Determinarea Nivelului de Mucina Si Amilaza Salivara la Pacientii cu Parodontita

Context si obiectiv: Pacientii cu boli parodontale prezinta diferente in profilul proteinelor salivare. Acest profil reflecta natura si amplitudinea raspunsului gazdei la provocarea microbiana parodontogena. Cum parodontita este o boala inflamatorie cronica cu diferite stadii de progresie, scopul acestui studiu este de a evalua raspunsul gazdei in aceste diferite stadii clinice, evaluand debitul salivar, concentratia de proteine si mucine, si activitatea amilazei.

Materiale si metode: 60 de subiecti adulti au fost examinati clinic si distribuiti in patru grupe, a cate functie de statusul parodontal, si anume: parodontiu sanatos, parodontita usoara, moderata si severa. A fost colectata intreaga saliva in decurs de 5 minute, apoi a urmat o a doua perioada de esantionare, fluxul salivar fiind stimulat prin mestecarea unui bloc de parafina, fiind apoi din nou stabilit debitul salivar. Proteinele salivare, amilaza si mucina au fost determinate prin metode colorimetrice.

Rezultate: Concentratia proteinelor, a amilazei si a mucinei a crescut la subiectii cu boala parodontala moderata si severa, in saliva nestimulata, in timp ce fluxul salivar a fost scazut. Intre grupuri a fost gasita o corelatie pozitiva intre concentratia proteinelor, a amilazei sau a mucinei, indicand faptul ca concentratiile acestora s-au schimbat in acelasi mod, fiind raspunsul la boala a glandelor salivare, posibil pentru a spori potentialul de protectie al salivei. Concentratia de mucina a fost mai mica la grupul cu parodontita usoara. Stimularea mecanica a indus o crestere a ratei si productiei de proteine, amilaze si mucine.

Concluzie: Parodontita induce o crestere a productiei de proteine, incluzand mucinele si amilazele, sporind astfel potentialul protector al salivei, dar acest lucru este insotit de scaderea debitului salivar.

Introducere

Saliva umană este un fluid al corpului secretat de glandele salivare majore și minore, fiind esențială pentru sănătatea cavitatii orale. Saliva conține un amestec complex de proteine, ​​cu diferite roluri biologice în digestie, aparare si lubrifiere. Se considera ca imunoglobulinele salivare si mucinele intretin clearance-ul microorganismelor din cavitatea orala. Mucinele salivare sunt glicoproteine puternic glicozilate cu o masa moleculara ridicata, produse de glandele salivare submandibulare, sublinguale si palatinale, si de glandele salivare minore din buza, obraji si limba. Mucinele joaca un rol major in mentinerea proprietatilor vascoelstice ale salivei, participa la formarea stratului protector de mucus al mucoasei orale si al peliculei de smalt a dintelui si promoveaza agregarea si clearance-ul bacterian din cavitatea orala. S-a demonstrat ca saliva umana contine doua tipuri de mucine, diferite din punct de vedere structural si functional, mucine cu masa moleculara mare- MG1 si mucine cu masa moleculara mica- MG2. MG1 inveleste si lubrefiaza suprafetele orale, in timp ce MG2 interactioneaza cu bacteriile. Amilaza este o componenta abundenta a salivei, ce catalizeaza hidroliza unei legaturi glicozidice dintre reziduri ale glucozei polizaharidice, cum ar fi amidonul, glicogenul si dextrina. In plus fata de saliva, s-a demonstrat ca amilaza exista aproape in fiecare fluid mucozal al corpului uman, cum sunt lacrimile, lichidul seminal si mucusul bronsic. Aceasta distributie omniprezenta a amilazei face dificila existenta functiei sale unice in digestie. Ar fi deci necesar sa se caute si alte functii ale amilazei, in conformitate cu conceptul multifunctional al proteinelor salivare. In aceasta privinta s-a raportat ca amilaza prezinta activitate inhibitorie asupra microorganismelor.

Secretia glandelor salivare este un reflex nervo-mediat. Amilaza si mucina sunt eliberate prin exocitoza din glandele parotida si submandibulara, ca raspuns la stimularea b-adrenergica. Stimularea colinergica muscarinica evoca cea mai mare parte a fluidului de secretie salivara, dar provoaca un grad variat de exocitoza.

Bolile parodontale reprezinta infectii cronice foarte raspandite, cauzate de un grup specific de bacterii anaerobe gram-negative, ce duc la inflamatia gingiei si distructia tesutului parodontal. Pacientii cu boala parodontala prezinta diferente in compozitia proteica a salivei. Parodontita cronica poate fi clasificata in 3 stadii, pe baza parametrilor clinici si a severitatii distructiei tesutului parodontal. Compozitia microbiana parodontogena. Scopul acestui studiu a fost de a evalua debitul salivar, concentratiile de proteine si mucine, si activitatea amilazelor, atat in saliva stimulata, cat si in cea nestimulata, in diferite stadii ale bolii parodontale, comparativ cu starea de sanatate parodontala.

Materiale si metode

Subiectii

Pentru acest studiu au fost recrutati dintr-o clinica dentara privata, subiecti adulti, parinti ai copiilor dintr-un program de preventie oro-dentara, care nu primeau la acel moment ingrijire dentara si care nu au mai fost diagnosticati parodontal. Inaintea studiului, a fost stabilit gradul de sanatate, utilizand istoricul medical si examene clinice, care au confirmat ca nu au urmat nici un tratament si ca nu erau fumatori. Subiectii si-au dat consimtamantul informat, fiind apoi evaluati parametrii clinici de catre un medic stomatolog specialist, incluzand adancimea pungilor la sondare, nivelul clinic de atasament (masurand distanta de la jonctiunea smalt-cement pana la fundul pungii) si sangerarea la sondare (marcata cu + sangerarea existenta si cu – sangerarea absenta). Au fost efectuate toate masuratorile parodontale in cele 4 cadrane, utilizand o sonda de prima generatie (Hu-Friedy Mfg. Co., Chicago, IL, USA). Adancimea pungii la sondare si nivelul clinic de atasament au fost evaluate in 6 puncte pentru fiecare dinte, iar sangerarea la sondare, in 4 puncte pentru fiecare dinte. Subiectii au fost distribuiti in 4 grupuri, in functie de pierderea clinica de atasament, adancimea pungii la sondare si sangerarea la sondare, si anume parodontiu sanatos, parodontita usoara, moderata si severa (Tabelul 1). Cincisprezece subiecti au fost recrutati pentru fiecare grup, cu o femeie in grupul sanatos, nici o pacienta de sex feminin in grupul cu parodontita moderata, si cinci femei in grupul cu parodontita severa. Protocolul a fost aprobat de Comitetul de Etica al Scolii de Medicina Dentara, de la Universitatea din Buenos Aires, iar studiul a fost realizat in conformitate cu Declaratia de la Helsinki, din 1975, revizuita in 2000.

Colectarea salivei

Intreaga saliva a fost colectata intr-un vas gradat racit cu gheata. Subiectii au eliminat saliva la fiecare 30 de secunde, timp de 5 minute. Apoi intreaga saliva a fost obtinuta dupa stimularea cu parafina pentru 5 minute. Volumul de saliva a fost inregistrat si exprimat ca mililitri pe minut. Saliva rezultata a fost stocata in parti alicote la 20 grade Celsius, pana cand au fost realizate determinarile. Toate examinarile au fost realizate la orele 10.00, de catre un acelasi examinator.

Determinarea concentratiilor de proteine, amilaze si mucine

Pentru toate determinarile s-au folosit metode colorimetrice, atat pentru saliva stimulata, cat si pentru cea nestimulata. Concentratia de proteine a fost determinata prin metoda Lowry, iar activitatea amilazelor a fost determinata in saliva diluata (1:100), prin metoda descrisa de Bernfeld, folosind ca substrat suspensie de amidon. Activitatea amilazei este exprimata in unitati pe miligram, unde 1 unitate de amilaza a fost definita ca fiind cantitatea de enzima care elibereaza 1 mg de maltoza intr-un minut, la 20 grade C. Concentratia de mucina a fost determinata folosind metoda Alcian Blue, descrisa de Hall et al si modificata de Sarosiek et al. Pe scurt, parti alicote din saliva diluata 1:10 au fost incubate pentru 30 de minute intr-o solutie de 1% de Alcian Blue cu 50 mM acetat de sodiu tampon, continand 25 mM MgCl2, pH 5.8, sub o agitare constanta la temperatura camerei. La incubarile urmatoare, probele au fost centrifugate pentru 20 de minute la 3000 rpm. Complexele mucina-colorant au fost disociate prin adaugarea unei solutii 1:2 de Aerosol OT cu apa distilata. Ulterior, probele au fost extrase cu volume egale de eter etilic sub agitare puternica. Solutia rezultata a fost centrifugata timp de 15 minute la 3000 rpm si concentratia de colorant determinata spectrofotometric la 605 nm in strat de faza apoasa. Aceasta metoda nu permite diferentierea dintre mucinele mari, MG1 si cele mici, MG2. Debitul pe minut al proteinelor, amilazei si mucinei a fost calculat in functie de rata fluxului salivar (in mm pe minut) a fiecarui pacient.

Analiza statistica

Semnificatia statistica a diferentelor a fost determinata prin analiza variantei (ANOVA), urmata de multiple teste de comparare Newman-Keuls. Pentru compararea parametrilor salivei stimulate cu cea nestimulata, in cadrul aceluiasi pacient, a fost utilizat testul-t. Au fost realizate corelatii, folosind GRAPHARD Prism versiunea 5.03 pentru Windows. Diferentele dintre valorile medii au fost considerate semnificative la p<0.05.

Rezultate

Evaluarea clinica

Tabelul 1 prezinta varsta, sexul si numarul de situri cu pierdere clinica de atasament ≥ 4mm, cu adancimea pungii la sondare ≥ 5 mm si cu sangerare la sondare, pentru fiecare pacient, grupati conform lui Page si Eke. Valoarea adancimii pungilor la sondare (media ± SEM) a fost de 1.9±0.12 mm pentru pacientii sanatosi, 2.2±0.08 mm (p<0.5) pentru pacientii cu parodontita usoara, 2.6±0.06 mm (p<0.001) pentru pacientii cu parodontita moderata si 3.4±0.1 mm (p<0.001) pentru pacientii cu parodontita severa. Valorile pierderii clinice a nivelului de atasament au fost 0 pentru subiectii sanatosi, 0.1±0.03 mm(p<0.05) pentru pacientii cu parodontita usoara, o.3±0.03mm (p<0.001) pentru parodontita moderata, si de 0.5±0.04 mm (p<0.001) pentru pacientii cu parodontita severa. Intervalul de varsta pentru pacientii sanatosi a fost de 27-41 de ani, pentru parodontita usoara 30-46 de ani, pentru parodontita moderata 35-57 si pentru parodontita severa 32-61 ani. Diferentele dintre parametrii salivari nu au fost cauzate de diferentele de varsta, deoarece subiectii in varsta din grupul cu parodontita au prezentat valori comparabile cu subiectii mai tineri.

Parametrii salivei nestimulate

In tabelul 2 sunt prezentate debitul salivar nestimulat, concentratiile de proteine totale si mucine, si activitatea amilazei, la pacientii cu parodontita usoara, moderata si severa. In timp ce debitul salivar a fost semnificativ scazut la pacientii cu parodontita severa, concentratiile de proteina totala si mucina, si activitatea amilazei au fost semnificativ crescute la pacientii cu parodontita moderata si severa. In mod invers, in grupul cu parodontita usoara, concentratia de mucina a fost semnificativ mai mica decat la subiectii sanatosi. Cand amilaza si mucina au fost exprimate ca unitati de miligrame de proteina, au fost obtinute aceleasi rezultate. Este de remarcat faptul ca concentratiile de proteine si mucina, ca si activitatea amilazei, au crescut de la parodontita usoara la cea severa.

Testele de corelare

Figura 1 prezinta corelatia dintre debitul salivar nestimulat, concentratiile de proteine si mucine, si activitatea amilazei, in cadrul tuturor grupurilor. Nu a fost observata nici o corelatie intre debitul salivar nestimulat si proteine sau amilaze, in schimb a fost gasita o corelatie inversa semnificativa (r=0.4055, p<0.01) intre debitul salivar si concentratia de mucina (fog. 1A-C). A fost detectata o corelatie semnificativa intre proteine si amilaze si mucine impreuna (r=0.3650, p<0.01 respectiv r=0.4528, p<0.01) si intre amilaze si mucine (r=0.3267, p<0.05; Fig. 1D-F). Corelatiile au fost efectuate doar pentru mostrele de saliva nestimulata, deoarece obiectivul a fost de a evalua daca o scadere a debitului salivar era responsabil de cresterea concentratiei de proteine, si daca mucinele si amilazele salivare, in conditii nestimulate, s-ar fi schimbat in acelasi mod in diferite stadii ale bolii.

Parametrii salivei stimulate

Tabelul 3 prezinta debitul salivar si concentratiile de proteine si mucine, si activitatea amilazei, la nivelul salivei stimulata mecanic. La pacientii cu boala moderata si severa, debitul salivar de dupa stimularea mecanica a fost semnificativ mai mic decat la pacientii sanatosi, in timp ce a fost observata o crestere semnificativa a concentratiei de proteine. Desi nu au fost observate diferente intre grupuri, in activitatea amilazei salivare, concentratia de mucina a fost semnificativ mai mica la grupul cu parodontita usoara.

Comparatie intre debitul salivar, productia proteinelor, amilazei si mucinelor, inainte si dupa stimularea mecanica

In figura 2 sunt prezentate debitul salivar si productia proteinelor, amilazei si mucinei, obtinute inainte si dupa stimulare. Stimularea a indus o crestere semnificativa a debitului salivar la toate grupurile, dar in grupul cu parodontita severa a fost semnificativ mai mica (Fig. 2A). Productia de proteine a crescut semnificativ la toate grupurile dupa stimulare (fig. 2B), in timp ce amilaza si mucina au crescut doar la nivelul grupurilor pacientilor sanatosi si cu parodontita usoara (Fig. 2C,D). In grupurile cu parodontita moderata si severa, productia de mucina si amilaza in conditii nestimulate a fost semnificativ mai mare decat in grupul sanatos (p<0.001 pentru mucina si p<0.05 pentru amilaza), in timp ce in conditiile stimulate nu a fost observata nici o diferenta. (Fig. 2).

Diferente semnificative fata de subiectii sanatosi: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001

Fig. 1 Corelatii intre debitul salivar, proteine, amilaze si mucine in saliva nestimulata de la toti subiectii studiati. Panoul de sus prezinta debitul salivar reprezentat grafic ca o functie a proteinelor (A), amilazei (B) sau a mucinelor (C). Panourile de jos prezinta proteinele reprezentate grafic ca o functie ori a amilazei (D), ori a mucinei (E), si amilaza reprezentata grafic ca o functie a mucinei (F). Fiecare simbol reprezinta un subiect.

Diferente semnificative fata de subiectii sanatosi: *p<0.05 si ***p<0.001

Discutii

In acest studiu au fost examinate debitul salivar, concentratiile de proteine si mucine si activitatea amilazei, asociate cu progresia parodontitei cronice la indivizii adulti, la nivelul salivei stimulate si nestimulate, pentru a intelege evolutia bolii in diferite etape. Fiecare grup a fost alcatuit din 15 subiecti, cu o femeie in grupurile sanatos si cu parodontita usoara, nici o femeie in grupul cu parodontita moderata si cinci femei in grupul cu parodontita severa. Absenta aproape totala a subiectilor de sex feminin in acest studiu a fost determinata de refuzul lor de a participa. Studiul s-a efectuat cu intreaga saliva deoarece scopul a fost de a evalua concentratiile de amilaza si mucina, acestea fiind produse de glandele parotida si submandibulara.

Debitul salivar nestimulat a fost semnificativ mai mic doar in grupul cu parodontita severa. In alte studii, in care debitul salivar nu a fost evaluat in functie de statusul parodontal, nu au fost observate diferente intre subiectii sanatosi si subiectii cu parodontita. Glandele salivare asigura un flux mediu de saliva la nivel oral, care indeplineste mecanismul de aparare si, potrivit rezultatelor obtinute la subiectii cu parodontita, acest flux este mentinut pana cand parodontita devine severa. Astfel, o reducere a debitului nu apare in stadiile incipiente ale bolilor parodontale, dar atunci cand distructia tesuturilor gingivale este avansata, debitul poate fi alterat.

Concentratiile proteinelor totale si ale mucinei, si activitatea amilazei erau crescute in saliva nestimulata, la subiectii cu parodontita moderata si severa. Aceasta crestere a proteinelor si amilazei nu poate fi atribuita unui schimb al debitului salivar, deoarece nu au fost gasite corelatii pozitive. Cu toate acestea, a fost gasita o corelatie inversa intre debitul salivar si concentratia de mucina salivara, indicand ca aceasta crestere a mucinei este insotita de o scadere a debitului salivar. Acest lucru se poate observa, deoarece in grupul cu parodontita usoara, concentratia de mucina s-a redus fara a fi schimbat debitul salivar, si, invers, in grupul cu parodontita severa, concentratia de mucinaa fost crescuta, si debitul scazut. De fapt, o crestere reala a secretiei de mucina a aparut in grupurile cu parodontita moderata si severa, precum reiese din rezultatele determinarilor. Proteinele salivare au diferite roluri in digestie, apararea gazdei si lubrifiere. Corelatia semnificativ pozitiva observata intre proteine, mucine si amilaze si faptul ca concentratiile lor salivare au crescut odata cu evolutia bolii, sustine punctul de vedere ca acestea sunt implicate in raspunsul gazdei. Mucina este una din proteinele care protejeaza cavitatea orala impotriva infectiilor microbiene, iar despre amilaza a fost raportata cresterea ei in boala parodontala si, in plus fata de saliva, a fost descrisa si in alte fluide mucozale ale corpului uman.

In grupul in care reactia inflamatorie a fost usoara, nici concentratia de proteine si nici cea de amilaza salivara nu au fost crescute, dar si mucina a fost scazuta. Acest lucru poate fi interpretat in doua moduri: in primul rand, stadiile incipiente ale bolii parodontale pot induce o reducere a secretiei de mucina; sau, pe de alta parte, subiectii cu concentratie scazuta de mucina sunt mai susceptibili la infectiile orale. La pacientii cu infectii cu Agregatibacter actinomycetemcomitans, a fost gasita o scadere a concentratiei proteinelor MG2 salivare, si, prin urmare, susceptibilitatea pacientilor a fost imbunatatita. Modelul de studiu a fost transversal, nu longitudinal, si din motive etice, dupa diagnosticare, pacientii au primit ingrijiri parodontale dupa caz; de aceea, evolutia pacientilor cu parodontita usoara nu a putut fi urmarita. Astfel, rolul concentratiilor de mucina, ca factor inductiv la inceputul de parodontita nu a putut fi pe deplin elucidat, dar este clar ca crestrea concentratiei de mucina in parodontita moderata si severa, poate fi considerata ca o incercare a glandelor salivare de a spori potentialul protector al salivei.

Fig.2 Comparatie intre debitul salivar (A), productia de proteine (B), amilaze (C) si mucine (D), intre saliva nestimulata (dungile goale) si cea stimulata (dungile pline) de la pacientii sanatosi, si pacientii cu parodontita usoara, medie si severa. Productia de proteine, amilaze si mucine a fost calculata in functie de debitul salivar al fiecarui pacient. Dungile reprezinta valorile medii ± SEM a 15 subiecti pentru fiecare grup. *p,0.05, **p,0.001, ***p,0.001 contra saliva nestimulata din acelasi grup. p<0.05 contra cresterii debitului salivar in toate celelalte grupuri

Debitul salivar a crescut dupa stimularea mecanica in toate grupurile, dar dupa stimulare, un debit mai mic a fost observat nu numai in parodontita severa, ci si in cea moderata, sugerand un raspuns mai mic la stimuli, in cadrul acestui grup. Fluxul salivar crescut a indus scaderea concentratiilor proteinelor si mucinelor si a activitatii amilazei salivare, subliniind faptul ca exocitoza nu a raspuns in mod egal la stimularea mecanica. In ciuda diluarii, diferentele dintre concentratiile proteinelor si ale mucinelor, in grupul cu parodontita moderata si severa, au fost inca observate. Acest lucru poate fi legat de scaderea debitului salivar observat in aceste grupuri. Din nou, o scadere a concentratiei mucinelor a fost observata in grupul cu parodontita usoara, dar, dupa cum s-a mentionat anterior, progresia bolii in acest grup nu a putut fi monitorizata din motive de etica. S-ar putea specula ca o scadere a mucinei poate fi implicata in patogeneza bolii, dar este un subiect care trebuie elucidat. Pentru a evalua diferentele de exocitoza, inainte si dupa stimularea mecanica, a fost calculata productia pe minut de proteine, amilaza si mucina, Productia de proteine a crescut cu aproximativ 55-75% in toate grupurile. Amilaza si mucina au crescut doat in grupurile cu subecti sanatosi si cu parodontita usoara, cu aproximativ 20-35%. Acest fapt poate fi explicat, pentru ca stimularea mecanica poate induce exocitoza unor proteine, dar eliberarea putina a altora. Productia nestimulata de amilaza si mucina a fost mai ridicata in grupul cu parodontita moderata si severa; astfel, lipsa de raspuns la simulare poate fi referitoare la epuizarea veziculelor acinare. Productia nestimulata de mucina in grupul cu parodontita usoara a fost cea mai mica. Acest lucru s-a reflectat in concentratia mucinelor salivare, dar raspunsul la stimulare a aratat ca nu exista nici o deteriorare a functiei glandelor salivare. Astfel, se poate presupune ca productia de mucina a crescut ca raspuns la stimulii inflamatori odata cu progresia bolii, avand semnificatie biologica, asa cum poate fi vazut in grupurile cu parodontita moderata si severa. Dupa stimulare nu au existat diferente intre grupuri, indicand faptul ca glandele salivare au imbunatatit potentialul protector al salivei in raspunsul procesului inflamator in conditii de repaus. Putem concluziona ca dezvoltarea parodontitei nu este legata de disfunctiile glandelor salivare, deoarece, pe masura ce boala avanseaza, se observa o crestere a concentratiilor de proteine, mucine si amilaze, lucru ce sporeste potentialul protector al salivei. Exocitoza de la nivelul celulelor salivare este legata de stimularea simpatica. Au fost descrise interactiuni dintre sistemul nervos simpatic si sistemul imun, in timpul inflamatiei. Astfel, se poate specula ca procesul infectios al parodontitei activeaza sistemul simpatic, care, la randul sau duce la eliberarea unor proteine salivare, crescand astfel potentialul protector al salivei.

O alta speculatie poate fi facuta pentru scaderea debitului salivar. Este cunoscut faptul ca la oameni, mestecatul unui material fara gust produce cresterea debitului saliva parotidian , iar in acest reflex masticator salivar sunt implicati mecanoreceptorii intraorali. Astfel, putem specula ca, odata cu agravarea parodontitei si cresterea pierderii de atasament, reflexele masticatorii scad, fiind responsabile de scaderea debitului salivar in stadiile ulterioare ale bolii.

Multumiri

Aceasta lucrare a fost sustinuta de un grant de la Universitatea din Buenos Aires (UBACyT O 401). Nu exista nici un conflict de interes.

Referinte

1. Humphrey SP, Williamson RT. A review of saliva: normal composition, flow and function. J Prosthet Dent 2001;85:162– 169.

2. Slomiany A, Okazaki K, Tamura S, Slomiany BL. In vitro sulfation of sublingual salivary gland mucin: structures of 15S-labeled oligosaccharides. Biochem Int 1989;18:589–597.

3. Tabak LA. Structure and function of human salivary mucin. Crit Rev Oral Biol Med 1990;1:229–234.

4. Schenkels LCPM, Veerman ECI, Nieuw Amerongen AV. Biochemical composition

of human saliva in relation to other mucosal fluids. Crit Rev Oral Biol Med 1995;6:161–175.

5. Levine MJ. Salivary macromolecules: structure/function synopsis. Ann NY Acad

Sci 1993;694:11–16.

6. Mellersh A, Clark A, Hafiz S. Inhibition of Neisseria gonorrhoeae by human normal

saliva. Br J Vener Dis 1979;55:20–23.

7. Douglas CW. The binding of human salivary a-amylase by oral strains of streptococcal

bacteria. Arch Oral Biol 1983;28:567–583.

8. Proctor GB, Carpenter GH. Regulation of salivary gland function by autonomic

nerves. Auton Neurosci 2007;133:3–18.

9. Henskens YMC, Vand der Velden U, Veerman ECI, Nieuw Amerongen AV.

Protein, albumin and cystatin concentration in saliva of healthy subjects and of patients with gingivitis or periodontitis. J Periodontal Res 1993;28:43–48.

10. Page RC, Eke PI. Case definitions for use in population-based surveillance of periodontitis.

J Periodntol 2007;78:1387–1399.

11. Mashayekhif F, Aghahoseini F, Rezaie A, Zamani MJ, Khorasani R, Abdollahi M.

Alteration of cyclic nucleotides levels and oxidative stress in saliva of human subjects

with periodontitis. J Contemp Dent Pract 2005;6:46–53.

12. Lowry OH, Rosebrough N, Farr AL, Randall R. Protein measurement with the

Folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193:267–275.

13. Bernfeld P. Enzymes of starch degradation and synthesis. Adv Enzymol Relat

Subj Biochem 1951;12:379–428.

14. Hall RL, Miller AC, Peatfield PS, Richardson I, Williams I, Lampert I. A colorimetric

assay for mucus glycoprotein using Alcian blue. Biochem Soc Trans 1980; 8:72–73.

15. Sarosiek J, Rourk RM, Piascik R, Namiot Z, Hetzel DP, McCallum RW. The effect

of esophageal mechanical and chemical stimuli on salivary mucin secretion in healthy indiciduals. Am J Med Sci 1994;308:23–31.

16. Henskens YMC, Van den Keijbus PAM, Veerman ECI et al. Protein composition

of whole and parotid saliva in healthy and periodontitis subject. J Periodontal Res

1996;31:57–65.

17. Da Ro´ s Gonc¸alvez L, Soares MR, Nogueria FCS et al. Comparative proteomic

analysis of whole saliva from chronic periodontitis patients. J Proteomics 2010; 73:1334–1341.

18. Groenink J, Walgreen-Weterings E, Nazmi K et al. Salivary lactoferrin and low- Mr mucin MG2 in Actinobacillus actinomycetemcomitans- associated periodontitis. J Clin Periodontol 1999;26:269–275.

19. Jensen JL, Brodin P, Berg T, Aars H. Parotid secretion of fluid, amylase and kallikrein during reflex stimulation under normal conditions and after acute administration of autonomic blocking agents in man. Acta Physiol Scand 1991; 143:321–329.

20. Hasko´ G. Receptor-mediated interaction between the sympathetic nervous system

and immune system in inflammation. Neurochem Res 2001;26:1039–1044.

21. Hector MP, Linden RWA. The possible role of periodontal mechanoreceptors in the control of parotid secretion in man. QJ Exp Physiol 1987;72:285–301.