Coordonator științific: Student: Lector dr. Zaulet Mihaela Dombi Hajnalka Julianna 2018 Cuprins Cap 1. Introducere 5 Cap 2. Stadiile dezvoltării… [304701]

UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI

FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE DISERTAȚIE

Coordonator științific: Student: [anonimizat]

2018

Cuprins

Cap 1. Introducere 5

Cap 2. Stadiile dezvoltării preimplantationare ale embrionilor umani 6

2.1. Gameții 6

2.2. Fecundarea 6

2.3. Stadiul de zigot 7

2.4. Stadiul de clivare 7

2.5. Stadiul de morulă 8

2.6. Stadiul de blastocist 9

3. Fertilizarea „in vitro” Error! Bookmark not defined.

Cap. 3. Criocongelarea 11

3.1. Crioprotectanții 12

3.2. Congelarea controlată 12

3.2. Vitrificarea (Open Pulled Straw) 13

3.3. Păstrarea 13

3.5. Decongelarea 15

Cap 5. Material și metodă 16

5.1. Protocol congelare și decongelare controlată 16

5.3. Decongelarea embrionilor 21

5.4 Protocol de vitrificare 23

5.4.1 Prepararea mediilor de congelare și decongelare 23

5.4.2. Vitrificarea embrionilor 25

5.4.3. Decongelarea embrionilor vitrificați 29

5.5. Evaluarea embrionilor 32

5.6. Assisted hatching (AH) 32

5.7. Embriotransferul 33

5.8. Testul de sarcină 33

Capitolul: Rezultate 34

Capitlul: Discuții 36

Concluzii 39

Bibliografie: 40

Introducere

În urma fertilizării „in vitro” a [anonimizat]. Astfel a [anonimizat], [anonimizat] a afecta calitatea lor. Aceste tehnici au fost oferite de criobiologie și anume criocongelarea embrionilor…….SURSA.

[anonimizat], astfel încât azi protocoalele pot oferi o viabilitate de 100% a embrionilor după decongelare. Perioada de congelare este nelimitată. [anonimizat], fără a fi afectate în nici un fel. …….SURSA

Pentru a [anonimizat]. [anonimizat], altele împiedică formarea cristalelor de apă în citoplasma acestora. …….SURSA

În timp, o [anonimizat], [anonimizat]: [anonimizat].

Scopul lucrării este de a [anonimizat]: [anonimizat], [anonimizat] (crio-embrio-transfer).

Stadiile dezvoltării preimplantationare ale embrionilor umani

2.1. [anonimizat]. Aceste celule diferă în funcție de sexul individului. În cazul bărbaților se dezvoltă în testicule și se numesc spermatozoizi iar în cazul femeilor se dezvoltă în ovare și se numesc ovocite. …….SURSA

Spermatozoizii se formează în timpul procesului numit spermatogeneză. Spermatozoizi sunt celule germinale ale sexului masculin și se formează din spermatogonii. Spermatogoniile migrează printre celulele Sertoli spre lumenul tubilor seminiferi. [anonimizat]. [anonimizat], care la rândul lor se vor diviza în alte două spermatide. Spermatidele trec pritr-o serie de schimbări în urma cărora devin unul din cele mai specializate celule din corp spermatozoizi. …….SURSA

Ovocitele se formează în urma procesului numit ovogeneză. Ovocitul este gamet al sexului feminin și se formează din celulele germinale primordiale, care încă din viața intrauterină se diferențiază devenind ovogonii. Aceste ovogonii își încep diviziunea meiotică formând ovocitele de ordinul I. În acest stadiu, încă diploid, aceste ovocite rămân blocate până la pubertate. La pubertate, în urma acțiunii hormonilor, ovocitul primar, își continuă diviziunea și formează ovocitul secundar, expulzând primul globul polar. În această fază, este expulsat din ovar în timpul ovulației. Ovocitul secundar trece prin trompe unde își continuă diviziunea, iar dacă întâlnește un spermatozoid și este fecundat, va forma zigotul. …….SURSA

2.2. Fecundarea

Fecundarea este procesul prin care spermatozoidul gametul masculin se unește cu ovocitul gamet feminin și formează împreună o singură celulă comună numit zigot. …….SURSA

2.3. Stadiul de zigot

Zigotul (Fig. 2.1. Zigot) este prima celulă comună, formată din unirea gametului feminin cu cel masculin după fecundare; este prima faza de dezvoltare al embrionului.

La aproximativ 18 ore de la fecundare, devin vizibili pronucleii. Pronucleul este forma pe care o ia după fecundare nucleul spermatozoidului și al ovocitului înainte de a fuziona. Această celulă are 2n cromozomi, respectiv se pot observa cei doi globuli polar. …….SURSA

Fig.2.1.Zigot …….SURSA

2.4. Stadiul de clivare

Acest stadiu începe în momentul in care are loc prima diviziune mitotică la aproximativ 23-29 ore de la fecundare și durează până embrionul începe să se compactizeze. Celulele embrionului se numesc blatomeri și ajung la un număr de 8-10 celule la aproximativ 72 de ore de la fecundare. În ziua a parta de la fecundare, embrionul deja are peste 10 celule. Între aceste celule se formează niște joncțiuni care vor ajuta embrionul la compactizare (fig. 2.2). …….SURSA

Fig. 2.2. Embrion în ziua a treia…….SURSA

2.5. Stadiul de morulă

În ziua a parta de la fecundare, embrionul deja are peste 10 celule. Între aceste celule se formează niște joncțiuni care ajută embrionul la compactizare. După compactizare embrionul devine morulă. În stadiul de morulă, celulele embrionului nu sunt clar delimitate, nu se pot vedea unul cate unul, ca în etapele anterioare (fig. 2.3).

Fig. 2.3. Compactizarea embrionului în stadiul de morulă…….SURSA

2.6. Stadiul de blastocist

După compactizare, în ziua a cincea-șasea de dezvoltare, embrionul începe să se formeze o cavitate. Comcomintent cu formarea cavității, se diferențiază două tipuri de celule: celulele trofectodermului și ICM-ul (inner cell mass). În ziua a cincia de dezvoltare numărul celulelor embrionului ajunge la 60 urmând ca până în ziua a șasea sa și-l dubleze (fig. 2.4.).

Fig. 2.4. Blastociști…….SURSA

Fertilizarea „in vitro”

Fertilizarea „in vitro” este procesul prin care se obțin și se cultivă embrioni. Acest proces începe cu stimularea ovarelor pentru a obține un număr mai mare de ovcite. Înainte să aibă loc procesul natural de ovulație, ovocitele sunt recoltate prin puncție ovariană din foliculi. Lichidul seminal cu spermatozoizi este recoltat de cele mai multe ori din ejaculare antegradă în ziua pucției ovariene. …….SURSA

După recoltare a probelor biologice, acestea sunt pregătite pentru a putea fi utilizate. Ovocitele se incubeză de la două la patru ore după care se denudează. Denudarea este procesul prin care se îndepărtează celulele cumulare din jurul ovocitelor pentru a putea fi manipulate sub microscop. Spermatozoizii sunt separate prin centrifugare de lichidul semminal trecând prin mai multe medii cu gradiente diferite, tot cu această metodă se selectează spermatozoizii motili de cei imotili. …….SURSA

Când probele sunt pregatite are loc procesul de fertilizare „in vitro”. Acest proces are două forme: cea clasică care presupute punerea în același mediu de cultură ovocitele și spermatozoizii, acștia din urmă fecundând fără intervenția umană ovocitele, metoda se poate practica la pacienții ca căror infertilitate este de cauză femimină și metota ICSI adică injecția intracitoplasmatică a spermatozoizilor cu ajutorul unui micromanipulator, figura 3.1. acesta fiind utilizată în cazurile în care infertilitatea este de cauză masculină. …….SURSA

Figura 3.1. Micromanipulator alcătuit dintr-un microscop și un sistem de micromanipulare Narishige

Criocongelarea

Criocongelarea este procesul prin care o celulă, un țesut sau orice component biologic care se poate distruge în urma cinetici chimice neregulate este păstrat prin congelare la temperaturi foarte scăzute, de obicei -80˚C folosind gheață carbonică sau -196˚C utilizând azot lichid. La aceste temperaturi joase, toate procesele biologice se opresc. Diferitele metode de criocongelare au ca scop înghețarea probelor biologice, fără a distruge componenetele acestora în timpul procesului. …….SURSA

Riscurile criocongelării sunt multiple. Fenomenele care pot cauza deteriorarea probelor sunt formarea cristalelor de gheață în interiorul celulei și la suprafața acesteia, deshidratarea și dezechilibrul chimic care poate apărea în celulă. …….SURSA

Formarea cristalelor de gheață în citoplasmă sunt fatale celulelor, deoarece în timpul formării lor apa își mărește volumul rupând membranele acestora, fenomenul fiind în fiecare caz fatal celulei. …….SURSA

Dezechilibrul chimic este cauzat de formarea cristalelor de gheață în interiorul celulelor. Odată cu formarea cristalelor anumite soluții părăsesc citoplasma astfel apare dezechilibru chimic. …….SURSA

Apa care părăsește citoplasma formează cristale la exteriorul celulei. Gheața extracelulară poate distruge mecanic membrana celulară strivindu-l.

Apa care migrează în spațiul extracelular, odată cu părăsirea citoplasmei, poate cauza deshidratarea acesteia. …….SURSA

Pentru a evita sau a diminua toate aceste riscuri sau dezvoltat crioprotectanți și diferite tehnici de criocongelare, primul fiind criocongelarea controlată sau slow freezing și o tehnică mai recentă vitrificarea. …….SURSA

3.1. Crioprotectanții

Crioprotectanții sunt substanțe care protejează celulele de distrugerile din timpul congelării. Aceste substanțe sunt capabili să scadă punctul de înghețare a compușilor citoplasmatici și împiedică formarea cristalelor de gheață. Crioprotectanții comuni sunt: DMSO (Dimethyl Sulfoxid), etilen glicolul, glicerolul, propilen glicolul, sucroza, MPD (2-metil-2,4-pentanediol).

Dimetil sulfoxidul este un compus organosulfuric cu formula (CH3)2SO. Această substanță incoloră este un solvent aprotic (adică nu conține și nici nu poate dona ioni de H) polar care poate să se dizolve atât în compuși polari cât și nepolari. DMSO este un crioprotectant penetrant care adăugat la mediile ce congelare împiedică formatea cristalelor de gheață. Acesta poate penetra membranele celulare fără a distruge structura lor.

Etilen glicolul este un compus organic cu formula chimică (CH2OH)2. Această substanță penetrantă este vâscoasă, incoloră, fară miros cu un gust dulce. Acesta reduce semnificativ punctul de îngheț al apei.

Glicerolul este o substanță incoloră, cu gust dulce și inodor. Formula chimică este C3H8O3. Este folosit cu succes în criocongelarea celulelor și țesuturilor.

MPD (2-metil-2,4-pentanediol) este un compus organic incolor cu formula (CH3)2C(OH)CH2CH(OH)CH3. Această substanță se leagă de proteine eliminând apa astfel fiind imposibilă formarea cristalelor de gheță.

Sucroza este un carbohidrat comun, un dizaharid alcătuit din combinația unui monozaharid de glucoză și o fructoză având formula C12H22O11. Este un crioprotectant nepenetrant, adică nu pătrunde în interiorul celulei, avand rol în diminuarea socului osmotic în timpul congelării.

3.2. Congelarea controlată

Congelarea controlată sau „slow-freezing” este o metodă mai veche, care încearcă să controleze proprietățile biofizice de congelare cum ar fi rata de răcire și încălzire în combinație cu crioprotectanți cu scopul de a minimaliza efectele dăunătoare ale congelării. Congelarea controlată permite răcirea celulelor la o temperatură foarte scăzuta fara formarea cristalelelor de gheață, respectiv ajută la diminuarea socului osmotic, care are loc datorită crrioprotectanților care pătrund în celulă respectiv a apei și a diferitelor soluții care părăsesc celula. Această metodă folosește o cantitate mai mică de crioprotectanți decât vitrificarea.

3.2. Vitrificarea (Open Pulled Straw)

Vitrificarea este o metodă mai recentă de congelare a embrionilor care se bazează pe scăderea temperaturii foarte brusc folosind concentrații mari de crioprotectanți, astfel evitând formarea cristalelor de gheță. În acestă tehnică probele biologice, embionii, sunt deshidratate prin expunerea scurtă la o soluție concentrată cu crioprotectanți înainte de a fi scufundate direct în azot lichid.

3.3. Păstrarea

Păstrarea embrionilor se face în niște containere cu azot lichid. Containerele sunt în așa fel concepute incât să probele să poată fi localizate cu ușurință, astfel acestea conțin mai multe canistre (fig. 3.1) care, sunt împărțite în goblete colorate (fig.3.2) în care sunt așezate paietele marcate (fig.3.3) cu datele de indentificare a probelor.

Figura 3.1 Container

Figura 3.2. Canistră Figura 3.3. Goblete colorate

Figura 3.4. Paietă OPS (Open Pulled Straw)

3.5. Decongelarea

Decongelarea este procesul prin care embrionii congelați sunt scoase din containerele de depozitare urmând sa fie încalzite și asezate în medii speciale, cu scopul de a indepărta crioprotectanții fără distrugerea membranelor. Pentru a nu provoca lezarea sau distrugerea membranelor mediile de decongelare conțin diferite concentrații de sucroză care, reduce socul osmotic.

……..Materiale și metode

De la 3….sari la ….5 ???????

În timpul efectuării studiului, laboratorul de fertilizare „in vitro” în care s-au efectuat congelările respectiv decongelările embrionilor, metoda congelării controlate a fost o metodă folosită de mult timp însă vitrificarea era încă doar în procesul de învățare. Toți embrionii luați în studiu au fost fie în stadiul de clivare fie erau deja blastociști cu cavitatea formată și ICM vizibil.

5.1. Protocol congelare și decongelare controlată

Pentru metoda de congelare clasică a fost utilizată kit-ul Embryo Freezing Pack de la Origio Danemarca congelarea fiind realizat cu Cryologic CL8000 programmable freezer (Australia).

Kit-ul conține trei medii diferite, cu albumină serică umană și insulină umană recombinată respectiv crioprotectanți. Se păstrează la temperaturi între: 2-8˚C în loc ferit de lumină.

Mod de utilizare:

Înainte de utilizare cu două ore, cele trei medii trebuie preîncălzite la temperatura camerei adică 20˚C, figura 5.1.

Figura 5.1. Plăcuță 4 well cu mediile de congelare

Embrionii în stadiul de clivare se așează în mediul Vial 1 pentru 5 minute, aici începe procesul de congelare propriu-izsă, figura 5.2.

Figura 5.2. Embrionii sunt așezați în godeul 1, săgeata albastră indică locul lor

Embrionii se mută, apoi în godeul 2, unde se incubează timp de 10 minute la temperatura camerei. Figura 5.3

Înainte ca embrionii să fie mutați în ultimul mediu de congelare, paietele în care urmeză să fie congelați trebuiesc limpezite în Vial 3.

Figura 5.3. embrionii sunt mutați în mediulVial 2

Embrionii se mută din godeul 2 în 4 în ultimul mediu de congelare, în care va fi congelat. Se incubează 15 minute la temperatura camerei, figura 5.4.

Figura 5.4. Embrionii se transferă în godeu 4

Embrionii se introduc în paieta înpreuna cu mediul Vial 3 apoi se introduc în aparat și se răcesc lent conform următoarelor etape, figura 5.5.

De la pemperatura camerei la -7˚C, la fiecare minut scăzând temperatura cu două grade la fiecare minut.

Se menține paieta la -7˚C timp de 5 minute.

Se începe scăderea temperaturii de la -7˚C la -30˚C cu 0,3˚C la fiecare minut.

După ce se ajunge la -30˚C, se continuă răcirea la -190˚C scăzând 50˚C la fiecare minut.

După ce s-a ajuns la temperatura de -190˚C se scoate paieta din aparat și se introduce în azot lichid.

Figura 5.5. Grafic temperatură pentru congelarea embrionilor

Protocol congelare blastociști

Kit-ul de congelare a blastociștilos conține trei medii de congelare diferite: primul mediu conține soluție de diluare cu 12mg/ml de albumină serică umană notată cu M1 pe plăcuță, al doilea mediu, notat cu M2, conține 9% glicerol, 0,2M mediu de congelare cu sucroză și 12mg/ml albumină serică umană, al treilea mediu conține 5% glicerol și 12mg/ml de albumină serică umană și este notat cu M3 pe plăcuță. Săgeata albastră indică poziția embrionilor.

Mod de utilizare:

Se încălzesc mediile la temperatura de 37˚C, apoi se pune embrionul complet expandat în mediul cu soluția de diluare și cu albumină, timp de 5 minute, figura 5.6.

Figura 5.6. Prima etapă în congelarea blastociștilor

După blastociștii se transferă în al doilea mediu unde, se țin timp de 10 minute la 37˚C, figura 5.7.

Figura 5.6. Embrionii sunt mutați în al doilea mediu

Embrionii se transferă din al doilea în al treilea mediu de congelare, unde se țin încă 10 minute la 37˚C, figura 5.7. Paietele în care urmează să fie congelați embrionii, se umple parțial cu mediu de congelare M3.

Figura 5.7. Embrionii se mută din godeul doi în patru

Embrionii se introduc în paietă, după care se începe congelarea propriu-zosă. De la 37˚C se răcește la -6˚C scăzând temperatura cu 2˚C la fiecare minut.

La temperatura de -6˚C se face seeding-ul manual după care se păstrează încă 10-15 minute la -6˚C.

Se continuă răcirea până la -35˚C cu 0,3˚C pe minut., după care se stochează în azot lichid.

5.3. Decongelarea embrionilor

Kit-ul de decongelare conține trei sticluțe cu medii care conțin12mg/ml de albumină serică umană. Primul mediu conține mediul de decongelare cu 0,5M sucroză, al doilea mediu coține 0,2M sucroză, iar al treilea este un mediu de decongelare care conține diluent, are ca scop spălarea embrionilor de crioprotectanți figura 5.8.

Figura 5.8. Kit de decongelare embrioni

Protocol de decongelare:

Embrionii congelați cu congelare clasică se decongelează cu rapid crescând temperatura cu o viteză de cel puțin 275˚C/minut. Pentru a face acest lucru este nevoie să ținem paieta cu embrionii 30-40 de secunde la temperatura camerei, după care se așează într-o baie marină la 30-35˚C până când gheața se topește complet.

Lichidul din paietă se golește într-o plăcuță apoi, embrionii trebuiesc localizați cât mai repede și se transferă în de mediu cu 0,5M sucroză la o temperatură de 37˚C timp unde se mențin 5 minute, figura 5.9.

Figura 5.9. Transferul embrionilor în perimul mediu de decongelare. Picătura albatră închisă este mediul de congelare, iar cel deschis este mediul de decongelare.

După acestă etapă embrionii se transferă în mediul cu sucroză 0,2M menținând temperatura de 37˚C, unde se țin 10 minute figura 5.10.

Figura 5.10. Embrionii se transferă în mediul cu sucroză 0,2M

Ultima etapă a decongelării constă în spălarea embrionilor în 7 picuri a câte 100µl fiecare în mediul de diluare/spălare a acestora, pipetându-i sus apoi jos în fiacare picur timp de 1 minut la 37˚C figura 5.11.

Figura 5.11. Picăturile albe reprezintă soluția de spălare a embrionilor.

După spălare embrionii se incubează minim 30 de minute în mediul de embriotransfer, abia după se poate efectua embriotransferul.

Protocol de vitrificare

Prepararea mediilor de congelare și decongelare

Sunt cinci feluri de medii care se prepară în laborator cu scopul de a congela și decongela embrioni. Indiferent de stadiul de dezvoltare al embrionilor, clivare sau blastocist, sunt utilizare aceleași medii, atăt la congelare căt și la decongelare. Atât durata de congelare cât și cea de decongelare este redusă, sub 30 de minute Acestea sunt ușor de preparat, nu necesită dispozitive sau aparate speciale. Ingredientele sunt usor și ieftin de achiziționat. Componentele necesare sunt: mediu TCM 199 încărcat cu Hepes, supliment proteic HSA (Human Serum Albumin), Etilen glicol și DMSO dimetilsulfoxid.

Paietele in care se stochează embrionii sunt special concepute pentru aceste tipuri de congelare și se numesc OPS (open pulled straw). Spre deosebire de alte paiete care sunt alcătuite din paietă și marcaj/dop, aceste paiete sunt compuse dintr-o paietă scurtă, subțire în care sunt absorbiți embrionii și una mai lungă mai groasă cu rol de protecție în care este introdusă paieta mică, figura 5.12.

Figura 5.12. Paietă OPS cu cele două componente: cu A este marcat paieta mare, iar cu B este notat paieta scurtă în care se vor afla embrionii.

Mediul de bază notat MB se prepară din mediu TCM 199 încărcat cu Hepes îmbogățit cu 20% HSA.

Primul mediu de vitrificare notat cu VM1 se prepară din: mediu de bază la care se adaugă 7,5% etilen glicol și 7,5% DMSO.

Al doilea mediu de vitrificare notat cu VM2 se prepară din MB în care se diluează sucroză 1M, pocentual este egal cu 68%, la care se adaugă 16% etilen glicol, 16% DMSO.

Primul mediu de decongelare este notat cu Sucroză 1M, și se prepară din mediu de bază cu o concentrație de 1M sucroză.

Al doilea mediu de decongelare este notat cu Sucroza 0,5M, și se prepară din mediu de bază cu o concentrație de 0,5M sucroză.

După prepararea mediilor, acestea se iau una căte una și se filtrează cu un filtru cu pori de 0,1 µm, după care se alicotează în niște tuburi speciale numite cryotburi. Pe fiecare cryotub se trece obligatoriu mediul pe care-l conține și data în care a fost preparat. Valbilitatea mediilor este de trei săptămâni de la data preparării. Mediile se păstrează la temperatura de 4˚C.

5.4.2. Vitrificarea embrionilor

În cazul blastociștilor, înainte de vitrificare se poate face colaps, adică că se decupeze o parte din zona pelucidă cu laserul și să se rupă legăturile dinte două celule unde livhidul din cavitate să se poată evacua lent astfel ușurănd procesul de congelare și szăzând riscul de formare a cristalelor de gheață, figura 5.14.

Figura 5.14. Blastocist înainte si după colaps.

Înainte de congelare mediile se preîncălzesc la 25˚C, temperatură la care are loc întregul proces de congelare. Când mediile au atins temperatura optimă, se pregătește plăcuța astfel: într-o placă Petri de 90 mm diametru se face o picătură de 50 µl din MB și două picături de 50 µl de mediu VM1. În partea cealaltă a plăcuței se face o picătură de 100 µl din mediul VM1. Sub aceste picături se fac două picături a câte 100 µl din mediul VM2, figura 5.12.

Figura 5.12. Plăcută pentru vitrificare

Se așează embrionii în mediul de bază după care se unesc cele două picături și se lasă embrionii în acest mediu timp de trei minute figura 5.13.

Figura 5.13. Unirea primelor două picături

Se localizează embrionii, care din cauza concentrațiilor diferite ale celor două medii au fost împinși spre marginea din stânga a picăturilor, și se aduc la mijlocul picăturilor, apoi se unesc cele trei picături. Se lasă embrionii în acest mediu timp de trei minute, figura 5.14.

Figura 5.14. Unirea celor trei picuri

Se localizează embrionii care, datorită concentrațiilor diferite, au fost înpinși în extremitatea de sus a celor trei picuri. După localizare embrionii se mută în mediul VM1 pur, unde se mențin 9-15 minute figura 5.15.

Figura 5.15. Embrionii sunt mutați în mediul VM1 pur. Săgeata indică poziția lor.

După trecerea celor 9 minute embrionii se transferă în prima picătură de mediu VM2 unde se țin 20 de secunde, după care se mută în al doilea mediu VM2 unde se menține tot atâta timp figura 5.16.

Figura 5.16. Embrionii sunt mutați în mediile VM2.

Din a doua picătură de VM2 embrionii se iau în capilar cu mediu cu tot și se formează o picătura mică de aproximativ 10 µl, cu care aceștia vor fi abrorbiți în paietă și stocați figura 5.17.

Figura 5.17. Embrionii sunt absorbiți în paietă.

Paieta este introdusă în azot lichid, apoi într-o altă paitetă care are rol de protecție al primei figura 5.18.

Figura 5.18. Așezarea paietei cu embrioni în cel de protecție.

După ce toți embrionii au fost congelați și toate paietele au fost închise, acestea se așează în containerul de stocare în azot lichid figura 5.20. Embriologul trebuie să aibă mare grijă, în momentul în care canistra se lasă în jos în azot. Paietele nefiind închise ermetic, o mică parte din azotul din paietă se evaporă, iar dacă canistra se lasă jos brusc în container, există riscul ca bula de aer să mențină la suprafată paieta un scurt timp, suficient însă pentru a pierde acesta definitiv în container.

Figura 5.20. Introducerea paietelor în container

5.4.3. Decongelarea embrionilor vitrificați

Mediile de decongelare sunt: Sucroza 1M care se încălzește înainte de congelare la 37˚C, Sucroza 0,5 M și MB acestea din urmă se încălzesc la 25˚C. Decongelarea se face într-o plăcuță 4well, în primul godeu se pune 1 ml de mediu sucroză 1M, în al doiela godeu se pune 1 ml de mediu cu sucroză 0,5M, iar în godeele trei și patru se pune mediu de bază figura 5.21.

Figura 5.21 Plăcuță de decongelare

Protocol decongelare:

Sescoate paieta cu embrioni și se introduce în mediul cu sucroză 1M unde se ține 60 de secunde. În acest timp embrionul sau embrionii trebuiesc localizați, deoarece din cauza presiunii ele pot fi duși în diferite locuri din mediu, iar dacă s-au format bule și embrionii s-au prins de aceștia și nu sunt luați de lânga bule în câteva secunde, aceștia pot suferi figura 5.22.

Figura 5.22. Mediul 1M, cu embrioni și bule care ot pune în pericol embrionii. Săgeata albastră indică poziția embrionilor, iar cea roșie bulele care prezintă pericol pentru embrioni.

În capilar se ia o cantitate mai mare de mediu din primul godeu și embrionii împreuma cu mediu, și se pun în mediul cu sucroză 0,5M. Cu grijă în jurul embrionilor se eliberează mediul de sucroză 1M cu scopul de a reduce socul brusc cauzat de diferența de concentrații. Aici se mențin embrionii timp de 3 minute figura 5.23.

Figura 5.23. Embrionii se mută din sucroză 1M în cel cu sucroză 0,5M. Săgeata indică direcția de transfer al embrionilor.

Din mediul cu sucroză 0,5M embrionii se mută în godeul trei și patru în MB, în fiecare godeu embrionii se lasă cate 5 minute figura 5.24.

Figura 5.24. Săgețile indică traseul embrionilor prin placuță.

Din plăcuța de decongelare embrionii se transferă în mediul de embriotransfer și se incubează minim 30 minute după decongelare și înainte de embriotransfer.

5.5. Evaluarea embrionilor

Înainte de embriotransfer, embrionii sunt evaluați din punct de vedere morfologic, analizând schimbările morfologice apărute după decongelare. Pentru evaluarea rezultatelor s-a folosit testul Chi-square, unde variabila P<0,05 a fost considerată ca fiind diferență semnificativă.

5.6. Assisted hatching (AH)

Assisted hatching-ul este o procedură la care au fost supuși toți embrionii care au fost decongelați indiferent de metoda cu care au fost congelați. Această procedură constă în decuparea unei bucăți mici din zona pelucidă cu un laser, cu scopul de a ușura eclozarea embrionului în ziua 5-6, figura 5.25. Assisted haching-ul nu este obligatorie, însă este recomandată efectuarea procedurii la embrionii decongelați, deoarece zona pelucidă își schimbă structura devenind mai dură în urma procesului de congelare, astfel putând bloca sau întârzia eclozarea embrionului, reducându-se șansele de a obține o sarcină.

Figura 5.25 Embrion la care s-a facut AH, în partea dreaptă se poate observa lipsa zonei pelucide decupate de laser.

5.7. Embriotransferul

Embriotransferul este procedura prin care unul sau mai mulți embrioni obținuți prin fertilizare „in vitro” sunt transferați în uterul viitoarei mame. Această procedură se realizează cu un cateter special din silicon, în care embriologul absoarbe embrionul sau embrionii împreună cu o cantitate redusă de mediu de cultură și pe care medicul obstetrician îl introduce în uter, eliberând lichidul și embrionii din cateter pe endometrul mamei.

5.8. Testul de sarcină

Testul de sarcină s-a realizat din sânge venos, detectând cantitatea de β-hCG din ser. Probele s-au recoltat după două săttămâni de la embriotransfer.

Rezultate

Din punct de vedere financiar costurile celor două tehnici sunt diferite, cele pentru congelarea lentă fiind mai scumpe.

Pentru congelarea lentă clinica trebuie să achite prețul unor Kit-uri de congelare care este suficient pentru congelarea unui număr de aproximativ 16-24 de embrioni, acest număr variind în funcție de producător, marimea chitului etc.

Iar pentru vitrificare mediile pot fi preparate de către embriolog în cantitățile care să acopere necesitățile laboratorului.

Testul Chi-square prin care s-a analizat frecvența rezultatelor obținute după congelarea și decongelarea embrionilor a arătat diferențe care pot fi vizualizate în tabelul din figura 6, unde rezultatele au fost grupate separat pentru embrionii din ziua a treia și blastociști în două tabele.

S-a analizat separat și rata de implantare, care repzezintă embrionii eclozați care au reușit să facă contact cu fluxul sangvin matern, în sânge fiind depistat β-hCG dar care nu a fost urmat de o sarcină clinică, separat sarcinile care reprezintă sarcini clinice care nu au depășit primul trimestru de dezvoltare sau care în momentul analizei se aflau în primul trimestru de sarcină, respectiv sarcinile în dezvoltare care reprezintă sarcini trecuți de primul trimestru de dezvoltare.

Figura 6 reprezintă rezultatele test Chi-square

Durata de congelare este mult mai lungă la congelarea clasică, care durează peste 3 ore la embrionii în stadiul de clivare și peste două ore la blastociști în timp ce congelarea prin vitrificare durează doar jumătate de oră. În cazul decongelării la tehnica congelării lente acest proces durează 22-24 de minute, iar în cazut decongelării a embrionilor vitrificați durează 14 minure.

Discuții

Din punct de vedere financiar pentru congelarea controlată este nevoie de o resursă financiară mai mare, kit-urile implicând în costuri nu doar prețul substanțelor chimice pe care le conțin ci și transportul lor dintr-o țară în alta. În cazul mediilor de congelare pentru vitrificare embriologul are nevoie doar de crioprotectanți, restul componentelor mediilor fiind medii uzuale care se folosesc des în toate protocoalele ce implică manipularea ovocitelor sau a embrionilor.

Kit-urile pot întârzia să ajungă la laboratorul care le-a comandat, din diverse motive, în lipsa lor fiind imposibilă congelarea embrionilor. În acest caz aceștia sunt supuși e unui stres suplimentar fiind tinute în mediul de cultură mai mult decât este necesar.

În timpul transportului datorită temperaturilor ambientale, mediile se pot deteriora. Mediile sunt transportate în cutii speciale izolate termic cu baterii de răcire, care să mențină temperatura de 2-4˚C necesare depozitării acestora, însă la temperaturi foarte ridicare care pot fii vara, respectiv temperaturile la care se pot încălzii încăperile de transport ale camioanelor poate depășii capacitatea de răcire și de menținere a temperaturilor, astfel componentele proteice ale mediilor pot suferii astfel devenind inutilizabile pentru congelare. În acest caz deteriorarea embrionilor nu va fi cauzat de procesul de congelare ci de calitatea mediilor incapabile să facă față necesităților acestra.

Un alt caz la fel de frecvent este cel în care temperaturile scad foarte tare, mai ales în timpul ierni când mediile pot îngheța cu ușurință. În acest caz la fel ca și în cazul în care se încălzesște, ele se deteriorează, scad calitativ și pot provoca moartea embrionilor.

La mediile comandate trebuie avut mare grijă să nu se comnade o cantitate prea mare, deoarece timpul de valabilitate este limitat la o lună – o lună jumătate. Dacă în acest timp nu sunt utilizate ele devin o pierdere pentru laborator, care trebuie recuperat. Singura metodă este de a urca prețul congelărilor efectuate la clinici lucru care cere un efort financiar mai mare din partea pacienților.

În cazul mediilor utilizate în vitrificare toate aceste pericole nu există. În laborator ajung crioprotectanții puri, fiecare separat cu termen de valabilitate mare, de câțiva ani, timp în care acestea sunt epuizate cu mult înaintea expirării lor, astfel nu se pierd.

În ceea ce privește mediile preparate de către embriolog, și aici pierderile pot fi minimalizate dacă nu chiar evitate deoarece fiind publice concentrațiile de crioprotectanți se pot calcula exact cantitățile necesare pentru congelare.

Un dezavantaj al congelării controlate este aparatura care e necesară pentru efectuarea acesteia. Față de metoda OPS, unde este necesar doar o masă cu flux laminar dotat cu o placă pe suprafața căruia se poate regla temperatura și un microscop, la congelarea lentă este nevoie și de un aparat capabil să scadă temperatura încet controlat respectiv de o baie marină la decongelare.

Dezavantajul aparatului de congelare reglată este faptul că se poate defecta oricând, iar acesta poate fi dificil de sesizat și chiar dacă se întâmplă acesta se poate face doar după decongelarea mai multor embrioni după luni de zile, în care acesta a fost utilizat. O asemenea dfecțiune poate cauza moartea a zeci sau chiar sute de embrioni în funcție de numărul de proceduri care a avut loc.

În cazul vitrificării toate aceste riscuri tehnice nu există, însă este nevoie de nivel de pregătire mare a embriologului, deoarece cu toate ca este mult mai simplă atât din punct de vedere al protocolului cât și a duratei are puncte slabe în care dacă se face orice greșeală embrionii pot fi uciși cu ușurință.

Un alt risc apare în moentul preparării mediilor, când daă în laborator există microorganism care a dimensiunii mai mici de 0,1˚µm pot ajunge în mediul de congelare infectând acesta.

Un alt avantaj pe care îl are metoda OPS față de metoda congelării controlate este timpul mai scurt în care se efectuează. Timpul mai scurt în care embrionii sunt expuși crioprotectanților înseamnă și toxicitate mai redusă pentru aceștia, crioprotectanții nu au la dispoziție așa mult timp pentru a face legături cu difetite structuri chimice ale componenților celulari și extracelurari al embrionului. În timpul stocării în azot lichid crioprotectanții nu afectează ebrionii. La -196˚C, temperatura pe care în are azotul lichid, moleculele respectiv atomii nu se mișcă cu o viteză suficient de mare încât să fie capabili de a desfășura orice reacție chimică.

Timpul scurt în care se poate congela embrionii prin vitrificare aduce beneficii nu doar embrionilor ci și embriologului care iși poate reduce durata orelor de muncă seminificativ. Într-un laborator de embriologie mereu se bucură de întâietate fertilizările „in vitro”, fertilizarea clasică și injecția intracitoplasmatică, acestea fiind obligatoriu efectuate intr-un anumit interval de tip după recoltare. Toate aceste procese durează cateva ore în funcție de numarul procedurilor care au avut loc în acea zi respectiv de numărul ovocitelor recoltate, iar dacă acestea se întind în timp există riscul de a nu mai avea suficient și pentru congelarea clasică. În acest caz embrionii fiind congelați a doua zi dimineață fiind supuși încă câteva ore stresului din incubator.

Rezultele testului Chi-square nu arată rezultate semnificative între cele două metode de congelare în cazul embrionilor din stadiul de clivare, ambele arătând o eficiență foarte asemănătoare.

În cazul blastociștilor diferențele sunt semnificative, rezultatele fiind mai bune în cazul congelării prin vitrificare. Acest lucru poate fi datorat concentrației mai mari de crioprotectanți din care sunt compuși mediile pentru vitrificare, care penetrează mai repede numărul mai mare de celule pe care le are un blastocist.

Concluzii

Din punct de vedere financiar este mult mai benefic vitrificarea. Prin această metodă se poate controla mult mai eficient cantitatea de mediu preparată evitând pierderile care pot apărea ușor în cazul Kit-urilor.

Kitu-rile prezintă un dezavantaj față de vitrificare și prin costul lor, acestea fiind mai ridicate decât cele preparate de embriolog carre cumpără ingredient cu ingredient nefiind adăugate costuri suplimentare pentru preparare și transport.

Vitrificare nu implică riscuri de deteriorare a medilor cum sunt cele care pot apărea în timpul transportului, singurul pericol fiind contaminarea cu microorganisme de dimensiuni mai mici de 0,1µm, a căror șanse sunt reduse datorită filtrelor existente în laborator.

Timpul scurt în care se pot congela ebrionii este un avantaj al vitrificării, de care beneficiază atât embriologul care iși reduce timpul de lucru cât și embrionii care sunt expuși mai puțin timp toxicitatea crioprotectanților, și a stresului ce implică congelarea.

Dezavantajul vitrificării este nivelul ridicat de pregătire pe care trebuie să-l aibă embriologul deoarece la anumite etape din protocol există risc ridicat de a greși.

În cazul congelării controlate embriologul are rol mai mic în ceea ce privește reușita congelării datorită aparatului utilizat, însă în cazul unei defecțiuni ale aparatului pierderile pot fi enorme și congelarea nu se poate efectua până la înlocuirea acestuia.

Rezultatele semnificativ mai bune obținute în cazul congelării blastociștilor prin metoda OPS, ne arată că a fost necesar un număr mai mic de embrioni pentru obținerea unei sarcini.

Ținând cont că metoda OPS a fost în fază de învățare în laborator iar congelarea lentă a fost folosită de mai mult timp, rezultatele sunt promițătoare.

Bibliografie:

http://anatomie.romedic.ro/spermatozoidul

http://www.mymed.ro/ovogeneza-foliculogeneza-ovulatia.html

https://en.wikipedia.org/wiki/Pronucleus

http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/fert/cleavage.html http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/pathphys/reprod/fert/cleavage.html

http://humrep.oxfordjournals.org/content/early/2012/06/29/humrep.des224.full

https://en.wiktionary.org/wiki/aprotic

https://en.wikipedia.org/wiki/Dimethyl_sulfoxide#Biology

https://en.wikipedia.org/wiki/Cryopreservation#Temperature

http://ruminref.eu/index.php?newsid=356567

http://humrep.oxfordjournals.org/content/early/2012/06/29/humrep.des224.full

https://en.wikipedia.org/wiki/Cryopreservation#Temperature

https://en.wikipedia.org/wiki/Glycerol

https://en.wikipedia.org/wiki/Sucrose

https://ro.wikipedia.org/wiki/Zigot

Embryo Development and Assessment of ViabilityThomas Ebner David K. Gardner In Vitro Fertilization F-Unit, Women’s General Hospital, Linz, Austria pg.199-220

In Vitro Fertilization, David K. Gardner, Colorado Center for Reproductive Medicine Englewood, Colorado, U.S.A. editura informa healthcare pg. 331-338

In Vitro Fertilization David K. Gardner Colorado Center for Reproductive MedicineEnglewood, Colorado, U.S.A. editura informa healthcare Pagina 333-334

(Neagoș D, Crețu R, Mierlă DM, Dicționar de genetică, Editura All, 2014, pagina 72.)