Dezvoltatea și evaluarea unor produse antimicrobiene [304982]

Dezvoltatea și evaluarea unor produse antimicrobiene

Profesori coordonatori:

Prof. Dr. Ing. Anton FICAI

Conf. Dr. Ing. Denisa FICAI

Masterand: [anonimizat]. Chim. [anonimizat] (UE) Nr. 528/2012 al Parlamentului European și al Consiliului din 22 mai 2012 privind punerea la dispoziție pe piață și utilizarea produselor biocide.

“1. Regulamentul de punere în aplicare (UE) Nr. 354/2013 al comisiei din 18 aprilie 2013 privind modificări ale produselor biocide autorizate în conformitate cu Regulamentul (UE) nr. 528/2012 al Parlamentului European

2.  Regulamentul (UE) NR. 334/2014 AL Parlamentului European și al consiliului din 11 martie 2014 de modificare a Regulamentului (UE) nr. 528/2012 [anonimizat] – diverse precizări + termen de epuizare a stocurilorSubstanțele active din produs trebuie să se regasească în: – Regulamentul delegat (UE) Nr. 1062/2014 privind programul de lucru pentru examinarea sistematică a [anonimizat] (UE) nr. 528/2012 [anonimizat] a Substantelor Active Aprobate

3. Regulamentul de punere în aplicare (UE) nr. 414/2013 al comisiei din 6 mai 2013 privind precizarea procedurii de autorizare a [anonimizat] (UE) nr. 528/2012 al Parlamentului European și al Consiliului 2.

4. Regulamentul delegat (UE) Nr. 736/2013 al comisiei din 17 mai 2013 de modificare a Regulamentului (UE) nr. 528/2012 [anonimizat]

5. Regulamentul delegat (UE) NR. 837/2013 al comisiei din 25 iunie 2013 de modificare a anexei III la Regulamentul (UE) nr. 528/2012 [anonimizat] a s.a” [1a].

Legislația în România

“1. Hotărârea nr. 617/2014 privind stabilirea cadrului instituțional și a unor măsuri pentru punerea în aplicare a Regulamentului (UE) nr. 528/2012 al Parlamentului European și al Consiliului din 22 mai 2012 privind punerea la dispoziție pe piață și utilizarea produselor biocide “ Art. 18 (1) La data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se abrogă următoarele acte normative: (a) Hotărârea Guvernului nr. 956/2005 privind plasarea pe piață a [anonimizat]; (b) Ordinul nr. 1321/2006/280/90/2007 [anonimizat] a Hotărârii Guvernului nr. 956/2005 privind plasarea pe piață a [anonimizat] (2) În termen de 60 de zile de la data intrării în vigoare a prezentei hotărâri se modifică și se completează următoarele acte normative: (a) Ordinul nr. 637/2492/50/2012 privind aprobarea membrilor Comisiei Naționale Pentru Produse biocide și a regulamentului de organizare și funcționare a acesteia; (b) Ordinul nr. 10/205/19/2013 privind tarifele pentru plasarea pe piață a produselor biocide și pentru solicitarea privind înscrierea substanțelor active în anexa nr. I, IA sau IB la Normele metodologice de aplicare a Hotărârii Guvernului nr. 956/2005 privind plasarea pe piață a produselor biocide, aprobate prin Ordinul ministrului sănătății publice, al ministrului mediului și gospodăririi apelor și al președintelui Autorității Naționale Sanitare Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 1.321/2006/280/90/2007.

2.Ordinul 10/368/11/2010 privind aprobarea procedurii de avizare a produselor biocide care sunt plasate pe piață pe teritoriul României a fost modificat prin ordinul 433/2014 al ministrului sănătății, al ministrului mediului și schimbări climatice și al președintelui Autorității Naționale Sanitare Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor pentru modificarea și completarea Ordinului ministrului sănătății, al ministrului mediului și pădurilor și al președintelui Autorității Naționale Sanitare Veterinare și pentru Siguranța Alimentelor nr. 10/368/11/2010 privind aprobarea procedurii de avizare a produselor biocide care sunt plasate pe piață pe teritoriul României [1b].”

Introducere

Bionanocompozite

Bionanocompozitele reprezintă un subiect de interes actual pentru oamenii de știință, deoarece oferă studii interesante și servesc drept legatura între știința materialelor, biologie și nanotehnologia [1]

În zilele noastre, acestea sunt de aplicații utile și în domeniul științei biomedicale. Bionanocompozitele existente sunt rezultatul biopolimerilor, incluzând polizaharide, polipeptide și proteine, poliesteri alifatici și acizi polinucleici; în timp ce materialele de legătură includ argile, hidroxiapatită și nanoparticule metalice [1].

Bionanocompozitele sunt deasemenea denumite "nanobiocompozite", "biocompozite", "compozite verzi", "biohibride" sau "materiale plastice biobazate", cunoscute în scurt timp ca "bioplastice" [1].

Ele prezintă proprietăți diferite, cum ar fi stabilitatea termică, solubilitatea în apă, biocompatibilitatea și biodegradabilitatea, determinarea metodelor de preparare, funcționalitățile și domeniile de aplicare a materialelor. Bionanocompozitele pot fi definite ca materiale care cuprind particule cu cel puțin o dimensiune cuprinsă între 1-100 nm și un constituent de origine biologică sau pot fi biopolimeri [1].

Nanocompozitele pot fi diferențiate de compozite prin prezența polimerilor pe bază de petrol ca o componentă organică pentru nanocompozite, în timp ce compozitele sunt constituite din aditivi anorganici. În plus, o diferență majoră între bionanocompozite și biocompozite este aceea că acestea din urmă pot fi constituite din biopolimeri, dar nu au aditivii cu structura nanometrica [1].

Acesti biopolimeri prezintă solubilitate în solvenți polari (de exemplu, apă), în timp ce polimerii derivați din petrol sunt solubili într-o măsură mai mare în solvenți organici. Deși unele asemănări pot fi observate cu nanocompozite, există și câteva diferențe, inclusiv metode de preparare, proprietăți, biocompatibilitate și biodegradabilitate [1].

Bentonitul

Pământ activ, argilă coloidală sau argilă bentonitică sunt câteva din denumirile sub care este cunoscut ca bentonitul, un silicat de aluminiu natural. Această argilă are proprietatea de a-și mări volumul prin fixarea apei și de a flocula în prezența eletroliților și de a reține proteinele [2].

Primii utilizatori ai acestor argile au fost chinezii, în urmă cu multe secole, aceștia utilizându-le la limpezirea uleiurilor. După o expediție în China, David Wessin, descoperă în 1890 la Fort-Benton, statul Wyoming, importante zăcăminte de montmorilonit, mult mai valoroase decât cele chinezești. Acesta, denumește, în 1898, argilă obținută că bentonit. În anii 1920, apăr și primele încercări de utilizare a bentonititului în practicile vinicole, dar sunt rapid abandonate. [2].

Bentonitul brut, din cauza umidității ridicate, are aspect untos și este plin de impurități. El este extras sub formă de bulgări, lăsat să se usuce în aer liber, apoi supus purificării. Tehnologia de obținere a bentonitului presupune următoarele procese: uscarea bulgarilor, mărunțirea și măcinarea lor, îndepărtarea pietrișului prin cernere, înmuierea și levigarea în apa, sedimentarea, decantarea, evaporarea apei, uscarea gelului și măcinarea lui [2].

În funcție de cationul predominant din spațiul interlamelar, bentonitul se împarte în trei tipuri, fiecare tip având anumite proprietăți specifice privitor la afinitatea față de apa, capacitatea de gonflare etc. Mai exact, cationii predominanți sunt Na+, Ca2+ și H+, benonitul purtând denumirile de Na-bentonită (bentonită sodică), Ca-bentonită (bentonită calcică) și bentonită acidă [2].

Unul din proprietățile bentonitului este afinitatea față de apa, care, în general, este una ridicată, bentonitul fiind higroscopic. În funcție de cationul interlamelar, afinitatea este mai ridicată sau mai scăzută [2].

Capacitatea de gonflare este o altă proprietate importantă. Această proprietate se rezumă la volumul pe care îl are bentonitul în urma adsorbției apei. În această situație, bentonita sodică are cea mai ridicată capacitate de gonflare, în comparație cu bentonită calcica și cea acidă [2].

Capacitatea de floculare a bentonitului este o proprietate foarte importantă. Sarcinile electropozitive ale cationilor compensează sarcinile electronegative ale particulelor coloidale de bentonit, având ca rezultat aglomerarea lor în flocule. Flocurarea apare și atunci când coloizii electropozitivi sunt reprezentați de proteine, în special proteine adăugate, precum gelatina. [2].

Bentonita are formula chimică: Al2H2O12Si4, masa moleculară 360.31 g/mol este un filosilicat de aluminiu. In general, se găsește în argila impură care este alcătuită în special din montmorillonit. Există diverse tipuri de bentonit, iar denumirile lor depind de elementele dominante, cum ar fi potasiu (K), sodiu (Na), calciu (Ca). În scopuri industriale, există două clase principale de bentonită: bentonită de sodiu și calciu. Bentonita propriu-zisă se formează din dezagregarea cenușii vulcanice, cel mai adesea în prezența apei [3].

Mineralele prezente în bentonite sunt alte minerale din argilă, cuarț, feldspați, gips, calcit, pirită și diversi oxizi / hidroxizi de fier. De asemenea, compușii amorfi și organici pot fi prezenți în cantități semnificative [4].

Cererea mondială de argile naturale pentru aplicații cosmetice și farmaceutice a crescut foarte mult în ultimile perioade și sunt asociate cu succesul continuu al terapiilor naturale. Acest lucru a determinat mai mulți cercetători să caute și să evalueze noi resurse minerale de argilă [4].

Minerale argiloase prezintă proprietăi fizico-chimice uimitoare, capacitate mare de schimb de cationi, materiale inerte chimic, non-toxice și proprietăți neiritante acceptate pentru aplicațiile cosmetice și farmaceutice [4].

Lutul natural a fost utilizat pe scară largă în terapii pentru artrită, reumatism, seboree, acnee și leziuni traumatice ale mușchilor osoși. S-a raportat că aplicațiile cosmetice ale argilelor se limitează la utilizarea externă ca tratament pentru piele și față [4].

Smectitele sunt grup structural de minerale din clasa filosilicatilor, caracterizat prin parametrul reticular si un raport intre unitatile tetraedrice si octaedrice ale retelei cristaline de 2:1. Cuprind hidrosilicati de Na, Ca, Fe si Al, cu capacitati de schimb cationic mari si bune proprietati absorbante [5].

Printre argilele folosite pentru aplicațiile în mediu, industrie și medicină, bentonitul a atras atenția pentru disponibilitatea și prețul scăzut, proprietătile sale unice, foarte mare capacitate de schimb de cationi, mărime redusă a particulelor, capacitate mare de adsorbție și proprietăti netoxice. Bentonitul din punct de vedere farmaceutic a fost definit ca mineral natural, cristalin și hidroxid de silicat de aluminiu care prezintă în natură o pulbere fină de culoare gri cenușie si cremoasă [6].

Aplicațiile medicale ale argilelor naturale legate de rolurile lor că principii active și / sau excipienți.

Aplicațiile comune ale argilelor naturale că principii active includ protecția dermatologică, antidiareică, gastrointestinală, antiinflamatorie și antiacidă [6].

Aplicații ale bentonitului în construcțiile civile

Pereți diafragma

Sprijin pentru laturile panourilor excavate. Bentonitul trebuie sa formeze un strat bariera pe laturile excavatiei care sa impiedice infiltrarea fluidului in sol si in acelasi timp presiunea exercitata de fluid asupra acestui strat, să echilibreze presiunile exterioare ale solului si apei freatice [7].

Investigații sol

De multe ori solurile de investigat sunt instabile. Se folosește forarea sub bentonit ca alternative la forarea cu tubulatură [7].

Pereți separatori

Sunt situații în care sunt necesare bariere subterane împotrivă apelor freatice, sau izolarea unor incinte subterane care conțin deșeuri toxice. În aceste situații se adaugă ciment sau alte materiale în bentonită , rezultând un amestec care rămâne fluid câteva ore înainte de a se solidifica. Câteodată se introduce în excavație o membrană subțire cu rol de etanșare suplimentară [7].

Tuneluri

Fluidul bentonitic este folosit pentru sprijinirea excavației în față utilajelor de forat și pentru transportul solului excavat către echipamentele de curățire și recirculare a acestuia [7].

Varietăți de bentonit

Bentonitele comerciale sunt silicați de aluminiu hidratat și au la bază un mineral denumit montmorillonit (numele vine de la localitatea Montmorillon din Franța, lângă care a fost descoperit).

Cele mai uzuale tipuri de bentonit sunt [7]:

Bentonit sodic natural

Cationul predominant este cationul de Na. Are capacitate de dilatare (umflare) foarte buna, limita inalta de lichefiere si filtratie scazuta [7].

Bentonit calcic natural

Cationul predominant este cationul de Ca. Are capacitate de umflare si limita de lichefiere inferioare, respectiv filtratie superioara bentonitei natural sodice [7].

Bentonit sodic activatat

Se obține adăugând NaCO3 solubil în bentonitul calcic. Efectul obținut este înlocuirea ionilor de Ca cu cei de Na. Se obține astfel un bentonit cu multe din caracteristicile tipice bentonitului sodic natural [7].

Bentonitul sodic natural este rareori folosit datorită costului mare, iar bentonitul calcic natural nu este în general folosită datorită proprietăților slabe. În practică, bentonitul sodic activat este cel mai des folosit [7].

Proprietatea principală a suspensiei apa – bentonit este că se gelifica în repaus și se lichefiază la agitare, procesul fiind reversibil. Această proprietate se explică prin fenomenul de tixotropie. La agitare, bentonitul se desface în particule de forma unor discuri încărcate cu sarcini negative pe suprafețe și cu sarcini pozitive pe muchii. În repaus, particulele se orientează după direcții perpendiculare datorită forțelor electrice, formând o rețea interconectată și generând gelul. La agitare, legăturile electrice sunt rupte și particulele se orientează aleatoriu generând lichefierea [7].

Cimenturi cu bentonit

“Bentonitul” este termenul folosit pentru denumirea unor varietati de argile care au proprietatea de a se dilata si gelifica atunci cand sunt dispersate in apa. A fost descoperita in Statele Unite ale Americii, in secolul 19, langa Fort Benton (de unde si numele) [8].

Folosit initial numai in forajul de titei, bentonitul si-a gasit ulterior o larga aplicabilitate in constructiile civile. De asemenea, depozite de bentonit au fost descoperite si in alte parti ale lumii [8].

Ce este important de retinut, este ca proprietatile bentonitului provenite din surse diverse sunt diferite. De aceea trebuie sa se tina cont de aceste diferente atunci cand se decide folosirea unui anumit bentoni pentru un anumit scop [8].

Utilizări farmaceutice și efecte biologic active ale montmorillonitului (MMT)

Mineralele din nanoargile au proprietăți excepționale, cum ar fi toxicitatea scăzută sau nulă, biocompatibilitatea superioară și garanția eliberării controlate a medicamentului, dând astfel naștere la curiozitatea neîncetată a progresului lor în aplicațiile biologice, de exemplu, în scopuri farmaceutice, cosmetice și chiar medicale. Nano-argilele pe care cercetătorii s-au concentrat sunt enumerate mai jos: [8].

Multe încercări au fost făcute pentru a dezvolta MMT ca un transportator de eliberare, de exemplu, pentru a îmbunătăți apa, solubilitatea medicamentelor insolubile și controlul eliberării moleculelor bioactive [8].

Caracteristica biochimică care face ca argila să fie valoroasă în domeniul farmaceutic pentru aplicații sunt capacitatea mare de adsorbție, suprafața internă ridicată, capacitatea imensă de schimbare a cationilor, reacțiile spațiului intermediar cu moleculele de medicament, toxicitatea inactivă din punct de vedere chimic și toxicitatea mică sau nulă [8].

În general, natura schimbului de ioni, capacitatea de intercalare și biocompatibilitatea MMT le fac candidațul ideal pentru eliberarea medicamentelor. Pe lângă utilizările farmaceutice, MMT și nanocompozitele sale sunt, de asemenea, agenți biologic activi pentru o gamă largă de aplicații [8].

MMT poate fi administrat pe cale orală pentru detoxifiere sistemul digestiv, eliminarea paraziților interni, sprijinul sistemului imunitar, fixarea oxigenului liber în fluxul sanguin, acțiunea suplimentului mineral, detoxifierea ficatului, reducerea durerilor de stomac și intoxicația cu alimente bacteriene etc [8].

MMT a fost de asemenea utilizat pe scară largă în tratamentul durerii, durerilor de cap cronice, răni deschise, afecțiuni ale pielii (acnee, eczeme, erupții etc.), colită, diaree, hemoroizi, ulcerații de stomac, probleme intestinale, anemie, vindecarea rapidă a rănilor (vânătăi, entorse, arsuri etc.), infecții bacteriene severe, întinerire a pielii și curățare profundă și varietate de alte probleme de sănătate [8].

1.1 Sistemele de eliberare controlată a medicamentelor (DDS)

În prezent pe plan mondial se derulează cercetări, inițiate de câteva decenii, pentru dezvoltarea unor sisteme noi de eliberare a medicamentelor [8].

În terapia conventională, medicamentul, imediat după administrarea în organism, este eliberat deodată, determinând creșterea rapidă a concentrației acestuia în plasmă sanguină, uneori la valori care depăsesc nivelul toxic, ceea ce conduce la un conflict cu scopul urmărit, de obținere a unui efect maxim al medicamentului, cu efecte secundare minime [8].

Progresele tehnologice în domeniul farmaceutic al terapiei medicamentoase contribuie continuu la înlocuirea acestor forme de formulare a medicamentelor cu sisteme de eliberare în mod constant și de durată a acestora. Complexitatea sistemelor biologice solicită sisteme de eliberare controlată a medicamentelor adecvate tratării individualizate și specifice fiecărei zone a organismului uman, care este sediul apariției unei disfunctionalităti, precum și tipurilor de maladii care necesită tratamentul [8].

Aceste sisteme trebuie să ia în considerare o serie de necesități, pornind de la ușurință de eliberare la eficacitatea medicamentelor. Mai multe companii se specializează în dezvoltarea metodelor de eliberare a medicamentelor, comercializarand aceste produse către companiile farmaceutice, în timp și alte companii farmaceutice își dezvoltă propriile sisteme [8].

Cele mai vechi sisteme de eliberare a medicamentelor, au fost introduse pentru prima dată în anii 1970, s-au bazat pe polimeri derivați din acid lactic [8].

În timp ce formele convenționale de eliberare a medicamentelor sunt simple orale, topice, inhalate sau injecții, noile sisteme de eliberare complexe trebuie să țină cont de principiile farmacocinetice, de caracteristicile precise ale medicamentului și de schimbarea răspunsului de la o persoană la alta și în interiorul aceleiași persoane în condiții diferite [8].

DDS intentionează să modifice farmacocinetica și biodistributia medicamentelor asociate sau să funcționeze ca rezervoare de medicamente și joacă un rol important în dezvoltarea formelor de dozare farmaceutică pentru industria medicală, deoarece adesea durata din eliberarea de medicamente trebuie extinsă pe o perioadă de timp [8].

Pentru a evita problemele asociate cu terapiile convenționale de medicamente, cum ar fi solubilitatea limitată a medicamentelor, biodistributia redusă, lipsa selectivitătii și farmacocinetică necontrolată, în ultimul deceniu cercetarea a fost indreptată spre dezvoltarea unor noi sisteme de eliberare a medicamentelor mult mai bune [8].

Imbunătătirea DDS intentionează să utilizeze bariere chimice sau fizice mai eficiente pentru a controla rapiditatea eliberării și pentru a asigura menținerea preferată a dozei. În acest sens, dezvoltarea sistemelor de eliberare este strict dependentă de alegerea unui agent purtător adecvat capabil să controleze eliberarea medicamentului [9].

De peste două decenii, cercetătorii s-au concentrat pe găsirea de modalităti mai bune de eliberare a medicamentele la nivelul organismului, cu o viteză sustinută, direct la locul de acțiune, cu toxicitate mai redusă și în mod specific afecțiunii [9].

Dezvoltarea sistemelor de eliberare a medicamentelor necesită o serie largă de sarcini, cum ar fi calea de administrare, proprietătile medicamentului, biocompatibilitatea materialelor și dezvoltarea materialelor adecvate aplicației specifice (biodegradabil, sensibil la ph, flexibil, etc.), capacitatea de incărcare a medicamentului și tipul de medicament,eliberarea cinetică (lentă, rapidă, pulsatilă), durata terapiei și dovada eficacitătii (Fig.1)[9].

Fig. 1 Prezentare a sistemelor de eliberare a medicamentelor

În plus, este important să se demonstreze siguranța sistemelor, care include două entități majore:

siguranța medicamentului distribuit sistemic

biocompatibilitatea sistemului de administrare a medicamentului

Pentru a obține un răspuns terapeutic, cantitatea adecvată de medicament activ trebuie să fie absorbită și transportată la locul de acțiune la momentul potrivit, iar rata de intrare poate fi apoi ajustată pentru a produce concentrațiile necesare pentru a menține nivelul efectului atât cât este necesar [10].

Distribuția medicamentului la țesuturi, altele decât locurile de acțiune și organele de eliminare, este inutilă, risipitoare și o cauză potențială de toxicitate [10].

Modificarea mijloacelor de livrare a medicamentului prin proiectarea și pregătirea unor noi dispozitive avansate de eliberare a medicamentelor poate îmbunătăți terapia. Metodele actuale de eliberare a medicamentelor prezintă probleme specifice pe care oamenii de știință încearcă să le rezolve [10].

De exemplu, numeroasele potențe și efecte terapeutice ale medicamentelor sunt limitate sau reduse altfel din cauza degradării parțiale care are loc înainte de a ajunge la o țintă dorită în organism [10].

Scopul tuturor sistemelor sofisticate de livrare a medicamentelor este așadar să pună medicamente intacte în părți specifice ale corpului printr-un mediu care să poată controla administrarea terapiei prin intermediul unui declanșator fiziologic sau chimic. Pentru a atinge acest obiectiv, cercetătorii se îndreaptă către progrese în lumea micro și nanotehnologiei ilustrează instrumentele strategice pentru sistemele controlate de livrare a medicamentelor [10].

1.2 Eliberarea medicamentelor controlate

Concentrația medicamentului la locul de acțiune din corpul uman este un aspect important pentru succesul unei farmacoterapii [11].

Concentrațiile prea mari ale medicamentelor pot duce la efecte secundare grave, în timp ce nivelurile prea scăzute de medicament duc la eșecul tratamentului medical. Pentru formulările convenționale, concentrația plasmatică a unui medicament este direct proporțională cu doza administrată [11].

Aceste formulări au dificultăți în menținerea dozei terapeutice pentru perioade lungi de timp, care necesită, de obicei, administrări multiple pentru a obține efect terapeutic. În plus, circulația sistemică a unei concentrații mari de medicament induce adesea efectul negativ, deoarece în acest caz, eliberarea medicamentului depinde numai de difuzarea simplă sau de împărțirea de la fluxul sanguin la locul țintă, singurul avantaj al formulărilor convenționale este costul dezvoltării este scăzut [11].

Tehnologia controlată de elibareare a medicamentelor reprezintă unul dintre domeniile cele mai cercetate ale științei în care chimiștii și inginerii chimici contribuie la îngrijirea medicală umană și reprezintă un domeniu în continuă evoluție pentru știință biomedicală și materiale [11].

Aceste sisteme oferă următoarele avantaje comparativ cu alte metode de administrare:

posibilitatea de a menține concentrațiile plasmatice de medicament din punct de vedere terapeutic (eficacitate îmbunătățită),

posibilitatea de eliminare sau reducerea efectelor secundare dăunătoare

administrarea medicamentului poate fi îmbunătățită și facilitată în zonele privilegiate în care nu există o supraveghere medicală bună,

administrarea de medicamente cu un timp de înjumătățire in vivo scurt poate fi facilitat foarte mult,

cantitățile mici de medicament pot fi mai puțin dureroase decât câteva doze mari;

utilizarea sistemelor de eliberare a medicamentelor poate rezulta într-un produs relativ mai puțin costisitor și mai puține deșeuri de medicament [12].

Această îmbunătățire poate lua forma unei creșteri a activității terapeutice în comparație cu intensitatea efectelor secundare,eliberarea medicamentului poate fi controlată pe perioade prelungite de timp [12].

Pe scurt, toate sistemele cu eliberare controlată urmăresc îmbunătățirea terapiei medicamentoase [12].

Utilizarea bentonitei in forajul puțurilor de apa

În România, singurul zăcământ de bentonită natural sodică se afla în Valea Chioarului, județul Maramureșului. Acesta este exploatat abia din anul 1914. Un alt zăcământ, de bentonită calcică se găsește în Orașu Nou, județul Satu Mare, cu exploatare din anul 1955 [13].

Procesul de absorbției se realizează atunci când montmorilonitul se dilată. Datorită acestui efect, bentonitul are capacitatea de a absorbi atât molecule de mici dimensiuni cât și macromolecule, cum sunt aminoacizii și compușii proteici. Ca și utilizare a bentonitei, are proprietatea de a purificarea apelor uzate [13].

Pentru foraje la adâncimi mari este folofita bentonită activată, adică bentonită calcică, măcinată selectiv și activată cu carbonat de sodiu. Prin aceasta activare se realizează înlocuirea ionilor alcalino-pământoși cu ionii metalelor, ceea ce duce la transformarea într-o bentonită sodică. Proprietățile sale absorbante, respectiv prezența montmorilonitului permite utilizarea cu succes a acesteia în industria extractivă [13].

Cu ajutorul bentonitei se prepară fluidul de foraj utilizat datorită vâscozității acesteia. Mixtura rezultată în urma combinării bentonitei cu apa se poate schimba în funcție de proporția fiecărui element. Se cunoaște de asemenea faptul că bentonita sodică se expandează în apă mai mult decât bentonita calcică. Rolul esențial pe care aceasta îl joacă în industria extractivă nu poate fi ignorat, aceasta fiind aleasă de cele mai mult ori în locul tuburilor sau a țevilor [13].

Bentonita formează un strat de etansare cu rol de protectie pe pereții excavați, strat care împiedică infiltrarea apei în sol, apă care odată rămasă în tunelul excavat crează o presiune care egalizează presiunea exterioară a solului și a apei freatice. În general se utilizează doar în combinație cu apa, dar există și situații în care sunt combinate și alte elemente de întărire, cum ar fi cimentul. Amestecul rezultat în cazul adăugării cimentului va rămâne fluid o perioadă destul de lungă de timp înainte să treacă în următoarea stare fizică, aceea de solid [13].

De cele mai multe ori bentonita prevalează în fața altor soluții tehnice identificate în cazul forajelor. Dintre cele trei tipuri de bentonită, respectiv natural sodică, natural calcică și sodic activată, cea care are cele mai bune proprietăți și este cel mai des utilizată este cea din urmă, adica cea sodic activată [13].

Această bentonită se obține prin procedeul de înlocuire a ionilor de Calciu cu cei de Sodiu. Caracteristica principală a sa este modificarea stării fizice în funcție de forțele care acționează asupra ei. Astfel, în cazul în care aceasta este în repaus, aceasta se regăsește într-o stare semisolidă, pe când dacă este agitată, revine în stare lichidă [13].

Utilizări ale montmorillonitului

Deși montmorillonitul de calciu natural are multe aplicații, au fost dezvoltate metode de imbunătătire și creștere a domeniilor de utilizare. Mai întâi s-a constatat că tratarea cu acid crește capacitatea mineralului de a elimina corpuri colorate din uleiuri și alte lichide. Această a condus la dezvoltarea unui nou tip de argilă inălbitoare, argilă acidă activată [14].

Mai recent, descoperirea unui procedeu economic comercial pentru transformarea montmorillonitlui prin schimb ionic, cu sodiu, l-a adus pe acesta în sferă de aplicabilitate a montmorillonitului de calciu. [14]. Cele mai importante utilizări ale montmorillonitului sunt:

Utilizări farmaceutice

Cel mai cunoscut domeniu de utilizare al montmorillonitului este în prepararea produselor farmaceutice, unde argilă este folosită în unele creme și pudre, precum și în calitate de pachete de față și nămoluri terapeutice. În acest scop, se utilizează o cantitate mică de montmorillonit, dar se pare a fi cel mai cunoscut domeniu de aplicabilitate pentru public [14].

Rafinarea petrolului

Principală utilizare a montmorillonitului natural a fost în rafinarea lichidelor, în special a uleiurilor, deși astăzi acesta a fost înlocuit în mare măsură de formele de argilă acidă activate [14].

Argilă naturală de inălbire ("natural fullers' earth") este utilizată pentru albirea uleiurilor foarte sensibile, sau pentru curătarea uleiurilor foarte ușoare, atunci când este necesară indepărtarea unor impurităti în cazul rafinării petrolului [14].

Tot în acest domeniu, argilă este folosită pentru indepărtarea săpunului de baleiaj. Săpunul se formează în timpul neutralizării cu sodă caustică a acizilor grași liberi prezenți în uleiul, iar aceste săpunuri sunt spălate înainte că uleiul să fie albit. În cazul în care uleiul nu este complet spălat, acesta se trateză cu montmorillonit natural înainte de albirea cu argilă acidă activată. Montmorillonitul absoarbe săpunurile apoase care ar putea diminua eficientă argilei acide activate [14].

Rafinarea zahărului

Rafinăriile de zahăr folosesc montmorillonit pentru clarificarea soluțiilor apoase de zahăr. Turbiditatea zahărului brut este adesea datorată particulelor coloidale proteice, care transportă sarcini negative mari [14].

Adăugarea de montmorillonit duce la neutralizarea acestor sarcini. Mecanismul de neutralizare se datorează cationilor cu sarcină mare, de exemplu aluminiul, care face parte din structură montmorillonitului; ph-ul soluției de zahăr care se tratează este scăzut, iar particulele coloidale sunt eliminate prin antrenare mecanică cu montmorillonit. Compuși de fier prezenți în soluțiile de zahăr duc la oxidare și, implicit, la modificarea culorii [14].

Pentru a se evită colorarea zahărului, acești complecși de fier pot fi indepărtati prin schimb ionic pe suprafața montmorillonitului [14].

Catalizatori

Montmorillonitul de calciu este folosit ca și catalizator pentru unele reacții organice, cum ar fi dimerizarea o-metilstirenului [14]. Suprafața mare a montmorillonitului face din acesta un suport adecvat pentru alți catalizatori. Un exemplu de utilizare în acest sens este atunci când montmorillonitul este impregnat cu clorură de cupru, pentru a elimină mirosul neplăcut al kerosenului. Sarea de cupru transformă mercaptanii cu miros neplăcut prezenți în kerosen în disulfuri inodore. Argila actionează pur și simplu ca un mijloc de transport pentru catalizatorul chimic [14].

2. Parte experimentală

2.1 Sinteza si caracterizarea materialelor de tip montmorillonit si bentonit cu principii active

2.1.1 Sinteza

Metoda 1

Pentru sinteza materialelor au fost cantarite 1g de montmorillonit (bentonit) si 0,1g antibiotic (ampicilina / eritromicina sau neomicina), peste care s-a adaugat un volum de 20 mL apa distilata, ajungând la o concentratie de 5% de medicament în suspensia apoasă de argilă. Suspensiile obtinute s-au lasat la agitare magnetica timp de 6 ore.

Ulterior agitarii, probele au fost filtrate si uscate, in final s-au obtinut materiale de tip montmorillonit / bentonit cu ampicilina, eritromicina sau neomicina.

Fig. 2 Schema de obtinere a metodei cu solutie apoasa

Metoda 2

Pentru sinteza materialelor au fost cantarite 2g de montmorillonit (bentonit) si 0.2g antibiotic (ampicilina/ eritromcina/ neomicina). Probele au fost fin mojarate pentru o omogenizare buna a pulberilor, dupa care au fost tinute la vid timp de 30 de minute. Acest proces s-a realizat pentru a se elimina apa și dioxidul de carbon.

Ulterior, peste probe s-au adaugat 3 mL de solvent, in cazul probelor ce contin ampicilina si neomicina solventul ales a fost metanol, iar in cazul probelor cu eritromicina s-a ales etanol. Dupa injectarea solventului in probele au mai fost tinute 10 minute in contact cu solventul adaugat, dupa care proba a fost tinuta la vid 30 de minute pentru inlaturarea solventului. Aceasta etapa de vidare, adaugare solvent și uscare s-a repetat inca de doua ori pentru fiecare proba. Probele la final au fost tinute la uscat.

Fig. 3 Schema de obtinere a metodei de adsorbtie

2.1.2 Materiale

Au fost folosite materiale de inaltă puritate cumparate de la producatorul Sigma-Aldrich. Solventii (methanol, etanol) au fost folositi fara o purificare pralabila.

2.1.3 Metodele de caracterizare

spectroscopie FTIR

microscopie SEM

spectroscopie de raze X dispersive în energie – EDAX

Analiza temica TGA +DSC

Studiul eliberarii principiilor active

Testarea activitatii biologice

Microscopie electronica de baleiaj pentru probele preparate prin metoda 1

Determinarea microstructurală prin microscopia electronică de baleiaj

Microscopia electronică reprezintă o metodă modernă de studiere a aspectului structurii foarte fine de ordinul 10-5 – 10-7 cm și cu măriri uzuale cuprinse între 50.000 și 100.000 x (există microscoape electronice care pot mări până la 300.000 x).

Microscopul electronic are o putere de separare de ordinul 10-8 cm, minim pentru care este posibilă distingerea a două repere alăturate.

Se pot studia astfel planele reticulare, diferite tipuri de defecte în rețeaua cristalină, interacțiuni ale defectelor, se pot urmări transformări de fază, deformări plastice, reacții de suprafață, etc.

Spre deosebire de lumina din microscopia optică, electronii din microscopia electronică cu baleiaj nu dau o imagine reală, ci creează o imagine virtuală din semnalele emise de probă (electroni secundari, electroni retroîmprăștiați, emisii de raze X).

Această imagine virtuală este influențată de:

intensitatea și diametrul fasciculului de electroni;

energia fasciculului de electroni;

volumul de probă care interacționează cu fasciculul de electroni;

compoziția probei.

Electronii secundari sunt electroni din probă, emiși în urma interacției acesteia cu fasciculul primar de electroni. În general, au o energie joasă (în general mai mică de 50 eV), iar datorită acestei energii joase ei sunt emiși de o porțiune foarte apropiată de suprafața probei.

Ca urmare, acești electroni oferă o bună rezoluție imaginii. Contrastul într-o imagine dată de electronii secundari este dat de topografia materialului. Interacții mai puternice au loc în zonele mai înalte, emițându-se astfel un număr mai mare de electroni secundari, ceea ce asigură o imagine mai luminoasă în vârfurile suprafeței probei. Acest lucru ușurează interpretarea unei imagini date de electronii secundari.

Dezavantajele microscopiei electronice de baleaj sunt legate de:

nivelul de vid – toate tunurile de electroni fiind sensibile, gazul din tun poate interacționa sau interfera cu fascicolul de electroni;

probă;

probele trebuie sa fie “tolerante la vid”; ele nu trebuie să fie modificate – chimic sau structural, sau textural de vidul înaintat

probele trebuie sa fie “vacuum friendly” – nu trebuie să afecteze sau să altereze starea vidului sau a instrumentelor (detectoare sau tunul de electroni).;

Este foarte important ca probele sa fie conducătoare (din punct de vedere electric). Probele izolatoare necesită un proces de acoperire cu un material conducător (de obicei carbon, aur, argint), pentru prevenirea ionizării suprafeței.

Morfologia materialelor pe baza de MMT/ bentonit si antibioticele studiate au fost analizate cu ajutorul microscopiei electronice de baleiaj.

Imaginile de microscopie electronică de baleiaj au fost obținute pe eșantioane de pulbere fină folosind microscopul electronic de baleiaj QUANTA INSPECT F.

Din imaginile SEM inregistrate pe materialele MMT/antibiotic, respectiv bentonit/ antibiotic au forme si dimensiuni variabile.

Toate imaginile SEM prezentate au fost alese la acceasi scala de marime, respectiv 1000x; 5000x; 10000x si 20000x.

Fig. 4 Imagini SEM Neomicina+MMT Fig. 5 Imagini SEM Neomicina+Bentonit

Din imaginile SEM inregistrate pe materialele MMT/Neomicina respectiv Bentonit/ Neomicina se poate observa o distributie neuniforma a particulelor atat din punct de vedere morfologic cat si dimensional, de asemenea se observa ca prin introducerea neomicinei atat suportul de MMT cat si bentonitul si-au pierdut structura lamelara, rezultand un compus cu o suprafata rugoasa, granulata.

Fig. 6 Imagini SEM Ampicilină+MMT Fig. 7 Imagini SEM Ampicilină+Bentonit

In imaginile de mai sus putem observa o structura neuniforma a particulelor atat din punct de vedere morfologic cat si dimensional, aglomeratele au dimensiuni de aproximativ 10 µm, structură lamelară și se poate observa atât în cazul MMT-ului dar si in cazul betonitului suprafata rugoasa.

Fig. 8 Imagini SEM Eritromicină+MMT Fig. 9 Imagini SEM Eritromicină+Bentonit

In imaginile SEM cu antobioticul eritromicina se constata o diferanta a structurii intre suportul MMT si bentonit. Morfologia și forma acestor particule sunt total diferite, iar in cazul bentonitului se observa o strucura plachetara si omogena. Atat in cazul probei cu MMT, dar mai ales in cazul probei cu bentonit se pot observa zone luminoase ceea ce ne poate indica prezenta substantei active pe suprafata materilului analizat.

Microscopie electronica de baleiaj pentru probele preparate prin metoda 2

Fig. 10 Imagini SEM Neomicină+MMT (vid) Fig. 11 Imagini SEM Neomicină+Bentonit (vid)

In aceste imagini putem observa structura lamalara, cu aspect acicular, se poate observa ca la suprafata materialului analizat este prezenta cristalizarea evidentiata prin zone luminoase, proces datorat degradarii compusilor organici din structura substantei active, in cazul acesta neomicina.

Fig. 12 Imagini SEM Ampicilină+MMT (vid) Fig. 13 Imagini SEM Ampicilină+Bentonit (vid)

In probele ce contin ampicilina se poate observa inglobarea in structura a substantei active, aspect acicular, dimensiuni variabile, incarcari neomogene ale antibioticului.

Fig. 14 Imagini SEM Eritromicină+MMT Fig. 15 Imagini SEM Eritromicină+Bentonit

In imeginile SEM de mai sus se observa ca structura este asemanatoare probelor de mai sus, dar la scala mica se evidentiaza in cazul bentonitului aspectul lamelar al probei ce contine eritromicina, dimenisiunea pariculelor este variabila, iar aspectul este unul neuniform.

Spectroscopie de raze X dispersive in energie (EDAX) pentru probele preparate prin metoda 1

Analiza de spectroscopie de raze X dispersivă în energie (EDS) a fost efectuată utilizând microscopul electronic de baleiaj QUANTA INSPECT F echipat cu detectorul de raze X dispersiv în energie (EDS) cu rezoluția la MnK de 133 eV pentru a se putea vizualiza și cuantifica prezența și distribuția unor elemente de interes.

Din Imaginel de spectroscopie de energie dispersive (EDX) se observa prezenta elementelor Al, Si, O ale substratului mormorilonit/ bentonite dat si ale partii organie (antibioticul)

Fig. 16 Reprezentare EDAX Neomicină+MMT Fig. 17 Reprezentare EDAX Neomicină+Bentonit

Fig. 18 Reprezentare EDAX Ampicilină+MMT Fig. 19 Reprezentare EDAX Ampicilină+Bentonit

Fig. 20 Reprezentare EDAX Eritromicină+MMT Fig. 21 Reprezentare EDAX Eritromicină+Bentonit

Spectroscopie de energie dispersiva (EDAX) pentru probele preparate prin metoda 2

Fig. 22 Reprezentare EDAX Neomicină+MMT(v) Fig. 23 Reprezentare EDAX Neomicină+Bentonit(v)

Fig. 24 Reprezentare EDAX Ampicilină+MMT(v) Fig. 25 Reprezentare EDAX Ampicilină+Bentonit(v)

Fig. 26 Reprezentare EDAX Eritromicină+MMT(v) Fig. 27 Reprezentare EDAX Eritromicină+Bentonit(v)

Studiul eliberarii principiilor active

Pentru studiul eliberarii substantelor active din suporturile MMT si bentonit a fost utilizata cromatografia de lichide de inalta performanta (HPLC).

Analiza HPLC a fost realizată pe un sistem Agilent 1260 Infinity II, echipat cu pompa binara, un detector DAD si coloana termostatata Eclipse Plus C18 avand 3,5um dimensiunea particulelor de umplutura, diametru de 4,6mm si lungime de 1000mm.

Metoda de lucru pentru echipament a avut faza mobila compusa din:

solvent A: apa + 0.1% acid trifluoroacetic

solv B: ACN+0.1% acid trifluoroacetic

Debit de faza mobile: 1mL/min, izocratic 80% A; 20% B

Lungime de unda 220nm

Pentru ambele suporturi absorbția a fost facută din soluție prin cele doua metode de lucru.

Fig. 28 Reprezentare grafica a eliberarii ampicilinei în apă distilată; proba analizata este obtinută prin soluție apoasă

Din reprezentarea grafica se poate observa că eliberarea de ampicilină este 11.2% din suportul de MMT, în timp ce in gradul de retinere a ampicilinei din soluție, așa cum este determinat conform analizei termo-gravimetrice este de ~33%.

Pentru probele care contin ampicilina retinuta pe MMT, se observa ca substanta activa din solutie se elibereaza lent, după o cinetică de ordinul I, fiind practic lineară .

În cazul sistemului MMT/Ampicilina obținută prin absorbție in solutie apoasa, se constata o „eliberare instantanee” de aproximativ 40,5 % în prima oră după imersarea în apă, explicatia poate fi ca substanta activa aflata la suprafata suportului se elibereaza mai intai, dupa care apare o eliberare lenta timp de cel putin 4 zile, eliberare datorata desorbtiei ampicilinei din profunzimea materialului. Eliberarea finala ajungand undeva la 74 % din ceea ce s-a retinut.

Prin metoda vid de lucru, in probele ce conțin ampicilină s-a retinut 0,1g ampicilina/g MMT. Din punct de vedere al eliberarii, pentru proba pe suportul de MMT se poate observa ca inclusiv dupa 96 de ore eliberarea ampicilinei este de doar 5%, fiind relativ constanta ceea ce denota faptul ca ampicilina este foarte bine retinuta (interactioneaza bine cu suportul).

In cazul bentonitului ca support se poate observa o eliberare masiva in primele ore, dupa care concentratia ramane neschimbata. Gradul de eliberare la 96h este de aproximativ 35%.

Acest lucru confera premisele ca sistemele pe baza de bentonit obtinute cu incarcare in vid pot fi utilizate pentru o eliberare sustinuta de ordinul zecilor de zile.

Spectroscopia de IR cu Transformată Fourier

In scopul stabilirii structurii materilaelor obtinute, dar si a stabilirii tipurilor de interactii ce au loc intre MMT si antibiotic (ampicilina, eritomicina, neomiina) au fost inregistrate stectrele IR. Spectrele IR (fig 31 si fig 32) ale materialelor sintetizate au fost interpretate comparativ cu materia prima(mormorilonit).

Fig. 31 Spectre FTIR ale MMT-ului nemodificat și ale materialelor de tip MMT / antibiotice, prin metoda absorbției din solutie apoasă, regiune spectrală 400-4000 cm-1

In Spectre FTIR ale MMT-ului nemodificat pot fi identificate benzile caracteristice (fig 31). Banda de vibratie de la 3624cm-1 corespunde legaturii Si-O-Al, banda de vibratie de la 3385cm-1 corespunde legaturii O-H iar, banda de intindere de la 1631cm-1 corespunde legaturii O-H.

Din spectrele materialelor de tip MMT-antibiotic sintetizate prin metoda solutiei se observa benzile caracteristice MMT-ului se deplaseaza la valori mai mici din cauza introducerii antibioticului.

De asemenea in spectrele materialelor de tip MMT/ampicilina si MMT/eritromicina pot fi identificate spectrele caracteristice antibioticului prin prezenta benzilor caracteristice gruparii ᵛC=O la 1736 cm-1, respectiv 1718 cm-1

In cazul materialelor de tip MMT-neomicina, prezenta antibioticului nu poate fi identificata cu strictete datorita cantitatii mici de substanta activa, dar si din cauza suprapunerii benzilor bentonitului peste benzile antibioticului.

Ca si in cazul materialelor de tip MMT-antibiotic sintetizate prin metoda solutiei, in spectrele materialelor de tip MMT-antibiotic sintetizate prin metoda la vid se observa ca benzile caracteristice MMT-ului se deplaseaza la valori mai mici din cauza introducerii antibioticului.

Benzile caracteristice antibioticelor eritromicina si ampicilina sunt mult mai intense deoarece cantitatea absorbita este totala insa in continuare intensitatea acestor picuri este moderată datorita concentartiei mici si a absorbtivitații molare mici.

Fig. 32 Spectre FTIR ale MMT-ului nemodificat și ale materialelor de tip MMT/ antibiotice, prin metoda vid, regiune spectrală 400-4000 cm-1

Benzile caracteristice MMT-ului nemodificat și ale materialelor de tip MMT/ antibiotic sunt prezentate in tabelul de mai jos.

In Spectre FTIR ale bentonitului nemodificat pot fi identificate benzile caracteristice (fig 33). Banda de vibratie de la 3624 cm-1 corespunde legaturii Si-O-Al, banda de vibratie de la 341 cm-1 corespunde legaturii O-H iar, banda de intindere de la 1633 cm-1 corespunde legaturii O-H.

Din spectrele materialelor de tip bentonit-antibiotic sintetizate se observa benzile caracteristice bentonitului se deplaseaza la valori mai mici din cauza introducerii antibioticului, dar din puct de vedere al structurii se observa ca ramane neschimbata dupa introducerea substantei active.

Prezenta antibioticului nu poate fi identificata cu strictete datorita cantitatii mici de substanta active.

Fig. 33 Spectre FTIR ale Bentonitui nemodificat și ale materialelor de tip bentonita/antibioticelor, prin metoda absorbției din solutie apoasa, în regiune spectrală 400-4000 cm-1

Fig. 34 Spectre FTIR ale Bentonitui nemodificat și ale materialelor de tip bentonite/antibioticelor, prin metoda absorbtiei in vid, regiune spectrală 400-4000 cm-1

In Spectre FTIR ale bentonitului nemodificat pot fi identificate benzile caracteristice (fig 33). Banda de vibratie de la 3624 cm-1 corespunde legaturii Si-O-Al, banda de vibratie de la 341 cm-1 corespunde legaturii O-H iar, banda de intindere de la 1633 cm-1 corespunde legaturii O-H.

Din spectrele materialelor de tip bentonit-antibiotic sintetizate se observa benzile caracteristice bentonitului se deplaseaza la valori mai mici din cauza introducerii antibioticului, dar din puct de vedere al structurii se observa ca ramane neschimbata dupa introducerea substantei active.

Prezenta antibioticului nu poate fi identificata cu strictete datorita cantitatii mici de substanta activă insă, prin substragerea spectrului incarcat sub vid sau din solutie din acelasi suport se poate observa că benzile rezultate sunt foarte similare antibioticului. In cazul probei bentonita incarcata cu eritromicina conform celor doua metode, prin diferenta se pot pune in evidenta, cu o similaritate destul de buna, benzile caracteristice eritromicinei. Acelasi rezulta se obtine si in cazul celorlalte sisteme studiate.

Analiza termica complexă

Analiza termică complexă a fost efectuată ȋn scopul evaluării pierderilor de masă (a determinării conținutului de antibiotic din probele) precum și a comportamentului termic pe domeniul TC – 900oC.

Curbele analizei termice pentru cele doua probe MMT cu neomicina (normal si la vid) sunt foarte asemanatoare, dar pierderea de masa este mai accentuata pentru proba obtinuta la vid. Probabil prin acest tratament s-a reusit disponibilizarea mai multor pori pentru a fi incarcati apoi cu neomicina. Masa pierduta in intervalul 30-350oC este practic dubla pentru proba tratata la vid fata de cea tratata normal. Nu numai masa de neomicina depusa pare sa fie dubla, dar si cantitatea de apa existenta in proba. Daca apa a venit cu neomicina (cum este ampicilina trihidrat) sau este a probei mi-e greu sa spun ca nu stiu ce ati folsit. Eu as merge pe varianta cu apa legata de neomicina, pentru ca in final poate fi apa rezultata din deshiratarea ciclurilor glicozidice ale neomicinei care au multe grupari OH. Faptul ca pana la sfarsit in intervalul 350-900oC masa pierduta este mai asemanatoare (6.05% vs 7.34%) ne poate indica faptul ca aici si suportul sufera anumite procese degradative, nu doar resturile organice (spre exemplu, daca 4% din pierderea de masa este data de suport, atunci avem o pierdere de masa de 2% vs 3.3% la vid – diferenta intre pierderea de masa si 4% – de aceea este important sa stiu cum se comporta suportul). Vedem ca pierderea de masa este practic continua pana la 900oC. Daca ne uitam la probele urmatoare, 2 si 8, observam ca acolo se intra pe un palier constant dupa 750oC, si este acelasi antibiotic. Acest lucru imi indica faptul ca cel putin in intervalul 750-900oC avem si pierderi de masa cauzate de MMT.

Proba 1 neomicina -MMT are masa reziduala cea mai mare si deci a avut cel mai putin antibiotic depus in ea.

Analiza termica pentru probele 2 si 8 cu bentonit-neomicina sunt foarte asemanatoare, in acest caz tratamentul cu vid parand sa nu fi avut mare influenta asupra incarcarii cu antibiotic. Analiza termica indica o pierdere de 2.51% si respectiv 2.78% care a fost atribuita moleculelor de apa din proba. La tempeaturi mai mari urmeaza degradarea oxidativa a antibioticului, dar si a suportului.

Probele cu MMT-ampicilina (3 si 9) au o forma asemanatoare dar se pot observa cateva diferente semnificative. Daca in primul interval de referinta 30-200oC avem o pierdere asemanatoare de masa (apa din proba, 3.94 vs 4.05%), in intervalul imediat urmator se observa o dublare a pierderii de masa pentru proba tratata la vid (1.81 vs 3.71%). Daca aceasta pierdere de masa este datorata doar degradarii oxidative a antibioticului atunci putem spune ca proba 9 este incarcata cu de doua ori mai mult antibiotic (aceeasi discutie ca la probele 1 si 7 vis-a-vis de porii MMT). Pe intervalul 350-900oC observam iarasi o apropiere a maselor pierdute 5.81% vs 8.61%. Daca am pastra exemplul dat la probele 1 si 7, daca 4% din pierderea de masa este datorata suportului, atunci pierderea de masa datorata oxidarii resturilor de antibiotic ar fi 1.81% vs 4.61%, deci cumva in confirmarea ideii ca prin tratament la vid se dubleaza cantitatea de ampicilina incarcata pe MMT.

Comparand probele ampicilina -bentonit (4 cu 10) observam diferenta destul de importante. In zona 30-200oC proba tratata la vid pierde 2.81% in timp ce proba netratata pierde 6.06%, indicand o cantitate mult mai mare de apa. In timp ce la proba cu vid porii au fost umpluti cu antibiotic, la proba netratata acestia au ramas cumva plini cu molecule de apa. Pe intervalul urmator unde consideram ca se oxideaza antibioticul observam ca proba netratata are o pierdere de doar 0.55%, in timp ce proba cu vid pierde 3.76%. Acest fapt indica ca proba 4 nu are asa mult antibiotic incarcat pe ea. De asemenea ne folosim de aceasta informatie, cum ca bentonitul nu prea are pierderi de masa in intervalul asta pentru a judeca restul analizelor (in lipsa unei analize directe pe bentonit simplu). Observam de asemenea ca dintre probele cu bentonit aici avem masa reziduala cea mai mare (84.63%). Daca consideram ca jumatate din antibioticul depus in proba 4 se descompune in intervalul 200-350oC am putea sa consideram deci aceasta proba ca avand ~ 1% incarcare cu antibiotic. Acest fapt ne poate ajuta sa estimam incarcarea probelor 2, 6, 8, 10 si 12 ca fiind 3.2%, 5.8%, 2.6%, 4% si respectiv 5.4%.

Revenind la analiza termica a celor doua probe, daca in intervalul 200-350oC exista o diferenta de ~ 3.2% intre ele, diferenta se pastreaza la 3% si in intervalul 350-900oC, indicand faptul ca intradevar cam jumatate din masa antibioticului se descompune pana in 350oC si restul de jumatate dupa 350oC (sa nu faca studenta confuzie aici cu eliberarea antibioticului; cand spun ca jumatate se descompune este vorba de masa pierduta sub forma de CO2 si H2O in urma oxidarii, nu ca si cum doar jumatate din molecule ar fi oxidate si restul asteapta la rand).

Comparand probele 5 si 11 (MMT cu eritromicina) observam din nou forma asemanatoare a analizelor termice, cu o pierdere de masa mai mare pentru proba cu vid. Si aici avem aceeasi explicatie cu accesibilitatea porilor in urma tratamentului cu vid. De ce porii de la MMT se incarca mai usor cu antibiotic decat cei de la bentonit? Probabil ca sunt mai mari ca volum, sau pur si simplu au diametru mai mare si pot intra mai usor moleculele de antibiotic.

Probele 6 si 12 (eritromicina cu bentonit) au o analiza termica asemanatoare. In etapa 30-200oC pierd apa, procesul fiind insotit de un efect endoterm pe curba DSC (3.12% vs 2.78%). Proba tratata la vid are o cantitate mai mica de apa, ceea ce era intr-un fel de asteptat. In zona de descompunere a antibioticului 200-350oC pare ca proba cu vid ar avea mai mult antibiotic (pierdere de masa mai mare cu ~ 1%), dar in final masa reziduala este asemanatoare.

Testarea activitatii biologice

Tulpinile utilizate pentru acest studiu au fost obtinute din colectia de tulpini a laboratorului de Microbiologie, Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucuresti.

În scopul studiului au fost selecționate, purificate, identificate și cultivate pe medii de cultură adecvate, 3 tulpini bacteriene diferite prelevate din diferite medii, după cum urmează:

Coci gram pozitivi- Staphylococcus aureus

Bacili gram negative- Pseudomonas aeruginosa

Fungi-Candida albicans

Pentru a studia testarea activitatii biologice a probelor ce contin antibiotic (ampicilina, neomicina sau eritromicina) pe support pe MMT/Bentonit, s-a utilizat metoda standard de determinare a efectului antimicrobian al antibioticelor prin “antibiogramă”.

Pe parcursul experimentelor s-au urmărit atât efectul de inhibiție (dezinfectant), cât și efectul de stimulare a dezvoltării culturilor microbiene (nutrificator) de către substanțele de analizat. Concentrația minimă inhibitorie a substanțelor, s-a estimat prin măsurarea diametrului minim de inhibiție al culturii bacteriene și fungice (M.I.C., μg/mL), care reprezintă, lățimea zonei de inhibiție [mm], din jurul microdiscului din hîrtie de filtru, impregnat cu substanța de analizat sau din jurul substantei de analizat introdusa direct in mediul de cultura ce contine agentul patogen.

Totodată, s-a urmărit dacă la contactul imediat realizat între fiecare din substanțe și cultura de germeni mobili, este influențată sau nu, viabilitatea acestora, mobilitatea lor, identificându-se daca răspunsul este bactericid, bacteriostatic sau substanța nu prezintă activitate microbiana. În plus s-a urmărit și puterea de difuzie a substanței în mediul de cultură, pe bază de geloză.

Substantele de analizat au fost testate pentru evidentierea actiunii inhibitoare a acestora pe un spectru larg de culturi bacteriene. Determinarea puterii bactericide a fost stabilita prin masurarea diametrului zonei de inhibiție a tulpinii microbiene, rezultat în urma introducerii substantei de analizat în mediul de agar-agar însamantat cu cultura bacteriana respectiva, figura 4.1.

Fig. 35. Actiunea inhibitorie a substantei de analizat introdusa in mediul de cultura cu agentul patogen

In analiza activitatii antimicrobiene a compusilor prezentati mai sus s-au parcurs 2 etape:

identificarea tulpinilor patogene ce urmeaza a fi testate din diverse medii biologice:

insamantarea tulpinilor etalon

identificarea prin metoda “antibiogramei” tulpinilor prelevate Coci gram pozitivi: Staphylococcus aureus, Bacili gram negativi: Escherichia Coli

Fungi:Candida albicans

identificarea comportamentului microbian a tulpinii noi comparativ cu tulpinile etalon carora li se cunoaste activitatea antimicrobiana asupra diferitelor clase de antibiotice.

Rezultate și discuții

Rezultatele obținute după însămânțarea, pe medii de cultură solide, a unor specii de coci Gram-pozitivi, bacili Gram-negativi și fungi, cu fiecare din soluțiile de analizat, au permis o încadrare specifică a substanțelor analizate, privind activitatea antimicrobiană si antifungica a acestora pe specii bacteriene și fungi, în scopul evidențierii activității liganzilor, a complecșilor metalici cu același ligand, dar și cu liganzi diferiți, ce prezintă efectul cel mai puternic inhibitor asupra diferitelor tulpini patogene de bacterii și fungi.

Încadrarea acțiunii substanței analizate asupra speciilor bacteriene și fungice testate, s-a făcut conform datelor de literatură [327-332], astfel:

Categoria I – Nu influențează creșterea culturii microbiene;

Categoria a II-a – Inhibă creșterea culturii microbiene, cu diametrul de inhibiție

Ø=0,1 – 10 mm  activitate microbiostatica

Ø= 10 – 20 mm  activitate microbicida

Ø > 20 mm activitate microbicida

Gehad G. Mohamed si colab. [PdOH] au realizat o incadrare a acțiunii substanței analizate asupra speciilor bacteriene și fungice in functie de diametru de inhibitie astfel:

Ø = 1–5 mm  activitate antimicrobiana si antifungica scazuta;

Ø = 6–10 mm activitate antimicrobiana si antifungica moderata

Ø = 11–15 mm  activitate antimicrobiana si antifungica marita.

Ø > 15 mm  activitate antimicrobiana si antifungica foarte buna

Fig. 36- Reprezentare grafica activitate antimicrobiana Coci gram pozitivi: Staphylococcus aureus

Referitor la activitatea antimicrobianǎ a probelor ce contin suport de MMT/Bentonit cu antibiotic, asupra bacteriei Gram pozitive Staphylococcus aureus putem observa valori cuprinse între 4 – 37 mm. Probele cu cele mai bune activitati antimicrobiene sunt cea care contine Eritromicina +MMT realizată prin metoda adsorbtiei prin vid, avand 37 mm ceea ce denotă ca proba are activitate antimicrobiana foarte buna, iar urmatoarea proba cu rezultate antimicrobiene bune este proba preparata prin metoda absorbtiei solutie apoasa compusa tot din suportul MMT si antibioticul eritromicina, aceasta avand 25 mm ceea ce insemna ca substanta activa actioneaza bine suportul dezvoltand dupa cum se observa activitati antimicrobiene si microbicide. De altfel , in toate cazurile activitatea antimicrobiană este superioara in cazul probelor obținute prin metoda absorbției in vid, datele fiind in corelare cu cantitatea de antibiotic absorbit si cu caracteristicile proceselor de eliberare prezentate anterior. Mai mult, lipsa activității antimicrobiane a probelor cu ampicilina obtinute prin absorbție din solutie confirmă faptul ca ampicilina nu se absoarbe pe MMT si Bentonit.

Din reprezentarea grafica se poate observa ca ampicilina are o activitate antimicrobiana si antifungica marita pentru proba obtinuta prin metoda adsorbtiei in vid, in timp ce pentru metoda solutiei apoase activitatea este foarte scazuta, ceea ce denota metoda adsorbtiei in vid este mult mai buna pentru obtinerea materialelor cu activitati antimicrobiene.

Fig. 37- Reprezentare grafica activitate antimicrobiana bacili gram negativi: Escherichia Coli

Referitor la activitatea antimicrobianǎ a probelor ce contin suport de MMT/Bentonit cu antibiotic, asupra bacteriei bacili gram negativi: Escherichia Coli, observam ca Escherichia Coli are rezistenta la probele studiate, dar cea mai buna activitate antimicrobiana o are proba de neomicina+MMT obtinuta la vid, avand 16 mm. Acelasi antibiotic a inregistrat activitate buna si pe suportul bentonit avand 8 mm. In ambele cazuri, probele cu neomicina obtinute prin adsorbție sub vid arata o activitate antimicrobiana egala sau superioara omologilor obtinuti prin absorbtie din solutie apoasa.

Analizand reprezentarea grafica observam ca singura substanta activa ce a avut activitate antimicrobiana a fost neomicina, ceea ce inseamna ca probele prezinta potential de distrugere a acestei bacterii.

Fig. 38- Reprezentare grafica activitate antigungica Fungi: Candida albicans

Referitor la activitatea antifungica a probelor ce contin suport de MMT/Bentonit cu antibiotic, asupra speciei de fungi: Candida albicans, se poate observa ca probe ce au avut in principal aceasta activitate au fost cele care au avut in compozitie antibioticul neomicina. Un alt antibiotic ce a aratat activitate antifungica a fost ampicilina pe suportul MMT.

Fig. 39- Reprezentare grafica diametrul zonei de inhibitie

CMI (stabilirea concentratiei minime inhibitorii) – metoda cantitativa

Pentru stabilirea CMI s-a utilizat o metoda cantitativă, bazata pe realizarea unor microdiluții

seriale binare în mediu lichid (bulion simplu), repartizat steril în plăci cu 96 de godeuri. In

primul godeu al fiecarui sir s-a adaugat o cantitate de compus/nanosistem bioactiv

corespunzatoare unei concentratii de 5mg/mL. Ulterior, cu ajutorul unei micropipete s-au 12

realizat dilutii binare, pornind de la godeul 1 (concentratie 2mg/mL) pana la godeul 12 (unde

concentratia finala va fi de 0.000976563mg/mL). Dupa realizarea microdilutiilor, in fiecare

godeu s-au adaugat 15 μL suspensie microbiana de densitate 0.5 McFarland. Placutele

insamantate au fost incubate 24h la 37

o

C, iar dupa incubare valoarea CMI pentru fiecare

compus/nanosistem in parte s-a stabilit macroscopic, ca fiind ultima concentrație a acestuia la

care nu s-a mai observat apariția creșterii microbiene, respectiv apariția turbidității mediului, dar

și prin citire spectrofotometrică a absorbanței culturii microbiene dezvoltate în mediul lichid la

620 nm.

Biofilm – material solubil/dispersabil

Pentru stabilirea efectului biomaterialelor obtinite asupra producerii de biofilme s-a utilizat o

metoda cantitativă, bazata pe realizarea unor microdiluții seriale binare în mediu lichid (bulion

simplu), repartizat steril în plăci cu 96 de godeuri. In primul godeu al fiecarui sir s-a adaugat o

cantitate de compus/nanosistem bioactiv corespunzatoare unei concentratii de 5mg/mL. Ulterior,

cu ajutorul unei micropipete s-au 12 realizat dilutii binare, pornind de la godeul 1 (concentratie

2mg/mL) pana la godeul 12 (unde concentratia finala va fi de 0.000976563mg/mL). Dupa

realizarea microdilutiilor, in fiecare godeu s-au adaugat 15 μL suspensie microbiana de densitate

0.5 McFarland. Placutele insamantate au fost incubate 24h la 37

o

C, iar dupa incubare biofilmele

formate au fost spalate cu grija e 3 ori cu apa fiziologica sterila (AFS) si fixate cu Metanol rece

timp de 5 minute.

Dupa indepartarea metanolului, placutele uscate au fost colorate cu solutie cristal violet 1% timp

de 20 minute. Dupa colorare, excesul de colorant a fost spalat cu apa de robinet, iar colorantul

inclus in celulele biofilmului format pe peretii godeului a fost solubilizat cu o solutie de acid

acetic 33%. Suspensiile astfel obtinute au fost utilizate pentru interpretarea rezultatelor, bazata pe

citirea spectrofotometrica a absorbantei suspensiei colorate la 492nm.

CMI (stabilirea concentratiei minime inhibitorii) – metoda cantitativa

Pentru stabilirea CMI s-a utilizat o metoda cantitativă, bazata pe realizarea unor microdiluții seriale binare în mediu lichid (bulion simplu), repartizat steril în plăci cu 96 de godeuri. In primul godeu al fiecarui sir s-a adaugat o cantitate de compus/nanosistem bioactiv corespunzatoare unei concentratii de 5mg/mL. Ulterior, cu ajutorul unei micropipete s-au 12 realizat dilutii binare, pornind de la godeul 1 (concentratie 2mg/mL) pana la godeul 12 (unde concentratia finala va fi de 0.000976563mg/mL).

Dupa realizarea microdilutiilor, in fiecare godeu s-au adaugat 15 μL suspensie microbiana de densitate 0.5 McFarland. Placutele insamantate au fost incubate 24h la 37oC, iar dupa incubare valoarea CMI pentru fiecare compus/nanosistem in parte s-a stabilit macroscopic, ca fiind ultima concentrație a acestuia la care nu s-a mai observat apariția creșterii microbiene, respectiv apariția turbidității mediului, dar și prin citire spectrofotometrică a absorbanței culturii microbiene dezvoltate în mediul lichid la 620 nm.

Valorile CMI pentru probele de argileȋncarcate cu antibiotice sunt promitatoare, majoritatea sistemelor obținute avand CMI mai mic, ceea ce arata o activitate mai pronuntata. In cazul probelor ȋncarcate cu neomicina, prin metoda absorbției din soluție, comportamentul este similar. Pentru S. aureus si E. Coli are loc o ȋnbunatatire substantiala a CMI in timp ce pentru C. Albicans CMI ramane neschimbat. Un comportament similar este observat si in cazul probelor ȋncarcate sub vid valorile CMI sunt similare insa putin mai mari ceea ce dovedeste faptul ca activitatea scade ȋn special in cazul suportului pe baza de MMT in timp ce in cazul suportului bentonit activitatea este imbunatatita, pentru toate cele 3 culturi studiate.

In cazul probelor obtinute prin absorbție sub vid, pentru ambele antibiotice (Ampicilina si eritromicina) valorile CMI sunt imbunătățite fiind in general superioare sistemelor similare obținute prin absorbție din soluție apoasă.

Biofilm – material solubil/dispersabil

Pentru stabilirea efectului biomaterialelor obtinite asupra producerii de biofilme s-a utilizat o metoda cantitativă, bazata pe realizarea unor microdiluții seriale binare în mediu lichid (bulion simplu), repartizat steril în plăci cu 96 de godeuri. In primul godeu al fiecarui sir s-a adaugat o cantitate de compus/nanosistem bioactiv corespunzatoare unei concentratii de 5mg/mL. Ulterior, cu ajutorul unei micropipete s-au 12 realizat dilutii binare, pornind de la godeul 1 (concentratie 2mg/mL) pana la godeul 12 (unde concentratia finala va fi de 0.000976563mg/mL).

Dupa realizarea microdilutiilor, in fiecare godeu s-au adaugat 15 μL suspensie microbiana de densitate 0.5 McFarland. Placutele insamantate au fost incubate 24h la 37oC, iar dupa incubare biofilmele formate au fost spalate cu grija e 3 ori cu apa fiziologica sterila (AFS) si fixate cu Metanol rece timp de 5 minute.Dupa indepartarea metanolului, placutele uscate au fost colorate cu solutie cristal violet 1% timp de 20 minute. Dupa colorare, excesul de colorant a fost spalat cu apa de robinet, iar colorantul inclus in celulele biofilmului format pe peretii godeului a fost solubilizat cu o solutie de acid acetic 33%. Suspensiile astfel obtinute au fost utilizate pentru interpretarea rezultatelor, bazata pecitirea spectrofotometrica a absorbantei suspensiei colorate la 492nm.

In cazul biofilmelor de S. Aureus, sistemele dezvoltate sunt mai putin active ȋn comparatie cu substanțele antibiotice considerate. Activitatea antibiofilm a probelor obținute prin absorbție sub vid este ȋn general superioară probelor obținute prin absorbție din soluție apoasă, exceptie probele cu neomicina care au activitati similare

Si ȋn cazul biofilmului E Coli activitatea antibiofilm cea mai pronuntata revine probelor obținute prin absorbtie sub vid excepție cazul probelor ȋncarcate cu neomicina cȃnd activitatea antibiofilm este ușor inversată.

In cazul biofiulmului de C albicand, evoluția activitatii antibiofilm este mult mai complexa, exista sisteme care manifesta o activitate superioara in cazul obțienrii prin absorbția sub vid (probele cu eritromicina) caz in care activitatea antibiofilm este chiar superioara substantei active pure, in cazul probelor cu neomicina activitatea antibiofilm impootriva C albicans este practice independent de ruta de obtinere si comparabile cu cea a substantelro active pure ȋn timp ce in cazul probelor cu ampicilina nu poate fi evidentiata o tendinta generala ceeace dovedeste un mechanism de actiune foarte complex.

Concluzii

S-a facut studiu de literatura care a permis interpretarea metodelor prezentate, metoda solutiei apoase si metoda adsorbtiei in vid. Au fost obtinute 12 probe, probe ce includ doua suporturi MMT/Betonit si trei substante antimicrobiene=antibiotice (ampicilina, neomicina si eritromicina) cu perspective de utilizare in aplicatii ce impun sterilizarea sau meu mentinerea unui mciroclimat lipsit de culturi microbiene.

Probele sus mentionate au fost obtinute prin doua metode similare și anume absorbția din solutia apoasă a antibioticului și respectiv prin absorbție sub vid. Prin metoda absorbției din solutii apoase se observa faptul ca retinerea de antibiotic este moderata sau chiar 0 in timp ce in metoda adsorbtiei in vid a permis o incarcare practica agala cu cantitatea de antibiotic luat in calcul cea ce face ca aceasta metoda sa fie accesibila, pierderile fiind minime.

Pe baza analizei termo-gravimetrice se observă că neomicina si eritromicina se incarca similar indiferent de ruta aleasa atunci cand suportul este bentonita insa ȋn cazul absorbției de ampicilina din soluție, cantitatea de antibiotic retinuta este cu 3.5% mai putin comparativ cu ruta prin absorbție sub vid. In cazul probelor pe baza de MMT, in toate cazurile analizate, metoda de absorbtie sub vid este recomandată deoarece gradul de retinere al antibioticului este net superior.

Probele analizate au manifestat activitate antimicrobiana si antifungica pe diverse linii de tulpini creând astfel premisele utilizării lor în diverse apolicații medicale sau de mediu. Mai mult, argilele obținute pot fi considerate în scopul obținerii de materiale complexe, cu aplicatii in constructii, cresterea animaleleor, etc. Includerea acestor argile incarcate cu antibiotice sau alte substante antimicrobiene in materiale liante/betoane poate duce lka obtinerea unor materiale speciale, antimicrobiene speciale cu potential de exploatare în scopul construirii unor fundatii/cladiri care sunt in contact cu o umiditate ridicata, scopul fiind acela de a elimina riscul apariției igrasiei. De asemeenea, aceste argile antimicrobiene pot fi utilizate in scopul dezvoltarii de materiale adsorbante pentru lizierele pisicilor, argilele avand atat rolul de a adsorbi mirosurile dar si de a permite eliberarea de antibiotic si implicit de a mentine sterilitatea acestora. Evident aceste materiale pot si exploatate si in alte scopuri care vor face obiectul unor viitoare cercetari.

Daca activitatea antibiofilm studiata pe S Aureus, E Coli si C albicans este in general modesta, activitatea antimicrobiana in multe cazuri este superioara substantei active pure ceea ce ofera premisele ca aceste sisteme sa fie destinate prevenirii dezvoltării de biofilme si nu distrugerii acestora.

Bibliografie

[1a] http://echa.europa.eu/web/guest/information-on-chemicals/biocidalactive-substances

[1b] http://echa.europa.eu/web/guest/information-on-chemicals/biocidalactive-substances)

[1] J.M.HARTWEEL, The diverse usesof montmorillonite, The fullers earth union limited, 1965 (pag.111-120)

[2] Fatma M.DardiraAya S.MohamedbMostafa R.AbukhadrabEzzat A.AhmedaMamdouh F.Soliman; Cosmetic and pharmaceutical qualifications of Egyptian bentonite and its suitability as drug carrier for Praziquantel drug, European Journal of Pharmaceutical Sciences,2018 (pag.320-329)

[3] http://aurelianlupu.blogspot.com/2015/05/bentonita-prezentare-si-cateva.html,Arurelia Albu, 2015

[4] Bentonite. In: European Pharmacopoeia (Ed.), European Pharmacopoeia Convention, Strasbourg, France, 5th ed. pp. 1068.

[5] Violeta Pașcalău, Violeta Popescu Controlled drug delivery systems. hydrogels, Confetinta Nationala multidisciplinara- cu participare international “Profesorul Hidroenergeticii Romanesti” 2011

[6] Bharti Arora, Rohit Bhatia, Pankaj Attri, Bionanocomposites: Green materials for a sustainable future, New Polymer Nanocomposites for Environmental Remediation, 2018, (Pages 699–712)

[7] http://www.romdril.ro/produse.php?pagina=be.php

[8] Ph.D Thesis B.D. Kevadiya ,Chapter 1,Polymer- Silicate Bio/Nanocomposites, Introduction & Review of Literature (pag.2-20)

http://shodhganga.inflibnet.ac.in/bitstream/10603/27132/8/08_chapter%201.pdf

[9] S. Simovic, D. Losic, K. Vasilev, Controlled drug release from porous materials by plasma polymer deposition, Chem. Commun. 46 ,2010 (pag.1317-1319).

[10] N. Saigal, S. Baboota, A. Ahuja, J. Ali, Site specific chronotherapeutic drug delivery systems: A patent review, Recent Pat. Drug Deliv. Formul. 3,(2009( pag.64-70).

[11] S.J. Choi, J.M. Oh, J.H.Choy, Human-related application and nanotoxicology of inorganic particles: complementary aspects, J. Mater. Chem. 18 ,2008 (pag.615-620).

[12] M. Stromme, U. Brohede, R. Atluri, Alfonso E. Garcia-Bennett, Mesoporous silicabased nanomaterials for drug delivery: evaluation of structural properties associated with release rate, WIREs Nanomed. Nanobiotech.1,2009 (pag.140-148)

[13] https://www.euforaje.ro/despre-bentonita-in-foraje-puturi/

[14] Alexandre Loukanov, Krassimir Genov, Anatoliy Angelov, Aluminium silicates (clinoptilolite, perlite and bentonite) modified with silver as catalyst and antibacterial agent, 2012, (pag.345-353).