Cromozomul Philadelphia. Produsului Genei de Fuziune Bcr Abl

citogenetice adiționale (ACA). Anomaliile citogenetice adiționale au constat în anomalii numerice și anomalii structurale.

La majoritatea pacienților cu LMC, singura modificare citogenetică este reprezentată de translocația standard t(9;22) și doar un procent restrâns din cazuri prezintă anomalii citogenetice adiționale la diagnostic. (Di Bacco A. și colab., 2000).

5.3 Cromozomul Philadelphia . Produsul genei de fuziune bcr-abl

Proteina BCR/ABL este efectul translocației reciproce echilibrate între cromozomii 9 și 22. Cromozomii 9 și 22 se fracturează la nivelul brațelor lungi, în zonele unde sunt plasați locii protooncogenei ABL(la 9q34) și ai genei bcr1 (la 22q11).

Gena abl este omologul uman al oncogenei v-abl care este răspunzatoare de leucemia murină Abelson (A-MuLV) și codifică un nonreceptor de tirozinkinază. Măsoară 230 Kb și conține 12 exoni dintre care primii 2 sunt numiți 1b și 1a, deoarece în procesul de maturare al ARN m pot fii excizati alternativ. Produsul său este o proteină de 145 Kda (p145) exprimată ubiquitar, ce face parte din familia tirozin-kinazelor nonreceptori și are două izoforme care rezultă din splicingul alternativ al primului exon.

Figura 4. Structura proteinei ABL: Tipul Ia de izoformă este ușor mai scurt decât tipul Ib, care conține un sit myr care este un loc de atașare la membrana plasmatică. De notat cele3 domenii SRC de omologie(SH) situate aproape de capătul NH2 terminal. Y393 este locul major de autofosforilare între domeniile kinazice, iar fenilalanina 401(F401) este conservată în partea SH. Mijlocul fiecărei proteine este dominată de regiunile bogate în prolină, capabile să se lege de domeniile SH 3. Capătul carboxiterminal conține ADN, care aparține domeniilor G și F actinic. Sunt vizualizate locurile de fosforilare Alm, cdc2 și PKC. Săgeata indică poziția punctului de rupere în proteina de fuziune BCR-ABL.

Conține mai multe domenii funcționale înșiruite în direcția NH2-COOH ; trei domenii SRC (SH3-SH2-SH1) localizate aproape de capătul NH2 terminal, trei domenii bogate în prolină (ab1,ab2,ab3), un domeniu cu rol de semnal de localizare nucleară (NLS), un domeniu de atașare la actină. SH1 conține activitatea tirozinkinazică. Celelalte două domenii SH și domeniile ab servesc la cuplarea proteinei ABL la secvențele specifice, sau complementare din structura altor molecule partenere: SH2 cu fosfotirozine ,SH3 cu segmente bogate în prolină. Secvențele bogate în prolină din centrul moleculei pot să interacționeze cu domeniile SH3 ale altor proteine ca Crk. Aproape de capătul 3 se gasesc locuri pentru semnale nucleare, locuri de legare pentru ADN, și locuri de legare pentru actină.

Proteina normală ABL este implicată în reglarea ciclului celular, în răspunsul la stresul genotoxic și în transmiterea informațiilor de la micromediu celular prin calea integrinelor. De asemenea, se pare că proteina ABL are un rol complex ca modul celular care integrează semnalele de la surse variate extra și intracelulare ce influențează deciziile cu privire la ciclul celular și la apoptoză. De remarcat că aceste date sunt bazate pe studii in vitro pe fibroblaste și nu pe celule hematopoietice, astfel încat sunt înca controversate.

Punctele de ruptură ale genei abl în regiunea 9q34 pot aparea oriunde, pe o porțiune de 300kb la capătul 5 terminal la nivelul exonului 2, mai sus decât primul exon alternativ Ib și mai jos de al doilea exon alternativ Ia, mai frecvent între cele două.

Materialul genetic situat în aval de punctul de rupere, migrează pe cromozomul 9. Punctele de rupere ale genei abl sunt plasate către extremitatea 5 ‘, înaintea exonului 2. Fragmentul distal al genei care migreaza pe cromozomul 22 cuprinde exonii 2-11(marcati cu “a”). Prin rearanjarea pe cromozomul 22 fragmentul distal al genei abl fuzionează cu segmental proximal din gena bcr rămas pe loc.

Gena bcr ca și gena abl, este exprimată ubicuitar și codifică pentru o proteină de 160 kd. Gena bcr1 este inclusă într-un megalocus complex în care sunt înșiruite în direcția centromer-telomer 8 gene: bcr2-gena pentru sindromul di George, bcr5, bcr4 gena pentru lanțul  de imunoglobulină, bcr1, bcr3, bcr6. Pot fi definite câteva structuri. Prima cu exon N- terminal codifică pentru o serintreoninkinază. Singurul substrat pentru această kinază este Bap-1, un membru al familiei de proteine 14-3-3 și posibil BCR însusi. Domeniul coiled-coin al capătului N terminal BCR permite formarea de dimeri in vivo. Centrul moleculei conține o regiune asemănătoare pleckstrinei (PH), care stimulează schimbul de guanidintrifosfat (GTP) și guanidinbifosfat (GDP) pe factorii de schimb Rho guanidine care în schimb poate activa factorii de transcripție ca NF-kB. Capatul C terminal are activitate GTP-azică pentru Rac și o activitate GTP-azică scăzută pentru superfamilia Ras care reglează polimerizarea actinei și activitatea NADPH oxidazei în celulele fagocitare.

De asemenea, BCR poate fi fosforilata de câteva reziduri de tirozină, mai ales tirozina 177 care leagă Grb-2, o molecula importantă implicată în activarea căii Ras. De remarcat că ABL s-a dovedit ca fosforilează BCR în celulele COS1, ceea ce determină o reducere a activitații kinazice a BCR. Aceste date reprezintă un argument pentru rolul BCR în transducția semnalelor, dar rolul ei biologic rămane să fie dovedit.

Figura 5. Proteina BCR se poate autofosforila, sau mai multe tirozine din structura sa pot servi ca substraturi pentru tirozinkinaze din diverse surse moleculare. Spre deosebire de gena Abl, în care punctul de ruptură este la nivelul exonului 2, gena BCR are trei mari puncte de ruptură, așa numitele breakpoint cluster region (BCR).

În LMC și în aproximativ o treime din cazurile de leucemie acută limfoblastică Ph+, linia de ruptură a genei bcr 1 se produce într-o zonă mică de 5,8 Kb denumită M-bcr (Major- breakpoint cluster region), care cuprinde aria exonilor 12-16 (denumiți și b1-b5). Gena de fuziune (5’ bcr-abl 3’) care se asamblează pe cromozomul Ph 1 se transcrie într-un ARN m hibrid primar. Acesta poate suferi excizii alternative ale exonilor bcr 13 (b2) sau 14 (b3), care au ca rezultat diferite variante de fuziune b2a2 sau b3a2. Acestea sunt traduse în proteina himerică P 210. Gena de fuziune, transcriptul hibrid și proteina himerică, împreună constituie baza diagnosticului la nivel molecular al LMC. (Aamir Rana și colab, 2011).

Saglio și colaboratorii au descris o nouă poziție pentru punctul de rupere al genei bcr, care este localizat în direcție 3’ față de punctual major M-bcr, între exonii e19 și e20, creând astfel un nou transcript de fuziune e19a2. Acest transcript conține o parte din gena bcr și codifică pentru o proteină de fuziune P230.

Mecanismele care provoacă t (9:22)(q34;q11) nu sunt cunoscute în detaliu. Analizând expresia G6PD în celulele bolnavilor cu LMC, Fialkow și colaboratorii aduc argumente în sprijinul originii clonale a bolii, și a faptului că proliferarea clonală precede apariția translocației. Cu ajutorul RT-PCR s-a demonstrat că celulele sanguine ale unor persoane normale pot exprima titruri mici de ARNm hybrid BCR/ABL (cca.1-10 transcripte /10 8 celule ) cu o frecvență individuală ce crește paralel cu vârsta. În anumite condiții experimentale s-au indus fuzionări ale genelor bcr și abl. S-au înregistrat diverse variante hibride dintre care numai unele îndeplineau condițiile corecte de respectare a cadrului de lectură care permite în continuare transcripția și translația. S-a sugerat că fuzionarea bcr-abl ar putea avea loc in vivo în mod continuu în celulele hematopoietice primitive normale, dar numai fuzionările corecte s-ar traduce în formarea proteinei himerice funcționale și s-ar asocia în acest mod cu un avantaj selectiv, soldat cu expansiunea clonală. S-ar părea că recombinarea celor două gene nu ar fi doar un eveniment întamplator. In nucleii celulelor CD 34+, ele sunt dispuse la distanță destul de mică una față de cealaltă, iar la momentul tranziției S-G2, ajung chiar să se învecineze, ceea ce ar favoriza producerea translocației. În faza cronică de debut a LMC, translocația afectează numai câte un cromozom ai perechilor 9 și 22. Conform unor argumente de ordin citogenetic s-a sugerat că participanții la schimbul de material genetic ar fi cromozomul 9 de proveniență paternă și cromozomul 22 de origine maternă.

Fragmentul distal al genei care migrează pe cromozomul 22 cuprinde exonii 2-11. Prin rearanjarea pe cromozomul 22, fragmentul distal al genei ABL1 fuzionează cu segmental proximal din gena bcr rămas pe loc. Tranlocația reciprocă t(9; 22) se soldează cu o pierdere mare de material genetic din zestrea primară a cromozomului 22, care se strămută pe cromozomul 9. Morfologic, cromozomul 22 rearanjat, apare micșorat ca și cum ar fi suferit o deleție (22q-). Nowell și Hungerford au fost primii care au sesizat în 1960 anomalia de talie a cromozomului 22, pe care l-au denumit cromozomul Philadelphia (ph1), fiind corespondentul citogenetic al LMC.

Proteina P 210 generează fenotipul LMC prin domeniile funcționale ale proteinelor primare (bcr și abl), care se regăsesc în produsul de fuziune. Două zone ale componentei bcr, (codificate în primul exon al genei), contribuie în mod decisiv la capacitatea transformatoare a proteinei himerice. Prima care cuprinde aminoacizii 1-63 de la capătul aminoterminal (corespunzând domeniului DD al genei) produce homodimerizarea proteinei BCR/ABL și este implicată în activările unor funcții ale componentei ABL: Tk și atașarea de actină. Cea de-a doua, ce corespunde aminoacizilor 176-426 conține secvențele necesare pentru legarea la domenii SH2 și pentru atașarea adaptorului Grb 2. Funcțiile specifice abl esențiale pentru activarea Tk (fosforilează tirozine din diverse substrate și tirozine proprii – efect autoactivator) de conservare intactă a domeniului SH2 și de activare a domeniului de atașare la actină.

Deși pare să fie clar rolul proteinei P210 în procesul de leucemogeneză, există numeroase întrebari ce nu au încă un răspuns.(Cortes, 2007)

Singurul factor cunoscut ca fiind predispozant, îl reprezinta radiațiile ionizante. Pentru cei mai multi pacienți nu se identifică un factor predispozant, iar cauza translocației cromozomale este obscură. De asemenea, este greu de înțeles mecanismul prin care apare inevitabil progresia din faza cronică în faza accelerată și criză blastică fatală. Heterogenitatea clinică a acestei boli este încă neexplicată. Cu terapie standard, durata medie de supraviețuire este de 6 ani, dar există pacienți care mor în primul an de la diagnostic, iar alții supraviețuiesc mai mult de 20 de ani. La unii pacienți boala debutează cu o fază cronică agresivă, iar la alții boala este indolentă. (Oliver Hantchel și colab, 2004).

Au fost luate în studiu 20 de probe provenite de la pacienți cu LMC, internați în Institutul Clinic Fundeni, din care 17 au fost de maduvă osoasă și 3 probe provenite din sânge periferic.

În toate cazurile s-a folosit măduvă osoasă aspirată prin puncție, pe seringă heparinată și sânge periferic pe vacutainer cu EDTA.

Toate probele au fost supuse investigațiilor prin tehnica FISH.

Probele de maduvă osoasă recoltate au fost supuse protocolului de lucru explicat anterior, s-au utilizat culturi peste noapte și culturi cu sincronizare de ciclu celular.

Analiza FISH a fost realizată pe nuclei interfazici utilizând sonde dublu-fuzionate BCR/ABL, provenite de la firma Cytocell, Cambridge, UK. După preparare lamele au fost incubate peste noapte la 37°C

S-a realizat o comparație între probele provenite din maduvă osoasă și cele colectate din sânge periferic de la pacienții cu LMC. Analiza datelor a pus în evidență o corelație foarte bună cu excepția identificării unui procent mai mic de celule Ph pozitive prin analiza FISH pe sânge periferic. Aceste diferențe ar putea fi cauzate de dinamica diferențiată a celulelor luecemice în maduva osoasă și sângele periferic. În 7 cazuri au fost observate rezultate atipice ale semnalelor la analiza FISH.

Există studii care demonstrează acuratețea folosirii tehnicii FISH în diagnosticul pacienților cu LMC, aceste studii arată că folosirea sondelor dublu colorate este foarte utilă și permite identificarea tuturor tipurilor de fuziune. Aceste studii pot pune în evidență inclusiv inserția criptică la nivelul genei de fuziune ce nu poate fi pusă în evidență prin tehnicile standard. Analiza prin FISH permite de asemenea și o mai mare sensibilitate față de citogenetica clasică, aceasta poate analiza 200 de nuclei sau chiar mai mult.

Tehnica FISH aplicată pe nuclei interfazici face ca această tehnică să fie prioritară în folosire, mai ales când nu se pot obține metafaze, sau atunci când există un numar mic de diviziuni. Detectarea bcr-abl prin analiza FISH pe sânge periferic a devenit o tehnică alternativă pentru citogenetica convenționala clasică.

Diagnosticul la pacienții cu LMC utilizând sânge periferic permite analiza leucocitelor în vederea punerii în evidență a genei de fuziune bcr-abl și nu necesită aspirat medular.Aspiratul medular este o tehnică invazivă și mulți pacienți refuză această procedură.

Alt avantaj al acestei tehnici este reprezentat de costul redus și de lipsa artefactelor de cultură, celulele sunt obținute prin metode directe de laborator. Tehnica necesită timp redus și rezultatele pot fi obținute în 24-48 de ore.

Comparând analiza FISH pe măduvă osoasă și cea pe sânge periferic a dus la concluzia că din maduvă osoasă se vede un rezultat mult mai bun privind numarul de nuclei analizați cu prezența genei de fuziune.

Analiza FISH a fost realizată pe lame obținute prin protocolul uzual de citogenetică conventională. Lamele au fost dehidratate în serii de alcooli. Co-denaturarea a fost facută 2 minute la 75°C urmată de hibridizarea peste noapte la 37°C. După hibridizarea peste noapte, lamele au fost spălate în 0,4X SSC la 73°C pentru 2 minute și respălate în 2 X SSC. Evaluarea semnalelor FISH a fost făcută cu un microscop cu fluorescență (AxioImager, Zeiss, Germany). Pentru fiecare caz au fost evaluați minim 200 de nuclei interfazici (detalii despre metodă –în capitolul anterior).

La majoritatea pacientilor(13/20) a fost pus în evidență semnalul tipic pentru gena de fuziune prin tehnica FISH, anume 1 semnal roșu, unul verde și 2 semnale fuzionate. (Imagine 1.)

Imagine 1 (Orig.)

Nucleu interfazic tipic fuziunii Philadelphia, cu un semnal roșu, unul verde și două semnale fuzionate galbene.

Nuc ish (ABL1 x3), (BCR x 3), (ABL1 con BCR x 2[100]

În cazul a 7 pacienți au fost puse în evidență aspecte atipice ale genei de fuziune bcr-abl prin analiza FISH pe nuclei interfazici. În tabelul de mai jos sunt aratate tipurile de aspecte atipice ale semnalelor, întâlnite la cei 7 pacienti Ph pozitivi.

Tabel 5. ACA prezente la 7 dintre pacienții investigați

Primul pacient este reprezentat de un bărbat, cu vârsta de 43 de ani, proba a fost prelucrată din măduvă osoasă, în urma testului FISH a prezentat anomalii citogenetice adiționale Ph pozitive, reprezentate de 1semnal roșu,unul verde și trei semnale de fuziune. (Imagine 2.)

Imagine 2

Nucleu cu ACA, reprezentate de 1semnal roșu,unul verde și trei semnale de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 4), (BCR x 4), (ABL1 con BCR x 3) [100]

Pacientul cu numărul 3 din lotul de pacienți are vârsta de 43 de ani, sexul masculin. Proba a fost prelucrată din inocul din măduvă osoasă, în urma testului FISH a prezentat cromozomi Philadelphia și anomalii citogenetice adiționale, puse în evidență prin două semnale roșii, două semnale verzi și un semnal de fuziune. (Imaginea 3).

Imagine 3

Nucleu cu ACA reprezentate de două semnale roșii, două semnale verzi și un semnal de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 3),(BCR x 3), (ABL1 con BCR x 1) [100]

Pacientul numărul 4 a fost reprezentat de o persoana de sex feminin, cu vârsta de 47 de ani, proba a fost prelucrată pornind de la inocul din măduvă osoasă, iar în urma testului FISH a prezentat 1 semnal roșu, unul verde și unul de fuziune. (Imagine 4).

Imagine 4

Nucleu cu ACA, 1 semnal roșu, unul verde și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 2), (BCR x 2), (ABL1 con BCR x 1) [100]

Pacientul numărul 10 din lotul de pacienți luat în studiu a fost un barbat cu vârsta de 33 de ani, a prezentat în urma testului FISH făcut din proba provenită din sânge periferic, nuclei Ph pozitivi cu două semnale roșii, unul verde și unul de fuziune.(Imagine 5).

Imagine 5

Nucleu cu ACA, prezintă două semnale roșii, unul verde și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 3), (BCR x 2), (ABL1 con BCR x 1) [100]

Pacientul numărul 13 din lotul de studiu este reprezentat de o persoana de sex masculin, de 63 de ani, a cărui proba a fost prelucrată pornind de la inocul de măduvă osoasă. În urma testului FISH a prezentat anomalii citogenetice adiționale Ph pozitive, pe lângă procentul de 35% de nuclei cu un semnal roșu, unul verde și doua semnale fuziune( Ph pozitiv clasic)(Imagine 6) s-a identificat și un procent de 25% nuclei cu un semnal roșu, două verzi și unul de fuziune.( Imagine 7)

Imagine 6

Nucleu tipic fuziunii Philadelphia cu un semnal roșu, unul verde și două semnale de fuziune

Nus ish (ABL1 x 3),(BCR x 3), (ABL1 con BCR x 2) [100]

Imagine 7

Nucleu cu ACA, prezintă un semnal roșu, două semnale verzi și un semnal de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 2), (BCR x 3),(ABL1 con BCR x 1)[100]

Pacientul cu numărul 16 din lotul de studiu are 35 de ani, sexul masculin, proba de analizat a provenit din măduvă osoasă, în urma testului FISH s-au pus în evidență anomalii citogenetice adiționale, reprezentate de doua semnale roșii, unul verde și unul de fuziune. (Imagine8).

Imagine 8

Nucleu cu ACA, prezintă două semnale roșii, unul verde și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 3),(BCR x 2), (ABL1 con BCR x 1)[100]

Pacientul cu numărul 18 din lotul de studiu a fost reprezentat de un bărbat cu vârsta de 63 de ani, proba de laborator a fost prelucrată pornind de la inocul din măduvă osoasă.

În urma testului FISH a prezentat pe lângă semnalele clasice Ph pozitive( unul roșu, unul verde, 2 fuziune-35%) (Imagine 9) și anomalii citogenetice adiționale în procent de 32%, reprezentate de un semnal roșu, două verzi și unul de fuziune. (Imagine 10).

Imagine 9

Nucleu cu ACA, prezintă două semnale verzi, unul roșu și două de fuziune

Nuc ish (ABL1 x3), (BCR x3), (ABL1 con BCR x 2)[100]

Imagine 10

Nucleu cu ACA, prezintă un semnal roșu, două verzi și unul de fuziune

Nuc ish (ABL1 x 2),(BCR x 3),(ABL1 con BCR x 1)[100]

Discuții

Ideea că leucemia mieloidă cronică ca și alte cancere este rezultatul unei evoluții secvențiale patogenice multistep, este cunoscută de aproximativ 20 de ani, dar nu se știe foarte mult despre modificările moleculare care preced apariția cromozomului Philadelphia. Se pare că generarea unei gene bcr-abl în celula stem pluripotentă apare în condițiile reducerii supravegherii imunologice. Opinia că apariția genei de fuziue bcr-abl este primul pas în geneza leucemiei mieloide cronice este susținută și de experimentele efectuate pe șoarece, la care transfectarea de celule stem cu gena bcr-abl produce o boală asemanatoare cu leucemia mieloida cronică. Odată debutată afecțiunea, faza cronică a bolii variază de la pacient la pacient și trebuie să fie influențată de alți factori.

Mecanismul prin care apare cromozomul Philadelphia și modul în care se ajunge la afecțiune este necunoscut. A fost formulată ipoteza potrivit căreia apropierea genelor bcr și abl în celulele hematopoietice în interfază, poate favoriza translocațiile între cele două gene. Recent s-a identificat un duplicon (două copii de ADN repetitiv ) de 76 kb pe cromozomul 9, aproape de gena abl și pe cromozomul 22, aproape de gena bcr care poate fi implicat în translocație, dar mecanismul rămâne pur speculativ.

Oricare ar fi mecanismul inițial, este cunoscut faptul că are loc creșterea masei mieloide atât a celulelor mature, cât și a precursorilor mieloizi. Până în anii 80 nu era foarte clar dacă există celule mieloide stem Ph- la pacienții nou diagnosticați. Oricum, cercetările făcute au demonstrat prezența progenitorilor mieloizi normali în măduva osoasă și s-a observat că progenitorii Ph- pot fi identificați după doze mari de chimioterapie, sau după scheme de tratament care includeau Interferon. Concluzia a fost că, clona mieloida Ph+ înlocuiește celulele hematopoietice normale, dar nu distruge celulele stem normale reziduale.

În general, se crede că leucemia mieloidă cronică se dezvoltă dintr-o singură celulă stem pluripotentă, care achiziționează un cromozom Philadelphia cu gena de fuziune bcr-abl care conferă celulelor progenitoare avantaje de proliferare față de elementele hematopoietice normale.

Această clonă Ph+, cu timpul dislocă hematopoieza normală reziduală. Nu se cunosc mecanismele moleculare și citogenetice prin care apare de fapt boala. De asemenea, bazele moleculare ale acestui avantaj de proliferare nu sunt bine cunoscute dar pot fi legate în parte de expresia în progenitorii leucemici a factorilor de creștere, mai ales interleukina 3 și factorul de creștere al coloniilor mieloide. Oricum, celulele leucemice supraviețuiesc mai mult decât cele normale, ca rezultat al defectului apoptotic care le impiedică maturizarea și moartea fiziologica.

Modificarea cea mai importantă în leucemia mieloidă cronică o reprezintă prezența proteinei himerice BCR/ABL P210, în celulele leucemice. P 210 induce trei mecanisme cu importanță majoră în leucemogeneza; activarea sistemelor de transmitere intracelulară a semnalelor care promovează proliferarea, reducerea adeziunii celulelor leucemice în micromediul celular (celulele stromale și matricea extracelulară) și inhibiția apoptozei.

Potențialul transformator al proteinei BCR/ABL se datorează activitații de tirozinkinază a segmentului ABL din componența sa. Activitatea tirozinkinazică este promovată de unele secvențe ale segmentului BCR. BCR acționează prin promovarea dimerizarii oncoproteinei, astfel încât cele două molecule adiacente BCR-ABL fosforilează fiecare un reziduu tirozinic și astfel activitatea sa crește. Activitatea kinazică a BCR-ABL devine necontrolabilă, astfel încât uzurpa funcțiile fiziologice ale enzimei normale ABL și interacționează cu o varietate de efectori și proteine, rezultatul final fiind dereglarea activității celulare proliferative cu scăderea aderenței celulare în măduva osoasă și reducerea răspunsului apoptotic la stimulii oncogeni mutageni. Din păcate, contribuția relativă a acestor efecte la desfășurarea fazei cronice a leucemiei mieloide cronice este puțin cunoscută.

BCR-ABL tirozinkinaza provoacă activarea unor substraturi prin transferul unor grupări fosfat (provenite din ATP) la diverse tirozine din structura acestora.

Proteina BCR/ABL activează prin acest mecanism mai multe proteine intracelulare (molecule adaptoare, factori de transcripție, proteine ale scheletului celular ,enzime și în plus posedă capacitatea de autoactivare prin fosforilarea unor tirozine proprii (autofosforilare).

Structura proteinei BCR-ABL și rolul său au fost intens studiate. Cunoștiințe despre rolul și funcțiile domeniilor conținute care derivă de la cele două proteine inițiale BCR și ABL sunt utile pentru a întelege rolul proteinei de fuziune rezultate. Tirozinkinaza codificată de domeniul SH1 al componentei ABL a fuziunii BCR este importantă pentru transformarea oncogenetică. Alte domenii importante ale porțiunii ABL sunt proteinele de interacțiune SRC homology 2(SH2) și domeniile C –terminale legate de actină.

Proteina P210 conține elementele necesare pentru activarea directă a componentelor funcționale ale căilor de semnalizare: proteine adaptoare, enzime și factori de transcripție, în plusâfosforilează sau reglează proteine componente ale scheletului celular și proteine reglatoare ale apoptozei. Prin aceste proprietăți, P210 se substituie etapei de inițiere a semnalelor care implică în celule normale asocierea citokinelor cu receptorii. Se pare ca, această substituție funcțională nu este perfectă, întrucât s-a demonstrat asocierea proteinei BCR/ABL cu lanțul lambda-c al receptorului IL3.

Segmentul intracitoplasmatic al lambda-c funcționează ca transductor de semnale.

Domeniile structurale ale proteinei BCR/ABL au o contribuție nuanțată în inducerea transformării celulelor mutante:

1) domeniul de oligomerizare NH2 terminal este necesar pentru fosforilarea secvenței TK și pentru autofosforilare; -autofosforilarea implică o autoactivare a la longue independentă de stimularea prin citokine și totodată fosforilarea tir, care devine situl de recrutare a Grb2, în esență BCR/ABL se comportă ca o tirozinkinază nonreceptor

2) domeniul SH3 ( care în proteina nativă c-ABL inhibă activitatea TK) este inhibat în proteina de fuziune, fie printr-o autoinhibiție legată de o rearanjare conformațională după fuzionarea ABL cu BCR, fie ca urmare a formării homodimerilor BCR/ABL;

3)domeniul SH2 este necesar pentru transformarea tumorală prin BCR/ABL în diverse modele experimentale in vivo. Activarea myc indusă de BCR/ABL este dependentă de domeniul SH2. Semnalul ar fi transmis prin intermediul ras/raf și al factorilor de transcripție care activează promoterul oncogenei c-myc ;

4)domeniul TK (SH1) este esențial pentru inducerea transformării maligne. Situl enzimatic este integrat într-o bucla de activare. Activarea Tk produce printre altele autofosforilarea unor Tir din componența buclei. În P210 autofosforilarea Tir este esențială pentru stabilizarea buclei în conformație activă întrucât mutația sa compromite efectul transformator al BCR/ABL;

5) domeniul de prindere la actină mediază localizarea proteinei BCR/ABL la nivelul membranei celulare. BCR/ABL induce creșterea numerică a moleculelor de F-actină, anomalii în organizarea scheletului celular și în expresia receptorilor pentru integrine. Asocierea BCR/ABL cu F-actină induce tirozinfosforilarea proteinelor citoscheletale și a unor molecule de adeziune focală (paxilina, tensina, vinculina, talina, FAK-“focal adhesion kinase”,cas-“Crk associated substrate ,Hef 1) care se asociază în complexe multimerice. Legarea acestor complexe multimoleculare cu proteina BCR/ABL se produce prin intermediul paxilinei și al unei proteine adaptoare denumită Crkl. Legarea Crkl de proteina BCR/ABL este atât directă -la secvențele bogate în prolină ale acesteia, cât și indirectă, prin intermediul altei proteine, CBL care se fixează pe domeniul SH2 al BCR/ABL și pe Grb2 atașată de Tir. Crkl este un substrat de importanță majoră al proteinei BCR/ABL întrucât creează legături funcționale și susține activarea altor adaptori (Shc, SOS, Grb2) sau enzyme (PI-3K)cu funcții în transducția semnalelor, sau atașează proteinele CAS și HEF 1, implicate în funcția receptorilor pentru integrine. Crkl joacă deci rolul central în orchestrarea semnalelor intracelulare induse de BCR/ABL și în recrutarea acesteia la scheletul celular.

Trei mecanisme majore ar fi implicate în transformarea malignă indusă de proteina BCR/ABL: activarea semnalelor de proliferare, reducerea adeziunii celulelor progenitoare mutante la stroma și la matricea extracelulară și deprimarea apoptozei.

Proteina BCR/ABL este capabilă să activeze direct proteine care mijlocesc conectarea sa cu căile de semnalizare Ras și PI-3K 1)Shc si Grb 2 care inițiază calea ras-MAPK și calea PI-3K prin complexa Shc/PI-3k,2) Crkl care formează complexele multimerice cu proteinele BCR/ABL, Cbl și Grb2 prin care se deschide calea SOS-Ras_MAPK, 3)PI-3K activata direct (în complexele cu Crkl-BCR/ABL) conectată cu Ras în amonte și Akt în aval,4) proteina 14-3-3 care interacționează cu Raf.

De asemenea, proteina BCR/ABL poate activa direct ( eludând etapa jak) și proteinele STAT 1 și 5 prin intermediul domeniilor sale SH2 și SH3. Activarea STAT 5 ar contribui la transformarea maligna în experimente cu unele linii celulare. Efectele acestor activări in vivo sunt greu de disecat, întrucât majoritatea observațiilor au fost făcute pe celule transfectate cu proteine BCR/ABL mutante la care s-a indus deficiența unor segmente constitutive. Se acceptă însă ideea conform căreia BCR/ABL activează mai multe căi prin intermediul proteinelor Ras, STAT și Akt pentru a genera semnale multidirecționale ce stimulează continuu proliferarea și supraviețuirea. Unul dintre acesti stimulatori ar putea fi c-Myc care este produsă în cantitate mare în celulele BCR/ABL pozitive. Activarea Myc este dependentă de domeniul SH2 al BCR/ABL. În experimente cu celule normale, Myc poate elibera semnale de proliferare sau semnale proapoptotice, în funcție de condțiile create. În leucemia mieloidă cronică semnalele apoptotice sunt însa neutralizate cel mai probabil prin intermediul caii PI-3K.

Apoptoza ( moartea programata a celulelor ) este un proces fiziologic care operează în faza G1 a ciclului celular când în funcție de stimuli ambientali, celulele optează pentru trecerea în faza S, sau pentru moarte. Sistemul este reglat de proteinele familiei BCL2 Bcl-xL și din promotoarele apoptozei (Bax,Bak,Bik Bad). Unele proteine ale familiei (Bcl2,Bcl-xL,Bax,Bad ) sunt localizate pe membrana mitocondrială .Celulele BCR/ABL pozitive sunt mai rezistente la apoptoza decât cele normale. Sunt discutate mai multe posibilități;1) activarea Bcl 2 prin intermediul căilor Ras și IP-3K/Akt; 2)stimularea transcripției Bcl-xL de către STAT 5, posibil prin intermediul Crkl care poate funcționa ca un adaptor pentru STAT5; 3)fosforilarea Bad indusă de Akt si Raf; 4) blocarea eliberării citocromului C din mitocondrii. De asemenea, alt mecanism antiapoptotic ar fi inhibiția unei proteine de legare a IFN , ICSBP( interferon consensus secquence binding protein).

Aderența celulelor progenitoare din LMC la structurile stromei medulare este mult diminuată. Aceasta explică descărcarea în sângele periferic a precursorilor granulocitari. Celulele hematopoietice normale exprimă receptori din familiile integrinelor și selectinele (E -selectina sau ELAM 1) care se cuplează cu moleculele adeziotrope expuse pe celule ale stromei (VCAM 1,ICAM 2), sau constituiente ale matricei extracelulare (fibronectina,trombospondina ,vitronectina,laminina ,colagenul). Aceste legături slăbesc progresiv în cursul maturării celulelor normale, ceea ce permite desprinderea acestora și diabaza. Contactul celulelor primitive cu elementele adeziotrope stromale influențează semnificativ unele funcții celulare, cum ar fi proliferarea, transducția semnalelor și organizarea scheletului celular. În culturi de lungă durată s-a observat inhibarea proliferării progenitorilor normali, sub influența productelor stromale. Mecanismul ar fi mediat de interacțiunea dintre receptorii integrinei și fibronectina. Dupa stimulare, receptorii integrinici se aglomerează în mănunchiuri și formează complexe multimoleculare cu elemente citoscheletale, iar PI-3K ar fi implicată în rearanjarea actinei și în formarea complexelor citate. Interacțiunea receptorului integrinic influentează atât legarea sa cu liganzii externi cât și transmiterea unor semnale în celule.

Celulele leucemice prezintă defecte în expresia pe suprafață a moleculelor de integrine și selectine, iar aderarea lor la fibronectină, laminină și colagen (tipul IV) este diminuată. Ele exprimă o variantă moleculară a lanțurilor 1 de integrină care inhibă parțial adeziunea lor la stromă și prezintă o mobilitate crescută pe fibronectină. Defectul cuplării integrină-fibronectină poate fi corectat experimental prin inhibiția exprimării genei BCR/ABL cu ajutorul oligonucleotidelor antisens, ceea ce demonstrează legătura între defectul genetic și cel al adeziunii. Proteina P 210 se atașează de membrana celulară prin intermediul legăturii sale cu actina și induce: defect de grupare a recptorului integrinic, deficiența formării complexelor receptorului cu proteinele citoscheletului, polimerizarea defectuoasă a actinei și afectarea transferului semnalelor de reglare a proliferarii. Există relații între proteina P210 și Crkl. Se pare că Crkl influențează o rețea de influențe prin care proteina BCR/ABL ar altera funcțional receptorii integrinici. Crkl induce fosforilarea directă a unui număr mare de proteine: paxilina, talina, vinculina, FAK, Cas, Hef 1 și Cbl. Shc activată de Cbl produce împreună cu FAK fosforilarea PI-3K, care la rândul său activează proteina Rac implicată în reglarea interacțiunilor dintre scheletul celular și integrine, și în generarea anomaliilor motilității celulelor BCR/ABL+. Aceste anomalii pot fi anihilate de către interferonul. (Maria Perez Caro și colab, 2006).

Mecanismele de transformare celulară induse de BCR_ABL pot fi grupate în :

1) Dereglarea activității tirozinkinazice a proteinei ABL

2) Acțiunea pe căile de transmitere intracelulară

Dereglarea activității tirozinkinazice a ABL

Proteina himerică BCR-ABL are o activitate tirozin-kinazică mai mare fața de a proteinei p145 ABL. Diverse zone ale proteinei himerice sunt esențiale pentru transformarea celulară. În ABL acestea implică domeniul SH1, SH2 și domeniul de legare al actinei. În BCR sunt importante domeniul coiledcoil de oligomerizare care conține aminoacizii 1-63, tirozina în poziția 177 și secvențele bogate de fosfoserina-treonina între aminoacizii 192-242 și 298-413. Formele cărora le lipsește situsul tirozinkinazic, sau care au mutații în domeniul SH1 de autofosforilare a părții ABL, nu au potențial transformator.

Kinaza ABL este strict reglată în condiții fiziologice, fie de mecanisme care acționează în poziție cis, fie de mecanisme care acționează în poziție trans. Domeniul SH3 are un rol cheie în procesul de inhibiție, deoarece deleția sa, sau orice alterare pozițională activează kinaza.

In vivo există diverse proteine care leagă ABL. ABL-1 și ABL-2 (proteinele de interacție ABL) activează funcția inhibitorie a domeniului SH3.

Un alt inhibitor al ABL este Pag/Msp23 care în urma expunerii celulelor la stres oxidativ ca radiații, este oxidat și se disociază de ABL.

În alternativ, domeniul SH3 poate lega intern regiunea bogată în prolină a centrului proteinei ABL determinând o modificare conformațională, care inhiba interacțiunea cu substratele. Fuziunea secvenței 5 a BCR cu domeniul SH3 al ABL elimină funcția fiziologică inhibitorie.

Anumite studii au demonstrat că secvențe ale genei BCR sunt esențiale pentru autofosforilarea in vivo a P210 și pentru a-i conferi o capacitate transformantă. Se presupune că este implicată o interacțiune directă între secvențe de aminoacizi codificate de primul exon al BCR și domeniul reglator tirozin-kinazic SH2 al ABL. Secvența BCR poate substitui din punct de vedere funcțional miristilarea și sau deleția domeniului SH3 în activarea oncogenei ABL.

Regiunile cele mai importante sunt cele care cuprind aminoacizii 1-63 și amoniacizii 176-242.

Prima regiune are o structură de elice care determină formarea unui complex tetramolecular în proteina nativă. În proteina hibridă p210, partea care aparține c-ABL, care are o structură monomerică suferă un proces de tetramerizare, tocmai în această regiune cu fosforilări consecutive intermoleculare ale reziduurilor tirozin-kinazice.

Aceasta oligomerizare crește activitatea legăturii dintre ABL și proteina F-actinică conferindu-i lui p210 posibilitatea să interacționeze cu proteinele care, la rândul lor leagă moleculele de adeziune având funcția de a transmite semnalele de inhibiție a creșterii și diferențierii.

A doua regiune aminoacidică a primului exon BCR, se leagă cu mare afinitate de domeniul SH” al c-ABL crescând eficiența de interacțiune cu regiunile tirozin-fosforilate.

Substratele BCR-ABL pot fi regrupate în funcție de rolul lor fiziologic în adaptorii moleculari ca Crkl și p62, care sunt proteine implicate în organizarea citoscheletului și a menmbranei celulare ca paxilina, talina și proteine cu funcție catalitică ca Fas.

Alegerea substratelor depinde de contextul celular –de exemplu Crkl este proteina fosforilată de neutrofile, în timp ce p62 este fosforilată mai ales în celulele progenitoare.

Se presupune că, BCR-ABL poate avea un rol în instabilitatea genomică și transformarea leucemieie mieloide cronice în criza blastică.

Cu timpul, clona leucemică îsi pierde capacitatea de diferențiere și apar anomalii cromozomale secundare, care duc inevitabil la criza blastică.

Există trei mecanisme importante care sunt implicate în transformarea malignă și în partea BCR-ABL

alterarea adeziunii la celulele stromale și la matricea extracelulară

activarea semnalului mitogen

inhibarea apoptozei

Împreună, aceste procese duc la alterarea maturării celulare, care caracterizează leucemia mieloida cronică.

În leucemia mieloidă cronică, celulele progenitoare au o adeziune diminuată a celulelor la stroma medulara și la matricea extracelulară.

A fost evidențiată în mod paticular o adeziune diminuată între celulele care au p210 și fibronectină, care reprezintă una dintre cele mai importante molecule ale microambientului medular.

Adeziunea la stroma medulară este în general reglată în contratimp cu proliferarea celulară, dar celulele leucemice se sustrag acestui mecanism de reglare în virtutea alterării proprietăților lor adezive. În interacțiunea dintre stromă și celulele progenitoare, un rol important îl au integrinele .

În leucemia mieloidă cronică, celulele exprimă o variantă a integrinei 1, care este inhibitoare a adeziunii, ce nu este prezentă în celulele normale.

Integrinele legându-se de receptorii lor, sunt în gradul de a induce semnalul normal de transducție din exteriorul în interiorul celulei. Se poate deci presupune, că transferul semnalului care inhibă proliferarea în leucemia mieloidă cronică este împiedicat.

P 210 fosforilează diverse proteine implicate în mecanismele de adeziune celulară printre care paxilina ,FAK și Crkl provocând o alterare a activității lor. Modificările proprietăților de adeziune celulara în celula Ph + se exprimă prin eliberarea în circulație a precursorilor hematopoietici cu infiltrarea organelor nonhematopoietice ca splina și cu pierderea inhibiției de contact.

Tratamentul cu Interferon sau cu inhibitori specifici ai funcției tirozin-kinazice (imatinib) a p210 determină revenirea la un comportament adeziv normal din partea celulelor Ph+ și o reducere a mobilitatii cu regăsirea capacității de legare cu integrinele.

Ras si cascada MAP/kinazelor

Au fost evidențiate diverse legături între BCR-ABL și Ras. Mecanismul de activare a Ras este mediat de proteine adaptatoare ca Grb-2 și SHC. Autofosforilarea Tyr177 furnizează un loc de ancorare pentru adaptorul molecular Grb-2, care apoi fiind legat de proteina Sos stabilizează Ras în forma sa activă care leagă GTPul.

De asemenea, alți doi adaptori moleculari ca SHC și Crkl pot să activeze Ras, ambii find substrate ale proteinei BCR-ABL și o pot lega cu domeniile SH2(SHC) și SH3(Crkl). Dovada că activarea Ras este importanta pentru patogeneza leucemiei granolocitare cronice deriva din observația ca în leucemia mieloidă cronică mutațiile Ras sunt absente chiar și în faza blastică a bolii, spre deosebire de alte tumori în care această mutație este mai frecvent întalnită. Aceasta înseamnă că, calea Ras este constitutiv activă și nu există mutații ulterioare.

Stimularea receptorilor de citokine ca Interleukina 3 (IL-3) determină activarea Ras și la recrutarea serin-treonin kinazei Raf, pe membrana celulară.

Raf induce cascada de semnale prin intermediul serin-treonin kinazelor Mek1/Mek2 și Erk, care în final duc la activarea transcriptiei genice.

Semnalul Ras poate fi transmis pe calea Rac care este un factor de schimb al GDP-ului cu GTP-ul și a Gckr (germinal center kinase related) și in final Jnk/Sapk.

Este posibil ca BCR-ABL să utilizeze căi ale factorilor de creștere în mod direct. S-a observat asocierea cu subunitatea c a receptorului interleukinei 3 cu receptorul c-kit. (Gustafsson B și colab., 2005)

Calea Jak-Stat

În celulele BCR-ABL pozitive există o fosforilare constitutivă a factorilor de transcripție Stat (Stat 1 si Stat 5) și în mod deosebit activarea Stat 5 pare să contribuie la transformarea malignă. Se știe că, funcția fiziologică a Stat5 este pleiotropică și efectul său pe celulele transformate este în principal antiapoptotic și implică activarea trascripțională a Bcl-Xl.

În mod normal, în urma stimulilor fiziologici, kinazele Janus fosforilează factorii transcripționali STAT, activându-i. Proteina BCR-ABL poate activa Stat1 și Stat5 fără o fosforilare precedentă.

Pentru a explica rolul jucat de căile Ras și Jak-Stat în răspunsul celular e importantă observația că, BCR-ABL este capabilă să facă independente liniile celulare, care sunt dependente de factorii de creștere. În timpul fazei cronice a leucemiei mieloide cronice, celulele progenitoare sunt dependente pentru supraviețuirea lor și proliferarea lor de factorii de creștere externi în mica măsura față de celulele normale. (Alister C.W., 2000).

Calea fosfoinozitol-3-kinazei(PI 3 -kinaza)

Activitatea PI 3 kinazei este cerută de proliferarea celulelor BCR-ABL pozitive. PI13 kinazele fosforilează fosfatidilinozitolul (PI) în poziția D3 in vivo și produce în principal PI-(3,4)-bifosfat și PI-(3,4,5)-trifosfat care pot să funcționeze ca mesageri secundari. PI3K este implicată în reglarea funcțională a proteinei Akt (supraviețuire și creștere), Rac (motilitate și supraviețuire), S6K (sinteza proteică).

PI3K poate de asemenea să fie reglată de Ras și poate să regleze ea însăsi funcția Ras. Proteina BCR/ABL formează complexe multimerice cu PI3-kinaze și cu moleculele adaptatoare Crk și Crkl care o activează.

Succesiv, substratul activat în această cascadă este serin-treonin kinaza Akt implicată în semnalul antiapoptotic. Proteina proapoptotică Bad este substratul cheie al Akt.

Când Bad este fosforilată și inactivă nu este capabilă să lege proteine apoptotice.

BCR-ABL este capabilă să fosforileze activând două tipuri de inozitolfosfataza, Ship1 și Ship2, care sunt fiziologic activate în răspunsul la factorii de creștere.

Se pare că acțiunea principală a proteinei Ship nu este aceea de a pune în strictă relație acțiunea fosfatazică care ar fi constituțional activată când interactionând prin intermediul domeniului SH2 și prin regiunea bogată în prolină cu alte proteine de semnal ca SHC, SHP2 și Grb-2 care ar duce la efectul final antitumoral. (John C. Byrd și colab., 2014)

Calea MYC

Gena Myc este supraexprimată în multe tipuri de tumori umane, codifică pentru o proteină de 439 kda, localizată mai ales în nucleu.

MYC este un factor transcripțional care poate lega ADN-ul prin intermediul domeniului sau “leucin zipper” și motivul “elice –loop-elice”.

Aceasta proteină poate regla expresia genelor țintă, legându-se de secvențe de ADN dupa dimerizare cu o altă proteină, ca MAX.

Complexul MYC/MAX activează și promovează proliferarea și transformarea celulei.

Activarea MYC din partea BCR-ABL nu este încă bine cunoscută și depinde de domeniul SH2.

Rezultatele obținute din studiul celulelor transformate cu v-ABL sugerează că semnalul este transmis prin intermediul kinazei ciclice dependente (cdks) ca Ras/Raf și factori de trasncripție ca e2F care activează promotorul MYC.

Mutațiile în domeniul SH2 și în regiunea de legatură cu Grb-2, domenii implicate în activarea c-MYC determină o pierdere a potențialului transformant al p210 care poate fi restabilit prin intermediul unei expresii crescute a c-Myc. (Linsey Reavy și colab., 2013).

Inhibarea apoptozei

Expresia BCR-ABL determină apoptoza în relație directă cu activitatea tirozin-kinazica și prin intermediul activării Ras.

Mai multe studii au evidențiat că celulele Ph+ sunt rezistente la apoptoza indusă de leziunile ADN-ului.

Mecanismele biologice ale acestui efect nu sunt încă bine știute. BCR-ABL poate bloca eliberarea citocromului C din mitocondrii și deci să impiedice activarea caspazelor Aceasta ar putea fi mediată de proteinele din familia Bcl2 în dependență Ras sau PI3K.

O altă legatură între inhibiția apoptozei și BCR-ABL ar putea fi fosforilarea proteinei proapototice bad.

Bad are funcție antiapoptotică și determină moartea celulara. Semnalele de supraviețiuire mediate de citokine ca IL-3, NGF(nerve growth factor) sau IGF (insului-like growth factor) determină fosforilarea Bad în două reziduri (Ser112 si Ser136) prin intermediul unei căi dependente de PI3K/Akt. Consecința fosforilării și inhibiției legăturii Bcl-XI este sechestrul în citoplasma.

E posibil ca BCR-ABL să inhibe apoptoza prin intermediul subreglării proteinei legate de secvența consens a interferonului (ICSBP).

CONCLUZII

În această lucrare s-a aratat că majoritatea cazurilor prezintă aspectul normal clasic al semnalelor de FISH-1R1V2F, corespunzând unui cromozom Philadelphia tipic.

Utilitatea analizei folosind tehnica FISH în diagnostic a fost de asemenea pusă în evidență în foarte multe studii de specialitate.

Într-un număr mic de cazuri( 7 din 20), rezultatele obținute în urma aplicării tehnicii FISH, au prezentat aspecte atipice ale semnalelor. Cu toate acestea, diagnosticul doar prin tehnica FISH când întâlnim și aceste anomalii citogenetice adiționale, s-ar putea face eronat fără citogenetica clasică.

Rezultatele obținute au arătat că prin tehnica FISH se pot diagnostica corect majoritatea cazurilor cu leucemie mieloidă cronică ce prezintă cromozom Philadelphia. În cazuri rare interpretarea exactă a semnalelor necesită și aplicarea sondelor pe metafaze și chiar examinarea metafazelor prin citogenetică clasică. Achiziția de anomalii citogenetice adiționale detectate prin tehnica FISH ( observarea semnalelor atipice Ph pozitive), pot avea implicații severe asupra diagnosticului și a prognosticului pacienților cu LMC.

BIBLIOGRAFIE

Assouline S. și J.H. Lipton, 2011, Monitoring response and resistance to treatment in Chronic Myeloid Leukemia, Current Oncology, Vol.18, nr 2, e71-e83

Byrd C. John, Jones J. Jeffrey, Woyach A.Jennifer, Johnson J.Amy și Flynn M. Joseph, 2014, Entering the Era of Targeted Therapy for Chronic Lymphocytic Leukemia: Impact on the Practicing Clinician, Journal of Clinical Oncology, Volumul 32, Numarul 27, 3039-3047

Campbell J. Lynda, 2011, Chronic Myeloid Leukemia: Cytogenetic Methods and Applications for Diagnosis and Treatment, Cancer Cytogenetics, Humana Press, Editia a 2-a, Capitolul 4, 38-40

Caro Perez Maria și Sanchez- Garcia Isidro, 2007, BCR-ABL and human Cancer, Humana Press Inc., Volumul 1, 1-31

Cortes Jorge și Deininger Michael, 2007, Allogeneic Hematopoietic Stemm Cell Transplantation for Chronic Myelogeneous Leukemia; Molecular targets Other Than BCR-ABL: How to incorporate them into the CML Therapy?, Myeloid Leukemia, Informa, Capitolul 2, 11-16; Capitolul 9, 106-11

Crews A. Leslie și Catriona H. M. Jamieson, 2012, Chronic Myeloid Lekemia Stem Cell Biology, Current Hematologic Malignancy Reports Springer, 7, 125-132

Di Bacco Alessandra, Keeshan Karen, Mc.Kenna Sharon și Cotter . Thomas,2000, Molecular Abnormalities in Chronic Myeloid Leukemia: Deregulation of Cell Growth and Apoptosis, The Oncologist, 5, 405-415

Dingli David, Traulsen Arne, Lenaerts Tom și Pacheco M. Jorge, 2010, Evolutionary Dynamics of Chronic Myeloid Leukemia, Genes and Cancer, I(4), 309-315

Geary C.G., 2000, The story of Chronic Myeloid Leukemia, British Journal of Haematology, 110, 2-11

Hantschel Oliver și Superti Furga Giulio, 2004, Regulation of the C-ABL and BCR-ABL Tyrosine Kinase, Nature, Volumul 5, 33-44

Kantarjian M., Hagop Obrien Susan, Cortes E. Jorge, Smith L.Terry, Rios Mary Beth, Jianqin Shan, Ying Yang, Giles J. Francis, Thomas A. Deborah, Faderl Stefan, Garcia Manero Guillermo, Sima Jeha, Wierda William, Pierre J. Jean Issa, Kornblau M.Steven, Keating Michael, Debra Resta, Capdeville Renaud și Talpaz Moshe, 2002, Treatment of Philadelphia Chromosome-positive, Accelerated phase Chronic Myelogenous Leukemia with Imatinib Mesylate, Clinical Cancer Research, Vol 8, 2176-2176

Keagle S.L.Gersen, 2005, The Principles of Clinical Cytogenetics, second Edition, Humana Press Inc. Towa, New Jersey

Lodish Harvey, Berk Arnold, Zipursky S. Lawrence, Matsudaira Paul, Baltimore David și Darnell James, 2007, Cancer, Molecular Cell Biology, Media Connected, Editia a 5-a, 944-960

Marica M., 2007, Oncologie generală, Editura UMF Iași, p. 90-123

Nicolini Franck Emmanuel, Basak W.Grzergov, Soverini Simona, Martinelli Giovanni, Mauro J. Michael, Muller C. Martin, Hochhaus Andreas, Chuan Charles, Dufva H.Inge, Rege- Cambrin Giovanna, Saglio Giuseppe, Michallet Mauricette, Labussiere Helene, Morisset Stephane, Hayette Sandrine, Etienne Gabriel, Olavarria Eduardo, Wei Zhou, Senaka Peter, Apperly F.Jane și Jorge Cortes, 2011, Allogenic stem cell transplantation for pacients harboring T3151 BCR-ABL mutated leukemias, BLOOD, Vol.118, Number 20, 5697-5700

Rana Aamir, Hussain Sabir Shah, Rehman Nazia, Shaukat Ali, Ghulam Muhammad Ali, Shahzad Bhatti și Ammad Farooqi, 2011, Chronic myeloid Leukemia: Attributes of break point cluster region-abelson (BCR-ABL), Journal of Cancer Research and Experimental Oncology, vol.3, 62-66

Radivoyevitch Tomas, Jankovic M. Gradimir, Tiu V. Ramon, Sauthararajah Yogen, Jackson C. Robert, Hlatky R. Lynn, Gale Peter Robert și Sachs K. Rainer, 2014, sex differences in the incidence of chronic myeloid leukemia, Nature, 53(1), 55-63

Reavie Linsey, Buckley M.Shannon, Loizou Evangelia, Takeishi Shoichiro, Aranda orgilles Beatriz, Ndiaye Lobry Delphine, Abdel Wahab Omar, Ibrahim Sherif, Nakamaya I. Keiichi și Iannis Aifantis, 2013, Regulation of c-Myc Ubiquitination Controls Chronic Myelogeneous Leukemia Initiation and Progression, Cancer Cell, 23, 362-373

Talpaz M., Hehlmann R., Quintas- Cardama A., Mercer J. și Cortes Jorge, 2013, Re-emergence of interferon-a in the treatment of chronic myeloid leukemia, Leukemia, 27, 803-812

Vargas L., Hamasy A., Nore B.F. și I.E Smith, 2013, Inhibitors of BTK and ITK: State of the New Drugs for Cancer, autoimmunity and Inflammatory Diseases, John Wiley and Sons Ltd, 131-139

Vicente-Duenas Carolina, Romero-Camarero Isabel, Cobaleda Cesar și Sanchez-Garcia Isidro, 2013, Function of Oncogenes in cancer development: a changing paradigm, The EMBO Journal, 32, 1502-1513

Vogelstein B. și Kinzler K.W., 1996, The genetic base of Human Cancer, McGraw Hill Professional ,241-242

Ward C. Alister , Touw Ivo și Akihiko Yoshimura, 2000, The Jak –Stat pathway in normal and perturbed hematopoiesis, Blood, Vol.95, 1-19

Yaoyu Chen și Shaogung Li, 2014, Omacetaxine mepesuccinate in the treatment of intracectable chronic myeloid leukemia, Dove press Journal :Onco Targets and Therapy, 177-186

http://www.cancerresearchuk.org/health-professional/cancer-statistics/statistics-by-cancer-type/leukaemia/incidence

http://www.cytocell.co.uk/products/aquarius/haematology-probes/BCR-ABL-probe.asp

https://en.wikipedia.org/wiki/Chromosomal_translocation

http://www.esmo.org/

http://www.epathology.ro/index.php