CSScromatografie ȋn strat subțire [309668]

cuprins

abrevieri

CSS=cromatografie ȋn strat subțire

GC=gaz-cromatografie

mL=mililitru

mm=milimetru

cm=centimetru

g=gram

kg=kilogram

UFC=unitӑți formatoare de colonii

ATCC=American Type Collection Culture

TAMC= numӑrul total de microorganisme aerobe

TYMC= numӑ[anonimizat], [anonimizat], o vor depăși. Această afirmație un este deloc o exagerare. Fie și numai listarea acestora ar necesita mai mult spațiu și timp decât ne putem îngădui într-o lucrare de genul celei de față. [anonimizat] a [anonimizat] a [anonimizat] a prezenta efectele medicale ale fiecăreia în parte, i-ar fi necesar un efort cu o [anonimizat]-un tratat care ar cuprinde un număr însemnat de volume.

[anonimizat]. [anonimizat] ([anonimizat], nu la denumirea comercială a medicamentului), se află în produsele apicole. Aici însă apar cel puțin două diferențe esențiale. [anonimizat]. [anonimizat], [anonimizat].

[anonimizat] o [anonimizat]. Acestea sunt adunate din natură și prelucrate în stup după o [anonimizat] a unei selecții și a [anonimizat], nevoilor coloniei de albine. Nici o [anonimizat] o substanță nu lipsește. Cantitativ, [anonimizat], [anonimizat]. [anonimizat], printr-o [anonimizat], de tipul celor iatrogene (Mateescu C.,2006)

Pe de o parte, [anonimizat], glucide și lipide-, [anonimizat], minerale etc.-, necesari biosintezei tuturor moleculelor și celulelor organismului uman pentru a-l menține în stare de imunitate față de agenții patogeni exogeni sau endogeni. [anonimizat], [anonimizat]-[anonimizat], [anonimizat], refăcută.

[anonimizat] o varietate impresionantă de biomolecule identice cu cele proprii biosintezei organismului uman. Acestea sunt: biomolecule de proteine (cu exact aceleași lanțuri de aminoacizi, enzime, coenzime, hormoni, amine etc), de lipide și glucide, de antioxidanți etc., care prezintă identitate de biostructură și biofuncții cu cele similare produse prin metabolismul organic uman, vin să pună la îndemâna acestuia o gamă extrem de diversificată de substanțe care pot fi utilizate direct, fără alte intervenții și prelucrări.

Avantajele acestui tip de ofertă sunt de o importanță imensă atunci când, datorită unei sau unor afecțiuni declarate, organismul uman nu are capacitatea fiziologică de a sintetiza aceste substanțe, fără de care nu poate reveni la starea de homeostazie.

Deoarece există o certă relație între o bună stare de sănătate, vitalitate și produsele stupului, aceste atribute au un oarecare temei. Totuși trebuie menționat că azi recoltarea acestui produs la scară ceva mai mare se face pentru că există cerere pe o piață în curs de formare. Situația se datorează faptului că produsele stupului sunt din ce în ce mai utilizate și apreciate în lume atât că alimente, dar mai ales că nutraceutice, numite și alimente funcționale (Popescu C.V.2013)

Nici un medicament, nici toate medicamentele, nici un aliment și nici toate alimentele, nu pot înlocui, ca valoare și complexitate biochimică oferta albinei, care cuprinde:

– toți aminoacizii esențiali și neesențiali din structura tuturor proteinelor – ca holoproteine și heteroproteine -, dar și ca biomolecule de holoproteine și heteroproteine necesare MEC, biosintezei celulelor, dar și intracelular, direct utilizabile fără vreo prelucrare, fapt de o importanță excepțională în cazul deficiențelor metabolice umane

– lipide: sub cele mai diverse forme: acizi grași, gliceride, fosfogliceride, sfingolipide, compuși steroidieni, sau suportul formării lipidelor (inclusiv pentru colesterol, acizi biliari, terpene, acizi alifatici superiori, carotenoizi etc.); unele lipide sunt oferite sub forma biomoleculelor direct utilizabile de către organismul uman, fără nici o prelucrare; esteri; lipidele reprezintă elementul principal al plasmalemei, asigurând integritatea structurală a acesteia. Lipidele formează și bariera biochimică ce desparte interiorul celulei de spațiul extracelular

– glucide direct asimilabile: toate cele care au un rol la nivel celular și extracelular, inclusiv cele care intră în structura glicolipidelor, proteoglicanilor și glicoproteinelor

– vitamine: toate cele cunoscute, ca atare – direct utilizabile, dar și toate substanțele precursoare, necesare biosintezei lor de către organismul uman

– factori vitamin-like sau substanțe care intră în structura acestora: colină (o amină – C5H15O2N, cu acțiune vitaminică), carnitină (numită și vitamina T), mioinozitol (considerat și ca fiind un membru al grupului vitaminelor B), ubiquinone (coenzime cu acțiune vitaminică, cea mai cunoscută fiind coenzima Q10: CaQ10); bioflavonoizi cu rol inclusiv vitaminic (ca flavanoli, flavanone, flavone, flavonoli, flavine etc.);

-factori insulin-like sau cu acțiune insulin-like: IGF-I; o peptidă de tip insulină, vitaminele B8, E, C; mineralele Se, Zn, Vn, Cr, Ca; proteine –  albumina în valori homeostazice etc.;

– minerale: toate cele cunoscute ca având un rol în metabolismul uman, ca atare, inclusiv ionizate, dar și în structura unor biomolecule – metaloproteine, metaloenzime, metalocorticoizi etc.

-enzime și coenzime, ca biomolecule direct utilizabile, dar și precursorii acestora; bogăția enzimatică a produselor apicole este categoric inegalabilă, enzimele identificate, numai partial,   fiind în număr de peste 800 (Crane, 1978);

– antioxidanți – toți cei cunoscuți în științele medicale

– acizi organici: unii fiind de o importanță remarcabilă inclusiv în tratarea cancerelor, așa cum este acidul 10-hidroxi-2-decenoic sau 9-hidroxi-decenoic, ca și acizii ADN și ARN;

– substanțele necesare celulei umane, majoritatea lor putând fi direct utilizabile, indiferent de starea metabolismului fiecărui pacient în parte, începând cu cele care intră în structura primară a celulei umane – C, H, O, N, P – biomolecule direct utilizabile de către organismul uman, de o diversitate și de o eficiență care ar trebui să facă obiectul unor ample studii la nivel fundamental și clinic (Andrițoiu, 2010; Mateescu C. 2010).

Polenul este considerat de cercetătorii în domeniu din lumea întreagă unul dintre cele mai pure alimente, pentru că plantele care se hrănesc cu apă și lumină condensează această energie, oferind-o înapoi naturii.

Polenul, este poate cel mai valoros produs al stupului, dar nu și îndeajuns studiat. Din acest motiv se impune redescoperirea acestui produs miraculos prin efectuarea unor studii fizico-chimice, microbiologice și studii privind activitatea antimicrobiană pentru a evidenția calitățile terapeutice ale acestui produs natural.

capitolul 1

“polenul – Considerații generale”

Apiterapia este o metodă de tratare și prevenire a îmbolnăvirilor prin utilizarea produselor stupului. Prin utilizarea sa, beneficiem indirect și de efectele plantelor polenifere și nectarifere, efectul unui produs apicol fiind diferit în funcție de sursa de la care provine. Pentru a fi un terapeut adevărat, trebuie să iubești și să respecți albinele și să le ajuți de câte ori ai posibilitatea. În natură, viața albinelor este strâns legată de aceea a plantelor cu flori și a arborilor, pe care le polenizează și le ajută să dea un rod bogat. De aceea, oricine dorește să răsplătească în vreun fel minunatele daruri pe care albinele ni le oferă, poate face aceasta cultivând plantele melifero-polenifere și transformându-și grădinile în „paradisuri ale albinelor”.

Ideea de produse apicole este bazată pe produse care au în compoziție miere sau polen. Acestea sunt create și comericalizate, în mod normal, de persoane fizice autorizate care se ocupă cu apicultură, creșterea albinelor și care au în posesie stupi, care facilitează astfel muncă. Ele fac parte din gamă produselor de origine naturală. În mod normal sunt produse fără a utiliza aditivi artificiali, substanțe chimice suplimentare care să deterioreze produsul. Totodată sunt prezentate sub formă unor leacuri pentru diferite afecțiuni interne sau externe, dar și sub formă de produse alimentare, precum mierea, care poate fi utilizată în foarte multe alimente.

Polenul (din limba latinӑ pollen) este o substanță ce se găsește ȋn florile care au ȋnflorit sau sunt ȋmbobocite, dar pe cale sӑ se deschidӑ. El se adunӑ pe piciorușele albinelor, iar acestea îl transporta din floare în floare, pe măsură ce caută nectar. Albinele secretă apoi nectar și enzime speciale în polenul colectat din flori, formând ceea ce cunoaștem ca 'polenul de albine'. Ca greutate, circa 15.000 de grăunciori de polen, de abia realizeză 1gram.

După polenizare, fenomen, care constă în transportul polenului de pe anterele staminelor pe stigmatul pistilului, grăunciorii germinează asemănător sporilor fungilor, formând tubul polinic (gametofitul), în care iau naștere, prin diviziunea nucleului germinativ, două spermatii (gameții masculini). Cei doi gameți masculi, iau parte la procesul de dublă fecundare (Andrițoiu V., 2010).

Colectarea polenului este preocupare rentabilă, numeroși apicultori folosesc colectoarele de polen în acest scop. Albinele ce se întorc de la zbor sunt obligate să treacă prin “placa activa” (în general este vorba de o placă de plastic) care are perforații cu diametrul de 5mm. Placă poate fi și din sârmă cu ochiuri de aceleași diametre.

Încărcăturile de polen numite granule sau ghemotoace, ce sunt colectate în coșulețele picoarelor posterioare se desprind, când albină intră în stup prin acele ochiuri, și cad într-un sertăraș (unde nu pătrund albinele).

Acest sertăraș este amplasat sub placă activă, de unde pot și preluate de apicultor, conservate și folosite ulterior, fără a periclita dezvoltarea normală a familiei de albine.

Greutatea granulelor de polen transportate de catre albine variaza intre 5 – 7 mg, atingând chiar 15mg. Diferentele acestea sunt datorate sursei polenifere si altor factori: capacitatea diferita de transport de catre albine, sau conditiile atmosferice variabile.

Intre cantitatile de polen recoltate de familli de albine asezate pe aceeasi vatra pot exista diferente importante.

Culoarea granulelor de polen poate fi uniforma, atunci cand polenul este colectat de la o singura specie de planta sau poate fi policroma, avand doua sau mai multe culori cand albinele colecteaza polen de mai multe specii de plante.

Intoarsa in stup, albina care a colectat polen, cauta o celula goala sau una cu polen in care mai exista spatiu de depozitare. Ea introduce picioarele posterioare in celula respectiva si granulele sunt desprinse de pe cosuletele sau corbicule cu ajotorul picioarelor mijlocii. Lucrarea este apoi urmata de o alta albina, care preseaza polenul cu capul spre fundul celulei eliminandu-ise aerul din masa acestuia. Acest polen inmagazinat de catre albinele lucratoare, care a suferit modificari in timpul depozitarii este numit pastura. Intr-o singura celula pot fi depozitate aproape 150mg de polen.

Deoarece in operatia inmagazinare diferitele granule de polen sunt amestecate, depozitele fiind stratificate, ocupand numai 2/3 din volumul celulei si sunt acoperite la suprafata (glazurate) cu miere, acest lucru avand rol protector.

Factorii care influenteaza cantitatea de polen pe care o poate realiza apicultorul sunt reprezentati de specia de planta ca sursa de polen, de conditiile atmosferice, puterea familiilor de albine (cantitatea de puiet) si tipul de colector utilizat.

Intr-un sezon favorabil, si intr-o zona bogatade polen productia medie atinge 12kg polen / familie, maximele ajungand si pana la 40kg/ familie. In Romania, sporul zilnic este intre 0.5 si 1kg, uneori chiar 2 kg polen.

Deosebirile intre familiile de albine in privinta cantitatilor de polen colectate, se datoreaza din o serie de factori cum ar fi:

diferentele in privinta cantitatilor de puiet si deci a necesarului de hrana,

marimea familiei si cantitatea depozitata ulterior de catre familie

existenta unor surse bogate de nectar si de polen in aproprierea stupinei

conformatia terenului si microclimatul zonei

O vatra lipsita de cules de polen pe o raza de 400m, priveaza albinele de substantele proteice necesare.

Flora existentiala la orice moment dat, constituie un factor important pentru stimularea activitatii de colectare. In zonele tropicale albinele colecteaza polen aproape tot anul.Albinele manifesta preferinte pentru specii de polen deja folosite, dar in functie de disponibilitati ele pot colecta chiar polenuri inferioare calitativ. Se cunosc putine plante de la care albinele colecteaza de obicei numai nectar (bumbac, mazariche, palamida) sau numai polen (alun, plop, mesteacan, porumb).

La stabilirea vetrei stupinei, in vederea asigurarii resurselor de polen, trebuie sa ne asiguram ca ca pe o raza de 400m in jurul stupilor se gasesc plante vizitate de albine pentru polenul lor.

Polenul este elementul mascul al florilor, pe care albinele îl recoltează în grăuncioare minuscule, cu o mărime de 10-50 de microni, fiecare ghemotoc având o greutate de 0,015 grame. Fiecare granulă de polen este alcătuită din doi nuclei, care constituie „miezul” folositor în alimentație și terapie. Nucleii sunt protejați de două învelișuri (membrane): un înveliș exterior, numit exină și un înveliș interior, numit intină. Exina este lizată de sucurile gastrice. Intina este nedigerabilă, dar prezintă un număr de orificii prin care pătrund sucurile gastrice, care interacționează cu principiile vitalizante din cei doi nuclei.

Este o pulbere de obicei galbenă, constituită din grăuncioare microscopice, ce provin din anterele staminelor. Acesta mai este definit și ca o pulbere galbenă produsă de staminele fanerogamelor, celulele reproducătoare mascule. Polenul și mierea sunt singurele resurse alimentare care s-au descoperit că conțin 22 de nutrienți. Din această cauză polenul este considerat ca „aliment complet”.

Polenul de albine este considerat unul dintre cei mai sanatosi nutrienti pe care natura ii poate pune la dispozitie. Este utilizat de mii de ani ca supliment nutritional, medicament, revigorant, iar majoritatea nutritionistilor vorbesc de el ca de un adevarat miracol pentru mentinerea tineretii si vitalitatii, pentru stimularea organsimului sa lupte impotriva bolilor si pentru conferirea unei stari de bine general.

Compoziția chimică:

Glucide, ca zaharuri reducătoare, în cantitate de 20-40%, din care: a) poleină; b) glucoză – 3,27-34,62%; c) fructoză – 3,19-43,84%; d) lactoză; e) rafinoză; f) stochiloză; g) riboză, zaharuri nereducătoare: 20% sau mai mult. În polen s-au mai decelat  amidon, dextrine, celuloză;

Lipide: până la 20%, ca esteri ai acizilor grași: oleic, linoleic, linolenic, palmitic, stearic, arahidonic. Polenul mai conține, în cantitate mică dar esențială, steroli. Cele mai multe tipuri de polen conțin sub 0,5% steroli, ei fiind necesari în metabolizarea colesterolului de către albine.

Studii efectuate de Ivanov și colaboratorii (1985) au relevat complexitatea acestei componente prezente în amestecuri poliflorale de polen recoltat de albine.

Acizi organici: citric, tartric, malic, malonic, succinic, aconitic, giberelic, adipic, indolil acetic, fumaric, alfa-cetoglutaric (Rzepecka-Stojko A, 2015;)

ARN și ADN – cei doi acizi nucleici – se găsesc în polen în cantități abundente. De fapt, acest lucru este valabil pentru orice substanță capabilă de reproducere (Mateescu, 2005).

Proteinele din polen reprezintă 11-45%, în structura lor aflându-se toți aminoacizii esențiali și neesențiali cu rol în nutriție

Valoarea biologică mare a polenului rezultă din conținutul important și variat în aminoacizi esențiali indispensabili vieții.

Aminoacizi: arginină – 5,70 %, histidină – 2,40 %, izoleucină – 4,50 %, leucină – 6,70 %, lizină – 5,70 %, metionină – 1,80 %, fenilalanină- 3,90 %, treonină – 4,0 %, triptofan – 1,30 %, valină – 5,70%.

Studiile nutriționale efectuate pornind de la aceste date, au arătat că polenul poate fi consumat într-o rație zilnică medie de 25g/zi.

Studiind conținutul total în aminoacizi liberi din polenul colectat de albine, Giner Pallares și colaboratorii (1987) au ajuns la concluzia că aceștia reprezintă, procentual în medie, un nivel de 28,69 mg/g polen raportat la greutatea uscată a acestuia, iar prolina, foarte abundentă în toate speciile de polen, se găsește în concentrație medie de 19,51 mg/g polen.

Deși clasificați ca aminoacizi neesențiali, se știe că prolina și hidroxiprolina sunt componenți esențiali ai colagenului, sunt proteogenici și glucogenici

Substanțe azotate: xantina, hipoxantina, geranina, trimetilamina

Vitamine:

toate vitaminele liposolubile (A, D, E, K);

toate vitaminele grupei B;

vitamina C

Pigmenții:se află în cantități și de odiversitate aproape imposibil de listat, în funcție de flora nectariferă; între aceștia se află șirutina, care sporește rezistenta vaselor capilare.

Vitaminele, prezente în polen în concentrații ce justifică utilizarea acestui produs ca supliment nutritiv joacă, pe lângă rolul de cofactori enzimatici și multe alte roluri esențiale în buna funcționare a organismului. S-a constatat că polenul este o sursă vegetală importantă de vitamină B12, vitamină al cărui rol este bine cunoscut ca factor proteic de origine animală cu o activitate biologică extrem de ridicată (Mateescu, 2006; Andrițoiu, 2006; Andrițoiu și Andrițoiu, 2010).

Minerale: sodiu, potasiu, nichel, titan, vanadiu, crom, fosfor, zirconiu, beriliu, bor, iod, zinc, plumb, argint, aur, arsenic, plutoniu, galiu, stronțiu, bariu, uraniu, siliciu, aluminiu, magneziu, mangan, molibden, cupru, calciu, siliciu, sulf, fier, clor, bariu, paladiu, wolfram, iridiu, cobalt, platina, cadmiu. Multitudinea de minerale din polen are o importanță deosebită, unele fiind componente ale proteinelor, altele ale fosfolipidelor și altele fiind coenzime Nichelul pare a fi în mod special asociat acidului ribonucleic; protejează structura ribozomilor de denaturarea termică și activează unele enzime. Deficiența de nichel produce modificări în ultrastructura ficatului și alterează nivelul de colesterol din membranele hepatice. Seleniul, prezent în polen, este component esențial al enzimei glutation peroxidază, care este necesară în protejarea membranelor globulelor roșii (hematiilor) și a altor țesuturi de distrugerile provocate de peroxizi; este un activator al vitaminei E.

Enzime: amilaza, invertaza, proteaza, lipaza, fosfataza, catalaza, lactaza

Alți constituent ai polenului:riboză și dezoxiriboză; pectină (în exină și intină – cu rol în peristaltism),lignine, celuloză 0,5-4,9%, cenușă 0,9-7%, inositol, factori de creștere pentru plante și animale, sub formă de fosfați sau în componența unor fosfolipide),substanțe cu caracter antibiotic (Andrițoiu, 2006;  Andrițoiu și Andrițoiu, 2010; Pascoal A. et all, 2014; Denisow B, Denisow-Pietrzyk M.“, 2016).

Beneficiile polenului de albine

Milioane de oameni au experimentat personal beneficiile polenului de albine. Acest nutrient miracol este benefic pentru: stimularea energiei naturale și combaterea oboselii cornice, regenerarea corpului și mușchilor, prevenirea alergiilor, reducerea nivelului de colesterol rau scăderea depozitelor de grasime din organism, pierderea in greutate, prevenirea infectiilor si a bolilor, creșterea duratei de viata, intarirea sistemului imunitar, detoxifierea organismului. Aduce un aport crescut de vitalitate și energie, echilibreaza sistemul hormonal si furnizeaza o concentrare mentala mai buna. De asemenea, este perfect pentru oamenii care sunt în convalescență după boli sau au un stil de viata agitat si nu au timp să aiba grija de ei in mod adecvat.

În 2009, Scoala de Medicina de la Universitatea din Juntendo din Japonia a realizat un studiu cu privire la efectele polenului de albine ca un anti-alergen. Ei au descoperit că producerea de celule mastocitare a scăzut considerabil la șoarecii care au fost hrăniți cu aceasta substanță.
De ce este aceasta un lucru bun? Deoarece celulele mastocitare sunt cele care declanseaza reactiile alergice, cum ar fi stranutul, tusea și mâncărimile. Acest studiu a demonstrat că polenul de albine este într-adevăr foarte eficient în lupta împotriva alergiilor.

Un alt studiu recent realizat la Institutul de Longevitate din Rusia dezvăluie modul în care polenul de albine poate crește durata de viață a unei persoane pe o perioadă considerabilă. Renumitul rus Nicolai Vasilievici si biologul Tsitsin au descoperit acest beneficiu în timp ce încercau să-si dea seama de ce atât de mulți localnici din statul Georgia, USA au trăit până la mai mult de 100 de ani. După cum se pare, cei mai multi dintre ei consumau in mod regulat polen de albine, miere și alte produse apicole. Substanțele nutritive naturale găsite în polenul de albine i-a facut mult mai sanatosi si mai puternici, fapt care le-a permis să trăiască dincolo de durata medie de viata a unui om normal.

Se recomandă în caz de astenie fizică, psihică și sexuală, lipsa poftei de mâncare, constipație (polenul reglează tranzitul intestinal!), colită, ateroscleroză, hipercolesterolemie, stări depresive, hepatită cronică, ciroză hepatică. Este bine să se ia zilnic, 1-2 lingurițe dimineața, pe stomacul gol, în amestec cu miere. Nu se înghite nemestecat, ci se mestecă până se dizolvă. Pentru cei sănătoși, se recomandă polenul poliflor, însă dacă există o problemă de sănătate, se recomandă în special polenurile monoflorale, mai ales sub formă proaspătă, conservate în miere sau prin congelare, deoarece astfel se păstrează mult mai multe din principiile active.

Polenul de albine colectat s-a dovedit a fi eficient in reducerea simptomelor de febra fânului, așa cum este aratat în studiile complete efectuate separat de Dr. William Paterson, un alergolog din Ada, Oklahoma și Dr. Ulrich Wahn din Heidelberg, Germania.

Ambele studii au arătat că majoritatea participanților au prezentat mult mai puține și mai ușoare simptome de febra fanului, inclusiv atacuri de astm, după administrarea de suplimente de polen de albine, pe tot parcursul sezonului de febra fânului.

În Universitatea din Viena, fizicianul Peter Hemuss a descoperit ca femeile care sufera de cancer uterin care au luat polenul de albine au avut o creștere a producției de globuline gamma, care au contribuit la minimizarea efectelor secundare inevitabile ale chimioterapiei si radiatiilor.
Studiile au aratat ca aportul de polen de albine ajută la stimularea producerii de anticorpi și de celule albe din sânge, care protejează împotriva bacteriilor dăunătoare în fluxul sanguin.
Utilizări:

Recomandat in: distrofii, anorexie, rinite alergice, boli hepatice, ulcer gastro-duodenal, tulburari ginecologice, tulburari de dinamica sexuala, prostatite, hiperlipidemie, anemie, angin pectoral, insuficienta cardiaca, tulburari de circulatie periferica,  schizofrenie, oligofrenie, in medicina sportiva ca stimulator al efortului fizic, adjuvant in neoplazii ( Denisow B, Denisow-Pietrzyk M.“, 2016).

Este utilizat in intarzierile de crestere la copii – un studiu facut la un spital de copii din Cordoba (Spania) a aratat ca administrarea zilnica a 5 – 10 grame de polen favorizeaza dezvoltarea si consolidarea oaselor, accelereaza dezvoltarea sistemului nervos si ajuta la amplificarea functiilor cognitive ale celor mici.

Polenul este recomandat chiar si in cazurile in care deja a aparut un retard al dezvoltarii fizice si mentale a copiilor. Este binevenit in convalecente si perioade postoperatorii.

Se poate apela cu incredere la polen ori de cate ori se urmărește creșterea rezistenței generale a organismului nu doar a persoanelor suferinde ci si a sportivilor.

Polenul este afrodisiac, anabolizant biologic, antibacterian, antidepresiv, antiinflamator, antiparazitar, antipiretic, antitoxic, biostimulator, dietetic, antianemic, diminueaza hemoragiile, scade colesterolul, euforizant, amelioreaza functiile cerebrale, gastrice, ale intestinului gros, functiile hepatice, sexuale, ale tiroidei, intervine in procesul cresterii, intreste capilarele sanguine , inima, sistemul imunitar. Este un tonic general. ( Babaei S. et all,2016).

Atenționări: Că și în cazul pasturei și al mierii, polenul nu poate fi folosit de către diabetici. Dacă totuși aceștia se aflăîntr-una din situațiile mai severe descrise, în care alternativele de tratament nu prea sunt variate, administrarea acesteia se va face după informarea medicului și mai ales cu controlul permanent al glicemiei.

a.

b.

Fig.1a,b- Polen

contrIbuȚii personale

MotivaREA alegerii temei

Polenul are un rol foarte mare în dezvoltarea tinerei insecte (albina) și în supraviețuirea ei îndelungată. Polenul este un aliment care concura la constituirea celulelor organismului datorită proteinelor, substanțelor minerale, vitaminelor, grăsimilor și celorlalte elemente valoroase ce le conține. 0 familie în care albinele nu au la dispoziție polen sufficient va crește tineret cu o durată de viață scurtă și cu o cantitate mică de proteine că rezervă în corpul gras.

De asemenea, mătcile ieșite în perioadele lipsite de polen au ovare mici și nu pot fi suficient de prolifice pentru a asigură înmulțirea familiei de albine și înlocuirea albinei uzate. Fără polen glandele faringiene ale albinei nu pot funcționa în vederea producerii lăptișorului de matcă. Chiar și clădirea fagurilor și deci producerea cerii fără polen se evidențiază în mică măsură; când în natură apare polen din abundență activitatea de clădire a fagurilor devine remarcabilă.

În vederea asigurării permanente a nutriției familei cu polen, albinele fac rezerve în interiorul stupului. Păstrarea polenului ca atare în celule ar duce în cel mai scurt timp la degradarea lui. Pentru conservarea polenului albinele îl depozitează în celule unde îl bătătoresc bine și unde polenul suferă anumite transformări care-l prefac în păstură. În afară de acțiunile polenului verificate asupra albinelor s-au făcut ulterior experimentări pe animale de laborator în vederea folosirii polenului în întreținerea sănătății și în tratamentul diferitelor afecțiuni.

Experimentele și observațiile clinice efectuate pe un număr mare de bolnavi pun în evidența o acțiune favorabilă în cazul anumitor boll în special bolile de carență proteica, în cazul anomaliilor funcționale în special în prostată, în tulburări digestive și cele asociate somnului, în tulburări hepatice, cardiace, în diabet.

Elementele fertilizante și de origine vegetală, sterealii și în general bogăția compoziției sale joacă un rol important în normalizarea funcțiilor corpului uman, a osificării, a formării elementelor figurate ale sîngelui.

Polenul nu este medicament și nici nu are caracter de medicament, el este în primul rând un valoros aliment dietetic. Regimul cu polen mărește randamentul fizic și cel intelectual. Astfel se îndeplinește frumosul principiu al lui Paracelsius: “Alimentele noastre să fie medicamentele noastre-medicamentele noastre să fie alimentele noastre”

Natura ne furnizează în polen unul dintre cele mai prețioase alimente, care îndeplinește că aliment dietetic o sarcină vitală importantă: dezintoxică organismul, separă carențele acestuia, livrează organismului toate substanțele necesare pentru formarea zilnică a celulelor noi.

Polenul este o substanta ce se gaseste in florile care au inflorit sau sunt imbobocite, dar pe cale sa se deschida. El se aduna pe piciorusele albinelor, iar acestea il transporta din floare in floare, pe masura ce cauta nectar. Albinele secreta apoi nectar si enzime speciale in polenul colectat din flori, formand ceea ce cunoastem ca 'polenul de albine'.

Polenul contine o cantitate foarte crescuta de vitamine, minerale si aminoacizi, enzime, coenzime si chiar hormoni. Este foarte bogat mai ales in vitamine din complexul B (B1, B2, B3, B6, B12), antioxidanti, inclusiv betacaroten, vitamina C si vitamina E, acid folic, provitamina A.

Cele mai importante minerale (dar nu singurele) care se găsesc în compoziția polenului sunt calciu, fosfor, potasiu, fier, magneziu, iod. Polenul este compus din aproximativ 55% carbohidrați, 35% proteine, 3% vitamine și minerale, 2% acizi grași și 5% alte substanțe nutritive. Conține de două ori mai multe proteine decât carnea de vită și reușește să aibe un conținut de grăsimi foarte scăzut.

Poate fi considerat o sursă excelentă de proteine pentru vegetarieni, fiind foarte bogat și în aminoacizi esențiali. Din punct de vedere al analizei nutrienților, polenul este unul, dacă nu chiar cel mai complet nutrient natural. 30 de grame de polen aduc organismului aproximativ 28 de calorii. Din aceste 30 de grame, 7 grame sunt carbohidrați, 15% este lecitină, 25% proteine de cea mai bună calitate.

Polenul de albine nu trebuie confundat cu mierea de albine, veninul de albine sau alte produse de acest tip. Ele nu contin polen. Polenul conține substanțe indispensabile vieții ca aminoacizi (metionina. valina, jizina, cistina, glutamine, etc.) care accelerează funcționarea ficatului și implicit dezintoxicarea organismului; grăsimi și mai ales acizi nesaturați – linol, acid linolic, acid arahidonic. – care joacă un rol important în prevenirea arterosclerozei fermenti, hormoni, vitamine, flavonoizi, necesari organismului, pentru mărirea puterii de rezistență.

Polenul conține de 20 de ori mai multa vitamina A decât morcovul, și tot asemenea provitamina A. Un gram de polen conține suficientă rutină pentru a asigura prevenirea hemoragiilor la nivelul creierului, inimii sau retinei.

Acesta conține vitamina E, vitamin cere duce parțial afecțiunile provocate de bioxidul de carbon și de bioxidul de sulf, gaze atât de periculoase pentru orăseanul zilelor noastre. Suplimentarea cu polen a regimului alimentar adaugă organismului substanțe de bază ale acizilor nucleici, realizându-se astfel o modernă terapie celulară necostisitoare.

Motivația noastră în abordarea studiului acestui produs al stupului de proveniență indigenă este redescoperirea și punerea în evidență a superiorității acestuia din punct de vedere al conținutului în principii active și al proprietăților antimicrobiene.

Riscul apariției unei contaminări microbiene cu microorganisme patogene sau nepatogene este o preocupare permanentă atât pentru alimente cât și pentru suplimente alimentare sau medicamente în vederea asigurării unui termen de valabilitate cât mai mare.

Având în vedere că utilizarea substanțelor cu proprietăți conservante este din ce în ce mai mult contestată, evidențierea unor proprietăți antimicrobiene la ingredienti naturali reprezintă o soluție tot mai frecvent agreată.

Pentru garantarea calității și siguranței unui produs există și alternativă naturală – compuși antimicrobieni proveniți din natură, alternativă la conservanții de sinteză. Prin proprietățile antimicrobiene intrinseci, anumiți ingredienti activi într-un produs, într-un raport optim și cu respectarea regulilor de bună practică de fabricație, dublat de modul de ambalare primară și sistemul de închidere al recipientului, contribuie la obținerea unui produs sigur și de calitate.

Este remarcabil faptul de a avea capabilitatea să oferi pacientului în special și consumatorului în general, un produs care să-și îndeplinească și rolul farmacologic sau de sursă de energie și aport nutritiv sau efect cosmetic dorit și în același timp, ingredienții activi care oferă aceste proprietăți produsului, să asigure și calitatea microbiologică impusă de legislația în vigoare pentru fiecare categorie, prin propria activitate antimicrobiană, deci fără adaos de conservanți de sinteză.

Substanțe naturale cu activitate antimicrobiană au fost identificate într-un domeniu foarte larg de surse, incluzând plante aromatice și alte plante medicinale și comestibile, microorganism, animale și produse ale stupului. Multe dintre ele au fost cercetate, câteva reprezintă subiecte de studiu în derulare, dar cele mai multe nu au fost încă abordate sub aspectul cercetării aprofundate.

În legislația actuală ele sunt încadrate în categoria produselor cu utilizare bine cunoscută (= Well established use products). În prezent, atât în Uniunea Europeană cât și în România, se manifestă un interes deosebit pentru valorificarea produselor stupului.

În ciuda atenției concentrate pe tendința de “natural”, înlocuirea ingredientilor chimici (conservanți, coloranți și aromatizanți) cu alternativele lor naturale a reprezentat și încă reprezintă adevărate provocări și încercări din punct de vedere tehnic, cu cele mai multe probleme legate de procesele de fabricație și de valabilitate a produselor finite obținute cu aceștia.

O companie cu capital exclusiv românesc, care a reușit obținerea unor materii prime apicole valoroase este compania SC Hofigal Export Import SA, București și care ne-a furnizat și mostrele pentru studiile personale efectuate ca argumente profesionale și științifice în susținerea motivației și mai ales concluziilor studiului.

„Hofigal” este unul dintre cele mai faimoase nume de marcă pentru produsele naturale din România, producător de medicamente, suplimente alimentare, produse cosmetice, ceaiuri, substanțe farmaceutice active, culturi ecologice de plante aromatice și medicinale.

Un punct forte privind portofoliul Hofigal îl reprezintă faptul că toate produsele sunt obținute pe baza unor rețete și tehnologii proprii, brevetate în țară și reprezintă premiere mondiale absolute. Calitatea și siguranța produselor impun „Hofigal” ca unul dintre cei mai puternici concurenți al unor firme, deja cu tradiție, din Franța, Italia și Elveția.

Aceste produse sunt rezultatul unei îndelungate și susținute activități de cercetare sidezvoltare desfășurate în propriile laboratoare de către colectivul de cercetători, doctori în științe (farmaciști, ingineri chimiști, medici, biologi, microbiologi, biochimiști, chimiști, agronomi). Acest colectiv colaborează cu cele mai importante instituții de învățământ superior și Institute Naționale de Cercetare și Dezvoltare din România și străinătate.

Toate etapele și trasabilitatea procesului, de la cultivare, pre-procesare, procesare plantă, până la produs finit care circulă în piață, respectă cerințele internaționale privind cultivarea și recoltarea plantelor, precum și Regulile de Bună Practică de Stocare, de Distribuție, Regulile de Bună Practică de Fabricație, de Bună Practică de Laborator. Din punct de vedere al calității produselor, indiferent de etapă, acestea îndeplinesc cerințele Farmacopeei Europene, completate cu cele ale altor farmacopei de circulație internațională și ale condițiilor de calitate și siguranță proprii filosofiei Hofigal.

Obiectivele majore ale companiei sunt de a aplica toate cerințele privind asigurarea calității, eficacității și siguranței tuturor produselor, de a proteja mediul înconjurător și a avea o grijă permanentă pentru sănătatea și siguranța tuturor angajaților săi.

Îndeplinirea acestor obiective este dovedită prin multitudinea Certificatelor, Autorizațiilor și Premiilor eliberate și acordate de către autorități și organisme de cerificare interne și internaționale, reviste și publicații, Instituții de învățământ prestigioase (Agenția Națională a Medicamentului/membră PIC’s; Institutul de Bioresurse; TUVThuringen/Germania; etc)

capitolul 2

Caracterizarea fizico-chimică a

produsului stupului – Polen

2.1. descrierea

Se determină ȋn conformitate cu Farmacopeea Romană, Ediția X, capitolul IX.B”Controlul organoleptic”.

Masă compactă neomogenă de culoare galben-maronie, în funcție de flora de pe care s-a recoltat polenul cu gustul dulce-acrișor și miros caracteristic.

2.2. Determinarea pierderii prin uscare

Se determină ȋn conformitate cu Farmacopeea Europeană, Ediția 9.0, capitolul 2.2. ,,Physical and physicochemical methods” subcapitolul 2.2.32. ,,Loss on drying”.

Echipamente:

– etuvă

– balantă analitică

Reactivi:

– nisip R;

Tehnica de lucru:

Într-o fiolă de cântărire cu diametrul de 50 mm și înalțimea de aproximativ 30 mm, se cântăresc rapid 0,5g probă de analizat. Se usucă în etuvă la 1050C ± 20C pentru 3 ore. Se răcește în exicator în prezența de pentaoxid de fosfor R sau silicagel anhidru Rși se cântărește.

Pierderea prin uscare se exprimă procentual (% m/m).Pierderea prin uscare se calculează după următoarea formulă :

Pierdere prin uscare, % =

ȋn care:

m2 = masa fiolei cu probă de analizat, ȋnainte de uscare, ȋn grame;

m1 = masa fiolei cu probă de analizat, după uscare, ȋn grame;

mp = masa probei de analizat luată ȋn lucru, ȋn grame.

2.3. Determinarea cenușii totale

Se determină in conformitate cuFarmacopeea Europeană, Ediția 9.0, capitolul 2.4. ,,Limit tests‘’, subcapitolul 2.4.16. ,,Total ash″

Echipament:

-balantă analitică

-cuptor de calcinare

Tehnica de lucru

Un creuzet de porțelan sau de platină se încălzește la incandescență timp de 30 minute, se răcește în exicator și se cântărește. Se cântărește 1,0g probă de analizat, în acest creuzet. Se usucă la 1000C–1050C timp de 1 oră și se calcinează până la masă constantă, într-un cuptor de calcinare la 6000C±250C, lăsând creuzetul la răcit în exicator după fiecare calcinare. Dacă reziduul mai prezintă particule de cărbune, se adaugă în creuzetul răcit câteva picături de apă caldă, se filtrează; filtrul cu precipitatul se calcinează. Filtratele combinate se evaporă cu precauție la sec și se calcinează până la masă constantă. După răcire în exicator reziduul se cântărește. Rezultatul se exprimă în procente de masă.

Calcul:

Cenușa totală, % =

ȋn care:

m1= masa creuzetului gol, în grame;

mp=masa probei de analizat inainte de calcinare, în grame;

m2=masa probei de analizat după calcinare, în grame.

2.4. Determinarea conținutului în polifenoli totali exprimați în acid clorogenic

Se determină în conformitate cu Farmacopeea Română, ediția a X-a, capitolul VIII. ,,Monografii’’, monografia ,,Cynarae folium’’.

Echipament:

-balanță analitică;

-spectrofotometru UV-VIS;

Reactivi:

-wolframat de sodiu R

-acid fosforic R

-apă R

-soluție fosfowolframat de sodiu R (Reactiv Folin: 10 g wolframat de sodiu R,10 mL acid fosforic R si 75 mL apă R se incalzesc la fierbere, la reflux, timp de 2 ore; după răcire se diluează cu apă R la 100 mL

-soluție carbonat de sodiu R 200 g/L

-acid cafeic R

-solutii standard de acid cafeicde20 µg/mL;30 µg/mL;40 µg/mL;50 µg/mL;60 µg/mL;70 µg/mL;80 µg/mL;90 µg/mL

-soluție etanol R 50% v/v

-soluția test: la1,0g probă de analizat se adaugă 100mL soluție etanol 50% v/v R, intr-un balon cu dop rodat si se încălzește la fierbere, pe baia de apa, la reflux, timp de 30 minute.Soluția fierbinte se filtreaza prin vata intr-un balon cotat de 100mL si după racirea soluției, se completeaza la 100mL prin spalarea rezidiului cu soluție etanol 50% v/v R.

Tehnica de lucru:

La 5,0 mL soluție test se adaugă 5 mL soluție fosfowolframat de sodiu R, se agită și se filtrează. Se îndepărtează primele porțiuni de filtrat. 2,5 mL filtrat, se diluează cu soluție200 g/L carbonat de sodiu R la 25 mL, într-un balon cotat. Se determină absorbanța soluției la 660 nm, folosind ca lichid de compensare o soluție preparată din 2,5 mL filtrat și apă R la 25 mL, într-un balon cotat.Concentrația în polifenoli totali a probei de analizat se calculează cu ajutorul unei curbe de calibrare, luând în lucru in 8 eprubete câte: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 mL soluție etalon 0,1 g/L acid cafeic R, la care se adaugă 4,0; 3,5; 3,0; 2,5; 2,0; 1,5; 1,0 si 0,5 mL apă Rsi apoi câte 5,0 mLsoluție fosfowolframat de sodiu R pentru fiecare etalon in parte. Din etaloanele astfel obținute, se iau cite 2,5 mL si se vor aduce la semn intr-un balon cotat de 25 mL cu soluție200 g/L carbonat de sodiu R proaspat preparata. Se determină absorbanța soluției la 660 nm, folosind ca lichid de compensare o soluție preparată din 2,5 mL din fiecare etalon adusi la semn cu apă R într-un balon cotat de 25 mL.

Calcul:

Polifenoli totali exprimați ȋn acid clorogenic, % =

în care:

C = concentrația citită pe curba de calibrare, în μg /mL

mp= masa probei de analizat, în grame

2,016 = factor de transformare a conținutului de acid cafeic în acid clorogenic

100 = factor de corelare

2.5. Determinarea conținutului în flavonoide exprimate în rutin

Se determină în conformitate cu Farmacopeea Română, ediția a X-a, capitolul VIII. ,,Monografii’’, monografia ,,Cynarae folium’’.

Echipament:

-balanta analitica;

-spectrofotometru UV-VIS;

Reactivi:

-metanol R ;

-metanol R soluție 50%, ( v/v) ;

-acetat de sodiu Rsoluție 100 g/L ;

-clorura de aluminiu Rsoluție 25 g/L ;

-rutin (s.r.) soluție 0,01% în metanol R ;

-soluția A : la 1,0g probă de analizat se adaugă 100mL soluție etanol 50% v/v R, intr-un balon cu dop rodat si se încălzește la fierbere, pe baia de apa, la reflux, timp de 30 minute. Soluția fierbinte se filtreaza prin vata intr-un balon cotat de 100mL si după racirea soluției, se completeaza la 100mL prin spalarea rezidiului cu soluție etanol 50% v/v R.

-soluția test: 10,0 mL soluție A se aduc într-un balon cotat de 25 mL și se completează la semn cu metanol R. Se agită puternic 2–3 minute și se lasă în repaus 10 minute. Se filtrează soluția, îndepărtând primele porțiuni de filtrat. La 5,0 mL filtrat se adaugă 5,0 mL acetat de sodiu R, soluție 100 g/L   și 3,0 mL clorura de aluminiu Rsoluție 25 g/L, agitând după fiecare adăugare de reactiv; se aduce la semn cu metanol R, după care se agită puternic soluția obținută;

-soluția de compensare:la 5 mL filtrat din soluția test se adaugă 8mL apă R si se aduce la semn cu metanol R, intr-un balon cotat de 25mL.

Obtinerea curbei de calibrare

Cantitatea de flavonoide se calculează prin raportare la curba de calibrare a rutinului, stabilită în aceleași condiții cu soluția test, luand in lucru în opt baloane cotate de 25 mL. In 7 din acestea se adaugă in fiecare câte1; 1,5; 2; 2,5; 3,5; 4,0 si 4,5 mLsoluție de rutin (s.r.) 0,01%în metanol R,câte 5 mLsoluție acetat de sodiu R 100g/Lși câte 3 mL soluție clorura de aluminiu R 25 g/L . Se agită si se completeaza la semn cumetanol R. Absorbanța fiecarei soluții etalon se citește după 15 minute, la 430 nm, în cuva de 1cm, folosind ca lichid de compensare o soluție obținută din 8 mL apă R si metanol R la 25 mL (al 8-lea balon).

Tehnica de lucru

Se masoară absorbanța soluției testfață desoluția de compensare după 15 minute la 430 nm, în cuva de 1 cm. În cazul în care extincția soluției este mai mare e 0,4 se face diluția corespunzătoare.

Calcul :

Conținut ȋn flavonoide exprimate ȋn rutin, % =

în care:

C = concentratia citita pe curba de etalonare, in μg/mL;

mp = masa probei de analizat, în grame;

V = volumul balonului cotat utilizat, în mL;

F = factor dediluție;

104 = factor de corelare.

2.6. Determinarea conținutului în aminoacizi totali exprimați în acid glutamic

Se determină în conformitate cu Farmacopeea Română, ediția a X-a, capitolul VIII. ,,Monografii’’, monografia”Acidum glutamicum”.

Echipamente:

-balanță analitică

-spectrofotometru UV-VIS

Reactivi:

-ninhidrină R soluție10 g/L;

-citrat de sodiu R soluție1M ;

-apă R;

-acid glutamic R soluție0,5 g/L (0,05 g acid glutamic se dizolvă și se aduce la semn cu apă R într-un balon cotat de 100 mL);

– soluția stoc : 1,0g probă de analizat se antrenează la reflux timp de 60 minute cu 50 ml apă R.Solutia extractivă se filtrează prin hartie de filtru calitativă și se aduce la balon cotat de 100 mL prin spălări repetate ale balonului și filtrului cu porțiuni mici de apă fierbinte ;

-soluție test: 0,5 mL soluție stoc se tratează cu 0,2 mL ninhidrină R soluție10 g/L  și o picătură citrat de sodiu R soluție1M  într-un pahar Erlenmeyer de 25 mL care se menține pe baia de apă la fierbere, până la evaporare, aproximativ 60 minute. Reziduul format se dizolvă în 5 mL apă Rși se aduce cantitativ prin spălări repetate ale vasului într-un balon cotat de 25 mL. Se completează la semn cu apă R;

-soluție de referință: 0,5 mL soluție acid glutamic R 0,5 g/L se tratează în aceleași condiții ca șisoluția test.

Tehnica de lucru:

Se citesc absorbanțele soluției testși soluției de referință la λ = 570 nm, față de apă R.

Calcul:

Conținut ȋn aminoacizi exprimați ȋn acid glutamic,% =

în care:

Ap = absorbanța probei;

Ae = absorbanța etalonului;

mp =masa probei, în grame;

me = masa etalonului, în grame;

2.7. Determinarea conținutului în minerale

Se determină ȋn conformitate cu Farmacopeea Europeană, Ediția 9.0, capitolul 2. 4. ,,Limit tests‘’, subcapitolul 2.4.27. ,,Heavy metals in herbal drugs and fatty oils’’.

Echipamente:

-balantă analitică;

-spectrometru de absorbție atomică echipat cu lămpi catodice ca surse de radiații, lampă de deuteriu utilizată ca un corector de fond, flacără de acetilenă-aer/flacără protoxid de azot-acetilenă

Reactivi :

-acid clorhidric R, lipsit de metale grele;

-acid azotic R, lipsit de metale grele;

-soluție standard ale metalelor eterminate cu concentrația de 1000 ppm;

-soluții de referință pentru calciu cu 1,0; 2,0; 3,0;4,0ppm;

Valoarea coeficientului de corelare R, din curba de etalonare, nu trebuie sa fie mai mica de 0,995 ;

-soluția test : se cantareste intr-un creuzet de portelan 1,0grame probă de analizat, si se calcineaza la o temperatura de 600-8000C timp de patru ore. După calcinare si racire se adaugă 5 mL dintr-un amestec format din acid clorhidric R : apă R (1 :1) (v/v), după care are loc evaporarea la sec. Se preia cantitativ intr-un balon cotat de 50 mL reziduul din creuzet prin spalari consecutive de trei ori cu câte 2,5 mL dintr-un amestec format din acid clorhidric R cu apă R, (1 :5) (v/v). In continuare se adaugă in creuzet 5 mL soluție formata din amestecul de acid azotic R si apă R, (1 :2) (v/v) si din nou se aduce la sec. Se preia după uscare reziduul prin spalari repetate de trei ori cu câte 2,5 mL soluție amestec formata din acid clorhidric R cu apă R, (1 :5) (v/v), colectandu-se fractiile in acelasi balon cotat folosit la prima serie de spalare. Se continua spalarea cu apă R, pana la aducerea la semn a lichidului din balonul cotat.

– soluția blanc: soluție acid azotic R 1% – lipsit de metale grele.

Tehnica de lucru

Se determina absorbantele soluțiilor de referință si a soluției test. Valoarea absorbantei soluției de referinta este automat scazuta din valoarea obținuta la soluția test. Se inregistrează valorile obținute pentru concentratia metalului respectiv, în µg/mL(ppm).

Calcul :

M (%) =

2.8. Determinarea conținutului în zaharuri reducatoare

Se determină ȋn cu literatura de specialitate “ Havaiian planter’s record” nr. 57 , 2, pag 151 – 158, 1964.

Echipamente:

-balanță analitică

-spectrofotometru UV-VIS

Reactivi:

-soluția 1: fericianura de potasiu,K3[Fe (CN)6], soluție 0,5 N:se dizolva16,5 g fericianura de potasiu R in1000 mL deapă R;

-soluția 2:carbonat de sodiu, (Na2CO3), soluție 1,0 N: se dizolva 106 g carbonat de sodiu R in2000 mLapă R;

-acid sulfuric R, soluție 0,8 N: se dizolva 21,4 mL acid sulfuric R in1000 mLapă R;

-etanol R, soluție 50% (v/v);

-soluție saturată de acetat de plumb;

-glucoza R;

-apă R;

-carbune activ R;

-soluția de blanc: 2,0 mLapă R si 5,0 mLsoluție 2. Amestecul obținut se încălzește pe baie de apă timp de 25 minute la 80 oC;

– soluția 3: 2 mLsoluție 1 se diluează la 100mL cu soluția 2. Se pregateste in momentul folosirii;

-soluția test:-soluția test: Întru-un pahar Erlenmayer se cântaresc 0,2g probă de analizat, se adaugă 50mL etanol R 50% (v/v) și se agită timp de 10 minute.Se adaugă 2-3 picături de soluție saturată acetat de plumb un vȃrf de spatulăde cărbune activ și se agită ȋncă 5 minute. Se filtrează prin hȃrtie de filtru calitativă într-un balon cotat și se diluează la 100mL cu apă R.

Obtinerea curbei de calibrare

Se dizolvӑ 0,010g glucoză R în apă R si se aduce la balon cotat de 100mL cu același solvent. Se iau consecutiv in eprubete diferite câte 0,2; 0,5; 0,75; 1,0 si 1,5 mL din aceasta soluție la care se adaugă 1,8; 1,5; 1,25; 1,0 si respectiv 0,5 mL apă R și câte 5,0 mL soluție 3. Eprubetele se inchid etans pentru a evita evaporarea soluției si se incalzesc pe baie de apa timp de 25 minute la 80oC. După parcurgerea timpului, se răcesc și se citesc absorbanțele la lungimea de undă de 420 nm față de soluția blanc. Se trasează curba de etalonare utilizând metoda celor mai mici pătrate, obținând o relație matematică de forma Y = aX + b, sau reprezentând grafic absorbanța funcție de concentrație.

Tehnica de lucru:

Într-o eprubetă, se adaugă 2,0mL soluție test și 5,0mL soluție 3. Amestecul obținut se încălzește pe baie de apa timp de 25 minute la 80 oC. Pentru a evita pierderea de lichid prin evaporare, eprubeta se inchide etanș. Se măsoarăabsorbanța la lungimea de undă de 420 nm față de soluțiablanc. La nevoie se diluează .

Calcul:

Conținut ȋn zaharuri reducatoare, % =

ȋn care :

C = concentrația obținută pe curba de etalonare, μg/mL ;

m = masa probei de analizat luatăîn lucru, în grame;

100= factor de corelare.

2.9. Determinarea conținutului în zaharuri totale

Se determină ȋn cu literatura de specialitate “ Havaiian planter’s record” nr. 57 , 2, pag 151 – 158, 1964.

Echipamente:

-balanță analitică

-spectrofotometru UV-VIS

Reactivi:

-soluția 1:fericianură de potasiu,K3[Fe (CN)6], soluție 0,5 N:se dizolvă16,5g fericianură de potasiu R în1000 mL deapă R;

-soluția 2:carbonat de sodiu, (Na2CO3), soluție 1,0 N: se dizolvă 106g carbonat de sodiu R în2000 mLapă R;

-acid sulfuric R soluție 0,8 N: se diluează 21,4 mL acid sulfuric R în1000 mLapă R;

-etanol R soluție 50% (v/v);

-soluțiesaturată de acetat de plumb;

-glucoză R;

-apă R;

-carbune activ R;

-soluția de blanc: 2,0 mL apă R si 5,0 mL soluție 2. Amestecul obținut se încălzește pe baie de apă timp de 25 minute la 80 oC;

-soluția3: 2 mL soluție 1 se diluează la 100-mL cu soluția 2.

Se pregateste in momentul folosirii;

-soluția test: Întru-un pahar Erlenmayer se cântaresc 0,2g probă de analizat, se adaugă 50mL etanol R 50% (v/v) și se agită timp de 10 minute.

Se adaugă 2-3 picături de soluție saturată acetat de plumb un vȃrf de spatulăde cărbune activ și se agită ȋncă 5 minute.

Se filtrează prin hȃrtie de filtru calitativă într-un balon cotat și se diluează la 100mL cu apă R.

La25 mL din această soluție se adaugă 0,7 mL acid sulphuricsoluție 0,8N și se menține pe baie de apă la temperatura de 800 C, timp de o oră.

Obtinerea curbei de calibrare

Se dizolvӑ 0,010g glucoză Rin apă R și se aduce la balon cotat de 100-mL cu același solvent.

Se iau consecutiv ȋn eprubete diferite câte 0,2; 0,5; 0,75; 1,0 si 1,5 mL din aceasta soluție la care se adaugă 1,8; 1,5; 1,25; 1,0 si respectiv 0,5 mL apă Rși câte 5,0 mL soluție 3.

Eprubetele se inchid etans pentru a evita evaporarea soluției si se incalzesc pe baie de apa timp de 25 minute la 80oC.

După parcurgerea timpului, se răcescși se citesc absorbanțele la lungimea de undă de 420 nm față de soluția blanc.

Se trasează curba de etalonare utilizând metoda celor mai mici pătrate, obținând o relație matematică de forma Y = aX + b, sau reprezentând grafic absorbanța funcție de concentrație.

Tehnica de lucru:

Într-o eprubetă, se adaugă 2,0mL soluție testși 5,0mL soluție 3.

Amestecul obținut se încălzește pe baie de apa timp de 25 minute la 80 oC.

Pentru a evita pierderea de lichid prin evaporare, eprubeta se inchide etanș.

Se măsoară absorbanța la lungimea de undă de 420 nm față de soluțiablanc. La nevoie se diluează.

Calcul:

Conținut ȋn zaharuri totale, % =

în care :

C = concentrația obtinută de pe curba de etalonare, μg/mL ;

m = masa probei de analizat luată ȋn lucru, ȋn grame ;

25 = factor de corelare.

2.10. Rezultate si discuții

Pentru efectuarea studiului au fost luate în lucru trei probe de “Polen” provenite din stupina SC AROMA SRL si anume:

P1 = probă Polen recoltată în anul 2013

P2 = probă Polen recoltată în anul 2014

P3 = probă Polen recoltată în anul 2015

Pentru a pune în evidență calitatea și siguranța acestora, probele au fost analizate din punct de vedere fizico-chimic cu metodele de analiză descrise în Capitolul 2 al prezentei lucrӑri. Rezultatele obținute ȋn cadrul analizelor fizico-chimice ale probelor luate în lucru, sunt menționate în Tabelul 1, Tabelul 2 respectiv Tabelul 3.

Tabelul 1

Rezultatele obținute la analiza fizico-chimică aprobelor de “Polen” -proba P1

Tabelul 2

Rezultatele obținute la analiza fizico-chimică aprobelor de “Polen” -proba P2

Tabelul 3

Rezultatele obținute la analiza fizico-chimică aprobelor de “Polen” -proba P3

Comentarii:

Din rezultatele obținute în cadrul analizelor fizico-chimice ale celor trei probe de Polen provenite din aceeași sursă (P1 = probă Polen recoltată în anul 2013, P2 = probă Polen recoltată în anul 2014 respectiv P3 = probă Polen recoltată în anul 2015) se pot concluziona următoarele:

– pentru parametri “Pierdere prin uscare” și “Cenușă totală” valorile obținute pentru cele trei probe sunt comparabile între ele și se încadrează în limitele de admisibilitate prevăzute de literatura de specialitate;

-pentru parametri “Conținut ȋn polifenoli totali exprimați ȋn acid clorogenic”, Conținut ȋn flavonoide exprimate în rutin”,” Conținut ȋn zaharuri totale “,” Conținut ȋn zaharuri reducătoare”, Conținut ȋn aminoacizi exprimati în acid glutamic” au fost obținute valori comparabile pentru cele trei probe, acestea depășind limitele de admisibilitate prevăzute de specificata tehnica a producatorului, respectiv literatura de specialitate;

Compoziția în minerale a produsului stupului” Polen” este prezentată în Tabelul 4.

Tabelul 4

Compoziția în minerale a probelor de Polen

Comentarii:

În cadrul determinării conținutului de minerale al celor trei probe de Polen se observă următoarele:

Valorile obținute la determinarea conținutului în minerale sunt comparabile între cele trei probe luate în studiu;

Raportul între calciu și magneziu este de 1:2, acest raport fiind ideal pentru asimilarea mineralelor de catre organismal uman;

Raportul sodium / potasiu indicat de literatura de specialitate este de 1:10, în cazul celor trei probe de Polen fiind mult mai mare și anume 1:30;

Pe lângă faptul că cele trei probe conțin cantități însemnate de fier și zinc, acestea conțin cantități mai mici mangan și cupru;

În probele de Polen nu sunt prezente urme de metale grele (cupru, crom, plumb, cadmiu)

Ca atare se poate spune că cele trei probe de Polen au o calitate net superioară față de produsele existente pe piața, la ora actuală și îndeplinesc cerințele prevăzute de Farmacopeea Europeană, ediția în vigoare și legislația europeană în vigoare, referitoare la calitatea produselor de origine natural, produse ale stupului.

Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute în cadrul analizelor fizico-chimice ale probelor de “Polen” este prezentată mai jos.

Fig.2-Reprezentarea grafică a parametrului “Pierdere prin uscare”

Fig.3-Reprezentarea grafică a parametrului“Cenușă totală”

Fig.4 -Reprezentarea grafică a parametrului“Conținut în polifenoli totali exprimați ȋn acid clorogenic”

Fig.5 -Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în flavonoide totale totale exprimate în rutin”

Fig.6 -Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în aminoacizi totali exprimați ȋn acid glutamic”

Fig.7 -Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în zaharuri totale”

Fig.8 -Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în zaharuri reducătoare”

Fig.9 – Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în calciu”

Fig.10 -Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în magneziu”

Fig.11 -Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în sodiu”

Fig.12-Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în potasiu”

Fig.13-Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în mangan”

Fig.14-Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în zinc”

Fig.15- Reprezentarea grafică a parametrului “Conținut în fier”

capitolul 3

Caracterizarea microbiologică a Polenului

3.1. Determinarea contaminării microbiene

Se efectuează în conformitate cu Farmacopeea Europeană, Ediția 9.0, capitolul 2.6. "Biological Test" subcapitolul 2.6.12. ”Microbiological Examination of non-Sterile Products : Microbial Enumeration Tests" respectiv subcapitolul 2.6.13. "Microbiological Examination of non-Sterile Products : Tests for Specified Micro-organisms".

Verificarea contaminării microbiene constă în determinarea numărului total de microorganisme aerobe (TAMC) și a numărului total combinat de levuri și fungi filamentoși (TYMC) respectiv izolarea și identificarea microorganismelor specifice (Bacterii gram negative tolerante la sărurile biliare, Escherichia coli, Salmonella sp.).

3.1.1. Determinarea numărului total de microorganisme aerobe (TAMC) si a numărului total combinat de levuri si fungi filamentoși (TYMC)

Echipamente :

-Etuvă Venticell 111;

-Incubator Incucell 404;

-Incubator Caloris TC 25;

-Incubator Caloris TCR 140

-Hotă microbiologică cu flux de aer laminar AV100

-Microscop optic ;

-Combină frigorifică RD33C Autoclav Systec V95;

-Autoclav Raypa;

Medii de cultură uzuale:

-Agar cu hidrolizat de caseina și soia (Casein soya bean digest agar), pentru cultivarea bacteriilor aerobe;

-Agar Sabouraud cu dextroză (Sabouraud dextrose agar)/ Agar Sabouraud cu dextroză suplimentat cu antibiotice, pentru cultivarea levurilor și fungilor filamentoși ;

Soluții:

-soluție tamponată de clorură de sodiu, pH=7,00 (buffered sodium chloride solution, pH=7,0);

-soluție de lucru tampon fosfat, pH=7,2(phosphate buffer solution, pH=7,2);

-bulion cu hidrolizat de caseina și soia (Casein soya bean digest broth);

-polysorbat 80,1g/L;

Materiale

-plăci Petri sterile (Ø = 9 cm);

-eprubete sterile 16 x 160 mm;

-pipete gradate sterile cu o capacitate de 1; 2;5 și 10 mL;

-cilindri gradați sterili cu o capacitate de 100 mL;

-flacoane Erlenmeyer sterile cu o capacitate de 250 mL;

-stative de inox ;

Tehnica de lucru :

Într-un flacon Erlenmeyer steril se suspendă 10g de produs în 90 mL din una dintre soluțiile menționate mai sus. Se obține diluția 1: 10. Se prepară diluții seriale (1/100; 1/1000, 1/10000 și 1/100000), folosind același diluant steril. În câte două plăci Petri, cu diametrul de 9 cm, se transfera 1 mL din fiecare diluție preparată.

Se adaugă 15-20 mL mediu de cultură agar cu hidrolizat de caseina și soia (Casein soya bean digest agar) sau 15-20 mL mediu de cultură agar Sabouraud cu dextroză ( Sabouraud dextrose agar).Dacă plăcile Petri sunt mari, se adaugă o cantitate mai mare de mediu.

Mediul de cultură lichefiat nu trebuie să aibă mai mult de 450C. Concomitent, se efectuează probe martor negativ cu agar cu hidrolizat de caseinăși soia sau agar Sabouraud cu dextroză respectiv agar cu hidrolizat de caseină și soia sau agar Sabouraud cu dextroză și soluție de clorurăde sodiu pH=7,0.

Plăcile cu agar hidrolizat de caseina și soia se incubează pentru 3-5zile la 30-350C, iar cele cu agar Sabouraud cu dextroză se incubează pentru 5-7zile la 20-250C.

Se verifică probele pe tot parcursul perioadei de incubare.Se selectează plăcile care nu au mai mult de 250colonii pentru bacterii și 50 colonii pentru levuri și fungi filamentoși.

Se număra coloniile dezvoltate și se face media aritmetica pentru fiecare diluție și se calculează numărul total de unități formatoare de colonii/g(UFC/g) împărțind la numărul de diluții efectuate.

Interpretarea rezultatelor:

Numărul total de bacterii (TAMC) reprezintă media de UFC determinată pe mediul agar cu hidrolizat de caseina și soia.Dacă se detectează UFC de levuri și fungi filamentoși se iau în calcul la numărul total de UFC pentru acest mediu (cu hidrolizat de caseina și soia). Numărul total combinat de levuri și fungi filamentoși (TYMC) reprezintă media de UFC determinată pe mediul agar Sabouraud cu dextroză.Dacă se detectează UFC de bacterii pe acest mediu de cultură, se iau în calcul la numărul total de UFC dezvoltate pe mediul agar Sabouraud cu dextroză.

Notă:Numărul total de microorganisme aerobe viabile este egal cu numărul de bacterii +numarul de levuri și fungi filamentoși dezvoltate pe cele două medii de cultură.

3.1.2. Izolarea și identificarea bacteriilor gram negative tolerante la sărurile biliare

Medii de cultură:

-Bulion cu hidrolizat de caseină și soia (Casein soya bean digest broth) ;

-Bulion de ȋmbogatire pentru Enterobacterii ( Enterobacteria enrichment broth – Mossel) ;

-Agar cu roșu fenol, cristal violet, săruri biliare și glucoză (Violet red bile glucose agar);

Soluții :

-bulion cu hidrolizat de caseină și soia (Casein soya bean digest broth)

Preparare proba si pre-incubare

Se prepară dilutia 1/10 din proba de lucru ȋn bulion cu hidrolizat de caseină și soia (Casein soya bean digest broth).Se omogenizează și se incubează la 20-250C, timp de 2-3ore pentru ca bacteriile să treacă în faza de multiplicare exponențială.

Test pentru absență

Din cultura obținută se transferă o cantitate care sa corespundă pentru 1g de proba ȋn bulion de ȋmbogatire Mossel pentru Enterobacterii (Enterobacteria enrichment broth – Mossel).Se incubează la 30-350C, timp de 24-48 ore. Se efectuează subculturi pe plăci Petri cu agar cu roșu fenol,cristal violet,săruri biliare și glucoză (Violet red bile glucose agar ).Se incubeaza la 30-350C, timp de 24-48ore. Produsul corespunde dacă nu se dezvoltă colonii de bacterii Gram-negative de culoare roșie sau roșiatică.

Evaluarea cantitativă

În bulion de îmbogățire Mossel pentru Enterobacterii (Enterobacteria enrichment broth – Mossel) se transfera o cantitate care să corespundă la 0,1g, 0,01g, 0,001g de probă. Se incubează la 30-350C pentru un interval de 24–48ore. Se efectuează subculturi pe plăci Petri cu agar cu roșu fenol, cristal violet, săruri biliare și glucoză (Violet red bile glucose agar ). Se incubează la 30-350C, timp de 18-24ore.Pentru produsele de uz oral care se prepară din plante medicinale, se efectuează testul semi-cantitativ.Se prepară diluția 1/10 din probă de lucru în bulion cu hidrolizat de caseina și soia (Casein soya bean digest broth). Se incubează la 20-250Cpentru un interval de 2-3ore, necesar pentru inițierea multiplicării.

Selecție și subcultură

În bulion de îmbogățire Mossel pentru enterobacterii (Enterobacteria enrichment broth-Mossel) se transferă o cantitate care să corespundă la 0,1g, 0,01g, 0,001g, 0,0001g;Se incubează la 30-350C pentru 24-48ore. Se fac subculturi pe plăci agar cu agar roșu fenol, cristal violet, saruri biliare și glucoză. Se incubează la 30-350C pentru 18-24ore.

Interpretare:

Prezența unor colonii reprezintă un rezultat pozitiv. Se notează plăcile cu cantitatea cea mai mică din produs pe care s-au dezvoltat colonii și care reprezintă un rezultat pozitiv și plăcile cu cantitatea cea mai mare din produs pe care nu s-au dezvoltat colonii și care reprezintă un rezultat negativ.

3.1.3. Izolarea și identificarea Escherichia coli

Medii de cultură :

-bulion MacConkey (MacConkey broth);

-agar MacConkey (MacConkey agar);

Soluții :

-bulion cu hidrolizat de caseină și soia (Casein soya bean digest broth)

-soluție tamponată de clorură de sodiu, pH=7,00 (buffered sodium chloride solution pH=7,0);

-soluție de lucru tampon fosfat, pH=7,2 (phosphate buffer solution, pH=7,2);

Preparare probă și pre-incubare:

Se prepară diluția 1/10 din probă de lucru în una dintre soluțiile menționate mai sus care să conțină cel puțin 1g probă. Se inoculează în bulion cu hidrolizat de caseina și soia (Casein soya bean digest broth ). Se omogenizează și se incubează la 30-350C, timp de 18-24ore.

Selecție și subcultură

Se transfera 1mL din omogenatul obținut în 100 mL bulion MacConkey . Se incubează la 42-440C, timp de 24-48ore. Se efectuează subculturi pe plăci Petri cu agar MacConkey (MacConkey agar). Se incubează la 30-350C, timp de 18-72ore.

Interpretare:

Dacă se dezvoltă colonii de bacterii Gram-negative, de culoare roșie, lactozo-pozitive și nemucoide se suspecteza prezența microorganismului Escherichia coli.Confirmarea se efectuează prin teste de identificare specifice (cultivare pe Agar triple sugar= agar cu glucoză, lactoză, zaharoză). Pentru produsele de uz oral care se prepară din plante medicinale, se efectuează testul semi-cantitativ ( metodă numărului probabil ).Din probă diluata 1/10 se inoculează în bulion cu hidrolizat de cazeină și soia (Casein soia bean digest broth ) cantități care să corespundă la 0,1g, 0,01g sau 0,001 g.Se inoculează în bulion cu hidrolizat de caseina și soia (Casein soya bean digest broth). Se omogenizează și se incubează la 30-350C, timp de 18-24ore.

3.1.4. Izolarea și identificarea Salmonella spp.

Medii de cultură:

-bulion de ȋmbogatire Rappaport Vassiliadis pentru Salmonella (Rappaport Vassiliadis Salmonella enrichment broth);

-agar cu xiloză, lizină si deoxycholat (Xylose, lysine, deoxycholate agar);

-bulion cu hidrolizat de caseină și soia (Casein soya bean digest broth)

Soluții:

-soluție tamponată de clorură de sodiu, pH =7,00 (buffered sodium chloride solution pH=7,0) ;

-soluție de lucru tampon fosfat, pH = 7,2 (phosphate buffer solution, pH= 7,2);

-mediu tamponat cu peptonă.

Preparare probă și pre-incubare

Se prepară o diluție ȋn mediu tamponat-peptonă care să contină 25 g produs în 225 mL mediu de pre-ȋmbogatire. Se omogenizează și se incubează la 30 – 35șC, timp de 18 – 24 ore.

Selecție și subcultură

Se transferă 0,1mL din cultura obținută ȋn 10mL bulion de ȋmbogațire Rappaport Vassiliadis pentru Salmonella (Rappaport Vassiliadis Salmonella enrichment broth). Se incubează la 30–350C timp de 18-24ore. Se fac subculturi pe plăci Petri cu agar cu xiloză, lizină și deoxicholat (Xylose, lysine, deoxycholate agar). Se incubează la 30-350C, timp de 18-48ore.

Interpretare:

Posibila existență a microorganismului Salmonella sp. este indicată de dezvoltarea unor colonii de culoare roșie, cu centrul facultativ colorat în negru. Confirmarea se efectuează prin teste de identificare specifice.

3.1.5. Rezultate si discuții

Rezultate și discuții privind caracterizarea microbiologică a produsului stupului – Polen

Pentru efectuarea studiului au fost luate în lucru trei probe de “Polen”, P1 = probă Polen recoltată în anul 2013, P2 = probă Polen recoltată în anul 2014 respectiv P3 = probă Polen recoltată în anul 2015, provenite din stupina SC AROMA SRL, Furculesti, Jud.Teleorman.

Probele au fost analizate din punct de vedere microbiologic cu metodele de analiză descrise în Capitolul 3 subcapitolul 3.1, pentru a pune în evidență calitatea și siguranța acestora.

Rezultatele obținute la analiza microbiologicӑ a probelor luate în lucru sunt menționate în Tabelul 5, Tabelul 6 respectiv Tabelul 7.

Tabelul 5

Rezultatele obținute la analiza contaminarii microbiene a probelor de “Polen” pentru proba P1

Tabelul 6

Rezultatele obținute la analiza contaminarii microbiene a probelor de “Polen” pentru proba P2

Tabelul 7

Rezultatele obținute la analiza contaminarii microbiene a probelor de “Polen” pentru proba P3

Comentarii:

Valorile obținute la analiza microbiologică a probelor de “Polen” luate în lucru atestă faptul că acestea sunt de calitatea intenționată, ȋncadrȃndu-se ȋn limitele de admisibilitate prevăzute de Farmacopeea Europeană, ediția ȋn vigoare și legislația europeană în vigoare, referitoare la calitatea produselor naturale, din punct de vedere al contaminării microbiene.

Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute in cadrul analizelor microbiologice ale probelor luate în studiu este prezentată mai jos:

Fig.16 – Reprezentarea grafică a parametrului “Contaminare microbiană: Număr total de microrganisme aerobe (TAMC)”

Fig.17 – Reprezentarea grafică a parametrului “Contaminare microbiană: Număr total combinat de levuri și fungi filamentoși (TYMC)”

Fig.18 – Reprezentarea grafică a parametrului “Contaminare microbiană: Bacterii gram-negative tolerante la sărurile biliare”.

3.2. Studiul eficacitatii antimicrobiene

Verificarea eficacitătii antimicrobiene se efectuează ȋn conformitate cu Farmacopeea Europeană, Ediția a 9.0-a, capitolul 5.1.3. “Eficacitatea antimicrobiana a conservantilor”, prin metodă inoculării ȋn profunzime. Ȋn vederea efectuării controlului eficacității antimicrobiene, contaminarea experimentală se efectuează cu următoarele microorganisme:

-Bacterii: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538 și Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

-Fungi: Candida albicans ATCC 10231 și Aspergillus brasilensis ATCC 16404.

Bacteriile se inoculează pe Agar cu hidrolizat de caseina și soya (Casein soya been digest agar), iar fungii se inoculează pe Agar Sabouraud cu dextroză (Sabouraud dextrose agar). Pentru bacterii, se fac trei pasaje pe Agar cu hidrolizat de caseina și soya (Casein soya been digest agar) la intervale de 18-24ore și o incubare la temperatură de 30-350C.

Pentru Candida albicans și Aspergillus brasilensis se fac trei pasaje pe Agar Sabouraud cu dextroză (Sabouraud dextrose agar) la intervale de 48ore și respectiv la 7zile. Mediul inoculat se incubează la temperatură de 20-25 șC. Culturile bacteriene și fungice se spăla cu Bulion cu clorură de sodiu și peptonă tamponată pH=7,0 (Buffered sodium chloride-peptone broth pH=7,0). Suspensiile se diluează cu aceeași soluție până la o concentrație până de 108 microorganisme test/mL, folosind standardul nefelometric. În flacoane care conțin 20mL sau 20g din probă de analizat se adaugă câte 0,1mL din suspensiile de microorganism test, astfel încât să se obțină o concentrație finală de 105 -106microorganisme-test. În flacoane care conțin 20 mL Bulion cu clorură de sodiu și peptonă tamponată pH=7,0 se aduga câte 0,1mL din suspensiile de microorganisme-test, astfel încât să se obțină o concentrație finală de 105 -106microorganisme test/mL. Probele de omogenizează și se mențin la 20-250C, protejate le lumina. Prelevarea din probele contaminate experimental se efectuează în funcție de câtegoria de produs:

-Câtegoria 1: pentru preparatele de uz topic se recoltează câte1mL la momentul inițial, la 2zile, la 7zile, la 14zile și la 28zile

-Câtegoria 2: pentru preparatele administrate pe cale orală sau intrarectala, se recoltează câte1mL la momentul inițial, la 14zile și la 28zile.

Criterii de acceptare:

Criteriul de evaluare al activității antimicrobiene este prezentat sub formă de reducție logaritmică a numărului de microorganisme viabile. Se efectuează raportul dintre numărul de UFC/mL inițial (timpul zero) și numărul de UFC/mL determinat la intervalele de timp menționate pentru fiecare câtegorie de produs.

Pentru preparatele din Câtegoria 1 (Criteriul A):

-numărul inițial de bacterii trebuie să fie redus cu un factor de 102/mL/g în decurs de 2 zile de la inoculare și de 103 în decurs de 7 zile de la incubare; după 14 și 28 de zile nu este admisă prezența bacteriilor;

-numărul inițial de bacterii trebuie să fie redus cu un factor de 102/mL/g în decurs de 14 zile de la inoculare; după acest interval de timp nu este admisă prezența fungilor;

Pentru preparatele din Câtegoria 2 (Criteriul A):

-numărul inițial de bacterii trebuie să fie redus cu un factor de 103/mL/g în decurs de 14 zile de la inoculare; după 28 de zile nu este admisă prezența bacteriilor;

-numărul inițial de fungi trebuie să fie redus cu un factor de 101/mL/g ȋn decurs de 14 zile de la inoculare; după acest interval de timp nu este admisă prezența fungilor.

3.2.1. Rezultate și discuții

Rezultate și discuții privind studiul eficacității antimicrobiene a polenului

Referitor la verificarea eficacității antimicrobiene această a fost efectuată în conformitate cu Farmacopeea Europeană, Ediția 9.0, capitolul 5.1.3. “Eficacitatea antimicrobiana a conservantilor”, prin metoda inoculării în profunzime.

Pentru efectuarea studiului au fost luate în lucru trei probe de “Polen” provenite din stupina SC HOFIGAL EXPORT IMPORT SA. și anume:

P1 = probă Polen recoltată în anul 2013,

P2 = probă Polen recoltată în anul 2014

P3 = probă Polen recoltată în anul 2015

Microorganismele-test față de care se efectuează testarea eficacității antimicrobienesunt menționate mai jos:

-Staphylococcus aureus ATCC 6538;

-Escherichia coli ATCC 8739;

-Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

-Aspergillus brasiliensis ATCC 16404;

-Candida albicans ATCC 10231

Cultivare microorganisme si prelucrarea probelor

Pentru bacterii, s-au efectuat trei pasaje, la intervale de 18-24 de ore, cu incubare la temperatură de 30-35 0 C. Pentru Candida albicans și Aspergillus brasiliensis s-au efectuat trei pasaje pe agar Sabouraud cu dextroză la intervale de 48ore și respectiv 7zile, pentru a obține o sporulare bună. Din fiecare microorganism s-au preparat suspensii cu o concentrație de 1 x10 8 /mL, în bulion cu clorura de sodiu și peptonă, corespunzătoare turbidității tubului 0,5 Mac Farland. Din acestea s-au preparat ulterior suspensii de lucru cu o concentrație de 1 x105/mL. În 6 flacoane care conțin câte 20mLprobă de analizat s-au adăugat câte 0,1mL din fiecare suspensie care conține 105-106microorganisme test/mL. În paralel, s-au efectuat probe martor cu 105-106 pentru fiecare microorganism-test.

Tehnica de lucru:

Testarea probelor contaminate forțat și a probelor martor s-a efectuat prin metoda inoculării în profunzime, la următoarele intervale de timp: T0= momentul inițial; T1= 1 oră, T3=6ore, T4=9 ore, T5=24ore, T6=48ore, T7=7zile; T8=14zile; T9=21zile, T10=28zile. La intervalele menționate mai sus s-a prelevat câte 1 mL probă de analizatși microorganismul test din probele martor. S-au transferat în câte două plăci Petri cu diametrul de 9 cm. Pentru bacterii s-au adăugat 10-20mL Agar cu hidrolizat de caseina și soia, iar pentru levuri și fungi filamentoși, s-au adăugat 10-20mL Agar Sabouraud cu dextroză.

Mediile de cultură lichefiate nu trebuie să aibă mai mult de 450C.Plăcile cu agar hidrolizat de caseina și soia s-au incubat pentru 24ore la 30-350C, iar cele cu agar Sabouraud cu dextroză s-au incubat pentru 5-7zile la 20-250C.După acest interval de timp a fost determinat numărul de microorganisme viabile (UFC/g).

Rezultatele obținute în cadrul verificării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen, față de microorganismele-test utilizate, sunt prezentate în Tabelul 8, Tabelul 9 respectiv Tabelul 10.

Tabelul 8

Rezultatele obținute in cadrul verificării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” pentru proba P1

Tabelul 9

Rezultatele obținute in cadrul verificării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” pentru proba P2

Tabelul 10

Rezultatele obținute in cadrul verificării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” pentru proba P3

Concentratiile microorganismelor-test (probe martor) la fiecare moment de testare, ȋn cadrul verificării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” sunt prezentate ȋn Tabelul 11.

Tabelul 11

Rezultatele obținute in cadrul verificării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” pentru microorganismele-test

Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute in cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” pentru probele P1, P2 respectiv P3 față de fiecare dintre microorganismele-test utilizate ȋn cadrul studiului, este prezentată mai jos.

Fig.19 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținuteȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P1 față de Staphylococcus aureus ATCC 6538

Fig.20 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P1 față de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Fig.21- Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P1 față de Escherichia coli ATCC 8739

Fig.22 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P1 față de Candida albicans ATCC10231

Fig.23 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P1 față de Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Fig.24 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P2 față de Staphylococcus aureus ATCC 6538

Fig.25 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P2 față de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Fig.26 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P2 față de Escherichia coli ATCC 8739

Fig.27 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P2 față de Candida albicans ATCC10231

Fig.28- Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P2 față de Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Fig.29 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P3 față de Staphylococcus aureus ATCC 6538

Fig.30 -Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P3 față de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

Fig.31 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P3 față de Escherichia coli ATCC 8739

Fig.32 – Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P3 față de Candida albicans ATCC10231

Fig.33- Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute ȋn cadrul testării eficacității antimicrobiene a produsului stupului “Polen” – proba P3 față de Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

Comentarii:

Pe baza rezultatelor obținute în timpul studiului privind verificarea eficacității antimicrobiene a se poate concluziona că produsul stupului “Polen”– proba P1, proba P2, respectiv proba P3 prezintă eficacitate antimicrobiană, reducția logaritmică fiind log = 5 (105UFC), față de microorganismele:

Staphylococcus aureus ATCC 6538,

Escherichia coli ATCC 8739,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027,

Candida albicans ATCC 10231 și

nu prezintă eficacitate antimicrobiană față de microorganismul Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

Suspensiile de microorganisme – test (105 – 106) folosite ca MARTOR (= fara prezenta produsului), utilizate și pentru contaminarea forțată a produsului s-au dezvoltat corespunzator așa cum se poate vedea din rezultatele obținute în timpul studiului și din reprezentarea grafică.

concluzii

1. Din rezultatele obținute în cadrul analizelor fizico-chimice ale celor trei probe de Polen provenite din aceeași sursă (P1 = probă Polen recoltată în anul 2013, P2 = probă Polen recoltată în anul 2014 respectiv P3 = probă Polen recoltată în anul 2015) se pot concluziona următoarele:

pentru parametri “Pierdere prin uscare” și “Cenușă totală” valorile obținute pentru cele trei probe comparabile între ele și se încadrează în limitele de admisibilitate prevăzute de specificatia tehnica a producatorului respectiv in limitele prevazute specificatia tehnica a producatorului respectiv de literatura de specialitate;

pentru parametri “Conținut ȋn polifenoli totali exprimați ȋn acid clorogenic”, Conținut ȋn flavonoide exprimate în rutin”, ”Conținut ȋn zaharuri totale “,”Conținut ȋn zaharuri reducătoare”, Conținut ȋn aminoacizi exprimati în acid glutamic” au fost obținute valori comparabile pentru cele trei probe, acestea depășind limitele de admisibilitate prevăzute de literatura de specialitate.

2. În cadrul determinării conținutului de minerale al celor trei probe de Polen se observă următoarele:

valorile obținute la determinarea conținutului în minerale sunt comparabile între cele trei probe luate în studiu;

raportul între calciu și magneziu este de 1: 2, acest raport fiind ideal pentru asimilarea mineralelor de catre organismal uman;

raportul sodium / potasiu indicat de literatura de specialitate este de 1:10, în cazul celor trei probe de Polen fiind mult maimareși anume 1:30;

pe lângă faptul că cele trei probe conțin cantități însemnate de fier și zinc, acestea conțin cantități mai mici mangan;

în probele de Polen nu sunt prezente urme de metale grele (cupru, crom, plumb, cadmiu).

3. Valorile obținute la analiza fizico-chimică a probelor de “Polen” luate în lucru atestă faptul că acestea suntde calitatea intenționată, ȋncadrȃndu-se ȋn limitele de admisibilitate prevăzute literatura de specialitate și legislația europeană în vigoare.

4. Valorile obținute la analiza microbiologică a probelor de “Polen” luate în lucru atestă faptul că acestea sunt de calitatea intenționată, ȋncadrȃndu-se ȋn limitele de admisibilitate prevăzute literatura de specialitate și legislația europeană în vigoare, referitoare la calitatea produsului natural de origine naturală vegetală, din punct de vedere al contaminarii microbiene.

5. Pe baza rezultatelor obținute în cadrul analizelor fizico-chimice și microbiologice se poate spune că probele de Polen nu își modifică semnificativ compoziția chimică în timp, dacă acestea sunt păstrate în condiții corespunzătoare de temperatură și umiditate.

6. Pe baza rezultatelor obținute în timpul studiului privind verificarea eficacității antimicrobiene a se poate concluziona că produsul stupului “Polen”– proba P1, proba P2, respectiv proba P3prezintă eficacitate antimicrobiană, reducția logaritmică fiind log = 5 (105 UFC), față de microorganismele Staphylococcus aureus ATCC 6538, Escherichia coli ATCC 8739, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231.

7. Pe baza rezultatelor obținute în timpul studiului privind verificarea eficacității antimicrobiene a se poate concluziona că produsul stupului “Polen”– proba P1, proba P2, respectiv proba P3 nu prezintă eficacitate antimicrobiană față de microorganismele Aspergillus brasiliensis ATCC 16404.

8. Suspensiile de microorganisme – test (105 – 106) folosite ca MARTOR (= fara prezenta produsului), utilizate și pentru contaminarea forțată a produsului s-au dezvoltat corespunzător așa cum se poate vedea din rezultatele obținute în timpul studiului și din reprezentarea grafică.

9. Ca urmare, produsul stupului studiat permite declararea acestuia ca materie primă de origine naturală pentru industria farmaceutică și a suplimentelor alimentare.

bibliografie

Andrițoiu V., Andrițoiu C.V., Cazuri și studii clinice în apiterapie, Casa de Editură Venus, Iași, 2010

Andrițoiu C.V., Andrițoiu V., Teze și ipoteze în apiterapie și apidietă, Casa de Editură Venus, Iași, 2010

Babaei S, Rahimi S, Karimi Torshizi MA, Tahmasebi G, Khaleghi Miran SN,” Effects of propolis, royal jelly, honey and bee pollen on growth performance and immune system of Japanese quails”, Vet Res Forum. 2016 Winter;7 (1):13-20. Epub 2016 Mar 15.

Denisow B, Denisow-Pietrzyk M., (2016), ”Biological and therapeutic properties of bee pollen: a review”, J Sci Food Agric. 2016 Oct; 96(13):4303-9. doi: 10.1002/jsfa.7729. Epub 2016 Apr 19.

Fatrcová-Šramková K, Nôžková J, Máriássyová M, Kačániová M , (2016) “Biologically active antimicrobial and antioxidant substances in the Helianthus annuus L. bee pollen” J Environ Sci Health B. 2016;51(3):176-8. doi: 10.1080/03601234.2015.1108811.

European Pharmacopoeia, 8.0 edition, Concil of Europe, Strasbourg, Franta

Farmacopeea Romana, Editia X–reeditata 2008, Editura Medicala, Bucuresti

Herbert, Elton W, and H Shimanuki. "Chemical Composition and Nutritive Value of Bee-Collected and Bee-Stored Pollen". Bacillus".

Karsten Münstedt and Stefan Bogdanov, (2009) , Bee products and their potential use in modern medicine, Journal of ApiProduct and ApiMedical Science 1 (3): 57-63 (2009)

Komosinska-Vassev K, Olczyk P, Kaźmierczak J, Mencner L, Olczyk K.,( 2015), “Bee pollen: chemical composition and therapeutic application ”Evid Based Complement Alternat Med. 2015; 2015:297425. doi: 10.1155/2015/297425. Epub 2015 Mar 11

Mateescu C. (2011) “APITERAPIA sau cum sa folosim produsele stupului pentru sanatate, Editia a III a” Editura Fiat Flux, Bucuresti

Mateescu C. (2006) “APITERAPIA sau cum sa folosim produsele stupului pentru sanatate” Editura Fiat Flux, Bucuresti

Pascoal A, Rodrigues S, Teixeira A, Feás X, Estevinho LM. (2014), “Biological activities of commercial bee pollens: antimicrobial, antimutagenic, antioxidant and anti-inflammatory”, Food Chem Toxicol. Jan; 63:233-9 doi: 10.1016/j.fct.2013.11.010

Popescu, C., V., (2013), Ingredienți activi naturali cu proprietăți antimicrobiene, Editura Vasile Goldiș University Press, Arad, ISBN: 978-973-664-638-6.

Rzepecka-Stojko A, Stojko J, Kurek-Górecka A, Górecki M, Kabała-Dzik A, Kubina R, Moździerz A, Buszman E, “Polyphenols from Bee Pollen: Structure, Absorption, Metabolism and Biological Activity” , Molecules. 2015 Dec 4; 20(12):21732-49. doi: 10.3390/molecules 201219800.

Serra Bonvehi J., Escura Pesudo F., Giner Pallares J. (1991)-Ladétermination quantitative des acides amines libres dans les pollens apicoles a l, aide de la chromatographie en phase gazeuse, chromatographie liquide haute performance et spectrophotometrie” Ann. Fals. Chim. 897(84):153 – 166