Diferentiera Tulpinilor de Eneterobacterii cu Diferite Fenotipuri de Rezistenta Prin Citometrie In Flux

CUPRINS

Introducere……………………………………………………………………………………

Cpitolul 1. Caracterizarea generala familiei Enterobacteriaceae si implicatii in patologia

umana…

1.1. Considerații taxonomice…………………………………………………………………. .

1.2. Caractere morfologice si de cultura…………………………………………………………

1.3. Caractere microscopice…………………………………………………………………….

1.4. Teste biochimice preliminare .………. . . ……………………………………….. ……….

1.5. Tipizarea antigenica………………………………………………………………………..

1.6. Endotoxine…………………………………………………………………………………

1.7. Habitat si implicații in patologie……………………………………………………………………

1.8. Rezistența la agenti chimici, fizici si biologici……………………………………………..

1.9. Patogenitatea si virulența……………………………………………………………. .. .. …

1.10. Mecanismele moleculare de rezistența a microorganismelor la antibiotice

1.10.1. Inactivarea enzimatică a antibioticelor……………………………………………..

1.10.2. Efluxul activ al antibioticelor………………………………………………………..

1.10.3. Rezistența prin impermeabilitatea porinelor………………………………………..

1.10.4. Modificarea mutationala a tintei antibioticului……………………………………..

1.10.5. Utilizarea unor cai metabolice rezistente……………………………………………

Capitolul 2. Notiuni generale despre tehnica citometriei in flux………………………………………………………………

2.1. Aplicațiile imunofenotiparii prin citometrie in flux in imunopatologie………………….

2.2. Informatii furnizate de citometria in flux…………………………………………………

2.3. Dispersia luminii……………………………………………………………………………

2.4. Emisia de fluorescenta……………………………………………………………………..

2.5. Componentele principale ale unui citometru de flux………………………………………

2.6. Sistemul de prelucrare electronica a semnalelor……………………………………………

2.7. Determinarea prin imunofluorescenta a antigenelor celulare de suprafata………………..

2.8. Fluorocromi folosiți in analiza in imunifluorescenta multicolora………………………….

2.9. Anticorpi monoclonali folositi ca marker celulari in citrometria in flux…………………..

2.10. Anticorpi monoclonali dublu marcați cu substanțe fluorescente, utilizați in imunofenotipare prin citometrie de flux…………………………………………………………………..

Capitolul 3. Cercetari personale – Caracterizarea unor tulpini de enterobacterii cu diferite fenotipuri de rezistenta prin citometrie in flux

Evidențierea mecanismului de rezistenta prin supraexprimarea pompelor de eflux, evaluat pe medii de cultura in prezența EtBr, la diferite tulpini de entrobacteriaceae………………

Masurarea parametrilor de marime celulara, viabilitate celulara si actiune pompelor de eflux prin citometrie in flux, la diferite tulpini de enterobacteriaceae…………………………..

Rezultate si discutii

Concluzii

Bibliografie

Introducere

Patogenii Gram negativi (majoritatea enterobacterii) sunt cauza a 69% din cazurile de boli bacteriene diareice cauzate de ingerarea de alimente contaminate, raportate in U.S.A. Preocuparile actuale sunt legate de reducerea contaminarii inițiale prin masuri corespunzatoare, dar si pentru prevenirea formarii de biofilme bacteriene, deoarece s-a demonstrat ca principalii factori de virulența ai tulpinilor patogene si condiționat-patogene de enterobacterii, sunt reprezentațti de adezine si toxine, dar si sinteza de capsula si siderofori.

Boala diareica este o problema de mari proportii; se estimeaza ca in lume se produc un miliard de episoade diareice, dintre care 3,3 milioane de cazuri sunt fatale, ceea ce plaseaza bolile diareiice pe locul doi in privinta cauzei mortalitatii prin boli infecțioase. Cele mai multe cazuri mortale se inregistreaza la copilul mic si in tarile in curs de dezvoltate (raport O.M.S., citat de Janda si colab., 1998) ( Lazar 2001).

Rezistența microbiană la antibiotice constituie o problemă complexă la nivel mondial, care necesită intervenții în timp util având în vedere impactul potențial enorm asupra sănătății umane. Unele organizații naționale și internaționale (Organizatia Momdiala a Sanatatii; Uniunea Europeana; European Control and Prevention) au dezvoltat strategii care indică prudență în utilizarea antibioticelor la om și animal, cât și importanța măsurilor de igienă în îngrijirea sănătății.

În 2001, Comisia Europeană a propus un sistem comunitar numit "Strategii de combatere a rezistenței microbiene" constând din patru componente cheie: supraveghere, prevenire, cercetare și dezvoltarea de produse antibiotice și vaccinuri, bazate pe cooperare internațională. UE urmărește cooperarea internațională, în special cu OMS, prin care să promoveze utilizarea rațională a antibioticelor (Bronzwaer si colab., 2004).

Deoarece epidemiologic rezistența bacteriilor la antibiotice variază de la o regiune geografică la alta, de la o specialitate la altă specialitate, de la un tip de infecție la altul, de la un an la altul (Zhanel si colab., 2010), am considerat că studierea rezistenței enterobacteriaceelor la antibiotice este o problemă de cercetat importantă și de actualitate.

CAPITOLUL 1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE – CARACTERIZAREA GENERALA SI IMPLICATII IN PATOLOGIA UMANA

Din această familie fac parte bacterii Gram negative, larg raspandite in natura (in sol, in apa, plante, in tractul intestinal al omului si al animimalelor) dar si intens studiate datorita implicarii lor in patologia umana, si datorita faptului ca au oferit un model ideal de studiu, prin cerintele lor nutritive reduse, ceea ce faciliteaza cultivarea si manipularea lor (Lazar, 2001). Din acest grup fac parte atat enterobacterii condiționat patogene (genurile Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Morganella, Proteus, Providencia, Serratia, Edwardsiella), cat si strict patogene (genurile Shigella, Salmonella, Yersinia).

1.1. Consideratii taxonomice

Morfologia tipica pe mediul solidificat este de bacili imobili sau mobili cu flageli peritrihi, dar in probele clinice este mult mai variata. Unele specii sunt capsulate (Klebsiella sp.), dar majoritatea sunt necapsulate. Familia include aproximativ 30 de genuri si 110 specii, majoritatea comensale, dar si specii patogene (produc diaree, gastroenterite, enterite, dizenterie, adenite mezenterice, febra septicemica) (Chifiriuc si colab., 2011).

Multe genuri cuprind specii noi, descrise sau considerate ca apartinand la aceste grupuri taxonomice in ultimul deceniu. Majoritatea nu au inca o semnificație medicala bine definit. Genurile Escherichia si Shigella au fost redefinite, iar Klebsiella, Serrația, Enterobacter, Citrobacter au fost extinse cu un numar mare de specii (Buiuc si Negut 2008).

1.2. Caractere morfologice si de cultura

Enterobacteriile sunt bacili Gram negativi nesporulați (pe frotiu diferite enterobacterii nu se disting morfologic), fara exigente nutritive, aerobi, facultative anaerobi, fermenteaza numeroase glucide, adeseori cu formare de gaze, sunt pozitive pentru catalază, oxidază negative, reduc NO3 la NO2. Fermenteaza glucoza, cu sau fara producere de gaz, proprietate metabolica importanta pentru diferențierea de alte bacterii (bacilli Gram negativi glucozo-fermentativi) (Chifiriuc si colab., 2011).

Definitoriu enterobacteriaceele sunt organisme facultativ anaerobe, care se dezvolta optim la 35 – 37 ˚C (Figura 1) pe medii nutritive simple.

Figura 1.Tulpina de E.coli ATCC 8739. Cresterea coloniilor pe mediu de cultura solid TSA (Imagine Originala)

Aspectele comune ale culturii sunt: i) colonii de tip S (smooth) -Colonii de 2-3 mm, rotunde, bombate, umede cu suprafata neteda si marginile regulate si ii) colonii de tip R- Colonii de 2-3 mm, rotunde plate, cu suprafată rugoasa si marginile neregulate (Figura 2), iii) crestere invaziva: in jurul coloniei se dezvoltă zone de migrare concentrice (caracteristica pentru genul Proteus) (Buiuc si Negut 2008).

Cele particulare sunt reprezentate de colonii mucoide de 4-5 mm, rotunde, bombate, cu margini regulate, tendinta de confluare.

Figura 2.Tulpina de E.coli ATCC 8739. Cresterea coloniilor pe mediu de cultura solid MacKonkey Agar(Imagine Originala)

1.3. Caractere microscopice

Enterobacteriaceele sunt bacilli Gram negativi ce nu sporuleaza, cu dimensiuni de 0,4 – 0,6μm in grosime si 2-3 μm in lungime. Prezintă structura caracteristica bacililor Gram negativi. Invelisul extern al peretelui bacterian are o importanta majora. Endotoxina se identifica cu portiunea lipidică a lipopolizaharidului (LPS) somatic. Poate prezenta si antigene de invelis (capsulare). Flagelii prezenți la toate Enterobacteriaceaele sunt dispusi peritrich. Mobilitatea este o proprietate definitorie pentru acest gen (Balbaie, 2002).

1.4. Caractere biochimice

Enterobacteriile se caracterizează printr-un metabolism respirator si fermentativ. Echipamentul lor enzimatic este in consecinta complex, permitand dezvoltarea in condiții modeste fara cerinte nutritive speciale. Deasemenea toate grupele din aceasata familie au capacitatea de a produce catalaza, oxidaza si de a reduce nitrații la nitrițti. Particularitatile metabolice fata de nitratii de carbon, protein lipide, acizi nucleici si saruri ale unor acizi organici, au generat o multime de teste a acaror gama este in continuă crestere. Dinte testele avand ca substrat acizii organici ori sarurile lor, numai cresterea pe medii cu citrat ca unica sursa de carbon, scindarea malonatului de sodiu si producerea de acid din mucat de Na sunt folosite in mod obisnuit in schemele pentru diferențierea genurilor si speciilor (Balbaie, 2002).

Necesitatea definirii si identificarii entitatilor taxonomice incluse in familia Enterobacteriaceae a determinat o importanta largire a gamei de teste biochimice.

Sistemele conventionale, asociaza teste variabile ca si complexitate in functie de scopul urmarit. Sistemele conventionale reprezinta punctul de referință pentru toate celelalte sisteme test exoenzimatice (Buiuc si Negut 2008).

In prezent sunt utilizate metode cromogene cum ar fi cea pentru testul oxidazei, care se efectueaza inaintea altor teste biochimice, toate enterobacteriile fiind oxidazo-negative. Utilizarea testelor individuale se realizeaza doar atunci cand rezultatele celorlalte teste sunt neconcludente (Lazar, 2001).

Sistemele multitest reprezintă asocierea mai multor sisteme in acelasi volum test, acestea au cunoscut o larga raspandire datorita avantajelor economice. Cele mai folosite sunt asocierile TSI (Triple Sugar Iron); MIU (Mbilitate, Inodol, Uree), MILF (Mobilitate, Inodol, Lizina, Fenilalanina) si testul Citratului.

– Sietemele microtest, precum Api 20E (Figura.3), reprezinta sisteme de identificare performant care permite identificarea unui numar mare de specii de enterobacterii in 18-24 ore, (Lazar, 2001).

Figura .3.Tulpina de E.coli ATCC 8739. Identificare pe trusa Api 20E.(Imagine Originala)

Testarea proprietatilor serologice prin teste calitative pentru antigenele O si cantitative in tub pentru antigenele O si H pentru evidentierea antigenelor bacteriene cu scopul serotipizarii tulpinilor izolate si realizarii unor studii de epidemiologie. Identificarea biochimică a unor tulpini de Salmonella, Shigella si E.coli din gastroenterite trebuie considerate o identificare prezumtiva si trebuie confirmata serologic.

Determinarea sensibilitații la substanțe antibiotice (determinarea antibiotipului) prin metoda disc difuzimetrica, (metoda Kirby-Bauer).

Metoda discurilor pentru determinarea sensibilitații la antibiotice poate sa nu detecteze intodeauna tulpini rezistente, mai ales cand se testeaza cefalosporinele, astfel ca se recomanda utilizarea metodei dilutiilor si metoda E test. Detectarea tulpinilor rezistente este importantă pentru pacient, dar si pentru monitorizarea infeciilor nosocomiale (Lazar, 2001).

1.5. Serotipizarea

Pentru identificarea enterobacteriaceelor, trei tipuri de antigene sunt importante: antigenele O (somatice), antigenele K (de invelis), antigenele H (flagelare).

– Antigenul O, reprezentat de polizaharidul regiunii externe a LPS, este alcatuit din secvente glucidice repetitive, este termo si alcoolo rezistent si se evidentiaza prin reactia de aglutinare. Fiecare gen de enterobacterii are un antigen O cu specificitate de grup, dar un singur organism poate avea cateva antigene O. Uneori grupuri diferite de enterobacterii (Sigella sp. si E.coli) au antigene O comune. Serul imun anti-O de E. coli reactioneaza incrucisat si aglutineaza celule de Providencia sp., Klebsiella sp., Salmonella sp.

– Antigenul K, este localizat la suprafața celulei, extern in raport cu antigenul O. La unele genuri (Klebsiella sp si E. coli), antigenul K este de natura polizaharidica iar la altele este de natura proteica. Prezenta antigenului K mascheaza antigenul O si inhiba aglutinarea bacteriana cu anticorpi specifici anti-O.

– Antigenul H, este reprezentat de proteina flagelara. Determinantii antigenici de tip H sunt reprezentați de secvențe de aminoacizi ai flagelinei, proteina structural a flagelilor (Chifiriuc si colab., 2011).

1.6. Endotoxine

In membrana externă a bacteriilor Gram negative se gaseste complexul molecular lipopolizaharidic (LPS). Endotoxinele sunt relativ termo-stabile si mai putin toxice decat exotoxinele, iar efectele lor sunt lipsite de specificitate. Din punct de vedere chimic, endotoxinele LPS sunt macromolecule complexe ce contin fosfolipide si polizaharide. Toxicitatea lor rezida in fractia fosfolipidica. Nu se denaturează si nu rezultă anatoxine.

Endotoxinele LPS reprezinta 25% din moleculele de suprafată ale celulei si sunt esențiale pentru integritatea membranelor externe (Chifiriuc si colab., 2011).

Prin mecanisme fiziopatologice endotoxinele sunt responsabile de:

– socul endotoxic

– coagularea intravasculara diseminata (CID)

– febra

– leucopenia

– hipotensiunea

– actiunea aborigena (Balbie si Pozsgi, 2002).

1.7. Hbitat si implicatii in patologie

Enterobacteriaceele sunt omniprezente in microbiota intestinala a animalelor si omului. Fecalele contin peste 10% enterobacterii/g. Pe aceasta cale se raspandesc larg in mediu ambient: sol, ape, plante si animale. Specii din genurile Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serrația, Proteus sunt prezente in mediile natural, participand la reciclarea biologică.

Cu anumite exceptii, enterobacteriile intalnite la om sunt reprezentate de patogeni intestinali, fiind cauza cea mai frecventa a sindromului diareic infectios.

Genurile Salmonella, Yersinia, Shigella si unele patotipuri de E.coli sunt “patogeni intestinali frecventi”, izolarea lor fiind intodeauna clinic semnificativa. Studii multiple releva, de asemenea, rolul dominant al enterobacteriilor in infecțiile tractul urinar. Intre acestea Escherichia este cel mai frecvent gen, fiind urmat de Klebsiella ssp., Enterobacter spp., Protyeus mirabilis, Citrobacter spp. si specia Serratia marcescens.

Cel putin o treime din pneumonii si infectiile cavitatilor convexe tractusului respirator sunt determinate de asemenea de Enterobacteriaceae.

Salmonella typhi si paratyphi ca si Yersinia pestis determina intodeauna infecții grave septicemice, dar frecventa lor a devenit extrem de restransă (Buiuc si Negut, 2008).

Agenții etiologici ai gastroenteritelor raman adesea nedetectati; investigatii epidemiologice recente raporteaza o rata de detectare a bacteriilor enteropatogene in materiile fecale variind intre 29,1% si 52,8%. Printre agenții enteropatogeni descrisi in ultimii ani figureaza agenti precum E.coli enteropatogen, ca si unele bacterii considerate anterior ca simpli comensali ai tractului intestinal (Lazar 2011).

Din anul 1982 cand pentru prima dată a fost inregistrat un focar cu serotipul O157:H7, acest serotip a fost cel mai des raportat ca agent etiologic in focare cu extindere de complicatii renale de tipul sindromului hemolitic uremic, cu evolutie uneori fatala. Cel mai extins focar cunoscut vreodata, produs de E.coli O157:H7, s-a produs in Japonia, intr-o scoala, si a afectat 6300 de copii, la doi dintre acestia evolutia fiind letala (Damian si colab., 2011).

In ciuda acestor cifre alarmante, agentii etiologici ai gastroenteritelor infectioase raman adesea nedetectati. Tulpini de enterobacterii lactozo-fermentative, apartinand unor specii care sunt membri ai microbiotei intestinale autohtone si deci nepatogene in mod normal, dobandind determinanți genetici care codifica factori de virulența, cum ar fi toxine, structuri de suprafata din categoria adezinelor, siderofori, care isi pot manifesta potentialul patogen generand infectii oportuniste.

Enterobacteriile reprezinta familia cea mai numeroasa de bacteri implicate in patologia umana si anume in:

– patologia enterala (digestivă): E. coli si specii ale genurilor Salmonella,Yersinia, Shigella.

– patologia urinară, E.coli, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Proteus.

– patologia respiratorie, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Enterobacter, E.coli

– patologia meningeala, Salmonella dar si Klebsiella, Serratia

– patologia localizată a partilor moi, E.coli, Serratia, Proteus (Lazar, 2001).

1.8. Rezistenta la agenți fizici, chimici si biologici

Enterobacteriile supraviețuiesc in sol si apa luni de zile. Majoritatea tulpinilor sunt distruse prin expunerea la 60˚C timp de 30 de minute. Tulpinile de E.coli sunt sensibile la actiunea antisepticelor uzuale: fenol, sublimat, cloramina etc. Sunt sensibile la actiunea unor coloranți, cum ar fi verdele brilliant, verde malachite, clorură de litiu, sarurile de selenium teluritul de poitasiu, care au actiune bacteriostatica asupra tulpinilor de E.coli. Tulpinile de E.coli sunt sensibile la actiunea bacteriofagilor: iar unele tulpini sunt liziogene. Rezistenta tulpinilor de E.coli fata de antibiotic si chimioterapice este in crestere, mediate de unele cazuri de plasmide (Chifiriuc si colab., 2011).

Aceste microorganisme sunt sensibile fata de o serie larga de antibiotic, precum; I. Betalactamine (ampicilina); II. oligozaharide (streptomicina); III. antibiotice cu spectru de „tip steptomicinic” (Neomicina Kanamicina, Polimixina B); VI. antibiotice „cu spectru larg” (Tetraciclina, Cloramfenicolul); V. Sulfasmide (Nitrofurantoinul); VI. Chimioterpice urinare (Cotrimoxazolul) (Balbie, 2002).

1.9. Patogenitate si virulența

Patogenitatea tulpinilor de E.coli este datorata unor factori de virulență (tabelul 1), asociati peretelui celular( factori de aderența si colonizare antigenică, antigene capsulare, antigenul somatic O) sau solubili (hemolizine, enterotoxine, siderofori).

Tulpinile patogene de E.coli poseda diferite adezine care se deosebesc prin capacitatea de hemaglutinare, morfologie, antigenitate și specificitate de receptori.

După natura lor chimică antigenele K se impart in doua categorii:

Antigene K de natură polizaharidică (K1); Antigene K de natura proteică (K88, K99);

K88 – determină aglutinarea hematiilor de cobai

K99 – determină aglutinarea hematiilor de cal (Chifiriuc si colab., 2011).

Capsula polizaharidica intervine in rezistență la mecanismele de aparare ale gazdei (Balbie si Pozsgi, 2002).

Factori de virulență atasati celular susține capacitatea bacteriilor de a adera de celulele epiteliale (Svanborg si colab., 1978).

Ambele antigene sunt codificate de plasmide.

Antigenele K polizaharidice sunt reprezentate de trei factori antigenici diferiti (antigenele L, A si B). In general, o tulpina de E.coli produce un singur antigen K.

Specificitatea antigenului O este data de secventa glucidica a catenei polizaharidice din molecula LPS. S-au identificat peste 170 serogrupe ale Ag O de E.coli.

Antigenul H, cu peste 50 de variante serologice, identifica serotipul E.coli. Serotipurile de E.coli sunt combinatii specific de antigene O si H. Antigenul K identifica tulpinile de E.coli prin specificitatea antigenică a capsulei. De exemplu, E.coliK1 este cea mai comuna cauza a faringitei commune la copii.

Cele mai multe tipuri bacteriene produc proteine termolabile de suprafață, cu structura filamentoasa, vizibile la microscopul electronic: fimbrii diferite din punct de vedere antigenic de Ag O, H, sau K.

Toxigeneza. O toxina comuna bacteriilor patogene Gram negarive, este antigenul somatic O, de natura glico-lipo-polipeptidica, termostabil. Rezista la actiunea alcoolului, formolului si acidului clorhidric.

Hemolizinele, codificate de plasmida Hly, produc liza hematiilor de la diferite specii de animale. E.coli produce 2 tipuri de hemolizine:

– α, filtrabila, antigenic;

– β, legata de corpul bacterian, nefiltrabila neantigenica.

E.coli produce doua enterotoxine:

– enterotoxina termolabila (LT). Are proprietati antigenice si este asemanatoare cu toxina holerică din punct de vedere al structurii functiei si mecanismului de actiune;

– enterotoxina termostabilă (ST). Este lipsita de proprietati antigenice.

Tabelul 1.Factori de virulentă si formele clinice produse de diferite patovaruri de E.coli (sursa: Chifiriuc si colab., 2011).

1.10. Mecanismele moleculare de rezistență la antibiotice

Bacteriile Gram negative sunt considerate in general mai rezintente decat bacteriile Gram pozitve la agenti antimicrobieni.

Plasmidele acestor bacterii (de exemplu: E.coli) confera rezistența nu numai la antibiotic, ci si la metalele grele (de exemplu: ionii metalici din clorura mercurica). S-au facut studii care au demonstrat rezistența la antibiotic si metale grele la tulpini de E.coli izolate de la om, din apa de rau, ape reziduale, alimente. Frecventa rezistenței la antibiotic si metalele grele la tulpini E.coli izolate din alimente reflecta gradul de contaminare a mediului cu aceste substante. Prin urmare, prezenta in probele de alimente a tulpinilor de E.coli multirezistente la antibiotic si metale grele reprezinta un potential risc de imbolnavire (health hazard) pentru consumatori.

Microbiologii sunt in present alertați de emergențta entrobacteriilor care prezinta rezistența multiplă la antibiotic. Unul din mecanismele prin care rezistență poate aparea la tulpini anterior sensibile este transferul fara bariere de specie si gen al plasmidelor R, transfer ce se face cu multa usurintă in intestine, unde densitatea populaționala a enterobacteriilor este foarte mare. Bacteriile Gram negative enterice poseda in mod obijnuit o singura plasmida mare care codifica rezistența la antibiotic. De exemplu, la K pneumonie sunt prezente gene care codifica sinteza β-lactamazei, gene care codifica factori de virulență pentru sideroforul aerobactina si operonul cf29, care codifica o adezina nefimbriala CF29K (implicate in fenotipul difuz de aderenta), toate gasindu-se pe aceeasi plasmida conjugativa (Lazar 2011).

Antibioticoterapia excesiva reduce biodiversitatea bacteriana favorizând colonizarea gazdei umane cu bacteri oportuniste rezistente la diverse antibiotice. La ora actuala bolile infectioase reprezintă o problema majora pentru sanatate datorita fenotipurilor de rezistență la care nu se mai pot aplica protocoalele terapeutice clasice (Jones, 1997).

Conceptul de rezistență microbiană defineste capacitatea unor microorganisme patogene de a supravietui si de a se multiplica in prezena antibioticelor. Bacteriile rezistente sunt sau devin tolerane la antibiotice. In momentul expunerii la un antibiotic, bacteria este selectată pentru rezistenă. Datorita acestui proced biologic este posibila rezistenta tulpinilor microbiene (Fedesa, 2000).

Desi s-a prevăzut evoluia rezistenei fată de aceste medicamente, nu au fost intuite mecanismele prin care genele care confera rezistență se vor răspandi. Prin urmare, agentii antimicrobieni care se vor folosi in viitor trebuie să evite selectarea de mutante rezistente.

O cauză importantă a esecului terapeutic în infectiile cu bacilli Gram-negativi (BGN) o constituie rezistenta bacteriana la antibiotice. Selectia antibioticelor, prin efecte directe si indirecte, a determinat o crestere a frecvenței infectiilor comunitare sau nosocomiale cu tulpini rezistente si multirezistente (Lipsitch si colab., 2002).

Efectul antibioticelor si al agentilor chimici antimicrobieni poate fi contracarat prin mai multe mecanisme (figura 4), unele mecanisme sunt intrinsece bacteriei; alte mecanisme rezulta din mutațiile genelor ce codifica pentru structurile tintă sau din dobandirea genelor ce modifica sau hidrolizeaza antibioticele (Mihaescu si colab., 2007).

Figura 4. Ilustrarea schematic a principalelor mecamisme care detrmina rezistenta la antibiotice.

Genele plasmidiale de rezistenta codifica sinteza proteinelor de efflux, enzimele care degradeaza antibioticul sau enzimele care modifica structura antibioticului (Adaptat dupa Mihaescu si colab. 2007).

1.10.1. Inactivarea enzimatică a antibioticelor

Inactivarea enzimatică a antibioticului este cel mai comun mecanism prin care se naste rezistentă la o varietate largă de tipuri structurale de antibiotice.

Gene codificatoare ale enzimelor ce inactiveaza diferitele antibiotice se gasec in rezerva naturală de gene de rezistente. Genele ce codifica sinteza enzimelor inactivatoare pot fi transferate prin conjugare. Antibioticele pot fi inactivate prin clivaj enzimatic sau prin modificare chimica astfel incat ele nu mai sunt transportate in celula sau nu mai inteactionează cu tinta specifica. Modificarea chimica poate conferi rezistență clinica la aminoglicozide, cloramfenicol, peniciline, cefalosporine. B-etalactamazele catalizeaza hidroliza ciclului B-lactamic (Bachmann si colab., 1998), iar acetil transferazele transferă un grup acetil de la un donator la un grup funcțional al antibioticului, convertindu-l la forma sa inactivă.

Unele bacterii pot sintetiza enzime care distrug agentul antibacterian sau pot modifica calea de intrare a antibioticului în celulă sau de legare a acestuia la nivelul țintei (Braun si colab., 2004).

1.10.2. Efluxul activ al antibioticelor

ADN cromosomal si plasmidial bacterian poseda un mare rezervor de gene de rezistență, ce codifică diferite mecanisme de rezistentă la medicamente, precum: pompe de eflux, enzime inactivatoare ale antibioticelor, enzime implicate in modificarea țintei actiunii antibioticului.

Efluxul transmembranar al antibioticelor este un mecanism foarte eficient al rezistentei. Sistemele de rezistentă prin flux sunt dependente de energie si pot fi sisteme de transport activ primare sau secundare. Pompele de eflux pot fi specifice pentru un anumit medicament (de exemplu, sistemul de transport TetBla la E.coli, elimina tetraciclina si un spectru ingust de analogi structurali) sau transportă o larga varietate structurală de medicamente si de aceeea s-au numit pompe cu functie transportoare multiplă.

Specificitatea de actiune a pompelor de eflux este variabila.

Sistemele de eflux au o semnificatie clinica majora: dobandirea unui astfel de sistem scade sensibilitatea la un spectru larg de agenti chimioterapeutici.

Cea mai bine caracterizată pompa de eflux este glicoproteina P, care confera rezistentă la un spectru larg de medicamente citotoxice prin exportul dependent de ATP.

Primele proteine identificate ca transportoare ale medicamentelor au fost pmpele de eflux pentru tetraciclină, care confera rezistentă bacteriilor Gram positive si Gram negative (Mihaescu, si colab., 2007).

Diminuarea permeabilității apare mai ales la nivelul membranei externe a bacteriilor Gram-negative, la care porii se obturează parțial sau total sau pot uneori să dispară. Mutații care afectează lipopolizaharidul pot duce la scăderea accesibilității antibioticelor prin porii de la exteriorul membranei externe.

Modificările apărute la nivelul membranei citoplasmatice pot fi implicate mult mai rar (rezistența la aminoglicozide prin modificarea sistemelor de transport). Sistemele de eflux sunt alcătuite din proteine particulare cu rol de pompe, care utilizează o forță proton-motrice care expulzează antibioticul de când pătrunde în celula bacteriană. Aceste sisteme de eflux pot apărea la diferite clase de antibiotice: fluorochinolone, cloramfenicol, tetracicline, dar și beta-lactamine, consitituind sistemele de rezistență multiplă (Jehl si colab., 2004).

1.10.3. Rezistenta prin impermeabilitatea porinelor

Bacteriile Gram negative pot dobandii rezistența inaltă ca rezultat al mutațiilor care modifica porinele si astfel rata difuziei pasive a medicamentului scade foarte mult. Influxul mediat de porine este contracarat de efluxul activ. Structura moleculară dar in special datele experimentale, sugerează ca antibioticele mici (B-lactamice, tetraciclina, cloramfenicolul, fluoroquinolonele) patrund in celula in special pe calea porinelor, cel putin la enterobacterii care poseda porine cu permeabilitate inaltă. Antibioticele cu molecule mari lipofile (macrolide, rifampicinele, novobiocina, acidul fuzidic) difuzeaza cu dificultatea prin porii canalelor. Saderea permeabilitații porinelor poate sa mereasca nivelul rezistentei. Pierderea mutationala a porinelor creste rezistența la antibiotice hidrofile, deoarece aceste molecule sunt mai mari decat nutrienții si trec greu prin canalele de transport ale acestora.

1.10.4. Modificarea mutationala a tintei antibioticului

Multe antibiotice pot inactiva o enzima specifica sau pot sa interfere cu functia ribosomilor (Mihaescu, si colab., 2007).

Rezistenta la o mare varietate de antibiotice poate duce la modificarea situsului de legare ribosomal. Dacă antibioticul nu se leagǎ la situsul tintǎ de pe ribosom își pierde abilitatea de a inhibă sinteza proteinelor și creșterea celulei. Modificarea situsului tintă de pe ribosom este principalul mecanism de rezistență multiplă la bacteriile aerobe și anaerobe Gram pozitive. La unele bacterii, pot apărea modificări ale enzimei țintă, astfel încât aceasta să rămână functională și să confere rezistență la agentul antibacterian, iar altele dezvoltă rezistență prin producerea unui număr mare de enzime țintă (Braun si colab., 2004).

1.10.5. Utilizarea unor cai metabolice alternative (de ocolire a caii metabolice inhibate)

Daca un antibiotic este activ prin inhibarea unei enzime esentiale a unei cai metabolice, celulele care produc o cantitate mai mare de enzima pot supraviețuii in prezenta antibioticului.

Rezistența multiplă la medicamente poate sa apară prin urmatoarele mecanisme:

Mutațiile genelor codificatoare ale sintezei moleculelor membranare transportoare cu rol fiziologic, urmata de amplificarea lor si schimbarea nivelului de activitate;

Mutațiile genelor reglatoare, care amplifică expresia transportorilor multiplii;

– Transferul intercelular al genelor de rezistentă, prin intermediul transpozonilor sau al plasmidelor.

Localizarea membranară a pompelor de eflux a ingreunat eforturile de a definii mecanismele moleculare care guverneaza activitatea acestor proteine.

Progresul cunoasterii a fost mult mai rapid in ceea ce priveste reglarea activitatii pompelor de eflux.

Supraproductia constructivă a proteinelor de eflux, in absenta agentului chimic, creaza un dezavantaj semnificativ in competiția cu cele care exprima adaptativ proteinele de eflux (Mihaescu, si colab., 2007).

CAPITOLUL 2. Notiuni generale despre tehnica citometriei in flux

Citometria de flux reprezintă o abordare tehnică nouă, de mare complexitate ce permite determinarea simultană a mai multor parametric fizici si chimici caracteristici unei singure celule aflate in miscare intr-un curent lichid (Melomed si colab.,1990).

Una din aplicatiile clinice dintre cele mai curente ale citometriei in flux este determinarea antigenelor celulare, adica imunofenotiparea celulelor normale si patogene.

Anticorpii monoclonali sunt adevarati reactanti standard, cu ajutorul carora se poate studia ontogenia limfocitelor, si se pot separa diferitele populații si subpopulații de limfocite ca si de leucocite polimorfonucleare. S-a putut stabili relații dintre fenotipul acestor celule si functiile lor.

2.1. Aplicatii in microbiologie

Citometria in flux poate fi utilizata pentru urmatoarele activitati desfasurate in laboratorul de microbiologie, in urmatoarele domenii:

In microbiologia clinică:

Pentru izolare si identificare de microorganisme,

Pentru detectia directa a compusilor microbieni in probe clinice,

Pentru monitorizarea raspunsului imun in timpul sau dupa infectie,

Pentru monitorizarea statusului clinic dupa chimioterapie,

Pentru optimizarea unor teste de determinare a sensibilitații microorganismelor la diferiti agenți antimicrobieni (antibacterieni, antifungici, antiparazitare, antivirale)

In Ecologie microbiană

Pentru determinarea numarului de microorganisme dintr-o proba,

Pentru evaluarea unor parametrii morfologici,

Pentru viabilitatea microorganismelor,

Pentru activitatea metabolica,

Pentru izolarea de tulpini din probele prelevate.

In Industria alimentara

Pentru determinarea numarului total de microorganism dintr-un produs,

Pentru detecția unor grupe de microorganisme de inters (coliformi, Staphylococcus sp.),

Pentru detecția de patogeni (Salmonella, Listeria),

Pentru viabilitatea tulpinilor – panificatie.

De asemenea se pot urmari modificarile in timp ale starii fiziologice in cursul proceselor microbiene industriale.

Folosind sonde fluorescente adecvate, este posibil să se măsoare proprietățile funcționale ale celulelor, (figura 5), cum ar fi nivelurile de expresia genelor și potențialul membranei citoplasmatice și mitocondriale. 

Figura 5. Reprezentare grafica a potentialului membranar cellular (Potential de membrana scazut, stanga; Potential de membrana crescut, dreapta). La potential de membrane scazut fluorocromul ramine in mediul extracelular, in timp ce la potential crescut, se acumueaza intracellular in cantitati ridicate (dupa: Kulaga 1998).

2.2. Informații furnizate de citometria in flux

Citometria in flux inlocuieste progresiv in laboratoarele de imunologie microscopia de fluorescentă in efectuarea rapidă de analize pe un numar mare de celule in suspensie cu posibilitatea sortarii celulelor.

Citometrul foloseste un fascicul luminos manocromatic cu o lungime de unda de 488 nm generat de un laser de argon. Celulele din suspensie trec una cate una prin fascicul fapt tradus prin semnale optice. Semnalele optice sunt converite in impulsuri electrice apoi memorate, ordonate si reprezentate procentual si grafic de calculator.

O prezentare de ansamblu a functionarii unui citrimetru de flux implică in general urmatoarea succesiune de evenimente:

suspensia de celule intra in contact cu un set de anticorpi monoclonali marcați cu anumite substante fluorescente;

suspensia trece printr-un dispozitiv de reglare a fluxului (camera de curgere), ce determină alinierea celulelor intr-un curent unicelular pe sectiune;

interesecția celulelor cu un fascicul laser ce soldeaza cu dispersia luminii si emisia de fluorescență;

un sistem de detectie analizeaza semnalele rezultate obtinandu-se date despre dimensiunea si complexitatea structurală a celulei si prezenta unor structuri antigenige corespondente anticorpilor marcati;

curentul fluidic este fragmentat in picaturi (ce contin celule) prin aplicarea energiei sonice la nivelul camerei de curgere;

indeplinirea de catre celula a unor condiții predefinite prin programare determina plasarea pe picatura ce o contine o sarcina electrica;

picaturile incarcate lectric sunt deflectate intr-un camp electrostatic si apoi colectate corespunzator.

O cale simplă de a intelege functionarea unui ctimetru de flux si informatiile pe care acesta le oferă este aceea de a percepe sistemul sub forma unui microscop cu lumină fluorescent.

Ambelele tipuri de aparate permit operatorului realizarea analizelor prin evaluarea intensitații fluorescentei si a semnalelor de dispersie a luminii. La examinarea unui camp intunecat se observa fenomenul de dispersie a luminii, putand fi determinate atat marimea celulei, cat si granularitatea acesteia. Un al trei-lea tip de informative este reprezentat de emisia de fluorescentă asociatată celulelor marcate cu floorocromi. Atunci cand filtrele de fluorescenta sunt inserate, lumina incidenta nu mai este vizibilă aparand doar fluorescenta elementelor de camp. Devine evident faptul ca cei doi parametrii nu pot fi vizualizati concomitent, ceea ce face dificila identificarea celulelor. Intensitatea luminii (provenita de la celula) poate fi evaluata de catre un operator experimentat ca fiind crescuta, scazuta sau absenta, grosiera a proceselor analizate. Daca ochiul (senzorul, in cazul examinarii microscopice) este inlocuit cu un sistem de detecti de natură electronică, intensitatea luminii sau fluorescență emise de catre celule pot fi cuantificate obiectiv si precis.

Prin inserția detectorilor si eliminarea consecutiv a subiectivitatii ochiului uman se realizează un pas major catre conceperea unui instrument total nou. Un al doi-lea pas ar fi acela de a “privi” una cate una si nu toate in acelasi timp. Intr-un fel de sistem, celulele individuale pot fi evaluate intr-un punct bine definit. La acest punct de masurare se determină intensitatea luminii dispersate atat in directia fasciculului incident, cat si in unghi drept fața de acesta. Concomitent este analizată intensitatea unui eventual semnal fluorescent emis de celulă. Datele obtinute se concretizeaza in informații despre morfologia celulei respective si prezența unei structuri de natură antigenică ale acesteia (Gerster si colb., 2005).

2.3. Dispersia luminii

Citometria in flux se bazeaza pe cateva fenomene fizice generate de utilizarea a fluorocromilor.

Dispersia luminii este definita ca fiind rezultatul unui proces fizic de interactiune dintre o particulă (ex. o celula) si un fascicul luminos, prin care se modifică doar directia luminii incidente nu si lungimea de unda a acesteia.

Caracteristicile si componentele celulare care contribuie la dispersia luminii sunt: dimensiunea, forma, aspectul suprafetei membranei (rugos sau neted), nucleul, orice material granular intern.

Lumina nu este dispersata in mod egal in toate direcțiile, existand doua situații particulare. Reprezentand grafic direcțiile de dispersie se observă o dependentă intre dimensiunea vectorului de intensitate si valoarea unghiului de dispersie α.

Pntru un unghi α = 0, disperia este maxima, acesta situatie corspunzand unei direcții paralele cu a fasciculului incident. Prescurtarea “FS”- reprezentand initialele pentru “Forward Scatter” (engl.Forward=inainte, scatter=dispersie, imprastiere). Lumina detectată in lungul axei incidente (FS) –rezultatul fenomenului de difractie – prezintă o intensitate proportională cu dimesiunea celulei.

Prescurtarea folosita pentru cealalta directie este “SS” reprezentand inițialele cuvintelor “Side Scatter “ (engl. Side=lateral). Lumina detectată perpendicular pe directia de incidentă (rezultatele fenomenelor de refractive si reflexive) este proportional, ca intensitate, cu granularitatea si complexitatea celulei. In directiile privilegiate prezentate (FS si SS) exista detector care genereaza la iesire semnale electrice proportionale cu intensitatea luminii captate. Prin amplificarea si prelucrarea acestor semnale se obtin informatiile deja mentionate ce permit, de exemplu, identificarea calselor de leucocite prin corelarea semnalelor FS (dimensiune) cu cele SS (granularitate). Pot fi astfel observate limfocitele, granulocitele si monocitele, fiecare prezentand o dispunere caracteristică (Philip 2002).

2.4. Emisia de fluorescenta

Detectia fluorescentei reprezintă o caracteristică fundamentală a citometriei in flux. In timp ce dispersia luminii oferă parametrii folositori pentru identificarea unor clase majore de celule dintr-o populatie heterogena, emisia de fluorescentă permite sub clasificarea celulelor, determinarea continutului de AND si analiza proprietatilor fiziologice ale celulelor vii.

Exista trei motive fundamentale pentru care fluorescenta, in acest caz este utilă.

In primul rand, semanul de fluorescentă provenit de la fiecare celula poate fi corelat in cateva microsecunde in timpul traversarii fascicolului luminous incident. Datorită faptului ca moleculele raman in stare excitată un timp de ordinul nanosecundelor inainte emiterea fluorescenței, fiecare poate fi exercitată de cel putin 10000 ori daca raza este suficient de intense. Rezultă astfel o mare sensibilitate ce permite detecția chiar a 1 000 de molecule antigenice/celula (presupunand ca autofluorescenta – emisia luminoasă generată doar de compozitia chimică a celulei si semnalele de fundal nu sunt prea crescute).

In al doi-lea rand, emisia diverselor substante fluorescente se situează in zone distincte ale spectrului luminos, oferind posibilitatea simultană a mai multor fluorocromi. Prin combinarea datelor de dispersie cu semnalele multiple de fluorescentă, este posibilă discriminarea fina a mai multor subpopulatii celulare dintr-o singura probă si in aceiasi masura, asocierea prezentei unui anumit marker cu subpopulații limfocite(de exeplu raportul dintre limfocitele T heloer si T supresoare) este mai exactă atunci cand fiecare tip celular este detectat simultan. De asemenea, folosirea unui indicator al continutului de AND impreuna cu alti parametrii decelati simultan prin citometrie de flux, permite corelarea proliferarii tumorale cu tipul celular implicat.

In al trei–lea rand, se pot obtine si date de fiziologie celulară. Astfel, anumite molecule fluorescente prezintă proprietati, cum ar fi spectrul de excitație, spectrul de emisie si randamentul de fluorescenta, sensibile la conditiile de mediu celular in care se gasesc. Flurocromii respectivi pot fi deci utilizati in experimente ce isi propun obtinerea de informații asupra mecanismelor intime ale unor procese celulare.

2.5. Componentele principale ale unui citometru de flux

– Sistemul hidraulic: are rolul de a prezenta celulele din probă, una cate una(figura 6 ) unui dispozitiv de masurare. Suspensia celulară ajunge la camera de curgere.

Figura6. Celule suspendate intr-un mediu lichid (dupa: Gerstner,5005)

fiind apoi propulsată printr-un ac de injecție cu un orificiu foarte mic intr-un curent lichidian extern (“de invelis”) cu diametru mai mare, aflat in curgere rapida.( Pe masura ce ambele curente lichide (fluindul contaminand proba – situatat intern si fluidul “de invelis”- situate extern) inaintează in camera de curgere, viteza lor focalizeaza hidrodinamic suspensia celulara (figura 7) Curentul intern are diametrul aproximativ egal cu cel al celulelor din proba care, in acest mod, sunt constranse sa se deplaseze una cate una prin dreptul unui fascicul luminous de excitație (raza laser).

Figura 7. a). Curgere laminara:eritrocite umane cu aspect elongat, orientate uniform datorita focalizarii hidrodinamice; b). Curgere turbulenta: in apropierea peretelui tubului celulele sunt deformate, iar deplasarea acestora este perturbata (dupa Melamed si colab., 1990).

Pe masură ce celulele trec prin dreptul acestuia, fiecare dintre ele dispersează lumina incidentă si emite eventual, fluorescent (generate de fixarea reactivilor marcati sau chiar de compozitia interna) (dupa Daco, Agilent Technology, www.dako.com). Lumina dispersată este captată pe doua direcții: una paralelă cu fasciculul incident (FS) iar a doua perpendicular fată de acesta SS). Emisia fluorescență este captată pe o direcție perpendicular fată de fasciculul incident. Pentru a separa componentele spectrale ale emisiei fluorescente sunt utilizate filtre optice.

Determinarea intensitații luminii dispersate si a emisiei de fluorescență precum si prelucrarea semnalelor obtinute va permite caracterizarea celulelor analizate.

Deoarece metoda isi propune sa efectueze determinari ale caracteristicilor unei singure celule, este important sa se folosească suspensii omogene, prezenta dubletelor sau a agregatelor de dimensiuni mai mari, putand compromite exactitatea rezultatelor.

– Sistemul optic: este alcatuit din elemente (figura 8), ce pot fi grupate intr–un sistem optic de excitație (sursa luminoasa si lentilele de focalizare) si intr-unul de colectare (filte, oglinzi si detectori).

Sistemul optic de excitație – sursa luminoasă are rolul de a produce un fascicul de excitatie avand o anumită intensitate si lungime de undă astfel incat sa stimuleze la un nivel acceptabil fluorocromii atasați de celula si sa determine o dispersie detectabilă după interactiunea cu acesta. Clasic, sursa de lumină este un laser (Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation) ce prezintă o emisie luminoasă monocromatică, unidirectională, coerentă si sincronă. Pot fi utilizate si alte surse luminoase de excitație cum ar fi lampile voltaice.

Sursele de excitatie laser reprezintă tipul de sursa cel mai frecvent intalnit. Din punct de vedere al citometriei de flux, caracteristicile relevante ale laserului sunt lungimea de undă, puterea si profilul intensitații fasciculului. Sunt folosite lasere cu xenon si vapori de mercur (Telfard, 2004).

Sunt folosite in mod curent lasere cu argon, heliu-neon (HeNe) si heliu-cadmiu (HeCd) iar laserele cu faza solida (neodimium YAG cu frecventa dubla si cele diodice) au intrat de asemenea in uz. Cele mai obisnuite lasere cu gaz sunt cele cu argon avand o putere de iesire de aproximativ 15mW la o lungime de unda fixa de 488nm. Aceste lasere sunt utilizate pentru a excita o gama larga de fluorocromi: derivati de fluorescina, phycoeritrina, iodura de popidiu.

Elementele optice de focalizare sunt proiectate pentru a oferi o iluminare uniformă fiecarei celule ce intersectează fasciculul.

Sistemul optic de colectare cuprinde:

– detectorul pentru dispersia in fată (SS) captează lumina dispersata de celule pe o directie apropiată de axa fasciculului incident, semnalul obtinut fiind proportional cu dimensiunea celulei.

– filtrele optice realizează separarea luminii colectate in componentele spectrale bine definite, permitand astfel analiza cantitativa a semnelor de fluorescență si respectiva dispersie(figura 8).

– detectarea fluorescentei si a luminii dispersate laterale. Spre deosebire de lumina dispersată pe direcția fasciculului incident, emisia de fluorescentă provenita de la celulele marcate prezintă o intensitate mai redusă cu cateva ordine de marime.

Figura8. Ilustrarea simpla a unui citometru in flux: sistem fluidic, optic si electronic (dupa: Gerstner, 2005).

Devine astfel necesar folosirea unui fotodetector special numit fotomultiplicator. Interacțiunea fotonilor incidenți cu fotocatodul tubului determină eliberarea de electroni ce sunt apoi accelerate intr-un camp electric aplicat pe suprafață diodelor in componenta tubului. Tuburile fotomultiplicatoare sunt cracterizate prin castigul de intensitate obținut si prin sensibilitatea spectrala in timp ce ultimul parametru este dependent de materialul de cintructie al fotocatodului, primul este determinat de numarul si tipul diodelor utilizate intervenind in plus si valoarea potentialului electric aplicat (cu cat tensiuna este mai mare, cu atat amplificarea este mai mare) (Telford, 2004). Sistemul optic de colectare are un detector pentru disperia in fața (SS) care capteaza lumina dispersată de celule pe o direcție apropiată de axa fasciculului incident, semnalul obtinut fiind proportional cu dimensiunea celulei si filtre optice realizează separarea luminii colectate in componente spectrale bine definite, permitand astfel analiza cantitativă a semnalelor de fluorescență si respectiv dispersie. La final are loc detectatarea fluorescenței si a lumnii dispersate lateral.

Spre deosebire de lumina dispersată pe directia fasciculului incident, emisia de fluorescență provenită de la celule marcate prezintă o intensitate mai redusă cu cateva ordine de marime. Devine astfel necesar folosirea unui fotodetector special numit fotomultiplicator. Interacțiunea fotonilor incidenți cu fotocatodul tubului determina eliberarea de electroni ce sunt apoi accelerați intr-un camp electric aplicat pe suprafața diodelor din componenta tubului. Tuburile fotomultiplicatoare sunt caracterizate prin castigul de intensitate obținut si prin sensibilitatea spectrala.

Lumina disperasată pe o directie pependiculară pe cea a fasciculului incident oferă, după analizare, informații asupra structurii interne a celulei. Trebuie totusi menționat ca semnalul captat pe aceasta direcție este influentat si de dimensiunea celulei astfel incat variatiile detectate reprezintă o reflectare a diferentelor de la nivelul structurii intracelulare si/ sau de marime. Desi nu este la fel de intensa ca lumina disperasată in fața, dispersia laterală este oricum mai puternică decat emisia de fluorescență.

Lumina disperastă pe o direcție perpendicular pe cea a fasciculului incident oferă, după analizare, informații asupra structurii interne a celulei. Trebuie totusi menționat ca semnalul captat pe această directive este influențat si de dimensiunea celulei astfel incat, variatiile detectare reprezintă o reflectare a diferențelor de la nivelul structurii intracelulare si/sau de marime. Desi nu este la fel de intensă ca lumina dispersată in fată, dispersia laterală este oricum mai puternică decat emisia de fluorescență (Guide to Flow Cytometry 2006).

2.6. Sistemul de prelucrare electronică a semnalelor

Rolul sistemului electronic este de a monitoriza și controla funcționarea fluxului citometrului (Guide to Flow Cytometry 2006).

Pot fi descrise trei etape distincte deprelucrare a luminii dispersate si fluorescenței emise de catre particula analizată.

In prima etapă, de prelucrare optică lumina provenită de la celule este colectată prin intermediul unor dispositive optice, fiind apoi selectate, prin filtrare, anumite lungimi de undă ce sunt dirijate catre detector.

In a doua etapă, conversia opico-lectrica la nivelul detectorilor genereaza un semnal electric proportional cu intensitatea semnalului optic captat. In prelucrarea electronică a senmalului impulsurile de natură electrica produse de detector intra intr-un process de amplificare urmat, eventual si de ințerventia altor circuite de ajustare.

Tipuri de semnale generate de catre detector: pot fi deosebite două tipuri de semnale electrice si anume semnalele “peak” (varf) si respective semnalele integrale.

Semnalele “peak” incep la linia de referința odată cu patrunderea particulei in interiorul fasciculului de excitație, cresc catre o amplitudine maxima – in momentul in care este atins centrul acestuia – revenind ulterior la valoarea initiala. Se deduce ca semnalul “peak” reprezinta intensitatea luminii emise de catre particula analizată, corespunzand de astfel, semnalului de iesire al unui detector.

Semnalele integrale obtinute prin integrarea in timp a semnalelor “peak“, prezintă o amplitudine proportional cu aria aflată sub curba ce corespunde acestora. Precizia semnalului integral este mai mare decat a semnalului de tip “peak “, eroarea relativă a unei determinari scazand pe masura ce mai multe venimente (in cazul de fata fotoni) sunt analizate. Urmand acest raționament putem deduce ca semnalele integrale prezintă o variatie static mai redusă comparativ cu semnalele “peak “corespondente.

Alte metode de prelucrare a semnalelor

Lumizozitatea semnalului poate produce efecte de interferență la nivelul detectorilor, un exemplu calsic ce ilustrează acest aspect fiind reprezentat de fluorescență reziduală din fluidul intern.

Compensarea electronică a suprapunerii spectrale in analizele fluorescente multiparametrice reprezintă, in majoritatea cazurilor, o necesitate absolută. Dacă s-ar utiliza fluorocromi ideali si filtre perfecte, celulele purtand numai markerul X vor genera un semnal detectat doar de fotomultiplicatorul corespondent, iar celulele purtand un ipotetic marker Y vor determina semnalele ce vor ajunge numai la celalalt fotomultiplicator. Din pacate, fluorocromii ce prezintă similitudini ale spectrului de absorbție au si un anumit grad de suprapunere spectrala la emisie, asa cum este cazul perechii ITCF/PE.

Achiziția, prezentarea si stocarea datelor etapa finala a unei determinari prin citometrie de flux presupune transformarea de natura electrica in valori digitale ce pot fi prelucrate, stocate si afisate de catre computerul anexat sistemului. Un component esential al sistemului de achizitie este convertorul analog-digital. Performantele acestuia sunt caracterizate de: viteza de conversie, uniformitatea dimensiunii canalelor si acuratetea transformarii. Odată convertite in format digital, datele pot fi preluate de catre computer. Pentru afisare si analiza se folosesc in mod obisnuit histograme de frecventa asociate profilurilor de intensitate determinate.

Histogramele cu un singur parametru nu pot preciza insa decat informații limitate. Nu putem sti astfel care celulă, din histrograma ce reprezinta distributia dimensiunii, corespondente unui anumite celule din histograma de fluorescența. Inițial, cei doi parametrii au fost corelați deoarece determinarea lor a avut loc simultan. Se impune deci prezentarea datelor pe o histrogramă alcatuita din doi parametrii, cum ar fi de exemplu dispersia in directia fascicului incident (FS) si emisia de fluorescența (FL). La intersecția valorilor corespunzatoare celor doi parametri este plasat un punct ce reprezinta o anume celulă analizată atat din punct de vedere al dimensiunii, cat si al fluorescenței asociate. Pot fi corelați in acest mod oricare doi parametrii din cei determinati, histograma rezultata numindu-se si “dot plot”.

Stocarea datelor se poate face sub forma de histograme sau direct intr-un dispozitiv special, ca date corelate secvențial. Deoarece cantitatea de date corelată de catre sistem poate fi foarte mare, continand eventual si informații despre particule nerelevante, există posibilitatea de a selecta anumite populații celulare care prezintă interes pentru aplicatia in cauză.

Aceasta functie se realizeaza prin intermediul “porțiilor” ce grupează celulele in fuctie de parametrii specifici determinati. După stabilirea “portii”sunt analizate doar celulele aflate in interiorul acesteia, rezultand o diminuare considerabila a duratei aplicatiei. Exista trei tipuri de “porti” disponibile citrometrelor de flux: rectilinii, eliptice si amorfice.

Porțile rectilinii reprezintă serii de limite superioare si inferioare pentru unul sau mai multi parametri. Numai celulele (sau particulele) prezentand valori de intensitate incadrabile intre limitele definite vor fi analizate de catre sistem.”Porțile “rectilinii sunt cel mai usor de stabilit, fiind asociate initial histogramelor cu un singur parametru si ulterior si celor biparametrice. Forma unei “porți” rectilinii este aceea a unui regiuni dreptunghiulare, fiind aplicabilă datelor aliniate pe axele histogramei.

“ Porțile” eliptice pot defini populații celulare care nu analizeaza cu axele histogramei si a caror forma este descrisă printr-o distributie gausiana bivariată.

“ Portile” amorfice au cea mai mare elesticitate putand fi utilizate pentru a defini populatii celulare.

2.7. Determinarea prin imunofluorescența a antigenelor celulare de suprafață

In cazul unei surse de excitație bazate pe un laser cu argon vor trebui alesi fluorocromi excitabili la lungime de undă a sursei de excitatie si anume 488nm. Cel mai utilizat fluorocrom din această categorie este izotiocianul de fluoresceina (ITCF). Asa cum se poate observa din spectrul de absorbție valoarea de 488nm este aproape de maximul de excitatie pentru ITCF. Excitarea la aceasta lungime de undă se va materializa printr-o emisie fluorescent puternică, iar folosirea unor lungimi de undă diferite, incadrate totusi in limitele spectrului de absorbție, va genera doar o intensitate diferita a emisiei si nu o schimbare a lungimii de undă. Un al doilea fluorocrom poate avea un spectru de absorbtie mai larg decat cel al ITCF. Devine astfel posibil ca ambii fluorocromi sa fie exitați concomitant, iar daca spectrele de emisie sunt diferite, putem realiza o analiza biparametrică. Un fluorocrom de acest tip este phycoeritrina (PE) ce prezinta spectre de absorbție si emisie ce depasesc pe cele ale ITCF.

2.8. Fluorocromi folosiți in analiza in imunofluorescentă multicoloră

In detecția multicoloră spectrul de fluorescentă este impartit in “ferestre de detectare” fiecare dintre acestea avand o lungime de 50 nm. In cazul unei excitatii la 488 nm exista patru ferestre tipice de detective cuprinse in intervalul 500-700 nm. Deoarece emisia majoritații fluorocromilor prezintă o panta usor descendentă la lungimi de unda mai mari, fluorescență lor se distribuie de obicei pe mai multe ferestre. Astfel, in orice tip de analiza cantitativă, distributia secundară trebuie indepartată prin compensare. Prin urmare, în cazul în care un citomrtru in flux are doar un laser de 488 nm, excitatia florocromilor se face numai la 488 nm. Determinarea exacta a nivelului de compensare poate fi dificilă datorită semnalelor variabile de autofluorescentă, iar in plus pot sa apară probleme prin folosirea unei scari de amplificare logaritmice. În citometrie de flux, lumina laser este de obicei folosita pentru a excita fluorocromi. (Guide to Flow Cytometry 2006).

Trecand in revistă principalii fluorocromi utilizați in prezent si ținand cont de faptul ca cea mai comună sursă de excitație pentru citometrele de flux actuale este laserul de argon (488nm) se observă ca derivații de fluoresceina raman reactivi de electie pentru obtinerea fluorescenței verzi (530nm).

Descoperirea calitatilor de fluorocrom ale unor componente proteice ale aparatului fotosintetic-phicobiliproteinele a reprezentat un important pas inainte pentru citometria de flux (Oi, Glazer si Stryer, 1982).

2.9. Anticorpi monoclonali folosiți ca reactanți in citometria in flux

Anticorpii naturali, indusi de diferite antigene “non-self, chiar in cazul specificitații lor inalte si al titrului optim, considerate ”policlonali” adica rezultați din proliferarea si diferențierea mai multor “clone” de limfocite B.

Anticorpii monoclonali reprezinta rezultatul proliferari si diferențierii unei singure “clone” de limfocite B. Ei sunt omogeni, avnd urmatoarele caracteristice:

– specificitate strictă si afinitate inalta pentru anumiți determinant de la suprafața haptenei antigenului inductor;

– aparenta la una din clasele imuniglobulinice majore (IgM sau IgG);

– izotip unic pe lantul greu

– determinant allotipic pe lanțul usor (kappa sau lamabda);

– structura antigenica a regiunilor variabile V[h] si V[I] in zona situsului de combinare cu antigenul correspondent.

2.10. Anticorpi monoclonali dublu marcați cu substanțe fluorescente, utilizați in imunofenotipare prin citometrie in flux

In cadrul diferitelor programe de imunofenotipare prin citometrie de flux, probele se pun in contact cu un amestec de anticorpi monoclonali, unul dintre acestia conjugat cu izotiocianat de fluoresceină (ITCF), celalalt cu phycoeritrină (PE). Ambii fluorocromi mentionati mai sus pot fi excitati la aceiasi lungime de unde (488nm), folosindu-se o sursa comuna de excitare. Emisiile consecutive de culoare, respective verde (ITCF) si portocaliu (PE), se utilizeaza pentru a distruge simultan mai multe subseturi celulare, care exprimă receptori corespunzatori anticorpilor monoclonali fluorocromati introdusi in proba, fie prin microscopie in lumina ultraviolet (imunifluorescenta directa sau indirecta), fie prin citometrie de flux (tabel 2).

Tabelul 2. Puterea de excitatie, de emisie si greutatea moleculara a fluorocromilor (dupa: Ormerod, 2000).

Sistemul aticorpilor monoclonali dublu marcați cu substantă fluorescentă prezintă avantaje, precum:

– analiza prin dubla culoare a probelor leucocitare permite efectuarea unor multiteste necesitand un timp de doua ori mai scurt decata analiza cu monoclonali monomarcați;

– anticorpii monoclonali dublu marcati ( figura 9 ), se gasesc prezenti in amestecul initial din solutia standard livrata de firma producatoare. Anticorpii sunt pretitrați, pentru a permite o analiza mai clara si cu acuratețe maxima, conditii absolut obtigatorii separarii subpopulațiilor celulare testate.

Marcare directa Marcare indirecta

Figura 9. Reprezentare schematica a metodei de marcare cu fluorocromi. Marcarea fluorescentă se realizează cu ajutorul anticorpilor cuplati cu fluorocromi (adaptare dupa: Ormed, 2000)

– sunt necesare mai puține celule per proba pentru a formula un rezultat corect , ceea ce reprezintă o importanta particulara pentru esantioanele leucopeniice sau din hematologia pediatrica;

– informatiile imunilogice sunt mult mai complexe in cazul examinarii celulelor prin reagent dublu marcati (de exemplu: prezenta si proporțiile celulelor care prezinta pe suprafata ambii markeri);

– reagentii monoclonali dublu marcati au un cost mai mic decat cei monocromatici.

Capitolul 3. Cercetari personale – Caracterizarea unor tulpini de enterobacterii cu diferite fenotipuri de rezistența prin citometrie in flux

Rezistența bacteriana la antibiotice a devenit o preocupare serioasa pentru starea de sanatate publica.

Prin urmare trebuie sa avem in vedere faptul ca rezistența intrinseca la antibiotice, a unor tulpini microbiene poate fi in mare parte datorata activitatii pompelor de eflux (Okuso, 1996).

Supraexprimarea pompelor de eflux poate duce la bacteri extreme de rezitente, care sunt dificil de tratat cu antibioticele disponibile in prezent.

Dezvoltarea de compusi care pot acționa ca inhibitori ale efluxului reducând astfel impactul acestor pompe privind eficacitatea anumitor antibiotice, va fi de interes clinic si ar putea avea un impact semnificativ pe tulpini microbiene clinice (Nelson, 2002).

Contributia activitații pompelor de eflux in rezistența tulpinilor microbiene clinice, trebuie sa fie un parametru in producerea de antibiotice sau in orice alti compusi activi(Bhardwaj, 2012).

Scopul acestui studiu a fost diferențierea tulpinilor de enterobacterii cu diferite fenotipuri de rezistența utilizand citometria in flux, investigand schimbarile morfologice și funcționale induse de antibiotice la tulpini Gram negative, precum și activitatea pompelor de eflux.

Obiective specifice

3.1. Evidențierea mecanismului de rezistența prin supraexprimarea pompelor de eflux, evaluat pe mediu de cultura solid in prezența bromurii de etidiu, la diferite tulpini de entrobacteriaceae.

3.2. Masurarea parametrilor de marime celulara, viabilitate celulara si acțăiune a pompelor de eflux prin citometrie in flux, la diferite tulpini de enterobacteriaceae.

Materiale si metode

Evidențierea mecanismului de rezistența prin supraexprimarea pompelor de eflux, evaluat pe medii de cultura in prezența Bromurii de etidiu (EB), la diferite tulpini de entrobacteriaceae.

Bacteriile care prezintă un fenotip de multirezistență la medicamente folosesc cateva mecanisme pentru a depasi acțiunea antibioticelor. Ca urmare, acest fenotip poate fi rezultatul mai multor mecanisme sau o combinatie a acestora. Principalele mecanisme de rezistență la antibiotice sunt: mutații in gene tinta (cum ar fi ADN-giraza si topoizomeraza IV), supraexprimarea pompelor de eflux, schimbari ale invelisului celular, reglarea negativa a porilor membranei, si modificarea componentei lipopolizaharidice a membranei celulere externe (in cazul bacteriilor Gram-negative). Metode care pot identifica rapid si eficient bacterii a caror rezistența a fost dezvoltata datorită unui eflux activ.

Această metodă ce utilizează agar simplu foloseste EB pentru a demonstra activitatea pompelor de eflux la bacterii. Determinarea rapida a multirezistenței la medicamente care prezintă o supraexprimare a pompelor de eflux (Metoda adaptata dupa Martins, 2011).

Principiul acestor teste se bazează pe trecerea EB in membrana plasmatica si acumularea in interiorul celulei (Amaral, 2011). Analiza rapida a tulpinilor cu multirezistentă la medicamente care prezintă o supraexprimare a pompelor de eflux.

Materiale

Colonii izolate de 24 ore din urmatoarele tulpini:

– Tulpini de referință ATCC – obtinute din colecția de tulpini a laboratorului de Microbiologie al Facultatii de Biologie:

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

– Tulpini izolate din diferite specimene clinice:

Escherichia coli 14057; Escherichia coli 2382; Escherichia coli 2471; Escherichia coli 2421; Escherichia coli 3441; Escherichia coli 2568; Escherichia coli 3138; Escherichia coli 2429; Escherichia coli 2431; Escherichia coli 3019.

Klebsiella oxitoca 3249; Klebsiella pneumoniae 151; Klebsiella pneumoniae 739; Klebsiella pneumoniae 662;. Klebsiella pneumoniae 319.

Mediu solid TSA;

Bromura de etidiu.

MOD DE LUCRU

Tulpinile de microorganisme au fost izolate din clinică si produse alimentare pentru a demonstra activitatea supaexprimată a pompelor de eflux.

In mediul de cultură TSA s-a adaugat bromura de etidiu in concentratie de 2 µg / L. Pompele de eflux responsabile de multirezistența la antibiotice au capacitatea de a elimina neselectiv orice substantă nociva, inclusiv EB.

Placile cu mediul de cultura TSA sunt preparate proaspat (din ziua anterioara), si sunt protejate de lumina. La insamanțare fiecare placă trebuie sa conțină cel putin o tulpină de referință care va servi ca martor comparativ pentru analiza de fluorescență. Placile cu TSA au fost impartite in 8 sectoare. Noua metodă poate fi aplicată simultan pentru maximum douasprezece tulpini bacteriene ce prezintă o activitate de supraexprimare a sistemului de eflux. Cu toate acestea, numarul de tulpini de referința poate fi crescut la două sau mai multe in functie de un anumit experiment. In plus permite evaluarea agentilor ce pot inhiba aceeasi activitate (Martins, 2011).

Culturile bacteriene au foat insamantate pe placile cu mediul de cultura TSA, care contine bromura de etidiu, pornind din centru catre marginea placii in linie dreapta.

Plcile cu mediu de cultura TSA si bromură de etidiu, insamanțate cu tulpinile de interes au fost incubate la temperatura de 37 C, timp de 16 ore. Dupa această perioada placile cu TSA au fost examinate la transiluminator cu lampa UV (VILBER LAURMAT). Principiul mediului TSA cu bromură de etidiu se bazeaza pe capacitatea bacteriilor de a expulza o molecula fluorescentă care este substratul pentru majoritatea pompelor de eflux.

Examinarea tulpinelor insamantate pe mediul de cultura TSA cu bromura de etidiu, dupa 16 de ore de incubare la transiluminator cu lampa UV (VILBER LAURMAT) a fost efectuata pentru a observa gradul de fluorescentă a cresterii microbiene.

Masurarea parametrilor de marime celulară, viabilitate celulară si actiune pompelor de eflux prin citometrie in flux, la diferite tulpini de enterobacteriaceae.

Au fost selectate tulpinile slab fluorescente rezultate din metoda insasamantarii pe mediu solid TSA cu EB, pentru analiza paramertrilor de marime celulară, viabilitate celulară si activitatea pompelor de eflux, prin metoda de citometrie in flux, in prezenta a doua antibiotice: ciprofloxacina si colistin. Si analizate la 20 minute si 2 ore de la incubare la 37˚C.

Materiale

Tulpini de referință ATCC – obtinute din colectia de tulpini a laboratorului de Microbiologie al Facultatii de Biologie:

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella pneumoniae ATCC 10031

Tulpini izolate:

Escherichia coli 1405; Klebsiella oxitoca 3249; Klebsiella pneumoniae 151; Klebsiella pneumoniae 739; Klebsiella pneumoniae 816

Discuri cu ciprofloxacină;

Discuri cu colistin;

Etanol;

Bromură de etidiu;

Iodură de propidiu;

BD FACSCalibur.

MOD DE LUCRU

Prepararea inoclului bacterian

Medota in mediu lichid: s-au repicat 3-5 colonii din placa cu mediu TSA insamanțate cu 18-24 ore inainte si s-au suspendat in 5 ml de mediu lichid (Tripticase soia).

Se agită cu ajutorul unui agitator vortex, timp de 10-15 secunde. După care au fost incubate la 35˚C timp de 2-6 ore, pană la obținerea unei turbiditați de 0,5 pe scara Mac Farland.

Culturile microbiene in fază exponențială obținute în bulion nutritiv au fost spălate și resuspendate în soluție salină tamponată cu fosfat la o densitate finală de 5 x 106 celule / ml .

Incubarea suspensii microbiene în prezența a 30 pg / ml ciprofloxacină (CIP) și colistin (COL) .

Aceste antibiotice au fost selecționate deorece: CIP este un marker pentru pompele de eflux, iar COL acționează asupra membranei plasmatice si florocromul patrunde in celulă.

După 20 minute și 120 de minute de incubare în prezența antibioticelor, suspensiile microbiene au fost colorate cu iodură de propidiu ( IP , 1 pg / ml) pentru parametru de viabilitate celulară și bromură de etidium (EB, 1 pg / ml) pentru evaluarea activitații pompelor de eflux, timp de 5 minute ( incubare în întuneric ) și analizate cu ajutorul unui BD FACSCalibur. Datele au fost colectate de 100.000 de evenimente pe eșantion.

Controale : suspensii microbiene fără antibiotice, suspensii microbiene ucise cu etanol.

Marea rezistența la nivel mondial în tulpini clinice impune o metodă de detectare rapidă, care ar putea permite o selecție corectă a terapiei de urgență. Achiziția datelor si analiza s-au efectuat cu ajutorul BD FACSCalibur.

3.3. Rezultate

Rezistența naturală caracterizeaza toate tulpinile apartinand unei anumite specii, de aceeea identificarea markerilor de rezistență constitutive si respective a sensibilitații la anumite substante reprezintă un criteriu util in identificarea speciilor.

S-a emis ipoteza ca genele de rezistență au evoluat ca mecanisme de aparare nespecifica impotriva compusilor toxici existenți in mediu cum ar fi metaboliții plantelor si microbiotei din sol. De exemplu, mecanismele de rezistență prin eflux care conferă rezistență de nivel scazut, nespecifică față de o gama largă de antibiotice, au evoluat in absența presiunii selective exercitate de antibiotic, pentru a proteja bacteriile de substanțe toxice rezultate din propriul lor metabolism. Determinanții de multirezistență care codifică pentru pompele de eflux la bacterii gram-negative joaca un rol important in natrură intervenind in reglarea concentrației intracelulare de molecule semnal utilizate in comunicarea interbacteriană. Asadar, pompele de eflux joca un rol important in rezistența bacteriana intrinsecă, considerate pana nu demult un fenomen pasiv, datorat impermeabilitații celulei bacteriene pentru antibiotic. Larga specificitate de substrat a pompelor de eflux duce la scaderea simultana a sensibilitații la beta-lactamine, aminoglicozide, tetracycline, cloramfenicol, treimetoprin, sulfamide, fluoroquinolone, macrolide.

Prezența acestor mecanisme nespecifice de rezistență si vechimea aparitiei lor in filogenie, ca si particulatitatile structurale ale diferitelor specii bacteriene determină rezistența naturală sau constitutiva a anumitor specii bacteriene la anumite substanțe cu acțiune antimicrobiană(Lazar, 2004).

Evidențierea intensitații fluorescentei la tulpini de E.coli insamanțate pe mediu solid TSA cu EB, examinate la transiluminator cu lampa UV.

In figura 10. s-a demonstrat ca pentru tulpinile de E. coli, rezultatele obținute prin metoda calitativă prezinta diferite intensitați ale fluorescenței după examinarea placilor la UV, ceea ce semnifică faptul ca activitațile pompelor de eflux diferă in functie de tulpina analizată.

Din cele 10 tulpini de Escherichia coli insamanțate pe mediu solid TSA cu EB, tulpina Escherichia coli 14057, nu emite fluorescență ceeea ce demonstrează supraexprimareă pompelor de eflux la concentratia de 2 µg/L EB(EB a fost expulzata din celula). Tulpinile Escherichia coli 2382; Escherichia coli 2471; Escherichia coli 2421; Escherichia coli 3441; Escherichia coli 2568; Escherichia coli 3138; Escherichia coli 2429; Escherichia coli 2431; Escherichia coli 3019, emit fluorescență ceea ce semnifică lipsa pompelor de eflux, EB nu este eliminată din celulă.

Figura 10 : Fluorescența tulpinilor de E. coli dupa expunere la UV, cultivate pe mediu TSA cu EB, timp de 16 ore. Tulpina E. coli 14057 prezintă un nivel scazut de fluorescența, ceea ce sugereaza ca la această tulpină se evidențiază supraexprimarea pompelor de eflux. Pentru celelalte tulpini luate in studiu nivelurile de fluorescența sunt relativ asemanatoare.

In figura 11. s-a observat ca pentru tulpinile de Klebsiela sp., rezultatele obținute prin metoda calitativă prezintă diferite intensitați ale fluorescentei după examinarea placilor la UV, ceea ce semnifică faptul ca activitațile pompelor de eflux difera in functie de tulpina analizată.

Din din cele 15 tulpini de Klebsiella sp. insamantate pe mediu solid TSA cu EB, in comparație cu ATTC K.pneumonie 10031 care este o cultură de referință si care prezintă fluorescență, ceea ce semnifică lipsa pompelor de eflux, tulpinile K. oxitoca 3249; K. pneumonipe 151; K. pneumonie 739; K. pneumonipe 816, nu emit fluorescența, ceeea ce demonstreaza supraexprimarea pompelor de eflux la concentrația de 2 µg / L EB. (bromura de etidiu a fost expulzata din celula), membrana celulară a fost impermeabila si bomura de etidium nu a patruns in celulă sau tulpina este capsulată.

Tulpinile K. pneumonipe 662;. K. pneumonie 31, K. pneumonie 303; K. pneumonipe 298; K. Pneumonipe 2471; K. Pneumonie 1468; K. pneumonie 3330; K. Pneumonie 1524; K. Pneumonipe 1626; K. Pneumonipe 13959, emit un nivel crescut de fluorescență ceea ce evidențiază absența pompelor de eflux, EB fiind acumulată in celula bacteriană.

Figura 11 : Tulpini de Klebsiella pasate pe mediu TSA cu EB. Citire la 16 ore, la UV

Tulpinile Klebsiella pneumonie 151; Klebsiella oxitoca 3249, Klebsiella pneumonie 739, Klebsiella pneumonie 816, au un nivel scazut de fluorescența, ceea ce sugereaza ca la aceaste tulpini se evidențiaza supraexprimarea pompelor de eflux. Pentru celelalte tulpini luate in studiu nivelurile de fluorescența sunt relativ asemanatoare.

Tulpinile testate au fost testate din punct de vedere al rezistenței la antibiotic de golegii din departamenul de cercetare si au demonstrat diferite paternuri de rezistenta.

Tabelul 2. Evidentierea profilului de rezistenta la tulpinile Escherichia coli 14057; Klebsiella oxytoca 3249; Klebsiella pneumoniae 739; K. pneumoniae 151; K. pneumoniae 81

*legenda

Evidențierea influentei antibioticelor asupra morfologiei celulare cuantificate prin masurarea intensitatii FSC.

Rezultate:

Rezultatele obținute prin metoda cantitatvă, pentru analiza influenței antibioticului pe dimensiunea celulei (FSC) la 20 si 120 minute, au demonstrat ca tulpinile analizate, prezintă diferite intensitați ale semnalului luminos datorate activitații antibioticului asupra celulei bacteriene (figura 13;14).

In figura 13. s-a observat ca la 20 de minute de la incubare cu COL, tulpinile de E.coli, atat cele tratate cu COL cat si martorii(netratate cu colistin) in prezența EB, prezintă un semnal luminos redus ceea ce reprezintă o marime mai mica a celulei.

Tulpinile de Klebsiella sp. atat cele tratate cu COL cat si martorii(cele netratate cu colistin) in prezenta EB, au un semnal luminos mare ceea ce reprezintă o marime mai mare a celulei.

Influenta COL la 20 de minute de la incubare asupra tulpinilor de Klebsiella sp. este mai rapidă decat la tulpinile de E.coli.

Figura 13. Evidentierea influentei antibioticului asupra marimii si morfologiei celulare pe baza distributiei FSC a culturilor microbiene, dupa 20 de min de contact cu Colistinul.

In figura 14. s-a observant ca la 120 de minute de la incubare, atat tulpinile de E.coli cat si tulpinile de Klebsiella sp. tratate cu CIP in prezenta EB, au un semnal luminos mare, CIP inducand moartea celulară, sau volumul celulelor creste urmat de liza celulară. In timp ce tulpinile control (netratate cu CIP), atat tulpinile de E.coli cat si tulpinile de Klebsiella sp. in prezenta EB au prezentat un semnal luminos redus, evidentiind dimensiuni celulare mai mici.

Figura 14. Evidentierea influenței antibioticului asupra marimii si morfologiei celulare pe baza distribuției FSC a culturilor microbiene, dupa 120 de min de contact cu Ciprofloxacina.

Evidențierea influenței antibioticelor asupra viabilitații celulare cuantificate prin masurarea fluorescenței PI

Rezultatele obtinute prin metoda cantitatvă pentru influența antibioticelor asupra viabilitații celulare cuantificate prin masurarea fluorescentei PI la 20 si 120 minute, au demonstrat ca tulpinile analizate prezintă nivel de fluorescenta diferit datorate activitatii antibioticului asupra celulei bacteriene (figura 15;16;17).

In figura 15. se observa ca la 20 minute de la incubare, tulpinile de E.coli si Klebsiella sp., atat cele netratate cat si cele tratate cu COL si CIP in prezenta IP, nu prezinta diferențe semnificative al semnalului fluorescent si nu se evidențiază rezultate concludente.

Figura.15 Nivelul medianei fluorescenței PI a culturilor microbiene dupa 20 min de contact cu antibioticul

In figura 16. se observă ca la 120 minute de la incubarea tulpinilor cu CIP comportamentul este diferit, unele tulpini fiind sensibile la CIP altele fiind rezistente. Tulpina E.coli ATCC tratat cu CIP in prezenta IP, are o fluorescența ridicată fată de E.coli ATCC PI, ceea ce semnifica sensibilitatea la CIP, IP a patruns in celulă si semnalul fluorescent a crescut semnificativ. La toate celelalte tulpini se observă semnalul fluorescent crescut la cele tratate cu CIP comparativ cu cele netratate. Rezultă ca tulpinile sunt sensibile la CIP, IP a patruns in celula si semnalul a crescut.

Rezultate pentru tulpina Klebsiella pneumonie 151 sunt neconcludente, deoarece nu exista diferente intre tulpina tratată cu antibiotic comparativ de cea fara antibiotic. In acest caz IP nu a patruns in celula bacteriană ceea ce rezultă ca tulpina este rezistentă la CIP, celulele fiind viabile.

Figura.16 Nivelul medianei fluorescenței PI a culturilor microbiene dupa 120 min de contact cu Ciprofloxacina.

In figura 17. se observă ca la 120 minute de la incubare la tulpinile E.coli ATCC si E.coli 14507 tratate cu COL prezenta IP, nivelul fluorescenței este ridicat ceea ce semnifica sensibilitatea la COL, IP a patruns in celulă si semnalul a crescut. La tulpina de Klebsiella pneumonie ATCC tratată cu COL nivelul fluorescenței este semnificativ mai ridicat, tulpina fiind sensibila la COL perimite patrunderea IP in celulă. La celelalte tulpini de Klebsiella sp., exista o diferența clara intre probele tratate cu COL si cele fara COL in prezentă IP, care au un nivel de fluorescență scazut, adica sunt viabile, sensibile la COL.

Comparativ cu tulpinile testate la 20 minute de la incubare la 120 de minute, modificarile sunt semnificative atat in cazul CIP cat si in cazul COL, media semnalului fluorescent a crescut si s-a evidențiat sensibilitatea tulpinilor.

Figura.17 Nivelul medianei fluorescenței PI a culturilor microbiene dupa 120 min de contact cu Colistinul

In figura 18. se observă ca tulpinile E.coli ATCC, E.coli 14057 si ATCC Klebsiella, care au fost omorate cu etanol, au un nivel de fluorescență ridicata, ceea ce semnifică faptul ca IP a patruns in celulă. Celelalte tulpini prezintă o flurescență mai scazută semnificand patrunderea anevoioasă a IP in celulă datorita activitații antibioticului.

Figura.18 Reprezentarea grafica a histogramelor fluroescenței PI a culturilor bacteriene dupa 120 min de contact cu antibioticul.

Evidentierea influenței antibioticelor asupra exprimarii pompelor de eflux cuantificate prin masurarea fluorescentei EB.

In figura 19. se observă ca diferentele sunt semnificative intre martorii netratați si tulpinile tratate cu antibiotic.

Ciprofloxacina induce mai rapid diferente decat COL la 20 min. Diferența cea mai mare este la tulpina K.pneumonie ATCC CIP, care are o medie a fluorescenței mai ridicată fată de tulpina cu COL, ceea ce evidentiază acumularea BE in celula bacteriana si prezenta pompelor de eflux. Acest rezultat sugereaza ca CIP este mai eficientă in inducerea expresiei pompelor de eflux, comparativ cu COL. La tulpinile K.pneumonie 151 si 739 tratate cu CIP media fluorescenței este mai mare decat la COL, ceea ce demonstrează ca tulpinile sunt mai sensibile la CIP decat la COL. In comparatie cu tulpinile fară antibiotic la toate tulpinile tratate cu antibiotic s-a evidențiat acumularea EB in celula bacteriană ceea ce reprezintă activitatea diferită a pompelor de eflux.

Figura.19 Influența Colistinului si a Ciprofloxacinei asupra exprimarii pompelor de eflux la 20 min. de contact cu antibioticul.

In figura 20 se observă ca la 120 de minute de la incubarea tulpinilor tratate cu COL in prezenta EB, diferența dintre tulpinile cu antibiotic in comparatie cu martorul (tulpina fara antibiotic), media fluorescenței este foarte mare, ceea ce evidențiază prezența pompelor de eflux. Diferența mai putin evidentiață la tulpina K. pneumonie 739, unde media fluorescenței intre tulpina tratata cu antibiotic si tulpina fara antibiotic nu este semnificativa, adica tulpina este rezistentă la COL. La tulpina Klebsiella oxytoca 3249 CIP, media nivelului de fluorescență este semnificativ in comparatie cu martorul fară antibiotic, ceia ce evidențiază prezentă pompelor de eflux si sensibilitatea la COL.

La 120 minute COL a indus diferente mult mai semnificative decat in cazul CIP la toate tulpinile tratate, comparativ cu diferentele induse la 20 minute.

Cea mai mare diferentă s-a evidențiat la tulpina Klebsiella oxytoca 3249 tratată cu COL, care la 20 minute nu a prezentat un nivel crescut al fluorescenței.

Figura. 20 Influența Colistinului asupra exprimarii pompelor de eflux la 120 min. de contact cu antibioticul.

In figura 21 se observă că la 120 de minute de la incubarea tulpinilor cu CIP in prezenta EB, la tulpina de E.coli media fluorescenței este mai ridicată la tulpinile cu antibiotic, ceia ce evidențiază prezența pompelor de eflux. La tulpina Klebsiella oxytoca 3249 tratata cu CIP, media fluorescenței este foarte mare, de unde rezulta prezența pompelor de eflux, tulpina fiind sensibila la CIP. La tulpina Klebsiella pneumonie ATCC tratată cu CIP media fluorescenței este mai mică decat la tulpina fară CIP ceea ce evidentiază ca BE nu a patruns in celula, este rezistentă la CIP. Klebsiella pneumonie 816, diferentele sunt evidente, tulpina cu antibiotic are o medie a fluorescenței ridicată ceea ce semnifica prezența pompelor de eflux si sensibilitatea ei la CIP.

Tulpina Klebsiella oxytoca 3249 CIP a avut un nivel nare al fluorescenței si la 20 minute si la 120 minute.

Figura.21 Influența Ciprofloxacinei asupra exprimarii pompelor de eflux la 120 min. de contact cu antibioticul.

CONCLUZII

Analizele de citometrie in flux au aratat ca tulpinile bacteriene sensibile (E.coli 14057, Klebsiella pneumonie 151, Klebsiella pneumonie 816, Klebsiella pneumonie 739, Klebsiella oxytoca 3249), analizate prezința modificari ale morfologiei celulare după 20 min de cultivare in prezența antibioticelor. Aceste modificari sunt exprimate printr-o crestere a semnalului luminos, indicand alterarea integritații membranei. La majoritatea tulpinilor analizate, dupa 120 minute se constata apariția unor modificari semnificative ale permeabilitații membranei, si chiar omorarea acestora.

Influența antibioticelor asupra viabilitații celulare cuantificate prin masurarea nivelului de fluorescență in prezenta PI, a demonstrat faptul ca la 20 minute de la incubare, nu au fost diferențe ale nivelului fluorescent. La 120 minute, tulpina E.coli ATCC tratata cu CIP a indus un nivel al fluorescenței ridicat , iar in cazul tulpinilor tratate cu COL nivelul fluorescent a fost la toate tulpinile semnificativ crescut in comparație cu tulpinile netratate cu antibiotic.

Influența antibioticelor asupra activitații pompelor de eflux cuantificate prin masurarea nivelului de fluorescență in prezenta EB a demonstrat faptul ca CIP induce mai rapid diferențe decat COL la 20 minute. La 120 minute COL a indus diferente mult mai mari decat in cazul CIP. S-a evidentiat tulpina Klebsiella oxytoca 3249, care atat in cazul tratarii cu CIP cat si in cazul tratarii cu COL a avut un comportament asemanator la 120 minute, prezentand un nivel al fluorescenței foarte mare.

Metodele optimizate folosite (atat ce cantitativa bazata pe insamantarea pe mediu solid cu EB, cat si ce cantitativa de citometrie in flux) reprezinta diferențierea mecanismelor de rezistența ce implica pompe de eflux.

Bibliografie

Alice Long Givan Wiley – Liss, Flow Cytometry –Frist Principles, New York 1992,,ISBN 0-471-5095-2.

Amaral L, Fanning S, Pagès JM. Efflux pumps of gram-negative bacteria: genetic responses to stress and the modulation of their ac-tivity by pH, inhibitors, and phenothiazines. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 2011, 77: 61-108.

Bhardwaj AK, Mohanty P. Bacterial Efflux Pumps Involved in Multidrug Resistance and their Inhibitors: Rejuvenating the Antim-icrobial Chemotherapy. Recent Pat Antiinfect Drug Discov 2012, 7: 73-89.

Braun PC, Zoidis JD – Update on DrugResistant Pathogens:Mechanisms of Resistance and Emerging Strains. RT for decision makers in respiratory care, 2004.

Bronzwaer S, Lonnroth A, Haigh R. The European Community strategy against antimicrobial resistance. Euro Surveill. 2004, 9: 30-34.

C. Svanborg, B.Eriksson, L.A.Hansan, V.Jadae, B.Kaijier, G.Lidin Janson. V.Lindberg, S.Olling Jurnal de pediatrie – 1978,Volum 3, 398-403.

Clinical Chemistry, 2000; 46:8(B) 1221–1229

Diagnostics: Basic Principles, Methods and Clinical Applications of Flowcytometry, Ulrich Sack, Attila Tárnok, Gregor Rothe .

Dumitru Buiuc, Marian Negut, Tratat de microbiologie clinica Editia a- II- a, 2008; 698 -705.

Fedesa (2000) – Antibiotics for animals. A FEDESA perspective on antibiotics, Animal Health and the Resistance Debate, vol. February: 6).

Flow cytometry – A practical approach 1994 IRL Press at Oxford Univercity Press, Oxford

Gerstner A , O , Tarnok A, Bootz F, Slide – based multi-parametric cytometry in ENT HNO, 2005;53 (2):134-41.

Grigore Mihaescu, Mariana Carmen Chifiuriuc, Lia-Mara Ditu, Antibiotice si substante chimioterapeutice antimicrobiene ,Editura Academiei Romane Bucuresti, 2007; 147 – 157.

Guide to Flow Cytometry, EDITOR Sonja Wulff Dako Fort Collins, Colorado, USA, 2006.

Heinemann J.A.– How antibiotics cause antibiotic resistance, Drug Discov Today, 1999 ;4 (2): 72-79.

James R, Fiona E, Steven H, Bcl-2 Expression by Multicolor Flow Cytometric Analysis Assists in the Diagnosis of Follicular Lymphoma in Lymph Node and Bone Marrow.Am J Clin Pathol., 2003;119(1):145.

Jehl F, Chomarat M, Weber M – De l antibiogramme a la prescription. Edition bioMerieux. 2004; 80-86.

Hutter K.J. and Eipelt H. E. Microbial . Determinations by Flow Cytometry. Journal of General Microbiology 1979, 113:369-375.

Kulaga H., Anderson P. E, Cain M., and Stopa P. J.. Identification of pathogenic agents via microsphere- based immunoassays on a flow cytometer. 1998, Cytometry 9, (Suppl.):5556.

LIPSITCH M and SOUSA A. O. Historical intensity of natural selection for resistance to tuberculosis. Genetics. 2002, 161:1599–1607.

M.G. Melomed, Tare Lindamo, Martimer, L.Mendelsohn, Flow cytometry and sorting, Wiley – Liss, New York, 1994, ISBN 0-471-56235-1.

Marc Lipsitch, Matthew H Samore – Antimicrobial Use and Antimicrobial Resistance: A Population Perspective. Emerg Infect Dis 2002 May, 8(5):540.

Maria Damian, Marian Negut, Diagnosticul de laborator in toxiinfectiile alimentareproduse de bacilli Gram negative, Editura Ceres Bucuresti, 2011, 226-227.

Maria Damian si Marian Negut, Diagnosticul de laborator in toxiinfectiile alimentare produse de bacilli Gram negative, Editura Ceres Bucuresti 2011, 19-34.

Mariana Carmen Chifiriuc, Grigore Mihaescu, Veronica Lazar, Micobiologie si virusologie medicala, 2011,189-212.

Marta Martinsa,b,*, Matthew P. McCuskera,b, Miguel Viveirosb,c, Isabel Coutoc,d, Séamus Fanninga,b, Jean-Marie Pagèsb,e, Leonard Amaral,A, Simple Method for Assessment of MDR Bacteria for Over-Expressed Efflux Pumps, The Open Microbiology Journal, 2013, 7, (Suppl 1-M6) 72-82.

Martins M, Viveiros M, Couto I, et al. Identification of efflux pump-mediated multidrug-resistant bacteria by the ethidium bro-mide-agar cartwheel method. In Vivo 2011, 25: 171-8.

Melamed MRFlow Cytometry and Sorting New York, NY: Wiley-Liss; 1990(ISBN 0-471-56235-1).

Michael Brown and Carl Wittwer, Flow Cytometry: Principles and Clinical Applications in Hematology ,*

Nelson ML. Modulation of antibiotic efflux in bacteria. Curr Med Chem 2002, 1: 35-54.

Nicholson J. K A.: Use of flow cytometry in the evaluation and diagnosis of primary and secondary irnmunodeficiency diseases. Arch. Pathol. Lab. Med. 1989, 113: 598-605.

Okuso H, Ma D, Nikaido H. AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants. J Bacteriol 1996, 178: 306-8.

Philip J , Basic principles of flow cytometry.Hematol Oncol Clin North Am , 2002, 16(2):229-34).

Ronald N Jones, Fernando Baquero, Gaetano Privitera et al – Inducibile β-lactamase-mediated resistance to third-generation cephalosporins. Clinical Microbiology and Infection – 1997,vol.3, suppl.1:S7-S18.

Shapiro H.Practical Flow Cytometry.3rd ed. New York, NY: Alan R. Liss; 1994(ISBN 0-471-30376-3.

Terstappen L., Loken M., Meloid cell diferention in normal bone marrow and myeloid leukemia assessed by multidimensional flow cirometry. Anal cell Pathal 1990, 2(4):229 – 240.

V.Bilbaie si.N.Pozsgi, Bacteriologie medicala Vol II, Editura medicala Bucuresti ,1995; 221 – 244.

V.T.Oi, A.N.Glazer si L. Stryer, 1982) Fluorescent phycobiliprotein conjugates for analyses of cells and molecules. J Call Biol 1982 93:981-986, Published June 1, 1982, doi:10.1083/jcb.93.3.981

Veronica Lazar, Microbiologie medicala – Note de curs si principia de diagnostic microbiologic, Editura Universitatii din Bucuresti 2001; 132 – 150.

Veronica Lazăr, Victoria Herlea, Ramona Cernat, Carmen Balotescu, Doina Bulai, Anca Morariu- Microbiologie generală :Manual de lucrări practice, Editura Universitatii din Bucuresti ,2004.

Zhanel GG, DeCorby M, Adam H, Mulvey MR, McCracken M, Lagacé-Wiens P et al. Canadian Antimicrobial Resistance Alliance, Hoban DJ. Prevalence of antimicrobial resistant pathogens in Canadian hospitals: results of the Canadian Ward Surveillance Study (CANWARD 2008). Antimicrob. Agents. Chemother. 2010; 54(11): 4684-4693.