Diagnosticul Genetic Prenatal Prin Amniocenteza

CUPRINS

INTODUCERE

PARTEA GENERALĂ

CAPITOLUL I. Cromozomii si cariotipul

CAPITOLUL II. Diviziunea celulara. Embriogeneza normala

CAPITOLUL III. Bolile cromosomice. Teratogeneza

CAPITOLUL IV. Aspecte legate de screening-ul genetic prenatal

PARTEA SPECIALĂ

CAPITOLUL V. Obiective

CAPITOLUL VI. Material si metoda

CAPITOLUL VII. Prezentarea lotului de studiu

CAPITOLUL VIII. Rezultate si discutii

CONCLUZII

BIBLIOGRAFIE

INTRODUCERE

Daca in trecut genetica era considerata o ramura supraspecializata a medicinii fundamentale, actualmente aceasta perspectiva s-a schimbat substantial datorita progreselor obtinute in acest domeniu. Dintre aplicatiile geneticii umane, un deosebit progres s-a inregistrat in perfectionarea testelor de diagnostic prenatal. Astfel s-au dezvoltat din ce in ce mai mult posibilitatile ce permit profilaxia si tratamentul unor boli genetice.

Sindroamele cromozomiale si malformațiile congenitale reprezintă o problemă de sănătate publică deoarece au o incidență globală mare, sunt grave, au caracter cronic, invalidant, și pot fi prevenite, ceea ce a determinat elaborarea si standardizarea unor metode de diagnostic prenatal.

Anomaliile cromozomiale reprezintă cauze importante ale malformațiilor congenitale și ale avorturilor spontane, fiind responsabile pentru morbidiatea și mortalitatea crescutȃ fetală atȃt pre- cȃt și post-natală. Lucrul acesta a dus de-alungul anilor la utilizarea diagnosticului genetic prenatal si a procedurilor invazive de screening în cazul pacientelor care prezintă un risc de anomalie cromozomială fetală la testele non-invazive cȃt si în cazul pacientelor care doresc să se asigure că sarcina evoluează în parametrii normali, cunoscut fiind faptul că aceste teste prezintă cel mai ridicat procent de certitudine în ceea ce privește gradul de determinare a anomaliilor fetale cromozomiale.

Ritmul rapid al progreselor facute de gentica si aplicarea acesteia in domeniul patologiei umane au impus cunoasterea principiilor de genetica medicala cu o mare importanta in metodele de diagnostic, tratament si mai ales profilaxie a bolilor. In prezent, in screening-ul si diagnosticul prenatal se utilizeaza o serie de teste ce pot detecta o serie de aberatii cromozomiale, numerice si structural.

Diagnosticul prenatal completeaza screening-ul prenatal si cuprinde metodele de investigatie utilizate pentru identificarea in cursul sarcinii a unor boli genetice sau anomalii congenitale ale produsului de conceptie.

Diagnosticul anomaliilor genetice compatibile cu supravietuirea postnatala trebuie realizat prenatal, insa nu este posibil si nu trebuie ca toti fetii sa fie investigate genetic direct, ci doar cei cu risc.

Prin metode noninvazive se pot diferentia sarcinile cu risc genetic mare, care trebuie investigate genetic, de sarcinile cu risc genetic mic, care nu vor fi investigate genetic direct.

Prin faptul că diagnosticul prenatal are ca și obiectiv, detectarea unei afecțiuni grave la un produs de concepție, acest act ofera o valoroasă opțiune reproductivă cuplurilor cu risc genetic crescut, care vor putea lua o decizie informată. Avȃnd în vedere că în majoritatea țărilor cu un standard ridicat de viață, problema calitații generaților viitoare este abordată într-un mod realist ș eficient, a fost posibilă elaborarea conceptului de planificare familială. Prin posibilitatea testarii citogenetice prenatale, mai ales la cuplurile cu un risc gentic crescut, analiza cromozomială aduce beneficii familiale, sociale si medicale.

Toate aceste date justifica alegea temei –Diagnosticul genetic prenatal prin amniocenteza-

Capitolul I

CROMOZOMII SI CARIOTIPUL

I.1. Morfologia cromozomilor umani

Citogenetica este o ramura a geneticii care studiaza comozomii.

Cromozomii, al caror nume provine din limba greaca (chroma=culoare;soma=corp) sunt organite nucleare purtatoare de informatie genetica intrucat contin ADN. Indeplinesc doua functii importante :

1.asigura continuitatea genetica intre generatii transportand materialul genetic de la parinti (prin gameti) la descendenti, precum si de la o celula “mama” la celulele “fiice” in cursul multiplicarii celulare, asigurand stabilitatea proceselor ereditare;

2.realizeaza amestecul materialului ereditar intre generatii succesive, prin procesele de recombinare ce au loc in meioza, sursa principala de variabilitate.

Elementele morfologice si functionale comune tuturor cromozomilor sunt: cromatidele, centromerul si telomerele.

Cromatidele sunt subunitati longitudinale identice (“cromatide surori”) care poseda fiecare o singura molecula de AND asociata cu proteine histone si non-histone maximal compactizata.

Centromerul este locul in care cromatidele surori sunt atasate prin intermediul unor proteine, formand constictia primara. Pozitia centromerului este fixa si specifica fiecarui cromozom, fiecarei perechi de cromozomi omologi. Centromerul este responsabil pentru deplasarea cromozomilor in cursul diviziunii celulare. El este cel care asigura distributia agala a fiecarui cromozom prin mitoza de la celula “mama” la celulele “fiice”. Dupa pozitia centromerului cromozomii pot fi: metacentrici (centromere localizat in mijlocul cromozomului), submetacentrici ( centromere situate in afara zonei central) si acrocentrici ( centromer localizat terminal la un capat al cromozomului)(Fig I.2). Deasemenea imparte cromatidele in doua brate: brat p (petit) si brat q (qeue).(Fig I.3)

Telomerele sunt structure specializate formate din AND si proteine care acopera capetele cromozomului. Au rol in mentinerea stabilitatii si integritatii cromozomilor. Acestia constau in secvente repetitive scurte (TTAGGG) ; asigura replicarea complete a AND-ului nuclear si in acelasi timp previn scurtarea progresiva a telomerilor datorita activitatii telomerazei.

Pe langa pozitia centromerului, cromozomii se mai deosebesc si prin lungime.

Numarul si morfologia cromozomilor sunt elemente caracteristice pentru fiecare specie. La om, in celulele somatice diploide, exista in mod normal 46 de cromozomi, iar in gameti (celule haploide) doar 23 de cromozomi. Dupa fecundare, la zigot se reface numarul diploid si se realizeaza 23 de perechi de cromozomi omologi, identici ca marime, forma si continut genetic dar diferiti ca origine. Asadar, nucleul fiecarei cellule cromatice contine doua seturi de cromozomi, fiecare provenit de la un parinte. 22 perechi de cromozomi sunt identice la cele doua sexe (autozomi); o pereche difera insa la cele doua sexe numindu-se cromozomi sexuali sau gonozomi: XX la femeie si XY la barbat. Cromozomii X si Y sunt numiti cromozomi sexuali, datorita rolului lor major in determinismul sexual. Ei se deosebesc morfologic (cromozomul Y fiind mult mai mic decat cromozomul X) si genetic (cromozomul X are si gene “nesexuale” ce determina caractere diferite ale corpului. Fiecare ovul poarte un cromozom X, in timp ce un spermatozoid poate purta un cromozom X sau unul Y. Sansele de fecundare ale unui ovul fiind aproximativ egale intre un spermatozoid X si unul Y, numarul de produsi de conceptie feminini fiind aproximativ egal cu cel al celor masculini.

Cariotipul este complementul cromozomial sau numarul de cromozomi ai unei celule, ai unui individ sau ai unei specii.Termenul de cariotip este folosit si pentru a descrie fotomicrografia cromozomilor unui individ, intr-un aranjament standardizat.

Cariotipul feminin normal-46,XX; Cariotipul masculin normal-46,XY.

I.2. Tehnici de analiza a cromozomilor-bandarea cromozomilor

Identificarea cromozomilor umani-bandarea cromozomilor

Tehnicile initiale de colorare a cromozomilor au folosit colorantul Giemsa, care produce o colorare uniforma a intregului cromozom uman.Din anul 1970 s-au introdus noi metode de colorare si s-a observant ca regiunile cromozomiale fixeaza selective colorantii. Drept urmare, apare un model de benzi transversal, alternante, mai mult sau mai putin colorate, unic pentru fiecare cromozom.Benzile intens colorate reprezinta zone cromozomiale puternic condensate(heterocromatina), iar benzile palid colorate reprezinta zone cromozomiale mai slab condensate(eucromatina).Numarul,marimea,succesiunea si tipul de banda sunt particulare pentru un cromozom si sunt identile pentru cromozomii omologi.

Bandarea G (giemsa)

Se obtine prin digestive controlata cu tripsina (denatureaza proteinele), urmata de o colorare cu Giemsa. Aceasta tehnica este larg folosita si rezulta o alternanta caracteristica fiecarui cromozom de banzi luminoase si banzi intunecate.

Bandarea Q (quinacrina)

In urma colorarii cu quinacrina si examinarii la microscop cu florescenta UV apar benzi alternante mai mult sau mai putin fluorescente. Benzile Q fluorescente au aceeasi distributie ca si benzile G.

Bandarea R (reverse)

Se obtin prin denaturarea termica a cromozomilor si colorarea cu Giemsa. Astfel, rezulta benzi cu o dispozitie inversa fata de cea a benzilor obtinute prin coloratia Giemsa clasica.

Bandarea C

Evidentiaza heterocromatina constitutiva, in special la nivel centromeric; se obtine dupa denaturarea cu o solutie saturata de hidroxid de bariu, inainte de colorarea cu Giemsa.

Este utilizata pentru localizarea centromerilor si nu pentru identificarea cromozomilor.

Bandarea T

Este utilizata pentru observarea telomerelor si se produc in conditii similar celor care detemina benzile R.

Unele tehnici de marcaj(R si G) sunt folosite current pentru analiza morfologiei cromozomilor, producand setul complet de benzi; alte tehnici(benzi Q,C,T) se folosesc in analiza numai in anumite situatii, pentru a define mai bine anumite subseturi de benzi precum si tipul de aberatii structurale ale cromozomilor.

I.3. Tehnici de citogenetica moleculara-FISH

Cunostiintele din domeniul geneticii moleculare au facilitate introducerea in citogenetica a unor tehnici mult mai performante prin care se pot localiza secvente specific de AND pe cromozomi dispersati. De exemplu, FISH (Hibridizarea in situ cu fluorescent) este o metoda performanta si mai ales utila in depistarea anomaliilor cromozomiale structurale discrete, aspect inaccesibil tehnicilor citogenetice conventionale.(Fig I.4) Aceasta tehnica este valoroasa pentru analiza unei regiuni cromozomiale de interes.

Fig.I.4 Tehnica FISH

FISH foloseste “sonde” de AND monocatenar specific unui anumit cromozom, unei regiuni cromozomice(centromer sau telomere) sau unor gene cu localizare cunoscuta in anumite zone. Sondele se fixeaza (hibridizeaza) prin complementarile in aceste situsuri “tinta”. Pentru a fi evidentiate dupa hibridizare, sondele sunt marcate cu un fluorocrom vizibil la microscopul cu lumina UV.

In mod normal, analiza microscopica si vizualizarea in UV arata doua semnale fluorescente, cate unul pentru fiecare cromozom omolog al unei perechi din nucleul unei celule somatice. Daca pacientul prezinta doar un singur semnal fluorescent inseamna sa ii lipseste un cromozom din pereche sau daca apare un al treilea semnal inseamna ca prezinta un cromozom supranumerar in pereche.(ex:trisomia 21)

Tehnica de hibridizare in situ cu fluorescenta are indicatii precise si nu se substituie celorlalte tehnici citogenetice. Se foloseste pentru suspiciunea clinica/citogenetica a unei microdeletii sau microduplicatii, a unor translocatii criptice sau deletii telomerice; detectia sexului genetic sau a uor aneuploidii in nuclei interfazici(FISH “interfazic”), mai ales din celulele fetale (diagnostic prenatal); caracterizarea unor remanieri complexe sau a unor cromozomi markeri, mai ales in celulele tumorale; detectarea unor secvente de Y la barbati XX; evaluarea unui mozaicism.

Este o tehnica costisitoare dar are avantajul obtinerii rapide a rezultatelor.

Capitolul II

DIVIZIUNEA CELULARA. EMBRIGENEZA NORMALA

II.1. DIVIZIUNEA CELULARA

II 1.1.Mitoza

Ciclul celular reprezinta succesiunea de evenimente biochimice si morfologice care se produl in viata unei celule, din momentul formarii si pana la sfarzitul diviziunii sale. Ciclul celular are doua perioade: interfaza si diviziunea.

Interfaza reprezinta perioada cuprinsa intre doua diviziuni succesive, in care se desfasoara toate activitatile specifice unei celule. Evenimentul cel mai important care are loc in aceasta etapa este sinteza de ADN (replicarea) prin care se dubleaza cantitatea de material genetic. Dupa interfaza, celula intra in mitoza.

Faza mitotica este alcatuita dintr-o serie de procese secventiale prin care materialul genetic (ADN), replicat in interfaza, se distribuie egal si total (segregare cromatidiana) formand doi nuclei distincti, iar celula se imparte in doua celule fiice(citokineza).

Diviziunea mitotica incepe cu diviziunea nucleului(mitoza) si se termina cu diviziunea citoplasmei(citokineza). In aceasta etapa, materialul genetic dublat in interfaza (4C molecule ADN in 46 cromozomi bicromatidieni) segrega, adica se distribuie in mod egal si total celulelor “fiice” (2C molecule ADN in 46 cromozomi monocromatidieni), care vor fi astfel identice cu celula din care provin.

Prin cele doua procese succesive( replicare si diviziune) se asigura transmiterea fidela a informatiei genetice in succesiunea generatiilor celulare. Acest process de distributie a materialului genetic poate suferi erori, care vor genrea anomalii cromosomice.

Mitoza este un proces continuu, impartit conventional in mai multe etape(Fig II.1):

Profaza: individualizarea cromozomilor, initierea formarii fusului mitotic, dezorganizarea invelisului nuclear;

Metafaza: cromozomii sunt dispusi in planul ecuatorial, fusul de diviziune este complet, dispar invelisul nuclear si nucleolul;

Anafaza incipienta: scindarea longitudinala a cromozomilor si migrarea lor catre poli;

Anafaza tarminala: agregarea cromozomilor la polii celulei, initierea diviziunii celulare, incepe formarea fusului de diviziune

Telofaza: reapar nucleul, invelisul nuclear si nucleolul, terminarea diviziunii celulare.

Celulele din majoritatea tesuturilor sunt inlocuite periodic datorita derularii continue a proceselor de diviziune si moarte culalara. Exceptiile sunt reprezentate de neuroni si cardiomiocite, care nu se multiplica postnatal.Tesuturile respective nu se pot regenera.

In interfaza ciclului celular pe diferite preparate ( frotiuri din mucoasa bucala, frotiuri din sangele periferic, biopsii de piele, celule recoltate din lichidul amniotic) se pot evidentia:

-la persoanele normale de sex feminine (cariotip: 46,XX) – corpusculul sexual X;

-la persoanele normale de sex masculine (cariotip:46,XY) – corpusculul sexual Y.

Corpusculul sexual X reprezinta unul dintre cei doi cromozomi X la femeie, care este mult condensat, si inactiv genetic, in interfaza ciclului celular. Corpusculul sexual evidentiat la nivelul nucleului celulelor epiteliale poarta denumirea de cromatina sexuala sau corpusculul Barr.

Corpusculul sexual Y mai este denumit si corpuscul F (fluorescent), datorita colorantilor specifici utilizati (quinacrina sau atebrina), care confera cromozomului Y un aspect fluorescent.

Studiul corpusculilor X si Y permite diagnosticarea sindroamelor genetice determinate de existenta unor anomalii de numar ale cromozomilor sexuali (Sindrom Turner 45,XO; Klinefelter 47,XXY; Triplo X 47,XXX; Supermascul 47,XYY) si a starilor de intersexualitate (hermafroditism adevarat, pseudohermafroditism).

Fig.II.1. Mitoza

II.1.2 Meioza

Meioza este procesul de diviziune care apare in timpul stadiului final al formarii gametilor.Indeplineste doua functii majore:

-reduce la jumatate numarul de cromozomi si asigura astfel, dupa fecundare, mentinerea constanta a numarului de cromozomi ai speciei; produsul de conceptie va primi astfel jumatate din setul diploid de cromozomi de la fiecare parinte;

-creeaza diversitatea genetica prin fenomenele de recombinare genica(din profaza I) si recombinare intercromosomica(din anafaza I); meioza este principala sursa de variabilitate genetica.

In timpul meiozei numarul diploid se injumatateste rezultand gamete mature care primesc fiecare cate un set haploid de cate 23 cromozomi.

Meioza este un proces complex care se realizeaza prin doua diviziuni succesive: meioza I(diviziunea meiotica primara, heterotipica, reductionala) si meioza II(diviziunea meiotica secundara, homotipica, ecuationala), neseparate de interfaza,deci ADN se replica numai o singura data.

Meioza I sau reductionala deoarece in timpul acesteia se injumatateste numarul de cromozomi. Prezinta 4 etape fiecare cu anumite particularitati:

Profaza 1: este de lunga durata si subdivizata in 5 stadii consecutive: Leptoten, Zigoten, Pahiten, Diploten, Diakinesis.

Cromozomii omologi se imprecheaza. Un fragment de cromatida de pe un cromozom matern se transfer ape omologul sau patern si invers, realizand o noua combinatie genica cu material genetic de la ambii parinti. Aceste schimb de segmente omoloage intre cromatide apare ca urmare a fenomenului de crossing-over(recombinare).(Fig Fenomenul implica numai doua din cele patru cromatide, care vor contine gene de la ambii parinti. Se realizeaza astfel o recombinare genica(intracromosomica) care reprezinta o sursa de variabilitate genetica, datorita noilor combinatii de gene care apar si se transmit la descendenti.

Metafaza I: membrana nucleara dispare complet si se formeaza fusul de diviziune; cromozomii se aliniaza in planul ecuatorial al celulei si se ataseaza de fus.

Anafaza I: cuprinde un fenomen genetic foarte important: disjunctia cromosomica; cromozomii omologi migreaza spre polii opusi ei celulei. Cromozomii omologi segrega independent, adica se separa si se repartizeaza intamplator la polii opusi ai celulei, indifferent de originea lor maternal sau paterna; in final la fiecare pol al celulei exista cate un set haploid de cromozomi bicromatidici intr-o combinatie variata de cromozomi materni si paterni.

Telofaza I: Celulele fiice au un set haploid de cromozomi bicromadici(cromatidele-surori difera una de cealalta ca rezultat al crossing-over-ului).Se divid pentru a forma doi gameti denumiti spermatocite,respectiv ovocite secundare.

Meioza II sau ecuationala:Incepe imediat dupa terminarea meiozei I si se aseamana cu o diviziune mitotica dar care se realizeaza in celule cu numar haploid de 23 de cromozomi bicromatidieni (dintre care unii sunt recombinanti) si nu este precedata de o replicare a ADN. De aceea se mai numeste si divizune homotipica, ecuationala. Cuprinde deasemenea cele patru stadii: profaza II, metafaza II, anafaza II si telofaza II. In final, apar patru celule haploide, care prin maturare se transforma in gamete fecundabili numiti spermatide respective ovule. Gametii rezultati nu sunt identici, fiecare are o alta combinatie de gene datorita fenomenelor de crossing-over si segregare independenta a cromozomilor.

Importanta meiozei rezida din obiectivele pe care le indeplineste:

1.mentine constant numarul de cromozomi(formeaza gamete haploizi care in urma fecundatiei refac numarul diploid);

2.produce gameti cu combinatii variate de gene; datorita acestui fapt descendentii care rezulta din reproducerea sexuata sunt diferiti genetic de parintii lor;

3.multe aberatii cromozomiale sunt rezultatul erorilor aparute in timpul meiozei(nondisjunctiile cromozomilor si procesele de crossing-over inegal).

II.2. EMBRIOGENEZA NORMALA

Perioada preembrioanara a dezvoltarii corespunde reproducerii si se ocupa de studiul gametogenezei (procesul de formare a celulelor sexuale: spermatozoidul si ovulul) si fecundatiei (unirea spermatozoidului cu ovulul).

GAMETOGENEZA LA OM

Gametogeneza este un process biologic complex in urma caruia se formeaza celulele sexuale-gameti (spermatozoizi si ovule). Gametii se deosebesc atat de celulele somatice, cat si intre ei, prin rolul fiecaruia in fecundatie, acestia fiind rezultatul spermatogenezei la barbat si al ovogenezei la femeie. Intregul proces de spermatogeneza/ovogeneza se desfasoara in mod diferit la sexul masculine, respective cel feminine, conform necesitatilor particulare ale fiecarui gamet. Ca urmare a acestui aspect, apar consecinte clinice diferite in momentul in care apar erori.

SPERMATOGENEZA

Spermatogeneza cuprinde totalitatea transformarilor prin care trec spermatogoniile (celule nediferentiate, diploide) pana devin celule sexuale mature- spermatozoizi (celule haploide).

Intregul proces spermatogenetic incepe si se finalizeaza in gonada masculina (testicul), la nivelul tubulului seminifer. Procesul de maturare a liniilor germinale incepe la pubertate si se desfasoara continuu, pana la andropauza, cand are loc involutia structurilor esentiale in mentinerea spermatogenezei. Fazele succesive ale acestui process sunt vizibile in peretele tubilor seminiferi contorti si au o durata de aproximativ 64 de zile pana la definitivare.

Etapa vitala a spermatogenezei o reprezinta faza de diviziune meiotica atunci cand setul cromozomial diploid este redus la jumatate.

Spermatogeneza, prin rezultatul meiozei reductionale, reprezentat de doua spermatocite secundare haploid, una cu cromozomul X si cealalta cu cromozomul Y, da nastere la doua tipuri de gameti (heterogameti), diferiti genetic, cu rol essential in determinarea sexului genetic.

Studiile efectuate asupra timpului si ritmului desfasurarii meiozei masculine au evidentiat ca acest proces este autoreglabil, caci odata declansat el se autointretine ritmic, ca o reactie “in lant”, nefiind conditionat de factori externi.Totusi, meioza masculine este sensibila la actiunea fatorilor de mediu: in patologie precum ectopia abdominala si criptorhidia inghinala, spermatogeneza este inhibata din cauza temperaturii mai ridicate, determinanad sterilitate. De asemenea, in cadrul procesului de gametogeneza pot aparea spermatozoizi anormali ca strucutra: cap mai mare sau mai mic decat normal, coada anormala sau dubla sau spermatozoizii pot suferi deformari dupa trecerea prin tractul genital feminine, pierzandu-si puterea de fecundare, determinand sterilitate partiala sau totala.

Desfasurarea ritmica si regulata a meiozei masculine asigura o deplina siguranta procesului de distributie al cromosomilor. Cresterea varstei tatalui nu produce o crestere a frecventei erorilor de distributie si deci a anomaliilor cromosomice. In schimb, meioza masculina produce fara oprire copii celulare identice (20-25 cicluri replicative pe an). Daca apare o mutatie genica aceasta este copiata neintrerupt: la varste tinere numarul de celule ce vor avea mutatia este mic dar la varste mai inaintate el devine semnificativ, producand un veritabil mozaic germinal. Drept urmare, odata cu cresterea varstei, barbatii sanatosi au risc crescut si recurent de a avea copii cu afectiuni monogenice autosomal dominante (neurofibromatoza, acondroplazie) deoarece o mutatie aparuta este copiata neintrerupt.

Fig II.5. Gametogeneza

OVOGENEZA

Ovogeneza reprezinta totalitatea transformarilor pe care le sufera ovogonia pana la stadiul de celula gametica, apta de fecundatie, denumita ovul.

Acest process are loc atat la nivelul gonadei feminine(ovarul), cat si la nivelul anexelor, pe parcursul unui ciclu cu perioade de diferentiere, maturare, dar si cu pauze, fiind un process lent si treptat.

Spre deosebire de spermatozoid care se dezvolta nemijlocit la nivelul tubului contort, ovulul devine, de la un punct, pretejat de folicul, structura complexa care prezinta si rol de secretie a foliculinei. La nivelul ovarului maturat, la pubertate, nu se gasesc ovogonii, aspect care reprezinta o particularitate a ovogenezei comparative cu spermatogeneza.

Spre deosebire de spermatogeneza, ovogeneza incepe prenatal si este discontinua. In luna a III-a de viata intrauterina ovogoniile incep sa se divida si se transforma in ovocite primare; in luna a VIII-a, ovogoniile dispar aproape complet deoarece s-au diferentiat in ovocite. Spre deosebire de barbat, la care spermatogoniile se produc(dupa pubertate) continuu pana la batranete, “capitalul” de ovocite al ovarului este limitat( la nastere exista aproximativ 2 milioane de ovocite in fiecare ovar, iar la pubertate mai putin de 200 000). Pana la pubertate se desfasoara perioada de crestere maturativa dupa care, ciclic, procesul de ovogeneza continua si se termina odata cu ultima ovulatie, adica la menopauza. In final, doar 400 de celule germinative vor devein ovule mature.

Inca din perioada fetala a vietii intrauterine, celulele germinative sunt protejate de foliculi, initial cei primordiali (diploten, faza meiotica propriu-zisa), dupa care incep sa se dezvolte cei primari si cei secundari. Cei care nu involueaza dupa nastere, odata cu ovocitele, raman in ovar si la pubertate evolueaza in folicul tertiar pe baza proliferarii granuloasei. Foliculul de Graaf (maturizat) este expluzat la suprafata ovarului, se subtiaza, se rupe peretele, eliberand astfel ovulul. Pentru ca ovulul sa fie matur si sa se poata realiza explulzia lui, ovocitul primar isi reia diviziunea meiotica inainte de ovulatie, deoarece pana la pubertate acesta ramane in diachineza.

Dupa pubertate, sub actiunea LH hipofizar, cateva ovocite isi incep lunar maturarea, dar de regula numai unul singur (maximum doua) termina meioza I, formand doua celule haploide inegale (datorita pozitiei excentrice a nucleului): ovocitul II (care preia aproape toata citoplasma ovocitului I) si primul globul polar. Meioza II incepe imediat dar este oprita in metafaza II si nu se reia decat daca s-a produs fecundarea ( definitivarea procesului cu unirea celor doi gameti). Atunci are loc explulzia celui de-al doilea globul polar. Meioza la femeie este un proces discontinuu si conditionat de factori externi (FSH si LH, ovulatia, fecundarea). La femeie, prin meioza, dintr-un ovocit I rezulta o singura celula exuala matura, apta de fecundare ( si 3 globule polare care ulterior vor degenera). Toate ovocitele vor avea un cromozom X.

Ritmul lent al ovogenezei (un ovul pe luna) face ca gametogeneza feminina sa fie putin intensa- in cursul perioadei reproductive de numai 30 de ani, se matureaza numai 300-400 de ovocite. Drept urmare, apar putine erori de copiere. Totusi, ovogeneza nu este ferita de accidente , mai ales dupa 35 de ani cand se produc mai fercvent accidente de distributie a cromozomilor rezultand gameti cu anomalii cromozomice de numar care, dupa fecundare vor produce zigoti anormali.

FECUNDATIA

Fecundatia reprezinta procesul de fuziune a spermatozoidului cu ovulul, formand celula-ou (zigot) si restabilind diploidia. In urma fecundatiei la celula ou, prezenta celui de-al doilea gonozom, X sau Y, va determina diferentierea sexuala si orientarea catre sexul corespunzator.

In timpui procesului de fecundatie, fiecare cromozom din nucleul spermatozoidului formeaza o pereche cu cromozomul corespunzator din nucleul ovulului. In felul acesta, celula rezultata va contine 22 perechi autozomi si o pereche de cromozomi sexuali (XX sau XY) fiecare pereche fiind formata dintr-un cromozom provenit de la ovul si altul de la spermatozoid.

Evenimentele produse in timpul fecundatiei:

-capacitatia(un ultim process de maturatie)

-contactul spermatozoidului cu ovulul

-reactia corticala(cu rolul de blocare a polispermiei)

-activatia(fenomenele care duc la formarea pronucleilor)

-conceptia propriu-zisa(ambii pronuclei cresc, isi pierd membranele si isi pun pe linia ecuatoriala in comun seturile cromozomiale haploide; odata cu aparitia fusului primei mitoze si dispunerea cromozomilor in placa ecuatoriala, fecundatia este practice definitivata)

Produsul de conceptie uman parcurge in dezvoltarea sa intrauterine doua mari perioade:

perioada embrionara ce dureaza aproximativ 2 luni, incluzand la randul ei mai multe faze succesive(segmentarea, gastrularea, organogeneza, histogeneza)

perioada fetala care incepe cu a treia luna intrauterina, de-alungul careia fatul nu sufera, practice, decat fenomenele de maturare.

Perioada embrionara:

Se intinde intre definitivarea fecundarii si luna a 3-a intrauterine.

Apar foitele embrionare din care se vor dezvolta organele.

In prima saptamana are loc segmentarea celulei-ou in timpul careia zigotul sufera o serie de diviziuni mitotice in urma carora rezulta blastomerele. La 3 zile de la fecundare, cand zigotul patrunde in cavitatea uterina este format din 16 blastomere si poarta numele de morula. In paralele cu formarea morulei produsul de conceptie avanseaza spre uter, ramane liber 72 de ore dupa care lichidul uterin strabate zona pellucida si patrunde in blastomerele morulei dislocandu-le. Celulele asezate la periferia oului constituie trofoblastul(strat profund-citotrofoblast si strat superficial-sincitiotrofoblast).

Apar sacul vitelin si cavitatea amniotica primara.

Din celulele profunde ale discului embrionar se separa endodermul sub forma unor celule plate, iar in interiorul butonului embrionar apare un spatiu ce separa amniosul de celulele embrionare propriu-zise care raman si formeaza discul embrionar.

Asadar, in saptamana a doua are loc formarea discului embrionar didermic cu cele doua foite: superficiala-ectoblast/ectoderm si profunda-endoblast/endoderm.

Saptamana a treia sau gastrularea se caracterizeaza prin aparitia celei de a treia foite embrionare-mezobastul/mezodermul.

Prin ingrosarea endoblastului, intre ectoblast si endoblast ia nastere foita mezodermica care se va intinde in tot discul embrionar intre endoblast si ectoblast numai ca in doua zone acestea raman lipite.

Discul embrionar tridermic prin curbare va forma corpul viitorului fat iar din foitele embrionare se vor dezvolta diferite tesuturi si organe.

In saptamana a 3-a apare linia primitiva. Acesta stabileste axul dorsal longitudinal al embrionului. Apar prin diferentiere cele trei straturi endodermul, mezodermul si ectodermal care stau la baza organogenezei.

Foitele embrionare si derivatele lor

Mezodermul formeaza oasele, muschi, vase sangvine,aparat renal, aparat urogenital.Din mezodermul splahnic se formeaza inima, vasele sangvine si majoritatea tesuturilor conjunctive din corp. Din mezodermul somatic se formeaza dermul, seroasa cavitatii ventral a corpului, oasele, ligamentele si dermul membrelor.

Notocordul si tubul neural se organizeaza pe fata dorsala a embionului, iar cavitatea celomica si intestinul primitive se organizeaza pe fata ventral.

Somitele sunt structure anatomice embrionare care produc inregiunea cefalica vertebrele, coastele, dermul si muschii scheletici ai trunchiului si membrelor superioare.

Perioada fetala:

Incepe din a 13-a saptamana de sarcina.

In aceasta perioada are loc cresterea in lungime a corpului, cresterea in greutate, maturizarea tesuturilor si organelor urmand ca primordiile de organe sa se transforme in aparatele si sistemele nou-nascutului.

Dismorfogeneza si diagnosticul malformatiilor

Etiologia dismorfogenezei cuprinde atat cauze nongenetice cat si cauze genetice.

Cauze nongenetice: factori materni precum uter defeormat, fenilcetonuria mamei netratata, factori de mediu(10% din defectele la nastere).

Cauzele genetice: duc la aparitia de anomalii unice sau multiple (sindroame).

Dismorfismul = prezenta de trasaturi ce difera de cele ale unei persoane normale, prin anomalii ale dezvoltarii formei si structurii.

Defectele structurale aparute prenatal sunt:

-defecte izolate primare

-defecte asociate-secvente, asocieri, sindroame malformative

Defectele izolate primare

Cele mai frecvent intalnite defecte primare izolate sunt dislocatia de sold, deformatia in var a piciorului, labioschisisul, palatoschisisul, defectele septale cardiace, defectele inchiderii tubului neural. Etiologia poate implica o singura gena sau poate fi multifactoriala. Foarte multe defecte primare isolate au etiologie necunoscuta.

Din punct de vedere al morfogenezei se subclasifica in malformatii, deformatii, disruptii si displazii.

Malformatiile sunt anomalii structurale identificate la nastere sau la interval de luni,ani dupa nastere, ce se produc insa inainte de momentul nasterii in urma unui proces intrinsec de dezvoltare anormala.

Deformatiile apar ca urmare a actiunii unor forte asupra fatului deja format.

Disruptiile apar prin distrugerea unui tesut anterior normal constituit.

Displazia apare ca o consecinta a organizarii anormale a celulelor.

Defecte multiple asociate

Secventa reprezinta o modalitate de aparitie a unor multiple anomalii prin-un mecanism “in cascada” pornind de la un defect primar unic aparut in cursul morfogenezei timpurii, se produc anomalii secundare, tertiare. Importanta diferentierii secventelor de sindroamele malformative rezida in necesitatea aprecierii riscului de recurenta a malformatiei primare si sfatul genetic ce decurge din acesta.

Asocierea este o reunire neintamplatoare a unor malformatii ce nu poate fi incadrata nici ca sindrom (nu au o etiopatogenie comuna), nici ca secventa. Exemplu: asocierea VATERS-malformatii vertebrale, anale, traheale, esofagiene, renale, radiale, artera ombilicala unica (single umbilical artery).

Sindroamele malformative reprezinta tipuri de anomalii structurale multiple ce afecteaza doua sau mai multe sisteme si despre care se presupune ca ar fi datorate unei etiologii commune. Deseori sunt mai putin evidente la varste mici, conturandu-se pe masura ce copilul creste.

Capitolul III

BOLILE CROMOSOMICE. TERATOGENEZA

III.1. BOLILE CROMOSOMICE

Se considera ca 50-60% dintre avorturile spontane la varsta tanara de sarcina sunt asociate cu anomalie cromozomiala. In afara avorturilor aneuploide, care caracterizeaza in special sarcina tanara (sub 8 saptamani) exista si avorturi euploide, prin mutatie genica (singulara sau poligenica) ce se gasesc in special in sarcini mai avansate cu un varf in saptamana 13-a. Aceste avorturi cresc dramatic dupa varsta de 35 de ani a mamei.[ Luca V. –Hemoragiile obstetricale]

Anomaliile cromozomiale reprezinta modificari ale numarului si structurii normale ale cromozomilor.

Orice schimbare de la numarul normal sau de la structura unica a cromozomului este considerata o anomalie cromozomiala si poate duce la o maladie genetica.Au o frecventa de 1/150 printre nou-nascutii vii si sunt o cauza importanta a morbiditatii si mortalitatii (50% dintre avorturile in primul trimestru de sarcina). Afecteaza atat autozomii (perechile 1-22), cat si gonozomii (X si Y).

Anomaliile cromozomiale pot fi :

constitutionale / dobandite;

numerice / structurale;

autozomale / gonozomale.

Exista mai multe criterii pe baza carora se pot clasifica bolile cromosomice, printre care se regasesc tipul anomaliei si numarul de celule modificate (omogene si mozaic). Prezenta a doua sau mai multe linii celulare diferite cromozomial la un individ se numeste mozaic cromozomial. Liniile celulare sunt complementare si deriva din acelasi zigot. Pe de alta parte, caracteristica anomaliilor omogene este prezenta anomaliei in toate celulele individului afectat.

In functie de modul in care afecteaza complementul cromozomal se clasifica in numerice si structurale.

Anomalii cromozommiale numerice:

Numarul caracteristic de cromozomi al speciei umane este:

-2n=46 de cromozomi in nucleul celulei somatice (celula diploida)

-n=23 de cromozomi in gamete-ovule sau spermatozoizi (celula haploida)

Orice abatere de la numarul corect de cromozomi al unei celule se numeste anomalie cromozomiala de numar.

Tipuri de anomalii numerice:

Poliploidia

Aneuploidia

Poliploidia se caracterizeaza prin prezenta in plus a unuia sau mai multor seturi haploide de cromozomi. Singurele poliploidii identificate la om sunt triploidia(69 de cromozomi) si tetraploidia(92 de cromozomi), acestea fiind incompatibile cu viata postnatala, sunt observate doar la produsii avorturilor spontane sau induse ori, extreme de rar, la fetusi care ajung la termen, dar mor la nastere/perinatal.

Aneuploidiile se caracterizeaza prin absenta (monosomie – 45 cromozomi / 2n-1) sau prezenta in plus a unuia sau mai multor cromozomi (trisomie – 47 cromozomi / 2n+1 ; tetrasomie – 48 cromozomi, pentasomie – 49 cromozomi) din aceeasi pereche sau din perechi diferite.

Cele mai frecvente forme de aneuploidie intalnite la pacienti sunt trisomiile si monosomiile.

Cea mai frecventa cauza a aneuploidiei o reprezinta nondisjunctia meiotica sau mitotica adica nesepararea cromozomilor omologi sau nesepararea cromatidelor surori in timpul anafazei.

Anomaliile cromozomiale structurale se caracterizeaza prin modificarea structurii normale a cromozomilor. Unele reanjamente cromozomiale sunt stabile, adica pot trece nealterate prin diviziuni celulare mitotice si meiotice, in timp ce altele sunt instabile. Pentru a fi complet stabil, un cromozom reorganizat trebuie sa aiba un centromere si doua telomere functionale.

Efectele anomaliilor structurale depind de dimensiunea si de locatia lor, sai daca materialul genetic este adaugat sau pierdut.

Anomaliile structurale se impart in:

-neechilibrate, in care este un castig sau o pierdere neta de material genetic, fata de complementul cromozomial normal (deletii, duplicatii, cromozomi inelari, dicentrici si izocromozomi):

Deletii= cromozomi cu material genetic pierdut

Insertii= cromozommi cu material genetic extra

Duplicatii= cromozomi cu arii duplicate

Izocromozomi= cromozomi cu 2 brate identice, fie lungi(q), fie scurte(p)

Cromozomi dicentrici= cromozomi cu 2 centromeri

Cromozomi inelari= cromozomi ce formeaza o structura circulara

-echilibrate, in care cantitatea de material genetic din celula este constanta, doar distributia sa modificandu-se ( translocatii si inversii).

Translocatii= cromozomi cu material genetic schimbat;schimb de segmente cromozomiale intre doi cromozomi, de obicei neomologi.

Insertii= cromozomi cu arii inversate; modificarea pozitiei unui segment cromozomic, ce ramane pe cromozomul de origine.

PRINCIPALELE SINDROAME CROMOZOMIALE

Termenul de sindrom indica o etiologie asemanatoare pentru toti indivizii afectati si in cadrul sindroamelor cromozomiale toate componenetele anormale se leaga de o anumita patogenie.

Cele mai frecvent intalnite anomalii cromozomiale la nou-nascutii vii sunt:

Sindroame autozomale:

Sindromul Down (trisomia 21) -1/800

Sindromul Edward (trisomia 18) 1/8000

Sindromul Patau (trisomia 13) 1/20000

Sindroame gonozomale:

Sindromul Klinefelter (47,XXY) -1/2000

Sindromul Turner (45,X0) 1/7000

SINDROMUL DOWN

Sindromul Down sau Trisomia 21 a fost prima anomalie cromozomiala descrisa la om. Si este considerate cauza cea mai frecventa a retardului mintal, care poate varia de la sever la moderat. Sindromul poarta numele celui care l-a descris pentru prima data in anul 1866, John Langdon Down.

Fenotipul este 47,XX/XY,+21, iar incidenta este 1/700-1/800 de nascuti vii, cu o incidenta mai mare (1/400) in trimestrul II de sarcina, atunci cand are loc screening-ul. Incidenta trisomiei 21 este strans asociata cu varsta mamei, ea crescand dupa varsta de 35 de ani.

Sindromul Down este diagnosticat la scurt timp dupa nastere, intrucat caracteristicile fizice sunt usor de identificat.

Fenotip clinic:

-facies caracteristic mongoloid

-brahicefalie, occiput aplatizat, microcefalie

-fata mica si rotunda, profil aplatizat

-fate palpebrale oblice, orientate in sus si in afara; epicantus; strabism, pete Brushfield(zone circulare depigmentate ce se dispun ca o coroana la jonctiunea treimii mijlocii cu treimea externa a irisului)

-hipoplazia oaselor nazale, urechi mici (hipoacuzie sau surditate)

-gura mica, buza superioara eversata, limba protuberanta, microdontie, hipodontie, eruptive intarziata, palat ogival si ingust, hipoplazie maxilara

-gat scurt cu cute in exces

-tonus muscular redus, incheieturi mobile; hipoplazia falangei medii a degetului 5, degete in trident; suprafata palmei prezinta in locul celor doua creste transversale o singura creasta –creasta simiana.

-malformatii cardiac, gastroeneterale, osteoarticulare

Un aspect important este predispozitia la leucemie acuta megacarioblastica.

Majoritatea copiilor cu trisomie 21 au deficient mintale semnificative, IQ deseori sub 50.

In al doilea an de viata devine evidenta intarzierea de dezvoltare psiho-motorie,toate achizitiile copilariei facandu-se cu 2-3 ani mai tarziu decat normal.

In ceea ce priveste evolutia si prognosticul, in ultimii 30 de ani, in tarile dezvoltate, rata de supravietuire s-a imbunatatit semnificativ, iar speranta de viata este acum de circa 60 de ani. Dupa 40 de ani se instaleaza frecvent o dementa senila prococe si mortalitatea creste semnificativ prin accidente vasculare.

Analiza cromosomica a trisomiei 21 este cea care ajuta la calcularea riscului de recurenta si poate evidentia:

-trisomie 21 libera si omogena, in circa 92-95% dintre cazurile de sindrom Down; riscul de recurenta este in medie 1%

-trisomie 21 libera si in mozaic cromozomial, in circa 2-3% dintre cazuri; riscul de recurenta a afectiunii este nesemnificativ, deoarece anomalia este determinata de un accident mitotic in primele etape ale dezvoltarii embrionare

-trisomie 21 prin translocatie Robertsoniana neechilibrata – intre cromozomul 21 si un alt cromozom acrocentric- poate fi observata in 4-5% dintre cazuri; riscul este moderat in translocatiile intre cromosomi neomologi(10-15% daca mama este purtatoare si 3-5% daca tatal este purtator) si total (100%) in translocatiile Robertsoniene intre cromosomi 21.

-trisomie 21 partiala, in mai putin de 1% dintre cazuri.

Din punct de vedere ecografic, sindromul Down se carcaterizeaza prin brahicefalie, hipoplazie nazala, edem nucal, defecte septale cardiace, intestine hiperecogenic, member scurte, clinodactilie sau hipoplazie a falangelor.

O asociere de semne ecografice, frecventa in sindromul Down si care poate fi considerata ca avand valoare predictiva mare, este: profil plat, humerus scurt, fald nucal, intestine hiperecogenic, pielectazie. O ecografie morfologica normal, fara niciun marker de sindrom Down, reduce riscul bazal de sindrom Down cu 60%.

Depistarea prenatala a sindromului Down poate fi efectuata (la orice varsta dar mai ales dupa 35 de ani) pe baza unor metode de screening biochimic si ecografic, urmate de confirmarea cazurilor suspecte prin realizarea cariotipului.

SINDROMUL EDWARD

Sindromul Edward apare la 1/ 5000-8000 de nou-nascuti vii, mai frecvent la femei.Cariotipul este 47,XX/XY,+18.

Este a doua anomalie autozomala ca frecventa, majoritatea cazurilor de trisomie 18 fiind cauzate de nondisjunctie.

Riscul pentru trisomia 18 creste cu varsta mamei;

riscul empiric al reaparitiei acestei anomalii este mai mic de 1%. Sindromul are o rata foarte scazuta de supravietuire.

Fenotip clinic:

-craniu lung si ingust cu occiput proeminent

-hipertelorism, epicantus

-nas scurt cu radacina larga

-urechi malformate, jos inserate

-micrognatie, hipoplazie mandibulara

-microstomie

-gat scurt cu piele laxa

-malformatii scheletice

-contractura si suprapunerea degetelor de la mana, unghii hipoplazice

-picior in piolet (dezvoltarea exagerata a calcaiului)

-malformatii cardiace

-retard psihomotor sever

-durata de viata redusa

Ecografic se pot decela chisturi de plex coroid, defecte de fosa posterioara, sindrom Dandy-Walker, defecte de tub neural. Chisturile de plex coroid se asociaza puternic cu sindromul Edward. Cea mai importanta metaanaliza pe studii prospective in populatii neselectate ii apartine lui Gupta si a concluzionat ca prezenta chisturilor de plex coroid creste de 9 ori riscul bazal de trisomie 18. Se poate aproxima ca prezenta chisturilor de plex coroid creste de 10 ori riscul de trisomie 18. Totusi, trisomia 18 este o conditie atat de rara, incat ramane rara si in populatiile cu risc crescut; prezenta chisturilor de plex coroid ar creste, teoretic, riscul de la 1/15 000 la 1/1500, ceea ce nu reprezinta indicatie pentru amniocenteza.

Varietatea trasaturilor dismorfice fac ca sindromul Edward sa fie greu diagnosticat.

SINDROMUL PATAU

Sindromul patau sau trisomia 13 implica prezenta unui cromozom suplimentar la perechea 13, astfel incat vor exista 47 de cromozomi si cariotipul va fi 47,XY+13. Incidenta este estimata a fi 1 la 15 000 de nou nascuti vii, statisticile aratand ca se intalneste mai frecvent la femei decat la barbati.

Cele mai multe cazuri de trisomie 13 sunt cauzate de nondisjunctii meiotice parentale, varsta inaintata a mamei fiind, deasemenea implicata. Riscul de recurenta este probabil scazut.

Fenotip clinic:

-microcefalie, frunte tesita, leziuni ale scalpului;

-microftalmie/anoftalmie, coloboma iridiana

-nas scurt si lat

-urechi malformate, jos inserate, surditate

-despicatura labiala si/sau palatina, micrognatie, limba despicata

-gat scurt si gros, cu hemangioame pe ceafa

-malformatii viscerale severe, defecte de sept atrial sau ventricular, rinichi polichistic, malformatii gastrointestinale si de perete abdominal(omflaocel), megavezica urinara

-criptorhidism la baieti si uter bicorn la fete

-polidactilie a membrelor superioare si inferioare, hiperconvexitatea degetelor, fibula in arc

-coaste absente sau hipoplazice

-hipotonie sau hipertonie musculara

La acestea se adauga deficiente mintale severe si, de multe ori, convulsii.

Ca si in cazul trisomiei 18, duce la avort spontan. Cei care supravietuiesc pana la termen de multe ori mor in primele zile de viata, de obicei, din cauza bolilor cardiac complexe si doar aproximativ 5% supravietuiesc pana la 6 luni.

SINDROMUL TURNER

Sindromul Turner (cariotip:45,X) este determinat de monosomia X, completa sau partiala, singura monosomie viabila la specia umana. Boala apare ca urmare e absentei complete sau partiale a unui gonozom, in conditiile in care cel de-al doilea gonozom este cromozomul X. Este una dintre cele mai comune anomalii cromozomiale intalnite in avorturile spontane si are o incidenta de 1/2000-1/500 dintre nou-nascutii de sex feminin. Nu exista date privind asocierea acestui sindrom cu varsta materna.

Fenotip clinic:

-talie mica

-fata triunghiulara

-fante palpebrale antimongoloide, epicantus, ptoza palpebrala, hipertelorism

-urechi jos inserate

-maxilar ingust, palat ogival, eruptie intarziata, dinti supranumerari si dinti geminate

-gat palmat (pterigium coli), implantarea joasa a firelor de par pe ceafa

-torace in scut

-limfedeme congenitale la maini si picioare, unghii hipoplazice si convexe

-nevi pigmentari

-infantilismul organelor genital externe si interne (disgenezie ovariana, uterul si vaginul au dimensiuni reduse), amenoree primara, sterilitate

-IQ in limite normale

-durata de viata depinde de severitatea malformatiilor organelor interne.

Diagnosticul prenatal este posibil numai atunci cand se identifica semne ecografice de alarma: hygroma cysticum, hidrops fetalis, malformatii congenitale cardiace sau renale dar diagnosticul unui fetus Turner ridica probleme etice majore privind continuarea sau intreruperea sarcinii.

Examenul cromosomic este esential pentru stabilirea diagnosticului de certitudine. In circa 50-60% din cazuri, cariotipul evidentiaza o monosomie X omogena; in 25% din cazuri se intalnesc diferite tipuri de mozaicuri, ce includ obligatoriu o linie cu monosomie X totala sau partiala (cel mai frecvent 45,X/46,XX -15% cazuri); in restul cazurilor se gasesc anomalii de structura ale cromozomului X: isocomosomi X de brat lung sau de brat scurt, deletii Xp sau Xq, cromosomi inelari.

Depistarea precoce a bolnavelor permite folosirea unei terapii eficace cu hormon de crestere si, prepubertar, cu estrogeni. Ulterior, pot aparea tiroidite autoimune, HTA, obezitate si diabet zaharat non-insulinodependent.

SINDROMUL KLINEFELTER

Sindromul Klinefelter este cea mai frecventa tulburare gonozomala intalnita la sexul masculin si este cauza cea mai comuna de hipogonadism si infertilitate la barbati. Incidenta acestui sindrom este de 1/1000 nou-nascuti de sex masculin.

Cariotip: 47,XXY

Fenotip clinic:

-semnele clinice se observa la pubertate si sunt evidente la adult

-atrofie testiculara

-ginecomastie

-pilozitate redusa

-talie inalta si uneori aspect ginoid

-sterilitate primara si definitive (10% din barbatii cu azoospermie)

-dezvoltare intelectuala aproape normala, coeficientul intelectual fiind la limita inferioara a normalului sau peste aceasta, dificultate de invatare, imaturitate

-anomalii dentare: taurodontism

-durata de viata normal, pot aparea probleme de adaptare sociala si tulburari de comportament

Riscul de recurenta nu este mai mare decat in populatia generala, fiind dependent de varsta materna numai in 30% din cazuri.

Prognosticul pacientilor cu sindrom 47,XXY poate fi imbunatatit in mod semnificativ prin interventie terapeutica adecvata. Se poate administra testosteron, iar defectele genitale si ginecomastia se pot trata chirurgical.

III.2. TERATOGENEZA

In luna a doua de viata, embrionul parcuge o perioada rapida de morfogeneza. Aceste procese de morfogeneza sunt controlate prin mecanisme complexe care pot fi perturbate cu usurinta datorita marii sensibilitati fata de anumiti factori de mediu intern sau extern, ce pot agresiona embrionul prin intermediul organismului matern. Intervalul cuprins intre zilele a 16-a si a 60-a de dezvoltare reprezinta perioada de maxima sensibilitate teratogena.

Un agent teratogen este reprezentat de orice substanta chimica, medicament, infectie, stare patologica sau insuficienta, care actionand asupra fatului poate induce modificari morfologice si fiziologice ale acestuia.

Efectele potentiale ale oricarui agent teratogen depind de doza si, mai ales, de timpul cand a fost administrat in timpul sarcinii. Se stie ca fiecare organ are o perioada critica, de maxima vulnerabilitate, sic a exista un veritabil “orar embrionar”, ce corespunde perioadei de formare a organelor. Un alt factor care influenteaza actiunea teratogenilor il reprezinta susceptibilitatea(reactivitatea) genetica a mamei si/sau a fatului, care explica de ce nu se produc intotdeauna malformatii dupa o expunere teratogena.

Agentii teratogeni:

Agentii biologici

Expunerea la agentii infectiosi virali in timpul sarcinii este recunoscuta a fi o cauza majora a aparitiei anomaliilor la nastere. Cei mai multi copii (daca infectia survine in timpul primului trimestru), vor suferi un sindrom congenital, avand dimensiuni mai mici fata de varsta sarcinii.

Infectii cu efecte teratogene certe

Agentii chimici

Strabaterea structurilor feto-placentare este critica in inducerea anomaliilor de dezvoltare. Factorii care determina accesul medicamentului sau al drogului asupra fatului sunt: absorbtia materna, metabolismul produsului chimic, afinitatea legarii proteinelor si depozitarea acestora, dimensiunea meleculei (meleculele cu o greutate moleculata peste 1000 cu greu strabat bariera placentara), incarcarea electrica, liposolubilitatea.

Alcoolul poate fi plasat pe primul loc deoarece alcoolismul cronic matern este inca relative frecvent si efectele nocive fetale sunt certe (Sindromul alcool fetal). Dupa unii autori alcoolismul fetal este una din cauzele majore ale retardului mintal si ale tulburarilor de comportament.

Droguri cu efecte teratogene certe

Agentii fizici

Radiatiile ionizante, hipertermia prelungita, iodul radioactive

Starea mamei

fiziologica: varsta peste 35 de ani, starea de nutritie, deficitul in folati;

patologica: diabet zaharat, fenilcetonurie, lupus eritematos sistemic, boala Graves, epilepsia

Desi numarul agentilor cert teratogeni este redus iar contributia lor la producerea unor anomalii congenitale este mica (circa 5%) se recomanda ca orice gravida sa cunoasca si sa evite in primele 2-3 luni de sarcina orice factor de mediu – biologic, chimic sau fizic – care ar putea interfera morfogeneza normala.

Capitolul IV

ASPECTE LEGATE DE SCREENING-UL GENETIC PRENATAL

IV.1.1. Screeningul prenatal

Datorita contributiei specialistilor in domeniu, centrul de greutate al evaluarii produsului de conceptie si al prognostului care se poate da, a fost mutat din ultimul trimestru in primul trimestru de sarcina. Conceptul poarta numele de inversarea piramidei care presupune ca investigatiile dominante sa se faca in primul trimestru, daca este posibil prin teste neinvazive pentru ca orice test invaziv are in spate o rata de insucces, de declansare a avortului, opririi in evolutie a sarcinii si complicatii inclusiv materne.

Fig. IV.1. Inversarea piramidei ingrijirii antenatale dupa Kypros Nicolaides – Fetal Medicine Foundation

O procedura noua de diagnostic antenatal poarta numele Harmony-NIPT(Noninvasive prenatal testing) si este o procedura neinvaziva de diagnostic disgenetic de tipul indentificarii in sangele matern a ADN fetal rezultat din apoptoza celulelor vilozitare si printr-un algoritm matematic se stabileste cu mare acuratete riscul de anomalii numerice cromozomiale. (si identificarii unor celule fetale care ulterior sunt cariotipate, avand ca scop detectia cu acuratete a trisomiilor 13, 18 si 21).

Majoritatea aneuploidiilor sunt incompatibile cu supravietuirea postnatala indelungata, cu o exceptie notabila: sindromul Down.

In urma progeselor din domeniul geneticii, cuplurile cu risc crescut pot spera la un copil sanatos si deasemenea se pot identifica cromozomopatii la o varsta adecvata care sa raspunda, in cazul deciziilor medicale si codului de etica, posibilitatii de intrerupere a cursului sarcinii, decizia continuarii sau intreruperii sarcinii apartinand in totalitate cuplului.Limita legala a intreruperii de sarcina este 24 de saptamani.

Test de sceening- metoda de estimare a riscului; selectioneaza indivizii cu risc crescut pentru o afectiune, dintr-o populatie asimptomatica. Testele de screening sunt sigure, neinvazive. Un rezultat pozitiv al testului screening este o indicatie puternica pentru procedure diagnostic cum ar fi amniocenteza.

Test diagnostic- metoda prin care se face diagnosticul pozitiv al unei afectiuni

Dintre indicatiile testelor de diagnostic fac parte conditiile care cresc riscul pentru anomalii cromozomiale: varsta materna, nasterea unor feti cu anomalii cromozomiale sau alte malformatii, modificari sugestive ultrasonografice, teste de screening pozitive, antecedente familiale de afectiuni genetice, solicitare materna.

Screening pentru aneuploidii:

Markeri pentru aneuploidii: varsta materna, β-hCG, PAPP-A, malformatii, markeri biometrici, evaluare functionala, NT, NB.

Markeri cu valoare predictiva mare:

markeri ecografici:

TN(translucenta nucala)

Anomalii os nazal

Doppler(DV, tricuspida)

markeri biochimici

Dublu test in trimestrul I

Triplu/Cvadruplu test de trimestru II

Testul combinat de trimestru I asigura o detectie de 90% cu 5% rezultate fals pozitive.

Testul integrat de trimestru I si II asigura o detectie de 85% cu 1% rezultate fals positive

Consultatia prenatala reprezinta o perioada mai indelungata care incepe in primul trimestru si se continua in al doilea trimestru, moment in care pot fi depistate anumite patologii care se prefera sa fie tratate inainte de sarcina si poate fi stabilit riscul ca o boala ereditara sa se manifeste sau sa reapara intr-o familie prin intermediul sfatului genetic. Citogenetica moderna impreuna cu progresele semnificative ale tehnologiei ADN, au creat premisele unul diagnostic mult mai precis si mai precoce al bolilor genetice cu scopul scaderii morbiditatii si mortalitatii perinatale si postnatale. Posibilitatea obtinerii de informatii privitoare la fetus s-a dezvoltat remarcabil si datorita acestui progres, diagnosticul prenatal a devenit un instrument extrem de eficient si cu beneficii certe asupra evolutiei sarcinii. S-a constatat ca la un numar mai mic de 4 consultatii prenatale, rata mortalitatii poate fi chiar de 3-5 ori mai mare.

Consultatia prenatala cuprinde 3 etape :

prima etapa se adreseaza evitarii imbolnavirilor

a doua etapa este cea a diagnosticului si tratamentului

a treia etapa se refera la evitarea complicatiilor si agravarilor.

In prezent sunt disponibile mai multe strategii de screening, care folosesc atat markerii biochimici cat si ecografia pentru a atinge rate de detectie ridicate. De asemenea sunt necesare teste de diagnostic de inalta precizie pentru a detecta daca persoanele care au iesit pozitiv la screening au intr-adevar boala si, in plus, trebuie sa existe o interventie profilactica, aplicabila pentru toti pacientii indentificati ca fiind afectati. Exista mai multe variante de screening: screening pentru defecte de tub neural, screening pentru sindromul Edwards si Down in primul trimestru de sarcina(bitest) , screening pentru defecte de tub neural, sindrom Edwards si Down in al doilea trimestru de sarcina (triplu si cvadruplu test). In urma evaluarii acestor markerii biochimici se va stabili riscul fiecarei paciente de a avea o sarcina cu modificari genetice. Certificarea unui rezultat pozitiv la testul screening se va face prin diagnostic prenatal bazat pe metode invazive care implica rezoltarea unei probe de sange fetal sau tesut placentar in vederea efectuarii de analize biochimice sau genetice precum amniocenteza, biopsia de vilozitati coriale, cordocenteza.

Femeile gravide de toate varstele ar trebui sa beneficieze de screening si teste de diagnostic invaziv pentru anomalii cromozomiale, inainte de 20 de saptamani de gestatie. Noi evolutii in metodele de screening au crescut numarul de optiuni pentru paciente. Optiuni de diagnosticare includ prelevarea de biopsie a vilozitatilor coriale in primul trimestru si amniocenteza in al doilea trimestru.

Optiuni de screening in primul trimestru includ bitestul: testarea translucentei nucale in combinatie cu masurarea nivelului α-fetoproteinei plasmatice(PAPP-A Pregnancy associated plasma protein A) si a gonadotropinei corionice umane(beta-hCG). Translucenta nucala (TN) apare ca urmare a edemului nucal si reprezinta tesutul cutanat retrocervical fetal care corespunde ecografic zonei transsonore de dedublare a pielii din regiunea cervicala posterioara. Evaluarea TN prin ecografie este facuta intre 11 si 13 saptamani. Translucenta nucala marita >3 mm pana la 14 saptamani; >5 mm intre 14-21 saptamani a fost asociata unui risc cresut de aneuploidii (Sindrom Down, Trisomia 18, Sindrom Turner).

In primul trimestru-bitestul presupune recoltarea de hormoni si efectuarea unei ecografii. Masuratori cu ajutorul ecografiei: CRL (lungime vertex-coccis), TN (translucenta nucala), NB (osul nazal), regurgitatie tricuspidiana, ductul venos.

In urma acestor investigatii se calculeaza un scor de risc care va arata daca produsul de conceptie are predispozitie spre anumite anomalii – modificarile indica efectuarea sau nu unei metode mai sigure.

Translucenta nucala:

Este o imagine hipoecogena determinate de acumularea normala de lichid in regiunea nucala fetala, subcutanat,intre 11-14 saptamani. Aceasta imagine ecografica este remisibila dupa 14 saptamani si in mod normal nu depaseste anumite limite determinabile prin studii populationale. Cresterea NT peste limitele normale semnifica risc crescut pentru patologie fetala, mai ales pentru aneuploidii si in special pentru sindrom Down. NT se remite in trimestrul II la majoritatea sarcinilor aneuploide. Remiterea NT in trimestrul II nu amelioreaza prognosticul unei sarcini cu NT crescuta in trimestrul I.

Etiologia cresterii NT:

disfunctie cardiaca (cel mai probabil mecanism al cresterii NT in sindromul Down)

congestie venoasa cefalica

alterarea matricei extracelulare

hipoplazia vaselor limfatice

anemie, hipoproteinemie

infectii congenitale

Osul nazal:

Este un dismorfism facial specific in sindromul Down, malformatie identificabila ecografic in trimestrul I

Ductul venos

Este un sunt intre vena ombilicala si vena cava inferioara. Fluxul absent sau inversat in timpul contractiei atriale este singurul marker de aneuploidie cu valoare prediciva mai mare decat cresterea NT.

Optiuni de screening in al doilea trimestru include triplu test (AFP+hCG+E3) = α-fetoproteina in serul matern + β hCG + estradiolul si quadruplu test (AFP+hCG+E3+Inhibina A) si echografie.

Triplul test – interpretare:

defectele de tub neural – α-fetoproteina crescuta, celelalte normale

sindromul Down – hCG crescuta, α-fetoproteina si estradiolul mai scazute decat media

sindromul Edwards – hCG, α-fetoproteina si estradiolul sunt scazuti mult fata de minimul acceptat. Rezultatele trebuie confirmate prin amniocenteza.

Testele vor depinde de indicatii, disponibilitatea procedurii si preferinta pacientei.

Metode de screening si diagnostic prenatal:

Screeningul prenatal, prima etapa a diagnosticului prenatal, are ca scop identificarea fetilor cu risc de a prezenta o anomalie congenitala care ulterior vor fi supusi unor procedure diagnostice invazive pe baza carora se pune diagnosticul de boala(diagnostic prenatal). Diagnosticul genetic prenatal cuprinde un numar de teste ce succed sceeningul si care sunt capabile sa confirme sau sa infirme anomalii genetice. Daca screeningul prenatal indica suspiciunea pentru o anomalie, diagnosticul prenatal este cel care o confirma sau o infirma.

IV.1.2. Diagnosticul prenatal

Reprezinta ansamblul de metode ce permit diagnosticarea defectelor inainte de nastere, permitand parintilor de a opta sau nu pentru intreruperea sarcinii:

ultrasonografia

amniocenteza

studii din sangele matern

fetoscopia

biopsia de vilozitati corionice si trofoblast

recoltarea percutana de sange din cordonul ombilical

Diagnosticul prenatal a devenit o activitate constanta a serviciilor de genetica din urmatoarele ratiuni:

-in conditiile extensiei evaluarii ultrasonografice a fatului in practica medicala este necesara interpretarea datelor prenatale(semne de alarma) care pot reflecta o boala genetica sau un defect sever de alta natura;

-este recomandat familiilor cu risc genetic crescut; testele de DPN trebuie precedate de un sfat genetic adecvat, preferabil inaintea unei noi sarcini;

-daca este diagnosticata prenatal o boala genetica, continuarea sarcinii va fi la optiunea familiei; in prima situatie se vor lua masuri adecvate de urmarire a sarcinii si asistenta speciala a nou-nascutului; in a doua situatie, dupa intraruperea sarcinii si analiza fatului se vor discuta cu familia riscurile de recurenta si optiunile posibile.

Diagnosticul prenatal este un act medical complex, înalt informativ, care permite depistarea a numeroase anomalii congenitale și boli genetice în cursul vieții fetale. Acest serviciu este realizat corect numai printr-o strȃnsă colaborare multidisciplinară în care medicul genetician are un rol esențial în evaluare, diagnostic și sfat genetic.

Indicatii pentru diagnosticul prenatal: anomalii cromozomiale, malformatii congenitale, anomalii mendeliene, aspect ecografice anormale, nivelul seric matern de AFP anormal, sindromul de X fragil(cea mai frecventa cauza de retardare mentala ereditara).

Identificarea precoce a cuplurilor cu risc genetic sau malformativ se poate realiza:

-preconceptional, cand unul dintre membrii cuplului are o anomalie cromozomiala echilibrata;

-precoce in sarcina, pe baza semnelor de alarma ecografice sau biochimice obtinute in cadrul screeningului prenatal.

Consultul genetic prenatal beneficiaza de mai multe etape:

-realizarea diagnosticului prenatal genetic cromozomial / monogenic / multifactorial

-consultul genetic propriu-zis in care se face ancheta familiala, efectuarea arborelui genealogic, identificarea tipului de transmisibilitate, apoi calcularea riscului de recurenta pe baza etiologiei, modului de transmitere, a incidentei mutatiei genetice in populatie, inclusiv cea de novo.

-consilierea cuplului pentru explicarea etiologiei, manifestarilor si evolutiei afectiunii respective; sarcina va evolua in functie de dorinta de optiune a cuplului

Necesitatea de a detecta cat mai devreme anomaliile genetice a determinat ca diagnosticul denetic prenatal sa reprezinte un domeniu de interes major al medicinii moderne.

Scopul principal al diagnosticului prenatal prin metode invazive este reprezentat de identificarea starii de sanatate genetica a produsilor de conceptie, descoperirea prin teste prenatale a eventualelor aneuploidii cromozomiale ale embrionilor, respective ale fetilor, in vederea adoptarii celei mai corecte atitudini fata de produsul de conceptie si/sau familie, inlaturarea anxietatii parentale, promovarea nasterii de copii sanatosi.

Consultul genetic si diagnoza genetica prenatala au o serie de circumstante clinico-genetice precum:

-in cadrul unui cuplu sau in afara lui, unul dintre genitori sau o persoana este purtator al unei boli ereditare

-in aceeasi situatie de mai sus, in cazul cand se recunoste prezenta in familie a unei genopatii, chiar daca persoana in cauza(probantul) este clinic sanatoasa

-sotii sunt consanguini

-infertilitate sau sterilitate investigate, de cauza probabil genetica.

Avorturile spontane repetate, fara o alta cauza evidentiabila clinic, necesita o investigatie citogenetica obligatory, deoarece statistic, la circa 200 de cupluri parentale s-a pus in evidenta prezenta la unul dintre soti a unei anomalii structural (cel mai adesea translocatii echilibrate); la cuplurile cu avorturi spontane repetate, incidenta de aparitie a unui fat malformat la nastere este de 7,5%.

Scopul consultului si diagnozei genetice este reprezentat de:

-depistarea bolilor genetice(genopatii)

-depistarea bolilor cromozomiale(cromozomopatii)

-depistarea mozaicurilor cromozomiale

-identificarea purtatorilor clinic sanatosi

-diagnosticul diferential correct al unei boli genetice propriu-zise de o malformatie congenitala neereditara

-determinarea tipului de transmitere a genopatiei, ceea ce ne permite pe de o parte calculul riscului de recurenta, iar pe de alta parte conduit terapeutica.

Bolile cu etiologie genetica sunt in mare clasificate in patru categorii:

1.boli cromozomiale

2.boli monogenice

3.boli poligenice(multifacoriale)

4.boli mitocondriale(matrocline)

O metoda invaziva de diagnostic prenatal utilizata la depistarea unor boli genetice este amniocenteza.

IV.2. Amniocenteza

Fig. IV.3. Amniocenteza

Este tehnica prin care se preleveaza lichid amniotic din cavitatea amniotica. Prelevarea se face in scopul diagnosticului genetic ideal intre 16 si 18 saptamani. Aceasta punctie se realizeaza cu un ac specific sub ghidaj ecografic, cu ajutorul caruia se recolteaza minumum 10 ml de lichid amniotic, cantitatea este variabila functie de investigatii. Amniocenteza reprezinta una din metodele de investigatie a starii fetale “in utero”, asadar este o metoda de diagnostic prenatal invaziva.

Amniocenteza este grevata de anumite riscuri pentru fat si pentru mama. Riscul pentru fat ar fi lezarea (mai putin frecvent). Mai frecvent-determinarea de contractii uterine care sa duca la expulzie si pierderea sarcinii. De aceea se administreaza medicamente antispastice.

Riscul de avort postamniocenteza pe studiu international multicentric este 1/200, iar riscurile pe fiecare centru sunt variabile ajungand in cadrul Spitalului Clinic de Obstetrica-Ginecologie “Prof. Dr. Panait Sȃrbu” la 1/380-1/400. Astfel, se suprapune peste riscul de incidenta de aparitie a sindromului Down in sarcina (1/380 in populatia Romaniei), iar incidenta sindromului Down la nastere este de 1/700-1/800 pentru ca jumatate din ei se opresc in cursul evolutiei.

Este o investigatie foarte valoroasa prin faptul ca se obtine proba biologica directa-lichid amniotic de la fat, celule fetale cu o puritate foarte mare.

Tehnica:

Se poate efectua anestezie locala

Sub ghidaj echografie se punctioneaza transabdominal, se patrunde cu acul prin peretele uterin pana in cavitatea amniotica de unde se recolteaza prin aspiratie o cantitate variabila de lichid amniotic, 10 ml sau mai mult, in functie de investigatiile preconizate.

In lichidul amniotic sunt prezente celule fetale descuamate de pe tegumente, cai respiratorii, excretorii, digestive fetale. Lichidul de aspiratie se supune unui process de centrifugare prin care se separa celulele fetale, celule de descuamare ale pielii fetale. Se cultiva si apoi se realizeaza cariotipul prin metode specifice. Din celulele amniotice se pot face culturi celulare in scopul efectuarii analizelor citogenetice (cariotip) si biochimice.

Utilitate:

Avand in vedere ca obtinerea unei culture celulare urmata de cariotip dureaza aproximativ 14 zile, se poate face analiza cromozomilor in nucleii interfazici prin tehnica FISH;QF-PCR pentru cromozomii 13,18,21 XY.

Precizarea prenatala a sexului produsului de conceptie este utila in cazul bolilor cu transmitere recesiva legata de cromozomul X (hemofilie, DMD Distrofia musculara Duchenne etc).

Fig. IV.4. Tehnica amniocentezei

Cand rezultatul testelor de screening devine pozitiv devine obligatorie efectuarea unui test de diagnostic. Amniocenteza este cea mai utilizata metoda de recoltare a produsului biologic in vederea analizarii analizelor genetice si biochimice.

Indicatii ale amniocentezei sunt urmatoarele:

-varsta gravidei peste 35 de ani

-avorturi spontane repetate , de etiologie neprecizata

-dupa nasterea unui copil cu diferite anomalii cromozomiale de numar (sindrom Down sau trisomie 21) sau de structura (translocatii cromozomiale) vor fi investigate citogenetic ambii parinti

-dupa nasterea unui copil cu malformatii congenitale deschise de tub neural(anencefalie, spina bifida)

-dupa nasterea unui copil cu diferite dismetabolii ereditare

-cupuri care sunt purtatori a unor translocatii sau inversii sau care au prezentat teste de screening positive(ecografic, biochimic)

-pentru detectarea bolilor genetice necromozomiale amniocenteza ar trebui efectuata la cuplurile cu risc crescut de a avea un copil cu talasemie, hemofilie

Boli genetice ce pot fi diagnosticate prenatal prin analiza lichidului amniotic si a celulelor amniotice:

Amniocenteza precoce este metoda de diagnostic prenatal care se recomanda in saptamanile 11-13 de sarcina si consta in recoltarea a cate 1 ml de lichid amniotic/fiecare saptamana de sarcina. Avantajul consta in faptul ca sarcina poate fi intrerupta intr-o perioada mai precoce in cazul depistarii unei anomalii cromozomiale dar pe langa acest beneficiu exista si cateva dezavantaje precum: rata de risc a complicatiilor, posibilitatea de pierdere a sarcinii si risctul de aparitie a malformatiilor mai mari comparative cu cele caractristice amniocentezei standard.

Amniocenteza precoce efectuata dupa a 16-a saptamana de gestatie preleveaza lichid amniotic in vederea depistarii anomaliilor genetice de origine cromozomiala sau metabolica si/sau a anomaliilor de tub neural.

Indicata cu discernamant, in cazuri bine selectate, amniocenteza precoce poate fi utila, desi timpul de precizare diagnostic prin culture de cellule este lung (3-6 saptamani).

Amniocenteza tardiva diagnostica reprezinta punctia cavitatii amniotice in ultimele luni de sarcina in scopul prelevatii lichidului amniotic. Controlul ecografic al punctiei amniotice a diminuat mult riscurile. Examinarea calitativa si cantitativa a componentelor lichidului amniotic ofera date importante asupra starii fatului “in utero” si a gradului sau de dezvoltare.

Amniocenteza tardiva terapeutica are ca scop evacuarea lichidului amniotic (hidramnios acut) sau administrarea terapeutica intraamniotica a aminoacizilor (hipotrofie fetala) sau masa eritrocitara in izoimunizarile Rh.

Amniocenteza este o metoda invaziva, traumatizanta, atat pentru mama cat si pentru produsul de conceptie si poate avea consecinte negative precum: avortul spontan, infectia, scurgerea de lichid amniotic, nasterea prematura, sagerarea, prejudiciul fetal.

Capitolul V

OBIECTIVE

V.1. Introducere si premise

Necesitatea de a detecta cat mai devreme in cursul unei sarcini o posibila anomalie genetica a determinat ca patologia sarcinii si testele de citogenetica moleculara sa reprezinte un domeniu de interes major.

Modificarile genetice care variaza de la benign la letal, au fost descise ca sindroame, dintre care cel mai frecvent este cel cauzat de prezenta unui cromozom suplimentar din perechea 21 cunoscut sub denumirea de Sindrom Down.

Actual, se folosesc pentru diagnosticul prenatal al anomaliilor cromozomiale a serie de tehnici, printer care QF-PCR si Cariotipul complet, studiul de fata propunandu-si sa obiectiveze si sa analizeze rezultatele obtinute in urma celor doua teste.

QF-PCR si Cariotip

QF-PCR cauta cele mai frecvente anomalii cromozomiale numerice precum Sindromul Down, Sindromul Edwards, Sindromul Patau si prezenta cromozomilor sexuali X si Y, in timp ce culturile cu Cariotip complet verifica toti cromozomii din celulele fetale atat ca numar cat si ca structura.

V.2. Obiectivele studiului

Pentru realizarea acestei lucrari am efectuat un studio retrospectiv asupra unui lot de 473 de paciente gravide ce isi propune sa analizele aportul QF-PCR si Cariogramei in diagnosticul prenatal.

Scopul studiului care a stat la baza elaborarii lucrarii de fata este de a evalua depistarea prenatala a anomaliilor genetice ale produsilor de conceptie aparute in cursul sarcinii si evaluarea frecventei anomaliilor cromozomiale in cadrul lotului prin prelevarea de lichid amniotic in cursul amniocentezei si analizarea acestuia prin intermediul testelor citogenetice.

Aceasta abordare este necesara avand in vedere ca anomaliile cromozomiale sunt responsabile pentru morbiditatea si mortalitatea fetala crescuta atat pre- cat si post-natala si permit detectarea unor afectiuni grave la un produs de conceptie.

Diagnosticul cat mai precoce al acestor anomalii reprezinta o prioritate si constituie obiectivul si totodata beneficiul medicinii prenatale.

Scopul si obiectivele studiului sunt justificate de implicatiile majore medicale, economice si sociale ale sindroamelor determinate de anomaliile cromozomiale, diagnosticul prenatal fiind cel care poate contribui in mod direct la scaderea morbiditatii si mortalitatii perinatale si postnatale tardive.

Capitolul VI

MATERIAL ȘI METODĂ

Studiul s-a derulat in intervalul 15.06. 2011-15.06.2015, pe un lot care cuprinde 473 de paciente care au efectuat amniocenteza, interventiile fiind realizate in cadrul Spitalului Clinic de Obstetrica-Ginecologie “Prof. Dr. Panait Sarbu”.

Probele recoltate in urma procedurii au fost analizate de catre personalul specializat in citogenetica si analiza moleculara al Laboratorului Genetic Lab pentru stabilirea diagnosticului de certitudine.

Metode citogenetice in diagnosticul prenatal:

Studiul anomaliilor comozomiale a fost realizat prin intermediul a doua teste de diagnostic antenatal:

QF-PCR ( analiza cantitativa a cromozomilor 13,18,21,X si Y), precizia metodei raportata la literatura de specialitate fiind de 99,1%

Cariotip ( analiza numerica si morfologica a celor 23 de perechi de cromozomi cu analiza metafazei prin bandarea G)

Rezultatele testarii citogenetice au fost prelucrate statistic cu programul Microsoft Excel pentru evaluarea semnificatiei in cadrul lotului de studiu.

Parametrii urmariti au fost:

-varsta gravidei

-varsta sarcinii

-motivele prezentarii pentru amniocenteza

-sexul fatului

-rezultatele obtinute prin QF-PCR

-rezultatele obtinute prin Cariotip

Informatiile necesare au fost obtinute din evidentele primare (foi de observatii) ale Spitalului Clinic de Obstetrica-Ginecologie “Prof. Dr. Panait Sarbu” si din datele obtinute de la Laboratorul de analize Genetic Lab cu privire la rezultatele testelor citogenetice efectuate.

Din punct de vedere al necesitatii amniocentezei a fost luat in considerare riscul genetic, stabilit pe baza rezultatelor screeningului prin dublu si triplu test , varsta materna avansata, existenta in antecedente personale patologice sau heredocolaterale a unor afectiuni genetice. Un rezultat cu risc scazut obtinut la testele de screening nu exclude absenta unor anomalii cromozomiale si totodata un rezultat cu risc crescut nu certifica diagnosticul, ci recomanda efectuarea unor teste de diagnostic citogenetic in vederea confirmarii sau infirmarii suspiciunii.

Criterii de includere in lot:

Au fost incluse in lotul de studiu gravidele la care s-a efectuat amniocenteza in vederea efectuarii QF-PCR si Cariotipului avand cel putin una din indicatiile urmatoare:

-varsta materna avansata (peste 35 de ani)

-dublu test cu risc crescut

-triplu test cu risc crescut

-anomalii ecografice

-existenta unor antecedente de afectiuni genetice

-indicatii combinate

Au fost excluse din lot paciente la care s-a practicat amniocenteza in acelasi interval dar pentru alte indicatii decat efectuarea testelor QF-PCR si Cariotip.

Criterii din includere a gravidelor in lotul cu risc genetic pentru produsul de conceptie :

Indicatiile pentru efectuarea diagnosticului citogenetic prenatal al anomaliilor cromozomiale sunt varsta conceptionala avansata a mamei, semnele ecografice de apel, rezultatele unui screening seric matern ce indica un risc crescut pentru defecte de dezvoltare, istoricul familial pozitiv si istoricul obstetrical pozitiv al gravidei pentru anomalii cromozomiale.

Consultul genetic prenatal:

Gravidelor sau cuplurilor cu risc genetic de anomalii cromozomiale pentru produsul de conceptie li s-a efectuat consultul genetic, care vizeaza: evaluarea indicatiilor, anamneza(generala, personala, familiala si gestationala), constituirea arborelui genealogic, examenul obiectiv, coroborarea datelor cu cele provenite de la alti specialisti, stabilirea diagnosticului clinic, indicarea unui test genetic, consiliera pretestare si elaborarea diagnosticului etiologic.

Metodele de screening prenatal utilizate inainte de efectuarea amniocentezei au constat in screeningul matern si in cel ecografic, efectuate in primul si al doilea trimestru de sarcina si s-au identificat pacientele cu risc genetic care au primit indicatie de diagnostic prenatal prin amniocenteza si au fost ulterior incluse in lotul de studiu.

Metode folosite in screening-ul prenatal:

Un rezultat cu risc scazut obtinut la screeningul seric nu poate exclude in totalitate absenta unor anomalii cromozomiale si totodata un rezultat cu risc cresccut nu poate certifica diagnosticul de anomalii cromozomiale. Riscul genetic stabiliit in urma dublului sau triplului test , varsta avansata sa gravidei nu constituie criterii absolute ci implica dorinta cuplului sau a gravidei de a efectua tehnica invaziva de diagnostic anenatal la recomandarea medicului. Efectuarea de teste de diagnostic citogenetic se recomanda in vederea stabilirii cu certitudine a statusului produsului de conceptie.

Asadar, recomandarea amniocentezei pentru testele citogenetice s-a efectuat pe baza rezultatelor pozitive ale screeningului biochimic, a varstei materne avansate, a malformatiilor fetale identificate in timpul ecografiei si a prezentei anomaliilor cromozomiale in antecedente.

Procedura de diagnostic prenatal folosita in studiul de fata a fost amniocenteza. Tabelul de mai jos prezinta cateva dintre avantajele si dezavantajele acestei proceduri.

Amniocenteza:

Fig. VI.1. Distributia pacientelor pe baza riscurilor stabilite in screeningul prenatal

SSM: Screening seric matern; VMA:Varsta materna avansata; SEA: Semne ecografice de alarma; IF+: Istoric familial pozitiv

Indicatiile amniocentezei au fost impartite in indicatii unice si indicatii multiple.

Indicatiile unice (64%) fac referire la:

-screeningul seric matern (45%)

-varsta materna avansata (13,5%)

-semnele ecografice de alarma (3%)

-istoricul familial pozitiv (2%)

-initiativa pacientei/la cerere (0,5%)

Indicatiile multiple (36%) cuprind doua sau mai multe dintre indicatiile unice.

Cauza principala de recomandare a investigatiei invazive a constituit-o rezultatele screening-ului seric matern, fie singur, fie in combinatie cu varsta materna.

Screeningul anomaliilor fetale – markeri serici materni:

Alfa-fetoproteina (AFP) : glicoproteina cu greutate moleculara de aproximativ 70 000 daltoni, produsa de vezicula vitelina si de ficatul fetal.In anumite situatii, cantitati anormale de AFP pot intra in serul matern printre care: defecte de tub neural, defecte de perete abdominal anterior, sindromul Turner cu higroma chistica, atrezia intestinala si nefroza congenitala.

Gonadotropina corionica umana fractiunea beta (β-hCG) : se pare ca un nivel crescut reprezinta cel mai senzitiv marker in detectia trisomiei 21; un nivel redus este asociat cu trisomia 18; nivelul este normal in defectele de tub neural.

Estriolul neconjugat (uE3) : reprezinta o forma de estrogeni sintetizati in cantitati mari in timpul sarcinii si este produsa de placenta. Ca si in cazul AFP, nivelele reduse de estriol se intalnesc in anomalii cromozomiale ca trisomia 21 si 18.

Acesti markeri biochimici din serul matern sunt cei mai utilizati si testarea lor poarta numele de Triplu test efectuat de obicei in trimestrul II de sarcina.

Nivelurile normale ale celor trei marker serici din sarcina se situeaza in jurul valorilor urmatoare:

AFP: 33,04 UI/ml

hCG: 24,04 UI/ml

uE3 : 2,56 ng/ml

Exprimarea valorilor se face in multiplu al medianei notat MoM si se calculeaza raportul dintre concentratia markerului seric si concentratia mediana a markerului pentru sarcinile neafectate de aceeasi varsta gestationala. Nivelul prag (cut-off) este valoarea variabilei de screening in functie de care rezultatele testului vor fi impartite in pozitive si negative.

Pentru Sindromul Down, valorile AFP si uE3 sunt cu aproximativ 25% mai mici decat cele de referinta, iar hCG seric este aproximativ dublu fata de valoarea de referinta. In Sindromul Edwards, toti cei trei markeri serici sunt scazuti.

Exprimarea valorilor se face in multiplu al medianei notat MoM si se calculeaza raportul dintre concentratia markerului seric si concentratia mediana a markerului pentru sarcinile neafectate de aceeasi varsta gestationala. Nivelul prag (cut-off) este valoarea variabilei de screening in functie de care rezultatele vor fi interpretate ca avand risc scazut (riscul calculat este sub cut-off-urile stabilite) sau risc crescut (riscul calculat depaseste cut-off-urile stabilite).

Valori de referinta pentru definirea unui screening normal:

Pentru celelalte aneuploidii este utilizat un cut-off de 1/.

Cu privire la testele biochimice efectuate inaintea amniocentezei s-a constatat ca din totalul pacientelor incluse in lot, cel mai ridicat procent de gravide au fost supuse Triplu testului (57%), 22% Bitestului, 5% Cvadruplu testului, iar 16% nu au avut niciun test biochimic de screening efectuat.

Fig. VI.2. Distributia pacientelor din lot in functie de testul biochimic efectuat inaintea amniocentezei

Capitolul VII

PREZENTAREA LOTULUI DE STUDIU

In lotul de studiu au fost incluse 473 de gravide cu varste cuprinse intre 21 si 48 de ani. Majoritatea gravidelor carora li s-a efectuat amniocenteza sunt in jurul varstei de 35 de ani, aceasta fiind si media varstei pacientelor din lotul studiat.

In gruparea pe clase de 5 ani se observa grupele de varsta 31-35 si 36-40 ce domina distributia, cu un numar de 118 respectiv 169 de gravide.

Categorii de varsta:

Fig. VII.1.: Distribuția lotului pe categorii de vârstă

In lotul studiat, 7 gravide (1,47%) au avut sarcina gemelara, la acestea practicandu-se testele de diagnostic citogenetic in urma carora nu s-a inregistrat nici un rezultat patologic.

Din punct de vedere al sexului genetic, din totalul fetilor, 244 sunt de sex feminin si 236 de sex masculin.

Fig. VII.2.: Repartiția pe sexe a feților

Varsta gestationala:

Cu privire la distributia in functie de stadiul gestatiei, exprimat in saptamani, la care gravidele au efectuat interventiile de diagnostic prenatal s-au constatat urmatoarele aspecte:

gravidele s-au prezentat pentru amniocenteza pe un interval cuprins intre 15 si 27 saptamani de sarcina

din totalul de 437 de amniocenteze, 394 au fost efectuate la o varsta mai mica de 20 de saptamani, si 79 au fost efectuate intre 20 si 27 de saptamani

ponderea cea mai mare de amniocenteze corespunde saptamnii 17 de sarcina, la marea majoritate a gravidelor procedura efectuandu-se la varsta gestationala de 17 saptamani.

Fig. VII.3. : Repartiția pacientelor din lot in funcție de varsta sarcinii

Capitolul VIII

REZULTATE ȘI DISCUȚII

Rezultatele testelor citogenetice QF-PCR si Cariotip au fost impartite in doua categorii: normale si patologice.

Pe parcursul studiului au fost depistate 42 de cazuri patologice, restul de 432 de paciente avand rezultate normale la ambele teste citogenetice efectuate din lichidul amniotic prelevat.

Studiul a relevat ca procentul anomaliilor numerice identificate pe tot parcursul studiului a fost de 40% , iar al celor structurale de 60%.

Distributia anomaliilor numerice cromozomiale releva faptul ca tipul cel mai frecvent este reprezentat de aneuploidiile autozomale care reprezinta 82% , in timp ce anomaliile gonozomale reunesc 18% din anomaliile numerice intalnite in lotul studiat.

Fig. VIII.1.: Distributia anomaliilor cromozomiale in lotul studiat

Fig. VIII.2. : Distribuția anomaliilor numerice cromozomiale

Anomalii autozomale descoperite in cazulile din lotului studiat:

-11 cazuri Trisomie 21

-2 cazuri Trisomie 13

-1 caz Trisomie 18

Anomalii gonozomale descoperite in cazurile din lotul studiat:

-1 caz Trisomie XXX

-1 caz Trisomie XXY

-1 caz Trisomie XYY

Tipuri de anomalii cromozomiale:

Incidenta anomaliilor in lotul studiat:

Anomaliile cromozomiale identificate:

Au fost identificate pe tot parcursul studiului 42 de cazuri patologice care au fost clasificate dupa tipul anomaliei- numerice respective structurale.

In cadrul aneuploidiilor, Trisomia 21 a fost intalnita in proportie de aproximativ 65%. Restul anomaliilor cromozomiale au fost identificate in proportii mai mici de: 11,76% Trisomia 13, 5,88% Trisomia 18, 5,88% Sindromul XXY, 5,88% Sindromul XXX, 5,88% Sindromul XYY.

In cadrul anomaliilor cromozomiale structurale ponderea a fost de 68% pentru Duplicatii cromozomiale, 24% pentru Inversii pericentrice, 4% pentru Mozaic cromozomial si 4% pentru Translocatie cromozomiala.

Fig. VIII.3. : Distribuția pe sex citogenetic a cazurilor cu anomalii cromosomiale

In urma analizei QF-PCR a fost stabilit sexul citogenetic al fetilor si in ceea ce priveste distributia pe sex citogenetic a cazurilor cu anomalii cromosomiale s-a observant ca 67% dintre cazurile patologice corespund sexului feminin si restul de 33% sexului masculin.

Rezultatele obtinute pe baza analizei QF-PCR:

Fig. VIII.4 : Distributia rezultatelor patologice obtinute in urma QF-PCR

Au fost diagnosticate prin analiza QF-PCR 17 cazuri patologice:

Cazurile patologice obtinute sunt reprezentate astfel:

-11 cazuri Trisomie 21/Sindrom Down

-1 caz Trisomie XXY/Sindrom Klinefelter

-1 caz Trisomie XXX

-1 caz Trisomie XYY/Sindormmul dublu Y

-2 cazuri Trisomie 13/Sindrom Patau

-1 caz Trisomie 18/Sindrom Edwards

Fig. VIII.5. : Distributia procentuala a rezultatelor patologice prin QF-PCR

In lotul studiat, conform rezultatelor obtinute in urma efectuarii analizei QF-PCR, cel mai ridicat procent de cazuri patologice corespunde Trisomiei 21(Sindormuli Down) intalnit in aproximativ 65% din cazurile patologice. Restul patologiilor au fost identificate in procente mai mici respectiv 5,88% Sindromul Klinefelter, 5,88% Trisomia XXX, 5,88% Trisomia XYY, 5,88% Trisomia 18 si 11,76% Trisomia 13.

In functie de categoria de varsta a gravidelor la care s-a analizat lichidul amniotic prin QF-PCR, au fost depistate 2 cazuri pentru categoria de varsta 26-30 ani, 2 cazuri pentru categoria 31-35 ani, 5 cazuri corespunzatoare categoriei de varsta 36-40 ani si 8 cazuri in categoria de varsta 41-45 ani.

Fig. VIII.6. : Distributia rezultatelor patologice obtinute in urma QF-PCR in functie de categoriile de varsta

Fig. VIII.7. : Distributia rezultatelor obtinute prin QF-PCR

Rezultate obtinute pe baza analizei Cariotipului:

Cea de-a doua investigatie ale carei rezultate au fost urmarite pe parcursul studiului a fost Cariotipul. Din totalul de 473 de paciente incluse in lotul de studiu, 42 au reprezentat un caz patologic in urma efectuarii cariotipului.

Fig. VIII.8. : Distributia rezultatelor obtinute in urma efectuarii Cariotipului

Fig. VIII.9. : Rezultate Cariotip

Fig. Distributia cazurilor patologice in functie de patologia genetica depistata dupa efectuarea Cariotipului

Testarea citogenetica prin efectuarea Cariotipului a permis diagnosticul cazurilor cu anomalii citogenetice, identificand urmatoarele cazuri patologice:

-17 cazuri de Duplicatie cromozomiala

-11 cazuri de Trisomie 21

-6 cazuri de Inversie pericentrica

-2 cazuri de Trisomie 13

-1 caz de Trisomie XXY

-1 caz de Trisomie X

-1 caz de Mozaic cromozomial

-1 caz de Trisomie XYY

-1 caz de Translocatie cromozomiala

-1 caz de Trisomie 18.

Analiza globala a lotului de paciente investigate a aratat ca in categoria anomaliilor identificate pe baza Cariotipului cea mai mare frecventa au avut-o duplicatiile cromozomiale intalnite in procent de 41%.

Fig. VIII. 10. : Distributia cazurilor patologice obtinute prin Cariotip

Raportate la categoriile de varsta, cele mai multe cazuri au fost intalnite la paciente cu varste cuprinse intre 36 si 40 de ani (15 cazuri). In grupa de varsta 41-45 ani s-au identificat 13 cazuri de anomalii cromozomiale, intre 31-35 ani 9 cazuri, 26-30 ani 3 cazuri si 21-25 ani 2 cazuri.

Fig. VIII. 11. : Distributia procentuala a cazurilor descoperite dupa efectuarea Cariotipului

Fig. VIII. 12. : Distributia cazurilor patologice in functie de categoriile de varsta

Fig. VIII.13. : Incidența Sindromului Down in funcție de categoriile de vârstă

In lotul studiat, incidenta Sindromului Down a fost corelata cu varsta materna si s-au constat

In categoria de varsta:

26-30 de ani – 1 caz

31-35 de ani – 1 caz

36-40 de ani – 3 cazuri

41-45 de ani – 6 cazuri.

In urma corelatiilor intre anomaliile citogenetice observate si varsta lotului investigat, s-a constatat ca procentul sarcinilor cu Sindrom Down a fost mai mare in lotul cu varsta materna 41-45 ani, in comparatie cu celelalte lotur, ceea ce subliniaza riscul crescut de aparitie a Sindromului Down la mamele cu varsta de 41-45 ani.

In ceea ce priveste riscul ridicat al mamelor cu varsta avansata de a avea copii cu anomalii cromozomiale, urmatorul grafic prezinta distributia cazurilor patologice in funtie de varsta materna.

Fig. VIII.14. : Distributia cazurilor patologice in functie de varsta – gresit, trebuie sa il modific

In urma corelatiilor intre anomaliile citogenetice observate si varsta lotului investigat s-a constatat ca femeile in varsta de peste 35 de ani reprezinta indicatia majora de diagnostic antenatal, intrucat acestea au riscul cel mai ridicat al nasterii unor copii cu anomalii genetice.

Cele 42 de cazuri de anomalii cromozomiale din lotul studiat s-au inregistrat la paciente cu varste de:

24 ani -1 caz, 25 ani- 1 caz, 27 ani – 1 caz, 29 ani – 1 caz, 30 ani – 1 caz, 32 ani – 2 cazuri, 33 ani – 2 cazuri, 34 ani – 1 caz, 35 ani – 4 cazuri, 36 ani – 2 cazuri, 37 ani – 4 cazuri, 38 ani – 6 cazuri, 39 ani – 3 cazuri, 41 ani – 6 cazuri, 42 ani – 4 cazuri, 43 ani – 2 cazuri, 44 ani – 1 caz.

Capitolul IX

CONCLUZII

Studiul personal realizat asupra unui lot de 473 de paciente care au efectuat amniocenteza in perioada 15.06.2011-15.06.2015 la Spitalul Clinic de Obstetrica-Ginecologie “Panait Sarbu”, Bucuresti, a condus la urmatoarele constatari cu caracter concluziv:

Studiul a fost derulat pe un interval de 4 ani, pe un lot de 473 de gravide cu risc genetic pentru produsul de conceptie, investigate prin screening, diagnostic prenatal prin amniocenteza si teste citogenetice QF-PCR si Cariotip

Din cele 473 de gravide luate in studiu, s-a remarcat prezenta unui numar de 42 de cazuri cu anomalii genetice depistate in urma analizarii prin tehnici citogenetice a lichidul amniotic prelevat.

Diagnosticul citogenetic a evidentiat modificari cromozomiale atat numerice(17 cazuri), cat si structurale(25 cazuri) aducand o contributie majora in conduit terapeutica precum si in acordarea sfatului genetic, oferind posibilitatea efectuarii avortului terapeutic in cursul trimestrului intai sau inceputul trimestrului doi de sarcina, in cazul descoperirii unei anomalii citogenetice majore, decizia apartinand in totalitate cuplului.

Conform evaluarilor statistice cele mai frecvente anomalii cromozomiale au fost reprezentate de cele structurale(60%), cele numerice fiind intalnite in procent mai mic(40%).

In cadrul aneuploidiilor autozomale, trisomia 21 a prezentat o pondere de 64,70%, trisomia 13-11,76%, trisomia 18- 5,88%, Sindromul XXY-5,88%, Sindromul XXX-5,88% si Sindromul XYY-5,88%.

In cadrul anomaliilor cromozomiale structurale ponderea a fost de 68% pentru duplicatii cromozomiale, 24% pentru inversie pericentrica, 4% pentru mozaic cromozomial si 4% pentru translocatie cromozomiala.

In cadrul indicatiilor unice pentru practicarea amniocentezei, cele mai multe au fost practicate avand ca indicatie screeningul seric matern sau varsta materna avansata.

Cea mai frecventa indicatie multipla pentru amniocenteza a fost varsta materna avansata asociata cu sceeeningul seric matern.

Rezultatul studiului a demonstrat faptul ca in lotul analizat frecventa cea mai mare a rezultatelor pozitive in urma testelor citogenetice QF-PCR si Cariotip s-a inregistrat la gravide cu varsta peste 35 de ani.

In lotul studiat , incidenta Sindromului Down a fost corelata cu varsta materna, cele mai multe cazuri inregistrandu-se in categoria de varsta 41-45 ani.

Diagnosticul prenatal atunci cand are indicatii precise judicios argumentate, prezinta numeroase avantaje si permite optimizarea oportunitatilor terapeutice in concordanta cu dorinta cuplului.

BIBLIOGRAFIE

Covic M. Stefanescu D., Sandovici I., Genetica Medicala EDITIA A II-A, Polirom 2011, P. 632-633;677

Nanu D., Marinescu B.,Matei D. et al Esentialul in obstetrica. Ed. Med Almatea, 2008

ACOG Committee on Practice Bulletins-ACOG Practice Bulletin No.77:Screening for fetal chromosomal abnormalities – Obstet Gynecol 2007, 109(1):217-228

Albu D.- The interventional ultrasonography in the prenatal diagnosis – Rev Obstetrica si Ginecologie, ISSN 1220-5532, Vol LI (2003), Nr. Supl., oct. 2003, pag. 33 CNCSIS Categoria C, cod 254

Albu C., Albu D., Severin E., Toma A.- Ultarsound and maternal serum screening at 10-12 weeks of pregnancy with Down syndrome – Ultrasound in Obstetrics&Gynecology, Indexed in Science Citation Index, Science Citation Index Expanded, Current Contents –Clinical Medicine; ISSM 0960-7692, vol 26, nr.4, sept 2005, pag 378, Revista ISI, Factor impact 2.43

Marinescu B.-Consultatia in sarcina cu risc crescut P100-106

Marinescu B.-Consultatia in sarcina cu risc crescut, Editura enciclopedica,Bucuresti,1999

Severin E.,Albu C.,Ioachim I.-Genetica umana:concepte si aplicatii practice, Editura Scripta,2002

Junqueira L. C., Carneiro J.-Histologie tratat si atlas- Editura medicala Callisto,2008

Neagos D.,Bohiltea L., Cretu R.- Anomalii cromozomiale umane. Aspecte genetice in diagnosticul prenatal, Editura ALL, 2013

Andronescu A.-Anatomia dezvoltarii omului.Embriologie medicala-Editura Medicala, Bucuresti 1987,p 48-49.

Anderson, CL;Brown, CEL- Fetal chromosomal abnormalities:antenatal screening and diagnosis, AMERICAN FAMILY PHYSICIAN, 01/2009, Volume 79, Issue 2,pages 117-123,ISSN 0002-838X,EISSN:1532-0650

Ancăr V., Ionescu C.- Obstetrica, Editura National,2008

William W. Beck, Jr.-Obstetrics and Gynecology NMS, Edition 4th,1997

Surcel I. V., Surcel M. –Obstetrica si ginecologie, Editura Dacia, Cluj-Napoca, 2005

Bennett R.L. – The practical guide to the genetic family history, NY,1999

Aitken D.A., Crossley J.A., Spencer K. – Prenatal screening for neural tube defects and aneuploidy – Principles and practice of medical genetics, Ed. DL Remoin, JM Connor, RE Pyeritz, BR Korf, 4-th edition,London,2002, p 763-1401.

Albu C., Albu D., Severin E., Dumitrescu M.-Early prenatal diagnosis of a fetus with Patau Syndrom: Case Report – The Journal of Maternal-Fetal & Neonatal Medicine, Volume 21 Supplement 1 2008, Indexed in Science Citation Index Expanded, Currenr Contents – Clinical Medicine; ISSN: 1476-4954 (electronic) 1476-7058 (paper), pag 21-280, Revista cotata ISI, Factor impact 1.101

Severin E., Albu D., Albu C., Dumiterscu M.- Antenatal ultrasound detection of an unusual pattern of anomalies associated with fetal agenesis of the corpus callosum – Case Report- Ultrasound in Obstetrics&Gynecology, ISSN

Andrew R.MacRae, Jacob A.Canick. Maternal Prenatal Screening for Fetal Defects. In Handbook of Clinical Laboratory Testing During Pregnancy. Ann M.Gronowski. Humana Press, USA, Ed. 2004, 105-120.

Breathnach, Fionunuala M, et al. First-and Second-Trimester Screening: Detection of Aneuploides Other Than Down Syndrome. In Obstetriics & Gynecology, September 2007, volume 110, pp 651-657.

Deborah A. Driscoll, Susan Gross. Prenatal Screning for Aneuploidy. In N Engl J Med 2009; 360-2556-2562.

Kypros H. Nicolaides. Screening for fetal aneuploides at 11 to 13 weeks. In Prenat Diagn. 2011; 31:7-15.

Laborator Synevo. Referintele specifice tehnologiei de lucru utilizate. 2013. Ref Type: Catalog.

Society of Obstetricians and Gynaecologists of Canada (SOGC) Clinical Practice Guidelines.  Obstetrical Complications  Associated With Abnormal Maternal Serum Markers Analytes. SOGC Technical Update, No.217, October 2008.

www.orpha.net

https://fetalmedicine.org/pyramid-of-care

http://cytogenomic.ro/index.php?obj=front&action=chapter&id=3157

http://www.acog.org/Resources-And-Publications/Committee-Opinions/Committee-on-Genetics/Noninvasive-Prenatal-Testing-for-Fetal-Aneuploidy

http://sogc.org/wp-content/uploads/2013/01/gui265CPG1109E.pdf