Determinarea Activitatii Enzimatice a Alcool Dehidrogenzei din Vin

DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ENZIMATICE A ALCOOL DEHIDROGENAZEI DIN VIN

Cuprins

Introducere

Capitolul I. ASPECTE BIOCHIMICE ȘI TEHNOLOGICE LA FERMENTAREA VINULUI

I.1. Fermentația alcoolică

I.2. Fazele de desfășurare a fermentației alcoolice

I.3. Drojdiile

I.4. Enzimele

I.5. Proprietățile biotehnologice ale drojdiilor fermentative

I.6. Factorii care influenteaza dinamica fermentației alcoolice

I.7. Fermentația malolactică

Capitolul II. TEHNOLOGIA FERMENTĂRII MUSTULUI ȘI PROCEDEE DE REALIZARE

II.1. Fermentația spontană

II.2. Fermentația provocată

II.3. Fermentația nedirijată

II.4. Fermentația dirijată

II.5. Supravegherea și conducerea fermentației

II.6.Macerația în tehnologia obținerii vinurilor roșii și aromate

Capitolul III (PARTE EXPERIMENTALĂ). DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ALCOOL DEHIDROGENAZEI ÎN FERMENTAȚIA VINULUI

III.1. Principiul metodei

III.2. Determinarea activității enzimatice a alcooldehidrogenazei din vin

III.3. Rezultate experimentale

Concluzii

Bibliografie

INTRODUCERE

în procesul de obținere a vinului, fermentația alcoolică reprezintă o etapă determinantă. De modul în care este condusă această fază depinde, în mare măsură, nivelul calitativ al vinului și evoluția lui ulterioară. Controlul strict asupra parametrilor fizico-chimici, precum și a agenților biologici în vinificație, sunt factori determinanți pentru calitatea produsului finit, respectiv pentru obținerea vinurilor de înaltă clasă.

Obținerea unor biocatalizatori noi, cu proprietăți superioare, reprezintă o prioritate și un domeniu vast de cercetare, a cărui exploatare poate conduce la noi performanțe de randament și calitate în industria vinului.

Alcool dehidrogenaza este o enzimă „cheie” în procesul de fermentație care influențează decisiv calitatea produsului finit. Activitatea ei depinde ce concentrația de etanol formată în timpul fermentației, precum și de durata de fermentare a mustului.

CAPITOLUL I

ASPECTE BIOCHIMICE ȘI TEHNOLOGICE

LA FERMENTAREA VINULUI

I.1. Fermentația alcoolică

Fermentația alcoolică este un proces biochimic anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reacții de oxido-reducere sub acțiunea echipamentului enzimatic al drojdiei, în produșii principali (alcool etilic și CO2) și produsi secundari ca: alcooli superiori, acizi organici, aldehide, etc.

Procesul de fermentație este exoergic și se realizează sub influența enzimelor elaborate de drojdii. Agenții tipici ai fermentației alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot să producă prin fermentarea glucidelor mai mult de 8° alcool etilic.

Fermentația alcoolică este poate fi produsă și de alte numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare, cantități mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel, mai pot produce alcool etilic și bacteriile: Bacillus macerans, Clostridium acetonoetilicus, Zymomonas, dar ele nu sunt considerate agenți tipici de fermentare .

Fermentarea alcoolică este un proces anaerob, care pornește de la glucoza liberă din struguri. Fermentarea urmează aceleași căi enzimatice ca și glicoliza anaeorbă până la formarea de acid lactic, care e transformat în acidul piruvic și apoi în dioxid de carbon și etanol.

Figura I.1. Fermentația alcoolică [1]

Fermentarea anaerobă este considerată ca fiind una dintre cele mai vechi căi de producere a energiei în organismele vii.

I.1.1.Biochimismul formării produșilor de reacție în fermentația alcoolică

Procesul de fermentație alcoolică se desfășoară în următoarele etape prezentate în figura I.2

Figura I.2. Glicoliza anaerobă [2]

Glicoliza implică două faze, una premergătoare, care necesită energie, prin intervenția ATP și o doua fază care formează energie, producând ATP.

Global, aceste transformari pot fi generalizate ca:

Energia (căldura) se eliberează din oxidarea substanțelor organice pe două căi principale:

în timp scurt și cu degajare de temperaturi înalte, în caz de ardere simplă, conform formulei:

Glucoză: C6H12O6+ 6O2 → 6CO2+ 6H2O + energie

lent și treptat, prin procese biochimice aproape identice pe toată biosfera lipsită de asimilația clorofilială, de la microb la animal, ca bază a metabolismului, cu eliminări dozate și controlate de energie în condiții anaerobe, care duce într-un prim stadiu, în citoplasmă la două molecule de piruvat, care se va descompune enzimatic – în cadrul ciclului Krebs – în mitocondriile celulei eucariote sau în citoplasma bacteriilor fie, aerobic, la dioxid de carbon, eliminat prin respirație și apă fie, printr-un proces de fermantație anaerob care va duce la acid lactic (în activitatea musculară intensivă) sau la etanol.

Glicoliza reprezintă etapa inițială și comună a respiratiei și a fermentației. Ea realizeză:

– legătura intre substratul respirator și ciclul Krebs;

– oferă două molecule de ATP si două de NADH+H+ la fiecare molecula de hexoza metabolizată;

– formează o serie de produși intermediari ce pot fi utilizați in diferite cicluri metabolice;

– in cloroplaste reprezintă o cale independentă de sinteză a ATP-ului si NADH+H+;

Catabolismul complet al glucozei

Oxidarea completă a glucozei poate fi generic reprezentată prin următoarea reacție:

Figura I.3. Etapele glicolizei [4]

Aceasta reprezintă o cale metabolică importantă prin care se eliberează multă energie și o cantitate de ATP de circa 20 de ori mai mare decât cea obținută prin glicoliză.

Oxidarea completă a glucozei cuprinde trei etape:

1. degradarea glicolitică anaerobă până la acid piruvic (etapele 1- 9);

2. decarboxilarea oxidativă a acidului piruvic, produși finali fiind acidul acetic si dioxidul de carbon, conform ecuației globale:

Practic are loc o decarboxilare, urmată de o oxidare, acidul acetic fiind în final legat de CoA. Biocatalizatorul acestor reacții este unul multienzimatic complex, cunoscut sub numele de piruvat dehidrogenaza. Produșii finali sunt de fapt acetil coenzima A si NADH.

3. ciclul acizilor carboxilici sau ciclul Krebs

Ciclul Krebs

Acetil-CoA formata in ciclul anterior intra in ceea ce se cunoaste sub denumirea de ciclul Krebs sau ciclul acizilor tricarboxilici si după cum se observă este refacută la un ciclu complet. Furnizoare de energie este scindarea hidrolitică a legăturii tioesterice, reactie reversibilă [5].

Bilanțul acestui ciclu poate fi reprezentat schematic ca:

scoțând in evidență oxidarea totală a acetilului la dioxid de carbon si hidrogen. Atomii de hidrogen reprezintă in fapt energia potențială care va fi eliberată în urma reacției cu oxigenul în cadrul procesului respirator.

Dacă se calculează acum bilanțul energetic al oxidării totale a glucozei, ținându-se cont ca principala forma de stocare a energiei este sub forma legăturilor de ATP, se va vedea că din cele 40 de molecule ATP eliberate la oxidarea unei molecule de glucoză se consumă 2 pentru degradări hidrolitice, deci câștigul este de 38 molecule ATP. Aceasta reprezintă de fapt izvorul energetic al manifestărilor biochimice [6].

I.1.2. Formarea produșilor secundari de fermentare

In fermentația alcoolică rezultă o diversitate de produse secundare. In vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substante diferite. Majoritatea lor rezultă prin fermentare, iar celelalte sunt dependente de compoziția mediului de fermentare. Enzimele cele mai importante care intervin în procesul de fermentație sunt dehidrogenazele: glicerat-dehidrogenaza și alcool dehidrogenaza care au drept coenzima NAD+, cu rol în transfer de hidrogen în reacțiile de catabolism.

Fermentația decurge activ când celulele de drojdie sunt in faza exponențială sau la începutul fazei stationare de creștere, în timp ce drojdiile autolizate, ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare și inactivarea enzimelor, își pierd proprietățile fermentative.

Viteza de fermentare depinde și de numărul de celule vii/cm3 mediu. Viteza fermentației crește cu numărul de celule, prin viteză intelegând conținutul de alcool etilic format la 100 cm3 lichid în unitatea de timp. [7]

Drojdiile produc fermentarea unui număr limitat de glucide ce pot fi transformate în alcool etilic și CO2 in conditi anaerobe, intre diversele specii existând diferențe.

Drojdiile fermentative au un spectru limitat de glucide atacabile. Astfel, toate tulpinile de Saccharomyces cerevisiae pot fermenta D-glucoza, D-manoza și D-fructofuranoza (fără să poată folosi D-fructopiranoza) și să le asimileze în condiții aerobe cand acestea reprezintă sursa unică de carbon. In aerobioză, dupa epuizarea glucidelor, drojdiile pot asimila și alcoolul etilic.

Zaharoza este hidrolizată sub acțiunea invertazei situată la nivelul peretelui celular al drojdiei.Se cunosc două forme de invertază si anume o invertază localizată în spațiul periplasmic care este responsabilă pentru hidroliza extracelulara a zaharozei și o formă secundară de invertaza, intracelulara. Invertaza este supusă represiei de către glucoză incât daca D-glucoza este disponibila in mediu, nu poate fi pusa in evidență activitatea invertazică extracelulară [8].

Maltoza este hidrolizată intracelular după ce are loc o absorbtie specifică de către maltozopermeaza sub acțiunea maltazei.

In condiții anaerobe, prin imersare în must, celulele de drojdie produc fermentarea glucidelor obtinând o cantitate mică de energie (2 moli ATP/mol glucoza fermentată). De aceea, ele trebuie sa prelucreze o cantitate mai mare de zahăr pentru a obține energie, iar cresterea numărului de celule are loc foarte lent.

Dintre alcoolii superiori, care se acumulează mai ales la fabricarea etanoului , fac parte alcoolii amilic, izoamilic, propanol, butanol, care pot sa contribuie la formarea unor substanțe de aroma.

La fabricarea vinului, alcoolii superiori (~ 250 mg.dm-3) sunt precursori de aromă deoarece se pot combina cu diferiții acizi rezultând esteri cu aromă caracteristică. De exemplu in vinuri, din fenilalanina se formeaza alcoolul feniletilic care da aroma de trandafir [9].

Diacetilul și acetoina se formează când cantitatea de celule de drojdie este foarte mare. Prezența în cantități mici a acestor substante nu influentează calitățile senzoriale ale produsului, dar la concentrații mai ridicate, se sesizeaza gustul de diacetil, și apar modificări senzoriale nedorite. Gustul este sesizat mai ales în bere unde se formează și sub acțiunea unor bacterii contaminante.

Mercaptanii apar când gruparea -OH din alcooli este înlocuita cu gruparea -SH. Prezența acestor substanțe cu gust neplăcut este datorată acțiunii unor drojdii cu calități nedorite, asupra compusilor cu sulf din mediile fermentative.

Ca rezultat al formării produselor secundare, in industria fermentativă se obțin produse diversificate, apreciate prin calități senzoriale și nutritive.

Acizii provin atât din must cât și din procesul fermentativ. Ei dau aciditate volatilă vinului (acid acetic, formic, propionic, butiric) precum și o aciditate fixă (acid lactic, succinic) care se regăsește in aciditatea totală a vinului.

Acidul lactic se poate acumula in cantitati de 20 mg/dm3 provenind din acidul piruvic care accepta H+.

Acidul acetic se acumuleaza in cantitati de 80-120 mg/dm3. El poate avea rol in formarea esterilor (acetat de etil), iar la concentrații mai mari determină modificări de gust, ceea ce conduce la deprecierea vinului.

Acidul succinic se formează prin bioconversia glucidelor (poate reprezenta 0,7% din cantitatea de zahar fermentat), fie din aminoacizi.

Din acidul glutamic prin dezaminare hidrolitică se eliberează amoniacul ce poate fi folosit de drojdii ca sursa de azot si rezultă acidul hidroxiglutaric din care se poate forma acidul formic si aldehida succinică.

In vinificatie, fermentarea alcoolică trebuie să respecte câteva reguli de bază [9]:

Să se asigure o fermentare completă și rapidă;

Să se evite producerea de aciditate volatilă (de exemplu, acid acetic/oțet) în prima perioada a fermentației. Acest fapt poate fi contracarat prin extragerea compușilor nocivi cu vapori de apă și se idul piruvic care accepta H+.

Acidul acetic se acumuleaza in cantitati de 80-120 mg/dm3. El poate avea rol in formarea esterilor (acetat de etil), iar la concentrații mai mari determină modificări de gust, ceea ce conduce la deprecierea vinului.

Acidul succinic se formează prin bioconversia glucidelor (poate reprezenta 0,7% din cantitatea de zahar fermentat), fie din aminoacizi.

Din acidul glutamic prin dezaminare hidrolitică se eliberează amoniacul ce poate fi folosit de drojdii ca sursa de azot si rezultă acidul hidroxiglutaric din care se poate forma acidul formic si aldehida succinică.

In vinificatie, fermentarea alcoolică trebuie să respecte câteva reguli de bază [9]:

Să se asigure o fermentare completă și rapidă;

Să se evite producerea de aciditate volatilă (de exemplu, acid acetic/oțet) în prima perioada a fermentației. Acest fapt poate fi contracarat prin extragerea compușilor nocivi cu vapori de apă și se poate preveni prin controlul sănătatii strugurilor (să nu fie alterați), al temperaturii și al drojdiilor;

Să se evite aparitia unor compuși cu mirosuri dezagreabile;

În tehnologia transformării strugurilor în vin, o mare importanță prezintă fermentația alcoolică, macerația boștinei și fermentația malolactică. De modul cum aceste trei procese sunt stimulate, activate, frânate, întrerupte sau chiar evitate, depinde în mare măsură calitatea vinului [10].

La fermentația alcoolică a mustului au loc și alte procese ca de exemplu, degradarea acidului malic (fermentația maloalcoolică), degradarea hexozelor în acid lactic, formarea alcoolilor superiori, reducerea sulfaților în sulfiți și a acestora la hidrogen sulfurat.

De exemplu, transformarea acidului malic în alcool etilic și CO2 are loc după următorul mecanism:

Acidul piruvic rezultat suferă o decarboxilare, iar acetaldehida formică se reduce în alcool etilic. Transformarea are loc sub influența enzimelor elaborate de levurile care produc fermentația alcoolică. Cantitatea de acid malic degradată de acestea variază între 10 și 25% din conținutul inițial. Există însă și specii, ca de exemplu Schizossacharomyces pombe, care pot degrada până la 90% din acidul malic al mustului. Asemenea specii ar putea fi utilizate la corectarea acidității în anii când musturile sunt bogate în aciditate malică.

I.2. Fazele de desfășurare a fermentației alcoolice

Fermentarea mustului nu decurge în mod uniform, în desfășurarea acestui proces se pot distinge trei faze [10]:

prefermentativă

fermentare tumultuoasă

postfermentativă

Faza prefermentativă, numită și faza inițială, se desfășoară de la introducerea mustului în vasul de fermentare până la degajarea evidentă a CO2. Macroscopic, în această fază, mustul începe să se tulbure, iar temperatura urcă lent până la 17-18°C.

Conținutul în glucide începe să scadă și implicit se micșorează densitatea mustului. Degajarea de CO2 nu se observă inițial, deoarece se dizolvă în lichid. Treptat însă CO2 începe să se degaje, iar la suprafața lichidului se formează spumă, motiv pentru care, încă de la umplere, la fiecare vas se lasă un anumit spațiu de rezervă, numit gol de fermentare.

Durata fazei este de obicei scurtă, 1-3 zile, fiind condiționată de numeroși factori [11]:

temperatura inițială a mustului și cea a aerului din secția de fermentare:

concentrația în zaharuri a mustului;

gradul de sulfitare;

mărimea vaselor;

natura levurilor utilizate, etc.

Macroscopic, faza se evidențiază printr-un număr mare de levuri aflate într-un proces intens de înmugurire.

Faza de fermentare tumultuoasă (zgomotoasă) este delimitată de începutul și sfârșitul degajării evidente a CO2. În această fază activitatea levurilor este foarte intensă, iar temperatura atinge și chiar depășește 25-30°C. Conținutul în zaharuri scade rapid, atrăgând după sine scăderea densității, creșterea gradului alcoolic și formarea unor mari cantități de CO2, care, în degajare, produce un zgomot șuierător și o frământare puternică a mustului.

Când gazul carbonic trece prin pâlnia de fermentare, lichidul din ea începe să bolborosească, să „fiarbă”. Faza durează 5-14 zile, uneori chiar și mai mult. Vinurile rezultate după o fermentare de lungă durată sunt mai aromate, mai buchetate. La fermentări rapide se produc pierderi de substanțe aromate și de buchet. De obicei, musturile bogate în zahăr fermentează mai încet, în timp ce cele sărace mai rapid și mult mai zgomotos.

Faza postfermentativă este numită și faza de fermentare liniștită, deoarece degajarea CO2 este mult mai încetinită, devenind aproape imperceptibilă. Tulbureala se depune, fără a mai reveni în masa lichidului, iar odată cu ea încep să se depună și levurile. Temperatura vinului scade treptat, până la nivelul celei din sala de fermentare, iar dacă timpul este friguros are loc și depunerea tartraților. Drept urmare, vinul începe să se limpezească și să își capete însușirile lui specifice. Când se prepară vinul cu rest de zahăr, post-fermentația se întrerupe la un stadiu care asigură concentrația de zahăr corespunzătoare categoriei de vin.

Dacă se urmărește obținerea de vinuri cu mai multă prospețime, atunci se iau măsuri ca în masa vinului să rămână mai mult CO2. Normal, orice vin tânăr conține 0,2-0,5g/l CO2. Cantități de 1-1,3g/l CO2, ce imprimă vinului prospețime, se pot obține numai în condițiile în care temperatura de fermentare este scăzută (17-18°C), deoarece solubilitatea CO2 depinde nu numai de presiune, ci și de temperatură [12].

I.3. Drojdiile

Drojdiile sunt microorganisme care produc fermentația mustului. Fermentația alcoolică este un proces biochimic prin care zaharurile fermentescibile sunt transformate în alcool și CO2 (dioxid de carbon).

Drojdiile sunt prezente pe struguri în mod natural, fără ele nu ar fi posibilă obținerea vinului. Însușirile drojdiilor variază de la un an la altul în funcție de factorii de mediu și climatici. Acest lucru face ca într-un an fermentația să fie de bună calitate și să dea vinuri deosebite, iar în alt an fermentația să nu mai fie chiar atât de reușită și să creeze probleme vinurilor (pornire grea sau nepornire a fermentației, fermentație incompletă, etc.). Din aceste motive au apărut drojdiile selecționate deshidratate. Ele au fost izolate în podgorii renumite, în ani excepționali, au fost testate, selectate, verificate ulterior în timpul mai multor campanii de vinificație.

Astfel au fost obținute drojdii cu caracteristici bine cunoscute și al căror rezultat în urma fermentării este cunoscut și studiat. Ele sunt multiplicate, deshidratate și împachetate sub vid, fiind comercializate sub diverse denumiri în funcție de varietatea lor [13].

Drojdiile selecționate se adaugă în mustul sau mustuiala proaspătă, înainte de începutul fermentației alcoolice asigurîndu-se astfel o activitate fermentativă ridicată și de bună calitate. Ele permit o fermentație completă și de calitate, chiar și în anii cu condiții nefavorabile (temperaturi scăzute, recolte spălate de ploaie, etc.) sau pe recoltele avariate sau supramaturate.

Vinurile obținute cu drojdii selectionate, alese în functie de soi sau tipul de vin ce se dorește a se obține, prezintă, în general, caracteristici superioare față de vinurile obtinute din aceiași struguri dar fără drojdii selecționate.

I.4. Enzimele

Enzimele sunt componenți naturali ai organismelor vii. Celulele strugurilor contin, în mod natural, o anumită cantitate de enzime, dar într-o cantitate insuficientă pentru a juca un rol vizibil în timpul vinificatiei [14]. Din acest motiv este necesara "întarirea" efectului acestora prin adaugarea unor cantitati suplimentare de enzime.

Enzimele enologice au rolul de a ameliora cîteva faze ale vinificatiei :

– obtinerea unei cantitati mai mari de must ravac

– limpezirea mai rapida si mai buna a mustului

– extractia culori

– extractia aromelor si îmbunatatirea expresivitatii aromatice a soiurilor

– ameliorarea filtrabilitatii vinurilor

Toate aceste operatii sunt îngreunate de prezenta pectinelor ce sunt extrase din struguri în momentul obtinerii mustului. Pectinele sunt constituenți importanți ai pereților celulari și sunt eliberate în must în timpul zdrobirii, scurgerii, presării. Moleculele de mari dimensiuni ale substantelor pectice împiedică clarifierea eficientă a mustului, precum și tratamentele de limpezire a vinului și filtrabilitatea acestuia [15].

Enzimele utilizate în timpul scurgerii-presarii ajută la degradarea pereților celulari și astfel favorizează eliberarea mustului ravac. În acelasi timp se realizează si o extractie rapidă a substantelor colorante și a taninurilor în cazul vinurilor roșii si o ameliorare a extracției de arome în cazul strugurilor aromati.

Enzimele adaugate în must, prin micsorarea vâscozității acestuia și diminuarea efectului de coloid protector al pectinelor ajută la decantarea rapidă a impurităților din must si la imbunătățirea filtrabilitatii acestuia. Enzimele adăugate în mustuiala de struguri rosii, prin degradarea compusilor pectici și celulozici din peretii celulari, îmbunătățesc extractia substanțelor colorante

Enzimele adăugate în mustuiala de struguri albi aromați, prin degradarea compușilor pectici și celulozici din pereții îmbunătățesc extracția substanțelor de aromă. Deasemenea, exista enzime care se folosesc fie pentru eliberarea substantelor aromate din precursorii de aroma, fie pentru ameliorarea filtrabilitatii vinurilor obținute din struguri supramaturati sau mucegăiți [16].

I.5. Proprietățile biotehnologice ale drojdiilor fermentative

Pentru a putea fi folosite in practică drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate și selecționate în functie de unele proprietăți care le recomandă pentru utilizare industrială, cum ar fi [17]:

Puterea alcooligenă care se referă la concentratia mare de alcool ce se poate acumula cand in mediu exista un exces de zahar. Drojdiile sunt sensibile la cresterea concentratiei in alcool si in timp ce drojdiile cu putere alcooligena slaba (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentratie in alcool de 4-6° drojdiile de vin si spirt (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus., Saccharomyces cerevisiae-cerevisiae) au o putere alcooligenă mare si continua fermentatia alcoolica pana se acumuleaza 16-18° alcool.

Alcoolorezistența se refera la capacitatea drojdiei de a continua fermentatia la cresterea concentratiei de alcool si de a demara fermentatia in prezenta de 8% alcool.

Sulfitorezistența este capacitatea drojdiilor de vin de a produce fermentatia alcoolica o proprietate importanta a drojdiilor de vin care in prezenta unor concentratii de 200-500 mg SO2·dm-3 pot influenza negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scaderii potențialului de oxidoreducere.

Se presupune ca rezistența la SO2 este datorată si capacitatii acestor drojdii de a excreta aldehida acetica ce poate lega SO2 care astfel isi reduce efectul levuristatic.

Capacitatea de floculare și pulverulență – proprietăți datorate structurii peretelui celular și a modificarii de pH si rH din timpul fermentației. Drojdiile floculante pot forma asociatii ce se depun mai usor, in timp ce drojdiile pulverulente se mentin mai mult timp in suspensie si produc o fermentatie mai avansata. Pentru drojdiile de șampanie se urmăreste ca aceasta sa se depună ușor in gâtul sticlei si prin operatia de degorjare să se separe sedimentul, obtinându-se o șampanie limpede.

Osmotoleranța se refera la capacitatea drojdiilor de a produce fermentatia in mediu cu concentratie crescuta de zahar. Aceste proprietati sunt recomandate drojdiilor folosite la obtinerea spirtului din melasa cu un randament superior in alcool etilic.

Frigofilia este o adaptare a drojdiilor de a produce fermentatia la temperaturi mai scazute de 10-15°C; astfel sunt evitate fermentații secundare iar in vin se acumulează mai multe substante de aroma.

Caracterul killer este intâlnit la unele drojdii capabile de a sinteza intracelular o toxină cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. In selectionarea drojdiilor de vin culturile care au caracter killer dau randamente superioare deoarece in cursul fermentatiei are loc o autoselectie naturală.

I.6. Factorii care influenteaza dinamica fermentației alcoolice

Fermentația alcoolică în condiții industriale foloseste substraturi naturale bogate în zahăr fermentescibil, iar viteza de fermentare și transformare a glucidelor in produsi primari si secundari este dependenta de numerosi factori care pot fi impărtiti î n doua mari categorii: factori biologici, dependent de microagentii fermentarii, si factori fizico-chimici, dependentt de compozitia mediului supus fermentarii si conditiile mediului ambiant.

Factorii biologici

Incă din 1885-1887 a fost stabilit de catre Ed. Büchner ca fermentația alcoolică este cauzată de enzimele elaborate de celula de drojdie, stabilindu-se natura enzimatica a fermentatiei [19].

Efectul Pasteur este mai evident la specii de drojdii la care glicoliza este mai putin eficienta, in timp ce pentru drojdiile cu metabolism fermentativ puternic, acest efect este mai putin important, deoarece enzimele ce intervin in respiratie (aeroba) sunt supuse represiei in prezenta glucozei din mediu. [20]

In practica vinificarii, atunci cand fermentatia decurge lent, ca rezultat al prezentei in mediu a unui numar mai mic de celule, se poate stimula cresterea de celule prin aerare. In industrii fermentative (spirt, vin, bere) nu se urmareste obtinerea de biomasa celulara, de aceea conditiile sunt anaerobe, astfel incat o cantitate mai mare de zahar este transformata in alcool etilic, iar cantitatea de drojdie reziduala la sfarsitul fermentarii este in cantitate mai mica.

Saccharomices cerevisiae, in conditii strict anaerobe nu creste mai mult de 2-3 generatii. Drojdia necesita cantitati reduse de oxigen pentru sinteza de steroli cu rol de intermediari in biosinteza. In absenta oxigenului, mediul trebuie sa fie suplimentat cu ergosterol si acizi grasi pentru continuarea cresterii celulare.

Fermentația alcoolică este influentata si de factori chimici si fizici, care actioneaza atat asupra vitezei de fermentare cat si asupra bilantului masic si a raportului dintre produsii primari si secundari.

I.5.1. Influența factorilor fizico-chimici asupra fermentației alcoolice

Compoziția mediului de fermentare. Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate in mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, in functie de calitatea mustului, care este influentata de soiul si gradul de coacere a strugurilor, apar diferente de aromă.

Concentratia in zahar influenteaza direct proportional viteza de fermentare atunci cand se situeaza in limitele 5-12% (50-120 g zahar.dm'3). Cu cresterea concentratiei de zahar anumite drojdii mai sensibile sufera o inhibare in activitate prin procese de represie catabolica sau prin modificari la nivel de membrana datorate plasmolizei. Drojdiile de fermentare au in general osmotoleranta si de aceea produc fermentarea in bune conditii a mustului de struguri cu o concentratie de 170-250 g zahar.dm-3 [21].

In fermentatia alcoolică industrială se folosesc diferite produse bogate in zahar, medii naturale ce contin si alte substante necesare pentru mentinerea activa si nutritia celulelor.stfel, daca mustul de struguri este folosit ca lichid fermentescibil la fabricarea vinului, la fabricarea berii se foloseste mustul de malt ce contine maltoza (80% din substanta solubila).

In industria spirtului si la obtinerea drojdiei comprimate se foloseste ca mediu de baza melasa, care are un continut de 45-55% zaharozanecristalizata.

Plamezile amidonoase pentru a putea fi folosite in fermentatie trebuie sa sufere mai intai o hidroliza enzimatica in urma careia se obtine glucoza, maltoza, dextrine cu molecule mici, care sunt apoi transformate in alcool etilic.

Zerul rezultat la fabricarea branzeturilor, cu un continut de 4,7% lactoza, poate fi folosit la obtinerea de alcool etilic folosindu-se drept agenti de fermentare drojdii din genul Kluyveromyces producatoare de lactaza.

Celuloza poate fi folosita drept substrat la obtinerea alcoolului carburant dupa hidroliza chimica si enzimatica din care rezulta celobioza si cellodextrine ce pot fi fermentate de catre drojdii.

Concentrația în alcool.

In mediile fermentative cu microbiota naturala, daca se ajunge la o concentratie alcoolica de 4-6°, se produce o incetinire a fermentarii la drojdii care nu au rezistenta la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar fermentarea este continuata de drojdii alcoolorezistente, acumulandu-se 18-20° alcool (1 grad alcoolic = 1cm3. alcool absolut/100 cm3 mediu fermentat) [22].

La cresterea concentratiei in alcool se poate produce o solubilizare a lipidelor situate la nivelul membranei plasmatice, creste permeabilitatea la ioni si metaboliti cu molecule mici si este inhibat transportul (absorbtia) glucidelor. Alcoolul poate actiona ca un denaturant al proteinelor si ca agent de inactivare a enzimelor.

Sensibilitatea drojdiilor la efectul de inhibare dat de alcool creste cu marirea temperaturii.

Drojdiile din genul Saccharomyces (Saccharomycces cerevisiae) prezinta o toleranta la acool determinata genetic.

PH-ul are un rol important in formarea compusilor de fermentare, in functie de pH cunoscandu-se doua forme ale fermentarii: fermentarea alcoolica propriu-zisa, ce se desfasoara la pH 3,5-5 cand produsul principal este alcool etilic si dioxidul de carbon, cu produsi secundari in cantitati mici, echilibrate si fermentarea la pH alcalin, când in afara de alcool etilic si dioxid de carbon se formează in cantitate mai mare glicerol (pâna la 30% din zahărul fermentat).

Mustul de struguri are un pH acid (3,6) de aceea la fabricarea vinurilor drojdiile sunt avantajate si au cele mai bune conditii de dezvoltare si activitate metabolică.

Substantele chimice existente sau adaugate mediului pot influenta procesul fermentativ.

Fosfatii au o influență pozitivă deoarece participă la formarea acizilor adenilici, contribuie la formarea esterilor fosforici ai glucidelor, forme in care acestea sunt transportate in celula si fermentate.

Dioxidul de sulf se adaugă in cantitati de 200-500 mg.dm-3 pentru a permit activitatea drojdiilor fermentative care, spre deosebire de alte drojdii, sunt sulfitorezistente. In concentratii admise de tehnologie, SO2 influenteaza viteza de fermentare, favorizand activitatea drojdiilor tipice. Daca doza de SO2 introdusa este accidental mai mare, fermentarea alcoolica este deviata de la forma de baza deoarece dioxidul de sulf se combina cu aldehida acetica, ceea ce conduce la formarea in exces a glicerolului, a acidului acetic si a unor cantitati mai mici de alcool etilic [21].

Temperatura

Enzimele componente ale sistemul zimazic prezinta fiecare un optim de activitate, iar proprietatile sunt determinate genetic de caracterele de specie. Fermentarea alcoolica poate avea loc intre 0-35°C. In functie de specia de drojdie predominantă sau folosita in cultura pura temperaturile optime sunt la [22]:

28-30°C, pentru drojdia de spirt si de panificafie (Saccharomyces cerevisiae)

6-12°C, pentru drojdia de bere (Saccharomyces carlbergensis)

15-20°C, pentru drojdiile de vin (Saccharomyces cerevisiae varellipsoideus si Sacch), care produc o fermentare mai lenta la aceste temperaturi, dar conduc la obtinerea unui vin de calitate deoarece la temperaturi mai scazute se evita pierderile de substance volatile.

Fermentarea este o etapa obligatorie si in obtinerea bauturilor alcoolice distilate, la romani foarte cunoscute fiind tuica si palinca de prune (horinca, in Maramures), dar, intr-un mod asemanator, se obtin si rachiurile din drojdiile ramase de la limpezirea vinului, din mere, pere, corcoduse sau whiskey-ul anglo-saxon, ouzo-ul grecesc, sake-ul japonez etc.

I.7. Fermentația malolactică

Fermentația malolactică este cunoscută și sub numele de fermentație secundară, retrogradare malolactică sau proces de dezacidifiere biologică a vinului, constă în degradarea acidului malic din vin în acid lactic și CO2. conform reacției globale [23]:

COOH-H2OC-H2C-COOH CH3-CHOH-COOH + CO2

Din reacție reiese că prin decarboxilarea acidului malic, care este un acid dicarboxilic, și formarea acidului lactic, care este monocarboxilic. dispare una din funcțiile acide, se pierde deci jumătate din aciditatea imprimată de acidul malic. În aceste condiții aciditatea titrabilă, în ansamblul ei, poate să scadă cu 1 până la 2 și chiar 3 g/l, scăderea fiind cu atât mai mare cu cât vinul este mai bogat în acid malic.

Declanșarea și desăvârșirea procesului se datorează bacteriilor lactice. Acestea cu echipamentul lor enzimatic, sunt capabile să producă pe lângă alte transformări și degradarea acidului malic în acid lactic, o transformare utilă pentru îmbunătățirea calității vinului.

Oportunitatea fermentației malolactice trebuie apreciată diferențiat, în general, ea este considerată ca absolut necesară pentru vinurile roșii, mai ales pentru cele superioare, afirmându-se că tară fermentația malolactică nu se pot obține vinuri roșii de calitate. Câștigul de calitate care apare la aceste vinuri nu se datorează numai reducerii acidității, ci și prezenței acidului lactic. Acesta impresionează mai plăcut papilele gustative și se asamblează mai bine cu astringența dată de compușii fenolici decât acidul malic, care le imprimă o aciditate crudă, un gust acerb și o anumită nuanță de verdeață. La vinurile albe. mai ales la cele din podgoriile sudice, fermentația malolactică este mai puțin sau deloc utilă, deoarece vinurile își pierd din prospețimea și fructuozitatea lor. Din aceste motive ea trebuie evitată: dealtfel este și mai puțin frecventă, din cauza gradului de sulfitare mai ridicat decât în vinurile roșii. Fermentația malolactică se preferă în podgoriile nordice. în anii când strugurii au aciditate excesivă.

I.6.1. Mecanismul biochimic al fermentației malolactice

Literatura de specialitate menționează că fermentația malolactică s-ar desfășura după trei mecanisme, catalizate de trei complexe enzimatice și anume [24]:

– malico dehidrogenaza.

– enzima malică,

– enzima malolactică.

Indiferent de mecanismul biochimic prin care are loc malolactică. procesul este endegonic, cu absorbție de energie. Ca o consecință a acestui fapt, bacteriile nu-și pot procura energia din degradarea acidului malic, ci pe alte căi. dintre care mai cunoscute sunt degradarea glucidelor, a substanțelor azotate și a mezoinozitolului. Dealtfel fermentația malolactică. considerată ca proces principal, este însoțită întotdeauna și de alte procese, ca cele menționate mai sus. la care se mai adaugă și altele cum este. de exemplu. degradarea acidului citric.

Creșterea acidității volatile cu 0,1 – 0,2 g/l H2SO4 care are loc la fermentația malolactică și apariția unor alți componenți decât acidul lactic se datorează tocmai acestor transformări. Astfel, degradarea acidului citric de către bacteriile lactice conduce la formare de acid acetic, substanțe acetoinice și puțin acid lactic. Degradarea glucidelor de către bacteriile homolactice conduce la formare de acid lactic. în schimb, la fermentația heterolactică pe lângă acid lactic se mai formează și mici cantități de acid acetic, alcool etilic, glicerol etc. în anumite condiții, bacteriile lactice atacă și alte substanțe, ca. de exemplu, acidul tartric și glicerolul. modificând nefavorabil calitatea vinului.

I.6.2. Desfășurarea fermentației malolactice

Cercetările întreprinse, coroborate cu rezultatele obținute în practica vinicolă, reliefează că fermentația malolactică dă cele mai multe rezultate când are loc la sfârșitul sau la scurt timp de la desăvârșirea fermentației alcoolice. Dacă se petrece mai înainte, când mustuiala conține zahăr, ea poate fi dominată de fermentația heterolitică a glucidelor, care conduce la apariția bolii cunoscută sub numele de înăcrire lactică sau poate fi înlocuită de fermentația manitică [25].

Atunci când ea se desfășoară la mult timp după fermentația alcoolică, toamna târziu sau în al doilea an, nu numai că se întârzie cu desăvârșirea vinului din punct de vedere biologic, dar lasă loc apariției unei perioade critice favorabilă altor fermentații (degradarea acidului tartric și degradarea glicerolului) care înrăutățesc calitatea vinului. Pentru evitarea lor se recomandă ca perioada critică să fie cât mai scurtă.

Pentru declanșarea și desfășurarea fermentației malolactice bacteriile reclamă anumite condiții. Dintre acestea, o mare importanță prezintă: pH-ul vinului, gradul lui de sulfitare. temperatura și aerația. Când pH-ul vinului este cuprins între 3.2 și 3.8 fermentația malolactică se produce fără nici o intervenție, la valori de pH mai mici de 3.2 este incertă și nu se produce.

Cu alte cuvinte, ea se realizează dificil tocmai acolo unde este nevoie. Pentru a favoriza totuși declanșarea ei se recomandă dezacidifierea ușoară și prealabilă a vinului pe cale chimică. De asemenea, gradul de sulfitare a mustuielii trebuie să fie astfel ales (maximum 5 g/hl SO2) încât să nu împiedice declanșarea procesului, știind faptul că bacteriile lactice pot fi inhibate nu numai de SO2 liber, ci și de SO2 combinat.

Temperatura cea mai convenabilă este de 20 – 25°C; peste 25°C este posibil să apară fermentația manitică. iar sub 15°C fermentația malolactică este lentă. Aerarea ușoară a vinului cu ocazia tragerii lui de pe drojdie favorizează, de asemenea, declanșarea și desăvârșirea fermentației malolactice [26].

Ca și fermentația alcoolică a mustului, fermentația malolactică poate fi nu numai spontană, ci și provocată. în acest sens s-a dovedit că un adaos de vin în plină fermentație malolactică sau un adaos de drojdie, separată de la un vin imediat după terminarea procesului, pot contribui la stimularea, reglementarea și desăvârșirea ei în termen util. provocarea fermentației malolactice cu ajutorul bacteriilor lactice selecționate se pare că este cel mai de perspectivă, cu toate că nu este încă bine pus la punct.

CAPITOUL II.

TEHNOLOGIA FERMENTĂRII MUSTULUI ȘI PROCEDEE DE REALIZARE

Marele savant L. Pasteur aprecia vinul ca fiind bautura “cea mai igienica si sanatoasa” dintre toate.

Stiinta care se ocupa cu studiul metodelor si procedeelor de producere, stabilizare si maturizare a vinurilor si acelorlalte produse obtinute pe baza de must si vin, in scopul realizarii unor produse finite care sa corespunda exigentelor sporite ale consumatorilor este oenologia. Denumirea de oenologie vine de la cuvintele grecesti oenos, care inseamna vin si logos-vorbire. In sens mai larg, oenologia este stiinta vinului; fiind o stiinta cu un pronuntat caracter practic, ea este cunoscuta si sub denumirea de tehnologia vinului.

Principalele operații tehnologice la vinificarea strugurilor roșii sunt [25]:

1. Recoltarea strugurilor

2. Transportul strugurilor la cramă

3. Recepția calitativă și cantitativă

4. Desciorchinarea – zdrobirea strugurilor

5. Macerarea fermentarea mustuielii

6. Scurgerea și presarea mustuielii fermentate

7. Desăvârșirea fermentației alcoolice

8. Îngrijirea vinului

9. Condiționarea vinului

10. Stabilizarea vinurilor

11. Stocarea și maturarea vinurilor

12. Îmbutelierea vinurilor

Vinificatia in rosu se deosebeste de vinificatia in alb prin faptul ca presarea mustuielii se face numai dupa ce aceasta sufera, impreuna cu mustul, o perioada de maceratie si fermentare (in cazul vinificarii in alb, presarea se face cat mai repede posibil dupa obtinerea mustuielii). In acest fel, mustul ramane in contact cu partile solide ale mustuielii si anume pielitele si semintele, in cazul cand strugurii se dezbrobonesc.

Operatia de dezbrobonire trebuie considerata ca obligatorie datorita influentei sale asupra imbunatatirii calitatii vinului. Prin contactul prelungit intre must si partile solide, cu un continut bogat in materii colorante, aromate, tanin, materii minerale si azotoase, acestea se dizolva in must si vor fi regasite apoi in vinul obtinut.

Materiile colorante, in special insolubile in mustul rezultat din struguri cu zeama necolorata, devin solubile odata cu zdrobirea strugurilor si inceperea procesului de fermentare, respectiv aparitia alcoolului rezultat din fermentare si cu cresterea temperaturii. Pe aceasta insusire a pigmentilor antocianici de a se dizolva in alcool si la cald se bazeaza, de fapt, prepararea vinurilor rosii. In timpul acestei perioade de contact intre must si partile solide din mustuiala, se produce simultan atat fermentarea alcoolica cat si o maceratie a materiilor solide in mustul de fermentare.

Odata cu materiile colorante trec in must si o parte din materiile aromate si substantele taninoase, ceea ce determina un continut mai mare in tannin si arome ale vinurilor rosii. Intensitatea culorii, ca si continutul in materii aromate si tanin, sunt dependente de durata macerarii, temperatura si continutul in alcool al mustului in fermentare. Niciodata disolutia materiilor colorante nu este totala, putandu-se ajunge in cazurile optime pana la 80% din cantitatea de materii colorante continute in pielite.

La inceputul maceratiei se produce o crestere rapida a extractiei substantelor colorante, deci si a culorii, pana se ajunge la un maxim in jurul celei de a sasea zi, in cazul vinificatiei clasice, dupa care intensitatea culorii incepe sa scada.

Vinificatia in rosu cuprinde fermentatia alcoolica, maceratia, fermentatia malolactica-toate desfasurandu-se in mai multe etape si anume [26]:

culesul strugurilor si tranportul lor;

prelucrarea mecanica a strugurilor (zdrobire, dezbrobonire);

fermentatia alcoolica si maceratia mustului impreuna cu partile solide (pielite, seminte);

extragerea vinului sau mustului partial fermentat (extragere, presare);

terminarea fermentatiei alcoolice a mustului incomplet fermentat;

desavarsirea fermentatiei malolactice.

în procesul de obținere a vinului, fermentația alcoolică reprezintă o verigă decisivă, întrucât este faza în care acesta se „naște” vinul. De modul cum este realizată acesat faza, depinde, în mare măsură, nivelul calitativ al vinului și evoluția lui ulterioară.

Pentru ca fermentația să se declanșeze și să decurgă cât mai bine este necesar ca, în primul rând, să se asigure levurilor un mediu optim de dezvoltare. Acestea, ca orice ființe vii. au nevoie de substanțe nutritive și anumite condiții de mediu. Substanțele nutritive sunt. de obicei, asigurate de către must, ca atare, fără a mai fi necesar vreun adaos suplimentar. în unele țări se administrează, câteodată, fosfat de amoniu, în cantitate de 5-10g/hl. Eficace s-a dovedit și introducerea unor vitamine, ca tiamina și acidul pantotenic, fiecare în doză de 0,5g/hl; ambele constituie pentru levuri factori de creștere. Dintre condițiile de mediu se amintesc, în principal, aerația și temperatura, care se pot regla prin adoptarea unor soluții tehnice corespunzătoare.

Umplerea vaselor de fermentație nu se face complet. La fiecare din ele se lasă așa numitul „gol de fermentare”, ce reprezintă 15% din capacitate. Când musturile au fost deburbate, acesta poate fi redus până la 10%. iar dacă se prevede o fermentație mai turbulentă se mărește până la 25%, evitându-se astfel pericolul debordării.

Aerația inițială a mustului, atât cât este nevoie pentru dezvoltarea levurilor, se realizează în procesul de prelucrare a strugurilor. Ulterior, când devine dăunătoare, este împiedicată prin echiparea vaselor cu pâlnii de fermentare sau cu diferite dispozitive care permit în același timp evacuarea CO2, sau chiar captarea, dirijarea și eventual colectarea acestuia. În plus, aceste echipamente favorizează existența unei atmosfere de CO2 în „golul de fermentare”, care, la rândul ei, determină formarea unor cantități mici de acetaldehidă și oxidarea mai moderată a H2SO3 din masa lichidului.

Există mai multe variante tehnologice de fermentare ce se practică în industria vinicolă: după fermentația mustului ea poate fi spontană, provocată, nedirijată sau dirijată.

II.1. Fermentația spontană

Ori de câte ori sunt întâlnite condițiile necesare, această fermentație se produce de la sine. fără vreo intervenție exterioară aparentă. Transformarea glucidelor în alcool și CO2 se face sub influența levurilor provenite de pe struguri. Din cele 11 genuri de levuri ce pot ajunge în mod natural în must numai genurile Kloeckera și Saccharomyces sunt utile fermentației spontane. Rareori și tot ca levuri utile, mai participă și genurile Torulopsis și Schizosaccharomyces. Restul genurilor cuprind levuri care prin transformările pe care le produc prin mirosurile și gusturile neplăcute ce le pot comunica sunt dăunătoare calității vinului și ca atare sunt socotite levuri patogene.

Din punct de vedere numeric, dintre speciile prezente în mod natural în must. mai abundente sunt Kloeckera apiculata și Saccharomyces ellipsoideus, care la un loc reprezintă 90% din totalul levurilor. În ordinea frecvenței se succed apoi S. oviformis. S. chevalieri (struguri negri), S. florentinus (struguri stafidiți), Torulopsis bacillaris (struguri mucegăiți), după care urmează S. bailii, S. bazanus, Schizosaccharomyces pombe, Brettanomyces intermedius, etc.

Inițial, fermentația spontană este declanșată de levurile apiculate, care degradează glucidele până ce concentrația mediului în alcool atinge 3-4 vol.%. în această perioadă ele reprezintă 70 – 80% din totalul levurilor. Apoi. numărul lor scade, pentru ca spre mijlocul fermentației să rămână într-o proporție de 15 – 20%. În locul lor devin predominante levurile eliptice, care. atunci când mustul este în plină fermentație, reprezintă 90%, însă atunci când concentrația mediului în alcool atinge 10 vol.% ele cedează locul levurilor oviforme care câștigă competiția datorită marii lor rezistențe la alcool.

Apreciate deci după gradul de participare și modul cum se succed, levurile responsabile de fermentația spontană se pot grupa în trei categorii [26]:

Levuri care declanșează fermentația (Kloeckera apiculata)

Levuri răspunzătoare de cea mai mare parte a procesului {Saccharomyces
ellipsoideus)

Levuri complementare sau de finisare (Saccharomyces oviformis) Abaterile de calitate, ce pot apărea uneori, datorate levurilor patogene, au făcut ca fermentația spontană să fie considerată ca sigur avantajoasă numai la recoltele sănătoase și mai puțin sau deloc în cazul strugurilor avariați. Dintre avantajele acestei fermentații se subliniază faptul că vinurile particularizează într-un grad înalt specificitatea soiului și podgoriei din care provin.

II.2. Fermentația provocată

Această fermentație se face sub influența omului, care intervine cu un adaos de levuri. La o astfel de fermentație, succesiunea levurilor nu mai are loc. Levurile adăugate fiind într-un număr mare modifică fenomenele de competiție în avantajul lor: pun stăpânire pe mediu și devin de la început până la sfârșit principalii realizatori ai fermentației alcoolice.

Adaosul de levuri s-a dovedit necesar în următoarele cazuri: la recoltele insuficient de bogate în microfloră naturală, spălate de ploi etc.: la cele unde echilibrul levurian natural este modificat, datorită substanțelor folosite în tratamentele de combatere a bolilor și dăunătorilor; în toamnele reci, când levurile sunt mai puțin active și, în mod deosebit, când se dorește ca fermentația să fie „pură”, adică realizată numai cu ajutorul unei anumite levuri.

Indiferent de scopul urmărit, adaosul de levuri se face sub formă de maia și mai rar în stare uscată sub formă granulată.

Maiaua în vinificație reprezintă o cultură de levuri în plină activitate, care. administrată în must sau mustuială. este capabilă, ca în condiții determinate, să producă un proces de fermentație alcoolică. în funcție de proveniența și natura levurilor care intră în compunerea ei, maiaua poate fi preparată din levuri indigene sau din levuri selecționate. Pentru a ușura lucrările legate de prepararea unor cantități mari de maia, în condiții igienico-sanitare cât mai bune, s-au proiectat și realizat mai multe tipuri de instalații. Acestea, când sunt echipate în mod corespunzător, pe lângă o bună sterilizare a mustului, dau posibilitatea de a se asigura controlul și reglarea temperaturii și aerației, precum și obținerea maielii în flux continuu [27].

Maiaua de levuri indigene se prepară pornind de la un must obținut din struguri sănătoși, curați, suficienți de copți și bine rumeniți, în care se administrează SO2 în cantitate de circa 10g/hl, doză convenabilă pentru a împiedica dezvoltarea bacteriilor, a levuri lor apiculate și a celor patogene, tara a împiedica pe cele eliptice. Uneori, în loc de maia de levuri indigene se adaugă câțiva litri dintr-un must care a început să fermenteze. Efectele sunt aproximativ aceleași. Ambele procedee pot fi însă folosite numai în cazul recoltelor sănătoase, nu și la cele avariate.

Maiaua de levuri selecționate se prepară conform instrucțiunilor care le însoțesc. Prin levuri selecționate se înțeleg levurile provenite din alegerea și înmulțirea uneia sau a mai multor clone, la care se cunosc și au fost apreciate ca pozitive principalele lor caracteristici.

Clona reprezintă totalitatea indivizilor rezultați dintr-o celulă, prin înmulțire vegetativă, care au aceleași însușiri genetice ca și celula-mamă. Selecționarea levurilor este o lucrare foarte dificilă și de mare răspundere. Ea necesită un studiu detaliat al unui număr mare de sușe de levuri, pentru a vedea care din ele se comportă mai bine în ceea ce privește randamentul în alcool, puterea alcooligenă, rezistența la temperaturi ridicate sau scăzute, formarea unor cantități mari de glicerol sau scăzute de acid acetic și acetat de etil, puterea de a fermenta acidul malic. producerea unei arome speciale, etc.

Sușa reprezintă o probă de levuri prelevată dintr-o podgorie determinată sau de la un anumit soi de viță dintr-o podgorie dată. Ea poate conține varietăți sau forme aparținând la o singură specie, la mai multe din același gen, sau la specii din genuri diferite. Pentru obținerea levurilor selecționate se pornește, de regulă, de la o singură celulă, prelevată din sușa de proveniență cunoscută. Indivizii rezultați din ea prin înmulțirea vegetativă formează o clonă. Pornind de la clonele alese se fac apoi culturi pure, care se înmulțesc și se livrează unităților de vinificație sub denumirea de levuri selecționate.

Alături de levurile păstrate pe diferite medii de cultură, industria vinicolă a început să folosească și levuri care sunt în stare liofilizată sau sub formă granulată.

Levurile liofilizate au un termen mai îndelungat de păstrare. Se obțin din culturi tinere, efectuate în medii solide sau lichide, prin uscare și congelare la vid. Procedeul este cunoscut sub numele de liofilizare. Pentru o bună conservare a viabilității celulelor, liofilizarea se face într-un mediu de protecție coloidal, constituit dintr-un amestec de gelatină și glucoza, din lapte sau gumă arabică [28].

Levurile granulate se obțin prin separarea celulelor cultivate într-un mediu lichid și uscarea acestora la temperaturi moderate, pentru a nu fi afectată viabilitatea lor. Celulele separate sub formă de pastă de levuri se granulează în timpul uscării. Granulele astfel obținute se păstrează în flacoane închise și la loc uscat. Avantajul levurilor granulate constă în faptul că ele pot fi utilizate direct, fără a mai fi nevoie să fie înmulțite în prealabil sub formă de maia. Doza recomandată variază între 5 și 20g/hl. Introduse în must ele se hidratează, devin metabolic active, înmuguresc și amorsează procesul de fermentație.

Indiferent de forma sub care se livrează, majoritatea levurilor selecționate aparțin speciei Saccharomyces ellipsoideus, în mai mică măsură S.oviformis și foarte puțin speciei Schizosaccharomyces pombe. Opțiunea încă de la început pentru levurile eliptice a fost și este justificată de faptul că acestea sunt mult mai avantajoase decât levurile sălbatice.

Levurile sălbatice sunt acele levuri, deosebite de cele eliptice și oviforme, prezente în mod natural în must și care dau rezultate mai puțin satisfăcătoare la fermentația alcoolică. Majoritatea levurilor sălbatice aparțin speciei Kloeckera apiculata, care în raport cu Saccharomyces ellipsoideus formează mai multă aciditate volatilă și dă un randament mai scăzut în alcool.

Unele forme din cadrul lui Saccharomyces ellipsoideus, așa-zisele levuri calde, sunt adaptate pentru a efectua procesul fermentației alcoolice la temperaturi ceva mai ridicate, tară a expune vinul la îmbolnăviri. Pe lângă acestea, există și altele capabile de a fermenta mustul la temperaturi scăzute, 7-12°C. Acestea, numite în mod convențional levuri reci, criolevuri sau levuri criofile s-au dovedit foarte bune în tehnologia obținerii vinurilor spumante. în prezent este unanim recunoscut că folosirea levurilor de Saccharomyces ellipsoideus. în ansamblul lor, trebuie să fie considerată ca o măsură oenologică indispensabilă la vinificarea recoltelor avariate, a celor provenite din podgorii recent înființate, precum și la cele rezultate din plantații ce au primit numeroase tratamente cu fungicide și insecticide. Folosirea lor s-a dovedit a fi utilă atât în tehnologia preparării vinurilor de consum curent, cât și a celor superioare.

Pentru obținerea de vinuri seci din musturi bogate în zahăr se preferă levuri selecționate din specia Saccharomyces oviformis. Prin realizarea unor vinuri de tip oxidativ (Xeres-Spania, Jura-Franța) sunt indicate levurile de tip pelicular, adică cele capabile să dezvolte la suprafața vinului un voal. o peliculă, sub influența căreia parte din alcoolul etilic este oxidat în aldehidă acetică, care imprimă vinului miros și gust caracteristice.

Levurile selecționate din specia Saccharomyces pombe, care sunt capabile să producă, pe lângă fermentația alcoolică a glucidelor și o fermentație maloalcoolică.

De asemenea, prezintă interes și așa-zisele levuri nespumante selecționate, în principal din Saccharomyces ellipsoideus. Acestea, producând puțină spumă, permit reducerea golului de fermentare și micșorează pericolul debordării.

II.3. Fermentația nedirijată

Aceasta are loc tară nici un fel de intervenții. Depinde mult de hazard, fapt pentru care calitatea viitorului vin, în cele mai numeroase cazuri, nu este garantată. Vinurile rezultate pot fi întâmplător bune. De cele mai multe ori însă se abat de la normal. Procedeul a rămas de domeniul trecutului.

Se întâlnește sporadic în vinificația casnică, dar nici aici în sensul absolut al cuvântului. Fermentația se face în butoaie de lemn. a căror capacitate rar depășește 1000 l. în astfel de vase, la care suprafața de răcire este mare în raport cu volumul lor, nu există pericolul ca temperatura să crească așa mult încât activitatea levurilor să fie paralizată, iar în locul fermentației alcoolice să apară alte fermentații. Lipsa pâlniilor de fermentare mărește, în schimb, riscul contaminărilor microbiene.

II.4. Fermentația dirijată

Aceasta are loc, după cum arată și numele, sub supravegherea oenologului, care, urmărindu-i desfășurarea, poate lua măsuri de dirijare a ei. Din mustul rezultat după această tehnică trebuie să rezulte întotdeauna un vin bun.

II.5. Supravegherea și conducerea fermentației

Constă în supravegherea permanentă sau periodică a procesului și în determinarea unor parametrii, pentru a cunoaște modul cum decurge. În acest scop, o mare importanță prezintă controlul microscopic al mustului și în mod deosebit cunoașterea variației unor indici fizico-chimici, cum ar fi: densitatea, concentrația în zahăr și temperatura lichidului.

Controlul microscopic

Furnizează date cu privire la natura, numărul și starea levurilor sub influența cărora se desfășoară fermentarea, gradul de infestare a mustului cu diferite bacterii și levuri patogene, precum și asupra necesității unui adaos suplimentar de maia.

Determinările privind densitatea, concentrația în zahăr și temperatura

Se fac de două ori pe zi, dimineața și seara, iar cu valorile găsite se întocmește graficul de fermentare. Variația densității și a concentrației în zahăr permite să se aprecieze ritmul, regularitatea și sfârșitul fermentației. Nivelul și evoluția temperaturii constituie criterii pe baza cărora se estimează intensitatea fermentației, forța cu care se desfășoară și momentul când trebuie să se intervină cu măsuri care să-i asigure o desfășurare optimă [28].

Nivelul temperaturii este determinat de: cantitatea de căldură acumulată în struguri-must în momentul recoltării și prelucrării; nivelul de temperatură din sala de prelucrare-fermentare: căldura degajată în procesul fermentației alcoolice și pierderea acesteia în mediul ambiant.

În timpul fermentației temperatura mustului crește, ca urmare a degajării căldurii ce rezultă de la transformarea glucidelor în alcool și CO2. S-a stabilit că la fermentarea unui litru de must ce conține 180 g/l zaharuri se degajă doar 23,5 Kcal, diferența de 9,5 Kcal reprezintă energia absorbită de către levuri pentru necesitățile lor vitale, plus pierderile de energie sub diferite alte forme.

întrucât procesul de fermentație nu are loc instantaneu, ci se desfășoară într-un anumit interval de timp, înseamnă că între must, care este cald și mediul ambiant apare un transfer de căldură. Acest transfer capătă o valoare cu atât mai importantă cu cât materialul din care s-a construit vasul are o conductibilitate termică mai mare și cu cât vasul este mai mic. De exemplu, la fermentarea în butoaie de lemn de 500 – 1000 de litri creșterea temperaturii este apreciată la jumătate (12 °C), în loc de 23,5 °C, în timp ce la cisternele din beton de mare capacitate creșterea poate fi, mai ales în podgoriile sudice, de 17 – 18°C. în această situație activitatea levurilor este mult încetinită, iar alături de fermentația alcoolică se pot dezvolta alte fermentații, cum este cea manitică.

In podgoriile nordice, din contră, se pot întâlnii situații când temperatura inițială a mustului este la un nivel mai scăzut decât cel necesar declanșării fermentației. Existența acestor deosebiri de temperatură, legate de situația geografică a podgoriei sau de alte împrejurări stau la baza celor două procese antagoniste – încălzirea sau răcirea – cu ajutorul cărora temperaturile inițiale sau din timpul fermentării se pot deplasa din limitele periculoase spre cele optime.

Activizarea fermentației alcoolice

Există situații când fermentația începe prea târziu, se desfășoară prea încet, sau se oprește înainte de atingerea gradului alcoolic dorit. Astfel de cazuri se întâlnesc la unele musturi limpezite prea puternic, suprasulfilate, cu un conținut ridicat în zahăr, insuficient de bogate în oxigen și elemente nutritive pentru levuri, precum și la cele a căror temperatură este prea scăzută sau prea ridicată.

Procedeele de activizare sunt numeroase și se aplică diversificat. Dintre cele mai utilizate se amintesc:

adăugarea suplimentară de maia;

introducere de must în fermentare sau chiar drojdie proaspătă;

agitarea și amestecarea drojdiei cu mustul din care s-a sedimentat;

administrarea de fosfat de amoniu atunci când conținutul mustului în azot amoniacal este sub 25 mg/l;

adăugarea a câte 0,5 g/hl de tiamină și acid pantotenic, care au rol de factori de creștere pentru levuri;

aerisirea, când condițiile de anaerobioză au fost prea stricte;

încălzirea sau răcirea mustului în funcție de condițiile concrete pe care le reclamă situația.

Frânarea fermentației alcoolice

Când musturile sunt calde, slab acide, sau cu un conținut scăzut în zahăr, fermentația alcoolică este uneori prea turbulentă. în acest caz înregistrându-se pierderi de aromă și alcool (până la 0,5 vol.%), iar fermentația este susceptibilă de a se opri înainte ca tot zahărul să fie degradat.

Măsurile de frânare în vederea normalizării sunt numeroase. Unele dintre ele trebuie luate înainte de declanșarea procesului întrucât este preferabil să previi decât a frâna o fermentație prea turbulentă.

Dintre acestea se menționează:

-obținerea unui must ceva mai sărac în oxigen, fapt realizabil printr-o prelucrare cât mai rapidă a strugurilor, dublată de o sulfitare corespunzătoare;

-deburbarea mustului, care întârzie pornirea cu 3-4 zile și prelungește durata cu încă 2-3 zile; adaosul de SO2 întârzie pornirea și mai puțin ritmul de desfășurare, iar administrarea de acid sorbic nu conduce la rezultate spectaculoase.

-răcirea mustului în faza fermentării tumultuoase și menținerea temperaturii sub 20°C normalizează cel mai bine procesul, atât ca durată, cât și ca intensitate.

Întreruperea fermentației alcoolice

în tehnologia obținerii vinurilor seci problema principală este ca procesul de fermentație să se continue până la transformarea completă a zahărului, admițându-se maximum 4 g/l. La prepararea vinurilor cu rest de zahăr este necesar ca fermentația să fie întreruptă înainte ca acesta să fie în totalitate transformat. Când musturile sunt foarte bogate în zahăr, ca cele rezultate din strugurii stafidiți sau botritizați. fermentarea se poate opri în mod natural, datorită gradului alcoolic ridicat care oprește activitatea levurilor.

La musturile cu o concentrație mai redusă în zahăr, dar nu mai mică de 200 g/l, socotită ca minimă pentru obținerea unui vin cu rest de zahăr, sistarea fermentației prin diferite mijloace devine obligatorie. Momentul este astfel ales încât pericolul unei fermentații ulterioare să fie cât mai redus, iar alcoolul și zahărul să se găsească într-un raport adecvat tipului de vin.

II.6. Macerația în tehnologia obținerii vinurilor roșii și aromate

La vinurile roșii, în afară de limpiditate, miros și gust, un rol important în aprecierea lor calitativă îl joacă culoarea, iar la cele aromate aroma. Pentru reali/arca acestor însușiri hotărâtoare în definirea unor astfel de vinuri, alături de celelalte operațiuni tehnologice comune tuturor vinurilor (zdrobire, desciorchinare, etc.), mai intervine și una specifică, macerația. Datorită acestui fapt, asemenea vinuri, îndeosebi cele roșii, sunt considerate pe drept cuvânt vinuri de macerație.

Macerația este o operațiune tehnologică prin care boștina este menținută un timp oarecare în contact cu mustul, în vederea extracției anumitor componente din părțile solide ale strugurelui.

Dintre constituenții extrași prin macerație, un interes deosebit pentru practica vinicolă prezintă substanțele odorante și compușii fenolici, mai ales cei colorați. Extracția substanțelor odorante, absolut indispensabilă la prepararea vinurilor aromate, fiind rapidă, poate fi asigurată printr-o macerație de scurtă durată. 24-36 ore. Extracția compușilor fenolici este mai complexă și de durată. într-o primă etapă, sub influența acidității, temperaturii, SO2 și eventual a alcoolului format are loc mortificarea celulelor bobului și o deteriorare a membranei cromoplastelor existente în vacuolele celulelor pieliței. Drept urmare, substanțele colorante din cromoplaste se dizolvă în must. în cea de-a doua etapă, datorită mișcărilor interne, dictate de diferențele de temperatură și degajarea CO2 din masa de mustuială, are loc difuzia substanțelor colorante în întreaga cantitate de must.

Difuzia poate fi mult accelerată prin măsuri (amestecarea și cufundarea boștinei, recircularea mustului) care permit îndepărtarea straturilor de lichid din imediata apropiere a fazei solide și înlocuirea lor cu altele mai puțin bogate in substanțe colorante.

În final, datorită proceselor de dizolvare și difuzie a antocianilor, intensitatea colorantă a lichidului crește progresiv, până ce atinge un maximum. Ulterior are loc însă o scădere a intensității, datorită adsorbției substanțelor colorante de către părțile solide (pielițe, ciorchini, semințe, levuri), precum și transformării ireversibile a unor antociani în forme incolore sau chiar distrugerii lor parțiale.

Din cele patru procese, de natură predominant fizico-chimică. care de fapt constituie tot atâtea etape ale macerației. numai primele două (extracția și difuzia) măresc concentrația vinului în substanțe colorante, pe când celelalte două (adsorbția și modificarea sau chiar distrugerea antocianilor) o diminuează.

Pentru macerarea boștinei există o mare diversitate de procedee. Clasificarea lor se face după mai multe criterii, dar, în raport de fermentație, acceptat ca un criteriu suficient de general, ele se clasifică în:

– procedee tehnologice, unde macerația se desfășoară simultan cu fermentația – operațiune tehnologică cunoscută sub numele de macerare – fermentare. numită frecvent și fermentare pe boștină.

– procedee unde macerația precede fermentația – din această categorie se cunosc macerația carbonică și macerația la cald.

II.6.1. Tehnologia de macerare – fermentare

Macerarea – fermentarea este o operațiune tehnologică specifică preparării vinurilor roșii. Faptul că ambele procese au loc în același timp înseamnă că ele se influențează reciproc. De exemplu, datorită creșterii temperaturii și formării alcoolului procesul de macerație este mai rapid și mai complet decât dacă boștina ar sta în contact cu un must care nu fermentează; mai mult. la temperatura de 28 -30°C extracția compușilor fenolici decurge mai bine decât la 20°C, considerată ca optimă la fermentarea vinurilor albe. în schimb, fermentarea la temperaturi mai ridicate de 30°C conduce la creșterea conținutului în taninuri. tară ca intensitatea colorantă să se mărească. Influența alcoolului devine cu atât mai importantă cu cât acesta se găsește într-o concentrație mai ridicată.

Influența SO2 este în funcție de gradul de sulfitare. La doze foarte ridicate de SO2 fermentația nu are loc, în schimb macerația este așa de puternică încât poate fi luată în considerare ca metodă (sulfitică) de extracție a colorantului roșu din strugurii negri. în doze obișnuite (5-15 g/hl). eficacitatea SO2 asupra extracției colorantului este puțin semnificativă. O ameliorare a culorii se observă la vinurile provenite din recolte putrezite, unde pe lângă acțiunea dizolvantă trebuie luat în considerare și efectul antienzimatic al SO2. inactivând lacaza, enzima care distruge pigmenții antocianici, SO2 protejează astfel culoarea vinurilor roșii.

In timpul macerației, pe lângă substanțele odorante și colorante, boștina mai cedează și altele, ca, de exemplu, substanțe tanante, azotate, pectice, minerale, etc. precum și unele care imprimă vinului un gust neplăcut, erbaceu, amar. O extracție suficient de selectivă pentru nevoile practicii este totuși oricând posibilă, deoarece la macerare substanțele utile pentru calitatea vinului sunt cedate mai ușor și mai repede decât cele a căror prezență în vin este mai puțin dorită.

De aici reiese că pe lângă temperatură, alcool și SO2, procesul de extracție care are loc la macerare – fermentare este influențat în mod esențial și de durata de contact a mustului cu boștina. Mărimea acestei durate, la rândul ei este influențată de numeroși factori dintre care se amintesc: tipul de vin proiectat a se realiza, soiul sau sortimentul de soiuri, gradul de maturitate a strugurilor și starea lor de sănătate, mărimea recoltei etc. Astfel, în măsura în care se preferă vinuri tinere, suple, cu multă prospețime, fructuozitate și aromă, durata macerației va fi redusă până la limita care asigură o bună colorație.

Pentru vinurile a căror calitate devine mai bună, prin păstrarea lor timp de 1-2 ani la butoi și apoi la sticle, durata de macerație va fi mai lungă. Procedând așa. pe lângă antociani se extrage și o cantitate importantă de taninuri, cu rol important asupra gustului. în conservarea vinului și în privința culorii, mai ales la vinurile vechi, unde conținutul în antociani rămâne foarte redus.

Reglarea duratei de macerare – fermentare trebuie făcută și în funcție de soi. Pentru cele care produc struguri cu gust comun, bogați în tanin. proveniți din plantații situate pe soluri bogate, vor fi preferate macerații scurte. Din contra, pentru soiurile valoroase, bogate în substanțe cu gust bun, sărace în componente ce prejudiciază calitatea și a căror vinuri se ameliorează prin învechire sunt necesare macerații lungi. La stabilirea duratei optime de macerare mai trebuie să se țină seama și de faptul că în cadrul aceluiași soi, conținutul în substanțe utile este mai mare la strugurii bine copți și sănătoși decât la cei care nu au ajuns la maturitate și sunt avariați.

Pentru stabilirea nivelului optim de umplere a vaselor cu mustuială trebuie să se țină seama și de mărimea volumului acesteia în timpul fermentării. în general se apreciază că din 100 kg struguri nedesciorchinați rezultă, după zdrobire, circa 92 litri mustuială. care în timpul fermentării crește până la 116 litri. Când strugurii sunt desciorchinați. valorile sunt mai mici [29].

Datorită macerării, relația dintre densitatea mustului și concentrația în zahăr este ceva mai eronată decât la vinificația în alb. De asemenea, măsurarea temperaturii trebuie făcută cu mai mult discernământ deoarece este mult mai neuniformă comparativ cu cea dintr-un must ce fermentează separat de boștină.

Mai trebuie luat în considerare și faptul că la fermentare – macerare, datorită degajării gazului carbonic și presiunii pe care acesta o exercită, părțile solide din mustuială sunt antrenate în partea superioară a lichidului. Aici se unesc, se interpătrund și se încâlcesc unele cu altele așa de strâns. încât. în final, rezultă o masă de boștină tasată cunoscută sub numele de căciulă.

Variantele tehnologice de macerare – fermentare, desemnate în fermentația tradițională în mod simplu sub numele de procedee de fermentare pe boștină, sunt numeroase, iar clasificarea lor se face în raport de modul de desfășurare a operațiunii, respectiv cu sau tară întreruperi, când se disting [30]:

– procedee discontinue – încărcarea vaselor cu mustuială și evacuarea boștinei din vase se fac cu întreruperi:

-procedee continue – încărcarea vaselor cu mustuială și evacuarea boștinei din vase au loc neîntrerupt.

CAPITOLUL III

PARTE EXPERIMENTALĂ

DETERMINAREA ACTIVITĂȚII ALCOOL DEHIDROGENAZEI

ÎN FERMENTAȚIA VINULUI

Alcool dehidrogenaza (ADH) și glucooxidaza (GOX) sunt considerate ca enzime de referință in fermentația aloocolică, de activitatea lor depinzând în mare măsură procesul fermentativ și deci și calitatea produsului finit.

Alcool dehidrogenaza (EC1.1.1.1.) catalizează reacția reversibilă de oxidare a etanolului în acetaldehidă în prezența sistemului redox de coenzime NAD+/NADH + H+, după reacția:

R – CH2 – OH + NAD+ ↔ R – CH=O + NADH + H+

Enzima izolată din drojdii are o masă moleculară de 141 000, un pH izoelectric de 5,4 și este un tetramer. Pe fiecare subunitate prezintă grefat un atom de zinc și două grupări tiolice, esențiale pentru procesul catalitic [24, 25].

Figura III.1. Alcool dehidrogenaza [24]

III.1. Principiul metodei

Viteza de reacție a alcool dehidrogenazei este determinată prin urmărirea creșterii valorii de extincție a amestecului de reacție la 340 nm, determinat de reducerea corespunzătoare de NAD+.

O unitate enzimatică corespunde reducerii unui micromol de NAD+ pe minut la 25°C, în condițiile definite [13].

Reactivi chimici

Soluție tampon 50 mM pirofosfat de sodiu pH 8,8

Etanol 2M

Soluție apoasă NAD+ 15 mM

Soluție tampon fosfat de sodiu 10mM

Albumină serică bovină 500 mg in 500 NAD+

Alcool dehidrogenază ( 0,1mg/ml în soluție tampon 4) izolată din Asppergillus niger

Soluție tampon fosfat de sodiu + albumină serică (0,1%)

Mod de lucru

Se determină activitatea etalon a alcool dehidrogenazei izolată din Asppergillus niger pe o soluție etalon de alcool etilic.

In cuva spectrofotometrului se introduc reactivii chimici în cantitatile prevazute in tabelul III .1. In paralel cu proba de analizat se execută și o probă martor în care nu se introduce enzimă.

Tabelul III.1. Mod de lucru 1

Se determină densitatea optică a probei cu enzimă la 340 nm comparată cu un martor la timpul zero, în intervale de 10 secunde timp de 10 minute. Rezultatele experimentale sunt prezentate în figura III. 2.

Figura III.2 Activitatea etalon a ADH

Calculul rezultatelor

Se reprezintă variația de densitate optică la 340 nm în funcție de timp pe porțiunea liniară inițială a curbei.

Unde,

6,2 x 106 cm2/ml reprezintă coeficientul de extincție al NADH la 340 nm.

Activitatea specifică a enzimei este exprimată în unități/mg proteină și ia în considerare factorul de diluație aplicat.

III.2. Determinarea activității enzimatice a alcooldehidrogenazei din vin

Probele de must fermentat au fost realizate prin zdrobirea a 1kg de struguri printr-o presă de fructe și au fost incubate la 21 ± 2° C în două fermentatoare de laborator și monitorizate continuu pentru parametrii pH, temperatură și oxigen dizolvat timp de 10 zile.

Probele de must nu au fost sterilizate înainte de fermentare. Pentru determinarile experimentale au fost luate probe la punctul de plecare și în primele șase zile de fermentație.

S-a urmărit:

Influența concentrației de substrat asupra activității alcooldehidrogenazei

Activitatea enzimatică a alcooldehidrogenazei în timpul fermentației vinului

Pentru determinarea influentei concentratiei de etanol asupra activitatii alocool dehidrogenazei se foloseste modul de lucru prezentat in tabelul III.2

Tabelul III.2. Mod de lucru 2

*Soluții de etanol de concentratii 4%, 8%, 12%, 16%, respectiv 20 %

S-a măsurat extinctia la 340 nm la spectrofometru pentru cele cinci probe realizate cu solutii diferite de etanol, rezultatele experimentale fiind prezentate in figura III.3.

Figura III.3 Influența concetrației de etanol asupra activității alcool dehidrogenazei

S-a determinat activitatea alcool dehidrogenazei în timpul fermentației vinului la momentul de start și in zilele 1, 3 și 6 de fermentare după modul de lucru prezentat în tabelul III.3.

Tabelul III.3. Mod de lucru 3

*Must fermentat la momentul de start, prima zi de fermentare, a treia si respectiv în a șasea zi de fermentare

Rezultatele experimentale sunt prezentate în figurile III.4 și III.5

Figura III.4. Activitatea alcool dehidrogenazei în fermentarea vinului

Figura III.5. Activitatea alcool dehidrogenazei la fermentarea vinului

III.3. Rezultate experimentale

Alcool dehidrogenaza este o enzimă „cheie” în procesul de fermentație care influențează decisiv calitatea produsului finit. Activitatea ei depinde ce concentrația de etanol formată în timpul fermentației, astfel odată cu creșterea concentrației de etanol are loc și o intensificare a activității alcool dehidrogenazei până la un anumit nivel (concentrații de 16%), când se atimge maximul de reacție. Concentrații de etanol peste această valoare, nu mai modifică viteza reacției enzimatice a ADH, datorită saturației enzimei cu substrat.

Durata de fermentare a mustului influențează activitatea ADH, durata de fermentare a mustului determinând creșterea concentrației de etanol format în timpul reacției de fermentare, respectiv și intensificarea activității enzimatice a ADH.

CONCLUZII

Controlul tehnobiochimic al producției vinicole are la dispoziție în prezent metode de cercetare perfecționate, care permit, în majoritatea cazurilor, să se stabilească cu precizie compoziția chimică a materiei prime și a multiplelor produse de prelucrare a strugurilor, în diferite faze de producție. De asemenea, prin aceasta se creează posibilitatea soluționării problemelor teoretice și practice de îmbunătățire a schemelor tehnologice, de a ușura efortul pentru obținerea unor calități superioare de vin, de a perfecționa automatizarea în procesele de vinificație, în scopul măririi randamentelor.

în procesul de obținere a vinului, fermentația alcoolică reprezintă o etapă determinantă. De modul în care este condusă această fază depinde, în mare măsură, nivelul calitativ al vinului și evoluția lui ulterioară. Controlul strict asupra parametrilor fizico-chimici, precum și a agenților biologici, în vinificație, sunt factori determinanți pentru calitatea produsului finit, respectiv pentru obținerea vinurilor de înaltă clasă, cu costuri de producție cât mai reduse.

Obținerea unor biocatalizatori noi, cu proprietăți superioare, reprezintă o prioritate și un domeniu vast de cercetare, a cărui exploatare poate conduce la noi performanțe de randament și calitate în industria vinului.

Alcool dehidrogenaza este o enzimă „cheie” în procesul de fermentație care influențează decisiv calitatea produsului finit. Activitatea ei depinde ce concentrația de etanol formată în timpul fermentației, precum și de durata de fermentare a mustului.

BIBLIOGRAFIE

A.M.Frolov-Bagreev, G.G.Agabalianț (1955) Chimia vinului. Editura Tehnică București

Batmanglij, Najmieh (2006) From Persia to Napa: Wine at the Persian Table. Washington, DC: Mage Publishers.

Cachiță, Dorina; Constantin, Deliu; Lenuța, Rakosy-Tican; Aurel, Ardelean (2004) Tratat de biotehnologie vegetală, vol.I Editura “Dacia”, Cluj-Napoca

E. S. C. O'Connor-Cox, J. Paik and W. M. Ingledew (1991) – Improved ethanol yields through supplementation with excess assimilable nitrogen, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 8, No.1

B. Mergler, J. Messerschmidt and G. Tölg (1991) – A contribution to the ecology and enology of platinum Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, Volume 357

Foulkes, Christopher (2001) Larousse Encyclopedia of Wine. Larousse. ISBN 2-03-585013-4.

H Alexandre and C Charpentier (1998) Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology

H. Queiroz and A. Pareilleux (1990)– Growth kinetics of Schizosaccharomyces pombe under various culture conditions: influence of pH, malate, ethanol and oxygenation, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 33, Number 5 / August, 1990

Johnson, Hugh (2003) Hugh Johnson's Wine Companion, 5th edition, Mitchell Beazley.“The Encyclopaedia of Wines, Vineyards and Winemakers”

McCarthy, Ed; Mary Ewing-Mulligan, Piero Antinori (2006) Wine for Dummies. HarperCollins.

MacNeil, Karen (2001) The Wine Bible. Workman. ISBN 1-56305-434-5.

M. Patic (2006) Enciclopedia viei și vinului, ISBN: (10) 973-31-2296-3 / (13) 978-973-31-2296-8

Nicholson, Paul T; I. Shaw (2000) Ancient Egyptian materials and technology. Cambridge: Cambridge University Press. ISBN 0-521-45257-0.“Grapes and wine in ancient Egypt; includes critique of chemical evidence for wine residues.”

P. N. Pimenta-Braz, J. M. Ricardo-da-Silva and O. Laureano (1998) – Evaluation of pectolytic activities of enological interest in industrial enzyme preparations Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, Volume 206, Number 1 / January, 1998,

P. Ribéreau-Gayon (1986) – The scientific basis for the production of quality wines, Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), Volume 42, Number 8 / August, 1986

P. Sanchez-Torres, L. Gonzalez-Candelas and D. Ramon (1998) – „Construction of Aspergillus nidulans strains producing enzymes of potential use in enology”, Biotechnology Letters, Volume 20, Number 1 / January, 1998

Robinson, Jancis (2006) The Oxford Companion to Wine, 3rd edition, Oxford: OUP. ISBN 0-19-860990-6.

S. Lafon-Lafourcade, A. Lonvaud-Funel and E. Carre (1983) – Lactic acid bacteria of wines: stimulation of growth and malolactic fermentation, Antonie van Leeuwenhoek, Volume 49, Number 3 / May, 1983

Sumio Michnick and Jean-Michel Salmon (1994) – Glycerol production from sugars with phosphoglycerate mutasedeficient Saccharomyces cerevisiae partially resistant to glucose repression, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 13, Number 1 / January, 1994

Taber, George M. (2005) Judgment of Paris: California vs. France and the Historic 1976 Paris Tasting the Revolutionized Wine. NY: Scribner.

Zraly, Kevin (2006) Windows on the World Complete Wine Course. Sterling. ISBN 1-4027-3928-1.

Zohary, Daniel; Maria Hopf (2000) Domestication of plants in the Old World. Oxford: OUP. ISBN 0-19-850356-3.

Bodner, George M.: Metabolism Part I: Glycolysis for the Embden-Meyerhoff pathway, J. Chem. Educ., (1986), 63 (7), p 566

http://courses.cit.cornell.edu/biomi290/MOVIES/GLYCOLYSIS.HTML

http://books.google.com/books?id=gSFbGLVFwMEC&pg=PA301

Lehninger, A.(1987 si 1992): Biochimie, vol I-II Editura tehnică, Bucuresti

http://www.bevitech.ro/vinros.htm\

Skoog, et al. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole. 2007, 169-173.

L. Sooväli, E.-I. Rõõm, A. Kütt, I. Kaljurand, I. Leito(2006). Uncertainty sources in UV-VIS spectrophotometric measurement. Accred. Qual. Assur. 2006, 11, 246-255. doi:10.1007/s00769-006-0124-x

BIBLIOGRAFIE

A.M.Frolov-Bagreev, G.G.Agabalianț (1955) Chimia vinului. Editura Tehnică București

Batmanglij, Najmieh (2006) From Persia to Napa: Wine at the Persian Table. Washington, DC: Mage Publishers.

Cachiță, Dorina; Constantin, Deliu; Lenuța, Rakosy-Tican; Aurel, Ardelean (2004) Tratat de biotehnologie vegetală, vol.I Editura “Dacia”, Cluj-Napoca

E. S. C. O'Connor-Cox, J. Paik and W. M. Ingledew (1991) – Improved ethanol yields through supplementation with excess assimilable nitrogen, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 8, No.1

B. Mergler, J. Messerschmidt and G. Tölg (1991) – A contribution to the ecology and enology of platinum Fresenius' Journal of Analytical Chemistry, Volume 357

Foulkes, Christopher (2001) Larousse Encyclopedia of Wine. Larousse. ISBN 2-03-585013-4.

H Alexandre and C Charpentier (1998) Biochemical aspects of stuck and sluggish fermentation in grape must Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology

H. Queiroz and A. Pareilleux (1990)– Growth kinetics of Schizosaccharomyces pombe under various culture conditions: influence of pH, malate, ethanol and oxygenation, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 33, Number 5 / August, 1990

Johnson, Hugh (2003) Hugh Johnson's Wine Companion, 5th edition, Mitchell Beazley.“The Encyclopaedia of Wines, Vineyards and Winemakers”

McCarthy, Ed; Mary Ewing-Mulligan, Piero Antinori (2006) Wine for Dummies. HarperCollins.

MacNeil, Karen (2001) The Wine Bible. Workman. ISBN 1-56305-434-5.

M. Patic (2006) Enciclopedia viei și vinului, ISBN: (10) 973-31-2296-3 / (13) 978-973-31-2296-8

Nicholson, Paul T; I. Shaw (2000) Ancient Egyptian materials and technology. Cambridge: Cambridge University Press. ISBN 0-521-45257-0.“Grapes and wine in ancient Egypt; includes critique of chemical evidence for wine residues.”

P. N. Pimenta-Braz, J. M. Ricardo-da-Silva and O. Laureano (1998) – Evaluation of pectolytic activities of enological interest in industrial enzyme preparations Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, Volume 206, Number 1 / January, 1998,

P. Ribéreau-Gayon (1986) – The scientific basis for the production of quality wines, Cellular and Molecular Life Sciences (CMLS), Volume 42, Number 8 / August, 1986

P. Sanchez-Torres, L. Gonzalez-Candelas and D. Ramon (1998) – „Construction of Aspergillus nidulans strains producing enzymes of potential use in enology”, Biotechnology Letters, Volume 20, Number 1 / January, 1998

Robinson, Jancis (2006) The Oxford Companion to Wine, 3rd edition, Oxford: OUP. ISBN 0-19-860990-6.

S. Lafon-Lafourcade, A. Lonvaud-Funel and E. Carre (1983) – Lactic acid bacteria of wines: stimulation of growth and malolactic fermentation, Antonie van Leeuwenhoek, Volume 49, Number 3 / May, 1983

Sumio Michnick and Jean-Michel Salmon (1994) – Glycerol production from sugars with phosphoglycerate mutasedeficient Saccharomyces cerevisiae partially resistant to glucose repression, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, Volume 13, Number 1 / January, 1994

Taber, George M. (2005) Judgment of Paris: California vs. France and the Historic 1976 Paris Tasting the Revolutionized Wine. NY: Scribner.

Zraly, Kevin (2006) Windows on the World Complete Wine Course. Sterling. ISBN 1-4027-3928-1.

Zohary, Daniel; Maria Hopf (2000) Domestication of plants in the Old World. Oxford: OUP. ISBN 0-19-850356-3.

Bodner, George M.: Metabolism Part I: Glycolysis for the Embden-Meyerhoff pathway, J. Chem. Educ., (1986), 63 (7), p 566

http://courses.cit.cornell.edu/biomi290/MOVIES/GLYCOLYSIS.HTML

http://books.google.com/books?id=gSFbGLVFwMEC&pg=PA301

Lehninger, A.(1987 si 1992): Biochimie, vol I-II Editura tehnică, Bucuresti

http://www.bevitech.ro/vinros.htm\

Skoog, et al. Principles of Instrumental Analysis. 6th ed. Thomson Brooks/Cole. 2007, 169-173.

L. Sooväli, E.-I. Rõõm, A. Kütt, I. Kaljurand, I. Leito(2006). Uncertainty sources in UV-VIS spectrophotometric measurement. Accred. Qual. Assur. 2006, 11, 246-255. doi:10.1007/s00769-006-0124-x