesul prin care apa este îndepărtată din țesuturi. Deshidratarea se face deobicei cu alcool și se realizează treptat, progresiv începând cu concentrații de 70* > 80*> 90*>100* . In urma deshidratării volumul piesei se reduce cu aproximativ 5-10 % .

Clarificarea este etapa prin care sunt inlocuiți alcoolii cu reactivi miscibili cu parafina reprezentați de toluen , xilen sau benzen. Denumirea acestei etape se explică prin faptul că solvenții pătrund in structurile profunde ale piesei conferindu-i un aspect translucid. De fapt acest aspect ne și dovedește când clarificarea s-a terminat.

Impregnarea cu parafină este etapa prin care piesele sunt pătrunse de parafină, pregătind astfel pasul următor, includerea.

Includerea este etapa prin care piesele sunt inglobate in blocuri de parafină cu ajutorul unor matrițe sau molduri.

Imaginea 16 – Mold pentru includere la parafină

Includerea propriuzisă se realizează cu ajutorul unei stații de includere care are in componență o cuvă care menține parafina la temperatură constantă.

Imaginea 17 – Stație de includere ( arhivă personală )

Rezultatul final al intregului proces este obținerea de secțiuni fine de 2- 4 microni din piesele incluse in parafină, care vor fi etalate pe lame de sticlă și pregătite pentru colorare.

Parafina este cel mai folosit mediu de includere datorită faptului că prezintă multe avantaje. Are punctul de topire destul de ridicat 54 -58* C și din punct de vedere material are costuri de achiziții mici. Impregnează țesuturile in profunzime formând un bloc compact perevenind torsionarea fragmentului in timpul secționării.

Secționarea se realizează cu ajutorul unor dispozitve numite microtoame. Microtoamele sunt de mai multe tipuri, in funcție de mediul de includere și tipul piesei. Așadar există microtoame cu mișcare verticală pentru parafină, microtoame cu mișcare orizontală pentru celoidină, microtoame de gheață (cryostate) pentru examene extemporaneu sau macrotoame pentru secțiuni foarte mari.

Imaginea 18 – Microtom cu mișcare verticală pentru parafină (arhivă personală)

Pentru obținerea de secțiuni fine, subțiri fără artefacte trebuiesc indeplinite anumite condiții:

îndepărtarea excesului de parafină (fasonarea blocului)

răcirea blocului de parafină – dacă blocul de parafină este răcit se obțin secțiuni subțiri

grosimea secțiunilor – pentru fasonarea blocurilor se vor utiliza vize de pătrundere in bloc mai mari,de 10-20 de microni, in schimb pentru secțiuni fine viza trebuie să fie cât mai mică, de 2-4 microni.

Secțiunile astfel obținute pentru a putea fi etalate pe lama de sticlă vor fi așezate cu grijă intr-o baie de flotație de unde vor fi intinse pe lamă cu ajutorul unui port ac sau tehnicienii cu experiență o fac in mod direct.

Imaginea 19 – Baie de flotație cu etalarea secțiunii pe lamă (arhivă personală)

Colorarea este etapa prin care materialul secționat și etalat pe lama de sticlă va trece printr-un proces de colorare care are ca scop punerea in evidență a diverselor structuri histologice in diverse culori.

Coloranții se pot extrage din pulberi sau sunt deja inglobați in cadrul unor kit-uri.

Coloranții de bază in anatomia patologică sunt Hematoxilina și Eozina.

Hematoxilina care se extrage din tulpina arborelui de băcan , se obține pulbere care se amestecă cu un mordant. In cazul hematoxilinei se folosește aluminiul și se obține soluția de hemalaun care colorează nucleii in rosu, culoarea fiind convertită in albastru-negru prin spalarea secțiunii in soluție slab alcalină. Soluțiile folosite pentru virarea culorii sunt apa de robinet, carbonatul saturat de litiu sau hidroxidul de amoniu în alcool.

Eozina este un colorant sintetic , cu un ph acid, derivat din fluoresceină. Fiind un colorant acid interacționează cu substraturile acidofile din țesuturi rezultînd colorații de la roz pal la roșu.

Există o multitudine de tipuri de colorații fiecare din ele având o specificitate aparte in funcție de organul studiat sau structura histologică.

Cea mai uzuală colorație , folosită peste tot in lume este colorația Hematoxilină – Eozină , care va pune in evidență nucleii colorați in albastru și citoplasma in roșu – roz. Colorațiile speciale ce sunt specifice glandei tiroide sunt colorația Roșu de Congo și colorația PAS.

Colorația Hematoxilină – Eozină

Trebuiesc parcurși o serie de timpi pentru realizarea colorației și anume :

deparafinarea secțiunilor de pe lame cu toluen , benzen sau xilen in 2-3 băi succesive.

hidratarea – se face la fel in băi succesive de alcool cu concentrații descendente de la 990 la 700și mai apoi in apă.

colorarea cu Hematoxilină

spălare in apă de robinet sau in Carbonat de Litiu pentru virarea culorii in albastru

colorare cu Eozină

spălare cu apă de robinet

deshidratare in băi succesive de alcool, de la 700 la 990.

clarificare in 2-3 băi succesive de toluen , benzen sau xilen.

montare – fixarea unei lamele foarte subțiri peste secțiunea colorată cu ajutorul unui adeziv (balsam).

Imaginea 20 – Colorație Hematoxilină – Eozină

http://www.scritub.com/medicina/ASPECTE-HISTOPATOLOGICE-IN-CAR93168.php

Colorația Roșu de Congo

Cu ajutorul acestei colorații se pune in evidență prezența amiloidului in preparatul histologic.

Timpii acestei colorații sunt:

deparafinare

hidratare

spălare

colorare cu soluție Roșu de Congo 0,5% – 10-30 minute

spălare în apă distilată

diferențiere în soluție KOH/ NaOH 0,2%

spălare apă distilată

hematoxilină – 2-5 minute

spălare

contrastare în soluție suprasaturată de Li2CO3

spălare

deshidratare

clarificare

montare

Rezultate – nucleii sunt colorați in albastru iar amiloidul in roșu-cărămiziu.La vizualizare cu ajutorul unui microscop cu fluorescență amiloidul apare in verde fosforescent.

Imaginea 21 – Colorație Roșu-Congo in tiroidită autoimună Hashimoto

http://www.epathology.ro/patologie-sistemica/patologia-glandelor-endocrine/tiroida.html

Colorația PAS

Colorația PAS pune in evidență prezența mucopolizaharidelor și a glicogenului din țesuturi. Preparatul colorat PAS are nucleii colorați in albastru sau negru-albăstrui și restul structurilor ce ne interesează in roșu magenta.

Timpii de xecuție sunt:

deparafinare

hidratare

apă distilată

oxidare cu acid periodic 0,5-1% – 5 -10minute

apă distilată

reactiv Schiff – 5-15 minute

apă robinet – 10 minute

hematoxilină Mayer – 2-5 minute

apă robinet

developare în solutie saturata de Li2CO3

apă robinet

deshidratare

clarificare

montare

Imaginea 21 – Colorație PAS

(http://www.epathology.ro/lucrari-practice/tehnologie-si-coloratii/preparatul-microscopic-permanent.html)

Complementar tehnicilor histopatologice, colorația HE și colorațiile speciale, se execută și tehnici de imunohistochimie. Aceste teste imunohistochimice sunt metode ce combină testele histologice cu cele de imunologie, având la bază reacții antigen-anticorp.Reacțiile antigen-anticorp sunt puse in evidență prin intermediul unei substanțe cromogenice numită DAB.Au loc la nivel tisular și se urmărește evidențierea unui antigen (Ag) specific. Antigenii au specificitate pentru fiecare tip de țesut in parte și deci și tumorilor care provin tot din aceleași țesuturi.Antigenii pot fi depistați cu ajutorul unor anticorpi ( Ac ) obținuți fie pe culturi celulare fie prin imunizarea unor animale care deobicei sunt șoareci albi sau iepuri.aceștia din urmă fiind preferați datorită cantității mai mari de anticorp ce poate fi recoltată.

Un Ag conține mai multe molecule prin care se leagă anticorpii, denumită epitopi. Fiecare anticorp in parte are o specificitate pentru un epitop.

In patologia tiroidiană sunt folosiți o serie de anticorpi, ce se mai numesc și markeri tumorali, specifici acestui tip de țesut care confirmă originea celulelor din tumorile tiroidiene mai ales in cazul proceselor infiltrative și de limfoproliferare.

Principalii markeri tumorali utilizați in patologia tiroidiană sunt: TTF1 ( Thyroid Transcription Factor 1 ), TG (Tiroglobulina ), CT ( Calcitonina ), CG ( Chromogranina ), CK19 ( Citokeratina 19 ), HBME-1 ( Hector Batifora Cell Marker 1).

In tehnicile IHC se utilizează mai multe metode de punere in evidență a reacției antigen-anticorp și anume :

metoda directă

metoda indirectă

metode speciale

Metoda directă – este prima metodă folosită in IHC, și care utilizează un anticorp marcat cu o substanță fluorescentă sau o enzimă. Această tehnică este mai simpă insă are dezavantajul că are o specificitate redusă.

Metoda indirectă – mai este numită si tehnica sandwich pentru că este compusă din două sau mai multe etape. In cadrul acestei metode intră mai multe tehnici, fiecare având avantajele și dezavantajele ei. Cele mai importante tehnici sunt:

tehnica indirectă in două etape

tehnica indirectă in trei etape

metoda complexului avidină-biotină

metoda EPOS

metoda imunoaur-argint

metoda envision

metoda complexului avidină-biotină marcată.

Cea mai utilizată tehnică, care are o sensibilitate foarte mare și un timp de execuție redus este metoda complexului avidină-biotină, denumită și metoda ABC, folosită și in cadrul laboratorul Spitalului de Urgență Brașov.

TEHNICA IHC . METODA ABC

1.Deparafinare și hidratare:

Deparafinare in 3 băi de toluen ( 3×10 minute ) – 30`

2.Hidratare : – 2 băi de alcool etilic absolut ( 2 X 10 minute ) – 20`

alcool etilic de 96* ( 1 X 10 minute ) – 10`

alcool 700 ( 1 X 10 minute ) – 10`

3.Pretatarea lamelor

Pretatarea lamelor se face conform indicațiilor din prospect, fierbere la baia termostatată sau MW ( microunde ) in tampoane de fierbere cu ph diferit.

inhibare cu H2O2 – 3% ( 20 de minute ) – 20`

tratament enzimatic ( 2 minute ) – dacă este necesar

apă distilată ( 2X 10 minute ) – 20`

PBS ( 2 X 10 minute ) – 20`

incubare cu ser normal de animal ( 20 de minute ) – 20`

4.Incubare cu anticorp primar

Se face la temperatura camerei timp de o oră sau peste noapte.

– PBS 2 X 10 minute – 20`

Incubare cu anticorp secundar ( 30 de minute )

PBS ( 2 X 10 minute ) – 20`

5 . Streptavidina – 30 de minute

In loc de anticorpul secundar și streptavidină se poate face incubare cu polimer timp de 30 de minute

spălare cu apă de robinet.

6. DAB

Prepararea DAB – cromogen + substrat buffer , incubare 5 – 30 minute

spălare cu apă de robinet

7. Colorare HE ( hematoxilină cu cloral pentru IHC ).

spălare cu apă de robinet

8. Contracolorare cu carbonat de Litiu timp de 1 minut.

spălare cu apă de robinet.

9. Deshidratare și clarificare

– alcool etilic 700 ( 10 minute )

– alcool etilic 960 (10 minute )

– alcool absolut ( 2 X 10 minute )

– toluen ( 3 X 10 minute ).

Imaginea 22 – Camere de incubare lame de IHC ( arhivă personală )

POZE CU MARKERI IHC

Interpretarea reacției IHC se va face de către medicul anatomopatolog in baza unui algoritm. Se va ține cont de intensitatea sau paloarea colorației in funcție de tipul de țesut testat.

Reacțiile IHC au unele particularități din punct de vedere micromorfologic:

reacție IHC citoplasmatică – care poate fi fin granulară, difuză citoplasmatică sau pronunțată

reacție IHC de membrană – care poate avea o dispersie complete sau incomplete la nivel cellular

reacție IHC nucleară – aici se poate intîlni situația în care nucleolul este sau nu colorat

reacția IHC se diferențiază clar față de structurile colorate natural ( pigment biliar sau melanic )

Alte caracteristici ale reacției IHC ar fi :

colorația trebuie să fie foarte bine delimitată față de restul țesutului care nu a fost implicat in reacția antigen-anticorp.

colorația IHC va trebui diferențiată față de coloritul de fond, care este prezent in cazul anticorpilor policlonali.

Factori ce pot influența interpretarea reacțiilor IHC:

tehnica de procesare a piesei operatorii incepând de la fixare pînă la includerea la parafină.

tehnica imunohistochimică folosită , direct, indirectă , executată manual sau automat.Corectitudinea execuției tehnicii cât și tipul de anticorpi folosiți (monoclonali sau policlonali )

clona anticorpului – există clone ce pot evidenția epitopi diferiți care apar in diverse tipuri de leziuni.

experiența medicului ce interpretează cazul.

artefacte ale unor procese de prelucrare intermediare cum ar fi decalcifierea.

Reacții fals pozitive :

nerespectarea protocolului de lucru ( timpi , uscarea secțiunilor )

diluție necorespuzătoare a anticorpului

efectul de suprafață

Reacții fals negative :

fixarea neadecvată a piesei operatorii

erori grave de tehnică

temperaturi neadecvate in timpul prelucrării la parafină

REZULTATE

Tehnicile histopatologice detaliate anterior au fost executate la toți cei 484 de pacienți care au făcut parte din studiu și in unele cazuri in care diagnosticul de certitudine a fost pus in dificultate s-au efectuat și teste imunohistochimice.

Toate testele histopatologice și imunohistochimice au fost executate in departamentul de anatomie patologică din cadrul Spitalului Județean de Urgență Brașov.

Din totalul celor 484 de pacienți din studiu am ales patru cazuri pentru prezentare la care s-au identificat incidental leziuni suspecte, care au necesitat pe lângă examinările histopatologice și testări imunohistochimice suplimentare pentru stabilirea caracterului( benign/ malign) al formatiunilor identificate, precum si fenotiparea leziunii.

Cazul 1

PACIENT : B. M.

SEX : FEMININ

VARSTA : 53 ANI

SECTIA : CHIRURGIE III

DIAGNOSTIC PREZUMTIV : GUSA POLINODULARA

PIESA TRIMISA : GLANDA TIROIDA

MACROSCOPIC : s-au descris lobi tiroidieni fara marcaj, lob 1 de 35/20/10 mm si lob 2 de 30/25/10 mm plus istm tiroidian ; pe sectiune piesa are aspect coloid.

MICROSCOPIC : la nivelul lobului tiroidian 1 s-a identificat un nodul cu dimensiunea de 3/2 mm fara prezenta unei capsule conjunctive. Nodulul este alcatuit din foliculi de talie mica, cu arhitectura compacta, unii cu secretie eozinofila in lumen. Celulele foliculare prezinta atipii citonucleare reduse .

Conform arhitecturii microscopice s-a indicat efectuarea examenului imunohistochimic cu un panel de 2 anticorpi, CK19 ( citokeratina 19) si HBME-1.

Aspectul microscopic ( nodul de dimensiune redusa 3/2 mm, lipsa capsulei conjunctive in jur ), corelat cu profilul imunohistochimic, CK 19 si HBME-1 pozitiv in celulele foliculare, incadreaza leziunea in categoria unei tumori foliculare cu potential malign incert.

CAZUL 2

PACIENT : R. M.

VARSTA : 54 ANI

SEX : FEMININ

SECTIA : CHIRURGIE III

DIAGNOSTIC CLINIC : GUSA POLINODULARA

MACROSCOPIC : piesă de tiroidectomie cu marcaj , in fixator formol 10%.

LOB DR. – de 4/2,5/1,5 cm, pe sectiune cu un mic nodul subcapsular albicios de 8 mm.

LOB STG – 4/2/1 cm.

MICROSCOPIC : glanda tiroida cu foliculi inegali, dilatai, tapetati de epiteliu aplatizat, cu arii microfoliculare active ( sandreson ). Stroma cu focare de hialinizare si inflamtie limfocitara nodulara izolata. La nivelul lobului drept corespunzator nodulului de 8 mm, din descrierea macroscopica, se identifica o microformatiune tumorala, relativ bine delimitata, cu configuratie stelata si arhitectura papilara. Nuclei cu modificari de tip PTC. Stroma hialina cu prezenta de corpi psamomatosi. Fara semne de invazie vasculara.

CONCLUZIE : hiperplazie nodulara tiroidiana ( gusa polinodulara ) cu un focar de microcarcinom papilar de 8 mm, localizat in lobul drept.

Recomandarea laboratorului a fost pentru executarea de investigatii imunohistochimice suplimentare, cu alcatuirea unui panel de anticorpi compus din TTF1, CK19, HBME-1, Ki67.

In urma efectuarii testarii s-au constat urmatoarele :

TTF1 – intens pozitiv nuclear in glanda tiroida si formatiunea tumorala.

CK19 – pozitiv intens in structura tumorala, negativ in restul glandei.

HBME-1 – intens pozitiv in structura tumorala, negativ in restul glandei.

Ki67 – pozitiv 20% in structura tumorala, pozitiv sub 1% in restul glandei.

CONCLUZIE : aspectul histopatologic corelat cu rezultatul testarii, orienteaza diagnosticul catre originea tumorala a nodulului, cu aspect histopatologic si fenotipal de de microcarcinom papilar.

CAZUL 3

NUME : H. P.

SEX : M

VARSTA : 56 ANI

SECTIA : CHIRURGIE TORACICA

DIAGNOSTIC CLINIC : TUMORA PULMONARA

BLOC PARAFINA nr. 3553

MACROSCOPIC : s-a descris formatiunea tumorala cu grupuri ganglionare.

MICROSCOPIC : aspectul histopatologic orienteaza diagnosticul catre o determinare secundara pulmonara de carcinom cu punct de plecare foarte probabil tiroidian, insa nu se poate exclude cu certitudine originea primitiv pulmonara a tumorii fara a execută teste imunohistochimice suplimentare.

Testele imunohistochimice au fost făcute pe baza unui panel de anticorpi alcatuit din CK19, TTF1, THY ( thyroglobulin), 34BE12, S100, VIM, EMA.

Concluzie

Aspectul histopatologic, corelat cu rezultatul testării, orientează diagnosticul către determinare secundară de carcinom papilar cu punct de plecare tiroidian. Nu se poate exclude cu certitudine existența unui adenocarcinom papilar primitiv pulmonar, având in vedere fenotipul IHC comun pentru TTF1, al celor doua tipuri tumorale menționate.

CAZUL 4

NUME : B. M.

SEX : F

VÂRSTĂ : 74 ANI

SECTIA : CHIRURGIE II

DIAGNOSTIC CLINIC : NODUL LOB TIR DR., ADENOPATIE LC. Dr.

MACROSCOPIC :

Lob dr. tiroidian de 6/4/3 cm, cu nodul de culoare cenușiu-gălbuie de 3/2/1 cm.

Lob stg. tiroidian de 3,5/2/1 cm, cu aspect polinodular.

Masă tumorală de 8/6/4 cm, formată din ganglioni voluminoși,coalescenți, cu aspect tumoral.

MICROSCOPIC :

Lob dr. – Formațiune tumorală fin incapsulată cu patern folicular, fără atipii nucleare evidente,fără modificări PTC-type nucleare. Aparent tumora nu invadează capsula separatoare de țesutul netumoral. Nu se identifică invazie vasculară in venulele și capilarele pericapsulare.

Lob stg. – Țesut tiroidian cuaspect anizofolicular, cu schțe de nodularitate, pe un fond stromal fibrotic, cu inflamație ușoară, mononucleară. Coloid intrafolicular bogat, uniform, cu rare vacuolizări.

Mase limfonodulare cu proces inlocuitor de spațiu, masiv, reprezentat de o infiltrare tumorală slab difernțiată, cu dispunere compact/lobulară. Tumora prezintă extensie perinodală in țesuturile moi adiacente. Celule tumorale epiteloide, pleomorfe,cu mitoze dense și prezența zonală de acumulări pigmentare intra și extracelulare.

CONCLUZIE

Hiperplazie nodulară tiroidiană, gușă anizofoliculară. Tumoră foliculară încapsulată de lob tiroidian dr. cu aspect de adenom microfolicular.

Metastaze masive limfonodulare, slab diferențiate, cu punct de plecare neprecizat, foarte probabil de origine melanocitară.

Se recomandă testare IHC in scopul evaluării fenotipale a metastazelor ganglionare.

Testarea IHC s-a bazat pe un panel de anticorpi format din : CK19, TTF1, Mart-1, HBME-1, VIM,S100.

Rezultatul imunomarcării a pus in evidență următoarele : TTF1 negativ, CK19 negativ, CK7 negativ, HBME-1 negativ.

S100- pozitivitate intensă difuză și nucleară și citoplasmatică in infiltartul tumoral.

VIM – intens pozitiv difuz in tumoră.

Mart-1 – slab pozitiv in tumoră.

CONCLUZIE

Aspectul histopatologic corelat cu rezultatl testării, orientează diagnosticul către determinări secundare limfonodulare de origine melanocitară ( melanom malign ).

POZE IHC

CONLUZII

Studiul pe care l-am efectuat este supus unui grad informațional restrîns datorită arealului geografic limitat.

Afecțiunile glandei tiroide au o frecvență destul de ridicată la sexul feminin cu o ușoară tendință de creștere și în cazul pacienților de sex masculin. Medicina modernă din zilele noastre pune la dispozița pacienților o gamă foarte variată de investigații de la simpla echografie până la bilogia moleculară, care pot descoperi din timp o eventuală leziune a glandei tiroide.

Tehnicile histopatologice și imunohistochimice au cunoscut in ultimii ani o evoluție ascendentă datorită modernizării laboratoarelor cu logistică de ultimă generație cât și datorită pregătirii personalului ce deservesc serviciile de antomie patologică prin programe de formare continuă in colaborare cu diverse centre din țară și străinătate.

BIBLIOGRAFIE

Andreson`s Pathology Ed. IX Editura Mosby 1996 vol. I – 566-568.

ePathology.ro [online] http:/www.epathology/lucrări-practice/istoria anatomiei patologice.html

”Incursiune in problematica laboratorului de Anatomie Patologică” – C.Ardeleanu, I.D. Căruntu, E. Lazăr.București 2013 Editura INCD- V. Babeș ISBN-B:978-973-0-15594-5, pg5-7, 26-28.

Legea nr. 104 din 27.03.2003 privind manipularea cadavrelor umane și prelucrarea organelor și țesuturilor de la cadavre in vederea transplantului. Emitent: Parlamentul României. Publicat in Monitorul Oficial nr 222 din 03.04.2003.

Hotărârea de Guvern ( H.G.) nr 451 din 01.04.2004 pentru aprobarea normelor metodologicede aplicarea legii 140 din 27.03.2003. Emitent: Guvernul României. Publicat in Monitorul Oficial nr 340 din 19.04.2004.

Ordinul nr 1217/2010 privind aprobarea Ghidurilor de Practică medicală pentru specialitatea anatomie patologică, Anexa 1. Tehnici de fixare, prelevare, transport și punerea in lucru a biopsiilor și pieselor chirurgicale.

Rosai and Ackerman`s Surgical Pathology. Ed. X 2012, Editura Elsevier. ISBN 13-9780323069694 vol I, pg 488-489,500.

Diagnostic Pathology anfd molecular Genetics of Thyroid, Ed 1 2009. Editor Lippincol- Wiliams&Wilkins cop7, pg97-99.

Pathology Outlines.com (online )- http:/www.pathologyoutlines.com/topic/thyroidpapilary.html