Diagnostic, Supraveghere Si Combatere In Leucoza Enzootica Bovina

CUPRINS

Introducere Capitolul 1 – Date bibliografice privind LEB 1.1 Etiologie…………………………………………………….4 1.2 Caractere epizootologice…………………………….6 1.3 Patogeneză…………………………………………………8 1.4 Tabloul clinic……………………………………………..10 1.5 Tabloul anatomopatologic…………………………..13 1.6 Diagnostic…………………………………………………..14 1.7 Profilaxie……………………………………………………16 1.8 Combatere………………………………………………….17 Capitolul 2 – Contribuții personale Observații privind diagnosticul, supravegherea și combaterea în leucoza enzootică bovină 2.1 Scopul lucrării……………………………………………18 2.2 Materiale și metode…………………………………….20 2.3 Rezultate și discuții…………………………………….23 2.4 Concluzii……………………………………………………51 Bibliografie………………………………………………………………………53

Introducere

Leucoza enzootică bovină este o boală infecțioasă, neoplazică, malignă caracterizată printr-o proliferare continuă și necontrolată a mezenchimului activ, leziunea fundamentală fiind hiperplazia și metaplazia sistemului reticulo-endotelial. Boala este cunoscută de aproape 130 de ani, prima descriere fiind făcută de Siedamgrotzki în 1878 în Germania. După 1900 boala este descrisă din punct de vedere clinic de către Knuth si colaboratorii săi, introducând ca element de diagnostic depistarea celulelor limfoide din sângele circulant. Termenul de “leucoză” este utilizat pentru prima dată pentru descrierea bolii la păsări, iar în 1932 Dobberstein propune ca același termen să fie folosit pentru limfosarcom, leucemie, limfomatoză, la taurine. Noțiunea de “leucoză enzootică” a fost formulată de catre Goetze și colaboratorii în 1954, definind leucoza enzootică ca “ o boală infecțioasă de natură virală, tumorigenă, care evoluează insidios în ferme”. În anii urmatori se identifică virusul în lapte (1966, Duther), se identifică agentul etiologic la microscopul electronic în culturi de limfocite provenite de la vaci cu limfocitoză (1969, Miller si col). În anul 1976, Miller pune la punct metoda de diagnostic serologic prin reacția de imunoduzie, iar în 1989 Pelerin introduce metoda de diagnostic prin amplificare genică (PCR). În România leucoza a fost diagnosticată pentru prima dată de Suțeanu in 1954, la un taur de de rasă Rosie daneză, ulterior fiind semnalate alte focare de boală în special la animalele importate sau cele venite în contact cu acestea. Leucoza enzootică bovină este cunoscuta în aproape toate țările și are tendința de extindere. Cele mai numeroase cazuri de leucoză s-au semnalat în țările baltice: Danemarca, Suedia, Germania, Finlanda, Rusia, Polonia, etc. Prezența bolii este pusă pe seama importului de taurine din țări cunoscute ca “leagăne ale leucozei bovine”. Importanța economică este dată de pagubele provocate de afectarea dezvoltării normale a animalelor, scăderea producției de carne și lapte. Eliminarea exemplarelor cu valoare zootehnică ridicată de la procesul de selecție și reproducție este un alt efect major pe plan economic. Leucoza enzootică bovină continuă să fie o problemă majoră pentru efectivele de bovine din România. În acelasi timp constituie un risc potențial de infecție pentru om fiind cunoscută capacitatea virusului leucozei enzootice bovine de a activa oncogene celulare implicate în cancerogeneză. Deși programul de programul de eradicare a leucozei enzootice bovine, prin sacrificarea bovinelor infectate și despăgubirea proprietarilor este în plină desfășurare, numărul cazurilor este in continuă creștere. Folosirea la montă a animalelor infectate, mentinerea în viață ca urmare a întârzierii sacrificării, păstrarea descendenților proveniți de la animalele pozitive și lipsa controlului circulației animalelor reprezintă cauzele principale ale incidentei bolii. Procesul de integrare europeană și de aliniere a legislației românești cu cea europeană în domeniul leucozei enzootice bovine trebuie abordat în mod unitar chiar dacă din punct de vedere epidemiologic incidența cazurilor pozitive este diferită de la o zonă la alta. În lucrarea de față ne-am propus să efectuăm o serie de investigații privind acțiunile de diagnostic, supraveghere și combatere în leucoza enzootică bovină pe o perioadă determinată, studiind evoluția cazurilor de boală, particularitățile și similitudinile, ultimele metode de diagnostic, realizând statistici și grafice concludente.

` Capitolul I

Date bibliografice privind Leucoza enzootică bovină

Etiologie

Leucoza enzootică bovină a fost atribuită inițial unor tulburări metabolice și hormonale, carențe în diferite substanțe, acțiunii unor radiații ionizante (factori de mediu) sau acțiunii unor substantțe leucozogene formate în organism. Leucoza enzootică bovină este atribuită actual unor factori infecțiosi iar transmisibilitatea acesteia a fost dovedită experimental. Dependența naturii bolii de virus a fost arătată prima dată de Miller și col în 1969, demonstrând că particule asemănătoare virusului de tip C (retrovirusuri tip C mamifer), sunt prezente în culturile de limfocite stimulate cu fito-hemaglutinine, provenite de la vaci cu leucoză. Același Miller si colaboratorii săi reușesc să transmită boala la viței si miei prin inocularea de material ce conținea virusul. Virusul leucozei bovine (Bovine Leukaemia virus- BLV) este taxonomic încadrat în familia Retroviridae, genul Delatretrovirus, tipul C bovin. La examenul electronomicroscopic virionii au aspectul unor compuși sferici cu diametrul de 130 nm si cu tendința de grupare în rozete (Carp Cărare M., 2001).Virionii sunt constituiți dintr-o nucleocapsidă helicală, ce constituie “inima virusului” și un inveliș peplos lipoproteic; genomul este format dintr-o singură moleculă de ARN monocatenar (36). În celula gazdă informația genetică este transcrisă de ARN viral într-o dublă catenă de ADN previral de neoformație printr-un fenomen de transcriere inversă cu ajutorul enzimei reverstranscriptaza, ADN-ul previral integrat în genomul celulei gazdă este responsabil de efectul oncogen; maturarea și eliberarea virionilor din celula gazdă se face prin înmugurire. Gena “gag”codifică o proteină structurală cu efect imunogen (p24), gena “pol” determină sinteza revers transcriptazei, iar gena”env” sinteza glicoproteinelor.

Fig. nr.1 Structura virusului L.E.B. (www.nyschap.vet)

Virusul are afinitate pentru limfocitele B (cu marker CD3) și într-o mai mică măsură pentru limfocitele T. Virusul a fost adaptat pe celule renale de fetus ovin în cultură continuă, iar fitohemaglutinina îi accelerează replicarea. S-au folosit si alte linii celulare, cum sunt: FLK, D 12, NP 2-10, etc. Pe baza experiențelor de transmitere și a studiilor epizootologice făcute pe efective de animale, virusul leucozei bovine este considerat drept agentul cauzal a două boli înrudite, dar total diferite, ale bovinelor: Forma adultă de limfosarcom – este probabil cea mai frecventă boală neoplazică a taurinelor. Limfocitoza persistentă – este o afecțiune limfoproliferativă benignă, observată frecvent la bovinele clinic normale, din efective cu o incidență mare de limfosarcoame, ea precede evoluția leucozei bovine în circa 60 % din cazuri, însă majoritatea acestor animale nu vor face limfosarcom, cu toate că virusul leucozei este agentul cauzal al amândurora (Ferner, 1979).

Caractere epizootologice

Leucoza enzootică bovină, cu formele sale, limfocitoza persistentă și limfosarcomul (forma adultă a bolii), are tendinta de focalizare în anumite zone geografice și în anumite efective (Perianu, 2005). Receptivitate – sunt receptive bovinele de toate vârstele, frecvența maximă fiind însă la vârsta de 4-8 ani. Rasele mai frecvent afectate sunt Roșie daneză, Roșie estonă, Roșie letonă, în general rasele de lapte (Barna I,1989). Sursele de infectie – sunt reprezentate de animalele bolnave cu semne clinice și cele inaparente, iar infecția se transmite vertical și orizontal. Mod de contaminare: Transmiterea verticală se face transplacentar (4 -8% din fetușii animalelor bolnave sunt infectați), prin colostrul matern, limfocitele infectate pătrunzănd prin epiteliul mucoasei intestinale foarte permeabil în primele ore; totuși anticorpii colostrali au un efect protector, conform studiilor fetușii la care aceștia lipsesc sunt de trei ori mai susceptibili la infecție. Transmiterea orizontală este cea mai frecventă și se realizează prin contactul direct sau cu secrețiile și excrețiile contaminate cu limfocite infectate, frecvent prin iatropatii- intervenții sângeroase (ecornare, tatuare), instrumente obstreticale, echipament de muls, seringi, ace contaminate și refolosite la animalele sănătoase. Un rol important îl au insectele hematofage, mai ales în zonele cu climă umedă, realizând prin sângele supt transferul limfocitelor infectate de la un animal la altul (Barna I, 1985). Bovinele se infectează mai frecvent în sezonul cald (vara), datorită aglomerărilor de animale și apariției insectelor hematofage. Absența fazei de viremie face ca transmiterea orizontală să fie de mare importanță. Faptul că virusul nu a fost detectat în materialul seminal nu exclude o posibilă contaminare; se pare că există un factor spermatic inactivant ceea ce explică dificultatea izolării virusului. S-a reusit infectarea experimental a vacilor prin introducerea de limfocite infectate în uterul acestora (Barna ,1976) Alte posibilități de transmitere sunt prin transfuzii sangvine, tuberculinare, administrarea de vaccinuri care conțin sânge. Riscul mare de infecție în perioada de după parturiție indică faptul că secretiile vaginale, excretiile și placenta precum și instrumentele obstreticale infectate reprezintă modalități de transmitere orizontală a bolii.

Fig. nr. 2 Transmiterea verticală și orizontală a L.E.B

Boala evoluează sporadic sau sub formă de enzootii staționare, fară tendința de difuzare în afara focarului, atingând mai multe generații de taurine. Introducerea bolii în efectivele indemne se face obișnuit prin animale infectate, din alte zone (Velescu E, 2002). Evoluția enzootică a bolii este favorizată de iatropatii, nerespectarea măsurilor sanitar veterinare impuse în cazul depistarii și declarării bolii.

Patogeneză

După pătrunderea în organism, virusul leucozei bovine modifică tabloul anatomoclinic și lezional, în funcție de cantitatea de virus, patogenitate, precum și de rezistența organismului și actiunea factorilor de stres (20). Contactul virusului cu organismul determină trei categorii de modificări. Modificări ale structurii și funcției virusului- prin pasaje pe grupe mari de bovine a crescut patogenitatea și s-a stabilizat genetic. Virusul nu are gena “onc”, patogenitatea sa fiind dată de activitatea genelor “tax” și “rex,”care activează leuconogeneza limfocitelor. Modificări ale imunitații mediate umoral și celular- p24 și gp58 determină sinteza de anticorpi (IgM, IgG, IgA), pentru care placenta vacilor gestante are efect de barieră; schimbă raportul limfocite T/limfocite B de la 2,61 la 0,7 în leucoză. Modificari asupra “supravegherii imune”- declanșează o reacție tip “grefă contra gazdă”. În mod normal organismul recunoaște celulele cancerizate, apărute ca urmare a mutațiilor sau infecției cu retrovirusuri oncogene. În cazul leucozei bovine “supravegherea imună” este eficientă numai dacă antigenele virale apar pe suprafața limfocitelor predestinate să le recunoască, ca antigene asocdepistarii și declarării bolii.

Patogeneză

După pătrunderea în organism, virusul leucozei bovine modifică tabloul anatomoclinic și lezional, în funcție de cantitatea de virus, patogenitate, precum și de rezistența organismului și actiunea factorilor de stres (20). Contactul virusului cu organismul determină trei categorii de modificări. Modificări ale structurii și funcției virusului- prin pasaje pe grupe mari de bovine a crescut patogenitatea și s-a stabilizat genetic. Virusul nu are gena “onc”, patogenitatea sa fiind dată de activitatea genelor “tax” și “rex,”care activează leuconogeneza limfocitelor. Modificări ale imunitații mediate umoral și celular- p24 și gp58 determină sinteza de anticorpi (IgM, IgG, IgA), pentru care placenta vacilor gestante are efect de barieră; schimbă raportul limfocite T/limfocite B de la 2,61 la 0,7 în leucoză. Modificari asupra “supravegherii imune”- declanșează o reacție tip “grefă contra gazdă”. În mod normal organismul recunoaște celulele cancerizate, apărute ca urmare a mutațiilor sau infecției cu retrovirusuri oncogene. În cazul leucozei bovine “supravegherea imună” este eficientă numai dacă antigenele virale apar pe suprafața limfocitelor predestinate să le recunoască, ca antigene asociate (Perianu, 2005). Virusul pătruns în organism ramâne mult timp în stare de latență, în echilibru cu organismul gazdă. Determină o infecție persistentă a limfocitelor B, prin integrarea ADN-ului proviral în ADN-ul celulei gazdă. La intervenția unor factori favorizanti, virusul oncogen determină multiplicarea celulelor în care se găsește, declanșând proliferarea malignă (Miclea, 1976). Pătrunderea virusului în limfocitele B, fuzionarea virus-celulă sunt mediate de proteina anvelopei virale GP-51 și unitatea sa transmembranară GP-30. Activarea limfocitelor B si proliferarea depinde de stimuli imuni, citokine, autoantigeni (22). Genomul viral conține o regiune a genei env- regiunea X , care codează o proteină virală regulatoare (tax), care crește rata transcripției virale activănd LTR, un susținator al regiunii provirale a genomului. Exprimarea proteinei virale „tax”de către un „tax transactivator” determină intrarea într-un ciclu celular, furnizând o proliferare selectivă, în avantajul celulelor infectate. Alte procese pot determina o expresie virală silențioasă într-o celulă fiică, determinată de factori inhibitori (HTLV p30, HBZ). Se pare că exprimarea virusului este in continuă desfășurare „in vivo”, deoarece transcripția virală este detectată la o incubare 37°C.

Fig. nr. 3 Mecanismul replicarii virusului LEB (www.retrovirology.com)

Mecanismele patogenezei sunt incomplet cunoscute, probabil fiind reprezentate de alterarea structurii citomorfologice a citoplasmei, nucleului limfocitelor, modificări citochimice, citoenzimatice, bioenergetice. Organismul elaborează anticorpi contra proteinei virale din înveliș, apoi a polipetidului intern, numărul lor crescând mereu.

Tabloul clinic

Durata perioadei de incubație în leucoza enzootică bovină este foarte lungă, variind de la câteva luni la 4-5 ani. Clinic, la animalele adulte, boala evoluează cronic, rar subacut, acut la viței. Simptomele sunt nespecifice, foarte variate, iar animalele au totdeauna un sfârșit letal; uneori boala se remite temporar, apariția simptomelor denotă că animalul este în stadiul terminal al bolii. În evoluția bolii se disting 4 stadii: Tabel nr.1 Stadializarea clinică a leucozei bovine (Barna, 1994)

Stadiul I al bolii nu se exprimă clinic, apar însă modificari ale elementelor sangvine, ale leucocitelor. Apare leucocitoză (peste 180000/) și crește numărul limfocitelor ( peste 75%) de durată, uneori remisiuni pasagere, atipii celulare frecvente afectând atât nucleul cât și citoplasma (apar în sâmgele periferic prolimfoblaștii, limfoblastii, celulele Rieder de iritație medulară). La 3-6 săptămâni de la infecție apar anticorpi precipitanți față de antigenele virale care dovedesc că animalul este infectat (2). Stadiul II al bolii ( limfadenopatie persistentă), evoluează cu hipertrofiii ganglionare, adenopatii ca urmare a proliferării în exces a limfocitelor maligne. Boala are un debut insidios (inițial sunt afectați limfonodulii portali și precrurali); animalul prezintă semne generale: apatie, anemie, lipsa apetitului, ce se accentuează progresiv. Boala afectează mai frecvent rasele de lapte, mai puțin cele de carne, iar incidența crește odată cu vârsta (Băieș, 1971).

Fig.nr.4 Hipertrofia limfonodurilor (www.vetmed.ucdavis.edu)

Semnele clinice specifice apar în urma dezvoltării procesului tumoral în zonele și organele abordabile prin metode clinice; cele mai frecvente semne sunt hiperplazia limfonodurilor prescapulari, precrurali, poplitei, retromamari ,cervicali, iliaci. Aceștia sunt afectați simetric, sunt duri la palpare (în reticulosarcom), sau de consistență scăzută (în limfosarcom), mobili, nedureroși, izolați de țesuturile vecine. Localizarea în plexul retrobulbar determina exoftalmie, strabism, cheratită. Apar anticorpii precipitanți, ce pot rămâne în platou, fiind decelați prin examene Obișnuit evoluția este cronică; limfonodurile superficiale se măresc în volum cu 75-90%. Sunt mărite și limfonodurile viscerale, ce pot fi palpate prin explorație rectală. Țesuturile afectate frecvent sunt inima, splina, rinichii, uterul, țesutul retrobulbar, rețeaua. Limfomatoza neurală poate duce la o paralizie graduală posterioară. Frecvent apare pierderea în greutate, hiperplazia limfonodală, depresie, febră, tahicardie, pareza posterioară, congestia cardiacă, semnele presiunii pe organele interne sunt mai rare. Moartea se produce în 2-8 săptămâni (Hagiu, 1993). Stadiul III- se caracterizează prin modificări calitative și cantitative ale leucocitelor și limfocitelor, ce au stat la baza întocmirii cheilor de diagnostic (Goetze, Toile, Rademacher). Leucozele sunt astfel clasificate în leucoze leucemice (însoțite de modificări ale sângelui circulant) și aleucemice (fără modificări). Leucoza leucemică poate fi acută (cu celule stem, hemocitoblastică, paralimfoblastică, limfoblastică), sau cronică (monocitară, limfocitară, plasmocitară). Leucoza aleucemică este reprezentată de limfosarcom, reticulosarcom, limfom, mielom multiplu. Anticorpii apar la 70% din animale. Stadiul IV (limfom malign limfocitar), se caracterizează prin generalizarea leziunilor tumorale, localizându-se în viscere. Celulele alterate neoplazic se localizează în diverse țesuturi și organe. Astfel apar disfuncții la nivelul aparatului digestiv (ocluzie esofagiană manifestată prin tulburări de deglutiție și meteorism), circulator (insuficiență cardiacă, ectazierea venelor, oboseală), genital (anestru, sterilitate, călduri anovulatorii), respirator (emfizem pulmonar, jenă respiratorie), nervos (paralizii parțiale sau totale) și excretor (insuficiență renală). În cele din urmă animalul moare fie brusc, ca urmare a rupturii splinei sau a accidentelor cardiace, sau dupa o perioadă lungă de timp ca urmare a slăbirii accentuate. Animalele infectate cu virusul leucozei nu manifestă în peste 95% din cazuri simptome clinice. Limfocitoza persistentă este considerată o manifestare subclinică a infecției virale, care în 5% din cazuri poate progresa intr-o limfoproliferare B oligo sau monoclonală la câțiva ani după infecție. Lipsa manifestărilor clinice până în stadiul terminal împiedică descoperirea animalelor infectate în absența testelor serologice (Barna 1994).

Tabloul anatomopatologic

Principalele leziuni constă în apariția unor focare de hiperplazie tumorală, de culoare cenușie albicioasă, cu aspect slăninos, de dimensiuni variabile (Paul, 1996) .Tumorile sunt diseminate în toate regiunile corporale, dar mai frecvent sunt afectate limfonodurile (90%), splina, rinichii, cordul. Limfonodurii sunt măriți în volum (de zeci de ori) și pe secțiune au un aspect suculent sau slăninos, uneori cu strii hemoragice, necroze și hemoragii pâna la o masa hemoragico-necrotică închisă în capsula organului (Oprean, 1998) Dintre organe, splina este mult mărită în volum ( de 5-20 de ori, foliculii limfoizi sunt hiperplaziați, înconjurați de pulpa roșie care are aspect de magmă purpurie)(26). Fig.nr.5 Leziuni cardiace(www.vet.uga.edu) Fig nr.6Aspirat limfonodal(www.vet.uga.edu) Histopatologic, se produc proliferări și infiltrații masive cu elemente limfoide reticulohistiocitare care determină necrobioza celulelor din țesutul lezat. Histologic în faza de LP apar celule mari cu citoplasma bazofilă, nucleu veziculos și membrana neregulată (celule blastice sau blastizate). Leucoza enzootică bovină este o leucoză limfoidă, ce se clasifică după modul de diferențiere a celulelor tumorale în patru tipuri: tipul cu celule nediferențiate, tipul histiocitar, tipul limfoblastic, tipul prolimfocitar-limfocitar (25). În cord masele tumorale afectează mai frecvent atriul drept dar și miocardul și pericardul. O categorie aparte o constituie leucozele aleucemice, care în funcție de tipul celular afectat prezintă mai multe forme: reticulosarcom, limfosarcom, reticulolimfosarcom, mielom multiplu, limfom giganto-celular, boala Hodgkin (Coțofan O,1992).

1.6 Diagnostic

Pentru diagnosticul leucozei bovine se folosește un complex de metode ce include examene epizootologice, clinice, serologice, hematologice, citomorfologice, anatomo- și histopatologice (Cătoi C, 2003). Examenul epizootologic- constă în verificarea antecedentelor, care pot îndruma spre o posibilă contaminare a animalelor. Examenul clinic individual urmărește simptomele bolii: hiperplazia limfonodurilor, slăbirea, cașexia. Examenul histologic- constă în stabilirea cantitativă și calitativă a elementelor figurate (leucocite). Leucocitoza și limfocitoza preced apariția semnelor clinice, în funcție de vârstă. Pentru diagnostic se utilizează „cheile de diagnostic” ce reprezintă valorile normale și patologice ale limfocitelor și leucocitelor. Eficiența cheilor de diagnostic este scăzută deoarece nu se poate distinge limfocitoza persistentă produsă de virusul leucozic, de limfocitozele trecătoare din alte cauze, precum și purtătorii latenți de virus. De asemenea multe animale nu prezintă limfocitoză deși sunt infectate (Pop, 1981). În acest stadiu se modifică raportul dintre limfocitele B și T (cresc limfocitele B), iar raportul Bo-CD-4/Bo-CD-8 se modifică de la 2,1 (stare de sănătate) la 1,4 (limfoleucoză persistentă), chiar 1,5. Celulele suferă și o serie de modificări calitative, ce se pun în evidență prin examen citomorfologic pe frotiuri sau din leucoconcentrat în cazul formelor aleucemice sau subleucemice Prezența de celule imature, modificarea raportului dintre liniile celulare sangvine, prezența limfocitelor binucleate (5-10%), proliferarea unei singure categorii celulare au valoare de diagnostic (15). Examenul hematologic se realizează cu sânge recoltat pe EDTA și constă în numărarea leucocitelor. Din probele cu valori între 4000 și 9000 leucocite/ se execută frotiuri pentru determinarea procentului de limfocite și a atipiilor. În toate formele se poate recurge la examenul organelor hematoformatoare, medulograma și adenograma. Se fac frotiuri din aspirate medulare sau limfonodare prin puncții, iar la animalele sacrificate amprente din limfonoduri și splină. Se stabilește raportul procentual al elementelor celulare (indice mitotic crescut, indice de maturație scăzut, atipii nucleare). Procedeele serologice de diagnostic au căpătat în ultima perioadă o importanță deosebită fiind eficiente, rapide, practice, specifice și mult mai ieftine. Cele mai utilizate metode sunt testul de imunodifuzie în gel de agar (ID) și testul imunoenzimatic ELISA (Perianu, 2005). Imunodifuzia are o specificitate de 99,8% și o sensibilitate de 98,5%. Testul ELISA este un test rapid, ce este utilizat și pe probe de lapte (de amestec sau individual), fiind mai sensibil decât imunodifuzia. Este util în supravegherea efectivelor indemne din ferme și gospodăriile populației, precum și pentru detectarea animalelor infectate.Toate metodele vizează detectarea anticorpilor contra virusului leucozei dar numai ELISA, ID și testul radioimunologic permit depistarea la scurt timp după infecție. Vițeii care au ingerat colostru de la vaci seropozitive au anticorpi maternali. Reacția PCR este necesară pentru a diferenția vițeii infectați viral de cei neinfectați. Testul PCR (reacția lanțului polimerazic) este util pentru identificarea ADN-ului proviral în limfocitele periferice, diferentiind nou-născuții cu anticorpi colostrali de vițeii infectați cu VLB. Izolarea virusului se poate face pe animalul viu, identificarea particulelor virale prin microscopie electronică, testul ELISA, ID. Pentru izolarea virusului se folosesc mediile Eagle MEM, Dulbeco MEM cu adaos de ser fetal, alantoină, iar ca material patologic se foloseste sânge integral, limfocite. Diagnosticul diferențial- se face față de stări inflamatorii ce determină leucocitoză (mamite, metrite, nefrite, abcese, flegmoane), de unele boli parazitare (fascioloză, babesioză). Leucoza bovină se distinge de inflamațiile limfohistiocitare și cele granulomatoase în care apare polimorfismul celular ( celule gigante în centru,celule epiteloide, eozinocite, plasmocite).Se diferențiază de tumori neleucozice (sarcoame, carcinoame, adenoame).

Profilaxie

Luând în considerare faptul că nu s-a găsit un tratament sau un vaccin contra leucozei bovine, măsurile de profilaxie trebuie să fie primordiale. Măsurile generale- vizează prevenirea introducerii bolii în țară prin animalele de import și depistarea animalelor bolnave. Efectivul din care provin animalele și taurii folosiți la reproducție trebuie să fie indemni de leucoză sau de suspiciune în ultimii 5 ani. Examinarea serologică și clinică se face cu 30 de zile înainte de îmbarcare, iar carantina profilactică este obligatorie (60 zile). În această perioadă se fac examene complete de laborator (Pop, 1988). Dacă în perioada de carantină nu se constată cazuri de leucoză lotul se menține sub supraveghere conform planului strategic anual. Efectivul de bovine de peste 6 luni se examinează serologic odată pe an, iar taurii de reproducție de două ori pe an prin imunodifuzie și ELISA. Un alt obiectiv îl constituie depistarea leucozei bovine și prevenirea difuzării acesteia. Pentru aceasta se efectuează examene clinice periodice la toate taurinele din ferme, examene necropsice la toate animalele sacrificate sau moarte indiferent de loc. Măsurile de sterilizare a instrumentarului folosit la intervenții sunt de asemenea necesare. Transmiterea la vițeii nou născuți poate fi redusă prin evitarea expunerii la sângele matern pe parcursul parturiției. Taurii de reproducție se testează de două ori pe an prin ELISA și se confirmă prin imunodifuzie, iar bovinele de peste 24 de luni odată pe an (Program strategic ANSVSA, 2008). Decornarea vițeilor prin electrocauterizare înainte de primele 2 luni de viață poate reduce prevalența infectiei comparativ cu ecornarea clasică, care permite transferul sângelui infectat între viței. Folosirea acelor de unică folosința pentru vaccinări, tratamente, recoltări de sânge, precum și folosirea mănușilor transrectale individuale pot reduce numărul de cazuri.

Combatere

În unitățile în care s-a confirmat leucoza bovină prin examen de laborator se instituie măsuri de carantină și de asanare în funcție de gradul de infectare a efectivului. Programul de măsuri constă în examinare serologică repetată la interval de minim 4 luni, administrarea la viței numai a laptelui de la vacile sănătoase sau sterilizarea prin fierbere, curățenia riguroasă și dezinfecția locului unde au fost cazate animalele (trei dezinfecții consecutive la interval de 15 zile), sterilizarea și dezinfectarea instrumentarului chirurgical și obstretical (14). Animalele sunt sacrificate la abator iar dacă nu există leziuni macroscopice sunt transformate în făinuri sau produse după tratarea termică. Se identifică, izolează și se elimină animalele depistate pozitiv în funcție de numărul lor prin extracție sau depopulare totală (Pârvu, 1988). Asanarea prin extracție – se va aplica în unitățile cu până la 15% infecție. Se examinează serologic din 3 în 3 luni efectivul sănătos cu eliminarea reagenților în termen de 3 zile și sacrificarea la abator. Se recoltează probe pentru examenul de laborator (limfonoduri, ficat, rinichi, cord, pulmon, tumori, amprente și frotiuri). Unitatea se consideră asanată când toate animalele au reacționat negativ la trei controale serologice succesive la interval de 3 luni(24). Asanarea prin depopulare totală – se aplică în unitățile cu peste 15% infecție. Se opresc montele cu mai mult de 1 an și jumătate înainte de lichidarea efectivului. Se depopulează în funcție de starea fiziologică și de întreținere a animalelor. Lunar se identifică animalele cu forme clinice și se trimit la abator. Gospodăriile populației în care sunt animale reacționate pozitiv intră în regim de asanare prin extracție și se elimină în cel mai scurt timp. Bovinele rămase în curtea respectivă se controlează serologic din 3 în 3 luni iar reagenții se elimină. Supravegherea pasivă constă în investigarea oricărei tumori obserate la examenul clinic în cursul inspecției cărnurilor în abator sau la necropsie.

Capitolul II

Contribuții personale

Cunoscută și sub numele de „leucemie”, leucoza enzootică bovină este o boală infecțioasă caracterizată prin proliferarea continuă și necontrolată a mezenchimului activ, leziunea principală fiind hiperplazia și metaplazia sistemului reticulo-endotelial.

Observații privind diagnosticul supravegherea și combaterea în leucoza enzootică bovină

2.1 Scopul lucrării

Leucoza enzootică bovină este o boala virală a bovinelor adulte caracterizată prin neoplazia limfocitelor și a limfonodurilor. Cunoscută de aproape 130 de ani, boala are o raspândire mondială cu tendința de extindere. Cele mai numeroase cazuri de leucoză bovină sunt înregistrate în țările baltice: Danemarca, Suedia, Finlanda, Rusia, Polonia, etc. Prezența leucozei este pusă pe seama importului de taurine din țări cunoscute ca „leagăne ale leucozei bovine”, iar în interiorul țărilor prin mișcările de animale bolnave, în special transmiterea orizontală a bolii, mai puțin cea verticală. În România leucoza a fost diagnosticată pentru prima dată de Suțeanu in 1954, la un taur de de rasă Roșie daneză, ulterior cuprinzând toate regiunile țării, cu o mai mare răspândire după 1990 odată cu desființarea fermelor de stat. Supravegherea dificilă a micilor exploatații și a mișcării animalelor bolnave au dus la o creștere alarmantă a numărului de cazuri între anii 2001-2003. În același timp constituie un risc potențial de infecție pentru om fiind cunoscută capacitatea virusului leucozei enzootice bovine de a activa oncogene celulare implicate in cancerogeneză. Importanța economică este dată de evoluția cronică și incurabilă a bolii cu scăderea in greutate, scăderea producției de lapte, afectarea dezvoltării normale a animalelor. Eliminarea exemplarelor cu valoare zootehnică ridicată de la procesul de selecție si reproducție este un alt efect major pe plan economic. Cheltuielile cu măsurile de supraveghere serologică, asanare prin extracție a focarelor, dezinfecție, sunt de asemenea majore. În cazul fermierilor pierderile sunt date de măsurile de carantină cu imposibilitatea comercializării laptelui și a subproduselor lactate de la animalele bolnave și dirijarea spre abator a animalelor diagnosticate pozitiv cu plata unor despăgubiri. De asemenea se recomandă și sacrificarea vițeilor proveniți de la mamele testate pozitiv. În lucrarea de față ne-am propus să facem investigații în două localități din județul Suceava privind diagnosticul clinic, anatomopatologic și de laborator al leucozei enzootice bovine, în perioada 2001-2007. Lucrarea are scopul de a prezenta evoluția în dinamică a leucozei enzoootice bovine, stabilirea incidenței și a prevalenței bolii cu aspecte de ordin epidemiologic și statistic concludente.

2.2 Materiale și metode

Investigațiile s-au efectuat pe o perioadă de șapte ani (2001-2007), în două localități (notate A și B) din județul Suceava, pe un efectiv total de 2979 bovine, din care 2251 vaci și junici. De asemenea s-au efectuat investigații generale privind întregul efectiv al județului Suceava (178.217 bovine), în scop comparativ. Investigatiile clinice au constat în examinarea clinică a două animale testate pozitiv ( în anul 2007), cu efectuarea de foi de observație. Investigațiile epidemiologice au constat în efectuarea statisticilor și reprezentărilor grafice privind structura efectivelor din cele două localități, pe categorii de vârstă, sex; evoluția efectivului de bovine între anii 2001-2007. De asemenea s-au efectuat statistici privind numărul de probe recoltate, numărul de cazuri pozitive în aceași perioadă de timp. S-au efectuat cercetări privind incidența leucozei în perioada dată, în funcție de vârstă, durata măsurilor de asanare a focarelor, sursele de infecție, ancheta epizootologică, dinamica evoluției L.E.B. În scop comparativ s-au efectuat și statistici pe întreg județul Suceava cu privire la incidența bolii, dinamica evoluției în perioada 2001-2007. Cercetarile s-au efectuat pe baza evidențelor existente la circumscripțiile sanitar veterinare din cele două localități, precum și la Direcția Sanitar Veterinară și pentru Siguranța Alimentelor Suceava. În cele două localități bovinele au fost examinate serologic prin testul E.L.I.S.A. și I.D. in gel de agar, urmărindu-se cele reacționate pozitiv și confirmate ca bolnave de leucoză enzootică bovină, cu scopul de a fi izolate, examinate clinic și apoi dirijate spre sacrificare în abatoarele autorizate pentru această acțiune. S-au recoltat probe de sânge în vederea examinării serologice de la toate bovinele în vârstă de peste 24 de luni din efectivele celor două localități ( gospodariile populației și microferme), odată pe an, primăvara, la un interval mai mic de 24 de luni de la ultima recoltare. De asemenea s-au recoltat probe de la toate bovinele din gospodăriile supuse asanării prin extracție, de două ori pe an, la interval de 4 luni. De la taurii de reproducție s-au recoltat probe de două ori pe an pentru a fi testați prin E.L.I.S.A și confirmați prin I.D. Probele recoltate au fost trimise la LSVSA din cadrul DSVSA Suceava pentru examinare serologică. S-au utilizat testele E.L.I.S.A. și I.D. în gel de agar. Principiul testului E.L.I.S.A. constă în fixarea antigenului pe fundul godeurilor microplacilor; serurile de testat se diluează 1/20 sau 1/50, și se incubează în godeuri; dacă serul de testat conține anticorpi anti-BLV se formează complexe imune BLV-anticorp, deci anticorpii se fixează pe fundul godeurilor microplăcilor. După spălare, o imunoglobulină antianticorp bovin cuplată cu o enzimă se incubează în microplăci; acest conjugat se fixează pe complexele imune. După o nouă spălare, un substrat enzimatic (TMB) pune în evidență prezența enzimei, prin apariția culorii bleu care virează în galben după adăugarea soluției stop. Intensitatea culorii este în funcție de titrul anticorpilor din serul de testat. Limita de pozitivitate a kit-ului este definită de un ser limită (ser de referință pozitiv) care corespunde standardului european (ser din șeptele indemne). Acest ser este introdus în fiecare microplacă de reacție. Se realizează amestecuri de 10 seruri de la animale de testat, astfel cu un kit se testează 940 bovine. Amestecurile găsite pozitive sunt reluate și se testează individual. Comparația se realizeză cu 10 martori pozitivi și negativi (seruri de referință). Citirea plăcilor se face la o densitate optică de 450 nm (serul de referință pozitiv dă valoarea 0,350). Se calculează la fiecare probă %E/P=DO 450 a probei/DO 450 a serului de referință pozitiv x100. Orice probă a cărui %E/P este mai mare de 100% va fi considerată ca provenind de la o bovină sau grup de bovine care a fost în contact cu virusul BLV. Animalele testate pozitiv prin testul E.L.I.S.A. s-au retestat pentru confirmare prin imunodifuzie în gel de agar. În cazul neconcordanței dintre E.L.I.S.A și I.D este prevăzută retestarea prin I.D la 30 de zile de la prima recoltare. Testul PCR este utilizat rar, în caz de litigii. Testul de imunodifuzie în gel de agar evidențiază anticorpii seroprecipitanți de la animalele infectate cu virusul leucozei enzootice bovine. Testul se execută în gel de agar cu 8,5% NaCl, repartizat 15 ml în plăcile Petri. Se execută godeuri în agar – unul central și 6 periferice. În godeul central se pune antigenul rehidratat în diluant, în goderile 1,3,5 serul pozitiv rehidratat, în godeurile 2,4,6 serurile de testat. Citirea reacției se face la 24, 48, 72 de ore, intensitatea reacției variind în funcție de titrul anticorpilor. Reacția pozitivă – linia de precipitare cu proba de testat este clară, netă și echidistantă față de godeurile cu reactanți. Linia de precipitare de control se unește cu linia dată de serul de testat și antigenul din set formând o linie continuă. Gospodăriile cu bovine depistate pozitiv prin E.L.I.S.A și confirmate prin I.D au fost supuse carantinei de gradul II și asanării prin extracție sau depopulare totală. S-a aplicat planul de măsuri conform legislației sanitar veterinare în vigoare. Animalele bolnave au fost dirijate spre abatorizare. În abator s-au efectuat examenue anatomopatologice și s-au recoltat probe pentru efectuarea examenului histopatologic de confirmare a leucozei enzootice bovine (limfogangliuoni retrofaringieni, bronsici, prescapulari, precrurali, mezenterici, porțiuni de ficat, inimă, rinichi, splină, porțiuni din intestin cu ganglioni mezenterici).

2.3 Rezultate și discuții

Investigațiile s-au efectuat pe o perioadă de șapte ani (2001-2007), în două localități (notate A și B) din județul Suceava, pe un efectiv total de 2979 bovine, din care 2251 vaci și junici. Localitățile luate în studiu (A și B) fac parte din județul Suceava, una dintre ele la periferie, iar cealaltă la o distanță de 25 km, fiecare cu câte un număr de șase sate. Studiile s-au efectuat pe efectivele de animale existente în cele două localități și s-au folosit și evidențele statistice existente în circumscripțiile respective, sau furnizate de DSVSA Suceava. Tabel nr.2 Structura efectivelor pe grupe de vârstă în local. A și B

In localitatea A efectivul era de 1559 bovine în anul 2006 și de 1420 în anul 2007, iar în localitatea B de 1893 bovine în anul 2006, respectiv 1559 în anul 2007. În cele două localități predomină bovinele de peste 24 luni (peste 65%), iar tineretul între 2-12 luni reprezintă 12-15% din efectiv, fiind mai numeroase în localitatea B (fig.nr.8). Graficul și tabelul alăturat arată faptul că tineretul taurin este crescut pentru prasilă proprie fiind mai rare achizițiile de prasilă din fermele specializate. Mai frecvent sunt achiziționate bovine din aceeași localitate și din localitațile învecinate.

În ambele localități se cresc bovine MBR (metis Bălțată Românească), cu producții de lapte medii rezistente la condițiile de mediu și mai puțin alte rase ( Holstein, Bălțată cu Negru Românească).

Fig. nr.8 Structura efectivelor pe grupe de vârstă

În ceea ce privește vârsta bovinelor, acestea sunt ținute în general până la 10-11 ani, chiar 12-14 ani. Investigațiile au cuprins și structura pe sexe a taurinelor din cele două localități. În localitatea A efectivul de bovine este format în majoritate din femele de peste 24 de luni (900 capete), crescute pentru producția de lapte și un singur taur de peste 24 de luni autorizat pentru reproducție (graficul nr.9). Fig.nr.9 Structura efectivului în funcție de sex în localitatea A

Între 12-24 luni sunt 169 masculi crescuți pentru producția de carne (abatorizare) și 163 femele, prăsilă proprie. Tabel nr.3 Structura efectivului în funcție de sex în localitatea A

Tineretul de 2-12 luni este constituit din 81 masculi și 80 femele, provenite de la femelele proprii. Taurinele sunt crescute în exploatații mici de maxim 4-5 capete (vaci producătoare de lapte), într-un mod dispersat și neorganizat. Pe raza localității există o singură microfermă cu 50 de capete. Achizițiile de bovine se fac în special din aceeași localitate dar și din târgurile și oboarele din localitațile învecinate. Astfel se pot introduce animale bolnave în efectivul existent sau se pot contamina prin contactul direct sau indirect cu animalele din alte localități. În localitatea B structura efectivului este asemănătoare cu cea din localitatea A, cu un număr de 992 femele de peste 24 de luni. Tabel nr.4 Structura efectivului în funcție de sex în localitatea B

Tineretul este format în proporții sensibil egale din masculi și femele, în total 208 capete cu vârste între 2-12 luni, respectiv 392 cu vârste între 12-24 luni (fig nr.10). Creșterea bovinelor se face în exploatații private cu un numar mic de animale, în general pentru producția de lapte și mai puțin tauri pentru îngrășat din cauza rentabilității scăzute. Poziția mai izolată a localității permite protejarea față de eventualele contaminări de la bovine infectate din localitățile vecine sau cu ocazia târgurilor și oboarelor.

Fig. nr.10 Structura efectivului în funcție de sex în localitatea B

Investigațiile epidemiologice au urmărit efectuarea acțiunilor de supraveghere activă conform planului strategic de supraveghere și combatere a leucozei enzootice bovine emis de ANSVSA în colaborare cu DSVSA, pentru anii 2006 și 2007 privind recoltarea de probe de sânge șî analiza lor la LSVJ. Tabel nr.5 Planul de supraveghere a LEB pe anul 2006 în local. A și B

Astfel în anul 2006 din efectivul total de 1559 de capete din localitatea A, cu un efectiv matcă (vaci și junici) s-au recoltat un număr de 700 de probe de sânge în perioada aprilie-mai trimise către DSVSA, respectiv LSVJ Suceava (fig.nr.11). Fig.nr.11 Planul de supraveghere a LEB pe anul 2006 în local. A și B

Probele au fost recoltate în eprubete individuale cu vacuum cu ace individuale pentru a preveni transmiterea leucozei de la un animal la altul. Numărul de probe ce s-au recoltat s-a stabilit în funcție de numârul de vaci și junici de peste 24 de luni. După recoltare probele au fost ținute în condiții corespunzătoare de temperatură pentru a nu se deprecia fiind trimise cât mai repede la laboratorul sanitar veterinar județean.

În localitatea B, care avea un efectiv total de 1893 capete din care 1001 vaci și junici (matcă) s-au recoltat 1001 probe de sânge în vederea supravegherii serologice active și depistârii anticorpilor anti-BLV, din ser prin testele rapide E.L.I.S.A. și I.D. în gel de agar. Recoltarea s-a făcut de la femelele de peste 24 de luni, iar taurii autorizați pentru montă s-au testat de două ori pe an. Examenele s-au efectuat pe aceleași probe care s-au recoltat pentru bruceloză. În focarele supuse asanării prin extracție s-au recoltat probe și de la taurinele de peste 12 luni de două ori pe an la interval de 4 luni. Planul de supraveghere a fost elaborat de A.N.S.V.S.A. și DSVSA iar punerea lui în aplicare s-a făcut de către medicul veterinar împuternicit din cadrul CSV împreună cu medicul veterinar zonal. Expertiza de diagnostic s-a efectuat la LNR din cadrul IDSA. Tabel nr.6 Planul de supraveghere a LEB pe anul 2007

În anul 2007 s-a constatat scăderea efectivelor de bovine din cele douâ localități cu 10 respectiv 20 %. Astfel în anul 2007 conform planului de supraveghere activă a efectivelor de taurine, în localitatea A din totalul de 1420 de bovine, din care un efectiv matcă de 895 vaci și junici, s-au recoltat un număr de 700 de probe de sânge. În localitatea B în același an din efectivul total de 1595 capete taurine, din care 1001 vaci și junici s-au recoltat un număr de 895 probe de sânge. S-a constatat că față de anul 2006 a scăzut efectivul matcă și deci și numărul de probe recoltate (fig.nr.12).

Fig.nr.12 Planul de supraveghere a LEB pe anul 2007 în local. A și B În anul 2007 datorită apariției a două focare de leucoză bovină s-au recoltat probe de la toate taurinele din exploatațiile respective, inclusiv tineret. Supravegherea pasivă – monitorizarea datelor despre boală s-a făcut de către medicul veterinar oficial din cadrul DSVSA prin întocmirea unui raport trimestrial transmis la ANSVSA de către DSVSA. S-au efectuat investigații epidemiologice în cele două localități pe o perioadă de 7 ani, între 2001-2007, pe baza evidențelor CSV din cele două localități și conform datelor centralizate de DSVSA Suceava. Depistarea s-a făcut prin teste serologice rapide ELISA și ID in gel de agar Tabel nr.7 Incidența LEB în județul Suceava între anii 2001-2007

Fig.nr.13 Evoluția incidenței LEB în jud Suceava

În perioada analizată se constată un vârf al incidenței bolii în anul 2001, cu un număr de 264 animale testate pozitiv prin examenele serologice. În perioada 2002-2004 incidența bolii se menține la un nivel ridicat dar în scădere evidentă față de anul precedent (fig. nr.13). În urma aplicării măsurilor de asanare a focarelor și astfel de evitare a difuzării bolii în efective în anii 2005 și 2006 s-a redus simțitor numărul de cazuri pozitive (39, respectiv 24). De asemenea prevalența bolii s-a redus prin eliminarea din efectiv în același an a animalelor confirmate cu LEB. În anul 2007 s-au depistat doar 4 cazuri pozitive, dintre care două în localitatea A, iar în anul 2008 până în prezent jud Suceva este indemn de LEB. În aceeași perioadă de timp în cele două localități supuse studiului epidemiologic s-au înregistrat focare de LEB. Tabel nr.8 Incidența LEB în perioada 2001-2007 în local A și B

Localitatea A a fost indemnă de leucoză bovină până în anul 2001 când s-a semnalat primul caz de boala într-o exploatație. În anul 2002 a crescut incidența bolii depistându-se 5 animale infectate. După aplicarea măsurilor de asanare și stingerea focarelor de boală în anii 2004 și 2006 nu s-au înregistrat cazuri de boală în efectiv (fig. nr.14). În anul 2005 s-a depistat pozitiv serologic un singur animal, iar ultimele cazuri au fost în anul 2007, animalele fiind achiziționate din alte județe unde au și fost depistate inițial. Reprezentarea grafică a incidenței LEB arată caracterul enzootic al bolii, staționar cu un număr scăzut de cazuri și cu o evoluție cronică, insidioasă (fără semne clinice) în focare mici cu o difuzibilitate scăzută înafara focarului

Fig.nr.14 Evoluția incidenței LEB în local. A și B În localitatea B luată în studiu, până în anul 2001 s-a semnalat un singur caz de leucoză bovină. În perioada 2001-2004 incidența LEB a crescut foarte mult (de la 3 cazuri în 2001 la 6 cazuri în 2003, respectiv 5 în anul 2004). Din figura de mai sus reiese că în perioada 2001-2004 au fost un număr de 16 animale ce au reacționat pozitiv la testele serologice. Numărul mare de cazuri a fost determinat de transmiterea orizontală a bolii în efectiv prin contact direct, indirect; de asemenea întârzierea sacrificării animalelor a contribuit la menținerea virusului leucozei bovine în efectiv și contaminarea altor animale. În urma asanării focarelor și efectuarii dezinfecției finale localitatea a devenit indemnă din anul 2005. Comparativ, incidența leucozei bovine a fost mai mare în localitatea B față de localitatea A, însă în cea din urmă au continuat să fie depistate cazuri până în prezent. Un rol important în menținerea focarelor de boală în localitatea A l-a avut localizarea acesteia în apropierea târgurilor de animale și intrările și ieșirile frecvente de animale din efectiv. Astfel 1,5% din totalul de bovine pozitive din jud Suceava s-au depistat în localitatea A, iar 2,4% în localitatea B.. S-au efectuat cercetări statistice privind vârsta la care animalele au fost depistate pozitiv prin testele serologice. S-au împărțit animalele în următoarele categorii de vârstă: 0-3 ani, 4-8 ani, 9-12 ani, peste 12 ani (fig. nr.15). Tabel nr.9 Incidența LEB în local A și B în funcție de vârstă

În localitatea A cele mai multe dintre taurinele depistate pozitiv fac parte din grupa de vârstă 4-8 ani (șapte), celelalte au vârste cuprinse între 9 și 12 ani; nu s-au semnalat cazuri de leucoză la cele mai mici de 3 ani sau peste 12 ani. În localitatea B incidența leucozei în funcție de vârstă este asemănătoare cu cea din localitatea A. Astfel, 11 taurine pozitive au vârste cuprinse între 4 și 8 ani, două sunt în categoria 9-12 ani iar trei dintre ele între 0-3 ani (2 ani). Din statisticile realizate și prezentate în graficul de mai jos reiese ca o concluzie faptul că leucoza enzootică bovină este o boală care afectează în special bovinele mature, mai frecvent între 4 și 8 ani dar și cele de 9-12 ani. Cazurile de îmbolnavire la tineretul sub 3 ani și la bovinele de peste 12 ani sunt rare. La tineret este mai dificilă depistarea lor deoarece nu se recoltează probe de sânge pâna la 24 luni decât din focarele supuse asanarii prin extracție. .

Fig.nr.15 Incidența LEB în funcție de vârstă În ceea ce privește sexul animalelor îmbolnăvite, acestea au fost reprezentate în totalitate de femele. În cadrul investigațiilor epidemiologice în cele două localitați s-au cercetat originile si căile de introducere a bolii (fig. nr.16). Pe baza anchetelor epidemiologice s-a stabilit că principala sursă de contaminare a bovinelor depistate pozitiv l-a reprezentat contactul cu bovine cu infecție inaparentă din cadrul efectivului localității, posibil la pășune (5 cazuri în localitatea A, respectiv 10 în localitatea B).

Tabel nr.10 Originea și căile de introducere a bolii

În ceea ce privește sexul animalelor îmbolnavite, acestea au fost în toate cazurile femele. Fig. nr.16 Originea și căile de introducere a bolii în local A și B O altă cale de introducere a leucozei în efectiv a reprezentat-o contactul cu bovine provenite din alte localități cu ocazia târgurilor și oboarelor precum și contactul cu bovine infectate ce au tranzitat localitățile A și B (trei bovine în localitatea A și același număr în localitatea B). De asemenea achiziția clandestină de bovine deja bolnave din alte localități a constituit o sursă importantă (două, respectiv trei animale fiind achiziționate în acest mod), precum și utilizarea de ace și instrumentar nesterile. Pe baza numărului de cazuri nou apărute în fiecare dintre anii din perioada 2001-2007 s-a calculat incidența leucozei în fiecare localitate și în județul Suceava (tabel nr.11). Tabel nr.11 Incidența LEB în perioada 2001-2007 în jud. Suceava și local. A și B

Din graficul de mai jos se constată că în toți cei șapte ani incidența leucozei enzootice bovine a fost mai mare decât media pe județul Suceava. Cea mai mare incidență a bolii s-a înregistrat în anul 2002 în localitatea A, respectiv 2004 în localitatea B. Numărul mare de exploatații contaminate (una pentru fiecare animal depistat pozitiv) a favorizat extinderea bolii în efectivele localităților și a îngreunat aplicarea măsurilor de asanare. Rata incidenței s-a menținut la un nivel relativ constant, fără variații mari, cu un caracter enzootic. Anchetele epidemiologice efectuate au fost de tip transversal, arătând răspândirea leucozei în efective la un moment dat, fără a cunoaște numărul de animale ce se vor infecta până la următoarea determinare. În concluzie prevalența leucozei a fost mai mare decât incidența acesteia (prevalența reprezentând numărul total de cazuri existente în efectiv pe perioada unui an, incluzând cazurile din anul precedent care nu au fost încă scoase din efectiv precum și cazurile de boală nou apărute). Fig. nr.17 Dinamica evoluției L.E.B. în local. A și B Din figura de mai sus reiese caracterul enzootic al evoluției în timp a leucozei în cadrul celor două localități luate în studiu. Curbele de nivel indică dinamica evoluției bolii în funcție de timp pe abcisă și de rata incidenței (exprimată procentual) pe ordonată. Evoluția în timp este similară în localitățile A și B cu nivele crescute în anii 2002-2004 și scăzute în 2005-2006. Între anii 2005-2008 localitatea B a avut o rată a incidenței zero iar localitatea B a oscilat cu valori mici. În concluzie gradul de variație a bolii a fost scăzut în perioada dată, chiar dacă numărul cazurilor depistate a fost mare. S-a comparat dinamica bolii în cele două localități (media incidenței în perioada 2001-2007) cu cea a județului Suceava (fig nr.18).

Fig.nr.18 Dinamica comparativă a evoluției LEB În județul Suceava în perioada 2001-2007 evoluția bolii a fost în continuă scădere, fără oscilații majore, tinzând spre eradicarea leucozei și indemnizarea efectivului de bovine. Evoluția LEB din cele două localități a urmărit evoluția medie din județ cu tendința de eradicare totală din efective. În urma efectuării acțiunilor de supraveghere în perioada 2001-2007 s-au depistat prin examene serologice (ELISA și ID) un număr de 26 bovine infectate cu virusul leucozei bovine în diferite faze de evoluție. S-au făcut investigații în anul 2007 când au apărut două focare de leucoză bovină în localitatea A. Direcția sanitar veterinară a emis buletine de analiză cu rezultatele examenelor serologice (probe negative și probe pozitive) catre CSV de origine. Pe baza buletinelor de analiză care au confirmat depistarea unor animale reacționate pozitiv (două animale) la testele serologice, medicul veterinar concesionar împreună cu medicul zonal a emis actul sanitar veterinar de declarare a bolii B 108 (leucoză enzootică bovină). Actul sanitar veterinar a cuprins localizarea bolii (curțile sau locurile contaminate, numele proprietarilor, adresa), efectivele de animale existente în locurile contaminate (specia, categoria, numărul lor), originea bolii, dacă au fost animale moarte, tăiate de necesitate. Pe baza actului sanitar-veterinar de declarare a bolii primarul localității a emis dispoziția de declarare a bolii ( leucoză bovină) în localitate și de instituire a măsurilor de carantină de gradul III, a aprobat programul de combatere a bolii acordând sprijinul necesar pentru aplicarea programului de măsuri. De asemenea primarul a dispus activarea comandamentului antiepizootic local. Ancheta epidemiologică a fost realizată de către medicul veterinar zonal. Aceasta a cuprins date referitoare la focar (numele bolii, proprietarul animalelor, localitatea, momentul apariției bolii, momentul primelor suspiciuni, vârsta animalelor afectate, categoria (vaci de lapte) . S-au găsit două animale depistate pozitiv din două curți din localitatea A achiziționate recent de către proprietari din județele Iași și Vaslui. În curțile respective mai existau două bovine din prăsilă proprie. Investigațiile clinice s-au efectuat pe două animale (bovine de 4 respectiv 6 ani, metiși Bălțată Românească), depistate pozitiv conform buletinelor de analiză prin testul E.L.I.S.A. și confirmate prin I.D. Animalele au fost depistate în localitatea A în anul 2007 în urma acțiunilor de supraveghere. Bovinele depistate au fost achiziționate clandestin din județul Iași, respectiv Vaslui, unde au fost inițial confirmate ca fiind pozitive. În urma examenului clinic s-au constatat semne generale: apatie, scăderea apetitului, scăderea producției de lapte, slăbire și o stare de întreținere necorespunzătoare (fig. nr.19); la examenul limfonodurilor prescapular, submandibular, retromamar nu s-au observat modificări de volum sau consistență. Fig. nr.19 Bovină MBR depistată pozitiv cu VLB Slăbirea animalului a fost o suspiciune de leucoză enzootică bovină, fiind însă posibilă și prezența altor afecțiuni (parazitoze), urmând a se stabili diagnosticul cert prin examen de laborator. Conform anamnezei bovinele au fost achiziționate din județele vecine fără aprobarea DSVSA, animalele aflându-se în carantină, iar focarele supuse asanării prin extracție (abatorizare în centrele autorizate). În urma examenelor clinice efectuate s-a stabilit că nu sunt semne clinice specifice leucozei enzootice bovine (animalele nu sunt într-o fază avansată a bolii) și este necesară efectuarea examenelui macroscopic anatomopatologic după tăiere în abator și recoltarea de probe pentru confirmarea prin examen histopatologic la LSVJ Suceava. Originea și căile de introducere a bolii – (posibil prin contactul cu animale bolnave), dacă în efectiv a mai evoluat boala (da), dacă în jurul focarului au existat și alte focare. S-a stabilit că boala a fost introdusă prin animale nou achiziționate, care nu au fost ținute în carantină profilactică, nefiind introdusă pe cale indirectă (mijloace de transport, furaje, păsări, etc). Fig.nr.20 Bovină depistată pozitiv -slăbire accentuată Nu s-a cunoscut cu ce animale s-a făcut monta și care era starea de sănătate a acestora. S-a constatat că a fost posibilă difuzarea bolii în perioada de incubație și difuzarea prin mișcări de animale. S-a constatat că starea de întreținere a animalelor era necorespunzătoare, la fel și condițiile de microclimat din adăposturi (neefectuarea curățeniei mecnice și prezența rozătoarelor). S-au efectuat acțiunile imunoprofilactice specifice bovinelor. Apariția bolii nu s-a datorat unei neglijențe sau unei erori umane. Medicul veterinar concesionar împreună cu medicul veterinar zonal au elaborat programul de măsuri privind combaterea leucozei enzootice bovine. In localitatea A au fost declarate două focare de LEB în baza buletinelor de analiză emise de LSVJ Suceava. În localitate bovinele sunt crescute în gospodăriile populației, neexistând colectivități de animale. Pentru combaterea bolii și prevenirea difuzării ei comandamentul antiepizootic a dispus aplicarea unui plan de masuri. Planul de măsuri aplicat în localitățile A și B prevedea următoarele:

bovinele reacționate serologic pozitiv pentru LEB vor fi dirijate la tăiere sub control sanitar veterinar în cel mai scurt timp;

se interzice vânzarea înstrăinarea sau tăierea animalelor;

se interzice consumul public al laptelui și a produselor lactate provenite de la animalele reacționate serologic pozitiv la LEB, consumul acestora se face doar în familie, numai după fierbere, interzicându-se ecremarea laptelui;

se vor anunța în scris punctele de colectare a laptelui din comună despre propietarii care dețin animale serologic pozitive la LEB, interzicandu-se colectarea acestuia;

se anunță primăria pentru a se interzice eliberarea biletelor de proprietate la gospodăriile cu bovine reacționate serologic pozitiv, pentru alte destinații decăt în abatoarele abilitate;

se interzice pășunatul acestor animale pe pășunele comunale;

gunoiul de grajd va fi sterilizat biotermic în platformă minim trei luni, după care va fi folosit;

se vor achiziționa bovine doar din zonele indemne de LEB, iar acestea vor fi însoțite de acte care să ateste starea de sănătate a acestora;

se va anunța medicul veterinar de circumscripție și primaria în termen de 48 de ore de fiecare animal nou introdus în comunâ;

se interzice practicarea activităților sanitar-veterinare de către persoane neautorizate, care pot difuza prin instrumentarul nesterilizat boala la alte animale;

bovinele reacționate pozitiv se vor dirija către abatoare în vederea sacrificării, unde o comisie de medici veterinari din partea DSVSA Suceava și din partea abatorului vor recolta probe de ganglioni și porțiuni de organe pentru examenul histopatologic;

după tăierea animalelor în fiecare curte se va face o curățenie mecanică riguroasă și se vor face trei dezinfecții consecutive la interval de 15 zile, după care se vor recolta tampoane în vederea efectuării testelor de sanitație, dacă testul este negativ se pot stinge focarele de boală și se poate face repopularea;

dacă în curțile contaminate există și alte taurine peste 6 luni care nu au reacționat pozitiv la LEB se vor preleva probe de sânge din 3 în 3 luni pentru examene de laborator, pănă când timp de 9 luni nu va reacționa pozitiv nici una din taurinele rămase în gospodărie;

atestarea indemnității efectivului se va face de către DSVSA Suceava.

Înainte de sacrificarea animalelor s-a stabilit valoarea de înlocuire a animalelor bolnave de LEB. Această comisie a fost constituită din medicul veterinar zonal, primarul localității și reprezentanți de la ORSA și Oficiul de consultanță agricolă. Aceștia au stabilit prin metoda punctelor valoarea genetică, dezvoltarea corporală, conformația și producția și în final suma de despăgubire conformă cu valoarea de piață a animalelor. S-a aplicat programul de măsuri de mai sus iar animalele au fost sacrificate într-un abator autorizat. După sacrificare în abator a animalelor s-au întocmit fișe de tăiere pentru fiecare animal. S-a făcut examenul anatomopatologiv al animalelor după tăiere. Nu s-au semnalat modificări macroscopice vizibile Destinația cărnii a fost pentru consum după prelucrare în regim termic. S-au recoltat probe pentru examenul de laborator: ganglioni, porțiuni din organe, ganglioni mezenterici. Unitatea care a achiziționat animalele a întocmit un borderou de achiziții care specifica propriietarul animalelor, motivul pentru care se sacrifică (pozitive LEB, conform buletinelor de analiza) și suma care se plătete pentru bovine. Decontul pentru stabilirea și plata despăgubirilor ce se cuvin deținătorilor de animale a fost întocmit de aceeași comisie. S-a stabilit suma recuperată prin sacrificarea în abator a animalelor și restul sumei ce trebuie plătită pănă la atingerea valorii de înlocuire. Această sumă s-a plătit din fondul de combatere a epizootiilor. După sacrificarea animalelor s-au efectuat trei dezinfecții succesive la interval de 15 zile cu Virkon S după o prealabilă curățenie mecanică. S-au recoltat teste de sanitație stafilococice după decontaminarea finală a adăposturilor și au fost trimise la LSVJ. S-a interzis popularea adăposturilor pănă la primirea rezultatului testului stafilococic. Deoarece testele de sanitație au fost negative, medicul veterinar concesionar a emis actul sanitar veterinar de închidere a epizootiei cu situația centralizată la sfârșitul evoluției bolii (două curți contaminate, două animale îmbolnăvite, două animale tăiate de necesitate), însoțit de un referat. Pe baza referatului medicului veterinar primarul localității a emis dispoziția de stingere a focarului de leucoză enzootică bovină de pe raza localității. Masurile de asanare a focarelor de leucoză bovină din cele două localități au avut o durată variabilă așa cum este prezentat în figurile de mai jos : Fig.nr.21 Durata asanării focarelor de LEB în local A În localitatea A au fost semnalate trei enzootii de LEB între anii 2001-2005, 2005-2006 și 2007-2008 (fig.nr 21). În perioada 2001-2007 în localitatea A s-au înregistrat mai multe focare de leucoză bovină la intervale scurte de timp. În aceste condiții a rămas permanentă starea de carantină până la sacrificarea ultimului animal reacționat pozitiv și efectuarea deziinfecțiilor finale cu prelevarea testelor de sanitație. Asanarea focarelor a fost întârziată de refuzul și amânarea sacrificării animalelor infectate de câtre proprietarii nemulțumiți. În total în perioada 2001-2005 au fost sacrificate un numâr de 8 animalele reacționate pozitiv la testele serologice. Ultimele focare apărute au fost în anul 2007 (două bovine), fiind sacrificate în același an, la scurt timp de la depistare.

Fig nr.22 Durata asanării focarelor de LEB în local. B În localitatea B leucoza enzootică bovină a evoluat în perioada 2001-2005 , boala fiind declarată și închisă de două ori, în total de 16 animale îmbolnăvite. Depistarea unui numâr mare de animale serologic pozitive între anii 2002-2005 a împiedicat declararea închisă a bolii în localitate. Bovinele reacționate pozitiv la testele serologice au fost sacrificate într-un abator specializat iar proprietarii au fost despăgubiți . După efectuarea a trei dezinfecții succesive la interval de 15 zile șî răspunsul negativ la testele stafilococice de sanitație s-a declarat închisă enzootia de LEB din localitatea B. După închiderea enzootiei în anul 2005 nu s-au mai semnalat cazuri de leucoză până în perioada actuală. Situația centralizată la sfârșitul evoluției leucozei enzootice bovine în cele două localități este prezentată în figura de mai jos (fig.nr.23). Tabel nr.12 Situația centralizată la sfârșitul evoluției bolii (anul 2007)

Fig. nr.23 Situația centralizată la sfârșitul evoluției LEB

În localitatea A au fost un număr de 10 curți contaminate (10 focare) și tot atâtea animale îmbolnăvite și tăiate de necesitate. Nu au fost animale moarte. În localitatea B au fost 14 curți contaminate (focare) cu 16 animale îmbolnăvite dintre care 15 tăiate de necesitate, unul mort și două înstrăinate în mod ilegal. În general focarele de leucoză bovină au fost de mici dimensiuni, cu un singur animal depistat pozitiv, doar unul cu două animale depistate din aceeași curte, ceea ce demonstrează difuzibilitatea redusă a bolii. În majoritatea curților contaminate, înafara animalului depistat pozitiv mai erau și alte bovine de diferite vărste. Nu s-au constatat contaminarea acestora de la animalul bolnav. Vițeii obținuți de la mamele depistate pozitiv au fost și ei sacrificați în abator, iar celelalte bovine au fost examinate serologic din trei în trei luni până ce timp de nouă luni nu s-au depistat animale pozitive cu VLB. Sacrificarea bovinelor s-a făcut într-un abator autorizat în prezența medicului de abator și a unui reprezentant al DSVSA Suceava. Tabel nr.13 Rezultatele examenului de abator

După efectuarea examenului clinic animalele au fost sacrificate și s-a făcut examenul de abator. Conform fișelor de tăiere ale bovinelor pozitive la un număr de două animale în localitatea A și patru în localitatea B s-au observat leziuni macroscopice specifice leucozei enzootice bovine (fig. nr.24). Cea mai frecventă leziune a fost mărirea în volum a limfonodurilor. S-au recoltat probe pentru examenul de laborator (histologic pentru LEB). Probele au constat în limfoganglioni, porțiuni din organe și organe (cord, splină, rinichi), porțiuni din intestin cu ganglioni mezenterici. Fig.nr.24 Rezultatele examenului de abator În concluzie, doar un număr mic de animale au prezentat leziuni macroscopice vizibile specifice leucozei enzootice bovine (10-20%). Prezența sau absența leziunilor a fost determinată de stadiul bolii în care se aflau animalele. În cazul celor cu stadii avansate (stadiile III-IV, de leucemie, respectiv limfom generalizat) s-a observat mărirea bilaterală în volum a limfonodurilor șî rar tumori sarcomatoase în organe. LSVJ Suceava a efectuat examenele histologice pentru leucoza bovină confirmănd în toate cazurile diagnosticul de LEB. Frecvent leziunile constatate au fost hiperplazia foliculilor limfoizi(limfonod), infiltrație limfoblastică interstițială (cord), hiperplazia foliculilor splenici.

2.4 Concluzii

Din rezultatele investigațiilor epidemiologice, serologice, clinice, de aplicare a măsurilor de prevenire și combatere efectuate atât în scop de diagnostic a LEB cât și pentru supravegherea epizootologică a efectivelor în localitățile A și B s-au desprins urmatoarele concluzii și recomandâri:

incidența leucozei în localitățile A și B a avut valorile cele mai mari între anii 2003-2005, diminuându-se treptat până în prezent;

incidența leucozei enzootice bovine este influențată de vârsta, sexul și tipul productiv al animalelor – leucoza afectează în special taurinele mature (de 4-8 ani), apoi cele de 9-12 ani, mai rar cele tinere și bâtrâne, în special vacile de lapte;

sursele de infecție a bovinelor au fost contactul direct sau indirect cu purtători asimptomatici din localitate sau localitățile învecinate (cu ocazia târgurilor de animale), sau prin efectuarea de achiziții clandestine de bovine infectate;

dinamica evoluției leucozei în cele două localități a avut un caracter enzootic, iar incidența bolii a scăzut în ultima perioadă pâna la dispariția totală, identică cu evoluția din județul Suceava;

semnele clinice ale leucozei bovine sunt rare și apar doar în stadiul final al bolii;

durata măsurilor de asanare a focarelor a fost mare din cauza întârzierii sacrificării bovinelor și a incidenței crescute a bolii;

un număr redus de bovine au prezentat leziuni macroscopice specifice leucozei enzootice bovine, ca urmare a efectuării examenului de abator;

principalele măsuri care au determinat reducerea pâna la dispariție a cazurilor de leucoză bovină au fost: identificarea prin crotaliere a bovinelor, utilizarea pentru recoltare a eprubetelor cu vacuum și a acelor individuale, utilizarea testelor ELISA pentru depistare imediată, sacrificarea în cel mai scurt timp a animalelor depistate.

Recomandări

este necesar un control mai strict al circulației animalelor, în special al achizitorilor clandestini, pentru a evita introducerea de animale bolnave în efectivele localităților;

identificarea rapidă a cazurilor de boală și eliminarea în timpul cel mai scurt din efectiv, astfel se reduce mult posibilitatea difuzării leucozei la alte animale;

este necesară o mai bună informare a crescătorilor asupra riscurilor bolii și a efectului asupra întregului efectiv;

se recomandă sacrificarea tineretului provenit de la vacile depistate pozitive cu virusul leucozei bovine;

este necesară o mai mare atenție la folosirea instrumentelor chirurgicale utilizate pentru intervențiile sângeroase, sterilizarea acestora după fiecare utilizare.

Bibliografie

Adameșteanu I. 1955- Patologia medicală a animalelor, vol I, Ed. Academiei, București.

Adameșteanu I. și col. -1959- Semiologie medicală veterinară, Ed. Academiei, București.

Anghelescu S., Barna I., Pârvu, Nicolaescu Al. – 1976- Actualități privind clasificarea și diagnosticul leucozei taurinelor.

Baba I. – 1996- Diagnostic necropsic veterinar, Ed. Ceres București

Barna I. – 1976- Despre etiologia virotică a leucozelor la mamifere, Culegere de Medicină Veterinară, vol I, București.

Barna I. – 1976- Profilaxia și combaterea leucozei bovine în Danemarca, Culegere de Medicină Veterinară, vol I, București.

Barna I. – 1976- Progrese recente în cunoașterea biologiei celulei canceroase, Sinteză, Culegere de Medicină Veterinară, vol I, București.

Barna I. -1989- Leucoza enzootică bovină, epizootologie, diagnostic, profilaxie și combatere, buletin informativ, LCSVD București.

Barna I. și col -1990- Sindromul de imunodeficiență dobândită la animale, Leucozele bovine, vol XVII, Cluj Napoca.

Barna I., Iuga C. -1995- Leucozele și bolile de imunosupresie la animale, Ed. Ceres.

Băieș I. și col. – 1971- Bolile infecțioase ale animalelor domestice, Ed. Didactică și pedagogică București.

Carp-Cărare M. – 2001- Microbiologie veterinară, Virusulogie, Ed. Venus, Iași.

Cătoi C. -2003- Diagnostic necropsic veterinar, Ed. Academic Press, Cluj-Napoca.

Coman I., Bârbală M, Florescu I. -1997- Decontaminarea, Ed Satya București, vol I.

Coțofan O. -1986- Diagnostic necropsic. Elemente de curs și lucrări practice, Centrul de multiplicari al institutului Agronomic Iași.

Coțofan O. -1992 – Morfopatologie generală. Curs ,Centrul de multiplicari al institutului Agronomic Iași.

Ghergariu S. -1995- Bazele patologiei medicale a animalelor, vol I și II, Ed. All, București.

Hagiu N. -1993- Patologie medicală veterinară Curs, Centrul de multiplicari al institutului Agronomic Iași.

Manolescu N., Bolte I. -1981- Oncologie veterinară, vol I și II, Ed. Ceres București.

Miclea E., Barna I. Pârvu Gh., Anghelescu S. -1976- Leucozele animalelor domestice, Ed. Ceres, București.

Nicolae St., Nasta C. -1968- Virusuri și tumori, Ed. Academia Română, București.

Oneț E.-1983- Virusuri și viroze la animale, vol I, Ed. Dacia, Cluj-Napoca.

Oprean O. Z.-1998- Morfopatologie generală veterinară, vol I, Ed. Evcont Consulting, Suceava.

Pârvu Gh. -1976- Combaterea leucozei enzootice bovine, Culegere de medicină veterinară, vol I, București.

Paul I. -1986- Morfologie generală și organologie, Institutul Agronomic Iași.

Paul I. -1996- Etiomorfopatologie Veterinară, vol I, Ed. All, București.

Perianu T., Nicolae St., Velescu E., Carp Cărare, Alexandru N. -2005- Boli infecțioase ale animalelor, vol II, Viroze, Casa de Editură Venus, Iași.

Pop M., Vasiu C., -1981- Ghid de diagnostic în bolile infecțioase ale animalelor, Ed. Ceres, București.

Pop M., Vasiu C. -1988- Profilaxia și combaterea în bolile infecțioase la animale, Ed Ceres, București.

Savuța Gh. -2001- Epidemiologie veterinră generala, Ed. Ion Ionescu de la Brad, Iași.

Velescu Elena -2002- Patologia bolilor infecțioase la animale, Ed Terra nostra, Iași.

Voiculescu M. -1990 – Boli infecțioase, Ed. Medicală București

www.oie.int – enzootic bovine leukosis.

www. nyschap.vet.edu – module leukosis.

www.merckvetmanual.com – leukosis.

www.retrovirology.com –Bovine Leukemia Virus .

www.ansv.ro – programul acțiunilor de supraveghere, prevenire și control al bolilor la animale, al celor transmisibile de la animale la om, protecția animalelor și protecția mediului pentru anul 2007- B108-leucoza enzooticâă bovină.