Culturile In Vitro Vegetale

INTRODUCERE

Începând cu anul 1975, culturile in vitro vegetale au prezentat o dezvoltare intensă. În laboratoarele științifice s-au dezvoltat diferite metode de a cultiva plante, semințe, embrioni, diferite tipuri de butași, meristeme, țesuturi definitive și chiar celule, cu scopul de a produce, de a regenera indivizi viabili, iar începând din anii 1980, biotehnologia vegetală a cunoscut și cunoaște încă, o explozie, mai ales prin dezvoltarea tehnicilor de manipulare genetică (Pietrick, 1997; Petruș-Vancea și colab., 2013).

Antibioticele au fost utilizate în mod extensiv și eficient atât în medicina umană, cât și în medicina veterinară. Beneficiile au fost vizibile în agricultură, acvacultură, apicultură ca și accelerator de creștere. Numeroase antibiotice au fost raportate pentru efectele produse de acestea în resursele de apă, apă uzată, nămoluri, sol, plante și organisme de pe întregul glob. Absorbția, fotodegradarea, biodegraderea și oxidarea au fost recunoscute ca principalele căi de eliminare pentru acești compuși și au fost discutate în detaliu. Efectele adverse ale acestor poluanți au fost evidențiate prin monitorizarea eficientă și diminuarea efectului de poluare (Gothwal și Shashidhar, 2014).

Încă de la începutul „erei antibioticelor” majoritatea efectelor pe care acestea le au asupra plantelor au fost de inhibare a creșterii. Aceste rezultate au condus la studierea efectelor antibioticelor și în condiții in vitro asupra germinației semințelor sub condiții standarde de laborator și într-un mediu steril (Nickell și Finlay, 1954).

Importanța antibioticelor asupra culturilor in vitro vegetale este evidențiată de efectul produs de acestea asupra germinației, asupra creșterii și dezvoltării inoculilor, având fie un caracter inhibitor sau stimulator asupra plantelor, dar și de modificările privind structurile morfologice, anatomice și genetice ale acestora. Pornind de la cercetările fundamentale asupra stresului exercitat de factorii abiotici asupra plantelor cultivate in vitro, se pot continua cercetări legate de creșterea rezistenței plantelor la astfel de factori de mediu, dar acestea sunt de interes doar la speciile ornamentale și nu la cele alimentare, deoarece antibioticele se pot acumula în organismele vegetale (Fodor și colab., 2012; Șandor și colab., 2012).

Scopul acestei lucrări a fost de a evidenția efectul antibioticelor amoxacilină și tetraciclină, în concentrații diferite, asupra a speciei de triticale (Triticosecale wittmack), în condiții in vitro. Doresc să mulțumesc Universității din Oradea pentru sprijinul acordat în vederea elaborării acestei lucrări de cercetare, precum și d-nei sef lucr. dr. Adriana Petruș.

2. ANTIBIOTICELE ȘI EFECTUL LOR

2.1. Caracteristici generale

Termenul „ antibiotic” a fost inventat în anul 1942 și descrie orice substanță produsă de un microorganism și ulterior sintetizată chimic, ce are un efect antagonic creșterii microorganismelor. Există o mare varietate de antibiotice care lucrează ca bactericide sau medicamente bacteriostatice folosite în tratarea și prevenirea bolilor umane și animale (Zimdahl, 2015). Lucrările de cercetare științifică indică faptul că funcționarea acestora în rezervoarele mediului poate avea un rol diferit față de rolul de „armă-scut” pe care îl joacă în situațiile clinice. Modificări în ecosistemele actuale inclusiv eliberarea unor cantități de substanțe antimicrobiene ar putea modifica dinamica populației microbiene inclusiv selectarea genelor de rezistență față de antibiotice având astfel consecințe asupra sănătății umane greu de prezis (Martinez, 2008).

2.2. Poluarea cu antibiotice

Antibioticele sunt cele mai utilizate și de succes medicamente folosite în terapia umană, însă acestea pot face față și populațiilor microbiene, fiind astfel considerate și poluanți importanți. Cele mai clare consecințe ale utilizării antibioticelor în mediul înconjurător natural sunt reprezentate de selecția bacteriilor rezistente. Cu toate acestea efectul antibioticelor asupra biosferei este mare și poate avea un impact semnificativ asupra structurii și mediului microbian (Martinez, 2008).

După Michael și colaboratorii (2014), fiind împrăștiate de fluxuri de deșeuri, acestea poluează sistemele acvatice, ce cuprind bacterii care posedă gene rezistente pe elementele mobile ale ADN-ului. Bacteriile ce conțin gene de rezistență la antibiotice pot fi identificate într-un eșantion de organisme, atât marine cât și terestre, inclusiv în genomul speciilor crescute pentru consum. Răspândirea acestor gene va avea consecințe imprevizibile pentru ambele organisme native, dar și asupra bunăstării umane. În această circumstanță ecosistemele acvatice vor deveni reactoare evolutive pentru recombinarea ADN. În cazul în care noi gene pot fi asamblate în elemente de ADN din ce în ce mai complexe se va putea determina apariția tot mai mare de noi specii de bacterii.

Kumar și colaboratorii (2005), arată că un procent ridicat de antibiotice este adăugat la hrana pentru animale de unde se excretă prin urină sau se elimină în gunoiul din grajd, urmând ca acestea să ajungă pe suprafața solului sau subteran cauzând astfel poluarea. Majoritatea antibioticelor dispersate în sol sunt greu degradabile. O preocupare importantă în protejarea mediului este monitorizarea prezenței antibioticelor în sursele de apa potabilă. Tetraciclinele și penicilinele, două dintre cele mai frecvente antibiotice utilizate în agricultura animală, au fost rareori găsite în apa potabilă însă a fost raportată prezența câtorva bacterii rezistente în apele de suprafață. Toxicitatea asupra microflorei, plantelor și faunei este puțin probabilă datorită cantității reduse de antibiotice, însă scăderea în anumite elemente a populațiilor microbiene din sol poate fi cauzată de utilizarea îngrășământului cu antibiotic, care poate duce la pierderea de surse de alimente pentru alte microorganisme din sol, care la rândul lor pot afecta procese importante ale solului, precum descompunerea ți mineralizarea.

Zheng și colaboratorii (2011) au studiat poluarea cu antibiotice a râului Jiulong și au analizat concentrația a 22 de antibiotice aflate în mostrele de apă prelevate din 17 locuri. Contaminarea cu sulfonamide, chinolon și cloramfenicol a fost des întâlnită în distribuția probei de antibiotice și astfel autorii menționați anterior au arătat prezența acestora în zona râului și în aval. Pentru descoperirea efectelor ecologice, au fost izolate 35 de tulpini bacteriene și s-a demonstrat că 97,1% din bacterii au prezentat rezistență la antibiotice, iar 70,6 % din tulpini au arătat o multi rezistență, în special la sulfonamide.

Apariția și îndepărtarea antibioticelor sulfametoxazol (SMZ), sulfatiazol (SFI), sulfametazine (SMA), trimetoprim (TMP), tetraciclina (TC), oxitetraciclina (OTC), clorotetraciclina (CTC) și enrofloxacina (EFX) au fost examinate utilizând mlaștinile pentru tratarea apelor reziduale ale animalelor. Nivelul de antibiotice în mlaștini au fost în ordinea urmatoare: clorotetraciclina, sulfatiazol, sulfametoxazol, sulfametazina, trimetoprim, oxitetraciclina, enrofloxacina și tetraciclina variind de la o concentrație de 48.98 respectiv la o concentrație de 6834.66 μg/L. A existat o corelație inversa între grupul sulfonamidelor (SMZ, SFI și SMA) și grupul tetraciclinelor indicând faptul ca antibioticele din grupul sulfonamidelor au fost eliminate într-un mod mai eficient. Antibioticele din grupul sulfonamidelor au valori pKa mai mari rezultând o adsorbție mai eficientă în solurile încărcate negativ prin interacțiune electrostatică. Experimentul luminii fotodegradabile arata ca EFX a fost eliminat într-un mod eficient (70%) comparativ cu alte antibiotice. Experimentul adsorbției microcrosmosului folosind soluri umede sub condiții de stres biotic și abiotic au arătat că antibioticele aflate în sistem biotic au fost eliminate cu o eficiență mai mare decât cele din sistemul abiotic indicând faptul că degradarea microbiană mediată în sol poate fi un mecanism de îndepărtare major în solurile mlăștinoase. Experimentele de adsorbție au fost efectuate utilizând în microcosmos plante din zone umede (Phragmites australis) au evidențiat ca sistemul biotic a eliminat antibioticele de tip sulfonamide într-un mod mai eficient comparativ cu sistemul abiotic. Rezultatele sugerează că eliminările antibioticelor din zonele mlăștinoase sunt mediate de biodegradarea și adsorbția pe plante și sol. De asemenea proprietățile fizico-chimice pot fi factori importanți în eliminarea antibioticelor din zonele mlăștinoase. Rezultatele noastre sugerează faptul că sistemul zonelor mlăștinoase poate fi folosit pentru îndepărtarea antibioticelor și pentru tratarea apelor reziduale ale animalelor (Choi și colab., 2016).

2.3 Efectul antibioticelor asupra organismelor vii

2.3.1. Efectul antibioticelor asupra criptogamelor

După Edlund și Nord (2000), administrarea orală de antibiotice pentru tratamentul infecțiilor tractului urinar poate provoca tulburări în microflora intestinala. Medicamentele slab absorbite pot ajunge în colon în stare activă suprimând microroganismele sensibile și perturbând echilibru ecologic. Ampicilina, amoxacilina si coamoxiclav reprimă atât microflora intestinală aerobă, cât și pe cea anaerobă, determinând creșterea rezistenței la ampicilină a enterobacteriaceelor. De asemenea, pivmecilina afectează microflora intestinală și conduce la suprimarea bacteriei Escherichia coli, dar nu are un efect major asupra microflorei anaerobe. Mai multe cefalosporine administrate oral cum ar fi: cefixim, cefpodoxim, cefprozil reduc numărul de enterobacteriacee și produc creșterea numărului de enterococi. Când agenții antimicrobieni sunt prescriși pentru tratamentul infecțiilor tractului urinar trebuie luat în considerare nu numai spectrul antimicrobian al agentului ci și potențialele tulburări ecologice inclusiv riscul apariției unor tulpini rezistente.

Prezența antibioticelor în mediu poate avea efecte nocive și asupra organismelor acvatice cum ar fi microalegele care sunt adesea utilizate ca indicatori biologici de poluare. Prin urmare a fost evaluată toxicitatea indusă de cloramfenicol, florfenicol și oxitetraciclină, 3 antibiotice utilizate pe scara largă în acvacultură pe microalga marină Tetraselmis suecica, fiind analizată inhibarea creșterii și parametri fiziologici și biochimici ai acestei specii. Aceste antibiotice – în concentrații ridicate – au inhibat creșterea microalgei observându-se o scădere a esterazei, aceasta fiind legată de viabilitatea celulară. Parametrii de fotosinteză și autofluorescență au fost, de asemenea, modificați, după 24 de ore, datorită surplusului cantității de antibiotice, dovedindu-se, astfel, sensibilitatea microalgei Tetraselmis suecica față de acestea (Seoane și colab., 2014).

Un efect secundar, inevitabil, al utilizării antibioticelor este apariția și difuzarea de bacterii rezistente. Majoritatea studiilor retrospective și prospective arată că, după utilizarea unui antibiotic, nu numai nivelul de rezistență al bacteriilor patogene, dar de asemenea și cel al bacteriilor comensale, crește (Van den Bogaard și colab., 2000).

2.3.2. Efectul antibioticelor asupra animalelor

În cazul crustaceelor de apă dulce și anume Daphnia magna au fost investigate toxicitatea a 9 antibiotice (Wollenberger, 2000) utilizate atât în domeniul terapeutic, cât și ca promoter de creștere în agricultură. Antibioticele folosite în cercetare au fost: metronidazol, olaquindox, acid oxolinic, oxitertraciclină, streptomicină, sulfadiazină, tetraciclină, tiamulin și tilozină utilizate conform procedurilor standard. Ordinea descrescătoare a toxicității acute înregistrate este: acid oxolinic), tiamulin (40 mg/l), sulfadiazină (221 mg/l), streptomicină (482 mg/l), tilozină (680 mg/l ) și oxitetraciclină (~ 1000 mg/l). Concentrațiile care nu au determinat nici un efect au fost: 340 mg/l pentru tetraciclină și 1000 mg/l pentru metronidazol și olaquindox. Efectele toxice asupra reproducerii au avut loc la concetrații ce au fost sub nivelul toxic acut. Toxitatea cronică de reproducere la Daphnia magna însă a fost înregistrată astfel în ordinea descrescătoare: tiamulin (5,4 mg), sulfadiazină (13,7mg), tetraciclină (44,8 mg) și oxittetraciclină (46,2mg). Fără nici un efect asupra reproducerii s-au înregistrat la loturile tratate cu: 0,38 mg/l acid oxolinic, 32mg/ l streptomicină, 45 mg/ l tilozină și 250 mg/l metronidazol. Toxicitatea dată de acidul oxalinic la Daphnia magna indică faptul că această substanță care este un aditiv pentru hrana animalelor – utilizată în mod obișnuit în fermele piscicole, are un potențial de a provoca efecte adverse asupra mediului acvatic (Wollenberger, 2000).

2.3.3. Efectul antibioticelor asupra plantelor aflate în condiții naturale de viață

Antibioticele au fost folosite încă din 1950 pentru a controla anumite boli bacteriene ce afectau fructele, legumele și diferite plante ornamentale. Astăzi, antibioticele utilizate cel mai frecvent în sfera plantelor sunt oxitetraciclina și streptomicina. Rezistența agenților patogeni la oxitetracilina este rar întâlnită, însă pot apărea tulpini rezistente la streptomicină la bacterii precum: Erwinia amylovora, Pseudomonas spp. și Xanthomonas campestris, ceea ce împiedică controlul asupra mai multor boli importante. O fracțiune de gene rezistente la bacterii față de streptomicină în cazul plantelor sunt similare cu cele întâlnite la bacteriile izolate de la om , animale si din sol însă acestea sunt distincte din punct de vedere genetic (McManus și colab., 2002).

2.3.4. Efectul antibioticelor asupra plantelor cultivate in vitro

În ceea ce privește creșterea și dezvoltarea plantelor in vitro a fost studiat efectul a 5 antibiotice: carbenicilina, cloramfenicol, cefatoxim, kanamicină și higromicină asupra organogenezei culturilor de calus a speciei Coryphantha elphantidens Lem. Toate antibioticele au suprimat înrădăcinarea lăstarilor cultivați in vitro, iar carbenicilina și cefatoximul au stimulat regenerarea lăstarilor din calus. După 5 subculturi pe mediu suplimentat cu kanamicină a fost obținută rezistența față de antibiotice. Cantitatea totală de proteine conținută de calus a crescut o dată cu creșterea rezistenței acestuia la antibiotice, iar lăstari selectați din mediul cu kanamicină au rezistat testului de stabilitate (Bhau și Wakhlu, 2001).

Transformarea genetică a plantelor necesită o selecție de bază non-himeră a țesuturilor transformate și regenerarea ulterioară a acestora. Cu rare excepții, cele mai multe protocoale de transformare se bazează încă, în mare măsură, pe antibioice pentru selectarea celulelor transgenice care conțin o genă marker de selecție și degradare a antibioticelor. Aici capacitatea morfogenică a culturilor de țesuturi de Chrysanthemum și Tabacco cultivate in vitro, respectiv a tulpinilor și frunzelor s-a schimbat datorită absorbției antibioticelor amiloglicozidice. Fitotoxicitatea a 6 antibiotice a fost demonstrată în concentrații de 10 până la 25 și 50 până la 100 ng ml.−1 . Utilizarea unor structuri celulare, împreună cu un nivel ridicat de selecție a amiloglicozidelor inițiale au sprijinit regenerarea lăstarilor și a calusului înregistrându-se un număr scăzut de pierderi. În urma unor analize nu a fost înregistrată nici o endoduplicare la crizanteme, chiar și în concentrații ridicate, însă la tutun se observă acest fenomen chiar și la o concentrație mică a acestora (Teixeira da Silva și Fukai, 2003).

3. RĂSPUNSUL PLANTELOR LA DIFERITI FACTORI BIOTICI SAU ABIOTICI

3.1. Stresul biotic

Capacitatea de a stabiliza și de a crește celule, țesuturi, organe și culturi de plante a fost explorată pentru cercetări fundamentale și de aplicabilitate, precum și pentru producția industrială de plante. Riscurile de contaminare microbiană sunt rezultate experimentale false, ca urmare a contaminării lantente sau a pierderilor de culturi experimentale și comerciale valoroase (Casells, 2012). Accentul a căzut pe eliminarea fitopatogenilor și menținerea culturilor libere față de contaminarea cu bacterii din mediu, ciuperci denumite „agenti patogeni in vitro” și microartropode „dăunători in vitro-. Contaminarea microbană a culturilor de plante este cauzată de disponibilitatea mare de nutrienți din mediul de cultură universal folosit Murashige – Skoog (1962) sau alte variante ale acestuia. În ultimii ani s-a dovedit că multe plante au fost endofitic colonizate de bacterii. Aceste bacterii patogene intracelulare, precum și virusurile și viroizii, pot trece latent în culturi răspândindu-se, atât vertical, cât și orizontal. Accesibilitatea tot mai mare și diagnosticarea moleculară au dus la progrese multiple, față de factorii patogeni și față de detectarea contaminării latente (Casells, 2012).

Agenții patogeni clasificați ca fiind procariote au structură simplă și dimensiuni mici,. Detectarea și identificarea factorilor patogeni bacterieni la plantele întregi, dar și la explante sunt posibile prin izolarea pe medii de cultură a acestora și prin metode de amprentare metabolică (Naraynasamy, 2010). Astfel protecția culturilor devine o cerință de bază a agriculturii durabile, pentru a asigura creșterea culturilor de producție. În promovarea creșterii plantelor, rizobacteriile joacă un rol important în biocontrolul agenților patogeni la plante. Toate mediile de cultură sunt colonizate cu microbi, între 1% și 3% dintre culturile microbiene au capacitatea antaginică de inhibarea a creșterii agenților patogeni in vitro, prin diverse mecanisme de biocontrol (Pandya și Saraf, 2014).

Virusurile plantelor diferă în mod semnificativ față de alți agenți microbieni patogeni, datorită structurii simple și metodei de replicare ce implică obligatoriu parazitismul. Astfel, și aceștia pot provoca diferite boli importante la plante. În funcție de proprietățile lor biologice, morfologice, imunologice și genomice au fost abordate mai multe metode pentru identificarea, cuantificarea și diferențierea virusurilor. Metode biologice de diagnosticare au fost utile pentru detectarea viroizilor, datorită acțiunii acestora asupra plantei gazdă. Deoarece este imposibil de a vindeca planta deja infectată cu virusuri sau viroizi, opțiunea disponibilă practic este eliminarea plantelor infectate, însă aceasta duce la efecte devastatoare asupra producției vegetale. Pentru a evita o astfel de posibilitate trebuie acordată o atenție adecvată în detectarea timpurie a virusurilor din semințele infectate și din materialele cu înmulțire vegetativă (Narayanasamy, 2010).

Plantele infectate cu virusuri sunt adesea lipsite de simptome și pot fi utilizate accidental ca surse de explante în cercetarea culturilor de țesuturi in vitro. Obiectivul este de a determina efectul infecției cu virus în micropropagare. S-a studiat efectul infecțiilor a 3 tipuri de virusuri din zmeur pe culturi de zmeur roșu (Rubus idaeus L.). Plantele de zmeur infectate au fost produse prin inocularea in vitro a grefelor de frunze din plante cunoscute infectate cu virusuri libere. Plante afectate de un singur virus au fost infectate fie cu baleiaj de tutun ilarvirus (TSV), pătarea tomatelor cu nepovirus (TomRSV), idaeovirus de zmeura stufos pitic (RBDV) și alte tipuri de virusuri determinate de testul imunoendoenzimatic și alte bioteste. La sfârșitul încercărilor de multiplicare, testul ELISA a confirmat prezența infecțiilor virale, aceasta fiind redusă semnificativ, iar multiplicarea plantelor infectate cu cele 3 tipuri de virusuri a reprezentat mai mult de jumătate din culturile infectate cu virus liber. Planta infectată cu cele 3 tipuri de virusuri s-a oprit din creștere avand si un aspect de culoare galbenă. (Tsao și colab., 2000).

Printre agenții ce produc un stres biotic asupra plantelor se numără și ciupercile fungice patogene, care au dezvoltat un talus format din hife. Caracteristicile morfologice ale acestor structuri sunt de diferite tipuri și stau la baza identificării și clasificării agenților patogeni. Cu toate acestea formele speciale, tulpinile, soiurile și biotipurile trebuie identoficate cu ajutorul altor caracteristici precum: patogenitatea, proprietățile biochimice și imunologice sau a secvențelor de nucleotide a ADNului genomic. Posibilitatea de a detecta doi agenți patogeni simultan a devenit reală după dezvoltarea tehnologiei ADN-ului, identificându-se agenți fungici din explante, plante infectate și produse post-recoltare (Narayanasamy, 2010).

3.2. Stresul abiotic

Seceta, condițiile scăzute de temperatură, salinitatea și căldura sunt factori abiotici de stres care reduc drastic producția de culturi alimentare la nivel mondial. Abordările tradiționale de ameliorare și de îmbunătățire a toleranței culturilor plantelor față de stresul abiotic a avut un succes limitat din cauza structurii multigenice față de toleranța la stres. În ultimele decenii tehnicile moleculare au fost utilizate pentru a înțelege mecanismele prin care plantele percep semnalele din mediu și transmiterea în continuare la mecanismele celulare pentru a activa răspunsurile adaptative. Această cunoașterea fost esențială pentru dezvoltarea strategiilor transgenice de a induce toleranța față stresul abiotic. O înțelegere completă a mecanismelor fiziologice și moleculare, în special a celor de semnalizare, se regăsește în răspunsul toleranței plantelor față de stresul abiotic și vor ajuta la manipularea plantelor de cultură sensibile și a creșterii productivității (Mantri și colab., 2011).

Efectele acestor tensiuni asupra plantelor sunt de obicei studiate în condiții de control al creșterii, în laborator. Mediul natural de viață este foarte diferit față de cel de laborator și implică de multe ori expunerea simultană a plantelor la mai mult de un factor de stres abiotic, cum ar fi combinația de secetă și temperaturi scăzute sau salinitate și căldură, sau la oricare dintre tensiunile abiotice combinate cu diverși factori patogeni rezultând un răspuns mai complex al plantelor (Suzuki și colab., 2014).

Este clar că există o varianță genetică substanțială în răspunsul la stres, în funcție de diversitatea speciilor de plante. Exploatarea unei asemenea variații în reproducere convențională a condus la formarea unor varietăți de specii tolerante la anumite tipuri de stres. Creșterea cererii pentru produsele alimentare și a produselor pe bază de plante, înseamnă o nevoie de dezvoltare mai rapidă a soiurilor corespunzătoare (Grant, 2011).

Salinitatea solului este larg recunoscută ca o amenințare majoră la adresa siguranței alimentare. Salinitatea și alți factori abiotici se așteaptă să fie tot mai frecvent întâlnite în viitor, din cauza unor dereglări climatice. Mai multe abordări au susținut ca soluția cea mai logică pentru a rezolva problema salinității este acea de a spori toleranța față de aceasta a plantelor de cultură. Datorită complexității genetice și fiziologice asociate cu toleranța la sare s-a ajuns la un rezultat limitat în controlarea acesteia. Deși s-au înregistrat progrese descifrarea bazei genetice a rezistenței la sare sunt necesare eforturi pentru a diseca sistematic și de a utiliza, prin tehnici moderne, variabilitatea naturală din „utilajele” genomice pentru a îmbunătății culturile din mediul salin. În acest scop sunt necesare mecanisme ale reproducerii convenționale, analize fiziologice, selecții marker și tehnologiile transgenice (Karan și Subudhni, 2011).

Temperatura ridicată reprezintă de asemenea un stres abiotic limitativ în procesul de fotosinteză a plantelor precum și în producția de biomasă și productivitatea culturilor. Aparatul fotosintetic este un important senzor termic recepționând o gama largă de temperaturi din aer, pornind de la cele moderate și până la cele extreme. Stresul abiotic termic provoacă schimbări la nivel fotochimic și metabolic afectând în mod direct starea sensibilă față de căldură și degajarea oxigenului în complexul fotosintetic II și a enzimelor Rubisco. Răspunsul la stres implică producerea de proteine specifice sau a compușilor de protecție care duc la creșterea stabilității termice. Diferite molecule contribuie la caile de semnalizarea a fotosintezei cu privire la stresul termic precum si categoriile reactive de oxigen cu preoxid de hidrogen, oxidul nitric, calciul și acidul abscisic (Brestic și colab., 2013).

Descoperirile recente în abordările geneticii moleculare au arătat noi perspective în răspunsul plantelor la factorii termici ridicați. O caracteristica izbitoare a fost că acestea conțin familii multigene extrem de complexe care codifica HPS. Observațiile recente au arătat că răspunsul termic se suprapune cu alți factori de stres (Krishna, 2004).

Prosopis juliflora este o specie de arbore care crește în diferite locuri industriale poluate cu metale grele pe care le și acumulează și care reprezintă o altă sursă de stres abiotic. Pentru a înțelege posibila contribuție a metalotioninelor în acumularea de metale grele la Prosopis juliflora s-au izolat și s-au comparat capacitatea a 3 tipuri diferite de metalotionine: PjTM1, PjTM2 și PjTM3. Analizele proteinelor legate prin fuziune în urma utilizării spectronomiei de absorbție a arătat că nivelele de PjTM1 sunt mai ridicate decât PjTM2 si PjTM3 față de metale grele precum cupru, cadmiu sau zinc. Varianța în inducerea de PjTMs ca răspuns la expunerea cu metale și diferitele metode de legare de acestea sugerează că fiecare metalotionin are un rol specific în cadrul speciei P. juliflora. Dintre cele 3 tipuri analizate PjTM1 prezintă o maximă reținere a metalelor grele fiind un potențial candidat în fitoremediare în poluarea cu aceste metale (Usha și colab., 2009).

În aceste cazuri, culturile in vitro au reprezentat un instrument de cercetare. Astfel, răspunsul activităților enzimatice antioxidative și nivelul de exprimare a genelor corespunzătoare privind bioacumularea de fier s-a efectuat asupra plantulelor obșinute in vitroîn urma germinației semințelor de Withania somnifera L. inoculată pe mediu lichid Murashige– Skoog (1962), cu concentrații crescătoare de FeSO4, timp de 7 și 14 zile (Rout și colab., 2014).

O metodă eficientă de screening in vitro a fost dezvoltată pentru a crea linii mutante induse selectate pe un mediu cu hidroxiprolină. Liniile și plantele mutante au fost subcultivate de mai multe ori pe mediu de menținere și depozitate la o temperatura de 5°C, efectuându-se teste pentru salinitate și rezistența la hidroxiprolina, atât la loturile cultivate in vivo, cât și la cele in vitro. Au fost astfel cultivate in vitro, pe medii ce conțin hidroxiprolina și NaCl, timp de 28 de zile și apoi evaluate după conținutul de prolină din frunze. Plantele non-aclimatizate, cât și cele aclimatizate au fost testate și pentru rezistanța la congelare Populațiile martor și liniile selectate au fost ulterior testate pentru NaCl și rezistența la îngheț. Platele de control au arătat o rezistență scăzuta față de NaCl sau hidroxiprolină, în timp ce plantele selectate au arătat diferite grade de rezistență. Conținutul de prolină din frunze a fost semnificativ mai mare în liniile mutante, iar ca urmare a utilizării de NaCl cel mai mare conținut de prolină s-a înregistrat în liniile cu NaCl, comparativ cu liniile martor (Fuller și colab., 2006).

Acidul salicilic este un fitohormon ce joacă un rol important în răspunsul la solicitările biotice și patogeneza plantelor. Studii recente au arătat că acidul salicilic participă la semnalizarea stresului abiotic și acumularea de endogeni abiotici induși de acesta. Acidul salicilic poate oferi protecție asupra mai multor tipuri de tensiuni din mediu, însă prin acumularea de peroxid de hidrogen poate provoca un stres oxidativ asupra plantelor. Efectul aplicării acidului salicilic depinde de numeroși factori, cum ar fi specia plantei la care este aplicat, stadiul de dezvoltare al plantei, modul de aplicare și concentrația acestuia (Hara și colab., 2011).

Cu toate că siliciul (SI) este cel de-al doilea cel mai des întâlnit element chimic atât pe suprafața scoarței Pământului și în soluri, nefiind încă evidențiat printre elementele esențiale pentru plantele superioare. Cu toate acestea rolul benefic al siliciului în stimularea creșterii și dezvoltării multor specii de plante a fost, în general, recunoscut. Siliciul este cunoscut pentru că reduce în mod eficient diverse tensiuni abiotice cum ar fi manganul, aluminiul și efectele toxice ale metalelor grele , salinitatea, seceta și degerarea. Cu toate acestea mecanismele mediate de ameliorare a stresului abiotic al siliciului rămân încă nedeslușite. Mecanismele principale a tensiunilor provocate de stresul abiotic al acestui element în plante includ: stimularea sistemelor antioxidante la plante, complexarea sau co-precipitarea ionilor metalici toxici cu siliciu, imobilizarea ionilor metalici toxici în mediul de creștere, procesele de absorbție și compartimentarea ionilor metalici în interiorul plantelor. Sunt necesare viitoare cercetări în privința reducerii tensiunilor provocate de stresul abiotic mediat de siliciu (Liang și colab., 2007).

3.3. Rezistența plantelor la antibiotice

Medicamentele joacă un rol cardinal în tratamentul, vindecarea și prevenirea bolilor la om, animale și plante. Cu toate acestea ele pot avea afecte neintenționate asupra mediului. Aceste produse farmaceutice au fost eliberate în mediu de ani de zile, dar estimarea lor cantitativă a fost monitorizată recent de către cercetători. Comportamentul de sorbție al solului, al sistemelor de apă și al stațiilor de tratare, determină transportul substanțelor farmaceutice în diferite medii înconjurătoare. Metodele convenționale utilizate pentru îndepărtarea acestor poluanți din mediu sunt costisitoare generând astfel nevoia de noi metode ecologice și economice. Fitoremedierea este o tehnologie care utilizează plantele în reducerea, imobilizarea și degradarea toxinelor din mediu. Această metodă ar putea fi folosită pentru așezări cu nivele scăzute sau moderate de contaminări, fiind o tehnică pasivă. Makhijani și colaboratorii (2014) au studiat efectul tetraciclinelor asupra plantelor de Cicer arietinum crescute in vitro.. Cicer arietinum este cunoscută pentru capacitatea sa de a fitoremedia contaminarea cu metale din sol, de aceea acest studiu a investigat capacitatea lo rîn fitoremedierea poluării cu tetraciclină. Autorii menționași anterior au afirmat că rata fitoremedierii prin utilizarea semințelor de Cicer arietinum a fost promițătoare indicând mai departe viitoarele exploatări pentru îndepărtarea unui eventual poluant din mediu (Makhijani și colab., 2014).

Meng și colaboratorii (2014) au raportat efectele kanamicinei, cefatoximului, carbenicilinei și ampicilinei asupra morfogenezei verzei chinezesti (Bassica rapa L. Ssp. Pekinensis), cultivată pe mediul Murashige-Skoog (1962). Patru antibiotice au avut efect redus asupra inducției de calus, dar a influențat creșterea și diferențierea rădăcinii în diferite grade. Concentrațiile scăzute de kanamicina au inhibat diferențierea de muguri și rădăcini de la calus. De asemenea, s-a constat că cefatoximul, la o concentrație relativ scăzută, a inhibat diferențierea și a întârziat morfogeneza organului. Carbenicilina nu a avut nici un efect evident asupra mugurilor sau diferențierii rădăcinii, în timp ce ampicilina a stimulat diferențierea la o cantitate de 0-1000 mg/L. Concentrațiile mai mari de ampicilina au provocat o mai mare stimulare a diferențierii. La 1000 mg/L ampicilină, diferențierea a ajuns la o frecvență de 93,3% comparativ cu 73,6 % cât semnala la lotul martor, fără suplimente de antibiotice. Astfel, kanamicina poate fi folosită ca agent selectiv pentru țesuturile plantelor care conțin markeri de selecție adecvați, în timp ce ampicilina (la o concentrație mai mare) sau carbenicilina potfi utilizate pentru transformarea genetică a țesuturilor din cultura de varză chinezească (Meng și colab., 2014).

Prin identificarea antibioticelor ce au avut cele mai reduse efecte în ceea ce privește fitotoxicitatea asupra explantelor în timpul transformării genetice s-a evaluat efectul diferitelor antibiotice în inducerea de calus și morfogeneza explantelor din frunze și creșterii culturilor in vitro a speciilor de Fragaria ananassa. Rezultatele au arătat că efectul produs de kanamicină a fost de inhibare semnificativă a inducției de calus, diferențierea mugurilor și morfogeneza rădăcinii, în timp ce carbenicilina și cefatoximul, în concentrații egale de până la 500 mg/l nu au avut efecte semnificative. Kanamicina chiar și în concentrații de 2,5 mg/l a inhibat semnificativ organogeneza plantei în timp ce lăstarii nu s-au regenerat la o concentrație de 15 mg/ l. Înrădăcinarea a fost complect inhibată la concentrații de 50 mg/ l de kanamicină. Cefatoximul a avut efecte negative asupra regenerării rădăcinii din explantele produse in vitro ale căpșunilor. Comparativ cu cefatoximul, carbenicilina la concentrații mai mici de 300 mg/l a promovat semnificativ organogeneza rădăcinii și a lăstarilor. Cu toate acestea, o concentrație egală de carbenicilină și cefatoxim ar putea diminua efectul negativ al cafatoximului asupra plantelor de căpșun. Cefatoximul, carbenicilina și kanamicina declanșează procese enzimatice active și metabolice diverse. Aceasta oferă un posibil mecanism pentru inhibarea sau stimularea creșterii căpșunelor sub acțiunea antibioticelor (Qin și colab., 2011).

Efectul diferitelor concentrații ale antibioticelor amiloglicozidice cum ar fi geneticina, paromomicina și streptomicina au fost testate pentru a proiecta o procedură alternativă în selectarea lăstarilor transgenici ai plantelor de cais (Petri și colab., 2005). Streptomicina si paromomicina au redus procentajele regenerării lăstarilor odată cu creșterea concentrației antibioticelor fiind atinsă aproape o inhibarea completă a regenerării la o concentrație de 20 µM paromomicina, deși la 40 µM de streptomicină s-a atins inhibarea completă. Geneticina a avut efecte foarte toxice asupra frunzei de cais, regenerarea fiind astfel inhibată la aproape toate concentrațiile testate. Adăugarea de kanamicină a grăbit dezvoltarea lăstarilor adventivi, deși tiosulfatul de argint și nu kanamicina ar fi responsabil pentru creșterea constantă a acestora observată în rezultatele experimentale independente. Kanamicina și paromomicina la concentrațiile testate au îmbunătățit selecția celulelor transformate și a dus la un număr mare de regiuni cu proteine verzi fluorescente: Paromomicina la 40 µM și kanamicina la 05,7 µM au îmbunătățit proliferarea celulelor transformate față de utilizarea altor antibiotice sau a altorvariante neselectate (Petri și colab., 2005).

Grzebelus și Skop (2014) au studiat protoplaștii a 3 soiuri de morcov care au fost izolați din plantulele cultivate in vitro și incubate în perioada de întuneric într-un amestec enzimatic compus din 1% celuloza Onozuka R – 10 și 0,1% pectoliază Y- 23. După imobilizarea celulelor în straturi de alginat subțire și modificat au fost adăugate 3 tipuri de antibiotice beta-lactamice (cefatoxim, carbenicilina, timetin) în concentrații diferite de la 100 până la 500mg/l în mediul de cultură. În culturile vechi de 20 de zile un număr diferit de colonii celulare s-au format și au variat într-un procentaj de la 27% și până la 56% pe mediu cu carbenicilina și cefatoxim. Suplimentarea culturilor cu antibiotice în concentrații mai de 100 mg/l a condus la o scădere a eficienței de placare în comparație cu variantele martor. Cu toate acestea datorită tratamentelor cu antibiotice, cu excepția carbenicilinei, la concentrații de 400-500 mg/l a avut loc o regenerare eficientă a plantelor. Din aceste considerente se crede că cefatoximul și temetimul, în concentrațiile analizate, pot fi utilizate la morcov în proceduri complexe in vitro, ca agent profilactic pentru prevenirea contaminărilor ocazionale (Grzebelus și Skop, 2014).

Pentru a elucida efectele antibioticelor precum cefatoximul, asupra creșterii calusului și a morfogenezei s-au incubat embrioni de calus de porumb (Zea mays L.) din liniile A 188 și R 91 din hribrizii F1 cu cantități egale de 50 și 150 mg/l cefatoxim adăugat pe mediu de cultură pe parcursul mai multor subculturi. Cefatoximul nu a inhibat frecvența inducerii și creșterii calusului, dar a îmbunătățit morfogeneza acestuia. Atât în ambele linii testate, cât și în cazul hibridelor a fost observată cea mai mare creștere a numărului de plante regenerate la o concentrație a antibioticelor de 150 mg/l. Gradul de stimulare a morfogenezei și gama concentrațiilor eficiente de cefatoxim în stimularea creșterii depind și de proprietățile calusului din genotipurile testate (Danilova și Dolgikh, 2004).

Efectul timetinului, în concentrație de 300 mg/l, asupra explantelor de tomate Lycopersicon esculetum au fost studiat între vârsta de 8 și 10 zilede cultură in vitro. Cotiledoanele explantelor au fost cultivate pe mediul Murashige-Skoog cu supliment de 1,0 mg/ l zeatină, plus 0,1 mg/l acid idoleacetic și timentin. Astfel că timentinul a determinat o creștere a morfogenezei cotiledoanelor explantelor de tomate cultivate in vitro. Înrădăcinarea a fost influențată pozitiv atât în prezența cât și în absența timentinului. Rezultatele confirmă însă efectele benefice ale acestor clase de antibiotice în regenerarea plantulelor de tomate și în consecință în fiabilitatea transformării acestei specii (Costa și colab., 2000).

Patru antibiotice, kanamicina, geneticina, carbenicilina și cefatoximul au fost evaluate pentru efectul lor asupra regenerării, diferențierii mugurilor adventivi și înrădăcinarea lăstarilor de Populus euphratica, precum si transformările cu privire la bacteriile din genul Agrobacterium. Rezultatele au arătat că intervalele de concentrațiilor optime de kanamicină și geneticină au fost de 10-15 mg/l la etapa de selecție a plantulelor transgenice. Efectele inhibitorii ale diferitelor endotipuri de Agrobacterium au variat în funcție de concentrațiile cefatoximului și carbenicilinei, inhibarea fiind mai puternică la Agrobacterium C58 la o concentrație de 100 mg/l a cefatoximului (Xia și colab., 2006).

Epirubicina este unul dintre antibioticele utilizate în chimioterapia cancerului. Acestea inhibă sinteza de ADN și ARN provocând moartea celulelor prin scindarea ADN-ului și eliberarea de radicali liberi. Fitotoxicitatea cauzată de epirubicina a fost investigată de către Hamat-Mecbur și colaboratorii, în anul 2014, pe rădăcini și lăstari în creștere în răsaduri de orz de 10 respectiv 20 de zile. Embrionii maturi de orz au germinat pe mediul de cultura Murashige-Skoog (1962) suplimentat cu 250 respectiv 500 de mg/l de epirubicină. Rezultatele au arătat că tratamentul a inhibat semnificativ creșterea rădăcinii si lăstarilor în comparație cu varianta martor (Fig. 1). Tratamentul a redus de asemenea lungimea lăstarilor după câteva zile de 1,5- 2 ori mai mult respectiv aceeași lungime a rădăcinii s-a redus. Astfel, după 20 de zile de cultură rădăcinile și lăstarii s-au dovedit a fi și mai afectați de tratamentul cu epirubicină. O concentrație de 500 mg/l a scăzut total nivelul de proteine și activitatea de peroxidază și a crescut activitatea catalazelor și superoxiddismutazelor (Hamat-Mecbur și colab., 2014).

Fig. 1. Germinarea și creșterea embrionului de orz pe mediu Murashige-Skoog suplimentat cu 250 mg/l și 500 mg/l epirubicină: 10 zile (a) și 20 zile (b) de la punerea la germinat (după Hamat-Mecbur și colaboratorii, 2014).

Efectele antibioticelor utilizate în mod obisnuit în transformarea mediată a genului Agrobacterium, au fost studiate pe culturi de țesuturi de Pinus pinaster (Tereso și colab., 2006). A fost analizat creșterea țesutului embriogen din linii embriogene și inducerea de muguri adventivi din cotiledoanele a 3 familii cu polenizare liberă. Cefatoximul, carbenicilina și timentinul, utilizate în mod obișnuit pentru eliminarea de Agrobacterium la concentrații de 200-400 mg/l nu a inhibat creșterea țesutului embriogen. Inducția de muguri și numărul acestora s-au redus semnificativ pentru una dintre familiile testate, atunci când s-a utilizat în concentrație de 400 mg/l de cefatoxim sau timentin. Agentul de selecție, kanamicina, a inhibat semnificativ creșterea țesutului embriogen din liniile embriogene în toate concentrațiile testate. Kanamicina a inhibat, de asemenea, creșterea grupului embriogenic și după două subculturi, la o concentrație de 5-50 mg/l. La cotiledoane, kanamicina a inhibat formarea mugurilor în cele 3 linii de familii utilizate, indiferent de concentrațiile testate. Autorii menționați anteriorpropun utilizarea timentinului pentru a elimina genul Agrobacterium, în experimentele de transformare, la concentrații de 300 mg/l pentru cotiledoane. Pentru selectarea țesuturilor transformate care poartă gena de rezistență la kanamicină, trebuie utilizat la o concentrație de 20 mg/l pentru țesuturi embrionare, 5 mg/l la grupuri când sunt în contact direct cu mediul de selecție și mai puțin de 5 mg/l pentru inducția de muguri (Tereso și colab., 2006).

Genele de origine bacteriană, rezistente față de antibiotice, sunt markeri de neprețuit pentru ingineria genetică a plantelor. Cu toate acestea, aceste gene sunt de temut și prezintă un posibil risc pentru sănătatea umană. Gena Atwbc19 care codifică o modul de legare al ATP –ului Arabidopsis thaliana, a fost raportată (Kang și colab., 2010) ca oferind rezistență la kanamicină și, în mod special, ca o alternativă a genelor bacteriene rezistente la antibiotic. În acest studiu s-a transformat hibridul Aspen (Populus canescens × Populus grandidentata) cu gena Atwbc19. Spre deosebire de tutunul cu aceeași genă, care a prezentat rezistență doar la kanamicină, plantele transgenice de Populus a prezentat rezistență la alte trei tipuri de antibiotice aminoglicozidice precum: neomicină, geneticină și paromomicină. Deși nu se știe de ce Populusul transgenic cu gena Atwbc19 a fost rezistent la toate cele trei tipuri de antibiotice aminoglicozidice testate, utilitatea acestei gene a fost confirmată și la alte specii de dicotiledonate. Deoarece gena Atwbc19 este omniprezentă la plante, aceasta ar putea servi ca marker de selecție alternativ la gene marker bacteriene curente, rezistente la antibiotice și în a atenua potențialul risc de transfer al genelor bacteriene rezistente la plantele transgenice (Kang și colab., 2010).

4. CERCETĂRI PROPRII PRIVIND EFECTUL ANTIBIOTICELOR ASUPRA CULTURILOR IN VITRO LA TRITICALE

4.1. Obiectivul cercetării a constat în studierea stresului abiotic exercitat de către două antibiotice, respectiv Amoxicilina plus acid clavulanic (AMO-C) și tetraciclina (TET) asupra germinației in vitro la triticale (Triticosecale wittmack).

4.2.Motivația alegerii temei

Antibioticele sunt produse farmaceutice obținute, în special, prin biotehnologii microbiene, care au proprietatea de a distruge sau de a inhiba, în mod selectiv, dezvoltarea unor microorganisme patogene. Acestea se folosesc atât în tratamentul bolilor umane, cât și în crescătoriile de animale. Principalul poluator cu antibiotice este omul, iar eliminarea antibioticelor sau metaboliților acestora (uneori mai toxice decât produsul inițial) în mediul natural crește nivelul de poluare a acestuia, întră în lanțul trofic, deoarece aceștia sunt absorbiți, mai mult sau mai puțin, de către plante, devenind, astfel, toxice pentru aceste organisme, precum și pentru animale cărora le servesc ca furaje, implicit a omului care consumă fie animalul fie planta. Antibioticele pot să ajungă în sol din bălegarul folosit ca îngrășământ, sau de la animalele tratate care pasc, precum și din apele menajere utilizate în sistemele de irigații, fiindcă 30-80% dintre aceste antibiotice pot trece prin tractul gastrointestinal al animalelor. Înțelegerea efectelor antibioticelor asupra activității anatomice și fiziologice a plantelor este încă limitată, mai ales la concentrația reală a acestora din mediul ambiant (Opriș și colab., 2013; Petruș – Vancea și colab., 2013).

În prezentele cercetări am ales pentru studiu o specie monocotiledonată. De asemenea, am utilizat ca instrument de cercetare germinația, care are un rol important în studiile de fiziologie vegetală, dar și culturile in vitro, cunoscute ca având efecte intensificatoare ale diferitelor tipuri de stres, cu evidențiere clară a efectelor acestora asupra materialului vegetal. Vom încerca să dovedim acest fapt prin compararea rezultatelor înregistrate în prezentele cercetări, cu unele similare anterioare, raportate în literatura de specialitate, dar care au fost efectuate asupra culturilor in vivo (Turdeanu și Petruș-Vancea, 2015).

4.3. Ipotezele cercetării

Ipotezele de la care am pornit în realizarea prezentelor cercetări au fost următoarele:

Amoxicilina plus acid clavulanic (AMO-C) stimulează germinația și creșterea in vitro a plantelor de triticale, comportându-se ca un fitohormon de creștere;

Tetraciclina (TET) inhibă germinația și creșterea plantulelor de triticale, cultivate in vitro;

Stresul abiotic produs de antibiotice asupra plantelor in vitro este mai intens decât in vivo.

4.3. Materiale și metode

Materialul vegetal utilizat în experimentele de față a constat din cariopse de triticale (Triticosecale wittmack).

Antibioticele folosite în experiment au fost: amoxicilina plus acid clavulanic (AMO-C) și tetraciclina (TET), care au fost dizolvate cu apă distilată pentru a se realiza diferite concentrații.

Din literatura de specialitate (Hernández și colab., 2003; Kim și colab., 2005; Axuc-Opriș, 2009; Turdeanu și Petruș-Vancea, 2015) am identificat faptul că două dintre antibioticele utilizate frecvent în tratarea bolilor umane și animale, apar preponderent ca poluatori ai mediului în anumite concentrații. Am utilizat aceste concentrații ca punct de plecare în cercetările noastre. Astfel, pentru amoxicilină am ales concentrația de 2,2 mg/l (varianta V1), iar pentru tetraciclină am ales concentrația de 0,06 mg/l (varianta V2) (Tabelul 1).

În cercetarea noastră, antibioticele adăugate mediului de cultură (amoxicilina plus acid clavulanic, respectiv tetraciclina) nu au fost introduse cu scopul eliminării infecțiilor specifice inițierilor de cultură, deoarece aceste antibiotice nu sunt specifice pentru acest demers. La plante și in vitro apar infecții cauzate de alți agenți patogeni (decât la om și animale), exemplu Cladosporium, iar tratamentele se realizează cu produse specifice.

Calcularea concentrațiilor s-a realizat astfel:

1 tabletă Augmentin (Ag) cântărește 1000 mg din care 500 mg amoxicilină (AMO) și 125 mg acid clavulanic (C) ca substanțe active

1 tabletă Tetraciclină (TET) cântărește 300 mg, din care 250 mg substanță activă

a) V1:1000 mg Ag…………..500 mg AMO-C

x mg Ag…………….2,2 mg AMO-C

x= 2,2 ∙ 1000/ 500 = 4,5 mg AMO-C, pentru 1000 ml mediu de cultură

b) V2: 300 mg TET……………..250 mg TET (substanță activă)

x mg TET………………..0,06 mg TET

x= 0,06 ∙ 300/ 250 = 0,072 mg TET, pentru 1000 ml mediu de cultură

Tabelul. 1. Protocol experimental.

Notă: AMO-C – amoxicilina+acid clavulanic, TET – tetraciclină, L – lungime, Nr. – număr; Tº – temperatura.

Mod de lucru

Pașii care au fost urmați în realizarea prezentei cercetări au fost următorii:

Pregătirea recipientelor de cultură – spălare cu apă și detergent, limpezire sub jet de apă, clătire cu apă distilată, stoarce și presterilizare la etuvă, timp de 4 ore la 115°C;

Prepararea mediul de cultură mediu de bază Murashige-Skoog (1962) (Vezi anexa 1), modificat de noi (lipsit de regulatori de creștere și aminoacizi, cu 20 g/l zaharoză), cu vitamine Gamborg (1968 ) (Fig. 2 A) (vezi anexa 2), martor (controlul fiind lipsit de adaos de antibiotice), cât și a variantelor de mediu testate (cu adaos de antibiotice) (Tabelul 1);

Repartizarea mediilor de cultură în recipientele presterilizate și codate (codurile variantelor experimentale s-a notat pe fiecare recipient în parte, pe tot parcursul desfășurării etapei experimentale);

Autoclavarea mediilor de cultură la Kuktă, timp de 25 min., la 121 °C;

Sterilizarea instrumentarului de inoculare (pense, cutii Petri, suporturi etc) la etuvă, prin căldură uscată, la 120 °C, timp de 4 h;

Răcirea mediilor de cultură;

Sterilizarea materialul semincer: cariopsele de triticale au fost submersate timp 30 sec. în alcool 70%, spălate cu apă sterilă, apoi sterilizate cu amestec de hipoclorit de sodiu 2% și câteva picături de Tween 80, timp de 20 de minute, după care au fost clătite cu apă sterilă, de repetate ori, timp de 25 de minute. Toată operațiunea de dezinfectare a materialului vegetal s-a desfășurat la hota cu flux laminar vertical de aer steril. După dezinfectare, semințele au fost amplasate în cutii Petri tapetate cu hârtie de filtru, sterilizate la etuvă, prin căldură uscată, la 120 °C, timp de 4 h;

Inocularea s-a realizat în condiții de asepsie, la hota cu flux vertical de aer steril Activ Flow 90 (Fig. 2 B), respectând regulile de asepsie (Petruș-Vancea și colab., 2013);

Incubarea și creșterea plantulelor: după inoculare, vitroculturile au fost incubate timp de 10 de zile, în camera de creștere, la temperatura de 22-24 ˚C, iluminare cu lumina albă fluorescentă, cu intensitate de 1700 lx si fotoperioada de 16/24h lumina (Fig. 2 C).

A B

C

Fig. 2. Mediul de cultură (A), condiții de inoculare (B), condiții de incubare și creștere (C).

Metode de prelucrare statistică utilizate

Datele obținute în urma efectuării măsurătorilor biometrice la 10 zile de la punerea la germinat au fost prelucrate matematic și statistic în programul de calculator SPSS vs.16, calculându-se media aritmetică, diferența, abaterea standard și testul t.

Media aritmetică (X) a fost calculată prin însumarea valorilor variabilelor (plantulelor), suma lor fiind apoi împărțită la numărul de variabile:

X = (x1 + x2 + x3 + … + xn) / n ,

X = Σx / n

x = valorile variabilelor, n = numărul variabilelor, Σ = semnul sumei

Media aritmetică trebuie să fie aceeași, indiferent de metodele folosite pentru calcularea ei. Ea reprezintă o valoare estimativă necesară, dar nu și suficientă pentru a caracteriza o întreagă populație, deoarece nu scoate în evidență anumite particularități esențiale ale șirului de variație, cum ar fi dispersia în jurul mediei, gradul de variabilitate al șirului etc. Pentru a caracteriza exact variabilitatea dintr-o populație, trebuie să cunoaștem dispersia valorilor individuale în jurul mediei, iar gradul de dispersie în jurul mediei se poate calcula cu ajutorul abaterii standard.

Media aritmetică și abaterea standard oferă informații privind heterogenitatea fiecărui lot în parte, a fiecărei populații, valori necesare pentru interpretarea datelor, dar nu sunt suficiente pentru evidențierea semnificației diferenței de creștere produse de efectele antibioticelor asupra plantulelor, față de lotul martor (V0). Pentru a afla această semnificație a diferenței față de lotul martor este necesar să calculăm testul t, care compară două populații între ele.

Procentul de plantule germinate reprezintă procentul numeric al capacității boabelor de a germina din 100% boabe (în cazul nostru, 100% reprezintă 40 de boabe). Acesta se poate calcula cu regula de trei simplă, 100% fiind numărul de boabe puse inițial la germinat.

Activități desfășurate:

Documentare științifică

Inițierea de culturi in vitro din cariopse de triticale

Biometrizări ale indicilor de creștere și elaborarea de baze de date

Prelucrarea, interpretarea datelor

Diseminarea rezultatelor:

participarea la 4 manifestări științifice (anexa 3):

International Conference on Science, 13-14 Mai, Universitatea din Oradea;

Simpozionul Național de Culturi de Celule și Țesuturi Vegetale, 19 Martie 2016, Universitatea Babeș-Bolyai, Cluj-Napoca;

Simpozionul Studențesc ”Gestionarea durabilă a resurselor pădurii, responsabilitate economică, socială și culturală”, 25 Martie 2016 – Universitatea din Oradea;

Sesiunea Națională a Studenților și a Cadrelor din Învățământul Preuniversitar, 13 Mai 2016;

publicarea unui articol științific.

Elaborarea lucrării de licență.

4.5. Rezultate și discuții

Primele cariopse care au germinat au fost cele aparținând loturilor cu adaos de antibiotice, fie AMO-C, fie TET, care la 3 zile de la punerea la germinat au prezentat nu numai rădăciniță embrionară ci și coleoptil (Fig. 3), ceea ce presupune că stresul generat de antibiotice a condus la intensificarea procesului de startare a germinației. Chiar și în această fază incipientă, în care lungimea rădăcinței embrionare prezenta cca. 0,4-0,5 cm, a fost identificată o abundență a perișorilor absorbanți la plantulele loturilor cultivate pe medii cu adaos de antibiotice, atât AMO-C, cât și TET.

Fig. 3. Plantule de triticale (Triticosecale wittmack), la 3 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice); V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l (bara reprezintă 1 cm).

La 10 zile de la inoculare, rata de germinație a fost cuprinsă între 70% și 75,5% (Fig. 4). Nu au fost diferențe mari între variantele experimentale, în schimb, comparativ cu raportările din literatura de specialitate, privind germinația in vivo la triticale în condițiile inducerii stresul abiotic cu antibiotice, diferențele sunt foarte mari. Astfel, Turdeanu și Petruș-Vancea (2015) au raportat, că facultatea germinativă, la 7 zile de la punerea la germinat în cazul triticalelor a fost bună, de 75% și 84,5%, cea mai ridicată fiind întâlnită la lotul cu adaos de AMO-C.

Fig. 4. Rata de germinație în cazul triticalelor (Triticosecale wittmack), la 10 zile de la punerea cariopselor la germinat pe variante de medii de cultură: V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice); V1- MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l.

Tratamentele cu cele două tipuri de antibiotice, nu a influențat major facultatea germinativă in vivo a cariopselor de triticale. Acest fapt ne duce la concluzia că, în cazul nostru, rata de germinație diminuată a fost cauzată de stresul generat de condițiile de cultură, specifice culturilor in vitro. Menționăm faptul că, infecțiile cauzate de erori de dezinfectare a cariopselor, prealabil inițierii culturii in vitro au fost eliminate din aceste calcule, ele neavând nicio legătură cu rata de germinație.

În studii similare realizate recent, dar o specie de dicotiledonată, și anume la sfeclă roșie, Bot și colaboratorii (2016) au raportat că procentul de semințe germinate a fost relativ scăzut, chiar și la martor, nu a depășit 75%, iar la variantele cu antibiotice acesta a fost drastic diminuat, ajungând până la 58% în tratamentul cu concentrații ridicate de 2,2 mg/l AMO-C, dar, la această specie de dicotiledonată, chiar și în condiții in vivo, nu există o facultate germinativă ridicată (Turdeanu și Petruș – Vancea, 2015). Explicația procentului deferit de germinație s-a regăsit în numărul ridicat de semințe negerminate, în special aferent variantelor cu AMO-C. Chiar dacă infecțiile au fost mai reduse la loturile cu adaos de AMO – C, nu se poate afirma cu certitudine că mucegaiul Cladosporium sp. (care a infectat culturile) poate fi tratat cu AMO-C, până nu executăm o antibiogramă, pe medii speciale, fapt semnalat și de către Bot și colaboratorii (2016).

În experimentele cu triticale, care fac obiectul prezentei lucrări de licență, la 10 zile de la punerea la germinat au fost înregistrate doar inhibiții (diferențe negative față de martor), mai mult sau mai puțin semnificative statistic (Tabelul 2). Aceste diferențe negative, nesemnificative statistic in cazul lungimii medii a coleorizelor, sau semnificative în ceea ce privește lungimea medie a rădăcinițelor și a frunzulilor, implicit a taliei întregii plantule (calculată prin însumarea lungimilor medii a rădăcinițelor, a coleorizelor și a frunzulițelor) au fost exprimate procentual în histogramele figurii 5 și se pot observa ochiometric, atât în cultura in vitro, în imaginile din figura 6, cât și în momentul scoaterii lor din recipientele de cultură (Fig. 7).

Tabelul 2 Prelucrare statistică a datelor biometrizate la nivelul plantulelor de triticale (Triticosecale wittmack), măsurate la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V0 – MB-MS+ G (martor – lipsit de antibiotice); V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l.

Notă: X ± s (media (cm) ± abaterea standard), ±d (diferența față de martor), p (pragul de semnificație a diferenței față de martor): p>0,5 – diferența nesemnificativă (ns), p<0,5 – diferența semnificativă (*), p<0,1 – diferența distinct semnificativă (**), p<0,01 – diferența foarte semnificativă (***).

În cazul plantulelor provenite de pe lotul tratat cu tetraciclină, diferențele negative (adică inhibițiile) au fost foarte semnificative statistic (Tabelul 2), mai ales în ceea ce privește indicii de creștere care exprimă rizogeneza (respectiv lungimea medie a rădăcinițelor) și de aici, implicit a taliei medii a întregii plantule.

Fig. 5. Valori procentuale ale indicilor de creștere ai plantulelor de triticale (Triticosecale wittmack), la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l, raportate la valorile înregistrate la lotul martor V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice), considerate ca fiind 100%.

A B C

Fig. 6. Plantule de triticale (Triticosecale wittmack), la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice); V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l (bara reprezintă 1 cm).

A B C

Fig. 7. Plantule de triticale (Triticosecale wittmack), scoase din recipiente, la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice); V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l (bara reprezintă 1 cm).

Amoxicilina plus acidul clavulanic, dar, în mai mică măsură și tetraciclina au determinat sporirea numărului de perișori absorbanți la nivelul rădăcinițelor plantulelor de triticale, observat ochiometric (Fig. 8 A și B), acest fapt datorându-se stresului abiotic suplimentar exercitat de acestea asupra plantulelor.

A B

Fig. 8. Aspecte ale sistemului radicular la triticale (Triticosecale wittmack), la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, provenite de pe medii de cultură cu adaos de AMO-C: V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l, in vitro (A), ex vitro (B) (bara reprezintă 1 cm).

Culturile in vitro, în sine, se caracterizează prin apariția unui stres suplimentar cultivării in vivo a speciilor vegetale, cauza de condițiile specifice în care micropropagarea se desfășoară (medii de cultură sterile, suplimentate cu sursă de carbon, tehnicile de sterilizare a explantelor și de inoculare, iluminarea artificială, fotoperioada etc). Cu atât mai mult, adăugarea în mediile de cultură de amoxicilină cu acid clavulanic, dar și de tetraciclina a indus un stres suplimentar, exprimat fenotipic prin abundența perișorilor absorbanți la nivel radicular (Fig. 8).

O situație similară a fost raportată de către Bot și colaboratorii (2016) și la dicotiledonate, respectiv la sfecla roșie, doar că, la sfeclă, TET a indus o neoformare de perișori absorbanți mai intensă. Abundența perișorilor absorbanți la toate plantulele cultivate pe medii cu antibiotice, indiferent de tipul și concentrația acestora denotă faptul că, acestea exercită asupra lor un stres abiotic, fapt semnalat și în condiții de cultură in vivo de către Turdeanu și Petruș – Vancea (2015).

În cazul sfeclei roșii (Bot și colab. 2016), la 30 de zile de la punerea la germinat a semințelor autorii au semnalat faptul că, indicii de creștere au înregistrat diferențe negative semnificative sau distinct semnificative din punct de vedere statistic, față de martor, la plantulele tratate cu TET, dar și inhibiții foarte semnificative statistic, la loturile de plantule tratate cu AMO-C, în diferite concentrații (respectiv 2,2 mg/l și 1 mg/l). Cu cât concentrația de AMO-C a fost mai mare, cu atât stresul abiotic suferit de inoculi a fost mai mare, fapt exprimat prin indicii de creștere scăzuți, dar și prin masa totală proaspătă și uscată. Plantulele de sfeclă roșie, tratate cu AMO-C de 2,2 mg/l au fost singurele care, după 30 de zile încă nu prezentau frunzulițe. Inhibițiile indicilor de creștere, exprimate procentual, au fost cuprinse între 12% și 98% (Bot și colab., 2016).

Antibioticele, cu toate că uneori se pot comporta și ca un hormon de creștere, dar la sfeclă roșie au exercitat un efect inhibitor asupra indicilor de creștere cu mențiunea că efectul TET, spre deosebire de cel al AMO-C, a fost mult mai puțin negativ la sfeclă roșie, comparativ cu triticale.

Această situație apărută in vitro atât la triticale, cât și la sfeclă roșie este în contradicție cu aceea semnalată la germinația in vivo realizată cu tratamente similare, la aceleași specii și în aceleași concentrații, de către Turdeanu și Petruș-Vancea (2015), posibila explicație fiind aceea că, prin autoclavare, la 121 °C, la presiunea de 1 atm., antibioticele se transformă în alți compuși, în cazul TET mai puțin toxici decât în cazul AMO-C.

Ipotezele de la care am pornit în ceea ce privește efectul antibioticilor asupra germinației la triticale s-au dovedit a fi parțial adevărate. Astfel, tetraciclina, chiar în concentrații extrem de mici, a avut un puternic efect inhibitor al germinației și creșterii plantulelor de triticale. Amoxicilina plus acidul clavulanic, deși în concentrații mult mai mari decât tetraciclina a determinat tot inhibiție față de martor, dar cu diferențe mai puțin semnificative față de martor, comparativ cu tetraciclina.

Masa de substanță proaspătă și uscată, cântărite la toate plantulele aparținând unei singure variante experimentale și împărțită la numărul de plantule al lotului respectiv este prezentată în tabelul 3. Se poate observa că, deși media masei proaspete/plantulă la lotul martor a fost cea mai ridicată, dintre cele trei variante experimentale, după deshidratare, cenușa rămasă, care de fapt reprezintă substanța uscată a plantulei a fost cea mai mare/plantulă la varianta cu adaos de AMO-C, ceea ce presupune o acumulare mai ridicată de minerale în aceste plantule, chiar dacă erau mai mici, din perspectiva măsurătorilor indicilor de creștere (Tabelul 2 și Tabelul 3).

În ansamblul măsurătorilor, la monocotiledonate, AMO-C nu a prezentat un efect inhibitor major, dimpotrivă, din perspectiva masei uscate, loturile cu AMO-C au prezentat sporuri față de martor, de cca. 10% (Fig. 9).

Tabelul . Masa proaspătă și masa uscată, cântărite la nivelul plantulelor (Triticosecale wittmack), la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice); V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l

Din perspectiva substanței proaspete și uscate cântărite la sfeclă roșie, autorii (Bot și colab., 2016) au raportat că cea mai mare masă de substanță proaspătă și uscată au prezentat-o plantulele aparținând lotului lipsit de tratamente cu antibiotice (martor), iar cea mai redusă s-a înregistrat la plantulele cultivate in vitro pe mediu cu adaos de 2,2 mg/l AMO-C, situație similară cu aceea întâlnită și la biometrizările vizând indicii de creștere la această specie de dicotiledonată.

Fig. 9. Valori procentuale ale masei proaspete și uscate, cântărite la nivelul plantulelor (Triticosecale wittmack), la 10 zile de la punerea la germinat a cariopselor în condiții sterile, pe variante de medii de cultură: V1 – MB-MS+G, plus AMO-C 2,2 mg/l; V2 – MB-MS+G plus TET 0,06 mg/l, în funcție de cele înregistrate la lotul martor V0 – MB-MS + G (martor – lipsit de antibiotice), considerate ca fiind 100%.

4.6. Concluzii

La monocotiledonate, și anume triticale (Triticosecale wittmack), amoxicilina cu acid clavulanic (cu excepția unor stimulări în ceea ce privește rata germinativă și masa uscată), dar în special tetraciclina au determinat inhibiții ale germinației și creșterii plantulelor.

Stresul abiotic a fost evidențiat ca fiind mai intens la culturile in vitro, comparativ cu cele in vivo, din cauza particularităților specifice acestora (în special al metabolismului intens).

Amoxiclina cu acidul clavulanic a indus formarea abundentă de perișori absorbanți, presupus ca fiind un răspuns al plantulelor la condițiile de stres suplimentar.

BIBLIOGRAFIE

Axuc – Opriș, O.I., 2012, Contribuții privind influența antibioticelor asupra unor ecoeconomice de optimizare a conservării și multiplicării in vitro a biodiversității vegetale.Vasile Goldiș University Press.

Axuc – Opriș, O.I., 2012, Contribuții privind influența antibioticelor asupra unor factori de mediu (rezumatul tezei de doctorat). Universitatea „Babeș-Bolyai” din Cluj-Napoca.

Bhau, B. S., Waklu A. K., 2001, Effect of Some Antibiotics on the in vitro morphogenetic response from callus cultures of Coryphantha elephantidens. Biologia Plantarum, 44 (1), pp. 19-24.

Brestic, M., Zivcak, M., Olsovska, K., Kalaji, M.H., Shao, H., Hakeem, R.K., 2013, Heat signaling and stress Responses in phytosynthesis. In: Plant signaling: Understanding the molecular crosstalk, Hakeem, K.R., Rehman, R., Tahi, I. (eds), pp. 241-256.

Bot, C.I., Mocanu, M.M., Citrea, L., Petruș-Vancea, A., 2016, Efectul antibioticelor asupra culturilor in vitro la Beta vulgaris var. Conditiva. Stiințe Exacte și Stiințe ale Naturii (Oradea), Vol. VIII (sub tipar).

Cassells, A.C., 2012, Pathogen and biological contamination management in plant tissue culture: phytopathogens, vitropathogens and vitro pests. Methods Mol Biol., 877, pp. 57-80.

Choi, Y.J., Kim, L.H., Zoh D. K., 2016, Removal characteristics and mechanism of antibiotics using constructed wetlands. Ecological Engineering, 91, pp. 85-92.

Costa, C.G.M., Nogueina, F.T.S., Figueira, M.L., Otoni, W.C., Brommonschenkel, S.H., Cecon, P.R., 2000, Influence of the antibiotic timentin on plant regeneration of Lycopersicon esculentum tomato cultivars. Plant Cell Reports, 19 (3), pp. 327-332.

Danilova, S.A., Dolgikh, Z.I., 2004, The stimulatory effect of the antibiotic cefatoxim on plant regeneration in maize tissue culture. Russian Journal of Plant Physiology, 51 (4), pp. 559- 562.

Edlund, C., Nord, E. C., 2000, Effect of the human normal microflora of oral antibiotics for treatment of urinary tract infections. J.Antimicrob. Chemoter., 46 (1:41-8), pp. 41-48.

Fuller, P.M., Metwali, E.M.R., Eed, M.H., Jllings, A.J., 2006, Evaluation of abiotic stress resistance in mutated population of cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis). Plant Cell Tiss Organ Cult, 86, pp. 239-248.

Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, O., 1968, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cell. Exp. Cell Res., 50, pp. 151- 158

Gothwal, R., Shashidhar, T., 2014, Antibiotic pollution in the environment: A Review. Clean – Soil, Air, Water, 43 (4), pp. 479–489.

Grant, M.O, 2011, Understanding and exploiting the impact of drought stress on plant physiology. In: Abiotic Stress Responses in Plants, Ahmad, P., Prasad, M.N.V. (eds), Springer New York, pp. 89-104.

Grzebelux, E., Skop, L., 2014, Effect of beta-lactam antibiotics on plant regeneration in carrot protoplast cultures. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Plant, 50 (5), pp. 568-575.

Hamat-Mcbur, H., Yilmaz, S., Temel, A., Sahin, K., Gozukirmizi, N., 2014, The Effect of epirubicin on barley seedlings. Toxicology and Industrial Health, 30 (1), pp. 52-59.

Hara, M., Furukawa, J., Sato, A., Mizoguchi, T., Miura, K., 2011, Abiotic stress and rol of salicylic acid in plants. In: Abiotic Stress Responses in Plants, Ahmad, P., Prasad, M.N.V. (eds), Springer New York, pp. 235-251

Hernández, F., Borull, F., Calull, M., 2003, Analysis of antibiotics in biological samples by capillary eectrophoresis. Trends in analytical Chesmistry, 22, pp. 416-427.

Kang, B.G., Ye, X., Osburn, L.D., Stewart, C.N. Jr., Cheng, Z.M., 2010, Trangenic hybrid aspen overexpressing the Atwbc19 gene encoding an ATP-binding cassette transporter confers resistence to four aminoglycoside antibiotics. Plant Cell Reports, 29 (6), pp. 643-650.

Karan, R., Subudhi, K.P., 2011, Approaches to increasing salt tolerance in crop plants. In: Abiotic Stress Responses in Plants, Ahmad, P., Prasad, M.N.V. (eds), Springer New York, pp. 63-88.

Kim, S., Eichhorn, P., Jensen, J. N., Weber, A. S., Aga, D. S., 2005, Removal of antibiotics in wastewater: effect of hydraulic and solid retention times on the fate of tetracycline in the activated sludge process. Environmental Science & Technology, 39, pp. 5816-5823.

Krishna, P., 2004, Plant responses to heat stress. In: Plant Responses to Abiotic Stress, Ahmad, P., Prasad, M.N.V. (eds), Springer New York, pp. 73-101

Kumar, K., Gupta, S.C., Chander, Y., Singh, A.K.,  2005, Antibiotic use in agriculture and its impact on the terrestrial environment. Advances in Agronomy, 87, pp. 1-54.

Liang, Y., Sun, W., Yhu, Y. G., Christie, P., 2007, Mechanisms of silicon-mediated alleviation of abiotic stresses in higher plants: A review, Environmental Pollution, 147 (2), pp. 422–428.

Makhijani, M., Gahlawat, S., Chauham, K., Valsankar, S., Gauba, P., 2004, Phytoremediation potential of Cicer arietinum for tetracycline. International Journal of Genetic Engineering and Biotehnology, 50 (2), pp. 153-160.

Mantri, N., Patade, V., Penna, S., Ford, R., Pang, E., 2011, Abiotic stress response in plants: Present and Future. In: Abiotic Stress Responses in Plants, Ahmad, P., Prasad, M.N.V. (eds), Springer New York, pp. 1-19.

Martinez, J.L., 2008, Antibiotics and antibiotic resistance genes in natural environment. Science, 321 (5887), pp. 365-367.

McManus, S.P., Stockwell, V.O., Sundin, W.G., Jones, L.A., 2002, Antibiotics use in plant agriculture. Annual Review of Phytopathology, 40, pp. 443-465.

Meng, Q., Liu, Z., Zhang, Y., Liu, C., Ren, F., Feng, H., 2014, Effect of antibiotics on in vitro cultured cotyledons. In Vitro Cellular & Developmental Biology- Plant, 50 (4), pp. 436-441.

Michael, G.R., 2014, Integrons: Past, Prezent, Future. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 72 (2), pp. 257- 277

Murashige, T., Skoog, A., 1962, Revised medium for rapid growth and bioassays with tabbacco tissue cultures. Physiol. Plant, (15), pp. 85-90.

Narayanasamy, P., 2010 a, Detection of bacterial and phytoplasmal pathogens, microbial plant pathogens. In: Detection and Desease Diagnosis, 2 Narayanasamy, P. (ed), Springer, pp. 5-169.

Narayanasamy, P., 2010 b, Detection of fungal pathogens in plants. Microbial Plant Pathogens. Detection and Desease Diagnosis, vol.1 pp. 5-199.

Narayanasamy, P., 2010 c, Detection of Virus and Viroid Pathongen in Plants, Microbial Plant Pathogens-Detection and Desease Diagnosis, vol.3 (Narayanasamy, P.,), Springer, pp. 7-220.

Nickell, G.L., Finlay, C. A., 1954, Antibiotics and their effects on plant growth. J. Agric. Food Chem, 2 (4), pp. 178-182.

Opriș, O., Copaciu, F., Soran, M. L., Ristoiu, D., Niinemets, Ü., Copolovici, L., 2013, Influence of nine antibiotics on key secondary metabolites and physiological characteristics in Triticum aestivum: Leaf volatiles as a promising new tool to asses toxicity. Ecotoxicology and Environmental Safety, 87, pp. 70-79.

Pandya, V., Saraf, M., 2014, In vitro evaluation of PGPR Strains for their biocontrol potential against fungal pathogens. Microbial Diversity and Biotechnology in Food Security, pp. 293-305.

Petri, C., Alburquerque, N., Burgos, L., 2005, The effect of aminoglycoside antibiotics on the adventitious regeneration from apricot leaves and selection of nptII transformed leaf tissue. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 80 (3), pp. 271-276.

Petruș-Vancea, A., Papp, Z., Fodor, A., Sándor, Z., Cupsa, D., Györe, K., Györéné, C. I., Józsa, V., Bíró, J., Petrehele, A. I. G., 2013, Monitoring the vegetative organs’ structure of several species from the Crișuri Basin ecosystem (NV Romania – E Hungary), in order to identify a possible pharmaceuticals and metabolites pollution. Analele Universității din Oradea, Fascicula: Protecția Mediului, XX, pp.51-60.

Petruș-Vancea, A., Cachiță, C.D., Purcărea C., 2013, Proceduri bioeconomice și ecoeconomice de optimizare a conservării și multiplicării in vitro a biodiversității vegetale. Vasile Goldiș University Press.

Pierik, R.L.M, 1997, In Vitro Culture of Higher Plants. Kluwer Academic Publisher.

Qin, Y. H., Teixeria da Silva, J.A., Bi, J.H., Zhang, S.L.,Hu, G.,B., 2011, Response of in vitro strawberry to antibiotics. Plant Growth Regulation, 65 (1), pp. 183-193.

Rout, J.R., Behera, S., Keshari, N., Ram, S.S., Bhar, S., Chakraborty, A., Sudarshan, M., Sahoo, S.L., 2014, Effect of iron stress on Withania somnifera L.: antioxidant enzyme response and nutrient elemental uptake of in vitro grow plants. Ecotoxicology, 24 (1), pp. 401-413.

Seoane, M., Rioboo, C., Herrero, C., Cid, A., 2014, Toxicity induced by three antibiotics commonly used in aquaculture on the marine microalga Tetraselmis suecica ( Kylin) Butch. Marine Enviromental Research, 101, pp 1-7.

Suzuki, S., Rivero, M.R., Shulaev, V., Blumwald, E., Mittler, R., 2014, Abiotic and biotic stress combination. Tansley review, 203 (1), pp. 32-43.

Teixeira da Silva, A. J., Fukai S., 2003, Effect of aminoglycoside antibiotics on in vitro morphogenesis from cultured cells of Chrysanthemum and Tobacco. Journal of Plant Biology, 46 (1), pp. 71-82.

Tereso, S., Miguel, C., Maroco, J., Oliveira, M.M., 2006, Suscceptibility of embryogenic and organogenic tissue of marine pine (Pinus pinaster) to antibiotics used in Agrobacterium mediated genetic transformation. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 87 (1), pp.. 33-40.

Tsao, C-W., Postman, D.J., Reed, M.B., 2000, Virus infection reduce in vitro multiplication of „Malling Landmark” raspberry. In Vitro Cellular & Developmental Biology – Plant, 36 (1), pp. 65-68.

Turdean, B.C., Petruș-Vancea, A., 2015, Efectul antibioticelor asupra germinației. Stiințe Exacte și Stiințe ale Naturii (Oradea), VII, pp. 24-29.

Usha, B, Venkataraman, G., Parida, A., 2009, Heavy metal and abiotic stress inducible metallothionein isoforms from Prosopis juliflora (SW) D.C. show differences in binding to heavy metals in vitro. Mol Genet Genomics, 281 (1), pp. 99-108.

Van den Bogaard, A.E., Stobberingh, E.E., 2000, Epidemology of resistence to antibiotics. International Journal of Antimicrobial Agents, 14 (4), pp. 327-335.

Wollenberger, L., Wollenberger, L., Halling-Sørensen, B., Kusk, K.O, 2000, Acute and chronic toxicity of veterinary antibiotics to Daphnia magna. Chemosphere, 11 (7) pp. 723–730.

Xia, D., Xiao-yang, C., Wei, L., Zhi-yan, D., 2006, Effect of antibiotics plantlet regeneration via organogenesis in Populus euphratica. Forestry Studies in China, 8 (1), pp. 27-31.

Zheng, S, Qiu, X., Chen, B., Yu, X., Liu, Z., Zhong, G., Li, H., Chen, M., Sun, G., Huang, H., Yu, W., Freestone, D., 2011, Antibiotics pollution in Jiulong River estuary: Source, distribution and bacterial resistence. Chemosphere, 84 (11), pp. 1677-1685.

Zimdahl, L.R., 2015, Six chemicals that changed agriculture. Elsevier B.V, pp. 165-182

ANEXE

ANEXA I. Mediul Murashige-Skoog (MS) (1962) (după Cachiță, 1987).

Soluție de MACROELEMENTE – Stoc I

Soluție de MICROELEMENTE – Stoc II

Soluția de FeEDTA 40 mg/l – Stoc III

Soluție de VITAMINE – Stoc IV – au fost înlocuite cu vitaminele rețetei Gamborg et. al. (1968)

Soluții de REGULATORI DE CREȘTERE

ZAHAROZĂ 30 g/l

DIFCO BACTO-AGAR 10 g/l

ANEXA II. Vitaminele Gamborg din mediu B5 (Gamborg et. al., 1968).

ANEXA III. Participări la manifestări științifice

Program simpozion ARCTV

UNIVERSITATEA ˮBABEȘ-BOLYAIˮ din CLUJ-NAPOCA (UBB) – Colectivul de Ingineriegeneticăvegetală

ASOCIAȚIA ROMÂNA DE CULTURI DE ȚESUTURI ȘI CELULE VEGETALE (ARCTV)

INSTITUTUL DE CERCETARI BIOLOGICE CLUJ-NAPOCA

SESIUNE JUBILIARA SI CELEBRATIVA

40 de ani de culturi de țesuturi și celule vegetale în România și celebrarea a peste 40 de ani de activitate în domeniu și de presedinte al ARCTV, a d-nei Prof. Dr. Dorina Cachiță-Cosma

19 martie 2016 ora 9.00

Str. Clinicilor 5-7 sala SZN

PROGRAM

Ora 9.00 – 9.30 Alocuțiuni de bun venit

Mesaj din partea Rectorului UBB

Mesaj de bun venit din partea organizatorilor

LISTA PREZENTARI IN PLEN

Dorina Cachita-Cosma, Constantin Craciun, Aurel Ardelean

40 de ani de la inițierea tehnicilor de culturi de țesuturi și celule vegetale în România

Gogu Ghiorghiță

În semn de omagiu ”Doamnei culturilor in vitro la plante” – dr. Dorina Cachiță-Cosma

Dorina Cachita-Cosma, Constantin Craciun

Celulele stem vegetale, aspecte teoretice și practice.

Aurelia Brezeanu

Abordări teoretice și biotehnologice în Institutul de Biologie București, în perioada 1975 – 2015, folosind tehnologia culturilor de cellule și țesuturi vegetale

Gina Cogalniceanu

Utilizarea sistemelor vegetale in vitro pentru sinteza nanoparticulelor de metale nobile

Elena Rakosy-Tican, Ramona Thieme, Adriana Aurori, Imola Molnar, Tunde-Eva Denes, Eniko Besenyei, Daniel Cruceriu, Raluca Alina Mustata

Biotehnologia combinatorie aplicata in ameliorarea rezistentei cartofului cultivat la factori de stres biotic si abiotic

Adela Halmagyi

Crioconservarea unor specii ornamentale

Anca Keul

Analiza stabilitatii genetice a plantelor obtinute in vitro cu ajutorul markerilor moleculari

Adriana Petruș

Micropropagarea și conservarea in vitro a biodiversității vegetale

Plant biodiversity micropropagation and in vitro conservation

Victoria Cristea

In vitro multiplication of endemic and rare species Lychnisnivalis

Maria Mihaela Antofie

Etape critice in cercetarea fiziologiei celulare bazata pe cultura de tesuturi

Daniel Cruceriu, Adriana Aurori, Imola Molnar, ZoritaDiaconeasa, Carmen Socaciu, Elena Rakosy-Tican

Efecte fiziologice ale culturii in vitro asupra explantelor vegetale apartinand unor genotipuri de Solanum

Adriana Petrus, Andrei Fordon

In vitro multiplication and conservation of Euphorbia canariensis L.

Irina Holobiuc, Cătană R., Maximilian C., Cogalniceanu G., Anastasiu P., Cristea V.

In vitro introduction of the vulnerable taxon Moehringia Janke Griseb Ex Janka for conservative purpose

Gina Cogalniceanu – Film Sahia – consultant stiintific Aurelia Brezeanu

MUGURI

Cosnarovici Dana – prezentarea Bancii de gene Suceava si film – Statiunea pilot de multiplicare in vitro Codlea

Film – Electrofuziunea protoplastelor – Elena Rakosy-Tican, Ioan Turcu

LISTA POSTERE

Cristian Banciu – Morfogeneza in vitro a murului fără spini (Rubus sp.) cu aplicații biotehnologice

Camelia Sand-Sava – Etape semnificative în evoluția cercetării din domeniul biotehnologiilor vegetale în România/Significant stages in the evolution of plant biotechnology research in Romania

Mirela Ardelean – Study of light influence on Sedum telephium Ssp. maximum L. Vitroplants exposed to different light sources

Gabriel Mihai Maria – Particularități la nivel micromorfologic ale specie stenoendemice Andryalale vitomentosa (E.I.Nyarady) P.D. Sell.

Iulian Octavian Stana – Growth in length of the embryonal radicles of sweet sorghum plantlets (Sorghum bicolor subsp. bicolor), resulted from caryopsis germinated on paper filter substrate, exposed to different types of natural or fluorescent light

Imola Erdely-Molnar, Antonia Maria Mărginean, Enikö Beseneyi, Elena Rakosy-Tican –  Feeding deterrent effect of potato somatic hybrids glandular trichomes against Colorado potato beetle

Carmen Florentina Popescu – Potențialul de micropropagare și capacitatea de regenerare din embrioni somatici la Vitis vinifera ssp. sylvestris(Gmelin) Hegi

Violeta Turcuș – Regenerarea directă de minirozete la nivelul limburilor foliare ale vitroplantulelor de Drosera rotundifolia L.

Adriana Aurori, Carmen Bădărău, Elena Rakosy-Tican- The state of the art of inducing PVY resistance in potato cultivars by biotechnological methods

Anca Nedelcu, Madalina Mocanu, Larisa Crisan, Crina Cuc – Date preliminare privind micropropagarea unor specii vegetale de interes economic

Tünde-Éva Dénes, Imola Molnár, Raluca-Alina Mustața, Vass István, András Cseri, Vass Imre, Elena Rákosy-Tican- Photosynthetic response under long-term drought stress in somatic hybrids between potato and Solanum bulbocastanum

 Raluca-Alina Mustata, Imola Molnar, Tunde Denes,  Adriana Aurori, Elena Rakosy-Tican- In vitro analysis for drought tolerance of different transgenic potato lines resistant to PVY

Lia Mladin – Aspecte privind multiplicarea in vitro si aclimatizarea la Gypsophila paniculata

Prezentare de carte:

Organismele modificate genetic și implicațiile lor – autor Gogu Ghiorghita Ed. Pim Iași, 2015

Program Conferință Internațională Științe

INTERNATIONAL CONFERENCE ON SCIENCES

UNIVERSITY OF ORADEA

FACULTY OF SCIENCES

13-14 MAY 2016

ORADEA

http://stiinte.uoradea.ro/

PROGRAM

Section Biology

15.00 – 16.00 – Poster session

Stature of 10th-13th-century populations from sites of Hajdúdorog, Hungary

Enikő SZVÁK, László SZATHMÁRY, István JÁNOS – College of Nyíregyháza, Hungary

In vitro micropropagation of some economical plant species

Larisa Renata CRIȘAN, Crina Georgiana CUC, Anca Melania NEDELCU, Mădălina Maria MOCANU, Adriana PETRUȘ-VANCEA – University of Oradea, Faculty of Sciences, Department of Biology

Cadmium and lead mobility and bioavailability in Copșa Mică soils

Petronela-Bianca PAVEL1, Constantin-Horia BARBU1, Elena DIACU2,

1 – “Lucian Blaga” University of Sibiu, Faculty of Agricultural Sciences, Food Industry and Environmental Protection, 7-9 Ioan Ratiu, 550012, Sibiu, Rom

2 – "Politehnica" University of Bucharest, Faculty of Applied Chemistry and Material Science, 1-7, Polizu, 011061, Bucharest, Romania

Direct regeneration of mini rosettes in Drosera rotundifolia L. vitroplantles leaf

Violeta TURCUȘ, Ciprian MIHALI, Dorina CACHIȚĂ – Vasile Goldis Western University of Arad, Institute of Life Sciences, Arad, Romania

Differences on ornithological dynamic of NW Romania lakes (Vârșolț, Moftin, Calinești Lakes)

Gavril ARDELEAN1, Camelia DUTĂ3, Marian PETRESCU2, Iosif BERES4

1 Vasile Goldis Western University of Arad

2 Vasile Goldis Western University of Arad, Institute of Life Sciences, Arad, Romania 

3 Maramures School Inspectorate

4 Maramureș Museum from Sighetul Marmatiei

6. The ichthyofauna of Agriș and Almaș River from Salaj County

Alexandru WILHEM3, Constantin-Marian PETRESCU2, Gavril ARDELEAN1

1 Vasile Goldis Western University of Arad

2 Vasile Goldis Western University of Arad, Institute of Life Sciences, Arad, Romania

3 Săcuieni High School from Bihor County

7. Morphological, anatomical and ultrastructural features in petioles of micropropagated Drosera rotundifolia L. explants

Violeta TURCUȘ1,2, Constantin-Marian PETRESCU2, Călin LADAȘIU2, Ciprian-Valentin MIHALI2, Cristina POPESCU2, Dorina CACHIȚĂ1

1Vasile Goldis Western University of Arad, Faculty of Natural Sciences, Engineering and Informatics, Arad, Romania

2Vasile Goldis Western University of Arad, Institute of Life Sciences, Arad, Romania

Program simpozion studențesc

ANEXA IV. Articol publicat