Cursuri Bm 1 2 3 [616538]

BIOTEHNOLOGII
CU APLICAȚII ÎN MEDICINĂ

Definirea obiectului de studiu al BAM
•Biotehnologiile cu aplicații în medicină (BAM) au
drept principal obiectiv de studiu:
•Optimizarea modalităților de utilizare a virusurilor
și a microorganismelor, precum și a componentelor
acestora pentru elaborarea și aplicarea procedeelor
necesare diagnostic ării, profilaxiei și terapiei
maladiilor umane
•Produsele obținute prin aplicarea BAM au trei ținte
principale:
•1 – diagnosticarea maladiilor umane grave
•2 – profilaxia (prevenirea) acestor maladii umane
•3 – terapia specifică maladiilor umane

Diagnosticarea maladiilor umane
•Un obiectiv major al unui test de diagnosticare este
acela de a determina prezența unei maladii, cât mai
curând posibil, înainte de a progresa semnificativ, pentru
a se asigura eficiența tratamentului.
•Testele de diagnosticare sunt utilizate pentru:
-a prevedea susceptibilitatea la o boală sau
răspunsul la un tratament
-a determina prognosticul bolii (progres și rezultat)
-a monitoriza eficacitatea tratamentului

•Un test de diagnosticare trebuie să aibă:
-o specificitate ridicată pentru molecula țintă sau
agentul patogen (adică câteva rezultate false pozitive)
ce se presupune că determină o anumită stare de boală,
– o sensibilitate ridicată pentru detectarea unor niveluri
scăzute ale țintei (adică, puține rezultate false negative)
– rapiditate și cost scăzut pentru aplicare de rutină și
pentru obținerea de performanțe ridicate ale analizei
efectuate.
Sunt de preferat testele neinvazive care pot detecta o
moleculă țintă sau un agent patogen în fluidele corpului
uman, cum ar fi sânge, urină, spută sau puroi de la o
rană.
Cu toate acestea, multe tehnici sunt disponibile pentru a
detecta molecula țintă în țesuturi prelevate doar prin
biopsie.

Testele moleculare de diagnosticare
•Testele moleculare de diagnosticare detectează
biomarkeri moleculari ai unei anumite maladii .
•Un biomarker al bolii este o moleculă specifică a
carei prezență a fost detectată la niveluri mai mari sau
mai mici, în țesuturile bolnave, comparativ cu țesuturile
sănătoase sau poate fi un indicator al prognosticului bolii
sau un răspuns specific al un anumit tip de terapie .
Poate fi o proteină, o secvență specifică de ADN sau
ARN sau o moleculă mică de metabolit .
•Anumite molecule specifice pot fi analizate calitativ
sau cantitativ în probe de urină, ser, sânge sau țesut .
Probele care conțin o cantitate mică din molecula țintă,
cum sunt probele de biopsie sau probele de sânge, pot
necesita o amplificare a țintei pentru detectare precisă

•Testele de diagnostic diagnostic molecular sunt
disponibile în prezent pentru a detecta agenții etiologici
ai anumitor infecții sau ai unor maladii genetice. Acestea
din urmă pot fi tulburări determinate de o singură genă,
cum ar fi fibroza chistică, sau tulburări complexe
multigenice, de tipul bolii Alzheimer.
•Deși mulți biomarkeri au fost identificați clinic,
biomarkerii relevanți nu sunt, încă, bine definiți pentru
majoritatea bolilor umane.
•Eterogenitatea complexă a probelor clinice poate
prezenta, de asemenea, o provocare pentru diagnosticul
molecular, iar anumite metode, precum microdisecția
țesuturilor, sunt utilizate pentru a crește puritatea
probelor de analiză.

Detectarea biomarkerilor proteici ai
maladiilor umane
•Proteinele joacă un rol critic în toate procesele
celulare, inclusiv în metabolism, comunicare, apărare,
reproducere, transport și motilitate. Proteinele cu rol
reglator mențin controlul strict asupra producției de
proteine ​​pentru a se asigura că celulele funcționează
normal. Dereglarea acestor procese în țesutul bolnav
este reflectată în modificări ale compoziției proteinei sau
ale nivelurilor de proteine ​​specifice.
•Schimbările caracteristice ale proteinelor au fost
utilizate pe scară largă pentru a diagnostica starea de
boală, fie prin detectarea existenței lor și măsurarea
nivelului specific de biomarkeri proteici sau prin
determinarea profilurilor proteinelor în bolile poligenice.

•Există mai multe avantaje pentru utilizarea proteinelor
ca biomarkeri de diagnosticare a stării de de boală.
Niveluri anormale ale expresiei genelor, ca o consecință
a mutațiilor asociate bolii, sunt cuantificate mai precis
prin măsurare directă, decât prin măsurarea nivelelor de
ARNm, care nu se corelează cu nivelurile de proteine
•Proteinele din țesuturile bolnave pot prezenta nereguli
în modificarea posttranslațională care nu pot fi detectate
utilizând acizi nucleici. În plus, multe boli sunt o
consecință a alterării conformației spațiale a proteinelor
(de ex.: boli prionice și unele boli neurodegenerative).
•Se pot produce anticorpi care se leagă la proteinele
țintă cu un nivel ridicat de afinitate și specificitate și, prin
urmare, abordările imunologice îndeplinesc criteriile de
sensibilitate, specificitate și simplitate pentru testele de
diagnosticare.

•Aglutinarea este o metodă simplă, ieftină, rapidă și
foarte specifică de testare imunologică, efectuată pe
scară largă în laboratoarele de diagnosticare.
•Spre exemplu, această metodă este adesea folosită
pentru testarea probelor de sânge uman pe baza
prezenței antigenelor specifice pe suprafața celulelor
roșii din sânge, care variază în rândul indivizilor.
•Antiser conținând anticorpi împotriva antigenului de
suprafață A sau B este amestecat cu celule roșii din
sânge.
•Aglutinarea ( Clumping ) indică prezența antigenului
Unele persoane produc doar antigen A (tip A de sânge),
care aglutinează cu antiser anti -A, dar nu cu antiser anti –
B. Persoanele cu sânge de tip B produc numai antigenul
B, care reacționează cu antiserul anti -B și nu cu
antiserul anti -A

•Alți indivizi umani au ambele antigene (tip de sânge
AB) sau nici unul (tip de sânge O). Probele de sânge
de la persoane cu sânge tip O, cel mai frecvent tip de
sânge, nu produc un rezultat pozitiv de aglutinare cu
antiser.
•Acest test, denumit hemaglutinare , este important
pentru a determina ce tip de sânge, destinat utilizării
în transfuzii, ca anticorpi naturali împotriva antigenelor
nespecifice celulelor roșii din sânge, ar distruge
sângele introdus.
•În unele teste de aglutinare, antigenul sau anticorpul
utilizat pentru a detecta fie un anticorp specific, fie un
antigen, în eșantioanele pacientului sunt folosite
pentru a acoperi suprafața margelelor de latex mici.

Testele de imunosorbție cu enzimă legată
(ELISA)
•Testele de imunosorbție cu enzimă legată (ELISA)
sunt utilizate pe scară largă pentru diagnosticarea
bolilor umane, incluzând diverse forme de cancer, boli
autoimune, alergii și boli infecțioase.
•Un test ELISA măsoară antigeni sau anticorpi produși
împotriva unui antigen într -o probă clinică din sânge,
urină sau țesuturi. Se bazează pe interacțiunea
specifică și de înaltă sensibilitate dintre un anticorp și
un antigen și este un test sensibil, care poate fi utilizat
pentru detectarea rapidă și pe scară largă (adică, un
test cu un randament ridicat). Detecția se bazează pe
activitatea unei enzime care este covalent legată de
un anticorp folosit în analiză.

•Un test ELISA indirect poate detecta prezența
anticorpilor specifici în serul pacientului care indică
răspunsul imun la prezența unei proteine sau a unui
agent patogen specific.
Într-un test ELISA indirect, utilizat pentru diagnosticare,
un antigen standardizat este legat de un suport solid, de
obicei suprafața unui godeu, în placa de microtitrare.
Proba de ser a pacientului este introdusă în godeul plăcii
de microtitrare, iar anticorpii primari specifici din ser se
leagă la antigenii imobilizați. Se adaugă un anticorp
secundar care se leagă specific la anticorpul primar.
•Deoarece anticorpul primar este prezent în serul
uman, anticorpul secundar este un anticorp
imunoglobulinic anti -uman care a fost generat în corpul
unui animal (ex. o capră), prin injectarea animalului cu
imunoglobulină umană.

•Anticorpul secundar este legat covalent (conjugat) la o
enzimă, cum este fosfataza alcalină sau peroxidaza
din rădăcină de hrean, care catalizează conversia
unui substrat incolor într -un produs colorat.
•Se aplică un substrat incolor și apoi se formează de
către enzimă un produs colorat care indică prezența
anticorpului secundar și, prin urmare, complexul
primar anticorp -antigen.
•Un test ELISA tip sandwich detectează prezența
unui antigen specific într -o probă prelevată de la
pacient și, prin urmare, este uneori menționată ca un
test de capturare a antigenului.
•Spre deosebire de o metodă ELISA indirectă, un test
ELISA tip sandwich detectează direct un antigen
specific într -o probă clinică complexă.

•Pentru captarea antigenului, un anticorp monoclonal
care este specific pentru antigenul țintă este în primul
rând legat de suprafața unei plăci de microtitrare.
•Un test ELISA tip sandwich detectează prezența unui
antigen specific într -o probă prelevată de la pacient și,
prin urmare, este uneori menționată ca un test de
capturare a antigenului.
•Testul ELISA tip sandwich constituie baza pentru
numeroase teste diagnostice, inclusiv testul de sarcină
la domiciliu.
•

Analiza proteinelor asociate cu diferite maladii
prin testul ELISA tip sandwich
•Cancerul ovarian este o boală devastatoare care
ucide peste 15 000 de femei pe an în Statele Unite.
Mai mult de 22.000 de cazuri noi sunt diagnosticate
fiecare an, cel mai mult într -un stadiu avansat, când
rata de supraviețuire este mai mică de 20%.
•Un imunotest utilizat pe scară largă pentru a
monitoriza evoluția și recurența carcinomului ovarian
măsoară nivelurile de proteină CA125 în ser.
•CA125 este o glicoproteină cu greutate moleculară
ridicată care este prezentă la niveluri mai înalte în
•50% dintre femeile cu cancer ovarian comparativ cu
femeile sănătoase.

•Niveluri crescute pot fi decelate, de asemenea, la
femeile cu afecțiuni pulmonare, pancreatice, de sân,
cervicale, și cancere colorectale, precum și cu tulburări
noncanceroase, cum ar fi bolile inflamatorii pelviene,
tulburări hepatice și chisturi ovariene nonmaligne.
•Deoarece proteina CA125 poate indica și alte tulburări
fără valori ridicate la pacientele cu cancer ovarian, în
special în stadiile incipiente ale bolii, când tumorile sunt
mici și, prin urmare, secretă doar nivele scăzute ale
proteinei, nu este recomandată determinarea acestei
proteine ca un test de screening.
•Mai degrabă, acest test este folosit în mod obișnuit
pentru monitorizarea răspunsului unui pacient la
tratament. Cercetătorii încearcă să identifice alți
biomarkeri care sunt cu specificitate înaltă pentru
cancerul ovarian.

Diagnosticarea bolilor autoimune
prin testul ELISA indirect
•Afecțiunile autoimune apar atunci când sistemul
imunitar al organismului nu recunoaște moleculele și
structurile celulare normale ca fiind „proprii", ci mai
degrabă produce anticorpi (autoanticorpi) care distrug
acele ținte. Au fost identificate mai multe boli
autoimune, inclusiv boala celiacă, diabetul de tip 1,
lupusul eritematos și artrita reumatoidă.
•S-au elaborat teste ELISA indirecte pentru a
diagnostica unele boli autoimune.
•În aceste teste, autoanticorpii produși împotriva unei
auto-proteine sunt detectați în probele de sânge ale
pacientului.

•Artrita reumatoidă este o boală autoimună având ca
rezultat inflamația cronică, sistemică a articulațiilor, în
principal, a articulațiilor (flexibile) sinoviale.
•Membrana sinovială care îmbracă articulațiile secretă
un fluid care lubrifiază oasele articulare.
•Inițial, un răspuns inflamator apare în membranele
sinoviale în articulațiile mici ale mâinilor și picioarelor;
apare apoi în îmbinări mai mari, provocând acumularea
în exces de fluid și afectarea articulațiilor.
•Inflamația sistemică poate deteriora anumite organe,
cum ar fi inima și plămânii. Boala afectează aproximativ
1% din populația Statele Unite.

•Factorul reumatoid este un autoanticorp care
vizează regiunea Fc din imunoglobulină G (IgG) și
contribuie la artrită reumatoidă.
•Este utilizat în mod obișnuit ca biomarker de
diagnosticare pentru a se diferenția poliartrita
reumatoidă de alte forme de artrită și de alte condiții
inflamatorii. Pentru a detecta prezența sa a fost
elaborată o metodă ELISA indirectă pentru determinarea
factorului reumatoid în probele de sânge ale pacientului.
În acest test, moleculele IgG, de obicei de la un iepure,
sunt antigenul standardizat legat de suprafață al unei
plăci multigodeu, iar serurile diluate prelevate de la
pacienți sunt aplicate în godeuri.

•După incubare, pentru a permite legarea factorului
reumatoid din ser la moleculele IgG de iepure și
spălare pentru a îndepărta moleculele nelegate, se
adaugă un anticorp IgG anti -uman.
•Anticorpul IgG anti -uman, în mod specific, țintește
factorul reumatoid (și nu IgG de iepure) și este
conjugat cu o enzimă cum ar fi peroxidază de hrean
pentru detectarea prin colorimetrie.
•Au fost dezvoltate alte teste ELISA care vizează
factorul reumatoid IgM și IgA care pot ajuta la
diagnosticarea corectă a artritei reumatoide.
•Diagnosticarea precoce este importantă pentru a
preveni deteriorarea articulațiilor ireversibile, deoarece
artrita reumatoidă poate fi tratată în primele etape prin
administrarea de medicamente antireumatice.

Imunoteste pentru boli infecțioase
•Laboratoarele clinice identifică deseori agenții
patogeni în eșantioanele prelevate de la pacienți, pe
baza caracteristicilor lor fiziologice sau biochimice.
•De exemplu, o bacterie patogenă poate fermenta
specific carbohidrații sau produce enzime specifice, iar
detectarea produselor acestor reacții este baza pentru
unele teste de diagnosticare. În timp ce aceste metode
sunt eficiente, ele necesită, totuși creșterea și izolarea
agentului patogen și, prin urmare, sunt mai lente decât
metodele imunologice și alte metode moleculare, ce
necesită mai mult de 48 de ore. Unii agenți patogeni
umani, cum ar fi bacteria intracelulară Chlamydia
trachomatis , sunt pretențioși și nu cresc bine în culturile
de laborator.

•Virusurile se propagă numai în celulele gazdă și nu
pot fi identificate utilizând caracteristici metabolice.
•Metode de detectare imunologică, cum ar fi analizele
de aglutinare și testele ELISA elimină necesitatea de a
crește patogenul în cultură și poate fi utilizată pentru a
detecta specific agenți patogeni virali, bacterieni, fungici
în fluide și țesuturi corporale. Deoarece abordările
bazate pe anticorpi detectează un antigen țintă cu
specificitate ridicată și sensibilitate, acestea sunt foarte
potrivite pentru a distinge un agent patogen specific de
celelalte sute de microbi care sunt în mod normal
prezente în unele țesuturi umane.
•Testele imunologice pentru boala infecțioasă pot viza
proteinele produse de un agent patogen sau pot detecta
prezența anticorpilor produși împotriva agentului
patogen.

Matrice de proteine pentru detectarea bolilor
poligenice
•Un test ELISA măsoară de obicei o singură proteină
țintă; totuși, pentru unele diagnostice, investigarea
proteinelor țintă multiple într -un singur test poate fi mai
mult informativă.
•Analiza proteomilor este frecvent utilizată în
cercetarea, identificarea și cuantificarea modificărilor
proteinelor în țesutul bolnav față de cel normal și este
utilă pentru diagnosticarea bolilor poligenice (care
rezultă din mutații ale mai multor gene), cum ar fi
cancerul de sân, boala Alzheimer, diabetul zaharat de
tip 1 și bolile cardiovasculare.

•Micromatricele proteice sunt imunoteste multiple care
pot detecta biomarkeri multipli într -o probă clinică.
Biomarkerii pot fi subseturi de proteine din probele
clinice complexe, cum ar fi țesutul tumoral biopsizat.
•În prezent, micromatricele proteice disponibile
comercial sunt cel mai frecvent utilizate pentru a
detecta anticorpi în ser de la pacienții care suferă de
alergii, boli autoimune sau infecții.
•Aproximativ 25% din populația țărilor industrializate
suferă de la alergii de tip I, care sunt hipersensibilitate
imediată mediată de IgE, cum ar fi: astmul, febra
fânului și eczemele. La persoanele predispuse la
febră, prima expunere la un alergen provoacă
producția de niveluri ridicate de anticorpi IgE care se
leagă de celulele mastocitare.

•În acest fel, individul devine sensibilizat la alergen.
•La expunerile ulterioare, alergenul reacționează cu
IgE legat de celulele mastocite și provoacă legături
între moleculele IgE adiacente, stimulând astfel
eliberarea inflamatorie de mediatori, cum ar fi
histamina, leucotrienele, prostaglandinele și factorul
de necroză tumorală.
•Aceste substanțe biochimice stimulează contracția
musculară netedă și dilatarea capilarelor care
determină edem (umflare), mâncărime și dezvoltarea
unei erupții cutanate.

Biotehnologii de modificare genetică a
organismelor
•Biotehnologia moleculară utilizează o varietate de
tehnici pentru izolarea și transferul genelor de la un
organism la altul. La baza acestor tehnici se află
capacitatea de a se insera o secvență de ADN de
interes într -un vector , care poate fi introdusă într-o celulă
gazdă adecvată. Acest proces este denumit tehnologia
ADN recombinant sau clonarea moleculară .
•Începutul aplicării acestor tehnologi i de manipulare a
ADN -ului a fost creditat lui Stanley Cohen de la
Universitatea Stanford, California, care a dezvoltat
metode de transfer al plasmide lor în celule bacteriene ,
precum și lui Herbert Boyer de la Universitatea
California din San Francisco, care lucra cu enzime de
restricție , care „taie” ADN la secvențe nucleotidice
specifice.

•Ei au emis ipoteza că enzimele descoperite de Boyer
ar putea fi folosite pentru a introduce un segment
specific de ADN într-o plasmidă și apoi plasmida
recombinantă ar putea fi introdusă într -o gazdă , cum ar
fi Escherichia coli , folosind metoda Cohen.
•În câțiva ani, metoda a fost utilizat ă cu succes pentru
a produce insulină umană, utilizată în tratamentul
diabetului. În cei 25 de ani de la prima comercializare a
producției de insulină umană recombinantă, peste 200
de medicamente noi produse prin tehnologia ADN
recombinant au fost folosite pentru a trata peste 300 de
milioane de persoane pentru boli, cum ar fi cancerul,
scleroza multiplă, fibroza chistică și boli cardiovasculare
și pentru a asigura protecție împotriva bolilor infecțioase.
•Peste 400 de medicamente noi sunt în curs de testare
pentru a trata o varietate de boli umane grave.

Clonarea moleculară a ADN
•Clonarea moleculară a ADN reprezintă procesul de
construire a unor molecule de ADN hibride (himere)
prin inserție de informație genetică străină într -un
vector (vehicul) adecvat, capabil să se replice
independent.
•Hibridul molecular respectiv este utilizat pentru a
transforma celulele bacteriilor receptoare (gazda
obișnuită a experimentelor de clonare).
•Pentru integrarea fragmentelor de ADN străin în vector
se pot folosi mai multe variante experimentale, ce
presupun sau nu prelucrarea " in vitro " a fragmentului
de ADN dorit, după care se realizează legarea
covalentă a acestor fragmente cu ajutorul ADN –
ligazelor.

•Pentru obținerea moleculelor de ADN hibride au fost
imaginate mai multe procedee
•Modalitatea cea mai simplă de incorporare este aceea
care utilizează fragmentele obținute cu enzimele de
restricție de tipul II , care clivează ADN la situsuri
specifice palindromice, producând capete monocatenare
complementare.
•Utilizând aceeași enzimă de restricție, atât pentru
clivarea ADN exogen, cât și a vectorului de clonare, se
obțin molecule hibride indiferent de proveniența ADN,
prin extremitățile monocatenare complementare identice
•Unirea inițială a segmentelor de restricție se face pe
bază de complementaritate, prin formarea legăturilor de
hidrogen la nivelul capetelor monocatenare, după care
amestecul se tratează cu ligază de fag T4, ce reunește
covalent moleculele respective

Metode de introducere a moleculelor de ADN
recombinant în celulele gazdă
•Menținerea și multiplicarea moleculelor de ADN
recombinant este condiționată de pătrunderea
lor într -o gazdă adecvată, în al cărei sistem
genetic să se integreze.
•Principala metodă utilizată pentru introducerea
moleculelor de ADN recombinant într -o celulă
gazdă este transformarea genetică.
•Transformarea genetică reprezintă transferul
de informație genetică, realizat prin intermediul
unei fracțiuni de ADN eliberată dintr -o celulă
donor, prin liză celulară și extracție chimică.

•Fenomenul natural a fost descoperit la bacterii de
către Griffith, în 1928.
•În principiu, sistemele bacteriene de transformare
genetică se împart în două grupuri:
–primul grup cuprinde acele sisteme biologice la
care capacitatea celulelor receptoare de a
reacționa cu ADN transformant este strâns
legată de o etapă fiziologică importantă, în care
se realizează starea de "competență“.
Această stare apare în timpul creșterii celulelor
într-un mediu special și se menține o perioadă
strict determinată.
Sistemele cel mai bine caracterizate din cadrul
acestui grup sunt reprezentate de Bacillus subtilis,
Diplococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae.

•Al doilea grup este reprezentat de acele organisme la
care competența este indusă artificial, prin
tratamente cu CaCl2 sau RbCl, cel mai bine studiat
fiind fenomenul de transformare de la E.coli .
•Procesul se realizează prin permeabilizarea
învelișurilor celulare în urma tratării bacteriilor cu
CaCl2 70-100mM, ceea ce suprimă bariera celulară
normală față de înglobarea ADN .
•Mecanismul transformării cu ADN plasmidial este
analog cu cel al transformării genetice cu ADN
cromozomal, dar există și unele diferențe.
•Astfel, atât la E.coli cât și la B.subtilis , transformarea
plasmidială este afectată de sistemul de restricție al
gazdei (ca și în cazul transfecției fagice). La B.subtilis ,
plasmidele de tip oligomer și nu cele monomere sunt
active în transformare

•După pătrunderea lor în celula gazdă (prin
fenomenul de transformare), moleculele de
ADN exogen se multiplică datorită sistemului
propriu de replicare.
•Ca urmare a replicării și prin amplificare,
fiecare moleculă recombinată dă naștere
unei clone moleculare, adică unei populații
omogene de plasmide sau fagi (în funcție de
vectorul utilizat) care propagă un segment
determinat de ADN.
•Spre deosebire de celulele natural competente,
bacteriile la care competența a fost indusă prin
tratament cu Ca2+ sunt capabile să preia atât
ADN monocatenar cât și dublu catenar .

•Aceasta înseamnă că ele pot fi transformate nu
numai cu ADN cromozomal linear, ci și cu ADN
plasmidial circular.
•Particularitatea celulelor de a deveni competente
prin tratament „ in vitro ” este foarte importantă
pentru experimentele de clonare moleculară sau
pentru aplicații ce necesită introducerea în celule
de ADN plasmidial sau fagic
•Atunci când se dorește introducerea în celule a
ADN viral (sau în anumite situații a ARN viral),
procesul este numit transfecție , rezultatul fiind
producerea de particule virale (fagi progeni) ce
determină apariția plajelor de liză.

•O situație specială apare în cazul anumitor
virusuri la care simpla transfecție a bacteriilor
cu ADN viral nu conduce la multiplicarea virală.
•Aceasta se datorează faptului că, în condițiile
infecției normale, odată cu genomul viral, în
celulele bacteriene este introdusă și o ARN –
polimerază virală care asigură transcrierea
genelor virale.
•In absența acestei ARN -polimeraze de origine
virală nu poate avea loc sinteza proteinelor
virale necesare multiplicării fagului, iar în final
nu se produc plajele de liză (dovada eficienței
infecției virale).

•Experimentele realizate în ultimii ani au
evidențiat faptul că, la numeroase
microorganisme, metoda transformării
genetice "clasice" (prin competență naturală
sau indusă) nu este posibil de aplicat.
•Tipurile de celule gazdă, acceptoare de ADN
exogen, s -au diversificat, astfel încât și
modalitățile de introducere a genelor de interes în
acestea au trebuit îmbunătățite.
•Dintre metodele noi de introducere în celulele
gazdă a moleculelor de ADN recombinat
menționăm: electrotransformarea,
microinjectarea, "bombardarea" celulelor cu
particule acoperite cu ADN etc.

•Electrotransformarea a fost descoperită pe
baza studiilor efectuate asupra celulelor
animale (hematii) supuse acțiunii câmpurilor
electrice și se bazează pe fenomenul
electroporării.
•Procesul de electroporare constă în
inducerea unei permeabilizări reversibile a
celulelor procariote sau eucariote, prin
utilizarea unui câmp electric.
•Atunci când o celulă este expusă într -un câmp
electric, componentele membranei devin
polarizate iar membrana este traversată de un
potențial electric.

•Dacă diferența de potențial depășește o valoare
prag, membrana se "rupe" în anumite zone, iar
celula devine permeabilă pentru molecule
exogene.
•Permeabilitatea indusă este reversibilă cu
condiția ca mărimea sau durata aplicării
câmpului electric să nu depășească o valoare
critică limită, pentru că altfel celula este afectată
ireversibil.
•Mecanismul electroporării nu este pe deplin
cunoscut. S -a stabilit experimental că diferența
de potențial necesară "ruperii" membranei și
formării porilor la eucariote este de 0,2 -2kV/cm,
porii rezultați având un diametru de 10 m.

La bacterii valoarea câmpului aplicat este mult mai
mare: 2 -25kV/cm, el variind în funcție de specie.
Diferențele apărute depind de factori, cum ar fi:
•compoziția membranei,
•temperatura de lucru,
•durata aplicării câmpului electric,
•specia testată.
Electrotransformarea este dependentă de:
•concentrația ADN transformant (eficiența
maximă de transformare se atinge cu 1 -5g
ADN/ml)
•dimensiunea moleculelor de ADN (moleculele
mai mici au eficiență mai mare de transformare)
•conformația moleculară a ADN (ADN
supraîncolăcit este mai eficient decât cel linear)

•Primele experimente de electroporare au fost
realizate cu celule animale (hematii), care sunt
lipsite de perete celular.
•Modelul experimental utilizat pentru acestea a
fost apoi aplicat și celulelor vegetale, levurilor și
bacteriilor, dar numai după ce peretele celular a
fost îndepărtat prin tratament enzimatic (deci
după convertirea celulelor la protoplaști).
•Cele mai multe rezultate, promițătoare de altfel,
au fost obținute la plante și la bacterii,
selectându -se clone recombinate ce conțin
vectori specifici.

•Metoda prezintă unele limitări ce depind de:
•sensibilitatea celulelor la tratamentul cu curent
electric (a celor lipsite de perete celular);
•barierele de restricție ale celulelor receptoare;
•posibila prezență în mediul de electroporare a
unor nucleaze nespecifice.
•O parte dintre aceste probleme au fost
rezolvate prin mai multe metode:
•metilarea ADN exogen,
•utilizarea unor molecule de ADN cu funcții de
cărăuș ("carrier DNA");
•folosirea unor inhibitori nucleazici etc.

•De asemenea, în ultima vreme în
experimentele de electroporare s -au folosit
celule intacte, la care perete celular nu a mai
fost îndepărtat.
•În cazul microorganismelor, au fost stabilite
condițiile optime de electrotransformare pentru
bacteriile Gram negative ( E.coli, Agrobacterium
tumefaciens ) (Potter, 1991), ca și pentru
anumite specii de drojdii.

•Microinjectarea este o metodă pentru
transferul de gene, relansată în ultimii ani, după
ce a fost inițial utilizată în experimente în anii
’40, prin folosirea unor micromanipulatoare noi.
•Primele rezultate semnificative de transfer de
gene prin utilizarea acestei tehnologii au fost
obținute abia prin anii ‘70, când s -a reușit
transplantarea unor nuclei din celule
diferențiate de amfibieni în celule ou enucleate.
•De asemenea, în 1974 s -au obținut șoareci
transformați (mozaicați) prin injectarea în celule
embrionare a ADN viral de SV40 (Jaenisch și
Mintz, 1974).

•Metoda este aplicabilă doar celulelor eucariote, ea
putând fi considerată ca o metodă de rutină în
cazul celulelor animale, în scopul obținerii de
animale transgenice .
•Eficiența obținerii de animale transgenice prin
această metodă este de 5 -15%, în funcție de
specia testată; cele mai bune rezultate fiind
înregistrate la șoareci și porci și mai slabe la vaci
și oi.
•Dintre descendenții organismelor transgenice,
numai aproximativ jumătate primesc și exprimă
gena de interes, deoarece exprimarea acesteia
depinde de locul unde s -a realizat integrarea în
genomul gazdei și de eficiența secvențelor
reglatoare însoțitoare.

•În cazul aplicării metodei microinjectării la plante sunt
necesare unele adaptări tehnice, cauzate de
particularitățile structurale ale celulelor vegetale
(prezența peretelui celular și a vacuomului).
•Cele mai multe rezultate au fost obținute cu protoplaști
vegetali evacuolați, prin introducerea fie a unor
cromozomi de la specii diferite, fie a unor vectori
derivați de la plasmida Ti de la Agrobacterium
tumefaciens .
•Tehnica microinjectării la plante permite obținerea de
clone transgenice din protoplaști sau himere
transgenice din proembrioni derivați din microspori.
Prin această metodă doar o celulă primește ADN de
interes.

•Avantajele aplicării acestei metode la plante ar
putea fi următoarele:
•cantitatea de ADN introdusă într -o celulă poate
fi optimizată;
•se poate decide care celulă va primi ADN;
•introducerea ADN poate fi urmărită la
microscop;
•celulele microinjectate pot fi reluate cu
ușurință, cultivate și apoi multiplicate pe medii
specifice, din ele regenerându -se organisme
întregi, transgenice, obținându -se în acest fel
clone .

Reprezentarea schematică a procesului de microinjectare a ADN de interes
în celulele vegetale

•Metoda biolistică constă în "bombardarea"
celulelor țintă cu particule acoperite cu ADN.
Metoda a fost elaborată de Klein și colab.
(1987) fiind aplicată, de obicei, celulelor
vegetale intacte.
•Principul metodei este următorul: ADN de
interes este depus pe suprafața unor particule
de tungsten sau aur (cu un diametru de
aproximativ 1μm), prin precipitare cu CaCl2,
acestea constituind "gloanțele".
•Particulele astfel pregătite sunt introduse într -un
dispozitiv special, numit "pușcă"

Reprezentarea schematică a dispozitivului utilizat pentru introducerea
unor particule "învelite" cu ADN de interes direct în celula țintă

•Particulele cu ADN sunt apoi împinse de
macroproiectil, dobândind o viteza mare; trec
prin orificiul de la nivelul dispozitivului de
reținere și lovesc ținta.
•Metoda are o serie de avantaje și o
aplicabilitate largă în cazul celulelor eucariote:
•este ușor de realizat, cu condiția existenței în
laborator a dispozitivului specific;
•printr -o singură "lovitură" se poate asigura
transferul genelor de interes în mai multe
celule;
•genele aflate la suprafața particulelor își mențin
activitatea biologică;

•celulele țintă pot fi foarte variate (polen, celule
de calus, meristeme), ele putând supraviețui
după "bombardarea" cu microproiectile;
•permite introducerea de gene la nivelul unor
organe, atât la suprafața lor cât și în
profunzime;
•metoda depinde doar de parametri fizici ce pot
fi optimizați în funcție de materialul biologic
folosit sau de scopul urmărit în experiment.
•Prin utilizarea unei asemenea metode se pot
introduce gene nu numai în nucleul celulei țintă,
ci chiar și în organitele celulare (exemplu, în
cloroplaste), ceea ce înseamnă că se poate
asigura o exprimare specifică a ADN transferat.

•In varianta originală, metoda electroforetică
presupune utilizarea unui sistem special în care
embrionul vegetal este plasat între doi electrozi,
într-o cameră electroforetică speciala.
•Catodul este conectat cu o pipetă subțire ce
conține ADN inclus într -o cantitate mică de agar
•Pipeta atinge embrionul vegetal, la nivelul
meristemului apical.
•Embrionul este atins la extremitatea bazală de
o a doua pipetă, ce conține tampon specific, ea
fiind conectată cu anodul.
•Electroforeza se realizează timp de o oră, la un
curent de 0,1mA și 2 -10V/cm, sensul de
migrare fiind de la catod la anod.

•Evidențierea prezenței genei de interes la nivelul
embrionului se realizează după electroforeză, prin
utilizarea de ADN marcat (prin hibridizare " in situ ").
•Eficiența metodei este influențată de anumiți factori
fizici asociați cu țesutul vegetal, precum și de factori
chimici cum ar fi: valoarea pH, cationii divalenți,
compoziția tamponului de electroforeză.
•Există și alte metode de transfer direct de gene:
•transformarea polenului sau injectarea ADN în sacii
polinici;
•macroinjectarea, care constă în introducerea ADN la
nivelul unor țesuturi conducătoare de la baza
meristemului floral imatur (ex. la secară);
•utilizarea microlaserului pentru a produce "găuri" în
peretele celular și membrana plasmatică prin care să
poată pătrundă moleculele de ADN.

•Moleculele de ADN recombinant purtătoare de
informație genetică nouă vor asigura proprietăți
noi celulelor receptoare, indiferent de metoda
utilizată pentru introducerea ADN de interes în
celulele gazdă.
•Aceste noi proprietăți se transmit
descendenților, putându -se menține stabil de -a
lungul generațiilor, oferindu -se astfel
posibilitatea multiplicării, după dorință, a noii
informații genetice.

Metode de detecție și selecție a clonelor
recombinate
•Una dintre etapele esențiale ale tehnologiei
ADN recombinant este reprezentată de
detectarea și selecția celulelor gazdă
transformate, adică a celor ce conțin fragmentul
de ADN dorit.
•Această etapă este foarte dificil de realizat dar
absolut necesară, mai ales în cadrul
experiențelor de tip "shotgun" prin care se
clonează o populație mare de fragmente
heterogene (a unor fragmente de ADN genomic
sau a ADNc).

•Selecția clonelor ce conțin vectorul recombinat
se face pe mediu selectiv ce conține un
antibiotic sau prin metode histochimice
(exemplu testul Xgal).
•Rezultă astfel o colecție de fragmente de ADN
genomic, propagate de obicei într -o bacterie
(E.coli ), ceea ce constituie o "bancă" sau
"bibliotecă" de gene.
•De remarcat însă că, această bancă de gene
conține o gamă foarte variată de clone, astfel
că se pune problema selecției acelor celule,
respectiv colonii, care conțin ADN de interes.

•Selectarea clonelor recombinate și, prin urmare, a
genelor de interes se poate realiza prin utilizarea unor
metode variate care au fost grupate în trei categorii
principale: metode microbiologice, genetice și
imunochimice, ele presupunând:
•utilizarea unor "sonde" de ADN sau ARN
complementare secvenței de interes;
•selectarea produsului genei clonate prin folosirea
anticorpilor anti -proteina respectivă;
•utilizarea unor teste de evidențiere a activității
proteinei de interes;
•amplificarea prin PCR a secvenței clonate și analiza ei
prin subclonare;
•determinarea secvenței de nucleotide sau modificarea
acesteia prin mutageneza la situs -specific etc.

1 – Metode microbiologice
de selecție a clonelor recombinate
•Aceste metode sunt dintre cele mai simple deoarece
se bazează pe evidențierea indirectă a ADN
recombinant prin detectarea prezenței unui marker
genetic, cum ar fi dobândirea sau pierderea rezistenței
la un anumit antibiotic.
•Se mai poate utiliza și detectarea apariției unei noi
proprietăți ce este codificată de gena străină, inserată
în vector, cum ar fi o necesitate nutritivă pentru un
anumit compus chimic ce trebuie introdus în mediul de
cultivare al microorganismelor respective

2 – Metode imunochimice
de selecție a clonelor recombinate
•Pentru identificarea și izolarea celulelor care conțin
vectori cu ADNc de origine eucariotă se poate folosi
capacitatea acestora de a determina sinteza în E.coli
a unor molecule proteice funcționale.
•Pentru a simplifica evidențierea acestora se folosesc
anticorpi specifici proteinelor de interes, marcați de
obicei radioactiv.
•Identificarea și analiza produsului sintetizat de clonele
recombinate este deosebit de importantă, deoarece
numai pe baza lor se poate stabili succesul sau
insuccesul experimentului.

•De asemenea, pentru a demonstra existența
într-o anumită probă a produsului unei gene de
interes se poate folosi și una dintre variantele
testului de imunosorbție cu enzimă legată
ELISA (“ Enzyme Linked Immunosorbent
Assay ”), al cărui principiu este asemănător celui
ce folosește anticorpi marcați radioactiv (test
RIA), numai că se utilizează marcarea
biochimică în locul celei radioactive

Reprezentarea schematică a detectării produșilor de interes,
sintetizați de clonele recombinate, prin utilizarea metodei imunochimice

3 – Metode genetice
de selecție a clonelor recombinate
•Acestea permit detectarea cu mare sensibilitate și
eficiență a genelor incorporate în vectorii de clonare.
•Se utilizează teste de hibridare în care identificarea
coloniilor bacteriene sau a plajelor de liză ce poartă
genele dorite se face cu ajutorul „sondelor"
moleculare.
•Coloniile sau plajele de liză supuse analizei sunt
reluate pe filtre de nitroceluloză sau membrane de
nylon și apoi incubate cu proba de ADN sau ARN (sau
cu anticorpi specifici)

Selecția clonelor recombinate (plaje de liză) prin utilizarea "sondelor"
moleculare
A – placa cu plajele de liză ce vor fi analizate; B – filtru de nitroceluloză; C –
filtrul de nitroceluloză pe care s -au adsorbit fagii din plajele de liză; D – soluție
ce conține sonda de ADN marcat cu 32P. 1 – acoperirea plăcii inițiale (ce conține
plajele de liză de interes) cu filtrul de nitroceluloză; 2 – îndepărtarea proteinelor
fagice și legarea ADN fagic la filtru; 2’ – adăugarea soluției cu sonda marcată;
3 – cuplarea sondei ADN la nivelul zonelor de complementaritate din ADN fagic
legat de filtru; 4 – expunerea filtrului cu hibrizii ADN -ADN la radiații X
(autoradiografie); 5 – developarea filmului, compararea cu placa originară,
alegerea plajelor recombinate și purificarea moleculelor de interes .

Analiza secvențelor de ADN clonate
•După clonare și selecția clonelor recombinate,
fragmentele de ADN de interes pot fi analizate prin
mai multe metode.
•Se pot utiliza diverse enzime de restricție pentru
clivarea ADN clonat, apoi fragmentele obținute
sunt analizate prin electroforeză în gel de agaroză.
•Gena de interes poate fi amplificată prin utilizarea
tehnologiei PCR, subclonată într -un vector specific
și introdusă într -o gazdă nouă, sau gena poate fi
modificată prin mutageneză " in vitro " iar funcțiile
sale (modificate) sunt studiate ulterior.

Amplificarea ADN
prin reacția în lanț a polimerazei
•Reacția în lanț a polimerazei (engl. Polymerase
Chain Reaction – PCR ) reprezintă mecanismul
biochimic de bază al biotehnologiei moleculară de
amplificare enzimatică in vitro , cu ajutorul ADN –
polimerazei, a unei anumite secvențe de ADN.
Actualmente, această biotehnologie de nivel molecular
s-a dezvoltat vertiginos fiind utilizată într -o mare
varietate de domenii cum sunt: biologia moleculară,
ingineria genetică, microbiologia, științele mediului,
medicină, industria farmaceutică, industria alimentară,
epidemiologie, criminalistică etc.

Biotehnologia moleculară de tip PCR este
constituită din cicluri succesive de replicare in vitro a
macromoleculelor de ADN, utlizând în acest scop doi
primeri oligonucleotidici ce fuzionează prin hibridizare cu
cele două catene ale secvenței originale, folosită inițial
ca matriță în replicare .
Deosebirea esențială dintre această reacție de replicare
și un proces natural de replicare a ADN in vivo este
aceea că în biotehnologia moleculară de tip PCR etapa
de scindare a dublului lanț catenar în formă de helix a
ADN matriță și, respectiv, cea de atașare a primerilor, nu
sunt realizate enzimatic, ci prin parcurgerea anumitor
trepte de temperatură, singura enzimă disponibilă pentru
reacție fiind ADN polimeraza ADN -dependentă, cu
funcție de replicază . În continuare, sunt redate
principalele etape ale unei reacții în lanț a polimerazei :

Principalele etape ale reacției în lanț a polimerazei (PCR) ADN dublu catenar, utilizat ca matriță
ADN monocatenar
Atașarea primerilor
Polimerizare cu ADN polimeraza ADN -dependentă
2 Molecule de ADN dublu catenare,
identice cu molecula inițială de ADN , utilizată ca matriță

Mecanismul reacției în lanț a polimerazei
(Polymerase Chain Reaction )
Metoda reacției în lanț a polimerazei ( Polymerase
Chain Reaction ), descrisă, pentru prima dată, în urmă
cu peste 10 ani (Saiki și colab., 1985; Mullis și
Faloona, 1987) a devenit una dintre cele mai des
întrebuințate tehnici de amplificare selectivă a
secvențelor nucleotidice de ADN sau ARN.
În ultima perioadă s -au dezvoltat numeroase variante
ale tehnicii de bază privind reacția în lanț a
polimerazei, fiind aplicabile, în prezent, diferite
variante perfecționate ale acestei metode

•Reacția în lanț a polimerazei (Polimerase Chain
Reaction – PCR ) este o metodă destinată producerii in
vitro a unor cantități mari de ADN, pornind de la anumite
secvențe de nucleotide, care sunt utilizate ca “țintă” în
procesul de amplificare genică (Paterson și Bridge,
1994).
•Cele două lanțuri ale unei molecule de ADN, de tip
parental, sunt separate în câte un singur lanț, care se
activează, apoi, sub forma unor tipare, destinate
resintezei unor noi lanțuri de tip pereche. Aceste lanțuri
duble sunt sintetizate urmărind regulile de bază privind
replicarea ADN.
•În acest mod, se formează două copii identice ale
dublului helix de ADN, pornind de la un singur lanț, acest
proces semiconservativ producându -se întotdeauna în
direcția 5’=>3’

3’ 5’

A T G C A C A G
T A C G T G T C

5’ 3’

separarea catenelor

3’ 5’

A T G C A C A G

T A C
creșterea lanțului ADN
5’
3’ – OH

3’ – OH
creșterea lanțului ADN 5’

G T T
T A C G T G T C A A

5’ 3’

Sinteza de ADN prin acțiunea ADN -polimerazei: creșterea lanțului
de ADN în direcția 5’ – 3’

•Prezența acestui primer este absolut necesară,
deoarece ADN -polimeraza nu poate efectua sinteza
de novo , ci are doar capacitatea de a adăuga
nucleotide la o anumită secvență, eliberată de
grupările hidroxil ale celui de -al treilea atom de carbon
al deoxiribozei sau ribozei.
•Primer -ul se recombină cu modelul de ADN parental,
după o prealabilă separare a catenelor nucleotidice,
prin tratament termic, furnizând o grupare 3’ – OH și
permițând, în felul acesta, efectuarea polimerizării.
•Amplificarea ADN in vitro , prin metode de tip PCR, se
bazează pe principii asemănătoare celor care se
aplică replicării ADN.

Moleculele de ADN „țintă”, cele de ADN -polimerază,
deoxiribonucleotidele și moleculele de ADN -primer
sunt adăugate într -o soluție tampon cu compoziție
specifică. În același timp, moleculele de ADN primer
sunt constituite din secvențe scurte ale unei singure
catene de ADN, având, în mod obișnuit, o lungime de
10 – 20 baze azotate.
•Pentru început, dubla catenă de ADN “țintă” este
desfăcută pentru producerea așa -numitelor ”tipare
(matrițe)” de ADN ( DNA -template ), formate din catene
simple, iar această operațiune se realizează, de
regulă, prin încălzire la o anumită temperatură.
•Apoi, moleculele de ADN -primer se recombină cu
aceste catene simple, în acest mod, resintetizându -se
catenele pereche, în direcția 5’ => 3’.

•În esență, amplificarea enzimatică a moleculelor de
ADN se produce la nivelul unui fragment de ADN, care
este flancat de două molecule de ADN -primer ,
acestea recombinându -se împreună cu acele catene
opuse secvenței de ADN “țintă”
•Moleculele de ADN -primer sunt orientate cu capetele
3’ unele în fața celorlalte. Ciclurile repetate de
denaturare termică a moleculelor de ADN “țintă”
(pentru separarea dublelor catene nucleotidice), prin
recombinarea moleculelor de ADN -primer cu
secvențele lor complementare, precum și extinderea
acestor molecule recombinate, prin acțiunea ADN –
polimerazei, determină amplificarea segmentului
nucleotidic definit de capetele 5’ ale inițiatorilor reacției
lanțului polimerazic

1. ADN “țintă”

5. Repetarea ciclurilor 2. Denaturare termică

4. Extinderea catenelor de ADN 3. Inițierea sintezei ADN
de către ADN primers

Diagrama desfășurării reacției în lanț a p olimerazei

•Este demn de reținut faptul că metoda reacției
în lanț a polimerazei este extrem de sensibilă,
astfel încât, procesul de amplificare genomică
poate fi inițiat pornind, chiar, de la o singură
moleculă de ADN, utilizată ca model pentru
replicare.
•Această sensibilitate crescută determină
asigurarea unor condiții speciale de asepsie,
dată fiind posibilitatea contaminării materialului
de analizat