Determinari Cantitative In Spectoscopria Uv Vis

Introducere

Sănătatea organismului înseamnă o alimentație echilibrată cantitativ și calitativ.

Pentru a avea o populație sănătoasă și pentru a reduce riscul îmbolnăvirilor, respectiv pentru ameliorarea stării de sănătate trebuie să avem în vedere următoarele (Banu și colab., 2011).

Să avem o alimentație conștientă cantitativ și calitativ;

Să avem un aport suficient de vitamine și minerale mai ales în condițiile vieții moderne cu mult stres;

Să avem o dietă care să mențină echilibrele biologice;

Pentru a ajuta organismul să se echilibreze acido-bazic este necesar un compromis între alimentele acidifiante și cele alcalinizante

Trebuie avut în vedere că tulburările la nivelul psihicului influențează major dezechilibrele din organism.

Partea I. STUDIU BIBLIOGRAFIC

1.Cereale

1.1.Compoziție chimică și transformări biochimice în cereale

Aici o sa scriu eu

1.2. Orzul

1.3. Ovăz

1.4. Grâu

1.5. Lucernă

1.6. Obtinerea pudrelor verzi de cereale

2. Produși secundari de metabolism în alimentele de origine vegetalӑ

2.1. Compuși polifenolici

In ultimii ani consumul de fructe și legume se bucură de un interes crescut, deoarece o serie de studii biochimice și epidemiologice au demonstrat că există o legătură strânsă între consumul de fructe și legume și o rată redusă a bolilor de inimă, a cancerului și a unor boli degenerative, cum ar fi îmbătrânirea. Această acțiune protectivă se datorează prezenței antioxidanților ca de exemplu: pigmenți, Vitamina C, vitamin E, provitamina A dar și a compușilor polifenolici.

Polifenolii sunt răspânditi pe scară largă în plante și contribuie la calitatea organoleptică și nutritivă a acestora (Garcia-Salas și colab, 2010). Compușii polifenolici sunt o clasă importantă de antioxidanți naturali.

Din punct de vedere chimic fac parte din familia moleculelor organice hidrosolubile, foarte des întâlnite în plante. Compușii fenolici sunt derivați mono sau polihidroxilici ai arenelor în care gruparea hidroxil este legată direct de un radical aril. Ei cuprind două grupe principale de substanțe: fenoli simpli și polifenoli. În plante, polifenolii se găsesc sub formă de monomeri, oligomeri și polimeri. Aceste substanțe sunt utilizate de plantă in reacțiile sale de auto-apărare, împotriva factorilor de mediu.

Polifenolii sunt produși secundari de metabolism deosebiți de importanți pentru aspectele funcționale ale plantelor, inclusiv roluri structurale în diferite țesuturi de susținere sau de protecție, implicare în strategiile de apărare, și proprietăți de semnalizare, în special în interacțiunile dintre plante și mediu. Plantele superioare sintetizează mii de astfel de compuși (Boudet, 2007).

Cei mai des intalniti polifenoli în dieta noastră, sunt acizii fenolici (acidul benzoic și cinamic), și flavonoidele. Acizii fenolici apar sub formă de acizi liberi, esteri, glicozide, flavonoide, etc. Flavonoidele sunt formate din două inele aromatice legate prin trei carburi care formeaza, de obicei, un heterociclu oxigenat. Flavonoidele pot fi impărțite în 13 clase: calcone, dihidrocalcone, aurone, flavone, flavonoli, flavanoli (catechine), flavandioloi, leucoantocianidine, antocianidine, isoflavone, protoantocianidine, taninuri condensate sau flavonoide (Escarpa și Gonzales, 2008).

Compușii polifenolici, ca antioxidanți duc la evitarea oxidării celulare si astfel luptă împotriva îmbătrânirii celulare. Acest lucru este important în prevenirea și tratamentul cancerului, a bolilor imflamatorii, cardiovasculare și neurodegenerative. Au un efect protector împotriva osteoporozei.

Unii compuși polifenolici au funcții gustative și vizuale. De exemplu flavononele imprimă gustul amar al grapefruitului, taninurile determină astringent multor fructe, iar antocianii imprimă culoarea fructelor roșii.

2.2. Flavonoide

Flavonoidele reprezintă o familie de compuși sintetizați de plante care au o structură chimică comună. Sunt pigmenți fenolici care conțin în molecula lor un heterociclu piranic sau furanic condensat cu un inel benzenic. De heterociclu se cuplează un alt inel benzenic. Caracterul fenolic al acestor pigmenți este dat de grupările hidroxilice, de pe inelele benzenice.

Flavonoidele predomină în plantele superioare. Se găsesc în flori, fructe, frunze, tulpini, rădăcini, scoarța copacilor etc. În cantitate mică se găsesc în unele alge, în microorganisme și în unele insecte (flavone). Majoritatea flavonoidelor sunt colorate și contribuie în mare parte la formarea culorii florilor și a fructelor. Se găsesc în natură în stare liberă, dar mai ales sub formă de glicozide.

Sub aspect chimic pigmenții flavonoidici sunt glicozide fenolice, solubile în apă. Se găsesc în sucul vacuolar și în cromoplaste. Se cunosc 6 tipuri de flavonoide: flavani, antocianidine, flavone, flavanone, calcone și aurone. Aceste grupe se deosebesc între ele prin felul heterociclului și prin numărul și poziția grupărilor hidroxilice și metoxilice, legate de inele benzenice.

Flavanii sunt pigmenți care derivă de la flavan (2-fenil-benzopiran, croman). Ei au în moleculă un inel benzopiranic. Au tendință de polimerizare și formează catechine care intră în constituția taninurilor catechinice.

Antocianidine și antociani sunt pigmenți care derivă de la 2-fenil-benzopirenă (2-fenil-cromenă). Ei sunt principalii pigmenți care dau culoarea roșie și albastră florilor și fructelor. Se găsesc în natură de obicei sub formă de glicozide, care poartă numele de antociani. Cele mai importante antocianide sunt: pelargonidina, cianidina și delfinidina, care se deosebesc între ele prin numărul și poziția grupărilor hidroxilice de pe inelul benzenic C.

Flavone și izoflavone, sunt pigmenți galbeni care derivă de la 2-fenil-benzopironă (2-fenil-cromonă) și respectiv de la 3-fenil-benzopironă (3-fenil-cromenă). În natură, flavonele și izoflavonele se găsesc, de obicei, sub formă de glicozide și sunt larg răspândite. Se cunosc peste o sută de flavone care se găsesc în flori, fructe, frunze, în lemn și scoarța copacilor.

Dintre flavonele mai răspândite, fac parte apigenina, luteolina și quercitrina.

Flavonele sunt substanțe cristaline, de culoare galbenă, solubile în apă și alcool. În mediu alcalin, inelul piranic se deschide și se formează dicetone. Flavonele au maxime de absorbție cuprinse între 335-350 nm, iar flavanolii între 360-380 nm. Se găsesc în cantitate mai mare în plantele tropicale și în cele din regiuni montane și alpine. Flavanolii care au un număr mare de grupări hidroxilice și metoxilice pe inelul A sunt intens colorați în galben. Așa sunt gosipetina, quercetagetina care imprimă culoarea galbenă florilor de bumbac, primulelor, numeroaselor compozite. Florile albe au un conținut redus de flavone și de flavanoli.
Flavanone, calcone și aurone, derivă de la 2-fenil-dihidrobenzo-pironă, calconele de la benziliden-aceto-fenonă, iar auronele de la 2-benziliden-cumaranonă. Flavonele sunt pigmenți incolori care însoțesc flavonele. În mediu bazic se transformă în calcone (prin ruperea heterociclului), iar acestea în mediu acid se ciclizează și refac flavonele. Prin oxidare se transformă în aurone, care au o culoare galben-aurie intensă și se găsesc predominant în florile unor compozite.

Prezența flavanonelor în organismele vegetale mărește rezistența acestora la atacul insectelor și al microorganismelor. Ele influențează gustul, aroma și stabilitatea unor preparate extrase din plante. Unele flavonoide se utilizează ca substanțe antioxidante la conservarea grăsimilor, altele se utilizează ca produse farmaceutice.

Au fost identificate peste 6.000 de flavonoide care apar în fructe, legume și băuturi (ceai, cafea și băuturi din fructe).

Potențialele efecte benefice ale flavonoidelor asupra sănătății umane:  antialergice, antiagregant plachetar, antiviral, antiinflamator, are activitate antioxidantă si antitumorală.

Flavonoidele pot forma în organism sisteme de oxido-reducere, cu un rol însemnat în organism. Prezența lor în organismele vegetale mărește rezistența acestora la atacul insectelor și microorganismelor. Unele flavonoide pot fi utilizate la conservarea grăsimilor ca substanțe antioxidante, iar altele ca produse farmaceutice.

2.3 Pigmenții clorofilieni

Frunza reprezintă organul specializat al plantelor cormofite în care se realizează procesul de fotosinteză. Epiderma frunzelor este prevăzută cu stomate, aparat prin care se face schimbul de gaze între frunze și mediul ambiant.

Frunza este străbătută de nervuri, respectiv de fascicole libero-lemnoase, care transportă și distribuie apa și sărurile minerale în limbul foliar, și seva elaborată înspre toate organele plantelor. Frunza conține cloroplaste – organite specializate – în care se desfășoară procesul de fotosinteză.

Adaptările pe care le prezintă cloroplastele pentru desfășurarea procesului de fotosinteză sunt legate de suprafețele mari ale membranelor tilacoide și de prezența pigmenților clorofilieni. Membranele tilacoide au structura asemănătoare cu aceea a membranelor plasmatice, adică sunt alcătuite dintr-un strat dublu de galactolipide în care sunt încorporați pigmenți asimilatori, respectiv clorofilele, carotenoizii și xantofilele (Burzo și colab., 1996).

Clorofila reprezintă pigmentul verde al cloroplastelor, iar denumirea pe care o are provine de la cuvintele „chloros”, care înseamnă verde și „phillon”, care semnifică frunza. Clorofila este alcătuită din 4 nuclee pirolice, care formează nucleul porfirinic, iar în centrul moleculei se află un atom de magneziu, legat prin 2 valențe principale și 2 valențe secundare de inelele pirolice. De nucleul porfirinic se leagă fitolul, alcoolul unei hidrocarburi nesaturate, superioare, cu 20 de atomi de carbon (Neamțu, 1981).

Cele mai răspândite clorofile sunt clorofila a și clorofila b. Clorofila a are o grupare metilică, în timp ce clorofila b are o grupare aldehidică. Raportul dintre clorofila a și b este de 3 /1, și acesta poate să crească, în cazul plantelor heliofile (Burzo și colab., 1996).

Clorofilele a și b, în stare pură, sunt substanțe solide, cristaline, insolubile în apă, dar solubile în solvenți organici (acetonă, alcool, eter, etc). In soluție alcoolică, clorofila a are o culoare albastră-verzuie și o fluorescență roșiatică, iar clorofila b, are o culoare galbenă-verzuie și o fluorescență roșie brună.

Carotenoizii, sunt pigmenți reprezentați, în principal, de carotină și de xantofilă. Ei sunt pigmenți neazotați, care datorită dublelor legături conjugate pe care le conțin toamna dau frunzelor culoarea galbenă, portocalie, roșie sau chiar albǎstruie. In frunze, culoarea lor este mascată de culoarea clorofilelor, care se află în cantitate mai mare.

Sub aspectul proprietăților fizice, carotenoidele sunt substanțe insolubile în apă și solubile în solvenți organici, fapt pentru care unii autori le atribuie și denumirea de lipocromi. Carotenoidele prezintă spectre de absorbție caracteristice, diferite de cele ale pigmenților clorofilieni, proprietate care servește la identificarea lor spectrofotometricǎ.

Din punct de vedere chimic, carotenoidele sunt substanțe active datorită legăturilor duble, conjugate, din molecula lor. Ele dau reacții de adiție și de substituție. Pigmenții carotenoidici se oxidează foarte ușor, iar în contact cu aerul se autooxidează repede și se degradează, din această cauză cantitatea de carotenoizi se micșorează prin păstrare (Neamțu, 1981).

Biosinteza pigmenților se realizează în cicluri biochimice diferite, în funcție de compoziția lor chimică.

Pigmenții clorofilieni se biosintetizează în cloroplaste, în ciclul acidului γ- aminolevulinic. Prin condensarea aminoacidului glicină, cu succinil CoA (produs intermediar al ciclului Krebs),se formează acidul γ-aminolevulinic. Două molecule de acid γ-aminolevulinic formează nucleul pirolic, iar 4 nuclee pirolice dau naștere nucleului porfirinic. Prin legarea magneziului de nucleul porfirinic se formează Mg-porfirina, care se esterifică cu fitolul formând clorofila a.

Pigmenții carotenoidici se biosintetizează în cloroplaste și în cromoplaste, prin ciclu, din acetil CoA, rezultată din biodegradarea glucidelor și lipidelor.

Factorii care influențează biosinteza pigmenților sunt: lumina, temperatura, oxigenul, substanțele minerale, etc.

2.4. Enzimele antioxidante

Factorii de stres pot cauza o schimbare a balanței prooxidant-antioxidante, din celulele vegetale schimbare care se poate datora unei creșteri în frecvența de generare a SRO, ceea ce induce lipidperoxidarea în structurile membranare ale celulelor (Zenkov și colab., 2001).

Sistemele antioxidante joacă un rol important în procesele de neutralizare ale efectelor stresului oxidativ.

Un efect fiziologic direct al AS se datorează influenței acestuia, administrat exogen, asupra activității enzimelor antioxidante. Tratarea plantulelor cu AS, produce o creștere a anionilor superoxid O2-, a H2O2 și o creștere simultană în activitatea enzimei superoxiddismutază (SOD), o enzimă cheie a sistemului antioxidant, dar și a peroxidazei și a catalazei, enzime implicate în neutralizarea SRO (Janda și colab., 1999). In urma acțiunii superoxiddismutatzei în celulele țesuturilor vegetale, are loc dismutarea anionului superoxid, urmată de o acumulare de H2O2, însoțită de o activare a enzimei peroxidază. Unele enzime, cum ar fi guaiacol-peroxidaza și glutation-reductaza, sunt activate de tratamentele efectuate cu soluții de AS, iar altele, cum ar fi catalaza, sunt inhibate, în urma tratamentelor cu AS, observându-se modificări în amprentele izoenzimelor acesteia (Nemeth și colab., 2002). Nu se cunoaște însă exact dacă această inhibiție este specifică doar pentru catalază, sau este valabilă în cazul tuturor enzimelor care conțin fier în compoziția lor. Catalaza este o enzimă tetramerică, care conține câte o grupare hem, în toate subunitățile sale. La porumb, catalaza există sub 3 izoforme, distincte din punct de vedere biochimic. Expresia acestor izoenzime, în diferite țesuturi vegetale și în diferite stadii de dezvoltare ale plantei, au fost studiate în detaliu de către Scandalios și colaboratorii, și publicate în anul 1997.

2.5. Vitamina C

Vitamina C (acid ascorbic) – este o substanță, albă, cristalină, solubilă în apă, care are funcții importante în corpul omenesc, stimulează metabolismul glucidelor, lipidelor și a numeroși aminoacizi. Are rol important în stimularea sau inhibarea unor sisteme enzimatice din lanțul oxidării celulare, fiind un antioxidant puternic care contribuie la neutralizarea radicalilor liberi. Este vitamina de care omul are cea mai mare nevoie pentru că nu o poate sintetiza.

Vitamina C

În avitaminoză pronunțată apare boala numită scorbut, caracterizată prin sângerări la nivelul gingiilor, apariția de hematoame, anemie, tulburări digestive. Pentru prevenirea scorbutului este necesară o cantitate de 20 mg acid ascorbic, dar pentru asigurarea unor funcții fiziologice normale este nevoie de cantități mai mari cuprinse între 50-100mg acid ascorbic/zi.

În rația alimentară zilnică sunt necesare cantități de 25-30 mg de vitamină C. Deși produsele care constituie baza alimentației asigură suficiente vitamine pentru organism, totuși sunt perioade ale anului când se simte lipsa de vitamine, în special vitaminele A,D,C mai ales la copii, adolescenți și cei cu muncă fizică grea. În aceste cazuri se pot administra vitamine farmaceutice, se poate mări conținutul de vitamine din alimente, sau se consumă suplimente nuritive cu conținut mare de vitamina C. Vitaminele farmaceutice trebuie administrate împreună cu alimentele și nu independent.

O importanță deosebită, pe durata transformărilor tehnologice ale materiei prime în aliment, o prezintă conservarea vitaminelor și crearea condițiilor impuse de sensibilitatea diferită a vitaminelor la lumină, temperatură, pH, umiditate, etc. Este cunoscut faptul că vitamina C se distruge prin fierbere și prin oxidare.

Menținerea vitaminelor în alimente depinde de prelucrarea industrială, de depozitare și de prelucrarea culinară a materiilor prime agroalimentare. În majoritatea acestor procese vitaminele se pierd, dar sunt cazuri când în timpul prelucrării alimentelor unele vitamine se mențin sau chiar cresc cantitativ.

Pentru aprecierea conținutului de vitamine trebuie să ținem cont de pierderile efectuate, adică de faptul că vitaminele se schimbă și iau forma biologic inactivă sau o parte din ele trec în deșeuri neutilizabile pentru alimentația oamenilor (Purcărea, 2008).

Cantitatea de vitamina C din alimente provenite din plante depind de:

varietatea exactă a plantei,

condițiile solului

climatul în care s-a dezvoltat,

perioada de timp dintre recoltare și consumare,

condițiile de păstrare,

metoda de preparare -gătitul în general, se presupune, distruge vitamina C.

3. Determinǎri cantitative în spectroscopia UV -VIS

Înălțimea curbei și suprafața încadrată de curbă intr-un spectru de absorbție reprezintă caracteristici cantitative care servesc la determinarea concentrației substanțelor din probe. Dacǎ se determinǎ absorbanțele la concentrații diferite la lungimea de undǎ corespunzǎtoare maximului de absorbție se obține așa numita curba de etalonare care servește la analiza cantitativă. Nu întotdeauna punctele se situează toate, în mod riguros, pe o dreaptă deoarece intervin erori experimentale și din același motiv, în practică, dreapta nu trece exact prin origine.

Determinarea concentratiei pentru proba necunoscutǎ se poate face prin mai multe metode (Chis, 2010):

Determinarea concentrației prin comparație cu un etalon de concentrație cunoscută.

Cea mai simplă metodă de determinare a concentrației pe cale fotometrică este aceea de a compara absorbanța (A) unei soluții de concentrație cunoscută a substanței de analizat cu absorbanța (Ax) a unei soluții de concentrație necunoscută a aceleași substanțe. Este evident că fiind vorba de aceeași substanță, absorbanțele molare sunt identice iar substanța analizată trebuie să aibă aceeași grosime, ceea ce presupune folosirea de cuve identice.

Unde:

εmol – coeficientul de extincție molară pentru soluția de concentrație cunoscută, respectiv de concentrație necunoscută,

b-grosimea probei din cuvă,

c-concentrația cunoscută a probei de referință,

cx- concentrația necunoscută a probei analizată.

Prin împărțirea celor două ecuații se obține:

Iar după simplificarea coeficientului molar și a grosimii stratului de care sunt aceleași pentru ambele probe, ecuația de mai sus devine:

Ecuația din care se poate calcula concentrația necunoscută este:

Calculul concentrației prin comparație este folosit totdeauna atunci când una din componentele sistemului suferă variații în timp. De asemenea esta valabil numai atunci când dependența între absorbanță și concentrație este liniară.

Prin interpolare pe curba de etalonare.

Determinarea concentrației necunoscute a probei analizate cu ajutorul curbei de etalonare se face prin interpolarea absorbanței măsurate pentru acea probă pe axa abscisei unde se citește concentrația ei.

Prin intermediul ecuației de regresie

La fotometre moderne prevăzute cu microprocesor, perechile de valori de absorbție-concentrație cu care se realizează curba de etalonare sunt memorate, iar computerul poate sǎ afișeze alǎturi de curbǎ și ecuația care o descrie alǎturi de termenul R2, mǎsurǎ a exactitǎții pentru determinarea în cauzǎ, dupǎ cum se observǎ ȋn figura III. . Pe baza ecuației care descrie curba:

y = ax +b, de unde x = (y- b)/a

se determinǎ concentrația necunoscutǎ cx

cx = (absorbanțax – b)/a

Unele aparate fac extrapolarea automat, apararul afișând direct numeric valoarea concentrației pentru proba necunoscutǎ.

Prin intermediul factorului de pantǎ mediu

Dacǎ nu avem posibilitatea utilizǎrii programului Excel prin intermediul cǎruia se genereazǎ automat ecuația curbei, se poate folosi metoda factorului de pantă pe care unele standarde de metodǎ o și solicitǎ.

Se calculează factorul de transformare (de pantă) F făcând raportul dintre concentrațiile și absorbanțele corespunzătoare pentru fiecare soluție care formează scara etalon.

Ci

Fi = ––

Ai

În continuare se calculează media aritmetică a valorilor obținute Fi, notată cu Fm, unde i are valori de la 1 la maxim n, în funcție de numărul de soluții etalon utilizate pentru obținerea punctelor prin care se obține curba de etalonare (minim 5 maxim 10, în general).

Concentrația probei necunoscute se determină prin calcul, înmulțind absorbanța citită Ax cu Fm.

Cx = Ax • Fm

Valorile Fi trebuie să fie cât mai apropiate, altfel înseamnă că s-a produs o eroare experimentalǎ, pentru metodele cunoscute, sau metoda nu este aplicabilǎ în domeniul de concentrații ales. Valorile Fi nu pot fi perfect identice. În general standardele de metodă solicită o abatere maximǎ admisă între valori.

Determinarea concentrației cu ajutorul unui factor constant (coeficient molar de absorbanță)

La majoritatea determinărilor fotometrice de absorbție, există în domeniul de măsurare o dependență liniară între concentrația substanței de analizat și absorbția de lumină, astfel încât să se poată aplica legea Lambert-Beer. În această situație dacă coeficientul molar de extincție este cunoscut se poate determina concentrația substanței de analizat fără curbă de etalonare folosind legea Lambert-Beer:

PARTEA II – CONTRIBUȚII PROPRII

5. Scopul lucrării

Alimente alcaline ……

Produșii secundari de metabolism din pudrele de cereale verzi contribuie la profilaxia  sau la ameliorarea unor afecțiuni, asigurând astfel menținerea stării de sănătate.

Scopul prezentei lucrări de disertație este de a determina astfel de produși secundari de metabolism din pulbere de orz verde, pulbere de ovăz verde, pulbere de grâu verde și pulbere de lucernă, prin spectrofotometrie molecularǎ.

6.Materiale și metode de analiză

6.1.Materiale analizate

Plantele luate în studiu au fost reprezentate de:

pulbere de orz verde,

pulbere de ovăz verde,

pulbere de grâu verde

pulbere de lucernă – produse importate și comercializate de Phyto-Biocare.

Pentru fiecare parametru determinat în cazul fiecărei plante s-au executat câte 3 repetiții.

Fig. 6.1. Imagini probe analizate (pliant reclama)

6.1.1. Orzul verde

Conține: – vitamina A, complexul B, și vitaminele C, P si E

minerale Ca, Mg, K,Fe, Cu, Zn

Fibre vegetale, enzime, clorofilă

Polifenoli, bioflavonoide, polizaharide

Efecte: – tonifica, energizează și detoxifică organismul

Întărește sistemul imunitar

Reglează și protejează sistemul digestiv

Scade colesterolul

Antiinflamator natural

Grăbește refacerea organismului după efort intens sau în convalescență

6.1.2. Ovăzul verde

Conține: – vitamina A, complexul B – înspecial B6, și vitaminele C, K si E

minerale Ca, Mg, K, Fe, Cu, Zn

Fibre vegetale, enzime, clorofilă

Polifenoli, polizaharide

Efecte: – tonifica general cu efect special de nutriție și de susținere a sisitemului nervos central

creste rezistența la stres și oboseală fizică și intelectuală

Stimuează și întărește sistemul imunitar

Energizează, tonifică și redă pofta de viață.

6.1.3. Grâu verde

Conține: – vitamina A, complexul B – înspecial B6, și vitaminele C, K si E

minerale Ca, Mg, K, Fe, Cu, Zn

betaglucan șî alte polizaharide

Fibre vegetale, clorofilă, polifenoli;

Este cea mai importantă sursă de enzime ntioxidante – citocrom oxidază, superoxiddismutază, catalază – enzime active în procesul redox din organism

Efecte: – detoxifiant

Protecție împotriva radicalilor liberi

Tonic general

Alcalinizant

Reface echilibrul biochimic al organismului

6.1.4. Lucernă

Conține: – vitamina B6, și vitaminele C, D, E, K si U (anitulcer) vitamina U nu este de fapt o vitamina, ci este un termen folosit care se refera la enzima S-methylmethionine sau enzima S.

minerale P, Mg, K, Fe, Ca

Fibre vegetale, enzime, clorofilă

Efecte: – tonifica, energizează și remineralizează organismul

Stimulează digestia

Protejează și reface mucoasa gastrică

Stimulează funcția hepatică și secreția biliară

Scade colesterolul

Influențează fixarea calciului în oase, foarte util în osteoporoză, în special persoanelor de vârsta a treia.

6.2.Metode de analiză

Determinările s-au efectuat pe băuturile preparate, respectiv 100 ml apă cu adaos de pudră de orz, ovăz, grâu si lucernă.

Fig. 6.2 – Pregătirea extactului care urmează să fie analizat

6.2.1. Determinarea compușilor fenolici din vegetalele cu frunze

Principiu

Reactivul Folin-Ciocâlteu, un reactiv complex pe bazǎ de acid fosfomolibdenic și fosfotungstic. În mediu basic, compușii fenolici transferǎ electroni cǎtre molibden formând un complex colorimetrabil albastru a cǎrui absorbanțǎ se poate mǎsura la lungimi de undǎ între 750 – 765 nm. Mediul bazic este creat de cǎtre soluția de carbonat de sodium care ajusteazǎ pH-ul în jur de 10. Metoda se folosește pentru cuantificarea compușilor polifenolici din numeroase alimente de origine vegetalǎ cum ar fi: legume frunzoase și condimente (Fahad Al-Juhaimi and Kashif Ghafoor, 2011), vin (Singleton et al.,1999), cacao (Wollgast, 2004), tomate (Devanand et al., 2006), vișine (Filimon et al, 2011) și origine animalǎ cum este mierea de albine (Mărghitaș et al, 2009), etc.

Reactivi și aparaturǎ

Carbonat de sodium anhidru, soluție 20%

Reactiv Folin-Ciocâlteu, 0,1N

Etalon: soluție acid galic, concentrație stoc 1mg/ml

Sticlǎrie uzualǎ de laborator

Micropipete pentru domeniul 100 – 1000µl

Hârtie de filtru

Spectrofotometru UV-VIS 1240 Mini Shimadzu

Mod de lucru

Într-o eprubetǎ se amestecǎ 200 µl extract eteric cu 400 µl reactiv Folin-Ciocâlteu, 0,1N dupǎ care se adaugǎ 4 ml apǎ distilatǎ. Se amestecǎ puternic și se lasǎ 10 minute la temperatura camerei, dupǎ care se adaugǎ 2 ml soluție de carbonat de sodiu 20%. Se incubeazǎ probele timp de 2 ore. În paralel se realizeazǎ și curba de etalonare utilizând soluția stoc de acid galic. Se realizeazǎ concentrații între 0 și 200 mg/l prin diluarea soluției stoc și se procedeazǎ în același mod ca și la probele necunoscute.

Se citește absorbanța probelor ce formeazǎ curba de etalonare precum și cea a probelor necunoscute la lungimea de undǎ λ de 765 nm. Mǎsurǎtorile se realizeazǎ în triplicat.

Se întocmește curba de etalonare, concentrație în funcție de absorbanțǎ.

Calcul – Se calculeazǎ concentrația probei necunoscute în funcție de factorul de pantǎ mediu sau prin intermediul ecuației de regresie aferentǎ curbei de etalonare. Conținutul de fenoli al probei necunoscute se exprimǎ în echivalenți acid galic/100g material uscat mg GAE/100 g substanță uscată (s.u.).

Fig. 6.3. Spectrofotometrarea in vederea determinării compușilor polifenolici

6.2.2. Determinarea compușilor flavonoidici

Conținutul în flavonoide totale s-a determinat folosind metoda spectrofotometrică cu AlCl3. Absorbanțele au fost măsurate la lungimea de undă de 510nm. Standardul utilizat a fost catechina (Atanassova et al, 2011).

Standardul de prepara astfel: soluție de catechinӑ 20,40,60,80 si 100mg/l.

Mod de lucru

1 ml standard /extract intr-un balon de 10 ml in care s-a pus 4 ml AD. Se adaugӑ 0.3ml NaNO2 , dupӑ 5 minute 0.3 ml AlCl3. În al 6-lea minut se adaugӑ 2 ml NaOH 1M.Se agitӑ amestecul, și după 30 de minute se citește absorbanta la 510nm fațӑ de martor preparat identic doar cu apa în loc de standard.

6.2.3. Determinarea conținutului de vitamin C

Pentru a determina conțiutul de vitamin C am folosit metoda volumetrică cu acid oxalic.

Reactivi necesari

Acid oxalic 2%

Nisip

2,6 diclorfenolindofenol (2,6 DCPIP) – 0,25 g 2,6 DCPIP se aduce la 1000 ml cu AD. (solutie 0,0009M)

1 ml din aceasta sol contine 0,25 mg 2,6 DCPIP care este oxidata de 1 ml acid ascorbic 0,0009 M contine 0,0009x 176 =0,158 mg acid ascorbic

Mod de lucru

Legume, fructe – 10 g proba, 2 g nisip, se mojarează cu 10 ml de acid oxalic. Se completează cu acid oxalic până la 100 ml in balon cotat.

Sucuri – 5 ml suc se completeaza la 50 ml cu acid oxalic;

Se lasă 10 minute la intuneric. Se filtreaza.

10 ml filtrat se titreaza cu 2,6 DCPIP până la culoare roz care persistă 30 de secunde

Calcul:

V x 0,158 xVb

Vit C mg % = ––––––– x 100 = V x 0,158 x 100=Vx 15,8

Vf x m

V = vol 2,6 DCPIP folosit la titrare

0.158 = cantitatea de acid ascorbic in mg care reduce 1ml 2,6 DCPIP 0,0009M

Vb = vol bal cotat = 100 ml

Vf = vol filtrate luat in lucru = 10ml

M = masa probei = 10 g

Fig. 6. 4. Determinarea vitaminei C

6.2.4.Determinarea conțintului de pigmenți clorofilieni

Determinarea pigmenților clorofilieni s-a făcut folosind metoda spectrofotometrică. Extracția clorofilei s-a facut utilizând acetona ca solvent de extracție.

Mod de lucru

Se cântăresc 100mg frunze mărunțite, se pun într-un mojar, se adaugă 10 ml acetonă 80% (80:20; acetonă:apă). Se mojarează în prezența de nisip de cuarț.

Omogenizatul se filtrează și filtratul se colectează într-un eprubetă.

Fig. 6.5. Extractia clorofilei

Determinarea concentrației de clorofilă

Citirile se fac la spectrofotometru la lungime de unda 663 și 645 nm, fată de acetonă.

Calcule – folosim ecuația Arnon pentru a converti absorbanța în mg Clorofilă /g frunză.

Chl a (mg/g) = [(12.7 × A663) – (2.6 × A645)] × ml acetone / mg frunză

Chl b (mg/g) = [(22.9 × A645) – (4.68 × A663)] × ml acetone / mg frunză

Total Chl = Chl a + Chl b.

http://www.chem.iitkgp.ernet.in/faculty/SDG/LeafExp1.pdf

6.2.5. Determinarea activității peroxidazice

Mod de lucru: Pentru realizarea extractului enzimatic s-a recoltat1g material vegetal proaspăt. S-au adӑugat 4 ml tampon fosfat în concentrație de 6,7x 10ˉ³ M, pH=7, diluat 1:9 cu apă distilată răcită la 4ºC și 40 mg polivinil-pirolidonǎ (pentru înlǎturarea eventualilor inhibitori ai activitǎții peroxidazice) și s-a mojarat cu nisip de cuarț spălat și sterilizat în etuvă la 120ºC. Extractul s-a centrifugat la 15000xg, timp de 20 de minute la 4˚C. Supernatantul a fost separat și păstrat 2 ore la frigider pentru exprimarea și stabilizarea activității enzimatice. Au fost efectuate câte 3 repetiții pentru variantele experimentale luate în studiu.

Activitatea peroxidazică s-a determinat folosind un spectrofotometru Shimadzu UV-mini–1240, la o temperatură de 30ºC. S-a urmărit formarea tetraguaiacolului, la lungimea de undă de 470 nm, ε=26.6mM-1cm-1, în cei 3 ml amestec de reacție care au conținut urmӑtoarele:

1 ml tampon fosfat 0,1M pH=6,0; 1 ml guaiacol 15mM, 1 ml H2O2 3mM, și 50μl extract enzimatic.

Conform metodei citate de Kim și Yoo, 1996, o unitate peroxidazică (U) reprezintă cantitatea de enzimă care catalizează oxidarea a 1μmol de guaiacol într-un minut,

Se citeste absorbanța imediat la momentul t=0 (A0) și dupa 1 minut (A1)

(ΔA/min x Vt) / (ε x Vs)

Unde :

ΔA/min = A1 – A0

Vt = vol final de reactie = 3,05 ml

Vs = vol probei = 0,05

7. Rezultate și discuții

In cele ce urmează sunt prezentate rezultatele obținute la determinarea conținutului de compuși polifenolici, flavonoide, pigmenți clorofilieni, respectiv activitatea peroxidazică.

7.1. Rezultate compuși polifenolici totali

Conținutul de polifenoli totali în probele testate exprimat în echivalenți acid galic este prezentat în tabelel 7.1.

Toate calculele din acest capitol au fost efecuate cu ajutorul programului Excell.

Întocmirea curbelor de etalonare spectrofotometrice, prin metoda Folin-Ciocâlteu, descrisă în capitolul 6 a condus la urmǎtoarele rezultate.

Graficul din figura 7.1 prezintǎ curba de etalonare obținută experimental citind absorbanța la 120 minute în condițiile utilizǎrii a 200 µl etalon acid galic.

Figura 7.1 – Curba de etalonare, etalon GAE

Tabelul 7.1 – Conținutul de polifenoli, echivalenți GAE (ecuația de regresie)

7.2 Rezultate flavonoide

Folosind metoda cu clorură de aluminiu șî quercitina ca standard, am realizat curba de etalonare pentru flavonoide, iar rezultatele pentru probe le-am exprimat in mg catechină/100g pudră și pe 100 ml băutură preparată.

Figura 7.2 – Curba de etalonare, etalon CAT

Tabelul 7.2 – Conținutul de flavonoide, echivalenți quercitină (ecuația de regresie)

Comparând probele testate din punct de vedere al conținutului total de fenoli, flavonoide și vitamina C, obținem situația prezentata în graficul din figura 7.3.

7.3. Rezultate vitamina C

Tabel 7.3. Conținut mediu în vitamina C

Figura 7.3 – Conținut mediu în substanțe cu caracter antioxidant

7.4. Rezultate pigmenti clorofilieni

Valorile absorbanțelor au fost inserate în tabelul 7.4.

Tabel 7.4. Absorbanțele citite la spectrofotometru la diferite lungimi de undă pentru probele analizate

Având valorile medii ale absorbanțelor, s-au aplicat formulele de calcul pentru obținerea conținutului în clorofilă a și b iar prin însumarea lor am obținut conținutul total în pigmenti clorofilieni

Tabel 7.5, Conținutul în pigmenți clorofilieni și carotenoidici pentru probele analizate

Conținutul în pigmenti clorofilieni totali a fost cel mai mare în probele de orz, ovăz și grâu verde, având valori apropiate, iar cel mai mic conținut de pigmenti clorofilieni s-a înregistrat la lucernă (fig. 7.5.).

Pigmenții clorofilieni sau porfirinici (clorofila a, clorofila b) dau culoarea verde și galben-verzuie a frunzelor și tulpinilor, participând la procesul de fotosinteză, Din punct de vedere chimic, pigmenții clorofilieni sunt derivați metalici ai porfirinelor, deoarece conțin un metal reprezentativ, magneziul Mg(II), Acest pigment poate fi un agent terapeutic eficient în tratamentul anemiei, carenței de calciu și magneziu, acnee, gastrită, ulcer.

Figura 7.4. – Conținut mediu de pigmenti clorofilieni a,b si totali

7.5. Rezultate activitate peroxidazică

8. Concluzii

In cazul probelor analizate de noi, din punct de vedere al conținutului în polifenoli totali, flavonoide șî vitamin C, cunoscute ca substanțe cu caracter antioxidant s-a putut observa că probele de orz, ovăz și grâu verde conțin cantităti mai mari de polifenoli totali iar probele de lucernă verde conțin o cantitate mai mare de flavonoide.

Clorofila este o substanță producătoare de energie, Pentru a avea efect maxim este indicat să se consume sucul obținut din frunzele verzi, în stare proaspătă, sau suc preparat din pudra verde obținută din frunzele anumitor cereale.

Probele analizate au activitate peroxidazică

BIBLIOGRAFIE

Atanassova M,, S, Georgieva, K, Ivancheva, 2011, Total phenolic and total flavonoid contents, antioxidant capacity and biological contaminants in medicinal herbs, Journal of the University of Chemical Technology and Metallurgy, 46, 1, 2011, 81-88,

Banu C, Ianițhi D,, Vizireanu C,, Săhleanu E,, – 2011 – Alimente vii- alimente nevii; Alimente bune-alimente rele, Editura ASAB București,

Boudet, A,M,,2007- Evolution and current status of research in phenolic compounds, Phytochemistry, 68, 2722-2735,

Bunghez R,I, – 2012 – Rezumt teza de doctorat,

Burzo I,,Voican V,, Dobrescu A,, Delian E,, 1996– Curs de fiziologia plantelor, Universitatea de Stiințe Agricole și Medicină Veterinară, București,

Chiș A,, 2012, Notițe de curs, Metode optice și cromatografice în industria alimentară, Ed, Universității din Oraadea,

Devanand L, Luthriaa, Sudarsan Mukhopadhyaya, Donald T, Krizekb – 2006- Content of total phenolics and phenolic acids in tomato (Lycopersicon esculentum Mill,) fruits as influenced by cultivar and solar UV radiation, Journal of Food Composition and Analysis 19, pg 771–777,

Escarpa, A,, Gonzalez, M,C,, 2008 – An overview of analytical chemistry of phenolic compounds in foods, Crit, Rev, Anal, Chem, 75, 57-139,

Fahad al-Juhaimi and Kashif Ghafoor, 2011, Total phenols and antioxidant activities of leaf and stem extracts from coriander, mint and parsley grown in Saudi Arabia, Pak, J, Bot,, 43(4): 2235-2237,

Filimon RV, Beceanu D, Niculaua M, Arion C, 2011, Study of the anthocyanin content of some sour cherry varieties grown in Iași area, , Cercetǎri agronomice în , Vol XLIV No 1 (145), pg 81-91,

Garcia-Salas P,, A, Morales-Soto, A, Segura-Carretero and A,Fernández-Gutiérrez – 2010, Molecules, 15, 8813-8826; doi:10,3390/molecules15128813,

Horváth E,, Szalai G,, Pál m,, Páldi E, Janda T,, (2002) – Differences between the catalase isozymes of maize (Zea mays L,) in respect of inhibition by various phenolic compounds, Acta Biol Szeged 46 (3-4), p,33-34,

Janda T,, Szalai G,, Tari I,, Páldi E,, (1999) – Hydroponic treatment with salicylic acid decreases the effect of chilling injury in maize (Zea mays) plants, Planta 208, p,175-180,,

Kim și Yoo, 1996, Peroxidase production from carrot hairy root cells culture, Enzyme, Microbiologiie, Technology, 18-531-535,

Mărghitaș L,, Dezmirean D,, A, Moise, O, Bobis, L, Laslo, Bogdanov S, , 2009, Physico-chemical and bioactive properties of different floral origin honeys from Romania, Food Chemistry, Vol 112, nr 4,pg 863-867, 

Neamțu G,, 1981 – Biochimie vegetală, Ed, Ceres București,

Németh M,, Janda T,, Horvath E,, Paldi E,, Szalai G,, (2002) – Exogenous salicylic acid increased polyamine content but may deceased drought tolerance in maize, Plant Sci, 162, p,569-574,

Singleton Vernon L, Rudolf Orthofer, Rosa M, Lamuela-Raventós, 1999, Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocalteu reagent, Methods in Enzymology, Volume 299, 1999, Pages 152–178,

Scandalios JG,, Guan L,, Polidoros AN,, (1997) – Catalases in plants: gene structure, properties, regulation and expression, In: Scandalios JG (ed) Oxidative stress and the molecular biology of antioxidant defenses, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, p, 343-406,

Wollgast J,, 2004, The contents and effects of polyphenols in chocolate,Qualitative and quantitative analyses of polyphenols in chocolate and chocolate raw products as well as evaluation of potential implications of chocolate consumption in human health, Dissertation,

Zenkov N,K,, Lankin V,E,, Menschikova T,N,, (2001) – Okislitel’nyi stress (Oxidative Stress), Moscow: Nauka, p, 280,

http://www,chem,iitkgp,ernet,in/faculty/SDG/LeafExp1,pdf