Diclofenacul Sodic

INTRODUCERE

Diclofenacul sodic introdus în terapie de către firma Ciba-Geigy sub numele de Voltaren este un medicament antiinflamator nesteroidian (NSAID) cu puternică acțiune antiinflamatoare, analgezică și antipiretică.

Diclofenacul sodic acționează prin inhibarea ciclooxigenazei, enzimă implicată în procesul sintezei de prostaglandine, tromboxani și prostacicline, prevenind astfel sinteza acidului arahidonic.

Există dovezi că diclofenacul sodic acționează și asupra lipooxigenazei.

Printre proprietățile farmacocinetice ale diclofenacului se numără: timpul de înjumătățire scurt care scade riscul acumulării în organism, acest lucru fiind combinat cu menținerea îndelungată a unei concentrații mari de diclofenac în lichidul sinovial.

În cei peste 30 de ani de când a fost introdus în terapie, diclofenacul a fost clasificat în fruntea medicametelor antiinflamatoare nesteroidiene de nenumărați cercetători, deoarece combină o eficacitate mare cu o bună tolerabilitate. [1]

Diclofenacul este indicat pentru tratamentul de bază în artrita reumatoidă (cu toate complicațiile derivate din această afecțiune), osteoartrite, simptoame dureroase apărute la nivelul coloanei vertebrale: sindromul cervicobrahial, sciatică și lumbago, boli reumatice nonarticulare cum ar fi: dureri de umăr, tendinite, artrite, gută și pseudogută.

Diclofenacul sodic a fost folosit cu succes și pentru tratarea durerilor sau inflamațiilor nonreumatice cum ar fi: colici renale sau biliare, cazuri posttraumatice, dismenoree, cazuri postoperatorii (inflamabile); înlătură durerea și febra în cazul rinofaringitei, ginecologie, oftalmologiei, pediatrie, urologie. În toate aceste afecțiuni diclofenacul exercită o puternică acțiune de calmare a durerilor, comparabilă cu cea a analgezicelor opioide. În contrast cu analgezicele pure, diclofenacul mai acționează și asupra termiei și a altor semne ale inflamației facilitând astfel vindecarea și reabilitarea organismului.

Diclofenacul sodic este disponibil sub diferite forme pentru a face față cerințelor speciale.

Pe lângă comprimate enterice normale diclofenacul se mai găsește sub formă de diclofenac SR (acțiune lentă) pentru menținerea tratamentului, diclofenac D (dispersabil) pentru a forma suspensie lichidă în apă, diclofenac dropsuri pentru doze precise în pediatrie, diclofenac supozitoare ca o alternativă a administării orale, Diclofenac rapid comprimate pentru obținerea unei acțiuni rapide după administrarea orală și Diclofenac Emulgel pentru terapia topică.

Rezultatele obținute în timp, de la mai bine de 100.000 pacienți demonstrează că diclofenacul și-a asigurat un loc important în terapia antiiflamatoare.

Efectele adverse (mai ales reacțiile gastrointestinale) au fost semnalate la un număr redus de pacienți, iar reacții toxice deosebite nu au fost semnalate.

În numeroase studii diclofenacul a fost comparat cu celelate NSAID principale și foarte des s-a observat superioritatea acestuia sau cel puțin egalitatea în eficacitatea terapeutică.

Se poate trage concluzia că diclofenacul este primul antiinflamator nesteroidian fără echivalent atât din punct de vedere al eficacității cât și al siguranței.[2]

Având în vedere larga utilizare a diclofenacului, am considerat că ar fi binevenită realizarea unei monografii asupra acestei importante substanțe farmaceutice.

Acest lucru încercăm să-l realizăm în lucrarea de față, prin trecerea în revistă a metodelor de obținere, proprietățile fizico-chimice și farmacologice ca și prezentarea metodelor de analiză și control ale diclofenacului din forme farmaceutice și medii bilogice.

CAPITOLUL I

STRUCTURA, SINTEZĂ,

CARACTERIZARE FIZICO-CHIMICĂ

I.1. Structura

Diclofenacul este acidul 2[(2,6 diclorofenil)amino]fenilacetic.

În preparatele farmaceutice se utilizează sarea de sodiu a diclofenacului cu formula molecualră C14H10Cl2NO2Na.

Structura diclofenacului sodic este următoarea:

Diclofenacul sodic are următoarele denumiri chimice [3]:

Sarea de sodiu a acidului 2[(2,6 diclorfenil)amino]fenilacetic;

Sarea de sodiu a acidului [0, – [(2,6 dicloro)]anilino)fenil]acetic;

Acetatul sodic de [0-[(2,6 diclorfenil(amino]fenil].

I.2. Sinteza

Sinteza diclofenacului se poate realiza prin mai multe metode ce se deosebesc unele de altele prin randament. [4]

Cu un randament bun (93%) se aplică reacția dintre 2,6 diclorodifenilamina (I) cu clorura acidului monocloracetic II, când se obține 2 cloro – N – (2’,6’ diclorfenil)N fenilacetamidă (III), care prin încălzire la 160ºC în prezența catalizatorului AlCl3 formează 1 – (2,6 diclorfenil) oxindol (IV) ce conduce la diclofenac sodic prin fierbere cu o soluție alcoolică de NaOH 2N.

O altă metodă se bazează pe reacția dintre 2 iodofenilacetat de potasiu (Ia) cu 2,6 dicloranilina (IIa) în prezența K2CO3 anhidru, pulbere de cupru și N metilpirolidonă la temperatura de 120ºC când se obține 2 – (2,6 dicloranilina) – fenil acetatul de potasiu (IIIa).

Prin acidulare se obține acidul corespunzător (IVa) iar prin neutralizarea acidului cu Na2CO3 se obține diclofenacul sodic (Va).

Randamentul metodei de obținere a diclofenacului este de 56%.

Metoda descrisă de Tamura și colaboratorii săi [3] utilizează N fenil 2,6 dicloranilina (1), care prin N – acilare duce la obținerea produsului α metiltio acetanilida (2); aceasta se oxidează cu acidul m cloroperbenzoic (mCPBA) sau H2O2 la α (metilsulfinil) acetanilida (3).

Prin încălzirea compusului (3) în benzen cu acid p toluen sulfonic (pTSOH) s-a obținut compusul 2 tiometil [1–(2,6 diclorfenil) oxindolul (5).

Prin clorinarea α(metiltio) acetanilidei (2) cu N clorsuccinimida (NCS) în tetraclorura de carbon se formează 2 cloro α metil tio – N – 2’,6’ diclorfenil) – N – fenilacetamida (4) care prin ciclizare în prezența SnCl4 conduce la compusul (5).

Prin desulfurizarea compusului (5) cu Nichel Raney (Ra – Ni) sau Zn în acid acetic (Zn – Ac – OH) se obține 1 – (2,6 diclorfenil) oxindolul (6) care prin hidroliză cu NaOH formează diclofenacul sodic (7).

I.3. Proprietăți fizice

Diclofenacul sodic se prezintă sub formă de pulbere cristalină, albă sau alb gălbuie, fără miros, higroscopică. Se topește la 280ºC cu descompunere. Studiul cristalelor efectuat de către Reck [3] a scos în evidență existența unor siteme monociclice, cristalizate cu 4 molecule de apă.

I.4. Solubilitate, proprietățile soluțiilor (constantă de aciditate pKa și coeficient de partiție)

Diclofenacul sodic este solubil în metanol, alcool etilic, puțin solubil în apă, greu solubil în benzen, insolubil în cloroform [5].

Datele privind solubilitatea în diferiți solvenți sunt prezentate în tabelul 1.[3]

Tabelul 1. Solubiltatea diclofenacului sodic în diferiți solvenți

la temperatura camerei

Diclofenacul sodic în apă prezintă o valoare pemtru pKa în jur de 4, iar coeficientul de partiție în n – octanol / tampon fosfat este de 13,4.

Aceste trei proprietăți explică unele însușiri farmacocinetice ale diclofenacului sodic (absorbția, legarea de proteinele plasmatice, distribuția în organism, excreția, legarea de receptori).

În tabelul 2, sunt prezentate valorile pKa și P ale diclofenacului comparativ cu alte antiinflamatoare; de asemenea este precizată și configurația nucleelor aromatice unele față de altele (torsionate sau nu).

Tabelul 2. Valorile pKa și P și configurația nucleelor aromatice ale diclofenacului sodic comparativ cu alte antiinflamatoare

I.5. Caractere spectrale

Diclofenacul sodic a fost caracterizat prin spectre de absorbție în UV, VIS și IR, spectre de masă, RMN.

Confirmarea structurii s-a făcut prin spectrofotometrie IR în KBr; spectrele IR se utilizează ca parametru fizico-chimic de identificare a diclofenacului sodic.

Spectrele în UV ale diclofenacului sodic dizolvat în metanol sau în tampon fosfat la pH = 7,2, prezintă două maxime caracteristice la 283 și 276 nm.

Spectrele de masă [3] ale diclofenacului și 4 metoxidiclofenacului au fost realizate prin transformarea în derivații lor indolinonici.

Linia ionului molecular pentru diclofenac este 277 iar pentru metoxi diclofenac este de 307.

Diclofenacul a fost caracterizat și prin spectre de rezonanță magnetică nucleară pentru azot și pentru proton [3].

Spectrul RMN al diclofenacului sodic pentru 15N a fost realizat folosind o soluție de hexa deuteriodimetil sulfoxid (DMSO) 20%.

Deplasarea chimică a 15N diclofenac sodic, a fost – 294,4.

Spectrul RMN pentru 1H a fost trasat folosind metanolul deuterat (d4) și acetat de sodiu (standard intern).

Semnficația picurilor spectrale RMN ale 1H diclofenac sodic sunt prezentate în tabelul 3.

Tabelul 3 Semnificația picurilor spectrale RMN ale

1H diclofenac sodic

Difracția razelor X [3] a fost utilizată pentru confirmarea configurației sterice a diclofenacului.

S-a demonstrat astfel că cele două nuclee aromatice sunt rotite unul față de altul cu un unghi de 69º datorită celor doi atomi de clor din configurația diclofenacului.

Aranjarea sterică a nucleelor aromatice influențează interacțiunea receptorilor unor medicamente antiinflamatoare nesteroidiene incluzând și cazul diclofenacului.

I.7. Stabilitatea diclofenacului

S-a urmărit stabilitatea diclofenacului în diferite forme farmaceutice în funcție de condițiile de depozitare. [3]

Concluziile desprinse au fost următoarele:

Diclofenacul este foarte stabil sub forma de comprimate polimerice (hidroxipropil celuloză acilată) după o depozitare timp de o săptămână la 30ºC și umiditate de 80%;

Cu ajutorul spectroscopiei UV și cromatografiei au fost analizate supozitoarele cu diclofenac sodic și li s-a demonstrat o bună stabilitate timp de 24 de luni la temperatura camerei.

S-a demonstrat și stabilitatea diclofenacului în ser și s-au obținut rezultate favorabile pentru o perioadă de două săptămâni sub formă congelată fără a suporta degradare.

I.8. Proprități chimice

Diclofenacul sodic prezintă caracter slab bazic, datorită ionului carboxilat, caracter ce poate fi intensificat în solvenți cu efect prototropic cum este acidul acetic glacial.

Această proprietate este utilizată la determinarea titrimetrică a diclofenacului sodic.

Diclofenacul are capacitatea de complexare cu unii cationi (exemplu Cu2+), ca și o bună capacitate de a forma complecși moleculari, reacții utilizate pentru identificarea și determinarea spectrofotometrică a diclofenacului. Caracterul său slab reducător (Ex. reduce Fe3+ la Fe2+) este utilizat de asemeni în scop cantitativ.

Pe baza acestor proprietăți s-au dezvoltat metode de separare, identificare și determinare cantitativă, metode ce sunt prezentate în capitolul IV.

CAPITOLUL III

PROPRIETĂȚI FARMACOLOGICE

III.1. Generalități

Diclofenacul sodic acționează ca și celelalte medicamente antiinflamatoare nesteroidiene la nivelul cascadei acidului arahidonic prin inhibarea acțiunii ciclooxigenazei împiedicând formarea tromboxanului, prostaglandinelor și prostaciclinelor. [6]

În schema următoare se prezintă cascada acidului arahidonic

Diclofenacul acționează diferențiat față de ciclooxigenază în sensul unei inhibiții mai pronunțate față de aceasta comparativ cu acțiunea asupra 5 – lipooxigenazei. Diclofenacul nu are efect asupra fosfolipazei A2 și reduce concentrația acidului arahidonic prin stimularea sintezei de trigliceride.

În tabelul 4 sunt prezentate concentrațiile diferitelor antiinflamatoare necesare pentru a inhiba prostaglandinsintetaza.

Tabelul 4 Concentrații AINS necesare inhibării prostaglandinsintetaza

Pentru a se stabili o relație între structura chimică și acțiunea antiinflamatoare a diclofenacului sodic au fost sintetizați și testați biologic în laboratoarele firmei Ciba – Geigy peste 200 de analogi. Voltarenul s-a dovedit cel mai promițător antiinflamator.[7]

S-au utilizat două modelele farmacologice experimentale: inhibarea ciclooxigenazei și inhibarea artritei la șobolan.

În urma experimetului s-au tras următoarele concluzii:

Diclofenacul sodic datorită stabilității sale chimice este preferat pentru a fi utilizat în scop terapeutic;

Dere cantitativă, metode ce sunt prezentate în capitolul IV.

CAPITOLUL III

PROPRIETĂȚI FARMACOLOGICE

III.1. Generalități

Diclofenacul sodic acționează ca și celelalte medicamente antiinflamatoare nesteroidiene la nivelul cascadei acidului arahidonic prin inhibarea acțiunii ciclooxigenazei împiedicând formarea tromboxanului, prostaglandinelor și prostaciclinelor. [6]

În schema următoare se prezintă cascada acidului arahidonic

Diclofenacul acționează diferențiat față de ciclooxigenază în sensul unei inhibiții mai pronunțate față de aceasta comparativ cu acțiunea asupra 5 – lipooxigenazei. Diclofenacul nu are efect asupra fosfolipazei A2 și reduce concentrația acidului arahidonic prin stimularea sintezei de trigliceride.

În tabelul 4 sunt prezentate concentrațiile diferitelor antiinflamatoare necesare pentru a inhiba prostaglandinsintetaza.

Tabelul 4 Concentrații AINS necesare inhibării prostaglandinsintetaza

Pentru a se stabili o relație între structura chimică și acțiunea antiinflamatoare a diclofenacului sodic au fost sintetizați și testați biologic în laboratoarele firmei Ciba – Geigy peste 200 de analogi. Voltarenul s-a dovedit cel mai promițător antiinflamator.[7]

S-au utilizat două modelele farmacologice experimentale: inhibarea ciclooxigenazei și inhibarea artritei la șobolan.

În urma experimetului s-au tras următoarele concluzii:

Diclofenacul sodic datorită stabilității sale chimice este preferat pentru a fi utilizat în scop terapeutic;

Derivații care conțin în pozițiile 2,6 ale nucleului B atomi de clor sau grupări metil sunt mai active terapeutic, în special cei cu atomi de Cl, iar prin înlocuirea atomilor de clor cu F se constată o scădere considerabilă a acțiunii terapeutice;

Activitatea terapeutică este micșorată prin introducerea grupărilor – OCH3 sau – CH3 în poziția 3 a nucleului B;

Activitatea antiinflamatoare scade de peste 100 ori prin introducerea în poziția 3 sau 4 a grupării – OH sau prin introducerea în poziția 4 a grupării -OCH3 la nivelul nucleului B:

III.2. Farmacocinetică și metabolism

Diclofenacul sodic după administrare per os este absorbit complet la nievelul tractului gastrointestinal.

Timpul de înjumătățire pentru diclofenac este aproximativ de 24h cu absorbție plasmatică maximă de aproximativ 0,5 μg/ml obținută în timp de 2-3 h după administarea unei singure doze de 25 mg și 50 mg sub formă de comprimate enterice. [3]

Valoarea absorbției plasmatice maximă de 1,9 μg/ml este obținută după 24 h de la administrarea unei singure doze de 75 mg.

Studiile efectuate după administrarea per os a diclofenacului sodic marcat cu 14C au dovedit că acesta se absoarbe complet la nivelul tractului gastrointestinal, eliminarea fiind completă după 72 h de la administare.

În urma administrării rectale a diclofenacului, sub formă de supozitoare la șobolan, se produce rapid concentrația plasmatică maximă, care are o valoare aproape identică cu cea obținută în urma administrării per os a medicamentului în soluție. [3].

În figura 1 se prezintă concentrațiile plasmatice atinse de diclofenac administrat în diferite moduri.

Fig 1. Curbele concentrațiilor medii ale diclofenacului

după o singură doză

Diclofenacul sodic se leagă de proteinele plasmatice în proporție de 99,7% proces care nu este influențat de prezența altor substanțe. Cuplarea (legarea) se realizează în special la nivelul a două situsuri, unul cu afinitate mare iar celălalt cu afinitate mai mică.

Concentrații ridicate se ating în ficat, rinichi și sânge, iar în țesutul adipos, mușchi și creier se obțin concentrații mici.

Diclofenacul sodic penetrează membrana sinovială și difuzează în lichidul sinovial.

Se atinge o concentrație maximă la 2-4 ore de la administare. [3]

După 4 – 24 h nivelele sinoviale ale diclofenacului sodic sunt mai ridicate decât nivelele plasmatice.

Inhibarea sintezei prostaglandinelor în lichidul sinovial este mult accentuată.

Diclofenacul sodic este metabolizat de către enzime microzomale hepatice în derivați hidroxilați la om și maimuță, iar în cazul șobolanilor și câinilor modificarea metabolică duce la obținerea de metaboliți rezultați prin conjugarea directă.[3]

Principalii metaboliți sunt prezentați în tabelul 5.

Tabelul 5 Principalii metaboliți ai diclofenacului

La om, metabolitul principal este 4 hidroxi diclofenacul. Metaboliții I și IV reduc edemul labei și inhibă sinteza de prostaglandine, dar efectul lor terapeutic este de 30 de ori mai slab decât cel obținut prin administarea de diclofenac în doză normală. Efectele metaboliților II și III sunt produse în doze mari de diclofenac sodic și nu sunt relevanți. Ulterior acești metaboliți vor fi eliminați pe cale renală și biliară sub formă glucuro și sulfoconjugată. Doar 0,7% se elimină sub formă de diclofenac sodic netransformat.

Eliminarea diclofenacului netransformat și a metaboliților săi este rapidă: 40% din doza administrată în primele 12h.[3]

II.3 Farmacodinamia diclofenacului sodic

Comparativ cu alte antiinflamatoare, considerate deja clasice, ca fenilbutazona și indometacinul, diclofenacul prezintă o eficiență terapeutică superioară, efectele secundare sunt mult mai atenuate, iar reacțiile adverse sunt rare. [8]

Este activ în doze relativ mici între 75 – 150 mg/zi manifestând o remarcabilă activitate antiinflamatoare, analgezică, antipiretică și antiagregantă plachetară.

Ceea ce aduce nou, este activitatea condroprotectoare cu utilizare largă în reumatologie.

Se utilizează cu predilecție în artrita reumatoidă, spondiloartropatii seronegative, în bolile degenerative inflamatorii ca: artroze periferice, vertebrale și abarticulare. În spondiloza anchilozantă se recomandă doze mai mari de 300 mg/zi timp de 2-4 săptămâni. Este eficient și în osteoartrită iar rezultate bune s-au obținut și în gută – faza acută. [8]

Este eficient și în inflamații nereumatismale cum ar fi inflamațiile oculare: uveite, hiperemie conjunctivală, glaucom, dezlipire de retină. În aceste cazuri, după administrarea orală (100mg) diclofenacul reduce semnificativ durerea și hiperemia conjunctivală.

Efecte notabile s-au înregistrat și în cazuri de colică renală, dismenoree, prostată. Un efect surprinzător, testat clinic, a fost cel anticonvulsivant. Ipoteza de la care s-a pornit a avut la bază observația că în timpul convulsiilor spontane sau induse, prin metode chimice sau electrice cresc foarte mult PG cerebrale.

Deoarece diclofenacul este un pueternic inhibitor al sintezei de PG, s-a aplicat la pacienții tineri cu “grand mal” un tratament cu 50 mg diclofenac de 3 ori pe zi, constatându-se scăderea numărului de crize de la o criză pe săptămână până la o criză la 6 luni. Acest tratament s-a urmărit comparativ cu administrarea de doze active de fenitoină (50 mg) și fenobarbital (100 mg) sau 50 mg fenitoină și 200 mg carbamazepină.

Performanța și marea securitate terapeutică a diclofenacului a fost dovedită și prin studiile pe trei generații de animale, dovedindu-se slaba sa toxicitate și lipsa efectelor teratogene. [8]

În toate testele farmacologice folosite s-a deovedit că diclofenacul sodic are un efect terapeutic ridicat. Aceste teste s-au realizat în cazul edemului labei la șobolan indus prin carrageenin și kaolin, dar și în cazul altor afecțiuni de inflamație acută.

În figura 2 este reprezentată relația între activitatea antiinflamatoare a unor AINS în cazul artritei la șobolan și dozele normale orale folosite la oameni. [1]

Administrând oral timp de 4 luni doze de 1 și 3 mg/kg (5 zile consecutive dintr-o săptămână) diclofenacul sodic reduce osteoartrita de la nivelul membrului de șobolan comparativ cu alte antiinflamatoare nesteroidiene care nu au avut același efect.

Figura 2. Relația dintre activitatea antiinflamatoare a

unor AINS și doza zilnic

În tabelul 6 sunt prezentate rezultatele sintetizate de firma Ciba Geigy după 20 de ani de utilizare a diclofenacului

Tabelul nr. 6. Activitățile antiinflamatoare, analgezica și antipiretică a diclofenacului în comparație cu cele ale altor antiinflamatoare nesteroidiene (AINS).

II.4. interacțiuni medicamentoase

Aspirina administrată concomitent cu diclofenacul sodic îl dezlocuiește pe acesta de pe siturile de cuplare determinând realizarea unor concentrații mai mici.

Studiile făcute pe șobolani de firma Ciba – Geigy au demonstrat faptul că proporția de diclofenac sodic eliminat a crescut comparativ cu doza de salicilat și că totalul diclofenacului sodic în plasmă a crescut în timp ce eliminarea medicamentului și a metaboliților lui este mare în bilă. [3]

Diclofenacul crește toxicitatea digoxinei, metatrexatului și ciclosporinei și scade clearence-ul renal al Li favorizând instalarea efectelor sale toxice. Rosak, Schoffbing și Chlud au raportat că insulina și nivelele tolbutamidei din plasmă nu au fost afectate de diclofenacul sodic. [3].

Diclofenacul sodic poate inhiba activitatea diureticelor, iar în cazul diureticelor care economisesc ioni de K+ acționează în sensul creșterii [K+] seric. În cazul anticoagulantelor (tipul warfarinei) administrarea concomitentă a acestora cu diclofenac impune ajustarea dozelor deoarece diclofenacul sodic afectează procesul de agregare plachetară.

II.5. Supradozare

În caz de supradozare la 2 din 27 de cazuri raportate pe plan medical pot apare stări de vomă, colici abdominale și afecțiuni renale acute în urma administrării de 2,35 – 2,50 g diclofenac.

Se va recurge la administrare de diuretic (epurare renală) sau la administrarea unui emetic combinat cu spălături gastrice.

II.6. Studii de toxicitate

Efectele toxice majore la administrarea de antiinflamatoare nesteroidiene sunt iritațiile gastrice și ulcerațiile datorită inhibării ciclooxigenazei. [3]

Ciclooxigenaza și prostaglandina PG E2 au un efect protector față de mucoasa gastrică și acționează prin inhibarea secreției de acid gastric. În studiile de toxicitate acută s-a demonstrat că diclofenacul sodic este responsabil de leziuni gastrice la administrare în doză unică față de alte antiinflamatoare nesteroidiene.

Studiile de toxicitate cronică realizate pe o perioadă de 26 de săptămâni la maimuțe au evidențiat existența leziunilor gastrointestinale în urma administrării unei doze unice de 75 mg.

II.7. Influența asupra unor teste de laborator.

În urma cercetărilor s-a demonstrat că diclofenacul sodic crește timpul de agregare plachetară, însă nu afectează timpul de sângerare, timpul de coagulare, fibrinogenul și factorii V, VII → XII. [3]

II.8. Reacții adverse

La unii pacienți ce prezintă reacții alergice s-au observat hipersensibilizări la administrarea diclofenacului sodic, manifestate prin: cefalee, vertij, grețuri, diaree, hemoragii oculte în fecale, ușoară creștere a transaminazelor serice.

La administrarea topică se pot observa unele reacții alergice: prurit, erupții cutanate.

Se recomandă precauții la bolnavii cu antecedente de ulcer gastric sau duodenal, colită ulceroasă, tulburări de coagulare, leziuni hepatice sau renale. Nu se recomandă folosirea diclofenacului în timpul sarcinii și nici în timpul alăptării.

Mod de admnistrare

Diclofenacul sodic se administrează:

Oral

sub formă de comprimate enterosolubile

Rectal

sub formă de supozitoare

Comprimatele se administrează întregi în timpul meselor. Doza pentru adulți în cazuri acute este de 50 mg de 2 – 3 ori/zi, iar doza de întreținere și în cazuri cronice este de 25 mg de 3 ori/zi. Supozitoarele administrate rectal sunt în doze de 100 – 200 mg/zi pentru adulți.

II.9. Farmacografie

În prezent numeroase firme produc și comercializează forme farmaceutice cu diclofenac sub diferite denumiri. Prezentăm în continuare câteva din produsele cele mai utilizate în România. [9]

Almiral

(medochemie lpt)

comprimate ce conțin 25 mg și 50 mg diclofenac sodic (S) (RFP)

almiral

(MEDOCHEMIE Lpt)

supozitoare conținând 100 mg diclofenac sodic (P – RF)

Arthrex cellugel

(CPM. CONTRACT PHARMA)

gel 100 mg conțin diclofenac sodic (OTC)

de clophen

(pharco – pharmaceuticals)

fiole ce conțin 75 mg/3ml diclofenac;

supozitoare ce conțin 100 mg diclofenac (PRF).

Diclofen

(the. united pharma) – gl (OTC)

Diclofen

(DICLOF. SODIUM – GALENIKA)

comprimate

supozitoare

Diclofenac

(TERAPIA S.A.)

drajeuri ce conțin 50 mg diclofenac sodic

comprimate ce conțin 50 mg diclofenac (RRF)

comprimate retard ce conțin 100 mg diclofenac

diclofenac

(antibiotice s.a)

supozitoare care conțin 0,1 diclofenac (PRF)

Diclofenac

(CHIRMIS FARMIMP)

gel (OTC)

diclofenac

(PROMEDIC)

drajeuri ce conțin 5 mg diclofenac sodic (P-RF)

diclofenac

(ANTIBIOTICE S.A.)

cremă ce conține 1,0 g diclofenac sodic la 100 g (OTC)

Diccogesic

(DAR ALDAWA)

comprimate enterosolubile ce conțin 50 mg diclofenac sodic

supozitoare ce conțin 100 mg diclofenac sodic (P-RF)

Epifenac

(EIPICO)

comprimate filmate gastrintestinale ce conțin diclofenac sodic 25 mg

supozitoare ce conțin 100 mg diclofenac sodic (RRF)

flugofenac

(ECOBI FARMACEUTICI)

capsule retard ce conțin diclofenac sodic 100 mg (OTC)

forgenac

NORDFARM – PRODUC)

Drajeuri (P – RF)

Naclof

(dispersa)

Soluție oftalmică ce conțin diclofenac sodic 1 mg/ml (P – 6L)

Novo difenac®

(NOVO PHARM)

comprimate film ce conțin diclofenac sodic 25, 50, 100 mg pe comprimat (P – RF)

refen

(HEMOFARM)

comprimate film (P)

remethan

(REMEDICA)

drajeuri (P)

rheumafec

(SR – 100 APIC))

capsule (P- RF)

rheumavec

(FARAN)

comprimate film ce conțin diclofenac sodic 25 mg

fiole 3 ml ce conțin diclofenac sodic 75 mg (P – RF)

gel ce conține 1% diclofenac sodic (OTC)

ruvominox

(RAFARR)

soluție oftalmică (P – GL)

sanfinac

(sanof) – Synthelabo

comprimate (P – RF)

tratul®

(GEROT PHARMAZEUTIKA)

capsule ce conțin diclofenac 50 mg

supozitoare ce conțin 60/120 mg diclofenac

fiole ce conțin 90 mg diclofenac (P – RT)

voltaren

(NOVARTIS – PHARMA SERVICES) Inc

drajeuri ce conțin 25 mg, 50 mg, 75 mg (drajeur retard) și 100 mg (drajeuri retard), diclofenac

voltaren

(NOVARTIS – PHARMA SERVICES) Inc

soluție injectabilă (P – RT)

voltaren

(NOVARTIS – PHARMA SERVICES) Inc

supozitoare

voltaren

(NOVARTIS – HEALTH CONSUMER)

gel (OTC)

voltaren rapid

(NOVARTIS – PHARMA SERVICES) Inc

drajeuri ce conțin 25 mg (P), 50 mg (P – RT) diclofenac

votrex

(HIKMAPH)

soluții injectabile (P – RT)

vurdon

(HELP, F)

gel (OTC) (P – RF)

soluție oftalmică (P – GL)

CAPITOLUL III

METODE DE ANALIZĂ

III.1. Analiza calitativă și controlul purității

Analiza calitativă a diclofenacului sodic cuprinde identificarea moleculei organice a acidului 2 – [(2,6, diclorofenil)amino]fenil acetic și a ionului de sodiu.

Pentru controlul anionului organic majoritatea farmacopeelor inclusiv FRX recomandă spectroscopia IR.

Se trasează spectrul IR prin dispersie în bromură de potasiu. Acesta trebuie să corespundă cu cel al diclofenacului sodic (sr) prin dispersie în bromură de potasiu.

În scop calitativ se utilizează și spectrul U.V. în metanol (maximele caracteristice 276 și 283 nm). Aspectul soluției metanolice de diclofenac servește ca parametru de control calitativ al substanței. Soluția obținută prin dizolvarea a 0,5 g diclofenac sodic în metanol, adusă la 25 ml cu metanol, trebuie să fie limpede, iar absorbția măsurată la 420 nm în cuva de 5 cm nu trebuie să depășească valoarea 0,20.

Identificarea ionului de sodiu se face pe reziduul obținut după calcinarea diclofenacului sodic, prin reacția de colorare flăcării (galbenă). Controlul impurităților cuprinde pe lângă identificarea unor impurități anorganice (cloruri, metale grele, sulfiți) controlul impurităților înrudite chimic.

Acest lucru se realizează prin CSS pe silicagel GF.254, developantul fiind un amestec de cloroform: acetonă acid formic (80:10:2).

Examinarea plăcii cromatografice se face în lumină U.V. la 254 nm, cât și prin stropire cu soluție de K2Cr2O7 0,5% în H2SO4 20%.

Diclofenacul formează o colorație roșie – violacee.

III.2. Metode de analiză cantitativă

Metodele indicate în literatura de specilitate pentru determinarea cantitativă a diclofenacului diferă între ele ca sensibilitate, selectivitate, tehnică de lucru și posibilități de aplicare.

Metodele de analiză cantitativă se pot clasifica astfel:

metode titrimetrice;

metode spectrofotometrice;

metode cromatografice;

spectroscopia RMN;

spectroscopia RAMAN.

III.2.1. Metode titrimetrice

Metoda titrimetrică cea mai utilizată este titrarea în mediu neapos.

Diclofenacul sodic în mediu de acid acetic anhidru, se titrează cu HClO4 0,1M în dioxan, în prezența indicatorului cristal violet, până la colorație albastră verzuie.

Reacția care are loc este următoarea:

Metoda este recomandată pentru controlul substanței farmaceutice și formelor solide cu diclofenac sodic, fiind rapidă și cu o sensibiltate bună.

III.2.2. Metode spectrofotometrice de analiză

Diclofenacul se determină spectrofotometric în U.V. și V.I.S.

III.2.2.1. Metode spectrofotometrice în U.V.

După cum s-a prezentat în capitolul II, diclofenacul dizolvat în medii diferite, prezintă maxime caracteristice, ce pot fi folosite la determinarea cantitativă.

Astfel, pentru determinarea din comprimate a fost utilizată cu rezultate bune absorbția soluției etanolice la 284 nm.

Metoda este considerată superioară față de utilizarea NaOH 2M ca solvent, având o sensibilitate mai bună, cu o regăsire de 99,9% și un coeficient de variație de 0,5%.[10]

Determinarea din soluții injectabile [11] s-a realizat după extracția diclofenacului din mediu acid, cu eter etilic, urmată de reextracție cu soluție de NaOH și măsurarea absorbanței soluției apoase rezultate la 275 nm.

Modul de lucru este următorul:

un volum de 2 ml probă se tratează cu 10 ml HCl (1:1) și se extrage cu 15 ml eter etilic după o agitare de 3 min.

extractul se spală cu H2O și se reextrage cu 10 ml NaOH 0,1 M după care este diluat cu același volum de apă ; se măsoară absorbanța unei porțiuni din această soluție (3 ml) la 275 nm. Graficul de calibrare este liniar în domeniu 7,4 – 22,3 mg/ml.

În cazul în care alături de diclofenac mai există și alte substanțe cum ar fi paracetamolul, determinarea spectrofotometrică se realizează folosind un volum de 2 ml probă care se tratează cu 10 ml HCl (1 :1), și apoi diclofenacul se extrage de 4 ori cu câte 25 ml de eter.

Extractele eterice reunite sunt supuse extracției cu 25 ml NaOH 0,1 M ; extractul este diluat cu NaOH 0,1 M până la 200 ml.

Din soluția obținută un volum de 5 ml se diluează cu apă până la un volum cunoscut. Se măsoară absorbția la 276 nm față de NaOH 0,1 M. Regăsirea este de 98,4% iar coeficientul de variație (n=6) este de 0,4%.[12]

Componentele active din medicamentele multicomponente sunt determinate prin înregistrarea spectrului soluției în domeniul de lungimi de undă 200 – 440 nm, iar datele spectrale se vor evalua cu ajutorul unui program specializat de tipul QUEST (Perkin – Elmer).

Sunt necesare pentru acest program spectrele componentelor pure.

Legea Lambert – Beer trebuie să fie verificată pentru fiecare component, iar spectrul sistemului multicomponent trebuie să fie o sumă a spectrelor individuale [13]. Determinarea diclofenacului din comprimate se poate face și prin dizolvarea în metanol urmată de tratarea cu NaNO2 5% în mediu de HCl. Soluția obținută se diluează la 100 ml cu metanol, iar după 30 min se măsoară absorbția la 390 nm.

Legea Lambert Beer este respectată în domeniul 0,05 – 0,6 mg/ml. Regăsirea (n=6) este 98,6% cu o deviație standard cuprinsă între 0,4 – 0,8%.[14]

Alți autori [15] au realizat determinarea diclofenacului sodic din comprimate, alături de fosfatul de codeină prin tratarea pulberii de comprimate cu etanol 50%, filtrare și înregistrarea absorbției soluției etanolice la 212,2, 238,5 și 282,1 nm, cu prelucrarea computerizată a datelor. Regăsirea a fost de 99,8% iar RSD de 0,4 – 0,5%.

Pentru determinarea diclofenacului sodic din comprimate, unguente supozitoare au fost descrise două tehnici de determinare.[16]

S-au preparat soluții din 50, 40 și respectiv 50 mg din fiecare formă farmaceutică prin tratare cu 50 ml H2O și îndepărtarea excipienților prin filtrare.

S-a măsurat absorbanața soluției obținute la 276 nm.

Cea de-a doua metodă constă în precipitarea diclofenacului cu acid percloric și analiza precipitatului obținut prin D.S.C. (calorimetrie diferențială de scanare) la 182ºC în atmosferă de azot măsurându-se picurile endotermice.

Determinarea diclofenacului sodic și a alcoolului benzilic din soluțiile injectabile s-a făcut folosind prima și a doua derivată în domeniul 230 – 300 nm.[17] Graficul de calibrare a fost obținut pentru cantități de 15,1 – 40,2 μg/ml diclofenac, regăsirea din soluții injectabile a fost 101,1 – 102%.

Un studiu al stabilității diclofenacului în unguent a fost efectuat prin măsurarea absorbanța soluțiilor etanolice aduse la pH=8,5 cu TRIS 0,5M la 284 și respectiv 305 nm.[18]

O cantitate de unguent corespunzătoare la 1-2 mg diclofenac s-a tratat cu 30 ml etanol și s-a încălzit la 50ºC. După răcire, soluția a fost adusă la pH=8,5 cu TRIS 0,5M și s-a filtrat pentru îndepărtarea excipienților ; s-a măsurat absorbanța soluției obținute. Deși sensibilitatea la 284 nm este mai mare, s-a preferat cea de la 305 nm, deoarece la această lungime de undă produșii de degradare nu prezintă absorbție.

O metodă spectrofotometrică în domeniul U.V. a fost folosită pentru determinarea diclofenacului, clorzoxazonei și paracetamolului din comprimate.[19]

O cantitate de pulbere de comprimate s-a dizolvat cu o soluție de NaOH 0,2M, soluția obținută după filtrare s-a diluat încât să rezulte un conținut de 10μg/ml paracetamol, 10μg/ml clorzoxazonă și 7μg/ml diclofenac.

Absorbția soluției s-a determinat la lungimi de undă de 257, 276,3 și 288 nm.

Regăsirile au fost cantitative, iar RSD 2,04%. O metodă asemănătoare s-a aplicat la comprimatele ce conțin diclofenac și paracetamol.[20]

O cantitate de pulbere de comprimate, echivalentă la 50 mg paracetamol respectiv 30 mg diclofenac sodic s-a dizolvat în 75 ml NaOH 0,02M.

După filtrare, soluția a fost diluată pentru obținerea unei concentrații de 6,5μg/ml paracetamol și 7μg/ml diclofenac sodic.

Absorbanțele au fost înregistrate la 276 și 257 nm. Legea Lambert-Beer a fost verificată, iar regăsirea a fost ≈100%.

Spectrofotometria U.V. a fost utilizată și pentru studii de cedare a diclofenacului sodic din matrice hidrofilă (alcool polivinilic) și pentru studii de solubilitate. [3]

Determinarea s-a făcut la 275 nm și respectiv 280 nm.

III.2.2. Metode spectrofotometrice în vizibil

Determinarea spectrofotometrică în VIS a diclofenacului se bazează pe formarea de compuși colorați a căror absorbanță este proporțională cu concentrația.

Se utilizează în acest scop :

reacții de complexare cu diferiți cationi ;

reacții cu formare de complecși moleculari ;

metode indirecte bazate pe caracterul reducător al diclofenacului;

reacții de obținere de derivați ai diclofenacului.

Reacții de complexare cu cationi

Reacția de complexare cu cationul Cu(II) a fost utilizată pentru determinarea spectrofotometrică a diclofenacului la 680 nm. Complexul format este extractibil în cloroform.

Legea Lambert – Beer se respectă până la 6,28 nM diclofenac sodic, limita de detecție fiind de 72 μg/ml.

2 ml soluție se tratează cu 3 ml acetat de cupru 0,25 M, 1ml KCl 1M, 4 ml tampon acetat pH=6 și 5 ml cloroform. Se măsoară absorbanța fazei organice la 680nm.

Regăsirea este de 96 – 104%, iar coeficientul de variație (n=7) este de 1,3 – 3% pentru 2,5 – 75 mg/ml diclofenac sodic.[21]

O altă metodă are la bază formarea complexului cu Fe(III) în prezența tiocianatului de amoniu la pH=4,2 – 6,5.

Complexul roșu este extractibil în cloroform. Variabilele luate în considerare au fost pH-ul, puterea ionică și concentrația reactivilor de culoare.

Complexul prezintă absorbanța maximă la 481 nm. Limita de detecție este de 14μg/ml, iar regăsirea (n=10) este de 98,8.[22]

Diclofenacul sodic formează un complex colorat cu 3 – metil – 2 – benzotiazolinonhidrazona și sulfatul de Cu și amoniu a cărui absorbanță se măsoară la 600nm.[3]

Metode bazate pe formarea de complecși moleculari

Un reactiv mult utilizat în acest scop este albastrul de metilen, care formează un complex extractibil în cloroform, ce prezintă absorbția maximă la 653 nm.

Reacția a fost utilizată pentru determinarea diclofenacului din comprimate.[23]

Reacția de complexare are loc la pH=9,4 (tampon amoniacal) cu soluții de reactiv de concentrație 0,5 mM.

Limita de detecție este de 1,2 μM diclofenac iar RSD< 1%.

O metodă asemănătoare a fost elaborată pentru comprimate ce conțin și paracetamol. [3]

Complexul cu albastru de metilen format la pH=6,8 (tampon fosfat) se extrage în clorofom, iar absorbanța se măsoară la 640 nm.

Legea Lambert – Beer se respectă în domeniul 5-40μg/ml. Regăsirea este de 97,7 – 100,4%, iar coeficientul de variație este de 1%.

O altă metodă de determinare a diclofenacului se bazează pe formarea unui complex cu transfer de sarcina cu cloranilul. Metoda s-a aplicat la comprimate, soluții injectabile și supozitoare. Pulberea de comprimate se tratează cu etanol și se filtrează, soluțiile injectabile se diluează cu etanol, iar supozitoarele se dizolvă în etanol fiebinte. O porțiune din soluție conținând 2-20 mg diclofenac sodic se amestecă cu 2,5 ml cloranil 0,5% în dioxan se aduce la 25 ml cu etanol ; amestecul se încălzește la 50ºC (timp de 25 min, apoi se răcește). Absorbanța soluției se măsoară la 545 nm față de o probă oarbă.[24]

Metoda descrisă de Sam și colaboratorii (citat de 3) pentru determinarea diclofenacului din forme farmaceutice are la bază reacția de complexare cu K3[Fe(CN)6] în medii de NaOH, complexul galben obținut prezintă absorbanță maximă la 450 nm.

Metode indirecte bazate pe caracterul reducător al diclofenacului

Diclofenacul reduce Fe3+ la Fe2+ care reacționează cu dipiridilul formând un complex roșu. Reacția se execută în etanol la cald, cu absorbanță maximă la 520 nm. [25]

Legea lui Beer este liniară în domeniul 10-80 μg/ml. Determinarea diclofenacului sodic din comprimate, capsule s-a realizat prin solubilizarea unei cantități de probă echivalentă la 100 mg derivat, în apă și filtrarea în vederea eliminării excipienților.

La soluția filtrată se adaugă KH2PO4 – Na2HPO4 (soluție tampon la pH =6), după care amestecul este tratat cu 1,5 ml dihidroclorură de N,N dimetil p-fenilendiamina 2,5 mM, 1 ml K2S2O8 10mM și se adaugă apă până la 25 ml.

Se măsoară absorbția la 670 nm față de o soluție martor ce conține aceeași reactivi. Legea Lambert Beer este liniară în domeniul 2-24 μg/ml. [26]

Reacții de obținere de dervați ai diclofenacului

Molecula diclofenacului poate participa la o serie de reacții caracteristice, sinteze organice, al căror produs de reacție este colorat.

Astfel nitrofenilhidrazina a fost utilizată ca reactiv de culoare, pentru o serie de antiinflamatoare nesteroidiene dintre care și diclofenacul. Metoda constă în reacția acestor agenți cu 2 nitrofenil hidrazina în prezență de ciclohexil carbodiimida în etanol, când se obține o colorație violet intensă cu absorbanța maximă la 550 nm.

Compușii studiați au fost: acidul flufenamic, acidul metafenamic, ketoprofenul, ibuprofenul, diclofenacul și indometacinul.

S-a obținut un coeficient de variație de 2%. Graficul de calibrare a fost liniar în domeniul 0,04 – 0,2 mM. [27]

Se poate determina diclofenacul sodic și acidul mefenamic folosind p-dimetilamino cinamaldehida prin spectroscopie VIS.

1 ml conținând 0,1 – 0,8 mg/ml diclofenac sodic a fost amestecat cu 2,5 ml de p dimetilamino – cinamaldehida și 2 ml HCl.

Soluția obținută a fost încălzită la 100ºC timp de 6 min și apoi a fost răcită și completată cu metanol la 10 ml.

Absorbția soluției rezultate a fost măsurată la 538 nm.

1 ml conținând 0,01 – 0,08 mg/ml acid mefenamic a fost tratat cu 2 ml p dimetil aminocinamaldehidă și 2 ml HClO4.

Soluția obținută a fost încălzită la 100ºC timp de 5 min și completată la 10 ml cu metanol.

Absorbanța soluției a fost determinată la 665 nm. Legea lui Beer a fost verificată pentru 10 – 80 și 1-8 μg/ml diclofenac, respectiv acid mefenamic. Regăsirile au fost 100, 33 ± 0,87% și 100,73 ±0,44%.[28] Reacția cu NaNO2 în mediu de HCl a fost utilizată pentru determinarea din forme farmaceutice a unor cantități de ordinul 50 – 600μg/ml diclofenac sodic la 390 nm. [3]

III.3. Metode cromatografice de analiză

Metodele cromatografice sunt folosite în special pentru a separa diclofenacul sodic de alte substanțe, pentru controlul purității acesteia și pentru determinări cantitative în diverse medii.

III.3.1 Cromatografia pe strat subțire (C.S.S. TLC)

Cromatografia pe strat subțire este folosită pentru analiza diclofenacului sodic din formele farmaceutice și pentru determinarea acestuia alături de metaboliți din materiale biologice. Astfel, analiza din plasmă sau urină, s-a realizat după extracția cu cloroform din mediu de acid fosforic, urmată de separarea prin cromatografie pe strat subțire pe o pălăcuță de tip Silufol, (activată la 120ºC timp de 20 min), cu faza mobilă formată din hexan: acetat de etil: anhidridă acetică (139:60:1). Reactivul de revelare este NaOH 0,1M : K3[Fe(CN)6] 15 mM (5:1) sau tampon fosfat 0,1 M: H2O2 10 mM: peroxidază (28:1:1).

Diclofenacul (Rf=0,61) prezintă spoturi cu Rf=0,30 și Rf=0,39, iar absorbanța maximă pentru aceste substanțe se înregistrează la 579 și 540 nm.

Absorbanțele acestor spoturi la 455 nm sunt de 8 și respectiv 18,5% din absorbanța lor maximă, astfel încât diclofenacul poate fi determinat fără îndepărtarea metaboliților,

Iradierea în U.V. a cromatogramelor pe straturile care conțin un indicator fluorescent prezintă un spot întunecat pe un fundal fluorescent.

Spoturile pot fi preluate și tratate cu NaOH și K3[Fe-(CN)6] și după centrifugare se măsoară absorbanța la 455 nm.

Prin această metodă în domeniul 125-400 mg, eroarea este 11,3 – 2,4%.[29]

O metodă de analiză a diclofenacului din supozitoare implică dizolvarea acestora într-o soluție fierbinte de etanol 50%, filtrare și determinare spectrofotometrică la 276 nm în soluție alcalină.

Un volum de 20μl de soluție de probă în etanol 96% este analizat prin cromatografie pe strat subțire, pe o plăcuță Silufol U.V. 254, faza mobilă alcătuită inițial din hexan, apoi după uscare, din hexan: cloroform: acetonă: anhidridă acetică (60:60:30:1). Spotul corespunzător diclofenacului este vizualizat la 254 nm. [30]

Determinarea diclofenacului din țesuturi s-a realizat printr-o metodă combinată de separare pe coloană și CSS, urmată de determinare spectrofotometrică.

Proba de țesut (stomac, intestin, ficat) este omogenizată, amestecul este extras de câteva ori cu etanol 96% și centrifugat; extractele reunite sunt evaporate la 80ºC până la consistența unui sirop, care va fi separat cromatografic pe o coloană cu etanol 96% : H2SO4 1% (1:1) drept fază mobilă. Diclofenacul apare în prima fracție de unde este extras în cloroform.

După ce se va evapora o picătură de soluție diclofenacul va fi determinat spectrofotometric în urma reacției cu HNO3 concentrat (colorație violetă), H2SO4 concentrat și H2O2 (culoare violet-albastră), sau folosind HCl 0,1N și reactiv Dragendoff (cristale aciculare), sau prin cromatografie pe strat subțire, prin separarea extractului pe o plăcuță Silufol, cu fază mobilă formată din benzen: 2 propanol (9:1) și localizarea spotului corespunzător diclofenacului (Rf=0,6) cu o soluție de dicromat de potasiu 1% în H2SO4 40% (culoare violetă).

Pentru a determina diclofenacul o parte din extractul cloroformic este evaporat, reziduul este tratat cu o soluție de NaIO4 5% în H2SO4 75%, absorbanța soluției violete este măsurată la 550 nm.

Concentrația poate fi determinată folosind un grafic de calibrare, legea lui Beer fiind liniară în domeniul 0,01 – 0,5 mg diclofenac.

Metoda prezintă o acoperire de 81,7% cu o eroare relativă de ±2,5% (limita de detecție 5 ppm), comparativ cu cele obținute prin alte metode (11,5 – 23,3%). [31]

Acidul izobenzamic, lignocaina, diclofenacul din preparatele farmaceutice utilizate în stomatologie sunt separate prin CSS pe o plăcuță Silicagel 254 având faza mobilă formată din benzen: metanol: acid acetic anhidru (85:10:1), iar măsurarea densitometrică a spoturilor se face la 234, 230 și 280 nm.

Ibuprofenul, piroxicamul, oxifenilbutazona, indometacinul, diclofenacul sodic, fenbufenul, aspirina sunt separați prin CSS pe Silica Gel R (0,5 mm) având faza mobilă formată din CHCl3: CH3OH: NH3 25% (16:3:1). După developare de 30 min, plăcuța este uscată în aer apoi la 100 – 120 ºC timp de 15 min.

După uscare se folosește pentru revelare un derivat de 9- izotiocianatoacridina (0,1 % în CH2Cl2 sau în benzen) și se vor măsura densitometric spoturile la 254, 366 nm. Limita de detecție pentru fiecare spot este de 0,1 μg. [33]

O altă metodă de determinare a unor agenți antiinflamatori nesteroidieni prin CSS constă în impregnarea stratului subțire cu un amestec fluorescent.

Astfel 1-2 μl de soluție de ibuprofen și oxifenbutazonă în etanol, piroxicam, diclofenac, indometacin și fenilbutazonă în etanol 50%; fenbufen în bezen și aspirină în apă, sunt aplicate pe o placă de sticlă acoperită cu SilicaGel R impregnat cu un amestec format din fluorogermanat de Mg: Zn2SiO4: ZnS(7:8:2) sau cu un amestec format din fluorogermanat de Mg activat cu Mn (fluorescență roșie), ZnMgGeO4 activat cu Mn (fluoroscență verde) și CaWO4 (fluorescență albastră).

Faza mobilă este formată din CHCl3:Ch3OH:NH3 25% (18:15:5). După developare plăcuța cromatografică este uscată la 100 – 120ºC timp de 15 min. Spoturile sunt detectate la 254 nm. Separarea tuturor componentelor este realizată cu o limită de detecție de 1μg .[34]

Lipofilitatea aspirinei, diclofenacului, ibuprofenului, indometacinului, ketoprofenului, naproxenului, fenilbutazonei, piroxicamului, a fost studiată prin cromatografie pe strat subțire.

Separarea a fost posibilă folosind suporturi (10×10 cm) umezite cu RP 18 W/U.V. 254 Nano-Sil sau Nano – Durasil (20/U.V. 254) acoperite cu ulei de parafină.

Drept fază mobilă s-a uitlizat amestecul, metanol/apă iar temperatura coloanei a fost de 23 – 25ºC. Zonele separate au fost vizualizate la 254 nm. Spoturile (RF) au fost măsurate și calculate prin intermediul RM.

Analiza prin prima derivată a fost realizată pe baza datelor de retenție folosind un program computerizat descris de Mackievz și Rotajezak pentru a putea compara lipofilitatea medicamentelor. [35]

III.3.2. Cromatografia de gaze

III.3.2.1 Cromatografia de gaze cuplată cu detecția cu ionizare în flacără (FID)

Cromatografia de gaze este o variantă a cromatografiei pe coloană în care separarea componentelor dintr-un amestec se realizează între o fază mobilă gazoasă și o fază staționară lichidă (G.L.C. – gaz lichid cromatografia) sau solidă (G.S.C. – gaz solid cromatografia).

Cromatografia de gaze permite atât separarea substanțelor volatile dar stabile la temperatura de volatizare, cât și a celor nevolatile după transformarea lor în derivați mai volatili (derivatizare).

Diclofenacul fiind un produs nevolatil, s-a determinat gaz cromatografic după derivatizare cu diferiți agenți de derivatizare.

Metodele gaz – cromatografice utilizate pentru determinarea diclofenacului diferă între ele prin tipul de coloană utilizată, metoda de derivatizare și sistemele de detecție.

Analiza diclofenacului din plasmă s-a realizat după extracția acestuia din mediu acid cu un amestec de cloroform metanol (199:1).

Proba de analizat (1ml plasmă deproteinizată) s-a acidulat cu HCl și s-a supus extracției.

Extractul s-a metilat cu diazometan și evaporat sub azot; rezidul reluându-se cu 50 – 100 μl hexan după care se injectează într-o coloană de tipul DB-5 (0,25 μm) cu dimensiuni de 30 mm x 0,25mm.

Regimul de temperatură a fost următorul: de la 150ºC la 210ºC temperatura a avut o creștere de 2.5ºC/min, apoi cu 10ºC/min până la 275ºC unde este menținută constantă (20 min). Gazul purtător (He) are un debit de 1,5 ml/min. Ca detector s-a folosit un detector cu ionizare în flacără. Acoperirea este de 93,7 – 102,3% în aceeași zi (n=5) și coeficientul de variație este de 2,1-12,5%.

Între zile (3 analize pe zi timp de 10 zile) acoperirea este de 3,6 – 13,8%, limita de detecție este de 25μg/ml. [36]

III.3.2.2. Cromatografia de gaze cuplată cu spectrometria de masă (G.C. – M.S.)

Cromatografia de gaze cuplată cu spectrofotometria de masă este folosită pentru determinarea diclofenacului sodic din materiale biologice. 1 ml probă (urină) este amestecată cu NaH2PO4 · H2O 1M (pH=3,5) pentru obținerea unui pH =5. Amestecul se va introduce într-o coloană de tip Band – Elut (1 ml) și hexan 200 μl, iar analiții sunt eluați cu 600μl CH2Cl2.

Eluatul este evaporat la 50º (sub azot rezidul obținut este dizolvat în 200 μl acetonă iar soluția obținută este tratată cu 20μl iodmetan și cristale de K2CO3, și va fi încălzită la 60 ºC timp de 1 h.

Amestecul este evaporat sub azot și rezidul este dizolvat în 50 μl acetonă. O porțiune de 1μl din această soluție este analizată prin G.C. – M.S. pe o coloană de tipul D.B. – 5 (25 mm x 0,25 mm x 0,25 μm) cu un program de temperatură: de la 50ºC (unde se ține constantă 10 min.), temperatura crește cu 40ºC/min până la 280ºC unde se va menține constant 10 min. Limita de detecție pentru diclofenac este de 5 μg/ml.[37]

Pentru determinarea cantitativă a unor agenți antiinflamatori nesteroidieni și pentru detecția lor se folosește GC – MS:

0,5 ml de plasmă la care s-a adăugat standard intern (Ketoprofen) a fost agitată cu 1 ml H3PO4 2,7M timp de 30 min apoi proba este supusă extracției cu toluen.

Se evaporă stratul organic iar rezidul se esterifică cu H2SO4 0,5% în etanol timp de 1 h la 60ºC. Produsul a fost neutralizat cu NaHCO3 și extras cu hexan, esterul este transferat în benzen pregătit pentru analiza cromatografică pe o coloană (12,5 m x 0,2 mm x 0,33 μm) cu un program de temperatură de la 190ºC, temperatura va crește cu 7ºC /min până la 235ºC.

Gazul purtător utilizat este He (1,22ml/min) iar detecția se face prin M.S. cu urmărirea ionilor esterilor etilici ai diclofenacului și ketoprofenului (ce prezintă raportul m/z 214 și 209).

Diclofenacul poate fi detectat până la 2μg/ml cu o acoperire de 86,4% la o concentrație de 120 μg/ml coeficientul de variație fiind de 10,3%.[38]

Kodowaky și alții au dezvoltat o metodă sensibilă pentru determinarea diclofenacului din plasma umană cu ajutorul G.C. M.S.

1 ml plasmă la care s-a adăugat 4’metoxi diclofenac ca standard este supus extracției cu benzen în prezența H3PO4 1M, apoi este reextras în tampon Na2CO3 0,08 M (pH=9,6) și în final în benzen.

După evaporarea benzenului, la reziduu se adaugă anhidridă pentafluoropropionică în hexan.

Derivatul indolinonic format este separat și identificat prin G.C. – M.S. pe o coloană (0,5 m x 3 mm) ce conține O.V. – 1 chromosorb W – AW – DM C.S. 3% la 200ºC cu He drept gaz purtător și un spectrometru de masă la care energia electronilor de impact este de 20 eV. Acoperirea este de 83,6%, limita de detecție de 0,2 μg/ml iar coeficientul de variație (n=6) este de 5,1 – 8,7%.[39]

O altă metodă de analiză a cantităților de ordinul femtomolilor de diclofenac este următoarea: 0,5 ml plasmă, acidulată cu 2 ml HCl 0,2 M până la pH = 1, este tratată cu 0,5 μg standard intern (diclofenac marcat cu 18O), proba fiind trecută printr-o coloană Bond Elut C18 care a fost condiționată cu metanol și apă.

Coloana este spălată cu 5 ml apă și 6 ml hexan iar eluția se efectuează cu 3 ml CH2Cl2, eluatul este evaporat în curent de azot, iar rezidul este tratat cu 2 bromo pentafluorotoluen, reactivul neconsumat fiind apoi îndepărtat sub curent de azot.

Derivatul obținut este dizolvat în 0,5 ml hexan și trecut printr-o coloană Bond – Elut V18 și apoi pe o coloană cu Nucleosil C18, cu faza mobilă formată din metanol : apă: anhidridă acetică (7500: 2500: 1), detecția se face la 279 nm.

Fracția care conține diclofenac este analizată G.C., pe o coloană de DB – 5 (20 mm x 0,25 m x 0,25 μm) cu următorul program de temperatură: de la 120ºC (unde este menținută 1 min.) temperatura crește cu 20ºC/min până la 280ºC (unde este menținută constant 5 min).

Gazul purtător (He) are un debit de 1 ml/min. Detecția se face urmărind ionii ( cu m/z=294 și 300) pentru analit și respectiv standard intern.

Graficul de calibrare este liniar în domeniul 10 mg – μg diclofenac, limita de detecție în plasmă fiind de 2μg/ml. [40]

Aceeiași autori propun o modificare a acestei metode: o cantitate de 0,5 ml plasmă este adusă la pH = 1 cu acid clorhidridic, se adaugă standard intern (diclofenac sodic cu 18O) iar amestecul este trecut pe o coloană Bond Elut C18, eluția făcându-se cu CH2Cl2, după spălare cu apă și hexan.

Din eluat se evaporă solventul, rezidul este tratat cu diizopropiletilamină și bromură de pentafluorobenzil în acetonitril, la temperatura camerei, timp de 10 min și după îndepărtarea excesului de solvent derivatul obținut este dizolvat în hexan.

Soluția este trecută printr-o coloană Bond – Elut C18 și apoi pe o coloană Nucleosil C18 (12,5 cm x 4 mm x 10 μm) cu o fază mobilă formată din CH3OH = H2O = CH3COOH (75 : 25 : 0,01) cu un debit de 3 ml/min.

Detecția se face la 279 nm. Fracțiile care conțin esterul pentafluorobenzilbenzilic al diclofenacului, sunt evaporate la sec, reziduul este dizolvat în hexan și soluția obținută este analizată prin GS – M.S. pe o coloană DB – 5 (20 m x 0,25 m), cu un program de temperatură: 1 min la 120ºC după care temperatura crește cu 20 ºC/min până la 280ºC unde este menținută constantă 5 min. Gazul purtător este He.

Acoperirea diclofenacului este de 84,7%, limita de detecție este de 2 μg/ml, iar coeficientul de variație inter și intrazile este de 4,0 și 0,3% [41].

O metodă de analiză cromatografică prin gaz cromatografie capilară combinată cu spectrometrie de masă prin raze ionizate negative, a fost propusă pentru caracterizarea noului metabolit de diclofenac sodic în urina umană.

Formele oxindolice ale metaboliților de diclofenac au fost deținute prin hidroliza a 5 ml urină timp de 1 h la 80ºC cu 3,6 ml HCl concentrat. După răcirea amestecului până la înghețare reziduul a fost dizolvat în 5 ml H2O și după ajustarea pH-ului la 5 – 6 cu KHCO3 2M, a fost din nou înghețat.

Amestecul format din reziduu și NaCl cristale, s-a introdus într-o celulă SFG și apoi într-o coloană G.C. încălzită la 100ºC și supusă presiunii de CO2 35MPa (Rh).

După menținerea unei atmosfere de CO2 compușii extrași au fost colectați într-un ml de acetonitril.

Metaboliții hidrolizați au fost supuși la G.C. pe o coloană de sticlă (20 m x 0,3 m. i. d), învelită cu SOP – 50 – TF, gazul purtător fiind H2 la temperatură de la 40ºC la 380ºC (4ºC/min) iar detecția s-a realizat prin derivatizare cu CH3CIMS.

Formele oxiindolice ciclice ale metaboliților au fost determinate similar cu modelele nehidrolizate nesaturate.

Spectrul complet a fost obținut cu 1 μg/ml pentru cinci metaboliți de diclofenac și pentru un nou metabolit: acid 2(2,6–dicloro, 4–hidroxi, 3– metoxi fenilamino) fenilacetic [42].

III. 3.2.3. cromatografia de gaze – detecție cu captură de electroni (E.c.d.)

Unii autori determină eterul glucuronic al diclofenacului în urină prin cromatografia de gaze pe coloană capilară.

Astfel, 3 ml urină la care s-a adăugat 3 ml tampon acetat (pH=5,2), 20 ml acid ascorbic și 0,5 ml glucorinidază, se mențin timp de 18 ore la 37ºC.

Pentru determinarea diclofenacului sodic din plasmă și urină, Rayanam propune o metodă gaz-cromatografică ce folosește o coloană capilară și un detector cu captură de electroni. Un ml plasmă sau urină conținând 4’ metoxi diclofenac drept standard intern, se tratează cu 1 ml H3PO4 1M și se supune extracției cu 5 ml CH2Cl2.

Extractul este evaporat la sec, reziduul se dizolvă în 0,2 ml CH3OH conținând H2SO4 0,1% și este încălzit la 60ºC timp de 60 min, apoi se adaugă 0,4 ml KHCO3 25% și hexan.

După amestecare, 1,8 ml din faza ce conține hexan este evaporată la sec iar reziduul dizolvat în hexan este analizat prin G.C. pe o coloană SCOT. OV – 17 (10 m x 0,24 mm) cu un raport de splitare de 1:3 la 260ºC, cu N2 gaz purtător (0,5 ml/min) și detecție dublă FID și N63 ECD. Graficul de calibrare este liniar în domeniul 0,1 – 2 μg/ml diclofenac în urină sau plasmă.

Coeficientul de variație (n=3) este de 0,8 – 4,99% în plasmă și 2,65 – 7,1% în urină. [44]

Pentru determinarea diclofenacului din plasmă se poate folosi atât GC cât și HPLC.

În continuare vom prezenta un exemplu făcând și comparație între cele două metode.

Probele de diclofenac adăugate în plasmă umană au fost analizate prin cele două metode. Pentru GC de înaltă rezoluție, diclofenacul este extras din plasmă acidulată în hexan CH2Cl2 (1:1), se prepară derivatul său, cu tetrabutilamoniu care este extras în hexan, conținând metilmeclofenamat ca standard intern, înainte de injectare într-o coloană capilară de sticlă O.V – 1 (15 m x 0,32 mm x 0,4 μm). Programul de temperatură este următorul: de la 180ºC la 240ºC cu 10ºC/min.

Se utilizează 63Ni EC.D ca detector.

Pentru HPLC, diclofenacul este extras din plasma acidulată în benzen și curățată prin partiționare cu solvent, înainte de analiza pe o coloană (25 cm x 4,6 mm) de tipul Partisil – 5.

Faza mobilă este un amestec de CH3CN – H3PO4 0,1M (pH = 2,9), 7:3, cu acid mefenamic ca standard intern.

Detecția se face în UV la 280 nm. Metoda GC este mai sensibilă dar necesită etape de preparare a probei mai sofisticate [45].

III.3.3. Cromatografia de lichide de înaltă performanță

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (CLIP sau HPLC) este una din metodele cele mai utilizate pentru determinarea diclofenacului și metaboliților săi din medii biologice, studii de biodisponibilitate și bioechivalență.

Literatura de specialitate prezintă numeroase metode HPLC pentru diclofenac ce se deosebesc prin tehnica de lucru, sistemul de detecție, compoziția fazei mobile.

Prezentăm în continuare câteva din metodele HPLC întâlnite.

III.3.3.1 HPLC cu detecție de fluorescență

A fost dezvoltată o metodă de analiză a diclofenacului sub forma unui derivat fluorescent prin fotoderivatizări postcoloană.

50 μl plasmă a fost amestecată cu 50 μl acetonitril, după care proba a fost centrifugată la 12.000 rot/min. O porțiune de 50 μl supernatant a fost analizat prin HPLC pe o coloană Nucleosil C18 (15 cm x 4 mm x 5 μm), prevăzută cu o precoloană ODS (15 mm x 3,2 mm x 5 μm) cu o fază mobilă formată din CH3CN – tampon fosfat (pH = 6,6) (32 : 68) cu un debit de 0,9 ml/min.

Eluatul este introdus într-un tub PTFE, este iradiat la 254 nm și fluorescența soluției este măsurată la 350 nm.

Acoperirea diclofenacului este de 92%; graficul de calibrare este liniar în domeniul 10 – 5.500 μg/ml în plasmă [46].

III.3.3.2. HPLC cu detecție electrochimică

Pentru determinarea diclofenacului și a metaboliților săi din plasmă și fluid cerebrospinal prin HPLC cu detecție electrochimică, probele au fost condiționate cu H3PO4 1M iar acești compuși au fost extrași prin eluție cu metanol pe o coloană C18 de tipul SPE – Octadecil, eluatul a fost evaporat la sec și dizolvat în faza mobilă [CH3CN : tampon acetat pH=3 (7:13)] înainte de analiza pe o coloană C8 (8 cm x 4,6 mm).

În cursul separării cromatografice debitul fazei mobile a fost de 1,2 ml/min.

Detecția s-a făcut la un potențial de + 0,95 V de un electrod de Ag/AgCl.

Răspunsul electrodului este liniar în domeniu 5 – 500 μg/ml în cazul plasmei și în domeniul 1- 20 ng/ml în cazul lichidului cerebrospinal cu limitele de detecție de 0,5 -1,4 și respectiv 3,2 – 4,8 pentru diclofenac și metaboliții săi în plasmă și respectiv în fluidul cerebrospinal corespunzător unei regăsiri de 6,17 – 7,18% respectiv 66 – 87,1% [47].

În cazul în care determinarea diclofenacului se face din plasmă și din lichid sinovial, analiza prin HPLC cu detecție electrochimică se desfășoară în următoarele condiții:

diclofenacul se extrage cu CH2Cl2 după care se separă pe o coloană C18 de tipul Erbasil cu dimensiunile 15 cm x 4,6 mm x 5 μm folosind ca fază mobilă tampon acetat 50 mM (pH =3): CH3CN (3:2) cu un debit de 2 ml/min.

Detecția se realizează la un potențial de 0,95 V, folosind un electrod de sticlă – carbon.

Graficul de calibrare este liniar în domeniul 5 – 500 μg/ml atât în plasmă cât și lichidul sinovial.

Coeficienții de variație între zile au valorile cuprinse între 2,3 – 3,4 în plasmă și 2,2 – 3,8 în fluid sinovial (n=4). [48]

O altă metodă de analiză a diclofenacului prin HPLC cu detecție electrochimică din plasmă, constă în extragerea acestuia cu benzen, după care faza organică este analizată prin HPLC pe o coloană LiCh rosole NH2 cu o fază mobilă formată din CH3CN : HClO4 2,5 mM (7:13) cu detecție la un potențial de + 900 mV.

Graficul de calibrare este liniar până la 200 μg/l diclofenac iar limita de detecție este de mai puțin de 5 μg/l în ser sau plasmă [49].

III.3.3.3. HPLC cu detecție în ultraviolet

Pentru determinarea diclofenacului sodic din plasma umană a fost pusă la punct o metodă automatizată. Astfel este descris un sistem robotizat de tipul Zymate II în care din amestecul probei la care este adăugat standardul intern (GP. 4287) se extrage diclofenacul prin amestecare timp de 15 minute cu hexan : 2 propanol (9 : 1), apoi extractul este concentrat sub curent de azot la 45ºC.

Reziduul este dizolvat în faza mobilă.

CH3OH : CH3CN : tampon fosfat 80 mM (5 : 4 : 11).

Un volum de 50 μl din soluția rezultată este analizat prin HPLC folosind o coloană C18 de tipul Zorhax ODS (8 cm x 6,2 mm x 3 μm) prevăzută cu o precoloană de tipul Guard – Pak ODS. Debitul fazei mobile este de 1,5 ml/min. Detecția se face în ultraviolet la 220 nm. Graficul de calibrare este liniar până la 1 μg/ml. Limita de detecție este de 5μg/ml. Acoperirea medie este de 99,8% iar coeficientul de variație este de aproximativ 10,3% [50].

Un alt sistem automat de tipul Zymate folosește o serie de etape automatizate pentru prepararea probei. Procentul se bazează pe adăugarea de indometacin ca standard intern și de H3PO4 în plasmă înainte de extracția cu hexan – 2 propanol (9 : 1). După extracție, faza organică este evaporată iar reziduul este dizolvat în faza mobilă (tampon acetat de sodiu 0,02 M cu pH = 7 conținând NaCl 0,02 M : CH3CN : 2 propanol în raport 77 : 18 : 15). O porțiune din această soluție este introdusă într-o coloană de separare de tipul Waters Resolne C18 (15 cm x 3,9 mm x 5 μm). Debitul fazei mobile este de 1,2 ml/min iar detecția se face în ultraviolet la 210 nm.

Graficul de calibrare este liniar în domeniul 0,02 – 6 μg/ml [51].

O altă metodă utilizată la determinarea diclofenacului din plasmă prin HPLC constă în amestecarea unui ml de probă cu 20 μl standard intern, acidularea amestecului cu 2 ml H3PO4 2,5N și agitare puternică.

După agitare, diclofenacul este extras în hexan : 2 propanol (9 : 1) prin agitare timp de 30 secunde și centrifugare timp de 10 min.

Faza organică este concentrată prin evaporare și o porțiune de 0,05 ml din aceasta este analizată prin HPLC la 45ºC folosind o coloană cu fază inversă waters Resolne, ca fază mobilă, formată din tampon acetat pH=7: CH3CN : 2 propanol (77 : 18 : 5) și un detector UV fixat la 210 nm.

Fiecare etapă din această metodă este controlată de un sistem automat Zymate II iar datele sunt procesate pe un calculator UA x 11/780.

Precizia metodei este de aproximativ 10% pe domeniul 0,02 – 3 μg/ml, iar reproductibilitatea este mai mică de 0,5% [52].

Determinarea diclofenacului din plasmă, utilizând un sistem automatizat combinând extracția lichid – solid cu cromatografia de lichide, se realizaează în următorul mod: plasma e amestecată cu tampon citrat pH=5 și cu standardul intern (GP.4287) și analizată utilizând un sistem de preparare a probei automat, de tipul Gilsan prevăzut cu coloane de extracție.

Proba este trecută printr-o coloană C18 de tipul Bakerbond SPE, folosind o fază mobilă formată din CH3OH : tampon fosfat pH=7,2 (14 : 11).

Eluatul este amestecat cu apă și trecut din nou pe o coloană Nova Pak C18 (15 cm x 3,9 mm x 4 μm) cu un debit al fazei mobile de 0,4 ml/min. Detecția se realizează în ultraviolet la o lungime de undă de 282 nm.

Graficul de calibrare este liniar în domeniul 31,4 – 314 nM diclofenac.

Coeficientul de variație în cadrul aceleeași zile este de 1,0 – 9,3% iar cel între zile este de 1,0 – 8%.

Regăsirea este de 95,9 – 106,0% [53].

Diclofenacul sodic și impuritatea sa 1 – (2,6 diclorofenil 2 hidroxiindol sunt determinate prin HPLC cu fază inversă utilizând difenilul ca standard intern.

Analiza se efectuează pe o coloană C18 de tipul YWG (15 cm x 16 mm), folosind o fază mobilă formată din CH3OH : H2O : CH3COOH 36% (35 : 15 : 1), cu un debit de 2 ml/min.

Detecția se face în ultraviolet la 260 nm.

Graficul de calibrare este liniar pe domeniul 7 – 35 μg/ml pentru diclofenac și de 0,12 – 0,60 μg/ml pentru 1 – (2,6 diclorofenil – 2 hidroxiindolul). [54]

Pentru determinarea diclofenacului sodic din ser în cazul unor studii de farmacocinetică s-a dezvoltat o metodă de analiză prin HPLC rapidă și sensibilă.

Astfel, un volum de 0,5 ml a fost amestecat cu un volum de 50 μl soluție acid flufenamic (standard intern) și apoi deproteinizat cu 2 ml CH3CN.

După centrifugare la 2500 rot/min timp de 10 minute soluția de supernatant este evaporată la sec la 45ºC sub curent de azot. Reziduul este dizolvat în 200μl fază mobilă (soluția apoasă de CH3CN 50% cu pH –ul ajustat la 3, cu acid acetic), soluția obținută fiind din nou centrifugată.

O porțiune de 100 μl de supernatant este analizată prin HPLC pe o coloană Spherisorb RC-C8 (25 cm x 4,6 mm x 5 μm). Debitul fazei mobiele este 2 ml/min. Detecția se face în U.V. la 280 nm.

Graficul de calibrare este liniar în domeniul 50-4000 mg/ml diclofenac sodic.

Limita de detecție este de 25 μg/ml. Regăsirea medie este de 99-102%.

Așa cum am precizat această metodă a fost aplicată în studii de farmacocinetică.[55]

Pentru determinarea diclofenacului și a metaboliților săi hidroxilați din plasma umană și urină s-a realizat o metodă de analiză prin HPLC care constă în următoarele etape:

diclofenacului liber este extras din plasmă sau urină cu butilmetileter în soluție de tampon fosfat pH=4. Pentru determinarea diclofenacului total și a metaboliților săi, la probă s-a adăugat acid ascorbic și NaOH, după care amestecul a fost încălzit la 75ºC, timp de 1h înainte de extracție cu ț– butil metil eter și HCl. După extracție, determinarea cromatografică s-a realizat pe o coloană Hypersil ODS (2,5 cm x416 mm), echipate cu o precoloană cu fază inversă, dintr-un material pelicular (10 cm x 2 nm), folosind o fază mobilă formată din CH3CN : CH3OH : THF : H2O (15 : 10 : 3 : 72) și care are un debit de 1,5 ml/min.

Detecția se face în U.V. la 282 nm.

Limita de detecție pentru diclofenac și metaboliți este de 0,02 – 0,06 mg/ml în plasmă și de 0,6 – 2,5 ng/ml în urină.

Coeficientul de variație (n=3) este de 1,3 – 6,1 %. [56]

În cadrul unei cercetări farmacocinetice asupra diclofenacului sodic s-au realizat un număr de compuși prin legarea în proporții variate a acestuia pe suporturi polimerice în dextran cu grade diferite de reticulare.

S-a urmărit absorbția la șobolan a diclofenacului, legat în proporție de 20% de suport polimeric.

S-a lucrat pe două loturi cu câte 12 șobolani Westar, adulți, crescuți în condiții identice de laborator și care nu au primit alimente cu 18 ore înainte de experiment.

Un lot a primit diclofenac (substanță pură) în doză de 40 mg /kg, iar celălalt a primit diclofenac legat de polimeri în proporție de 20% (în doze echivalente diclofenacului pur).

S-a recoltat sânge inițial și la 2, 4, 6, 8, 24 ore.

Determinarea concentrației diclofenacului în plasma sangvină s-a făcut pe un cromatograf de tipul HP 1090 series II, folosind o coloană C8 Hypersil ODS (200 nm x 2,1 mm x 0,5μm) și o fază mobilă formată din CH3COO Na: CH3OH : CH3CN (55 : 25 : 20) cu un debit de 0,3 ml/min.

Detecția s-a realizat în U.V. la 215 nm.

Datele obținute arată că există o suficientă absorbție a diclofenacului legat de suport polimeric (0,243 μg / μl) la 24 de ore pentru diclofenacul legat față de 0,170 ng/ μl de cel pur, ceea ce duce la ideea utilizării produșilor cu diclofenac legat de suport polimeric în terapia antiinflamatoare.[57]

Separarea cromatografică prin coloane umplute cu fluid supercritic și estimarea acetaminofenului, diclofenacului și metocarbamolului în forme farmaceutice se realizează în următorul mod: comprimatele ce conțin acetaaminofen (paracetamol) și metacarbamol, sau paracetamol și diclofenac au fost mărunțite și dizolvate în 100 ml metanol.

După centrifugare, supernatantului i s-a adăugat 5 μg/ml diclofenac sodic și 6 μg/ml metacarbamol ca standard intern.

Soluțiile stoc rezultate (20 μl) care conțin 10 μg/ml paracetamol, 14 μg/ml diclofenac și 36 μg/ml metacarbamol, au fost analizate pe o coloană de 5 μg/ml Shendon Phenyl sau Shendon – ODS (25 cm x 4,6 m i.d.), cu 11,1% metanol în CO2 la 45ºC și 14,7 MPa, iar ca fază mobilă folosind 0,1% acid acetic, detecția făcându-se la 225 sau 254 nm.

Graficul de calibarare a fost liniar pentru 0,2 sau 0,3 – 20 μg/ml SFC cu o limită de detecție de 0,1 – 0,2 μg/ml și RSD 2,69% (2). Regăsirea a fost mai mare de 99,2%. [58]

O altă metodă de analiză prin HPLC a diclofenacului sodic și fluribuprofenului din plasmă a folosit 225 μl plasmă.

Această cantitate a fost tratată cu 25 μl soluție de 3 μg/l diclofenac sodic (standard intern) sau 10 μg/l flurbiprofen și 500 μg/l acid o – fosforic 2,5 M.

Amestecul obținut a fost agitat timp de 25 s, iar la sfârșit s-a adăugat 1,5 ml hexan : 2 propanol (4 : 1); s-a agitat din nou 2,5 min., iar centrifugarea s-a realizat la 3000 rpm (10 min).

Stratul organic a fost separat și evaporat prin uscare la 37ºC în atmosferă de azot.

Reziduul obținut a fost reluat cu 250 μl fază mobilă servind pentru analiza prin HPLC.

S-a folosit o coloană de 5 μm C18 Sp – herisorb (25 cm x 4,6 mm i.d.) și s-a injectat un volum de 20 μl dar cetonitril: acetat de sodiu 0,1 N (7 : 13) la pH=6,3 (fază mobilă), detecția realizându-se la 278 nm. Graficul de calibrare a fost liniar pentru 0,02 – 5 μg/ml diclofenac sodic și 0,1 – 40 μg/ml flurbiprofen.

Reconversiile au fost 97,2 – 100,3% pentru diclofenac și 98 – 99,6% pentru flurbiprofen, iar RSD mai mic de 8%. [59]

S-a folosit o metodă rapidă HPLC pentru determinări simultane a diclofenacului sodic, paracetamolului și clorzoxazonei în forme farmeceutice folosind ketoprofenul ca standard intern.

O cantitate determinată de comprimate a fost mojarată iar cantitatea de pulbere obținută, echivalentă la 325 mg paracetamol, 250 mg clorzoxazonă și 50 mg diclofenac sodic a fost cântărită și agitată cu 25 ml acetonitril timp de 10 min.

Soluția obținută a fost filtrată, iar filtratul a fost diluat cu 100 ml sare A (hidrogenofosfat de disodiu).

O cantitate din filtratul diluat a fost tratată cu 1 ml soluție standard intern (ketoprofen) și diluat la 50 ml cu sare A.

20 μl soluție împreună cu soluțiile standard similare din compușii cu paracetamol, clorzoxazonă și diclofenac a fost analizată prin HPLC pe coloană Zorbax C8 (25 cm x 4,5 mm i.d.), faza mobilă folosită fiind alcătuită din acetonitril: hidrogenofosfat de sodiu 50 mM (sare A) la pH=3,3 iar detecția a fost obținută la 220 nm.

Garficul de calibrare a fost liniar pentru 4 – 20 μg/ml pentru paracetamol, clorzoxazonă și diclofenac sodic. Reconversiile medii ale celor trei compuși din forme farmaceutice au fost 100,65% pentru paracetamol, 99,11% clorzoxazonă și 99,24% diclofenac sodic. [60]

Spectroscopia de rezonanță magnetică nucleară

În analiza diclofenacului sodic și a comprimatelor ce conțin diclofenac sodic se poate aplica și spectrometria de rezonanață magnetică nucleară (RMN).

Astfel la probe ce conțin 12 – 40 μg diclofenac sodic se adaugă 1 ml metanol conținând 10 μg CH3COONa ca standard intern.

După amestecare, un volum de 0,5 ml soluție este analizat cu un spectrometru Varian T60 – a RMN.

Diclofenacul este determinat prin compararea singletul total de la 3,62 ppm cu acela al acetatului de sodiu de la 1,85 ppm. Regăsirea (din compimate) este de 103%, cu un coeficient de variație de 0,5% (n=4). Rezultatele sunt în concordanță cu cele obținute prin metodele spectrofotometrice. [61]

Spectroscopia Raman

Determinarea unor agenți antiinflamatori în polimeri s-a realizat și prin spectroscopie Raman.

Astfel diclofenacul sodic, indometacinul, prometazina hidroclorică sau teofilina sunt amestecate cu alginatul de sodiu și presate pentru a forma discuri cu diametrul de 3 mm.

Aceste dscuri se utilizează pentru obținerea spectrelor Raman. [62]

CAPITOLUL IV

CONCLUZII

În lucrarea de față s-a încercat să se realizeze o monografie asupra Diclofenacului sodic, antiinflamator nesteroidian cu largă utilizare datorită acțiunii sale antiinflamatoare, analgezice și antipiretice.

Activitatea antiinflamatoare, analgezică și antipiretică a diclofenacului, se explică prin capacitatea sa de a inhiba intens:

ciclooxigenaza și prin aceasta, transformarea acidului arahidonic în prostaglandine, prostaciline și tromboxani;

calea lipooxigenazei, prin limitarea acidului arahidonic disponibil.

Diclofenacul se caraterizează prin indice terapeutic mare (interval mare între doza activă, terapeutică și doza toxică). După administrarea orală, rectală sau intramusculară, diclofenacul are aproape o absorbție totală; suferă metabolizare hepatică, astfel încât doar 60% din doza orală sau rectală ajunge nemodificată în circulația sistemică.

Este eliminat rapid (T1/2 = 1-2 ore), mai ales prin urină sub formă de metaboliți hidroxilați, conjugați.

Afecțiunile hepatice, renale sau vârsta nu afectează farmacocinetica diclofenacului. Diclofenacul pătrunde în lichidul sinovial unde realizează concentrații superioare celor plasmatice pe perioade de timp mari, ceea ce explică menținerea efectului terapeutic în ciuda T1/2 scurt.

Diversele forme farmaceutice dozate cu diclofenac sodic, care sunt comercializate permit adaptarea individualizării tratamentului la cerințele bolnavului astfel:

supozitoarele, preparatele injectabile intramusculare cu diclofenac realizează concentrații plasmatice de diclofenac mari în mai puțin de o oră.

Diclofenacul sodic se administrează în timpul sau după masă deoarece absorbția medicamentului este mai eficientă în acest moment. Absorbția diclofenacului nu este afectată de momentul administrării.

Diclofenacul sodic este nu numai un medicament eficace, ci și unul dintre cele mai bine tolerate AINS.

Studii chimice pe termen scurt și pe perioade mai îndelungate de tratament cu diferite forme farmaceutice au demonstrat că diclofenacul este mai bine tolerat decât aspirina și indometacinul, reacțiile adverse înregistrate fiind moderate, incluzând mai ales simptome gastro-intestinale.

Efectele nedorite asupra funcției hepatice, renale, cardio-vasculare, SNC și asupra pielii au o incidență mai redusă și sunt similare cu cele observate în comparație cu alte AINS.

Având în vedere toate aceste proprietăți ce pledează în favoarea utilizării pe scară largă a diclofenacului am considerat că este bine venită realizarea unui studiu asupra metodelor de control fizico-chimic al acestui medicament.

În tabelul nr. 7 sunt prezentate studiile fizico-chimice efectuate de diferiți autori asupra diclofenacului sodic.

Se poate constata complexitatea studiilor ce se întreprind pentru a caracteriza din punct de vedere fizico-chimic o substanță farmaceutică.

Analiza diclofenacului din formele farmaceutice și medii biologice cuprinde trei etape esențiale: separarea, identificarea și determinarea cantitativă.

Metodele de separare cele mai utilizate sunt extracția cu solvenți și cromatografia, aceasta din urmă reprezentând și o importantă metodă de identificare și determinare cantitativă.

TABELUL 7. Studii fizico-chimice efectuate pentru diclofenacul sodic

Cei mai buni solvenți pentru diclofenac sunt metanolul, etanolul, eterul etilic. Identificarea diclofenacului se poate realiza prin metodele prezentate în tabelul nr. 8.

Determinarea cantitativă a diclofenacului se realizează prin diferite metode ce diferă între ele ca sensibilitate, specificitate, tehnică de lucru și posibilitate de aplicare.

Metodele prezentate în literatura de specialitate pot fi clasificate astfel:

1. Metode titrimetrice

2. Metode spectrofotometrice

3. Metode cromatografice

4. Rezonanță magnetică nucleară

5. Spectroscopia Raman

Dintre metodele titrimetrice, cea mai utilizată este titrarea în mediu neapos cu acid percloric în dioxan sau acid acetic în dioxan. Ca solvent se utilizează acidul acetic anhidru, iar ca indicator cristal violetul.

Metoda este recomandată pentru controlul substanței farmaceutice și pentru unele forme solide cu diclofenac sodic, prezentând o bună sensibilitate și rapiditate.

Un grup de metode bine reprezentate de literatura de specialitate îl constituie metodele spectrofotometrice prezentate în tabelul nr. 9.

TABELUL. 8 Identificarea Diclofenacului

Sensibilitatea acestor metode este de ordinul 10-7-10-8g. Metodele cu cea mai largă aplicabilitate în analiza diclofenacului sunt cele cromatografice, datorită avantajelor pe care le prezintă:

permit separarea de compușii înrudiți chimic sau de alte AINS

se aplică pentru dozare din medii biologice ceea ce este important pentru studiile de farmacocinetică și bioechivalență

sunt foarte sensibile și selective.

Se utilizează cromatografia pe strat subțire (CSS), densiometria, cromatografia de gaze, HPLC (cromatografia de lichide de înaltă performanță).

În tabelul nr. 10 sunt prezentate câteva dintre cele mai sensibile metode de separare prin CSS urmate de determinări cantitative, densiometrice sau spectrofotometrice.

Gaz cromatografia este o metodă sensibilă și utilă mai ales pentru separarea diclofenacului de metaboliți. Diclofenacul fiind un compus nevolatil, determinarea sa prin gaz cromatografie s-a făcut după derivatizarea sa cu diferiți agenți.

TABELUL 9 Metode spetcrofotometrice pentru determinarea cantitativă a diclofenacului

TABELUL 9 Continuare

TABELUL. 10 Metode CSS de separare detecție și dozare a diclofenacului

Metodele gaz cromatografice utilizate diferă între ele prin tipul de coloană utilizat, metoda de derivatizare și sistemul de detecție.

În tabelul nr. 11 sunt prezentate câteva dintre aceste metode.

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) este una dintre metodele cele mai utilizate, mai ales pentru determinarea din mediile biologice alături de metaboliți și alte AINS. Este metoda cea mai recomandată pentru studii de biocompatibilitate și bioechivalență.

Metodele prezentate în literatura de specialitate se deosebesc prin sistemul de detecție, compoziția fazei mobile, tehnica de lucru, sensibilitate.

În tabelul 12 sunt prezentate câteva metode HPLC utilizate în analiza diclofenacului.

Alte metode de utilizate sunt RMN aplicată la determinarea din forme farmaceutice, spectroscopia Raman pentru determinarea din polimeri.

Pe baza studiului de literatură întreprins se poate aprecia, din multitudinea lucrărilor referitoare la diclofenac, că acesta este în continuare un medicament mult utilizat datorită proprietăților sale terapeutice.

TABELUL 11 Gaz cromatografia aplicată în analiza diclofenacului

TABELUL 12 Metode HPLC utilizate în analiza diclofenacului

=== Diclofenac ===

CAPITOLUL V

CONCLUZII

În lucrarea de față s-a încercat să se realizeze o monografie asupra Diclofenacului sodic, antiinflamator nesteroidian cu largă utilizare datorită acțiunii sale antiinflamatoare, analgezice și antipiretice.

Activitatea antiinflamatoare, analgezică și antipiretică a diclofenacului, se explică prin capacitatea sa de a inhiba intens:

ciclooxigenaza și prin aceasta, transformarea acidului arahidonic în prostaglandine, prostaciline și tromboxani;

calea lipooxigenazei, prin limitarea acidului arahidonic disponibil.

Diclofenacul se caraterizează prin indice terapeutic mare (interval mare între doza activă, terapeutică și doza toxică). După administrarea orală, rectală sau intramusculară, diclofenacul are aproape o absorbție totală; suferă metabolizare hepatică, astfel încât doar 60% din doza orală sau rectală ajunge nemodificată în circulația sistemică.

Este eliminat rapid (T1/2 = 1-2 ore), mai ales prin urină sub formă de metaboliți hidroxilați, conjugați.

Afecțiunile hepatice, renale sau *** nu afectează farmacocinetica diclofenacului. Diclofenacul pătrunde în lichidul sinovial unde realizează concentrații superioare celor plasmatice pe perioade de timp mari, ceea ce explică menținerea efectului terapeutic în ciuda T1/2 scurt.

Diversele forme farmaceutice dozate cu diclofenac sodic, care sunt comercializate permit adaptarea individualizării tratamentului la cerințele bolnavului astfel:

supozitoarele, preparatele injectabile intramusculare cu diclofena realizează concentrații plasmatice de diclofenac mari în mai puțin de o oră.

Rata absorbției diclofenacului din Voltaren Rapid nu este influențată de momentul administrării (în timpul sau după masă). Absorbția diclofenacului nu este afectată de momentul administrării.

Diclofenacul sodic este nu numai un medicament eficace, ci și unul dintre cele mai bine tolerate AINS.

Studii chimice pe termen scurt și pe perioade mai îndelungate de tratament cu diferite forme farmaceutice au demonstrat că diclofenacul este mai bine tolerat decât aspirina și indometacinul, reacțiile adverse înregistrate fiind moderate, incluzând mai ales simptome gastro-intestinale.

Efectele nedorite asupra funcției hepatice, renale, cardio-vasculare, SNC și asupra pielii au o incidență mai redusă și sunt similare cu cele observate în comparație cu alte AINS.

Având *** toate aceste proprietăți ce pledează în favoarea utilizării pe scară largă a diclofenacului am considerat că este bine venită realizarea unui studiu asupra metodelor de control fizico-chimic al acestui medicament.

În tabelul nr. 7 sunt prezentate studiile fizico-chimice efectuate de diferiți autori asupra diclofenacului sodic.

Se poate constata complexitatea studiilor ce se întreprind pentru a caracteriza din punct de vedere fizico-chimic o substanță farmaceutică.

Analiza diclofenacului din formele farmaceutice și medii biologice cuprinde trei etape esențiale: separarea identificarea și determinarea cantitativă.

Metodele de separare cele mai utilizate sunt extracția de solvenți și cromatografia, aceasta din urmă reprezentând și o importanță metoda de identificare și determinare cantitativă.

TABEL Nr. 7. Studii fizico-chimice efectuate pentru diclofenacul sodic

Cei mai buni solvenți pentru diclofenac sunt metanolul, etanolul, eterul etilic. Identificarea diclofenacului se poate realiza prin metodele prezentate în tabelul nr. 8.

Determinarea cantitativă a diclofenacului se realizează prin diferite metode ce diferă între ele ca sensibilitate, specificitate, tehnică de lucru și posibilitate de aplicare.

Metodele prezentate în literatura de specialitate pot fi clasificate astfel:

1. Metode titrimetrice

2. Metode spectrofotometrice

3. Metode cromatografice

4. Rezonanță magnetică nucleară

5. Spectroscopia Raman

Dintre metodele titrimetrice, cea mai utilizată este titrarea în mediu neapos cu acid percloric în dioxan sau acid acetic în dioxan. Ca solvent se utilizează acidul acetic anhidru, iar ca indicator cristal violetul.

Metoda este recomandată pentru controlul substanței farmaceutice și pentru unele forme solide cu diclofenac sodic, prezentând o bună sensibilitate și rapiditate.

Un grup de metode bine reprezentate de literatura de specialitate îl constituie metodele spectrofotometrice prezentate în tabelul nr. 9.

Determinarea cantitativă a diclofenacului se realizează prin diferite metode ce diferă între ele ca sensibilitate, specificitate, tehnică de lucru și posibilitate de aplicare.

Metodele prezentate în literatura de specialitate pot fi clasificate astfel:

1. Metode titrimetrice

2. Metode spectrofotometrice

3. Metode cromatografice

TABEL NR. 8 Identificarea Diclofenacului

4. Rezonanță magnetică nucleară

5. Spectroscopia Raman

Dintre metodele titrimetrice, cea mai utilizată este titrarea în mediu neapos cu acid percloric în dioxan sau acid acetic în dioxan. Ca solvent se utilizează acidul acetic anhidru, iar ca indicator cristal violetul.

Metoda este recomandată pentru controlul substanței farmaceutice și pentru unele forme solide cu diclofenac sodic, prezentând o bună sensibilitate și rapiditate.

Un grup de metode bine reprezentate de literatura de specialitate îl constituie metodele spectrofotometrice prezentate în tabelul nr. 9.

Sensibilitatea acestor metode este de ordinul 10-7-10-8g. Metodele cu cea mai largă aplicabilitate în analiza diclofenacului cele cromatografice datorită avantajelor pe care le prezintă:

permit separarea de compuși înrudiți chimic sau de alte AINS

se aplică pentru dozare din medii biologice ceea ce este important pentru studiile de farmacocinetică și bioechivalență

sunt foarte sensibile și selective.

Se utilizează cromatografia pe strat subțire (CSS), densiometria, cromatografia de gaze, HPLC (cromatografia de lichide de înaltă performanță).

În tabelul nr. 10 sunt prezentate câteva dintre cele mai sensibile metode de separare prin CSS urmate de determinări cantitative, densiometrice sau spectrofotometrice.

Gaz cromatografia este o metodă sensibilă și utilă mai ales pentru separarea diclofenacului de metaboliți. Diclofencul fiind un compus nevolatil, determinarea sa prin gaz cromatografie s-a făcut după derivatizarea sa cu diferiți agenți.

TABEL Nr. 9

TABEL Nr. 9 – Continuare

TABEL Nr. 10 Metode CSS de separare detecție și dozare a diclofenacului

Metodele gaz cromatografice utilizate diferă între ele prin tipul de coloană utilizat, metoda de derivatizare și sistemul de detecție.

În tabelul nr. 11 sunt prezentate câteva dintre aceste metode.

Cromatografia de lichide de înaltă performanță (HPLC) este una dintre metodele cele mai utilizate, mai ales pentru determinarea din mediile biologice alături de metaboliți și alte AINS. Este metoda cea mai recomandată pentru studii de biocompatibilitate și bioechivalență.

Metodele prezentate în literatura de specialitate se deosebesc prin sistemul de detecție, compoziția fazei ***, tehnica de lucru, sensibilitate.

TABELUL Nr. 12 Metode HPLC utilizate în analiza diclofenacului

Alte metode de utilizare sunt RMN aplicată la determinarea din forme farmaceutice, spectroscopia Raman pentru determinarea din polimeri. În tabelul nr. 12 sunt sintetizate câteva din aceste metode.

Pe baza studiului de literatură întreprins se poate aprecia, din multitudinea lucrărilor referitoare la diclofenac, că acesta este în continuare un medicament mult utilizat datorită proprietăților sale terapeutice.

TABEL Nr. 11 Gaz cromatografia aplicată în analiza diclofenacului

TABEL Nr. 12 Metoda HPLC utilizată în analiza diclofenacului