Determinarea Activitatii Antioxidante a Hibiscusului

CUPRINS

Introducere

Capitolul 1

Notiuni teoretice

HIBISCUS

1.1 Caracteristici

1.1.2 Structura morfologică și compozitia chimică a hibiscusului

1.1.3 Utilizarea hibiscusului in industria alimentară

1.1.4 Culoarea

Capitolul 2

2.1 Cercetari proprii

2.1.2 Materiale si metode

2.1.3 Determinarea antocianilor totali

2.1.4 Metodele efectuate pentru fiecare specie de hibiscus

Capitolul 3

3.1 Determinarea p H –ului

3.1.2 Determinarea Flavonoidelor

3.1.3 Analiza continutului de flavonoide din extractele de Hibiscus

3.1.4 Determinarea Flavonoidelor conform metodei Hristos Muller

3.1.5 Determinarea Antocianilor

Capitolul 4

4.1 Determinarea activitătii antioxidante

4.1.2 Determinarea DPPH

4.1.3 Determinarea FRAP

4.1.4 Determinarea TEAC

Capitolul 5

Rezultate

Concluzii Bibliografie Anexe

INTRODUCERE

Industria alimentară precum și industria farmaceutică sunt într-o continuă evoluție,apărând pe piață noi porduse, folosind tehnologii tot mai avansate și mai rapide. Odata cu creșterea producției și complexitatea proceselor tehnologice o problemă foarte importantă o are ținerea sub control a microorganismelor care pot cu ușurință contamina produsele și liniile tehnologice. Produsele realizate din extracte de plante cu ajutorul tehnologiilor inovatoare, care sunt mai prietenoase cu mediul înconjurător decât cele chimice, care își doresc substituirea produselor chimice clasice.

Scopul studiului nostru a fost de a compara conținutul de antociani din trei specii de extracte de Hibiscus pentru a putea fi utilizata în viitor, în domeniul dermatologiei si farmacologiei. Obiectivele acestei lucrari sunt cele de a determina conținutul total de antociani din speciile de hibiscus si cel de a determina culoarea de extracte de hibiscus , în RGB , CIE L * a * b * și CIE L * C * h * in spatii tricromatice .

Literatura de specialitate a demonstrat faptul că foarte mulți compuși care se pot extrage din diferite plante au efecte dăunătoare împotriva culturilor de microorganisme, unele microorganisme sunt rezistente la antibiotice, dar sunt foarte repede eliminate de substanțele active găsite în plante.

Așadar referitor la climatul local și la diversitatea mare de plante care se pot găsi pe teritoriul României am ales un număr de plante care se întalnesc și se utilizează în diferite domenii și aplicații. Plantele selectate sunt plante ornamentale Hibiscus syriacus:Gold Dust(yellow), Hibiscus syriacus:Oiseau Blue or Blue Bird (Blue), Hibiscus Sabdariffa (Red).

Hibiscusul este o planta erbacee care apartine familiei Malveceae . Acesta conține câteva sute de specii prin lume .Un număr mare de studii de cercetare au aratat ca floarea de hibiscus spp . are diferite proprietăți farmacologice ( activitate anticancerigenă , capacitate antioxidantă ) .Compușii bioactivi ai florilor de Hibiscus fac parte flavonoidele , antociani, și clasele de acizi fenolici .

Florile uscate din Hibiscus sabdariffa au fost achiziționate de la o piață locală din Oradea . Petalele de Hibiscus syriacus au fost obținute de la o florărie, fiind identificate la Departamentul de Agricultură a Universității din Oradea . Din materiale uscate au fost preparate atât metanol cat și extract de metanol acidulat . Conținutul de antociani a fost înregistrat în ambele extracte. Plantele investigate sunt cunoscute a fi bogate în derivați polifenolici cu activitate Anti microbiană (Niamh et al., 2009; Çelik and Wendel, 2005;Pop,2013). Flavonoidele formează o grupă mare de compuși chimici din familia derivaților polifenolici, cu potential antimicrobian (incluzând acizii fenolici, flavone) (Day and Harborne, 1993; Harborne and Williams, 2000; Cardonaa et al., 2013; Neveu et al., 2010).

Polifenolii sunt prezenți în diferite plante medicinale, inclusiv în fructe, cereale, ceai, cafea,vin (Sarica et al., 2005), dar și în plante ornamentale (Areej et al., 2013; Couto et al.,2012),fiind dovedit faptul ca au activități anti-microbiene (Nichenametla, 2006). Polifenolii existenți în diferite plante au un efect anti-inflamator, protector împotriva stresului oxidativ, efect care este corelat cu efectul de prevenție al arterosclerozei și al altor maladii cardiovasculare (Qadan et al., 2005; Chizzola et al, 2008; Kale et al., 2012; Amarowicz et al, 2009; Papageorgiou et al., 2008; Werner and Ros, 2010; Deepinderjeet and Sachin, 2013).

Obiectivele principale ale studiilor experimentale au fost:

Determinarea conținutul total de antociani din speciile de hibiscus

Determinarea de culoare a extractelor de hibiscus , în RGB , CIE L * a * b * și CIE L * C * h * in spatii tricromatice

Lucrarea de față este structurată în două părți: prima parte cuprinde capitolele 1, 2, 3, iar a doua parte cuprinde capitolele 4, 5.

Capitolul 1 prezintă informații de bază despre tipurile de plante investigate: Hibiscus siriacus:Gold Dust(yellow), Hibiscus syriacus:Oiseau Blue or Blue Bird (Blue), Hibiscus Sabdariffa (Red). Precum si a unor notiuni despre caracteristicile si compozitia chimica. Toate aceste plante au fost alese deoarece literatura de specialite a demonstrat că o mare parte din componentele active ale aestora au numeroase activități, printre care se numără și activitatea antimicrobiană.

Capitolul 2 prezintă date despre utilizarea hibiscusului in industria alimentară și aplicabilitatea acestora in acest moment .

Capitolul 3 prezintă principiile ce stau la baza fotometriei si colorimetriei ca metode de generare și masurarea culorilor. Tot in acest capitol se detaliează cele trei spatii tricromatice de culare RGB, XZY si CIE La ٭b٭

Capitolul 4 conține date experimentale cu privire la obținerea extractelor din plantele investigate utilizând diferite metode de extracție,fiind investigate probe uscate in etuva la 50ºC ,precum și date referitoare la determinarea compusilor bioactivi pentru cele trei determinari : determinarea compusilor biochimici, determinarea activitătii antioxidante,determinarea culorii.

Capitolul 5 Prezintă rezultatele analizelor

La final se prezinta concluziile acestui studiu și datele obtinute .

Capitolul 1

Hibiscusul

Notiuni teoretice

Este o specie de plante floricole din tribul Hibisceae, familia Malvaceae, native din Asia de Est.Cunoscut si sub denumirea de trandafir chinezesc sau trandafir japonez, Hibiscus este o planta lemnoasa (un arbust), inalta de 1,5m – 2 m. Hibiscusul infloreste, cu exceptia iernii, aproape intreg anul.Frunzele sunt ovate sau rombic ovate și neregulat dintate . Florile complete , mari colorate viu și divers (caliciul intern , 6-12 fidat sau 10-12 foliat, 5 stigmate , filamentele reunite ale staminelor depasesc lungimea corolei). Fruct ,capsula cu 5 loji Caliciul este format din 5 sepale libere. In centrul florii se afla 5 stamine galbene,sudate,care formeaza un tub lung. Pistilul are 5 ovare și un stil lung care trece prin interiorul tubului format de stamine. Florile au o durata scurta de viata, de cel mult 24 de ore, dar pe canicula tin chiar mai putin, de obicei de dimineata si pana seara. Unii hibrizi noi au flori mai logevive, care pot tine chiar trei zile. Florile sunt monocrome sau bicrome, simple, semiduble sau duble, foarte divers colorate. Hibiscusul infloreste din martie-aprilie si pana in octombrie, dar, tinut in apartamente la caldura, poate inflori si pe timpul iernii.Speciile de hibiscus se înmulțesc destul de ușor din lăstari semi lemnificați plantați în substrat cu nisip și în microseră. Însă lucrul ăsta nu dă rezultate bune în orice perioadă din an și indiferent de specie. Majoritatea hibiscușilor de interior pot să facă rădăcini atât în vase cu apă, cât și în pământ. Hibiscușii de grădină se înmulțesc în mod curent prin semințe și rezultatele sunt foarte bune. Varietățile hibride sunt mai dificile, pentru că unele nu au semințe cu capacitate germinativă, iar lăstarii puși la înrădăcinat putrezesc.Vegeteaza bine pe soluri permeabile cu suficiente substante nutritive. In zonele temperate,specia ornamentala cea mai frecvent cultivata este Hibiscus Syriacus cunoscuta in unele zone ca “Trandafirul de Athea.

Condiții de ingrijire și cultivare

Ca in cazul majorități arbuștilor de gradină, lumina reprezintă si pentru Hibiscus syriacus un factor important de care va trebui să tineti cont. Desi tolerează semi-umbra, numai exemplarele cultivate in spatii largi și insorite, se vor dezvolta impresionant și vor produce multe flori.

Caldura este o altă conditie de ingrijire de care se va tine seama, cel putin la plantele tinere, proaspăt transplantate. H.syriacus apreciaza temperaturile medii si vegeteaza intre 10 si 28 grade Celsius. Este considerat totusi un arbust foarte rezistent, atăt la iernile din tara noastra cat și la arsita verilor. Dacă este plantat in zone libere de curenti de aer sau vanturi puternice, trece cu bine peste ierni in care temperaturile scad și pană la minus 20 sau chiar minus 25 grade Celsius.

Are nevoie de udări periodice, exemplarele mature devenind foarte setoase in timpul verii, cand apreciază o udare abundentă, la fiecare 3-4 zile. Primavara și toamna se multumesc cu o udare pe săptamană, iar pe timpul iernii pot rezista fără apă chiar și 3-4 săptămani.

Studiul coloranților naturali este un domeniu de investigații extensiv și activ datorită interesului crescut de a înlocui coloranții sintetici care au efecte nocive asupra sănătății oamenilor. Carotenoidele și antocianii sunt coloranții vegetali printre cei mai utilizați în industria alimentară. Antocianii sunt solubili în apă și mai puțin stabili decât carotenoidele; aceștia sunt extrași din struguri, fructe de pădure, varză roșie, mere, ridichi, lalele, trandafiri, orhidee.

Antocianii (din greacă anthos= floare și kianos= albastru) sunt cei mai importanți pigmenți ai plantelor vasculare; aceștia nu sunt toxici și sunt usor încorporabili în medii apoase ceea ce îi face utili pe post de coloranți naturali hidrosolubili. Acești pigmenți sunt responsabili pentru portocaliul strălucitor, roz,roșu, violet și albastru în florile și fructele unor plante.Altă proprietate importantă a antocianilor este activitatea lor antioxidantă, care joacă un rol vital în prevenirea bolilor neuronale și cardiovasculare, cancer și diabet printre altele. Există studii privind efectul antocianilor în nutriția umană și activitatea sa biologică.

Principala clasă de coloranți alimentari derivați de benzopiran este reprezentată de de antociani, la aceștia adăugându-se flavoinoizi, taninuri și coloranți chalconici a căror structură derivă din sistemul benzopiranic.Antocianii sunt coloranți hidrosolubili cu largă răspândire, responsabili deculoarea orange, roșu, violet, sau albastru a multor flori, fructe sau legume. Utilizarea acestora ca și coloranți este atestată încă din antichitate deoarece romanii utilizau fructe intens colorate pentru a intensifica culoarea vinurilor. O specie de fructe, merișoarele(engleză:cranberries) intrau în compoziția unui aliment conservat pe bază de carne utilizat de indienii americani pentru călătoriile lungi, numit pemmican, conferindu-I acestuia o culoare și o aromă plăcute și asigurându-i totodată o valoare acidă a pH-ului pentru a împiedica dezvoltarea microorganismelor. În acest moment sunt cunoscuți 539 antociani dintre care 277 au fost identificați după anul 1992. Din punct de vedere chimic antocianii sunt glicozide ale antocianidinelor având structura de bază cationul de 2-fenilbenzopiriliu (flaviliu),substituit cu grupe OH fenolice și/sau metoxil. Antocianidinele (sau agliconii) sunt formați dintr-un inel aromatic (A), legat de un inel heterociclic (C) care conține un atom de oxigen, care la rândul său estelegat printr-o legătură carbon-carbon de un al treilea inel aromatic (B) – Figura 1

Fig 1

(https://www.lescienze.blogautore.espresso.repubblica-antocianine)

(http://www.plantsondemand.com)

1.1.2 Structura morfologică si compozitia chimică a hibiscusului

Un interes considerabil în conținutul de flavonoide de produse alimentare și plante a fost încă de la începutul anilor 1980, când studiile de Steinmetz și Potter au demonstrat o relatie între o dietă bogată în fructe si legume si un risc redus de boli cronice. Deoarece riscul redus nu sa corelat cu nutrienți tradiționali, atenția sa concentrat pe non-nutrienți, compuși potențial bioactivi, din care flavonoide .Flavonoidele sunt în mod natural compuși polifenolici cu o catenă C6-C3-C6. Acest grup de pigmenți de plante care se gasesc in fructe, legume, cereale, coaja, radacini, tulpini, flori, ceai, și vin pot fi împărțite în șase categorii chimic structurale: flavone, flavonoli, flavanone, flavanonols, flavan-3-oli ( catechine), și antocianidine. Acești compuși (agliconi) sunt de obicei glicozilati (la una sau mai multe poziții cu o varietate de zaharuri) și pot fi de asemenea alcoxilate sau esterificate. Ca urmare, peste 5000 flavonoide diferite au fost identificate în materialele vegetale. Metodele care au fost raportate pentru determinarea flavonoidelor se bazează pe peformarea complexului de clorura de aluminiu , care este una dintre procedurile analitice cel mai frecvent utilizate aplicate pentru determinarea conținutului în flavonoide în diferite plante, în general , formele de aluminiu de clorură acidă complexe stabile cu gruparea C – 4 ceto și C – 3 sau gruparea C – 5 hidroxil de flavone și flavonoli . In plus , aluminiul formează cloruri acide complecși labili cu grupările orto – dihidroxil în A sau B inelului de flavonoide . Compusii fenolici ai plantei prezintă activitatea antioxidantă bogată de coridoarele radicalilor liberi generați în timpul procesului normal de metabolism .

Acest grup cuprinde o mare diversitate de compuși , care include în principal : flavonoide si pro – antocianidine. Conținutul fenolici și conținutul flavonoizi prezenti în corp de plante dau în principal ideea de importanta medicamentului. Acestea sunt considerate indicele cu putere antioxidantă ,deoarece aceste componente sunt implicate în ștergerea ,neutralizarea radicalilor liberi datorită prezenței inelului conjugat și grupurilor carboxilice. Aceasta grupare funcțională în compuși fenolici și flavonoide , de asemenea, se implica puternic in inhibarea peroxidarii lipidelor in activitati antibacteriene . Floarea de H.rosa – sinesis are activitati medicinale promitatoare si poate juca un rol terapeutic impotriva bolilor epidermice și patogeni născuți . Pe baza rezultatelor și sfera activităților promițătoare de extract de metanol al florilor ar putea fi expus la izolarea componentelor mai active pentru programul de dezvoltare de droguri si tratamentul bolilor infecțioase .

Activitățile biologice ale H. rosa sinensis includ anti – implantare,avortive ,antispastice, anti spermatogenice,analgezic, are proprietăti antifungice si anti- inflamatorii ( Centrul de Cercetare Medicina din plante , 2002) . Obiectivul acestui studiu a fost acela de a identifica noi agenți antimicrobieni potențial plante din specia Hibiscus care ar putea fi dezvoltate de industria farmaceutică,precum și pentru a promova utilizarea speciilor hibiscus întratamentul diferitelor boli. Plante proaspete de H. rosa au fost colectate în noiembrie 2003. Un numar de plante au fost identificate și autentificate de către Unitatea de plante de la Institutul de Cercetari Medicale ( IMR ) , Kuala Lumpur . Plantele colectate au fost uscate in cuptor( 40 ° C ) , sol într-o pulbere curs și depozitat la -20 ° C . Cele uscate , frunzele și tulpina pudrate se extrag cu eter de petrol , acetat de etil și metanol prin extracție la rece . Extractul s-a filtrat și s -a concentrat la un volum mic pentru a elimina tot solventul , folosind un evaporator rotativ la 40 ° C . Volumul mic a fost ulterior uscat și extractul rășinos a fost păstrat în congelator ( -70 ° C ) . O soluție stoc de extract (200 mg / ml ) a fost preparată prin dizolvarea extractului în dimetil sulfoxid pur ( DMSO ) ( Sigma , USA) și diluarea acestuia de două ori . Acest extract a fost sterilizat și filtrat folosind hârtie de filtru ( 0,2 pm) și depozitat în tuburi Eppendorf la 4 ° C .Organismele utilizate în această cercetare au fost MRSA , S. aureus , E. coli , P. aeruginosa și K. pneumonie . La primirea , toate izolatele au fost subcultivate pe mediu de cultură selectate pentru a asigura puritatea și să confirme identificarea lor . Tulpinile au fost menținute și testate pe Mueller Hinton agar ( MAI ) ( Merck , Germania ) , care a fost depozitat la 4 ° C . Efectul pH-ului asupraconținutului antociani de trei probe plante a fost studiat la șase pH diferit ( 2,0 ,2.5 , 3.0 , 3.5 , 4.0 și 4.5) la 25 °C. pH-ul probelor au fost ajustate folosind acid citric – Na2 HPO4 tampon . Gama de condiții acide au fost selectate în cadrul pH de produse alimentare acide , cum ar fi conserve , gemuri, jeleuri , băuturi și sucuri.

Utilizarea hibiscusului in industria alimentară

Recent, a existat un interes crescut în cercetarea pe componente alimentare , cum ar fi antociani si alti compuși fenolici , din posibila cauza a acestora la beneficii de sănătate , inclusiv reducerea bolilor de inima si cancer , în funcție de activitatea lor antioxidante ( Seeram et al. , 2002 ) . Roselle este un arbust tropical cu calyces umflate roșii sau verzi . Gruparile frunzelor sunt de tipu roșu și verde roșu , închis . ( Schippers , 2000 ) .Cele mai diferite de părțile Roselle sunt semințe,frunze,flori și au fost folosite ca legume , surse de ulei , băuturi răcoritoare și conserve alimentare . Florile cărnoase de Roselle au fost utilizate în diferite țări din Africa și Caraibe ca aliment sau ingredient alimentar , cum ar fi jeleuri, siropuri, băuturi , budinci ,prăjituri,vinuri și ca un colorant . In plus fata de utilizarea lor în produsele alimentare , diferite părți ale plantei a folosit Hibiscus în medicina tradițională pentru prevenirea bolilor cum ar fi bolile cardiovasculare și hipertensiune .

Compușii care se găsesc în florile roșii ale Hibiscusului au un efect coleretic ( îmbunătățirea funcției hepatice).Florile au fost găsite pentru a stimula peristaltismul intestinal , ajutând la ameliorarea constipației într-un mod ușor . Compușii antioxidanți , cum ar fi flavonoidele , antocianii și polifenoli , cuprinsi în floare contribuie in general la sănătate și anti – îmbătrânire. Hibiscusul este utilizat si pentru tratarea pierderii poftei de mâncare , raceli , pentru inima , boli nervoase , dureri ale tractului respirator superior, retenție de lichide , iritarea stomacului , și ca un diuretic pentru a crește producția de urină . Consumul de ceai de hibiscus poate reduce semnificativ tensiunea arteriala la persoanele cu diabet de tip 2. Hibiscusul acționează si ca un inhibitor al apetitului natural, ajutand la pierderea in greutate dietetica . Ceaiul sau infuzia de flori de hibiscus este nu doar o băutură răcoritoare, ci are și unele beneficii medicinale. Originar din Angola, hibiscusul este cultivat ȋn regiunile tropicale și subtropicale, în special în Sudan, Egipt, Thailanda, Mexic și China. Semințele de hibiscus acționează ca un stimulent și sunt folosite ȋmpotriva crampelor în unele părți din Asia.

Ceaiul are un efect diuretic dar are și un conținut bogat ȋn vitamina C. În medicina ayurvedică rădăcinile sunt utilizate pentru vindecarea tusei si ca tratament ȋmpotriva pierderii pǎrului sau a albirii pǎrului.Noi cercetǎri sugereazǎ cǎ ceaiul de hibiscus sau extractul de hibiscus are efecte antioxidante și îmbunătățește și sănătatea cardiovasculǎ. Potrivit unui studiu din 2010, consumul de ceai de hibiscus aduce beneficii persoanelor cu tensiune arterialǎ ușor ridicatǎ. De asemenea, acesta este de ajutor ȋn cazul persoanelor cu diabet de tip II și duce la creștere semnificativă a HDL, a colesterolului "bun" și la o scǎdere semnificativǎ a LDL, cunoscut sb numele de colesterolul "rǎu". Consumarea de ceai de Hibiscus din frunze te ajută să mănânci mult mai puțin și digestia alimentelor e mai eficienta pentru a reduce acumularea de grasime nedorita in corpul tau . Consumul regulat de ceai din frunze de hibiscus ajută femeile în scăderea nivelului de estrogen din organism . Acest lucru ajută organismul să mențină un nivel hormonal echilibrat ajuta în reglarea ciclului menstrual propriu.

Pasta facută din frunze de hibiscus zdrobite și petale din floarea ei este folosit ca un balsam natural pentru par . Este cunoscut pentru a întuneca culoarea parului si reduce matreata atunci când este aplicat după șampon. Extractul de ulei de hibiscus este utilizat pentru aplicarea pe răni deschise ajutand rana sa se vindece mai repede .

Cercetările efectuate la Universitatea Jambheshwar Guru de Știință și Tehnologie din India asupra sarcinii și asupra fertilității au arătat că ceaiul de hibiscus are calitati estrogenice. Excesul de hibiscus interferează cu fertilitatea feminine si reduce nivelul de estrogen . Ceaiul de hibiscus conține hidrocarburi aromatice policilici, care sunt asociate cu cancer si malformatii congenitale. Femeile insarcinate ar trebui sa evite ceaiul de hibiscus.

Ceaiul de hibiscus ajută la :

• Reduce colesterolul – Antioxidanții și bioflavonoide conținute de ceaiul de hibiscus sunt utile în controlul colesterolului, contribuind astfel la reducerea riscului de boli de inimǎ.

• Scăderea tensiunii arteriale – Ceaiul de hibiscus ajută la scăderea tensiunii arteriale.

• Combate simptomele rǎcelii – Pentru că este bogat în vitamina C, hibiscusul este un „paznic” excelent ȋmpotriva rǎcelilor și a gripei.

• Ȋmbunǎtǎțește digestia – hibiscusul îmbunătățește modul de funcționare a vezicii urinare, iar acesta a fost utilizat în mod tradițional pentru a trata constipația. De asemenea, are un efect antispasmodic și poate fi utilizat pentru tratamentul sindromului de colon iritabil.

• Adjuvant ȋn caz de depresie – Ceai de hibiscus poate contribui la calmarea sistemului nervos și poate fi considerat un adjuvant ȋn caz de depresie.

• Previne creșterea celulelor precanceroase – Ca toate alimentele bogate ȋn antioxidanți, ceaiul de hibiscus poate ajuta la stoparea dezvoltǎrii celulelor precanceroase.

Culoarea

Pentru determinarea culorii ne-am construit o reflexie VIS ce am convertito cu funcțiile senzitive relative de la spatiul de culoare x la z. Culoarea a fost măsurată în mod obiectiv , precum și concentrarea pigmentilor pe baza Wrolstad ( 2005) . Culoarea este una dintre primii parametrii pe care consumatorii se bazează dacă să cumpere un produs alimentar sau nu. Există mulți factori care influențează variația de stabilitate și culoare a antocianilor,a colorantilor naturali și pH-ul care este printre cel mai important factor. Acest studiu are ca scop determinarea stabilității antocianilor din liofilizat Hibiscus sabdarifa. Antociani totali monomerici, indicele de degradare, densitatea de culoare au fost analizate pentru a determina degradarea antocianilor și variațiile lor de culoare.

Spectral to XYZ colour space conversion

Transformarea XYZ la RGB & CIE L * a * b *

XYZ coordonatele cromatice de probe de hibiscus sunt transformate în RGB iAR separat coordonatele cromatice in CIE L * a * b *

In urmatoarele imagini avem reprezentarea grafică a coordonatelor RGB L * a * b * si L * C * H * al celor trei specii de hibiscus, de asemenea aici sunt prezente culoarile redate de extractul de hibiscus in extract de culoare RGB.

La reprezentarea grafică pentru CIE L * a * b * putem nota că Hibiscusului galben prezintă cea mai mare lumină dar si cea mai mică ƐB. Aceste aspecte denotă lipsa pigmentilor din antociani .

Toată această concluzie poate fi trasă din reprezentarea tridimensională a coordonatelor cromatice CIE L * a * b * al soiurilor de hibiscus libere.

Figura 1 Figura 2

1 Doar Hibiscus Syriacus:Blue Bird (Blue) și Hibiscus Sabdariffa(Red) sunt sursa bogata in antociani.

2 Solventul utilizat pentru extracție influențează semnificativ nivelurile extractelor antioxidante.

Capitolul 2

Cercetari proprii , metoda practica

1. Determinarea conținutul total de antociani din speciile de hibiscus

2. Determinarea de culoare a extractelor de hibiscus , în RGB , CIE L * a * b * și CIE L * C * h * in spatii tricromatice.

2.1.2 MATERIALE SI METODE

Pentru cuantificarea totală a antocianilor prin metoda spectrofotometru , petalele pulverulente uscate cu aer de Hibiscus au fost amestecate cu metanol și metanol acidulat cu acid clorhidric ( 0,1 % ) în raport 01:10 ( greutate / volum ) . Amestecul se centrifughează la 15000 rpm timp de 15 minute , iar supernatanții au fost utilizati pentru analize .

2.1.3 Determinarea antocianilor totali

Materialele folosite la determinarea antocianilor sunt :

0,025 M tampon clorură de potasiu , pH 1,0

0,4 M tampon de acetat de sodiu , pH 4,5

2.1.4 Metodele efectuate pentru fiecare specie de Hibiscus :

Diluarea cu proba tampon

Pastrea probelor in diluții in echilibru : 15 min

Măsurarea absorbanței din fiecare diluție la 520 nm și la 700 nm

( Shimadzu 1240mini UV -VIS spectrofotometru ) .

Amprentele spectrofotometrice UV -VIS ale extractelor Hibiscus au fost realizate pentru ( 520 & 700 ) nm , după o diluare prealabilă ( 1 : 5 v / v ) , folosind un spectrofotometru Shimadzu Japonia UV – VIS 1240mini , Shimadzu Corp. Kyoto.

Pentru cuantificarea antocianilor totali am apreciat pigmentul antocianilor monomerici. (MPA)

Unde :

A = absorbție a eșantionului diluat ;

MW =greutate moleculară ( 449.2 ) ; DF = factorul de diluție ( 5 ) ;

e = absorbanța molar ( 26900 ) ; Vsmpl și msmpl = volumul probei ( ml ) și greutate ( g ) .

UV-Vis spectrele de trei specii de hibiscus diferite ( Hibiscus syriacus , praf de aur Hib – galben , Hibiscus syriacus , Oiseau Bleu – HIB_Blue ; Hibiscus sabdarifa – HIB_Red )

The total anthocyanins content (means ± SD) from two different species of Hibiscus

Valorile medii sunt urmate de litere diferite , dacă sunt semnificativ diferite , în funcție de testul Tukey . ( P < 0,05 ) .

Cel mai mare conținut de antociani sa înregistrat în cazul Hibiscusului sabdarifa ( HIB_Red ) comparativ cu Hibiscus syriacus ( HIB_Blue ) . Cea mai buna extracție de antociani au fost înregistrate în momentul in care metanolul acidulat a fost utilizat ca solvent , iar rezultatele sunt prezentate în imaginea de mai sus. Aishah colab . , 2013 a investigat efectul pH-ului asupraconținutului de antociani monomeri în H. sabdarifa , M. malabathricum și I. batatas.

Continutul total de antociani ( mg / l ) din speciile hibiscusului exprimat ca pigment monomeric, antociani și diferența ( exprimata ca raport între cele mai inalte si cele mai mici continuturi de antociani ) dintre specii și solventul folosit.

Fitochimicale identificate în floarea de hibiscus este o potențială sursă de antioxidant natural care ar putea avea o mare importanță în medicină și farmacologie . În acest studiu ne concentrăm asupra conținutului de antociani din trei specii diferite de Hibiscus , unul dintre ei , H. sabdarifa care contine cel mai mare conținut al acestor compuși bioactivi .

CAPITOLUL 3

3.1. Determinarea p H –ului

pH-ul a fost măsurat utilizând un pH-metru Hanna Instruments care în prealabil a fost calibrat cu soluții tampon pH 4.0 respectiv pH 7.0. Antociani prezintă diferite culori la diferite pH . Astfel încât să poată fi utilizati ca sursă naturală de pH indicație [ 11,14,17 ] . Extractul Antocianin fost măsurat exact 1 ml și a fost luată în diferite eprubete curate , . PH-ul soluției în fiecare eprubetă a fost reglată prin 1N HCL și 1N NaOH secvențial între 1 și 12 folosind acid, bază și pH- metru pentru pH cu precizie exacta . Conținutul din fiecare eprubetă s-au în mod corespunzător amestecate și dezvoltarea de culoare a fost observată și înregistrată.

3.1.2 Determinarea flavonoidelor

În cercetarea fitochimică a extractelor, există o cerere din ce în ce mai mare de metode de analiză cantitativă a flavonoidelor (flavone, antociani, taninuri) care să fie simple, rapide, selective și precise. În această lucrare autorii abordează determinarea cantitativă a flavonozidelor din extractele de Hibiscus sabdariffa L. (Malvaceae) utilizând mai multe metode spectrofotometrice: Christ-Müllers, Chang și colab., și câteva variante ale acesteia. Obținerea acestor extracte are ca scop evidențierea fracțiunii cu cel mai bun potențial hipoglicemiant (verificat prin experiment pe șobolani cu diabet zaharat indus experimental prin aloxan) și antioxidant. Rezultatele obținute arată că procentual, conținutul în flavone determinat prin metoda Christ-Müllers conduce la cele mai mici valori, în timp ce prin metoda Chang și colab. se obțin cele mai mari valori.

În concluzie, metoda Chang și colab. este cea mai simplă, rapidă, și precisă pentru determinarea conținutului în flavonoli (liberi și glicozidați), precum și extracția cu metanol și hidroliza heterozidelor prin refluxare cu HCl 4 N, timp de 30 min.

Nu a fost un interes considerabil în conținutul de flavonoide de produse alimentare și plante de la începutul anilor 1980 , când studiile de Steinmetz și Potter a demonstrat o relatie intre o dieta bogata in fructe si legume si un risc redus de boli cronice . Deoarece riscul redus nu sa corelat cu nutrienți tradiționali , atenția sa concentrat pe multe non – nutrienți , compuși potențiali bioactivi , printre care flavonoidele constituie o familie.

Flavonoidele sunt în mod natural compuși polifenolici cu o catenă C6 – C3 – C6 . Acest grup de pigmenți de plante care se gasesc in fructe , legume, cereale , coaja, radacini , tulpini , flori, ceai , și vin pot fi împărțite în șase categorii chimic structurale : flavone , flavonoli , flavanone , flavanoli , și antocianidine . Acești compuși ( agliconi ) sunt de obicei glicozilate ( la una sau mai multe poziții cu o varietate de zaharuri ) și pot fi de asemenea alcoxilate sau esterificate . Ca urmare , peste 5000 flavonoide diferite au fost identificate în materiale vegetale.

Metodele care au fost raportate pentru determinarea flavonoidelor se bazează pe formarea complexului “clorura de aluminiu” , care este una dintre procedurile analitice cel mai frecvent utilizate sunt aplicate pentru determinarea conținutului în flavonoide în diferite plante. In general , formele de aluminiu de clorură acidă complexe stabile cu gruparea C – 4 ceto și C – 3 sau gruparea C – 5 hidroxil de flavone și flavonoli . In plus , aluminiul cu forme de cloruri acide complecși labili cu grupările orto – dihydroxyl în A sau B inelului de flavonoide . Au fost utilizate metode analitice , fie pentru a determina glicozila sau flavonoidele neglicozilate .

Quercetin Quercetin-3-rutinoside Quercetin-3-rhamnose

Figura 1 Agliconul liber și sub formă glicozilată de quercetin

Hidroliza efectuată în scopul de a produce agliconi , servită in scopuri multiple : a redus numărul de compuși și a făcut separarea cromatografică mai ușor de realizat ; a permis cuantificarea flavonoidelor , deoarece standardele pentru un număr mare de flavonoide glicozilate nu sunt disponibile ; și a furnizat date în concordanță cu punctul de vedere anterior că flavonoidele au fost absorbite numai în intestin ca agliconi . Din păcate , hidroliza asemenea, duce la degradarea agliconului , oferind astfel mai multă importanță acelei metode bazate pe flavonoide glicozilate.

Studiul literaturii a relevat prezența a două clase de flavonoide în extractele de Hibiscus sabdarifa : flavonoli, și antociani. Studiul de față relatează unele metode analitice utilizate pentru determinarea conținutului de flavonol în diferite extracte hibiscus și selectarea celor mai bune proceduri care trebuiesc urmate în analiza cantitativă a flavonoidelor în planta menționata .

3.1.3 Analiza conținutului de flavonoide din extractele de Hibiscus .

3.1.4 Determinarea flavonoidelor conform metodei Hristos Mullers:

Această metodă este aplicată părții aglicone; Prin urmare conținutul în flavonoide total se calculează ca tip quercetin.

Procedură: 20 ml de acetonă, 2 ml de 25% HCI și 1 ml de 0,5% hexametil entetramină au fost adăugate la 25 ml extract (corespunzând la 2 g de material vegetal) și refluxat la 56ºC timp de 30 minute. Extractul a fost filtrat si re-extras de două ori cu 20 ml acetonă timp de 10 min. După răcire și filtrare, extractul a fost completat până la 100 ml cu acetonă (soluție probă elementară, BSS). 20 ml de BSS a fost amestecată cu 20 ml de apă și apoi se extrage cu acetat de etil (mai întâi cu 15 ml și apoi de trei ori cu 10 ml). Extractele de acetat de etil s-au spălat de două ori cu apă, apoi se filtrează și se completează până la 50 ml cu acetat de etil (S1). In 10 ml de S1 0,5 ml de 0,5% soluție de citrat de sodiu și 2 ml de AlCI3 (preparată prin dizolvarea a 2 g de AlCI3 în 100 ml de 5% acid acetic în metanol) s-au adăugat și apoi se aduce la 25,0 ml cu 5% soluție metanolică de acid acetic (soluție de probă, SS). Aceeași procedură a fost realizată cu soluție de probă martor, dar fără AICI3. După 45 de minute, soluții galbene au fost filtrate și absorbanța la 425 nm a fost măsurată. Conținutul total flavonoide a fost evaluată la trei analize independente. Randamentul a fost calculat ca quercetin procent utilizând următoarea expresie:

g% = A x 0.772 / b,

unde A este absorbanța și b reprezintă masa de material pe bază de plante uscate în grame.

3.1.5 Determinarea antocianilor

Există mulți factori care influențează variația de stabilitate și culoarea antociani colorant natural și pH-ul este printre cele mai important factor. Acest studiu are ca scop determinarea stabilității antocianilor din liofilizat Hibiscus Syriacus, în diversi pH acizi (pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0 și 4,5). Antociani totali monomerici, indicele de degradare, densitatea de culoare și pentru culoarea polimeră au fost analizate pentru a determina degradarea antocianilor și variațiile lor de culoare.

Antocianinele sunt un grup important de pigmenți de plante solubile în apă frecvent intalnite in diferite fructe si legume . Provin , datorită pigmenților cu o gama larga de spectru de culori atractive la portocaliu strălucitor , roz , rosu, albastru violet si ca are un mare potential pentru utilizarea ca colorant alimentar natural pentru a înlocui coloranți sintetici . Cu toate acestea ,pigmentul nu este stabil datorită condițiilor de prelucrare și depozitare . Mai mulți factori care influențează stabilitatea pigmentului au fost investigate , cum ar fi speciile , de mediu și condițiile agronomice ; extracție și prelucrarea parametrilor cum ar fi pH-ul , temperatura de depozitare , concentrare , structura chimică , lumina , oxigen , proteine ​​, acid ascorbic , zaharuri , sulfiții, enzime și ionii metalici ( frâu , 2005 ; Patras ș.a. , 2010 ; . . Cavalcanti,2011) . Printre acești factori , pH-ul este unul dintre factorii majori influențat semnificativ de variațiile culoarii de pigment și stabilitate . În general , antociani sunt mult mai stabili în mediu acid la valori pH scăzut decât în soluții alcaline ( Rein 2005 ) . Cavalcanti colab . ( 2011) a explicat trecerea culoare antociani " bazate pe structurile lor chimice. În soluții apoase , antociani există în principal în formă de patru specii în echilibru în funcție de pH-ul : bază quinonoidal ( QB ) , cation flavylium ( FC ) , carbinol sau pseudobase ( PB ) și chalcon ( CH ) . În condiții acide ( pH < 2 ) , antociani există în principal în formă de roșu intens cation flavylium ( FC ) . Creșterea pH cauzeaza pierderea rapida de a produce forme de bază quinonoidal albastru sau violet protonul . În același timp hidratarea de flavylium cation ( FC ) are loc , generând carbinol sau pseudobase ( PB ), care atinge ușor echilibrul cu calconă incolora ( CH ) . Cu alte cuvinte , antociani de natura ionică permite modificări reversibile ale structurii moleculei conform pH predominant , având ca rezultat culori și nuanțe diferite la diferite valori ale pH-ului . Se crede că prin ajustarea pH-ului ,procesul de stabilizare natural pentru antocianine poate fi realizat , astfel cunoașterea poate deveni de mare valoare pentru producătorii de produse alimentare .

Hibiscus sabdarifa L. , de asemenea, cunoscut sub numele de Roselle este larg răspândită în Malaezia și alte țări , cum ar fi Indonezia , Africa și America. Forile sale au fost de culoare roșie strălucitoare, datorită compusilor sai de antociani ( Castaneda – Ovando colab . , 2009 )

CAPITOLUL 4

4.1 DETERMINAREA ACTIVITATII ANTIOXIDANTE

Compușii care se oxidează cel mai ușor sunt de regulă cei mai buni antioxidanți (molecule care pot dona un electron liber sau atomi de hidrogenradicalilor liberi reactivi). Câteva studii au sugerat faptul că conținutul de antocian șiactivitatea lor antioxidantă corespunzătoare contribuie la efectul protector al fructelor și al legumelor împotriva bolilor degenerative și cronice. Anumite plante și extractedin fructe cu conținut ridicat în compuși fenolici s-a raportat că acestea acționează cainhibitori de mutageneză și carcinogeneză. În categoria substanțelor fitochimice care prezintă activitate antioxidantă sunt incluși, în afară de compușii fenolici (flavonoizi),compuși cu azot (derivați de clorofilă), tocoferoli, carotenoide și acidul ascorbic.În catecoli oxidarea are loc prin radicalii liberi până când se formează osemichinonă foarte stabilă. Compușii care conțin catecol sau 1,4-hidrochinonă suntușor de oxidat deoarece radicalul fenoxil poate fi stabilizat cu oxigen. Aceste speciisunt destul de stabile și nu extrag hidrogen din alte substanțe și au o durată de timpsuficientă pentru a reacționa cu o altă semichinonă și de a crea o reacție dedeprotonare care generează o chinonă și un grup fenolic utilizând doi radicali.

4.1.2 Determinarea DPPH

Radicalul DPPH•este utilizat ca sursă radicalică în evaluarea AAO22, monitorizarea acestuia fiind spectrofotometrică sau electro chimică 23, 24. În prezența AO, DPPH• (culoare violetă) este redus la un compus galben pal; variația absorbanței DPPH• este măsurată la 517 nm. Valorile AAO sunt exprimate ca și cantitatea de AO ce produce descreșterea DPPH• absorbanței la 50%. Metoda DPPH este simplă, rapidă, se bazează pe un principiu simplu de detecție, însă o posibilă problemă o reprezintă evaluarea AAO a AO al căror spectru se suprapune cu cel al DPPH• (ex: carotenoizii).

DPPH radical este un azot , centrat pe radicalul liber stabil cu un electron nepereche . Soluția apare violet profund și prezintă o absorbție puternică la 517 nm . Substanța ,care face culoarea mai deschisă ,pot fi considerate ca antioxidanți și , prin urmare, radicali captatori ( Marca – Williams și colab . , 1995 ) . Acum , DPPH radical este folosit pentru a analiza potențialul de compuși de baleiaj .

Metoda DPPH este o metodă la fel de folosită pentru si investigarea activității antiradicalice a fructelor și legumelor, folosind ca radical liber 2,2 difenil-1-picrilhidrazil. Rezultatele acestei metode pot fi exprimate în echivalenți de Trolox, acid ascorbic sau orice alt compus cu rol antioxidant, deoarece metoda nu este una standardizată. Schimbare de culoare de DPPH la violet la galben este consecința reducerii capacității de antioxidanti fata de DPPH stabil radical inițial, DPPH a fost considerat a fi redus la derivatul hidrazină când reacționează cu substanțele de hidrogen donatoare . Cu toate acestea , mai multe studii recente au arătat că ceea ce se întâmplă în principal este un transfer de electron rapid de la proba de DPPH. Captarea hidrogenului din proba de DPPH este marginal pentru că ea este foarte mare și depinde de hidrogen daca legătura accepta solvent . Metanolul și etanolul sunt solvenți folositi în general pentru teste de abilitate antioxidante sunt puternice in hidrogeni de – acceptare , De aceea reacția –de abstractizare a hidrogenului este foarte mare . Prezența de acizi sau baze în metanol pot influenta mult echilibrul de ionizare al fenolilor și să provoace o reducere sau o creștere , respectiv , a constantelor de viteză măsurate . În cazul reacțiilor reversibile , DPPH poate radical da valori capacitatea antioxidante greșit reduse , ca și în eugenol sau alți compuși fenolici cu o structura similara Carotenoidele interfera cu DPPH la 515 nm , Prin urmare, interpretarea datelor este complicata.

Absorbanța reacției amestecate la 517 nm a fost măsurată cu un spectrofotometru . semifabricatul se prepară prin înlocuirea extractului cu 1 ml metanol sau metanol + Apa ( 1 : 1 ) sau apă . Procentul de radical liber Activitatea baleiajului a fost calculată după cum urmează : – Activitatea Baleiaj ( % ) = [ 1 – ( O probă / A blank ) ] x 100

HS este o sursa buna de compuși bioactivi cu activitate antioxidantă. Metoda uscată afectează compoziția în polifenoli și continutul de flavonoide și AAC din petale de HS. Solventul este unul dintre factorii care poat influența extracția compușilor bioactivi.

4.1.3 Determinarea FRAP

Se va lucra cu spectrofotometrul Specord 205 UV-VIS Analytik Jena, utilizandu-se cuve de cuart cu grosimea de 1cm. Aceasta metoda a fost dezvoltata initial pentru determinarea capacitatii antioxidante a plasmei si se baza pe capacitatea plasmei de a reduce ionii ferici la ioni ferosi care formau la pH acid un complex colorat cu tripiridil triazina (TPZ), cu maximul de absorbtie la 593 nm. Capacitatea antioxidanta este direct proportionala cu cantitatea de ioni ferosi formati, care se determina pe baza unei curbele de etalonare utilizand etaloane cu concentratii cunoscute de ioni ferosi.

Metoda FRAP (ferric reducing antioxidant power)- metoda simplă spectofotometrică care testează puterea antioxidantă a probelor luate în studiu, și se bazează pe reducerea complexului tripiridiltriazina ferică ( Fe(III)_TPTZ) la complexul tripiridiltriazina feroasă (Fe(III)-TPTZ) de către un reductant la pH acid. Soluția FRAP de lucru se prepară proaspăt prin amestecarea a 50 ml tampon acetat 300 mM cu 5 ml soluție FeCl_3 și 5 ml TPTZ.

4.1.4 Metoda TEAC

Se bazează pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion ABTS+ de către antioxidanți. ABTS este oxidat de către radicalii peroxil sau alți oxidanți la radicalul său cationic ABTS. +, intens colorat (λmax = 734 nm). Capacitatea antioxidantă este exprimată ca și potențialul VII compușilor testați de a decolora radicalul ABTS. + prin reacție directă cu acesta. Capacitatea antioxidantă a compușilor testați a fost exprimată ca și echivalenți Trolox. Această metodă se bazează pe abilitatea antioxidanților de a diminua viața radicalului cation (ABTS^+), un cromofor albastru verde care absoarbe la 734 nm, comparativ cu Trolox. ABTS^+ se produce prin reacția dintre soluția stoc de ABTS (7mM) cu persulfatul de potasiu ( 2,45 mM) timp de 12-16 ore.

Pentru studiul activității antioxidante, soluția ABTS^+ se diluează cu etanol până când se obține o absorbanță de 0,70±0,02 la 734 nm. După adăugarea a 100 µl probă la 2900 µl soluție ABTS^+, amestecul a fost monitorizat spectofotometric la 734 nm, timp de 1 minut.