Dermatology in general medicine 2 v. (xxxi, 3002, 127 p.): ill. [311732]

Ca absolventă a [anonimizat] o [anonimizat] o [anonimizat]-a fost un adevărat exemplu de urmat și care mi-a acordat tot sprijinul de la începutul carierei mele profesionale, m-a îndrumat și m-a sfătuit pentru a [anonimizat].

[anonimizat] I [anonimizat]. Comănescu- [anonimizat]. [anonimizat]- Clinica I [anonimizat]- Clinica I [anonimizat]. Dr.[anonimizat] I [anonimizat] I Craiova și Constanța.

Mulțumesc familiei mele pentru tot sprijinul acordat.

1

CUPRINS

STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII

Lista de abrevieri………………………………………..……………………………..5

Introducere ……………………………………………………………………………..6

CapI. Virusul hepatic B

I.1 Epidemiologia infecției virale B 8

I.2 Structura genomică a virusului hepatic B 10

I.3 Mecanisme imunopatogenice în infecția virală B 13

I.3.1 Răspunsul imun celular și umoral 13

I.3.2 Secvențialitatea răspunsului imun 16

I.3.3 Rolul citokinelor………. 17

I.4 Markerii infecției cu virusul hepatic B și semnificația lor 19

I.5 Modalități de evoluție a infecției virale B 21

Cap II. Virusul hepatic D

II.1 Particularități structurale ale virusului hepatic D 23

II.2 Mecanisme etiopatogenice de intervenție ale

virusului hepatic D 24

Cap III. Virusul hepatic C

III.1 Date epidemiologice în infecția cu virusul hepatic C 26

III.2 Particularități structurale ale virusului hepatic C 28

III.3 Răspunsul organismului la infecția cu VHC 29

III.3.1 Rolul răspunsului imun umoral in infecția cu HCV 29

III.3.2 [anonimizat] 30

III.4 Evoluția naturală a infecției cu virusul hepatic C 34

III.4.1. Modalități de evoluție a infecției cu virusul hepatic C ………. 36

2

Cap IV. Hepatitele cronice virale

IV.1 . Definiția și cadrul nosologic 38

IV.2 Semnificația explorărilor paraclinice în hepatitele cronice virale 40

IV.3 Criterii de diagnostic în hepatita cronică virală B 47

IV.4 Diagnosticul la pacienții cu hepatită cronică cu virus D 51

IV.5 Diagnosticul hepatitei cronice virale C 52

IV.6. Factori de prognostic în evoluția hepatitelor cronice virale………..….57

Cap V. Manifestări extrahepatice în hepatitele cronice virale

V.1 Manifestări extrahepatice în hepatita cronică virală B 60

V.2. Hepatita cronică virală C-manifestări extrahepatice……………………… 63

V.2.1. Interferențe virus hepatic C-afectare renală 64

V.2.2.Afectarea vasculară imun mediată 65

V.2.3 Manifestări endocrine 67

V.2.4. Manifestările extrahepatice cutanate 69

V.2.5. Manifestările hematologice 71

V.2.6. Alte manifestări extrahepatice 73

Cap VI Partea specială

VI.1.Obiectivele studiului 75

VI.2. Material și metoda 75

VI.3. Interpretarea statistică a datelor 98

Cap VII. Rezultate

VII.1. Caracteristicile demografice ale pacienților

cu hepatite cronice virale 100

VII.2. Profilul clinic al pacienților cu hepatite cronice virale 101

VII.3. [anonimizat]

3

la pacienții cu hepatite cronice virale 104

VII.3.1.Markerii virali serologici în hepatitele cronice virale 104

VII.3.2 Modificările hemoleucogramei 109

VII.3.3 Sindromul citolitic 111

VII.3.4. Sindromul de colestază 119

VII.3.5. Parametrii sindromului imuno-inflamator 121

VII.4. Profilul manifestărilor extrahepatice………………………………… 141

VII.5. Caracteristici histopatologice și imunohistochimice…………………153

VII.5.1.Hepatita cronică minimal activă 156

VII.5.2.Hepatita cronică ușor activă 158

VII.5.3. Hepatita cronică moderat activă 160

VII.5.4. Hepatita cronică sever activă 162

VII.6. Aspectele histopatologice și imunohistochimice particulare

în hepatita cronică B și C 165

VII.6.1. Hepatita cronică virală B 165

VII.6.2. Hepatita cronică virală C 169

VII.7. Studii imunohistochimice 172

Cap.VIII. Discuția rezultatelor 180

Cap IX. Concluzii……………………………………………………………….. 194

Bibliografie 202

4

Lista de abrevieri

AAN= anticorpi antinucleari

Ac=anticorpi

Ag= antigen

ALAT= alaniltransaminaza

ASAT=aspartattransaminaza

C3= complement

CEM=criglobulinemie esențială mixtă

CIC= complexe imune circulante

GGT= gammaglutamiltranspeptidaza

HAI= activitate necrotico-inflamatorie

VHB=hepatită cronică virală B

HCV=hepatită cronică virală C

HVD=hepatită cronică virală D

IL=interleukină

IFN = interferon

Ly= limfocite

Ly CTL= limfocite citolitice

Ly NK= limfocite natural killer

PBH=puncție biopsie hepatică

PCT=porfiria cutanea tarda

PR=poliartrită reumatoidă

TNFα = factor de necroză tumorală α

TGFβ = transforming growth factor

5

INTRODUCERE

Hepatitele cronice se definesc prin persistența procesului inflamator hepatic timp de cel puțin 6 luni, ca o consecință a unei agresiuni infecțioase sau noninfecțioase. Pe lângă inflamație, este prezentă și alterarea hepatocitelor, inclusiv necroza hepatocitară și fibroza.[1]

Virusurile hepatice B, C și D au risc crescut de cronicizare și determină spectrul hepatitei cronice cu potențial evolutiv spre ciroza hepatică sau carcinom hepatocelular.

Hepatitele cronice virale reprezintă o importanta cauză de morbiditate și mortalitate, datele din literatura estimează o incidența crescută a infecției cu virusul hepatic B și C.

Morbiditatea crescută, procentul mare de cronicizare, numărul mare de decese și implicațiile în alte domenii ale patologiei umane, precum și consecințele majore privind manifestările clinice și complicațiile, reprezintă un interes crescut pentru abordarea diagnostică și terapeutică a acestui domeniu.

Astfel, hepatitele cronice virale reprezintă o problemă majoră de sănătate a lumii contemporane prin cifrele de morbiditate și mortalitate datorate în special complicațiilor: ciroza hepatică, carcinom hepatocelular.

Deasemenea este recunoscută implicarea factorilor imunologici în perpetuarea agresiunii hepatocitare caracteristică hepatitelor cronice virale, prin declanșarea unei reacții imunologice, îndreptate împotriva antigenelor membranei hepatocitare. Este cunoscută intervenția în patogenia bolii, atât a imunității celulare, prin intervenția limfocitelor și celulelor mononucleare din infiltratul portal și periportal cât și a celei umorale prin implicarea anticorpilor tisulari circulanți.

Mecanismele imunologice au rol în apariția manifestărilor extrahepatice, prin depunerea complexelor imune circulante și activarea complementului, fiind însoțite de un tablou clinic polimorf.

Modificările imunologice prezente în hepatitele cronice virale fac adesea dificil diagnosticul diferențial între hepatitele autoimune și cele virale, acestea fiind responsabile de

6

asocierea manifestărilor extrahepatice și de agravarea gradului de afectare hepatică, influențând adesea decizia terapeutică și prognosticul.

Pornind de la aceste ipoteze, studiul prezent își propune identificarea modificărilor imunologice din cadrul hepatitelor cronice virale, implicațiile clinice ale acestora, precum și identificarea unor corelații cu gradul de afectare hepatică. Determinarea acestora, precum și stabilirea unor corelații imunohistochimice, au valoare prognostică și pot fi considerați indicatori de agresivitate necesitând monitorizarea atentă în vederea aprecierii evoluției bolii.

Complexitatea modificărilor bioumorale, imunologice și corelația lor cu modificările anatomopatologice și imunhistochimice, necesită o evaluare minuțioasă ceea ce argumentează studiul nostru.

Lucrarea cuprinde două părți distincte :

partea generală axată pe date recente privind etiopatogenia, mecanismele imunopatologice implicate în cronicizarea bolii, manifestările extrahepatice asociate hepatitelor cronice virale

partea specială, care a urmărit modificările clinice, bioumorale, imunologice și imunohistochimice la pacienții incluși în studiu, evidențiind corelațiile existente între acești parametrii și gradul de afectare hepatică, în vederea stabilirii unor factori de pronostic, cu

valoare predictivă în evoluția bolii.

7

Capitolul I.

VIRUSUL HEPATIC B

I.1 EPIDEMIOLOGIA INFECȚIEI VIRALE B

Infecția cu virusul hepatic B este universal răspândită, deși inegal distribuită la nivel global și reprezintă o problemă majoră de sănătate publică o problemă importantă de sănătate globală. [1] Prevalența infecției virale variază în diferite arii geografice și pe subgrupuri de populații, aproximativ 45% din cei infectați locuind în zone cu prevalență mare [3].

Studiul epidemiologic a stabilit zone cu endemie mică (0,5-2%) – Australia, Europa de Vest, America de Nord, endemie medie (2-7%)- Europa de Est, țările mediteraneene, Orientul apropiat, fosta URSS, și zone cu endemie înaltă (8-15%)- Asia de sud est, Africa subsahariană. Prevalența în Romania este apreciată la 3-5%.

Infecția cu virusul hepatic B determină 60-80% din carcinoamele hepatocelulare, una din cele trei cauze majore de deces în Asia, Africa, Pacific [4]. Carcinomul hepatocelular a înregistrat o creștere a incidenței în întreaga lume, reprezentând azi a cincea cauză de cancer.[2]

Risc crescut pentru infecția virală B pot avea persoanele cu parteneri sexuali multipli sau diagnosticate cu boli cu transmitere sexuală (homosexuali, contacți sexual infectați), narcomanii, persoane din aceeași locuință infectate, nou-născuții din mame infectate, nou-născuții și copiii care au migrat din ariile cu incidență crescută a infecției (Asia, Africa, Alaska și sudul Americii), personalul medical și hemodializații.

SURSA DE INFECȚIE ȘI CĂI DE TRANSMITERE

Sursa de infecție o reprezintă bolnavii în diferite stadii de evoluție a infecției cu VHB: purtători aparent sănătoși de AgHBs, bolnavi cu boală acută clinic manifestă sau infraclinică, purtători convalescenți de AgHBs, bolnavi cu forme cronic evolutive (persistentă; activă), bolnavi cu ciroză sau adenocarcinom hepatic, bolnavi cu manifestări extrahepatice, determinate de complexele imune circulante [5,6]

8

Transmiterea perinatală de la mama purtătoare la făt este cel mai important factor asociat prevalenței mari a infecției în zonele cu endemie înaltă, în special China și Sudul Asiei. Există trei posibilități de transmitere a infecției de la mamă la făt: transplacentar, transmitere directă în timpul nașterii și postnatal, prin laptele matern. La nou-născuți și copiii sub 1 an, care sunt infectați cu virusul hepatic B riscul de a dezvolta infecție cronică este de 90%, datorită cel mai probabil unui sistem imunitar deficitar [6, 7].

Transmiterea pe cale sexuală este frecventă în întreaga lume, în special în zonele cu endemie mică- America de Nord, hepatita cronică virală B fiind considerată una din bolile cu transmitere sexuală.[3,5] Risc mare îl prezintă homosexualii, deși procentul de infectări la populația heterosexuală este în creștere. Factorii de risc sunt durata activității sexuale, numărul de parteneri sexuali, serologia pozitivă pentru sifilis, utilizarea de droguri intravenoase, prostituatele și partenerii acestora [4,5]

Transmiterea parenterală include utilizare de droguri intravenos, transfuzii, dializa, acupunctura, efectuare de tatuaje, utilizare acelor sau a obiectelor tăioase la personalul medical. În Statele Unite și Europa de Vest, administrarea injectabilă a drogurilor rămâne o importantă cale de infecție (23% din pacienți), riscul crescând cu durata injectării drogurilor. [7].

Infecția virală B este o afecțiune cu risc mare de apariție la personalul din domeniul sanitar, studiile serologice evidențiind o prevalență de 10 ori mai mare a infecției cu virusul hepatic B la personalul sanitar comparativ cu populația generală, recomandându-se măsuri suplimentare de protecție și vaccinarea acestuia.[7,8]. Principalele căi de infectare a personalului sanitar sunt:

Inocularea directă percutană prin sânge și derivații săi a virusului, prin înțepare sau tăiere cu instrumentele folosite ;

Inocularea directă prin contact cu sânge și derivați la nivelul tegumentelor, mucoaselor, care prezintă diferite tipuri de leziuni

Inoculare indirectă prin contact cu diferite suprafețe cu sânge sau derivați, la nivel cutaneo-mucos

Sângele prezintă cel mai înalt titru viral și reprezintă cea mai importantă sursă de infectare [8]. Doza minimă infectantă necesară pentru inducerea infecției este foarte mică. S-a constatat că inocularea a 1 ml de plasmă, la diluția de 10-7 induce boala clinic manifestă.

9

Riscul de infecție al derivatelor de sânge este ierarhizat astfel: derivate cu risc mare de contagiune (amestecurile mari de plasmă, concentrate trombocitare, fibrinogenul, crioprecipitatele, complexul protrombinic); derivate cu risc mediu (plasma proaspătă sau conservată prin îngheț, plachetele sanguine, trombină); derivate fără pericol (albumina, globulina, globulinele fracționate cu etanol, hematiile spălate) [8,9]. Majoritatea cazurilor raportate la personalul sanitar a fost înainte de 1991, datorită lipsei vaccinării acestuia, riscul reducându-se major după 1991, cu peste 67%, cel mai frecvent fiind infecții cu antigen HBe negativ [7,8].

Deși antigenul HBs a fost detectat și în laptele matern, bilă, lichid cerebrospinal, salivă, spermă, transpirații, lichid sinovial, concentrația acestuia este de 100-1000 ori mai mare în sânge. Infectarea prin intermediul acelor determină 8-16 milioane de infecții virale B anual, comparativ cu 2,3-4,7 milioane de infecții cu virusul hepatic C [10,11,12].

În zonele cu endemie crescută, cea mai frecventă cale de transmitere o reprezintă cea perinatală, infecția fiind prezentă la preșcolari [1], în timp ce în zonele cu endemie intermediară, transmiterea este perinatală sau orizontală [5]. Calea de transmitere are implicații clinice, transmiterea perinatală asociindu-se cu risc mare de dezvoltare a hepatitei cronice la preșcolari [5]

În zonele cu endemicitate mică, transmiterea infecției se face predominant orizontal, precoce în viața adultului tânăr, consecutiv administrării de droguri intravenos sau prin activități sexuale neprotejate [5]

I.2 STRUCTURA GENOMICĂ VIRUSULUI HEPATIC B

Virusul hepatitei B (VHB) este un ADN virus, din familia Hepadnaviridae, care se replică la nivelul hepatocitelor în principal, dar și la nivelul altor celule cum ar fi celulele mononucleare, epiteliul ductelor biliare, endoteliu, celule acinare pancreatice, glande adrenale, gonade, culturi de măduvă osoasă, rinichi, ganglioni, splină, tiroidă,etc. [12, 13]

Particulele infectante (Dane) conțin un inel de proteine core în plus. În 1965, Blumberg și colaboratorii săi descoperă antigenul de suprafață al virusului hepatic B, cunoscut ca antigen HBs, precum și anticorpii dirijați împotriva acestuia, descoperire pentru

10

care Blumberg a primit în 1977 Premiul Nobel. În 1970, Dane evidențiază particula virală B[14].

Virusul hepatic B este o particulă sferică de aproximativ 42 nm, care conține proteine de suprafață (HBs), core, ADN dublu catenar și ADN polimerază. Genomul viral este alcătuit din patru gene: pol, enve, pre-core și X, codate de ADN-polimeraza. Funcția proteinei X nu este cunoscută pe deplin, însă activarea sa pare să fie în legătură cu dezvoltarea cancerului. [15,16]

Studiile electronomicroscopice au identificat în ser două forme principale:

Virusul incomplet (fig. 2), care este alcătuit din particule sferice (15-25 nm) sau filamentoase (20-22 nm) ce conțin antigenul hepatic de suprafață (AgHBs) și pot

atinge concentrații serice până la 1013 particule/ml.

Structurarea genomului VHB este unică, toate regiunile genomului viral codificând secvențe proteice. Antigenul de înveliș de suprafață – HBs – constituie principalul produs (―major protein‖) al genei S a VHB. În sânge, antigenul HBs circulă ca o

componentă a virionului intact, sau separat, sub formă de particule de 22 nm, sferice sau filamentoase – care reprezintă probabil un exces de sinteză. [15,17].

Antigenul HBs este alcătuit din 2 polipeptide: una de 24 000, cealaltă de 28 000 Da – varianta glicozilată a celei dintâi. Antigenul HBs are mai mulți determinanți antigenici: unul comun pentru toate tipurile de HBs, desemnat cu ―a‖, iar ceilalți doi variabili și pot fi de tip d sau y și w sau r, care determină apariția a 8 subtipuri comune (ayw1, ayw2, ayw4, ayr, adw2, adw4, adr) și alte subtipuri rare, cu diverse repartizări geografice ( de exemplu – în Franța subdeterminantul antigenic major este d, în timpul ce în Grecia este y). Recent au fost identificate și alte specificități, toate fiind markeri epidemiologici adiționali, evoluția clinică și prognosticul fiind independente de acestea [15,16,17]:

gena "S" ce codifică polipeptidul major al AgHBs ,considerat ―proteina majoră‖. Împreuna cu pre-S2 codează o ―proteină medie‖, iar cu ambele regiuni pre-S, o ―proteină mare‖.

regiunea pre-S ce conține:

gena pre-S1 cu rol în recunoașterea VHB de către receptorii hepatocitari. Domeniul pre-S1 determină producerea de anticorpi ce pot fi evidențiați pe parcursul hepatitei acute virale; nivelul seric al Ag pre-S1 se corelează cu gradul replicării VHB și poate fi utilizat în evaluarea clinică a cronicizării

11

infecției.

gena pre-S2 are același rol ca gena pre-S1.

Virusul complet sau particula Dane se găsește în ficat, și mai rar în sânge, are dimensiuni mai mari (42 nm) și două componente:

anvelopa (7 nm), conține proteine sub formă glicozilată sau neglicozilată și are pe suprafață determinanți antigenici HBs. Îndepărtarea anvelopei cu detergenți anionici dezvăluie porțiunea centrală (core).

nucleocapsida (core) este icosaedrică, electronodensă, măsoară 27 nm în diametru și cuprinde, la rândul ei, mai mulți componenți: capsida, ADN polimeraza și genomul [14,15].

Capsida este alcătuită din 180 de capsomere și conține un singur polipeptid, cu greutatea moleculară de 25 kDa, denumit antigen central al virusului – AgHBc – care nu apare liber în sânge, fiind mascat de anvelopă. AgHBc are imunogenicitate înaltă și poate fi găsit, în principal, în nucleul hepatocitului.

În 1972 a fost evidențiat, tot în capsida virionului, un alt antigen, denumit HBe – un polipeptid solubil, care în sânge este legat de imunoglobuline și care reprezintă un polipeptid de glisaj al ADN polimerazei [15].

ADN polimeraza asigură replicarea virală și asigură ―repararea‖ ADN-VHB. Gradul de activitate al ADN polimerazei indică intensitatea replicării virale, deci gradul de infectivitate al serului. Polimeraza virală codifică reverse-transcriptaze, postprimare terminale pentru sinteza ADN și funcția de încapsulare a genomului. În vitro, ADN-polimeraza poate repara forma monocatenară a ADN, refăcând forma bicatenară.

Genomul VHB (fig. 3) este compus din ADN circular parțial bicatenar, partea monocatenară fiind variabilă 25 – 60%.[15,18,19] Având mărimea de numai 3,2 kDa, genomul VHB prezintă două asimetrii structurale remarcabile :

Extremitatea 5' a lanțului (-) este legată covalent de o proteină, iar extremitatea 5' a lanțului (+) este legată de o nucleotidă ARN.

Cele două lanțuri ADN sunt de mărime inegală.

ADN-ul viral parțial dublu catenar are o catenă lungă (L), cu polaritate negativă și o lungime fixă de 3200 nucleotide și o catenă scurtă (S) cu polaritate pozitivă, care reprezintă 15 – 70% din catena lungă. Capacitatea de codare aparține exclusiv catenei lungi, ce cuprinde 4 segmente de citire ORF (opening reading frame), denumite S, C, P și X [17,20]. Cele patru

12

ORF- uri conduc la transcripția și translația a șapte proteine diferite de VHB, prin utilizarea de codoni de start diferiți din interiorul rețelei(inframe start codons).

Gena C și gena pre-C codifică polipeptidul major al capsidei AgHBc și AgHBe. Gena C are doi codoni inițiatori, o regiune pre-core și regiunea core. Dacă este inițiată translația la regiunea pre-core, produsul proteic este AgHBe, care este un semnal peptidic ce se leagă de reticulul endoplasmatic neted și duce la secreția lui în circulație. Dacă translația începe în regiunea core, produsul proteic este AgHBc.[15,20]

Segmentul de citire P este o genă mare care codează pentru ADN polimeraza ARN dependentă.

Zona X – codifică o proteină mică (AgHBx) cu activitate de transactivare a transcripției între genele virale și celulare. Această transactivare poate amplifica replicarea VHB, ducând la asociația observată clinic între produsul genei X ( AgHBx ) și anticorpii corespunzători, la bolnavii cu hepatită cronică severă și carcinom hepatocelular [15,17].

I.3. MECANISME IMUNOPATOGENICE ÎN INFECȚIA VIRALĂ B

I.3.1.RĂSPUNSUL IMUN CELULAR ȘI UMORAL

Virusul hepatic B în forma sa completă prezintă un înveliș extern lipoproteic dublu stratificat și un miez central electronodens (27nm).

Învelișul extern conține antigenul HBs format din trei tipuri de proteine (majoră, mare medie). Miezul conține antigenul HBc, HBe, ADN-ul viral, ADN polimeraza și proteina X.

Majoritatea acestor componente sunt imunogene, astfel că pătrunderea virusului în organismul gazdă, determină apariția unui răspuns imun specific și nonspecific. Virusul se atașează de celule care sunt capabile să îi suporte replicarea, însa secvențele inițiale prin care virusul pătrunde în celulă nu sunt încă cunoscute. În încercarea de a defini un anume receptor pentru VHB s-au identificat o serie de candidați pentru acest rol, printre care apolipoproteina

(apo-H), o apolipoproteina H modificată, albumina serică poliumană, fibronectina, IL-6, recent descoperindu-se o proteină GP180 care pare să interacționeze cu domeniul pre-S1 al virusului și o proteina de 80 kDa care se leagă de diferite componente ale virusului.[18,20]

13

Studiile existente sugerează că VHB nu are un efect direct citopatic, astfel încât, leziunile hepatice ar putea fi induse de activarea sistemului imun mai mult decât de acțiunea directă a virusului. Această ipoteză a fost susținută prin studiile in vitro care nu au arătat nici un efect al virusului asupra culturilor viabile de hepatocite infectate cu virus hepatic B. Efect citopatic direct ar avea mutanții pre-core, acestea beneficiind de o replicare crescută față de tulpinile virale sălbatice, având și un genom mai stabil. [20,21]

Dovada faptului ca virusul nu are efect citopatic direct, sunt purtătorii cronici de virus fără leziuni hepatice.

În boala acută leziunile hepatice se produc prin mecanisme imunologice, sistemul imun fiind activat cu aproximativ o lună înaintea apariției leziunilor hepatice. În ordine cronologică se produc: sensibilizarea limfocitelor T anti-pre S, activarea limfocitelor T anti-antigen HBc, apariția anticorpilor IgM anti –HBc. Astfel, creșterea nivelurilor serice ale ALT, semn al instalării leziunilor hepatocitare se combină cel mai bine cu sensibilizarea limfocitelor T anti-preS, ceea ce argumentează importanța antigenelor S și a imunității mediate celular în patogenia hepatitei acute virale B.

În distrucția hepatocitară, imunitatea umorală nu intervine direct, dar anticorpii specifici față de antigenele virale (anti-HBs, anti-Hbe și anti-HBc) au rol în limitarea infecției, în apariția manifestărilor extrahepatice din debutul hepatitei acute și în evoluția infecției.

Prima dată apar în ser ADN-ul viral și ADN polimeraza, câteva săptămâni mai târziu apar în ser antigenul HBc și antigenul HBe. Antigenul HBs apare apoi în ser, simptomele apărând la 1-6 săptămâni. În majoritatea cazurilor sistemul imun continuă să lupte până la dispariția antigenului HBe. [34]

14

Figura nr. 1 Markeri serologici ai infecției virale B [CDC]

Anticorpii anti HBc (Anti-HBc) sunt detectați prima dată la 8 săptămâni după infecția cu VHB; sunt anticorpi dirijați împotriva proteinelor core. Inițial sunt de tip Ig M și Ig G, și sunt depistați după apariția antigenului HBs, dar frecvent înainte de creșterea nivelurilor de ALT. Acești anticorpi nu au capacitate neutralizantă, cei persistenți în ser sunt predominant de tip Ig G, prezența celor de tip Ig M indică de obicei o infecție acută.[35,36]

Anticorpii anti HBe apar în mod normal după câteva săptămâni de la infecție, se asociază cu un prognostic bun.

Anticorpii anti HBs – sunt în general ultimii care apar, pot neutraliza virusul,

și reprezintă un indicator că infecția inițială a fost îndepărtată. Pot fi induși și prin

vaccinare.[37, 38]

Persistența infecției cu VHB se produce probabil prin mecanisme de șuntare a răspunsului imun al gazdei prin instalarea intoleranței imune cu apariția unor mutanți rezistenți imunologic sau prin antagonizarea unor citokine.

Cu siguranță, la persistența infecției virale, un rol important revine și unor deficiențe în mecanismele de apărare ale gazdei și anume creșterea activității celulelor T supresoare, diminuarea limfocitelor Th, scăderea producției de interferon.

15

1.3.2. SECVENȚIALITATEA RĂSPUNSULUI IMUN

Pătrunderea virusului în organismul gazdă va stimula sistemul imunitar al organismului, al cărui răspuns va determina leziuni hepatice, prin intermediul unui răspuns imun celular dirijat împotriva proteinelor virale și în special împotriva antigenului HBs prezent la suprafața hepatocitelor.[21] Deoarece implicarea răspunsului imun specific necesită o perioadă lungă de timp, inițial sunt implicate mecanismele imune non-specifice, reprezentate de limfocitele NK non-specifice, care distrug hepatocitele infectate și secretă IFN γ. Acesta are efect antiviral, intervenind și în secreția altor citokine, cu activarea limfocitelor NK și creșterea răspunsul citolitic indus de moleculele CMH clasa I ce vin în contact cu hepatocitele, facilitând distrucția celulară. [22,23]

Hepatocitele infectate secretă interferon α și β, ambele responsabile de activarea sistemului imun celular nonspecific reprezentat de implicarea macrofagelor, celulelor NK. [23,24] Citokinele eliberate de aceste celule vor stimula expresia antigenelor de pe suprafața celulelor infectate, care vor veni în contact cu moleculele de CMH clasa I. Celulele non-T reprezintă principala populație celulară identificată în ficatul infectat înainte de apariția manifestărilor clinice. În această fază nivelul hepatic al ADN-ului viral tinde să crească, dar pacientul rămâne asimptomatic, transaminazele având valori normale [24,25].

Răspunsul imun nespecific nu realizează îndepărtarea completă a virusului, astfel încât, în următoarele zile se activează sistemul imun specific. Limfocitul T are rol central în patogenie, interferența acestuia cu antigenele virale fiind directă (prin intermediul TCR) sau mediat de celulele prezentatoare de antigen (APC). Acestea prelucrează antigenele virale până la peptide, care apoi se cuplează cu moleculele self ale CMH clasa I și II. Limfocitele T (Th1/Th2) recunosc antigenele după cuplarea acestuia cu CMH. Receptorul CD4 + recunoaște o porțiune constantă din molecula de CMH clasa II de pe APC, fiind implicat în activarea celulară.[24, 26, 27]

Celulele T CD8+ și moleculele HLA clasa I recunosc peptidele virale obținute prin fragmentarea intracelulară a particulelor virale și exprimate la suprafața hepatocitelor, se activează astfel activitatea citotoxică a limfocitelor TCD 8+ cu ajutorul citokinelor, ganzinelor și perforinelor. Recent studiile au sugerat natura polimorfă a complexului major de histocompatibilitate.[ 25,27]

Limfocitele CD4+ legate de HLA clasa II recunosc peptidele virale fragmentate, fixate de APC non-hepatice, reprezentate în principal de macrofage. Identificarea epitopilor

16

proteici virali de către celulele CD4+, stimulează proliferarea celulelor T și sinteza citokinelor. în anumite situații, celulele CD4+ pot avea activitate citotoxică. [26,27]

Răspunsul imun inițiat de celula T , ca răspuns la prezența antigenelor virale, pare să fie fundamental pentru clearance-ul viral și patogenia infecției virale. Răspunsul celulelor T în hepatitele acute virale B autolimitate este un răspuns consistent, policlonal, multispecific, citotoxic și helper. La purtătorii cronici de VHB, care nu sunt capabili să elimine virusul, acest răspuns e slab și nedetectabil.[ 26-28]

I.3.3. ROLUL CITOKINELOR

Citokinele joacă un rol important în infecțiile virale, fie direct prin inhibarea replicării virale, fie indirect prin diferite tipuri de pattern-uri. Ele par să fie implicate și în apariția leziunilor hepatice. Sunt molecule mici, secretate de diferite celule, implicate în răspunsul de apărare al organismului împotriva infecțiilor virale. Odată pătruns virusul în celulă, răspunsul sistemului imunitar este prompt. Celulele CD4+ și CD8+ sunt activate și intervin în citoliza și secreția de citokine. Citokinele produse de limfocitele CD4+ joacă rol important în răspunsul imun celular. In anumite condiții, celulele CD8+ pot produce și ele citokine.[27, 29]

Inițial, se sintetizează IL-4 și IFN γ,citokine ce alcătuiesc pattern-ul de tip 0. Tipul 1 se caracterizează prin secreția de IL-2 și IFN γ, cu rol în declanșarea și menținerea imunității celulare specific antigenică. Tipul 2 se caracterizează prin prezența citokinelor de tip IL-4, IL-5, IL-10, cu rol în răspunsul imun umoral. Pattern-ul de tip 0 se poate transforma în tip 1 sau 2, în funcție de diferiți factori de activare. Prezența IFN γ, IL-12, TGF- β pot duce la stimularea pattern-ului de tip 1, în timp ce IL4, IL-10 pot stimula sinteza pattern-ului tip 2.[ 28, 29]

IL-4 și IL –10 inhibă tipul 1 de răspuns. In general, citokinele de tip 0 sunt produse de celulele non T. Citokinele produse de APC ca IL-2, TNF- α, IL-6 pot activa proliferarea celulelor T CD4+. In infecțiile virale, citokinele tip I par a avea un rol imunoprotector puternic.[29, 30]

Limfocitele T-CTL pot produce și ele citokine ca IFN- γ, și TNF- α, Celulele prezentatoare de antigen, ca macrofagele și celulele Kuppfer pot produce IL-12, după infecția virală, care va activa celulele NK , care, vor prolifera și vor produce și ele citokine, în special IFN γ. [30]

17

Citokinele au efect chemotactic local cu activarea celulelor proinflamatorii, inhibă regenerarea hepatocitelor, favorizează apoptoza și inhibă replicarea virală, prin degradarea ADN-ului viral intrahepatocitar.

Celulele T citolitice își exercită efectul apoptotic prin interacțiunea FasL-Fas, iar corpii apoptotici rezultați devin ținta celulelor prezentatoare de antigen care îi fagocitează. [30, 31]

Tabel nr. 1 Variante de hepatocit-virus

RĂSPUNSUL IMUN

CELULAR INDUS DE VIRUS

MANIFESTĂRI CLINICE

Liza celulară

Disfuncție celulară

Stimularea răspunsului imun al

gazdei

Multiplicare virală fără leziuni celulare

Insuficiența hepatică fulminantă

Hepatita acută sau cronică

Hepatita acută sau cronică

Purtător cronic

Infecția cronică cu VHB are un stadiu de replicare (ADN-VHB prezent intrahepatocitar, extracromozomial, antigen HBe prezent, imunologic prezintă stadiul de clearance imun cu creșterea limfocitelor T CD3+ și citotoxice CD8+ în spațiile portale, exprimarea antigenelor virale la nivel hepatocitar), stadiul de integrare caracterizat prin absența în ser a markerilor de replicare, antigen HBe absent, ADN viral nedetectabil , anticorpi anti HBe prezenți, infiltrat inflamator portal cu predominanța limfocitelor T CD4+ și B.[31, 32, 33]

18

I.4. MARKERII INFECTIEI CU VIRUSUL HEPATIC B ȘI SEMNIFICAȚIA

LOR

Diagnosticul hepatitei cronice virale B a cunoscut un progres important odată cu descoperirea antigenului Australia, numit și antigenul de suprafață HBs, și ulterior prin noile tehnici biologice de hibridizare și polymerase chain reaction (PCR) care determină prezența ADN virusului. Diagnosticul mai cuprinde și identificarea antigenului HBs sau HBc prin tehnici imunohistochimice, pe preparatele de biopsie hepatică [35, 36] Diagnosticul serologic se bazează pe identificarea de modificări ale antigenelor și anticorpilor antivirali .

Tabel nr. 2 Diagnosticul serologic al hepatitei cronice virale B

Antigenul HBs este emblema serologică a infecției cu virusul B, se poate determina prin metode radioimmunoassays (RIA) sau enzyme immunoassays (EIA) și apare în ser la 1-10 săptămâni după infectarea acută. Persistența acestuia peste 6 luni în ser definește infecția cronică, clearance-ul acestuia survenind la 0,5%/an, din populația infectată. Pacienții cu afectare cronică prezintă antigen HBs și anticorpi anti HBc (IgG) toată viața. Deși mulți pacienți pot fi asimptomatici, ei pot dezvolta hepatită cronică, ciroză hepatică sau carcinom hepatocelular [34, 35].

Prezența continuă a antigenului HBe se asociază cu nivel seric crescut al ADN-ului viral și leziuni hepatice mai severe. Unii pacienți pot prezenta absența antigenului HBe și prezența anticorpilor anti-HBe, corelându-se cu nivel scăzut al viremiei și valori normale ale transaminazelor. Peste 70% din pacienții cu anticorpi anti HBe asociază prezența serică a ADN-ului viral la 1000-100000 molecule/ml. [36]

19

Pacienții cu antigen HBe prezent și nivel seric al ADN-ului viral mai mare de 105 copii/ml, cu transaminaze normale sunt considerați a fi în faza de toleranță imună, nu necesită tratament antiviral dar se recomandă determinarea la 3-6 luni a valorilor transaminazelor serice. Dacă acestea sunt crescute de peste 2 ori nivelul superior al valorilor normale se indică biopsie hepatică în vederea inițierii tratamentului antiviral.[38, 39]. Unii pacienți prezintă absența antigenului HBe, nivel crescut al transaminazelor și valori crescute ale transaminazelor, sugerând prezența mutațiilor core sau precore. Hepatita cronică virală B antigen HBe negativă se caracterizează prin prezența antigenului HBs, absența antigenului HBe, prezența anticorpilor anti HBe, nivel crescut persistent sau intermitent al transaminazelor, nivel seric detectabil al ADN-ului viral, activitate necroinflamatorie prezentă, fără alte cauze care să determine lezarea hepatică și fără ciroză. Profilul serologic al acestor pacienți este asemănător cu cel al purtătorilor sănătoși.[39]

Pacienții considerați purtători inactivi de antigen HBs necesită monitorizarea nivelului seric al ALT la fiecare 6-12 luni. Dacă valorile acestora sunt crescute, dar sub valori de 2 ori superioare normalului, trebuie stabilit nivelul seric al ADN-ului viral și alte cauze de afectare hepatică. Dacă însă valorile ALT sunt de cel puțin 2 ori nivelul superior al normalului, iar ADN-ul viral peste 105 copii/ml, se recomandă biopsia hepatică în vederea tratamentului antiviral. [38, 39]

În cursul infecției virale cronice există trei faze de replicare virală.

Faza înalt replicativă – se asociază cu prezența antigenului HBs, HBe și ADN viral detectabil, creșterea transaminazelor, modificări moderate ale activității necrotico-inflamatorii, riscul de dezvoltare al cirozei fiind crescut.

Faza slab replicativă – se caracterizează prin pierderea antigenului HBe, titru viral redus, apariția anticorpilor anti-HBe, scăderea activității inflamatorii hepatice și normalizarea transaminazelor. Această fază este denumită și ―seroconversie―.

Faza nonreplicativă- caracterizată prin absența markerilor virali de replicare, diminuarea inflamației hepatice sau activitate necroinflamatorie absentă.

Deși biopsia hepatică este adesea indicată la pacienții cu hepatită cronică virală B, modificările histologice constatate nu influențează managementul bolii, însă poate furniza

20

date despre pacienții aflați deja în stadiul de ciroză sau despre gradul de progresie al bolii, iar în unele cazuri poate prezice răspunsul la terapia antivirală.[39, 45]

I.5. MODALITĂȚI DE EVOLUȚIE A INFECȚIEI VIRALE B

Hepatita acută virală B apare după o perioadă de incubație de 45-180 de zile (simptomatice/asimptomatice), persoanele infectate prezentând markeri pentru infecția virală B (antigen HBs, anticorpi anti HBc-IgM și posibil antigenul HBe). Boala se poate asocia cu icter la aproximativ 50% din adolescenți și adulți, anorexie, grețuri, vărsături, simptome pseudogripale, astenie fizică sau poate trece neobservată, asociindu-se cu un procent de decese de 10-15% la vârstnici. Examinarea fizică poate varia de la anomalii minime nespecifice, la hepatomegalie, icter, sau prezența unor manifestări extrahepatice imun-mediate de tip vasculită, artrite, glomerulonefrite, poliartrita nodoasă. Majoritatea pacienților au capacitatea imunologică de a elimina virusul, doar 5% din cei infectați dezvoltând o hepatită cronică virală B, adeseori asimptomatică. Un procent redus de pacienți prezintă o evoluție fulminantă.[34, 37]

Antigenul HBs este primul marker serologic și poate fi detectat la 2-12 săptămâni de la infecție. Prezența acestuia precede adesea simptomatologia și modificările testelor hepatice.

Detectarea anticorpilor anti HBc de tip IgM se poate face la 2 săptămâni de la prezența în ser a antigenului HBs și rămân detectabili până la 6 luni. Prezența acestora alături de antigenul HBs permite diagnosticul de hepatită acută virală B. Antigenul HBe este prezent la pacienții cu hepatită acută dacă titrul viral este foarte înalt.

Infecția cronică este definită ca persistența în ser a antigenului HBs cel puțin 6 luni [31], majoritatea pacienților infectați cronic prezentând titruri peste 1 µg/ml [32]. Infecția cronică definită astfel poate cuprinde un spectru larg de modificări virologice sau patogenice, debutând când răspunsul imunologic este prea slab pentru a proteja organismul de infecție, astfel că se constată la copii <1an de la expunere și la persoanele imunodeprimate. Infecția apare de asemenea la aproximativ 5% dintre adulți.[38, 39]

Purtătorii sănătoși de antigen HBs nu prezintă virusul evidențiabil prin metodele de hibridizare convenționale ( >105 – 106 /ml de ser) și nu au semne de afectare hepatică (infiltrat leucocitar sau distrucție activă hepatocitară).[35]

21

Pacienții cu nivel viral înalt (109 – 1010/ml) prezintă răspuns imunologic scăzut împotriva antigenelor virale și o activitate scăzută, în timp ce cei cu nivel viral scăzut asociază o activitate hepatică înaltă [35, 36].

Prognosticul pentru persoanele infectate este destul de rezervat, 10-25% dintre aceștia dezvoltând ciroză hepatică sau hepatocarcinom [38], un număr redus de pacienți decedează sau necesită urgent transplant hepatic ca urmare a unei evoluții fulminante [39, 40]

Majoritatea pacienților infectați cronic precoce în cursul vieții au un procent redus de decese prin ciroză sau cancer hepatic [41, 42]. Unele studii efectuate în China au arătat că prezența cancerului hepatic se asociază cu istoric familial sau cu modificarea unor gene (glutathione S-transferaza M1) [42]. Un al factor de risc pentru prezența cancerului hepatic sau al cirozei hepatice este titrul înalt al replicării virale, aceasta asociindu-se cu vârsta înaintată [43].

Studiile epidemiologice au arătat că modificările la nivelul genelor myc sunt asociate cu riscul de apariție a cancerului hepatic, un factor important reprezentându-l regenerarea celulară și în special a hepatocitelor, ca o consecință a răspunsului imun al gazdei la prezența virusului [43]. Prezența genei X virale poate modifica creșterea celulară, însă studiile au evidențiat că nu există o relație directă între prezența doar a acestei gene și carcinogeneza [44,45].

22

Capitolul II

VIRUSUL HEPATIC D

II.1. PARTICULARITĂȚI STRUCTURALE ALE VIRUSULUI HEPATIC D

În 1977, Mario Rizzeto și colaboratorii săi , descoperă prin imunofluorescență, la pacienții cu hepatită cronică virală B, un nou antigen, diferit de cel de suprafață, core sau cel din sistemul e, și l-au numit ―antigen delta‖ [45, 46], fiind similar cu antigenul core. Ulterior s-a observat că acesta era prezent doar la pacienții care prezentau antigenul HBs, ridicându-se suspiciunea că este un virus diferit de cel hepatic B.

Aproximativ 5% din pacienții cu hepatită cronică virală B prezintă infecție cu virusul hepatic D.

Infecția virală D este asociată infecției virale B, fiind prezentă în întreaga lume, însă prevalența variază în funcție de ariile geografice. Infecția cu virusul D este foarte rară în partea estică a Asiei, însă este frecventă în țările arabe, România și la populațiile indiene din America de Sud.

În Europa și în SUA, infecția este mai frecventă la pacienții cu risc înalt: hemofilici, la cei care utilizează droguri intravenos, cei cu parteneri sexuali multipli, copii născuți din mame infectate.

La pacienții cu hepatită cronică sau ciroză hepatică, prevalența infecției virale D variază între 8.1% și 19%.[46]

Virusul hepatic D este un ARN virus, de 37 nm, cu cel mai mic genom, care necesită pentru replicare prezența virusului hepatic B. Este alcătuit dintr-un ARN monocatenar închis covalent, o proteină structurală și un înveliș ajutător al virusului hepatic B. Antigenul viral delta este o fosfoproteină alcătuită din două polipeptide cross-reactive, capabile de a lega ARN-ul viral. Genomul viral este alcătuit din 1682-1685 de nucleotide, pentru genotipul II și din 1676 de nucleotide pentru genotipul IV. Nucleocapsida este alcătuită dintr-un antigen HD-S și un antigen HD-L, cu roluri diferite în ciclul viral care include clivajul ARN-ului de către ribozomi [45]. Se consideră că sunt prezente 3 genotipuri virale. Recent însă cercetătorii au descris 7 genotipuri virale, subclasa genotipului IIb, IIb-M corelându-se cu progresia afectării hepatice.[45,46]. Noile date experimentale au demonstrat că replicarea ARN-ului în cazul infecției cu genotipul II este mai redusă decât în cea cu genotipul I, ceea

23

ce ar însemna că infecția cu genotipul II ar implica alte mecanisme patologice ce stau la baza manifestărilor clinice [47].

II.2. MECANISME ETIOPATOGENICE DE INTERVENTIE ALE VIRUSULUI HEPATIC D

Virusul hepatic D folosește anvelopa virusului hepatic B pentru a disemina intrahepatocitar, producând leziuni după modelul mecanismelor implicate în afectarea hepatică de către virusul hepatic B.[47]

Infecția cu virusul D se asociază cu hepatite acute sau cronice, numai în prezența hepatitei virale B. Mecanismele patogenice implică interacțiunea VHD-VHB, precum și factori ce țin de gazdă. Leziunile hepatice se pot datora efectului citopatic direct al virusului, comparativ cu virusul B unde, leziunile hepatice sunt produse cel mai adesea prin mecanism imunologic. VHD poate persista în ficat/sânge timp îndelungat (luni/ani) și se pare că inhibă replicarea VHB. Prezența virusului hepatic D se află în raport de coinfecție sau suprainfecție cu virusul hepatic B.[51, 52]

COINFECȚIA se definește prin infectarea simultană cu virusului hepatic B și D, fiind responsabilă de 1% din episoadele de hepatită acută fulminantă. Pacienții au două peak-uri ale transaminazelor, primul determinat de virusul B și al doilea, la câteva săptămâni, determinat de virusul D. Doar 2,4-4,7% dintre cei ce fac episod acut, se vor croniciza.[52].

Figura nr. 2 Evoluția serologică a coinfecției VHB-HDV [CDC]

24

SUPRAINFECȚIA se definește prin infectarea cu virusul D la un pacient cunoscut cu infecție virală B, 50-70% dintre aceștia dezvoltând forme severe de hepatită acută, 90% dintre acestea cronicizându-se.[ 47] Suprainfecția VHD coincide cu decelarea Ac anti-HD IgM și IgG în ser și ficat.

Hepatita cronică D este aproape exclusiv consecința suprainfecției. Ag HD și ARN-VHD se decelează în ficatul tuturor pacienților în stadiul evolutiv al infecției VHD. [47,52]

Replicarea virusului hepatic D pare să aibă loc la nivelul nucleului hepatocitar, aceste ipoteze fiind susținute și de detectarea antigenului delta, precum și a ARN-ului viral la nivelul nucleului hepatocitar. După inițierea replicării genomului viral, proteinele părăsesc nucleolul, localizându-se preferențial în nucleoplasmă. In timpul replicării genomului viral apar diferite forme de proteine cu dimensiuni reduse care conțin antigenul delta.[48]

Rămâne destul de controversat dacă virusul D este direct citopatic la nivel hepatic; în anumite studii experimentale, prezența proteinelor virale a determinat o scădere a factorului de creștere celular și toxicitate, crescând frecvența apoptozei.[49]

Infecția cu virusul hepatic D determină leziuni hepatice mai severe (de tipul necroză și inflamație) comparativ cu infecția doar cu virusul hepatic B.

Genomul viral delta nu pare direct citopatic, dar răspunsul imun pare să determine aceste leziuni. Studiile recente au evidențiat că, mecanismele de intervenție patogenică sunt la fel ca și în infecția cu VHB, în infecția cu VHD, rol important îl dețin limfocitele TH1 și TH2. Prezența virusului D determină proliferarea celulelor mononucleare și sinteza de citokine, cu activarea limfocitelor NK și T-CD8+.[49, 50]

Limfocitele CD8+ recunosc receptorul celular T sintetizat de antigenele virale, acestea fiind procesate într-un compartiment citosolic și determinând sinteza de peptide translocate la nivelul reticulului endoplasmatic unde se leagă de moleculele de clasa I cu rol în stimularea limfocitelor CTL. Secvențial, acestea vor determina fragmentarea ADN-ului și apoptoza celulară prin intermediul granzimelor și perforinelor. Limfocitele CD4+, CD8+ și CTL participă la clearance-ul viral.[49,50]

Limfocitele CD4+ joacă rol important în infecțiile virale identificându-se 3 subpopulații : TH1, TH0 și TH2, cu rol important în realizarea injuriei hepatocitare prin intermediul citokinelor secretate [50]. Un titru înalt de anticorpi anti VHD-IgM pare a se corela cu viremia înaltă și afectare severă hepatică, în timp ce un titru înalt de anticorpi anti VHD-IgG pare a se asocia cu o evoluție mai favorabilă [48, 50]

25

Capitolul III

VIRUSUL HEPATIC C

III.1. DATE EPIDEMIOLOGICE IN INFECȚIA CU VIRUSUL HEPATIC C

Infecția virală asociază o mortalitate și o morbiditate semnificativă, fiind cauză majoră de ciroză hepatică și carcinom hepatocelular.[53, 54]

VHC este o cauză majoră de afectare hepatică în întreaga lume, numărul persoanelor infectate cu VHC fiind estimat la 350-400 milioane. În România prevalența anticorpilor anti VHC în populația sănătoasă este în jur de 10%[53]. Virusul hepatic C a fost identificat în 1989, fiind răspunzător de 80% din hepatitele virale nonA, non-B. Face parte din grupul Hepacivirus, familia Flaviviridaee, alături de virusul febrei galbene și al pestei animale, fiind capabil să inducă infecții persistente la gazdele susceptibile, prin transmitere sexuală, parenterală, percutană, mecanismele ce stau la baza infecției fiind incomplet cunoscute.

Infecția cronică cu virusul hepatic C afectează aproximativ 170 milioane de oameni din întreaga lume, având o prevalență cuprinsă între 1-4,9% [53]. Geografic, distribuția infecției virale C este împărțită în:

zona de endemie redusa (<2%): Marea Britanie, tarile scandinave (0,1-0,5%), tarile din Europa de Vest, SUA, Australia (0,4%), Canada (0,4-1,4%), Republica Sud-Africana;

zona de endemie medie (2-5%): Europa de Est, Republica Moldova, Bazinul M. Mediterane, Brazilia, Orientul Mijlociu, India, China;

zona de endemie înalta (>5%): Libia >7%. Majoritatea infecțiilor sunt asimptomatice, însă se apreciază că procentul de infecții acute a scăzut după 1990 [53, 54]. Prevalența infecției variază cu sexul, rasa și nivelul socio-economic, procentul cel mai

mic (0,5%) fiind înregistrat la donatorii voluntari de sânge [54]. O prevalență mare o au persoanele cu vârste între 30-40 de ani (3-4%) și negrii (9-10%). [54]. În prezent 40-60% din pacienții cu afectare hepatică cronică sunt infectați cu virusul hepatic C [55].

Sursa de infecție o reprezintă bolnavii în diferite stadii de evoluție a infecției cu VHC: bolnavi cu boală acută clinic manifestă sau infraclinică, bolnavi cu hepatită cronică virală C, bolnavi cu hepatită cronică "asimptomatică" virală C, bolnavi cu ciroză virală C sau

26

adenocarcinom hepatic, bolnavi cu forme nehepatice de infecție, cu manifestări de tip complexe imune –vasculită crioglobulinemică.

Virusul hepatic C a fost izolat din sânge, salivă, urină, lichid spermatic și din lichidul de ascită. Studiile privind incidența și prevalența infecției au demonstrat că aceasta se asociază cu factori de risc reprezentați de: transfuzii, administrarea intravenoasă de droguri, personalul sanitar care vine în contact cu sângele și derivații acestuia, contact sexual cu o persoană infectată, parteneri sexuali multiplii, nivel socio-economic scăzut [55]

Aproximativ 10-20% din pacienții cu infecție cronică neagă prezența oricărui factor de risc [55]

Virusul hepatic C se transmite în principal prin sânge și derivații acestuia, prin expunere directă cutaneo-mucoasă. Expunerea directă include transfuzii cu produși din sânge infectat, prin administrarea unor medicamente parenteral, prin transplant de organe de la persoane infectate sau prin intermediul instrumentarului tăios la personalul sanitar. Hemofilicii primesc frecvent transfuzii care poate favoriza transmiterea virusului hepatic C, însă nu s-a raportat prezența riscului la administrarea de factor concentrat recombinat sau la albumina umană

Administrarea de imunoglobuline intravenos se asociază deasemenea cu risc crescut de

infecție.

Riscul de infectare prin contact sexual rămâne destul de controversat, fiind redus la 0-0,6%/an la persoanele monogame și de 1% la cei cu relații multiple.

Transmiterea verticală de la mamă la făt se asociază cu un risc de 5%, însă este mai mare la mamele care sunt coinfectate cu HIV. Nu s-a demonstrat o relație între virus și alăptare.[55, 56]

Infecțiile nosocomiale cu HCV pot fi responsabile de transmiterea virusului atunci când nu sunt folosite tehnici adecvate de dezinfecție sau sterilizare. Un risc de infecție îl au și pacienții aflați în hemodializă.[54,56]. Incidența infecției la hemodializați este în scădere, probabil datorită metodelor de screening și testelor de control din unitățile de hemodializă.

27

III.2 PARTICULARITĂȚI STRUCTURALE ALE VIRUSULUI HEPATIC C

Virusul hepatic C (VHC) prezintă un înveliș de proteine glicozilate E1 și E2, un miez proteic reprezentat de o nucleocapsidă și genomul viral ARN. Genomul viral este reprezentat de un lanț ARN monocatenar cu polaritate pozitivă și aproximativ 9600 nucleotide, ce codifică o proteină de aproximativ 3000 aminoacizi, cu o porțiune N terminală ce conține proteine structurale și o porțiune C terminală ce conține proteine non-structurale.[57]

Proteinele structurale includ cele două proteine ale învelișului (E1, E2) și proteinele core;cele non-structurale(NS 2, NS3, NS4, NS5) , includ proteaze, helicaze (ce rup lanțurile duble de acizi nucleici), ARN polimeraza ARN dependenta (NS5B) ce ar avea diferite funcții esențiale ciclului viral.[56, 57]

În prezent se cunosc 6 genotipuri de HCV, fiecare cu diferite subtipuri. Este evident ca indivizii infectați cu un anume genotip sau subtip au un răspuns variabil la terapia antivirala, genotipurile 2 și 3 răspunzând mai bine decât tipul 1. Majoritatea pacienților au infecție cu un singur genotip/subtip, însa s-au constatat și cazuri când unde s-au asociat 2 sau mai multe genotipuri/subtipuri, semnificația clinica a cestora fiind încă incerta. [57, 58]

Virusul hepatic C pătrunde în hepatocit și se replică la nivelul citoplasmei. Rata de producție zilnică și clearance-ul viral pot ajunge la 1012 copii. Unele studii sugerează că HCV poate infecta și alte celule, printre care limfocitul B, dar modul de replicare virală rămâne încă neclar. HCV este un virus noncitopatic, mecanismele patogenice ale infecției fiind însă insuficient cunoscute. Complexele imune circulante par să joace un rol esențial în patogenie, și să fie decisive pentru apariția inflamației hepatice, distrucției hepatocitare, fibrogenezei, carcinogenezei, și apariția manifestărilor extrahepatice. [59, 60]

28

III.3 RĂSPUNSUL ORGANISMULUI LA INFECȚIA CU VHC

3.1. ROLUL RĂSPUNSULUI IMUN UMORAL ÎN INFECȚIA CU HCV

Aproximativ 80-90% din indivizii infectați dezvoltă o infecție persistentă, după o hepatită acută virală, majoritatea acestora fiind asimptomatici sau cu simptome ușoare ce pot fi trecute cu vederea. In fața infecției virale, organismul răspunde prin implicarea mecanismelor imune umorale și celulare [59]

Răspunsul imun umoral este reprezentat de anticorpii anti HCV specifici, sintetizați de limfocitele B, care pot lega și neutraliza virioni (anticorpi neutralizanți). Celulele B activate, prezente în agregatele limfoide hepatice, sintetizează anticorpi împotriva proteinelor structurale și non-structurale. Anticorpii dirijați împotriva proteinelor de înveliș (E1, E2) au capacitate neutralizantă, dar persistența infecției virale sugerează că au o capacitate insuficientă de neutralizare. O explicație ar putea fi diversitatea de tipuri virale care ar putea ― scăpa‖de controlul umoral imun [60, 61]

Mecanismul imun umoral discret mediat imunologic este conturat de prezența unor anticorpi ca cei antiGOR, anti LKM1, ANCA, și alții.

Este bine știut că răspunsul imun specific la orice infecție virală este inițiat de macrofage și celulele dendritice (APC), care prezintă proteinele virale celulelor B, T, T citolitice. Celulele B produc anticorpi care pot neutraliza virusul și pot induce imunitatea de durată, protejând împotriva infecției. [60, 62]

Nu există nici o evidență că, răspunsul imun umoral ar avea rol în patogenia bolilor hepatice virale C, însă au rol important în apariția manifestărilor extrahepatice. De exemplu, în apariția crioglobulinemiei mixte, rol important ar avea complexele imune circulante ce conțin IgG și FR .[63]

S-a constatat prezența anticorpilor anti-GOR reactivi față de proteinele capsidei virale și față de un component nuclear al gazdei, la unii din pacienții cu hepatite cronice virale C și forme de hepatită autoimună. Epitopul GOR este recunoscut de anticorpii anti-GOR întâlniți în hepatita cronică virală C. Aceștia apar precoce în cursul infecției virale și dispar odată cu încetarea replicării virale. Anticorpii anti-GOR sunt dirijați și împotriva unor componente ale capsidei virale și a unui component nuclear al gazdei datorită probabil unei similitudini structurale. Este posibil ca în cursul infecției virale să fie stimulată gena GOR care produce o proteină nucleară responsabilă de leziunea hepatocitară.

29

De asemenea au fost depistați și alți anticorpi cu rol în patogenia bolii, ca anticorpii anti-asialoglicoproteine, antitiroidieni, antimitocondriali, antiactină, anti LKM1 [61,63].

Anticorpii anti LKM1 sunt dirijați împotriva citocromului P450 2D6 și sunt întâlniți în aproximativ 5% din pacienții cu HCV, fiind implicați în mecanismele imunologice datorită mimetismului molecular între proteinele virale și citocromul P450 2D6. [61]

Anticorpii anti-asialoglicoproteină sunt anticorpi anti-IgG, dirijați împotriva unui autoantigen specific hepatic, cu rol de receptor. Ei apar frecvent în hepatitele autoimune, însă au putut fi identificați și la pacienții cu VHC. Pe de altă parte, unele ipoteze susțin că glicoproteinele E1și E2 au rol de asialoglicoproteine. Noile studii susțin că virusul hepatic C ar pătrunde în hepatocit prin intermediul receptorului asialoglicoproteic. Prezența acestor anticorpi se asociază cu afectare severă hepatică.

Anticorpii anti fibră musculară netedă (ASMA) reprezintă un marker de diagnostic la pacienții cu hepatită autoimună, însă au fost detectați și la un procent redus din pacienții cu HCV. Anticorpii de tip Ig G anticapsida sunt un subtip al anticorpilor ASMA și pot fi descoperiți la 4-6 săptămâni de la debutul infecției reprezentând un marker sensibil al infecției, în timp ce IgM se asociază cu stadiul replicării virale. Genotipul 1b se corelează cu un nivel ridicat de viremie și răspuns slab la terapia antivirală.[ 62]

III.3.2. RĂSPUNSUL IMUN CELULAR- PROFILUL POPULAȚIILOR LIMFOCITARE

La majoritatea pacienților cu hepatite cronice virale, răspunsul limfocitelor T nu este capabil să determine clearance-ul viral. Este foarte puțin cunoscut în prezent care din populațiile limfocitare joacă rolul cel mai important în patogenie. Limfocitele CD8 par a se corela în multe studii publicate, cu nivelul seric al ALT și cu indexul de activitate necrotico-inflamatorie.[59, 63]

HCV determină inițial un răspuns slab al celulelor T la pacienții ce dezvoltă infecție cronică, frecvența precursorilor celulelor T citotoxice fiind specifice pentru fiecare peptid HCV și e mai scăzută decât frecvența celulelor T ce recunosc peptide ale virusului gripal, de exemplu, ca antigene de memorie sau ale altor virusuri. Imunosupresia nu reprezintă o cauză

infecției persistente cu HCV, deoarece cei mai mulți pacienți infectați cronic manifestă răspunsuri imune normale la diferite infecții virale. Apariția mutanților virali sau a

30

cvasispeciilor cu variații de secvențe în epitopii celulelor T, poate contribui la aparenta ineficacitate a răspunsului imun mediat celular. Proteinele E2 și NS5A interferă cu răspunsul imun.[64]

Răspunsul imun celular joacă un rol important datorită capacității sale de a recunoaște și a elimina virusul din celulele infectate, majoritatea studiilor argumentând rolul răspunsului imun mediat de limfocitele CD8+/CD4+ ca răspuns la antigenele specifice. Studiile au constatat un răspuns CD4+ prompt a susținut, în unele cazuri, care după o infecție acută cu HCV, sunt capabili să elimine virusul complet. Poate exista și un răspuns susținut împotriva proteinelor core și NS3, ceea ce conduce la o evoluție benignă a infecției, însă acest aspect s-a constatat la un număr redus de pacienți. [65,67]

Totuși, chiar și în infecțiile cronice cu HCV, limfocitele CD4+ virus specifice au putut fi identificate în infiltratul inflamator hepatic, ceea ce ar presupune un răspuns favorabil la terapia antivirală. [64]

Atât limfocitele CD8+ cât și cele CD4+ au fost constatate în spațiile portale și periportale pe secțiunile obținute prin biopsie hepatică, însă cu o prevalență mai mare cele CD8+. La acest nivel, limfocitele B sunt într-un procent mai redus.[65]

In spațiile sinusoidale s-au constatat și prezența limfocitelor CD45RO+, precum și CD20+ (limfocit B), CD45RA, CD16 (macrofage) și CD57 (limfocite NK). Hepatocitele și celulele endoteliale sinusoidale de la nivel lobular, exprimă adesea ICAM-1. CD20 au fost detectate în special în zonele portale, iar limfocitele NK în zonele portale și lobulare.[66, 67]

Celulele NK sau celulele Pit aparțin populației de limfocite mari granulare și exercită o activitate de tip "natural killer" (NK). Ele pot fi observate în lumenul sinusoidului în legătură cu celulele Kupffer, dar pot apare uneori și în spațiul Disse sau printre hepatocite.[59]

Izoformele CD45 (RA/RO) nu par a se corela cu gradul de activitate histologică sau biologica la pacienții cu hepatite cronice. [67]

Unele studii au urmărit cantitativ și calitativ răspunsul limfocitelor T CD8+ CTL în timpul infecției acute, comparativ cu infecția cronică, deși studiile preliminare sugerează că un răspuns CTL viguros s-a constatat la pacienții care elimină virusul după infecția acută cu HCV. Totuși, HCV persistă la majoritatea persoanelor infectate, în ciuda prezenței unui

31

răspuns viguros CTL policlonal. Unii autori au constatat că răspunsul CTL-HCV specific este mai intens la indivizii cu HCV cronică decât la cei cu infecție VHB cronică, fiind dirijat împotriva a 5 epitopi diferiți la un singur individ. S-a sugerat că titruri scăzute de HCV se asociază cu un răspuns CTL core-specific.[68, 69]

Clearance-ul viral și scăderea activității inflamatorii hepatice se asociază cu proliferarea subtipului T8 limfocitar, mai puțin activate și capabile să sintetizeze IFN. In faza de infecție cronică, numărul celulelor CD8+ scade mai mult față de alte infecții virale, ca o consecință unui răspuns inadecvat al LyThCD4+-CD25+. Evoluția bolii acute spre cronicizare în prezenta unui răspuns antiviral al limfocitelor citotoxice ar putea fi explicată prin apariția formelor mutante.[69, 70]

Celulele T CD4+ intervin precoce în infecția virală (Th1/Th2), eliberând citokinele specifice(IFN-γ, IL-4), stimulând celulele B și celulele T CD8+. Se constată o corelație între intensitatea infiltratului hepatic cu celule T, răspunsul lor celular, și faza infecției. La recrutarea și poziționarea celulelor T, NK, și NKT joacă un rol important alături de chemokinele α care prezintă receptori cu densitate crescută pe aceste celule [68, 69]

Unele dintre peptidele virale se leagă cu mare afinitate de moleculele CMH clasa II-a, aceste secvențe putând fi cercetate în vederea dezvoltării unui vaccin eficient împotriva virusului hepatic C.[70]

Activarea limfocitelor T (CD4+, CD8+), se face de către celulele prezentatoare de antigen, care expun antigenele virale în asociere cu moleculele CMH clasa II-a.[65]

Celulele CD8+ intervin tardiv, exercitându-și efectul prin eliberarea IFN-γ și TNF-α, influențând replicarea virală, apoptoza și eliberarea de mediatori citolitici solubili (perforine, granzine).[67]

S-a sugerat posibilitatea ca celulele CD4+ să fie deficitare la pacienții cu hepatite cronice virale, fiind componente ale sistemului imunitar ―helper‖. Limfocitele CD4+ apar ca răspuns la prezența antigenelor virale fragmentate în peptide, legate de CMH clasa II-a .[63, 64]

Unele dintre aceste peptide rezultă din activitatea proteolitică din compartimentele endozomale ale APC. Recunoașterea peptidelor virale asociate moleculelor CMH clasa II-a se face prin intermediul receptorului TCR heterodimer, care intervine în transducția semnalului prin intermediu CD3, însă acest lucru nu e suficient pentru activarea deplină a

32

limfocitelor T, fiind necesar un al doilea semnal mediat de moleculele accesorii ca CD4,CD28, CD40.[69, 70, 71]

Figura nr. 3 Secvențialitatea intervenției patogenice a celulei prezentatoare de antigen

Primul semnal mediat de complexul TCR-CD3, în absența unui semnal secundar, va determina apariția unei stări numită anergie, aceasta determinând o incapacitate a celulelor T să sintetizeze citokinele specifice, ceea ce duce la stimularea răspunsului imun umoral, cu implicarea anticorpilor eliberați de celulele B și la diferențierea celulelor CD8+ citotoxice. Anergia poate fi indusă și de antagoniștii proteici care sunt similari cu peptidele virale, dar incapabile de a se asocia cu TCR. Celulele T devin metabolic blocate.[71]

Interacțiunea TCR-ligand va duce la fosforilarea unui rest tirozinic al TCR, determinând fosforilarea unei PK-ZAP70, care devine astfel activă. Activarea acestei proteinkinaze este necesară în patogenie, fiind implicată în transcripția genei ce codifică sinteza de IL-2. Dacă TCR se leagă de un antagonist peptidic-CMH, are loc fosforilarea restului tirozinic, fără însă a activa PK-ZAP 70, blocând astfel transcripția genei pentru IL-2.[69, 70]

33

VHC poate suferi mutații în cursul infecției și poate induce starea de anergie. Limfocitele CD4+ sunt influențate de cantitatea și calitatea semnalului primar și secundar, fiind divizate în două categorii. Limfocitele Th1 sunt responsabile de activitatea citotoxică, în timp ce limfocitele Th2 sunt răspunzătoare de apariția anticorpilor.[67, 71] Pacienții care prezintă un răspuns inițial puternic la antigenele virale, au o reactivitate Th1 crescută, eliminând virusul și rămânând seronegativi. Din contră, pacienții incapabili să dezvolte un răspuns TCD4+ HCV specific, în timpul infecției acute, vor avea viremie persistentă.[63, 64]

Limfocitele CD4+ sunt responsabile de sinteza de IFN-γ și IL-2, care vor stimula răspunsul celular T killer. Stimularea limfocitelor CD4+ de către antagoniștii peptidelor virale va duce la producția de citokine de către Th2, mai intense decât cele produse de Th1.Scăderea producției de IL-2 și IFN –γ ar compromite diferențierea precursorilor celulari T citotoxici, ceea ce nu ar mai permite limfocitelor TCD8+ să participe la eliminarea virusului, s-ar produce modificări ale afinității TCR pentru peptidele HCV-CMH, determinând un semnal primar incomplet sau deficitar.[59, 67]

Limfocitul T –CTL mediază apoptoza hepatocitelor infectate. Activarea lor se face de către proteinele virale legate de CMH, prin intermediul TCR. Legarea ligandului Fas de receptorul Fas al hepatocitelor infectate, duce la formarea unui complex ce va activa caspaza 8 și va activa cascada caspazei, determinând apoptoza. Mai mult, caspaza 8 poate activa proteina Bid ce va determina eliberarea citocromului ―c‖ din mitocondrii, ceea ce poate bloca moleculele din familia Bcl-2(proteine antiapoptotice), stimulând astfel proteinele apoptotice ca proteina Bax. Citocromul C poate lega Apaf-1 și s-o activeze, determinând astfel stimularea caspazei 9, care deasemenea stimulează cascada caspazei [69]. Limfocitele CTL eliberează granule citotoxice cum ar fi granzime B și perforine după stimularea receptorului de către antigenele virale. Granzima B clivează procaspazele, stimulând apoptoza. [69, 70]

III.4. EVOLUTIA NATURALĂ A INFECȚIEI CU VIRUSUL HEPATIC C

Istoria naturală a infecției cu virusul hepatic C rămâne o adevărată provocare în hepatologie, o bună apreciere a acesteia ajutând personalul medical să ofere pacienților un pronostic și un rol al terapiei antivirale. Numeroși factori au fost asociați cu riscul de progresie al afectării hepatice, printre care vârsta înaintată, consumul de alcool, genotipul

34

viral, nivelul seric al viremiei [72]. Clearance-ul viral spontan poate apare la 15-25% din pacienți, cel mai frecvent în mai puțin de 6 luni de la infectare [59]. Majoritatea infecțiilor acute sunt asimptomatice, și de cele mai multe ori pacientul nu poate preciza un astfel de episod în cursul vieții sale. 15-25% din pacienți vor dezvolta în următorii 25 de ani, ciroză hepatică, cu multiple complicații și deces. Studiile recente au demonstrat că la pacienții peste 40-45 ani, fibroza poate progresa rapid, susținându-se ideea că aceasta progresează cu înaintarea în vârstă, dar și cu consumul de alcool. [59].

O trăsătură specifică infecției cu VHC este succesiunea repetată a episoadelor de injurie hepatică, rezultatul reactivării infecției preexistente sau emergenței unei tulpini mutante noi, endogene. Ciroza hepatică poate fi prezentă la momentul diagnosticului sau se poate dezvolta în 10-20 de ani. Carcinomul hepatocelular survine la 30-50% din pacienții cu ciroză hepatică cu VHC [73, 74, 75]

Figura nr. 4 Istoricul infecției virale C

35

III.4.1. MODALITĂȚI DE EVOLUȚIE A INFECȚIEI CU VIRUSUL HEPATIC C

Hepatita cronică virală C se definește prin persistența la cel puțin 6 luni de la infecția inițială a leziunilor hepatice inflamatorii și necrotice.

Istoria naturală a infecției virale C este mai puțin cunoscută comparativ cu infecția virală B, un rol important în acest sens avându-l și prevalența ridicată a formelor asimptomatice de boală. Vindecarea hepatitei acute este constată la un procent redus de pacienți, în timp ce cronicizarea se produce la 50-80% din cazuri.

După expunerea inițială, ARN-ul viral poate fi detectat în sânge la 1-3 săptămâni, (15-150 zile). Teoretic, toți pacienții pot prezenta leziuni hepatice, cu creșterea valorilor serice ale aminotransferazelor (ALT), însă majoritatea sunt asimptomatici și anicterici [56,73]. Aproximativ 25-40%dintre aceștia prezintă stare de rău general, astenie fizică, anorexie și icter, insuficiența hepatică fulminantă apărând la un procent redus de pacienți. Anticorpii anti HCV pot fi detectați la aproximativ 50-70% dintre pacienții infectați recent și la 90% după 3 luni de la infectare[73,74]. Nivelul seric al ARN-ului viral crește în primele săptămâni, atinge un vârf între 105-107UI/mL și apoi scade, înainte ca nivelul seric al aminotransferazei să atingă maximul [101]. Aproximativ 75% din pacienții cu hepatită acută virală C vor dezvolta hepatită cronică.

Figura nr. 5 Markeri serologici în infecția acută virală C

36

Hepatita cronică virală C este una dintre cele mai frecvente afecțiuni hepatice cronice, care poate fi complet asimptomatică, cu valori ale transaminazelor hepatice normale, dar cu modificări hepatice la biopsie. Diagnosticul poate fi confirmat prin depistare nivelului seric al viremiei, prin PCR, însă poate dificil la pacienții imunodeprimați și la cei care au afectare hepatică de altă etiologie (alcool, autoimună, hemocromatoză, ș.a.). Aproximativ 20% din pacienți dezvoltă ciroză hepatică, la 10-20 de ani de la infecție, iar 5%vor dezvolta carcinom hepatocelular. [75,76]

Infecția cu virus hepatic C poate parcurge :

faza latentă- caracterizată prin simptomatologie minimă, teste hepatice funcționale normale, anticorpi anti HCV-IgM negativi, anticorpi anti HCV-IgG prezenți, ARN viral nedetectabil, fracțiile NS3-NS5 nestructurale negative

faza de reactivare a infecției virale : simptome clinice prezente, teste de citoliză și colestază prezente, sindrom imunoinflamator prezent, ARN viral prezent, anticorpi anti componente nestructurale (NS3-NS5) prezenți.[77]

In funcție de activitatea afectării hepatice, pacienții pot prezenta o formă ușoară, moderată sau severă de boală[72, 73]

Evoluția este lentă, pacienții cu leziuni severe de fibroză hepatică complicându-se cu ciroza hepatică și/sau cancerul hepatocelular. Un tip particular de evoluție al hepatitei cronice virale C este asocierea acesteia cu hepatita autoimună tip II, cu apariția unor autoanticorpi organ specifici și non-organ specifici, asociind diferite manifestări extrahepatice.

Sexul masculin, consumul de alcool, genotipul I, coinfecțiile virale B+/-D, HIV, vârsta înaintată în momentul infecției, pot fi considerați ca factori de prognostic negativ în evoluția bolii.

37

Capitolul IV

HEPATITELE CRONICE VIRALE

IV.1. DEFINIȚIA ȘI CADRUL NOSOLOGIC

Hepatitele cronice se definesc ca boală inflamatorie hepatică cu persistența manifestărilor clinice și a modificărilor biochimice cu durată de cel puțin șase luni. In prezent este recunoscut faptul că tabloul hepatitei cronice persistente este de fapt caracteristic pentru hepatita cronică virală C și majoritatea acestor pacienți, netratați, vor dezvolta leziuni hepatice avansate [78]

Majoritatea hepatitelor cronice sunt induse de infecția cu virusurile hepatice B, C D, precum și de mecanismele imunologice (autoimune) sau medicamentoase. Un procent important îl reprezintă hepatitele idiopatice, induse cel mai probabil prin mecanism autoimun.

Clasificarea etiologică actuală a hepatitelor se împarte în:

Hepatite cronice virale:

Hepatita cronică virală B+/-D

Hepatita cronică virală C

Hepatita cronică virală B+C

Hepatita cronică virală G?

Hepatite cronice autoimune:

Tip I

Tip IIa

Tip IIb

Hepatite cronice toxic medicamentoase

Afectarea cronică hepatică în cadrul anomaliilor metabolice

Boala Wilson

Deficitul de alfa1-antitripsină

Hepatite cronice ―criptogenice‖[78]

38

Din punct de vedere biochimic, hepatitele cronice se pot asocia cu valori persistent crescute ale transaminazelor, însă adeseori, valorile acestora nu sunt corelate cu gradul de afectare hepatică.

Din punct de vedere histologic hepatitele cronice sunt clasificate în cronic persistente, cronic lobulare și cronic active. Un rol important îl au scorurile recente de clasificare bazate pe etiologie, gradul de fibroză, gradul de inflamație și necroza hepatocitară. Inflamația hepatocitară are caracter reversibil, fibroza însă, este ireversibilă.

Gradul de fibroză (gradingul) apreciază severitatea afectării necrotico-inflamatorii. Fibroza și activitatea necrotico-inflamatorie sunt fenomene distincte, ce trebuiesc analizate separat, calculând un scor pentru grading și unul pentru staging.

Tabel nr. 3 Scorul Metavir (activitate)

Tabel nr. 4 Scorul Metavir (fibroză)

39

Tabel nr. 5 Indicele de activitate histologica ISHAK (Ishak și colab.,1995)

IV.2. SEMNIFICAȚIA EXPLORĂRILOR PARACLINICE ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE

Termenul de hepatită cronică cuprinde inflamația hepatică prezentă cel puțin 6 luni, detectată prin teste biochimice și histologice. Se poate asocia cu creșterea transaminazelor (ALT, AST) și uneori o ușoară creștere a fosfatazei alcaline. În formele severe pot crește nivelul seric al bilirubinei, INR, scăderea indicelui de protrombină, a albuminemiei.[79]

Diagnosticul etiologic al hepatitei virale cronice se face ușor bazându-ne pe testele serologice și virusologice, biopsia fiind indicată pentru a stabili gradingul și stagingul leziunilor histologice hepatice, în practică, folosindu-se sisteme numerice semicantitative,

40

care pot fi catalogate în activitate necroinflamatorie medie, moderată și severă, având valoare prognostică și implicații terapeutice [79, 80].

Diagnosticul etiologic al hepatitelor cronice are în vedere: infecția cu virus hepatic B (VHB), cu virus hepatic C (HVC), cu virus hepatic D (HVD), hepatitele cu etiologie mixtă, precum și hepatitele cronice autoimune, hepatitele cronice medicamentoase și hepatitele cronice criptogenetice .

Screening-ul pentru diagnosticarea hepatitelor cronice virale se impune în special pacienților cu risc crescut: persoane care administrează medicamente sau droguri injectabile, cei care au primit transfuzii repetate, hemofilici, transplant de organe, tratamente stomatologice, personalul medical, persoane cu contacte sexuale neprotejate, persoane aflate în închisori.

Anamneza urmărește momentele cheie ale antecedentelor personale (afecțiuni hepatice, intervenții chirurgicale, transfuzii, personal medical, călătorii în zonele cu endemie înaltă). Examenul clinic urmărește prezența unor manifestări clinice dependente într-o mare măsură de gradul de afectare hepatică (endocrine, hematologice, cutanate, renale, autoimune, articulare, musculare)

Algoritmul de diagnostic în hepatitele cronice virale presupune:

Stabilirea diagnosticului

Descoperirea și excluderea altor leziuni

Stabilirea gradului activității necroinflamatorii

Stabilirea extensiei fibrozei, care dă relații asupra evoluției bolii

Evaluarea efectelor tratamentului aplicat

Investigațiile paraclinice includ hemoleucograma completă, testele hepatice, sideremia, glicemia, ureea, creatinina, screening-ul serologic (anticorpii anti-VHC IgM, IgG, antigenul HBs,anticorpii anti-HBc, antigenul HBe, anticorpii anti HBe, anti VHD ),α – fetoproteina (pentru screening-ul cancerului hepatocelular), ecografia abdominală,

41

endoscopia digestivă superioară pentru identificarea varicelor esofagiene sau a gastropatiei portale, EKG, radiografia pulmonară. Testele inițiale necesită adesea investigații suplimentare, ca determinarea prezenței autoanticorpilor, transferina, feritina, ceruloplasmina, hormonii tiroidieni, teste imunologice, scintigrafia hepatosplenică, colangiografia endoscopică retrogradă, tomografia computerizată sau rezonanța magnetic nuclear. Investigațiile efectuate ajută și la stabilirea diagnosticului diferențial:

alte hepatite cronice virale

hepatita cronică autoimună

hepatita medicamentoasă

hepatita alcoolică

steatoza hepatică

fibroza hepatică

ciroza hepatică

boli hepatice genetic predispuse (hemocromatoza, boala Wilson)

afectarea parazitară a ficatului

colecistita sau colangita cronică

cancerul hepatic

În lipsa unor corelații satisfăcătoare între testele serologice (în esență transaminazele) pe de o parte și amploarea reacțiilor necrotico-inflamatorii și fibrozei pe de altă parte, biopsiei hepatice îi revine ca sarcină indispensabilă formularea diagnosticului de hepatită cronică, inventarierea leziunilor și evaluarea codificată a modificărilor necrotico-inflamatorii și fibrozei cu stabilirea indicilor prognostici și eventual evidențierea unor agenți patologici asociați (alcoolul, alte infecții). Biopsia rămâne singurul și cel mai fidel mijloc în orientarea terapiei și stabilirea evoluției bolii. [81, 82]

Investigațiile paraclinice includ sindromul de citoliză, sindromul de colestază, sindromul de insuficiență hepato-celulară, testele imunologice și explorarea imagistică.

Sindromul de citoliză, caracterizat prin creșteri ale valorilor serice ale transaminazelor (ALT, AST) poate fi utilizat pentru aprecierea biologică, însă adesea valorile crescute ale acestora nu se corelează cu gradul de afectare hepatică. Pacienți cu valori persistent normale ale transaminazelor pot prezenta leziuni hepatocitare severe.

Creșteri ale valorilor ALT se întâlnesc mai frecvent în afectarea hepatică din hepatitele acute, hepatite cronice virale, steatoza hepatică, icter colestatic sau boala Wilson,

42

în timp ce creșteri ale valorilor AST se pot asocia cu hepatita alcoolică, ciroza hepatică, leziuni neoplazice. Un rol important îl are și calcularea raportului Ritis (AST/ALT) care la valori > 2 se asociază frecvent cu etiologia alcoolică a afectării hepatice.

Alte enzime de citoliză sunt glutation S-transferaza, izocitrat dehidrogenaza, malat dehidrogenaza, glutamin dezaminaza, alcool-dehidrogenaza, glutamic-dehidrogenaza, dar mult mai rar determinate.

Sindromul de colestază caracterizat prin creșteri ale bilirubinei serice, fosfatazei alcaline, ɣ -glutamil transferaza, lactic dehidrogenazei și colesterolului total, este asociat adesea formelor severe de afectare hepatică.

Determinarea serică a bilirubinei cu cele două forme -conjugată și neconjugată, poate ajuta la diferențierea unui icter din afectările congenitale, de cel hemolitic sau colestatic.

Fosfataza alcalină cu formele sale (hepatică și biliară, osoasă, intestinală, placentară, renală ) poate fi evidențiată prin metode imunologice și electroforeză. În principal. Fosfataza alcalină serică este reprezentată de forma hepatică și osoasă. Creșterile acesteia pot fi atât fiziologice ( în perioadele de creștere, postprandial, în sarcină sau alăptare ) cât și patologice (hepatite acute și cronice, sindroame de colestază de diferite etiologii, tumori benigne sau maligne, ciroza hepatică, insuficiența cardiacă congestivă, limfom Hodgkin).

Nivelul seric crescut al ɣ-glutamil transferazei este asociat adesea, consumului de alcool, însă el poate fi crescut și în hepatitele cronice virale, afectări pancreatice, neurologice, post-radioterapie.

Creșteri ale valorilor LDH se asociază cu hepatitele acute, dar și cu afectarea ischemică hepatică sau cu consumul de paracetamol, leziuni maligne cu sau fără afectare hepatică.

Alte teste funcționale hepatice includ determinarea electroforezei proteinelor serice , indicele de protrombină și timpul parțial de tromboplastină, fibrinogen, colinesteraza serică, ș.a.

Albumina serică, sintetizată exclusiv la nivel hepatic poate fi considerată ca marker obiectiv pentru funcția de sinteză a ficatului. Creșteri ale γ-globulinelor serice se pot întâlni în hepatitele cronice virale și autoimune.

43

Explorarea imunologică

Testele imunologice includ electroforeza, determinarea complexelor imune circulante (CIC), determinarea fracțiunii C3, test Coombs la pacienții cu anemie hemolitică autoimună asociată hepatitelor cronice virale, autoanticorpi specifici, imunofenotiparea.

Testele imunologice pot fi modificate la pacienții cu hepatită cronică virală, mai ales la cei cu infecție cu VHC.

Imunoglobulinele serice stimulează activitatea proliferativă a celulelor hepatice stelate, studiile publicate recent în literatura de specialitate susținând existența unei corelații între nivelul seric al acestora și gradul de afectare hepatică, în special la pacienții cu HCV.

Complexele imune circulante alcătuite din antigenele virale, antigenele hepatocitare, anticorpi și complement, au fost descrise adesea la pacienții cu hepatite cronice virale, însă rolul acestora este neclar. Ele pot fi implicate în patogenie prin apariția leziunilor hepatice și extrahepatice, influențând clearance-ul viral.

Determinarea nivelului seric al complementului este acceptată în prezent ca metodă de studiu la pacienții cu modificări imunologice. Rolul acestuia în patogenie este incomplet cunoscut în prezent. Activarea cascadei complementului poate fi responsabilă de severitatea manifestărilor clinice, afectarea hepatică severă asociind adesea un nivel seric scăzut al complementului.

Factorul reumatoid determinat prin nefelometrie, este adesea constatat la pacienții cu hepatite cronice virale, mai ales la cei cu VHC, fiind asociat sindromului reumatoid. Prezența acestuia la pacienții cu artralgii poate duce adesea la diagnostic eronat de poliartrită reumatoidă.

Crioglobulinele serice sunt imunoglobuline monoclonale sau policlonale, frecvent de tip IgG, care precipită reversibil la temperaturi sub 37oC, fiind întâlnite mai frecvent la pacienții cu VHC. Crioprecipitatul conține antigene virale sau anticorpi dirijați împotriva antigenelor virale și poate avea rol important în interacțiunea dintre crioglobuline, celule endoteliale și granulocitele neutrofile. Prezența crioglobulinelor serice poate fi considerată ca factor de prognostic negativ pentru pacienții cu hepatită cronică virală, influențând evoluția bolii prin leziunile de tip vasculitic și neuropatice induse.

44

Autoanticorpii serici sunt frecvent constatați la pacienții cu hepatită cronică virală C și mai puțin frecvent la cei cu hepatită cronică virală B. Unele studii susțin existența anticorpilor antinucleari (AAN) și ASMA cu o frecvență de 4-41%, respectiv 7-66%.

Prezența modificărilor imunologice la pacienții cu hepatite cronice virale se asociază mai frecvent cu grad înalt de afectare hepatică. Imunofenotiparea, prin determinarea markerilor de suprafață specifici populațiilor limfocitare și sublimfocitare, permite evidențierea dezechilibrelor imunologice implicate în patogenia bolii.

Explorarea imagistică se bazează pe scintigrafia hepatosplenică, ecografia abdominală, endoscopia digestivă superioară (pentru identificarea pacienților cu varice esofagiene sau gastropatie portală), tomografia computerizată, scintigrafia hepatosplenică.

Ecografia abdominală oferă date despre dimensiunile hepatice, conturul hepatic structura, prezența sau absența altor procese localizate; permite evaluarea hepatică în interrelație cu splina, vena portă, în vederea diagnosticării hipertensiunii portale. Ecografia abdominală poate fu utilă pentru ghidaj în efectuarea puncției biopsie hepatice.

Scintigrafia hepato-splenică, prin utilizarea unor izotopi ca AU198 sau TC99, poate orienta diagnosticul de hepatită cronică activă, datorită fixării izotopului la nivel hepatocitar. Ajută de asemenea, la diagnosticul unor afectări splenice sau medulare.

FibroScan-ul (elastografia) este o metodă ultrasonografică non-invazivă care ajută la diagnosticul și gradul de fibroză la pacienții cu hepatite cronice.

La pacienții cu hepatită cronică virală C FibroTest-ul și FibroScan-ul pot juca un rol important în identificarea cirozei, dar sunt mai puțin fidele în determinarea stadiilor precoce. În prezent se urmărește înlocuirea biopsiei hepatice cu acestea.[97]

Examinarea FibroScan are avantaje că este nedureroasă, permite obținerea imediată a rezultatelor, examinarea directă a ficatului fără a ține cont de alte afectări extrahepatice, există un operator de măsurătoare independent, este ușor de utilizat și nu necesită anestezie.

FibroScan-ul împreună cu markerii serici fibrotici (acidul hialuronic, tipul IV de colagen, tipul IV de colagen- domeniu 7S, tipul III procolagen-N-peptide) poate fi utilă la distincția dintre hepatita cronică și ciroza hepatică [97, 98, 99]

45

Majoritatea studiilor recente susțin că FibroScan-ul ajută la identificarea gradului de fibroză la 95% din pacienți.[99, 100]

Cu toate că se folosesc o serie de investigații pentru stabilirea corectă a diagnosticului, biopsia hepatică rămâne standardul de aur pentru stabilirea gradului de fibroză și a activității necrotico-inflamatorii. [79]. Ea poate oferi unele date în ceea ce privește prezența steatozei hepatice, a agregatelor portale limfoide și a leziunilor ductelor biliare. Prezența displaziei celulelor hepatice nu este o anomalie frecvent întâlnită la biopsiile hepatice la pacienții cu ciroză hepatică. Noile tehnici imunohistochimice și moleculare permit localizarea virusului în țesutul hepatic și înțelegerea mai completă a patogeniei, ceea ce ar putea fi de folos în monitorizarea terapiei. Indexul de activitate histologică sau scorul Knodell este o ―metodă semicantitativă pentru standardizarea interpretării biopsiei hepatice‖ [80, 81].

Necroza și inflamația reflectă agresivitatea procesului (H.A.I=index de activitate histologică), iar extensia fibrozei se asociază determinând regenerarea nodulară.

Anumite aspecte sunt sugestive pentru etiologie:

celule ―ground-glass‖ pentru HVB;

foliculi limfoizi, steatoză și anomalii biliare pentru H.V.C.;

celule gigante (parvomixovirusuri);

aspecte granulomatoase și corpi PAS + ( deficit alfa l antitripsină). [81]

Consensul actual privind clasificarea histologică presupune o cuantificare adecvată a gradului necro-inflamator și stadiului fibrozei stabilite pentru precizarea diagnosticului, evaluarea prognostică și monitorizarea efectului terapiei. S-a adoptat un sistem numeric de scor (1981) care a înlocuit clasificarea Grupului Internațional pe criterii pur morfologice. Scorurile numerice pentru gradul și stadiul bolii (Knodell, grila Metavir, Scheuer, Ludwig, Bianchi, Ishak, Prodromos Hytiroglon) sunt utilizate în monitorizarea bolnavilor în timpul terapiei [81, 82]

Analiza descriptivă a gradingului și stagingului, alături de scorurile numerice poate ajuta la stabilirea unei decizii clinice ș terapeutice corespunzătoare. Scorurile au la bază unele diferențe, însă toate pornesc de la ideea că la baza diagnosticului stă inflamația portală și lobulară, necroza, activitatea necrotico-inflamatorie.

46

IV.3. CRITERII DE DIAGNOSTIC IN HEPATITA CRONICĂ VIRALĂ B

Diagnosticul hepatitei cronice virale B se realizează prin evidențierea unor markeri serologici, virali, biochimici și histologici. Evaluarea pacienților trebuie să includă o anamneză amănunțită, cu referire la factorii de risc (coinfecții, consum de alcool, istoric familial, profesie, transfuzii, injectare de droguri,..), istoricul infecției virale, investigații de laborator, imagistice, și biopsia hepatică. Clinic pacienții pot fi asimptomatici, însă unii dintre aceștia pot prezenta astenie fizică, meteorism abdominal, artralgii, inapetență, mialgii, dureri în hipocondrul drept sau semne clinice ale cirozei sau carcinomului hepatocelular.[82, 83]

Markerii serologici sunt caracteristici diferitelor faze de activitate la pacienții cu VHB (figura nr. 6, tabel nr 6). Emblema diagnostică a infecției o reprezintă antigenul HBs, acesta fiind primul marker serologic al infecției virale, ce poate fi detectat la 2-12 săptămâni după infectare. Seroconversia antigen HBs/anticorpi anti HBs reprezintă un indicator al supresiei replicării virale.[83]

ADN-ul viral reprezintă un marker al replicării virale și poate fi detectat în ser la câteva zile de la infecție [83, 84].

Figura nr. 6 Markerii serologici în infecția virală B

47

Tratamentul la acești pacienți nu este influențat de modificările histopatologice constatate, ci de gradul de replicare virală, constatat pe baza testelor biochimice hepatice, nivelul de ADN viral și studiile serologice specifice hepatitei virale B [84, 85] Endoscopia digestivă superioară poate evidenția prezența varicelor esofagiene, ajutând la diagnosticarea cirozei hepatice, fără a apela la biopsia hepatică.

48

Detectarea ADN-ului viral în fragmentele de biopsie hepatică și în ser, ar avea rol semnificativ în selecția pacienților pentru terapia antivirală, prezența acestuia la nivel hepatic nefiind totdeauna acompaniată de prezența acestuia în ser.[85]

ALGORITM DE DIAGNOSTIC ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE B

Pacienti cu risc crescut:

ALT crescut

Ciroza hepatica, carcinoma

Date anamnestice

Examen clinic

Ag HBs persistent peste 6 luni

nivel seric ALT

antigen HBe, anticorpi anti HBe

nivelul viremiei

genotipul viral

eventuale coinfectii-HIV, HCV, HVD

49

Evoluția bolii se corelează cu replicarea virusului și cu răspunsul imun al gazdei.

Aspectul morfologic al hepatitei cronice virale B prezintă grade variate, în funcție de etapa evolutivă a bolii, modificări de tip necrotico-inflamator și fibroză [83]

Infiltratul celular inflamator este alcătuit predominant din limfocite la care se adaugă rare plasmocite ,histiocite și mai rar infiltrat limfo-granulocitar. Infiltratul inflamator este cel mai frecvent localizat în spațiile porte ,dar și intralobular, dispus în focare mici, în spoturi, adeseori în jurul unor hepatocite alterate sau sub forma unor șiraguri intra sinusoidale. In spațiile porte, care apar mai mult sau mai puțin lărgite, limfocitele formează uneori agregate limfoide [81, 82, 84]. Infiltratul inflamator limfocitar prezintă limfocite cu un raport CD4/CD8 scăzut și un procentaj foarte mare de celule NK (CD 56 +) [81]

În hepatita cu virus B se întâlnesc hepatocite dispersate, a căror citoplasmă era integral sau parțial înlocuită de un aspect granular uniform, cunoscute ca celule cu aspect de sticlă mată (ground glass). Aspectul particular al acestor hepatocite este datorat dilatării reticulului endoplasmatic prin acumulare de anvelope virale Ag HBs. Pe colorația HE, ele au o citoplasma foarte fin granulară, palid eozinofilă, mărginită adeseori de un halou periferic. Hepatocitele "ground glass" pot fi mai bine evidențiate prin colorația cu orceină (Shikata). [85, 86]

In anul 1986 Callea și col [81, 82], aplicând tehnicile sus amintite au identificat următoarele patternuri de expresie antigenilor virali :

prezența AgHBc și AgHBs

-AgHBc citoplasmatic

absența AgHBc și AgHBs

prezența AgHBs și absența AgHBc

prezența AgHD

Patternul AgHBs prezent și AgHBc absent a fost considerat de Bianchi și Gudat [81] caracteristic pentru starea de purtător sănătos și pentru hepatopatiile nonagresive. Pe secțiunile colorate imunohistochimic se observă prezența AgHBs în citoplasmă, de obicei extensivă, pe când AgHBc și AgHBs membranar sunt absenți în majoritatea celulelor.

50

Tipul AgHBc focal este asociat cu mare frecvență cu hepatita cronică activă. În asemenea cazuri AgHBs citoplasmatic este observat doar în 20-30% din hepatocite ,din loc în loc, și nu este specific de tip. AgHBs membranar este mai frecvent cu dispoziție focală.[82, 87]

AgHBc este observat în nucleii hepatocitelor. Amploarea expresiei antigenice este în relație inversă cu intensitatea activității inflamatorii; cu cât inflamația este mai activă cu atât este mai slabă expresia tisulară a AgHBc și invers [81, 88] .

IV.4. DIAGNOSTICUL LA PACIENȚII CU HEPATITĂ CRONICA CU VIRUS D

Hepatita cronică cu virus D este întâlnită numai în prezența unei infecții cu virus B. Prezenț a acesteia necesită prezenț a infecț iei virale B, virusul delta fiind un virsu defectiv, necesitând pentru replicare prezenț a unui grad de informaț ie genetică al virusului B. Prezența AgHD în nucleii hepatocitelor se însoțește de o agravare a evoluției hepatitei, virusul delta având efect citopatic direct, însoț it de eozinofilie citoplasmatică, steatoză microveziculară la examneul histopatologic hepatic, ș i de creș teri ale transaminzelor serice, în special ALT.[46]

Infecț ia virală D poate fi de tip coinfecț ie, superinfecț ie, infecț ia cronică prezentând diverse pattern-uri, de la purtători sănătoș i la hepatite cronice severe, ciroză sau carcinom hepatocelular.

Diagnosticul se suspicionează la un pacient cu hepatită cronică virală B ș i se susține pe baza prezenței anticorpilor anti HVD sau a antigenului delta la pacienții infectați cu virusul hepatic B. Antigenul delta poate fi izolat la nivel hepatic prin tehnici de imunofluorescență sau imunoperoxidază. In ser pot fi detectați anticorpii anti-Delta de tip IgG, IgM sau totali sau antigenul HB-delta.[46, 47]

Testarea pentru infecția cu virusul hepatic delta este recomandată pentru toți pacienții consumatori de droguri, toți pacienții cu HBs prezent, purtătorii sănătoși de HBs cu afectare hepatică, toți pacienții cu hepatită fulminantă chiar dacă antigenul HBs este absent.[47]

Testele hepatice sunt modificate (transaminaze, bilirubinemia, electroforeza ), un procent redus prezentând anticorpi anti LKM3 ș i anti-timocite umane. Din punct de vedere

51

histopatologic, hepatita cronică virală D se caracterizează prin activitate necrotico-inflamatorie severă, cu piecemeal necrosis ș i bridging necrosis.

IV.5. DIAGNOSTICUL HEPATITEI CRONICE VIRALE C

De cele mai multe ori infecția cronică virală C este descoperită prin teste de screening la donatorii de sânge sau la o examinare de rutină, când se constată o creștere a transaminazelor, majoritatea acestora fiind infectați cronic, fără însă a se putea efectua o diferențiere între cei infectați acut sau cronic. Pacienții cu nivel seric ALT normal, necesită monitorizarea afectării hepatice prin urmărirea valorilor acestora la 6-12 luni. Testele de screening trebuie efectuate la :

Pacienții consumatori de droguri

Personalul medical

Pacienții care au primit transfuzii repetate sau transplant de organe

Copiii născuți din mame HCV pozitive

Pacienți cu afecțiuni diverse care au necesitat hemodializă, administrare de concentrat de factori celulari[89]

Diagnosticul hepatitei cronice virale C se bazează pe depistarea prezenței virusului C

și a gradului de afectare hepatică, în vederea stabilirii tratamentului corespunzător. Depistarea anticorpilor anti-HCV prin EIA-2 (second generation enzyme immunoassay) reprezintă azi cea mai utilizată metodă screening de depistare a infecției virale. Testele ELISA de generația a III-a, aprobate recent de FDA, pentru donatorii de sânge sunt mult mai eficace în detectarea anticorpilor dirijați împotriva antigenelor virale comparativ cu cele de primă generație. Diagnosticul poate fi confirmat prin teste RIBA sau depistarea ARN-ului viral (PCR). [90]

Tabel nr. 7 Valoarea predictivă a testelor ELISA pentru detectarea anticorpilor anti HCV comparativ cu RIBA

52

Tabel nr. 8 Determinanții antigenici la pacienții cu anticorpi anti HCV prezenți

Creșterea transaminazelor la pacienții cu hepatită cronică virală C, sugerează o infecție activă, testele serodiagnostice necesitând confirmare și suplimentare prin metode ELISA și RIBA. Confirmarea diagnosticului se face prin teste RIBA care utilizează patru antigene (RIBA® HCV 2.0 SIA, Chiron Corporation, Emeryville, Calif) sau prin stripuri immunoblot assay (SIA). Testele RIBA de a treia generație (RIBA® HCV 3.0 SIA, Chiron Corporation) au o sensibilitate mai mare și au fost recent introduse și în Europa [83-85]

Deși, în practică, diagnosticul se bazează pe prezența anticorpilor anti-HCV detectați prin metode ELISA, această metodă nu este fidelă în faza inițială a infecției virale, la pacienții imunoincompetenți, la care titrul anticorpilor este scăzut, și nici nu ajută la diferențierea fazei active de cea de rezoluție. În această situație se indică determinarea ARN-ului viral prin reverse-transcriptase PCR (RT-PCR), considerându-se această metodă ca standard de aur în diagnosticul hepatitei cronice virale C [84, 85]. Detectarea ARN-ului viral se face atât calitativ cât și cantitativ. Avantajul principal al tehnicilor PCR este o înaltă sensibilitate, nivelul minim al ARN-ului detectat fiind de 1000 copii/ml [89, 90].

Efectuarea testelor genetice este importantă pentru numeroase subtipuri virale (genotipuri), cunoscându-se șase genotipuri majore și peste 100 de subtipuri. Peste 97% din

53

infecții sunt produse cu genotipurile 1, 2 și 3, însă cel mai frecvent întâlnit este genotipul 1 [6, 85]

După ce infecția virală C a fost diagnosticată este important excluderea altor cauze de afectare hepatică prin următoarele determinări:

Hemoleucogramei complete

Indicele de protrombină și testele tiroidiene

Sideremia pentru diagnosticarea hemocromatozei

Antigenul HBs

Testul HIV

AAN, nivelul seric al ceruloplasminei și al alfa1-antitripsina, la cei cu istoric familial

54

ALGORITM DE DIAGNOSTIC AL HEPATITEI CRONICE VIRALE C

– Date clinice și paraclinice de

Test EIA

Test EIA

negativ pozitiv

pozitiv

negativ

Test RIBA

pozitiv

negativ

Investigații pentru

altă etiologie a

Determinare

Test EIA fals afecțiunii hepatice ARN cantitativ

pozitiv

detectabil

nedetectabil

Stabilirea genotipului

Repetare la

6 luni Evaluare clinică în

vederea tratamentului

55

Aspectul histopatologic particular al hepatitei cronice C include leziuni ale canaliculelor biliare, leziuni intralobulare de tipul steatozei, infiltrat limfocitar intrasinusoidal, infiltrate limfoide cu centri germinativi în spațiul port, în vecinătatea canaliculelor biliare, macrofage și a corpi acidofili , inconstant corpii hialini Mallory.[91, 92]

Deși aceste trăsături sunt sugestive pentru hepatita cronică cu virus C, ele nu sunt patognomonice pentru aceasta, diagnosticul definitiv necesitând confirmare serologică. În hepatita cronică cu virus C se întâlnesc mai frecvent activitate necrotico-inflamatoare ușoară sau moderată, spre deosebire de hepatita cronică cu virus B, în care inflamația este mai intensă și, urmărită în timp, mai fluctuantă.[92]

Alterarea canaliculelor biliare este de asemenea considerată de majoritatea autorilor ca având o frecvență și o amploare semnificativă în hepatita cronică cu virus C comparativ cu celelalte tipuri de hepatite [92, 93]. Această alterare se concretizează prin vacuolizarea și stratificarea celulelor epiteliului biliar, picnoza nucleilor, pierderea polarității celulare și prezența în jurul ductelor biliare a unui infiltrat inflamator limfocitar. Acestor leziuni li se impută asocierea cu o mai rapidă evoluție spre ciroză [93] In hepatita cronică cu virus C se întâlnesc frecvent leziuni periportale (piecemeal necrosis) moderate și chiar leziuni discrete. Leziunile de tipul hepatitei lobulare care asociază în diverse grade infiltratul inflamator intrasinusoidal.[91, 94]

Scorul hepatosteatozei reprezintă o trăsătură particulară în hepatita cronică cu virus C și poate fi întâlnit în 50% din cazuri. La acești pacienți pot coexista factori favorizanți ca obezitatea, alcoolul și diabetul. Gradul steatozei se corelează cu intensitatea activității și cu extensia fibrozei [95, 96].

Tabel nr. 9 Rubbia Brandt Laura

56

IV.6. FACTORI DE PROGNOSTIC ÎN EVOLUȚIA HEPATITELOR CRONICE VIRALE

Formele anicterice de hepatită pot precede apariția cirozei hepatice sau a cancerului hepatocelular, modificările imunologice prezente în organism fiind responsabile de apariția complicațiilor.

Biopsia hepatică, deși este adesea însoțită de numeroase complicații, rămâne în prezent standardul de aur pentru diagnosticul hepatitelor cronice, evidențiind gradul de afectare histopatologică hepatică, prezența sau absența cirozei hepatice.[101]

În practică există un interes deosebit pentru depistarea markerilor noninvazivi care să se coreleze cu gradul de lezare la pacienții cu hepatită cronică virală C, mai ales că riscurile și morbiditatea asociate biopsiei hepatice sunt crescute. Se consideră ca rol important îl au indicele APRI (AST/ trombocite), raportul AST/ALT și GGT, care par să se coreleze sensibil cu gradul leziunilor hepatice [99, 102]

Nivelul seric al acidului hialuronic pare să se asocieze cu riscul de dezvoltare a carcinomului hepatocelular și cu gradul fibrozei hepatice.[102]

Diagnosticul etiologic al hepatitei virale cronice se face ușor bazându-ne pe testele serologice și virusologice, biopsia fiind indicată pentru a stabili gradingul și stagingul leziunilor histologice hepatice, în practică, folosindu-se sisteme numerice semicantitative, care pot fi catalogate în activitate necroinflamatorie medie, moderată și severă, având valoare prognostică și implicații terapeutice [78]. Numeroase studii au arătat că, rata de progresie spre ciroză variază între 1% și 37%, la intervale diferite, în timp ce alte studii au arătat că rata de progresie e mai mare. [75,76]

Factorii histologici cheie predictori ai cirozei sunt inflamația, fibroza și steatoza, constatate la biopsia hepatică. Bazându-ne pe studii retrospective, majoritatea pacienților cu inflamație moderată la biopsia hepatică, dezvoltă ciroză hepatică după aproximativ 20 ani, majoritatea celor cu fibroză severă dezvoltând ciroză după aproximativ 10 ani de evoluție a bolii. Pacienții cu fibroză minimă au risc scăzut de apariție a cirozei. Steatoza hepatică este și ea un factor de prognostic în infecția cu HCV [75]

57

Datele clinice pot aduce informații despre prognostic, dar nu pot înlocui valoarea biopsiei hepatice. Studiul publicat de Poynard și colaboratorii săi, a arătat că există trei factori importanți pentru progresia fibrozei hepatice :

vârsta peste 40 ani în momentul infecției consumul zilnic de alcool de cel puțin 50 grame sexul masculin.

Alți factori predictori includ imunosupresia și coinfecția cu virusul hepatic B sau HIV [87, 93]

Studiul MULTIVIRIC efectuat pe 339 de pacienți a folosit ca markeri serici α- 2 macroglobulina, gamma glutamil transpeptidaza, haptoglobina, bilirubina și apolipoproteina A1, în raport cu vârsta și genotipul infecției; doar 5 % din date s-au corelat cu gradul fibrozei, în timp ce în 50 % din cazuri, datele au fost incerte [102]

Transaminazele, în special ALT, au fost folosite ca factori predictivi pentru fibroza hepatică și pentru gradul de inflamație, însă ultimele studii au arătat că acestea au un grad mic de corelație. Pacienții cu valori persistent normale ale ALT par să aibă un grad de inflamație și fibroză hepatică mai reduse decât cei cu valori crescute însă în ciuda acestor date, pacienții cu valori normale ale ALT pot avea proces inflamator hepatic sever sau chiar ciroză hepatică [102, 103]

Prezența coinfecțiilor la pacienții cu hepatite cronice virale agravează evoluția leziunilor hepatice. Infecția cu virusul hepatic B sau C este frecventă la pacienții infectați cu HIV. Prevalența coinfecției variază în funcție de factorii de risc.[104]

Numeroase studii au evidențiat că pacienții cu hepatite cronice virale asociate cu infecție virală D, prezintă leziuni severe hepatice, asociind un risc crescut de dezvoltare a cirozei sau carcinomului hepatocelular.[52]

Interacțiunile HIV-VHB/HCV prezintă căi de transmitere comune: sexuală și manopere nesterile. Rata coinfecțiilor este crescută în zonele în care aceste căi de contaminare HIV sunt predominante – HIV-HCV în grupuri de toxicomani, HIV-VHB în zonele unde este dominantă transmiterea pe cale sexuală; terapia activă pentru infecția HIV, cât și pentru VHB/HCV este adesea grevată de eventualele interacțiuni și de toxicitatea sporită la pacienții coinfectați. Decesul pacienților cu infecție HIV este adesea cauzat de o suferință hepatică severă. În unele statistici, afectarea hepatică severă reprezintă cea mai

58

frecventă cauză de deces a pacienților cu infecție HIV.[104, 105] Datele provenind din diverse studii epidemiologice arată că asocierea VHB-HIV are o prevalență în diverse zone geografice de 5-9%, în timp ce asocierea HIV-HCV variază între 1și 47% în funcție de existența unor factori de risc: utilizare de droguri intravenos (IVDU), transmitere perinatală, sexuală. În ultima perioadă, atenția cercetătorilor medicali a fost îndreptată asupra acestor coinfecții. Markeri ai contactului cu infecția virală B sunt prezenți la majoritatea pacienților HIV pozitivi, însă doar 10-15% din pacienți au hepatită cronică virală B.[104].Toți pacienții cu antigen HBs prezent vor fi testați pentru infecția virală D, C și pentru carcinomul hepatocelular.[104]

Un procent semnificativ din pacienții infectați HIV prezintă anticorpi anti-HBc pozitivi și nivel seric scăzut al viremiei, fiind considerați a avea infecție virală B ocultă. Astfel că la toți pacienții HIV pozitivi se recomandă testarea antigenului HBs, anticorpi anti HBs și anticorpi anti HBc. Dacă acești pacienți vor prezenta antigen HBs sau anticorpi anti HBc, se recomandă determinarea viremiei.[104]

Evoluția cronică a hepatitei cronice virale este accelerată la pacienții HIV pozitivi, cu creșterea frecvenței cirozei hepatice și a carcinomului hepatocelular. Coinfecția cu virusurile hepatice B sau C la pacienții HIV pozitiv, crește riscul de ciroză hepatică, precum și frecvența mortalității prin boală hepatică, în special la cei cu nivel seric scăzut de CD4+, sau la cei cu consum de alcool.[104, 105]

În prezent nu există teste non-invazive care să stabilească gradul de afectare hepatică, deși în practică se încearcă folosirea unor markeri serici, sau elastografia. Rol predictiv important îl are gradul de afectare histopatologică la biopsia hepatică, comparativ cu nivelul seric al transaminazelor, genotipul sau încărcarea virală.[102, 103]

Asocierea steatozei hepatice non-alcoolice la acești pacienți, consumul de alcool, genotipul viral pentru infecția virală C, tratamentul antiviral cresc riscul de afectare hepatică severă.[96]

59

Capitolul V

MANIFESTĂRILE EXTRAHEPATICE ÎN

HEPATITELE CRONICE VIRALE

Infecția cronică cu virusurile hepatice B și C se poate asocia cu prezența unor manifestări extrahepatice induse de mecanismele imunologice implicate în patogenia bolii.

Acestea sunt mai frecvent constatate la pacienții cu hepatită cronică virală C comparativ cu cei cu hepatită cronică virală B. Prevalența manifestărilor extrahepatice la aceștia variază în diferite studii publicate, însă frecvența exactă a acestora nu este încă pe deplin cunoscută.

V.1. MANIFESTĂRILE EXTRAHEPATICE IN HEPATITA CRONICĂ VIRALĂ B

Infecția virală B este adesea însoțită de manifestări extrahepatice de tipul artrite, tiroidite, fibromialgii, vasculite, lichen plan, sindrom Sjogren, și altele dar cu un procent redus comparativ cu infecția virală C [2,106].

MANIFESTĂRI RENALE

Glomerulonefritele asociate infecției cu VHB au fost descrise pentru prima dată de Combes și colaboratorii săi, după ce au evidențiat prezența antigenului Australia în complexele imune depozitate la nivelul membranei bazale glomerulare, la un pacient cu ciroză hepatică virală B, după ce s-a efectuat transplantul hepatic. Afectarea glomerulară poate fi de mai multe tipuri, formele membranoasă și membranoproliferativă fiind mai frecvent constatate. Incidența acestora variază între 0.25 și 25 %, fiind mai frecvent întâlnite la copiii de sex masculin, din zonele unde infecția cu VHB are caracter endemic.[45, 106]

Relația exactă dintre virusul hepatic B și afectarea glomerulară nu este încă bine stabilită. Complexele imune circulante ce conțin antigenele virale se pot depozita la nivelul spațiului subepitelial determinând glomerulonefrita membranoasă.[45]

Debutul clinic poate fi insidios majoritatea pacienților prezentându-se pentru

sindrom nefrotic care nu răspunde la administrarea corticoterapiei, puțini dintre aceștia prezentându-se cu semne de insuficiență renală. La unii pacienți, afectarea renală se poate constata doar prin investigații sistemice. Pacienții pot prezenta și anorexie, slăbiciune

60

musculară, stare de rău general, în timp ce alții pot prezenta doar proteinurie asimptomatică.[106, 107]

Afectarea glomerulară asociată infecției cu virusul hepatic B nu răspunde la administrarea corticoterapiei, evoluând spre insuficiență renală cronică. La copii, prognosticul este favorabil, în timp ce la adulți evoluția este lent progresivă, putând răspunde la administrarea de interferon.[45, 108]

POLIARTERITA NODOASĂ

PAN a fost descrisă pentru prima dată de Kussmaul și Maier în 1866. In 1948 a fost introdus termenul de poliarterită microscopică de către Davson. Este o afecțiune care apare mai frecvent la bărbați, în special în decadele 4 și 5. [108]

Poliarterita nodoasă este o afecțiune inflamatorie sistemică determinată de vasculita arterelor medii și mici. Complexele imune circulante conținând particule virale au fost implicate în patogenia PAN asociate cu infecția virală, sugerând că PAN este o afecțiune care ar răspunde la tratamentul cu imunosupresoare sau tratament antiviral. [109, 110]

Citokinele sunt și ele probabil implicate în patogenia vasculitelor, constatându-se nivele crescute de IFNα și de IL- 12, precum și valori moderat crescute de TNFα și IL-1b.[108]

Clinic, pacienții cu PAN prezintă afectare sistemică, inclusiv renală,

musculoscheletală, nervoasă, gastrointestinală, cardiacă, genitourinară și cutanată.

Supraviețuirea la 5 ani la pacienții cu PAN este de aproximativ 13%, tratamentul cu corticosteroizi îmbunătățind supraviețuirea, în special în asociere cu imunosupresoarele. Cauza frecventă a decesului este insuficiența renală, dar poate fi și prin complicații gastrointestinale și cardiovasculare [108,109]

La majoritatea pacienților, poliarterita nodoasă se asociază cu simptomatologie nespecifică incluzând inițial febra, scădere ponderală, stare de rău general, mialgii, cefalee și dureri abdominale. Ulterior aceste simptome sunt urmate de semne din partea altor organe afectate: hipertensiune arterială sau semne de insuficiență renală (cefalee severă, retenție hidrosalină, grețuri, confuzie ), dureri abdominale cu grețuri sau vărsături, tulburări ale funcțiilor mentale, astenie fizică, mialgii, artralgii, dureri toracice cu dispnee, dureri pelvice sau testiculare. Arterita cerebrală poate determina tromboze cu ischemie cerebrală, hemoragii

61

subarahnoidiene sau intraparenchimatoasă, apărând adesea tardiv, în evoluția bolii. Neuropatia periferică apare la aproximativ 60% din pacienți, este adesea asimetrică caracterizându-se prin mononevrite multiplex, polineuropatie distală sau neuropatie cutanată [110, 111]

Investigațiile paraclinice evidențiază infecția cu virusul hepatic B, anemie, VSH crescut, modificări ale funcției renale cu creșterea ureei și creatininei, ANCA prezenți. Arteriografia poate arăta microanevrisme la nivelul arterelor mici și medii de la nivel renal sau la nivelul viscerelor abdominale. EEG arată o încetinire a activității cerebrale în cursul encefalopatiei sau în delirul toxic. Examenul LCR este adesea normal. Biopsia arterelor mici de la nivelul viscerelor abdominale și angiografia ajută la stabilirea diagnosticului . [109]

DIABETUL ZAHARAT

Diabetul zaharat este o afecțiune generală care afectează populația, însă boala are o prevalență mai mare la pacienții cu hepatite cronice severe sau ciroze. Unele studii au sugerat că diabetul zaharat este mai frecvent la pacienții cu infecții virale hepatice cu sau fără ciroză, mai ales la cei cu infecție virală C comparativ cu cei cu infecție virală B.[108] Efectul posibil al diabetului zaharat asupra progresiei afectării virale nu este încă pe deplin cunoscută. La pacienții cu steatoză hepatică nonalcoolică, diabetul se asociază cu o creștere a biomarkerilor distrucției hepatice, în special cu o creștere a transaminazelor. Studii recente au demonstrat că prezența diabetului sau a rezistenței la insulină se poate asocia cu o fibroză crescută hepatică, mai ales la cei cu infecție virală C.[112]

CRIOGLOBULINEMIA MIXTĂ

Primele date despre crioglobulinemie au fost publicate în 1966 și a fost descrisă ca o afecțiune caracterizată prin erupție purpurică nontrombocitopenică după expunerea la frig, însoțită de slăbiciune, neuropatii, hepato-splenomegalie, artralgii generalizate. Ulterior, studiile au evidențiat prezența crioglobulinelor în ser în special la pacienții cu infecție virală C sau cu antigen HBs prezent. Complexele imune circulante la pacienții cu hepatită cronică virală B cu antigen HBe negativ pot fi responsabile de asocierea crioglobulinemiei la acești pacienți. Tratamentul cu α- IFN pare să dea rezultate bune.[108, 113]

62

V.2. HEPATITA CRONICĂ VIRALĂ C- MANIFESTĂRI EXTRAHEPATICE

Virusul hepatic C (VHC) se asociază cu o serie de modificări imunologice și manifestări extrahepatice, mai ales cu crioglobulinemia mixtă, limfoame non-Hodgkin, glomerulonefrite membranoproliferative și porfiria cutanea tarda, mai rar cu sindromul Sjogren, tiroidite autoimune, lichen plan, diabet zaharat. Simptome nespecifice ca artralgiile sau astenia fizică se pot însoți mai frecvent la acești pacienți. Asocierea cu aceste manifestări variază în funcție de genotip, de aria geografică și probabil de influențele genetice.[114]

Virusul hepatic C activează limfoproliferarea, cu implicarea limfocitelor T și B, cu apariția în ser a factorului reumatoid, a crioglobulinelor, autoanticorpilor responsabili de apariția leziunilor hepatice și extrahepatice. Crioglobulinemia este cea mai frecventă manifestare extrahepatică întâlnită la acești pacienți.

CLASIFICAREA MANIFESTĂRILOR EXTRAHEPATICE

RENALE:

GLOMERULONEFRITA MEMBRANOPROLIFERATIVĂ NEFROPATII INTERSTIȚIALE

VASCULITE:

CRIOGLOBULINEMIA MIXTĂ

POLIARTERITA NODOASĂ

SINDROMUL SJOGREN

CUTANATE:

PORFIRIE CUTANATĂ TARDA

LICHEN PLAN

HEMATOLOGICE:

ANEMIE APLASTICĂ

PURPURĂ TROMBOCITOPENICĂ IDIOPATICĂ

ENDOCRINOLOGICE:

TIROIDITA HASHIMOTO

63

DIABETUL ZAHARAT

ALTE MANIFESTĂRI:

MANIFESTĂRI REUMATISMALE

FIBROZĂ PULMONARĂ

MANIFESTĂRI NEUROLOGICE

V.2.1 INTERFERENTE VIRUS HEPATIC C-AFECTAREA RENALĂ

Asocierea infecției cu virus C cu afecțiuni determinate prin mecanism imunologic a fost sugerată în 1990 de către Pascual, care a raportat doua cazuri de infecție virală C asociate cu crioglobulinemia mixtă.[115]

Afectarea renală apare frecvent la pacienții cu infecție cu virusul hepatic C, cea mai frecventă formă fiind glomerulonefrita membranoproliferativă cu sau fără crioglobulinemie, în general asociindu-se cu ani de evoluție ai infecției virale.[116, 117]

Manifestările clinice sunt minore, majoritatea pacienților rămânând nediagnosticați. Afectarea glomerulară apare frecvent ca o componentă a sindromului de crioglobulinemie mixtă, constatându-se la pacienții cu semne ale acestuia, incluzând purpură palpabilă, artralgii, neuropatie, slăbiciune, mai rar semne de vasculită sistemică severă, cu dureri abdominale sau manifestări cardiovasculare, pulmonare sau determinate de afectarea SNC. Glomerulonefritele crioglobulinemice sunt diagnosticate frecvent între decadele 5 și 6, la majoritatea pacienților, fiind mai frecventă la femei decât la bărbați [118, 119].

Virusul hepatic C (VHC) infectează limfocitele circulante B și stimulează sinteza de factor reumatoid de tip Ig M responsabil de apariția crioglobulinemiei mixte de tip III, capabil de a se lega de anticorpii anti VHC de tip Ig G, alcătuind complexe imune circulante, care se pot depune în capilarele glomerulare, la nivel subendotelial și mesangial, stimulând proliferarea și infiltrarea leucocitară [119, 120].

Cel mai frecvent sindrom clinic este proteinuria izolată, uneori asociată cu hematurie microscopică, aproximativ 50% evoluând spre insuficiență renală [119]. Aproximativ 25% din pacienți prezintă sindrom nefrotic cu proteinurie masivă și hipoalbuminemie, fără a avea crioglobuline circulante.

64

Nefritele acute, prezente la 20-25% din pacienți se caracterizează prin proteinurie masivă de tip nefrotic, hematurie macroscopică și leziuni severe la biopsia renală. Precipitarea masivă a crioglobulinelor în lumenul capilarului glomerular se asociază cu infiltrat monocitar, precum și semne și simptome de vasculită renală și sistemică [120, 121, 122] Nefritele acute se complică cu insuficiență renală oligurică, reversibilă la tratamentul cu corticosteroizi și ciclofosfamidă [120]

Hipertensiunea este cea mai frecventă manifestare a afectării renale, fiind severă și dificil de controlat, putând predispune la afectare cerebrală și cardiovasculară . Edemele la nivelul membrelor inferioare pot fi primul semn de afectare renală, ele putând predispune la ulcere gambiere și alte complicații [118]

Aproximativ 30% din pacienți au remisiuni parțiale sau totale, chiar dacă au prezentat sindrom nefrotic sau semne de insuficiență renală, 30% evoluează lent după ani de evoluție spre insuficiență renală, prezentând momente reversibile de exacerbare de tip nefrită acută sau sindrom nefrotic, o treime din ei, în ciuda persistării modificărilor urinare și a disfuncției renale medii, nu evoluează spre insuficiență renală [118, 120].

Insuficiența renală, care necesită dializă, apare relativ rar, majoritatea decedând prin afectare cardiovasculară. Analizele de laborator pot evidenția în cazul glomerulonefritelor crioglobulinemice, prezența factorului reumatoid de tip IgG policlonal sau IgM monoclonal, valori scăzute sau normale ale componentelor complementului seric, anticorpii anti HCV și prezența ARN VHC prin tehnici PCR, iar microscopia electronică poate evidenția leziuni de mesangioliză, infiltrat leucocitar, depozite de complexe imune la nivel subendotelial și subepitelial [117-120] .

Tratamentul glomerulonefritei la pacienții cu HCV include hipotensoarele, statine, corticosteroizi, citostatice, plasmafereză, interferon, ribavirină.

V.2.2. AFECTAREA VASCULARĂ IMUN MEDIATĂ

Crioglobulinemia, descrisă pentru prima dată de Brouet în 1974, se caracterizează prin prezența unor anticorpi cu proprietăți chimice specifice, numite crioglobuline, fiind capabile să precipite la temperaturi scăzute și să se redizolve la creșterea temperaturii. Factorii de risc sunt diverși, etiologia acestei afecțiunii fiind incomplet cunoscută. Virusul hepatic C se asociază frecvent cu această afecțiune [115, 122, 123]

65

Prezența crioglobulinelor serice se asociază gradul afectării hepatice și cu durata bolii.

Crioglobulinemia face parte din afecțiunile determinate de prezența complexelor imune, pacienții având depozite intravasculare de crioglobuline, fracțiuni de complement (C3a, C5a), ce acționează ca mediatori chemotactici ai inflamației.[124]. Virusul hepatic C, prin activitatea sa hepatotropă și limfotropă se asociază frecvent cu crioglobulinemia, prin implicarea genei Bcl2 [124, 125]. Activarea protooncogenei antiapoptotice poate fi responsabilă de activarea limfocitelor B, determinând creșterea producției de autoanticorpi, inclusiv crioglobuline. Acest lucru se asociază și cu creșterea frecvenței afecțiunilor limfoproliferative [125]. Creșterea prevalenței modificărilor la nivelul genei bcl-2( translocația 14;18 cel mai adesea ) s-a constatat adesea la pacienții cu hepatită virală C, în special la cei ce asociază și crioglobulinemia mixtă ( tipul II ). Creșterea raportului bcl-2 / Bax la acești pacienți și modificarea aranjamentului genetic la administrarea terapiei antivirale, sugerează că această translocație se asociază cu funcția antiapoptotică a genei Bcl-2, care e modificată adesea la pacienții cu infecție virală [115, 125]

Manifestările clinice pot include acrocianoza, hemoragii retiniene, fenomene Raynaud severe sau tromboze arteriale, manifestări articulare ( artralgii, artrite la nivelul articulațiilor IFP, MCF, genunchi și gleznă), afectare renală prin complexe imune și leziuni de purpură vasculară. [127, 128, 129]

Datele de laborator pot permite evidențierea crioglobulinelor, anemie, leucocitoză, modificări urinare, hepatice, factor reumatoid prezent, VSH crescut, nivel scăzut de C4.

Diagnosticul de certitudine se pune pe biopsia vasculară sau renală, pe evidențierea crioglobulinelor și a infecției virale. Biopsia poate evidenția modificări vasculare de tip vasculită leucocitoclazică, depozite intraluminale de crioglobuline, în special la nivelul glomerulilor renali [128, 129]

Sindromul Sjögren se caracterizează în principal prin infiltrat limfocitar la nivelul organelor exocrine. Majoritatea pacienților prezintă sindrom siica cu xeroftalmie, xerostomie și afectarea glandelor parotide. Fiziopatologia acestui sindrom este încă necunoscută. Deși

66

există o predispoziție genetică prin prezența antigenului HLA–B8, HLA-Dw3, și HLA-DR3, cercetătorii au constatat o incidență crescută a corelației hepatitei virale C cu acest sindrom. [115]

Incidența acestei asocieri variază în unele studii între 55 și 77%, corelându-se cu sexul feminin, vârsta, leziunile histopatologice hepatice, fără a se corela cu durata bolii, genotipul viral sau prezența cirozei hepatice. [132, 133]

Biopsia glandelor salivare la pacienții cu hepatite virale a arătat adesea prezența infiltratului limfocitar la acest nivel. Ipoteza cea mai frecvent vehiculată este cea a autoimunității conform căreia VHC este eliminat salivar, ductile salivare fiind afectate de limfocitele T sensibilizate față de antigenele ductale [114, 133, 134]

Există însă și studii care privesc cu reținere asocierea hepatitelor virale cu acest sindrom. [134]

V.2.3. MANIFESTARI ENDOCRINE

DIABETUL ZAHARAT

Virusul hepatic C (VHC) poate induce creșterea rezistenței la insulină, fără a se asocia cu gradul leziunilor hepatice , dar variind cu genotipul viral. Rezistența la insulină poate contribui la fibroză progresivă la pacienții cu acest virus. [135]

Studiile recente au evidențiat asocierea infecției cu VHC cu apariția diabetului zaharat tip II, aceasta asociere fiind mai frecventă la pacienții cu VHC decât la populația generală sau față de cei cu alte afecțiuni hepatice [135, 136]. Rezistența la insulină joacă rol important în dezvoltarea diabetului zaharat de tip II, ea fiind cel mai bun factor predictiv pentru dezvoltarea acestuia, precedându-l cu 10-20 ani .[136]

Mecanismele implicate sunt încă incerte. Hiperinsulinemia poate stimula direct proliferarea celulelor hepatice stelate și sinteza de matrix extracelular. Pe de altă parte, valorile crescute ale glicemiei și hiperinsulinemia pot stimula factorul de creștere tisular și citokinele implicate în patogenia fibrozei hepatice [137, 138]. Activarea TNF în infecția cu VHC se poate corela cu gradul de activitate al bolii, nivelul crescut al acestuia fiind factor de prognostic negativ la terapia antivirală. [139, 140]

67

Rezistența la insulină pare să fie dependentă de genotipul viral și joacă un rol important în activitatea necroinflamatorie hepatică, ca de exemplu în steatoza hepatică nonalcoolică. Unele studii arată ca aceasta ar avea și rol predictor în ceea ce privește răspunsul la terapia antivirală [140, 141] S-a constatat incidența crescută a diabetului zaharat tip II la pacienții cu infecția cu VHC genotipul 1 și 2, deși cei cu genotipul 3 au fibroză hepatică severă [142, 143].

Virusul însuși sau răspunsul inflamator al gazdei la infecția virală pot contribui la dezvoltarea rezistenței la insulină și la creșterea riscului de apariție a diabetului zaharat [140]

Factorii favorizanți pentru apariția diabetului zaharat la pacienții cu infecția cu virusul hepatic C sunt, de asemenea, indexul de masa corporală, vârsta înaintată, istoricul familial, negrii și hispanicii. [136, 143]

AFECTAREA TIROIDIANĂ

Mai multe studii susțin existența unei corelații între infecția virală C și funcția glandei tiroide, disfuncțiile tiroidiene incluzând hipotiroidismul, hipertiroidismul, anticorpii anti-tireoglobulină, anti-tireoperoxidaza, antigenul microsomal și receptorul hormonului tireotrop.[115]

Unii pacienți prezintă o tiroidită autoimună care debutează cu un episod de hipertiroidie, care apoi se transformă într-o hipotiroidie.[144]

Mulți autori susțin că modificările funcției tiroidiene apar până la inițierea tratamentului cu interferon și au o frecvență mai mare decât la pacienții cu infecție virală B.[145]

Mecanismele patogenice includ faptul că modificările imunologice în infecția virală C influențează în sens negativ funcția tiroidiană, în timp ce disfuncția tiroidiană poate influența metabolismul hepatic.

O concentrație crescută de hormoni T3, T4 determină modificări parenchimatoase hepatice, cu destabilizarea membranei hepatocitare.

Heller J, Musialik consideră că anticorpii anti-tireoglobulină reprezintă un factor de risc pentru apariția tiroiditei autoimune, mai ales la pacienții care sunt candidați la terapia cu interferon,astfel că în prezent mulți autori susțin că la pacienții cu infecție virală C, în special femeile, ar trebui testate pentru testele tiroidiene (TSH, T3, T4), precum și pentru anticorpi anti-tireoperoxidază.[144]

68

In prezent există trei ipoteze patogenice de apariție a tiroditei autoimune: lezarea directă a glandei tiroide prin mecanism antigenic, defectul limfocitelor T supresoare și tulburări ale funcției TSH reglatoare.[144, 146]

Unii autori susțin că afectarea tiroidiană ar fi determinată de localizarea intratiroidiană a virusului C [146].

Prevalența anticorpilor anti-tiroidieni variază între 4.6 și 48% la pacienții cu infecție virală C [144].

V.2.4. MANIFESTĂRI EXTRAHEPATICE CUTANATE

Infecția cu virusul hepatic C se poate asocia cu o serie de manifestări extrahepatice, inclusiv cutanate, întâlnite la 20-40% din pacienții dermatologici și la 15-20% din pacienții generali [115]

Studiile au evidențiat prezența particulelor virale la nivelul celulelor epidermice, limfocitelor, celulelor prezentatoare de antigen și vaselor sangvine [147]

În infecția cu virusul hepatic C, la nivelul tegumentelor pot avea loc fenomene patologice, datorită modificărilor răspunsului imun. Vasculita leucocitoclazică din cadrul crioglobulinemiei mixte este unul dintre exemple. Pe de altă parte, manifestările cutanate pot fi determinate ca răspuns al afectării altor organe în cadrul infecției virale, ca de exemplu în tiroidita autoimună. [115,147]

Hepatita cronică virală C poate degenera în carcinom hepatocelular și să se însoțească de manifestări cutanate ca steluțele vasculare sau eritemul palmar. Alte leziuni cutanate se asociază infecției virale, însă mecanismul patogenic este incomplet cunoscut:

Sindromul Behcet caracterizat prin apariția de ulcerații la nivelul mucoasei orale, genitourinare și uveite, la pacienții tineri între 20—30 ani

Prurigo nodular : apariția unor noduli inflamatori keratozici pe fețele de extensie ale brațelor, picioarelor, trunchiului, pruriginoase;

Lichen plan

Porfiria cutanea tarda

Alte manifestări: în cadrul sialadenitei, vitiligo, eritem nodos, s.a.[147, 148]

69

Porfiria cutanea tarda (PCT) reprezintă cel mai frecvent tip de porfirie, caracterizat prin semne dermatologice, incluzând fragilitatea tegumentelor și erupție papulo-buloasă la nivelul mâinilor și feței, simptomatologie ce se accentuează după expunerea la soare. Aceste manifestări sunt determinate de depozitarea uroporfirinelor și parțial de decarboxilarea porfirinelor la nivelul tegumentelor. [148]

Infecțiile virale par să fie implicate în etiopatogenie. Deși, inițial s-a considerat că doar virusul hepatic B ar avea acest rol, ulterior s-a constatat că și virusul imunodeficienței umane și virusul hepatic C ar avea acest rol [149].

Pacienții cu PCT au o evoluție cronică a afecțiunii cu prezența unor leziuni papulo-buloase la nivelul mâinilor, brațelor și feței, cu evoluție îndelungată spre vindecare, precum și leziuni hepatice de tipul hepatitei, cirozei sau carcinomului hepatocelular [150]. Tegumentul afectat poate prezenta și tulburări de tipul neuropatiei senzitive.

Biopsia cutanată poate evidenția leziuni buloase subepidermice cu infiltrat inflamator minim, exces de țesut colagen, de elastină, și depozite de material hialin în derm, leziuni ale membranei bazale dermoepidermice [150]. In unele cazuri este necesară și puncția biopsie hepatică.[151]

Lichenul plan este o afecțiune caracterizată prin prezența unor erupții papulare pruriginoasă, cu contur poligonal, de culoare violacee și uneori cu suprafața plană, întâlnite adesea la nivelul suprafețelor flexoare ale extremităților, pe mucoase și în zona genitală, părând să fie determinat de reacții mediate imunologic [152].

Din punct de vedere fiziopatologic, lichenul plan pare să fie determinat de modificări de cauză necunoscută a răspunsului imun celular. Studiile au demonstrat o asociere între lichenul plan și infecția cu virus hepatic C precum și cu ciroza biliară primitivă. [152, 153]

Cauza exactă a afecțiunii este încă necunoscută. Patogenia pare să aibă la bază mecanisme mediate imunologic.

VHC se poate replica la nivelul celulelor epiteliale atât la nivelul leziunilor cât și în zone fără leziuni, însă acest lucru nu justifică pe deplin apariția lichenului plan [154, 155]

Virusul are capacitatea de a modifica funcția moleculelor de clasa II a de histocompatibilitate, influențând celulele prezentatoare de antigen și cele dendritice să stimuleze celulele T. Scăderea secreției de IFN-γ și de IL-12 modifică de asemenea răspunsul

70

celulelor T. Un alt mecanism posibil implicat în inhibarea răspunsului moleculelor de clasa II de histocompatibilitae, ar fi determinată de regiunea hipervariabilă (HVR1) de la nivelul proteinei de înveliș E2, care suprimă limfocitele CD4+. HVR1 acționează ca un antagonist de receptor T [155]

Majoritatea cazurilor au evoluție insidioasă. Leziunile inițiale sunt localizate la nivelul suprafețelor flexoare, ulterior, după o săptămână sau mai mult se dezvoltă o erupție generalizată, pruriginoasă. Leziunile hipertrofice sunt extreme de pruriginoase. Leziunile orale pot fi asimptomatice sau însoțite de o senzație de arsură sau pot fi chiar dureroase când apar eroziunile. În peste 50% din cazuri , leziunile cutanate se remit în mai puțin de 6 luni, la nivelul mâinilor, însă, leziunile pot persista ani [154].

Din punct de vedere clinic, caracteristic sunt niște linii fine, albe numite striuri Wickam. [154, 155]

V.2.5 MANIFESTĂRI HEMATOLOGICE

Anemia hemolitică, ca afecțiune autoimună a fost frecvent raportată la pacienții cu HCV, mai ales în timpul și după tratamentul cu interferon, și mult mai rar ca manifestare extrahepatică.

Manifestările extrahepatice hematologice au fost raportate în literatură între 1 și 2%. Datele clinice și biopsia hepatică susțin că mecanismul implicat este imun mediat, cu implicarea răspunsului imun T intrahepatic [116, 156]

La pacienții cu anemie hemolitică, limfocitele citotoxice sunt localizate în măduvă osoasă, secretând cantități mari de interferon, precum și limfokine ce stimulează secreția de CD4 și CD8, acestea influențând și activitatea necrotico-inflamatorie hepatică la pacienții cu infecții virale hepatice.[45]

Analizele moleculare la nivelul receptorului T celular, au arătat modificări în ambele boli autoimune (hepatita virală și anemia hemolitică) [156].

Primele simptome ale anemiei hemolitice includ dispneea la eforturi mici, astenia fizică, palpitațiile, în formele avansate pacienții prezentând stări confuzionale, letargie, tulburări de ritm.

71

Trombocitopenia la pacienții cu HCV. Deși în literatură au fost raportate cazuri de hepatite cronice virale C și trombocitopenie (definită ca număr de trombocite<100000/mmc), rolul infecției virale în mecanismul etiopatogenic al acesteia nu este încă pe deplin cunoscut.

Scăderea numărului de trombocite s-ar putea datora hipersplenismului, scăderii secreției de trombopoetină sau supresiei medulare indusă de virus, modificări imunologice cu apariția de anticorpi antitrombocitari sau de complexe imune ce fixează secundar trombocitele. Virusul hepatic C interacționează cu glicoproteina membranară VI trombocitară, influențând secreția de imunoglobuline [45, 157]

Gradul de asociere hepatită -trombocitopenie este necunoscut, dar la cazurile studiate, rolul central îl ocupă fibroza hepatică. Majoritatea pacienților prezintă leziuni severe hepatice, ciroză hepatică și carcinom hepatocelular.

Mulți autori susțin că trombocitopenia la pacienții cu HCV ar putea fi un factor predictiv pentru activitatea inflamatorie hepatică.[158, 159]

In plus, ficatul reprezintă principalul sediu de secreție al trombopoetinei, citokina care influențează secreția de megacariocite și numărul seric al trombocitelor, nivelul seric al acestora fiind influențată de gradul de fibroză hepatică.[160]

Limfoamele la pacienții cu HCV. Studiile recente au demonstrat că prezența infecției cu VHC dublează riscul de apariție a limfoamelor, în special cele non- Hodgkin. Rolul virusului hepatic C în apariția crioglobulinemiei și a limfoamelor a fost mult timp discutată și cercetată [161,162, 163]. Datele recente au arătat că și infecția cu HGV s-ar asocia cu manifestări extrahepatice, în special hematologice.[164]

Virusurile hepatice sunt hepatotrope și limfotrope, fiind implicate în apariția unor procese maligne ca limfoamele, carcinomul hepatocelular. Persistența infecției cu VHC stimulează oncogeneza, prin excesul de imunoglobuline secretate în urma activării limfocitare, care pot suferi mutații genetice și să inducă apariția neoplaziei [163]. VHB stimulează activitatea factorilor hematopoetici de creștere și răspunsul imunologic celular și umoral, ceea ce ar putea duce deasemenea la apariția proceselor neoplazice [165, 166].

Asocierea dintre infecția cu VHC și limfomul non Hodgkin a fost sugerată pentru prima dată de Ferri și colaboratorii săi în trei studii diferite, aproximativ 30 % dintre pacienți prezentând această asociere, în special cei ce asociază și crioglobulinemia mixtă.

72

Alte studii au arătat că în unele țări coinfecția HIV și HCV predispun deasemenea la limfoame, însă în SUA aceste studii nu au fost confirmate [167, 168]

Este însă neclar dacă asocierea aceasta este dependentă de genotipul viral, studiile raportate de Ferri sugerând ca genotipul 2 ar fi mai frecvent implicat [168].

V.2.6. ALTE MANIFESTĂRI EXTRAHEPATICE

Fatigabilitatea

Majoritatea pacienților cu infecție cu HCV rămân mult timp asimptomatici, totuși, astenia fizică este un simptom adesea întâlnit, fiind considerate de unii autori ca o manifestare extrahepatică [169]. Studiile au arătat că fatigabilitatea se poate asocia cu alte manifestări extrahepatice ca cele reumatologice, neurologice, sau nefrologice,precum și cu diabetul zaharat, hipertensiunea arterială și crioglobulinemia. Fatigabilitatea a fost întâlnită la 53% din pacienți, la 17% din ei fiind severă, împiedicând activitatea. S-a constatat mai frecvent la femei, în jurul vârstei de 50 ani, care asociau și ciroza, purpura și depresie [170, 171]. S-a sugerat ca infecția cu HCV ar crește riscul de apariție al depresiei și fatigabilității. [172, 173]. Recent studiile de specialitate au considerat că fatigabilitatea este mai de grabă o manifestare psihologică decât un efect psihologic [172].

Studiul publicat de McDonald și colaboratorii săi a constatat o corelație redusă între fatigabilitate și gradul de fibroză hepatică, însă există o corelație crescută între aceasta și prezența anxietății sau depresiei. Studiile publicate de Obrahai și colegii săi au arătat că fatigabilitatea și modificările psihiatrice apar nu numai la pacienții cu infecție cu VHC dar și la cei cu afectare hepatică alcoolică, metabolică sau în afecțiuni hepatice acute. Nu s-au constatat corelații între fatigabilitate și genotipul viral, consumul de alcool sau disfuncții tiroidiene [174]

Fibromialgia

Fibromialgia este o afecțiune care constă în dureri musculare și articulare difuze, asociate afectării tendinoase și însoțită de o serie de alte simptome nespecifice.

Fibromialgia și hepatita cronică virală C au manifestări clinice comune incluzând afectarea musculoscheletală și astenia fizică. Există o conexiune strânsă între aceste manifestări și intervenția citokinelor, în special IL 2, receptorul pentru IL-2, IL-8,

73

antagonistul de receptor pentru IL-1,creșterea nivelului de IL-1 și IL-6 produse prin stimularea celulelor mononucleare periferice la pacienții cu fibromialgie de mai mult de 2 ani, și creșterea gp 130, secretată de neutrofile [173, 174].

Creșterea receptorului solubil al IL-6 și a antagonistului de receptor pentru IL-1 s-a constatat numai la pacienții care asociază fibromialgie și depresie [172].

În plus, unele studii arată că modificarea profilului citokinic la pacienții cu HCV și fibromialgie poate determina hiperalgezie sau alte simptome mediate neurologic, prin prezența receptorilor pentru citokine la nivelul celulelor gliale și limfocitelor, influențând axul hipotalamo-epifizo- adrenal. Relația dintre HCV și fibromialgie este destul de controversată, în viitor încercându-se o terapie care să vizeze modificările imunologice din cadrul acestora [172, 174].

Alte manifestări

Pacienții cu hepatite cronice virale, mai ales cei cu infecție virală C, prezintă frecvent manifestări reumatologice. Artritele sunt apanajul infecției acute , dar distrucția articulară este foarte rară. Artralgiile au caracter asimetric, însoțite sau nu de modificări cutanate. Mecanismele implicate par a fi tot imunologice, observându-se la nivel sinovial depozit de imunoglobuline, complement și particule virale. [175]

Studiile recente au urmărit asocierea VHC cu sindromul Sjogren, poliartrita reumatoidă, LES și sindromul antifosfolipidic. Manifestările reumatologice includ artralgii, artrite, fatigabilitatea, vasculite, sialoadenite (Sjogren- like).Tratamentul manifestărilor reumatologice severe ridică importante probleme, mai ales că tratamentul de bază al acestora se poate asocia cu complicații majore hepatice.[176, 177]

Pacienții cu hepatite cronice virale pot avea ca manifestări extrahepatice, tulburări neurologice, mai ales de tipul neuropatiei periferice, însă acest lucru este destul de controversat.[45]

74

Capitolul VI

PARTEA SPECIALĂ

VI.1. OBIECTIVELE STUDIULUI

Lucrarea de față și-a propus un subiect din ce în ce mai dezbătut în literatura de specialitate: asocierea manifestărilor extrahepatice la pacienții cu hepatite cronice virale, profilul modificărilor imunologice la acești pacienți, precum și rolul predictiv al acestora.

Studiile efectuate au arătat că infecțiile virale hepatice asociază frecvent leziuni ale altor organe, mecanismele implicate fiind imun mediate.

Scopul studiului a fost analiza datelor clinice, biologice, imunologice și anatomopatologice la pacienții cu hepatite cronice virale, identificarea manifestărilor extrahepatice asociate, precum și stabilirea unor valori predictive ale alterărilor imunologice.

VI.2.MATERIAL ȘI METODĂ

Studiul a avut un caracter prospectiv, fiind efectuat pe un lot de 307 pacienți cu infecție virală B, cu sau fără alte coinfecții, și 330 de pacienți diagnosticați cu infecție virală C, internați și urmăriți pe o perioadă de 3 ani – ianuarie2004- decembrie 2007.

Este un studiu clinic prospectiv deschis, multicentric, desfășurat în Clinica I Medicală a Spitalului Județean Craiova și în Clinica Medicală I a Spitalului Clinic Județean de Urgență Constanța.

Investigațiile biologice s-au efectuat în laboratorul Spitalului Clinic Județean Craiova, Spitalului Clinic Județean Constanța și Laboratorul Synevo (Medicover Rombell)- Constanța. Explorările histopatologice și imunohistochimice au fost realizate de Departamentul de anatomie patologică al UMF Craiova.

Studiul a fost condus în concordanță cu principiile ― Declarației Drepturilor Omului‖ de la Helsinki, urmărind permanent siguranța și starea de bine a pacienților, supravegherea și deciziile medicale fiind totdeauna în favoarea pacienților incluși în studiu. Fiecare pacient a fost informat și a semnat un consimțământ de participare la studiu. Toți pacienții incluși în studiu au fost investigați înaintea inițierii tratamentului antiviral.

75

Criteriile de includere în studiu au fost:

Vârsta cuprinsă între 18-70 ani,

Teste paraclinice de obiectivare a infecției virale B, C, D

Pacienți cunoscuți cu infecție virală înaintea introducerii în studiu,

Pacienți diagnosticați de novo cu infecție virală în cursul spitalizării

Prezența sau absența altor afecțiuni asociate, care sunt nominalizate ca manifestări extrahepatice ale infecției virale

Au fost excluși din studiu pacienții cunoscuți cu ciroză hepatică și consumatori de

alcool.

S-a întocmit o fișă de urmărire pentru fiecare pacient inclus în studiu, având consemnate:

Date personale (nume, prenume, vârsta, sex, condiții de viață și muncă)

Prezența eventualilor factori de risc pentru infecție

Antecedentele personale patologice și heredo-colaterale

Istoricul afecțiunii

Semne și simptome clinice

Investigații de laborator (hemoleucograma completă, uree, creatinina, sumar urină, transaminaze, GGT, markerii virali, ADN/ARN viral, teste imunologice)

Examenul histopatologic al biopsiei hepatice

Toate datele au fost incluse într-o bază de date creată în SPSS.

Tabloul clinic a fost comun tuturor formelor de hepatită cronică, cu particularități legate de etiologie. Clinic s-a urmărit prezența simptomatologiei secundare afectării hepatice și prezența altor simptome secundare unor afecțiuni asociate. Majoritatea pacienților cu hepatite cronice au fost asimptomatici, însă unii dintre aceștia au prezentat astenie fizică, hepatalgii de efort, sindrom dispeptic nesistematizat.

Examenul obiectiv efectuat pe aparate și sisteme a urmărit:

Statusul nutrițional ( talia și greutatea)- am urmărit greutatea în kilograme și talia în centimetri la fiecare bolnav. Valorile obținute au fost raportate la greutatea ideală calculată pe baza formulei Asigurărilor Metropolitane de la New York. La femei valorile obținute s-au înmulțit cu 0.9

76

Examenul tegumentelor și mucoaselor- s-a urmărit prezența icterului sclerotegumentar și subicterului scleral. Paloarea tegumentară este un alt semn fizic important,asociat prezenței anemiei și apreciat prin examinarea atentă a tegumentelor și mucoaselor, a patului unghial, feței palmare a mâinilor, mucoasei conjunctivale, bucale și faringiene. Aprecierea anemiei poate fi influențată de vasoconstricție, hiperpigmentare constituțională sau dobândită.

La examenul obiectiv al tegumentelor și mucoaselor am urmărit de asemenea prezența purpurei peteșiale sau echimotice(asociate trombocitopeniei, LES, LLC,PAN, etc), ulcerații cutaneo mucoase, fenomen Raynaud, acrocianoza, livedo reticularis.

Examinarea sistemului ganglionar superficial – s-a făcut simetric, începând cu regiunea occipitală, retro- și preauriculară, submandibulari, laterocervicali, supraclaviculari, axilari, epitrohleeni, inghinali și spațiul popliteu. În prezența unei adenopatii s-au descris următoarele elemente semiologice: localizarea, dimensiunile, numărul ganglionilor din fiecare zonă, consistența, mobilitatea pe planurile superficiale și profunde, sensibilitatea la palpare.

În lotul studiat am identificat adenopatii la pacienții cu limfoame sau leucemii. La aceștia adenopatiile au fost localizate în regiunile predilecte (laterocervicale, supraclaviculare, axilare, inghinale), cu consistență crescută, dimensiuni moderate, nedureroase la palpare, aderente la planurile superficiale și/sau profunde.

Examinarea aparatului respirator a urmărit prezența unor sindroame de condensare și prezența unui epanșament pleural.

In examinarea aparatului cardio-vascular am ținut cont de vârsta pacientului, starea anterioară cardio-vasculară a pacientului, urmărind frecvența cardiacă, ritmul regulat sau neregulat,prezența unor sufluri precum și valorile tensiunii arteriale.

La examinarea aparatului digestiv s-au urmărit eventualele modificări la nivelul cavității bucale, gradul hepatomegaliei și splenomegaliei, precum și caracteristicile semiologice ale acestora.

Evaluarea paraclinică a parcurs etapa de laborator și cea imagistică, precum și biopsia hepatică efectuată la 211 pacienți cu hepatită cronică virală B și 210 pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală C, în scopul inițierii tratamentului antiviral.

77

Evaluarea de laborator a urmărit:

sindromul de insuficiență hepatică: albumine serice, timp Quick și indice de protrombină

sindromul bilioexcretor:bilirubina serică, enzime de colestază (fosfataza alcalină,

gamaglutamil-transpeptidaza)

sindromul de hepato-citoliză: alanin aminotransferaza (ALT), aspartat aminotransferaza (AST), lactat dehidrogenaza (LDH),

sindromul de inflamație mezenchimală: electroforeza proteinelor serice, imunoelectroforeza, complementul seric,

determinarea etiologiei: AgHBs, AgHBe, Ac anti-HBe, Ac anti-VHC, Ac anti-

VHD

Tabel nr. 10 Parametrii biologici analizaț i

78

teste imunologice determinarea antinucleari, anticorpi antitiroidieni, anti circulante, etc

C3, factor reumatoid, crioglobuline, anticorpi LKM1, anti GOR, ASMA, complexe imune

Determinările bioumorale ale glicemiei, ureei, creatininei, colesterolului, trigliceridelor, bilirubinei, AST, ALT și imunogramei au fost realizate prin metode specifice de laborator. Acestea sunt prezentate în tabelul următor.

Colesterolul s-a determinat prin metoda enzimatică endpoint. Concentrația minimă detectabilă este de 0.43 mmol/l. Valori peste 210mg/dl au fost considerate patologice.

Trigliceridele s-au dozat prin metoda calorimetrică GPO-PAP, după o hidroliză enzimatică a trigliceridelor cu lipază. Prin hidroliza trigliceridelor se formează glicerol liber, dar glicerolul liber aflat în probă va fi la fel metabolizat și, în consecință va crește fals rezultatul pentru concentrația trigliceridelor. Valori peste 150mg/dl au fost considerate patologice.

ALT(GPT/alanilaminotransaferaza) s-a dozat în UV, metodă standardizată după IFCC.

Valori normale : 9-44UI.

AST (GOT/aspartataminotransferaza) se dozează tot în UV, ca și ALT-ul, metodă optimizată după recomandarea IFCC. AST-ul catalizează transferul grupării amino de pe acidul aspartic pe α-oxoglutarat, în prezența coenzimei NADH. Valori normale: 9-44UI

La pacienții incluși în studiu s-a calculat indicele APRI, folosind următoarea formulă

[178]

APRI = AST(/limita superioară a normalului) × 100 / număr trombocite (109/L)

și urmărind corelații între acesta și gradul de fibroză. Deasemenea s-a calculat raportul AST/ALT. Raportul AST/ALT este normal de 1,33 și reprezintă coeficientul de Ritis.

ALP (fosfataza alcalină) am folosit ca metodă de dozare, metoda colorimetrică. Valori normale: 98-279U/l

GGT-ul a fost determinat prin metoda spectrofotometrică. Valori normale: 11-50U/l.

79

Proteinele specifice (IgA, IgG, IgM, ) se determină prin metoda imunoturbidimetrică.

Valori normale: IgG=100-250 UI/ml (800-2000 mg%), IgA=63-320 UI/ml (90-450 mg%),

IgM=70-330 UI/ml (60-280 mg%)

Testele virusologice s-au efectuat imediat după internarea pacienților și ulterior repetate. S-au efectuat, pentru hepatita virală B: antigen HBs, antigen HBe, anticorpi anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe; pentru hepatita D: antigen delta, anticorpi anti-delta; pentru hepatita virală C : anticorpi anti-VHC. ADN-ul viral B a fost detectat prin metoda PCR (Roche Molecular Systems), cu o limita de detectare între 4 x 102 și 4 x 107 copii/ml. Determinarea ARN VHC s-a făcut prin tehnica Amplicor HCV Monitor TM 2.0 (Roche Molecular Systems) sau Quantiplex TM HCV RNA 2.0( Roche Molecular Systems), limita inferioară de detectare fiind 50UI/L.

Determinarea antigenului HBs s-a făcut prin tehnica ELISA cu determinare calitativă. S-au folosit chituri de reactivi „Hepanostika HBs Ag Uni-Form II‖ produse de Organon Teknica din Germania. Rezultat pozitiv : prezent

Determinarea anticorpilor antivirus hepatic C s-a făcut folosind tehnica ELISA cu kituri de reactivi ORTHO HCV 3.0 ELISA , Testsystem with Enhanced, SAVE (Sample ADDITION Verification) care reprezintă antigene recombinate specifice virusului hepatitei (C 22-3, C 200 și NS5 ).

Testele imunologice utilizate la pacienții incluși în studiu au inclus determinarea complementului seric C, determinarea factorului reumatoid, anticorpii antinucleari, anticorpii anti LKM1, anti-tireoperoxidază, anti-tireoglobulină, ASMA.

Nivelul seric al complementului C3 a fost detectat imunochimic prin metoda Mancini.

Valori normale C3=90-180mg/100ml ser.

Factorul reumatoid este o imunoglobulină, fiind detectat calitativ prin metoda aglutinării cu latex, valorile negative fiind considerate normale.

Complexele imune circulante au fost determinate prin metoda colorimetrică, cu ajutorul polietilenglicolului, cu masa moleculară de 6000, ce determină precipitarea acestora. Valori normale 0-50 unități fotometrice.

Anticorpii antinucleari au fost detectați ca metodă de screening prin metoda imunoenzimatica cu detecție prin fluorescență (FEIA), valori normale: negativ.

80

În funcție de patologia pacientului cu hepatită cronică virală s-au determinat prin metoda ELISA și alți anticorpi. ASMA, anti-LKM1 au fost determinați prin diluții succesive ale serului, prin tehnica imunofluorescenței indirecte, iar anticorpii antitiroidieni au fost detectați prin ELISA, valori pozitive fiind considerate la concentrații ≥12.5U/ml

Crioglobulinele sunt imunoglobuline mono sau policlonale cel mai frecvent de tip IgM, care au proprietatea de a precipita la temperaturi scăzute și de a se redizolva la creșterea temperaturii. Au fost determinate din ser, fiind necesar 15-20 ml sânge, care a fost ținut la cald până la separarea celulelor de ser. Ulterior, serul este ținut la rece (1-4oC), 1-7 zile. Crioglobulinele prezente precipită la temperaturi scăzute. În studiul prezent s-au determinat crioglobulinele din punct de vedere calitativ.

TSH-ul a fost testat la toți pacienții, concomitent cu fT3 și fT4; valori normale au fost considerate pentru TSH între 0.5 și 5 µUI/ml, fT3=230-420 µUI/ml , fT4=0.8-1.8 µUI/ml.

Tabel nr. 11 Interpretarea clinică a valorilor hormonilor tiroidieni

81

ALTE INVESTIGAȚII PARACLINICE

Ecografia abdominală are sensibilitate redusă în hepatitele cronice. Aspectul ecografic a fost normal, sau a relevat:

Hepatomegalie simetrică, cu structură parenchimatoasă mai mult sau mai puțin neomogenă

Discretă dilatare a sistemului portal

Splenomegalie de diferite grade, cu ecostructură discret hipoecogenă

Nici unul din aceste semne nu orientează însă asupra etiologiei hepatitei. Nu a fost identificată ascita sau aceasta a fost în cantitate foarte mică și complet reversibilă. Am urmărit de asemenea eventuale modificări ecografice din partea altor organe (rinichi, pancreas, aparat uro-genital).

Endoscopia digestivă superioară- s-a efectuat în Clinica Medicală I a Spitalului Județean Constanța și în Clinica Medicala I a Spitalului Județean Craiova, în scopul de a identifica prezența varicelor esofagiene/gastrice și a gastropatiei portale, prezența acestor manifestări de hipertensiune portală reprezentând criterii de excludere din studiu.

Am mai utilizat pentru diagnostic:

Radiografia toracică

Radiografii osteo-articulare

– Tomografia computerizată a fost rezervată cazurilor la care s-a ridicat suspiciunea unor procese tumorale sau limfoame.

Biopsia hepatică

Examenul anatomopatologic

Biopsia hepatică reprezintă standardul de aur în diagnosticul histopatologic al hepatitei cronice virale, fiind singura metodă în prezent pentru stabilirea gradului de afectare hepatică, rezultatele acesteia influențând decizia terapeutică. Gradul de fibroză și activitatea necrotico-inflamatorie sunt stabilite prin scoruri de clasificare. Deși există în prezent mai multe scoruri de clasificare, în practică cel mai frecvent folosite sunt scorul Knodell și Metavir.[178]

82

SCORUL HAI MODIFICAT : PUNCTAJUL NECROINFLAMATOR DUPĂ ISHAK ȘI COL.[179]

83

HAI PENTRU SCORUL NUMERIC AL PREPARATELOR DE BIOPSIE HEPATICĂ (KNODELL) [95]

84

SCOR METAVIR [45]

METODE DE RECOLTARE

Din 1958 tehnica biopsiei hepatice a fost îmbunătățită cu introducerea acului Menghini, ce a permis prelevarea unui fragment hepatic cu apariția unor artefacte minore datorate tehnicii. Menghini a imaginat și a pus în practică o tehnică în care acul rămâne în ficat numai timp de aproximativ o secundă, în loc de 5-10 secunde cât este necesar în cazul acului Silverman. În acest scop se folosește aspirația și un ac de tip special care nu trebuie rotit în plagă de puncție pentru obținerea fragmentului tisular. Riscul hemoragiei sporește pe măsura creșterii diametrului acului, astfel că pereții acestuia sunt ultrafini asigurându-se fragmente tisulare relativ mai groase. În practică se utilizează ace de 1,2, 1,4 și 1 mm. Acul utilizat de noi a fost de 1,2 mm. Acul fără stilet este prevăzut cu un scurt punct de oprire de forma unui vârf bont și este lung de 8 cm. [179, 180]

Bolnavul este așezat în poziție de supinație cu capul întors spre stânga, iar brațul drept este ridicat și adus în așa fel încât mâna dreaptă poate prinde marginea patului la înălțimea umărului stâng.

Biopsia se efectuează în spațiul intercostal corespunzător punctului de maximă matitate hepatică, între liniile axilare anterioară și posterioară. După stabilirea reperelor, se dezinfectează tegumentul cu alcool iodat și se efectuează anestezie locală cu xilină 1%. Se perforează pielea cu stiletul. Se montează acul Menghini se fixează la seringă, se pătrunde 4 cm, se aspiră și se puncționează. Se efectuează pansament steril local, bolnavul fiind

85

supravegheat în următoarele 24 h. Fragmentul recoltat este introdus în fixator. Se examinează macroscopic fragmentul biopsic.[181, 182]

Pentru majoritatea afecțiunilor hepatice, biopsia hepatică percutanată este suficientă. Fragmentul trebuie să aibă cel puțin 2 cm. Biopsia laparoscopică este utilă pentru anumite leziuni ce nu pot fi obținute ușor prin biopsia percutanată. De asemenea, există variații între biopsiile hepatice, deoarece acele utilizate variază și ele. Ele variază în funcție de lungimea și lățimea fragmentului, și de apariția artefactelor.

Fragmentul poate fi obținut și prin rezecție chirurgicală în timpul unei intervenții chirurgicale pentru o altă patologie. Este tehnica de elecție pentru leziunile focale localizate la nivelul sau imediat sub capsulă.

O alta metodă utilizată este obținerea de fragment hepatic cu ajutorul unui cateter venos prin vena jugulară, vena cavă inferioară până la nivelul venei hepatice. Biopsia transjugulară este folositoare când pacientul prezintă ascită masivă sau diateza hemoragică. Prin aceasta tehnică, de obicei se obține un fragment ce nu reprezintă întreaga arhitectură hepatică. De aceea, se preferă biopsia transcutanată.[182, 183]

Puncția biopsie are și unele contraindicații:

bolnavi necooperanți

deficitul de protrombină

infecția locală

ascită

icter intens prin obstrucție extrahepatică

anemie marcată

sângerare prelungită la locul de incizia cutanată.

Reacțiile și complicațiile sunt reprezentate de:

Durerea la locul de puncție cu iradiere scapulohumerală dreaptă Durere sau disconfort epigastric

Hemoragie intraperitoneală. Deși rară, este principala complicație letală a biopsiei hepatice. De regulă hemoragia devine manifestă în timpul celor 24 ore care urmează

86

biopsiei. Din fericire hemoragia se oprește spontan și consecințele ei pot fi remediate prin transfuzii izogrup, izoRh;

Peritonita biliară – poate surveni numai în cazul icterului mecanic și reflectă probabil infecția biliară asociată;

Șocul – survine foarte rar după biopsii;

Embolia biliară letală este o complicație rară; a fost citată la un bolnav cu carcinom al ampulei Vater;

Însămânțarea tumorală pe traiectul acului nu este considerată un risc important;

Perforația organelor abdominale – s-au citat cazuri de perforație a colonului ascendent și

veziculei biliare.[184]

Indicațiile clinice ale puncției hepatice sunt:

Excluderea bolilor hepatice în cazul hepatomegalilor evidente

Excluderea unor boli hepatice în prezenta unor teste de puncție hepatică anormale.

Diferențierea obstrucției venoase portale intrahepatice de cea extrahepatică

Monitorizarea evoluției hepatitelor cronice

Evaluarea eficienței terapiei

Identificarea cauzei unei hepatomegalii

Diagnosticul inflamațiilor granulomatoase și a altor afecțiuni inflamatorii

Diagnosticul cancerului hepatic

Valoarea clinică a puncției biopsie hepatice este validată în 72-85% din cazuri.[185]

Limitele biopsiei hepatice sunt:

fragmentul obținut poate fi insuficient pentru prelucrarea histopatologică și evaluarea scorurilor

complicațiile uneori letale ale puncției biopsie

spre deosebire de laparatomie unde fragmentul hepatic poate fi ales, puncția biopsie se poate efectua în cel mai bun caz sub ghidaj ecografic.

aspirația cu ac fin are dezavantajul de a nu reda modificările arhitecturale, care sunt cheia diagnosticului în multe tipuri de leziuni. De asemenea este limitată și în diagnosticul leziunilor inflamatorii difuze fiind cel mai adesea utilizată pentru leziunile înlocuitoare de spațiu.

87

interpretarea fragmentului obținut prin laparoscopie, poate fi îngreunată de dimensiunile fragmentului și de prezența artefactelor de strivire – ce sunt constant prezente în grade variate.

Dificultăți pot apărea la interpretarea fragmentului hepatic obținut prin intervenție chirurgicală:

capsula poate fi îngroșată obținându-se un fragment insuficient de parenchim pentru a fi util unui diagnostic

fibroza capsulară extinsă la nivelul parenchimului hepatic poate mima ciroza

prezența unui infiltrat inflamator cronic subcapsular poate fi interpretat ca hepatită cronică

prezența unui infiltrat inflamator acut în parenchim poate fi sechelă nespecifică a laparoscopiei.

prezenta hamartoamelor de duct biliar poate simula aspectul de carcinom metastatic [184, 185]

Prelucrarea fragmentelor hepatice

Există câteva reguli de bază ce trebuie respectate :

Fragmentul nu trebuie lăsat sa se usuce, nu trebuie contribuit în nici un fel la uscarea lui și trebuie așezat pe tifon umezit în soluție salină fără a fi pus niciodată direct în soluție salină, aceasta ducând la balonizarea hepatocitelor și perturbarea arhitecturii hepatice. Expunerea prelungită a fragmentului la temperatura camerei duce la uscarea lui. Dacă fixarea nu poate fi realizată imediat, fragmentul trebuie păstrat la rece, fie în frigider, fie prin așezarea recipientului cu fragmentul într-un recipient mai mare cu cuburi de gheață sau apă rece.

Fixarea promptă este vitală!

Specimenele obținute prin aspirație cu ac fin trebuie de asemenea prelucrate prompt, evitându-se astfel apariția de artefacte datorate uscării.

88

Fragmentele recoltate se fixează în formol 10%. După fixare la temperatura camerei 36-48 ore, fragmentele alese au fost prelucrate pentru includerea la parafină, după următorii timpi: deshidratarea, clarificarea, includerea propriu zisă și realizarea blocului de parafină, secționarea blocului, lipirea și uscarea secțiunilor, colorarea acestora. Secțiunile obținute au fost inițial colorate hematoxilin-eozină și în funcție de cerințe s-au executat colorații speciale. Colorațiile speciale utilizate cel mai frecvent au fost: colorația PAS, colorația Tricrom Masson, impregnația argentică Gömöri, a căror tehnică este redată în continuare.

Colorația PAS după MANUS

Această colorație este utilizată pentru diferențierea mucopolizaharidelor acide.

Reactivi utilizați au fost reactivul Schiff, soluția apoasă de acid picric.

Tehnica a constat în următoarele etape succesive:

-deparafinare:

-benzen I – 5 minute

-benzen II – 5 minute

-benzen III – 5 minute

-hidratare în alcooluri în concentrație scăzândă (4 băi):

alcool absolut – 5 minute;

alcool 90 – 5minute;

alcool 80 – 5 minute;

alcool 70 – 5 minute;

-spălare cu apă distilată – 5 minute

-tratare cu acid Schiff1 – 15 -30 minute

Prepararea reactivului: se dizolvă 1gr. de fuxină bazică într-un balon de 1 litru ce conține 200 ml. apă distilată fierbinte. Se fierbe 5 minute, se răcește la 50 grade, se filtrează și se adaugă 1 gram

89

-spălarea în 3 băi de apă sulfuroasă2, fiecare 5 minute -spălare cu apă curentă – 10 minute -colorare de fond cu hemalaun

-spălare cu apă curentă – 10 minute

colorare cu hematoxilină Weigert – 2 minute

-colorare cu albastru de anilină – 2 minute

-colorare cu acid picric3 – 6 minute

-diferențierea în 2 băi de alcool absolut – 10 minute -deshidratarea în 2 băi alcool absolut – 10 minute -clarificare în xilol – 3 băi – 15 minute -montare cu balsam de Canada

-termostat – 37 grade

Structurile PAS pozitive se colorează roșu violet.

Colorația tricromic după metoda Masson

Tehnica:

-deparafinarea (3 băi benzen) – câte 5 minute fiecare -hidratare (alcooluri în concentrație scăzândă):

-alcool absolut – 5 minute;

-alcool 90 – 5minute;

metabisulfit de Na sau K; se lasá la întuneric 18-24 ore; se adaugă 2 grame cărbune activat; se agită 1 minut; se filtrează. Soluția trebuie să fie limpede, incoloră sau ușor gălbuie. Se conservă la întuneric și la 0-4 grade.

Prepararea apei sulfuroase: 10 ml soluție apoasă, 10% metabisulfit de K la care se adaugă 10 ml de acid clorhidric N ßi 200 ml apă distilată.

Preparare – soluție de 0,04% anilină în soluție apoasă saturată de acid picric.

90

-alcool 80 – 5 minute;

-alcool 70 – 5 minute;

-spălare în apă de robinet – 10 minute

-colorarea nucleilor cu hematoxilină Mayer 10-15 minute -spălare în apă de robinet

-diferențiere în alcool clorhidric

-spălare în apă de robinet

-virare în carbonat de litiu (soluție saturată) 2-3 secunde -spălare în apă de robinet – 10 minute

-colorare cu soluție A4 timp de 3 minute

-spălare în 3 băi apă acidulată cu acid acetic glacial 1/100

-colorare cu soluție B5 timp de 10 minute

-spălare cu 3 băi apă acidificată

-deshidratare în alcool 96° – 5 minute

-deshidratare în 3 băi de alcool etilic absolut – câte 5 minute -clarificare cu xilol fenicat 10-15 minute -trei băi xilol – câte 5 minute

-montare în balsam de Canada

-termostat 37°C – 24 ore

Prin această metodă se vizualizează prin colorare tipul I de colagen. În ficatul normal se identifică colagen colorat tricrom pozitiv (culoare verde) în spațiile portale și în jurul venei centrale. Această colorație permite parțial evaluarea gradului de fibroză. Ea

orange C-3gr., ponceau R – 2gr., fuxină acidă -1gr., acid acetic glacial – 300 ml.

verde lumină – 3gr., orange C – 2gr., acid fosfomolibdenic – 8gr., apă distilată – 300 ml.

91

trebuie însoțită de colorația pentru reticulină care este pusă în evidență prin impregnarea argentică.

Colorația fibrelor de reticulină – impregnarea după metoda Gömöri -deparafinare (3 băi benzen) câte 5 min fiecare

-hidratare cu alcool etilic (alcooluri de concentrații scăzute):

-alcool absolut – 5 minute;

-alcool 90 – 5minute;

-alcool 80 – 5 minute;

-alcool 70 – 5 minute;

-spălare cu apă de robinet -10 min

-soluție de permanganat de potasiu 2% – 3 min

-spălare cu apă de robinet – 5 min

-decolorarea secțiunilor cu metabisulfit de potasiu până devin albicioase – 1-2 min

-spălare cu apă de robinet – 5 min

-clătire în 2 băi apă distilată

-tratare cu soluție de fier și amoniu 2% proaspătă6 – 4 min

-impregnare argentică cu soluție amoniacală de azotat de argint 7- 1 min -spălarea rapidă cu apă distilată

-reducere cu formol 10% până se înnegresc secțiunile -5 min

se folosesc numai cristale violete

La 10 cc de azotat de Ag 10% se adaugă: 2 cc. hidroxid de potasiu 10% se agită, se picură amoniac concentrat până precipitatul brun se dizolvă. Se adaugă în continuare cu picătura nitrat de Ag 10% până ce precipitatul format se dizolvă cu greutate, se adaugă apă distilată până la volum dublu. Soluția poate fi folosită numai 40 ore dacă a fost păstrată la întuneric și la rece

92

-spălare apă robinet-10 min

-spălare apă bidistilată – 10 min

-virare în clorură de aur 0,2% – 10 min

-spălare apă bidistilată

-reducere în metabisulfit de potasiu 1-3% – 1 min

-fixare în tiosulfat de sodiu – 1 min

-spălare

-deshidratare

-clarificare în 3 băi de clarificare – 15 min

-montare în balsam de Canada

Reticulina conturează lumenul sinusoidelor hepatice ale ficatului normal, și se colorează diferențiat în brun auriu tipul I de colagen. Preparatele de reticulină sunt folosite în evaluarea structurii lobulului și a stării parenchimului. Metoda este folosită în special pentru a detecta degenerarea, necroza focală și în punți, precum și fibroza.

Antigenul viral este pus în evidență prin legare succesivă cu un anticorp primar și cu complexul avidin-biotină (ABC). Molecula complexă este colorată cu diaminobenzidină (DAB) și poate fi vizualizată la microscopul optic. Pe aceeași secțiune se efectuează succesiv colorarea pentru Ag HBs, Ag HBc și Ag HD.[186,187]

Pentru studiul imunohistochimic al cazurilor luate în studiu am utilizat secțiunile de 4 microni obținute din blocurile incluse la parafină, care au fost întinse pe lame de sticlă pretratate cu polilizină după care, pentru o mai bună aderență a secțiunilor pe lame, acestea au fost lăsate peste noapte la termostat, la 37°C.

Ulterior, lamelele s-au prelucrat utilizând metoda Complexului Streptavidin-Biotină (sABC)/Horse Radish Peroxidase (HRP). Această metodă a presupus parcurgerea mai multor etape, primele fiind comune cu cele folosite pentru metoda de colorare cu hematoxilină-eozină, și anume:

93

deparafinarea secțiunilor prin trecerea secțiunilor prin 3 băi succesive de xilen sau benzen, a câte 5 minute în fiecare baie;

hidratarea secțiunilor prin trecerea succesivă prin băi cu soluții de alcool etilic cu concentrații descrescătoare: alcool etilic absolut (2 băi), 95°C (1 baie) și 70°C (1 baie), câte 5 minute în fiecare;

inhibarea peroxidazei endogene cu soluție de apă oxigenată;

demascarea antigenului la microunde, la 750 W, în tampon citrat;

spălare în apă de robinet;

blocarea biotinei endogene;

spălare în soluție tampon fosfat salin;

incubare cu anticorpul primar, timp de 30 minute;

spălare în soluție tampon fosfat salin;

incubare cu anticorpul secundar, 10 minute;

incubare cu streptavidină peroxidată, 10 minute;

developare în soluție de diaminobenzidină, 2-5 minute,

contracolorarea nucleilor cu hematoxilină;

deshidratarea secțiunilor prin trecerea prin 3 băi de alcool etilic absolut, a câte 5 minute în fiecare baie;

clarificarea secțiunilor prin trecerea prin 2 băi de xilen;

montarea secțiunilor între lamă și lamelă cu balsam de Canada.

Rezultatele s-au tradus prin colorarea în brun cu ajutorul cromogenului diaminobenzidină (DAB). Reacția a apărut pozitivă la nivelul membranei, citoplasmei sau nucleului, în funcție de tipul de antigen.

94

Tabel nr. 12 Markerii imunohistochimici utilizați

CD20 (L26)

Antigenul CD20 este o fosfoproteină non-glicozilată de 33 kDa ce marchează în special celulele B. Ca anticorp primar am utilizat clona L26 ( Novocastra) în diluție 1: 100. Imunomarcajul a fost prezent la nivel membranar.

CD45Ro (UCHL1)

Molecula CD45Ro este o izoformă a CD45 de 180 kDa. Este exprimată în limfocitele T periferice, limfocitele CD4 pozitive și timocite. Am utilizat anticorpul primar CD45Ro, clona UCHL1 (Novocastra) în diluție de 1:100. Imunomarcajul a fost localizat membranar.

95

CD4

CD4 este o glicoproteină de suprafață cu o greutate de 59 Da. Antigenul CD4 are expresie în majoritatea timocitelor (80%) și a subpopulațiilor mature de celule T (celule T helper) și slab pozitivă în monocite.

Am utilizat anticorpul monoclonal CD4, șoarece anti-uman, clona 1F6 (NCL-CD4-1F6) (Novocastra) în diluție 1:20. Marcajul s-a obținut cu colorant DAB și contracolorat cu hematoxilină și a fost localizat membranar.

CD8

CD8 este o glicoproteină transmembranară de 32 kDa cu rol de co-receptor al receptorului celulelor T (TCR). Este exprimat predominant la suprafața celulelor T citotoxice, dar poate fi întâlnit și la nivelul celulelor NK. Anticorpul primar utilizat a fost CD8 clona 1A5 (NCL-CD8-295) ( Novocastra) în diluție de 1:30. Pentru amplificarea imunosemnalului s-a utilizat cromogenul DAB. După aplicarea imunomarcajului, s-a utilizat pentru contracolorare hematoxilina Mayer. Marcajul a fost membranar.

TGF β

TGF β este asociat cu procesele de regenerare și apoptoză. Anticorpul anti TGF -β este un anticorp policlonal .

Secțiunile la parafină de (7µm) au fost deparafinate și tratate cu citrat în cuptorul cu microunde. Secțiunile au fost preincubate cu 10% ser normal de capră (NGS) în PBS conținând 0,3% Triton X100 pentru o oră. Imunocolorarea se face utilizând anticorpi anti TGF-β (diluție 1:75 Novocastra). Reacția a fost vizualizată cu 3,3`-diamino benzidina (DAB DAKO).

În figura următoare este redat algoritmul utilizat în studiul lotului de pacienți cu hepatite cronice virale.

96

ALGORITM DE STUDIU

637 pacienți cu hepatite

cronice virale

237 pacienți HBV 70 pacienți HBV + HVD 330 pacienți HCV

Examen clinic general

Explorări biologice generale

Teste imunologice (imunelectroforeză, C3,

FR)

Explorări imagistice

pacienti

HBV+HVD

CD4

CD8

TNF alfa

NK

97

VI.3. INTERPRETAREA STATISTICĂ A DATELOR

Pentru evaluarea tendinței centrale a datelor au fost utilizate media aritmetică și mediană pentru centralizările privitoare la vârstă, situații în care mediana este o măsură mai reprezentativă pentru tendința centrală, nefiind influențată de una sau mai multe dintre valorile extreme.

Calculele statistice au fost efectuate cu ajutorul a două programe computerizate: Excel 7.0 (pentru calcularea mediilor, medianei, varianței, deviației standard, testului t – Student, testului Chi-square și Fisher) și SPSS versiunea 6.0 (Stat calc și Epitable, pentru testele Chi-square, Fisher, compararea semnificației statistice a diferitelor procente). Am urmărit în special indicele de corelație Pearson, deviația standard.

Valorile indicelui Pearson variază între -1 și 1. Valoarea de 1 arată o ecuație liniară, descriind perfect și pozitiv relația dintre datele incluse. Valoarea de -1 arată o relație invers proporțională a datelor, în timp ce valoare de 0 arată că nu există o relație liniară între variabile. Corelațiile semnificative sunt la valori ale lui P<0,005

Deviația standard- valori mari ale acesteia indică depărtarea de medie a datelor incluse, în timp ce o valoare scăzută a acesteia arată ca datele incluse sunt mult apropiate de medie.

In vederea stabilirii semnificației modificărilor dintre valorile unor mărimii aparținând diferitelor loturi au fost utilizate: testul "t" – Student, testul ―χ2 ― și testul ―ANOVA‖ Analysis of Variance‖, considerând un nivel de semnificație de 95%. Utilizarea acestuia este impusă de numărul mic de determinări.

Riscul relativ (RR) reprezintă raportul proporțional al cazurilor pozitive din două loturi incluse în studiul prospectiv. El reprezintă raportul dintre două niveluri de risc absolut. Cu câr RR este mai mare, cu atât este mai mare asocierea dintre boală și factorul de risc. Dacă valoarea RR este apropiată de 1, riscul de apariție al bolii este același, cu sau fără factorul de

98

risc analizat. Dacă RR <1 există o asociere negativă a bolii cu factorul de risc analizat, care de fapt nu este factor de risc ci factor protector.

Odds ratio reprezintă estimarea riscului relativ și probabilitatea ca un eveniment/boală să apară. Estimarea este utilă când prevalența bolii este <10%.

99

Capitolul VII

REZULTATE

Studiul s-a efectuat în perioada 2004-2007, pe un lot de 637 de pacienți, împărțit în două subloturi, un sublot de 307 pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală B și un sublot de 330 pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală C. 70 de pacienți din cei 307 diagnosticați cu hepatită cronică virală B au prezentat și infecție virală D, aceștia fiind analizați în cadrul lotului de pacienți cu VHB.

VII.1. CARACTERISTICILE DEMOGRAFICE ALE PACIENȚILOR CU HEPATITE CRONICE VIRALE

DISTRIBUȚIA PE SEXE

In studiul efectuat am constatat că 195/307 pacienți erau de sex feminin în lotul cu hepatită cronică virală B, în timp ce 208/330 pacienți din lotul diagnosticat cu hepatită cronică virală C erau de sex feminin, constatându-se o ușoară creștere a frecvenței infecției virale la sexul feminin la pacienții cu HCV și VHB, diferențele nefiind semnificative statistic (RR=1,07).

Sex feminin sex masculin

HBV 195 112

Grafic nr. 1 Repartiția pe sexe a pacienților cu hepatite cronice virale

100

DISTRIBUȚIA PE GRUPE DE VÂRSTĂ

In studiu au fost incluși pacienții diagnosticați cu hepatită cronică virală B sau C, cu vârste cuprinse între 18 ani și 70 ani. La pacienții diagnosticați cu infecție virală B, media de vârstă a fost 39,66± 10,04 ani, în timp ce la pacienții cu infecție virală C, media de vârstă a fost 49,61 ± 8,37 ani, constatându-se o frecvență mai mare la pacienții cu vârste peste 35 ani.

Tabel nr. 13 Repartiția pe grupe de vârstă și sex a lotului de pacienți cu VHB și HCV

VII.2. PROFILUL CLINIC AL PACIENȚILOR CU HEPATITE CRONICE VIRALE

Infecția cu virusurile hepatice poate fi total asimptomatică sau se poate manifesta atipic prin astenie fizică, hepatalgii de efort, sindrom dispeptic nesistematizat, artrite/artralgii. Pacienții pot prezenta de asemenea, semne și simptome asociate manifestărilor extrahepatice .

Majoritatea pacienților din loturile de studiu au prezentat simptome nespecifice: sindromul asteniform a fost constatat cel mai frecvent, cu o prevalență mai mare la pacienții cu HCV (57,98% din pacienții cu HBV vs 68,18 % din pacienții cu HCV); sindromul dispeptic nesistematizat caracterizat prin grețuri, vărsături, dureri abdominale, a fost constatat cu o prevalență asemănătoare în cele două loturi de studiu, (31,9% la pacienți cu HBV, respectiv 44,8% din pacienții cu HCV), sindromul icteric asociat hepatitei colestatice a fost constatat la un procent redus din pacienți (3,63% din pacienții cu HCV vs 2,28% din pacienții cu HBV).

Sindromul sicca caracterizat prin xerostomie, xeroftlamie, a fost constatat cu o

101

prevalență mai mare la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu HBV (7 pacienți cu HCV vs 3 pacienți cu HBV). 4 pacienți cu HCV și sindrom sicca erau diagnosticați cu sindrom Sjogren.

Din tabelul următor se observă că majoritatea pacienților simptomatici au prezentat astenie fizică, dureri abdominale, meteorism abdominal.

Tabel nr. 14 Manifestările clinice la pacienții cu hepatite cronice virale

26,06% (n=86/330)din pacienții cu HCV și 31.59% (n=97/307) au fost asimptomatici, diagnosticul hepatitei cronice virale realizându-se exclusiv pe baza investigațiilor paraclinice.

Dimensiunile ficatului și splinei la admiterea în studiu, sunt redate în tabelul următor:

Tabel nr. 15 Dimensiunile ficatului și splinei la pacienții intrați în studiu

102

S-a constatat astfel că majoritatea pacienților cu hepatite cronice virale au prezentat ficat cu marginea inferioară la 2 cm sub rebord și splină nepalpabilă. Hepato-splenomegalia importantă s-a constatat la pacienții cu neoplazii sau limfoame asociate. Hepatomegalia și splenomegalia au fost obiectivate cu ajutorul ultrasonografiei abdominale.

La lotul studiat au fost constatate și alte afecțiuni asociate, cel mai frecvent fiind constatate afecțiunile cardiovasculare, însă am insistat pentru evidențierea acelora care au mecanism patologic intricat cu cel al afectării hepatice virale: poliartrita reumatoidă a fost diagnosticată înaintea includerii în studiu la 3 pacienți cu HBV și la 7 pacienți cu HCV, lupusul eritematos sistemic la 3 pacienți cu HCV, sindromul Sjogren la 4 pacienți cu HCV. Pacienții diagnosticați cu aceste afecțiuni asociate au efectuat investigații suplimentare, în clinicile de reumatologie, pentru stabilirea corectă a diagnosticului și a abordării terapeutice.

La pacienții incluși în studiu am constatat existența manifestărilor extrahepatice mai frecvent la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu HVB- crioglobulinemia mixtă (37 de pacienți cu HCV vs 7 pacienți cu HBV), sindromul reumatoid (16 pacienți cu HCV vs 11 pacienți cu HBV), tiroidită autoimună ( 7 pacienți cu HCV vs 4 pacienți cu HBV), diabet zaharat (40 pacienți cu HCV vs 31 pacienți cu HBV), eritem nodos la 5 pacienți cu HBV, limfoame ( 5 pacienți cu HCV vs 2 pacienți cu HBV), glomerulonefrita cronică (21 pacienți cu HCV vs 8 pacienți cu HBV), leziuni cutanate de tip psoriazis, lichen plan ( 5 pacienți cu HCV vs 2 pacienți cu HBV ).

Studiul acestor pacienți s-a efectuat comparativ cu analiza transaminazelor, GGT, gradul fibrozei și activitatea necrotico-inflamatorie, analizând existența eventualelor corelații între acești parametri.

103

VII.3. PARTICULARITĂȚILE MODIFICĂRILOR BIO-UMORALE LA PACIENȚII CU HEPATITE CRONICE VIRALE

Studiul prezent s-a concentrat pe analiza parametrilor bioumorali, insistând pe cei imunologici, urmărindu-i prin prisma corelațiilor acestora cu modificările clinice, anatomopatologice, în încercarea de a stabili anumiți factori cu valoare prognostică.

Parametrii bioumorali urmăriți sunt redați în tabelul următor.

Tabel nr. 16 Parametrii biologici urmăriți la pacienții incluși în studiu

VII.3.1. MARKERII VIRALI SEROLOGICI ÎN HEPATITELE CRONICE VIRALE

Termenul de hepatită cronică cuprinde inflamația hepatică prezentă cel puțin 6 luni, detectată prin teste biochimice și histologice.

Diagnosticul etiologic al hepatitei virale cronice se face ușor bazându-ne pe testele serologice și virusologice, biopsia fiind indicată pentru a stabili gradingul și stagingul leziunilor histologice hepatice, în practică, folosindu-se sisteme numerice semicantitative, care pot fi catalogate în activitate necroinflamatorie medie, moderată și severă, având valoare prognostică și implicații terapeutice [79, 80]. Diagnosticul se stabilește prin coroborarea unor markeri serologici, virali, biochimici și histologici.

104

Tabel nr. 17 Diagnosticul serologic al hepatitei cronice virale B

Din cei 637 de pacienți incluși în studiu, antigenul HBs a fost prezent la 307 de pacienți (48.20%), 70 de pacienți diagnosticați cu infecție virală B prezentau și infecție virală D asociată.

HBV HBV+HVD HCV HBV+HCV

2%

36%

51%

11%

Grafic nr. 2 Prevalenta infecției virale B,B+D și C la lotul studiat

Semnificația prezenței Ag HBe

In infecția cronică, persistența antigenului HBe se corelează cu replicarea virală activă și cu infecțiozitatea ridicată a sângelui [17].

Antigenul HBe se asociază cu nivel seric crescut al ADN-ului viral; unii pacienți pot prezenta absența antigenului HBe și prezența anticorpilor anti-HBe, corelându-se cu nivel

105

scăzut al viremiei și valori normale ale transaminazelor. Peste 70% din pacienții cu anticorpi anti HBe asociază prezența serică a ADN-ului viral la 103-105 copii/ml. [36]

Hepatita cronică virală B antigen HBe negativă se caracterizează prin :

prezența antigenului HBs,

absența antigenului HBe,

prezența anticorpilor anti HBe,

nivel crescut persistent sau intermitent al transaminazelor,

nivel seric detectabil al ADN-ului viral,

activitate necroinflamatorie prezentă, fără alte cauze care să determine lezarea hepatică și fără ciroză.

În studiul prezent am vizat identificarea unor posibile corelații între prezența sau absența antigenului HBe și a anticorpilor anti-HBe, cu nivelul seric al transaminazelor, activitatea necrotico-inflamatorie și gradul de fibroză.

Din lotul studiat, 181(59%) pacienți au prezentat antigen HBe pozitiv și 126 de pacienți (41%) cu anticorpi anti-HBe prezenți.

atg Hbe+ atg HB-

41%

59%

Grafic nr. 3 Prevalenta antigenului HBe la pacienții cu VHB

Valorile transaminazelor au fost analizate la pacienții cu antigen HBe prezent, constând că 32 (17.70%) de pacienți au avut valori normale ale acestora, fiind considerați a fi în faza de toleranță imună, în timp ce la 149 (82.30%) de pacienți s-au consemnat valori crescute.

106

Din cei 126 de pacienți cu antigen HBe negativ, 60 (47,61%) de pacienți au avut valori ≥ 2X valoarea superioară a normalului.

Din cei 181 de pacienți cu antigen HBe prezent, doar 124 de pacienți au efectuat puncție biopsie hepatică, majoritatea acestora având grad înalt de fibroză (89/124, p=0,02) și activitatea necrotico-inflamatorie ușoară -50 /124 de pacienți (p= 0,7).

biopsie

Grafic nr. 4 Activitatea necrotico-inflamatorie la pacienții cu VHB în funcție de prezenta/absenta antigenului HBe

Prezența antigenului HBe s-a asociat cel mai frecvent, valori crescute ale viremiei și cu gradul 3 și 4 de fibroză (p=0.02, RR=0.01), asocierea fiind semnificativ statistic, astfel că prezența antigenului HBe poate fi considerată un factor predictiv pentru fibroză.

107

Grafic nr. 5 Gradul de fibroză la pacienții cu VHB în funcție de prezența/absența antigenului HBe

16.2% din pacienți(n=50/307) s-au aflat în faza înalt replicativă caracterizată prin prezența antigenului HBs, a antigenului HBe și ADN viral detectabil în ser, creșterea transaminazelor, activitate inflamatorie moderată histologică și risc mare de dezvoltare a cirozei.

10.42% din pacienți (n=32/307) erau în faza slab replicativă caracterizată prin pierderea antigenului HBe, nivel scăzut sau absența ADN-ului viral, apariția anticorpilor anti-HBe, iar histologic activitate inflamatorie minimă. Această fază este denumită și seroconversia în sistemul HBe.

La pacienții din studiul nostru s-au determinat anticorpii anti HBc- IgG care, în funcție de asocierea cu prezența/absența Ag HBs ne-a arătat statusul bolnavului studiat, astfel :

Asocierea Ac anti HBc + Ag HBs indică infecție cronică cu VHB

Asocierea Ac anti HBc + Ac anti HBs arată existența unei infecții cu VHB în antecedente.

Toți cei 307 de pacienți incluși în studiu au avut antigen HBs prezent și anticorpi anti HBc-IgG. 211 pacienți au efectuat biopsie hepatică, constatând la 103 pacienți (33,6%) gradul 3 de fibroză și la 33 de pacienți (10,7%) gradul 4 de fibroză.

La toți pacienții cu hepatită cronică virală B s-a determinat antigenul delta, constatându-se că 70 de pacienți prezentau asociat infecția cu virusul delta.

Diagnosticul hepatitei cronice virale C se bazează pe depistarea prezenței anticorpilor anti HCV. Aceștia au fost prezenți la 330 de pacienți din cei 637 incluși în studiu. Nivelul

108

seric al transaminazelor a fost crescut la majoritatea pacienților. 210/330 au efectuat biopsie hepatică, observându-se la 92 pacienți (27,9%) gradul 3 de fibroză, și la 28 pacienți (8,5%) gradul 4 de fibroză.

VII.3.2. MODIFICĂRILE HEMOLEUCOGRAMEI

Anemia (considerată în studiul prezent la valori sub 10g/dl) a fost prezentă la pacienții cu VHB și HCV, asociată cu prezența altor afecțiuni (insuficienta renală, crioglobulinemia, vasculite, neoplazii). Nici un pacient inclus în studiu nu a fost diagnosticat cu anemie hemolitică autoimună.

Un parametru important de analizat a fost numărul de trombocite (valori normale 150000-400000/mmc), studiile recente sugerând o corelație între numărul de trombocite și gradul de fibroză hepatică. Am urmărit modificări ale valorilor numărului de trombocite la pacienții lotului, constatând valori:

< 150000/mmc

150000-200000/mmc

200000-250000/mmc

251000-300000/mmc

> 300000/mmc

Am constatat că 122 (39.73%) din pacienții cu VHB și 108 (32.72%) din pacienții cu HCV aveau valori peste 300000/mmc, iar 42 din pacienții cu HCV și 62 din pacienții cu VHB aveau valori ale trombocitelor între 200000 și 150000/mmc. 28 de pacienți cu HCV au prezentat trombocitopenie < 150000/mm3.

109

Grafic nr. 6 Repartiția loturilor în funcție de numărul de trombocite la pacienții cu hepatite cronice virale

Analiza rezultatelor a evidențiat că trombocitopenia sub 150000/mmc a fost mai frecvent constatată la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu VHB.

Apreciind numărul de trombocite (x 109/L) după cum urmează:

>300=1, 300-250 =2; 249-200=3; 199–150=4; <150=5,

am analizat corelația acestora cu gradul de fibroză, constatând că la pacienții cu HCV cu numărul de trombocite peste 250 (109/L), 90 de pacienți aveau grad de fibroză 1 și 2, în timp ce majoritatea pacienților cu număr de trombocite sub 250 (109/L) care au efectuat biopsie hepatică, prezentau grad de fibroză 3 și 4. (p=0.07)

Tabel nr. 19 Corelația dintre numărul de trombocite și gradul de fibroză la pacienții cu HCV

110

Analizând la pacienții cu VHB gradul de fibroză în raport cu numărul de trombocite, am constatat că, majoritatea pacienților cu număr de trombocite sub 250000/mmc, au avut gradul de fibroză 3 și 4, iar pacienții cu trombocite peste 300000/mmc, au avut predominant gradul 1 și 2 de fibroză ( p<0.001).

Tabel nr. 20 Corelația între numărul de trombocite și gradul de fibroză la pacienții cu VHB

Studiul prezent a evidențiat că nivelul seric al trombocitelor se corelează cu gradul de fibroză hepatică, și poate fi considerat un factor predictiv al gradului de fibroză, mai ales la pacienții cu HCV.

VII.3.3. SINDROMUL CITOLITIC

Pentru estimarea sindromului citolitic la pacienții incluși în studiu, au fost analizate transaminazele (ALT, AST), precum și analiza indicelui Ritis și APRI. Valorile acestora au fost analizate în raport cu gradul de fibroză și activitatea necrotico-inflamatorie. Analiza markerilor citolizei la pacienții lotului de studiu a relevat niveluri înalte ale aminotransferazelor la majoritatea pacienților, valorile medii ale transaminazelor fiind mai mari la pacienții cu HCV. Valori normale ale AST au fost constatate la 48 de pacienți (15,60%) cu infecție virală B și la 100 de pacienți (30,30%) cu infecție virală C.

111

Grafic nr. 7 Profilul nivelurilor AST la pacienții incluși în studiu

Nivelul seric al ALT a fost predominant crescut la majoritatea pacienților incluși în studiu, 36 de pacienți cu HCV și respectiv 46 de pacienți cu HBV (37 cu VHB și 9 cu VHB+VHD) având valori normale ale acestuia.

Grafic nr. 8 Profilul nivelurilor ALT la pacienții incluși în studiu

Din punct de vedere al unei eventuale corelări ale transaminazelor cu manifestările clinice, s-a observat că valorile medii ale acestora au fost mai mari la pacienții cu asocieri de manifestări extrahepatice (r=0,07, p=0,17).

Valorile medii ale transaminazelor au fost mai mari la pacienții cu hepatite cronice virale și manifestări extrahepatice asociate, comparativ cu cei fără manifestări extrahepatice, în special la pacienții cu hepatită cronică virală C, însă în ambele loturi de studiu au predominat pacienții cu valori crescute ale transaminazelor. Acest lucru se poate datora și faptului că pacienții internați în clinicile de gastroenterologie erau investigați în vederea inițierii tratamentului antiviral.

112

MANIFESTARI + MANIFESTARI – MANIFESTARI + MANIFESTARI –

HBV HCV

Grafic nr. 9 Valorile medii ale transaminazelor în funcție de asocierea manifestărilor extrahepatice

Corelații ale AST, ALT cu activitatea necro-inflamatorie și fibroza hepatică

Din cei 637 de pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală, incluși în studiu, doar 421 de pacienți au efectuat biopsie hepatică. Majoritatea acestora au prezentat valori crescute ale transaminazelor.

Analizând nivelul seric al transaminazelor în raport cu activitatea necro-inflamatorie și gradul de fibroză, am constatat că majoritatea pacienților cu valori serice crescute ale transaminazelor au avut predominant activitate necro-inflamatorie moderată și gradul F2 și F3 de fibroză, p<0.001 .

140

120

100

80

60

40

20

0

HBV ALT

HBV AST

HCV ALT

HCV AST

Grafic nr. 10 Corelații între nivelul aminotransferazelor și gradul de fibroză

113

Analizând posibilelor corelații între activitatea necrotico-inflamatorie și nivelul seric al transaminazelor, am constatat că majoritatea pacienților cu activitate necrotico-inflamatorie moderată/severă au avut valori serice ale transaminazelor crescute. Deasemenea, majoritatea pacienților cu activitatea necrotico-inflamatorie ușoară, au avut valori serice ușor crescute ale transaminazelor, iar pacienții cu activitate necrotico-inflamatorie minimă au prezentat predominat valori crescute normale și ușor crescute ale transaminazelor.

HCV ALT

HCV AST

Grafic nr. 11 Corelații nivel seric transaminaze- activitate necrotico-inflamatorie

Se constată astfel că în studiul prezent, valorile serice crescute ale transaminazelor au fost mai frecvent întâlnite la pacienții cu HBV comparativ cu cei cu HCV. Acest lucru se datorează și faptului că pacienții diagnosticați cu VHB internați în clinică, erau candidați pentru inițierea tratamentului antiviral. Nivelul seric al transaminazelor s-a corelat cu gradul de fibroză (p<0,001) și cu activitatea necrotico-inflamatorie, mai ales la pacienții cu HCV (p=0.02) comparativ cu cei cu VHB (p=0.04).

Pacienții cu valori persistent normale ale ALT par să aibă un grad de inflamație și fibroză hepatică mai reduse decât cei cu valori crescute, însă în ciuda acestor date, pacienții cu valori normale ale ALT pot avea proces inflamator hepatic sever sau chiar ciroză hepatică.

Analizând valorile transaminzelor în raport cu nivelul viremiei și gradul de fibroză, am constatat că valorile transaminzelor s-a corelat cu nivelul viremiei și gradul fibrozei, în special la pacienții cu HCV (p=0,05 la pacienții cu HBV și p=0,002 la pacienții cu HCV)

114

Tabel nr. 21 Valorile medii ale transaminazelor și viremiei în funcție de gradul de fibroza

La toți pacienții s-a calculat indicele Ritis ( AST/ALT), cuantificând rezultatele astfel:

AST/ALT: >.1.7=1; 1.2–1.7=2; 0.6–1.19=3; < 0.6=4

Analiza datelor din tabelul următor, constată că majoritatea pacienților cu HVC și HVB au prezentat valori sub 1.2 ale acestui indice. Toți cei 70 de pacienți cu VHB și HVD au avut valori între 0,6-1,2 ale acestui raport.

115

Tabel nr. 22 Indicele RITIS la pacienții cu hepatite cronice virale

Vârsta, sexul, durata afecțiunii nu au avut influență asupra indicilor de citoliză, apreciați în acest studiu.

Analizând la pacienții cu HCV care au efectuat biopsia hepatică, raportul Ritis în relație cu gradul de fibroză, am constatat că majoritatea pacienților cu grad 3 și 4 de fibroză au avut raportul Ritis ≤1,2 (p=0,02)

Tabel nr. 23 Corelația raport AST/ALT-grad de fibroză la pacienții cu HCV

La pacienții cu VHB, am constatat că majoritatea acestora- 218/307, au avut valori ale raportului Ritis între 0.6 și 1.2, 99/218 pacienți, având gradele 3 și 4 de fibroză hepatică, iar 56/218 nu au efectuat biopsie hepatică. Majoritatea pacienților cu valori ale raportului RITIS sub 1,2 au asociat grad înalt de fibroză hepatică (r=-0,12, p= 0,03), valorile acestui raport necorelându-se semnificativ cu activitatea necrotico-inflamatorie (r=-0,017, p=0,21)

116

Tabel nr. 24 Corelația raport AST/ALT-grad de fibroză la pacienții cu VHB

Analizând graficul următor, din punct de vedere al corelației raportului Ritis cu gradul de activitate necrotico-inflamatorie, și notând cu ―0‖- pacienții care nu au efectuat biopsia hepatică, constatăm că majoritatea pacienților cu hepatită cronică virală și activitate necrotico-inflamatorie severă au prezentat valori sub 1,2 ale acestui raport.

Grafic nr. 12 Corelații activitate necrotico-inflamatorie- indice Ritis, la pacienț ii cu VHB (A) ș i VHC (B)

La pacienții cu hepatite cronice virale a fost prezent cu frecvență mai mare sindromul de citoliză, caracterizat prin creșterea aminotransferazelor serice și reducerea raportului AST/ALT.

La toți pacienții incluși în studiu s-a calculat indicele APRI.

Din cei 307 de pacienți cu VHB, 76 de pacienți au avut indice APRI ≤0.4, 118 pacienți au avut indice APRI de 0.4-1.2, iar 113 pacienți au avut APRI >1.2 . Analizând o corelație între acest indice și gradul de fibroză sau activitatea necrotico-inflamatorie, am constatat că majoritatea pacienților cu grad 3 și 4 de fibroză hepatică (p=0.04), precum și cei

117

cu activitate necrotico-inflamatorie moderată sau severă (p=0.45) au avut indice APRI >1.2, constatând că indicele APRI se corelează mai fidel cu gradul de fibroză.

biopsie

Grafic nr. 13 Corelații grad de fibroză – indice APRI la pacienții cu VHB

Majoritatea pacienților cu HAI moderată sau severă au prezentat scor APRI peste 1.2, rezultatele nefiind semnificative din punct de vedere statistic( p=0.45).

Grafic nr. 14 Corelații activitate necrotico-inflamatorie-indice APRI la pacienții cu VHB

Analizând acest indice la pacienții cu hepatită cronică virală C, am constatat că 71 de pacienți au avut indice APRI <0.42, 165 de pacienți au avut indice APRI =0.42-1.2, în timp ce 94 de pacienți au avut indice APRI >1.24.

33/71 de pacienți cu indicele APRI < 0.42, au avut predominant un grad mic de fibroză (F1,F2), în timp ce 44/94 din pacienții cu APRI >1,2 au avut grad mare de fibroză (F3, F4). Corelația indice APRI –grad de fibroză nu este înalt semnificativ statistic, p=0.07. Majoritatea pacienților cu APRI <0.42 (28/37) care au efectuat biopsie hepatică, au avut

118

activitate necro-inflamatorie ușoară, iar majoritatea pacienților cu APRI>1.2 (43/58), au avut activitate necro-inflamatorie moderată/severă (p=0.10)

biopsie

Grafic nr. 15 Corelații indice APRI – grad de fibroză la pacienții cu HCV

biopsie

Grafic nr. 16 Corelații indice APRI – HAI la pacienții cu HCV

Putem constata că, la pacienții cu HCV indicele APRI e mai fidel corelat cu gradul de fibroză sau activitatea necro-inflamatorie, comparativ cu pacienții cu VHB.

Rezultatele evidențiază corelația între indicele APRI, raportul AST/ALT și gradul de fibroză la pacienții cu hepatite cronice virale, în special la cei cu HCV.

VII.3.4.SINDROMUL DE COLESTAZĂ

Majoritatea pacienților incluși în studiu au avut valori normale ale bilirubinei totale și ale fracțiilor acesteia. Valoarea medie a bilirubinei a fost de 0.92±0.5mg/dl la pacienții cu HBV și 1,26± 0,76 mg/dl la pacienții cu HCV. Valori crescute ale bilirubinei directe au fost

119

constatate la 7/307 (2,28%) din pacienții cu HBV, cu vârsta medie 44,33± 4,58 ani și la 12/330 (3,63%) din pacienții cu HCV, cu vârsta medie de 47± 7,42 ani. Prezența valorilor crescute ale bilirubinei serice s-a corelat cu apariția subicterului scleral/icterului tegumentar, astenie fizică, creșteri ale transaminazelor și GGT-ului.

Valorile fosfatazei alcaline au fost urmărite la toți pacienții, valoarea medie a acestei fiind de 196,56± 6,10UI/L la pacienții cu VHB și de 210,09 ± 15,65 UI/L la pacienții cu HCV. 31/307 de pacienți cu VHB (10.09%) și 48/330 de pacienți cu HCV (14.54%) au avut valori crescute ale fosfatazei alcaline.

GGT-ul a fost analizat la toți pacienții incluși în studiu, având valoarea medie 31,46±22,89 mg/dl la pacienții cu VHB și de 31.5±10.32 mg/dl la pacienții cu HCV.

Valori crescute ale acesteia au fost constatate la 91/307 (29.64%) din pacienții cu VHB și la 118/330 (35.75%) din pacienții cu HCV.

Tabel nr. 25 Caracteristici ale sindromului colestatic la pacienții cu hepatite cronice virale C (monoinfecție)

Valorile colesterolului și trigliceridelor au fost urmărite la toți pacienții, constatându-se nivel crescut al colesterolului la 129/330 din pacienții cu HCV și la 22/307 din pacienții cu VHB, în timp ce valori crescute ale trigliceridelor s-au constatat la 134/330 din pacienții cu HCV și la 26/307 de pacienții cu VHB. Dislipidemia s-a asociat cu obezitatea și prezența diabetului zaharat, majoritatea pacienților fără acești factori prezenți prezentând predominant valori scăzute ale colesterolului și trigliceridelor.

În concluzie putem să menționăm că pentru pacienții cu hepatită cronică virală , indicii colestatici pot fi crescuți la pacienții cu hepatite cronice virale. Dintre indicii de colestază, cei mai sensibili pentru reactivarea virusului hepatic sunt fosfataza alcalină și GGT.

120

VII.3.5. PARAMETRII SINDROMULUI IMUNO-INFLAMATOR

Mecanismele de progresie a hepatitelor cronice virale sunt incomplet cunoscute în prezent. Imunoglobulinele par să stimuleze in vitro, activitatea proliferativă.[188]

Numeroase studii publicate în literatură au susținut că nivelul seric al imunoglobulinelor s-ar corela cu gradul fibrozei hepatice, în special la pacienții cu hepatită cronică virală C.[188, 189]

In studiu au fost incluși toți cei 637 de pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală, la care s-au determinat nivelul seric al globulinelor și imunoglobulinelor, prin tehnici standard de laborator.

Nivelul seric normal a fost considerat la valori de 52-68% pentru albumină, 12-18% pentru globuline, IgG=100-250 UI/ml (800-2000 mg%), IgA=63-320 UI/ml (90-450 mg%), IgM=70-330 UI/ml (60-280 mg%).

S-a urmărit vârsta pacienților, sexul, prezența antigenului HBs, a antigenului HBe sau a anticorpilor anti HBe, anticorpii anti VHC, ADN VHB respectiv ARN VHC, gradul de fibroză hepatică, precum și activitatea necrotico-inflamatorie.

La toți pacienții cu valori crescute ale γ-globulinelor, s-au efectuat investigații suplimentare, excluzându-se ecografic și endoscopic ciroza hepatică sau a carcinomului hepatocelular.

Valoarea medie a nivelului seric al γ-globulinelor a fost de 17,65±3,35% pentru lotul de pacienți cu VHB și 18,24 ±3,70% pentru lotul de pacienți cu HCV. Valori serice crescute au fost constatate la 41/307 (13.40%) din pacienții cu VHB (24 bărbați și 17 femei, cu vârsta medie 40,27 ±10,89 ani) și la 53/330 (16.06%) din pacienții cu HCV (23 bărbați și 30 femei, cu vârsta medie 47,79± 7,94 ani). În lotul de pacienți cu VHB am constatat mai frecvent valori crescute ale ALT comparativ cu AST, valorile medii ale acestora fiind mai mari comparativ cu sublotul cu nivel seric normal al γ-globulinelor – p=0,005, RR=0,50,(ALT-131,61 ±64,51 vs 119,03± 61,42, AST-97,49± 36,69 vs 95,54± 42,13). În lotul de pacienți cu HCV și creșteri ale γ-globulinelor, s-a constatat mai frecvent nivel seric crescut al ALT comparativ cu AST, valorile medii prezentând diferențe nesemnificative comparativ cu

121

sublotul de pacienți cu nivel normal al γ-globulinelor (AST- 95,60± 61,41 vs 96,80± 65,06, ALT -106,26± 56,02 vs 102,30± 61,41)

Grafic nr. 17 Nivelul seric al transaminazelor la pacienții cu valori crescute ale γ-globulinelor

Antigenul HBe a fost prezent la 23/41 pacienți cu nivel seric crescut al γ-globulinelor, p=0.05, valoarea medie a acestora la pacienții cu antigen HBe prezent fiind de 17,78± 2.97 % comparativ cu cei cu antigen HBe absent (17,55 ±3,58 %), diferențele fiind nesemnificative statistic.

Majoritatea pacienților la care s-a determinat viremia în vederea inițierii tratamentului antiviral și care prezentau nivel seric crescut al γ –globulinelor, au avut valori ale ADN/ARN-ului viral crescute comparativ cu pacienții care aveau nivel seric scăzut al γ-globulinelor ( ARN-VHC- 9,87×105 copii/ml vs 4,17×105 copii/ml , ADN-VHB- 10,36× 105 copii/ml vs 1,37× 105 copii/ml)

Dintre acești pacienți, majoritatea pacienților cu nivel seric crescut al γ-globulinelor, la care s-a efectuat biopsie hepatică au prezentat fibroză hepatică gradul 3 și 4 (HBV- r=-0,002, p=0.96 vs HCV- r=0,17, p=0,001 ) și activitate necro-inflamatorie moderată/severă (HBV- r= 0,007, p=0.88 vs HCV- r=0,07, p=0,16), rezultatele fiind mai semnificative la pacienții cu HCV.

122

biopsie

Grafic nr. 18 Corelația grad de fibroză – nivelul seric al γ-globulinelor

biopsie

Grafic nr. 19 Corelația activitate necro-inflamatorie nivelul seric al γ globulinelor

Analizând valorile imunoglobulinelor serice, am constatat că valoarea medie a IgG a fost discret mai redusă la pacienții cu VHB comparativ cu cei cu HCV, fiind de 199,24 ±73,38 U/L la pacienții cu VHB și de 215,43 ±70,99 U/L la pacienții cu HCV, iar valorile medii ale IgA au fost de 178,46±87,67 U/L la lotul de pacienți cu VHB și 195,29± 91,87U/L la pacienții cu HCV.

Nivelul seric al IgG a fost crescut la 48/307 pacienți (15.63%) cu VHB (19 femei și 29 bărbați) și la 68/330 (20.60%) pacienți cu HCV (43 femei și 25 bărbați). Pacienții cu HCV și valori crescute ale IgG au fost mai vârstnici decât cei cu HBV și valori crescute ale IgG, astfel că, prezența nivelului seric crescut al IgG s-a asociat cu vârsta medie 40,27 ±10,89 ani la pacienții cu VHB și 49.71 ±7,84 ani la pacienții cu HCV.

123

La 14/48 pacienți cu HBV și 31/68 pacienți cu HCV s-a constatat prezența manifestărilor extrahepatice.

Grafic nr. 20 Manifestări extrahepatice întâlnite la pacienții cu nivel seric crescut al IgG

23/48 din pacienții cu VHB și 42/68 din pacienții cu HCV au avut nivel seric al transaminazelor crescute, valorile medii ale acestora fiind ușor mai mari comparativ cu valorile medii la pacienții cu nivel seric normal al IgG, (AST-110,47± 56,12 U/L vs 95,68± 65,60 U/L, ALT-107,21± 54,86 U/L vs 101,82± 61,94 U/L la pacienții cu HCV, AST-89,17 ±34,52 U/L vs 71,31± 36,69 U/L, ALT- 129,28 ±61,56 U/L vs 108,15± 68.81 U/L la pacienții cu VHB) diferențele nefiind semnificative din punct de vedere statistic (p=0.15).

34/48 de pacienți cu VHB și nivel seric crescut al imunolglobulinelor, au prezentat antigen HBe, valorile medii ale IgG fiind de 199,08± 77,06 UI/ml (p=0,054) comparativ cu cei cu antigen HBe absent care au prezentat valori medii ale IgG de 199,47 ±68,04 UI/ml, diferențele fiind nesemnificative.

Majoritatea cazurilor cu nivel seric crescut al IgG care au efectuat biopsie hepatică (32/48 pacienți cu HBV și 41/68 pacienți cu HCV) au prezentat grad de fibroză 3 și 4 (p=0.06 vs p=0,05) și activitate necro-inflamatorie moderată (p=0.05 vs p=0,03)

Doar 1/4 pacienți cu VHB și activitate necrotico-inflamatorie severă a prezentat nivel seric crescut al IgG.

124

HBV 188.05 187.61 202.35 198.05 237.78

Grafic nr. 21 Corelația grad de fibroza – nivelul seric al IgG

Grafic nr. 22 Corelația activitate necro-inflamatorie nivelul seric al IgG

Nivelul seric al IgA a fost crescut la 9/307 pacienți cu VHB, cu vârsta medie 41,89± 6,77 ani și la 11/330 pacienți cu HCV, cu vârsta medie 54,09 ±5,64 ani, fără a exista o corelație între acestea și nivelul seric al transaminazelor sau gradul de fibroză hepatică. IgA este imunoglobulina predominantă în bilă. Creșterea ei în ser poate apare în afectările canaliculelor biliare, a spațiilor Disse și a spațiilor portale.

Prezența acestora nu s-a asociat cu gradul de fibroză (p=0,34) sau activitatea necrotico-inflamatorie, ( p=0,41).

125

Studiul a evidențiat că nivelul seric al γ-globulinelor și al IgG se corelează mai frecvent cu gradul de fibroză hepatică și cu activitatea necro-inflamatorie, în special la pacienții cu HCV, în timp ce nivelul seric al IgA nu se corelează cu acestea.

FACTORUL REUMATOID

Factorul reumatoid este un anticorp secretat de sistemul imun, cu rol de autoanticorp dirijat împotriva porțiunii Fc a IgG, care poate fi de tip IgM, mai rar IgG, IgE. Complexul anticorp-antigen este responsabil de modificările patologice organice.

În studiul prezent, factorul reumatoid a fost determinat calitativ prin tehnici standard de laborator, la toți pacienții incluși în studiu, fiind constatat la 18 (5,86%) din pacienții cu hepatită cronică virală B și la 49 (14,84%) din pacienții cu hepatită cronică virală C. S-a constatat că prezența factorului reumatoid s-a asociat mai frecvent cu sexul feminin (la 34 de femei și la 15 bărbați, cu vârsta medie de 50,35±8,35 ani în lotul cu HCV și la 11 femei și 7 bărbați, cu vârsta medie 49,61±2,68 ani în lotul cu VHB).

Din punct de vedere clinic, la pacienții cu HCV, prezența factorului reumatoid a fost asociată cu artralgii-41 de pacienți (83,67%), 8 pacienți (16,32%) cu fenomen Raynaud,

126

leziuni cutanate de tip purpură -7 pacienți (14,28%), mialgii- 8 pacienți (16,32%), 7 pacienți fiind asimptomatici.

mialgii

purpură

artrite

artralgii

HCV

0 10 20 30 40 50

Grafic nr. 23 Manifestările clinice la pacienții cu HCV și FR prezent

7 pacienți au fost diagnosticați cu poliartrită reumatoidă pe baza criteriilor ARA, 21 pacienți prezentau în ser crioglobuline, 3 pacienți cu lupus, 2 pacienți cu sindrom Sjogren, 16 pacienți fără asocierea unei alte afecțiuni.

La pacienții cu VHB, factorul reumatoid s-a asociat cu artralgii-13 pacienți (72,23%), 2 pacienți (11,11%) cu fenomen Raynaud, mialgii- 5 pacienți (27,78%). 3 pacienți au fost diagnosticați cu poliartrită reumatoidă pe baza criteriilor ARA, 3 pacienți prezentau în ser crioglobuline, iar 11 pacienți nu asociau alte afecțiuni.

Din punct de vedere biochimic, prezența factorului reumatoid s-a asociat cu nivel crescut al transaminazelor, mai ales cu nivelul seric al ALT, și cu nivel crescut al GGT, valorile medii ale acestora fiind mai mici comparativ cu sublotul de pacienți cu hepatite cronice virale B sau C dar cu factor reumatoid absent.

127

Grafic nr. 24 Modificările probelor hepatice la pacienții cu FR prezent

Prezența factorului reumatoid s-a corelat mai frecvent cu nivelul seric al ALT la pacienții cu HCV, fără a exista o corelație directă între acesta și aminotransferaze sau GGT la pacienții cu VHB.

Tabel nr. 27 Parametrii biologici la pacienții cu hepatite cronice virale și FR prezent/absent

La 35/49 de pacienți cu HCV și factor reumatoid prezent s-a efectuat biopsie hepatică, constatându-se că prezența factorului reumatoid a fost mai frecvent asociată cu gradul 3 de fibroză, rezultatele nefiind semnificative din punct de vedere statistic (p=0.09) și cu activitate necro-inflamatorie moderată (p=0,11). În lotul de pacienți cu VHB și factor reumatoid prezent, doar 7 pacienți au efectuat biopsie hepatică, constatându-se mai frecvent

128

grad înalt de fibroză (p=0,13) și activitate necrotico-inflamatorie moderată (p=0,23), rezultatele nefiind însă semnificative statistic.

Grafic nr. 26 Corelații activitate necrotico-inflamatorie- factor reumatoid

Factorul reumatoid a fost constatat mai frecvent la pacienții cu hepatită cronică virală C, asociindu-se cu sexul feminin, cu prezența artralgiilor, nivel crescut al ALT, fără a exista o corelație directă între acesta și gradul de fibroză sau activitate necrotico-inflamatorie.

COMPLEMENTUL SERIC (C3)

129

Se presupune că activarea complementului la pacienții cu HCV ar avea rol în producerea leziunilor hepatice, și ar fi util în monitorizarea răspunsului la tratamentul cu interferon.[190]

La pacienții incluși în studiu, s-au determinat valorile complementului seric C3. Majoritatea pacienților incluși în studiu au avut valori normale sau ușor scăzute ale nivelului seric al C3. Valorile medii ale C3 au fost mai scăzute la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu VHB (118,64±36,01mg/dl pentru lotul cu pacienți cu HCV vs 139,07± 37,04 mg/dl pentru lotul de pacienți cu VHB)- p=0.04, RR=0,05. Valori scăzute au fost constatate la 20 din pacienții cu VHB (6,5%) și respectiv 43 de pacienți cu HCV(13,03%) fiind mai frecvente la sexul feminin, cu vârsta peste 35 ani și valori crescute ale transaminazelor. Nivelul scăzut s-ar putea datora scăderii sintezei sau creșterii consumului acestuia în procesele imunologice.

350

300

250

200

150

100

50

0

HBV HCV

Grafic nr. 27 Valorile medii ale complementului seric

Urmărind clinic acești pacienți, am constatat că 4/20 pacienți cu VHB au fost diagnosticați cu alte manifestări extrahepatice : 2 pacienți cu diabet zaharat tip I, 1 pacient cu afectare tiroidiană, care prezenta concomitent în ser și anticorpi antitiroidieni, 1 pacient cu limfom non-Hodkgin.

5/43 pacienți cu HCV și nivel seric scăzut al C3 au prezentat concomitent anticorpi antinucleari, 6 pacienți prezentau factor reumatoid, 17/43 de pacienți fiind diagnosticați cu alte afecțiuni extrahepatice (8 pacienți cu glomerulonefrită, 1 pacient cu afectare tiroidiană, 5 pacienți cu crioglobulinemie mixtă, 3 pacienți cu lupus eritematos sistemic).

130

Valorile medii ale transaminazelor au fost ușor crescute la pacienții cu VHB și nivel scăzut al C3, comparativ cu pacienții cu VHB și nivel seric normal al C3,(p=0,12) în timp ce valorile medii ale transaminazelor la pacienții cu HCV și nivel scăzut al C3 au fost ușor mai mici comparativ cu cei cu HCV și nivel seric normal al C3, (p=0,6). Rezultatele studiului evidențiază că nu există o corelație directă între nivelul seric al C3 și cel al transaminazelor.

Tabel nr. 28 Parametrii biologici și histopatologici urmăriți la pacienții cu nivel scăzut al C3

Afectarea hepatică severă se corelează cu creșterea nivelului seric al globulinelor, iar pe de altă parte poate fi responsabilă de scăderea sintezei complementului. În studiu am urmărit nivelul γ–globulinelor și al IgG la pacienții cu hepatite cronice virale și nivel scăzut al C3, fără a constata o asociere semnificativ statistic între valorile –globulinelor ș i a IgG ș i nivelul scăzut al C3.

22/43 pacienți cu HCV și nivel scăzut al C3 (p=0,18) și respectiv 9/20 pacienți (p=0,24) cu VHB și nivel seric scăzut al C3 au avut valori crescute al γ–globulinelor.

131

15/43 (p=0.08) respectiv 6/20 pacienți (p=0.10) au avut concomitent nivel crescut al IgG. Valorile medii ale acestora au fost de 246,37± 93,21UI/ml, discret mai mari comparativ cu valorile medii ale acestora la pacienții cu nivel seric normal al C3 ș i HCV- 211,04± 66,29 UI/ml, respectiv 199,80 ±75,21UI/ml vs 194,55 ±73,38 UI/ml la pacienț ii cu HBV. Valorile medii ale IgG au fost mai crescute la lotul de pacienți cu HCV comparativ cu lotul de pacienți cu VHB, diferenț ele nefiind semnificative.

În ambele loturi de studiu, nivelul seric scăzut al complementului C3 s-a asociat cu grad de fibroză moderat/sever (p=0,16) și activitate necrotico-inflamatorie moderat/severă (p=0,26). În ambele loturi de studiu, gradul 4 de fibroză s-a asociat cu valori medii mai scăzute ale complementului seric.

Grafic nr. 28 Corelații grad de fibroză-nivel seric al complementului la pacienții cu VHB ( figura A) și HCV (figura B)

Nivelul seric al complementului poate fi influențat la pacienții cu hepatite cronice, de mecanismele imunologice implicate în patogenia bolii. Deși la pacienții cu afectare hepatică severă, un procent redus dintre aceștia au avut nivelul seric al complementului redus, acesta nu s-a corelat direct nici cu nivelul seric al transaminazelor, nici cu gradul de fibroză. Procentul pacienților cu C3 scăzut a fost mai mare la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu VHB, consecință probabil a mecanismelor imunologice constatate mai frecvent la cei cu HCV.

132

COMPLEXELE IMUNE CIRCULANTE (CIC)

Rolul complexelor imune circulante (CIC) în patogenia bolii la pacienții cu hepatite cronice virale B și C este încă, controversat.

Studiul a urmărit prevalența complexelor imune circulante la acești pacienți precum și relația acestora cu modificările clinice, biologice și virusologice.

Complexele imune circulante au fost pozitive la 14/307 (4,6%) din pacienții cu HBV și la 36/330 (10,9%) din pacienții cu HCV, constatând o prevalență mai mare la pacienții cu HCV (RR=3,72, OR=4,27)

Valorile medii ale acestora au fost mai mari la lotul de pacienți cu HCV comparativ cu lotul de pacienți cu HBV, fiind de 37,58± 23,28 unități fotometrice la pacienții cu HCV și de 29,34± 13,41 unități fotometrice la pacienții cu HBV.

Vârsta medie a pacienților cu complexe imune circulante prezente a fost de 44,50± 6,72 ani la pacienții cu HBV și de 51,54± 7,36 ani la pacienții cu HCV.

17/36 (47,2%) pacienți cu HCV și complexe imune circulante pozitive (r=0,10, p=0,06) și respectiv 4/14 (28,5%) pacienți cu HBV și complexe imune circulante pozitive au prezentat manifestări extrahepatice (renală, tirodite, crioglobulinemie)- RR=1,12, OR=1,18.

Analizând valorile transaminazelor la acest grup de pacienți, am observat că majoritatea pacienților au avut valori ușor crescute ale acestora, 14/36 pacienți și respectiv 4/14 pacienți prezentând valori normale ale transaminazelor.

Tabel nr. 29 Corelații clinice între prezenta CIC și valorile transaminazelor

8/14 pacienți și respectiv 26/36 pacienți au avut valori scăzute ale complementului seric, 1/14 pacienți și 7/36 pacienți prezentând simultan anticorpi antinucleari.

Nici un pacient cu CIC prezente nu a efectuat biopsie hepatică.

133

CRIOGLOBULINELE

Crioglobulinele sunt proteine termolabile, care au proprietatea de a precipita la temperaturi scăzute, fiind asociate bolilor limfoproliferative, autoimune sau infecțioase.

Crioglobulinele au fost constatate în ser la 3 din pacienții cu HBV, cu vârsta medie de 50,34±7,89 ani și la 27(8,2%) din pacienții cu HCV, cu vârsta medie 51,2±7,55 ani, asocierea acestora fiind mai evidentă la pacienții cu HCV.

VHB- crioglobuline+

VHC- crioglobuline+

hepatita cronică-

crioglobuline

absente

Grafic nr. 29 Prevalența crioglobulinelor serice

Toți pacienții au fost evaluați clinic, imunologic (factorul reumatoid, nivelul seric al C3, anticorpii antinucleari) și anatomopatologic.

Toți cei trei pacienți cu HBV au fost asimptomatici. Din lotul de pacienți cu HCV și crioglobuline prezente 7 pacienți au prezentat purpură, artralgii, 8 pacienți prezentând afectare renală, 12 pacienți fiind asimptomatici.

Din cei 27 pacienți cu VHC și crioglobuline prezente, 19 pacienți au avut funcția renală normală (creatinină <1,4mg/dl), în timp ce 8 pacienți au avut afectare renală de diferite grade. 3 pacienți au prezentat proteinurie, hematurie și cilindrii hialini, sugerând afectarea glomerulară. Nici unul dintre acești pacienți nu a efectuat biopsie hepatică sau renală.

Analiza transaminazelor și a GGT-ului la acești pacienți a evidențiat o corelație semnificativă între prezența crioglobulinelor și nivelul transaminazelor (p<0.05) la pacienții cu HCV, însă acest lucru nu s-a putut constata și în lotul de pacienți cu HBV, probabil și datorită unui număr foarte mic de pacienți cu crioglobuline prezente.

134

Tabel nr. 30 Corelații între prezența crioglobulinelor și parametrii biologici

Factorul reumatoid a fost constatat la unul din pacienții cu HBV și la 6/27din pacienții cu HCV (p>0,05).

Complementul seric C3 a fost urmărit la acești pacienți, constatând că toți cei 3 pacienți cu VHB au avut valori normale (123,45± 41,33 mg/dl), în timp ce în lotul de pacienți cu HCV, 3 pacienți aveau valori scăzute ale acestuia (p>0,05), valoarea medie fiind de 113,3±39,31 mg/dl, discret mai redusă comparativ cu pacienții cu crioglobuline prezente și valori normale ale C3- 119,08 ±35,74 mg/dl.

La 5 pacienți cu VHC și crioglobuline prezente am constatat prezența anticorpilor antinucleari, nici un pacient din cei trei cu VHB nu a prezentat anticorpi antinucleari.

Biopsia hepatică a fost efectuată la 15 din pacienții cu HCV și crioglobuline prezente, constatând mai frecvent gradul 3 și 4 de fibroză (p=0,01) și activitate necrotico-inflamatorie (p=0,05)

135

PREZENȚA AUTOANTICORPILOR LA PACIENȚII CU HEPATITE CRONICE VIRALE

Din cei 637 de pacienți luați în studiu, diagnosticați cu hepatită cronică virală B sau C, la 240 de pacienți (110 de pacienți cu VHB și 130 de pacienți cu HCV), s-a urmărit nivelul seric al transaminazelor, gradul fibrozei și prezența anticorpilor ANA (anticorpi anti-nucleari), AMA (anticorpi antimitocondriali), ASMA (anti-smooth muscle antibodies), anti-LKM1(anti-liver-kidney microsomal antibody) ca markeri ai răspunsului autoimun. Cele două loturi au fost omogene din punct de vedere al distribuției pe sexe și grupe de vârstă, fiind formate din 130 de pacienți cu infecție virală C (64 de femei și 66 bărbați, cu vârsta medie 40,21±5,34 ani), și 110 de pacienți cu infecție virală B (51 de femei și 59 de bărbați, cu vârsta medie 38,30± 7,06 ani).

ANA (anticorpi antinucleari) sunt anticorpi dirijați împotriva unor componente ale nucleului celular și caracterizează bolile cu mecanism autoimun. În studiul prezent, ANA au fost depistați la 26/130 (20%) din pacienții cu HCV și la 12/110 (10,90%) din pacienții cu VHB. Prezența acestora s-a asociat mai frecvent cu sexul feminin (18/26-HCV, respectiv 8/12-VHB), și la vârste peste 38 ani (vârsta medie la pacienții cu HCV de 48,77±10,12 ani, respectiv 47,77±3,98 ani la pacienții cu VHB).

Urmărind clinic acești pacienți am constatat prezența anticorpilor antinucleari s-a asociat cu lupusul eritematos sistemic, poliartrita reumatoidă, afectarea autoimună tiroidiană și cu diabetul zaharat tip I.

Grafic nr. 30 Afecțiuni clinice diagnosticate la pacienții cu hepatite cronice virale cu ANA +

136

Analizând parametrii biochimici, s-a constatat că la pacienții cu HCV, ANA s-a corelat cu creșterea ALT (p=0,04), GGT (p=0,02) și mai puțin cu AST (p=0,10). În lotul de pacienți cu VHB, prezența ANA s-a corelat mai frecvent cu nivelul seric crescut al AST (p=0,02) și ALT (p=0,08) și mai puțin frecvent cu nivelul seric crescut al GGT. Pacienții cu anticorpi antinucleari prezenți au prezentat valori medii mai mari ale γ–globulinelor și IgG comparativ cu cei cu anticorpi antinucleari absenți, deși diferențele dintre cele două subloturi nu sunt semnificative.

Tabel nr. 31 Parametrii biologici la pacienții cu ANA și hepatite cronice virale

5/26 pacienți cu ANA prezenți și HCV prezentau simultan în ser factor reumatoid prezent, 4 din acești pacienți fiind diagnosticați cu poliartrita reumatoidă, în timp ce la 5/12 pacienți cu VHB și ANA prezenți s-a constatat prezența factorului reumatoid, 3 dintre aceștia fiind diagnosticați cu poliartrită reumatoidă, pe baza criteriilor ARA.

Din cei 26 pacienți cu HCV și ANA prezenți, doar 18 pacienți au efectuat biopsie hepatică. Rezultatele anatomopatologice au evidențiat gradul 3 și 4 de fibroză la 10/18 pacienți (p=0,06) și activitate necrotico-inflamatorie severă la 9/18 pacienți.

În lotul de pacienți cu hepatită cronică virală B, 6 pacienți au efectuat biopsie hepatică, fără ca prezența ANA să se coreleze cu gradul de fibroză (p= 0,28) sau cu activitatea necrotico-inflamatorie (p=0,36)

137

Grafic nr. 31 Corelații între prezența ANA și gradul de fibroză

Grafic nr. 32 Corelații între prezența ANA și activitatea necrotico-inflamatorie

Prezența anticorpilor antinucleari a fost constatată mai frecvent la pacienții cu HCV comparativ cu VHB, fiind mai frecvent întâlniți la pacienții de sex feminin, cu vârsta peste 38 ani, cu valori crescute ale transaminazelor, în special al ALT, fără a exista o corelație semnificativă între prezența acestora și gradul de fibroză sau activitate necrotico-inflamatorie.

Anticorpii antitiroidieni. În studiul prezent s-a urmărit prezența anticorpilor antitireoperoxidază la cei 240 de pacienți incluși în studiu pentru depistarea anticorpilor. Anticorpii antitiroidieni pot fi prezenți la 70-80% din pacienții cu tiroidită autoimună și la aproximativ 20-30% din pacienții cu boală Graves, însă ei pot fi constatați și la pacienți cu anemie hemolitică autoimună, poliartrita reumatoidă, lupus eritematos sistemic.

Afectarea tiroidiană la pacienții cu hepatite cronice virale, mai ales la cei cu HCV, este adesea constatată secundar tratamentului antiviral, dar poate fi indusă înaintea inițierii tratamentului prin mecanisme autoimune.

138

În studiul prezent anticorpii antitiroidieni au fost constatați la 7 pacienți cu HCV și la 4 pacienți cu VHB, înaintea inițierii tratamentului antiviral. Prezența anticorpilor antitiroidieni s-a constatat mai frecvent la sexul feminin, cu vârsta medie 45,14±6,71 ani la pacienții cu HCV și 42,5 ±8,66 ani la pacienții cu VHB. Prezența anticorpilor antitiroidieni a fost asociată cel mai frecvent cu hipotiroidismul.

Grafic nr. 33 Diagnosticul clinic al pacienților cu anticorpi antitiroidieni

Pacienții cu anticorpi antitiroidieni au prezentat valori medii ale transaminazelor mai crescute comparativ cu pacienții care nu prezentau în ser acești anticorpi la ambele loturi (AST/VHC-98,12±82,90 UI/L vs 78,24±34,67 UI/L, ALT/VHC-110,67±77,96 UI/L vs 97,35±40,56 UI/L, AST/VHB- 122±13,85 UI/L vs 73,47±36,68 UI/L, ALT/VHB-113±34,04 UI/L vs 93,01±68,24 UI/L ). În tabelul următor sunt redate caracteristicile demografice, biologice, imunologice și histopatologice ale pacienților cu anticorpi antitiroidieni, constatând mai frecvent gradul 3 de fibroză și activitatea necrotico-inflamatorie ușoară-moderată.

139

Tabel nr. 32 Caracteristicile clinice , biologice ș i histopatologice la pacienții cu hepatite cronice virale și anticorpi antitiroidieni

La pacienții incluși în studiu, am mai constatat prezența anticorpilor ASMA la 2 pacienți cu HCV și 1 pacient cu HCV și anticorpi anti-LKM1, fără a exista vreo corelație cu nivelul transaminazelor.

Analizând parametrii biologici la pacienții incluși în studiu, putem concluziona că nivelul seric al trombocitelor, raportul RITIS, APRI, au valoare prognostică, fiind corelate cu gradul de fibroză hepatică. Nivelul seric al γ-globulinelor și al IgG se corelează mai frecvent cu gradul de fibroză hepatică și cu activitatea necro-inflamatorie, în special la pacienții cu HCV, în timp ce nivelul seric al IgA nu se corelează cu acestea.

De asemenea, prezența crioglobulinelor serice și scăderea complementului seric s-a corelat semnificativ cu gradul de afectare hepatică (p<0.05), în timp ce prezența factorului reumatoid, a autoanticorpilor și a complexelor imune circulante nu s-a corelat semnificativ cu gradul de afectare hepatică (p>0,05).

140

VII.4.PROFILUL MANIFESTĂRILOR EXTRAHEPATICE

Modificările imunologice sunt responsabile de apariția unor leziuni organice, induse cel mai probabil prin intermediul complexelor imune, determinând manifestările extrahepatice.

Scopul studiului a fost să urmărească prevalența manifestărilor extrahepatice la pacienții cu hepatite cronice și eventualele asocieri clinice, biologice și histopatologice.

Hepatitele cronice virale B și C sunt însoțite adesea de prezența altor manifestări extrahepatice: articulare, cutanate, renale, endocrinologice, etc.

Din cei 637 de pacienți incluși în studiu, 206 de pacienți (32,34%) prezentau asociate manifestări extrahepatice- 75/307 (24,42%) de pacienți cu VHB și 131/330 (39,70%) de pacienți cu HCV.

100

131

50 75

0

HBV HCV

Grafic nr. 34 Prevalența manifestărilor extrahepatice

Prezența manifestărilor extrahepatice a fost mai frecventă la femei în ambele loturi de studiu (122 femei, 84 bărbați), diferențele nefiind semnificative statistic- RR = 0.6025, 95 % CI = 0.42 – 0.86 și la vârste peste 38 ani (vârsta medie 50,6±7,47 ani în lotul de pacienți cu HBV și 42,30±10,62 ani în lotul de pacienți cu HCV).

141

HBV HCV

Grafic nr. 35 Repartiția pe sexe a pacienților cu manifestări extrahepatice și hepatită cronică virală

HBV HCV

46 50

54

Grafic nr. 36 Distribuția pe grupe de vârstă a pacienților cu hepatite cronice virale și manifestări extrahepatice

Manifestările extrahepatice constatate au fost crioglobulinemia mixtă, afectarea renală, diabetul zaharat, sindromul reumatoid, leziunile cutanate de tip lichen plan, psoriazis, tiroidita autoimună, limfoame/neoplazii.

142

Grafic nr. 37 Incidența principalelor manifestări extrahepatice la pacienții cu hepatite cronice virale

Prezența manifestărilor extrahepatice a fost analizată din punct de vedere al eventualelor corelații cu nivelul transaminazelor, GGT-ului, complementul seric, gradul de fibroză și activitatea necrotico-inflamatorie.

Tabel nr. 33 Corelații între prezența manifestărilor extrahepatice ;i valorile testelor hepatice și complementului seric

143

complementului seric C3 au fost mai scăzute la pacienții cu manifestări extrahepatice prezente, diferențele fiind nesemnificative. Valorile negative ale indicelui p Pearson, semnifică prezența unor valori scăzute ale complementului seric la cele două loturi, posibil și prin consumarea acestuia în formarea complexelor imune circulante.

Box-and-whisker

300

250

200

150

100

50

0

C3- HCV C3-HBV

Grafic nr. 38 Valorile medii ale complementului seric la pacienții cu manifestări extrahepatice asociate

În ceea ce privește gradul de corelare cu fibroza hepatică, din cei 206 de pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală B sau C și care prezentau manifestări extrahepatice, 120 de pacienți au efectuat puncție biopsie hepatică, constatându-se mai frecvent gradul F3 (p=0,09).

Rezultatele nu sunt semnificative statistic, probabil și datorită faptului că majoritatea pacienților cu manifestări extrahepatice nu au efectuat biopsia hepatică.

144

HBV+afecțiuni extrahepatice HCV +afecțiuni extrahepatice

Grafic nr. 39 Repartiția pacienților cu manifestări extrahepatice în funcție de gradul fibrozei hepatice

Analizând activitatea necrotico-inflamatorie la acești pacienți am constatat că prezența manifestărilor extrahepatice la pacienții cu hepatite cronice virale se asociază mai frecvent cu activitatea necrotico-inflamatorie ușoară/moderată, rezultatele nefiind semnificative din punct de vedere statistic (p=0.10).

HBV+afecțiuni extrahepatice HCV +afecțiuni extrahepatice

54

biopsie

Grafic nr. 40 Repartiția pacienților cu manifestări extrahepatice în funcție de activitatea necrotico-inflamatorie

Afectarea renală a fost constatată atât la pacienții cu crioglobuline prezente (8 pacienți cu HCV) și diabet zaharat (8 pacienți cu HCV și 6 pacienți cu HBV), cât și la pacienții fără alte afecțiuni asociate (21 de pacienți cu HCV- 6,36% și 8 pacienți cu HBV-2,60%). Afectarea renală din cadrul diabetului zaharat sau al crioglobulinemiei nu a fost atent investigată, atenția îndreptându-se spre pacienții cu semne de afectare renală fără asocierea clinică a unei alte afecțiuni care o poate induce.

145

Cel mai frecvent constatată a fost proteinuria; aceasta a fost de tip nefritic (< 3g/zi) la

pacienți cu HBV și la 11 pacienți cu HCV și de tip nefrotic (>3g/zi) la 4 pacienți cu HBV, respective 7 pacienți cu HCV.

Hematuria microscopică a fost constatată la 3/8 din pacienții cu HBV și la 12/21 din pacienții, iar cea macroscopică la 3/8 pacienți, respectiv 7/21 din pacienți.

Proteinuria de tip nefrotic, hematuria și prezența cilindrilor hialini la analiza sedimentului urinar, au fost constatate la 13/21 din pacienții cu HCV, respectiv 4/8 sugerând

leziunea glomerulară. Dintre acești pacienți, 4 pacienți cu HCV au prezentat valori crescute ale complexelor imune circulante, sugerând implicarea mecanismelor imunologice în leziunea glomerulară. Nici un pacient dintre aceștia nu a efectuat biopsie renală.

Sindromul de retenție azotată a fost constatat la 2/8 din pacienții cu HBV, respectiv 6/21 pacienți cu HCV.

Din punct de vedere clinic, 15/21 pacienți, respectiv 5/8 pacienți au prezentat edeme periferice, 9 pacienți cu HCV și 2 pacienți cu HBV și afectare renală au fost diagnosticați cu hipertensiune arterială secundară.

Afectarea renală s-a asociat frecvent cu creșteri ale transaminazelor în ambele loturi de studiu (HBV- r=-0,06, p=0,22, HCV- r=0,08, p=0,16). Majoritatea pacienților cu afectare renală nu au efectuat biopsie hepatică (30/42, respectiv 14/21)

Grafic nr. 41 Valorile medii ale transaminazelor în funcție de prezența afectării renale

Diabetul zaharat a fost prezent la 31 din pacienții cu HBV-10,10% și la 40 din pacienții cu HCV-12,12%, diferențele nefiind semnificative statistic între cele două loturi. (RR = 0.8331, 95 % CI = 0.5352 -1.2967).

146

Din punct de vedere al relației diabetului zaharat cu sexul pacienților s-a constatat o incidență crescută la pacienții de sex masculin (26/40- 65%, respectiv 19/31-61,30%), pacienții cu HCV și diabet zaharat fiind mai vârstnici comparativ cu cei cu HBV și diabet zaharat, (vârsta medie 54,90 ±4,08 ani în lotul de pacienți cu HCVvs 40,45± 12,88 ani în lotul de pacienți cu HBV).

Diabetul zaharat a fost de tip I la 6 din pacienții cu HBV și la 5 din pacienții cu HCV.

Loturile au fost subdivizate în 3 grupuri:

Un grup de pacienți care erau cunoscuți cu diabet zaharat înaintea diagnosticării infecției virale (14/40, respectiv 17/31 )

Un grup de pacienți diagnosticați în același moment cu diagnosticarea infecției virale

(n=18/40 respectiv 8/31)

Un grup de pacienți diagnosticați cu diabet zaharat pe parcursul evoluției infecției

virale (n=8/40 respectiv 6/31 )

Un număr redus de pacienți (11/40 respectiv 9/31) au necesitat insulinoterapie, majoritatea pacienților fiind în tratament cu antidiabetice orale sau/și restricții dietetice.

Afectarea renală la pacienții cu hepatite cronice virale și diabet zaharat a fost observată la (8/40 pacienți, respectiv 6/31 pacienți)

Frecvent, pacienții cu diabet zaharat au prezentat și alte comorbidități: metabolice (obezitate, dislipidemie), cardio-vasculare (hipertensiune arterială, cardiopatie ischemică), alte afecțiuni (hipotiroidism, gastrite-esofagite).

Asocierea diabet zaharat hepatită cronică virală, s-a asociat cu creșteri ale transaminazelor și GGT-ului, (valorile medii ale acestora fiind mai mari comparativ cu subloturile de pacienți cu hepatite cronice virale fără asocierea de diabet zaharat), grad moderat de fibroză.

147

Tabel nr. 34 Corelații între prezenta/absenta DZ și principalii parametrii analizați

Grafic nr. 42 Valorile medii ale transaminazelor la pacienții cu diabet zaharat asociat

Prezența diabetului zaharat la pacienții cu hepatite cronice virale s-a asociat cu o frecvență mai mare a tulburărilor metabolice (hipercolesterolemia- 11/31 pacienți, respectiv 16/40 pacienți, hipertrigliceridemie-19/31 pacienți cu HBV, 29/40 pacienți cu HCV) și cardiovasculare, în special de tip hipertensiune arterială (13/31 pacienți cu HBV și 18/40 pacienți cu HCV).

148

Prezența diabetului zaharat s-a asociat cu gradul de fibroză hepatică, pacienții prezentând mai frecvent leziuni de steatoză ușoare și moderate.

Manifestările reumatologice au fost prezente cu o frecvență mai mare la pacienții cu HCV comparativ cu pacienții cu HBV, fiind observate la 70/307 din pacienții cu HBV (22,80%) și la 154/330 din pacienții cu HCV (46,70%). Manifestările reumatologice s-au asociat mai frecvent cu sexul feminin (47/70, respectiv 98/154 ), cu vârsta medie 43,09± 3,91 ani în lotul de pacienți cu HBV și 48,54± 9,70 ani în lotul de pacienți cu HCV.

Cel mai frecvent au fost constatate artralgiile asimetrice (70/307, respectiv 123/330) și mialgiile (45/307 pacienți cu HBV și 68/330 pacienți cu HCV).

Manifestările clinice de tip artrită simetrică la nivelul articulațiilor mici au fost constatate la 17/307 din pacienții cu HBV și 56/330 din pacienții cu HCV. 14/17 și respectiv 47/56 din pacienți au prezentat în ser factor reumatoid. Dintre aceștia, 7 pacienți cu HCV și 3 pacienți cu HBV au fost diagnosticați pe baza criteriilor ARA cu poliartrită reumatoidă. Cu excepția pacienților diagnosticați cu poliartrită reumatoidă, toți ceilalți pacienți cu artrite și artralgii nu au prezentat leziuni articulare. 3 pacienți cu HBV și 27 de pacienți cu HCV prezentau în ser simultan crioglobuline, fiind diagnosticați cu crioglobulinemie.

În urma investigațiilor paraclinice, sindromul reumatoid caracterizat prin artralgii, artrite simetrice la nivelul articulațiilor mici, factor reumatoid prezent a fost constatat la 11 pacienți cu HBV și 16 pacienți cu HCV. Acesta s-a asociat cu sexul feminin (7/11 pacienți, respectiv 11/16 pacienți), vârsta medie 44,54± 7,34 ani la pacienții cu HBV și 48,35 ±6,89 ani la pacienții cu HCV.

Prezența sindromului reumatoid s-a asociat cu valori normale și ușor crescute ale transaminazelor la majoritatea pacienților (8/11 pacienți, respectiv 12/16 pacienți), fără a exista o corelație între acesta și nivelul transaminazelor sau gradul de afectare hepatică.

149

Tabel nr. 35 Corelații între prezenta sindromului reumatoid și principalii parametrii analizați

Afectarea tiroidiană a fost constatată la 17 pacienți (5,53%) cu HBV cu vârsta medie 43,35 ±7,81 ani și la 34 pacienți (10.30%) cu HCV cu vârsta medie 45,45± 5,09 ani, fiind asociată mai frecvent cu sexul feminin (24/34, respectiv13/17), RR=0.9231, 95 % CI = 0.65 – 1.29 .

Hipotiroidismul a fost diagnosticat prin creșteri ale TSH-ului și scăderi ale nivelurilor serice ale hormonilor tiroidieni la 22/34 din pacienții cu HCV, respectiv 11/17 din pacienții cu HBV.

Hipertiroidismul a fost diagnosticat la 10 pacienți cu HCV și la 6 pacienți cu HBV. Anticorpii antitiroidieni au fost constatați la 7 pacienți cu HCV și la 4 pacienți cu

HBV, sugerând implicarea sistemului imun în determinarea leziunilor.

Majoritatea pacienților cu afectare tiroidiană au prezentat valori normale și ușor crescute ale transaminazelor, valorile medii ale acestora fiind mai scăzute comparativ cu pacienții cu hepatită cronică virală fără afectare tiroidiană, existând o relație inversă între acești parametri.

150

Tabel nr. 36 Corelații între afectarea tiroidiană, transaminaze și gradul de fibroză

Grafic nr. 43 Valorile medii ale transaminazelor în funcție de prezența afectării tiroidiene

8/17 pacienți cu HBV și respectiv 12/34 pacienți cu HCV nu au efectuat biopsie hepatică, majoritatea pacienților care au efectuat biopsie hepatică prezentând gradul 3 de fibroză (4/9 pacienți cu HBV, respectiv 10/22 pacienți cu HCV). Nu a existat nici o corelație directă între afectarea tiroidiană, nivel seric al transaminazelor și gradul de afectare hepatică.

151

Alte manifestări extrahepatice

Infecția cu virusurile hepatice, în special cele cu virusul C, dublează riscul de apariție a limfoamelor, mai ales cele non-Hodgkin. Stimularea oncogenezei se face prin intermediul excesului de imunoglobuline secretate în urma activării limfocitare, cu apariția unor mutații genetice, responsabile de apariția neoplaziilor.

Asocierea dintre infecția cu VHC și limfomul non Hodgkin a fost sugerată pentru prima data de Ferri și colaboratorii săi în trei studii diferite, aproximativ 30% dintre pacienți prezentând această asociere.[161, 162]

12/330 pacienți cu HCV (n=3.6%) au prezentat asociat neoplazii, 3 pacienți prezentând limfom Hodgkin, 1 pacient cu limfom non-Hodgkin, 4 pacienți prezentau asociat neoplasm gastric și 4 pacienți neoplasm mamar.

4%

HCV fără tumori

asociate

tumori/limfoame

96%

Grafic nr. 44 Prevalența neoplaziilor la pacienții cu HCV

6/307 pacienți cu HBV prezentau asociat neoplazii (2 pacienți cu limfom Hodgkin, 1 pacient cu limfom non-Hodgkin, 2 pacienți cu cancer gastric, 1 pacient cu cancer de colon), acestea fiind diagnosticate ulterior diagnosticului de hepatită cronică virală.

Prezența afecțiunilor oncologice s-a constatat mai frecvent la sexul masculin (9/12 pacienți, respectiv 4/6 pacienți), cu vârsta medie 50,17± 9,42 ani la pacienții cu HCV, respectiv 51,83± 4,5 ani la pacienții cu HBV.

Nu s-a observat nici o corelație a prezenței neoplaziilor și modificări ale testelor hepatice. Niciun pacient nu a efectuat biopsie hepatică.

152

Unii autori susțin că, crioglobulinemia mixtă se asociază și ea frecvent cu limfoamele non Hodgkin, la acești pacienți existând o populație limfocitară anormală [165] presupunând că factorul reumatoid secretat ar favoriza degenerarea malignă. În studiul prezent nici un pacient nu prezenta crioglobuline în ser sau factor reumatoid.

În loturile de studiu, s-a observat prezența leziunilor cutanate la 5 pacienți cu HCV (psoriazis vulgar) și la 2 pacienți cu HBV (1 pacient cu lichen plan și 1 pacient cu psoriazis).

În urma analizei acestor parametrii clinici și paraclinici, putem concluziona că la pacienții incluși în lotul de studiu, prezența manifestărilor extrahepatice s-a asociat mai frecvent cu sexul feminin, creșteri ale testelor hepatice, vârsta peste 35 ani, cu activitate necrotico-inflamatorie ușoară/moderată și grad de fibroză F3.

VII.5.CARACTERISTICI HISTOPATOLOGICE ȘI IMUNOHISTOCHIMICE

Lucrarea este un studiu statistic efectuat pe un număr de 421 de puncții biopsii hepatice, la pacienții diagnosticați cu hepatite cronice virale, în intervalul ianuarie 2004-decembrie 2007.

Pentru evaluarea histologică a importanței și evoluției modificărilor hepatice, cât și pentru evidențierea imunohistochimică a markerilor virali, a fost necesar examenul histopatologic pe material obținut prin puncția biopsie hepatică.

Fragmentele recoltate au parcurs următorii pași până la interpretarea histopatologică:

Au fost fixate în formol 10% la temperatura camerei, timp de 36-48 de ore,

Au fost prelucrate pentru includerea la parafină;

S-a secționat blocul de parafină și secțiunile obținute au fost colorate cu: hematoxilină-

eozină (HE) sau cu colorații speciale: PAS, Tricrom Masson, impregnație argentică

Gömöri , sau au fost pregătite pentru examenul imunohistochimic (IHC).

Secțiunile hepatice colorate după modul de mai sus au fost evaluate cu ajutorul scorului Knodell și METAVIR.

Examinarea preparatelor necesită o atenție specială, în funcție de etiologia hepatitei

cronice:

la pacienții cu hepatite cronice cu virus C, s-a evaluat densitatea și componentele infiltratului inflamator, această evaluare fiind utilă pentru diagnosticul microscopic diferențial;

153

fibroza perivenulară se observă mai dificil la colorația hematoxilină-eozină, motiv pentru care s-au folosit colorațiile speciale: VG, Tricrom Masson;

examinarea biopsiilor hepatice cu obiectiv mic a permis aprecieri asupra arhitecturii, numărului de spații porte, a raportului sinusoide-hepatocite;

lipidele s-au identificat în microscopia optică pe secțiuni la gheață colorate cu reactivi specifici (Scharlach roșu, Sudan III, IV);

evidențierea fibrelor de reticulină s-a făcut prin impregnație argentică Gömöri; aceasta permite aprecieri asupra modificărilor arhitecturale ale parenchimului hepatic (colapsul rețelei de fibre argirofile) și semnalează arii mici de necroză și de regenerare;

la nivelul citoplasmei au fost evaluate depozitele de glicogen, staza biliară intrahepatocitară, prezența vacuolelor, a transformării hialine (corpii Mallory) și a depozitelor de hemosiderină și cupru;

identificarea spațiului portal inițial din zonele de „piecemeal necrosis‖ s-a făcut utilizând colorațiile pentru colagen, care permit diferențierea fibrelor grosolane de colagen de tip I din spațiile porte, față de fibrele fine de colagen de tip III (fibre de reticulină), care apar în primele stadii ale leziunilor de „piecemeal necrosis‖.

Prezenta depozitelor de fier au fost puse în evidență cu ajutorul colorației Pearls

Figura nr. 7 Hepatită cronică – infiltrat inflamator, prezenț a depozitelor de fier, colorație Pearls obx10

154

Pe preparatele obținute prin puncție biopsie hepatică se evidențiază imunohistochimic (IHC) markerii virali ai hepatitei B prin metoda ABC (avidin- biotin-complex peroxidază) ce permite vizualizarea particulelor virale prin reacții Ag-Ac succesive cu molecule din ce în ce mai mari și în final colorate cu diaminobenzidină (DAB). Tehnica permite decelarea unor cantități mici de antigene virale pe preparatele incluse la parafină.

Studiul statistic efectuat în perioada ianuarie 2004- decembrie 2007 a relevat existența a 421 de puncții biopsii hepatice, efectuate pentru stabilirea diagnosticului de hepatită cronică, în vederea efectuării tratamentului cu interferon.

Fișele de însoțire a biopsiilor au menționat diagnosticul de:

hepatită cronică C – pentru 210 de bolnavi,

hepatită cronică B – pentru 211 bolnavi, dintre care hepatită cronică B+D – pentru 52 de bolnavi;

Repartiția pe sexe arată o prevalență a sexului feminin, cu 283 de cazuri din totalul de 421(67.22 %), comparativ cu sexul masculin, reprezentat de 138 de cazuri (32.78 %).

În ceea ce privește vârsta, cele mai multe cazuri au fost în intervalul 41-50 de ani – 164 de cazuri, comparativ cu extrema cealaltă, grupa de vârstă > 60 ani cu 10 de cazuri .

Repartiția pe grupe de vârstă și sex a hepatitelor cronice este reprezentată în tabelul de mai jos.

Tabel nr. 37 Repartiția cazurilor de hepatită cronică în funcție de grupa de vârstă și sex

155

În ceea ce privește tipul de hepatită cronică, după Indexul Activității Histologice (HAI) descris de Knodell și după scorul METAVIR, din cele 421 puncții biopsii hepatice:

68 cazuri au fost de hepatită cronică minimal activă (16.17%);

173 de cazuri au fost cu hepatită cronică ușor activă (41.09%);

138 de cazuri au fost cu hepatită cronică moderat activă (32.77%)

42 cazuri cu hepatită cronică sever activă (9.97%) – din care un caz a prezentat și

zone de ciroză;

Repartiția cazurilor de hepatită cronică în funcție de leziunile descrise după scorul

Knodell și METAVIR, se observă în tabelul următor.

Tabel nr. 38 Repartiția cazurilor de hepatită cronică în funcție de HAI și scorul METAVIR

VII.5.1. HEPATITA CRONICĂ MINIMAL ACTIVĂ

A fost prezentă în 68 cazuri, reprezentând 16.15% din totalul celor 421 de puncții hepatice; sexul feminin a fost reprezentat cu 45 cazuri, iar vârstele extreme au fost reprezentate de 27 și 56 de ani și au aparținut sexului masculin.

Microscopic

La interpretarea histologică cele 68 puncții hepatice au avut scorul Knodell 2-4, scorul

METAVIR A1F1 sau 2.

Se remarcă piecemeal necrosis doar în unele spații porte sau, în 2 cazuri, într-un singur segment al perimetrului spațiului port. Necrozele sunt parcelare și au fost ocazionale. Modificările intralobulare au fost minime și au constat din mici focare de necroză hepatocitară cu reacție inflamatorie modestă. Fibroza a fost prezentă doar în spațiile porte.

156

Conform scorului Knodell avem următoarele modificări:

I.B. ușoară piecemeal necrosis (scor 1);

II.B. degenerare intralobulară ușoară și/sau rare focare de necroză hepatocelulară

1/3 din lobuli (scor 1);

– III.A sau B. inflamație portală absentă sau ușoară în 1/3 din spațiile porte (scor 0-1);

IV. A sau B fibroză absentă sau expansiune fibroasă portală (scor 0-1).

Rezultă că modificările hepatice întâlnite în cele 60 cazuri de hepatită cronică minimal activă au avut scorul Knodell cuprins între 2 și 4.

Modificările hepatice întâlnite pe cele 8 biopsii hepatice conform scorului

METAVIR au fost următoarele:

A1 – activitate necrotico-inflamatorie absentă sau ușoară (cel puțin un focar necrotico-inflamator pe lobul, piecemeal necrosis absentă sau ca alterare focală a plăcii periportale, inflamație doar în unele spații porte, steatoza 10% din hepatocite) ;

F0 sau F1 sau F2 – fibroză absentă sau portală fără septuri sau portală cu rare septuri.

Figura nr. 8 Hepatită cronică minimal activă, infiltrat inflamator redus sinusoide dilatate și steatoză ușoară col HEx10

157

Figura nr. 9 Hepatita cronică minimal activă, infiltrat inflamator redus în spațiu port (A1), fibroză în septuri (F2)

VII.5.2 HEPATITA CRONICĂ UȘOR ACTIVĂ

A fost prezentă în 173 de cazuri (41.10%), din care 126 au fost de sex feminin.

Vârstele extreme au fost reprezentate de 2 bărbați de 20 de ani și respectiv 45 de ani.

Microscopic

Indexul Activității Histologice (HAI) sau scorul Knodell a fost de 4-6, scorul

METAVIR A1 sau 2 F1 sau 2.

Cazurile s-au caracterizat histopatologic prin infiltrat limfoplasmocitar în spațiile porte și periportal sau intralobular, cu eroziunea plăcii limitante a hepatocitelor periportale, cu distrugerea hepatocitelor situate la interfața dintre infiltratul inflamator și parenchimul hepatic. Inflamația și necroza de interfață au afectat mai puțin de 25% din circumferința unora sau tuturor spațiilor porte, iar necroza și inflamația lobulară au fost parcelare, interesând mai puțin de 1/3 din lobul .

Modificările după scorul Knodell constatate la 97 din cazuri au fost următoarele:

I.B. ușoară piecemeal necrosis (scor 1);

– II.B degenerare intralobulară și necroză focală ușoară 1/3 din lobuli (scor 1);

– III.B sau C. inflamație portală ușoară 1/3 din spațiile porte sau moderată 1/3-2/3

din spațiile porte (scor 1 sau 3);

158

IV. B. fibroză portală (scor 1).

Rezultă că modificările hepatice întâlnite în cele 97 cazuri de hepatită cronică ușor activă au avut scorul Knodell cuprins între 4 și 6.

Figura nr. 10 Hepatita cronica ușor activa cu infiltrat inflamator intralobular și steatoză marcată col HE ob X20

Scorul METAVIR a fost cuprins între A1 sau 2 F1 sau 2 și constatat la 76 din cazuri, fiind caracterizat prin următoarele modificări hepatice:

A1 sau A2 – un focar necrotico-inflamator sau mai multe pe lobul sau necroză confluentă sau în punte, piecemeal necrosis absentă sau ca alterare focală ori difuză a plăcii periportale în unele spații porte;

F1 sau F2 – fibroză portală fără/cu rare septuri.

159

Figura nr. 11 Hepatită cronică ușor activă dilatarea focală a sinusoidelor,col HE 40x.

VII.5.3 HEPATITA CRONICĂ MODERAT ACTIVĂ

A fost prezentă în 138 de cazuri, reprezentând 32.80% din cele 421 de biopsii hepatice. Sexul feminin a dominat cu 76 de cazuri, bolnavii având vârste cuprinse între 31 și 58 de ani.

Microscopic

Hepatita cronică moderat activă s-a caracterizat prin inflamație densă portală și periportală și piecemeal necrosis extensivă, interesând 50% din circumferința aproape tuturor spațiilor porte, rămânând în ariile periportale, iar necroza și inflamația lobulară a fost semnificativă, cu afectarea 1/3-2/3 din lobul

Scorul Knodell a fost între 8 și 12, scorul METAVIR a fost A2 sau 3 F2 sau 3. Modificările histologice prezente în hepatita cronică moderat activă au avut scorul

Knodell cuprins între 8 și 12 la 50 de pacienți și au fost următoarele:

I.C. moderată piecemeal necrosis 50% din circumferința majorității spațiilor porte (scor 3);

II.C. degenerare intralobulară și necroză focală moderată, afectând 1/3-2/3 din lobuli (scor 3);

160

– III.B sau C. Inflamație portală ușoară ( 1/3 din spațiile porte) sau moderată (1/3-2/3 din spațiile porte) (scor 1 sau 3);

IV.B sau C. Fibroză portală, C – fibroză în punți porto-portale sau porto-centrale

(scor 1 sau 3).

Scorul METAVIR a fost de A2 sau 3 F2 sau 3, constatat la 88 și a prezentat următoarele modificări histologice:

A2 sau3 – piecemeal necrosis în jurul tuturor spațiilor porte mai multe focare necrotico-inflamatorii sau alterare difuză a plăcii periportale în toate spațiile porte;

F2 sau 3 – fibroză portală cu rare septuri sau numeroase septuri.

grading 3 – inflamație limfocitară/piecemeal necrosis moderată, cu afectarea 50% din circumferința tuturor spațiilor porte, iar necroza și inflamația hepatocelulară este semnificativă cu interesarea 1/3-2/3 din lobul;

staging 2 sau 3 – fibroză periportală, rareori porto-portală.

Figura nr. 12 Hepatită cronică moderat activă, infiltrat inflamator nodular în spațiul port, modificări ale epiteliului biliar col HEx10

Un caz de hepatită cronică moderat activă a prezentat asociat și hepatocarcinom; este vorba de un bărbat, în vârstă de 51 ani.

161

Microscopic

La nivelul parenchimului hepatic se observă infiltrat limfocitar moderat la nivelul spațiului port și fibroză portală. Intralobular este prezent infiltratul inflamator moderat. Scorul Knodell a fost de 7, scorul METAVIR A2F2.

Alături de modificările din hepatita cronică moderat activă, la nivelul parenchimului hepatic s-au observat zone cu celule predominant rotunde, uni- sau multinucleate, cu tahicromazie nucleo-citoplasmatică, alături de zone de necroză și zone de fibroză

Figura nr. 13 Hepatită cronică moderat activă (A2) fibroză portală septală și în punți (porto-centrala)(F3) col van Gieson x20

VII.5.4 HEPATITA CRONICĂ SEVER ACTIVĂ

A fost prezentă în 36 cazuri, reprezentând 8.60% din totalul celor 421de puncții biopsii hepatice. Repartiția pe sexe a evidențiat o ușoară preponderență la sexul feminin, reprezentat de 21 cazuri. Vârstele extreme au fost de 44 și 64 ani.

Microscopic

Cazurile s-au caracterizat prin piecemeal necrosis în aproape toată circumferința periportală și de-a lungul septurilor fibroase. Necroza confluentă în punți (bridging necrosis) a

162

fost mascată de septurile fibroase porto-portale. Septurile pasive sunt rezultatul colapsului datorat necrozei confluente și coexistă cu septurile active. Alterarea lobulară a interesat peste 2/3 din lobuli. Un caz a prezentat și zone de ciroză incipientă .

Scorul Knodell a fost între 15 și 18, scorul METAVIR a fost A3 F3 sau 4

Modificările histologice prezente în hepatita cronică sever activă au avut scorul

Knodell cuprins între 15 și 18 și au fost următoarele:

– I.D, sau E sau F. marcată piecemeal necrosis 50% din circumferința majorității

spațiilor porte, E –moderată piecemeal necrosis + necroză în punți, F marcată

piecemeal necrosis + necroză în punți (scor 4, 5, 6);

– II.D. degenerare intralobulară și necroză focală marcată, afectând 2/3 din lobuli

(scor 4);

III.D. Inflamație portală marcată (arii dense cu celule inflamatorii în 2/3 din spațiile porte) (scor 4);

IV.C sau D. Fibroză în punți porto-portale sau porto-centrale, D – ciroză (scor 3

sau 4).

Scorul METAVIR a fost de A3 F3 sau 4 și a prezentat următoarele modificări

histologice:

A3 – piecemeal necrosis în jurul tuturor spațiilor porte și mai multe focare necrotico-inflamatorii sau alterare difuză a plăcii periportale în toate spațiile porte;

F3 sau 4 – numeroase septuri +/- ciroză.

163

Figura nr. 14 Hepatită cronică sever activă, infiltrat inflamator abundent în spațiul port și în septuri, piece- meal necrosis, steatoză ușoară sinusoide dilatate Col HE x10

Figura nr. 15 Ciroză hepatică incompletă, distorsionarea arhitecturii hepatice cu formare de noduli incompleți, steatoză marcată colHEX4

164

Microscopic

La nivelul parenchimului hepatic se remarcă fibroză și inflamație densă, în toate spațiile porte, cu prinderea în totalitate a acestora, cu distorsionarea arhitecturii de organ; intralobular, degenerescența granulo-vacuolară este semnificativă, interesând peste 2/3 din lobul. Capilarele sinusoide sunt dilatate difuz în aria centro-lobulară și periportală și cu conținut limfocitar. În câteva zone este prezentă fibroza în punți cu schițare de noduli de regenerare.

VII.6. ASPECTE HISTOPATOLOGICE ȘI IMUNOHISTOCHIMICE PARTICULARE ÎN HEPATITA CRONICĂ B ȘI C

VII.6.1. HEPATITA CRONICĂ VIRALĂ B

Hepatita cronică virală B a fost cel mai bine studiată din punct de vedere imunohistologic, determinându-se prezența antigenului HBc, HBs, delta la nivelul nucleului și citoplasmei hepatocitelor. Din cei 307 de pacienți incluși în studiu, doar la 211 pacienți s-a urmărit prin biopsie hepatică gradul de fibroză și activitatea necrotico-inflamatorie, studiile imunohistochimice efectuându-se doar la 50 de pacienți.

Microscopic

Aspectul histopatologic particular al hepatitei cronice B îl dă prezența hepatocitelor „în sticlă mată‖, aspect ușor evidențiabil pe colorațiile uzuale HE, în care prezența intracitoplasmatică sau membranară a AgHBs poate fi demonstrată prin colorații imunohistochimice. Numărul acestor celule este invers proporțional cu gradul activității necrotico-inflamatorii.

165

Figura nr. 16 Hepatita cronică virală B- hepatocite cu citoplasma în sticlă mată col HE X20

Infecția cu virusul hepatic B determină la nivelul parenchimului hepatic inflamație intensă, care în timp are caracter fluctuant.

Nu se remarcă o corelație semnificativă între gradul activității necrotico-inflamatorii și stadiul fibrozei; acest lucru se datorează fluctuației bolii și influenței altor factori: stadiul viremic, alcoolul, tratament.

Aceste aspecte histopatologice sunt sugestive pentru hepatita cronică cu virus B, dar, diagnosticul definitiv necesită confirmare serologică.

Antigenul HBs (de înveliș, porțiunea externă) – (AgHBs) în hepatocitele umane are două pattern-uri de expresie și implicații biologice diferite:

AgHBs membranar (AgHBs-m) asociat membranei celulare și conferind hepatocitelor aspectul de fagure de miere. Prezența AgHBs-m în hepatocite este strâns legată de prezența AgHBc, fiind astfel marker al replicării virale;

AgHBs intracitoplasmatic (AgHBs-cit) demonstrat imunohistochimic, a fost observat în grade diferite, de la slaba prezență perinucleară, la răspândirea largă în citoplasmă, localizarea fiind focală, submembranară sau difuză.

166

Antigenul HBc (core= miez, porțiune internă) – (AgHBc) este localizat într-o mai mare măsura în nucleul hepatocitului și în mai mică măsură în citoplasmă și/sau la nivelul membranei hepatocitare. Se corelează cu ADN-ul viral prezent în ser, ADN-polimeraza, particulele complexe Dane. Prezența AgHBc în hepatocite reflectă o replicare virală activă.

Figura nr. 17 Hepatită cronică virală B-Ag HBc ( IHC) obx10

Figura nr. 18 Hepatita cronică virală B- Ag HBc (IHC)x20

167

În ceea ce privește evoluția, mai mulți factori pot influența gradul și extensia necrozei hepatocitare, inflamației și fibrozei, în hepatita cronică cu virus B, cei mai importanți fiind:

gradul și extensia reacțiilor imunologice;

gradul și extensia integrării virale;

coinfecția sau suprainfecția cu alte virusuri (virusul C, A).

Infiltratul celular inflamator a fost alcătuit predominant din limfocite la care s-au adăugat rare plasmocite, histiocite și mai rar infiltrat limfo-granulocitar fiind localizat cel mai frecvent în spațiile porte și intralobular, dispus în focare mici, adeseori în jurul unor hepatocite alterate sau sub forma unor șiraguri intra sinusoidale. In spațiile porte, limfocitele au format uneori agregate limfoide.

Infiltrarea spațiilor porte cu celule inflamatorii fără depășirea limitantei lobulare (limita parenchim – mezenchim) constituie așa zisa portită cronică regulată, caracteristică hepatitei cronice persistente din vechea clasificare. [184, 185]

Infiltratul inflamator limfocitar a prezentat limfocite cu un raport CD4/CD8 scăzut și un procentaj foarte mare de celule NK (CD 56 +). Efectul citotoxic al celulelor NK și citotoxice este mediat de eliberarea a numeroase citokine, incluzând interferonul, TNF și ligantul Fas.[65]

Alterarea izolată a unor hepatocite a variat de la forme ușoare de degenerare balonizată, la necroza acidofilă și formarea corpilor Councilman.

În lotul de pacienți cu hepatită cronică virală B s-au constatat hepatocite dispersate, cu citoplasmă integral sau parțial înlocuită de un aspect granular uniform, aspect cunoscut ca „sticlă mată‖ (ground glass). Acest aspect este datorat dilatării reticulului endoplasmatic prin acumulare de anvelope virale Ag HBs. Pe colorația HE, apar cu o citoplasma foarte fin granulară, palid eozinofilă, mărginită adeseori de un halou periferic. Hepatocitele "sticlă mată" pot fi mai bine evidențiate prin colorația cu orceină (Shikata).

168

VII.6.2 HEPATITA CRONICĂ VIRALĂ C

Aspectul histopatologic particular al hepatitei cronice C constă în prezența de leziuni ale canaliculelor biliare, leziuni intralobulare de tipul steatozei, infiltrat limfocitar intrasinusoidal, infiltrate limfoide cu centri germinativi în spațiul port, în vecinătatea canaliculelor biliare, macrofage și corpi acidofili, inconstant corpii hialini Mallory.[183,185]

Deși aceste trăsături sunt sugestive pentru hepatita cronică cu virus C, ele nu sunt patognomonice pentru hepatita cronică cu virus C, diagnosticul definitiv necesitând confirmare serologică. În hepatita cronică cu virus C se întâlnesc mai frecvent activitate necrotico-inflamatoare ușoară sau moderată, spre deosebire de hepatita cronică cu virus B, în care inflamația este mai intensă și, urmărită în timp, mai fluctuantă.[181]

Alterarea canaliculelor biliare este de asemenea considerată de majoritatea autorilor ca având o frecvență și o amploare semnificativă în hepatita cronică cu virus C comparativ cu celelalte tipuri de hepatite. Această alterare se concretizează prin vacuolizarea și stratificarea celulelor epiteliului biliar, picnoza nucleilor, pierderea polarității celulare și prezența în jurul ductelor biliare a unui infiltrat inflamator limfocitar. Acestor leziuni li se impută asocierea cu o mai rapidă evoluție spre ciroză.[185]

Infecția cu virusul hepatic C determină la nivelul parenchimului hepatic, activitate necrotico-inflamatorie ușoară sau moderată.

La pacienții cu hepatită cronică periportale (piecemeal necrosis) moderate

cu virus C s-au întâlnit mai frecvent leziuni și chiar leziuni discrete.

169

Figura nr. 19 HCV- infiltrat inflamator portal, fibroză în spațiul port, col HE, ob x10

Nu s-a observat o legătură directă, proporțională între gradul activității necrotico-inflamatorii și stadiul fibrozei. Acest lucru se poate explica prin activitatea fluctuantă a bolii; boala este puțin simptomatică și poate fi diagnosticată tardiv, cu fibroză avansată.

Pe biopsiile selecționate a fost studiată activitatea, fibroza, steatoza, interacțiunea dintre fibroza și alte modificări.

Inflamația portală a fost întâlnită în toate cazurile, activitatea lobulară în 72% din cazuri, hepatita de interfață în 93% din cazuri, steatoza asociată a fost întâlnită în 67 % din cazuri, din care ușoară în 42 de cazuri, moderată la 36 de cazuri și severă 18 cazuri. S-a constatat că nu există o legătură directa între steatoză, necroză și fibroză .

170

Figura nr. 20 Agregat limfocitar nodular în spațiul port la pacient cu HCV(col HE, Obx10)

Exista însă o legătură indirectă între inflamația lobulară, piecemeal-necrosis și fibroză.

Prezența infiltratului inflamator în spațiul port este legată de modificările de tip biliar.

Se crede că necroza de interfață, activitatea lobulară (necroza sau apoptoza ) ar avea un rol important în evoluția spre ciroză.[185, 186]

La bolnavii infectați cu virusul hepatic C au fost efectuate studii ale răspunsului imunologic al limfocitelor T, comparându-se diferențiat CD4 și CD8.

Răspunsul imun celular la pacienții cu hepatita cronică virală C depinde activitatea citotoxică a limfocitelor Tc. Mecanismul persistenței virale și patogenia sunt incomplet cunoscute.[64,187]

171

VII.7. STUDII IMUNOHISTOCHIMICE

Din cei 421 pacienți diagnosticați cu hepatite cronice virale, care au efectuat biopsie hepatică, la 100 de pacienți (2.37%) s-au efectuat studii imunohistochimice (40 de pacienți cu monoinfecție virală B, 10 pacienți cu infecție virala B+D și 50 de pacienți cu infecție virală C). Toți pacienții incluși în studiu, cu HCV erau cu anticorpi anti HCV prezenți și cu ARN viral detectabil. Pacienții cu HBV incluși în studiu au avut ADN viral cu valori medii de 9,39×105 copii/ml

La aceștia s-a urmărit vârsta, sexul, nivelul seric al AST, ALT, gradul de fibroză și stadiul activității necrotico-inflamatorii, prezența infiltratului inflamator bogat în limfocite T/B, markeri UCHL1, CD20, CD4, CD8, CD68 și TGF-β.

Tabel nr. 39 Tipuri de anticorpi studiați

Studiul s-a concentrat pe detectarea la nivelul spațiilor portale și periportale hepatice a limfocitelor T CD4/CD8.

Caracteristicile clinice, biochimice și histopatologice sunt redate în tabelul următor.

172

Tabel nr. 40 Caracteristicile lotului inclus în studiu imunohistochimic

Infiltratul inflamator a fost + la 27 din cazuri, ++ la 45 din cazuri și +++ la 28 din cazuri fiind alcătuit din elemente celulare specific virale, precum și celule nespecifice, aparținând

173

sistemului imun, fiind bogat în limfocite T și mai puțin frecvent limfocite B, constatându-se într-un procent mai mic prezența altor celule (macrofage, celule dendritice). Infiltratul cu limfocite B a fost + în 15 cazuri, ++ în 11 cazuri și +++ în 4 cazuri, pe când limfocitele T au

Majoritatea pacienților cu activitatea necrotico-inflamatorie moderată sau severă incluși în studiu, au avut infiltrat inflamator ++ și +++. Studiul imunohistochimic a evidențiat un infiltrat inflamator intrahepatic bogat în limfocite T, în special CD4+ și CD8+, ceea ce

sugerează implicarea sistemului imun în patogenia afectării hepatice.

Grafic nr. 45 Repartiția infiltratului inflamator T CD4+/CD8+ la pacienții cu hepatite cronice virale

174

Figura nr. 21 HCV infiltrat cu limfocite T- CD4 , Obx10 (col IHC-CLA)

Pacienții cu activitatea necrotico-inflamatorie moderată/ severă au avut infiltrat inflamator predominant CD4+, astfel încât s-ar putea considera că limfocitele CD4+ ar putea juca un rol important în activitatea necrotico-inflamatorie hepatică. Infiltratul inflamator CD4+ a fost predominat de tip Th1. Prezența infiltratului inflamator CD4+ a fost constatat mai frecvent la pacienții cu viremie înaltă, valori crescute ale transaminazelor, scăderea complementului seric (7 pacienți cu HBV și 15 pacienți cu HCV).

Nu s-a găsit nici o relație semnificativă între prezența acestora și sexul sau vârsta pacienților, posibil și datorită numărului mic de pacienți incluși în studiu.

Majoritatea pacienților cu infiltrat bogat în limfocite CD8+ au prezentat nivel seric crescut al AST și GGT, iar pacienții cu infiltrat inflamator bogat în limfocite CD4+ au prezentat nivel seric crescut al AST, ALT și GGT, precum și activitate necrotico-inflamatorie moderată/severă.

175

Tabel nr. 42 Caracteristicile loturilor în funcție de prezența limfocitelor CD4+ și CD8+

Prezența infiltratului inflamator de tip CD8+ a fost constatat mai frecvent la pacienții cu activitate necrotico-inflamatorie ușoară/minimă (p<0,005) și la pacienții cu nivel scăzut al viremiei.

Figura nr. 22 HCV infiltrat inflamator limfoplasmocitar cu limfocite T- CD8, ObX20 (col IHC)

176

Studiile imunohistochimice au evidențiat prezența limfocitelor CD4+ mai frecvent decât limfocitele CD8+, la nivelul spațiilor portale și periportale, susținând ipotezele publicate în literatura de specialitate, conform cărora limfocitele T joacă rol important în patogenia afectării hepatice. Limfocitele T sunt implicate și prin secreția de citokine, însă studiul prezent nu a urmărit și eventualele corelații ale acestora.

Studiul prezent a evidențiat o importantă corelație între prezența limfocitelor CD4/CD8 și gradul activității necrotico-inflamatorii.

Prin studiile imunohistochimice efectuate s-au evidențiat și alți markeri: CD20, CD45, limfocite NK.

CD20 (L26) -Celulele CD20+ au fost observate în special în spațiile portale la 2 pacienți diagnosticați cu infecție cronică virală C care prezentau asociat limfom și care au efectuat biopsie hepatică.

Figura nr. 23 HCV-Infiltrat inflamator cu limfocite B ( col IHC)- CD 20 pozitivă în limfocitele B

177

Figura nr. 24 HCV infiltrat inflamator sărac în limfocite B -CD20 +, (col IHC) Obx20

S-au evidențiat deasemenea la pacienții cu HCV markeri CD45 și prezența limfocitelor NK1. CD45Ro (UCHL1) recunoaște o variantă a LCA limitată la celulele T. El marchează celulele T, granulocitele și o parte din histiocite. Uneori pot exista probleme datorita prezenței fondului.

Figura nr. 25 HCV infiltrat inflamator moderat CD45 pozitiv – Col IHC, Obx20

178

Figura nr. 26 HCV-infiltrat cu limfocite T-CD45RO (col IHC -UCHL1), Obx20

Limfocitele NK1 joacă un rol important în evoluția hepatitelor cronice spre un hepatocarcinom, activitatea este inhibată de IL6 printr-un mecanism care nu este încă bine descifrat.[81]

NK1 este un antagonist al HGF (hepatocyte growth factor ) care are proprietăți mitogene și morfogene cu rol în inducerea hepatocarcinomului. [26]

Figura nr. 27 HCV -infiltrat inflamator limfoplasmocitar, T-NK1 +(col IHC), Obx20

179

CAPITOLUL VIII

DISCUȚIA REZULTATELOR

Studiul a fost efectuat pe un lot de 637 de pacienți diagnosticați cu hepatită cronică virală B (237 pacienți), B+D (70 de pacienți ) și C (330 de pacienți), cu vârsta medie 39,66±10,04 ani în lotul de pacienți cu VHB și de 49,61 ± 8,37 ani la pacienții cu HCV, constatându-se o prevalență mai mare la sexul feminin (n=403/637).

Majoritatea pacienților incluși în studiu au prezentat simptome nespecifice, sindromul asteniform fiind constatat cel mai frecvent, în timp ce 26.06% (n=86/330) din pacienții cu HCV și 31.59% (n=97/307) au fost asimptomatici, diagnosticarea hepatitei cronice virale făcându-se cu ajutorul investigațiilor paraclinice.

La pacienții incluși în studiu, s-au constatat și alte comorbidități asociate, cel mai frecvent fiind cele cardio-vasculare, însă dintre afecțiunile cu mecanism imunologic intricat cu cel al hepatitei cronice virale, am constatat prezența poliartritei reumatoide, a lupusului eritematos sistemic și al sindromului Sjogren.

Majoritatea pacienților cu hepatite cronice virale au prezentat ficat cu marginea inferioară la rebord și splină nepalpabilă. Hepato-splenomegalia importantă s-a constatat la pacienții cu neoplazii sau limfoame asociate.

MODIFICĂRI BIOCHIMICE

Analizând valorile hemoleucogramei, am constatat că anemia a fost moderată, normocromă, normocitară, asociată altor afecțiuni clinice. Valorile trombocitelor au fost predominant normale, în ambele loturi de studiu, trombocitopenia sub 150000/mm3 fiind mai frecvent constatată la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu VHB.

Nivelul seric al acestora s-a corelat mai frecvent cu gradul de fibroză comparativ cu activitatea necrotico-inflamatorie, în special la pacienții cu HCV, astfel că nivelul seric al trombocitelor poate fi considerat un factor predictiv al gradului de fibroză, mai ales la pacienții cu HCV. Trombocitopenia este o complicație a hepatitelor cronice, dar mecanismele patologice sunt incomplet cunoscute.

Scăderea numărului de trombocite, care nu este secundară hipersplenismului, poate fi un semn precoce al afectării hepatice severe.

În studiul efectuat, am observat la pacienții diagnosticați cu hepatită cronică virală că

180

nivelul seric al transaminazelor era crescut la majoritatea pacienților, cu valori medii ALT-120,71±61,88 UI/L și AST-95,80±41,39 UI/L, pentru pacienții cu VHB, respectiv ALT-98,20±58,41 UI/L, AST-90,99±60,37UI/L, diferențele fiind nesemnificative între cele două grupuri, deși valorile medii ale ALT și AST au fost peste valorile normale la ambele grupuri.

Valorile serice crescute ale transaminazelor au fost mai frecvent întâlnite la pacienții cu HBV comparativ cu cei cu HCV. Acest lucru se datorează și faptului că pacienții diagnosticați cu VHB internați în clinică, erau candidați pentru inițierea tratamentului antiviral. Nivelul seric al transaminazelor s-a corelat cu gradul de fibroză (p<0,001) și cu activitatea necrotico-inflamatorie, mai ales la pacienții cu HCV (p=0.02) comparativ cu cei cu VHB (p=0.04).

Valorile medii ale acestora au fost mai mari la pacienții cu asocieri de manifestări extrahepatice (r=0,07, p=0,17).

Pacienții cu valori persistent normale ale ALT par să aibă un grad de inflamație și fibroză hepatică mai reduse decât cei cu valori crescute, însă în ciuda acestor date, pacienții cu valori normale ale ALT pot avea proces inflamator hepatic sever sau chiar ciroză hepatică. Este un fenomen greu de înțeles, de ce unii pacienți cu valori normale ale transaminazelor au grad înalt de fibroză. Nivelul seric al ALT pare să fie corelat cu nivelul citopatic al viremiei și cu mecanismele imunologice. Unele studii susțin că răspunsul imun celular la pacienții cu ALT normal este mai redus comparativ cu cei cu valori crescute ale ALT. (186)

Studiile publicate [102, 103] au evidențiat că majoritatea pacienților cu valori normale ale transaminazelor, evaluați morfologic, prezintă leziuni minime sau ușoare și mai rar leziuni severe de hepatită sau ciroză, precum și o rată redusă a proliferării hepatocitare și a apoptozei.

Unele studii au ajuns la concluzia că valorile transaminazelor s-ar corela cu activitatea necro-inflamatorie (studiul Gordon, Mathurin) și gradul de fibroză, în timp ce alte studii susțin că nu există o corelație exactă între valorile serice ale acestora și activitatea necroinflamatorie sau gradul de fibroză. Studiile efectuate de Zechini au sugerat că nivelul seric al ALT și mai ales al AST se corelează cu gradul de afectare hepatică, în timp ce studiile efectuate de Puoti au arătat că nu există nici o corelație între nivelul seric al transaminazelor și gradul de fibroză hepatică. [193,194]

Rezultatele studiilor publicate în literatură, sunt discordante, de aceea pentru stabilirea exactă a gradului de fibroză, în prezent este indicată efectuarea biopsiei hepatice.

181

La toți pacienții s-a calculat indicele RITIS care constă în raportul AST/ALT, constatând că majoritatea pacienților cu HVC și HVB au prezentat valori sub 1.2 ale acestui indice. Vârsta, sexul, durata afecțiunii nu au avut influență asupra indicilor de citoliză, apreciați în acest studiu. Valorile <1,2 ale raportului RITIS, s-au asociat cu gradul de afectare hepatică, în special la pacienții cu HCV.

Indicele APRI s-a urmărit la toți pacienții, constatând că, la pacienții cu HCV acesta e mai fidel corelat cu gradul de fibroză sau activitatea necro-inflamatorie, comparativ cu pacienții cu VHB.

Indicele APRI poate fi considerat ca un factor predictiv pentru fibroză, mai ales la pacienții cu HCV.[87]

Pentru pacienții cu hepatită cronică virală, indicii colestatici cresc la 12-15% din pacienții cu hepatite cronice virale. Dintre indicii de colestază, cei mai sensibili pentru reactivarea virusului hepatic sunt fosfataza alcalină și GGT.

MODIFICĂRI IMUNOLOGICE

Teoriile recente privind mecanismele imunopatogenice prin care virusul ar determina activarea sistemului imun, sunt bazate pe 3 ipoteze: modificarea autoantigenică, modificarea mecanismelor imunologice ale gazdei și mimetismul molecular [188].

Analiza profilului imunologic a evidențiat că atât pacienții cu HCV cât și cei cu VHB, pot prezenta modificări imunologice, responsabile adesea de prezența unor manifestări extrahepatice, care ridică probleme de abordare diagnostică și terapeutică a pacienților.

La pacienții incluși în studiu s-au determinat nivelul seric al globulinelor și imunoglobulinelor, factorul reumatoid, C3, ANA, anticorpii antitiroidieni, AMA, ASMA, anti-LKM1, prin tehnici standard de laborator.

Majoritatea pacienților au prezentat nivel seric al imunoglobulinelor și al γ– globulinelor normal.

Valoarea medie a nivelului seric al γ-globulinelor a fost de 17,65±3,35% pentru lotul de pacienți cu VHB ușor mai scăzute comparativ cu cele din lotul de pacienți cu HCV- 18,24

182

±3,70%, diferențele fiind nesemnificative. Valori serice crescute au fost constatate mai frecvent la pacienții cu HCV comparativ cu VHB (13.40%-VHB vs 16.06%-HCV ), fiind asociate cu fibroza hepatică gradul 3 și 4 (p=0.005) și activitatea necro-inflamatorie moderată/severă (p=0.34).

Studiul evidențiază o corelație între nivelul seric al γ–globulinelor și gradul de afectare hepatică, acestea putând fi interpretate ca un factor de prognostic important.

Celulele hepatice stelate sunt capabile să își activeze funcția fibrotică participând la leziunea hepatică. Acestea prezintă la suprafața lor receptori pentru imunoglobulinele G, care le stimulează diferențierea și proliferarea.[189]

Nivelul imunoglobulinelor reflectă gradul de afectare hepatică, astfel că am urmărit valorile acestora în raport cu nivelul seric al transaminazelor și rezultatele biopsiei hepatice.

Nivelul seric al IgG a fost crescut mai frecvent la pacienții cu HCV ( VHB -15.63% vs 20.60%-HCV), majoritatea acestora prezentând în ser nivel crescut al transaminazelor, grad de fibroză 3 și 4 (p=0.004) și activitate necro-inflamatorie moderată/severă (p=0.024)

Nivelul seric al IgA a fost detectat la mai puțini pacienți, fără a exista o corelație între acestea și nivelul seric al transaminazelor sau gradul de fibroză hepatică. IgA secretorie este o imunoglobulină care se găsește predominant în bilă. Creșterea ei în ser poate apare în afectările canaliculelor biliare, a spațiilor Disse și a spațiilor portale.

Un număr redus de pacienți au avut valori normale ale IgA, majoritatea pacienților cu IgA crescute prezentând în ambele loturi de pacienți, nivel crescut al transaminazelor, iar prezența acestora nu s-a asociat cu gradul de fibroză sau activitatea necrotico-inflamatorie.

În studiul prezent, prezența autoanticorpilor a fost constatată la un procent mai redus comparativ cu datele publicate în literatura de specialitate. Astfel că studiul publicat de Wu Chi-hong în China, 2006-Feb pe un lot de 69 de pacienți cu VHB și 69 pacienți cu HCV a evidențiat prezența acestora la 4,3% respectiv 29% [196]. Eman Sh. Al-Obeidy publică în IJGE Issue 6 Vol 1 2006, un studiu efectuat pe 50 pacienți cu HCV, constatând frecvența mai mare a ANA -80%, [197].

Deși numărul pacienților cu autoanticorpi care au efectuat biopsie hepatică este mic, s-a constatat că prezența acestora s-a asociat mai frecvent cu o evoluție mai severă a hepatitei cronice, cu grad de activitate necrotico-inflamatorie mai mare și grad înalt de fibroză.

183

Urmărind în acest studiu factorul reumatoid, am observat că acesta a fost constatat la 5,86% din pacienții cu HBV și la 14,84% din pacienții cu HCV, fiind mai frecvent la sexul feminin cu vârsta peste 45 ani, asociindu-se clinic cu artralgii, artrite, fenomene Raynaud, mialgii, purpură vasculară. Un număr redus de pacienți din ambele loturi a fost diagnosticat cu poliartrită reumatoidă pe baza criteriilor ARA sau crioglobulinemie. Adesea, factorul reumatoid prezent la pacienții cu hepatite cronice virale, asociat cu prezența clinică a artralgiilor la nivelul articulațiilor mici ale membrelor, poate fi interpretat greșit ca poliartrită reumatoidă. În studiul prezent, un număr redus de pacienți cu factor reumatoid au fost diagnosticați cu poliartrită reumatoidă, diagnosticul pozitiv fiind susținut pe baza criteriilor ARA. Acești pacienți au fost investigați suplimentar în clinicile de reumatologie, pentru stabilirea exactă a diagnosticului și a conduitei terapeutice. Ceilalți pacienți, cu simptomatologie asemănătoare, dar la care s-a exclus diagnosticul de poliartrită reumatoidă, au fost interpretați ca sindrom reumatoid în cadrul hepatitei cronice virale. Pacienții cu factor reumatoid prezent au avut nivel crescut al transaminazelor, mai ales al ALT, și nivel crescut al GGT, asociind mai frecvent gradul 3 de fibroză și activitate necro-inflamatorie moderată .

Se presupune că activarea complementului la pacienții cu HCV ar avea rol în producerea leziunilor hepatice, și ar fi util în monitorizarea răspunsului la tratamentul cu interferon.[89]

Majoritatea pacienților incluși în studiu au avut valori normale sau ușor scăzute ale nivelului seric al C3. Valorile medii ale C3 au fost mai scăzute la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu VHB. Nivelul seric al complementului poate fi influențat la pacienții cu hepatite cronice, de mecanismele imunologice implicate în patogenia bolii. Deși la pacienții cu afectare hepatică severă, un procent redus dintre aceștia au avut nivelul seric al complementului redus, acesta nu s-a corelat direct nici cu nivelul seric al transaminazelor, nici cu gradul de fibroză. Procentul pacienților cu C3 scăzut a fost mai mare la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu VHB, acest lucru putând fi influențat și de mecanismele imunologice constatate mai frecvent la cei cu HCV.

Prevalența complexelor imune circulante a fost mai mare la pacienții cu HCV comparativ cu cei cu HBV, însă rolul acestora este destul de controversat în patogenia bolii.

În studiul prezent, complexele imune circulante s-au asociat cu prezența manifestărilor extrahepatice la 47,2% pacienți cu HCV și la 28,5% pacienți cu HBV – RR=1,12, OR=1,18.

184

Majoritatea pacienților cu hepatite cronice virale și CIC prezente au avut valori predominant crescute ale transaminazelor.

Numeroase studii au arătat că prevalența acestora nu diferă la pacienții sănătoși comparativ cu cei cu afectare hepatică ușoară, însă poate fi crescută la pacienții cu hepatite cronice virale severe sau la cei cu ciroză hepatică.

Relația dintre CIC și răspunsul imun celular, cu implicarea limfocitelor T și B, poate determina o activare defectuoasă a limfocitelor B, cu apariția autoanticorpilor și hipergamaglobulinemie.

Prezența CIC pare a fi rezultatul implicării limfocitelor T supresoare, dar mecanismul exact este încă necunoscut [190, 191].

MANIFESTĂRILE EXTRAHEPATICE PREZENTE ÎN LOTUL DE STUDIU

Un studiu publicat în decembrie 2007 în Jurnalul internațional de Gastroenterologie, de către Tchernev și Petrova susține că prezența manifestărilor extrahepatice la pacienții cu hepatite cronice virale poate fi întâlnită la 76.5% din pacienți, cel mai frecvent întâlnite fiind astenia fizică, artralgiile, manifestările renale, purpura vasculară [83]. Prevalența manifestărilor extrahepatice la pacienții cu hepatite cronice virale a constituit baza mai multor studii.

Tabel nr. 43 Studii privind prevalența manifestărilor extrahepatice la pacienții cu HCV

185

Infecția virală B se asociază mai puțin frecvent cu prezența manifestărilor extrahepatice, acest lucru fiind susținut și de datele recente publicate în literatura de specialitate.

Tabel nr. 44 Studii privind prevalența manifestărilor extrahepatice la pacienții cu VHB

Din cei 637 de pacienți incluși în studiu, 32,34% prezentau asociate manifestări extrahepatice, 24,40% de pacienți cu VHB și 39,7% de pacienți cu HCV. Prezența manifestărilor extrahepatice a fost mai frecventă la femei (122 femei, 84 bărbați)- RR = 0.6025, 95 % CI = 0.42 – 0.86 și la vârste peste 35 ani. Majoritatea pacienților cu hepatite cronice virale care au efectuat biopsia hepatică au prezentat activitate necrotico-inflamatorie ușoară/moderată și grad de fibroză F3 (p=0,09).

MANIFESTĂRILE RENALE

Infecția virală C sau B se poate asocia cu leziuni glomerulare, glomerulonefrita membranoasă, membrano-proliferativă putând fi idiopatică sau ca o componentă a sindromului crioglobulinemic. Mecanismele patogenice implicate nu sunt pe deplin cunoscute, însă se consideră ca la baza acestora stau complexele imune circulante ce conțin particule virale [45]

Afectarea renală a fost constatată atât la pacienții cu crioglobuline prezente (8 pacienți cu HCV) sau diabet zaharat (8 pacienți cu HCV și 6 pacienți cu HBV), cât și la pacienții fără alte afecțiuni asociate, fiind indusă prin mecanisme imunologice.

186

Prezența acesteia, înafara asocierii cu crioglobulinemia sau diabetul zaharat, a fost mai frecvent constatată la pacienții cu HCV (6,36%), comparativ cu pacienții cu VHB (2,6%), fiind mai frecvent de tipul glomerulonefrită cronică aceste rezultate încadrându-se în studiile publicate în literatură, unde prevalența afectării renale variază între 0,25 și 25% din pacienții cu hepatită cronică virală [45, 109, 117].

Afectarea renală din cadrul diabetului zaharat sau al crioglobulinemiei nu a fost atent investigată, atenția îndreptându-se spre pacienții cu semne de afectare renală fără asocierea clinică a unei alte afecțiuni care o poate induce.

Afectarea renală, în studiul prezent, s-a asociat mai frecvent cu sexul feminin, vârsta înaintată, majoritatea pacienților prezentând creșterea valorilor transaminazelor și grad înalt de afectare hepatică. Clinic, s-a manifestat cel mai frecvent prin proteinurie de tip nefritic/nefrotic și hematurie macroscopică. Sindromul de retenție azotată a fost constatat cu

frecvență mai redusă.

Limitele studiului au fost marcate de imposibilitatea de a efectua biopsia renală și eventualele corelații între rezultatele obținute și gradul de fibroză hepatică.

DIABETUL ZAHARAT

Studiile recente au evidențiat asocierea infecției cu VHC cu apariția diabetului zaharat tip II, aceasta asociere fiind mai frecventă la pacienții cu VHC decât la populația generală sau față de cei cu alte afecțiuni hepatice [136].

Virusul hepatic C (VHC) poate induce creșterea rezistenței la insulină, fără a se asocia cu gradul leziunilor hepatice , dar variind cu genotipul viral. Rezistența la insulină poate contribui la fibroză progresivă la pacienții cu acest virus. [137]

Studiile recente au evidențiat asocierea infecției virale cu apariția diabetului zaharat tip II, această asociere fiind mai frecventă la pacienții cu VHB decât la populația generală sau față de cei cu alte afecțiuni hepatice [106, 112]. Mai multe studii recente au demonstrat o asociere a acestuia sau a rezistenței la insulină cu progresia fibrozei la acești pacienți. [112].

187

Tabel nr. 45 Studii clinice publicate în literatură privind incidența diabetului zaharat la pacienții cu VHB

Andrew L. Maso1, Johnson Y. N. Lau, Hepatology, February 1999 12%

Studiul efectuat de Daad în 2002 pe 399 de pacienți a arătat că există o prevalență mai mare a diabetului zaharat tip II la pacienții cu HCV (21,2%) față de cei cu HBV (14%)[190]. Aceeași concluzie e susținută și de alte studii efectuate pe pacienții cu hepatite cornice virale B și C. [195]

În studiul prezent, diabetul zaharat a fost constatat la 31 din pacienții cu HBV-10,10% și la 40 din pacienții cu HCV-12,12% (RR =0.8331, 95 % CI = 0.5352 -1.2967), fiind asociat cu o incidență crescută la pacienții de sex masculin (26/40 pacienți respectiv 19/31 pacienți), cu vârsta medie 54,90 ±4,08 ani, la pacienții cu HCV și 40,45± 12,88 ani în lotul de pacienți cu HBV.

Diabetul zaharat s-a asociat cu nivel seric crescut al GGT-ului și mai puțin cu nivelul seric crescut al transaminazelor, cu gradul de fibroză sau activitatea necrotico-inflamatorie.

Tulburările metabolice au fost constatate mai frecvent la acești pacienți și par să se asocieze cu obezitatea și rezistența la insulină, influențând rata de răspuns la tratamentul antiviral. Acumularea de lipide la nivel hepatocitar este responsabilă de apariția steatozei hepatice severe, care la rândul ei se corelează cu gradul de fibroză. Steatoza hepatică la pacienții cu hepatită cronică virală, poate fi indusă de tulburările metabolice, de rezistența la insulină sau de infecția virală.

188

AFECTAREA TIROIDIANĂ

Afectarea tiroidiană este mai frecvent constatată la pacienții cu hepatite cronice virale, în urma tratamentului cu interferon. Studiul prezent a urmărit prevalența afectării tiroidiene la pacienți, înaintea inițierii tratamentului antiviral. Afectarea tiroidiană la pacienții cu HCV a fost prezentă la 10.30% din pacienți, și la 5,53% cu HBV, predominant de sex feminin, cu vârsta medie peste 40 ani, RR = 0.9231, 95 % CI = 0.65 – 1.29 .

Hipotiroidismul a fost constatat mai frecvent la ambele loturi de studiu comparativ cu hipertiroidismul, însă cu o ușoară prevalență crescută la pacienții cu HCV.

Majoritatea pacienților cu afectare tiroidiană au prezentat valori normale și ușor crescute ale transaminazelor, valorile medii ale acestora fiind mai scăzute comparativ cu pacienții cu hepatită cronică virală fără afectare tiroidiană, existând o relație inversă între acești parametri.

Anticorpii antitiroidieni au fost constatați la 7 pacienți cu HCV și la 4 pacienți cu HBV, sugerând implicarea sistemului imun în determinarea leziunilor.

Majoritatea pacienților cu afectare tiroidiană nu au efectuat biopsie hepatică, însă la cei care au efectuat biopsie hepatică s-a constatat mai frecvent gradul 3 de fibroză hepatică. La pacienții cu HCV, prezența afectării tiroidiene s-a corelat mai frecvent cu gradul de afectare hepatică (p=0,07), în timp ce la lotul de pacienți cu HBV, această corelație a fost nesemnificativă (p=0,4).

Rezultatele obținute se încadrează în datele publicate în literatura de specialitate, care susțin că înaintea inițierii tratamentului antiviral afectarea tiroidiană este prezentă la 2-13% din pacienți, fiind mai frecvent asociată cu sexul feminin, vârsta peste 35 ani, nivel crescut al transaminazelor, cu grad înalt de fibroză și mai puțin cu activitatea necrotico-inflamatorie.

189

Tabel nr. 46 Studii clinice publicate în literatura privind incidenta afectării tiroidiene la pacienții cu HCV

CRIOGLOBULINEMIA

Crioglobulinele au fost constatate cu o frecvență mai mare la pacienții cu HCV- 8.2% în raport cu cei cu HBV (0,9%), comparativ cu datele din literatură care susțin prezența crioglobulinelor la 19-37% din pacienții cu HCV.

Tabel nr. 47 Studii clinice publicate în literatura privind incidenta crioglobulinemiei la pacienții cu HCV

Crioglobulinemia este frecvent asociată pacienților cu VHC, rol important avându-l mecanismele imunopatogenice, cu implicarea complexelor imune, responsabile de leziunile cutanate, vasculare, renale și neurologice.

190

În studiul efectuat, am constatat că prezența crioglobulinelor a fost mai frecventă la sexul feminin și la pacienții cu vârste medie 51,22±7,55 ani, asociind valori predominant crescute ale transaminazelor, activitate necrotico-inflamatorie moderată(p=0,05) și un grad de fibroză moderat (p=0,01), rezultatele nefiind semnificative dpdv statistic.

Factorul reumatoid a fost constatat la 6/27 pacienți cu HCV și doar la un pacient cu HBV, p<0,05, acesta putând fi considerat un marker important pentru depistarea crioglobulinelor la acești pacienți. Scăderea nivelului seric al complementului a fost constatată cu o prevalență mai redusă, însă la pacienții cu crioglobuline prezente, este important de analizat acest parametru, pentru a evita apariția complicațiilor (glomerulonefrită, neuropatie, afecțiuni maligne).

Din punct de vedere clinic, s-a constatat o frecvență mai mare a asteniei fizice, a artralgiilor, mialgiilor și purpurei la acești pacienți, comparativ cu cei fără crioglobuline prezente.

AFECTAREA ARTICULARĂ

Virusul hepatic B poate determină infecții sau acționează ca un cofactor în dezvoltarea unor afecțiuni reumatologice, acționând în funcție de factori ce țin de gazdă sau de virus. Factorii ce țin de gazdă includ vârsta, sexul, predispoziția genetică, istoricul infecției virale și răspunsul imunologic. Factorii virali includ tropismul tisular, replicare, efectele citokinelor, capacitatea de a determina o infecție latentă sau persistentă. [107, 109] Artralgiile sunt mai frecvent prezente la pacienții cu hepatită acută virală B comparativ cu formele cronice, rol important avându-l tulburările sistemului imunologic din cadrul infecției virale B, cu implicarea în special a limfocitelor Th ce pot fi responsabile de apariția modificărilor osteo-articulare [107].

Din cei 637 de pacienți diagnosticați cu hepatite cronice virale, 154/330 de pacienți (46.7%) și 70/307 pacienți (22.80%) au prezentat clinic manifestări reumatologice. Acestea au fost mai frecvente la sexul feminin, cu vârsta medie peste 43 de ani. Din punct de vedere clinic, cel mai frecvent au fost constatate artralgiile asimetrice.

Din cei 154 de pacienți cu HCV, 3 pacienți au fost diagnosticați cu LES, 7 pacienți cu PR, 27 pacienți cu crioglobulinemie mixtă.

191

Sindromul reumatoid caracterizat prin artralgii, artrite simetrice la nivelul articulațiilor mici, factor reumatoid prezent a fost constatat mai frecvent la pacienți cu HCV fiind mai frecvent asociat cu sexul feminin, vârsta medie peste 44 de ani, valori ușor crescute ale transaminazelor, fără a exista vreo corelație între acesta și gradul de fibroză hepatică.

CARACTERISTICI HISTOPATOLOGICE ȘI IMUNOHISTOCHIMICE

La pacienții cu infecție cronică virală, răspunsul imun joacă un rol important în patogenia bolii, dar atât răspunsul imun celular (prin secreția de citokine) cât și cel umoral sunt incapabile de eradicarea infecției la majoritatea pacienților.

Severitatea și perpetuarea leziunilor hepatice la pacienții cu hepatită cronică virală sunt în interrelație cu activarea limfocitelor T intrahepatic și intervenția citokinelor secretate de limfocitele T-CD4+ sau CD8+. Mecanismele patogenice implicate în trecerea de la forma acută la cea cronică, sunt încă intens studiate, însă se consideră că un rol important îl au limfocitele T citotoxice și răspunsul umoral la agresiunea virală.

Răspunsul limfocitelor T CD4+/ CD8+ a fost asociat cu modificări ale transaminazelor, cu gradul de fibroză hepatică precum și cu activitatea necrotico-inflamatorie.

Gradul de afectare hepatică la pacienții cu hepatite cronice virale pare a se corela cu activarea limfocitelor T, în special cu prezența infiltratului cu limfocite CD4+/CD8+ precum și cu capacitatea acestora de a secreta citokine.

Limfocitele CD8+ sunt responsabile de secreția de TNF-α și IFN- γ implicate în replicarea virală.

Mecanismele imunologice celulare, prin implicarea limfocitelor T au rol important în patogenia hepatitelor cronice virale, mai ales în cele virale C.

Se cunosc trei membrii ai familiei TGF-β: TGF -β1, TGF -β 2, TGF-β3. TGF β își mediază activitatea prin afinitatea crescută în legarea de receptorul de tip 2, ce necesită atât activarea kinazei sale, cât și asocierea cu un număr de membrii ai kinazelor activin receptor like (ALK) 1-6. Anticorpul anti TGF-β este un anticorp policlonal.[26, 185]

Studiul anatomopatologic al preparatelor de biopsie hepatică a evidențiat deasemenea agregate limfoide în tracturile portale, leziuni ale ductelor biliare precum și leziuni de

192

steatoză macro și microveziculară. Majoritatea cercetătorilor consideră că leziunile ductelor biliare ar fi determinate de activarea mecanismelor imune incomplet cunoscute în prezent.[26, 185]

Infiltratul inflamator hepatic a fost cel mai frecvent moderat (++), predominat cu limfocite T și mai puțin cu limfocite T, elemente celulare virale, macrofage, celule dendritice. Majoritatea pacienților cu infiltrat inflamator ++ și +++ au avut activitate necroticoinflamatorie moderată și severă, infiltratul inflamator fiind bogat în limfocite T-CD4+, sugerând implicarea sistemului imun în patogenie .

Studiul prezent a evidențiat o importantă corelație între prezența limfocitelor CD4/CD8 și gradul fibrozei precum și gradul activității necrotico-inflamatorii. Limitele studiului sunt reprezentate de imposibilitatea determinării nivelului seric al limfocitelor T, și stabilirea eventualelor corelații cu infiltratul inflamator constatat la biopsia hepatică.

193

CAPITOLUL IX

CONCLUZII

Studiul prezent a fost efectuat pe un lot de 637 de pacienți cu hepatite cronice virale B și C, 10 pacienți prezentând infecție virală asociată B+D, constatându-se o frecvență mai mare a acestora la sexul feminin și la vârste peste 35 ani. Situația hepatică a pacienților a fost analizată prin probe biochimice (la intervale de 3 luni), ecografie abdominală și markeri serologici pentru infecția cu VHB, VHD și VHC (antigenul HBs și HBe, anticorpii anti-HBs, anti-HBc de tip IgG eventual IgM, anti-HBe, anti-virus delta, anti-VHC).

La pacienții propuși pentru tratament antiviral, s-au efectuat și determinări cantitative ale ADN VHB și /sau ARN VHC.

Nivelul seric al transaminazelor a fost crescut la majoritatea pacienților și s-a corelat cu activitatea necrotico-inflamatorie și mai puțin cu gradul de fibroză, în special la pacienții cu HCV. Gradul de fibroză hepatică s-a asociat cu nivelul crescut al transaminazelor, în special cu nivelul seric al ALT, numărul de trombocite, indicele APRI, raportul AST/ALT<1.2, nivelul seric al imunoglobulinelor G și al γ-globulinelor serice. Analizând o corelație între indicele APRI și gradul de fibroză sau activitatea necrotico-inflamatorie, am constatat că majoritatea pacienților cu grad 3 și 4 de fibroză hepatică, precum și cei cu activitate necrotico-inflamatorie moderată sau severă au avut indice APRI >1.2, constatând că indicele APRI se corelează mai fidel cu gradul de fibroză.

Studiul a evidențiat că nivelul seric al γ-globulinelor și al IgG se corelează mai frecvent cu gradul de fibroză hepatică și cu activitatea necro-inflamatorie, în special la pacienții cu HCV, în timp ce nivelul seric al IgA nu se corelează cu acestea.

Factorul reumatoid a fost prezent la 18 pacienți cu VHB(5,86%) și la 49 (14,84%) din pacienții cu HCV și s-a asociat cu sexul feminin, nivel crescut

ALT și grad înalt de fibroză.

Nivelul seric al complementului (C3) a fost scăzut la 6,5% din pacienții cu VHB și respectiv 13,03% din pacienții cu HCV, incluzând pe cei cu poliartrită reumatoidă, crioglobulinemie, lupus. Valorile scăzute ale C3 s-au corelat cu

194

sexul feminin, vârsta peste 37 ani și valori crescute ale transaminazelor. Nivelul seric scăzut al complementului C3 s-a asociat cu grad de fibroză moderat/sever (p=0,16) și activitate necrotico-inflamatorie moderat/severă (p=0,26). În ambele loturi de studiu, gradul 4 de fibroză s-a asociat cu valori medii mai scăzute ale complementului seric.

Cel mai frecvent constatați au fost anticorpii AAN și antitiroidieni. Anticorpii antinucleari au fost prezenți la 10,09% din pacienții cu VHB și la 20% din pacienții cu HCV și s-a asociat cu sexul feminin, cu vârsta medie peste 38 ani, prezența clinică a artralgiilor, erupție purpurică. Am constatat că prezența anticorpilor antinucleari s-a asociat clinic cu lupusul eritematos sistemic, poliartrita reumatoidă, afectarea autoimună tiroidiană și cu diabetul zaharat tip

I. De asemenea, am constatat că prezența autoanticorpilor s-a asociat cu valori crescute ale transaminazelor, în special al ALT, fără a exista o corelație între aceștia și gradul de fibroză sau activitate necrotico-inflamatorie.

Prezența manifestărilor extrahepatice s-a asociat cu nivel seric mai ridicat al transaminazelor și cu activitatea necrotico-inflamatorie și gradul de fibroză hepatică.

Studiul prezent a evidențiat asocierea manifestărilor extrahepatice la 32.34% din pacienții cu hepatite cronice virale, 24,4%.din pacienții cu hepatita cronică virală B și 39,7% din pacienții cu hepatită cronică virală C, demonstrând că manifestările extrahepatice au frecvență mai mare la pacienții cu HCV. Prezența afecțiunilor extrahepatice au fost constatate mai frecvent la pacienții de sex feminin, cu vârste peste 35 ani, și cu activitate necrotico-inflamatorie moderată și grad înalt de fibroză.

Manifestările extrahepatice pot fi împărțite în două grupuri: asociate cu frecvență crescută și asociate cu frecvență moderată sau scăzută cu infecția virală.

Astenia fizică, considerată de mulți autori ca manifestare extrahepatică, este cea mai frecvent întâlnită la acești pacienți, influențând calitatea vieții acestora, fiind adesea asociată cu tulburări de tip depresiv. In studiul prezent, astenia fizică a fost constatată la 57,9% din pacienții cu VHB și la 68,1% din pacienții cu HCV.

195

Artralgiile sunt frecvent întâlnite atât la pacienții cu VHB cât și la pacienții cu HCV, cu o frecvență mai mare la cei cu infecție cronică virală C (46,7%- HCV vs. 22,8%-VHB).

Crioglobulinemia mixtă este una dintre afecțiunile extrahepatice frecvent întâlnite atât la pacienții cu VHB cât și la pacienții cu HCV, fiind constatată la 0,9% din pacienții cu VHB vs. 8,2 % din pacienții cu HCV, comparativ cu datele întâlnite în literatura conform cărora aceasta ar fi prezentă la 45-90% din pacienții cu HCV și mai puțin frecvent la pacienții cu VHB.

Diabetul zaharat a fost constatat la 10,1% din pacienții cu VHB comparativ cu 12,1% din pacienții cu HCV.

Afectarea tiroidiană a fost constatată la 5,5% din pacienții cu VHB comparativ cu 10.3% din pacienții cu HCV, fiind mai frecventă la pacienții de sex feminin, cu vârste peste 35 ani, cu nivel moderat crescut al transaminazelor și grad de fibroza 2/3. Anticorpii antitiroidieni au fost prezenți la femei cu vârsta peste 50 ani.

Hipotiroidismul a fost mai frecvent constatat la ambele grupuri.

Afectarea renală a fost întâlnită la 2,6% din pacienții cu VHB vs. 6,3% din pacienții cu HCV, comparativ cu datele din literatură care susțin o frecvența peste 40%, fiind caracterizată prin afectare glomerulară în principal. Datele de laborator au evidențiat în principal nivel seric crescut al viremiei, proteinurie, hematurie microscopică, insuficiență renală ușoară sau moderată.

Alte afecțiuni extrahepatice sunt întâlnite cu o frecvență mai redusă: limfoame/ neoplazii (1,9% din pacienții cu VHB comparativ cu 3,6% din pacienții cu HCV), leziuni cutanate de tip psoriazis, lichen plan la 2 pacienți cu HBV și 5 pacienți cu HCV, sindrom sicca (0,9% din pacienții cu VHB comparativ cu 2,3% din pacienții cu HCV).

Studiul imunohistochimic a evidențiat un infiltrat inflamator intrahepatic bogat în limfocite T, în special CD4+ și CD8+, și mai puțin frecvent bogat în limfocite B, ceea ce sugerează implicarea sistemului imun în patogenia afectării hepatice.

Pacienții cu activitatea necrotico-inflamatorie moderată/ severă au avut infiltrat

inflamator predominant CD4+, astfel încât s-ar putea considera că limfocitele CD4+ ar putea juca un rol important în activitatea necrotico-inflamatorie hepatică. Infiltratul inflamator

196

CD4+ a fost predominat de tip Th1. Prezența infiltratului inflamator CD4+ a fost constatat mai frecvent la pacienții cu viremie înaltă și cu prezența altor manifestări autoimune.

Prezența infiltratului inflamator de tip CD8+ a fost constatat mai frecvent la pacienții cu activitate necrotico-inflamatorie ușoară/minimă și grad mic de fibroză.

La pacienții cu infecție cronică virală, răspunsul imun joacă un rol important în patogenia bolii, dar atât răspunsul imun celular (prin secreția de citokine) cât și cel umoral sunt incapabile de eradicarea infecției la majoritatea pacienților. La bolnavii cu hepatită cronică, răspunsul limfocitelor T CD8+ a fost asociat cu grad mic al fibrozei hepatice.

Studiile imunohistochimice au evidențiat și prezența unor markeri.

CD20 (L26) sau antigenul L26, un antigen membranar care marchează în special celulele B, celulele centrilor germinativi și ale zonei mantalei a fost evidențiat la 2 pacienți diagnosticați cu infecție cronică virală C care prezentau asociat limfom și care au efectuat biopsie hepatică. La acești pacienți s-a evidențiat și CD45RO-.

Majoritatea cazurilor analizate au fost CD4+, și mai puțin frecvent CD8+, CD20-, CD45RO-, aceștia din urmă fiind constatați la cele 2 cazuri cu HCV și limfom.

Importanța medico-socială a infecției cronice virale, mai ales cu VHC, reiese și

din studiile de prognostic, care apreciază că, între anii 2000-2010 infecția cu virusurile hepatice, în special VHC, va duce la o creștere cu peste 60% a numărului de ciroze, cu peste 65% a carcinomului hepatocelular și cu circa 25% a mortalității prin boli hepatice, reprezentând un adevărat șoc pentru serviciile medicale. Noile metode de studiu al fibrozei hepatice de tip FibroTest/FibroScan (elastografia) tind să înlocuiască efectuarea biopsiei hepatice, asociată cu costuri mari, multiple incidente și adeseori contraindicată la mulți pacienți. Identificarea unor markeri noninvazivi pentru aprecierea gradului de afectare hepatică, care să permită evitarea efectuării biopsiei hepatice, reprezintă o altă direcție de studiu în prezent. Utilizarea acestor metode ar permite aprecierea afectării hepatice la toți pacienții care ar prezenta modificări imunologice, subliniind prognosticul de boală al acestora. Însă pentru moment biopsia hepatică reprezintă standardul de aur pentru aprecierea gradului de fibroză și al activității necrotico-inflamatorii.

197

Studiul prezent vine în susținerea ideii de investigare completă a pacientului cu hepatită cronică virală, deoarece mecanismele imunopatogenice implicate pot sta la baza leziunilor hepatice severe.

198

BIBLIOGRAFIE:

Weinbaum CM, Williams I, Mast EE, et al. Recommendations for identification and public health management of persons with chronic hepatitis B virus infection. MMWR Recomm Rep. 2008;57:1-20.

Mahoney FJ. Update on diagnosis, management, and prevention of hepatitis B virus infection. Clin Microbiol Rev 1999; 12(2): 351-366

Alter MJ. Epidemiology of hepatitis B in Europe and worldwide. J Hepatol 2003; 39: S 64- S 69

Custer B, Sullivan SD, Hazlet TK, Iloeje U, Veenstra DL, Kowdley KV. Global epidemiology of hepatitis B virus. J Clin Gastroenterol. 2004;38(10 suppl):S158-168.

Jacob Alexander, MD; Kris V. Kowdley, MD, FACP, „Epidemiology of Hepatitis B –

Clinical Implications‖, Medscape General Medicine. 2006;8(2):13

Liu C, Kao J. Hepatitis B virus genotypes: Epidemiology and therapeutic implications. Hep B Annual 2006;3:54-75

Naoky Tsai MD, Diagnosis and management of chronic hepatitis B in the primary care setting, VOL 119, NO 2, July-August 2006 / POSTGRADUATE MEDICINE

Gunson RN, Shouval D, Roggendorf M, Zaaijer H, Nicholas H, Holzmann H, et al . Hepatitis B virus (VHB) and hepatitis C virus (HCV) infections in healthcare workers (HCWs): Guidelines for prevention of transmission of VHB and HCV from HCW to patients. J Clin Virol 2003;27:213-30

Kane A, Lloyd J, Zaffran M et al. Transmission of hepatitis B, hepatitis C and human immunodeficiency viruses through unsafe injections in the developing world: model-based regional estimates. Bull World Health Organ 1999; 77(10): 801-807

Evans, A. A., and W. T. London. 1998. Epidemiology of hepatitis B, p. 107-114. In A. J. Zuckerman, and H. C. Thomas (ed.), Viral hepatitis. Harcourt Brace & Co., Ltd., London, United Kingdom

Shapiro CN: Occupational risk of infection with hepatitis B and hepatitis C virus. Surg Clin North Am 75:1047-1056, 1995

Mahoney FJ, Stewart K, Hu H, Coleman P, Alter MJ. Progress toward the elimination of hepatitis B virus transmission among healthcare workers in the United States. Arch Intern Med 1997;157:2601-5.

Raimondo G. Pollicino T, Cacciola I, et al. Occult hepatitis B virus infection.

199

Hepatol 2007;46:160–70

Blumberg BS: Australia antigen and the biology of hepatitis B. Science 1977 Jul 1;

197(4298): 17-25

Christoph Seeger and William S. Mason, Hepatitis B Virus Biology, Microbiology and Molecular Biology Reviews, March 2000, p. 51-68, Vol. 64, No. 1

Geller SA. Hepatitis B and C, Clin Liver Dis. 2002, may;6(2):317-34, v. Review

Lok, AS, McMahon, BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology 2007; 45:507.

Lok ASF, McMahon BJ. Chronic hepatitis B. Hepatology 2001; 34: 1225-41.

Wieland, S. F., Chisari, F. V. (2005). Stealth and Cunning: Hepatitis B and Hepatitis C

Viruses. J. Virol. 79: 9369-9380

Stefan F. Wieland and Francis V. Chisari, „Stealth and Cunning: Hepatitis B and

Hepatitis C Viruses „ Journal of Virology, August 2005, p. 9369-9380, Vol. 79, No. 15

Bertoletti, A., Gehring, A. J. (2006). The immune response during hepatitis B virus infection. J. Gen. Virol. 87: 1439-1449 [Abstract]

Thimme, R., S. Wieland, C. Steiger, J. Ghrayeb, K. A. Reimann, R. H. Purcell, and F.

V. Chisari..‖ CD8+ T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during

acute hepatitis B virus infection.‖ J. Virol. 2003 77:68-76.

Nayersina R, Fowler P, Giulhot S, et al. HLA A2 restricted cytotoxic T lymphocyte responses to multiple hepatitis B surface antigen epitopes during hepatitis B virus infection. J Immunol 1993;150:4659-4671

Chu CM, Liaw YF, „HBsAg seroclearance in asymptomatic carriers of high endemic areas: appreciably high rates during a long-term follow-up‖ Hepatology. 2007 May;45(5):1187-92

Amarakurpar, DN,. R.Kulshrestha, et al, „Profile of hepatitis Be antigene-negative chronic hepatitisB‖, Indian J Gastroenterol, 2002, 21, 99-101

Whalley SA, Muurray JM, Brown,D et al, „Kinetics of acute hepatitis B virus infection in humans‖, J Exp Med, 2001, 193, 847-53

Ganem D, Prince AM. Hepatitis B virus infection-natural history and clinical consequences. N Engl J Med. 2004;350:1118-29.[ PubMed Abstract]

Penna A, Del Prete G, Cavalli A, et al. Predominant T-helper 1 cytokine profile of hepatitis B virus nucleocapsid-specific T cells in acute self-limited hepatitis B. Hepatology 1997;25:1022-1027

200

Stoop, JN, van der, Molen RG, Baan, CC, van der, Laan LJ. „Regulatory T cells contribute tothe impaired immune response in patients with chronic hepatitis B virus infection‖. Hepatology 2005; 41:771.

Aslan, N.; Yurdaydin, C. et al, ―Cytotoxic CD4+ T cells in viral hepatitis‖, Journal of Viral Hepatitis, Volume 13, Number 8, August 2006 , pp. 505-514(10)

Penna A, Fowler P, Bertoletti A, et al. Hepatitis B virus (VHB)-specific cytotoxic T-cell (CTL) response in humans: Characterization of HLA class II-restricted CTLs that recognize endogenously synthesized VHB envelope antigens. J Virol 1992;66:1193-1198

Rossol S, Marinos G, Carucci P, et al. Interleukin-12 induction of Th1 cytokines is important for viral clearance in chronic hepatitis B. J Clin Invest 1997;99:3025-3033

Guidotti LG, Chisari FV. To kill or to cure: Options in host defense against viral infection. Curr Opin Immunol 1996;8:478-483

Senji Kasahara, Kazuki Ando et al.‖Lack of Tumor Necrosis Factor Alpha Induces Impaired Proliferation of Hepatitis B Virus-Specific Cytotoxic T Lymphocytes‖, Journal of Virology, February 2003, p. 2469-2476, Vol. 77, No. 4

Rehermann B, Ferrari C, Pasquinelli C, Chisari FV. The hepatitis B virus persists for decades after patients' recovery from acute viral hepatitis despite active maintenance of a cytotoxic T-lymphocyte response. Nat Med. 1996;2:1104-8. [PubMed Abstract]

Hyams KC. Risks of chronicity following acute hepatitis B virus infection: a review. Clin Infect Dis. 1995;20:992–1000. [PubMed]

Perrillo RP, „Acute flares in chronic hepatitis B: the natural and unnatural history of an immunologic mediated liver diseases‖, Gastroenterology, 2001, 120, 1009-1022

Pungpapong S, Kim WR, Poterucha JJ.‖Natural history of hepatitis B virus infection: an update for clinicians.‖Mayo Clin Proc. 2007 Aug;82(8):967-75. Review

Crockett SD, Keeffe EB. Natural history and treatment of hepatitis B virus and hepatitis C virus coinfection. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2005;4:13.

Hoofnagle JH, Dusheiko GM, Seeff LB, Jones A, Waggoner JG, Bales ZB. Seroconversion from hepatitis B e antigen to antibody in chronic type B hepatitis. Ann Intern Med 1981; 94: 744-8.

Chen, CJ, Yang, HI, Su, J, et al. REVEAL-VHB Study Group. Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level. JAMA 2006; 295:65.

201

McGlynn KA, Tsao L, Hsing AW, et al. International trends and patterns of primary liver cancer. Int J Cancer 2001; 94(2): 290-296, Lemon SM, Layden TJ, Seeff L, et al. The 20th United States-Japan Joint Hepatitis Panel Meeting. Hepatology 2000; 31(3): 800-806

Lok, A. S., C. L. Lai, H. T. Chung, J. Y. Lau, E. K. Leung, and L. S. Wong. Morbidity and mortality from chronic hepatitis B virus infection in family members of patients with malignant and nonmalignant hepatitis B virus-related chronic liver diseases. Hepatology, 1991 13:834-837[Medline]

London, W. T., A. A. Evans, K. McGlynn, K. Buetow, P. An, L. Gao, E. Lustbader, E. Ross, G. Chen, and F. Shen. 1995. Viral, host and environmental risk factors for hepatocellular carcinoma: a prospective study in Haimen City, China. Intervirology 38:155-161[Medline]

T.CIUREA, Hepatite cronice virale actualități diagnostice și terapeutice,Editura medicală universitară Craiova, 77-90

A. Ponzetto, B. Forzani, „Epidemiology of hepatitis delta virus (HDV) infection‖, vol

1, no1, december 1985

Glebe D, Urban S: Viral and cellular determinants involved in hepadnaviral entry. World J. Gastroenterol. 13(1), 22-38 (2007).

Atef Nehdi, Jonathan Perreault „A novel structural rearrangement of hepatitis delta virus antigenomic ribozyme‖, Nucleic Acids Res nov , 2007, 35:6821-6831

Elkin, C. D., H. Zuccola, J. M. Hogle, and D. Joseph-McCarthy. 2000. Computational design of D-peptide inhibitors of hepatitis delta antigen dimerization. J. Comput. Aided Mol. Des. 14:705-718.

R Nisini, M Paroliet all,‖ Human CD4+ T-cell response to hepatitis delta virus: identification of multiple epitopes and characterization of T-helper cytokine profiles‖, J Virol. 1997 March; 71(3): 2241–2251

Ibranyi E, Mihaly I, Kovacs M, Telegdy L, Delta virus infection in hemodialysed kidney patients and patients with chronic liver diseases, Orvosi Hetilap, 1992, 133 (suppl 1): 45-8

Hess, G. – Virological and serological aspects of hepatitis B and the delta agent. Gut, 1993; 34: 2; S 1 – 6

World Health Organization: Hepatitis C. Fact Sheet 164, 2000

World Health Organization. Hepatitis C – Global Surveillance Update. Weekly Epidemiological Record 75:17-28, 2000

202

Wong JB, McQuillan GM, McHutchinson JG et al, „Estimating future hepatitis C morbidity, mortality and costs in the United States‖, Am J Public Health 2000;90:1562-1569

Fields B, Knipe DM, Howley PM. Fields Virology (3rd Ed.) Lippincott-Raven (1996) Chapters 24 (HAV), 85-86 (VHB), 32 (HCV), 88 (HDV), 89 (HEV)

Pozzetto B, Bourlet T, Grattard F, Bonevial L, Structure, genomic organization, replication and variability of hepatitis C virus, Nephrol Dial Transplant, 1996, 11: 2-5

Pawlotsky, JM, „Molecular diagnosis of viral hepatitis‖, Gastroenterology, 2002, 122,

1554-68

Pawlotsky, J. M. 2004. „Pathophysiology of hepatitis C virus infection and related liver disease‖, Trends Microbiol. 12:96-102

Racanelli, V., and B. Rehermann. 2003. Hepatitis C virus infection: when silence is deception. Trends Immunol. 24:456-464

Marceau G, Lapierre P, Béland K, Soudeyns H, Alvarez F., LKM1 autoantibodies in chronic hepatitis C infection: a case of molecular mimicry?, Hepatology. 2005 Sep;42(3):675-82.

Choudhuri K, Gregorio GV, Mieli-Vergani G, Vergani D. Immunological cross-reactivity to multiple autoantigens in patients with liver kidney microsomal type 1 autoimmune hepatitis. Hepatology 1998; 28(5):1177-1181.

AlterHJ, Seef LB, „Recovery, persistence and sequelae in hepatitis C virus infection: a perspective on long-term outcome‖, Semin Liver Dis 2000; 20:17-35

Christel Gremion, Benno Grabscheid, Benno Wölk, Darius Moradpour, Jürg Reichen, Werner Pichler, and Andreas Cerny, Cytotoxic T Lymphocytes Derived from Patients with Chronic Hepatitis C Virus Infection Kill Bystander Cells via Fas-FasL Interaction, Journal of Virology, February 2004, p. 2152-2157, Vol. 78, No. 4

Ana Teresa Rodriguez Viso, Thaís de Castro Barbosa, et al, „Portal CD4+ and CD+ t lymphocyte correlate to intensity of interface hepatisis in chronic hepatisis C‖, Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2007 Dec ;49 (6):371-378

Dahari H, Major M, Mihalik K, et al. Lack of virus cytopathicity but strong IFN and cellular immune responses during primary HCV infection in chimpanzees. Hepatology. 2000;32:302A. Abstract 572

Fiore G, Galetta V et all, „CD45RA and CD45RO isoform expression on intrahepatic

T-lymphocites in chronic hepatitis C‖, Microbios, 1997; 92 (371): 73-82

203

Wang, J. H., T. J. Layden, and D. D. Eckels. „Modulation of the peripheral T-cell response by CD4 mutants of hepatitis C virus: transition from a Th1 to a Th2 response‖. Hum. Immunol, 2003, 64:662-673

Bantel H, Lugering A, Poremba C et al. Caspase activation correlates with the degree of inflammatory liver injury in chronic hepatitis C virus infection. Hepatology 2001; 34: 758-767

Huang L, Fowler N, Schmidt EV, et al. Enhanced apoptosis of activated T cells induced by hepatocytes expressing HCV structural proteins. Hepatology. 2000;32:303A. Abstract 574

Bonacini M, Govindarajan S, „Intrahepatic lymphocite phenotypes in hepatitis C virus infection: a comparison between cirrhotic and non-cirrhotic livers‖, Minerva Gastroenterology, 2007, mar; 53(1):1-7

de Ledinghen V. Natural history of hepatitis C virus infection. Gastroenterol Clin Biol. 2002, apr26, Spec No 2:B9-22

Paul Martin, MD, The Natural History of Hepatitis C, an Evolving Story: Prognostic Factors; Disease Progression and Long-term Burden , Digestive Disease Week 2000 Day 3 – Tuesday, May 23

Alter MJ, Margolis HS, Krawczynski K, et al. The natural history of community-acquired hepatitis C in the United States. The Sentinel Counties Chronic non-A, non-B Hepatitis Study Team. N Engl J Med 1992;327(27):1899-905

Perz JF, Armstrong GL, Farrington LA, Hutin YJ, Bell BP. „The contributions of hepatitis B virus and hepatitis C virus infections to cirrhosis and primary liver cancer worldwide‖, J Hepatol. 2006 Oct;45(4):529-38, 2006 Jun 23.

Idilmann R et al. „Pathogenesis of hepatitis B and C-induced hepatocellular carcinoma‖. Journal of Viral Hepatitis, 1998, 5:2, 285-300

Thimme R. et al. Determinants of viral clearance and persistence during acute hepatitis C virus infection. J Exp Med. 2001;194(10):1395–406. [PubMed]

Scheuer PJ. Classification of chronic viral hepatitis: a need for a reassessment. J Hepatol 1991;13:372-374

Ishak K.J. – Chronic hepatitis: morphology and nomenclature. Mod/Pathol., 1994, 7, 690-713

Rubio C A, Porwit A. Quantitation of fibrosis in liver biopsies. Anal Quant Cytol Histol 1988; 10: 107-9.

204

Carmen Ardeleanu, Violeta Comanescu, B.Zaharia, „Imunohistochimie‖, Editura

SITECH, 1999, 22-30

Van Walraven C, Goel V‖ The effect of a hepatitis serology testing algorithm on laboratory utilization‖, JEval ClinPract. 2002, aug;8(3):327-32

Diana V Stefanova-Petrova, Anelia H Tzvetanska, ―Chronic hepatitis C virus infection: Prevalence of extrahepatic manifestations and association with cryoglobulinemia inBulgarian patients‖, World J Gastroenterol 2007 December 28; 13(48): 6518-6528, World Journal of Gastroenterology ISSN 1007-9327

Shaheen AA, Wan AF, Myers RP, ―FibroTest and FibroScan for the prediction of hepatitis C-related fibrosis: a systematic review of diagnostic test accuracy‖, Am J Gastroenterol. 2007 Nov;102(11):2589-600. Epub 2007 Sep 10

Chie Tatsumi, Masatoshi Kudo, ―Noninvasive Evaluation of Hepatic Fibrosis Using Serum Fibrotic Markers, Transient Elastography (FibroScan) and Real-Time Tissue

Elastography‖, Intervirology, vol 1, suppl 1, 2008

Murawaki Y, Ikuta Y, Okamoto K, Koda M, Kawasaki H. Diagnostic value of serum markers of connective tissue turnover for predicting histological staging and grading in patients with chronic hepatitis C. J Gastroenterol 2001; 36: 399-406.

Castιra L, Vergniol J, Foucher J, Le Bail B, Chanteloup E, Haaser M, et al . Prospective comparison of transient elastography, Fibrotest, APRI and liver biopsy for the assessment of fibrosis in chronic hepatitis C. Gastroenterology 2005;128:343-50.

Wong V S, Hughes V, Trull A, Wight D G D, Petrik J, Alexander G J M. Serum hyaluronic acid is a useful markers of liver fibrosis in chronic hepatitis C virus infection. J Viral Hepatol 1998; 5: 187-92

Bravo AA, Sheth SG, Chopra S. Liver biopsy. N Engl J Med 2001;344:495-500

Poynard T, Mathurin P, Lai CL, et al. A comparison of fibrosis progression in chronic liver diseases. J Hepatol. 2003;38:257-265

Rozario R, Ramakrishna B. Histopathological study of chronic hepatitis B and C: a comparison of two scoring systems J Hepatol 2003;38:223-9.

Park W; Keeffe EB, Diagnosis and treatment of chronic hepatitis B, Minerva Gastroenterol Dietol. 2004; 50(4):289-303 (ISSN: 1121-421X

Anna SF Lok, MD, Serologic diagnosis of hepatitis B virus infection, December 2006, Update

205

Aldershvile J, Frosner GG, Nielsen JO, Hardt F, Deinhardt F, Skinhoj P. Hepatitis B e antigen and antibody measured by radioimmunoassay in acute hepatitis B surface antigen-positive hepatitis. J Infect Dis. 1980;141:293-8.[PubMed Abstract]

Strader DB, Wright T, Thomas DL, Seeff LB. Diagnosis, management, and treatment of hepatitis C. Hepatology. 2004;39:1147–1171

Gretch DR. Diagnostic tests for hepatitis C. Hepatology 1997;26(suppl 1):43S-47S

Roth WK, Lee JH, Ruster B, Zeuzem S. Quantification of hepatitis C virus RNA by RT-PCR in comparison to the branched DNA method. Z Gastroenterol 1998;36:5-11

Bedossa P, Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The METAVIR Cooperative Study Group. Hepatology 1996; 24: 289-93.

The METAVIR cooperative group. Intraobserver and interobserver variations in liver biopsy interpretation in patients with chronic hepatitis C. The French METAVIR Cooperative Study Group. Hepatology 1994; 20: 15-20.

T, Ratziu V, Benmanov Y, Di MV, Bedossa P, Opolon P. Fibrosis in patients with chronic hepatitis C: detection and significance. Semin Liver Dis 2000; 20: 47-55

Van Leeuwen DJ, Wilson L, Crowe DR. Liver biopsy in the mid-1990s: questions and answers. Semin Liver Dis 1995;15: 340-358

Zaitoun A M, Al Mardini H, Awad S, Ukabam S, Makadisi S, Record C O. Quantitative assessment of fibrosis and steatosis in liver biopsies from patients with chronic hepatitis C. J Clin Pathol 2001; 54: 461-5.

Rubbia Brandt Laura și col „Hepatocyte steatosis is a cytopatic effectof hepatitis C virus genotyp 3‖, J.of Hepathology 2000;33 106- 115

Carla W. Brady, John G. McHutchison and Keyur Patel, „Fibrosis markers in hepatitis C‖, Current Hepatitis Reports, Volume 5, Number 3 / August, 2006

Richard K. Sterling, M.D., F.A.C.P., F.A.C.G., Hepatitis B Virus in the Setting of

HIV Infection: A Clinical Challenge, MEDICAL WRITER’SCIRCLE

Janke M. et al. Which factors predict early and sustained virological response under combination hepatitis C therapy in HIV/HCV co-infected patients? Fourth International Workshop on HIV and Hepatitis Coinfection, Madrid, abstract 14, 2008.

Nikolaus, T.Extrahepatic manifestation of chronic viral hepatitis, Current Gastroenterology Repports, 2001, 3: 71-78.

Lalitha Bandi, MD, MBBS ,‖Extrahepatic complications often are silent–and thus

overlooked‖, vol 113 / no 2 / february 2003 / postgraduate medicine

206

Baig S, Alamgir M, „The extrahepatic manifestations of hepatitis B virus‖, J Coll Physicians Surg Pak. 2008 Jul;18(7):451-7

Albert DA, Rimon D, Silverstein MD: The diagnosis of polyarteritis nodosa. A literature-based decision analysis approach. Arthritis Rheum 1988 Sep; 31(9): 1117-2.

Fernandes SR, Coimbra IB, Costallat LT: Uncommon features of polyarteritis nodosa: psychosis and angio-oedema. Clin Rheumatol 1998; 17(4): 353-6.

Calabrese LH, Hoffman GS, Guillevin L: Therapy of resistant systemic necrotizing vasculitis. Polyarteritis, Churg-Strauss syndrome, Wegener's granulomatosis, and hypersensitivity vasculitis group disorders. Rheum Dis Clin North Am 1995 Feb; 21(1): 41-57.

G. V. Papatheodoridis; N. Chrysanthos; S. Savvas; V. Sevastianos; G. Kafiri; K. Petraki; E. K. Manesis, Diabetes Mellitus in Chronic Hepatitis B and C: Prevalence and Potential Association With the Extent of Liver Fibrosis, Journal of Viral Hepatitis

Lohr H, Goergen B, Weber W, Godderz W, Meyer zum Buschenfelde KH, Gerken G, Mixed cryoglobulinemia type II in chronic hepatitis B associated with HBe-minus VHB mutant: cellular immune reactions and response to interferon treatment, J Med Virol. 1994 Dec;44(4):330-5

Galossi A, Guarisco R, Bellis L, Puoti C. Extrahepatic manifestations of chronic HCV infection. J Gastrointestin Liver Dis. Mar 2007;16(1):65-73. [Medline].

Ramos-Casals M, „Extrahepatic manifestations in patients with chronic hepatitis C

virus infection‖, Curr Opin Rheumatol. 2005 Jul;17(4):447-55

Sterling RK, Bralow S., „Extrahepatic manifestations of hepatitis C virus‖, Curr Gastroenterol Rep. 2006 Feb;8(1):53-9.

Doutrelepont JM, Alder M, Willems M, et al. Hepatitis C infection and membranoproliferative glomerulonephritis. (Letter) Lancet 1993;341(8840):317

Harle JR, Disdier P, Dussol B, et al. Membranoproliferative glomerulonephritis and hepatitis C infection. (Letter) Lancet 1993;341(8849):904

D'Amico G. Renal involvement in hepatitis C infection: cryoglobulinemic glomerulonephritis. Kidney Int 1998;54(2):650-71

D'Amico G, Colasanti G, Ferrario F. Renal involvement in essential mixed cryoglobulinemia. Kidney Int 1989;35(4):1004-14

Yamabe H, Johnson RJ, Gretch DR, et al. Hepatitis C virus infection and membranoproliferative glomerulonephritis in Japan. J Am Soc Nephrol 1995;6(2):220-3

207

S.Prakash,SC.Dash, A.Kumar, AK.Dinda et al.,Frequency and Role of HepatitisC Virus and Type II Cryoglobulinemia in Membranoproliferative Glomerulonephritis, Japi, vol52, june 2004.

Cacoub P, Maisonobe T, Thibault V, Gatel A, Servan J, Musset L, et al. Systemic vasculitis in patients with hepatitis C. J Rheumatol 2001;28:109

Gatenby PA: Vasculitis–diagnosis and treatment. Aust N Z J Med 1999 Oct; 29(5):

662-77

Brouet JC, Clauvel JP, Danon F: Biologic and clinical significance of cryoglobulins. A report of 86 cases. Am J Med 1974 Nov; 57(5): 775-88

Ferri C, Moriconi L, Gremignai G: Treatment of the renal involvement in mixed cryoglobulinemia with prolonged plasma exchange. Nephron 1986; 43(4): 246-53

Ferri C, Pietrogrande M, Cecchetti R: Low-antigen-content diet in the treatment of patients with mixed cryoglobulinemia. Am J Med 1989 Nov; 87(5): 519-24

Dore MP, Fattovich G, Sepulveda AR, Realdi G, „Cryoglobulinemia related to

hepatitis C virus infection‖, Dig Dis Sci. 2007 Apr;52(4):897-907. Epub 2007 Feb 16

Edison Roberto PARISE(1), Ana Cláudia de OLIVEIRA et al, „Cryoglobulinemia

in chronic hepatitis : clinical aspects and response to treatment with interferon alpha and ribavirin‖, Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo 49(2):67-72, March-April, 2007

Dore, Maria; Fattovich, Giovanna, et al, ―Cryoglobulinemia Related to Hepatitis C Virus Infection‖, Digestive Diseases and Sciences, Volume 52, Number 4, April 2007 , pp. 897-907(11)

Landau DA, Saadoun D, et al, „Relapse of hepatitis C virus-associated mixed

cryoglobulinemia vasculitis in patients with sustained viral response‖, Arthritis Rheum. 2008 Feb;58(2):604-11

Daniels TE: Labial salivary gland biopsy in Sjogren's syndrome. Assessment as a diagnostic criterion in 362 suspected cases. Arthritis Rheum 1984 Feb; 27(2): 147-56.

Daniels TE, Fox PC: Salivary and oral components of Sjogren's syndrome. Rheum Dis Clin North Am 1992 Aug; 18(3): 571-89.

Wilde PC, Kater L, Bodeutsch C, et al: Aberrant expression pattern of the SS-B/La antigen in the labial salivary glands of patients with Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum 1996 May; 39(5): 783-91

Mehta SH, Brancati FL, Sulkowski MS, Strathdee SA , Szklo M, Thomas DL. Prevalence of type 2 diabetes mellitus among persons with hepatitis C virus infection in the United States. Ann Intern Med 2000; 133(8):592-599.

208

Mason AL, Lau JY, Hoang N, Qian KP, Alexander GJ, Xu LZ et al. Association of diabetes mellitus and chronic hepatitis C virus infection. Hepatology 1999; 29(2):328-333.

Konrad T, Zeuzem S, Vicini P, Toffolo G, Briem D, Lormann J et al. Evaluation of factors controlling glucose tolerance in patients with HCV infection before and after 4 months therapy with interferon-a. Eur J Clin Invest 2000; 30(2):111-121.

Bigam DL, Pennington JJ, Carpentier A, Wanless IR, Hemming AW, Croxford R et al. Hepatitis C-related cirrhosis: A predictor of diabetes after liver transplantation. Hepatology 2000; 32(1):87-90.

Duong M, Petit JM, Piroth L, Grappin M, Buisson M, Chavanet P et al. Association between insulin resistance and hepatitis C virus chronic infection in HIV-hepatitis C virus-coinfected patients undergoing antiretroviral therapy. J Acquir Immune Defic Syndr 2001; 27(3):245-250.

Knobler H, Schihmanter R, Zifroni A, Fenakel G, Schattner A. Increased risk of type 2 diabetes in noncirrhotic patients with chronic hepatitis C virus infection. Mayo Clin Proc 2000; 75(4):355-359.

Allison MED, Wreghitt T, Palmer CR, Alexander GJM. Evidence for a link between hepatitis C virus infection and diabetes mellitus in a cirrhotic population. J Hepatol 1994; 21(6):1135-1139.

Zein NN, Abdulkarim AS, Wiesner RH, Egan KS, Persing DH. Prevalence of diabetes mellitus in patients with end-stage liver cirrhosis due to hepatitis C, alcohol, or cholestatic disease. J Hepatol 2000; 32(2):209-217.

Betterle C, Fabris P, Zanchetta R, Pedini B, Tositti G, Bosi E et al. Autoimmunity against pancreatic islets and other tissues before and after interferon-a therapy in patients with hepatitis C virus chronic infection. Diabetes Care 2000; 23(8):1177-1181.

Piquer S, Hernández C, Enriquez J, Ross A, Esteban JI, Genescá J et al. Islet cell and thyroid antibody prevalence in patients with hepatitis C virus infection: Effect of treatment with interferon. J Lab Clin Med 2001; 137(1):38-42.

Bartolomé J, Rodríguez-Iñigo E, Quadros P,et al, „Detection of hepatitis C virus in

thyroid tissue from patients with chronic HCV infection‖, J Med Virol. 2008 Sep;80(9):1588-94

Broussolle C, Steineur MP, Bailly F, Zoulim F, Trépo C., Hepatitis C virus infection and thyroid diseases, Rev Med Interne. 1999 Sep;20(9):766-73

209

Connie M. Chung; Julia R. Nunley, ―Overview of Hepatitis C and Skin‖, Dermatol Nurs. 2006;18(5):425-430.

Dervis E, Serez K. „The prevalence of dermatologic manifestations related to

chronic hepatitis C virus infection in a study from a single center in Turkey‖. Acta Dermatovenerol Alp Panonica Adriat. Sep 2005;14(3):93-8. [Medline]

Gisbert, J.P., Garcia-Buey, L., Pajares, J.M., & Moreno-Otero, R. (2003). Prevalence of hepatitis C virus infection in porphyria cutanea tarda: Systemic review and meta-analysis. Journal of Hepatology, 39, 620-627.

151. . Grossman ME, Bickers DR, Poh-Fitzpatrick MB, et al: Porphyria cutanea tarda. Clinical features and laboratory findings in 40 patients. Am J Med 1979 Aug; 67(2): 277-86

Kappas A, Sassa S, Galbraith RA, et al: The porphyrias. In: CR Scriver, et al, eds. The Metabolic Basis of Inherited Disease. New York: McGraw-Hill; 1995:2103-59.

Shiohara, T., & Kano, Y. (2003). Lichen planus and lichenoid dermatoses. In J.L. Bolognia, J.L. Jorizzo, & R.P. Rapini (Eds.), Dermatology (pp. 175-198). Philadelphia: Elsevier.

Boyd AS, Neldner KH. Lichen planus. J Am Acad Dermatol 1991;25:593-619.

Freedberg IM, Fitzpatrick, TB. Fitzpatrick's dermatology in general medicine. 5th ed. New York: McGraw-Hill, Health Professions Division, 1999. Variant Title: Dermatology in general medicine 2 v. (xxxi, 3002, 127 p.): ill.

Porter SR, Kirby A, Olsen I, Barrett W. Immunologic aspects of dermal and oral lichen planus: a review. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod 1997;83:358-66.

Grigoriu,G .Anemiile aplastice in Tratat de medicina interna, Hematologie, partea I, sub redactia Radu Paun, Ed. Medicala Bucuresti,1997,661-672

Iagoda AV, Koroĭ PV, „Thrombocytic dysfunctions and potentialities of their

differential correction in chronic viral hepatitis‖, Klin Med (Mosk). 2004;82(10):41-5

Chan H, Moore JC, Finch CN, et al: The IgG subclasses of platelet-associated autoantibodies directed against platelet glycoproteins IIb/IIIa in patients with idiopathic thrombocytopenic purpura. Br J Haematol 2003 Sep; 122(5): 818-24.

Cortelazzo S, Finazzi G, Buelli M, et al: High risk of severe bleeding in aged patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura. Blood 1991 Jan 1; 77(1): 31-3.

210

Crow AR, Lazarus AH: Role of Fc-γ receptors in the pathogenesis and treatment of

idiopathic thrombocytopenic purpura. J Pediatr Hematol Oncol 2003 Dec; 25 Suppl 1:

S14-8.

Mazzaro C, Zagonel V, Monfardini S, Tulissi P, Pussini E, Fanni M et al. Hepatitis C virus and non-Hodgkin's lymphomas. Br J Haematol 1996; 94(3):544-550.

Matsuo K, Kusano A, Sugumar A, Nakamura S, Tajima K, Mueller NE. Effect of hepatitis C virus infection on the risk of non-Hodgkin’s lymphoma: a meta-analysis of epidemiological studies. Cancer Sci. 2004;95:745–52.

Pioltelli P, Gargantini L, Cassi E, Santoleri L, Bellati G, Magliano EM et al. Hepatitis C virus in non-Hodgkin's lymphoma. A reappraisal after a prospective case-control study of 300 patients. Am J Hematol 2000; 64(2):95-100.

Ellenrieder V, Weidenbach H, Frickhofen N, Michel D, Prümmer O, Klatt S et al. HCV and HGV in B-cell non-Hodgkin's lymphoma. J Hepatol 1998; 28(1):34-39.

Hausfater P, Cacoub P, Sterkers Y, Thibault V, Amoura Z, Nguyen L et al. Hepatitis C virus infection and lymphoproliferative diseases: Prospective study on 1,576 patients in France. Am J Hematol 2001; 67(3):168-171.

Ohsawa M, Shingu N, Miwa H, Yoshihara H, Kubo M, Tsukuma H et al. Risk of non-Hodgkin's lymphoma in patients with hepatitis C virus infection. Int J Cancer 1999; 80(2):237-239.

Collier JD, Zanke B, Moore M, Kessler G, Krajden M, Shepherd F et al. No association between hepatitis C and B-cell lymphoma. Hepatology 1999; 29(4):1259-1261.

King PD, Wilkes JD, Diaz-Arias AA. Hepatitis C virus infection in non-Hodgkin's lymphoma. Clin Lab Haematol 1998; 20(2):107-110.

Hassoun Z, Willems B, Deslauriers J, Nguyen BN, Huet PM. Assessment of fatigue in patients with chronic hepatitis C using the Fatigue Impact Scale. Dig Dis Sci 2002;47(12):2674-81.

Poynard T, Cacoub P, Ratziu V, Myers RP, Dezailles MH, Mercadier A, et al. Fatigue in patients with chronic hepatitis C. J Viral Hepat 2002;9(4):295-303.

Wessely S, Pariante C. Fatigue, depression and chronic hepatitis C infection. Psychol Med 2002;32(1):1-10.

Dwight MM, Kowdley KV, Russo JE, Ciechanowski PS, Larson AM, Katon WJ. Depression, fatigue, and functional disability in patients with chronic hepatitis C. J Psychosom Res 2000;49(5):311-7.

211

McDonald J, Jayasuriya J, Bindley P, Gonsalvez C, Gluseska S. Fatigue and psychological disorders in chronic hepatitis C. J Gastroenterol Hepatol 2002;17(2):171-6.

Obhrai J, Hall Y, Anand BS. Assessment of fatigue and psychologic disturbances in patients with hepatitis C virus infection. J Clin Gastroenterol 2001;32(5):413-7.

Roux CH, Brocq O, Breuil V, et al. Safety of anti-TNF alpha therapy in rheumatoid arthritis and spondylarthropathies with concurrent B or C chronic hepatitis. Rheumatology (2006) 45:1294–7.

Zuckerman E, Yeshurun D, Rosner I. Management of hepatitis C virus-related arthritis. BioDrugs 2001;15:573–84.[Medline]

Wai C.T., Greenson J.K., Fontana R.J., et al. A simple noninvasive índex can predict both significant fibrosis and cirrhosis in patients with chronic hepatitis C. Hepatology 2003;38:518-26.

Ishak K, Baptista A, Bianchi L, et al. Histological grading and staging of chronic hepatitis. J Hepatol 1995; 22: 696-9.

Menghini G. One-second needle biopsy of the liver. Gastroenterology 1958;35:190-195

Neil D Theise, ―Liver biopsy assessment in chronic viral hepatitis: a personal,

practical approach‖, Modern Pathology (2007) 20, S3–S14.

Lebrec D. Various approaches to obtaining liver tissue: choosing the biopsy technique. J Hepatol 1996;25(Suppl 1):20-24

Colloredo G, Guido M, Sonzogni A, Leandro G. Impact of liver biopsy size on histological evaluation of chronic viral hepatitis: the smaller the sample, the milder the disease. J Hepatol 2003; 39:239-44.

Friedman SL. Liver fibrosis—from bench to bedside. J Hepatol 2003;38:S38-S53

Gondal, R, ―Evaluating liver disease in chronic viral hepatitis: indication and role of

liver biopsy‖, Journal of Gastroenterology and Hepatology, Volume 19, Supplement 7, December 2004 , pp. S338-S341(1)

Afdhal NH. Diagnosing fibrosis in hepatitis C: is the pendulum swinging from biopsy to blood tests? Hepatology 2003;37:972-974

Buckley A, Petrunia D. Practice guidelines for liver biopsy. Canadian Association of Gastroenterology. Can J Gastroenterol 2000;14:481-482

212

188. H. Schmilovitz-Weiss; A. Tovar; M. Halpern;‖ Predictive Value of Serum Globulin Levels for the Extent of Hepatic Fibrosis in Patients With Chronic Hepatitis B Infection‖, J Viral Hepat. 2006;13(10):671-677

189. SCHMILOVITZ-WEISS Hemda ,COHEN Michal , „Serum globulin levels in predicting the extent of hepatic fibrosis in patients with recurrent post-transplant hepatitis C infection ―,Clinical transplantation ISSN 0902-0063, 2007, vol. 21, no3, pp. 391-397

Vasei M, Monabbati A, Alizadeh-Naeeni M, Houshmand S,‖ Immunoglobulin and

complement depositions in the liver of chronic hepatitis patients‖, Hepatogastroenterology. 2008 May-Jun;55(84):1066-70

S Shantha, SP Thyagarajan,‖ Correlation of autoimmune reactivity with hepatitis B and C virus (VHB and HCV) infection in histologically proven chronic liver diseases‖,

Official Publication of Indian Association of Medical Microbiologists , 2002 Volume :

20 , Issue : 1, page : 12-15

Mathurin P, Moussalli J, Cadranel JF, et al. Slow progression rate of fibrosis in hepatitis C virus patients with persistently normal alanine transaminase activity. Hepatology 1998; 27: 868-72

Zechini B, Pasquazzi C, Aceti A,‖ Correlation of serum aminotransferases with HCV RNA levels and histological findings in patients with chronic hepatitis C: The role of

serum aspartate transaminase in the evaluation of disease progression‖. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2004;16:891–896.

Puoti C, Castellacci R, Montagnose F, et al. Histological and virological features and follow up of hepatitis C virus carriers with normal aminotransferase levels: the Italian prospective study of the asymptomatic C carriers (ISACC). J Hepatol 2002; 37: 117-23.

Michael Shim, Steven-Huy B Han, ―Extrahepatic manifestations of chronic hepatitis B‖, Hepatitis B Annual Kalinga Gastroenterology Foundation, 2006, vol3, issue 1,

p:128-154

Wu CH, Xu XY, Tian GS, Yu YY, ―Serum autoantibodies of patients with chronic

hepatitis C and the significance thereof in infection of hepatitis C virus‖, Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2006 Feb 14;86(6):390-3

Eman Sh. Al-Obeidy, Nawal M. Al-Khalidi, ― A comparison of the prevalence of autoantibodies in individuals with chronic hepatitis C and those with autoimmune

hepatitis‖, IJGE Issue 6 Vol 1 2006, p 49-53

213