Determinarea Unor Microtoxine de Origine Animala

Determinarea unor micotoxine de origine animală

Partea I – [NUME_REDACTAT]

Capitolul I

Micotoxinele

1.1 Definiția micotoxinelor

Termenul de micotoxină vine de la cuvântul grecesc “mycos” care inseamnă “ciupercă” și de la cuvântul latin “toxicum” care înseamnă otravă. Ele desemnează metaboliți secundari secretați de mucegaiurile care aparțin în principal genurilor Aspergillus, Penicillium și Fusarium, prezente în mod natural în aerul ambient, pe pământ și pe culturi.

Micotoxinele sunt considerate ca fiind parte din contaminanți alimentari cei mai semnificativi în ceea ce privește impactul asupra sănătății publice, securității alimentare și asupra economiei a numeroaselor țări. Ele se găsesc pe o mare varietate de produse alimentare înainte, în timpul și după recoltă. Afectează numeroase produse agricole, anume cereale, fructele, nucile, boabele de cafea, orezul și plantele oleaginoase, care sunt substraturi foarte sensibile la contaminarea cu mucegaiuri și la producerea de micotoxine.

Mucegaiurile și micotoxinele creează probleme de natură economică în agricultură, crescătorilor de păsări și animale și pierderi în industria alimentară. Se estimează că pe plan mondial aceste pierderi sunt de peste 5-10 %. Ca toate substanțele toxice, ele produc doua tipuri de intoxicații:

acute, care se produc prin ingestia unei doze relativ mari de micotoxine sau în cantități mai mici într-un interval scurt de timp;

cronice, care se produc pe termen lung, iar intoxicația se manifestă dupa consumarea unor doze mici un timp indelungat și repetat. Aceste intoxicații provoacă tulburări la nivelul diferitelor organe și sisteme: ficat, rinichi, cnetri nervoși, circulația sanguină sau la nivelul tractului digestiv.

Tabel 1. Specii fungice producătoare de micotoxine

1.2 Principalele micotoxine alimentare

1.2.1 AFLATOXINELE-Aspergillus flavus, parasiticus

1.2.2 ZEARALENONA (toxina F2)-Fusarium graminearum

1.2.3. OCHRATOXINA-Penicillium, Aspergillus

1.2.4. Sterigmatocistina

1.2.1 [NUME_REDACTAT] sunt un grup de metaboliti secundari produsi in principal de sușe apartinand speciilor Aspergillus flavus si A. Parasiticus, la care pot fi adaugate si alte specii cum ar fi de exemplu Aspergillus niger, A. wenti, A. ruber, Penicillium citrinum, P. glabrum, P. puberulum si P. variabile.

Aflatoxinele apartin grupului de derivati bifunocumarinici cu patru produsi principali: aflatoxinele B2, B2, G1 si G2. Acesti patru metaboliti au o structura chimica similara, dar dupa ce metabolizarea aflatoxinelor B1 si B2 rezulta inca doi metaboliti M1 si M2 ca derivati hidroxilati ai compusilor din care rezulta.

Din anul 1966 sunt cunoscuti B2a si G2a ca derivati hidroxilati ai aflatoxinelor B1 si G1 cu un oarecare potential toxicogen, ulterior evidentiindu-se alti metaboliti toxici cum ar fi: GM1; Ro; P1; H1; Q1; B3 etc.

Din totalul compusilor denumiti uzual aflatoxine, doar 14 apartin grupului bifuranocumaric, produsi de Aspergillus flavus si A. parasiticus, gasiti in special in sfera vegetala dar si in produse de origine animala, distingandu-se unii de altii atat prin culoare cat si prin fluorescenta emisa.

Aflatoxinele sunt foarte solubile in solventi polari de tipul cloroformului si metanolului ca si dimetilsulfoxid( solvent utilizat ca vector pentru administrarea aflatoxinelor la animalele de experienta).

In stare pura, aflatoxinele sunt putin solubele in aer si chiar la temperaturi crescute, pe cand in solventii cu activitate solara mare devin relativ instabile, indeosebi prin expunerea lor la aer si lumina pe suprafata mare si in strat subtire. La intuneric si frig solutiile cloroformice si benzoice le conserva timp de mai multi ani. Pasteurizarea alimentelor nu influenteaza structura aflatoxinelor, in schimb tratarea energica in autoclave cu amoniac si hipocloritpoate produce o oarecare descompunere a lor.

Prezenta ciclului lactonic in molecula lor le face susceptibile la hidroliza alcalina numai daca tratamentul este bland, o eventuala acidifiere putand reconverti reactia. Aceasta proprietate este foarte importanta pentru ca orice tratament pe care il sufera alimentele, la care s-ar putea adauga si substante cu caracter acid sau bazic, dar totodata, prezenta proteinelor, valoarea ph-ului si durata tratamentului, pot compromite rezultatul.

Este de mentionat si faptul ca nu provoaca raspuns imunologic, aspect valabil si pentru celelalte micotoxine.

Aflatoxinele sunt alcătuite din aproximativ 20 compuși chimici aparținând unui grup numit difurano-cumarine dar numai 4 se găsesc în mod natural în alimente. Acestea sunt aflatoxinele B1 B2, G1 și G2. Aflatoxina B1 este cea mai frecvent întâlnită în alimente și cea mai toxică. Atunci când bovinele și alte animale aflate în perioada de lactație ingerează furaje contaminate se pot forma metaboliți toxici care pot fi prezenți în lapte. Acești metaboliți hidroxilați sunt denumiți aflatoxina M1 și M2 și sunt cei mai importanți contaminanți în produsele lactate.

Aflatoxinele sunt compuși destul de stabili și pot supraviețui la temperaturi relativ ridicate cu o mică degradare. Stabilitatea lor termică este influențată de alți factori cum ar fi nivelul de umiditate și pH-ul , dar procesele de încalzire sau gătire nu pot fi invocate pentru a distruge aflatoxinele. Stabilitatea aflatoxinei M1 în procesele de fermentație a laptelui a fost de asemenea studiată și, deși apar pierderi semnificative, cantițăți semnificative de toxine au rămas în brânză și iaurt.

Fig.1.Structrura chimică a aflatoxinelor

Mecanismul acțiunii aflatoxinelor: Aflatoxina B1 pătrunde în celulă și este fie metabolizată de monooxigenază în reticulul endoplasmatic obținîndu-se produși metabolici hidroxilați care sunt ulterior metabolizați la glucuronid și conjugați sulfurați; fie este oxidată obținându-se epoxidul reactiv care este hidrolizat spontan și se poate lega de proteine devenind citotoxic. Epoxidul poate reacționa cu ADN-ul sau cu proteinele, sau poate fi transformat de o glutationă, S-transferaza la (GSH) – conjugat.

Datorită efectelor negative asupra organismului animal și uman, limitele maxime admise de aflatoxine în produsele alimentare sunt cuprinse între 0.05-15 (μg/kg) (tabel 2).

Aflatoxina M1

În 1963 s-a demonstrat că la vite, aflatoxina B1 este absorbită cu hrana contaminată, este metabolizată într-un derivat numit aflatoxina M1 care este regăsit în lapte. 0.5-4% de aflatoxină B1 ingerată se regăsesc sub formă de aflatoxina M1 în lapte. Această micotoxină păstrează , la o treaptă inferioară, importantele proprietăți cancerigene ale aflatoxinei B1.

Astfel, efectul cumulativ legat cu ingerarea regulată a acestor toxine, face să se expună la mari riscuri copii și sugarii, marii consumatori de lapte și produse lactate. Aceste riscuri sunt cu atât mai importante deoarece aflatoxina M1 rezistă la tratamentele uzuale de conservare și procesare a produselor lactate. Aflatoxina M1 se regăsește în totalitate în laptele smântânit și în produsele lactate (iaurt, brânză), se regăsește foarte puțin în unt. Aceasta este legată de prezența interacțiunilor hidrofobe între aflatoxina M1 și cazeină.

Tabel 2. Aflatoxine – limitele maxime admise

1.2.2 [NUME_REDACTAT] sau toxina T2 are o acțiune estrogenă. Este o lactonă produsă de Fusarium graminearum și de alte specii de mucegaiuri care se dezvoltă pe porumb. În plus, această micotoxină și derivații ei au un efect anabolizant.

Fig.2. Structura chimică a zearalenonei

Se prezintă ca o lactonă nesaturată a acidului β exorcilic (figura. 5). Este termostabilă și rezistă la o depozitare prelungită. Prin hidrogenare, se reduce funcția cetonică în alcool astfel încât se obțin izomerii zearalenonei: izomerul α este folosit ca stimulent de creștere pentru ovine. Nu are efecte toxice cronice. Porcul este animalul cel mai sensibil.

Contaminarea fungică intervine pe câmp, porumbul prezentând un mucegai roșu. Dar producția de toxine se realizează în principal în timpul depozitarii. Nu prezintă efecte toxice cronice.

Limita maximă admisă pentru conținutul de zearalenonă este de 20 μg/kg.

Tabel 5. Limite maxime admise pentru conținutul de zearalenonă

Efectele toxice ale zearalenonei

Mecanismul de acțiune al zearalenonei: Zearalenona (Z), asemenea poliestrogenilor (PE) și al estrogenilor din mediu (AE), traversează pasiv membrana celulară și se leagă de receptorii estrogeni. Complexul receptor -Z ajunge în nucleu foarte rapid unde se leagă de receptori nucleari specifici și generează raspunsuri estrogene prin activarea genelor: acest lucru are ca rezultat producerea de ARN mitocondrial (mARN) care codifică în mod normal producerea de proteine care apar în mod normal prin legarea de receptorii estrogeni.

1.2.3 [NUME_REDACTAT] au fost identificate în numeroase produse alimentare de origine vegetală: porumb, grâu, orez, ovăz, orz, sorg, soia, leguminoase, cafea și pește sărat, în concentrații până la 2800 µg/kg.

[NUME_REDACTAT] de exemplu, s-a stabilit că contaminarea orezului cu ochratoxine reprezintă cauza nefropatiei la porci. Cazurile de nefropatii produse de ochratoxine au fost identificate și la păsări.

Ochratoxina A se poate acumula în țesuturi (rinichi, ficat, mușchi) și se elimina prin lapte. La porcii care prezentau nefropatii, ochratoxina a fost prezentată în rinichi, în concentrații ridicate. Toxicitatea acută a ochratoxinei este cuprinsă între 0,2 și 0,34 µg/kg. Ea este prima netrotoxină determinată, care produce, în afară de leziuni renale și leziuni hepatice.

Fig. 2 Ochratoxina A

Ochratoxina A a fost detectată în sângele și rinichii de porc precum și în sângele uman și laptele mamelor. Cele mai mari accidente cu această toxină s-au întâlnit în sângele de porc 60% din cazuri, în cereale 13%, în rinichi de porc 21%.

Folosind RIDASCREEN OCHRATOXINA A puteți determina aceste reziduuri în cereale, fânețe, bere și ser de porc într-un mod rapid și sigur.

Ca producători de ochratoxine au fost identificate specii de Aspergillus și Penicillium, și anume: Aspergillus ochraceus, Aspergillus alliaceus, Aspergillus melleus, Aspergillus ostianus, Aspergillus petrakii, Aspergillus sclerotiorum, Aspergillus sulphureus, Penicillium viridicatum, Penicillium commune, [NUME_REDACTAT], Penicillium palitans, Penicillium purpurescent, Penicillium variabile.

Tulpinile de Aspergillus ochraceus, cu înaltă toxicitate, sunt frecvente prezente în mediul natural. Există posibilitatea unui sinergism între diferiți fungi în producerea micotoxinei. Sunt poluate cu ochratoxine, în special, cerealele.

Mucegaiurile care secretă ochratoxina A produc și acid penicilic substanță cancerigenă cunoscută, efectele micotoxinelor fiind sinergice.

În zona balcanică, inclusiv în România, a creat, a dezvoltat la oameni diverse tumori de-a lungul traiectului urinar. [NUME_REDACTAT] de Nord a venit informația că, între nefritele cronice intestinale și expunerea la ochratoxin, există o corelație foarte pozitivă.

Inducerea cancerului la oameni de către Ochratoxina A a fost confirmată și de [NUME_REDACTAT] de Cercetări asupra Cancerului (IARC). Inducerea cancerului renal a fost obținută la șoareci, la doze mici de numai 70 µg/kg/corp viu. Ochratoxina A este foarte prezentă în mai toate alimentele analizate pe piața [NUME_REDACTAT]. Ele nu numai că au fost prezente, dar au fost și foarte disponibile din punct de vedere biologic. În alimentele obținute din plante, din 7000 de mostre, Ochratoxina A a fost găsită în 57,2 din cazuri în concentrație peste limita admisă. Cea mai mare frecvență a toxinei s-a întâlnit în pâine, bere, cafea, alune și fructe uscate, macaroane și prăjituri. N-a lipsit însă nici din fructe, sucuri și vin.

Formarea micotoxinelor

1.2.4 [NUME_REDACTAT] este o micotoxină legată structural de aflatoxine,semnificativă pentru patologia umană și veterinară,datorită prezenței sale crescute în produsele vegetale din zona temperat-continentală.Este un compus hepatocarcinogenic frecvent decelată în brânzeturi cu pastă tare,din care s-a izolat o floră micotică în care predominau speciile:

Aspergillus versicolor,Aspergillus repens,Penicilium veruculosum var. veruculosum var. cyclopium.

Este o micotoxină hepatotoxică,corelată chimic cu aflatoxinele,izolată pentru prima oară din Aspergillus versicolor și mai târziu găsită în alte specii de Aspergillus (A. nidulans),dintr-o specie de Penicillium (P. lutem),și din specii de ciuperci din genurile Chaetomium,Bipolaris (Cochliobolus) și Monocillium (Niesslia).O importanță micotoxicologică deosebită o capătă sterigmatocistina formată de către tulpinile de Aspergillus versicolor în ambele specii de cereale(grâu și orz),în condiții meteorologice de căldură și umiditate,la depozitarea cerealelor după recoltare.Urme de sterigmatocistină au fost găsite și în unele cereale din comerț,în special în grâu,chiar și în cafea,fasole,în crusta de branză tare,în legume,în semințele de bumbac,în hrana pentru animale și produse alimentare.

Această micotoxină este biologic și structural corelată cu aflatoxinele și aceasta explică activitatea hepatocancerigenă în organismul animal.Sunt cunoscute cel puțin opt forme derivate.Microorganismele producătoare sunt Aspergillus versicolor,Aspergillus nidulans,Aspergillus rugulosus și altele.LD 50 injectat intraperitonal la șobolani este de 60-65 mg/kg.

Apariția în produsele alimentare.

Sterigmatocistina a fost întâlnită la cerealele mucegăite,în particular la porumb,arahide și nuci,boabe de cafea verde și brânză.Pentru a fi mai puțin frecventă,cu toate că are un nivel scăzut în produsele alimentare,aceasta poate fi depistată cu ajutorul analizelor senzoriale,efectuate imediat.Cu toate acestea,este greu de detectat în anchetele de bună calitate efectuate produselor alimentare,chiar și cu utilizarea unor metode analitice moderne.

Sterigmatocistina a fost foarte rar detectată în contaminarea naturală a alimentelor procesate,dar a fost depistată a fi prezentă la un nivel destul de ridicat în pâine,în unele tipuri de carne conservată,mucegaită producătoare de toxine.

CAPITOLUL II

Factori care influențează producerea micotoxinelor

Micotoxinele sunt metaboliți secundari produși de mucegaiuri aparținând în principal genurilor Aspergillus, Penicillium și Fusarium.

În condiții nefavorabile de temperatură și umiditate, mucegaiurile care contamineaza alimentele au capacitatea de a elabora metaboliți toxicogeni. Prin consumul de nutrețuri contaminate cu micotoxine, acestea sunt preluate de animal care le poate metaboliza doar partțal. De la animal, micotoxinele ajung la om prin consumul de carne, în care micotoxinele sunt cumulate, prin consumul de ouă, lapte și produse lactate, în care micotoxinele sunt excretate. Acestea devin alimente nocive pentru om, adica îți pierd inocuitatea.

Condițiile de toxicogeneză sunt în general mai restrictive decât cele necesare creșterii mucegaiurilor.

2.1 Biogeneza micotoxinelor

Formarea micotoxinelor poate avea loc la toate stadiile din câmp și până la comercializarea produselor pentru consumul animal și uman.

Natura micotoxinelor produse și care contaminează alimentele depinde de speciile fungice, de condițiile ecologice și de stabilitatea acestor toxine în mediu alimentar.

Micotoxinele nu contituie o clasă chimică. Sunt metaboliți secundari care nu joacă un rol evident în economia microorganismelor:

în comparație cu metabolismul primar care este cu temeinicie același pentru toate ființele vii, metabolismul secundar depinde de speciile considerate, în acest caz, susele;

metabolismul secundar, foarte important la mucegaiuri, aduce o mare diversitate de molecule, din care micotoxinele;

metaboliții secundari sunt foarte adesea elaborați de familia de produși chimici vecini, din punct de vedere toxicologic, aceasta explică în parte că pentru aceeași doză de toxină, efectele sunt foarte grave și mai puțin specificate în intoxicațiile naturale față de intoxicațiile experimentale efectuate cu o micotoxină pură.

Natura produselor care se acumulează în aval, depinde de caracterele individuale ale suselor și de condițiile de mediu.

La ora actuală se cunosc în jur de 200 de specii de mucegaiuri care au capacitatea de a forma micotoxine.

Biosinteza micotoxinelor

Originea chimică a micotoxinelor este foarte diversă, unele derivă din aminoacizi (alcaloizii de ergot, acidul aspartic, acidul ciclopiazolic, slaframina, glioxina, roquefortin, sporodesina), altele sunt policetoacizii ( aflatoxinele, ochratoxina, patulina, citrinina, acidul penicilic, sterigmatocistina, zeararlenona), iar altele sunt derivați terpenici ( fusarenona, desoxinivalenolul, varidina, toxina T-2).

Micotoxinele se formează la finalul fazei exponențiale și începutul fazei staționare a creșterii mucegaiului .

Fazele de creștere fungică și localizarea sintezei micotoxinelor

2.2 Formarea micotoxinelor

Formarea micotoxinelor pe produsele alimentare presupune parcurgerea următoarelor etape:

2.2.1. Infestarea cu mucegai – este favorizată de temperaturi ridicate și de umiditatea redusă a solului

2.2.2 Colonizarea –favorizată de atacul de insecte:

– distrugerea barierelor fizice facilitează raspândirea infecției pe produs;

– distrugerea pericardului favorizează infecția interiorului boabelor;

– descreșterea umidității boabelor ÷35%;

2.2.3. Producerea de micotoxine –favorizată de:

– temperaturi ridicate;

– precipitații reduse-stres hidric al plantelor;

– alți factori limitativi ai plantelor cu boabe în curs de formare;

– prolina, factor, semnal de stres în plante induce sinteza toxinelor în tulpinele toxicogene;

2.3 Influența factorilor extrinseci asupra apariției micotoxinelor

2.3.1 [NUME_REDACTAT] are influență asupra speciei de mucegai, dar și asupra produselor de metabolism.

Procesele metabolice se desfășoară în limite stricte de temperatură, specifice fiecărui microorganism. Acest factor poate favoriza sau inhiba dezvoltarea microorganismelor, iar în anumite cazuri poate chiar determina moartea acestora. Efectul temperaturii asupra dezvoltării microorganismelor se datorește influenței pe care aceasta o exercită asupra:

– stării de agregare a apei, în funcție de care se mărește sau se micșorează disponibilitatea apei;

– vitezei reacțiilor enzimatice;

– plasticității membranei celulare și citoplasmei;

– macromoleculele pe care le pot denatura;

2.3.2 [NUME_REDACTAT] de apă existentă în mediul ambiant și în substraturi este unul din factorii importanți pentru dezvoltarea mucegaiurilor și pentru producția de micotoxine.

În atmosferă există o umezeală relativă de 70-90% și prin păstrarea alimentelor, în timp, în funcție de temperatură și compoziția produsului are loc o absorbție a vaporilor de apă din aer, instalându-se o stare de echilibru, cu creșterea cantității de apă liberă și a indicelui de activitate a apei. Este știut faptul că mucegaiurile apar după o creștere accidentală a umidității. Însă, nu doar cantitatea de apă influențează ci și forma de prezentare a acesteia (liberă sau legată).

Apa liberă este apa din interiorul celulelor și poate fi eliminată fără a interveni în procesele vitale.

Apa legată face parte integrată din celule. Pentru germinare, sporii de mucegai au nevoie ca apă să se găsească în formă liberă.

Există două unități relaționate cu cantitatea de apă:

umiditate relativă de echilibru (HRE): este cantitatea de apă care dispun microorganismele, fiind echilibrul între conținutul de apă liberă al produsului și vaporii de apă existenți în mediul ambient. Se exprimă în procente și variază de la un produs la altul în funcție de conținutul acestuia în glucide sau materie grasă.

apa disponibilă sau activitatea apei (aw) este relația existentă între apa liberă din alimente și capacitatea microorganismelor pentru proliferare. Activitatea apei ne indică care este cantitatea de apă disponibilă pentru dezvoltarea microorganismelor.

aw se exprimă ca relația existentă între tensiunea vaporilor de apă în substratul (P) și apa pură (Po), la aceeași temperatură, (aw =P/Po). Dacă umiditatea alimentului este în echilibru cu umiditatea relativă de echilibru a atmosferei, aw este numeric echivalentă cu aceasta (aw = HRE/100).

2.3.3 Presiunea osmotică

Presiunea osmotică poate provoca modificări bruște ale structurii celulare (plasmoliza, turgescența) și modificări ale morfologiei microorganismelor.

Mucegaiurile sunt microorganisme osmofile (se pot dezvolta pe medii cu presiune osmotică mare) și din acest motiv, ele pot altera produsele alimentare care conțin o cantitate mare de zahăr (miere, dulceață, etc.). Ele se pot dezvolta pe produse care conțin max. 70% zahăr.

2.3.4 [NUME_REDACTAT] luminii depinde de specia microorganismelor. În general se poate spune că lumina este dăunătoare mucegaiurilor. Acțiunea vătămătoare a luminii crește cu scăderea luminii de undă a razelor luminoase. Din spectrul luminos cele mai vătămătoare sunt razele violete, iar din spectrul invizibil, radiațiile ultraviolete. Acțiunea dăunătoare a razelor ultraviolete depinde de intensitatea și durata lor de acțiune asupra mucegaiurilor, acestea putând fi împiedicate sau oprite din activitatea lor, ori complet distruse.

Când acțiunea luminii se exercită asupra unei culturi și nu numai asupra unui singur microorganism, se deosebește alături de acțiunea directă, și acțiunea indirectă asupra mediului de cultură. Astfel, în mediile de cultură care au fost expuse la lumină solară sau la radiațiile UV, s-a găsit întotdeauna apă oxigenată, rezultată din oxidarea apei, oxidare produsă de raze, care constituie un toxic pentru microorganism. Prin urmare, acțiunea luminii asupra microorganismului, se exercită fie direct, asupra celulei însăși, fie indirect, prin producerea apei oxigenate.