Culturile in vitro [625368]

Culturile in vitro
și aplicația lor la un terrarium închis

Micropropagare este tehnică de înmulțire vegetativă in vitro , în mediu
artificial, aseptic, prin care se obțin plante identice cu planta mamă.
Termenul de aspsizare este utilizat în cazul sterilizării mater ialului vegetal
deoarece rezervă de agenți patogeni endogeni nu poate fi eliminată prin
tratamentele de spălare cu agenți de sterilizare.
Tehnicile de cultură in vitro folosite în cercetare sau pentru producerea de
plante, pornesc de la aceeași premiză: posibilitatea de a controla într -un mod optim
factorii de mediu (temperatură, lumină, compoziția mediului de cultură, pH,
umiditate) necesari fragmentului de plantă inoculat în condiții artificiale de mediu,
în încercarea de a analiza funcțiile sale fiziologice sau de a -l conduce într -o
anumită direcție.
Pe baza con ceptului de totipotență celulară, conform căruia fiecare celulă
conține informația genetică necesară obținerii prin regenerarea unui organism
vegetal complet, în anul 1952 Morel și Martin au stabilit și au perfecționat o
metodologie de cultivare pe medii a septice a explantelor meristematice caulinare,
obținând prin creșterea in vitro a acestora plante sănătoase, libere de viroze,
pornind de la plante mamă contaminate cu diferite viroze. În acest mod se produce
material de plantat devirozat, prin utilizarea tehnicilor tradiționale de înmulțire
vegetativă, evitându -se și degenerarea soiurilor din cauza infecțiilor virale,
transmisibile prin înmulțire vegetativă.
În mod ge neral, prin cultura in vitro se înțelege creșterea pe medii artificiale,
în condiții de asepsie deplină și de factori ambientali bine controlați, a unor organe,
părți de organe, țesuturi sau celule vegetale. Reușita culturii depinde de o
multitudine de fac tori și este vizibilă în momentul în care explantul crește.
Explantul, numit și inocul, este porțiunea de plantă (organ, țesut, celulă) care se
desprinde de pe plan ta mamă , și se inoculează în condiții sterile pe un mediu artificial de cultură.
Evoluția explantului este dirijată de operator în funcție de scopul urmărit. Acesta poate evolua
formând o nouă plantă (sau mai multe plante – neoplantule), pri n stimularea dezvoltării
organelor aeriene (tulpina și frunzele) și a rădăcinii, sau poate forma calus, prin stimularea
înmulțirii nediferențiate a celulelor.

Explantul constituie unitatea vie ce conține în celule întreaga informație genetică a plantei
mamă și pe baza totipotenței este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu
planta mamă .
Culturile in vitro sunt folosite în specia l pentru multiplicarea speciilor
floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilor arboricole ornamentale și
fructifere, dar și pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentru regenerarea
celor create prin inginerie genetică.
Totipotența, este însușirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce și de a
forma o plantă identică cu planta mamă. Teoretic fiecare celul ă vie este totipotentă, însă în
practică s -a observat că nu toate celulele au capacitatea de a -și exprima acest caracter . Astfel,
s-a demonstrat practic că, într -o plantă matură, celulele specializate care constituie țesuturile,
de exemplu: traheidele, fibrele libero -lemnoase, sclereidele, etc, la care lipsește citoplasma și
nucleul, nu sunt totipotente. Acest aspect este expl icat chiar prin faptul că întreaga informație
genetică a celulei totipotente se află în cromozomii din nucleu. La plantele cormofite, odată cu
înaintarea în vârstă, o parte din celule își pierd capacitatea de totipotență sau aceasta se reduce
foarte mult. Rămân, însă, anumite zone în care activitatea celulelor este intensă, având loc
diviziunea și formarea aproape continuă de noi celule. Aceste celule sunt mici în dimensiuni,
poligonale, bogate în citoplasmă, au vacuolă mică și nucleu mare dispus central ș i prezintă o
membrană celulozică, formând țesutul cu denumirea de meristem.
Meristemele sunt zonele generatoare de celule necesare creșterii în lungime și grosime a
plantelor, fiind dispuse terminal atât în tulpină cât și în rădăcini.
Caracteristicile culturilor in vitro :
Spre deosebire de multiplicarea tradițională, unde se operează cu semințe sau porțiuni
mari de plantă (marcote, butași, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici,
devordinul milimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplaști), explante care în condiții
normale de cultură nu ar reuși să crească opunând rezistență agenților patogeni și sintetizându –
și singure substanțele nutritive necesare.
Din acest motiv, pentru reușita culturii de celule și țesuturi se cer respectate următoarele
condiții:
-prepararea unui mediu de creș tere care să asigure o bună nutriție heterotrofă a
explantului, prin asigurarea sursei de carbon organic ușor accesibil explantelor;

-asigurarea și controlarea factorilor de me diu (temperatură, lumină, umiditate) în
limitele optime pentru fiecare specie, soi și fază de creștere, în funcție de cerințele acestora și
scopul urmărit;
-stimularea creșterii și diferențierii sau dediferențierii organelor prin utilizarea
corespunzătoare a substanțelor stimulatoare de creștere;
-asigurarea unei asepsii depline pe tot fluxul de producere a plantelor in vitro , prin
dezinfecția materialului vegetal, sterilizarea mediului și a vaselor de cultură, precum și
efectuarea tuturor operațiilor în ho ta cu flux de aer laminar steril, folosind instrumentar sterilizat
prin flambare.

Datorită spectrului larg de probleme la care culturile in vitro au răspuns afirmativ, sunt
utilizate în prezent în agricultur ă, silvicultură, farmacie, industria alimentară, industria ușoară,
etc. În agricultură, în general și în horticultură în special, culturile de țesuturi și celule sunt
folosite pentru multiplicarea unor specii, soiuri sau clone valoroase, pentru ameliorarea
speciilor cultivate, pentru conservarea germoplasmei horticole, pentru obținerea de metaboliț i
secundari.
Avantajele culturii in vitro :
-asigură multiplicarea clonală rapidă a unor soiuri, hibrizi sau clone valoroase po rnind
de la cantități mici de material vegetal. Teoretic, se asigură o multiplicare exponențială, prin
care în circa 6 luni se pot obține 1 milion de plante;
-se poate produce material săditor liber de viroze și micoplasme, material mai viguros,
precoce și productiv;
-necesită spații mici de cultură și se valorifică bine spațiul din laborator prin cultura pe
verticală pe 3 -5 nivele suprapuse;
-obținerea de plante haploide, prin cultura de polen, antere sau alte explante de țesuturi
generative (cu n cromozomi);
-dă posibilitatea obținerii hibrizilor interspecifici prin fecundarea in vitro , hibrizi care în
condiții normale sunt imposibil de obținut;
-selecția de plante rezistente la stres, boli și dăunători;
-se evită efectul sezonier de pepinieră;
-se pot obține semințe artificiale;
-se pot obține plante pe rădăcini proprii evitând astfel cheltuielile de altoire;

-asigură multiplicarea clonală a portaltoilor care nu înrădăcinează în condiții normale
de cultură;
-asigură păstrarea materialului în faza d e plantulă până la primirea unor comenzi ferme
de multiplicare.
Cu toate aceste avantaje, există specii care nu răspund bine la cultura in vitro și care,
deocamdată rămân să fie înmulțite tradițional.
Există însă și câteva impedimente în utilizarea aceste i:
-necesitatea unui laborator cu dotările minime: instalații și aparate indispensabile
activităților de micropropagare, care sunt costisitoare;
-necesitatea unui personal specializat în multiplicarea clonală și manipularea in vitro ;
-utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi și puțin accesibili tuturor unităților de
producție;
-nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu răspund la
metodele cunoscute de multiplica re;
-există riscul apariției și multiplicării mutațiilor recesive, cu afectarea autenticității
soiurilor;
-riscul apariției germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care
se comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcir ii bazei de germoplasmă pentru unele
specii. riscul apariției germenilor genetici prin multiplicarea solitară numai a unor tipuri care se
comportă bine la acest tip de cultură, cu riscul sărăcirii bazei de germoplasmă pentru unele
specii .
Tehnicile de cultură in vitro , pe lângă aspectul tehnol ogic, ne permit rezolvarea unui
număr de probleme:
-menținerea unui explant viabil și activ din punct de vedere vegetativ;
-permiterea creșterii normale a unui explant reprezentat de o structurăorganizată
(meristem, vârf de creștere sau mugure);
-inducerea pro ceselor de diferențiere în cazul unor fragmente de calus pentru formarea
de organe sau embrioni somatici;
-inducerea proceselor de dediferențiere, în cazul unor explante formate din celule
diferențiate (fragmente de tulpină, frunză, pețiol, rădăcină, etc.)re zult ând o nouă organizare
tisulară;
-inducerea proceselor de diviziune celulară, valabilă tuturor cazurilor amintite mai sus.
Aceste probleme au fost parțial rezolvate odată cu identificarearegulatorilor de creștere
endogeni de tipul auxinelor (primul grup d e fitohormoni recunoscut), giberelinelor,

citochininelor, pentru a numi doar cele trei clase principale de regulatori de creștere. Aceste
substanțe par a determina orientarea dezvoltării celulelor în cultura artificială, fapt pentru care
li se acordă prima atenție atunci când se încearcă explicarea unor fenomene fiziologice.

Mediul de cultur ă- reprezintă suportul fizic și chimic necesar pentru creșterea și dezvoltarea
explantelor in vitro . Este aproximativ ca și o soluție nutritivă echival entă sevei elaborată de
frunză după fotosinteză . Un mar e număr de cercetători au formulat diferite rețete de medii
folosite pentru diferite tipuri de culturi in vitro la mare majoritate a speciilor vegetale.

Condițiile pe care trebuie să le îndeplinească un mediu de cultură sunt :
-să corespundă cerințelor nutritive și hormonale ale speciei cultivate pentru faza în care
se găsește (stabilizare, proliferare, calogeneză, înrădăcinare, etc.)
-să asigure condiții optime de creștere și dezvoltare în ceea ce privește presiunea
osmotică, pH -ul, umiditatea, etc.
-să fie echilibrat din punct de vedere ionic
-să nu conține ioni sau substanțe toxice
-să fie ușor preparat si reproductibil
-să fie stabil după autoclavare (să -și mențină neschimbată compoziția și caracteristicile
fizio-chimice)
-să fie ieftin și să conțină cât ma i puțin constituenți naturali costisitor și neomogeni
Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au în general o structură
compl exă, fiind alcătuite dintr -un mare număr de constituenți de natură diversă și cu rol diferit.
După rolul lor :
-constituenți cu rol nutritiv : elemente minerale (macro și microelemente ) și elemente
organice (zahărul, aminoacizi și vitamine)
– constituenți cu rol hormonal fitoregulator al creșterii și dezvoltări i explantelor in vitro :
auxine, citochinine, gibereline și alte substanțe cu rol stimulator sau inhibitor: acid abcisic,
etilenă, colchicină, palclobutrazol, etc.
-constituenți cu rol în stabilirea mediului de cultură: apa, agenți de solidificare,
stabilizatori osmotici și de pH, antioxidanți și substante absorbante.
Un mediu de cultură in vitro are o componentă anorganică, constituită din săruri
minerale și o componentă organică, ce include carbo – hidrați, vitamine și substanțe reglatoare
ala creșterii.

Mediile folosite pentru culturi statice conț in și un agent gelifiant, care de obicei, este agarul.
Apa folosită pentru prepararea mediilor trebuie să fie purificată, deionizată, filtrată , distilată.
Diferiți cercetători au studiat cerințele de elemente minerale ale țesuturilor cultivate și au
elaborat medii cu compoziții bine.
Comp onenta anorganică a mediilor de cultură in vitro include elementele esențiale
pentru creșterea plantelor, la care se adaugă uneori, aluminiul și nichelul. în funcție de
cantitățile care se găsesc în diferitele formule de mediu, acestea se împart în:
– macr oelemente (N, P, K, S, Mg, Ca)
– microelemente (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo, Al, I, Fe).
Toate elementele sunt incluse în mediu sub formă de săruri, alese îndeosebi după criteriul
solubilității.
Componenta organică. Celulele și țesuturile cultivate in vitro nu sunt autotrofe, adică nu
sunt capabile să sintetizeze carbohidrați prin asimilarea CO2 în timpul fotosintezei. Din această
cauză, în mediile în care sunt cultivate trebuie introdusă zaharoză, într -o concentrație de 2 – 3%.
În culturile de celule sau de țesut uri in vitro , absența sau insuficiența unor vitamine constituie
tot atâția factori limitativi ai creșterii, drept pentru care în mediile de cultură se adaugă în mod
curent tiamină , acid nicotinic , piridoxină . Se mai utilizează biotina , cholina, acidul folie , acidul
pantotenic, riboflavina și, frecvent, m -inositolul.
Prin “steril” în culturile in vitro se înțelege lipsa totală a microorganismelor, atât de pe suprafața
cât și din interiorul materialului biologic cu care se lucrează

Speciile utilizate la terrarium : Sedum roseum , Sedum aizoon var. floribundum , Sedum gracile ,
Sedum sieboldii 'October Daphne' , Sedum pluricaule 'Sakhalin'
Surse: origine

Bibliografie

Cătană Corina , Micropropagare – Îndrumător practic , Microînmulțirea speciilor dendro –
floricole , 2014
http://documents.t ips/documents/culturi -in-vitro -55a35aa53f99b.html
https://www.scribd.com/doc/60936467/Culturi -in-Vitro
https: //www.scribd.com/doc/33326478/Micropropagare -anul-IV-IG
https://www.scribd.com/document/131412252/Cultura -Plantelor -in-Vitro
https://prezi.com/0tf8ffcom3la/mediile -de-cultura -si-cresterea -culturilor -in-vitro/
http://documents.tips/documents/cultura -plantelor -in-vitro.html
https://en.wikipedia.org/wiki/Plant_tissue_culture
http://www.aquariumgardens.co.uk/tissue -culture -plants -87-c.asp
http://hortsci.ashspublications.org/content/27/5/453.full.pdf
http://www2.ib.uj.edu.pl/abc/pdf/51_1/83_90_wojciechowicz.pdf
http://www.sedumphotos.net/v/sedum -s/Sedum+sieboldii+October+Daphne+3.jpg.html
http://dekorsad56.ru/content
https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/2/26/Sedum_aizoon_var_flor ibundum1.jpg
http://www.sedumphotos.net/v/sedum –
ghij/Sedum+gracile+from+the+Caucasus_2_.jpg.html?g2_imageViewsIndex=1
http://www.sarracenia.com/photos/horticulture/horticultu007.jpg
https://en.wikipedia.org/wiki/Micropropagation#/media/File:Culture_in_vitro.JPG
https://en.wikipedia.org/wiki/Micropropagation#/media/File :Rose_grown_from_tissue_cultur
e.jpg
https://en.wikipedia.org/wiki/Micropropagation#/media/Fi le:Plant_tissue_cultures,_National_
Center_for_Genetic_Resources_Preservation,_USDA.jpg
http://science.halleyhosting.com/nature/denali/flora/5/stone/rosea/SedumRoseum7a.jpg