Cuplajul Intercelular Si Carcinoamele Orale

CUPRINS

PARTEA

GENERALĂ

Motivarea alegerii subiectului

Medicina ca sumă de discipline puse în slujba sănătății și cunoașterii organismului omenesc presupune existența unui uriaș număr de specialiști , cercetători , cadre medicale care alocă mii de ore de muncă în scopul cercetării sau vindecării bolnavilor. Cu toate aceste eforturi din partea atâtor oameni, microuniversul corpului omenesc se pastrează obscur în anumite zone mai dificil de investigat.

O muncă într-adevar aparte și nu de puține ori însoțită de eșecuri, erori, munca zadarnică, sacrificarea vieții personale este aceea de cercetător și aici nu mă refer strict la cercetătorii din lumea medicală ci la toată comunitatea pionierilor din orice domeniu care prin munca lor asigură progresul omenirii.

Revenind la motivarea alegerii subiectului consider că, fără a minimaliza importanța altor discipline medicale, biologia celulară are capacitatea de a atinge atât originea cât și ținta finală a oricărui proces patologic : celula. Prin cunoașterea mecanismelor intime de producere a bolii precum și efectele acesteia manifestate la nivel de structură internă a acestei veritabile “cărămizi” a corpului omenesc se pot stabili planuri eficiente de tratament, se pot imagina noi căi de acțiune a unor medicamente, de blocare a propagării unui anume factor etiologic al bolii și enumerarea ar putea continua. Varietatea mare de subiecte posibile din cadrul acestei discipline medicale a impus o analiză atentă cu concluzia că zonele de cuplaj intercelular sunt printre primele afectate în cazul bolilor, sunt mai ușor de investigat decât elementele interne ale celulei afectate de situații patologice și reflectă clar situațiile de boală prin modificări caracteristice. A doua temă analizată în lucrarea de față și anume carcinoamele orale se grefează perfect pe profilul de studiu al facultății absolvite și a fost aleasă datorită gravelor implicații asupra duratei medii de viață a individului , a multitudinii de materiale științifice existente și nu în ultimul rând datorită fascinației personale pe care o produce această maladie în fața căreia știința este încă lipsită de mijloace eficiente de combatere.

Morfologia și funcțiile epiteliului oral

Morfologic, mucoasa orală este constituită din două tipuri de țesuturi:

la exterior, țesut epitelial care vine în contact direct cu alimentele și saliva sub care se găsește o pătură de

țesut conjunctiv moale, dens, semiordonat. Această pătură este numită și corion. Între țesutul epitelial și conjunctiv se găsește o structură membranară moleculară numită membrană bazală

Țesuturile epiteliale de acoperire și tapetare din cavitatea orală prezintă multiple particularități morfo-funcționale ca urmare a expunerii la mediul exterior și la fluxul salivar continuu, precum și datorită conexiunilor cu structurile dure de la coletul dinților. Epiteliul oral, expus la traumatismul masticator și mediul extern va prezenta particularități care îi conferă rezistența mecanică și rezistență la agresiunile microbiene, chimice, termice.

Epiteliul oral a fost clasificat în:

epiteliul stratificat pavimentos fără keratinizare

epiteliul stratificat pavimentos cu parakeratinizare

epiteliul stratificat pavimentos cu ortokeratinizare.

Toate aceste trei tipuri de epitelii orale sunt formate din mai multe straturi de celule suprapuse. În raport cu stadiul de evoluție al celulelor , în structura epiteliilor orale de acoperire și tapetare s-au descris trei pături:

pătura bazală

pătura spinoasă

pătura superficială

Țesuturile epiteliale de acoperire din cavitatea orală nu sunt vascularizate. Conțin doar fibre nervoase care sunt ramuri senzitivo-senzoriale. Între celulele din structura epiteliului oral există unități joncționale specializate abundente descrise la nivelul zonelor de contact intercelular și între celule și matricea extra -celulară.

Topografic mucoasa orală cuprinde: mucoasa labială, jugală, linguală, a planșeului bucal, gingivală, a palatului dur, a palatului moale și amigdaliană.

Funcțional mucoasa orală cuprinde: mucoasa vestibulară, masticatorie și specializată.

Rolurile epiteliului oral:

acoperire

secretor

senzorial

absorbție

apărare

transport

Adezivitatea celulară la nivel epitelial

Înainte de abordarea specifică a modalităților de adezivitate celulară este necesară o prezentare succintă a altor elemente structurale celulare. Din punct de vedere al organizării funcționale celula depinde de membrana plasmatică, aceasta delimitând celula și separând conținutul intern de mediul înconjurător. Structura citoplasmei depinde tot de membrană datorită proprietății acesteia de a putea fi o bariera selectivă la trecerea diferitor molecule. Constituenții săi fundamentali sunt lipidele și proteinele dispuse în bistrat impermeabil la majoritatea moleculelor hidrosolubile.

Funcțiile îndeplinite de proteinele membranare sunt complexe dintre acestea putându-se enumera :

medierea transportului selectiv de ioni

transportul moleculelor de diferite dimensiuni în și dinspre celulă

constituie senzori pentru semnalele venite din exteriorul sau interiorul celulei

controlează interacțiunile celulă-celulă

controlează interacțiunile celulă-substrat

asigură imunitatea celulară

Conform concepției actuale toate membranele biologice au aceeași organizare structurală: proteinele membranare și bistratul fosfolipidic.

Bistratul fosfolipidic apare electronomicroscopic sub forma a două linii dense separate de un spațiu. Acest aspect datorită modului în care capetele polare ale fosfolipidelor se leagă metale grele care sunt electronodense, spațiul dintre ele fiind ocupat de lanțurile de acizi grași hidrofobi care sunt electronotransparente.

Hemidesmozomii: roluri în adeziune, semnalizare și bolile umane

Perspectiva asupra rolului hemidesmozomilor în adeziunea celulei s-a îmbunătățit considerabil atât ca rezultat al experimentelor de mutație genetică țintită, cât și prin observațiile asupra mai multor boli de piele generatoare de beșici în care au fost demonstrate absența sau defectele proteinelor hemidesmozomale. Domeniile funcționale importante din proteinele care formeaza hemidesmozomii au fost recent identificate prin studii de mutageneză.

Aceste complexe multiproteice par nu numai să medieze adeziunea celulară, ci și să medieze semnalele matricei extracelulare către interiorul celulei, lucru care poate modifica profund comportamentul celulei.

Hemidesmozomii sunt mici complexe multiproteice, cu diametru de 0.1-0.5m, care mediază adeziunea celulelor epiteliale la membrana bazală, conectând elementele citoscheletului celulei la matricea extracelulară. Hemidesmozomii sunt prezenți în stratul de celule bazale și în anumite epitelii complexe ca epiderma , corneea , placenta și epiteliul anumitor zone din tractul respirator și gastrointestinal.

În mai multe boli de piele buloase dobândite și moștenite, defectele componentelor hemidesmozomale sau a structurilor lor asociate, cum ar fi filamentele intermediare de citokeratină, filamentele de ancorare și fibrele de ancorare, cauzează fragilitate tisulară, demonstrând importanța acestor structuri pentru menținerea atât a adeziunii dermo-epidermale cât și a integrității țesutului.

Din punct de vedere al organizării sunt asemănători desmozomilor (fig.1), realizând adezivitatea între celulă și matricea extracelulară.

Fig. 1 Desmozomi (desen, imagine Microscopie Electronică)

Datele recente au sporit cunoașterea atât în privința componentelor moleculare ale hemidesmozomilor cât și asupra rolului hemidesmozomilor în adeziune prin țesutul epitelial conectiv, polarizarea celulară, morfogeneza și vindecarea rănilor.A devenit clar că hemi-desmozomii nu sunt numai niște dispozitive de adeziune ci sunt implicați în medierea semnalului prin integrina 64. Aceste semnale mediate de hemidesmozomi se cred a fi responsabile de influențarea arhitecturii citoscheletului, diferențierea și creșterea celulară.

În continuare vor fi dezbătute descoperirile recente cu privire la structura moleculară și asamblarea hemidesmozomilor. Atenția va fi concentrată asupra potențialelor interacțiuni ale componentelor hemidesmozomale unele cu altele, cu citoscheletul și cu matricea extracelulară. Vom vedea cum absența sau defectele acestor componente se regăsesc în cazuri clinice severe.

Conexiunea prin filamentele intermediare hemidesmozomale

Componentele plăcii citoplasmatice hemidesmozomale, mai precis ( BP230 ) antigenul pemfigoidului bulos, două proteine cu greutate moleculară mare, (FAP300) proteina 300 asociată filamentelor intermediare, proteina 1 hemidesmozomală și proteina P200 cu greutate moleculară de 200 kDa recunoscută de anticorpii monoclonali 6A5, toate acestea sunt implicate în conectarea rețelei de citokeratină a filamentelor intermediare la hemidesmozomi.

Aceste presupuneri se bazează pe următoarele observații:

În primul rând aceste molecule au fost localizate ultrastructural la suprafața citoplasmatică a plăcii hemides-mozomale, acolo unde sunt inserate filamentele intermediare de citokeratină.

În al doilea rând studiile în vitro asupra adezivității au adus dovezi privind interacțiunea dintre IFAP300 și plectină cu filamentele intermediare.

În al treilea rând domeniul terminal carboxilic al plectinei a fost implicat într-o asociere cu filamentele inermediare în celulele afectate tranzitoriu.

În final BP230 împarte secvențe omoloage cu plectina și desmoplakina. Aceasta din urma s-a demonstrat că leagă filamentele intermediare în procesele de legare în vitro și în experimentele de transfecție . Studiile recente biochimice și de biologie celulară nu permit o definire precisă a interacțiunilor responsabile de legarea keratinei filamentelor intermediare la membrana plasmatică. În analogie cu ceea ce a fost observat în contactele focale, când mai multe proteine cum ar fi talina și -actinina sunt esențiale în legarea microfilamentelor de actină la subunitățile transmembranare integrinice, este de presupus că un complex multi-proteic similar este implicat în ancorarea rețelei de filamente intermediare la membrană.

Există o confuzie în ceea ce privește relația dintre IFAP300, plectină și proteina 1 hemidesmozomală datorită similitudinii mărimii moleculare și distribuției tisulare. IFAP300 care ințial a fost descris ca o proteină de legare a vimentinei, a fost mai târziu găsită în placa desmozomală și hemidesmozomală.

Clonarea parțială și hărțile bidimensionale ale peptidului triptic din IFAP300 indică existența de diferențe față de plectină. Oricum posibilitatea ca plectina și IFAP300 să fie înrudite sau chiar forme izomere nu poate fi exclusă.

Experimentele efctuate în mai multe laboratoare sugerează că nou descrisa moleculă a proteinei 1 hemidesmozomale poate fi identică cu plectina. Plectina este o moleculă versatilă de legare încrucișată care unește tipuri diferite de filamente intermediare cum ar fi vimentina , desmina și proteinele neurofilamentelor.

ADN-ul care codifică plectina șobolanului și mai nou cea umană a fost clonat, și ceea ce e mai interesant analiza structurii primare bazate pe secvența ADN-ului uman anticipează prezența unui domeniu de legare a actinei la capătul amino-terminal. Deci plectina poate lega filamentele intermediare și sistemul de filamente de actină.

În final observația că plectina conține un situs de fosforilare specifică mitotică țintit de către kinaza p34cdc2 reglatoare a ciclului celular, sugerează că plectina este implicată în organizarea structurală de ansamblu a citoscheletului.

Interacțiunea componentelor hemidesmozomale cu matricea extracelulară

Componentele transmembranare ale hemidesmozomilor includ molecula colagenoasă a antigenului 2 al pemfigoidului bulos ( BP180 cunoscută și ca BPAG2 și colagen de tip XVII ) și integrina 64. Datele din studiile de biologie celulară și probabil mai important cele din observarea bolilor de piele generatoare de vezicule, caracterizate în special prin clivajul dermo-n special prin clivajul dermo-epidermal, indică faptul că integrinele 64 și BP180 sunt cruciale pentru adeziunea keratinocitelor și a altor celule epiteliale la matricea extracelulară subiacentă. Oricum, liganzii BP180 la membrana bazală care este o rețea supramoleculară complexă constând din izomeri ai lamininei , colagen tip IV și glicoproteine variate mai exact nidogen , perlecan și fibulină , au rămas nesesizate.

În antiteză adeziunea celulelor epiteliale la matricea extracelulară mediată de 64 pare să se bazeze în principal pe interacțiunea cu o forma izomeră a lamininei –5laminina. Aceasta este un heterotrimer format din lanțuri 3, 3, 2, din acestea numai lanțurile 3, 2 fiind supuse unei procesări complexe. Adeziunea celulară care determină activitatea 5lamininei pare a fi dependentă de conformația acesteia în special de brațul ei lung. În plus adeziunea mediată de 64 poate fi complet blocată de anticorpii monoclonali BM-165 care se leagă la primul domeniu G al lanțului 3 din 5-laminină, indicând că domeniul G este un potențial situs de legare celulară. Mecanismul exact de legare a 5-lamininei la scheletul membranei bazale ramâne a fi elucidat. În lumina afinității scăzute la legare a nidogenului datorită motivului asemănător cu cel al EGF (epidermal growth factor), 2III4, pare puțin probabil ca 5-laminina să interacționeze cu colagenul tip IV, perlecanul sau fibulina prin intermediul acesteia (fig. 2).

Mai mult, scurtarea brațelor scurte probabil compromite capacitatea de autopolimerizare pentru a forma o structură de tip rețea. Interacțiunea cu membrana bazală poate apărea prin legarea covalentă la alți izomeri ai lamininei, inclusiv 6-laminina (cu lanțurile 3 , 1 , 1 ) și 7-laminina ( cu lanțurile 3, 2, 1 ). În schimb aceste laminine se pot lega la nidogen mediind astfel încorporarea 5-lamininei în membrana bazală.

În mod clar 5-laminina nu este singurul ligand recunoscut de integrina 64, interacțiuni cu alte tipuri de laminină putând surveni în diferite etape de evoluție a pielii și în condiții patologice. Mai mult, datorită faptului că exprimarea 5-lamininei pare să fie restrânsă la nivelul membranei bazale atât a epiteliului cât și endoteliului scuamos, tipuri diferite de laminină pot fi implicate în adeziunea celulară din alte țesuturi prin intermediul integrinei 64. Spre exemplu, în membrana bazală a celulelor Schwann, care nu conține 1 și 5-laminină, integrina 64 poate interacționa în primul rând cu lamininele 2 și 4. Datorită creșterii permanente și a identificării de izomeri noi ai lamininei, specificitatea de legare la laminină a receptorilor integrinici precum și rolul lor funcțional în vivo trebuiesc în permanență reajustate.

În final, la ora actuală, este în continuare neclar dacă și alte integrine contribuie la adeziunea epitelio-stromală. De exemplu, integrina 31, care este exprimată pe celulele epiteliale, leagă și ea 5-laminina. Este de presupus a fi relevant faptul că șoarecii cu absență de 3 prezintă detașare dermo-epidermală cu dezorganizarea membranei bazale.

Mai mult decât un simplu conector de matrice extracelulară, integrinele 64 și BP180 sunt implicate în formarea hemidesmozomilor.

Domeniile integrinei 64 importante pentru asamblarea hemidesmozomilor sunt actualmente identificate. Experimentele de transfecție au identificat un domeniu citoplasmatic în aminoacidul 303 din lanțul subunității 4 care conține prima pereche de fibronectină tip III, domeniu care se repetă, segmentul de conectare părând a fi esențial pentru localizarea integrinei 64 în hemidesmozomi. Mai mult, supraexprimarea unei subunități 4 fără terminație a arătat că inhibă formarea hemidesmozomilor. Este posibil ca subunitatea 4 fără terminație să aibe un efect dominant negativ asupra asamblării hemidesmozomilor prin interferarea cu semnalele transduse de tipul “sălbatic” de integrine care sunt necesare asamblării hemidesmozomilor. Această subunitate 4 fără terminație se asociază cu subunitatea 6, dar rămâne rar distribuită la suprafața celulei. Mai mult, îndepărtarea segmentului terminal nu are efect observabil asupra adeziunii integrinei la izomerii variați ai lamininei ca 1, 2, 4 și 5-laminina. Aceste date implică faptul că formarea hemidesmozomilor nu este o cerință necesară pentru o adeziune celulară mediată de 64.

S-a comunicat că asamblarea hemidesmozomilor este prevenită prin inhibarea fosforilării integrinei 4. Experimentele de mutageneză au arătat că un „motiv tyrozinic de activare” (TAM), format din două reziduuri tirozinice în pozițiile 1422 și 1440 ale subunității 4, poate fi decisiv în alegerea integrinei 64 în hemidesmozomi. În contrast aparent cu aceste descoperiri, rezultatele din alte laboratoare au indicat că o moleculă secționată de 4, căreia îi lipsește o porțiune din terminația citoplasmatică din zona reziduurilor tirozinice 1422 și 1440, poate fi corect localizată în hemidesmozomi în cazul celulelor 804G din tumora de vezică a șoblanului. Aceasta discrepanță se poate explica numai prin existența a cel puțin două situsuri funcționale pe domeniul citoplasmatic al 4, adică reglator și de legare, care prin îndepărtarea porțiunii care conține situsurile cu TAM nu interacționează, ci dimpotrivă stimulează activitatea situsului de legare.

Mai mult, cu toate că fosforilarea tirozinică a secvențelor TAM poate fi un pas esențial în asamblarea hemidesmozomilor, este clar că există și alte mecanisme de asemenea implicate în reglarea asamblării hemidesmozomilor. De fapt, unii au arătât că, în ciuda faptului că activarea recptorului pentru EGF duce la fosforilarea TAM în 4, activarea receptorului pentru EGF induce mai degrabă dezasamblarea decât asamblarea hemidesmozomilor, suprareglând migrarea celulară a lamininei.

Studiile de cuplare în vitro folosind proteine 4 recombinatoare, în adiție la studiile de transfecție pe linii celulare deficiente de 4, au adus dovezi biochimice că domeniul citoplasmatic al 4 interacționează cu plectina. Această interacțiune poate fi unul din mecanismele prin care sunt stabilizați hemidesmozomii. Interesant, structurile rudimentare asemănătoare cu hemidesmozomii și conținând plectină și 64 integrină, dar fără BP230 și BP180, au fost descrise. Este deci tentant de speculat că integrina 64 și plectina formează un complex care servește ca un miez pentru asamblarea hemidesmozomilor la care BP230 și BP180 se agregă intr-o etapă ulterioară. În plus, cum plectina conține un domeniu de legare a plectinei, în anumite tipuri de celule poate asigura o conexiune indirectă între 64 și citoscheletul actinic.

Studiile de transfecție au relevat domenii funcționale importante pentru BP180, o proteină transmembranară cu o orientare de tip II. Un segment de 36 de aminoacizi localizat la capătul aminoterminal intracelular pare să determine polarizarea BP180 la baza celulei, când segmentul extracelular imediat adiacent la domeniul transmembranar este necesar pentru încorporarea în hemidesmozomi. Studiile de co-imunoprecipitare au adus dovezi pentru susținerea interacțiunii directe dintre BP180 și subunitatea 6 integrinică. Interacțiunea pare să se bazeze pe regiunea extracelulară, necolagenoasă a BP180 (domeniul NC16a) adiacent membranei și poate fi necesar pentru stabilizarea hemidesmozomilor. Rezultatele altor laboratoare sugerează faptul că aceste rezultate trebuiesc interpretate cu precauție. În primul rând studiile de transfecție folosind construcții chimerice ce codifică diferite porțiuni citoplasmatice ale BP180 și semnalele K-Ras care țintesc membrana plasmatică, indicând că domeniul extracelular nu este o cerință absolută pentru localizarea moleculei BP180 în hemidesmozomi. În plus s-a identificat un pacient cu epidermoliză joncțională buloasă asociată cu atrezie pilorică care are deficit complet al subunității 4 integrinice. În culturile de keratinocite provenite de la acest pacient, subunitatea 6 integrinică a fost asociată cu cea 1 și localizată în adezivitățile focale, având în vedere că BP180 era prezent în structurile asemănătoare hemidesmozomilor.

Legarea celulelor la laminine le poate afecta profund influențându-le fenotipul. De exemplu, 5-laminina derivată din celulele canceroase G804 provenite din vezica de șobolan, determină atât adeziunea celulară cât și migrația în plus față de asamblarea hemidesmozomilor din celulele epiteliale. Cu toate că mecanismul care susține această activitate regulatoare specifică, multifuncțională a 5-lamininei rămâne a fi elucidat, acum a devenit clar că multe semnale de la nivelul matricei extracelulare sunt transmise interiorului celulei prin intermediul integrinelor. Respectând acest lucru și 64 integrina poate avea un rol important. Domeniul citoplasmatic al subunității 4 este subiect pentru mecanisme reglatoare variate, incluzând îmbinare intercalată, clivaj proteolitic și fosforilare tirozinică. Ligaturarea și îngrămădirea de 64 induse de anticorpi sau de laminină determină fosforilarea tirozinică a subunității 4 printr-un mecanism de asociere fizică a unei kinaze citoplasmatice. În adiție proteina adaptoare Shc este adiționată la 64 recrutând proteina adaptoare Grb 2 la membrana plasmatică. Prin aceasta calea Ras este potențial legată de integrina 64. Aceste observații indică faptul că existența căii de transmitere a semnalului mediat de integrina 64 poate stimula nu numai asamblarea hemidesmozomilor ci și creșterea celulei. În aparent contrast cu toate acestea, transfectarea subunității 4 către celulele RKO din carcinomul rectal, care exprimă integrinele 61 fără a exprima pe cele 64 , induce blocarea parțială a celulei în faza G1 și intrarea în apoptoză.

Recent a fost identificată o nouă proteină asociată membranei (p80) cu o greutate moleculara de 80 kDa; aceasta este specific fosforilată tirozinic urmând detașării cheratinocitelor de 5-laminină. Mai mult, inhibarea defosforilării p80 a prevenit ancorarea celulară la laminina dependentă de 64. Cu toate acestea mai trebuiesc mult studiate implicațiile funcționale ale acestor fenomene de fosforilare, aceste studii aducând numai primele dezvăluiri cu privire la mecanismele de semnalizare care implică integrina 64 care poate afecta critic funcționarea mașinăriei celulare.

O breșă majoră în elucidarea în vivo a rolului funcțional al componentelor hemidesmozomilor a venit din partea experimentelor de țintire genetică. La scurt timp după îndepartarea BP230 la șoarece s-a observat pierderea integrității celulelor bazale epidermale cu semne discrete de fragilitate a pielii. Ultrastructural hemidesmozomilor le lipsea placa internă și nu erau asociați cu mănunchiurile de filamente de keratină deși acestea erau conectate bine la substrat. Mai mult migrarea keratinocitelor și nu creșterea celulelor a fost redusă în cazul experimentelor de vindecare a rănilor folosind șoarecele cu deficit de BP230. Aceste observații denotă implicarea esențială a BP230 în conectarea filamentelor intermediare la hemi-desmozomi, care nu pot fi compensate de alte componente hemidesmozomale. Totuși rezultatele nu exclud cerința unei rețele de interacțiuni multiproteice, caz în care pierderea uneia dintre componente duce la compromiterea stabilității legăturilor. De menționat este și faptul că șoarecele mutant fără BP230 a dezvoltat adiacent distonie și degenerarea sistemului nervos. Un studiu recent a argumentat neașteptata descoperire demonstrând că generatoarea distoniei musculare la șoarece este o genă, un izomer neural al proteinei BP230. Desprinderea țintită a genei BP230 dintr-o regiune localizata 3’ față de distonina neurală specifică a dus la inactivarea izomerilor neurali specifici. Identificarea unui potențial domeniu de cuplare a actinei sugerează ca distonina asemeni plectinei poate media legarea filamentelor intermediare la citoscheletul de actină în sistemul nervos.

Pentru a studia contribuția integrinei 64 în funcționarea hemidesmozomilor a fost inactivată gena 4. Șoarecele deficitar de subunitatea integrinică 4 a dezvoltat beșici generalizate cu implicare multisistemică, murind la scurt timp după naștere. Hemidesmozomii erau absenți și se produsese clivajul dermo-epidermal la nivelul celulelor bazale și în lamina lucida după un tipar în mod evident distinct de cel observat la șoarecele mutant deficitar de BP230 și de 14-keratina, la care beșicarea se datora numai rupturii celulelor bazale. Ablația subunității 6 integrinice a condus la un fenotip similar cu cel observat în cazul îndepărtării celei 4. Astfel, 64 integrina pare a fi esențială pentru nuclearea și asamblarea hemidesmozomilor, absența ei ducând atât la fragilitate celulară cât și la separarea dermo-epidermală.

În multe, câteodata letale, boli ale pielii și mucoaselor generatoare de vezicule, componente ale hemidesmozomilor și ale structurilor înrudite funcțional sunt anormal exprimate sau sunt ținte ale anticorpilor circulanți. De exemplu în forma severă a epidermolizei joncționale buloase, la care s-a raportat inițial o exprimare deficitara a BP180, au fost descrise mutații în genele care codau BP180 și 5-laminina. La unii dintre pacienți a fost revendicată exprimarea anormală a proteinei asociată unui filament de ancorare, antigenul 1 IgA liniar al dermatozei buloase. Studile recente din mai multe laboratoare indică faptul că epidermoliza buloasă simplă asociată cu distrofia musculară este cauzată de apariția mutațiilor în gena care codifică plectina. În cele mai severe forme ale epidermolizei joncționale buloase (forma Herlitz) au fost găsite mutații în genele care codifică cele trei subunități ale 5-lamininei.

Din aceste observații pot fi trase trei concluzii:

Anomaliile implicând proteine diferite pot fi asociate cu un fenotip clinic similar. Aceasta nu e ceva neașteptat din cauza localizării structurale apropiate și potențialei sinergii funcționale a acestor proteine.

Mutații diferite ale aceleiași gene pote duce la severități variabile ale fenotipului pentru că acestea compromit sinteza proteică, stabilitatea proteinelor și asamblarea supra-moleculară a acestora de diferite grade. În epidermoliza buloasă distrofică în care au fost găsite mutații ale colagenului de tip VII au fost stabilite corelații între genotip și fenotip.

Studiile asupra acestor boli ne permit stabilirea eficienței mecanismelor compensatorii și nu în ultimul rând asigurarea bazei pentru terapia genetică a acestor boli. Studiile asupra bolilor de piele buloase mediate de autoanticorpi au contribuit la descrierea proteinelor BP230, BP180 și a altor proteine din membrana bazală epidermală. Mai mult ele au asigurat o privire de ansamblu asupra mecanismelor de distrugere tisulară induse de autoanticorpi. S-a arătat că domeniul extracelular adiacent domeniului transmembranar al BP180 exprimă epitopi imunodominanți care sunt recunoscuți de autoanticorpi la pacienții cu pemfigoid bulos. Anticorpii IgG ridicați împotriva porțiunii omoloage corespunzătoare murinei BP180 care sunt transferați pasiv la șoarecele neonatal cauzează o boală buloasă care mimeaza pemfigoidul bulos. Acești autoanticorpi se presupune că induc fragmentarea hemidesmozomilor prin interferarea în procesul de interacțiune dintre BP180 și subunitatea 6 inegrinică. Oricum presupunând că o asemenea interacțiune există cu adevarat, acest efect este puțin probabil să fie direct deoarece activarea complementului și răspunsul inflamator celular sunt necesare pentru formarea bulelor. În contrast unii pacienți cu pemfigiod cicatriceal au autoanticorpi împotriva lanțului 3 din 5-laminină. În modelul animal de transfer pasiv, anticorpii împotriva 5-lamininei sunt capabili să aibă ca răspuns direct clivajul dermo-epidermal. În consecință este tentant de speculat că acești autoanticorpi interferă direct cu asocierea 5-lamininei fie cu membrana bazală fie cu situsul ei de legare celulară, compromițând astfel adeziunea dermo-epidermală.

Placa hemidesmozomală

Caracterizarea constituenților majori proteici ca markeri de diferențiere pentru anumite forme de epitelii.

Pentru a examina dacă în hemidesmozomi există constituenți proteici ce pot fi folosiți ca markeri pentru anumite căi de diferențiere epitelială am examinat apariția proteinei majore Mr- ~230000 de la nivelul plăcii, antigenul pemfigoidului bulos BP. Au fost inspectate mai multe linii celulare în cultură provenind de la bovine, șobolan și țesuturi umane folosind preparate umane diferite de autoanticorpi în imunocitochimie și imunodistrugere. S-a observat că această proteină, de asemenea identificată de clonarea și secvențierea ADN-ului, apare nu numai în epiteliile stratificate diferențiate ci și aproape mereu în structurile hemidesmozomale, în epiteliul vezicii, în epiteliul complex al traheei și bronhiilor, în mai multe tipuri de glande din care de menționat sunt cele care conțin mioepitelii mai exact glandele mamare și cele salivare. Proteina este absentă în toate epiteliile unistratificate și în mai multe țesuturi despre care se știe că au densități subplasmalemale similare structural cu cele ale hemidesmozomilor cum ar fi fibrele Purkinje din inimă, meningele și peritoneul. Linia de celule epiteliale derivate din glanda mamară (BMGE+H) este în mod particular foarte bogată în hemidesmozomi. Aceasta a fost utilizată pentru a studia migrarea endocitotică a domeniilor membranei plasmatice bogate în hemidesmozomi, în veziculele citoplasmice după detașarea straturilor celulare în timpul tratamentului cu dispaza, o enzimă proteolitică. Propunem să folosim proteina Mr- ~230000 din placa pe post de marker selectiv pentru anumite seturi de celule epiteliale și tumori epiteliale derivate în cadrul studiului dezvoltării fetale și tumorale, incluzând diagnosticul diferențial al carcinoamelor.

Diferențierea epitelială se caracterizeaza prin sinteza unui set de proteine citoscheletale care în mod uzual include citokeratinele, reprezentând un subgrup de filamente de mărime intermediară (IFs) și proteine specifice desmozomilor cum ar fi joncțiunile inter-celulare asigurând plăci de ancorare din filamente intermediare. Oricum nici citokeratinele nici desmozomii nu sunt prezenți în exclusivitate și absolut obligatorii în epitelii. La mamifere proteinele constitutive ale hemidesmozomilor sunt markeri care caracterizează căile de diferențiere urmate de celulele epiteliale dar mai apar și în miocard, reticolul dendritic al nodulilor limfatici, în anumite celule meningeale și componente ale plăcii desmozomale. Asemenea componente include desmoplakina I și II, antigenul D1 și glicoproteinele transmembranare desmogleina și desmocolina I și II care se extind atât în spațiul intercelular cât și în placa citoplasmatică. Datorită capacității mari de împrăștiere și apariției selective în tumorile epiteliale, asemenea proteine desmozomale sunt acum, ca și citokeratinele, utilizate frecvent în patologie ca markeri ai diferențierii epiteliale, mai ales în diagnosticul tumorilor epiteliale. În diverse tipuri de epitelii filamentele intermediare sunt nu numai la membrana plasmatică laterală ci și în membrana plasmatică bazală care limitează matricea extracelulară. Spre exemplu în straturile de celule bazale din epiteliul stratificat mănunchiurile de filamente intermediare converg înainte și se atașează aparent la domeniile membranei plasmatice purtătoare de placă care fac contact intim cu lamina bazală. Aceste situsuri de deziune purtătoare de placă au fost denumite în grup hemidesmozomi datorită similarității structurale cu o jumătate de desmozom. Oricum, din punct de vedere al compoziției, hemidesmozomul nu este cu siguranță numai o jumătate de desmozom de vreme ce anticorpii monoclonali ridicați împotriva componentelor desmozomale nu au reacționat cu hemidesmozomul. Sunt totuși posibile și excepții deoarece anumite proteine ca desmoplakina și Mr- ~230000 împart epitopi reprezentând omologii de secvență. Viceversa nici unul din anticorpii descriși până acum ca reactivi cu componentele hemidesmozomale nu a reacționat cu desmozomii.

Din variatele proteine raportate a fi localizate în hemidesmozomii anumitor epitelii în prezent, numai polipeptidul Mr-~230000 este știut a face parte din o largă varietate de țesuturi și specii, fiind recunoscut de autoanticorpii prezenți în serul pacienților suferind de pemfigoid bulos. Acest antigen a fost localizat specific pe hemidesmozomi și, prin microscopie imunoelectronică, și în placa hemidesmozomală. Pentru a se evalua dacă proteina poate fi un candidat ca marker epitelial, s-a început cu țesuturi bovine pentru a minimiza oxidarea imuno-citochimică datorată prezenței imunoglobulinelor umane.

Carcinoamele orale

Cele mai ample studii medicale se desfașoară în SUA motiv pentru care sunt folosite de multe ori ca etalon. Unul dintre aceste studii arată că din toate tipurile de cancer cel oral (oro-faringian) reprezintă aprox. 3 %. Dintre pacienții diagnosticați cu acest tip de cancer 50% au decedat în maximum 5 ani. Medicii stomatologi, prin natura activității desfășurate , se află în poziția ideală de a recunoaște orice abatere de la normal a mucoasei orale prevenind impactul acestei boli asupra mortalității.

Etiologie

Cei mai probabili factori etiologici implicați în apariția și dezvoltarea acestei afecțiuni sunt:

Expunerea la radiații solare

Consumul de alcool

Fumatul

Mestecarea tutunului

Sifilisul

Virusuri (Epstein-Barr , papilomavirus)

Traumatisme repetate

Asocierea fumatului cu consumul de alcool este cu mare probabilitate de a induce cancer oral , 90% din pacienții diagnosticați reclamând acești doi factori.

La nivel celular se produc alterări ale materialului genetic. Cercetările recente au identificat un mare număr de agenți incluzând oncogene , protooncogene , virusuri și alți factori care induc modificări ale genomului celular.

În absența diagnosticului precoce și tratamentului leziunilor premaligne acestea pot evolua către carcinom. Bazele moleculare ale acestuia sunt la fel ca în displazii: alterarea genomului keratinocitelor din epiteliul oral.

Clinic , fazele precursoare ale carcinomului de mucoasă sunt leucoplazia , eritroplazia și ulcerațiile rebele la tratament după 7-10 zile. Orice ulcerație cronică nediagnosticabilă la nivelul mucoasei orale sau vermillonului trebuie considerată o leziune cu potențial de degenerare , diagnosticul diferențial incluzând procese infecțioase , reacționale și chiar neoplasme. Diagnosticul final se bazeză pe biopsia țesutului.

Cele mai comune forme de carcinom sunt cele de buză , de limbă și de planșeu oral. Cancerul de bază de limbă este mai greu de diagnosticat datorită absenței în cabinetul stomatologic a instrumentarului endoscopic.

Pe de altă parte fructele , cerealele , produsele lactate , uleiul de măsline asigură protecție în fața cancerului oral efectele lor fiind explicate prin conținutul crescut de riboflavină , fier și magneziu. Afirmația este susținută de incidența scăzută a acestei afecțiuni în Grecia.

Imaginile următoare prezintă situații comune din cabinetul stomatologic care orientează medicul spre diagnosticul unei leziuni tumorale:

În cancerul oral etapizarea TNM și evoluția conform sistemului lui Bloom și Richardson sunt cele mai acceptate și sigure metode de prognostic. Oricum , implicațiile clinice ale sistemului de evoluție au rămas limitate, cele terapeutice fiind extrase din parametrii etapelor în cea mai mare parte.

Frecvența mitotică a fost acceptată ca marker al proliferării celulare. În cancerul de sân în particular a fost estimată tradițional din preparatele histopatologice ca scăzut , moderat sau sever și reprezintă o componentă a sistemului de evaluare Bloom și Richardson. Ca o alternativă se poate cuantifica numărul de figuri mitotice. După numărarea simultană de către doi obsevatori fără focalizarea asupra fiecărui câmp , a fost descoperită o puternică relație de corespondență între numărul de figuri mitotice din 10 câmpuri de înaltă putere (mărire 400x) și prognosticul asupra pacientului. Au fost investigate fragmente de țesut tumoral provenind de la 104 pacienți cu vârste cuprinse între 47 și 71 de ani diagnosticate cu carcinom primar. Toți pacienții au fost tratați în 101 cazuri. În funcție de stadiul evolutiv al tumorii 76 dintre pacienți au primit iradiere secundară, 10 chimioterapie și 4 ambele. Cele 14 rămase nu au fost tratate adițional. Datele citometrice și morfometrice ale ADN-ului au fost disponibile din analizele efectuate anterior. Perioada de observație pentru cei 33 care au supraviețuit a variat între 5.3 și 13.5 ani. Perioada medie de supraviețuire a fost de 4.5 ani.

Stadializarea TNM . Postoperator stadializarea TNM s-a efectuat conform standardelor impuse de Uniunea Internațională împotriva Cancerului. Au fost căutate clinic metastazele prezente la distanță cu ajutorul ecografiei abdominale a radiografiei pulmonare și prin scintigrafie osoasă. La 92 din cazuri a fost precizată dimensiunea exactă în centimetri a tumorilor prezente.

Sistemul de stadializare Bloom și Richardson

Toate cele 104 tumori au fost evaluate morfologic de un observator pe specimene de 4m grosime colorate cu hematoxilin-eozină. Criteriile de evaluare tumorală ale lui Bloom și Richardson au fost diferențierea tubulară , pleomorfismul nucleului și frecvența mitotică , toate cu valori cuprinse între 1 și 3 , scorul final fiind calculat prin însumarea acestor valori. Tumorile care au însumat valori cuprinse între 3 și 5 au fost clasificate ca G1 , cele cu 6-7 puncte ca G2 , iar cele cu 8-9 ca G3.

Numărarea figurilor mitotice.

Independent de evaluarea histomorfologică , figurile mitotice au fost numărate în 10 câmpuri distincte cu mărire de 400x. Câmpul vizual avea un diametru de 450 m cu o arie de 159 m². În scopul numărării au fost alese 10 zone tumorale care aparent conțineau cele mai multe figuri mitotice. Cele mai multe dintre ele erau de asemenea bogate în celule tumorale. Pentru identificarea unei figuri mitotice s-au ales criteriile propuse de Baak și van Diest.

Analiza statistică.

Pentru evaluarea statistică s-a folosit pachetul statistic BMDP. Pentru a analiza interrelațiile dintre diferiți parametri au fost calculați coeficienții de corelare a gradului Spearman. Pentru o mai bună validare și pentru o comparație mai sugestivă s-au construit patru tabele pentru parametri continui după calcularea mediei și au fost interpretate utilizând testul de independență Pearson. Pentru analiza univariabilă a supraviețuirii , curbele Kaplan-Meier au fost testate pentru diferențe semnificative cu ajutorul testelor pereche Wilcoxon-Breslow. Pentru analiza multivariabilă a supraviețuirii modelele de regresie Cox au fost calculate retrograd pas cu pas. În 20 din cazurile de numărare a figurilor mitotice a fost repetată numărarea de același sau de un al doilea observator pentru evaluarea reproductibilității intraobservatorie și interobservatorie. La alte 20 de numărări s-au ales trei locuri tumorale diferite.

Semnificația clinică a frecvenței mitotice în carcinoamele orale

Prin comparare cu diferiți parametri de prognostic valizi , numărarea frecvenței mitotice a fost semnificativă statistic prin corelare cu sistemul de evaluare al lui Bloom și Richardson sau cu testul Spearman și doar foarte puțin corelată cu alți parametri de gradare și etapizare , în special cu cei care fac referire la mărimea tumorii sau statusul nodulilor limfatici. Folosind media aritmetică sau cuantificarea 1:2:1 , numărarea frecvenței mitotice a fost semnificativ independentă de orice alt parametru de gradare sau etapizare cuprinși în interpretarea celor patru câmpuri din testul Pearson. În ceea ce privește numărul figurilor mitotice , mărimea tumorilor și statusul nodulilor limfatici au arătat informații prognostice independente din punct de vedere statistic în modelul Cox , cu frecvența mitotică plasată a doua după mărimea tumorei. Acești trei parametri au fost luați în considerare ca model pentru a investiga dacă înregistrarea frecvenței mitotice are o semnificație practică. Astfel, analiza statistică a fost efectuată pentru trei etape de corelare cu prognosticuri probabile diferite , incluzând 88 din cei 104 pacienți evaluați. Speciile tumorale T1 N0 (n=23 , numărul mediu de mitoze=3) au fost evaluate cu prognostic favorabil , speciile tumorale T1 N1 sau T2 N0 (n=37 , numărul mediu de mitoze=7) prognostic rezervat , iar speciile tumorale T2 N1 sau T3 N1 (n=28 , numărul mediu de mitoze=8) prognostic nefavorabil. Luînd valoarea medie a subgrupului ca prag , au fost calculate curbele de supraviețuire Kaplan-Meier. Diferențele de lungime a supraviețuirii au fost semnificative în cazul tumorilor T1 N0 și în cel al celor T1 N1 sau T2 N0 ; nu au fost semnalate diferențe mari în cazurile grupurilor nefavorabile T2 N1 sau T3 N1. Din cele 16 cazuri care nu au fost luate în considerare , 11 au prezentat tumori T4 sau metastaze la distanță toate cu prognostic fatal indiferent de clasificarea tumorei; la trei pacienți nu a fost efectuată limfadenectomie , iar doi dintre ei au prezentat o combinație rară T3 N0. Prin comparare cu masurătorile citometrice și morfometrice ale ADN-ului celulei singulare , măsuratori efectuate anterior la aceeași serie de carcinoame orale, evaluarea frecvenței mitotice a arătat o mai mare validitate a prognosticului în modelul Cox.

Analiza statistică a reproductibilității intra și interobservatorii și a omogenității tumorale

Limita de 95% a încrederii asupra evaluării frecvenței mitotice include o eroare complexă ca o consecință a variațiilor negative care apar pe parcursul analizelor statistice. Valorile au fost +/- 6 mitoze pentru reproductibilitatea intraobservatorie, +/- 9 mitoze pentru cea interobserva-torie și de +/- 8 mitoze pentru omogenitatea tumorei. Limita de încredere reală de 95% a fost estimată ca aproximativ +/- 1 mitoză. Investigațiile precedente asupra reproductibilității intra și interobservatorii și asupra omogenității tumorei au utilizat parametri din citometria și morfometria ADN-ului acelorași subiecți prinși în acest studiu demonstrând valori comparabile pentru rata de acceptabilitate de 95% , indicând o valabilitate echivalentă între morfometria cu citometria ADN și măsurarea frecvenței mitotice.

PARTEA

PERSONALA

Material și metodă:

Au fost prelevate specimene provenind de la 15 cazuri de carcinoame orale umane de la nivelul palatului, gingiei alveolare și mandibulei. 3 cazuri au provenit de la pacienți cu adenopatie metastatică bilaterală submento-submandibulară. Fragmentele de țesut au fost obținute prin biopsie.

Microscopia fotonică și electronică

Microscopie fotonică:

Secțiunile realizate la parafină au fost supuse unei colorații de control cu hematoxilină-eozină.

Fragmentele de țesut au fixate în formol. Ulterior au fost spălate în apă curentă.

Includerea fragmentelor de țesut s-a realizat în parafină, ca agent de clarificare fiind utilizat xilolul.

Secțiunile au avut grosimi cuprinse între 4 și 10 microni.

Tehnica colorării cu hematoxilină-eozină:

Deparafinarea s-a efectuat cu xilol (2 minute)

Hidratarea s-a efectuat cu alcool în concentrații descrescătoare (2 minute, fiecare etapă)

Colorarea cu hematoxilină, 10 minute

Spălarea cu apă distilată

Colorarea cu eozină, 7 minute

Spălarea cu apă distilată

Deshidratarea cu alcool în concentrații crescătoare (2 minute, fiecare etapă)

Clarificarea s-a efectuat cu xilol (2 minute)

Montarea secțiunilor în balsam de Canada.

Pentru a pune în evidență componentele desmozomale (desmoplakină, desmogleină și desmocolină) și citokeratinele s-a utilizat tehnica de imunolocalizare cu complexul avidin-biotin peroxidaza împreună cu anticorpi specifici.

Tehnica imunohistochimică:

Fixarea a fost realizată în formol calciu 10%

Includerea fragmentelor de țesut s-a realizat în parafină, ca agent de clarificare fiind utilizat xilolul

Secțiunile efectuate la microtom au avut grosimi cuprinse între 3 și 10 microni.

Tehnica de lucru cu complexul avidin/biotin:

Deparafinarea secțiunilor în xilol, 5 minute

Spălarea în 2 băi de alcool absolut

Incubarea în metanol absolut (care conține 20% peroxid de hidrogen), 15 minute

Spălarea în 2 băi de alcool absolut și apoi în apă curentă

Incubarea în 1:5 ser normal de porc timp de 20 de minute

Se îndepărtează excesul de ser de pe lame și se incubează cu anticorpul primar, 30 minute

Spălare sub jet în soluție tampon salină TRIS/HCl, pH 7,6 (TBS)

Spălare în TBS, 3 minute

Incubare în al doilea anticorp, 30 minute

Spălare sub jet în TBS

11.Spălare în TBS, 3 minute

Incubare în complexul avidin/biotin

Spălare sub jet în TBS

Spălare în TBS, 3 minute

Incubare în soluție DAB, 10 minute

16.Spălare în apă curentă

Incubare în sulfat de cupru 0,5% în clorură de sodiu 0,9%, 30 minute

Spălare în apă curentă

Contrastare cu hematoxilină

20.Deshidratare, alcool în concentrații crescătoare

Clarificare, xilol.

Metoda a fost utilizată pentru a pune în evidență componentele desmozomale.

Vizualizarea rezultatelor s-a realizat cu ajutorul unui microscop de tip Olympus.

Microscopie electronică:

Probele au fost prelucrate prin tehnica uzuală de microscopie electronică si incluse în Epon 820.

Tehnica de microscopie electronică:

Fragmentele de țesut au fost fixate în glutaraldehidă tamponată și postfixate în tetraoxid de osmiu.

Ulterior au fost deshidratate în acetonă în vederea includerii.

Includerea s-a realizat în Epon 812, în capsule de gelatină.

Secționarea s-a realizat cu ajutorul unui ultramicrotom, cu cuțite de sticlă.

Contrastarea secțiunilor s-a efectuat cu citrat de plumb.

Secțiunile au fost etalate pe grile de cupru și observate la microscopul electronic de transmisie, Philips CM100.

Vizualizarea rezultatelor s-a utilizat un microscop electronic de transmisie de tip Philips CM100.

Achiziția imaginilor s-a efectuat cu ajutorul unui soft de tip analySIS.

Rezultate:

S-au urmărit dezorganizarea zonelor de cuplaj celular în carcinoamele orale, prin reducerea sau chiar dispariția joncțiunilor intercelulare (desmozomilor).

Lucrarea de față s-a axat si pe studiul glicoproteinei desmozomale numită desmocolină. S-a încercat de asemenea sa se determine și măsura în care stadiul de diferențiere al tumorii se reflectă în prezența citokeratinelor 1, 3 și 19.

Colorarea secțiunilor cu hematoxilină-eozină și examinarea cu microcopul Olympus, au confirmat din punct de vedere histologic existența procesului malign (fig.1,2, 3a și 3b).

Fig.1(HE, x20)

Fig.2 (HE, x20).

Fig.3a (HE, x20).

Fig. 3b (HE, x40).

Imunohistochimie:

În urma realizării tehnicii imunohistochimice s-a remarcat o reacție moderată a proteinelor desmozomale la nivelul tumorilor provenite de la pacienții fără adenopatie metastatică (fig. 4a, 4b și 4c).

Fig. 4a (A/B, x20)

Fig. 4b (A/B, x20)

Fig. 4c (A/B, x20)

S-a remarcat o lipsă a imunoreactivității în cazul tumorilor provenind de la pacienți cu adenopatie metastatică (fig. 5).

Fig. 5 (A/B, x20)

Imaginile de microscopie electronică de transmisie obținute, au relevat că la nivelul tumorilor provenind de la pacienții fără adenopatie metastatică sunt prezenți desmozomi normali dar au putut fi observați și desmozomi aflați în diferite grade de dezorganizare (fig. 6a, 6b, 6c și 6d).

Fig. 6a

Fig. 6b

Fig. 6c

Fig. 6d

Probele prelevate de la pacienții cu adenopatie metastatică au indicat faptul că există o alterare importantă până la dispariție a structurilor desmozomale (fig.7a și 7b).

Fig.7a

Fig. 7b

Discuții:

Din moment ce gama de opțiuni pentru tratamentul pacienților cu cancer oral se lărgește continuu , stabilirea unui prognostic valabil pentru fiecare caz în parte devine proporțională ca importanță cu scopul de a stabili o conduită terapeutică individualizată. Până acum deciziile au fost efectuate pe baza gradului tumorei , mărimea acesteia , statusul nodulilor limfatici , tratamentul chirurgical și aplicarea de terapie adjuvantă variind.

Concluzii:

Studiile corelate de imunohistochimie și microscopie electronică au indicat că:

Reducerea numărului de desmozomi reprezintă o slabă adezivitate celulară fiind corelată cu metastazarea tumorilor

Dispariția răspunsului imun pentru cele 3 componente desmozomale (ceea ce indică o expresie redusă a acestora) este corelată cu invazia tumorală și metastazare

Studiile de microscopie electronică au demonstrat existența unei corelații semnificative între aspectul ultrastructural al desmozomilor și dezorganizarea joncțiunilor, ceea ce va conduce la promovarea metastazelor și a comportamentului invaziv.

Transformările ultrastructurale cât și cele puse în evidență prin metode imunologice pot constitui markeri de pronostic în cancerul oral.

BIBLIOGRAFIE

Benga Gh. , Biologie celulara si moleculara . Ed. Dacia Cluj , 1985 : 47 – 209 , 228 – 265

Chita O. , Rogoz I. , Cruce M. , Mixich F. , Biologie celulara – curs. Xerografia Univ. 1987 , 124-139

Citi S. , The molecular organization of tight junctions. J. Cell Biology , 1993 , 121: 485 – 489.

Cooper G.M. , Oncogenes. Second Ed. , Boston Jones , Bartlett , 1995: 38 – 104

Cotrutz C. , Cotrutz Carmen , Ionescu C.R. , Manual de lucrari practice de biologie celulara , Ed tehnica , Chisinau , 1994: 176 – 211

Cotrutz C. , Curs de biologie celulara , Xerografia Univ. , 1985 , 14 – 39 , 120 – 124

Cruce M. , Biologie celulara si moleculara , Ed. 2 , Ed. Aius Craiova , 2000,161-222

Cowin P , Garrod DR , 1983 , Antibodies to epithelial desmosomes show wide tissue and species cross – reactivity. Nature 302: 148 – 151

Cowin P , Kapprell H-P , Franke WW , Tamkun J , Hynes RO , 1986 Plakoglobin : A protein common to different kinds of intercellular adhering junctions. Cell 46 : 1062-1073

Gumbiner B.M. , Cell Adhesion ; The molecular basis of tissue architecture and morphogenesis , Cell , 1996 , 84 : 345 – 357

Kumar N.M. , Gilula N. , The gap junction communication channel , Cell , 1996 , 84 : 381 – 388.

Mixich F. , Biologie celulara si moleculara , Ed. Sitech , Craiova , 1997 : 198 – 278

Schmeiz M , Duden R , Cowin P , Franke WW , 1986 , A constitutive transmembrane glycoprotein of M , 165 000 (desmoglein) in epidermal and non-epidermal desmosomes

Simon Z. , Schneider F. , Aspecte actuale de biologie si fiziologie moleculara , Ed. “Viata medicala Românească”, București 1998 , 75 – 133

Stanley JR , Foidart J-M , Murray JC , Martin GR , Kats S , 1982 , The epidermal cell which selectively adheres to a collagen substrate is the basal cell. J. Invest Dermatol 74 : 54 – 63

Stanley JF , Beckwith JB , Fuller RP , Kats S , 1983 A specific antigenic defect of the basement membrane is found in basal cell carcinoma but not in other epidermal tumours. Cancer 50 : 1486 – 1496.

Vogelstein B. , Kinzler K.W. , The multistep nature of cancer , Trends Genet. , 1993 , 9: 138 – 141

Westgate GE , Weaver AC , Couchman JR , Shaw DA , 1984 , Immunohistochemical localization of basement membrane components during hair follicle morphogenesis. J Invest Dermatol 82 : 259 – 264.